01991R2568 — PL — 04.12.2016 — 031.005

Dokument ten służy wyłącznie do celów informacyjnych i nie ma mocy prawnej. Unijne instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego treść. Autentyczne wersje odpowiednich aktów prawnych, włącznie z ich preambułami, zostały opublikowane w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej i są dostępne na stronie EUR-Lex. Bezpośredni dostęp do tekstów urzędowych można uzyskać za pośrednictwem linków zawartych w dokumencie

zmienione przez:





sprostowane przez:







(*) Akt ten nie został nigdy opublikowany w języku polskim.









▼B

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 2568/91

z dnia 11 lipca 1991 r.

w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy







▼M20

Artykuł 1

1. Oleje, których właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 1 i 2 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. a) i b) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawane są za oliwę z oliwek pierwszego tłoczenia.

2. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 3 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. c) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek typu lampante.

3. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 4 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 2 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z oliwek.

4. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 5 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 3 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek złożoną z rafinowanej oliwy z oliwek.

5. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 6 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 4 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za surową oliwę z wytłoczyn oliwek.

6. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 7 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 5 rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z wytłoczyn oliwek.

7. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 8 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 6 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z wytłoczyn oliwek.

▼M26

Artykuł 2

1. Właściwości olejów wymienione w załączniku I określa się zgodnie z następującymi metodami analizy:

a) metoda oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych wyrażonych jako procentowa część kwasu oleinowego, przedstawiona w załączniku II;

b) metoda oznaczania liczby nadtlenkowej, przedstawiona w załączniku III;

c) metoda oznaczania zawartości wosków, przedstawiona w załączniku IV;

d) metoda oznaczania składu i zawartości steroli i dialkoholi triterpenowych metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych, przedstawiona w załączniku V;

e) metoda oznaczania zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu, przedstawiona w załączniku VII;

f) metoda analizy spektrofotometrycznej, przedstawiona w załączniku IX;

▼M28

g) metoda oznaczania składu kwasu tłuszczowego, przedstawiona w załączniku X;

▼M26

h) metoda oznaczania lotnych rozpuszczalników chlorowcowanych, przedstawiona w załączniku XI;

i) metoda oceny właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, przedstawiona w załączniku XII;

j) metoda oznaczania stigmastadienów, przedstawiona w załączniku XVII;

k) metoda oznaczania zawartości triglicerydów z ECN42, przedstawiona w załączniku XVIII;

▼M28

l) metoda oznaczania zawartości alkoholi alifatycznych i triterpenowych, przedstawiona w załączniku XIX;

▼M26

m) metoda oznaczania zawartości wosków, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych, przedstawiona w załączniku XX.

▼M28 —————

▼M26

2. Weryfikacja właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia prowadzona przez organy krajowe i ich przedstawicieli wykonywana jest przez zespoły degustatorów zatwierdzone przez państwa członkowskie.

Właściwości organoleptyczne oliwy, o których mowa w akapicie pierwszym, określa się jako zgodne ze zgłoszoną kategorią, jeżeli zespół degustatorów zatwierdzony przez państwo członkowskie potwierdzi taką klasyfikację.

W przypadku gdy zespół nie potwierdzi kategorii zgłoszonej w odniesieniu do właściwości organoleptycznych, na wniosek zainteresowanej strony organy krajowe lub ich przedstawiciele zapewniają niezwłoczne przeprowadzenie przez inne zatwierdzone zespoły dwóch ocen porównawczych, z których przynajmniej jedna wykonana jest przez zainteresowane państwo członkowskie będące producentem. Przedmiotowe właściwości określa się jako zgodne ze zgłoszonymi właściwościami, jeżeli co najmniej dwie z ocen porównawczych potwierdzą zgłoszoną klasyfikację. Jeżeli tak się nie stanie, zainteresowana strona ponosi koszty ocen porównawczych.

3. W przypadku gdy organy krajowe lub ich przedstawiciele sprawdzają właściwości oliwy, jak przewidziano w ust. 1, próbki pobiera się zgodnie z normami międzynarodowymi: normą EN ISO 661 dotyczącą przygotowania próbek do badań oraz normą EN ISO 5555 dotyczącą pobierania próbek. Jednak niezależnie od przepisów pkt 6.8 normy EN ISO 5555, w przypadku partii takiej oliwy w opakowaniu bezpośrednim próbkę pobiera się zgodnie z załącznikiem Ia do niniejszego rozporządzenia. W przypadku oliwy luzem, której próbek nie można pobrać zgodnie z normą EN ISO 5555, pobieranie próbek wykonuje się zgodnie z instrukcjami opracowanymi przez właściwy organ państwa członkowskiego.

Bez uszczerbku dla normy EN ISO 5555 oraz rozdziału 6 normy EN ISO 661 pobrane próbki jak najszybciej umieszcza się w ciemnym miejscu, z dala od źródeł wysokiej temperatury i wysyła się do laboratorium w celu poddania analizie nie później niż piątego dnia roboczego po ich pobraniu, w przeciwnym razie próbki przechowuje się w taki sposób, aby nie uległy rozpadowi ani uszkodzeniu w czasie transportu lub przechowywania, zanim zostaną wysłane do laboratorium.

4. Do celów weryfikacji przewidzianej w ust. 3, analizy, o których mowa w załącznikach II, III, IX i XX, oraz w stosownych przypadkach wszystkie analizy porównawcze wymagane na mocy prawa krajowego, wykonuje się przed upływem daty minimalnej trwałości w przypadku produktów pakowanych. W przypadku pobierania próbek oliwy luzem analizy te wykonuje się nie później niż po upływie sześciu miesięcy od miesiąca, w którym pobrano próbkę.

Nie stosuje się żadnych terminów w przypadku innych analiz przewidzianych w niniejszym rozporządzeniu.

Jeżeli wyniki analiz nie odpowiadają właściwościom zgłoszonej kategorii oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek, zainteresowana strona powiadamiana jest nie później niż miesiąc przed końcem okresu określonego w akapicie pierwszym, chyba że próbkę pobrano później niż dwa miesiące przed upływem daty minimalnej trwałości.

5. W celu oznaczenia właściwości różnych rodzajów oliwy z oliwek za pomocą metod przewidzianych w ust. 1 akapit pierwszy wyniki analiz porównuje się bezpośrednio z limitami określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

▼M25

Artykuł 2a

1. Do celów niniejszego artykułu „oliwa z oliwek wprowadzona do obrotu” oznacza całkowitą ilość oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek odpowiedniego państwa członkowskiego konsumowanej w tym państwie członkowskim lub wywożonej z tego państwa członkowskiego.

2. Państwa członkowskie zapewniają selektywne przeprowadzanie opartych o analizę ryzyka i odpowiednio częstych kontroli zgodności, tak aby zagwarantować, że oliwa z oliwek wprowadzona do obrotu jest zgodna ze zgłoszoną kategorią.

3. Kryteria oceny ryzyka mogą obejmować:

a) kategorię oliwy, okres produkcji, cenę oliwy w stosunku do innych olejów roślinnych, czynności związane z mieszaniem i pakowaniem, obiekty i warunki przechowywania, państwo pochodzenia, państwo przeznaczenia, środki transportu lub objętość partii;

b) pozycję podmiotów gospodarczych w łańcuchu wprowadzania do obrotu, objętość lub wartość produktów wprowadzanych przez nie do obrotu, zakres kategorii oliwy, które wprowadzają do obrotu, rodzaj prowadzonej działalności, na przykład tłoczenie, przechowywanie, rafinowanie, mieszanie, pakowanie lub sprzedaż detaliczna;

c) ustalenia poczynione podczas poprzednich kontroli, w tym liczbę i rodzaj stwierdzonych wad, typową jakość oliwy wprowadzanej do obrotu, efektywność wykorzystywanego wyposażenia technicznego;

d) wiarygodność systemów zapewnienia jakości lub systemów samokontroli podmiotów gospodarczych w odniesieniu do zgodności z normami handlowymi;

e) miejsce przeprowadzania kontroli, zwłaszcza jeśli jest to pierwszy punkt wprowadzenia produktów na teren Unii, ostatni punkt wyprowadzenia produktów z Unii lub miejsce, w którym oleje są produkowane, pakowane, ładowane lub sprzedawane konsumentowi finalnemu;

f) wszelkie inne informacje, które mogą wskazywać na ryzyko niezgodności.

4. Państwa członkowskie z wyprzedzeniem ustanawiają:

a) kryteria oceny ryzyka wystąpienia niezgodności poszczególnych partii;

b) na podstawie analizy ryzyka dla każdej kategorii ryzyka – minimalną liczbę podmiotów gospodarczych, partii lub ilości podlegających kontroli zgodności.

Rocznie przeprowadza się co najmniej jedną kontrolę zgodności na tysiąc ton oliwy z oliwek wprowadzonej do obrotu w państwie członkowskim.

5. Państwa członkowskie sprawdzają zgodność:

a) przez przeprowadzenie, w dowolnej kolejności, analiz określonych w załączniku I; lub

b) przez przeprowadzenie analiz w kolejności określonej w załączniku Ib w sprawie schematu decyzyjnego aż do osiągnięcia jednej z decyzji wymienionych w tym schemacie decyzyjnym.

▼M19 —————

▼M25

Artykuł 3

W przypadku gdy stwierdzono, że oliwa nie odpowiada opisowi jej kategorii, zainteresowane państwo członkowskie stosuje, bez uszczerbku dla wszelkich innych kar, skuteczne, proporcjonalne i odstraszające kary, które są ustalane w świetle tego, jak poważna jest stwierdzona nieprawidłowość.

W przypadku gdy w ramach kontroli ujawnione zostają istotne nieprawidłowości, państwa członkowskie zwiększają częstotliwość kontroli w odniesieniu do etapu wprowadzania do obrotu, kategorii oliwy, pochodzenia lub innych kryteriów.

▼M5

Artykuł 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Jeżeli Państwa Członkowskie napotykają trudności w utworzeniu na swoim terytorium zespołów degustatorów, mogą wezwać zespół degustatorów zatwierdzony w innym Państwie Członkowskim.

3. Każde Państwo Członkowskie sporządza wykaz zespołów degustatorów utworzonych przez organizacje zawodowe lub międzybranżowe zgodnie z warunkami ustanowionymi w ust. 1 i zapewnia przestrzeganie tych warunków.

▼M19 —————

▼B

Artykuł 6

1. Zawartość oleju w makuchu i innych wytłokach powstających przy ekstrakcji oliwy z oliwek (kody CN 2306 90 11 i 2306 90 19 ) oznaczane są metodą przedstawioną w załączniku XV.

2. Zawartość oleju, określona w ust. 1, wyrażana jest jako procent masy oleju w stosunku do masy suchej substancji.

▼M20

Artykuł 7

Przepisy wspólnotowe dotyczące zawartości zanieczyszczeń stosuje się.

W odniesieniu do rozpuszczalników chlorowcowanych limity dla wszystkich kategorii oliwy z oliwek są następujące:

— maksymalna zawartość wykrytych rozpuszczalników chlorowcowanych: 0,1 mg/kg,

— całkowita maksymalna zawartość wykrytych rozpuszczalników chlorowcowanych: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artykuł 7a

Osoby fizyczne lub prawne oraz grupy osób, które posiadają oliwę z oliwek lub oliwę z wytłoczyn z oliwek od etapu ekstrakcji w tłoczni do etapu butelkowania włącznie, w dowolnych celach zawodowych bądź handlowych, muszą prowadzić rejestry wprowadzania i wycofywania w odniesieniu do każdej kategorii takiej oliwy.

Państwa członkowskie zapewniają należyte przestrzeganie obowiązku określonego w akapicie pierwszym.

▼M25

Artykuł 8

1. Państwa członkowskie powiadamiają Komisję o środkach służących wprowadzeniu w życie niniejszego rozporządzenia. Państwa członkowskie powiadamiają Komisję o wszelkich późniejszych zmianach.

2. Nie później niż do 31 maja każdego roku państwa członkowskie przekazują Komisji sprawozdanie dotyczące wdrażania niniejszego rozporządzenia w poprzednim roku kalendarzowym. Sprawozdanie zawiera przynajmniej wyniki kontroli zgodności przeprowadzonych w odniesieniu do oliwy z oliwek przedstawione zgodnie z szablonami określonymi w załączniku XXI.

3. Powiadomienia, o których mowa w niniejszym rozporządzeniu, są dokonywane zgodnie z rozporządzeniem Komisji (WE) nr 792/2009 ( 1 ).

▼B

Artykuł 9

Niniejszym rozporządzenie (EWG) nr 1058/77 traci moc.

Artykuł 10

1. Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie trzeciego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Jednakże metodę określoną w załączniku XII stosuje się od ►M1 dnia 1 listopada 1992 r. ◄ , z wyjątkiem działań odnoszących się do systemu interwencyjnego.

▼M5

Metody tej nie stosuje się do oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia przygotowanej na rynek przed dniem 1 listopada 1992 r.

▼B

2. Niniejsze rozporządzenie nie stosuje się do oliwy z oliwek i oleju z wytłoczyn z oliwek pakowanych przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia oraz wprowadzonych do obrotu do dnia 31 października 1992 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Państwach Członkowskich.









ZAŁĄCZNIK I

Streszczenie







ZAŁĄCZNIK I: Właściwości oliwy z oliwek ZAŁĄCZNIK Ia: Pobieranie próbek oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek dostarczonych w opakowaniu bezpośrednim ZAŁĄCZNIK Ib: Schemat podejmowania decyzji, czy próbka oliwy z oliwek jest zgodna ze zgłoszonąkategorią ZAŁĄCZNIK II: Oznaczanie wolnych kwasów tłuszczowych, metoda na zimno ZAŁĄCZNIK III: Oznaczanie liczby nadtlenkowej ZAŁĄCZNIK IV: Oznaczanie zawartości wosków metodą chromatografii gazowej z użyciem kolumny kapilarnej ZAŁĄCZNIK V: Oznaczenia składu i zawartości steroli i dialkoholi triterpenowych metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych ZAŁĄCZNIK VII: ►M21 Oznaczanie zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu ◄ ▼M20 ————— ▼B ZAŁĄCZNIK IX: Badanie spektrofotometryczne w ultrafiolecie ▼M28 ZAŁĄCZNIK X: Oznaczanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej ▼B ZAŁĄCZNIK XI: Oznaczanie lotnych fluorowcowanych rozpuszczalników oliwy z oliwek ZAŁĄCZNIK XII: Metoda międzynarodowej rady ds. oliwy służąca do organoleptycznej oceny oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ZAŁĄCZNIK XV: Zawartość oleju w pozostałości z oliwek ZAŁĄCZNIK XVI: Oznaczenie liczby jodowej ZAŁĄCZNIK XVII: Metoda oznaczania stigmastadienów w olejach roślinnych ZAŁĄCZNIK XVIII: Oznaczenie różnicy między rzeczywistą a teoretyczną zawartością triglicerydów z ECN 42 ANNEX XIX: ►M28 Oznaczanie zawartości alkoholi alifatycznych i triterpenowych metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych ◄ ▼M23 ZAŁĄCZNIK XX: Metoda dla oznaczenia zawartości wosków, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych metodą kapilarnej chromatografii gazowej ▼M28 ————— ▼M25 ZAŁĄCZNIK XXI: Wyniki kontroli zgodności przeprowadzonych w odniesieniu do oliwy z oliwek, o których mowa w art. 8 ust. 2

▼M31









ZAŁĄCZNIK I

WŁAŚCIWOŚCI OLIWY Z OLIWEK

Cechy jakościowe







Kategoria Kwasowość (%) (*) Liczba nadtlenkowa mEq O2/kg (*) K232 (*) K268 lub K270 (*) Delta-K (*) Ocena organoleptyczna Estry etylowe kwasu tłuszczowego mg/kg (*) Mediana wad (Md) (*) Mediana aromatu owoców (Mf) (*) 1. Oliwa z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — 3. Oliwa lampante > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Rafinowana oliwa z oliwek ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Oliwa z oliwek składająca się z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Surowa oliwa z wytłoczyn z oliwek — — — — — — — — 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) Mediana wad może być mniejsza lub równa 3,5, kiedy mediana aromatu owocowego wynosi 0.

Charakterystyka czystości







Kategoria Zawartość kwasów tłuszczowych (1) Izomery transoleinowe ogółem (%) Izomery translinolowe + izomery translinolenowe ogółem (%) Stigmastadieny mg/kg (2) ►C4 Różnica między ECN42 (HPLC) a teoretycznym ECN42 ◄ 2-monopalmitynian glicerolu (%) Mirystynowy (%) Linolenowy (%) Arachidowy (%) Eikozenowy (%) Behenowy (%) Lignocerynowy (%) 1. Oliwa z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C4 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 1,0, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C4 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 1,0, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 3. Oliwa lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C4 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 1,1, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 4. Rafinowana oliwa z oliwek ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C4 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 1,1, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 5. Oliwa z oliwek składająca się z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C4 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 1,0, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 6. Surowa oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C4 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C4 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C4 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Kategoria Skład steroli Sterole ogółem (mg/kg) Erytrodiol i uwaol (%) (**) Woski mg/kg (**) Cholesterol (%) Brassikasterol (%) Kampesterol (3) (%) Stigmasterol (%) App ß-sitosterol (%) (4) Delta-7-stigmastenol (3) (%) 1. Oliwa z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Oliwa lampante ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Rafinowana oliwa z oliwek ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Oliwa z oliwek składająca się z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Surowa oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Oliwa z wytłoczyn z oliwek ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Kamp. > 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Uwagi:

a) wyniki analiz muszą być wyrażone z dokładnością do tej samej liczby miejsc po przecinku, jaką zastosowano w odniesieniu do każdej właściwości. Ostatnia cyfra musi być powiększona o jeden, jeżeli następna cyfra jest większa niż 4;

b) jeżeli tylko jedna właściwość nie jest zgodna ze wskazanymi wartościami, kategoria oliwy może zostać zmieniona lub zgłoszona jako niezgodna pod względem czystości do celów niniejszego rozporządzenia;

c) jeżeli właściwość oznaczona jest gwiazdką (*), w odniesieniu do jakości oliwy oznacza to, że: – w przypadku oliwy lampante obie odpowiednie wartości dopuszczalne mogą jednocześnie różnić się od podanych; – w przypadku oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, jeżeli co najmniej jedna z wartości dopuszczalnych różni się od podanych wartości, kategoria oliwy zostanie zmieniona, jedna i druga będzie nadal zaliczana do jednej z kategorii oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia;

d) jeżeli właściwość oznaczona jest dwiema gwiazdkami (**), oznacza to, że w przypadku wszystkich rodzajów oliwy z wytłoczyn z oliwek obie odpowiednie wartości dopuszczalne mogą różnić się jednocześnie od podanych wartości.









Dodatek

SCHEMAT PODEJMOWANIA DECYZJI

Schemat podejmowania decyzji dotyczących kampesterolu w przypadku oliwy z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia i oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia:

Pozostałe parametry są zgodne z wartościami dopuszczalnymi określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

Schemat podejmowania decyzji dotyczących delta-7-stigmastenolu w przypadku:

— Oliwa z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia i oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia —

Pozostałe parametry są zgodne z wartościami dopuszczalnymi określonymi w niniejszym rozporządzeniu.

— Oliwa z wytłoczyn z oliwek (surowa i rafinowana) —

▼M26









ZAŁĄCZNIK Ia

POBIERANIE PRÓBEK OLIWY Z OLIWEK LUB OLIWY Z WYTŁOCZYN Z OLIWEK DOSTARCZONYCH W OPAKOWANIU BEZPOŚREDNIM

Ta metoda pobierania próbek ma zastosowanie do partii oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn z oliwek umieszczonych w opakowaniu bezpośrednim. W zależności od tego, czy zawartość opakowania bezpośredniego przekracza 5 litrów czy też nie, zastosowanie mają różne metody pobierania próbek.

„Partia” oznacza zbiór opakowań detalicznych, które są produkowane, wytwarzane i pakowane w takich warunkach, w których oliwę zawartą w każdym opakowaniu detalicznym uważa się za jednorodną pod względem wszystkich właściwości analitycznych. Oznakowanie partii musi zostać przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2011/91/UE ( 8 ).

„Próbka jednostkowa” oznacza ilość oliwy zawartej w opakowaniu bezpośrednim, pobraną z dowolnego miejsca partii.

1. ZAWARTOŚĆ PRÓBKI PIERWOTNEJ

1.1. Opakowanie bezpośrednie nieprzekraczające 5 litrów

„Próbka pierwotna” w przypadku opakowania bezpośredniego nieprzekraczającego 5 litrów oznacza liczbę próbek jednostkowych pobranych w danej partii zgodnie z tabelą 1.







Tabela 1 Minimalna próbka pierwotna powinna zawierać Jeżeli opakowanie bezpośrednie ma pojemność Próbka pierwotna musi zawierać oliwę pobraną z a) 1 litr lub więcej; a) jednego opakowania bezpośredniego; b) mniejszą niż 1 litr. b) minimalnej liczby opakowań o łącznej pojemności wynoszącej co najmniej 1 litr.

Liczba opakowań wymienionych w tabeli 1, które tworzą próbkę pierwotną, może być zwiększona przez każde państwo członkowskie, zgodnie z jego własnymi potrzebami (na przykład ocena organoleptyczna dokonana przez laboratorium inne niż to, które wykonało analizy chemiczne, analizy porównawcze itd.).

1.2. Opakowanie bezpośrednie przekraczające 5 litrów

„Próbka pierwotna” w przypadku opakowań bezpośrednich przekraczających 5 litrów oznacza reprezentatywną część łącznych próbek jednostkowych, otrzymaną w procesie redukcyjnym zgodnie z tabelą 2. W skład próbki pierwotnej muszą wchodzić różne przykłady.

„Przykład” próbki pierwotnej oznacza każde opakowanie wchodzące w skład próbki pierwotnej.







Tabela 2 Minimalna liczba próbek jednostkowych, które należy pobrać Liczba opakowań w danej partii towaru Minimalna liczba próbek jednostkowych, które należy pobrać do 10 % 1 11–150 2 151–500 3 501–1 500 4 1 501 –2 500 5 > 2 500 na 1 000 opakowań 1 dodatkowa próbka jednostkowa

W celu ograniczenia objętości próbkowanych opakowań bezpośrednich zawartość pobieranych próbek jednostkowych jest homogenizowana w celu przygotowania próbki pierwotnej. Części różnych próbek jednostkowych wlewane są do wspólnego pojemnika w celu poddania ich homogenizacji przez wymieszanie, aby jak najlepiej zabezpieczyć je przed dostępem powietrza.

Próbkę pierwotną należy wlać do kilku opakowań o minimalnej pojemności wynoszącej 1,0 litr, z których każde stanowi przykład próbki pierwotnej.

Liczba próbek pierwotnych może być zwiększana przez każde państwo członkowskie, zgodnie z jego własnymi potrzebami (na przykład ocena organoleptyczna dokonana przez laboratorium inne niż to, które wykonało analizy chemiczne, analizy kontrolne itd.).

Każde opakowanie należy napełnić w taki sposób, aby warstwa powietrza nad próbką była jak najmniejsza, a następnie odpowiednio zamknąć w celu zabezpieczenia produktu.

Przykłady te należy oznakować w celu zapewnienia prawidłowej identyfikacji.

2. ANALIZY I WYNIKI

2.1. Każdą próbkę pierwotną należy podzielić na próbki laboratoryjne, zgodnie z pkt 2.5 normy EN ISO 5555, i analizować w kolejności przedstawionej na schemacie podejmowania decyzji opisanym w załączniku Ib lub w innej dowolnej kolejności.

2.2. Jeżeli wszystkie wyniki analiz są zgodne z właściwościami zgłoszonej kategorii oliwy, cała partia ma być zgłoszona jako zgodna.

Jeżeli jeden wynik analizy nie jest zgodny z właściwościami zgłoszonej kategorii oliwy, cała partia zostaje zgłoszona jako niezgodna.

3. WERYFIKACJA KATEGORII DANEJ PARTII

3.1. W celu zweryfikowania kategorii danej partii właściwy organ może zwiększyć liczbę próbek pierwotnych pobranych w różnych punktach partii zgodnie z następującą tabelą:







Tabela 3 Liczba próbek pierwotnych uwarunkowana wielkością partii Wielkość partii (w litrach) Liczba próbek pierwotnych mniej niż 7 500 2 od 7 500 do mniej niż 25 000 3 od 25 000 do mniej niż 75 000 4 od 75 000 do mniej niż 125 000 5 równa i większa niż 125 000 6 + 1 na każde 50 000 litrów więcej

Każda próbka jednostkowa stanowiąca próbkę pierwotną musi zostać pobrana z ciągłej części partii; konieczne jest zapisanie miejsca pobrania każdej próbki pierwotnej i jej jednoznaczne zidentyfikowanie.

Tworzenie każdej próbki pierwotnej musi przebiegać zgodnie z procedurami, o których mowa w pkt 1.1 oraz 1.2.

Każdą próbkę pierwotną poddaje się następnie analizom, o których mowa w art. 2 ust. 1.

3.2. Jeżeli jeden z wyników analiz, o których mowa w art. 2 ust. 1, co najmniej jednej próbki pierwotnej jest niezgodny z właściwościami zgłoszonej kategorii oliwy, cała partia pobieranych próbek zostaje zgłoszona jako niezgodna.









ZAŁĄCZNIK Ib

SCHEMAT PODEJMOWANIA DECYZJI, CZY PRÓBKA OLIWY Z OLIWEK JEST ZGODNA ZE ZGŁOSZONĄKATEGORIĄ

Tabela 1

Tabela 2

Tabela 3









Dodatek 1







Tabela równoważności między załącznikami do niniejszego rozporządzenia a analizami określonymi w schemacie podejmowania decyzji — Kwasowość Załącznik II Oznaczanie wolnych kwasów tłuszczowych, metoda na zimno — Liczba nadtlenkowa Załącznik III Oznaczanie liczby nadtlenkowej — Spektrometria UV Załącznik IX Analiza spektrofotometryczna — Ocena organoleptyczna Załącznik XII Ocena organoleptyczna oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia — Estry etylowe Załącznik XX Metoda oznaczania zawartości wosków, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych — 3,5- stigmastadieny Załącznik XVII Metoda oznaczania stigmastadienów w olejach roślinnych ▼M28 — Izomery trans kwasów tłuszczowych Załącznik X Oznaczanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej — Zawartość kwasów tłuszczowych Załącznik X Oznaczanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej ▼M26 — ΔECN42 Załącznik XVIII Oznaczanie składu triglicerydów z ECN42 (różnica między danymi HPLC a zawartością teoretyczną) — Skład i całkowita zawartość steroli — Erytrodiol i uwaol Załącznik V Oznaczanie składu i zawartości steroli i dialkoholi triterpenowych metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych — Woski Załącznik IV Oznaczanie zawartości wosków metodą chromatografii gazowej z użyciem kolumny kapilarnej ▼M28 — Alkohole alifatyczne i triterpenowe Załącznik XIX Oznaczanie zawartości alkoholi alifatycznych i triterpenowych metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych ▼M26 — Kwasy tłuszczowe nasycone w pozycji 2 Załącznik VII Oznaczanie zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu

▼M29









ZAŁĄCZNIK II

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, METODA NA ZIMNO

1. ZAKRES I DZIEDZINA STOSOWANIA

Niniejsza metoda opisuje sposób oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych w oliwie z oliwek i w oliwie z wytłoczyn z oliwek. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych wyrażona jest w postaci kwasowości obliczonej jako procentowa część kwasu oleinowego.

2. ZASADA

Próbkę rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników, a obecne w niej wolne kwasy tłuszczowe miareczkuje przy użyciu roztworu wodorotlenku potasu lub wodorotlenku sodu.

3. ODCZYNNIKI

Stosować wyłącznie odczynniki o uznanej czystości analitycznej i wodę destylowaną lub o równoważnym stopniu czystości.

3.1. Eter dietylowy; etanol 95 % (v/v), mieszanina jednakowych objętościowo części. Zobojętnić dokładnie w momencie stosowania za pomocą roztworu wodorotlenku potasu (3.2) z dodatkiem 0,3 ml roztworu fenoloftaleiny (3.3) na 100 ml mieszaniny. Uwaga 1: Eter dietylowy jest wysoce łatwopalny i może tworzyć wybuchowe nadtlenki. Stosując tę substancję należy zachować szczególną ostrożność. Uwaga 2: Jeśli zastosowanie eteru dietylowego jest niemożliwe, można zastosować mieszaninę rozpuszczalników zawierających etanol i toluen. Jeśli to konieczne, etanol można zastąpić 2-propanolem.

3.2. Wodorotlenek potasu lub wodorotlenek sodu, mianowany roztwór etanolowy lub wodny, c(KOH) [lub c(NaOH)] o stężeniu 0,1 mol/l lub, jeśli konieczne, c(KOH) [lub c(NaOH)] o stężeniu 0,5 mol/l. Roztwory są dostępne w handlu. Przed zastosowaniem należy sprawdzić stężenie roztworu wodorotlenku potasu (lub roztworu wodorotlenku sodu). Stosować roztwór przygotowany co najmniej pięć dni przed użyciem i zdekantowany do butelki z brązowego szkła z gumowym korkiem. Roztwór powinien być bezbarwny lub mieć barwę słomkową. Jeśli doszło do rozdziału faz przy zastosowaniu wodnego roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu), należy zastąpić roztwór wodny roztworem etanolowym. Uwaga 3: Stabilny bezbarwny roztwór wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) można przygotować w następujący sposób: doprowadzić do wrzenia 1 000 ml etanolu lub wody z 8 g wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) i 0,5 g opiłków aluminiowych i gotować pod chłodnicą zwrotną przez godzinę. Następnie poddać bezzwłocznie destylacji. Rozpuścić w destylacie wymaganą ilość wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu). Odstawić na kilka dni, a następnie zdekantować klarowną warstwę cieczy znad osadu węglanu potasu (lub węglanu sodu). Roztwór można także przygotować z pominięciem procesu destylacji w następujący sposób: do 1 000 ml etanolu (lub wody) dodać 4 ml butanolanu glinu i odstawić mieszaninę na kilka dni. Zdekantować znad osadu klarowną ciecz i rozpuścić w niej wymaganą ilość wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu). Roztwór jest gotowy do użycia.

3.3. Fenoloftaleina, roztwór 10 g/l w 95–96 % etanolu (v/v) lub błękit alkaliczny 6B lub tymoloftaleina, roztwór 20 g/l w 95–96 % etanolu (v/v). W przypadku silnie zabarwionych olejów należy stosować błękit alkaliczny lub tymoloftaleinę.

4. APARATURA

Normalnie stosowany sprzęt laboratoryjny, w tym:

4.1. waga analityczna;

4.2. kolba stożkowa o pojemności 250 ml;

4.3. biureta na 10 ml, klasa A, skalowana co 0,05 ml lub równoważna biureta automatyczna.

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie próbki do badań

Jeśli próbka jest mętna, należy ją przefiltrować.

5.2. Porcja badana

W zależności od zakładanej kwasowości pobierać próbkę według poniższej tabeli:







Przewidywana kwasowość (w przeliczeniu na kwas oleinowy g/100 g) Masa próbki (g) Dokładność ważenia (g) 0 do 2 10 0,02 > 2 do 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0,001

Próbkę należy ważyć w kolbie stożkowej (4.2).

5.3. Oznaczanie

Rozpuścić próbkę (5.2) w 50 do 100 ml poprzednio zobojętnionej mieszaniny eteru dietylowego i etanolu (3.1).

Miareczkować mieszając z 0,1 mol/l roztworem wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) (3.2) (zob. Uwaga 4), dopóki nie nastąpi zmiana barwy wskaźnika (zabarwienie wskaźnika utrzymuje się co najmniej przez 10 sekund).

Uwaga 4: Jeżeli wymagana ilość 0,1-molowego wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) przekracza 10 ml, należy zastosować roztwór 0,5 mol/l lub zmienić masę próbki w zależności od przewidywanej wolnej kwasowości i przedstawionej tabeli.

Uwaga 5: Jeżeli w trakcie miareczkowania rozwór zaczyna mętnieć, należy dodać dostateczną ilość rozpuszczalników (3.1), aby uzyskać klarowny roztwór.

Należy wykonać drugie oznaczenie jedynie wówczas, gdy rezultat pierwszego oznaczenia jest wyższy niż limit określony dla danej kategorii oliwy.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

Kwasowość wyrażona jako procent masowy kwasu oleinowego wynosi:

gdzie:

V = objętość użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) w mililitrach;

c = dokładne stężenie molowe użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu);

M = 282 g/mol, molowa masa w gramach na mol kwasu oleinowego;

m = masa próbki w gramach.

Kwasowość oleju podaje się następująco:

a) do drugiego miejsca po przecinku dla wartości od 0 do 1 włącznie;

b) do pierwszego miejsca po przecinku dla wartości od 1 do 100 włącznie.

▼M30









ZAŁĄCZNIK III

OZNACZANIE LICZBY NADTLENKOWEJ

1. Zakres

W niniejszym załączniku opisano metodę oznaczania liczby nadtlenkowej olejów i tłuszczów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego.

2. Definicja

Liczba nadtlenkowa to zawartość w próbce substancji, które utleniają jodek potasu w opisanych warunkach technologicznych, wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram.

3. Zasada

Poddanie badanej części próbki działaniu roztworu jodku potasu w roztworze kwasu octowego i chloroformu. Miareczkowanie uwolnionego jodu mianowanym roztworem tiosiarczanu sodu.

4. Aparatura

W użytym sprzęcie nie mogą występować substancje redukujące lub utleniające.

Uwaga 1: Nie pokrywać tłuszczem powierzchni szlifowanych.

4.1. Łyżka szklana o pojemności 3 ml.

4.2. Kolby stożkowe ze szlifowanymi szyjkami i korkami o pojemności około 250 ml, wcześniej wysuszone i napełnione czystym, suchym gazem obojętnym (azotem lub najlepiej ditlenkiem węgla).

4.3. Biureta o pojemności 5, 10 lub 25 ml, wyskalowana co najmniej co 0,05 ml, najlepiej z automatycznym nastawianiem zera, lub równoważna biureta automatyczna.

4.4. Waga analityczna.

5. Odczynniki

5.1. Chloroform o jakości wymaganej dla odczynników laboratoryjnych, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przez niego silnego strumienia czystego, suchego gazu obojętnego.

5.2. Kwas octowy lodowaty o jakości wymaganej dla odczynników laboratoryjnych, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przez niego silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

5.3. Jodek potasu w postaci nasyconego roztworu wodnego, świeżo przygotowany, niezawierający jodu i jodanów. Rozpuścić około 14 g jodku potasu w około 10 ml wody o temperaturze pokojowej.

5.4. Wodny roztwór tiosiarczanu sodu, 0,01 mol/l (równoważny z 0,01 N) o dokładnie nastawionym mianie; miano należy nastawić tuż przed zastosowaniem.

Tego samego dnia przed użyciem roztworu przygotować świeży roztwór tiosiarczanu sodu 0,01 mol/l z mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l, lub ustalić dokładne stężenie molowe. Doświadczenie pokazuje, że stabilność jest ograniczona i zależy od wartości pH i zawartości wolnego ditlenku węgla. Do rozcieńczania stosować wyłącznie świeżo przegotowaną wodę, najlepiej przepłukaną azotem.

W celu określenia dokładnego stężenia molowego roztworu tiosiarczanu sodu zalecana jest następująca procedura:

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, od 0,27 do 0,33 g jodanu potasu (mKIO3) do kolby miarowej (250 ml lub 500 ml) i rozcieńczyć, napełniając do kreski świeżo przegotowaną wodą (V2), schłodzoną do temperatury pokojowej. Za pomocą pipety przenieść 5 ml lub 10 ml tego roztworu jodanu potasu (V1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 60 ml świeżo przegotowanej wody, 5 ml kwasu chlorowodorowego 4 mol/l oraz od 25 do 50 mg jodku potasu lub 0,5 ml nasyconego roztworu jodku potasu. Miareczkować roztwór przy użyciu roztworu tiosiarczanu sodu (V3) w celu określenia dokładnego stężenia molowego roztworu tiosiarczanu sodu.

gdzie:

mKIO3 – masa jodanu potasu, w g;

V1 – objętość roztworu jodanu potasu, w ml (5 lub 10 ml);

V2 – całkowita objętość roztworu jodanu potasu, w ml (250 lub 500 ml);

V3 – objętość roztworu tiosiarczanu sodu, w ml;

wKIO3 – czystość jodanu potasu, w g/100 g;

MKIO3 – masa cząsteczkowa jodanu potasu (214 g/mol);

T – dokładne stężenie molowe roztworu tiosiarczanu sodu (mol/l);

5.5. Wodny roztwór skrobi o stężeniu 10 g/l, świeżo przygotowany z naturalnej rozpuszczalnej skrobi. Można również zastosować równoważne odczynniki.

6. Próbka

Należy zadbać, aby próbka była pobrana i składowana w ciemnym i chłodnym miejscu, w całkowicie napełnionych szklanych pojemnikach, zamkniętych hermetycznie zatyczkami szklanymi szlifowanymi lub z korka.

7. Procedura

Badanie wykonuje się w rozproszonym świetle dziennym lub w świetle sztucznym. Odważyć szklaną łyżką (4.1) lub, w przypadku jej braku, w kolbie (4.2) z dokładnością do 0,001 g masę próbki według poniższej tabeli stosownie do przewidywanej liczby nadtlenkowej:







Przewidywana liczba nadtlenkowa (meq) Masa naważki (g) 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

Wyjąć korek z kolby (4.2) i wprowadzić do niej szklaną łyżkę z naważką. Dodać 10 ml chloroformu (5.1). Szybko rozpuścić badaną próbkę mieszając. Dodać 15 ml kwasu octowego (5.2), a następnie 1 ml roztworu jodku potasu (5.3). Szybko zakorkować kolbę, wstrząsać przez jedną minutę i pozostawić dokładnie na pięć minut w nieoświetlonym miejscu o temperaturze od 15 do 25 °C.

Dodać około 75 ml wody destylowanej. Miareczkować uwolniony jod roztworem tiosiarczanu sodu (5.4) intensywnie wstrząsając, używając jako wskaźnika roztworu skrobi (5.5).

Przeprowadzić dwa oznaczenia tej samej próbki analitycznej.

Jednocześnie przeprowadzić ślepą próbę. Jeżeli wynik ślepej próby przekracza 0,05 ml w roztworze 0,01 mol/l tiosiarczanu sodu (5.4), wymienić zanieczyszczone odczynniki.

8. Wyrażenie wyników

Liczba nadtlenkowa (LN) wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram określana jest wzorem:

gdzie:

V = ilość ml mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu (5.4) użytego w badaniu, skorygowana w celu uwzględnienia ślepej próby;

T = dokładne stężenie molowe użytego roztworu tiosiarczanu sodu (5.4), w mol/l;

m = masa naważki w g;

Jako wynik przyjąć średnią arytmetyczną dwóch oznaczeń.

Informować o wyniku z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

▼M21









ZAŁĄCZNIK IV

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WOSKÓW METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ

1. CEL

Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości wosków w oliwie z oliwek. Woski rozdziela się w zależności od liczby atomów węgla. Metodę można w szczególności stosować do rozróżniania oliwy z oliwek uzyskanej z tłoczenia od oliwy z oliwek uzyskanej z ekstrakcji (oliwy z wytłoczyn).

2. ZASADA

Dodanie odpowiedniego wzorca wewnętrznego do tłuszczu, następnie frakcjonowanie metodą chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym, odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą chromatografii gazowej z użyciem kolumny kapilarnej.

3. MATERIAŁY

3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2. Szklana kolumna do chromatografii gazowej, średnica wewnętrzna 15,0 mm, wysokość 30–40 cm, wyposażona w kranik.

3.3. Odpowiedni chromatograf gazowy z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z: 3.3.1. komory z termostatem do kolumn, wyposażonej w programator temperatury; 3.3.2. zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny; 3.3.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera-wzmacniacza; 3.3.4. rejestrującego integratora współpracującego z konwerterem-wzmacniaczem (3.3.3), o szybkości odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru. (Można również zastosować systemy informatyczne przewidujące uzyskiwanie danych z chromatografii gazowej przy użyciu komputera osobistego); 3.3.5. Kolumny kapilarnej, ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m, średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokrytej od środka płynem rozdzielającym, o jednolitej grubości 010–0,30 μm. (Płyny rozdzielające nadające się do użycia typu SE52 lub SE 54, dostępne w handlu).

3.4. Mikrostrzykawka umożliwiająca bezpośrednie wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni.

3.5. Wibrator elektryczny.

3.6. Wyparka rotacyjna.

3.7. Piec muflowy.

3.8. Waga analityczna zapewniająca precyzję pomiaru ± 0,1 mg.

3.9. Zwykłe szkło laboratoryjne.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 60 do 200 μm. Żel krzemionkowy należy umieścić w piecu w temperaturze 500 °C na co najmniej 4 godziny. Schłodzić, następnie dodać 2 % wody względem ilości pobranego żelu krzemionkowego. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny. Trzymać w zaciemnionym miejscu przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2. n-heksan, do chromatografii.

4.3. Eter etylowy, do chromatografii.

4.4. n-heptan, do chromatografii.

4.5. Roztwór wzorca arachidynianu laurylowego o stężeniu 0,1 % (m/V) w heksanie (wzorzec wewnętrzny). (Można również zastosować palmitynian palmitylu lub stearynian mirystylu). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenylo-azo-2-naftol).

4.6. Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej.

4.7. Gazy pomocnicze: — czysty wodór, do chromatografii gazowej, — czyste powietrze, do chromatografii gazowej.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie kolumny chromatograficznej

Sporządzić zawiesinę 15 g żelu krzemionkowego (4.1) w n-heksanie (4.2) i wprowadzić do kolumny (3.2). Po spontanicznym wytrącaniu osadu zakończyć ten proces przy użyciu wytrząsarki elektrycznej (3.5), tak aby warstwa chromatograficzna była bardziej jednolita. Przesączyć 30 ml n-heksanu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Odważyć dokładnie, przy użyciu wagi (3.8), 500 mg próbki do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i dodać właściwą ilość wzorca wewnętrznego (4.5), zależnie od przypuszczalnej zawartości wosków. Dodać na przykład 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek i 0,25–0,5 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn oliwek. Do tak przygotowanej próbki dodać dwie porcje po 2 ml n-heksanu (4.2) i przenieść do kolumny chromatograficznej.

Wprowadzić próbkę, tak aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu, następnie przesączyć dodatkowych 70 ml n-heksanu, tak aby usunąć naturalnie obecne n-alkany. Rozpocząć wymywanie chromatograficzne, pobierając 180 ml mieszaniny n-heksanu/eteru etylowego w proporcji 99/1, przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund. Wymywanie próbki należy prowadzić w temperaturze pokojowej 22 °C ± 4.

Uwagi:

— Mieszaninę n-heksanu/eteru etylowego (99/1) należy przygotowywać codziennie.

— W celu wzrokowego skontrolowania prawidłowości wymywania wosków można dodać do próbki 100 μl roztworu 1 % Sudanu w mieszaninie wymywającej. Ponieważ wartość retencji tego barwnika jest pośrednia pomiędzy wartościami retencji wosków i triglicerydów, należy zatrzymać wymywanie, gdy barwnik dotrze do dna kolumny chromatograficznej, ponieważ wszystkie woski zostały już wymyte.

Otrzymaną w ten sposób frakcję suszy się w wyparce rotacyjnej (3.6) aż do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usuwa się ostatnie 2 ml rozpuszczalnika przy użyciu słabego strumienia azotu; a następnie dodaje 2–4 ml n-heptanu.

5.2. Analiza metodą chromatografii gazowej

5.2.1. Procedura wstępna

Umieścić kolumnę w chromatografie gazowym (3.3), łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Wykonać ogólne kontrole aparatury do chromatografii gazowej (działanie pętli gazowych, sprawność detektora i systemu rejestracyjnego itp.).

Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowej. Stopniowo podgrzewać do uzyskania, po około 4 godzinach, temperatury 350 °C. Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (zadać natężenie przepływu gazu, zapalić płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego (3.3.4), ustawić temperaturę komory kolumny, detektora itd.) oraz rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość przewidziana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików, i linia ta nie powinna wykazywać nachylenia.

Prostoliniowe, ujemne nachylenie linii wskazuje na to, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została poddana wystarczającemu kondycjonowaniu.

5.2.2. Dobór warunków roboczych

Ogólnie należy przestrzegać następujących warunków roboczych:

— temperatura kolumny: —



20 °C/minutę 5 °C/minutę 20 °C/minutę początkowa 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detektora: 350 °C,

— porcja wstrzykiwana: 1 μl roztworu (2–4 ml) n-heptanu,

— gaz nośny: hel lub wodór z szybkością liniową optymalną dla wybranego gazu (patrz: dodatek),

— czułość urządzenia: taka, aby były spełnione warunki określone poniżej:

Warunki te mogą być modyfikowane w sposób dostosowany do charakterystyk kolumn i aparatów do chromatografii gazowej, tak aby uzyskano oddzielenie wszystkich wosków i zadowalającą rozdzielczość pików (patrz: rysunek), przy czym czas retencji wzorca wewnętrznego C32 powinien wynosić 18 ± 3 minut. Pik najbardziej reprezentatywny dla wosków musi mierzyć co najmniej 60 % od dołu skali.

Ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pól powierzchni rozpatrywanych pików.

Uwaga: Ze względu na wysoką temperaturę końcową przyjmuje się dodatnie nachylenie, które nie może przekraczać 10 % od dołu skali.

5.3. Przeprowadzenie analizy

Pobrać 1 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl; odciągnąć tłoczek, aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do układu nastrzykowego i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po upływie około 5 sekund powoli wyciągnąć igłę.

Przeprowadzić rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków.

Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania.

5.4. Identyfikacja pików

Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach.

Rysunek przedstawia chromatogram wosków oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.

5.5. Analiza ilościowa

Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu i estrom alifatycznym od C40 do C46.

Obliczyć zawartość wosków każdego z estrów, w mg/kg tłuszczu, zgodnie ze wzorem:

gdzie:

Ax = pole pod pikiem każdego estru, w milimetrach kwadratowych;

As = pole pod pikiem wzorca wewnętrznego, w milimetrach kwadratowych;

ms = masa dodanego wzorca wewnętrznego, w miligramach;

m = masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

Podać zawartość poszczególnych wosków od C40 do C46, w mg/kg tłuszczu (ppm).

Uwaga:Oznaczane składniki odpowiadają pikom o liczbie par węglowych zawartych pomiędzy estrami C40 a C46, zgodnie z przykładowym chromatogramem wosków oliwy z oliwek przedstawionym na rysunku poniżej. Jeżeli ester C46 pojawi się podwójnie, w celu jego identyfikacji zaleca się analizę frakcji wosków oliwy z wytłoczyn oliwek, gdzie C46 łatwo jest zidentyfikować, ponieważ wykazuje wyraźną przewagę ilościową.

Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Rysunek

Chromatogram wosków oliwy z oliwek ( 9 )

Objaśnienie:

I.S. = Arachidynian laurylowy

1 = Estry diterpenowe

2 + 2′ = Estry C40

3 + 3′ = Estry C42

4 + 4′ = Estry C44

5. = Estry C46

6 = Estry steroli i alkohole triterpenowe.









Dodatek

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze wprowadzić 1–3 μl metanu (lub propanu). Mierzyć chronometrem czas potrzebny na przejście gazu przez kolumnę, począwszy od momentu wstrzyknięcia do spadku wartości szczytowej (tM).

Prędkość liniowa, w cm/s, jest określona na podstawie wzoru L/tM, gdzie L jest długością kolumny w centymetrach, a tM – czasem zmierzonym w sekundach.

▼M26









ZAŁĄCZNIK V

OZNACZENIA SKŁADU I ZAWARTOŚCI STEROLI I DIALKOHOLI TRITERPENOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH

1. ZAKRES

W ramach metody opisuje się sposoby oznaczania zawartości prostych i łącznych steroli oraz dialkoholi triterpenowych w oliwie z oliwek i oliwie z wytłoczyn z oliwek.

2. ZASADA

Oliwa, do której dodano α-cholestanol, pełniąca rolę wewnętrznego wzorca, jest zmydlana roztworem wodorotlenku potasu w etanolu, a następnie substancja niezmydlająca się jest ekstrahowana eterem dietylowym.

Frakcje steroli i frakcja dialkoholi triterpenowych są oddzielane od substancji niezmydlającej się metodą chromatografii cienkowarstwowej na podstawowej płytce z żelu krzemionkowego. Frakcje uzyskane z żelu krzemionkowego przekształcane są w trimetylsilyletery i następnie poddawane analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

3. APARATURA

Typowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności następujące urządzenia:

3.1. Kolba o pojemności 250 ml wyposażona w chłodnicę zwrotną ze szlifem szklanym.

3.2. Rozdzielacz o pojemności 500 ml.

3.3. Kolby o pojemności 250 ml.

3.4. Kompletny zestaw aparatury do analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej łącznie z płytkami szklanymi 20 × 20.

3.5. Źródło światła ultrafioletowego o długości fal 254 lub 366 nm.

3.6. Mikrostrzykawki o pojemności 100 i 500 μl.

3.7. Cylindryczny lejek do sączenia z porowatą przegrodą G3 (porowatość 15–40 μm) o średnicy około 2 cm i głębokości 5 cm, przystosowany do filtracji w próżni i ze szlifem szklanym zewnętrznym.

3.8. Kolba stożkowa próżniowa o pojemności 50 ml ze szlifem szklanym wewnętrznym, którą można połączyć z lejkiem do sączenia (pkt 3.7).

3.9. Probówka o pojemności 10 ml z lejkowatym dnem i szczelnym korkiem szklanym.

3.10. Chromatograf gazowy współpracujący z kolumną kapilarną z systemem rozdziału strumienia, składający się z:

3.10.1. komory termostatycznej do kolumn w celu utrzymania wymaganej temperatury z dokładnością do ± 1 °C;

3.10.2. regulowanego termostatem zespołu dozowania z otworem wytryskowym ze szkła krzemowanego i z systemem rozdziału strumienia;

3.10.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID);

3.10.4. systemu gromadzenia danych współpracującego z detektorem FID (pkt 3.10.3.), z możliwością całkowania ręcznego.

3.11. Kolumna kapilarna wypełniona żelem krzemionkowym o długości 20–30 m, o wewnętrznej średnicy 0,25–0,32 mm, pokryta w 5 % difenylem i w 95 % dimetylopolisiloksanem (faza stacjonarna SE-52 lub SE-54 lub podobna), o jednakowej grubości wynoszącej 0,10–0,30 μm.

3.12. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl przeznaczona do chromatografii gazowej z umocowaną na stałe igłą do rozdzielania strumienia.

3.13. Eksykator z chlorkiem wapnia.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Minimalne miano roztworu wodorotlenku potasu 85 %.

4.2. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 2 mol/l.

Rozpuścić 130 g wodorotlenku potasu (pkt 4.1), jednocześnie schładzając, w 200 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (pkt 4.10). Roztwór przechowywać w dobrze zakorkowanej butelce z ciemnego szkła przez maksymalnie dwa dni.

4.3. Eter dietylowy do analiz.

4.4. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 0,2 mol/l.

Rozpuścić 13 g wodorotlenku potasu (pkt 4.1) w 20 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (pkt 4.10).

4.5. Bezwodny siarczan sodu do analiz.

4.6. Płytki szklane (20 × 20 cm) pokryte żelem krzemionkowym nie zawierającym wskaźnika fluorescencyjnego o grubości 0,25 mm (dostępne w handlu w postaci gotowej do użytku).

4.7. Toluilen do chromatografii.

4.8. Aceton do chromatografii.

4.9. n-heksan do chromatografii.

4.10. Eter dietylowy do chromatografii.

4.11. Etanol do analiz.

4.12. Octan etylu do analiz.

4.13. Roztwór porównawczy stosowany w chromatografii cienkowarstwowej: roztwór cholesterolu lub fitosterolu i erytrodiolu w octanie etylu o stężeniu 5 % (pkt 4.11).

4.14. 0,2 % roztwór 2,7-dichlorofluorosceiny w etanolu. Roztwór ten uzyskuje nieco zasadowy charakter w wyniku dodania kilku kropli 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w alkoholu (pkt 4.2).

4.15. Bezwodnik pirydyny do chromatografii (zob. uwaga 5).

4.16. Heksametyldizylazyna do analiz.

4.17. Trimetylchlorosilan do analiz.

4.18. Roztwory próbek eterów trimetylosilanowych steroli.

Należy je przygotować tuż przed użyciem ze steroli i erytrodiolu uzyskanych z zawierających je olejów.

4.19. α-cholestanol o czystości większej niż 99 % (czystość należy sprawdzać metodą analizy GC).

4.20. 0,2 % wewnętrzny roztwór wzorcowy (m/V) α-cholestanolu w octanie etylu (pkt 4.11).

4.21. Roztwór fenoloftaleiny, 10 g/l w etanolu (pkt 4.10).

4.22. Gaz nośny: czysty wodór lub hel do celów chromatografii gazowej.

4.23. Gazy pomocnicze: Czysty wodór, hel, azot i powietrze do celów chromatografii gazowej.

4.24. Mieszanina n-heksanu (pkt 4.9)/eteru dietylowego (pkt 4.10) w proporcji 65:35 (V/V).

4.25. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania składający się z mieszaniny pirydyny/heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu w proporcji 9:3:1 (V/V/V).

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie substancji niezmydlającej się. 5.1.1. Do kolby o pojemności 250 ml (pkt 3.1) wprowadzić przy użyciu mikrostrzykawki o pojemności 500 μl (pkt 3.6) pewną ilość wewnętrznego roztworu wzorcowego α-cholestanolu (pkt 4.20) zawierającą ilość cholestanolu odpowiadającą w przybliżeniu 10 % steroli w próbce. Na przykład w przypadku próbki zawierającej 5 g oliwy z oliwek dodać 500 μl roztworu α-cholestanolu (pkt 4.20), a w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek 1 500 μl. Odparować do wysuszenia pod słabym strumieniem azotu w łaźni wypełnionej ciepłą wodą, następnie po schłodzeniu kolby odważyć 5 ± 0,01 g suchej przefiltrowanej próbki w tej samej kolbie. Uwaga 1: w przypadku zwierzęcych lub roślinnych olejów i tłuszczów zawierających znaczne ilości cholesterolu może wystąpić pik o czasie retencji zbliżonym do cholestanolu. W takich sytuacjach należy dokonać analizy frakcji steroli z dodaniem wewnętrznego wzorca i bez dodawania go. 5.1.2. Dodać 50 ml 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w etanolu (pkt 4.2) i niewielką ilość kamienia pumeksowego, uruchomić chłodnicę zwrotną i podgrzać do momentu lekkiego wrzenia aż nastąpi zmydlenie (roztwór stanie się przejrzysty). Kontynuować podgrzewanie przez dalsze 20 minut, następnie wprowadzić 50 ml wody destylowanej od strony wylotu chłodnicy, odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury około 30 °C. 5.1.3. Przenieść zawartość kolby ilościowo do rozdzielacza o pojemności 500 ml (pkt 3.2), używając kilku porcji wody destylowanej (50 ml). Dodać około 80 ml eteru dietylowego (pkt 4.10), mieszać energicznie przez około 60 sekund, obniżając okresowo ciśnienie przez przełączenie rozdzielacza i otwarcie zaworu odcinającego. Odstawić do całkowitego rozdzielenia się dwóch faz (uwaga 2). Następnie do drugiego rozdzielacza zebrać jak najdokładniej roztwór mydła. Przeprowadzić jeszcze dwie ekstrakcje na fazie wodno-alkoholowej w ten sam sposób przy użyciu 60–70 ml eteru dietylowego (pkt 4.10). Uwaga 2: emulsję można wyeliminować, dodając niewielkie ilości etanolu (pkt 4.11). 5.1.4. Połączyć wszystkie trzy eterowe ekstrakty w jednym rozdzielaczu zawierającym 50 ml wody. Przemywać nadal wodą (50 ml), aż woda przestanie barwić się na różowy kolor po dodaniu kropli roztworu fenoloftaleiny (pkt 4.21). Po usunięciu wody popłucznej przefiltrować przez bezwodny siarczan sodu (pkt 4.5) do wcześniej zważonej kolby o pojemności 250 ml, płucząc rozdzielacz i filtr niewielkimi ilościami eteru dietylowego (pkt 4.10). 5.1.5. Odparować rozpuszczalnik przez destylację przy użyciu wyparki obrotowej w temperaturze 30 °C w próżni. Dodać 5 ml acetonu i usunąć całkowicie lotny rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem powietrza. Suszyć pozostałość w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C przez 15 minut. Schłodzić w eksykatorze i zważyć z dokładnością do 0,1 mg.

5.2. Oddzielenie frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych (erytrodiol + uwaol) 5.2.1. Przygotowanie podstawowych płytek do chromatografii cienkowarstwowej Zanurzyć płytki z żelu krzemionkowego (pkt 4.6) na głębokość około 4 cm w 0,2 mol/l roztworze wodorotlenku potasu w etanolu (pkt 4.5) na 10 sekund, następnie suszyć je w dygestorium przez dwie godziny i na koniec umieścić w piecu nagrzanym do temperatury 100 °C na godzinę. Wyjąć z pieca i umieścić w eksykatorze z chlorkiem wapnia (pkt 3.13) aż do czasu ich użycia (płytki poddane takiej obróbce powinny być wykorzystane w ciągu 15 dni). Uwaga 3: w przypadku stosowania podstawowych płytek z żelu krzemionkowego do oddzielania frakcji steroli nie ma potrzeby poddawania frakcji niezmydlającej się działaniu tlenku glinu. W ten sposób wszystkie związki o charakterze kwasowym (kwasy tłuszczowe i inne) zatrzymują się na linii początkowej, a pasmo steroli jest wyraźnie oddzielone od pasma alkoholi alifatycznych i triterpenowych. 5.2.2. Napełnić komorę chromatograficzną mieszaniną heksanu i eteru dietylowego (pkt 4.24) (uwaga 4) do poziomu około 1 cm. Zamknąć komorę odpowiednią pokrywą i pozostawić na co najmniej godzinę w chłodnym miejscu w celu uzyskania równowagi układu ciecz-para; na wewnętrznych powierzchniach komory można umieścić paski bibuły filtracyjnej zanurzone w eluencie. Pozwala to skrócić o około jedną trzecią czas przemieszczenia linii cieczy i uzyskać bardziej jednorodną i regularną elucję składników. Uwaga 4: przy każdej analizie należy wymienić mieszaninę rozwijającą w celu uzyskania idealnie odtwarzalnych warunków elucji, zamiennie można stosować rozpuszczalnik w postaci mieszaniny n-heksanu i eteru dietylowego w proporcji 50:50 (V/V). 5.2.3. Przygotować roztwór substancji niezmydlającej się (pkt 5.1.5) w octanie etylu (pkt 4.12) o stężeniu około 5 % i za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 100 μl nanieść 0,3 ml roztworu w postaci wąskiego i jednolitego pasma na dolnej części płytki chromatograficznej (pkt 5.2.1) w odległości 2 cm od dolnej krawędzi. Na linii pasma nanieść 2–3 μl roztworu porównawczego (pkt 4.13) w celu identyfikacji pasma steroli i dialkoholi triterpenowych po rozwinięciu. 5.2.4. Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej przygotowanej w sposób opisany w pkt 5.2.2. Temperaturę otoczenia należy utrzymywać w granicach 15–20 °C (uwaga 5). Bezzwłocznie zakryć komorę pokrywą i pozostawić w celu elucji składników aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość około 1 cm od górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę z komory chromatograficznej i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza lub umieścić w tym celu płytkę na chwilę w dygestorium. Uwaga 5: wyższa temperatura mogłaby utrudniać oddzielenie. 5.2.5. Spryskać płytkę lekko i równomiernie roztworem 2,7-dichlorofluorosceiny (pkt 4.14) i pozostawić do wyschnięcia. Obserwując płytkę w świetle ultrafioletowym, pasma steroli i dialkoholi triterpenowych można zidentyfikować, przyrównując je do plamek uzyskanych za pomocą roztworu porównawczego (pkt 4.13). Zaznaczyć czarnym ołówkiem granice pasm wzdłuż krawędzi fluoryzujących (zob. wykres 3 dotyczący płytki TLC). 5.2.6. Za pomocą metalowej szpatułki zeskrobać żel krzemionkowy z zaznaczonego obszaru. Usunięty i dokładnie rozdrobniony materiał przenieść do lejka do sączenia (pkt 3.7). Dodać 10 ml gorącego octanu etylu (pkt 4.12), ostrożnie wymieszać za pomocą metalowej szpatułki i przefiltrować w próżni, zbierając filtrat do kolby stożkowej (pkt 3.8) połączonej z lejkiem do sączenia. Pozostałość na filtrze przepłukać trzykrotnie eterem dietylowym (pkt 4.3) (około 10 ml przy każdym płukaniu), zbierając filtrat do tej samej kolby połączonej z lejkiem, odparować filtrat do objętości 4–5 ml, przelać pozostały roztwór do zważonej wcześniej probówki o pojemności 10 ml (pkt 3.9), wysuszyć poprzez lekkie podgrzewanie w delikatnym strumieniu azotu, rozpuścić jeszcze raz kilkoma kroplami acetonu (pkt 4.8), ponownie wysuszyć. Pozostałość znajdująca się w probówce to frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych.

5.3. Przygotowanie trimetylsilyloeterów 5.3.1. Do probówki zawierającej frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych dodać odczynnik wywołujący reakcję sililowania (pkt 4.25) (uwaga 6) w ilości 50 μl na każdy miligram steroli i dialkoholi triterpenowych, w sposób pozwalający uniknąć wchłaniania wilgoci (uwaga 7). Uwaga 6: w handlu dostępne są gotowe roztwory. Inne odczynniki sililujące, takie jak na przykład bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylochlorosilanu, który musi zostać wymieszany z taką samą ilością bezwodnika pirydyny, również są dostępne. Pirydynę można zastąpić taką samą ilością acetonitrylu. 5.3.2. Zamknąć probówkę korkiem i ostrożnie wstrząsać (bez odwracania) aż do całkowitego rozpuszczenia się związków. Pozostawić na co najmniej 15 minut w temperaturze otoczenia, a następnie wirować przez kilka minut. Przejrzysty roztwór można poddać analizie metodą chromatografii gazowej. Uwaga 7: pojawienie się lekkiej opalizacji jest zjawiskiem normalnym i nie stanowi żadnej nieprawidłowości. Pojawienie się białej zawiesiny lub różowego koloru wskazuje na obecność wilgoci w odczynniku lub pogorszenie jego jakości. W takich przypadkach badanie należy powtórzyć (tylko w przypadku zastosowania heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu).

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej 5.4.1. Czynności wstępne, przygotowanie kolumn kapilarnych 5.4.1.1. Osadzić kolumnę (pkt 3.11) w chromatografie gazowym, podłączając końcówkę wlotową do dozownika z rozdziałem strumienia, a końcówkę wylotową do detektora. Dokonać ogólnych kontroli zespołu chromatografu gazowego (szczelność układu zasilania gazem, wydajność detektora, wydajność systemu dzielenia strumienia i systemu zapisu itd.) 5.4.1.2. Jeżeli kolumna zostaje użyta po raz pierwszy, zaleca się jej przygotowanie: przepuścić powoli przez kolumnę strumień gazu, następnie włączyć zespół chromatografu gazowego i rozpocząć stopniowe podgrzewanie do temperatury co najmniej 20 °C powyżej temperatury roboczej (uwaga 8). Utrzymywać taką temperaturę przez co najmniej dwie godziny, następnie ustawić zespół w trybie pracy (regulacja strumienia gazu i układu rozdzielania, zapalenie płomienia, połączenie z systemem obliczeniowymi, regulacja temperatury kolumny, detektora i dozownika itd.), a następnie rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwa razy większą niż przewidziana czułość analizy. Przebieg linii podstawowej musi mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików i bez przesunięcia. Ujemne przesunięcie prostej linii wskazuje na nieszczelność połączeń kolumn; przesunięcie dodatnie wskazuje na niedostateczne przygotowanie kolumny. Uwaga 8: temperatura przygotowania kolumn musi zawsze być co najmniej o 20 °C niższa niż maksymalna temperatura określona dla fazy stacjonarnej. 5.4.2. Dobór warunków roboczych 5.4.2.1. Warunki robocze są następujące: — temperatura kolumny: 260 ± 5 °C; — temperatura dozownika: 280–300 °C; — temperatura detektora: 280–300 °C; — prędkość liniowa gazu nośnego: hel 20–35 cm/s; wodór 30–50 cm/s; — stosunek rozdziału strumienia: 1:50–1:100; — czułość przyrządów: 4–16 razy minimalne tłumienie; — czułość rejestratora: 1–2 mV w pełnej skali; — ilość wprowadzonej substancji: 0,5–1 μl roztworu TMSE. Warunki te mogą być zmieniane zgodnie z charakterystyką kolumny i chromatografu gazowego w celu uzyskiwania chromatogramów spełniających następujące wymogi: — czas retencji w przypadku piku ß-sitosterolu powinien wynosić 20 ± 5 min; — pik kampesterolu powinien wynosić: w przypadku oliwy z oliwek (średnia zawartość 3 %) 20 ± 5 % w pełnej skali; w przypadku oleju sojowego (średnia zawartość 20 %) 80 ± 10 % w pełnej skali; — Należy oddzielić wszystkie występujące sterole. Oprócz całkowitego oddzielenia od siebie piki muszą także całkowicie rozdzielone, co oznacza, że wykres piku musi łączyć się z linią podstawową, zanim przejdzie w następny pik. Niepełna rozdzielczość jest jednak tolerowana, pod warunkiem że pik w punkcie RRT 1,02 (sitostanol) może zostać oznaczony ilościowo na podstawie linii prostopadłej. 5.4.3. Procedura analityczna 5.4.3.1. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl pobrać 1 μl heksanu, zassać 0,5 μl powietrza i następnie 0,5–1 μl roztworu próbki. Pociągnąć dalej tłoczek w celu opróżnienia igły. Wprowadzić igłę przez membranę dozownika i po jednej, dwóch sekundach szybko wstrzyknąć, a następnie powoli wyjąć igłę po około pięciu sekundach. Można zastosować także dozownik automatyczny. 5.4.3.2. Prowadzić rejestrację do całkowitego wyeluowania TMSE obecnych w próbce dialkoholi triterpenowych. Linia podstawowa powinna nadal spełniać wymogi (pkt 5.4.1.2). 5.4.4. Identyfikacja pików Zidentyfikować poszczególne piki na podstawie czasów retencji oraz przez porównanie z mieszaniną steroli i TMSE dialkoholi triterpenowych poddanych analizie w takich samych warunkach (zob. dodatek). Sterole i dialkohole triterpenowe podlegają elucji w następującej kolejności: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-awenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-awenasterol, erytrodiol i uwaol. Czasy retencji ß-sitosterolu na kolumnach SE-52 i SE-54 przedstawione są w tabeli 1. Na rysunkach 1 i 2 przedstawione są typowe chromatogramy niektórych rodzajów oliwy. 5.4.5. Ocena ilościowa 5.4.5.1. Obliczyć powierzchnie pików α-cholestanolu i steroli oraz dialkoholi triterpenowych za pomocą systemu obliczeniowego. Pominąć związki, które nie są ujęte w tabeli 1 (nie należy uwzględniać w obliczeniach ergosterolu). Współczynnik odpowiedzi w przypadku α-cholestanolu przyjmuje się jako równy 1. 5.4.5.2. Obliczyć stężenie każdego poszczególnego sterolu w mg/kg substancji tłuszczowej w następujący sposób: gdzie: Ax = powierzchnia piku w przypadku sterola x, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym As = powierzchnia piku α-cholestanolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym ms = masa dodanego α-cholestanolu, w miligramach m = masa próbki użytej do oznaczenia, w gramach

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

6.1. Podać stężenie poszczególnego sterolu w mg/kg substancji tłuszczowej i ich sumę jako „sterole całkowite”.

Skład każdego z poszczególnych steroli oraz skład erytrodiolu i uwaolu należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Zawartość całkowitych steroli musi być podana jako liczba całkowita bez przecinka dziesiętnego.

▼M28

6.2. Procentową zawartość każdego sterolu obliczyć na podstawie stosunku powierzchni odpowiedniego piku do sumy powierzchni pików steroli:

gdzie:

Ax = powierzchnia piku dla x;

ΣA = suma powierzchni pików dla steroli.

▼M26

6.3. APP β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-awenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4. Obliczyć procentową zawartość erytrodiolu i uwaolu:

gdzie:

ΣA = suma powierzchni piku dla steroli, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym;

Er = powierzchnia erytrodiolu zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym;

Uv = powierzchnia uwaolu zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.









Dodatek

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki pracy wstrzyknąć 1–3 μl metanu (lub propanu) i zmierzyć czas, w jakim gaz przejdzie przez kolumnę od momentu wstrzyknięcia do momentu, w którym pojawi się pik (tM).

Prędkość liniowa w cm/s jest określona jako L/tM, gdzie L oznacza długość kolumny w centymetrach, a tM oznacza czas zmierzony w sekundach.







Tabela 1 Względne czasy retencji dla steroli Pik Identyfikacja Względny czas retencji Kolumna SE 54 Kolumna SE 52 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α-cholestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]-24-metyl-Δ-5,22-cholestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * ergosterol [24S] 24 mety Δ5-7-22 cholestatrien 3β-ol 0,78 0,76 4 24-metylen-cholesterol 24-metylen-Δ-5,24-cholestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 kampesterol (24R)-24-metyl-Δ-5-cholesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 kampestanol (24R)-24-metyl-cholestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 stigmasterol (24S)-24-etyl-Δ-5,22-cholestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol (24R)-24-metyl-Δ-7-cholesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol (24R,S)-24-etyl-Δ-5,23-choIestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 klerosterol (24S)-24-etyl-Δ-5,25-cholestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-sitosterol (24R)-24-etyl-Δ-5-cholesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-awenasterol (24Z)-24-etyliden-Δ-cholesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-stigmastadienol (24R,S)-24-etyl-Δ-5,24-cholestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol (24R,S)-24-etyl-Δ-7-cholesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-awenasterol (24Z)-24-etyliden-Δ-7-cholesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 erytrodiol 5α olean-12en-3β28 diol 1,41 1,41 18 uwaol Δ12-ursen-3β28 diol 1,52 1,52

Rysunek 1

Chromatogram gazowy frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych oliwy z oliwek typu lampante (wzmocniony wewnętrznym wzorcem)

Rysunek 2

Chromatogram gazowy frakcji steroli i dialkoholi triterpenowych rafinowanej oliwy z oliwek (wzmocniony wewnętrznym wzorcem)

Rysunek 3

Płytka TLC oliwy z wytłoczyn z oliwek ze strefą, którą musi zostać zeskrobana w celu oznaczenia steroli i dialkoholi triterpenowych

1 – skwalen

2 – alkohole triterpenowe i alifatyczne

3 – sterole i dialkohole triterpenowe

4 – początkowe i wolne kwasy tłuszczowe.

▼M26 —————

▼M21









ZAŁĄCZNIK VII

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI PROCENTOWEJ 2-MONOPALMITYNIANU GLICEROLU

1. CEL I ZAKRES STOSOWANIA

Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości procentowej kwasu palmitynowego w pozycji 2 triglicerydów metodą oznaczania 2-monopalmitynianu glicerolu.

Niniejsza metoda dotyczy olejów roślinnych płynnych w temperaturze pokojowej (20 °C).

2. ZASADA

Po przygotowaniu próbkę oleju poddaje się działaniu lipazy trzustkowej: częściowa i swoista hydroliza w pozycjach 1 i 3 cząsteczki triglicerydu powoduje pojawienie się monoglicerydów w pozycji 2. Zawartość procentowa 2-monopalmitynianu glicerolu we frakcji monoglicerydów jest oznaczana, po sililowaniu, metodą chromatografii gazowej na kolumnie kapilarnej.

3. APARATURA I MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE

3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2. Zlewki o pojemności 100, 250 i 300 ml.

3.3. Szklana kolumna chromatograficzna (wewnętrzna średnica: 21–23 mm, długość: 400 mm), wyposażona w płytkę ze spieku szklanego i kranik.

3.4. Cylindry miarowe o pojemności 10, 50, 100 i 200 ml.

3.5. Kolby o pojemności 100 i 250 ml.

3.6. Wyparka obrotowa.

3.7. Probówki do wirowania o pojemności 10 ml, ze szlifowanym korkiem.

3.8. Wirówka do probówek o pojemności 10 i 100 ml.

3.9. Termostat umożliwiający utrzymanie temperatury na poziomie 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Biurety z podziałką co 1 i 2 ml.

3.11. Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml.

3.12. Mikrostrzykawka o pojemności 100 μl.

3.13. Lejek, 1 000 ml.

3.14. Chromatograf gazowy do kolumn kapilarnych, wyposażony w dozownik do nastrzykiwania „na kolumnę” na zimno w celu bezpośredniego wprowadzania próbki do kolumny oraz w piecyk zapewniający utrzymanie wybranej temperatury z dokładnością do 1 °C.

3.15. Układ nastrzykowy „na kolumnę” na zimno, w celu bezpośredniego wprowadzenia próbki do kolumny.

3.16. Detektor płomieniowo-jonizacyjny i elektrometr.

3.17. Rejestrujący integrator współpracujący z elektrometrem, z szybkością odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru.

3.18. Kolumna kapilarna ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m i średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokryta 5 % polimetylosiloksanem lub polifenylo-metylosiloksanem, o grubości 0,10–0,30 μm, którą można stosować w temperaturze 370 °C.

3.19. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni, o długości co najmniej 7,5 cm, przeznaczona do wykonywania bezpośrednich nastrzyków na kolumnę.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 0,063 do 0,200 mm (70/280 mesh), przygotowany następująco: umieścić żel krzemionkowy w kapsule porcelanowej, suszyć w suszarce w temperaturze 160 °C przez 4 godziny, schłodzić do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodać objętość wody równoważną 5 % masy żelu krzemionkowego, w następujący sposób: do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml odważyć 152 g żelu krzemionkowego i dodać 8 g wody destylowanej, zatkać kolbę i delikatnie wstrząsać do uzyskania równomiernego rozprowadzenia wody. Odstawić na co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2. n-heksan (do chromatografii).

4.3. Izopropanol.

4.4. Izopropanol, roztwór wodny 1/1 (V/V).

4.5. Lipaza trzustkowa. Użyta lipaza musi wykazywać aktywność w zakresie od 2,0 do 10 jednostek lipazy na mg (W handlu dostępne są lipazy trzustkowe o aktywności w zakresie od 2 do 10 jednostek na mg enzymu).

4.6. Roztwór buforowy tris-hydroksymetyloaminometan: roztwór wodny 1 M doprowadzony do pH 8 (kontrola potencjometryczna) stężonym HCI (1/1 V/V).

4.7. Cholan sodu, jakości enzymatycznej, roztwór wodny o stężeniu 0,1 % (roztwór ten należy wykorzystać w ciągu 15 dni od sporządzenia).

4.8. Chlorek wapnia, 22 % roztwór wodny.

4.9. Eter dietylowy do chromatografii.

4.10. Rozpuszczalnik rozwijający: mieszanina n-heksanu/eteru dietylowego (87/13) (V/V).

4.11. Wodorotlenek sodu, roztwór 12 % wagowo.

4.12. Fenoloftaleina, roztwór 1 % w etanolu.

4.13. Gaz nośny: wodór lub hel do chromatografii gazowej.

4.14. Gazy pomocnicze: – wodór w stężeniu minimum 99 %, pozbawiony wilgoci i substancji organicznych – oraz powietrze do chromatografii gazowej o takiej samej czystości.

4.15. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania: mieszanina pirydyna/heksametylodisilazan/trimetylochlorosilan w proporcji 9/3/1 (V/V/V) (W handlu dostępne są roztwory gotowe do użycia. Można zastosować również inne odczynniki wywołujące reakcję sililowania, jak np. bis-trimetylosilyltrifluoraocetamid + 1 % trimetylochlorosilan, rozcieńczone taką samą objętością bezwodnika pirydyny).

4.16. Próbki wzorcowe: czyste monoglicerydy lub mieszaniny monoglicerydów o znanym składzie procentowym podobnym do występującego w próbce badanej.

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie próbki

5.1.1. Oleje o wolnej kwasowości poniżej 3 % nie wymagają zobojętnienia przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Oleje o wolnej kwasowości powyżej 3 % muszą być zobojętnione zgodnie z ppkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do lejka o pojemności 1 000 ml (3.13) wlać 50 g oleju i 200 ml n-heksanu. Dodać 100 ml izopropanolu i ilość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 12 % (4.11) odpowiadającą wolnej kwasowości oleju powiększonej o 5 %. Wstrząsać energicznie przez jedną minutę. Dodać 100 ml wody destylowanej, ponownie wstrząsnąć i odstawić. Po dekantacji usunąć dolną warstwę mydła. Usunąć także wszystkie pośrednie warstwy (śluzy, substancje nierozpuszczalne). Płukać roztwór heksanu i zobojętnionego oleju kolejnymi porcjami 50–60 ml roztworu izopropanol/woda w proporcji 1/1 (V/V) (4.4), aż zniknie różowa barwa fenoloftaleiny. Usunąć większość heksanu za pomocą destylacji w próżni (wykorzystać do tego celu na przykład wyparkę obrotową) i przenieść olej do kolby o pojemności 100 ml (3.5). Suszyć olej w próżni do całkowitego usunięcia rozpuszczalnika. Pod koniec tej czynności kwasowość oleju musi wynosić poniżej 0,5 %.

5.1.2. Wprowadzić 1,0 g oleju przygotowanego w sposób wskazany powyżej do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i rozpuścić go w 10 ml mieszaniny rozwijającej (4.10). Odstawić roztwór na co najmniej 15 minut przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Jeżeli roztwór jest mętny, odwirować go w celu zapewnienia optymalnych warunków wykonywania chromatografii. (Można zastosować gotowe do użycia wkłady żelu krzemionkowego SPE o masie 500 mg).

5.1.3. Przygotowanie kolumny chromatograficznej Nanieść na kolumnę (3.3) około 30 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10), za pomocą szklanej pałeczki wprowadzić wacik do dolnej części kolumny; przycisnąć w celu usunięcia powietrza. Przygotować w zlewce zawiesinę 25 g żelu krzemionkowego (4.1) w około 80 ml rozpuszczalnika rozwijającego i przelać ją do kolumny przy użyciu lejka. Sprawdzić, czy cały żel krzemionkowy został wprowadzony do kolumny; przemyć rozpuszczalnikiem rozwijającym (4.10), otworzyć kranik i poczekać, aż poziom płynu osiągnie wysokość około 2 mm poniżej górnego poziomu żelu krzemionkowego.

5.1.4. Chromatografia na kolumnie Do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) odważyć dokładnie 1,0 g próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1. Rozpuścić próbkę w 10 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10). Wlać roztwór do kolumny chromatograficznej przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1.3. Starać się nie poruszyć powierzchni kolumny. Otworzyć kranik i zlać roztwór próbki, aż osiągnie poziom żelu krzemionkowego. Rozwinąć poprzez dodanie 150 ml rozpuszczalnika rozwijającego. Ustawić szybkość przepływu na 2 ml/min (tak aby 150 ml przeszło przez kolumnę w ciągu około 60–70 minut). Zebrać odciek z kolumny do wcześniej wytarowanej kolby o pojemności 250 ml. Odparować rozpuszczalnik w próżni i usunąć jego resztkowe pozostałości pod strumieniem azotu. Zważyć kolbę i obliczyć ilość zebranego ekstraktu. (W przypadku korzystania z gotowych do użytku wkładów krzemionkowych SPE postępować następująco: wprowadzić 1 ml roztworu (5.1.2) do wkładów przygotowanych wcześniej przy użyciu 3 ml n-heksanu. Po perkolacji roztworu rozwinąć chromatogram poprzez dodanie 4 ml n-heksanu/eteru dietylowego w proporcji 9/1 (V/V). Zebrać odciek z kolumny do probówki o pojemności 10 ml i poddać go odparowywaniu do sucha pod strumieniem azotu. Poddać suchą pozostałość działaniu lipazy trzustkowej (5.2). Bezwzględnie konieczne jest sprawdzenie składu kwasów tłuszczowych przed przepuszczeniem i po przepuszczeniu przez wkład SPE).

5.2. Hydroliza przez lipazę trzustkową

5.2.1. Do probówki do wirowania odważyć 0,1 g oleju przygotowanego zgodnie z ppkt 5.1. Dodać 2 ml roztworu buforowego (4.6), 0,5 ml roztworu cholanu sodu (4.7) i 0,2 ml roztworu chlorku wapnia, dobrze wstrząsając po dodaniu każdej z tych substancji. Zamknąć probówkę szlifowanym korkiem i umieścić ją w termostacie o temperaturze 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Dodać 20 mg lipazy, ostrożnie wstrząsać (nie dopuszczając do zwilżenia korka) i włożyć probówkę do termostatu na dokładnie 2 minuty, następnie wyjąć ją, wstrząsać energicznie i dokładnie przez 1 minutę i odstawić do schłodzenia.

5.2.3. Dodać 1 ml eteru dietylowego, zatkać korkiem i wstrząsać energicznie, następnie odwirować i przenieść roztwór eteru do czystej i suchej probówki przy użyciu mikrostrzykawki.

5.3. Przygotowanie pochodnych silanizowanych i chromatografii gazowej

5.3.1. Przy użyciu mikrostrzykawki wprowadzić 100 μl roztworu (5.2.3) do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml.

5.3.2. Usunąć rozpuszczalnik pod słabym strumieniem azotu, dodać 200 μl odczynnika wywołującego reakcję sililowania (4.15), zatkać probówkę i odstawić na 20 minut.

5.3.3. Po 20 minutach dodać od 1 do 5 ml n-heksanu (zależnie od warunków chromatografowania): uzyskany roztwór jest gotowy do chromatografii gazowej.

5.4. Chromatografia gazowa

Warunki robocze są następujące:

— temperatura urządzenia nastrzykującego (nastrzyk „na kolumnę”) niższa od temperatury wrzenia roztworu (68 °C),

— temperatura detektora: 350 °C,

— temperatura kolumny: zaprogramowanie temperatury pieca: 60 °C przez 1 minutę, ze zwiększaniem temperatury o 15 °C na minutę aż do 180 °C, następnie o 5 °C na minutę do 340 °C, następnie 340 °C przez 13 minut,

— gaz nośny: wodór lub hel, z regulacją do odpowiedniej liniowej szybkości przepływu w celu uzyskania rozdzielczości przedstawionej na rysunku 1. Czas retencji triglicerydu C54 musi wynosić 40 ± 5 minut (patrz: rysunek 2); (Wskazane powyżej warunki robocze zostały zaproponowane orientacyjnie. Każdy operator musi je zoptymalizować w celu uzyskania pożądanej rozdzielczości. Wysokość piku odpowiadającego 2-monopalmitynianowi glicerolu musi wynosić minimum 10 % skali rejestratora),

— ilość nastrzykiwanej substancji: 0,5–1 μl roztworu (5 ml) n-heksanu (5.3.3.).

5.4.1. Identyfikacja pików

Poszczególne monoglicerydy są identyfikowane według czasów retencji oraz przez porównanie z pikami uzyskanymi ze standardowymi mieszaninami monoglicerydów analizowanymi w tych samych warunkach.

5.4.2. Ocena ilościowa

Oblicza się pole pod każdym pikiem przy użyciu elektronicznego integratora.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

Zawartość procentową monopalmitynianu glicerolu oblicza się na podstawie stosunku pola pod odpowiednim pikiem do sumy pól pod pikami wszystkich monoglicerydów (patrz: rysunek 2), na podstawie wzoru:

Glyceril monopalmitate (%):

gdzie:

Ax = pole pod pikiem odpowiadającym monopalmitynianowi glicerolu

ΣA = suma pól pod wszystkimi pikami monoglicerydów

Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

7. SPRAWOZDANIE Z ANALAIZY

Sprawozdanie z testu powinno zawierać:

— odwołanie do niniejszej metody,

— wszelkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próbki,

— wynik analizy,

— wszelkie odchylenia od metody będące wynikiem decyzji zainteresowanych stron lub zaistniałe z innego powodu,

— dane identyfikujące laboratorium, datę analizy i podpisy osób odpowiedzialnych za tę ostatnią.

Rysunek 1

Chromatogram produktów reakcji sililowania uzyskanych po zadziałaniu lipazą na rafinowaną oliwę z oliwek, do której dodano 20 % zestryfikowanego oleju (100 %)

Objaśnienie: „Acides gras libres” = Wolne kwasy tłuszczowe; „Huile d’olive raffinée” = Rafinowana oliwa z oliwek – „+ 20 % huile estérifiée” = + 20 % oliwa z oliwek estryfikowana; „1-2 monopalmitine” = 1-2 monopalmityn – „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitoleina; „1-2 mono C18 insat.” = 1-2 mono C18 nenasyc.; Squalène = Skwalen

Rysunek 2

Chromatogram:

A) nie estryfikowanej oliwy z oliwek, po zadziałaniu na nią lipazą; po sililowaniu; w podanych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Objaśnienie: 1 = Wolne kwasy tłuszczowe 2 = Monoglicerydy 3 = Diglicerydy 4 = Triglicerydy * = 2-monopalmityn ** = Trigliceryd C54

Chromatogram:

B) oliwy estryfikowanej po zadziałaniu lipazą; po sililowaniu; w tych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Objaśnienie: 1 = Wolne kwasy tłuszczowe 2 = Monoglicerydy 3 = Diglicerydy 4 = Triglicerydy * = 2-monopalmityn ** = Trigliceryd C54

8. UWAGI

PRZYGOTOWANIE LIPAZY

W handlu dostępne są lipazy o zadowalającej aktywności. Możliwe jest również ich przygotowanie w laboratorium w następujący sposób:

Schłodzić w 0 °C 5 kg świeżej trzustki wieprzowej. Usunąć tłuszcz stały i otaczającą go tkankę łączną i utrzeć w młynku do uzyskania płynnej pasty. Wymieszać tę pastę z 2,5 litra bezwodnego acetonu w czasie od 4 do 6 godzin, następnie odwirować. Poddać pozostałość jeszcze trzykrotnej ekstrakcji taką samą objętością bezwodnego acetonu, a następnie dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną acetonu i eteru dietylowego w stosunku 1 do 1 (V/V) i dwukrotnej ekstrakcji eterem dietylowym.

Suszyć pozostałość w próżni przez 48 godzin w celu uzyskania stabilnego proszku nadającego się do przechowywania przez dłuższy czas w lodówce, w miejscu chronionym przed wilgocią.

KONTROLA DZIAŁANIA LIPAZY

Przygotować emulsję oliwy z oliwek w następujący sposób:

Wstrząsać przez 10 minut w mieszadle mieszaninę składającą się ze 165 ml roztworu gumy arabskiej o stężeniu 100 g/l, 15 g skruszonego lodu i 20 ml wcześniej zobojętnionej oliwy z oliwek.

Do zlewki o pojemności 50 ml wlać 10 ml tej emulsji, a następnie 0,3 ml roztworu cholanu sodu o stężeniu 0,2 g/ml i 20 ml wody destylowanej.

Umieścić zlewkę w termostacie, którego temperatura utrzymywana jest na poziomie 37 °C; umieścić w nim elektrody pH-metru i mieszadło spiralne.

Za pomocą biurety dodawać kroplami 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie wartość 8,3.

Dodać dostateczną objętość wodnej zawiesiny lipazy w proszku (0,1 g/ml lipazy). Z chwilą gdy pH-metr wskaże 8,3, włączyć stoper i rozpocząć wkraplanie roztworu wodorotlenku sodu z prędkością umożliwiającą utrzymanie pH na poziomie 8,3. Co minutę zapisywać objętość zużytego roztworu.

Nanieść zanotowane wartości na diagram, zaznaczając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych liczby mililitrów 0,1 N roztworu zasadowego zużytego w celu utrzymania stałego pH. W wyniku tego powinno się otrzymać linię prostą.

Aktywność lipazy wyrażoną w jednostkach lipazowych na mg oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

A oznacza aktywność w jednostkach lipazowych/mg

V oznacza liczbę mililitrów 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu na minutę (obliczoną na podstawie wykresu)

N oznacza normalność roztworu wodorotlenku sodu

m oznacza masę w mg oznaczanej lipazy.

Jednostkę lipazową definiuje się jako ilość enzymu uwalniającą 10 mikroekwiwalentów kwasu na minutę.

▼M20 —————

▼M28









ZAŁĄCZNIK IX

BADANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNE W ULTRAFIOLECIE

WPROWADZENIE

Dzięki badaniu spektrofotometrycznemu w ultrafiolecie można uzyskać informacje o jakości substancji tłuszczowej, jej stanie zachowania i zmianach wywołanych procesami technologicznymi. Efekty absorpcji fal o długości ustalonej w tej metodzie wywołane są obecnością sprzężonych systemów dienowych i trienowych wynikającą z utleniania lub rafinacji. Wielkość takiej absorpcji jest wyrażana jako właściwa gęstość optyczna

(gęstość optyczna 1 % w/v roztworu substancji tłuszczowej w określonym rozpuszczalniku w ogniwie 10 mm) oznaczona zgodnie z konwencją jako K (zwana również „współczynnikiem ekstynkcji”).

1. ZAKRES

W niniejszym załączniku opisuje się procedurę przeprowadzania badania spektrofotometrycznego oliwy z oliwek w zakresie ultrafioletu.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

Próbkę rozpuszcza się w wymaganym rozpuszczalniku, a następnie mierzy się absorbancję roztworu dla określonych długości fal w porównaniu z czystym rozpuszczalnikiem.

Właściwą gęstość optyczną oblicza się przy 232 nm i 268 nm w izooktanie lub przy 232 nm i 270 nm w cykloheksanie dla stężenia 1 % w/v w ogniwie 10 mm.

3. URZĄDZENIA

3.1. Spektrofotometr odpowiedni do pomiarów długości fal ultrafioletowych (220 nm do 360 nm) z możliwością odczytu pojedynczych jednostek nanometrycznych. Zaleca się regularną kontrolę dokładności i odtwarzalności skal absorbancji i długości fal, a także kontrolę światła rozproszonego. 3.1.1. Skala długości fal: Można ją sprawdzić poprzez zastosowanie materiału wzorcowego złożonego z filtra ze szkła optycznego zawierającego tlenek holmu lub roztwór tlenku holmu (zamkniętego hermetycznie lub niehermetycznie) o wyraźnych pasmach absorpcyjnych. Materiały wzorcowe służą do weryfikacji i kalibracji skali długości fal w spektrofotometrach w świetle widzialnym i ultrafiolecie o nominalnej spektralnej szerokości wiązki do 5 nm. Pomiary są wykonywane względem próbki wzorcowej z powietrzem otoczenia w zakresie długości fal od 640 do 240 nm, według instrukcji załączonej do materiałów wzorcowych. Przeprowadzana jest korekta bazowa przy pustym torze wiązki dla każdej zmiany szerokości szczeliny. Długości fal dla normy są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego. 3.1.2. Skala absorbancji: Można ją sprawdzić z użyciem dostępnych w sprzedaży hermetycznie zamkniętych materiałów wzorcowych złożonych z kwasowych roztworów dichromianu potasu o określonych stężeniach i certyfikowanych wartościach absorbancji przy λmax (4 roztwory dichromianu potasu w kwasie nadchlorowym szczelnie zamkniętych w czterech kwarcowych ogniwach ultrafioletowych do pomiaru wartości referencyjnej liniowości i dokładności fotometrycznej w ultrafiolecie). Pomiary roztworów dichromianu potasu są wykonywane względem próbki wzorcowej użytego kwasu, po dokonaniu korekty bazowej, według instrukcji załączonej do materiału wzorcowego. Wartości absorbancji są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego. Inną możliwością sprawdzenia reakcji ogniwa fotoelektrycznego i powielacza fotoelektrycznego jest następująca procedura: odważyć 0,2000 g czystego chromianu potasu do badań spektrofotometrycznych, rozpuścić w roztworze 0,05 N wodorotlenku potasu i dopełnić do kreski w kolbie o pojemności 1 000 ml. Następnie pobrać dokładnie 25 ml otrzymanego roztworu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 500 ml, po czym uzupełnić do kreski tym samym roztworem wodorotlenku potasu. Zmierzyć gęstość optyczną otrzymanego w ten sposób roztworu dla długości fali 275 nm, używając roztworu wodorotlenku potasu jako wzorca. Gęstość optyczna zmierzona przy użyciu kuwety o grubości 1 cm powinna wynosić 0,200 ± 0,005.

3.2. Prostokątne kuwety kwarcowe z pokrywą, odpowiednie do pomiarów przy długości fal ultrafioletowych (220–360 nm) o długości drogi optycznej 10 mm. Po napełnieniu ich wodą lub innym odpowiednim rozpuszczalnikiem kuwety nie powinny się różnić między sobą o więcej niż 0,01 jednostki gęstości optycznej.

3.3. Kolby miarowe z miarką, pojemność 25 ml, klasa A.

3.4. Waga analityczna z dokładnością odczytu do najbliższego 0,0001 g.

4. ODCZYNNIKI

W trakcie analizy, jeżeli nie ma innych wskazań, stosuje się jedynie odczynniki o uznanej klasie analitycznej oraz wodę destylowaną lub demineralizowaną lub wodę o równorzędnej czystości.

Rozpuszczalnik: izooktan (2,2,4-trimetylopentan) do pomiarów przy 232 nm i 268 nm i cykloheksan do pomiarów przy 232 nm i 270 nm, przy czym absorbancja wynosi mniej niż 0,12 przy 232 nm i mniej niż 0,05 przy 270 nm w stosunku do wody destylowanej; pomiar w ogniwie 10 mm.

5. PROCEDURA

5.1. Próbka musi być całkowicie jednorodna i pozbawiona wszelkich zanieczyszczeń występujących w postaci zawiesiny. W przeciwnym razie musi zostać przefiltrowana przez filtr papierowy w temperaturze około 30 °C.

5.2. Odważyć około 0,25 g (z dokładnością do najbliższego 1 mg) przygotowanej w ten sposób próbki w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, uzupełnić wskazanym rozpuszczalnikiem do kreski i poddać homogenizacji. Uzyskany roztwór musi być idealnie przezroczysty. W razie wystąpienia opalizacji lub mętnienia przefiltrować szybko przez filtr papierowy. UWAGA: Zasadniczo próbka 0,25–0,30 g jest wystarczająca do pomiarów absorbancji oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia i oliwy z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia przy 268 nm i 270 nm. Dla pomiarów 232 nm zazwyczaj wymaga się próbki 0,05 g, przygotowuje się zatem dwa oddzielne roztwory. W pomiarach absorbancji oliwy z wytłoczyn z oliwek, rafinowanej oliwy z oliwek oraz fałszowanej oliwy z oliwek potrzebna jest zazwyczaj mniejsza próbka, np. 0,1 g, ze względu na większą absorbancję tych oliw.

5.3. Jeżeli jest to konieczne, przeprowadzić korektę bazową (220–290 nm) rozpuszczalnikiem w obu ogniwach kwarcowych (próbka i materiał wzorcowy), a następnie wypełnić ogniwo kwarcowe próbki badanym roztworem i zmierzyć gęstość optyczną przy 232, 268 lub 270 nm względem rozpuszczalnika wzorcowego. Zarejestrowane wartości gęstości optycznej muszą mieścić się w przedziale od 0,1 do 0,8 lub w przedziale liniowości spektrofotometru, którą należy zweryfikować. Jeżeli się nie mieszczą, należy powtórzyć pomiary, stosując odpowiednio silniejsze lub słabsze roztwory.

5.4. Po dokonaniu pomiaru absorbancji przy 268 lub 270 nm, zmierzyć absorbancję przy λmax, λmax+4 i λmax-4. Uzyskanych wartości absorbancji używa się do określenia zmienności właściwej gęstości optycznej (ΔΚ). UWAGA: λmax jest przyjmowane za 268 nm dla izooktanu używanego jako rozpuszczalnik i 270 nm dla cykloheksanu.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

6.1. Należy zarejestrować właściwe gęstości optyczne (współczynniki ekstynkcji) dla różnych długości fal, obliczając je w następujący sposób: gdzie: Kλ = właściwa gęstość optyczna przy długości fali λ; Eλ = gęstość optyczna zmierzona przy długości fali λ; c = stężenie roztworu w g/100 ml; s = droga optyczna ogniwa kwarcowego w cm; z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6.2. Zmienność właściwej gęstości optycznej (ΔΚ) Zmienność wartości bezwzględnej gęstości (ΔΚ) oblicza się według wzoru: gdzie Km oznacza właściwą gęstość optyczną przy długości fali dla maksymalnej absorpcji 270 nm i 268 nm w zależności od zastosowanego rozpuszczalnika. Wynik należy podać z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.









ZAŁĄCZNIK X

OZNACZANIE ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1. ZAKRES

Niniejszy załącznik zawiera wytyczne w zakresie oznaczania metodą chromatografii gazowej wolnych i związanych kwasów tłuszczowych w tłuszczach i olejach roślinnych po ich przekształceniu na estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME).

Związane kwasy tłuszczowe w formie triglicerydów (TAG) oraz – w zależności od metody estryfikacji – wolne kwasy tłuszczowe (FFA) są przekształcane na estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME), które oznacza się metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

Metoda opisana w niniejszym załączniku pozwala na oznaczanie FAME od C12 do C24, w tym estrów metylowych kwasów tłuszczowych nasyconych, cis- i trans-jednonienasyconych oraz cis- i trans-wielonienasyconych.

2. ZASADA

Do analizy ilościowej FAME stosuje się chromatografię gazową (GC). FAME są przygotowywane zgodnie z częścią A. Następnie są wstrzykiwane do dozownika i odparowywane. Rozdział FAME przeprowadza się w kolumnach analitycznych o określonej polarności i długości. Do wykrywania FAME stosuje się detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Warunki badania określono w części B.

W chromatografii gazowej FAME z użyciem FID można użyć wodoru lub helu jako gazu nośnego (faza ruchoma). Wodór przyspiesza rozdział i daje wyraźniejsze piki. Fazą stacjonarną jest mikroskopijna warstwa cienkiego filmu cieczy naniesiona na obojętną powierzchnię z topionej krzemionki.

Podczas przejścia związków lotnych poddawanych analizie przez kolumnę kapilarną następuje ich oddziaływanie z fazą stacjonarną pokrywającą wewnętrzną powierzchnię kolumny. W wyniku różnych oddziaływań różnych związków elucja ma miejsce w różnym czasie – jest to tak zwany czas retencji związku chemicznego przy danym zbiorze parametrów analitycznych. Porównanie czasów retencji służy identyfikacji różnych związków chemicznych.

CZĘŚĆ A

PRZYGOTOWANIE ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Z OLIWY Z OLIWEK ORAZ OLIWY Z WYTŁOCZYN Z OLIWEK

1. ZAKRES

W niniejszej części opisano przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Zawarto w niej metody przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych z oliw z oliwek oraz z oliw z wytłoczyn z oliwek.

2. ZAKRES ZASTOSOWANIA

Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych z oliw z oliwek oraz z oliw z wytłoczyn z oliwek przeprowadza się w drodze transestryfikacji roztworem metanolowym wodorotlenku potasu w temperaturze pokojowej. Konieczność oczyszczania próbki przed transestryfikacją zależy od zawartości wolnych kwasów tłuszczowych w próbce oraz od oznaczanych parametrów analitycznych; metodę można wybrać zgodnie z następującą tabelą:







Kategoria oliwy Metoda Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia, o kwasowości ≤ 2,0 % 1. Kwasy tłuszczowe 2. Kwasy tłuszczowe trans 3. ΔECN42 (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE) Rafinowana oliwa z oliwek Oliwa z oliwek złożona z rafinowanej oliwy z oliwek i oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia Rafinowana oliwa z wytłoczyn z oliwek Oliwa z wytłoczyn z oliwek Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia, o kwasowości > 2,0 % Surowa oliwa z wytłoczyn z oliwek 1. Kwasy tłuszczowe (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE) 2. Kwasy tłuszczowe trans (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE) 3. ΔECN42 (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE)

3. METODOLOGIA

3.1. Transestryfikacja roztworem metanolowym wodorotlenku potasu w temperaturze pokojowej

3.1.1. Zasada

Estry metylowe powstają w wyniku transestryfikacji roztworem metanolowym wodorotlenku potasu na etapie pośrednim przed zmydlaniem.

3.1.2. Odczynniki

3.1.2.1. Metanol o zawartości wody nieprzekraczającej 0,5 % (m/m).

3.1.2.2. Heksan, jakość chromatograficzna.

3.1.2.3. Heptan, jakość chromatograficzna.

3.1.2.4. Eter dietylowy do analizy, stabilizowany.

3.1.2.5. Aceton, jakość chromatograficzna.

3.1.2.6. Rozpuszczalnik elucyjny do oczyszczania oliwy metodą chromatografii kolumnowej/SPE, w mieszaninie heksanu z eterem dietylowym 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Wodorotlenek potasu, roztwór metanolowy ok. 2M: rozpuścić 11,2 g wodorotlenku potasu w 100 ml metanolu.

3.1.2.8. Wkłady z żelem krzemionkowym, 1 g (6 ml), do ekstrakcji do fazy stałej.

3.1.3. Aparatura

3.1.3.1. Probówki zakręcane (objętość 5 ml), zakrętka z uszczelką PTFE.

3.1.3.2. Pipety miarowe lub automatyczne, 2 ml i 0,2 ml.

3.1.4. Oczyszczanie próbek oliwy

W razie potrzeby próbki można oczyścić przez przepuszczenie oliwy przez wkład z żelem krzemionkowym do ekstrakcji do fazy stałej. Wkład z żelem krzemionkowym (3.1.2.8) umieszcza się w elucyjnej aparaturze próżniowej i przemywa się 6 ml heksanu (3.1.2.2); przemywanie odbywa się bez próżni. Następnie do kolumny podaje się roztwór oliwy (około 0,12 g) w 0,5 ml heksanu (3.1.2.2). Roztwór przepuszcza się przez kolumnę, a następnie poddaje elucji mieszaniną 10 ml heksanu/eteru dietylowego (87:13 v/v) (3.1.2.6). Wszystkie eluaty są homogenizowane i dzielone na dwie podobne objętości. Podwielokrotność odparowuje się do suchości w wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej. Pozostałość rozpuszcza się w 1 ml heptanu i roztwór jest gotowy do analizy kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej. Drugą podwielokrotność odparowuje się, a pozostałość rozpuszcza się w 1 ml acetonu do analizy triglicerydów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), jeśli jest to konieczne.

3.1.5. Procedura

W zakręcanej probówce o pojemności 5 ml (3.1.3.1) odważyć ok. 0,1 g próbki oliwy. Dodać 2 ml heptanu (3.1.2.2) i wstrząsnąć. Dodać 0,2 ml roztworu metanolowego wodorotlenku potasu (3.1.2.7), zamknąć nakrętką z uszczelką PTFE, zacisnąć nakrętkę i wstrząsać energicznie przez 30 sekund. Pozostawić do rozwarstwienia, aż górna warstwa roztworu stanie się klarowna. Dekantować górną warstwę zawierającą estry metylowe. Roztwór heptanu jest gotowy do wstrzyknięcia do chromatografu gazowego. Zaleca się przechowywanie roztworu w chłodziarce do czasu analizy metodą chromatografii gazowej. Nie zaleca się przechowywania roztworu dłużej niż przez 12 godzin.

CZĘŚĆ B

ANALIZA ESTRÓW METYL