(A)

Kompetycyjny lub blokujący test ELISA przeprowadza się zgodnie z następującym protokołem: Kompetycyjny test ELISA z wykorzystaniem przeciwciała monoklonalnego 3-17-A3 jest w stanie zidentyfikować przeciwciała skierowane przeciwko wszystkim znanym serotypom wirusa choroby niebieskiego języka. Zasada testu polega na przerwaniu reakcji pomiędzy antygenem wirusa BTG i grupowo swoistym przeciwciałem monoklonalnym (3-17-A3) poprzez dodanie surowicy badanej. Przeciwciała skierowane przeciwko wirusowi BTG obecne w surowicy badanej blokują reaktywność przeciwciała monoklonalnego (Mab), przez co ograniczona jest spodziewana reakcja barwna po dodaniu znakowanego enzymatycznie przeciwciała anty-mysiego oraz chromogenu/substratu. Surowice mogą być badane w jednokrotnym rozcieńczeniu 1:5 (test plamkowy – dodatek 1) lub mogą być miareczkowane (miareczkowanie surowicy – dodatek 2) do osiągnięcia punktu końcowego. Wartości inhibicji powyżej 50 % można potraktować jako wynik dodatni. Materiały i odczynniki: 1. Odpowiednie mikropłytki do testu ELISA. 2. Antygen: dostarczany w postaci stężonego ekstraktu komórkowego, przygotowywany według podanego poniżej sposobu, przechowywany w temperaturze – 20 °C albo – 70 °C. 3. Bufor blokujący: bufor fosforanowy (PBS), zawierający 0,3 % surowicy dorosłego bydła ujemnej w kierunku wirusa BTG, 0,1 % (v/v) roztwór Tween-20 (dostarczany jako syrop monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu) w PBS. 4. Przeciwciało monoklonalne: 3-17-A3 (dostarczane jako supernatant z hodowli tkankowej linii komórkowej hybrydoma) skierowane przeciw grupowo swoistemu polipeptydowi VP7, przechowywane w temperaturze – 20 °C lub liofilizowane i rozcieńczane przed użyciem buforem blokującym w stosunku 1:100. 5. Koniugat: królicza globulina anty-mysia (adsorbowana i wymywana) sprzężona z peroksydazą chrzanową, przechowywana w ciemności w temperaturze 4 °C. 6. Chromogen i substrat: ortofenylodiamina (chromogen OPD) w końcowym stężeniu 0,4 mg/ml w sterylnej wodzie destylowanej. Nadtlenek wodoru (substrat 30 % w/v) 0,05 % v/v dodawany tuż przed użyciem (5μl H2O2 na 10 ml OPD). (Ostrożnie! Pracując z OPD należy używać rękawic gumowych! Podejrzewane działanie mutagenne). 7. 1 M kwas siarkowy: 26,6 ml kwasu dodane do 473,4 ml wody destylowanej. (Uwaga! Zawsze dodawać kwas do wody, nigdy odwrotnie). 8. Wytrząsarka orbitalna. 9. Czytnik płytek ELISA (wyniki testu można odczytać wizualnie). Format badania Cc: koniugat kontrolny (bez surowicy/bez przeciwciała monoklonalnego); C++: silnie dodatnia surowica kontrolna; C+: słabo dodatnia surowica kontrolna; C-: ujemna surowica kontrolna; Cm: przeciwciało monoklonalne kontrolne (bez surowicy).



DODATEK 1 Format testu plamkowego (1:5) – (40 surowic/płytkę) Kontrole Surowice badane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C++ C++ D C++ C++ E C+ C+ F C+ C+ G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



DODATEK 2 Format miareczkowania surowicy (10 surowic/płytkę) Kontrole Surowice badane 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C++ C++ 1:20 1:20 D C++ C++ 1:40 1:40 E C+ C+ 1:80 1:80 F C+ C+ 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Protokół badania: Koniugat kontrolny (Cc) : studzienki 1A i 1B to ślepa kontrola składająca się z antygenu wirusa BTG oraz koniugatu. Może być używany do zerowania czytnika ELISA. Przeciwciała monoklonalne kontrolne (Cm) : kolumny 1 i 2, wiersze G i H to próba kontrolna z przeciwciałami monoklonalnymi, zawierająca antygen wirusa BTG, przeciwciała monoklonalne i koniugat. Te studzienki wykazują najsilniejsze zabarwienie. Odczyt średniej gęstości optycznej dla tej kontroli odpowiada wartości inhibicji równej 0 %. Dodatnia kontrola (C++, C+) : kolumny 1 i 2, wiersze C-D-E-F. Studzienki te zawierają antygen wirusa BTG, odpowiednio silnie i słabo dodatnią antysurowicę wirusa BTG, przeciwciała monoklonalne i koniugat. Ujemna kontrola (C-) : studzienki 2A i 2B to kontrolne ujemne zawierające antygen wirusa BTG, ujemną antysurowicę, przeciwciała monoklonalne i koniugat. Surowice badane : w badaniach serologicznych na dużą skalę i szybkich badaniach przesiewowych surowice mogą być badane w jednokrotnym rozcieńczeniu 1:5 (dodatek 1). Alternatywnie można badać 10 surowic w rozcieńczeniu w przedziale od 1:5 do 1:640 (dodatek 2). Pozwala to uzyskać przybliżone wskazania co do miana przeciwciał w surowicy badanej. Procedura: 1. Rozcieńczyć antygen wirusa BTG do wstępnie miareczkowanego stężenia w PBS, poddać krótkiej sonikacji w celu rozproszenia skupisk wirusa (jeśli sonikator nie jest dostępny, silnie wstrząsnąć pipetą), po czym dodać po 50 μl do wszystkich studzienek płytki ELISA. Postukać w ścianki płytki w celu rozproszenia antygenu. 2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut na wytrząsarce orbitalnej. Przemyć płytki trzykrotnie poprzez zalanie studzienek niesterylnym PBS i ich opróżnienie, po czym osuszyć na bibule. 3. Skontrolować studzienki: dodać 100 μl bufora blokującego do studzienek oznaczonych jako Cc. Dodać 50 μl dodatniej i ujemnej surowicy kontrolnej w rozcieńczeniu 1:5 (10 μl surowicy + 40 μl bufora blokującego) odpowiednio do studzienek oznaczonych jako C-, C + oraz C++. Dodać 50 μl bufora blokującego do studzienek kontrolnych oznaczonych jako Mab. Metoda testu plamkowego: Dodać każdej z badanych surowic w rozcieńczeniu 1:5 w buforze blokującym w celu zduplikowania studzienek w kolumnach od 3 do 12 (10 μl surowicy + 40 μl bufora blokującego), lub Metoda miareczkowania surowicy: Przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń każdej z próbek badanych (1:5 do 1:640) w buforze blokującym, w ośmiu studzienkach w pojedynczych kolumnach od 3 do 12. 4. Natychmiast po dodaniu surowic badanych rozcieńczyć Mab w stosunku 1:100 w buforze blokującym oraz dodać po 50 μl do wszystkich studzienek na płytce, z wyjątkiem próby ślepej. 5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut na wytrząsarce orbitalnej. Przemyć trzykrotnie PBS i osuszyć na bibule. 6. Rozcieńczyć koncentrat króliczych przeciwciał anty-mysich do 1:5000 w buforze blokującym i dodać po 50 μl do wszystkich studzienek na płytce. 7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut na wytrząsarce orbitalnej. Przemyć trzykrotnie PBS i osuszyć na bibule. 8. Rozmrozić dichlorowodorek o-fenylenodiaminy (OPD) i bezpośrednio przed użyciem dodać 5 μl 30 % nadtlenku wodoru do każdych 10 ml OPD. Dodać po 50 μl do wszystkich studzienek na płytce. Odczekać około 10 minut na wytworzenie się reakcji barwnej, po czym zatrzymać reakcję przy pomocy 1 M kwasu siarkowego (50 μl na studzienkę). Reakcja barwna powinna pojawić się w studzienkach kontrolnych oznaczonych jako Mab oraz w studzienkach zawierających surowice bez przeciwciał wirusa BTG. 9. Ocenić płytki wizualnie lub przy pomocy czytnika spektrofotometrycznego i zapisać wyniki. Analiza wyników: Używając pakietu oprogramowania, wydrukować wartości gęstości optycznej (OD) oraz procent inhibicji (PI) dla badanej i kontrolnej surowicy w oparciu o wartość średnią zarejestrowaną w studzienkach zawierających antygen kontrolny. Odnotowane wartości OD i PI pozwolą ustalić, czy wyniki testu mieszczą się w akceptowalnych granicach. Wartość górnej granicy kontrolnej i dolnej granicy kontrolnej dla studzienek kontrolnych oznaczonych jako Mab (antygen plus przeciwciało monoklonalne przy braku surowic badanych) wynoszą pomiędzy 0,4 i 1,4 wartości gęstości optycznej. Każda płytka, która nie spełnia powyższych kryteriów, musi zostać odrzucona. Jeśli pakiet oprogramowania nie jest dostępny, wydrukować wartości OD korzystając z drukarki analizatora ELISA. Obliczyć średnią wartość OD dla studzienek kontrolnych zawierających antygen, która równa jest 100 %. Określić 50 % wartości OD i ręcznie obliczyć, czy każda z próbek jest dodatnia, czy ujemna. Wartość procentu inhibicji (PI) = 100 – (OD każdej kontroli/średnia wartość OD z Cm) × 100. Zduplikowane studzienki zawierające ujemną surowicę kontrolną, a także zduplikowane studzienki ze ślepą kontrolą powinny wykazywać, odpowiednio, wartości PI pomiędzy + 25 % i – 25 % oraz pomiędzy + 95 % i + 105 %. Niespełnienie powyższych kryteriów nie unieważnia wyniku pochodzącego z danej płytki, ale sugeruje, że kolor tła cały czas się zmienia. Silna i słaba dodatnia surowica kontrolna powinna wykazywać, odpowiednio, wartości PI pomiędzy + 81 % i + 100 % oraz pomiędzy + 51 % i + 80 %. Próg diagnostyczny dla surowic badanych wynosi 50 % (PI 50 % lub OD 50 %). Próbki wykazujące wartość PI mniejsze niż 50 % uznaje się za ujemne. Próbki wykazujące wartość PI powyżej i poniżej progu dla zduplikowanych studzienek uznaje się za wątpliwe. Takie próbki można ponownie przebadać metodą testu plamkowego bądź miareczkowania. Próbki dodatnie mogą zostać poddane miareczkowaniu w celu określenia stopnia, w jakim ich wynik jest dodatni. Odczyt wizualny: Próbki dodatnie i ujemne można z łatwością rozróżnić wizualnie. Próbki słabo dodatnie lub silnie ujemne mogą być trudniejsze do interpretacji wizualnej. Przygotowania antygenu wirusa BTG do testu ELISA: 1. 40-60 butli Roux z wyrośniętą hodowlą komórek BHK-21 przemyć trzykrotnie pożywką Eagle’a bez surowicy, a następnie zakazić serotypem 1 wirusa BTG w pożywce Eagle’a bez surowicy. 2. Inkubować w temperaturze 37 °C i sprawdzać codziennie na obecność efektu cytopatycznego (CPE). 3. Gdy efekt cytopatyczny obejmuje 90-100 % komórek hodowli w każdej butli Roux, należy zebrać wirus przez energiczne wytrząsanie w celu odklejenia komórek od powierzchni szkła. 4. Odwirować przy 2 000-3 000 obr/min w celu osadzenia komórek. 5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w około 30 ml PBS zawierającego 1 % roztwór sarkozylu i 2 ml fluorku fenylometylosulfonylu (bufor lizujący). Może to spowodować żelifikację komórek, co można ograniczyć dodając więcej buforu lizującego. (Uwaga! Fluorek fenylometylosulfonylu jest substancją niebezpieczną! Ostrożnie!) 6. Rozbić komórki przy użyciu sondy ultradźwiękowej przy amplitudzie 30 mikronów przez 60 sekund. 7. Odwirowywać przy 10 000 obr/min przez 10 minut. 8. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze 4 °C, a pozostały osad z komórek ponownie zawiesić w 10-20 ml buforu lizującego. 9. Rozbić komórki ultradźwiękami, odwirować i zebrać uzyskany supernatant. Powtórzyć procedurę trzykrotnie, za każdym razem zbierając supernatant. 10. Połączyć porcje supernatantu i odwirowywać przy 24 000 obr/min (100,000 g) w temperaturze 4 °C przez 120 minut na 5 ml poduszce z 40 % sacharozy (w/v w PBS) używając 30 ml probówek do wirówki Beckmanna i wirnika SW 28. 11. Odrzucić supernatant, wysuszyć probówki i ponownie zawiesić osad w PBS przy użyciu sonikatora. Tak uzyskany antygen należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze – 20 °C Miareczkowanie antygenu wirusa BTG do testu ELISA: Antygen wirusa choroby niebieskiego języka do testu ELISA jest miareczkowany przy użyciu pośredniego testu ELISA. Roztwór otrzymany przez dwukrotne rozcieńczenie antygenu jest miareczkowany w stosunku do stałego rozcieńczenia (1:100) przeciwciała monoklonalnego 3-17-A3. Protokół wygląda następująco: 1. Miareczkować roztwór 1:20 antygenu wirusa BTG w PBS na mikropłytce w serii podwójnych rozcieńczeń (w objętości 50 μl/studzienkę), przy pomocy pipety wielokanałowej. 2. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej. 3. Przepłukać płytki trzykrotnie przy użyciu PBS 4. Do każdej studzienki mikropłytki dodać po 50 μl przeciwciała monoklonalnego 3-17-A3 (rozcieńczonego w stosunku 1:100). 5. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej. 6. Przepłukać płytkę trzykrotnie przy użyciu PBS. 7. Do każdej studzienki mikropłytki dodać po 50 μl koniugatu króliczej globuliny anty-mysiej, znakowanej peroksydazą chrzanową, w optymalnym wstępnym stężeniu. 8. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce orbitalnej. 9. Dodać substrat i chromogen według podanego poprzednio opisu. Zatrzymać reakcję barwną po 10 minutach przez dodanie 1 M kwasu siarkowego (50 μl/studzienkę). W teście kompetycyjnym należy stosować nadmiar przeciwciała monoklonalnego, gdyż pozwala to wybrać rozcieńczenie antygenu, które znajduje się na krzywej miareczkowania (nie w obszarze plateau) i daje około 0,8 OD po 10 minutach.