1998L0057 — PL — 30.07.2006 — 001.001

Dokument ten służy wyłącznie do celów dokumentacyjnych i instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego zawartość

zmienione przez:









▼B

DYREKTYWA RADY 98/57/WE

z dnia 20 lipca 1998 r.

w sprawie kontroli organizmu Ralstonia solanacearum (Smith), Yabuuchi i wsp.







RADA UNII EUROPEJSKIEJ, uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską, w szczególności jego art. 43, uwzględniając wniosek Komisji ( 1 ), uwzględniając opinię Parlamentu Europejskiego ( 2 ), uwzględniając opinię Komitetu Ekonomiczno-Społecznego ( 3 ), a także mając na uwadze, co następuje: a także mając na uwadze, co następuje: szkodliwy organizm Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi i wsp. był znany wcześniej jako Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi i wsp. stanie się prawdopodobnie powszechnie przyjętą nazwą dla tego organizmu; niniejsza dyrektywa powinna uwzględniać ten fakt; produkcja ziemniaka i pomidora zajmuje istotną pozycję w rolnictwie Wspólnoty; wydajność produkcji ziemniaka i pomidora jest stale zagrożona przez organizmy szkodliwe; ochrona upraw ziemniaka i pomidora przed takimi szkodliwymi organizmami powinna nie tylko utrzymać na obecnym poziomie, ale nawet zwiększyć wydajność produkcji rolnej; środki ochronne przed wprowadzeniem organizmów szkodliwych na terytorium Państwa Członkowskiego mogą mieć ograniczony efekt, gdyby jednocześnie nie prowadzono metodycznej kontroli ich występowania w całej Wspólnocie i gdyby nie zapewniono ochrony przed ich rozprzestrzenianiem się; jednym z organizmów szkodliwych dla ziemniaka i pomidora jest Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuubhi i wsp., czynnik patogenny w chorobie brunatnej zgnilizny ziemniaka i w bakteryjnym więdnięciu ziemniaków oraz pomidorów; epidemie choroby spowodowanej tym patogenem występowały już w niektórych częściach Wspólnoty i nadal występują pewne ograniczone źródła infekcji; istnieje poważne ryzyko dla upraw ziemniaka i pomidora w całej Wspólnocie, jeżeli nie zostaną podjęte skuteczne środki ochrony tych roślin, polegające na lokalizacji występowania tego organizmu, określeniu jego rozpowszechnienia, tak by zapobiec jego pojawieniu się i rozprzestrzenianiu się oraz w przypadku znalezienia tego organizmu – zabezpieczeniu przed jego rozprzestrzenieniem się i likwidacji organizmu przez usunięcie roślin wraz z korzeniami; dla zapewnienia osiągnięcia powyższych celów we Wspólnocie powinny być podjęte określone środki; ponadto Państwa Członkowskie muszą być zdolne do podjęcia w razie potrzeby dodatkowych lub bardziej rygorystycznych środków, kiedy nie będzie przeciwwskazań co do transportowania ziemniaków lub pomidorów we Wspólnocie, z wyjątkiem sytuacji określonych w dyrektywie Rady 77/93/EWG z dnia 21 grudnia 1976 r. w sprawie działań ochronnych przeciwko wprowadzaniu do Państw Członkowskich organizmów szkodliwych dla roślin lub produktów roślinnych oraz przeciwko ich rozprzestrzenianiu się we Wspólnocie ( 4 ); o podjęciu takich środków należy powiadomić inne Państwa Członkowskie oraz Komisję; należy podjąć środki, które powinny uwzględniać fakt, że niezbędne są systematyczne urzędowe kontrole w celu zlokalizowania patogenu; takie kontrole powinny obejmować inspekcję oraz, kiedy zachodzi taka potrzeba, gdy w określonych warunkach środowiskowych choroba może pozostawać w formie utajonej i nie dawać się zaobserwować ani w rosnących ziemniakach, ani w zmagazynowanych bulwach ziemniaczanych, to powinny one obejmować także pobieranie próbek i ich badanie; rozprzestrzenianie się patogenu na roślinach w fazie wzrostu nie jest czynnikiem najważniejszym, najgroźniejsze jest jego rozprzestrzenianie się poprzez wody powierzchniowe wraz z dzikimi roślinami psiankowatymi i dlatego nawadnianie upraw ziemniaka i pomidora przy użyciu skażonej wody wydaje się stanowić ryzyko zarażenia tych upraw; patogen może występować również w samosiewach ziemniaka i pomidora w zimie i może stanowić źródło infekcji przeniesionej z jednego sezonu na drugi; patogen może być również roznoszony przez skażenie ziemniaka wskutek kontaktu z ziemniakami zakażonymi oraz poprzez kontakt z urządzeniami stosowanymi podczas uprawy, zbioru i przetwórstwa zbiorów, albo podczas transportu i magazynowania w zbiornikach, które uprzednio zostały zainfekowane tym organizmem, poprzez wcześniejszy kontakt z porażonymi ziemniakami; rozprzestrzenianie się patogenu można zredukować lub można mu całkowicie zapobiec dzięki dekontaminacji odpowiednich obiektów; jakiekolwiek zarażenie materiału siewnego ziemniaka stanowi główne ryzyko rozprzestrzeniania się patogenu; podobnie utajona postać infekcji ziemniaka stanowi poważne ryzyko rozprzestrzeniania się patogenu i można temu zapobiec poprzez stosowanie materiałów siewnych ziemniaka wyprodukowanych w ramach urzędowo zatwierdzonego programu, w którym materiały siewne zostały przebadane i uznane za wolne od infekcji; aktualna wiedza na temat biologii i epidemiologii Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi i wsp. w warunkach europejskich nie jest pełna i przewiduje się, że w ciągu najbliższych kilku sezonów konieczne będzie dokonanie przeglądu proponowanych środków ostrożności; przewiduje się dokonanie podobnych ulepszeń w zakresie procedur badań, w wyniku dalszych prac badawczych, szczególnie w odniesieniu do czułości oraz specyficzności metod badania, tak aby wybrać oraz wystandaryzować optymalną wersję spośród dostępnych metod badania; w celu określenia danych szczegółowych, dotyczących takich ogólnych środków oraz bardziej restrykcyjnych i dodatkowych środków, które zostaną podjęte przez Państwa Członkowskie dla zapobieżenia przenoszenia patogenu na ich terytorium, pożądana jest ścisła współpraca Państw Członkowskich z Komisją, koordynowana przez Stały Komitet ds. Zdrowia Roślin (zwany dalej „Komitetem”), PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:







Artykuł 1

Niniejsza dyrektywa dotyczy środków, jakie Państwa Członkowskie podejmują w celu zabezpieczenia się przed szkodnikiem Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi i wsp., znanym wcześniej jako Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (zwanym dalej „organizmem”), w odniesieniu do roślin żywicielskich powyższego organizmu, wyszczególnionych w załączniku I sekcja 1 (zwanych dalej „wyszczególnionym materiałem roślinnym”):

a) zlokalizowania organizmu i określenia jego występowania;

b) zabezpieczenia przed pojawieniem się i rozprzestrzenianiem się tego organizmu; oraz

c) w przypadku stwierdzenia obecności tego organizmu – zabezpieczenia przed jego rozprzestrzenianiem się i jego likwidacji przez usunięcie roślin z korzeniami.

Artykuł 2

1. Państwa Członkowskie przeprowadzają coroczne, systematyczne urzędowe kontrole występowania organizmu w wyszczególnionym materiale roślinnym, pochodzącym ze swojego terytorium. W celu identyfikacji innych możliwych źródeł skażenia zagrażającego produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, Państwa Członkowskie oceniają występujące ryzyko i jeżeli stwierdzą ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu, prowadzią na obszarach produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego docelowe kontrole urzędowe występowania organizmu na roślinach innych niż wyszczególniony materiał roślinny, łącznie z dzikorosnącymi roślinami żywicielskimi tego organizmu z rodziny psiankowatych, kontrole jego obecności w wodach powierzchniowych, używanych do nawadniania lub zraszania wyszczególnionego materiału roślinnego oraz w odpadach płynnych pochodzących z przetwórstwa przemysłowego wyszczególnionego materiału roślinnego, a także w sortowniach i pakowalniach wyszczególnionego materiału roślinnego i na obiektach służących do nawadniania i zraszania wyszczególnionego materiału roślinnego. Zakres tych docelowych kontroli jest określany stosownie do stwierdzonego stopnia ryzyka przenoszenia organizmu. Państwa Członkowskie mogą także prowadzić urzędowe kontrole występowania organizmu na takich materiałach, jak pożywki, gleba i odpady stałe z przetwórstwa przemysłowego lub procesu czyszczenia i pakowania.

2. Kontrole urzędowe, przewidziane w ust. 1, przeprowadza się:

a) na wyszczególnionym materiale roślinnym, zgodnie z ustaleniami przedstawionymi w załączniku I sekcja II pkt 1; oraz,

b) w przypadku roślin żywicielskich innych niż wyszczególniony materiał roślinny, wód powierzchniowych, łącznie z odpadami ciekłymi, zgodnie z właściwymi metodami, a także gdy zaistnieje taka potrzeba, należy pobrać próbki i poddać je badaniu urzędowemu lub w urzędowo nadzorowanym laboratorium;

c) w razie potrzeby, kontroli należy poddać inne materiały, stosując właściwe metody.

Dalsze szczegółowe informacje, dotyczące procedur kontrolnych oraz liczb, pochodzenia i czasu pobierania próbek do kontroli, zostaną ustalone przez odpowiednie organy urzędowe, w rozumieniu dyrektywy 77/93/EWG, w oparciu o właściwe zasady naukowe i statystyczne oraz znajomość biologii organizmu, uwzględniając specyfikę poszczególnych systemów produkcyjnych wyszczególnionego materiału roślinnego oraz, w miarę potrzeb, innych roślin żywicielskich tego organizmu, występujących w danym Państwie Członkowskim.

3. Szczegółowe informacje i wyniki kontroli urzędowych, przewidzianych w ust. 1 są co roku przekazywane do wiadomości innych Państw Członkowskich oraz do Komitetu, zgodnie z ustaleniami załącznika I sekcja II pkt 2. Notyfikacje takie należy dostarczyć do dnia 1 czerwca, z wyjątkiem notyfikacji dotyczących ziemniaków przeznaczonych na materiał siewny dla gospodarstw rolnych, w tym przypadku – do dnia 1 września. Szczegółowe informacje o przebiegu kontroli i jej wynikach odnoszą się do produkcji z poprzedniego roku, o czym może być powiadomiony także Komitet.

4. Przyjmuje się następujące przepisy, zgodnie z procedurą ustanowioną w art. 16a dyrektywy 77/93/EWG:

— właściwe metody kontroli i analiz laboratoryjnych, przewidziane w ust. 2 akapit pierwszy lit. b).

5. Można przyjąć następujące przepisy, zgodnie z procedurą przewidzianą w art. 16a dyrektywy 77/93/EWG:

— właściwe metody kontroli, przewidziane w ust. 2 akapit pierwszy lit. c),

— dalsze szczegółowe informacje dotyczące kontroli, przewidziane w ust. 2 akapit drugi, w celu zapewnienia porównywalnego poziomu bezpieczeństwa w Państwach Członkowskich.

Artykuł 3

Państwa Członkowskie dostarczą do właściwych organów urzędowych informacje o podejrzeniu wystąpienia lub o potwierdzonej obecności organizmu na ich obszarze.

Artykuł 4

1. We wszystkich przypadkach podejrzeń co do wystąpienia organizmu odpowiedzialne organy Państwa(-w) Członkowskiego(-ch) zapewnią urzędowe lub urzędowo nadzorowane analizy laboratoryjne wyszczególnionego materiału roślinnego, przy użyciu odpowiednich metod, określonych w załączniku II oraz zgodnie z warunkami wymienionymi w załączniku III pkt 1 albo we wszystkich innych przypadkach, przy użyciu innej urzędowo uznanej metody, potwierdzającej lub wykluczającej podejrzewaną obecność organizmu. W przypadku potwierdzenia obecności organizmu, zostaną spełnione wymagania ustanowione w załączniku III pkt 2.

2. Do czasu potwierdzenia lub wykluczenia podejrzewanej obecności organizmu według ust. 1, we wszystkich przypadkach podejrzewania wystąpienia organizmu, albo:

i) zostaną zaobserwowane objawy diagnostyczne choroby spowodowanej przez organizm i otrzyma się pozytywne wyniki szybkiego badania(-ń) przesiewowego(-ych), określonego w załączniku II sekcja I pkt 1 oraz sekcja II; albo

ii) otrzyma się wynik pozytywny badania(-ń) przesiewowego (-ych), określonego(-ch) w załączniku II sekcja I pkt 2 oraz sekcja III,

i odpowiedzialne organy Państw Członkowskich, w zakresie dotyczącym ich własnej produkcji:

a) wydadzą zakaz przenoszenia roślin oraz bulw ze wszystkich zbiorów, serii produkcyjnych oraz wysyłkowych, z których pobrano próbki, z wyjątkiem tych znajdujących się pod kontrolą, o których wiadomo, że nie występuje podejrzenie ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu;

b) podejmą odpowiednie kroki dla wyśledzenia pochodzenia podejrzanej obecności organizmu;

c) wprowadzą właściwe dodatkowe środki ostrożności, w oparciu o znajomość stopnia oszacowanego ryzyka, szczególnie w odniesieniu do produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego oraz przenoszenia materiałów siewnych ziemniaków innych niż te, do których odnosi się lit. a), wyprodukowanych w miejscu, z którego pobrano próbki, do których odnosi się lit. a), aby zapobiec jakiemukolwiek rozprzestrzenieniu się organizmu.

3. W przypadkach podejrzenia obecności organizmu, w których występuje ryzyko skażenia wyszczególnionego materiału roślinnego lub wód powierzchniowych ze źródeł w innym Państwie Członkowskim lub występowania ryzyka przeniesienia tego organizmu na teren innego Państwa(-w) Członkowskiego(-ch), Państwo Członkowskie, w którym stwierdzono podejrzenie wystąpienia organizmu, niezwłocznie przekaże innym Państwom Członkowskim informacje szczegółowe, zgodnie ze stwierdzonym ryzykiem, o podejrzewanej obecności organizmu i zostanie nawiązana właściwa współpraca między Państwami Członkowskimi. W ten sposób powiadomione Państwa Członkowskie wprowadzą środki ostrożności, zgodnie z ust. 2 lit. c) i podejmą dalsze działania, we właściwy sposób, zgodnie z ust. 1 i 2.

4. Można przyjąć następujący przepis, zgodnie z procedurą przewidzianą w art. 16a dyrektywy 77/93/EWG:

— środki, określone w ust. 2 lit. c).

Artykuł 5

1. Jeżeli urzędowe lub urzędowo nadzorowane badania wyszczególnionego materiału roślinnego, wykonane z zastosowaniem właściwych metod, podanych w załączniku II lub w innych przypadkach przy użyciu innych urzędowo uznanych metod, potwierdzą obecność organizmu w próbce pobranej zgodnie z niniejszą dyrektywą, to upoważnione organy Państwa Członkowskiego, działające w oparciu o zdrowe zasady naukowe, biologię organizmu, odpowiednio do specyfiki poszczególnych systemów produkcji, wprowadzania do obrotu i przetwarzania roślin żywicielskich organizmu w tym Państwie Członkowskim:

a) w przypadku wyszczególnionego materiału roślinnego: i) ustalą zakres badań zmierzających do określenia rozmiaru i pierwotnych źródeł(-ła) skażenia, zgodnie z przepisami załącznika IV, przeprowadzając dalsze badania zgodnie z art. 4 ust. 1, przynajmniej na spokrewnionych klonowo siewkach i zapasach materiału siewnego ziemniaka, oraz ii) oznaczą jako skażony wyszczególniony materiał roślinny, serię wysyłkową i/lub serię produkcyjną, z której pobrano próbkę, oraz maszyny, pojazdy, magazyny lub ich części, oraz wszelkie inne obiekty, łącznie z materiałami opakowań, będącymi w kontakcie z wyszczególnionym materiałem roślinnym, z którego pobrano próbkę; oznaczać jako skażone również, gdy zajdzie potrzeba, pole(-a) uprawne zabezpieczonej produkcji oraz miejsca, z których pobrano próbkę; oraz w przypadku próbek pobranych w okresie sezonu wegetacyjnego, oznaczać jako skażone pole(-a) uprawne, miejsce(-a) produkcji oraz, gdy zachodzi potrzeba, produkty, z których została pobrana próbka, oraz iii) ustalą, zgodnie z przepisami załącznika V pkt 1, zakres możliwego skażenia na drodze kontaktu przed i po zbiorach, w produkcji, podczas nawadniania lub zraszania lub poprzez powiązania klonalne, z oznaczanym skażeniem, oraz iv) wytyczą strefę ochronną, w oparciu o oznaczenie skażenia zgodnie z ii), określą rozmiar możliwego skażenia zgodnie z ppkt iii) i możliwe rozprzestrzenienie się organizmu, zgodnie z przepisami załącznika V pkt 2 ppkt i);

b) w przypadku zbiorów roślin żywicielskich organizmu, innych niż wyszczególnione w lit. a), gdy produkcja wyszczególnionego materiału roślinnego zostanie oceniona za ryzykowną: i) przeprowadzą badania zgodnie z lit. a) ppkt i); oraz ii) oznaczą jako skażone rośliny żywicielskie organizmu, z których została pobrana próbka; oraz iii) określą prawdopodobne skażenie i wytyczą strefę ochronną, zgodnie z lit. a) ppkt iii) i ppkt iv), odpowiednio, w odniesieniu do produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego;

c) w przypadku wód powierzchniowych (łącznie z odpadami płynnymi z przetwórstwa przemysłowego lub czyszczeniem, sortowaniem pakowaniem wyszczególnionego materiału roślinnego) oraz dzikorosnących roślin żywicielskich, gdy produkcja wyszczególnionego materiału roślinnego zostanie uznana za ryzykowną, w związku z nawadnianiem, zraszaniem lub zalaniem wodami powierzchniowymi: i) ustalą zasady badań, łącznie z urzędową kontrolą w odpowiednich okresach czasu, próbek wody powierzchniowej oraz, jeśli one występują, próbek dzikorosnących roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych organizmu, w celu określenia rozmiaru skażenia; oraz ii) oznaczą jako skażoną wodę powierzchniową, z której pobrano próbkę(-i), we właściwym zakresie, na podstawie badania zgodnie z ppkt i); oraz iii) określą prawdopodobne skażenie i wytyczą strefę skażenia, na podstawie oznaczenia skażenia zgodnie z ppkt ii), oraz możliwe rozprzestrzenienie się organizmu, przy uwzględnieniu przepisów załącznika V pkt 1 oraz pkt 2 ppkt ii).

2. Państwa Członkowskie niezwłocznie powiadomią pozostałe Państwa Członkowskie oraz Komitet, zgodnie z przepisami załącznika V pkt 3, o wszelkich skażeniach oznakowanych zgodnie z ust. 1 lit. a) ppkt ii) oraz ust. 1 lit. c) ppkt ii) oraz o szczegółach dotyczących wytyczonej strefy skażenia, zgodnie z ust. 1 lit. a)) ppkt iv) oraz, gdy stosuje się ust. 1 lit. c) ppkt iii), zgodnie z tym ustępem. Szczegółowe informacje o treści powiadomienia, wysłanego zgodnie z tym ustępem są dostarczane do Komitetu.

Państwa Członkowskie w tym samym czasie dostarczą do Komitetu dodatkowe powiadomienia, określone w załączniku V pkt 4. Szczegółowe dane z tego powiadomienia, zgodnie z tym akapitem, zostaną niezwłocznie dostarczone do członków Komitetu.

3. W wyniku powiadomienia wysłanego zgodnie z ust. 2 oraz jego elementów, inne Państwa Członkowskie, wyszczególnione w powiadomieniu, przeprowadzą badania zgodnie z ust. 1 lit. a) ppkt i) oraz, jeśli się stosuje, ust. 1 lit. c) ppkt i) i podejmą dalsze stosowne działania, zgodnie z ust. 1 i 2.

Artykuł 6

1. Państwa Członkowskie zarządzą, że wyszczególnionego materiału roślinnego, oznaczonego jako skażony według art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii) nie wolno wysadzać oraz że pod kontrolą i za zgodą upoważnionych organów zostanie on poddany jednemu z przepisów załącznika VI pkt 1, w sposób zapewniający, że nie powstanie możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu.

2. Państwa Członkowskie zarządzą, że wyszczególniony materiał roślinny, określony jako prawdopodobnie zanieczyszczony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) oraz lit. c) ppkt iii), łącznie z wyszczególnionym materiałem roślinnym, dla którego zidentyfikowano ryzyko, wyprodukowanym na miejscu produkcji oznaczonym jako prawdopodobnie skażone, na mocy art. 5 ust. 1) lit. a) ppkt iii) nie może być wysadzany i zostanie, pod kontrolą upoważnionych organów urzędowych, właściwie zastosowany lub we właściwy sposób przeznaczony na odpady, zgodnie z załącznikiem VI pkt 2, tak że nie powstanie możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzenienia się organizmu.

3. Państwa Członkowskie zarządzą, że wszelkie maszyny, pojazdy, zbiorniki, magazyny lub ich części oraz jakiekolwiek inne obiekty, łącznie z materiałem opakowań, oznaczone jako skażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii) lub określone jako prawdopodobnie skażone na mocy 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) oraz lit. c) ppkt ii), zostaną albo zniszczone, albo oczyszczone ze skażenia, przy zastosowaniu właściwych metod, zgodnie z załącznikiem VI pkt 3. Po dekontaminacji wszystkie te obiekty nie będą już dłużej uważane za skażone.

4. Bez uszczerbku dla środków wprowadzonych w życie zgodnie z ust. 1, 2 i 3, Państwa Członkowskie zastosują zasadę, że w strefie skażonej, wytyczonej na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz lit. c) ppkt iii), zostanie wprowadzonych szereg środków, wyszczególnionych w załączniku VI pkt 4.1. i 4.2. Szczegółowe informacje o podjętych środkach są co roku dostarczane innym Państwom Członkowskim oraz Komisji. Szczegółowe informacje mogą zostać dostarczone do Komitetu.

Artykuł 7

1. Państwa Członkowskie zarządzą, że materiały siewne spełniają wymogi dyrektywy 77/93/EWG oraz pochodzą w linii prostej z materiału siewnego ziemniaka otrzymanego w ramach urzędowo uznanego programu, wolnego od organizmu, zgodnie z badaniami urzędowymi lub przeprowadzonymi pod nadzorem urzędowym, z użyciem odpowiedniej metody, określonej w załączniku II.

Wyżej określone badania są wykonywane przez Państwo Członkowskie:

a) w przypadkach, w których potwierdzono obecność organizmu w ich własnej produkcji materiału siewnego, i) przez sprawdzenie roślin, od których pochodzi materiał roślinny, łącznie z selekcją materiału do klonowania oraz systematycznym badaniem klonów podstawowego materiału przeznaczonego do sadzenia; lub ii) w przypadkach stwierdzenia braku powinowactwa w zakresie klonowania, poprzez badanie wszystkich podstawowych klonów materiału do sadzenia lub roślin, od których pochodzą, łącznie z elitarnym materiałem siewnym wybranym do klonowania, oraz

b) w innych przypadkach albo wszystkich roślin z początkowej selekcji do klonowania lub reprezentatywnych próbek materiału siewnego, albo roślin, od których pochodzą.

2. Można przyjąć następujące przepisy, zgodnie z procedurą przewidzianą w art. 16a dyrektywy 77/93/EWG:

— szczegółowe zasady stosowania ust. 1 akapit drugi lit. a),

— zasady odnoszące się do reprezentatywnych próbek, zawarte w ust. 1 akapit drugi lit. b).

Artykuł 8

Państwa Członkowskie wprowadzą zakaz przechowywania organizmu oraz manipulowania tym organizmem.

Artykuł 9

Bez uszczerbku dla przepisów dyrektywy 77/93/EWG, Państwa Członkowskie mogą zezwolić na odstępstwa od środków określonych w art. 6 i 8 niniejszej dyrektywy, zgodnie z przepisami dyrektywy 95/44/EWG ( 5 ), jeśli zamierzają podjąć próby i prace naukowe oraz prace nad selekcją odmianową.

Artykuł 10

Państwa Członkowskie mogą przyjąć, w odniesieniu do ich własnej produkcji takie dodatkowe lub bardziej radykalne środki, jakie mogą być potrzebne do zwalczenia organizmu, albo dla zapobieżenia jego rozprzestrzenianiu się, w zakresie zgodnym z przepisami dyrektywy 77/93/EWG.

Szczegółowe dane na temat podjętych środków należy dostarczyć do innych Państw Członkowskich i do Komisji. Ponadto szczegółowe informacje o tej notyfikacji mogą zostać przesłane do Komitetu.

Artykuł 11

Zmiany w załącznikach do niniejszej dyrektywy, które będą dokonane w wyniku rozwoju wiedzy naukowej lub technicznej, należy przyjąć zgodnie z procedurą przedstawioną w art. 16a dyrektywy 77/93/EWG. W przypadku zastosowania metod ustanowionych w załączniku II oraz środków ustanowionych w załączniku VI pkt 4.1 i 4.2 do niniejszej dyrektywy, zostaje przygotowane sprawozdanie przez Komisję. Sprawozdanie to przedstawia metody i środki oparte na zdobytym doświadczeniu. Raport należy dostarczyć do Komitetu przed dniem 1 stycznia 2002 r.

Artykuł 12

1. Państwa Członkowskie wprowadzą w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy przed dniem 21 sierpnia 1999 r. i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.

Środki te zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie to towarzyszy ich urzędowej publikacji. Metody dokonywania takiego odniesienia określane są przez Państwa Członkowskie.

2. Państwa Członkowskie niezwłocznie przekażą Komisji teksty podstawowych przepisów prawa krajowego, przyjętych w dziedzinach objętych niniejszą dyrektywą. Komisja poinformuje o tym pozostałe Państwa Członkowskie.

Artykuł 13

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie z dniem jej opublikowania w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Artykuł 14

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.









ZAŁĄCZNIK I

SEKCJA I

Wykaz roślin żywicielskich dla Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi i wsp ., określonych w art. 1







Rośliny (łącznie z bulwami), inne niż nasiona Solanum tuberosum L. Ziemniak Rośliny, inne niż owoce i nasiona Lycopersicon lycopersicum (L) Karsten ex Farw. Pomidor

SEKCJA II

Kontrole

1. Kontrole urzędowe, określone w art. 2 ust. 2 lit. a) będą oparte na znajomości biologii organizmu oraz uwzględnią specyfikę poszczególnych systemów produkcji w określonym Państwie Członkowskim. Będą one obejmować: i) w przypadku ziemniaka: — we właściwym czasie kontrole wzrokowe rosnących roślin i/lub pobranie próbek zarówno materiału siewnego, jak i innych części roślin w okresie wegetacji lub z magazynu. Próbki te zostaną poddane kontroli urzędowej lub pod urzędowym nadzorem, poprzez nacięcie bulw i kontrolę wzrokową, oraz — w przypadku materiału siewnego i wtedy, gdy jest to właściwe dla innych części roślin ziemniaków, badanie laboratoryjne urzędowe lub pod urzędowym nadzorem, z użyciem metody wymienionej w załączniku II, ii) w przypadku pomidora: — wzrokowa we właściwej fazie wegetacji, w szczególności sadzonek przeznaczonych dla plantacji produkcyjnych.

2. Notyfikacja z urzędowej kontroli, określonej w art. 2 ust. 3 zawiera: i) w przypadku kontroli ziemniaków: — oszacowanie areału (w hektarach) plantacji materiału siewnego i innych ziemniaków, — podział według kategorii materiału siewnego oraz sposobu przechowywania, gdzie sytuacja tego wymaga, z uwzględnieniem regionu, — liczba oraz czas pobrania próbek do badań, — liczba kontroli wzrokowych na plantacjach, — liczba (i wielkość próbki) do kontroli wzrokowej bulw; ii) w przypadku kontroli roślin pomidora, przeznaczonych do rozsady, przeprowadzonych w fazie wzrostu roślin, — szacunkowa liczba roślin, — liczba kontroli wizualnych; iii) w przypadku kontroli roślin żywicielskich organizmu, innych niż ziemniak i pomidor, łącznie z dzikorosnącymi roślinami żywicielskimi z rodziny psiankowatych dla organizmu: — gatunek, — liczba i czas pobrania próbek, — obszar/rzeka, z których pobrano próbki, stosowanie do okoliczności, — metody analizy; iv) w przypadku kontroli wody i odpadów płynnych z przemysłowego przetwórstwa lub pomieszczeń do pakowania: — liczba i czas pobrania próbek, — powierzchnia/rzeka/lokalizacja obiektu, z których pobrano próbki, stosownie do okoliczności, — metoda analizy.

▼M1









ZAŁĄCZNIK II

SCHEMAT BADANIA DIAGNOSTYCZNEGO, WYKRYWANIA ORAZ IDENTYFIKACJI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ZAKRES BADANIA

Przedstawiony schemat opisuje różne procedury odnoszące się do:

i) diagnostyki śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora i niektórych innych roślinach żywicielskich;

ii) wykrywania Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka, roślinach ziemniaka, pomidora i w innych roślinach żywicielskich, oraz w wodzie i glebie;

iii) identyfikacji Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

SPIS TREŚCI







Zasady ogólne SEKCJA I: Zastosowanie schematu badania 1. Schemat diagnostyki śluzaka (R. solanacearum) w bulwach ziemniaka oraz w bulwach ziemniaka oraz roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego 2. Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka 3. Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich SEKCJA II: Szczegółowe metody wykrywania R. solanacearum w bulwach ziemniaka i roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego 1. Objawy 2. Szybkie testy przesiewowe 3. Posiew na podłoża selektywne 4. Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum SEKCJA III: 1. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka 1.1. Przygotowanie próby 1.2. Badanie 2. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych ziemniaka, pomidora lub innych roślin 2.1. Przygotowanie próby 2.2. Badanie SEKCJA IV: 1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie 2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie 2.1. Przygotowanie próby 2.2. Badanie SEKCJA V: 1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie 2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie 2.1. Przygotowanie próby 2.2. Badanie SEKCJA VI: Zoptymalizowane protokoły wykrywania i identyfikacji R. solanacearum A. Testy diagnostyczne i wykrywanie 1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi 2. Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu 3. Test aglutynacji serologicznej 4. Izolacja selektywna 4.1. Izolacja na podłoże selektywne 4.2. Procedura wzbogacenia 5. Test immunofluorescencyjny (test IF) 6. Reakcja łańcuchowa polimerazy (test PCR) 6.1. Metody oczyszczania DNA a) Metoda zgodnie z Pastrik (2000) b) Inne metody 6.2. PCR 6.3. Analiza produktu PCR 7. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (test FISH) 8. Testy immunoenzymosorbcyjne (testy ELISA) a) ELISA pośrednie b) DASI ELISA (test ELISA sandwiczowy pośredni) 9. Test biologiczny B. Testy identyfikacyjne 1. Testy fizjologiczne i biochemiczne 2. Test IF 3. Test ELISA 4. Test PCR 5. Test FISH 6. Analiza kwasów tłuszczowych (FAP) 7. Metoda oznaczania szczepu 7.1. Określenie biowaru 7.2. Genomowe fingerprinting 7.3. Metody PCR C. Testy potwierdzające Dodatek 1 Laboratoria zajmujące się optymalizacją i zatwierdzeniem protokołów Dodatek 2 Pożywki do izolacji i hodowli R. solanacearum Dodatek 3 A. Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne B. Przygotowanie kontroli Dodatek 4 Skład buforów i sposób ich przygotowania Dodatek 5 Określenie poziomu porażenia w testach IF i FISH Dodatek 6 Zatwierdzone protokoły PCR i odczynniki Dodatek 7 Zatwierdzone odczynniki do testu FISH Dodatek 8 Hodowla oberżyny i pomidora Literatura

ZASADY OGÓLNE

Dodatki zawierają zoptymalizowane protokoły dla różnych metod, zatwierdzonych odczynników i danych szczegółowych dotyczących przygotowania badania i materiałów kontrolnych. Dodatek 1 zawiera spis laboratoriów uwzględnionych w optymalizacji i zatwierdzeniu protokołów.

W związku z tym, że protokoły obejmują wykrywanie organizmu poddanego kwarantannie i wykorzystanie kultur żywych R. solanacearum jako materiału kontrolnego, konieczne będzie wykonanie procedur w odpowiednich warunkach kwarantanny przy użyciu odpowiednich urządzeń do usuwania odpadów oraz będąc w posiadaniu odpowiednich pozwoleń wydanych przez władze urzędowe odpowiedzialne za kwarantannę roślin.

Parametry badania muszą zapewnić zgodne i dające się odtworzyć wykrycie różnych poziomów R. solanacearum przy użyciu określonych wartości progowych wybranych metod.

Niezbędne jest dokładne przygotowanie pozytywnych kontroli

Przeprowadzanie badań zgodnie z wymaganymi wartościami progowymi zakłada również właściwe ustawienia, utrzymanie oraz kalibrację urządzeń, ostrożne obchodzenie się i przechowywanie odczynników i wszystkie środki niezbędne dla zapobiegnięcia kontaminacji próbek, np. oddzielenie kontroli pozytywnych od prób badanych. Dla uniknięcia błędów administracyjnych i innych błędów należy przestrzegać norm kontroli jakości, zwłaszcza dotyczących etykietowania i dokumentacji.

Podejrzenie o wystąpienie opisane w art. 4 ust. 2 dyrektywy 98/57/WE oznacza pozytywny wynik badań diagnostycznych lub przesiewowych wykonanych na próbie zgodnie z tym, co określono na poniższych schematach blokowych. Pozytywne pierwsze badanie przesiewowe (badanie IF, PCR/FISH, izolacja selektywna) musi zostać potwierdzone drugim badaniem przesiewowym w oparciu o inną zasadę biologiczną.

Jeżeli pierwsze badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas istnieje podejrzenie porażenia R. solanacearum i należy wykonać drugie badanie przesiewowe. Jeżeli drugie badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas podejrzenie zostaje potwierdzone (podejrzenie występowania) i należy wykonywać badania zgodnie ze schematem. Jeśli drugie badanie przesiewowe da wynik negatywny, wówczas próbę uznaje się za nieporażoną R. solanacearum.

Potwierdzenie obecności porażenia, o której mowa w art. 5 ust. 1 dyrektywy 98/57/WE, oznacza wyizolowanie i zidentyfikowanie czystej kultury R. solanacearum z potwierdzeniem patogeniczności.

SEKCJA I

SCHEMAT BADANIA

1. Schemat diagnozowania śluzaka w bulwach ziemniaka oraz R. solanacearum w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego

Procedura badania jest przeznaczona dla bulw ziemniaka i roślin z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego. Procedura ta obejmuje szybkie badanie przesiewowe, izolację patogenu z porażonej tkanki naczyniowej na pożywkę diagnostyczną (selektywną) oraz, w przypadku wyniku pozytywnego, identyfikację kultury jako Ralstonia solanacearum.

2. Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka

Zasada:

Procedura badania przeznaczona jest do wykrywania utajonych infekcji bulw ziemniaka. W przypadku wyniku pozytywnego przynajmniej dwóch badań przesiewowych3, w oparciu o różne zasady biologiczne, procedura musi zostać uzupełniona izolacją patogenu, po której wykonane zostaje – w przypadku izolacji typowych kolonii – potwierdzenie czystej kultury jako R. solanacearum. Pozytywny wynik tylko jednego badania przesiewowego nie jest wystarczający dla stwierdzenia, że próba jest podejrzana.

Badania przesiewowe i badania izolacji muszą pozwolić na wykrycie od 103 do 104 komórek/ml zawieszonego osadu, w kontroli pozytywnej załączonej do każdej serii badań.

3. Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich.

SEKCJA II

SZCZEGÓŁOWE METODY WYKRYWANIA RALSTONIA SOLANACEARUM W BULWACH ZIEMNIAKA I ROŚLINACH ZIEMNIAKA, POMIDORA LUB INNYCH ROŚLINACH ŻYWICIELSKICH Z OBJAWAMI ŚLUZAKA LUB WIĘDNIĘCIA BAKTERYJNEGO

1. Objawy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Objawy na ziemniaku

Roślina ziemniaka. Wczesnym stadium infekcji w polu jest więdnięcie liści od podstawy w kierunku wierzchołka rośliny w wysokiej temperaturze panującej w ciągu dnia oraz poprawa ich stanu w ciągu nocy. We wczesnych stadiach więdnięcia liście pozostają zielone, lecz później żółkną i rozwijają się nekrozy. Występuje również epinastia. W szybkim czasie więdnięcie jednego pędu lub całej rośliny staje się nieodwracalne i prowadzi do śmierci całej rośliny. Tkanka naczyniowa w łodygach przeciętych w poprzek więdnącej rośliny zwykle brązowieje, a z przeciętej powierzchni wypływa mleczny śluz bakteryjny lub można go wycisnąć z rośliny. Gdy uciętą łodygę wstawi się pionowo do wody, z wiązek naczyniowych będzie wypływać śluz.

Bulwa ziemniaka. Bulwy ziemniaka należy przecinać poprzecznie w pobliżu części przystolonowej lub podłużnie poprzez stolon. Wczesne stadium infekcji objawia się odbarwieniem szklistożółtym do lekko brązowego pierścienia naczyniowego, na którym po kilku minutach samoistnie zacznie pojawiać się kremowy wyciek. Później przebarwienie wiązek naczyniowych staje się bardziej brązowe, a nekrozy mogą objąć tkankę parenchymatyczną. W zaawansowanych stadiach choroby infekcja rozprzestrzenia się i obejmuje nie tylko części przystolonowej oraz oczka, z których mogą wypływać bakterie, co powoduje przyleganie cząstek glebowych. Mogą pojawić się czerwonawo-brązowe, lekko zapadnięte zmiany na naskórku z powodu wewnętrznego zapadania się tkanek naczyniowych. W zaawansowanych stadiach choroby częste jest występowanie wtórnego rozwoju zgnilizny grzybowej i bakteryjnej.

1.2. Objawy na pomidorze

Roślina pomidora. Pierwszym widocznym objawem jest zwiędły wygląd najmłodszych liści. W korzystnych dla patogenu warunkach środowiska (temperatura gleby około 25 °C, wysoka wilgotność powietrza) w ciągu kilku dni następuje epinastia oraz więdnięcie jednej strony lub całej rośliny, co prowadzi do pokładania się rośliny. W warunkach mniej korzystnych (temperatura gleby niższa od 21 °C) więdnięcie jest mniejsze, lecz na łodydze może rozwinąć się wiele nowych korzeni. Można zaobserwować tłustawy pasek dookoła łodygi, który świadczy o martwicy układu naczyniowego. Po przecięciu łodygi w poprzek odbarwione brązowe tkanki naczyniowe wydzielają krople białego lub żółtawego śluzu bakteryjnego.

1.3. Objawy na innych roślinach żywicielskich

Rośliny Solanum dulcamara oraz S. nigrum. W warunkach naturalnych objawy więdnięcia u tych żywicieli obserwuje się rzadko, chyba że temperatura gleby przekracza 25 °C lub poziomy inokulum są bardzo wysokie (np. jak dla S. nigrum rosnącej w pobliżu chorej rośliny ziemniaka lub pomidora). Gdy nie występuje więdnięcie, objawy są takie jak w przypadku pomidora. Rośliny S. dulcamara, które nie więdną, rosnące z łodygami i korzeniami w wodzie, mogą wykazywać wewnętrzne lekkie brązowawe przebarwienie wiązek przewodzących na przekroju poprzecznym podstawy łodygi lub na częściach znajdujących się pod wodą. Z przeciętych wiązek przewodzących mogą wydostawać się bakterie lub smugi śluzu, jeśli przecięta łodyga zostanie ustawiona pionowo w wodzie, nawet przy braku objawów więdnięcia.

2. Szybkie testy przesiewowe

Szybkie testy przesiewowe mogą ułatwić wstępną diagnozę, ale nie są niezbędne. Należy zastosować jeden lub kilka z poniższych zatwierdzonych testów:

2.1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

(Patrz: sekcja VI.A.1)

2.2. Wykrywanie granulek poli-β-hydroksymaślanu (PHB)

Charakterystyczne granulki PHB w komórkach R. solanacearum można zobaczyć, wybarwiając je na szkiełku przedmiotowym błękitem Nilu A lub czernią sudanową w utrwalonych termicznie rozmazach śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki (patrz: sekcja VI.A.2).

2.3. Test aglutynacji serologicznej

(Patrz: sekcja VI.A.3.)

2.4. Inne testy

Dalsze odpowiednie badania przesiewowe to test IF (patrz: sekcja VI.A.5), Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7), testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8) oraz test PCR (patrz: sekcja VI.A.6).

3. Posiew na podłoża selektywne

a) Pobrać wyciek z tkanki lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek łodygi rośliny ziemniaka, pomidora lub innych więdnących roślin żywicielskich. Zawiesić je w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4) i pozostawić na 5–10 minut.

b) Przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny.

c) Przenieść 50–100 µl zawiesiny i jej rozcieńczeń na pożywkę uniwersalną (NA, YPGA lub SPA; patrz: dodatek 2) i/lub na pożywkę tetrazolową Kelmana (dodatek 2) i/lub na zatwierdzoną selektywną pożywkę (np. SMSA; patrz: dodatek 2). Nanieść i rozprowadzić zawiesinę na płytce. W razie potrzeby przygotować oddzielne płytki z rozcieńczoną zawiesiną R. solanacearum biowaru 2 jako kontrolę pozytywną.

d) Inkubować płytki przez 2–6 dni w temperaturze 28 °C. — Na pożywkach uniwersalnych wirulentne szczepy R. solanacearum rosną w postaci kolonii perłowo-białych, płaskich, nieregularnych i ciekłych, często z charakterystycznymi spiralami w środku. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całkowicie kremowo-białe. — Na pożywce tetrazolowej Kelmana i SMSA spirale mają krwistoczerwony kolor. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całe o głęboko czerwonej barwie oraz o maślanej konsystencji.

4. Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum

Badania potwierdzające wstępną identyfikację szczepów R. solanacearum pokazano w sekcji VI.B.

SEKCJA III

1. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka

1.1. Przygotowanie próby

Uwaga:

— Standardowa wielkość próby wynosi 200 bulw. Bardziej intensywne badania wymagają większej ilości testów na próbach tej wielkości. Większa liczba bulw w próbie będzie uniemożliwiać lub utrudniać interpretację wyników. Jednak gdy dostępna jest mniejsza niż 200 liczba bulw, procedurę tę można stosować z powodzeniem.

— Zatwierdzenie wszystkich opisanych niżej metod wykrywania oparte było na testowaniu prób złożonych z 200 bulw.

— Opisany poniżej ekstrakt z ziemniaków może być także wykorzystany do wykrywania bakterii bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Fakultatywne czynności wstępne przed przygotowaniem próby:

a) Inkubować próby w temperaturze 25–30 °C przez okres do dwu tygodni przed badaniem, aby pomóc w namnożeniu populacji R. solanacearum.

b) Umyć bulwy. Użyć właściwych środków odkażających (związki chloru, gdy zastosowane ma być badanie PCR dla usunięcia DNA patogenu) i detergentów pomiędzy każda próbą. Wysuszyć bulwy na powietrzu. Ta procedura mycia jest szczególnie przydatna (lecz niewymagana) przy próbach z nadmiarem ziemi i w przypadku wykonywania testu PCR lub procedury bezpośredniej izolacji.

1.1.1. Usunąć czystym i zdezynfekowanym skalpelem lub nożem do warzyw skórkę z części przystolonowej każdej bulwy, w taki sposób, by odsłonić tkanki przewodzące. Starannie wyciąć mały stożek z tkanki przewodzącej z części przystolonowej i ograniczyć ilość tkanki innej niż przewodząca do minimum. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Uwaga: Odłożyć na bok wszystkie (gnijące) bulwy z objawami śluzaka przechowywać i badać oddzielnie. Jeżeli w czasie pobierania tkanki przystolonowej obserwuje się objawy nasuwające podejrzenie śluzaka, należy przeprowadzić wzrokowe badanie bulwy i przeciąć bulwę w części przystolonowej. Wszystkie przekroje bulw z podejrzanymi objawami powinny być pozostawione co najmniej przez dwie doby w temperaturze pokojowej, aby umożliwić korkowacenie i przechowywane w lodówce (w temperaturze 4–10 °C) we właściwych warunkach kwarantanny. Wszystkie bulwy, włącznie z tymi przejawiającymi podejrzane objawy, należy przechowywać zgodnie z załącznikiem III.

1.1.2. Fragmenty części przystolonowych umieścić w nieużywanych wcześniej pojemnikach jednorazowego użytku, które można szczelnie zamknąć (w przypadku powtórnego użycia pojemników należy je starannie oczyścić i zdezynfekować przy użyciu związków chloru). Pobrane fragmenty części przystolonowych najlepiej poddać obróbce niezwłocznie. Jeżeli jednak nie będzie to możliwe, przechować je w pojemniku bez dodatku roztworu buforowego w lodówce nie dłużej niż 72 godziny lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej. Z pobranymi fragmentami części przystolonowych postępować według jednej z następujących procedur: a) fragmenty tkanki przystolonowej pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub b) fragmenty tkanki przystolonowej homogenizować z odpowiednią ilością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) albo z użyciem miksera (np. Waring lub Ultra Thurax), albo przez rozdrabnianie w szczelnie zamkniętej jednorazowej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba z polietylenu o dużej wytrzymałości, 150 x 250 mm; sterylizowane promieniowaniem), używając gumowego młotka lub odpowiedniego aparatu do rozdrabniania (np. Homex). Uwaga/ jeśli próby są homogenizowane przy użyciu miksera, ryzyko kontaminacji między próbami jest znaczne. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby nie dopuścić do powstania aerozolu lub rozlania w czasie procesu ekstrakcji. Należy się upewnić, że do każdej próby używane są świeżo wysterylizowane ostrza i naczynia miksera. Jeśli ma być stosowany test PCR, unikać przeniesienia DNA na pojemniki lub aparaty do rozdrabniania. JeFśli ma być zastosowany test PCR, zleca się rozdrabnianie w torebkach i stosowanie jednorazowych probówek.

1.1.3. Zdekantować supernatant. Jeśli jest zbyt mętny, sklarować – albo przez odwirowanie przy niskiej liczbie obrotów (przy nie więcej niż 180 g przez 10 minut w temperaturze 4–10 °C) lub przez filtrację w próżni (40–100 µm), myjąc filtr dodatkowym (10 ml) buforem do ekstrakcji.

1.1.4. Zagęścić frakcję bakterii przez odwirowanie przy 7 000 g przez 15 minut (lub 10 000 g przez 10 minut) w temperaturze 4–10 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu

1.1.5. Zawiesić powtórnie osad w 1,5 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4). Stosować 500 µl do badań na obecność R. solanacearum, 500 µl na obecność Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus i 500 µl do celów porównawczych. Dodać sterylną glicerynę aż do uzyskania ostatecznego stężenia 10–25 % (obj./obj.) i dodać do 500 µl zawiesiny porównawczej i do pozostałej zawiesiny testowej, zworteksować i przechowywać w temperaturze od 16 do 24 °C (tygodnie) lub od 68 do 86 °C (miesiące). W czasie wykonywania testu przechowywać zawiesiny testowe w temperaturze 4–10 °C. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie jest wskazane. Jeśli konieczny jest transport ekstraktu, zapewnić dostawę w przenośnej lodówce w ciągu 24 lub 48 godzin.

1.1.6. Jest niezwykle ważne, aby w celu uniknięcia kontaminacji wszystkie kontrole pozytywne R. solanacearum i próby badać osobno. Odnosi się to zarówno do szkiełek IF, jak i do wszystkich testów.

1.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:

Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)

Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)

Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)

Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)

Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)

Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)

2. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich

2.1. Przygotowanie próby

Uwaga: Przy wykrywaniu utajonych populacji R. solanacearum zaleca się przebadanie prób złożonych. Procedurę tę można łatwo zastosować do prób złożonych o wielkości do 200 części łodygi. Przy wykonywaniu badań powinny się one opierać o statystycznie reprezentatywną próbę badanej populacji rośliny.

2.1.1. Pobrać fragmenty łodygi o wielkości 1–2 cm do zamkniętego sterylnego pojemnika zgodnie z poniższą procedurą próbobrania: Sadzonki pomidora w szkółce: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą. Rośliny pomidora hodowane na polu lub w szklarni: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać najniższy pęd boczny z każdej rośliny, ucinając go tuż nad połączeniem z łodygą główną. Z każdego pędu bocznego odciąć najniższy 1 cm fragment. Inni żywiciele: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża lub sekatora pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą. W przypadku S. dulcamara lub innych roślin żywicielskich rosnących w wodzie, pobrać 1–2 cm fragmenty z łodygi znajdującej się pod wodą lub rozłogi z korzeniami wodnymi. Podczas próbobrania w danym miejscu zaleca się przebadanie statystycznie reprezentatywnej próby składającej się z przynajmniej 10 roślin z miejsca próbobrania każdego potencjalnego żywiciela. Wykrycie patogenu będzie najbardziej wiarygodne późną wiosną, latem i jesienią, choć u wieloletnich Solanum dulcamara rosnących w ciekach wodnych porażenie naturalne można wykrywać przez cały rok. Znani żywiciele to samosiewy ziemniaka (groundkeeper), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium i inni członkowie rodziny Solanaceae. Inni żywiciele to Pelargonium spp. oraz Portulaca oleracea. Niektóre gatunki chwastów europejskich, których korzenie lub ich rizosfera w pewnych szczególnych warunkach środowiskowych mogą potencjalnie stanowić rezerwuar populacji R. solanacearum biowar 2/rasa 3, to: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra oraz Urtica dioica. Uwaga: Na tym etapie można zastosować wizualne badanie na obecność wewnętrznych objawów (przebarwienie wiązek naczyniowych lub wyciek śluzu bakteryjnego). Odłożyć na bok wszystkie fragmenty łodygi wykazujące objawy i przebadać je oddzielnie (patrz: sekcja II).

2.1.2. Zdezynfekować fragmenty łodygi krótko przy pomocy 70 % alkoholu etylowego i natychmiast wytrzeć je do sucha przy pomocy bibuły. Po czym poddać fragmenty łodyg jednej z następujących procedur: a) fragmenty pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub b) rozpocząć procedurę bezzwłocznie, miażdżąc odcinki w mocnej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba) z odpowiednią ilością buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4), używając gumowego młotka lub odpowiedniego urządzenia do rozdrabniania (np. Homex). Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać odcinki łodyg nie dłużej niż 72 godziny w lodówce lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.

2.1.3. Zdekantować supernatant po ustaleniu się przez 15 minut.

2.1.4. Dalsze klaryfikowanie ekstraktu lub zagęszczanie frakcji bakteryjnej zwykle nie jest wymagane, ale można je osiągnąć przez filtrację i/lub odwirowanie, jak opisano w częściach III.1.1.3–1.1.5.

2.1.5. Podzielić czysty lub stężony ekstrakt z próby na dwie równe części. W czasie przeprowadzania testu jedną połowę trzymać w temperaturze 4–10 °C, a drugą połowę – z 10–25 % (obj./obj.) – sterylnego glicerolu przechowywać w temperaturze 16 do 24 °C (tygodnie) lub 68 do 86 °C (miesiące), jeśli wymagane są dalsze testy.

2.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:

Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)

Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)

Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)

Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)

Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)

Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)

SEKCJA IV

1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

Zasada

Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach wód powierzchniowych i można go zastosować do badania prób ścieków z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że oczekiwana czułość wykrywania zmienia się w zależności od substratu. Na czułość badania izolacji wpływ mają populacje konkurujących bakterii saprofitycznych, które są na ogół o wiele większe przy przetwarzaniu ziemniaków i w ściekach niż w wodzie powierzchniowej. Zakłada się, że poniższy schemat wykryje zaledwie 103 komórek na litr w wodzie powierzchniowej, natomiast czułość wykrywania przy przetwarzaniu ziemniaków lub w ściekach będzie prawdopodobnie znacznie niższa. Z tego powodu zaleca się badać ścieki po ich utylizacji (np. sedymentacji lub przefiltrowaniu), w czasie których to operacji zmniejszają się populacje saprofityczne. Ograniczenia czułości schematu badania powinno się wziąć pod uwagę przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych. Schemat ten był z powodzeniem stosowany w pracach badawczych dla ustalenia występowania lub braku patogenu w wodzie powierzchniowej, jednak należy pamiętać o jego ograniczeniach przy używaniu go do podobnych badań ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych.

2.1. Przygotowanie próby

Uwaga:

— Wykrycie R. solanacearum w wodzie powierzchniowej jest najbardziej pewne późną wiosną, latem i jesienią, gdy temperatura wody przekracza 15 °C.

— Wielokrotne próbobranie w różnych okresach w powyższym terminie w wyznaczonych punktach zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia dzięki zmniejszeniu skutków zmian klimatycznych.

— Pod uwagę należy wziąć skutki ulewnych deszczów i lokalizację cieków wodnych dla uniknięcia skutków nadmiernego rozwodnienia, co może wpływać na zamaskowanie obecności patogenu.

— Próby wody należy pobrać w sąsiedztwie roślin żywicielskich, jeśli takie występują.

2.1.1. W wybranych punktach próbobrania pobrać próby wody, wypełniając nią jednorazowe sterylne probówki lub butelki na głębokości, o ile to możliwe, poniżej 30 cm i w promieniu 2 m od brzegu. W przypadku ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, próby należy pobrać z punktu usuwania ścieków. Zaleca się stosowanie prób o wielkości do 500 ml na punkt próbobrania. Jeśli preferowane są próby mniejsze, zaleca się pobieranie prób przynajmniej 3 razy z każdego punktu próbobrania, z czego każda próba składa się z 2 podprób, każda o objętości minimum 30 ml. Przy intensywnych badaniach należy wybrać przynajmniej 3 punkty próbobrania na odcinku cieku wodnego o długości 3 km i zagwarantować, że zostaną pobrane próby również z dopływów.

2.1.2. Próby transportować w niskiej temperaturze (4–10 °C), bez dostępu światła i przebadać w ciągu 24 godzin.

2.1.3. W miarę potrzeby przy pomocy jednej z poniższych metod można zagęścić frakcję bakteryjną: a) wirować 30–50 ml podpróby w 10 000 g przez 10 minut (lub 7 000 g przez 15 minut), najlepiej w temperaturze 4–10 °C, usunąć zawiesinę i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4); b) przeprowadzić filtrację membranową (minimalny rozmiar porów 0,45 µm), po której przemyć filtr 5–10 ml buforu do zwieszania osadu i zebrać popłuczyny. Metoda ta ma zastosowanie do większych objętości wody zawierającej małą ilość saprofitów. Zagęszczania nie poleca się zazwyczaj dla prób ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, ponieważ zwiększona populacja konkurujących bakterii saprofitycznych hamuje wykrywanie Ralstonia solanacearum.

2.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.

SEKCJA V

1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

Zasada

Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach gleby, lecz można go również wykorzystać do badania prób stałego lub ciekłego odpadu z obróbki ziemniaka. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że metody te nie są wystarczająco czułe do zagwarantowania wykrywania nisko i/lub nieregularnie rozproszonych populacji Ralstonia solanacearum, które mogą występować w naturalnie porażonych próbach tych substratów.

Przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych, jak również przy badaniu w celu określenia obecności lub nieobecności patogenu w glebie i odpadach powinno się wziąć pod uwagę ograniczenia czułości schematu badania. Najbardziej wiarygodnym badaniem obecności patogenu w glebie jest posadzenie żywiciela podatnego na chorobę i kontrolowanie go pod względem porażenia, lecz nawet przy tej metodzie niskie poziomy porażenia nie zostaną wykryte.

2.1. Przygotowanie próby

2.1.1. Próbobranie gleby z pola powinno być wykonane zgodnie ze standardowymi zasadami stosowanymi dla prób nicieniowych. Należy pobrać 0,5–1 kg ziemi dla każdej próby z 60 miejsc na każde 0,3 ha z głębokości 10–20 cm (lub w siatce 7 x 7 metrów). Jeśli istnieje podejrzenie występowania patogenu, należy zwiększyć liczbę punktów poboru do 120 na 0,3 ha. Przed badaniem próby trzymać w temperaturze 12–15 °C. Próby osadów z obróbki ziemniaków i ścieków należy sporządzić, pobierając łącznie 1 kg z punktów próbobrania, tak aby były reprezentatywne dla całkowitej wielkości badanego osadu. Przed badaniem dobrze wymieszać każdą próbę.

2.1.2. Podpróby 10–25 g ziemi lub osadu zawiesić w 60–150 ml buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4) i wytrząsać na wstrząsarce obrotowej (250 obr./min) przez okres do 2 godzin. W razie potrzeby w rozdrobnieniu może pomóc dodanie 0,02 % sterylnego Tween-20 i 10–20 g sterylnego żwiru.

2.1.3. W czasie badania utrzymywać zawiesinę w temperaturze 4 °C.

2.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.

SEKCJA VI

ZOPTYMALIZOWANE PROTOKOŁY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI R. SOLANACEARUM

A. TESTY DIAGNOSTYCZNE I WYKRYWANIE

1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

Obecność R. solanacearum w więdnących łodygach ziemniaka lub pomidora lub innych roślin żywicielskich można stwierdzić, wykonując poniższe proste badanie wstępne: uciąć łodygę tuż nad poziomem gleby. Umieścić odciętą powierzchnię łodygi w probówce napełnionej czystą wodą. Po kilku minutach można zaobserwować charakterystyczny samoczynny wypływ śluzu bakteryjnego z przeciętych wiązek przewodzących.

2. Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu

1. Przygotować rozmaz śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki albo rozmaz z 48-godzinnej hodowli na pożywce YPGA lub SPA (dodatek 2) na szkiełku mikroskopowym.

2. Przygotować rozmazy kontroli pozytywnej ze szczepu biowar 2 R. solanacearum, oraz jeśli konieczne, przygotować rozmaz kontroli negatywnej PHB sp.

3. Pozostawić rozmazy do wyschnięcia i przesunąć dolną część szkiełka kilkakrotnie w płomieniu palnika, w celu utrwalenia rozmazu.

4. Preparat wybarwić błękitem nilu lub czernią sudanowa i obserwować pod mikroskopem zgodnie z poniższym opisem.

Badanie z błękitem Nilu:

a) Zanurzyć utrwalony rozmaz w 1 % wodnym roztworze błękitu nilu A i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C.

b) Zlać roztwór barwiący. Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.

c) Zanurzyć rozmaz w 8 % wodnym roztworze kwasu octowego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.

d) Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.

e) Ponownie zwilżyć rozmaz kroplą wody i nałożyć szkiełko przykrywkowe.

f) Oglądać rozmaz pod mikroskopem epifluorescencyjnym w świetle 450 nm, pod warstwą oleju immersyjnego, przy powiększeniu 600–1 000 razy, używając do tego celu obiektywu olejowego lub wodnego.

g) Sprawdzić, czy pojawi się jasna, pomarańczowa fluorescencja granulek PHB. Sprawdzić także w świetle normalnym, czy wewnątrz komórek znajdują się granulki i czy morfologia komórek ma cechy typowe dla R. solanacearum.

Badanie z czernią sudanową:

a) Zanurzyć utrwalony rozmaz w 0,3 % roztworze czerni sudanowej B w 70 % alkoholu etylowym i inkubować przez 10 minut w temperaturze otoczenia.

b) Zlać roztwór barwiący i krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu, usuwając nadmiar wody bibułą.

c) Zanurzyć szkiełka na chwilę w ksylenie i osuszyć na bibule. Uwaga: Ksylen jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.

d) Zanurzyć szkiełka w 0,5 % (w/v) wodnym roztworze safraniny i pozostawić na 10 sekund w temperaturze otoczenia. Uwaga: Safranina jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.

e) Wypłukać delikatnie wodą z kranu, osuszyć na bibule i nałożyć szkiełko przykrywkowe.

f) Oglądać wybarwiony rozmaz pod mikroskopem, stosując światło przechodzące, pod warstwą olejku immersyjnego, przy powiększeniu 1 000 razy z użyciem obiektywu olejowego.

g) Granulki PHB w komórkach R. solanacearum wybarwiają się na kolor czarno-niebieski, a ściany komórkowe na różowo.

3. Test aglutynacji serologicznej

Aglutynacja komórek R. solanacearum w śluzie bakteryjnym lub ekstrakcie z tkanek symptomatycznych jest najlepiej widoczna przy użyciu zatwierdzonych przeciwciał (patrz: dodatek 3) oznaczonych odpowiednio zabarwionymi markerami, takimi jak czerwone komórki Staphylococcus aureus lub zabarwione elementy lateksowe. Używając zestawu dostępnego w obrocie handlowym (patrz: dodatek 3), należy postępować zgodnie ze wskazówkami producenta. W przeciwnym razie należy wykonać następującą procedurę:

a) Wymieszać krople zawiesiny przeciwciał i śluzu bakteryjnego (ok. 5 µl każdej) na okienkach szkiełek z wieloma zagłębieniami.

b) Przygotować kontrolę pozytywną i negatywną przy użyciu zawiesin R. solanacearum biowar 2 i szczepu heterogenicznego.

c) Mieszając delikatnie przez 15 sekund, można zaobserwować aglutynację w próbach pozytywnych.

4. Izolacja selektywna

4.1. Izolacja na podłoże selektywne

Uwaga: Przed użyciem tej metody po raz pierwszy, należy wykonać wstępne badania mające zagwarantować odtwarzalność wykrywania rzędu 103 do 104 jednostek R. solanacearum tworzących kolonie na ml dodany do ekstraktu prób, które uprzednio zostały przetestowane jako negatywne.

Należy użyć właściwie zatwierdzonej pożywki selektywnej, takiej jak SMSA (zmodyfikowanej przez Elphinstone et al., 1996; patrz: dodatek 2).

Należy uważać, aby odróżnić R. solanacearum od innych bakterii będących w stanie rozwinąć kolonie na pożywce. Poza tym, kolonie R. solanacearum mogą wykazywać morfologię nietypową, jeśli płytki są przepełnione lub obecne są również bakterie antagonistyczne. Jeśli podejrzewa się występowanie skutków konkurencji lub antagonizmu, próby należy ponownie przebadać z użyciem innego testu.

Najwyższej czułości wykrywania przy użyciu tej metody można oczekiwać przy użyciu świeżo przygotowanych ekstraktów. Jednak metoda ta jest używana również w odniesieniu do ekstraktów przechowywanych w glicerynie w temperaturze 68 do 86 °C.

Jako kontrole pozytywne należy przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny 106 cfu na ml wirulentnego szczepu biowar 2 R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Dla uniknięcia ewentualnej kontaminacji kontrole pozytywne należy przygotować w ścisłej separacji od badanych prób.

W przypadku każdej nowo przygotowanej partii pożywki selektywnej przed użyciem jej do przebadania rutynowych prób należy sprawdzić jej przydatność do wzrostu patogenu.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

4.1.1. Zastosować odpowiednią technikę rozcieńczeń płytkowych w celu zapewnienia, że wszelkie saprofityczne populacje tworzące kolonie zostają rozcieńczone. Nanieść 50–100 µl na płytkę ekstraktu i każdego rozcieńczenia.

4.1.2. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C. Oglądanie płytek rozpocząć po 48 godzinach, a potem kontynuować codziennie do 6 dni. Typowe kolonie R. solanacearum na pożywce SMSA są mlecznobiałe, płaskie, nieregularne oraz ciekłe, a po 3 dniach inkubacji ich środek staje się od różowego do krwistoczerwonego z wewnętrznymi smugami lub spiralami. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Uwaga: Na tej pożywce tworzą się czasami nietypowe kolonie R. solanacearum. Mogą być małe, okrągłe, całkiem czerwone i nieciekłe lub tylko częściowo ciekłe i w związku z tym mogą występować problemy z odróżnieniem ich od bakterii saprofitycznych tworzących kolonie.

4.1.3. W celu uzyskania pojedynczych kolonii oczyścić kolonie wstępne przez pasażowanie lub metodą rozcieńczeń płytkowych R. solanacearum na pożywce odżywczej (patrz: dodatek 2).

4.1.4. W celu krótkotrwałego przechowywania trzymać kultury w sterylnej wodzie (pH 6–8, bez chloru) w temperaturze pokojowej w ciemności lub w celu długotrwałego przechowywania w odpowiedniej pożywce krioochronnej lub w temperaturze 68 do 86 °C lub w postaci liofilizowanej.

4.1.5. Zidentyfikować czyste kultury (patrz: sekcja VI.B.) i wykonać test patogeniczności (patrz: sekcja VI. C).

Wynik posiewu na podłoże selektywne jest negatywny w przypadku, gdy po 6 dniach nie obserwuje się żadnych kolonii bakteryjnych, albo jeżeli nie odnaleziono żadnych kolonii o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum, pod warunkiem że nie podejrzewa się inhibicji kolonii wskutek konkurencji lub antagonizmu przez inne bakterie i że na płytkach z kontrolą pozytywną potwierdzono obecność kolonii charakterystycznych dla R. solanacearum. Wynik posiewu na podłoże selektywne jest pozytywny, jeżeli wyizolowano kolonie o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum.

4.2. Procedura wzbogacenia

Należy użyć zatwierdzonej pożywki wzbogacającej, takiej jak zmodyfikowana pożywka Wilbrink (patrz: dodatek 2).

Procedurę tę można wykorzystywać do selektywnego zwiększania populacji R. solanacearum w ekstraktach i zwiększenia czułości wykrywania. Procedura ta również skutecznie rozcieńcza inhibitory reakcji PCR (1:100). Należy jednak pamiętać, że wzbogacenie R. solanacearum może się nie udać wskutek konkurencji lub antagonizmu ze strony organizmów saprofitycznych, które często są równocześnie wzbogacane. Z tego powodu izolacja R. solanacearum ze wzbogaconych kultur pożywki może okazać się trudna. Poza tym, jako że można zwiększyć populację serologicznie zbliżonych saprofitów, zaleca się stosowanie konkretnych przeciwciał monoklinalnych raczej niż przeciwciał poliklonalnych, gdy stosowany ma być test ELISA.

4.2.1. Przy wzbogacaniu do testu PCR przenieść 100 µl ekstraktu do 10 ml pożywki wzbogaconej (dodatek 2) uprzednio umieszczonej w zlewkach lub kolbach pozbawionych DNA. Przy wzbogacaniu do testu ELISA można użyć większych proporcji ekstraktu do pożywki (np. 100 µl w 1,0 ml pożywki wzbogaconej).

4.2.2. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze od 27 do 30 °C w hodowli wstrząsanej lub statycznej, a przykrywka powinna luźno przylegać do probówki, tak by umożliwić dostęp do powietrza.

4.2.3. Dobrze wymieszać przed użyciem w teście ELISA lub teście PCR.

4.2.4. Ze wzbogaconą pożywką postępować w taki sam sposób, jak z próbą w powyższych testach. Uwaga: Jeśli przewiduje się zahamowanie procesu wzbogacenia R. solanacearum z powodu wysokich populacji niektórych konkurujących bakterii saprofitycznych, lepsze wyniki może dać wzbogacenie ekstraktów przed odwirowaniem lub innymi sposobami zagęszczania patogenu.

5. Test IF

Zasada

Stosowanie testu IF jako głównego testu przesiewowego jest zalecane z uwagi na wykazaną zdolność osiągania wymaganych progów wykrywalności.

Kiedy test IF jest stosowany jako główny test przesiewowy, a wynik IF jest dodatni, konieczne jest zastosowanie izolacji, testu PCR lub FISH jako drugiego testu przesiewowego. Kiedy test IF jest stosowany jako drugi test przesiewowy, a odczyt IF jest dodatni, do zakończenia analizy wymagane jest przeprowadzanie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.

Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw r. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano jest określane jako największe rozcieńczenie, przy którym zachodzi optymalna reakcja w czasie testowania zawiesiny od 105do 106 komórek na ml homologicznego szczepu R. solanacearum i przy użyciu odpowiedniego koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), zgodnie z zaleceniami producenta. Stężone przeciwciała poliklonalne powinny mieć miano IF przynajmniej 1:2 000. W czasie przeprowadzania testu przeciwciała powinny być stosowane przy stężeniu roboczym (WD) bliskim lub równym mianu.

Test powinien być przeprowadzany na świeżo przygotowanych ekstraktach z prób. Jeśli to konieczne, może być z powodzeniem przeprowadzany na ekstraktach przechowywanych w temperaturze od 68 do 86 °C w glicerolu. Glicerol może być usunięty z próby przez dodanie 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4), powtórne odwirowanie przez 15 minut przy 7 000 g i powtórne zawieszenie w równej objętości buforu do zawieszania osadu. Często nie jest to konieczne, zwłaszcza jeśli preparaty z prób były utrwalane na szkiełkach przy pomocy opalania.

Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej szczepu homologicznego lub innego szczepu odniesienia R. solanacearum zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, jak szczegółowo opisano w dodatku 3B, oraz ewentualnie w buforze.

W miarę możliwości na to samo szkiełko należy nanieść jako podobną kontrolę naturalnie zainfekowane tkanki (zachowane w formie liofilizowanej lub zamrożone w temperaturze od 16 do 24 °C).

Jako kontrolę negatywną na R. solanacearum stosować ekstrakty prób, które wcześniej dały w teście wynik ujemny.

Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.

Używać wielopunktowych szkiełek mikroskopowych, najlepiej z 10 okienkami, o średnicy co najmniej 6 mm.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

5.1. Przygotować szkiełka do badań, stosując jedną z poniższych procedur:

i) dla prób zawierających stosunkowo niewiele skrobi: Odmierzyć pipetą standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć odpowiednio większą objętość) w rozcieńczeniu 1/100 zawieszonego osadu ziemniaka na pierwsze okienko. Następnie odmierzyć pipetą podobną objętość nierozcieńczonego osadu (1/1) na pozostałe okienka w szeregu. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 1;

ii) dla innych osadów: Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia (1/10, 1/100) zawieszonego osadu w buforze do zawieszania osadu. Odmierzyć standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć proporcjonalnie większą objętość) zawiesiny na szereg okienek. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 2.

5.2. Wysuszyć krople w temperaturze otoczenia lub ogrzewając je w temperaturze od 40 do 45 °C. Utrwalić komórki bakteryjne na szkiełku przez ogrzanie (15 minut w temp. 60 °C), albo umieszczenie w płomieniu, lub też za pomocą 95 % alkoholu etylowego zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostawcy przeciwciał. W miarę potrzeby utrwalone szkiełka można przechowywać zamrożone w suchym pojemniku przez jak najkrótszy okres (maksymalnie przez 3 miesiące) przed dalszym badaniem.

5.3. Procedura IF i) Przygotować szkiełka tak jak opisano w ust. 5.1 ppkt i): Przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń. Pierwsze okienko powinno mieć 1/2 miana (T/2), pozostałe 1/4 miana (T/4), 1/2 miana (T/2), miano (T) i dwukrotność miana (2T). ii) Przygotować szkiełka do badania, jak opisano w ust. 5.1 ppkt ii): Przygotować rozcieńczenie robocze (WD) przeciwciał w buforze IF. Rozcieńczenie robocze ma wpływ na specyficzność.



Rysunek 1 Przygotowanie szkiełka roboczego według 5.1 i) i 5.3 i) Rozcieńczenia próby ponownie zawieszonego osadu w buforze 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Rozcieńczenie ponownie zawieszonego osadu (T = miano) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dwukrotne rozcieńczenia surowicy/przeciwciała Próba 1 1 2 3 4 5 Powtórzenie próby 1 lub próba 2 6 7 8 9 10



Rysunek 2 Przygotowanie szkiełka roboczego według ust. 5.1 ppkt ii) i 5.3 ppkt ii) Rozcieńczenie robocze surowicy/przeciwciała 1/1 1/10 1/100 puste puste  Dziesięciokrotne rozcieńczenia ponownie zawieszonego osadu Próba 1 1 2 3 4 5 Powtórzenie próby 1 lub próba 2 6 7 8 9 10 5.3.1. Ułożyć szkiełka na wilgotnej bibule. Pokryć całkowicie każde okienko rozcieńczonymi przeciwciałami. Objętość nakładanej surowicy musi być równa objętości nakładanego ekstraktu. W przypadku braku szczegółowych instrukcji od dostawcy przeciwciał należy zastosować następującą procedurę: 5.3.2. Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C). 5.3.3. Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek i przepłukać szkiełka starannie buforem IF. Zanurzyć je na 5 minut w buforze IF – Tween (dodatek 4), a następnie w buforze IF. Unikać powstawania aerozoli i przenoszenia kropelek, co mogłoby doprowadzić do kontaminacji miedzy próbami. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci przez delikatne osuszanie bibułą. 5.3.4. Ułożyć szkiełka na wilgotnym papierze. Pokryć okienka do badań oraz okienko FTIC rozcieńczonym koniugatem FTIC, stosowanym do oznaczania miana. Objętość koniugatu nałożonego na okienka musi być identyczna z objętością zastosowanych przeciwciał. 5.3.5. Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C). 5.3.6. Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek. Obmyć i przepłukać tak jak poprzednio (5.3.3). Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci. 5.3.7. Na każde okienko nanieść po 5–10 l 0,1 M buforu fosforanowego-glicerynowego (dodatek 4) albo podobną ilością dostępnego w obrocie utrwalacza i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym.

5.4. Odczytywanie testu IF 5.4.1. Sprawdzić szkiełka pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem właściwym dla wzbudzenia FITC, pod olejkiem imersyjnym lub wodą, przy powiększeniu 500–1 000 razy. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość. Sprawdzić najpierw okienko z kontrolą pozytywną. Komórki muszą fluoryzować jasno i być zupełnie wybarwione przy określonym mianie przeciwciał lub rozcieńczeniu roboczym. Badanie IF (sekcja VI.A.5) należy powtórzyć, jeżeli wybarwienie nie jest właściwe. 5.4.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być równoważna intensywności wykazywanej przez pozytywny szczep kontrolny przy tym samym rozcieńczeniu surowicy. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić. W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii wykazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli komórki pozytywne zostają odnalezione (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka. 5.4.3. Ze specyficznością testu immunofluorescencyjnego wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i odcinka łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz bakterii saprofitycznych o wielkości i morfologii podobnej do R. solanacearum i dających reakcje krzyżowe. 5.4.4. Uwzględniać wyłącznie fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii przy mianie lub rozcieńczeniu roboczym, takim jak w 5.3. 5.4.5. Interpretacja wyników testu IF: i) Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 5). Wynik IF jest dodatni dla prób z przynajmniej 5 x 103 komórek na ml zawieszonego osadu. Próba uznawana jest za potencjalnie porażoną i wymagane są dalsze testy. ii) Odczyt IF jest negatywny dla prób o liczbie komórek mniejszej niż 5 x 103 na ml zawieszonego osadu, a próba uznawana jest za negatywną. Kolejne testy nie są wymagane.

6. Test PCR

Zasada

Przy wykorzystaniu testu PCR jako podstawowego badania przesiewowego i uzyskaniu w nim pozytywnego wyniku jako drugie badanie przesiewowe należy wykonać izolację lub test IF. Gdy test PCR jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.

Pełne wykorzystanie tej metody jako głównego badania przesiewowego zaleca się tylko wtedy, jeśli posiada się specjalistyczną, fachową wiedzę na ten temat.

Uwaga: Wstępne badanie przy użyciu tej metody powinno pozwolić na uzyskanie odtwarzalnego wykrywania rzędu od 103 do 104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, które w poprzednim badaniu wypadły negatywnie. Dla uzyskania maksymalnych poziomów czułości i specyficzności we wszystkich laboratoriach wymagane może być przeprowadzenie eksperymentów optymalizujących.

Należy używać zatwierdzonych odczynników PCR i protokołów (patrz: dodatek 6). Zaleca się wybór metody z kontrolą wewnętrzną.

Należy zastosować odpowiednie środki bezpieczeństwa w celu uniknięcia kontaminacji próbki docelowym DNA. Test PCR powinni wykonywać doświadczeni technicy w wyspecjalizowanych laboratoriach biologii molekularnej, tak aby zminimalizować możliwość kontaminacji docelowym DNA.

Kontrola negatywna (dla ekstrakcji DNA i procedur PCR) powinna być zawsze wykonywana jako ostatnia próba w procedurze tak, aby jasno stwierdzić, czy pojawiło się jakiekolwiek przeniesienie DNA.

W badaniu PCR należy zawrzeć następujące kontrolę negatywne:

— ekstrakt próby, który poprzednio został uznany za negatywny dla R. solanacearum,

— próby kontrolne buforu używanego do ekstrakcji bakterii i DNA z próby,

— mieszaninę do reakcji PCR.

Należy zawrzeć następujące kontrole pozytywne::

— zawiesiny osadu, do którego dodano R. solanacearum (przygotowanie patrz: dodatek 3 B),

— zawiesinę 106 komórek przypadających na ml wirulentnego izolatu R. solanacearum zawieszonego w wodzie (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3 B),

— w miarę możliwości korzystać również z ekstraktów DNA z kontroli pozytywnych DNA otrzymanych z testu PCR.

Dla uniknięcia potencjalnej kontaminacji, kontrole pozytywne przygotować w miejscu oddzielonym od prób, które mają być badane.

Ekstrakty stanowiące próby powinny być w jak największym stopniu pozbawione ziemi. W pewnych warunkach radzi się więc, aby ekstrakty przygotować z mytych ziemniaków, jeśli mają zostać zastosowane protokoły PCR.

Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.

6.1. Metody oczyszczania DNA

Użyć opisanych powyżej kontroli pozytywnych i negatywnych (patrz: dodatek 3).

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

Dostępnych jest wiele metod oczyszczania docelowego DNA, ze złożonych substratów próby, które usuwają inhibitory PCR i inne reakcje enzymatyczne i koncentrują docelowe DNA w ekstrakcie próby. Metoda przedstawiona poniżej została zoptymalizowana do użytku z zatwierdzoną metodą PCR przedstawioną w dodatku 6.

a) Metoda zgodnie z Pastrik (2000)

1. Odmierzyć pipetą 220 µl buforu do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa.

2. Dodać 100 µl ekstraktu i umieścić w jednostce grzewczej lub łaźni wodnej w temp. 95 °C na 10 min.

3. Trzymać probówkę w lodzie przez 5 min.

4. Dodać 80 µl roztworu lizozymowego (50 mg lizozymu przypadających na ml w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) i inkubować w temp. 37 °C przez 30 min.

5. Dodać 220 µl roztworu Easy DNA® A (Invitrogen), dobrze wymieszać przez worteksowanie i inkubować w temp. 65 °C przez 30 min.

6. Dodać 100 µl roztworu Easy DNA® B (Invitrogen), energicznie wymieszać przez worteksowanie, aż w probówce uwolni się osad i próbka będzie równomiernie lepka.

7. Dodać 500 µl chloroformu i wymieszać przez worteksowanie, aż lepkość spadnie i mieszanina będzie jednorodna.

8. Odwirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C, aby wytrącić fazy i utworzyć międzyfazę.

9. Przenieść górną fazę do świeżej probówki typu Eppendorf.

10. Dodać 1 ml 100 % alkoholu etylowego (20 °C), krótko wymieszać przez worteksowanie i inkubować na lodzie przez 10 min.

11. Wirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C i usunąć alkohol etylowy z osadu.

12. Dodać 500 µl 80 % alkoholu etylowego (20 °C) i wymieszać przez odwracanie probówki.

13. Wirować przy 15 000 g przez 10 min w temp. 4 °C, zostawić osad i usunąć etanol.

14. Zostawić osad do wysuszenia powietrzem lub w wirówce do suszenia DNA.

15. Zawiesić ponownie osad w 100 µl sterylnej UPW i zostawić w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 20 minut.

16. Przechowywać w temp. 20 °C, aż będzie potrzebny do badania PCR.

17. Oddzielić wszelki biały osad, wirując i użyć 5 µl zawiesiny zawierającej DNA do testu PCR.

b) Inne metody

Można zastosować inne metody ekstrakcji DNA, np. Qiagen DNeasy Plant Kit, pod warunkiem że dowiedzione zostało, że są równie skuteczne w oczyszczaniu DNA pochodzącego z prób kontrolnych zawierających od 103 do 104 komórek patogenu przypadających na ml.

6.2. PCR

6.2.1. Przygotować matryce testowe i kontrolne dla PCR według zatwierdzonych protokołów (sekcja VI.A.6). Przygotować jedno dziesięciokrotne rozcieńczenie DNA z ekstraktu próby (1:10 w UPW).

6.2.2. Przygotować odpowiednią mieszaninę reakcyjną PCR i wymieszać w nieskażonym środowisku zgodnie z opublikowanymi protokołami (dodatek 6). W miarę możliwości radzi się użyć multipleksowego protokołu PCR zawierającego również wewnętrzną kontrolę PCR.

6.2.3. Dodać 2–5 µl ekstraktu DNA przypadającego na 25 µl objętości reakcji PCR w sterylnych probówkach do PCR według protokołów PCR (patrz: dodatek 6).

6.2.4. Dodać negatywną kontrolę zawierającą tylko mieszaninę reakcyjną PCR. Wymieszać i w miejsce próby dodać to samo źródło UPW, które było używane w mieszaninie PCR.

6.2.5. Umieścić probówki w tym samym termocyklerze, który używany był do badań wstępnych i uruchomić właściwie zoptymalizowany program PCR (dodatek 6).

6.3. Analiza produktu PCR

6.3.1. Rozdzielić produkty PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Użyć przynajmniej 12 µl zwielokrotnionej mieszaniny reakcyjnej DNA z każdej próby zmieszanej z 3 µl buforu obciążającego (dodatek 6) w 2,0 % (w/v) żelu agarozowym w buforze trisacetate-EDTA (TAE) (dodatek 6) przy 5–8 V przypadających na cm. Użyć odpowiedniego markera DNA, np. 100 bp ladder.

6.3.2. Uwidocznić paski DNA odbarwiając żel w bromku etydyny (0,5 mg/l) przez 30–60 min, stosując właściwe środki ostrożności przy obchodzeniu się z tym mutagenem.

6.3.3. Oglądać wybarwiony żel w transiluminatorze UV (λ = 302 nm), szukając zamplifikowanych produktów PCR o oczekiwanym rozmiarze (dodatek 6) i udokumentować wyniki.

6.3.4. Dla wszystkich nowych wyników/przypadków weryfikować autentyczność amplikonu PCR, przeprowadzając analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych na próbce pozostałego zamplifikowanego DNA przez inkubację w optymalnej temperaturze i przez odpowiedni czas z właściwym enzymem i buforem (patrz: dodatek 6). Rozdzielić strawione fragmenty za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak wcześniej i oglądać charakterystyczny układ fragmentów strawionych przez enzymy restrykcyjne w transiluminatorze UV po uprzednim barwieniu bromkiem etydyny. Porównać z niestrawioną i strawioną kontrolą pozytywną

Interpretacja wyników testu PCR:

Wynik testu PCR jest negatywny, jeśli nie wykryto specyficznego dla R. solanacearum fragmentu amplikonu PCR o oczekiwanym rozmiarze w danej próbie, a taki fragment znaleziono we wszystkich kontrolach pozytywnych (w przypadku multipleksowego PCR ze specyficznymi dla rośliny starterami kontroli wewnętrznej: drugi produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze musi zostać zamplifikowany w danej próbie).

Wynik testu PCR jest pozytywny, jeżeli wykryto specyficzny amplikon dla R. solanacearum o oczekiwanym rozmiarze i wzorze restrykcyjnym (jeśli taki jest wymagany), pod warunkiem, że nie jest on namnożony z jakiejkolwiek negatywnej próby kontrolnej. Wiarygodne potwierdzenie pozytywnego wyniku można również uzyskać, powtarzając badanie przy pomocy drugiego zestawu primerów PCR (dodatek 6).

Uwaga: Może istnieć podejrzenie inhibicji PCR, jeśli oczekiwany amplikon zostanie uzyskany z kontroli pozytywnej zawierającej R. solanacearum w wodzie, lecz z pozytywnych prób kontrolnych z R. solanacearum w ekstrakcie z ziemniaka uzyskano wyniki negatywne. W multipleksowych protokołach PCR z wewnętrznymi kontrolami PCR, na inhibicję reakcji wskazuje fakt, że nie został uzyskany żaden z dwóch amplikonów.

Jeśli z jednej lub większej ilości kontroli negatywnych uzyskano oczekiwany amplikon, wówczas można podejrzewać kontaminację.

7. Test FISH

Zasada

Jeżeli test FISH używany jest jako pierwsze badanie przesiewowe, a wynik jego jest pozytywny, należy wykonać izolację lub badanie IF jako drugie, obowiązkowe badanie przesiewowe. Gdy test FISH jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.

Uwaga: Użyć zatwierdzonych, specyficznych dla R. solanacearum sond oligonukleotydowych (patrz: dodatek 7). Badanie wstępne przy użyciu tej metody powinno pozwolić na odtwarzalne wykrywanie przynajmniej 103–104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, w stosunku do których uprzednio uzyskano wynik negatywny.

Następującą procedurę najlepiej jest stosować w przypadku świeżo przygotowanego ekstraktu z próby, lecz można ją stosować również w odniesieniu do ekstraktu przechowywanego w glicerynie w temperaturze od 16 do 24 °C lub od 68 do 86 °C.

Jako kontroli negatywnej użyć ekstraktu próby, w stosunku do której uprzednio uzyskano wynik negatywny dla R. solanacearum.

Jako kontrole pozytywne przygotować zawiesiny zawierające 105 do 106 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 3) w buforze fosforanowym 0,01M (PB) z 3–5-dniowej hodowli). Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej z homogenicznego szczepu lub innego szczepu referencyjnego R. solanacearum, zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, zgodnie z opisem w dodatku 3 B.

Stosowanie znakowanej FITC eubakteryjnej sondy oligonukleotydowej daje możliwość kontrolowania procesu hybrydyzacji, ponieważ barwione będą wszystkie eubakterie obecne w próbie.

Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A).

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

7.1. Utrwalanie ekstraktu z ziemniaka

Poniższa procedura oparta jest na pracy Wullings et al., (1998):

7.1.1. Przygotować roztwór utrwalający (patrz: dodatek 7).

7.1.2. Odmierzyć pipetą 100 µl ekstraktu z każdej próby do probówki Eppendorfa i odwirować przez 7 min przy 7 000 g.

7.1.3. Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 200 µl utrwalacza przygotowanego < 24 godzin wcześniej. Odwirować i inkubować przez 1 godzinę w lodówce.

7.1.4. Odwirować przez 7 min przy 7 000 g, usunąć supernatant i zawiesić ponownie osad w 75 µl 0,01M PB (patrz: dodatek 7).

7.1.5. Nanieść po 16 µl utrwalonych zawiesin na czyste szkiełko wielopunktowe tak, jak pokazano na rys. 7.1. Na szkiełko nakładać dwie różne próby, nierozcieńczone i w rozcieńczeniu 1:100, używając 10 µl ekstraktu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100 (w 0,01M PB). Pozostały roztwór próby (49 µl) może być przechowywany w 20 °C po dodaniu 1 objętości 96 % etanolu. W przypadku jeśli test FISH wymaga powtórzenia, usunąć etanol przez wirowanie i dodać tę samą ilość 0,01M PB (zworteksować).



Rysunek 7.1. Rozkład na szkiełku FISH Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2 okienko 1 okienko 2 okienko 3 okienko 4 okienko 5 Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2 okienko 6 okienko 7 okienko 8 okienko 9 okienko 10 Szkiełko nakrywkowe 1 Szkiełko nakrywkowe 2

7.1.6. Wysuszyć szkiełka na powietrzu (lub na płycie do suszenia szkiełek w temperaturze 37 °C) i utrwalić w płomieniu. W tym momencie procedurę można przerwać i kontynuować hybrydyzację w dniu następnym. Szkiełka powinny być przechowywane w suchym miejscu pozbawionym kurzu. w temperaturze pokojowej.

7.2. Hybrydyzacja

7.2.1. Odwodnić komórki w serii rozcieńczeń alkoholu etylowego o stężeniach 50 %, 80 % i 96 % przez 1 minutę w każdym. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w statywie na szkiełka.

7.2.2. Przygotować wilgotną komorę do inkubacji wykładając dno hermetycznego pojemnika bibułą lub papierem filtracyjnym nasączonym w 1x mieszaninie hybrydyzacyjnej (hybmix) (dodatek 7). Wstępnie inkubować pojemnik w cieplarce do hybrydyzacji w temperaturze 45 °C przez przynajmniej 10 minut.

7.2.3. Nanieść po 10 μl roztworu do hybrydyzacji (dodatek 7) na 8 okienek (okienka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 oraz 10; patrz: rys. 7.1) z każdego szkiełka, pozostawiając dwa okienka środkowe (3 i 8) puste.

7.2.4. Przykryć szkiełkami nakrywkowymi (24 x 24 mm) pierwsze i ostatnie 4 okienka, tak aby nie uwięzić przy tym powietrza. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej wilgotnej komorze i hybrydyzować przez 5 godzin w cieplarce w 45 °C w ciemności.

7.2.5. Przygotować 3 zlewki zawierające 1 l Milli Q (stopień molekularny) wody, 1 l 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej (334 ml 3x hybmix i 666 ml Milli Q wody) oraz 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix oraz 958 ml Milli Q wody). Inkubować wstępnie każdą z nich w łaźni wodnej w 45 °C.

7.2.6. Usunąć szkiełka nakrywkowe ze szkiełek i umieścić szkiełka w statywie.

7.2.7. Usunąć nadmiar sondy, inkubując przez 15 min w zlewce z 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej w temperaturze 45 °C.

7.2.8. Przenieść statyw do szkiełek do 1/8 hybmix roztworu wymywającego i inkubować przez następne 15 min.

7.2.9. Zanurzyć szkiełka na krótko w Milli Q wodzie i umieścić na bibule filtracyjnej. Usunąć nadmiar wilgoci pokrywając powierzchnie delikatnie bibułą filtracyjną. Odmierzyć pipetą 5–10 μl roztworu utrwalającego zapobiegającego odbarwieniu (np. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA lub równoważny) na każde okienko i nałożyć duże szkiełko nakrywkowe (24 x 60 mm) na powierzchnię całego szkiełka.

7.3. Odczyt testu FISH

7.3.1. Oglądać szkiełka natychmiast, używając mikroskopu dostosowanego do mikroskopii epifluoroscencyjnej pod powiększeniem 630 lub 1 000 x, pod olejkiem imersyjnym. Przy filtrze odpowiednim dla izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), komórki eubakteryjne (w tym większość komórek Gram ujemnych) są zabarwione na kolor fluorescencyjno zielony. Przy stosowaniu filtra do 5-izotiocyjanianu tetrametylorodaminy barwione komórki Cy3 R. solanacearum są fluoryzująco czerwone. Porównać morfologię komórek z tą w kontroli pozytywnej. W przypadku niewłaściwego zabarwienia test FISH (sekcja VI.A.7) należy powtórzyć. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.

7.3.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być taka sama lub większa niż szczepu użytego jako kontrola pozytywna. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.

7.3.3. W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii pokazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli odnalezione zostaną komórki pozytywne (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.

7.3.4. Ze specyficznością testu FISH wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i fragmentów łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz dających reakcje krzyżowe bakterii saprofitycznych o wielkości i budowie podobnej do R. solanacearum choć znacznie rzadziej niż w przypadku testu IF.

7.3.5. Pod uwagę brać należy jedynie fluoryzujące komórki o typowym rozmiarze i morfologii.

7.3.6. Interpretacja wyników testu FISH: i) Prawidłowe wyniki testu FISH uzyskuje się, jeśli przy użyciu filtra FITC zaobserwuje się jasne zielone komórki fluorescencyjne o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum i jeśli zaobserwuje się jasne fluorescencyjne czerwone komórki przy użyciu filtra rodaminowego we wszystkich kontrolach pozytywnych, a nie zaobserwuje się ich w żadnej kontroli negatywnej. Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 4). Próbki o odczycie 5 x 103 typowych komórek przypadających na ml ponownie zawieszonego osadu uznaje się za potencjalnie porażone. Konieczne wykonanie jest dalszych badań. Odczyt jest negatywny przy mniej niż 5 x 103 komórek typowych przypadających na ml zawieszonego osadu. ii) Test FISH jest negatywny, jeśli fluoryzujące czerwone komórki o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum nie zostaną wykryte przy użyciu filtra rodaminy, pod warunkiem zaobserwowania typowych fluoryzujących na czerwono komórek w preparatach kontroli pozytywnych przy użyciu filtra rodaminowego.

8. Testy ELISA

Zasada

Test ELISA możne być używany wyłącznie jako badanie fakultatywne wraz z badaniem IF, PCR lub FISH ponieważ ma ono niską czułość. Przy użyciu testu DAS ELISA, konieczne jest zastosowanie wzbogacenia i przeciwciał monoklonalnych (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Wzbogacenie prób przed użyciem w teście ELISA może okazać się pomocne dla zwiększenia czułości tego badania, lecz może się nie powieść z powodu konkurencji ze strony innych organizmów obecnych w próbie.

Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw R. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano określa się jako największe rozcieńczenie, przy którym pojawia się optymalna reakcja w trakcie badania zawiesiny zawierającej 105 do 106 komórek przypadających na ml szczepu homogenicznego R. solanacearum i przy użyciu właściwych koniugatów przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. Podczas badań rutynowych używa się dostępnych w handlu przeciwciał w rozcieńczeniu roboczym zbliżonym do wartości miana.

Określić miano przeciwciał na zawiesinie 105 do 106 komórek przypadających na ml homogenicznego szczepu R. solanacearum.

Dołączyć ekstrakt z próby, w przypadku którego uprzednie badanie wykazało negatywne wyniki na R. solanacearum i zawiesinę niereagujących krzyżowo bakterii w buforze fosforanowym (PBS) jako kontrolę negatywną.

Jako kontroli pozytywnej użyć ekstraktu próby, w przypadku którego uprzednie badanie dało negatywne wyniki, wymieszanego z 103 do 104 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 2 A i B). Dla porównania wyników na każdej płytce wykorzystać standardową zawiesinę zawierającą 105 do 106 komórek przypadających na ml w PBS R. solanacearum. Należy upewnić się, że na płytce titracyjnej kontrole pozytywne są właściwie oddzielone od prób badanych.

Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny jak próbę(-y).

Zatwierdzone zostały dwa protokoły testu ELISA:

a) Pośredni test ELISA (Elphinstone i wsp., 1995)

1. Użyć 100-200 µl ekstraktu próby. (Ogrzewanie przez 4 minuty w temperaturze 100 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym może w pewnych wypadkach zredukować niespecyficzne wyniki).

2. Dodać tę samą objętość podwójnie stężonego buforu powlekającego (dodatek 4) i zworteksować.

3. Nałożyć po 100 l do każdej z co najmniej dwóch studzienek na płytce (np. Nunc-Polysorp lub równoważny). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.

4. Usunąć ekstrakty ze studzienek. Przepłukać studzienki trzykrotnie buforem PBS-Tween (dodatek 4), pozostawiając w studzience ostatni roztwór używany do płukania na przynajmniej 5 minut.

5. Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał przeciw R. solanacearum w buforze blokującym (dodatek 4). W przypadku zatwierdzonych komercyjnych przeciwciał, użyć zalecanych rozcieńczeń (zazwyczaj o stężeniu dwukrotnie większym niż miano).

6. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

7. Usunąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).

8. Przygotować właściwe rozcieńczenia drugich przeciwciał koniugatu alkalicznej fosfatazy w buforze blokującym. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

9. Usunąć koniugaty przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).

10. Dodać 100 µl roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (dodatek 4) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.

b) DASI ELISA

1. Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał poliklonalnych przeciw R. solanacearum w buforze powlekającym pH 9,6 (dodatek 4). Dodać 200 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4–5 godz. lub przy 4 °C przez 16 godz.

2. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4). Dodać 190 µl ekstraktu próby do co najmniej 2 studzienek. Dodać także kontrolę pozytywną i negatywną do dwóch studzienek przypadających na płytkę. Inkubować przez 16 godz. w temperaturze 4 °C.

3. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

4. Przygotować stosowne rozcieńczenia specyficznych dla R. solanacearum przeciwciał monoklonalnych w PBS (dodatek 4) zawierających również 0,5 % albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) oraz dodać 190 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz.

5. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

6. Przygotować stosowne rozcieńczenie koniugatu anty-mysich immunoglobin z fosfatazą alkaliczną w PBS. Dodać 190 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz.

7. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

8. Przygotować roztwór substratu alkalicznej fosfatazy zawierający 1 mg fosfatazy p-nitrofenylu przypadającego na ml buforu substratowego (dodatek 4). Dodać 200 µl do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.

Interpretacja wyników testu ELISA

Wynik testu ELISA jest negatywny, gdy średnia gęstość optyczna (OD) odczytywana w dwóch powtórzeniach ze studzienek próby wynosi < 2x OD dla studzienki kontroli negatywnej, pod warunkiem że OD dla kontroli pozytywnych studzienek kontrolnych wynosi powyżej 1,0 (po 90 minutach inkubacji z substratem) i więcej niż podwójna OD uzyskana dla negatywnych ekstraktów prób.

Wynik testu ELISA jest pozytywny, gdy odczyty średniej gęstości optycznej OD próby w dwóch powtórzeniach wynoszą > 2x OD w negatywnym ekstrakcie próby pod warunkiem, że odczyt OD dla wszystkich kontroli pozytywnych wynosi < 2x tych w studzienkach kontroli pozytywnych.

Negatywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli pozytywnych wskazują, że badanie nie zostało wykonane poprawnie lub że zostało zahamowane. Pozytywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli negatywnych wskazują na kontaminację lub pojawienie się niespecyficznego wiązania przeciwciał.

9. Test biologiczny

Uwaga: Wstępne testy przy użyciu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 jednostek tworzących kolonie R. solanacearum. na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach dały wyniki ujemne (sposób przygotowania opisano w dodatku 3).

Najwyższej czułości wykrywania można oczekiwać, kiedy stosuje się świeżo przygotowane ekstrakty i zapewnia się optymalne warunki wzrostu. Metodę tę można jednak z powodzeniem stosować do ekstraktów, które były przechowywane pod glicerolem w temp. od 68 do 86 °C.

Protokół ten oparty jest o publikację Janse (1988):

9.1. Dla każdej próby użyć 10 roślin testowych wrażliwej odmiany pomidora (np. „Moneymaker” lub odmiany o podobnej podatności określonej w badaniu laboratoryjnym) w stadium trzeciego właściwego liścia. Szczegóły hodowli zamieszczono w dodatku 8. Alternatywnie można użyć roślin oberżyny (np. odmiany „Black Beauty” lub odmian o podobnej podatności), używać wyłącznie roślin w stadium 2–3 liści do pełnego rozwoju trzeciego liścia właściwego. Wykazano, że w przypadku użycia oberżyny obserwowane symptomy były słabsze i rozwijały się wolniej. W miarę możliwości zaleca się używanie sadzonek pomidora.

9.2. Rozdzielić po 100 µl ekstraktu próby pomiędzy rośliny testowe. 9.2.1. Inokulacja za pomocą strzykawki Inokulować łodygi roślin powyżej liścieni za pomocą strzykawki z igłą do iniekcji podskórnej (nie mniejszej niż 23 G). Próbę rozdzielić między rośliny testowe. 9.2.2. Inokulacja przez nacięcie Trzymając roślinę między dwoma palcami, nanieść na łodygę kroplę (średnio 5–10 µl) zawieszonego osadu w miejscu między liścieniami i pierwszym liściem. Za pomocą sterylnego skalpela wykonać ukośne nacięcie, o długości 1,0 cm i na głębokość średnio 2/3 grubości łodygi, rozpoczynając od miejsca naniesienia kropli osadu. Ranę zamknąć sterylną wazeliną ze strzykawki.

9.3. Stosując tę samą technikę, zainokulować 5 sadzonek zawiesiną wodną 105 do 106 komórek przypadających na ml,