10.

Załącznik IV otrzymuje brzmienie:



„ZAŁĄCZNIK IV OKREŚLANIE ZAWARTOŚCI WOSKU PRZEZ CHROMATOGRAFIĘ GAZOWO - CIECZOWĄ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ 1. ZAKRES Niniejsza metoda opisuje procedurę określania zawartości wosku w niektórych tłuszczach i olejach w warunkach testowych. Może być ona stosowana w szczególności do rozróżniania między oliwą z oliwek uzyskaną z tłoczenia i oliwą z ekstrakcji (oliwa z wytłoczyn oliwek). 2. ZASADA Dodanie odpowiedniego wzorca wewnętrznego do tłuszczu lub oleju, następnie frakcjonowanie z wykorzystaniem metody chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym. Odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą chromatografii gazowo - cieczowej z użyciem kolumny kapilarnej. 3. APARATURA 3.1. Kolba Erlenmeyera 25-ml. 3.2. Szklana kolumna do chromatografii, średnica wewnętrzna 15 mm i długość 30–40 cm. 3.3. Odpowiedni chromatograf gazowo - cieczowy z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z: 3.3.1 Kontrolowanego termostatem piecyka do kolumn, zdolnego utrzymać pożądaną temperaturę z dokładnością do 1 oC. 3.3.2. Zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny. 3.3.3. Detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera - wzmacniacza. 3.3.4. Rejestrującego integratora współpracującego z konwerterem-wzmacniaczem (3.3.3.), o szybkości odpowiedzi poniżej 1 sekundy, z różną prędkością papieru. 3.3.5. Kolumny kapilarnej, ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 10–15 m i średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokrytej od środka płynem SE-52 lub SE-54 lub ich odpowiednikami, dla uzyskania jednolitej grubość 0,10–0,30 μm. 3.4. Mikrostrzykawki umożliwiającej wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μm, wyposażonej w igłę o utwardzonej powierzchni. 4. ODCZYNNIKI 4.1. Żel krzemionkowy, sito 70/230, art. 7754 Merck. Umieścić żel w piecyku w temperaturze 500 oC na cztery godziny. Schłodzić, następnie dodać 2 % wody utlenionej. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny. Trzymać w zaciemnionym miejscu, przez co najmniej 12 godzin przed użyciem. 4.2. n-heksan, do chromatografii. 4.3. Eter etylowy, do chromatografii. 4.4. n-heptan, do chromatografii. 4.5. Mianowany roztwór arachidynianu laurylowego w heksanie (wzorzec wewnętrzny), w proporcjach 0,1 % (m/v). 4.6. Gaz nośny: wodór, czysty, do chromatografii gazowo - cieczowej. 4.7. Gazy pomocnicze: — wodór, czysty, do chromatografii gazowo - cieczowej, — powietrze, czyste, do chromatografii gazowo - cieczowej. 5. PROCEDURA 5.1. Oddzielenie frakcji wosku. 5.1.1 Przygotowanie kolumny chromatograficznej. Sporządzić zawiesinę 15 g uwodnionego żelu krzemionkowego w 2 % bezwodnym n-heksanie i wprowadzić do kolumny. Pozostawić do osadzenia. Następnie wytrącić osad przy użyciu wytrząsarki elektrycznej, tak aby pasmo chromatograficzne było bardziej jednolite. Przesączyć 30 ml n-heksanu, by usunąć wszelkie zanieczyszczenia. 5.1.2. Chromatografia kolumnowa Odważyć dokładnie 500 mg próbki do kolby 25-ml i dodać odpowiednią ilość wzorca wewnętrznego, w zależności od założonej zawartości wosku, tj. dodać 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek i 0,25–0,5 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek. Do próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1. dodać dwie porcje po 2-ml n-heksanu i tak przygotowaną próbkę przenieść do kolumny chromatograficznej. Wprowadzić próbkę tak, aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu. Następnie rozpocząć wymywanie chromatograficzne; pobrać 140 ml mieszaniny n-heksan/eter etylowy w proporcji 99:1, przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund (2,1 ml/min.). Osuszyć otrzymaną frakcję w obrotowym aparacie wyparnym aż do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usunąć ostatnie 2 lub 3 ml rozpuszczalnika przy pomocy słabego strumienia azotu, a następnie dodać 10 ml n-heptanu. 5.2. Analiza metodą chromatografii gazowo - cieczowej 5.2.1. Procedura wstępna, kondycjonowanie kolumny. 5.2.1.1. Umieścić kolumnę w chromatografie gazowo-cieczowym, łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Sprawdzić aparaturę do chromatografii gazowo - cieczowej (działanie pętli gazowych, wydajność detektora i przyrządu rejestrującego itp.). 5.2.1.2. Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowo-cieczowej. Stopniowo podgrzewać do temperatury przynajmniej o 20 oC wyższej od temperatury pracy (patrz: uwaga). Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej dwie godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (zadać natężenie przepływu gazu, płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego, ustawić temperaturę piecyka dla kolumny, ustawić detektor itd.). Rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość wymagana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików i linia ta powinna mieć pewne nachylenie. Ujemne nachylenie linii oznacza, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została prawidłowo kondycjonowana. Przez cały czas utrzymywać temperaturę kondycjonowania na poziomie co najmniej o 20 °C poniżej maksymalnej temperatury wyszczególnionej dla używanego eluentu. 5.2.2. Dobór warunków roboczych. 5.2.2.1. Warunki pracy są następujące: — temperatura kolumny: początkowa 80 oC, wzrastająca z prędkością 30 oC/min. do 120 oC, a następnie zaprogramowana na wzrost o 5 oC/min. do 340 oC, — temperatura detektora: 350 oC, — prędkość liniowa gazu nośnego: wodór, 20–35 cm/sek., — czułość urządzenia: 4–16 razy większa od minimalnego tłumienia, — czułość przyrządu rejestrującego: 1–2 mV, od dołu skali, — prędkość przesuwu papieru: 30 cm/godz., — porcja wstrzykiwana: 0,5–1 μl roztworu. Warunki te mogą być modyfikowane w taki sposób, by pasowały do charakterystyk kolumn i aparatów do chromatografii gazowo-cieczowej (tak, aby otrzymywane chromatogramy spełniały następujące wymagania: czas retencji wzorca wewnętrznego C32 musi wynosić 25 ± 2 minuty, a najbardziej reprezentacyjny pik dla wosków musi zawierać się między 60 a 100 %, od dołu skali). 5.2.2.2. Ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pola powierzchni rozpatrywanego piku. 5.2.3. Przeprowadzenie analizy 5.2.3.1. Pobrać 1 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki 10 μl; odciągnąć tłoczek aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do systemu iniekcji i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po około pięciu sekundach delikatnie wyciągnąć igłę. 5.2.3.2. Przeprowadzić rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków. Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania (5.2.1.2). 5.2.4. Identyfikacja pików Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach. Rysunek 1 przedstawia chromatogram wosku oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia. 5.2.5. Analiza ilościowa 5.2.5.1. Przy pomocy integratora ustalić pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu i estrom alifatycznym od C40 do C46. 5.2.5.2. Ustalić zawartość wosków każdego z estrów, gdzie: Ax = pole pod pikiem dla każdego estru; As = pole pod pikiem odpowiadające arachidynianowi laurylowemu; ms = masa dodanego arachidynianu laurylowego w miligramach; m = masa badanej próbki pobranej, w gramach. 6. PREZENTACJA WYNIKÓW Podać zawartość poszczególnych wosków oraz sumę tych wosków w mg/kg tłuszczu.



Określenie liniowej prędkości gazu Wstrzyknąć 1–3 μl metanu (propanu) do aparatury do chromatografii gazowej/cieczowej, dostosowawszy ją uprzednio do normalnych warunków pracy. Zmierzyć czas przepływa gazu przez kolumnę, od momentu wstrzyknięcia próbki do pojawienia się piku (tM). Prędkość liniową w cm/sek. wylicza się ze wzoru L/tM, gdzie L jest długością kolumny w cm, a tM jest czasem mierzonym w sekundach. Rysunek 1: Chromatogram wosku dla oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.