1991R2568 — PL — 01.01.2014 — 025.001

Dokument ten służy wyłącznie do celów dokumentacyjnych i instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego zawartość

zmienione przez:





sprostowane przez:







(*) Akt ten nie został nigdy opublikowany w języku polskim.









▼B

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 2568/91

z dnia 11 lipca 1991 r.

w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy







KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą, uwzględniając rozporządzenie Rady nr 136/66/EWG z dnia 22 września 1966 r. w sprawie ustanowienia wspólnej organizacji rynku olejów i tłuszczów ( 1 ), ostatnio zmienione rozporządzeniem (EWG) nr 3577/90 ( 2 ), w szczególności jego art. 35a, a także mając na uwadze, co następuje: a także mając na uwadze, co następuje: załącznik do rozporządzenia nr 136/66/EWG zawiera opisy i definicje oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek, wprowadzanych do obrotu w każdym Państwie Członkowskim, w handlu wewnątrzwspólnotowym oraz w handlu z państwami trzecimi; w celu zróżnicowania rodzajów oliwy z oliwek należy określić ich fizyczne i chemiczne właściwości oraz właściwości organoleptyczne oliwy z pierwszego tłoczenia, aby zagwarantować czystość i jakość danych produktów, bez uszczerbku dla innych istniejących przepisów; charakterystyczne właściwości różnych rodzajów oliwy należy określać w sposób jednolity na terytorium całej Wspólnoty; w tym celu należy ustalić wspólnotowe metody analizy chemicznej i oceny organoleptycznej; należy zezwolić na stosowanie w okresie przejściowym innych metod analiz stosowanych w Państwach Członkowskich, pod warunkiem, że w razie występowania różnic w wynikach, wynikami ostatecznymi są wyniki uzyskane wspólną metodą; definicja fizycznych i chemicznych właściwości oliwy z oliwek i metod analizy pociąga za sobą zmiany dodatkowych uwag do rozdziału 15 Nomenklatury Scalonej; metoda oceny właściwości organoleptycznych oliwy z pierwszego tłoczenia obejmuje ustanowienie zespołów wybranych i wyszkolonych degustatorów; w związku z tym należy wyznaczyć niezbędny termin dla utworzenia takiej struktury; mając na względzie trudności, które niektóre Państwa Członkowskie napotkają w związku z powoływaniem zespołów degustatorów, należy zezwolić na korzystanie z zespołów innych Państw Członkowskich; w celu zapewnienia, że system opłat stosowanych w odniesieniu do przywozu wytłoczyn z oliwek funkcjonuje w sposób prawidłowy, należy wprowadzić jednolitą metodę oznaczania zawartości oleju w tych produktach; aby nie zakłócać handlu, należy ustanowić przepis dla oleju zapakowanego przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia, który ma być zbyty w określonym czasie; konieczne jest uchylenie rozporządzenia Komisji (EWG) nr 1058/77 ( 3 ), ostatnio zmienionego rozporządzeniem (EWG) nr 1858/88 ( 4 ); Komitet Zarządzający ds. Olejów i Tłuszczów nie wydał opinii w terminie ustalonym przez przewodniczącego, PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:







▼M20

Artykuł 1

1. Oleje, których właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 1 i 2 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. a) i b) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawane są za oliwę z oliwek pierwszego tłoczenia.

2. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 3 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. c) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek typu lampante.

3. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 4 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 2 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z oliwek.

4. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 5 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 3 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek złożoną z rafinowanej oliwy z oliwek.

5. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 6 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 4 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za surową oliwę z wytłoczyn oliwek.

6. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 7 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 5 rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z wytłoczyn oliwek.

7. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 8 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 6 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z wytłoczyn oliwek.

▼B

Artykuł 2

1. Właściwości olejów wymienione w załączniku I oznacza się określonymi poniżej metodami:

— metoda przedstawiona w załączniku II do oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych wyrażonych jako procentowa część kwasu oleinowego,

— metoda przedstawiona w załączniku III do oznaczania wskaźnika nadtlenku,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— metoda przedstawiona w załączniku V do oznaczania zawartości sterolu,

— metoda przedstawiona w załączniku VI do oznaczania erytrodiolu i uvaolu,

▼M21

— metoda przedstawiona w załączniku VII do oznaczania zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu,

▼M20 —————

▼B

— metoda przedstawiona w załącznik IX do przeprowadzania analizy spektrofotometrycznej,

— metoda przedstawiona w załączniku X A i X B do oznaczania składu kwasu tłuszczowego,

— metoda przedstawiona w załączniku XI do oznaczania lotnych rozpuszczalników fluorowcowanych,

— metoda przedstawiona w załączniku XII do oznaczania właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia,

▼M20 —————

▼M11

— metoda przedstawiona w zał. XVII do oznaczenia stigmastadienów,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX,

▼M23

— metoda przedstawiona w załączniku XX dla oznaczania zawartości wosków, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych metodą kapilarnej chromatografii gazowej.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Do celów sprawdzenia przewidzianego w ust. 3, analizy określone w załącznikach II, III, IX, X i XII oraz, jeżeli ma zastosowanie, jakakolwiek analiza porównawcza wymagana na mocy prawa krajowego, zostają przeprowadzone przed datą ważności. Jeżeli pobieranie próbek dokonane jest więcej niż cztery miesiące przed datą ważności, analizy zostają przeprowadzone najpóźniej cztery miesiące po pobraniu próbek. Żaden termin nie ma zastosowania do innych analiz przewidzianych w tym rozporządzeniu. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M25

Artykuł 2a

1. Do celów niniejszego artykułu „oliwa z oliwek wprowadzona do obrotu” oznacza całkowitą ilość oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek odpowiedniego państwa członkowskiego konsumowanej w tym państwie członkowskim lub wywożonej z tego państwa członkowskiego.

2. Państwa członkowskie zapewniają selektywne przeprowadzanie opartych o analizę ryzyka i odpowiednio częstych kontroli zgodności, tak aby zagwarantować, że oliwa z oliwek wprowadzona do obrotu jest zgodna ze zgłoszoną kategorią.

3. Kryteria oceny ryzyka mogą obejmować:

a) kategorię oliwy, okres produkcji, cenę oliwy w stosunku do innych olejów roślinnych, czynności związane z mieszaniem i pakowaniem, obiekty i warunki przechowywania, państwo pochodzenia, państwo przeznaczenia, środki transportu lub objętość partii;

b) pozycję podmiotów gospodarczych w łańcuchu wprowadzania do obrotu, objętość lub wartość produktów wprowadzanych przez nie do obrotu, zakres kategorii oliwy, które wprowadzają do obrotu, rodzaj prowadzonej działalności, na przykład tłoczenie, przechowywanie, rafinowanie, mieszanie, pakowanie lub sprzedaż detaliczna;

c) ustalenia poczynione podczas poprzednich kontroli, w tym liczbę i rodzaj stwierdzonych wad, typową jakość oliwy wprowadzanej do obrotu, efektywność wykorzystywanego wyposażenia technicznego;

d) wiarygodność systemów zapewnienia jakości lub systemów samokontroli podmiotów gospodarczych w odniesieniu do zgodności z normami handlowymi;

e) miejsce przeprowadzania kontroli, zwłaszcza jeśli jest to pierwszy punkt wprowadzenia produktów na teren Unii, ostatni punkt wyprowadzenia produktów z Unii lub miejsce, w którym oleje są produkowane, pakowane, ładowane lub sprzedawane konsumentowi finalnemu;

f) wszelkie inne informacje, które mogą wskazywać na ryzyko niezgodności.

4. Państwa członkowskie z wyprzedzeniem ustanawiają:

a) kryteria oceny ryzyka wystąpienia niezgodności poszczególnych partii;

b) na podstawie analizy ryzyka dla każdej kategorii ryzyka – minimalną liczbę podmiotów gospodarczych, partii lub ilości podlegających kontroli zgodności.

Rocznie przeprowadza się co najmniej jedną kontrolę zgodności na tysiąc ton oliwy z oliwek wprowadzonej do obrotu w państwie członkowskim.

5. Państwa członkowskie sprawdzają zgodność:

a) przez przeprowadzenie, w dowolnej kolejności, analiz określonych w załączniku I; lub

b) przez przeprowadzenie analiz w kolejności określonej w załączniku Ib w sprawie schematu decyzyjnego aż do osiągnięcia jednej z decyzji wymienionych w tym schemacie decyzyjnym.

▼M19 —————

▼M25

Artykuł 3

W przypadku gdy stwierdzono, że oliwa nie odpowiada opisowi jej kategorii, zainteresowane państwo członkowskie stosuje, bez uszczerbku dla wszelkich innych kar, skuteczne, proporcjonalne i odstraszające kary, które są ustalane w świetle tego, jak poważna jest stwierdzona nieprawidłowość.

W przypadku gdy w ramach kontroli ujawnione zostają istotne nieprawidłowości, państwa członkowskie zwiększają częstotliwość kontroli w odniesieniu do etapu wprowadzania do obrotu, kategorii oliwy, pochodzenia lub innych kryteriów.

▼M5

Artykuł 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Jeżeli Państwa Członkowskie napotykają trudności w utworzeniu na swoim terytorium zespołów degustatorów, mogą wezwać zespół degustatorów zatwierdzony w innym Państwie Członkowskim.

3. Każde Państwo Członkowskie sporządza wykaz zespołów degustatorów utworzonych przez organizacje zawodowe lub międzybranżowe zgodnie z warunkami ustanowionymi w ust. 1 i zapewnia przestrzeganie tych warunków.

▼M19 —————

▼B

Artykuł 6

1. Zawartość oleju w makuchu i innych wytłokach powstających przy ekstrakcji oliwy z oliwek (kody CN 2306 90 11 i 2306 90 19 ) oznaczane są metodą przedstawioną w załączniku XV.

2. Zawartość oleju, określona w ust. 1, wyrażana jest jako procent masy oleju w stosunku do masy suchej substancji.

▼M20

Artykuł 7

Przepisy wspólnotowe dotyczące zawartości zanieczyszczeń stosuje się.

W odniesieniu do rozpuszczalników chlorowcowanych limity dla wszystkich kategorii oliwy z oliwek są następujące:

— maksymalna zawartość wykrytych rozpuszczalników chlorowcowanych: 0,1 mg/kg,

— całkowita maksymalna zawartość wykrytych rozpuszczalników chlorowcowanych: 0,2 mg/kg.

▼M25

Artykuł 7a

Osoby fizyczne lub prawne oraz grupy osób, które posiadają oliwę z oliwek lub oliwę z wytłoczyn z oliwek od etapu ekstrakcji w tłoczni do etapu butelkowania włącznie, w dowolnych celach zawodowych bądź handlowych, muszą prowadzić rejestry wprowadzania i wycofywania w odniesieniu do każdej kategorii takiej oliwy.

Państwa członkowskie zapewniają należyte przestrzeganie obowiązku określonego w akapicie pierwszym.

▼M25

Artykuł 8

1. Państwa członkowskie powiadamiają Komisję o środkach służących wprowadzeniu w życie niniejszego rozporządzenia. Państwa członkowskie powiadamiają Komisję o wszelkich późniejszych zmianach.

▼B

2. Państwa Członkowskie przesyłają Komisji na początku każdego półrocza oświadczenie o danych analitycznych dotyczących badań przeprowadzonych w ciągu poprzedniego półrocza.

Wyniki analizowane są przez Komitet Zarządzający ds. Olejów i Tłuszczów zgodnie z procedurą ustaloną w art. 39 rozporządzenia nr 136/66/EWG.

▼M25

3. Powiadomienia, o których mowa w niniejszym rozporządzeniu, są dokonywane zgodnie z rozporządzeniem Komisji (WE) nr 792/2009 ( 5 ).

▼B

Artykuł 9

Niniejszym rozporządzenie (EWG) nr 1058/77 traci moc.

Artykuł 10

1. Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie trzeciego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Jednakże metodę określoną w załączniku XII stosuje się od ►M1 dnia 1 listopada 1992 r. ◄ , z wyjątkiem działań odnoszących się do systemu interwencyjnego.

▼M5

Metody tej nie stosuje się do oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia przygotowanej na rynek przed dniem 1 listopada 1992 r.

▼B

2. Niniejsze rozporządzenie nie stosuje się do oliwy z oliwek i oleju z wytłoczyn z oliwek pakowanych przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia oraz wprowadzonych do obrotu do dnia 31 października 1992 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Państwach Członkowskich.









ZAŁĄCZNIK I

Streszczenie







ZAŁĄCZNIK I: Właściwości oliwy z oliwek ZAŁĄCZNIK Ia: Pobieranie próbek oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek dostarczonych w bezpośrednim opakowaniu nieprzekraczającym 100 litrów ZAŁĄCZNIK Ib: Schemat decyzyjny ZAŁĄCZNIK II: ►M21 Oznaczanie wolnych kwasów tłuszczowych, metoda na zimno ◄ ZAŁĄCZNIK III: Oznaczanie liczby nadtlenkowej ZAŁĄCZNIK IV: ►M6 Określanie zawartości wosku przez chromatografię gazową/cieczową z użyciem kolumny kapilarnej ◄ ZAŁĄCZNIK V: Oznaczanie składu i zawartości steroli metodą kapilarnej chromatografii gazowej ZAŁĄCZNIK VI: Oznaczanie erytrodiolu i uvaolu ZAŁĄCZNIK VII: ►M21 Oznaczanie zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu ◄ ▼M20 ————— ▼B ZAŁĄCZNIK IX: Badanie spektrofotometryczne w ultrafiolecie ZAŁĄCZNIK X A: Analiza metodą chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil ZAŁĄCZNIK XI: Oznaczanie lotnych fluorowcowanych rozpuszczalników oliwy z oliwek Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ZAŁĄCZNIK XV: Zawartość oleju w pozostałości z oliwek ZAŁĄCZNIK XVI: Oznaczenie liczby jodowej ZAŁĄCZNIK XVII: Oznaczanie stigmastadienów w olejach roślinnych ZAŁĄCZNIK XVIII: Oznaczenie różnicy między rzeczywistą a teoretyczną zawartością triglicerydów z ECN 42 ANNEX XIX: Method for determining aliphatic alcohol content ▼M23 ZAŁĄCZNIK XX: Metoda dla oznaczenia zawartości wosków, estrów metylowych kwasów tłuszczowych i estrów etylowych kwasów tłuszczowych metodą kapilarnej chromatografii gazowej ▼M25 ZAŁĄCZNIK XXI: Wyniki kontroli zgodności przeprowadzonych w odniesieniu do oliwy z oliwek, o których mowa w art. 8 ust. 2

▼M23









ZAŁĄCZNIK I

WŁAŚCIWOŚCI OLIWY Z OLIWEK







Kategoria Estry metylowe kwasu tłuszczowego (FAME) i estry etylowe kwasu tłuszczowego (FAEE) Kwasowość (%) (*) Liczba nadtlenkowa mEq O2/kg (*) Woski mg/kg (**) 2-monopalmitynian glicerolu (%) Stigmastadien mg/kg (1) Różnica między HPLC ECN42 a teoretycznym ECN42 K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Ocena organoleptyczna Mediana błędów (Md) (*) Ocena organoleptyczna Mediana owocowości (Mf) (*) 1. Oliwa z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg lub 75 mg/kg < Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg oraz [FAEE/FAME] ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 ►C1 Md ≤ 3,5 ◄ Mf > 0 ≤ 1,0 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 3. Oliwa z oliwek typu lampante — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — ►C1 Md > 3,5 (2) ◄ — ≤ 1,1 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 4. Rafinowana oliwa z oliwek — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 5. Oliwa z oliwek złożona z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 6. Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliwa z wytłoczyn oliwek — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Kategoria Zawartość kwasów (1) Suma izomerów transoleinowych (%) Suma izomerów translinolowych translinolenowych (%) Skład steroli Łącznie sterole (mg/kg) Erytrodiol i uwaol (%) (**) Mirystynowy (%) Linolenowy (%) Arachidowy (%) Eikozaenowy (%) Behenowy (%) Lignocerynowy (%) Cholesterol (%) Brassikasterol (%) Kampesterol (%) Stigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7- stigmastenol (%) 1. Oliwa z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Oliwa z oliwek typu lampante ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinowana oliwa z oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Oliwa z oliwek złożona ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

▼M20









ZAŁĄCZNIK Ia

Pobieranie próbek oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek dostarczonych w bezpośrednim opakowaniu nieprzekraczającym 100 litrów

Tę metodę pobierania próbek stosuje się do dostaw oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek nieprzekraczającej 125 000 litrów, włożonej do bezpośrednich opakowań nieprzekraczających 100 litrów.

Jeżeli dostawa przekracza 125 000 litrów, zostaje ona podzielona na partie równe 125 000 litrom lub poniżej. Jeżeli dostawa jest mniejsza niż 125 000 litrów, stanowi ona jedną partię. Metodę stosuje się więc do każdej partii.

Minimalna liczba podstawowych próbek ustalona jest według wielkości partii zgodnie z tabelą wymienioną w pkt 1.

Wielkość podstawowej próbki ustalona jest na podstawie pojemności bezpośredniego opakowania, zgodnie z tabelą wymienioną w pkt 2.1.

Przez „dostawę”, „podstawową próbkę” i „próbkę laboratoryjną” rozumie się definicje określone w normach EN ISO 5555.

Przez „partię” rozumie się zbiór jednostek sprzedaży, które są produkowane, wytwarzane i pakowane w okolicznościach takich, że oliwa zawarta w każdej jednostce sprzedaży uznawana jest jako jednorodna dla wszystkich właściwości analitycznych.

1. LICZBA PODSTAWOWYCH PRÓBEK

Minimalna liczba podstawowych próbek będzie ustalona według wielkości partii zgodnie z następującą tabelą:







Wielkość partii (w litrach) mniej niż Minimalna liczba podstawowych próbek 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Bezpośrednie opakowania wybrane aby utworzyć podstawową próbkę muszą przylegać do każdej innej w partii.

W przypadku wątpliwości, Państwa Członkowskie zwiększają liczbę podstawowych próbek.

2. ZAWARTOŚĆ PODSTAWOWYCH PRÓBEK

2.1 Każda podstawowa próbka składa się z:



Jeżeli opakowanie bezpośrednie ma pojemność Podstawowa próbka składa się z oliwy z: a) 5 litrów lub więcej a) 3 bezpośrednich opakowań b) 3 litry lub więcej, ale nie mniej niż 5 litrów b) 3 bezpośrednich opakowań c) 2 litry lub więcej, ale nie mniej niż 3 litry c) 3 bezpośrednich opakowań d) 1 litr lub więcej, ale nie mniej niż 2 litry d) 6 bezpośrednich opakowań e) 0,75 litra lub więcej, ale nie mniej niż 1 litr e) 6 bezpośrednich opakowań f) mniej niż 0,75 litra f) trzy razy oliwa z minimalnej ilości opakowań, których całkowita pojemność przekracza 1,5 litra

2.2 Podstawowe próbki należy trzymać w opakowaniach bezpośrednich do czasu analiz. Oliwa z próbki podstawowej jest następnie, jeżeli jest to właściwe, podzielona na trzy próbki laboratoryjne w celu przeprowadzenia: a) analiz określonych w załączniku II, III, IX i X, b) analiz określonych w załączniku XII, c) innych analiz.

2.3 Opakowania składające się z próbki podstawowej podzielone są zgodnie z procedurami kontroli przewidzianymi przez prawo krajowe.

3. ANALIZY I WYNIKI

a) Każda z podstawowych próbek określonych w pkt 1 zostaje podzielona na próbki laboratoryjne, zgodnie z pkt 2.5 normy EN ISO 5555 i podlega następującym analizom: — oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych, określonych w art. 2 ust. 1 tiret pierwsze, — oznaczania liczby nadtlenkowej, określonej w art. 2 ust. 1 tiret drugie, — analizie spektrofotometrycznej, określonej w art. 2 ust. 1 tiret ósme, — oznaczania składu kwasu tłuszczowego, określonego w art. 2 ust. 1 tiret dziewiąte.

b) Jeżeli wyniki analiz określonych w lit. a) dla przynajmniej jednej z próbek podstawowych pobranych z tej samej partii nie są zgodne z właściwościami kategorii oliwy zgłoszonej, całość danej partii jest zgłoszona jako niezgodna. Jeżeli wyniki analiz określonych w lit. a) dla każdej próbki podstawowej pobranej z tej same partii nie są jednorodne, biorąc pod uwagę właściwości powtarzalności danych metod, całość partii zostaje zgłoszona jako niejednorodna, a każda próbka podstawowa poddana jest innej wymaganej analizie. Inaczej, jedna próbka podstawowa z tej partii poddana jest innej wymaganej analizie.

c) Jeżeli jeden z wyników analiz określonych w lit. b) akapit drugi nie jest zgodny z właściwościami kategorii oliwy zgłoszonej, całość danej partii zostaje zgłoszona jako niezgodna. Jeżeli wszystkie wyniki analiz określonych w lit. b) akapit drugi są zgodne z właściwościami kategorii oliwy zgłoszonej, całość partii zostaje zgłoszona jako zgodna.

▼M20









ZAŁĄCZNIK Ib

SCHEMAT DECYZYJNY DLA SPRAWDZENIA ZGODNOŚCI PRÓBKI OLIWY Z OLIWEK Z KATEGORIĄ ZGŁOSZONĄ

Analiza zgodności oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek z kategorią zgłoszoną może być przeprowadzona:

a) bądź przez przeprowadzenie w jakiejkolwiek kolejności analiz przewidzianych do celów sprawdzenia zgodności z właściwościami określonymi w załączniku I; lub

b) przez przeprowadzenie w kolejności wskazanej w schemacie decyzyjnym analiz tam określonych, aż do osiągnięcia jednej z decyzji wymienionych w niniejszym schemacie decyzyjnym.

Analizy odnoszące się do zanieczyszczeń, niezbędne do sprawdzenia zgodności z normami Wspólnoty Europejskiej, należy przeprowadzić oddzielnie.

Schemat decyzyjny stosuje się do wszystkich kategorii oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek. Składa się on z tabeli numerowanych od 1 do 11, z których nalezy korzystać, biorąc pod uwagę kategorię oliwy zgłoszonej w kolejności wymienionej w ogólnej tabeli.

Klucz od tabeli ogólnej do tabeli 11:

— podwójna linia (=) wskazuje ścieżkę, według której należy postępować w przypadku zgodności (odpowiedź pozytywna) z kryterium określonym w poprzednim polu. Linia kropkowana (…) wskazuje alternatywną ścieżkę, według której należy postępować w przypadku niezgodności,

— nagłówki pól znajdujących się w tabelach 1–11 odnoszą się do analiz przewidzianych w niniejszym rozporządzeniu na podstawie tabeli równoważności określonej w dodatku 1 do niniejszego załącznika,

— litery w nawiasach znajdujące się okręgach decyzji negatywnej w tabelach 1–11 odpowiadają indykatywnym informacjom wymienionym w dodatku 2 do niniejszego załącznika. Litery nie pociągają za sobą obowiązku dokonania analiz lub prawdziwości wymienionych założeń.









Dodatek 1

Tabela równoważności między załącznikami do niniejszego rozporządzenia a analizami określonymi w schemacie decyzyjnym







▼M21 - Kwasowość załącznik II Oznaczanie wolnych kwasów tłuszczowych, metoda na zimno; ▼M20 - Liczba nadtlenkowa załącznik III Oznaczanie liczby nadtlenkowej - Spektrometria UV załącznik IX Analiza spektrofotometryczna - Ocena organoleptyczna załącznik XII Ocena organoleptyczna oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia - 3,5-stigmastadieny załącznik XVII Metoda oznaczania stigmastadienów w olejach roślinnych - Trans izomery kwasów tłuszczowych załącznik Xa i Analiza metodą kapilarnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych załącznik Xb Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych - Zawartość kwasów tłuszczowych załącznik Xa i Analiza metodą kapilarnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych załącznik Xb Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych - AECN42 załącznik XVIII Oznaczanie składu triglicerydów z ECN42 (różnica między danymi HPLC a zawartością teoretyczną) - Skład i całkowita zawartość steroli załącznik V Oznaczanie składu i zawartości steroli metodą kapilarnej chromatografii gazowej - Erytrodiol i uvaol załącznik VI Oznaczanie erytrodiolu i uvaolu - Woski załącznik IV Oznaczanie zawartości wosku metodą kapilarnej chromatografii gazowej - Alkohole alifatyczne załącznik XIX Oznaczanie zawartości alkoholi alifatycznych metodą kapilarnej chromatografii gazowej ▼M21 - Kwasy tłuszczowe nasycone w pozycji 2 załącznik VII Oznaczanie zawartości procentowej 2-monopalmitynianu glicerolu ▼M20









Dodatek 2

Tabela 1

a) Patrz oliwa z pierwszego tłoczenia lub lampante (kryteria jakości tabela 2 lub kryteria jakości i czystości tabela 4)

b) Patrz oliwa z oliwek lampante (kryteria jakości i czystości tabela 4)

Tabela 2

a) Patrz oliwa z oliwek lampante (kryteria jakości i czystości tabela 4)

b) Patrz oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia (kryteria jakości tabela 1)

Tabela 3

a) Obecność oleju rafinowanego (oliwa lub inne)

b) Obecność oliwy z wytłoczyn oliwek

Tabela 4

a) Patrz oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia extra i oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia (kryteria jakości tabela 1 i tabela 2)

b) Obecność oleju rafinowanego (oliwa lub inne)

c) Obecność oliwy z wytłoczyn oliwek

d) Obecność olejów estryfikowanych

Tabela 7

a) Obecność oliwy z wytłoczyn oliwek

b) Obecność olejów estryfikowanych

Tabela 8

a) Obecność oleju rafinowanego (oliwa lub inne)

b) Patrz oliwa z oliwek lampante (kryteria jakości i czystości tabela 4)

c) Obecność olejów estryfikowanych

Tabela 11

a) Obecność olejów estryfikowanych estryfikowanych

▼B









ZAŁĄCZNIK II

▼M21

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, METODA NA ZIMNO

▼B

1. OZNACZANIE KWASOWOŚCI

Oznaczenie wolnych kwasów tłuszczowych w oliwie z oliwek. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych wyrażona jest w postaci kwasowości obliczonej metodami konwencjonalnymi.

1.1. Zasada

Próbkę rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników, a obecne w niej wolne kwasy tłuszczowe miareczkuje przy użyciu roztworu wodorotlenku potasu w etanolu.

1.2. Odczynniki

Wszystkie odczynniki powinny posiadać zatwierdzoną jakość kwalifikującą je do stosowania w laboratorium a woda stosowana powinna być destylowana lub o podobnym stopniu czystości.

1.2.1. Eter dietylowy; etanol 95 % (v/v), mieszanina jednakowych objętościowo części. Uwaga: Eter dietylowy jest substancją bardzo łatwo palną i może tworzyć nadtlenki o właściwościach wybuchowych. Stosując tę substancję należy zachować szczególną ostrożność. Zobojętnić dokładnie w momencie stosowania za pomocą roztworu wodorotlenku potasowego (1.2.2) z dodatkiem 0,3 ml roztworu fenoloftaleiny (1.2.3) na 100 ml mieszaniny. Uwaga: Jeżeli zastosowanie tlenku etylenowego nie jest możliwe, można użyć mieszaniny rozpuszczalników zawierającej etanol i toluen. W razie potrzeby etanol można zastąpić propanolem-2.

1.2.2. Wodorotlenek potasu, miareczkowany roztwór etanolowy, c(KOH) o stężeniu 0,1 mol/l lub w razie potrzeby c(KOH) o stężeniu około 0,5 mol/l. Konieczna jest znajomość dokładnego stężenia roztworu wodorotlenku potasu w etanolu, które należy sprawdzić bezpośrednio przed użyciem. Stosować roztwór przygotowany co najmniej pięć dni przed użyciem i zdekantowany do butelki z brązowego szkła z gumowym korkiem. Roztwór powinien być bezbarwny lub mieć barwę słomkową. Uwaga: Stabilny bezbarwny roztwór wodorotlenku potasu można przygotować w następujący sposób: doprowadzić do wrzenia 1 000 ml etanolu z 8 g wodorotlenku potasu i 0,5 g opiłków aluminiowych i nadal gotować w układzie zwrotnym skroplin przez godzinę. Następnie poddać bezzwłocznie destylacji. Rozpuścić w destylacie wymaganą ilość wodorotlenku potasu. Odstawić na kilka dni, a następnie zdekantować przejrzystą wartwę cieczy znad osadu węglanu potasu. Roztwór można także przygotować z pominięciem procesu destylacji w następujący sposób: do 1 000 ml etanolu dodać 4 ml butylanu glinu i odstawić mieszaninę na kilka dni. Zdekantować sklarowaną nad osadem ciecz i rozpuścić w niej wymaganą ilość wodorotlenku potasu. Roztwór jest gotowy do użycia.

1.2.3. Fenoloftaleina, roztwór 10g/l w 95 lub 96 % etanolu (v/v) lub błękit zasadowy (w przypadku silnie zabarwionych tłuszczów), roztwór 20 g/l 95 lub 9 % etanolu (v/v).

1.3. Aparatura

Normalnie stosowany sprzęt laboratoryjny, w skład którego wchodzą:

1.3.1. waga analityczna.

1.3.2. kolba stożkowa (Erlenmeyera) o pojemności 250 ml.

1.3.3. biureta na 10 ml skalowana co 0,05 ml.

1.4. Procedura

1.4.1. Przygotowanie próbki do badania (Badanie przeprowadzać na przefiltrowanej próbce. W przypadku, gdy łączna zawartość wilgoci i zanieczyszczeń jest mniejsza niż 1 %, wykorzystać próbkę bez dalszej obróbki; gdy zawartość ta przekracza 1 %, próbka musi być przefiltrowana.)

1.4.2. Pobieranie próbki W zależności od zakładanej liczby kwasowej pobierać próbkę według poniższej tabeli:



Przewidywana liczba kwasowa Masa próbki g Dokładność ważenia g < 1 20 0,05 1 do 4 10 0,02 4 do 15 2,5 0,01 15 do 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Próbkę należy ważyć w kolbie stożkowej (1.3.2)

1.4.3. Oznaczenie Rozpuścić próbkę (1.4.2) w 50 do 150 ml poprzednio zobojętnionej mieszaniny eteru dietylowego i etanolu (1.2.1). Miareczkować mieszając 0,1 M roztworem wodorotlenku potasu (1.2.2) (patrz Uwaga 2) dopóki nie nastąpi wskaźnikowa zmiana (różowa barwa fenoloftaleiny utrzymuje się przez 10 sekund). Uwaga 1: miareczkowany roztwór wodorotlenku potasu w etanolu (1.2.2) można zastąpić wodnym roztworem wodorotlenku potasu lub sodu, pod warunkiem, że ilość dodanej wody nie powoduje rozdzielnia faz. Uwaga 2: jeżeli wymagana ilość 0,1-molowego wodorotlenku potasu przekracza 10 ml, należy zastosować roztwór 0,5 M Uwaga 3: jeżeli w trakcie miareczkowania rozwór zaczyna mętnieć należy dodać dostateczną ilość rozpuszczalników (1.2.1), aby uzyskać przejrzysty roztwór.

1.5. Kwasowość: wyrażona w postaci procentowej części kwasu oleinowego

Kwasowość wyrażona jako procentowa część w stosunku do masy wynosi:

gdzie:

V = objętość użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu w mililitrach;

c = dokładne stężenie molowe użytego do miareczkowania rotworu wodorotlenku potasu;

M = molowa masa w gramach na mol kwasu użytego do podania wyniku (= 282);

m = masa próbki w gramach.

Jako wynik należy przyjąć średnią arytmetyczną ►M6 dwóch obliczeń ◄ .









ZAŁĄCZNIK III

OZNACZENIE LICZBY NADTLENKOWEJ

1. ZAKRES

Niniejsza norma zawiera opis metody oznaczania liczby nadtlenkowej olejów i tłuszczów.

2. ZAKRES ZASTOSOWANIA

Niniejsza norma stosuje się w odniesieniu do olejów i tłuszczów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego.

3. DEFINICJA

Liczba nadtlenkowa jest to wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram zawartość w próbce tych substancji, które utleniają jodek potasu w opisanych warunkach technologicznych.

4. ZASADA

Poddanie Badanej części próbki, w roztworze kwasu octowego i chloroformu, działaniu roztworu jodku potasu. Miareczkowanie uwolnionego jodu znormalizowanym roztworem tiosiarczanu sodu.

5. APARATURA

W użytym sprzęcie nie mogą występować substancje redukujące lub utleniające.

Uwaga: Nie pokrywać tłuszczem powierzchni szlifowanych.

5.1. Łyżka szklana o pojemności 3 ml.

5.2. Kolby stożkowe ze szlifowanymi szyjkami i korkami o pojemności około 250 ml, wysuszone i napełnione czystym, obojętnym gazem (azotem lub najlepiej ditlenkiem węgla).

5.3. Biureta o pojemności 25 lub 50 ml wyskalowana co 0,1 ml.

6. ODCZYNNIKI

6.1 Chloroform, którego jakość spełnia wymogi stawiane odczynnikom laboratoryjnym, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przezeń silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

6.2. Kwas octowy lodowaty, którego jakość spełnia wymogi stawiane odczynnikom laboratoryjnym, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przezeń silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

6.3. Jodek potasu w postaci nasyconego roztworu wodnego, świeżo przygotowany, niezawierający jodu i jodanów.

6.4. Tiosiarczan sodu, 0,01 lub 0,002 mol/l z dokładnie nastawionym mianem tuż przed użyciem.

6.5. Roztwór skrobi, rozproszenie wodne o stężeniu 10 g/l, świeżo przygotowany z naturalnej rozpuszczalnej skrobi.

7. PRÓBKA

Należy zadbać, aby próbka była pobrana i składowana w ciemnym i chłodnym miejscu w całkowicie napełnionych szklanych pojemnikach, zamkniętych hermetycznie zatyczkami szlifowanymi szklanymi lub z korka.

8. PROCEDURA

Badanie wykonuje się w rozproszonym świetle dziennym lub w świetle sztucznym. Odważyć szklaną łyżką (5.1) lub, w przypadku jej braku, w kolbie (5.2) z dokładnością do 0,001 g masę próbki według poniższej tabeli stosownie do oczekiwanej liczby nadtlenkowej:







Przewidywana liczba nadtlenkowa Ciężar próbki częściowej 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

Wyjąć korek z kolby (5.2) i wprowadzić do niej szklaną łyżkę z badaną częścią próbki. Dodać 10 ml chloroformu (6.1). Rozpuścić szybko badaną próbkę mieszając. Dodać 15 ml kwasu octowego (6.2), a następnie 1 ml roztworu jodku potasu (6.3). Szybko zakorkować kolbę, wstrząsać przez jedną minutę i pozostawić dokładnie na pięć minut w nieoświetlonym miejscu o temperaturze od 15 do 25 °C.

Dodać około 75 ml wody destylowanej. Miareczkować uwolniony jod roztworem tiosiarczanu sodu (6.4) (roztworem 0,002 mol/l dla przewidywanych wartości poniżej 12 i roztworem 0,01 mol/l dla przewidywanych wartości powyżej 12) intensywnie wstrząsając, stosując roztwór skrobi jako wskaźnik (6.5).

Przeprowadzić dwa oznaczenia tej samej próbki.

Jednocześnie przeprowadzić ślepą próbę. Jeżeli wynik ślepej próby przekracza 0,05 ml 0,01 mol/l roztworu tiosiarczanu sodu (6.4) należy wymienić zanieczyszczone odczynniki.

9. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

LICZBA NADTLenkowa (LN) wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram określana jest wzorem:

gdzie:

V = ilość ml nastawionego roztworu tiosiarczanu (6.4) użytego w badaniu, skorygowana w celu uwzględnienia ślepej próby

T = dokładna molarność użytego roztworu tiosiarczanu sodu (6.4)

m = masa badanej części próbki w gramach

Jako wynik przyjąć średnią arytmetyczną dwóch oznaczeń.

▼M21









ZAŁĄCZNIK IV

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WOSKÓW METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ

1. CEL

Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości wosków w oliwie z oliwek. Woski rozdziela się w zależności od liczby atomów węgla. Metodę można w szczególności stosować do rozróżniania oliwy z oliwek uzyskanej z tłoczenia od oliwy z oliwek uzyskanej z ekstrakcji (oliwy z wytłoczyn).

2. ZASADA

Dodanie odpowiedniego wzorca wewnętrznego do tłuszczu, następnie frakcjonowanie metodą chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym, odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą chromatografii gazowej z użyciem kolumny kapilarnej.

3. MATERIAŁY

3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2. Szklana kolumna do chromatografii gazowej, średnica wewnętrzna 15,0 mm, wysokość 30–40 cm, wyposażona w kranik.

3.3. Odpowiedni chromatograf gazowy z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z: 3.3.1. komory z termostatem do kolumn, wyposażonej w programator temperatury; 3.3.2. zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny; 3.3.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera-wzmacniacza; 3.3.4. rejestrującego integratora współpracującego z konwerterem-wzmacniaczem (3.3.3), o szybkości odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru. (Można również zastosować systemy informatyczne przewidujące uzyskiwanie danych z chromatografii gazowej przy użyciu komputera osobistego); 3.3.5. Kolumny kapilarnej, ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m, średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokrytej od środka płynem rozdzielającym, o jednolitej grubości 010–0,30 μm. (Płyny rozdzielające nadające się do użycia typu SE52 lub SE 54, dostępne w handlu).

3.4. Mikrostrzykawka umożliwiająca bezpośrednie wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni.

3.5. Wibrator elektryczny.

3.6. Wyparka rotacyjna.

3.7. Piec muflowy.

3.8. Waga analityczna zapewniająca precyzję pomiaru ± 0,1 mg.

3.9. Zwykłe szkło laboratoryjne.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 60 do 200 μm. Żel krzemionkowy należy umieścić w piecu w temperaturze 500 °C na co najmniej 4 godziny. Schłodzić, następnie dodać 2 % wody względem ilości pobranego żelu krzemionkowego. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny. Trzymać w zaciemnionym miejscu przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2. n-heksan, do chromatografii.

4.3. Eter etylowy, do chromatografii.

4.4. n-heptan, do chromatografii.

4.5. Roztwór wzorca arachidynianu laurylowego o stężeniu 0,1 % (m/V) w heksanie (wzorzec wewnętrzny). (Można również zastosować palmitynian palmitylu lub stearynian mirystylu). 4.5.1. Sudan 1 (1-fenylo-azo-2-naftol).

4.6. Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej.

4.7. Gazy pomocnicze: — czysty wodór, do chromatografii gazowej, — czyste powietrze, do chromatografii gazowej.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie kolumny chromatograficznej

Sporządzić zawiesinę 15 g żelu krzemionkowego (4.1) w n-heksanie (4.2) i wprowadzić do kolumny (3.2). Po spontanicznym wytrącaniu osadu zakończyć ten proces przy użyciu wytrząsarki elektrycznej (3.5), tak aby warstwa chromatograficzna była bardziej jednolita. Przesączyć 30 ml n-heksanu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Odważyć dokładnie, przy użyciu wagi (3.8), 500 mg próbki do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i dodać właściwą ilość wzorca wewnętrznego (4.5), zależnie od przypuszczalnej zawartości wosków. Dodać na przykład 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek i 0,25–0,5 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn oliwek. Do tak przygotowanej próbki dodać dwie porcje po 2 ml n-heksanu (4.2) i przenieść do kolumny chromatograficznej.

Wprowadzić próbkę, tak aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu, następnie przesączyć dodatkowych 70 ml n-heksanu, tak aby usunąć naturalnie obecne n-alkany. Rozpocząć wymywanie chromatograficzne, pobierając 180 ml mieszaniny n-heksanu/eteru etylowego w proporcji 99/1, przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund. Wymywanie próbki należy prowadzić w temperaturze pokojowej 22 °C ± 4.

Uwagi:

— Mieszaninę n-heksanu/eteru etylowego (99/1) należy przygotowywać codziennie.

— W celu wzrokowego skontrolowania prawidłowości wymywania wosków można dodać do próbki 100 μl roztworu 1 % Sudanu w mieszaninie wymywającej. Ponieważ wartość retencji tego barwnika jest pośrednia pomiędzy wartościami retencji wosków i triglicerydów, należy zatrzymać wymywanie, gdy barwnik dotrze do dna kolumny chromatograficznej, ponieważ wszystkie woski zostały już wymyte.

Otrzymaną w ten sposób frakcję suszy się w wyparce rotacyjnej (3.6) aż do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usuwa się ostatnie 2 ml rozpuszczalnika przy użyciu słabego strumienia azotu; a następnie dodaje 2–4 ml n-heptanu.

5.2. Analiza metodą chromatografii gazowej

5.2.1. Procedura wstępna

Umieścić kolumnę w chromatografie gazowym (3.3), łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Wykonać ogólne kontrole aparatury do chromatografii gazowej (działanie pętli gazowych, sprawność detektora i systemu rejestracyjnego itp.).

Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowej. Stopniowo podgrzewać do uzyskania, po około 4 godzinach, temperatury 350 °C. Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (zadać natężenie przepływu gazu, zapalić płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego (3.3.4), ustawić temperaturę komory kolumny, detektora itd.) oraz rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość przewidziana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików, i linia ta nie powinna wykazywać nachylenia.

Prostoliniowe, ujemne nachylenie linii wskazuje na to, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została poddana wystarczającemu kondycjonowaniu.

5.2.2. Dobór warunków roboczych

Ogólnie należy przestrzegać następujących warunków roboczych:

— temperatura kolumny: —



20 °C/minutę 5 °C/minutę 20 °C/minutę początkowa 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— temperatura detektora: 350 °C,

— porcja wstrzykiwana: 1 μl roztworu (2–4 ml) n-heptanu,

— gaz nośny: hel lub wodór z szybkością liniową optymalną dla wybranego gazu (patrz: dodatek),

— czułość urządzenia: taka, aby były spełnione warunki określone poniżej:

Warunki te mogą być modyfikowane w sposób dostosowany do charakterystyk kolumn i aparatów do chromatografii gazowej, tak aby uzyskano oddzielenie wszystkich wosków i zadowalającą rozdzielczość pików (patrz: rysunek), przy czym czas retencji wzorca wewnętrznego C32 powinien wynosić 18 ± 3 minut. Pik najbardziej reprezentatywny dla wosków musi mierzyć co najmniej 60 % od dołu skali.

Ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pól powierzchni rozpatrywanych pików.

Uwaga: Ze względu na wysoką temperaturę końcową przyjmuje się dodatnie nachylenie, które nie może przekraczać 10 % od dołu skali.

5.3. Przeprowadzenie analizy

Pobrać 1 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl; odciągnąć tłoczek, aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do układu nastrzykowego i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po upływie około 5 sekund powoli wyciągnąć igłę.

Przeprowadzić rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków.

Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania.

5.4. Identyfikacja pików

Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach.

Rysunek przedstawia chromatogram wosków oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.

5.5. Analiza ilościowa

Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu i estrom alifatycznym od C40 do C46.

Obliczyć zawartość wosków każdego z estrów, w mg/kg tłuszczu, zgodnie ze wzorem:

gdzie:

Ax = pole pod pikiem każdego estru, w milimetrach kwadratowych;

As = pole pod pikiem wzorca wewnętrznego, w milimetrach kwadratowych;

ms = masa dodanego wzorca wewnętrznego, w miligramach;

m = masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

Podać zawartość poszczególnych wosków od C40 do C46, w mg/kg tłuszczu (ppm).

Uwaga:Oznaczane składniki odpowiadają pikom o liczbie par węglowych zawartych pomiędzy estrami C40 a C46, zgodnie z przykładowym chromatogramem wosków oliwy z oliwek przedstawionym na rysunku poniżej. Jeżeli ester C46 pojawi się podwójnie, w celu jego identyfikacji zaleca się analizę frakcji wosków oliwy z wytłoczyn oliwek, gdzie C46 łatwo jest zidentyfikować, ponieważ wykazuje wyraźną przewagę ilościową.

Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Rysunek

Chromatogram wosków oliwy z oliwek ( 6 )

Objaśnienie:

I.S. = Arachidynian laurylowy

1 = Estry diterpenowe

2 + 2′ = Estry C40

3 + 3′ = Estry C42

4 + 4′ = Estry C44

5. = Estry C46

6 = Estry steroli i alkohole triterpenowe.









Dodatek

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze wprowadzić 1–3 μl metanu (lub propanu). Mierzyć chronometrem czas potrzebny na przejście gazu przez kolumnę, począwszy od momentu wstrzyknięcia do spadku wartości szczytowej (tM).

Prędkość liniowa, w cm/s, jest określona na podstawie wzoru L/tM, gdzie L jest długością kolumny w centymetrach, a tM – czasem zmierzonym w sekundach.

▼B









ZAŁĄCZNIK V

OZNACZENIE SKADU I ZAWARTOŚCI STEROLI METODĄ KAPILARNEJ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1. ZAKRES

metoda opisuje sposoby oznaczania zawartości prostych i łącznych steroli w substancjach tłuszczowych.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

Substancja tluszczowa, do której został dodany β-cholesterol w charakterze wewnętrznego mianowanego roztworu, jest zmydlana przy użyciu roztworu wodorotlenku potasu w etanolu, następnie część nieulegająca zmydleniu jest ekstrahowana eterem dietylowym.

Frakcja sterolowa jest oddzielana od nieulegającego zmydleniu ekstraktu metodą chromatograficzną na podstawowej płytce z żelu krzemionkowego; sterole uzyskane z żelu krzemionkowego przekształcane są w trimetylsilyletery i analizowane w chromatografie gazowym z kolumną kapilarną.

3. APARATURA

3.1. Kolba o pojemności 250 ml wyposażona w chłodnicę zwrotną ze szlifowanymi końcówkami.

3.2. Rozdzielacz 500 ml.

3.3. Kolby o pojemności 250 ml.

3.4. Kompletny zestaw do chromatografii cienko-warstwowej łącznie z płytkami szklanymi 20 × 20 cm.

3.5. Źródło światła ultrafioletowego o częstotliwości 366 lub 244 nm.

3.6. Mikrostrzykawka o pojemności 100 i 500 ml.

3.7. Cylindryczny lejek do sączenia z porowatym filtrem G3 (wielkość porów 15 do 40 mm) o średnicy około 2 cm i głębokości 5 cm z końcówką przystosowaną do filtracji w próżni i końcówką z zewnętrznym szlifem 12/21.

3.8. Kolba o pojemności 50 ml z końcówką z wewnętrznym szlifem 12/21 do łączenia z lejkiem do sączenia (3.7).

3.9. Probówka ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml i szczelnym korkiem.

3.10. Chromatograf gazowy dostawany do współpracy z kolumną kapilarną wyposażony w system oddzielania składający się z: 3.10.1 komory termostatycznej dla kolumn w celu utrzymania wymaganej temperatury z dokładnością do 1 °C. 3.10.2. termostatycznego zespołu odparowującego z otworem wtryskowym ze szkła krzemowanego 3.10.3. Detektor jonizacyjny płomienia oraz wzmacniacza-konwertera 3.10.4. współpracującego ze wzmacniaczem-konwerterem (3.10.3) rejestratora całkującego, którego czas reakcji nie przekracza jednej sekundy, o zmiennej prędkości podawania papieru.

3.11. Kolumna kapilarna ze szkła lub topionej krzemionki o długości 20 do 30 m, o wewnętrznej średnicy 0,25 do 0,32 mm, całkowicie pokryta od wewnątrz warstwą płynu SE-52 lub SE-54 lub im podobną, o jednakowej grubości od 0,10 do 0,30 μm.

3.12. Mikrostrzykawka do chromatografii gazowej o pojemności 10 μl z hartowaną igłą.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Wodorotlenek potasu, w przybliżeniu roztwór 2 mol/l w etanolu: 130 g wodorotlenku potasu (o stężeniu co najmniej 85 %) rozpuszcza się z jednoczesnym schładzaniem w 200 ml destylowanej wody, a następnie uzupełnia etanolem do objętości jednego litra. Roztwór powinien być przechowywany w dobrze zakorkowanej butelce z ciemnego szkła.

4.2. Czysty laboratoryjny eter dietylowy.

4.3. Czysty laboratoryjny bezwodny siarczan sodu.

4.4. Płytki szklane pokryte żelem krzemionkowym, nie zawierającym wskaźnika fluorscencyjnego, o grubości 0,25 mm (dostępne w handlu w postaci gotowej do użytku)

4.5. Wodorotlenek potasu, roztwór 0,2 mol/l w etanolu; rozpuścić 13 g wodorotlenku potasu w 20 ml wody destylowanej uzupełnianych do 1 litra etanolem.

4.6. Benzen do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.7. Aceton do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.8. Heksan, do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.9. Eter dietylowy do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.10. Chloform do chromatografii.

4.11. Roztwór chłodzący stosowany w chromatografii płytkowej: roztwór cholesterolu lub fitosterolu w chloroformie o stężeniu ►M6 2 % ◄ .

4.12 0,2 % roztwór 2,7-dichlorofluorosceiny w etanolu. Uzyskuje on nieco zasadowy charakter w wyniku dodania kilku kropel 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w alkoholu.

4.13. Bezwodnik piridyny do chromatografii.

4.14. Heksametyldizylazyna

4.15. Trimetylchlorosilan.

4.16. Roztwory eterów trimetylosilanowych steroli; należy je przygotowywać tuż przed użyciem ze steroli czystych lub mieszanek steroli, uzyskanych z zawierających je olejów.

4.17. 0,2 % roztwór (m/V) a-cholestanolu w chloroformie (wewnętrzny mianowany roztwór).

4.18. Gazy nośne: czysty wodór i hel do celów chromatografii gazowej.

4.19. Gazy pomocnicze: — czysty wodór do celów chromatografii gazowej, — powietrze, do celów chromatografii gazowej.

5. PROCEDURA

5.1 Przygotowanie substancji nie ulegającej zmydleniu. 5.1.1. Do kolby o pojemności 250 ml wprowadzić za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 500 μl pewną objętość 0,2 % roztworu β-cholestanolu w chloroformie (4.17) zawierającą ilość cholestanolu odpowiadającą w przybliżeniu 10 % steroli zawartych w części próbki, która ma być pobrana do badania. Na przykład w przypadku próbki oliwy z oliwek o wielkości 5 g należy dodać 500 μl, a w przypadku próbki ►M6 ————— ◄ makuchów oliwek takiej samej wielkości — 1 500 μl 0,2 % roztworu β-cholestanu. Odparować do wysuszenia w strumieniu azotu, a następnie odważyć dokładnie 5 g suchej przefiltrowanej próbki w tej samej kolbie. W przypadku ►M6 olejów ◄ zawierających znaczne ilości cholesterolu, może pojawić się wartość szczytowa odpowiadająca takiemu samemu czasowi zatrzymania jak cholestanol. W takich przypadkach należy dokonać podwójnej analizy frakcji steroli — bez dodawania mianowanego roztworu i z dodaniem tego roztworu ►M6 lub wykorzystać betulinol zamiast cholestanolu ◄ . 5.1.2. Dodać 50 ml 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w etanolu, uruchomić chłodzenie zwrotne, podgrzać w łaźni wodnej do temperatury lekkiego wrzenia cały czas mieszając intensywnie aż do zmydlenia (roztwór staje się przejrzysty). Kontynuować podgrzewanie przez 20 minut, a następnie dodać 50 ml wody destylowanej do górnej części chłodnicy, odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury około 30 °C. 5.1.3. Przenieść zawartość kolby do rozdzielacza o pojemności 500 ml płucząc ją kilkakrotnie wodą destylowaną, łącznie około 50 ml wody. Dodać około 80 ml eteru etylowego, mieszać energicznie przez 30 sekund i odstawić do rozdzielnia faz (Uwaga 1). Oddzielić dolną fazę wodną dekantując ją do innej kolby. Przeprowadzić jeszcze dwie ekstrakcje na fazie wodnej w ten sam sposób stosując każdorazowo około 60 do 70 ml eteru dietylowego. Uwaga 1: Wszelkie powstałe emulsje można wyeliminować dodając w tym celu za pomocą tryskawki niewielką ilość alkoholu etylowego lub metylowego. 5.1.4. Zebrać wszystkie eterowe ekstrakty do jednego rozdzielacza i wypłukać wodą destylowaną (każdorazowo stosując 50 ml) aż do uzyskania obojętnego odczynu wody popłucznej. Usunąć wodę popłuczną, wysuszyć bezwodnikiem siarczanu sodu i przefiltrować przez bezwodnik siarczanu sodu do zważonej uprzednio kolby o pojemności 250 ml, płucząc rozdzielacz i filtr niewielkimi ilościami eteru dietylowego. 5.1.5. Eter jest ulatniany delikatnym ogrzewaniem do kilku ml, a następnie osuszyć w słabej próżni lub w strumieniu azotu, zakończyć proces około 15-minutowym suszeniem w piecu w temperaturze 100 °C, a po schłodzeniu zważyć w eksykatorze.

5.2. Oddzielanie frakcji steroli. 5.2.1. Przygotowanie płytek podstawowych: zanurzyć całkowicie płytki z żelu krzemionkowego (4.4) w 0,2 mol/l roztworze wodorotlenku potasu w etanolu (4.5) na 10 sekund, a następnie zamknąć je na dwie godziny pod wyciągiem, a na koniec umieścić na godzinę w piecu nagrzanym do temperatury 100 °C. Wyjąć z pieca i umieścić w eksykatorze z chlorku wapnia aż do czasu ich użycia (poddane takiej obróbce płytki powinny być wykorzystane w ciągu 15 dni). Uwaga 2: Zastosowanie płytek z żelu krzemionkowego do oddzielania frakcji steroli, eliminuje potrzebę poddawania nie ulegających zmydleniu substancji działaniu tlenku glinu. W ten sposób wszystkie związki kwasowe (kwasy tłuszczowe i inne) zatrzymują się na linii osadzania. Uzyskuje się dzięki temu pasmo steroli, które jest wyraźnie oddzielone od pasma alkoholi alifatycznych i terpenowych. 5.2.2. Napełnić komorę chromatograficzną mieszaniną benzenu i acetonu w proporcji 95:5 (v/v) do poziomu około 1 cm. Zamiennie można użyć mieszaniny heksanu i eteru dietylowego w stosunku 65:35 (v/v). Zamknąć komorę i pozostawić na co najmniej 1 godzinę w celu uzyskania równowagi układu ciecz–para. Na wewnętrznych powierzchniach komory można umieścić paski papieru filtracyjnego, tak, aby były one zanurzone w eluencie: pozwala to zmniejszyć do mniej więcej jednej trzeciej czas przemieszczenia linii cieczy i uzyskania bardziej jednorodnej elucji składników. Uwaga 3. Przy każdej analizie mieszaninę należy wymienić w celu uzyskania powtarzalnych warunków elucji. 5.2.3. Przygotować około 5 % roztwór substancji nieulegającej zmydlaniu (5.1.5) w chloroformie i za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 100 μl rozprowadzić 300 μl ml tego roztworu równomiernie w postaci jednolitego pasma o jak najmniejszej grubości na płytce chromatograficznej w odległości około 2 cm od krawędzi płytki. Na przedłużeniu taśmy umieścić na jednym końcu płytki 2 do 3 μl wzorcowego roztworu sterolu (4.11) w celu określenia pasma steroli podczas ostatniego rozwinięcia. 5.2.4. Wewnątrz komory chromatograficznej umieścić płytkę przygotowaną w sposób opisany w pkt. 5.2.2. Temperatura otoczenia powinna być utrzymywana w granicach od 15 do 20 °C. Bezzwłocznie zamknąć pokrywę komory pozostawiając w niej próbkę w celu eluacji, dopóki rozpuszczalnik nie dotrze na odległość 1 cm z górnej części płytki. Następnie wyjąć płytkę z komory i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza lub pozostawić płytkę na chwilę pod wyciągiem. 5.2.5 Spryskać lekko i równomiernie płytkę roztworem 2,7-dichlorofluoresceiny. Wyszukać pasmo steroli przyrównując do plamy utworzonej za pomocą roztworu wzorcowego; oddzielić pasmo czarnym ołówkiem wzdłuż fluoryzujących krawędzi. 5.2.6 Zdrapać żel krzemionkowy znajdujący się na zaznaczonym obszarze za pomocą metalowej szpatułki. Usunięty materiał rozdrobnić i wprowadzić do lejka do sączenia (3.7), dodać 10 ml gorącego chloroformu i całość starannie wymieszać metalową szpatułką i przefiltrować w próżni, przy czym filtrat jest zbierany do stożkowej kolby (3.8) połączonej z lejkiem do sącznia. Pozostałość na filtrze przepłukać 3/10 ml eterem dietylowym a filtrat jest zbierany do tej samej kolby połączonej z lejkiem. Filtrat jest odparowany do objętości wynoszącej około 4 do 5 ml i pozostały roztwór przelany do probówki o pojemności 10 ml (3.9), która przedtem została zważona; probówka jest suszona przez lekkie podgrzewanie w słabym strumieniu azotu. Ponownie pozostałość jest rozpuszczona paroma kroplami acetonu, ponownie osuszona, następnie umieszczona w piecu w temperaturze 105 °C przez 10 minut, wyjęta, schłodzona w eksykatorze i zważona. Pozostałość w probówce to frakcja steroli.

5.3. Przygotowanie trimetylsilyloeterów. 5.3.1. Do próbówki zawierającej frakcję steroli dodawać odczynnik wywołujący reakcję silylowania składający się z mieszaniny pirydyny- heksametyldisilazanu-trimetylchlorosilanu w proporcji 9:3:1 (v/v/v) w ilości 50 μl na każdy miligram steroli, w sposób pozwalający uniknąć wchłaniania wilgoci (Uwaga 5). Uwaga 4: W handlu dostępne są roztwory gotowe do wykorzystania; ponadto inne odczynniki silanizujące jak np. bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylochlorosilanu przeznaczone do wymieszania z taka samą objętością bezwodnika pirydyny. 5.3.2 Zatkać próbówkę, wstrząsać (bez odwracania) aż do uzyskania pełnej stabilizacji steroli. Pozostawić na 15 minut w temperaturze otoczenia, następnie wirować przez kilka minut: przejrzysty roztwór może być poddany analizie metodą chromatografii gazowej. Uwaga 5: Ewentualne pojawienie się lekkiej opalizacji jest zjawiskiem normalnym i nie stanowi żadnej przeszkody. Biała zawiesina lub różowe zabarwienie wskazują na obecność wilgoci lub zmian w odczynniku. W takim przypadku próbę należy powtórzyć.

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej. 5.4.1. Operacje wstępne, przygotowanie kolumny. 5.4.1.1. Osadzić kolumnę w chromatografie gazowym łącząc końcówkę wlotową z wyparką podłączoną do systemu rozszczepiającego, a końcówkę wylotową z detektorem. Dokonać ogólnych kontroli zespołu chromatografu (szczelność układu zasilania gazem, sprawność detektora, sprawność systemu rozszczepiania i systemu zapisu itp.). 5.4.1.2 Jeżeli kolumna jest wykorzystywana po raz pierwszy, zalecane jest jej odpowiednie przygotowanie. Przepuścić przez kolumnę słaby strumień gazu nośnego, następnie zapalić zespół chromatrografu gazowego i rozpocząć stopniowe podgrzewanie do temperatury co najmniej o 20 °C wyższej niż temperatura robocza (Uwaga 6). Podtrzymywać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie doprowadzić zespół do stanu pracy (regulacja strumienia gazu i układu rozszczepiania, zapalenie płomienia, połączenie z rejestratorem elektronicznym, regulacja temperatury komory kolumny, detektora i inicjatora itd.) i dokonać zapisu sygnału z czułością co najmniej dwa razy większą od przewidzianej czułości analizy. Przebieg uzyskanej linii podstawowej musi mieć charakter liniowy, jest pozbawionym jakiejkolwiek wartości szczytowej i nie powinny w nim występować przesunięcia. Ujemne przesunięcie prostoliniowe wskazuje na złą szczelność połączeń kolumny, dodatnie przemieszczenie wskazuje na niedostateczne przygotowanie kolumny Uwaga 6: Temperatura przygotowywania kolumny powinna być zawsze niższa co najmniej o 20 °C od maksymalnej przewidywanej temperatury użytej cieczy rozdzielającej. 5.4.2. Dobór warunków roboczych. 5.4.2.1. Wytyczne warunki robocze są następujące: — temperatura kolumny 260 °C ± 5 °C, — temperatura wyparki: 280 °C — temperatura detektora: 290 °C — prędkość liniowa gazu nośnego: hel — 20 do 35 cm/s; wodór — 30 do 50 cm/s, — stosunek rozdzielania: 1: 50 do 1: 100, — czułość przyrządów; 4 do 16 razy minimalne tłumienie — czułość rejestratora: 1 do 2 mV f.s., — prędkość przesuwu papieru: 30 do 60 cm na godzinę — ilość wprowadzonej substancji: 0,5 do 1 μl roztworu TMSE. Warunki te mogą być zmieniane w zależności od charakterystyki kolumny i chromatografu gazowego w taki sposób, aby uzyskiwać chromatogramy spełniające następujące warunki: — czas zatrzymania b-sitosterolu powinien wynosić 20 ± 5 minut, — szczytowa wartość dla kampesterolu powinna wynosić: dla oliwy z oliwek (średnia zawartość 3 %) 15 ± 5 % skali tła, a dla oleju sojowego (średnia zawartość) 80 ± 10 % skali tła, — musi nastąpić oddzielenie wszystkich występujących w próbce steroli; konieczne jest, aby inne wartości szczytowe były również całkowicie oddzielone, co oznacza, że wykres wartości szczytowej powinien łączyć się z podstawą zanim pojawi się następna wartość szczytowa. Niepełna rozdzielczość jest jednak tolerowana pod warunkiem, że jest ona mierzalna wzdłuż prostopadłej do wartości szczytowej w punkcie TRR 1,02. 5.4.3. Wykonanie analizy. 5.4.3.1. Pobrać za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl 1 μl heksanu, zassać 0,5 μl powietrza, a następnie 0,5 — 1 μl roztworu próbki; pociągnąć tłoczek tak, aby opróżnić igłę. Wprowadzić igłę przez membranę zespołu iniekcyjnego i po upływie 1 do 2 sekund szybko opróżnić strzykawkę i powoli, tzn. mniej więcej po 5 sekundach, wyjąć igłę. 5.4.3.2. Prowadzić rejestrację do momentu całkowitego wypłukania TMSE występujących w próbce steroli. Linia podstawowa powinna zawsze spełniać wymagane warunki (5.4.1.2). 5.4.4. Wyznaczenie wartości szczytowych. Wyznaczenie poszczególnych wartości szczytowych odbywa się w oparciu o okresy zatrzymania i przez porównanie z mieszaniną TMSE steroli poddanych analizie w tych samych warunkach. Sterole podlegają elucji w następującej kolejności: cholesterol, brassikasterol, 24-metylen- cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7- kampesterol, Δ 5,23 stigmastadienol, klerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, Δ 5,24 stigmastadienol, Δ 7-stigmastenol, Δ 7-avenasterol. Tabela 1 podaje czasy zatrzymania w odniesieniu do sitosterolu dla kolumn SE-52 i SE-54. Rysunek 1 i 2 przedstawiają typowe chromatogramy kilku rodzajów oleju. 5.4.5. Ocena ilościowa. 5.4.5.1 Przystąpić do obliczania za pomocą integratora powierzchni wartości szczytowych β-cholesterolu i steroli. Nie uwzględniać ewentualnych wartości szczytowych związków nie wymienionych w tabeli 1. Współczynnik charakterystyki GLV β-cholesterolu przyjmuje się jako 1. 5.4.5.2. Obliczyć zawartość każdego prostego sterolu w mg/100 g substancji tłuszczowej w następujący sposób: gdzie: Ax = powierzchnia wartości szczytowej odpowiadającej obecności sterolu × ►M6 ————— ◄ As = powierzchnia wartości szczytowej odpowiadającej obecności β-cholestanolu ►M6 ————— ◄ ms = masa dodanego β-cholestanolu w miligramach m = masa próbki pobranej do badania w gramach

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

6.1. PODAĆ zawartości każdego sterolu w mg/100g substancji tłuszczowej, a ich sumę jako „sterole łączne”.

6.2. Procentową zawartość każdego sterolu oblicza się ze stosunku powierzchni odpowiedniej wartości szczytowej do sumy powierzchni wartości szczytowych steroli. gdzie: Ax = powierzchnia wartości szczytowej dla x; ΣA = łączna powierzchnia wartości szczytowej.









DODATEK

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze wprowadzić 1 do 3 μl metanu lub propanu i mierzyć chronometrem czas, którego gaz potrzebuje, aby przejść przez kolumnę począwszy od momentu wstrzyknięcia do spadku wartości szczytowej (tM).

Prędkość liniowa w cm/s określona jest jako L/tM, gdzie L jest długością kolumny w centymetrach, a tMczasem zmierzonym w sekundach.







Tabela 1 Względne wielkości czasu zatrzymania dla steroli Wartość szczytowa Oznaczenie Względna wielkość czasu zatrzymania SE 54 Kolumna SE 52 Kolumna 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α -cholestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]- 24-metyl-Δ-5,22-cholestadien-3β-ol 0,73 0,71 4 24-metylen-cholesterol 24-metylen-Δ-5,24-cholesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]- 24-metyl-Δ-5 cholesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]- 24-metyl-cholestan 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]-etyl- Δ- 5,22-cholestadien-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]-metyl- Δ- 7-cholesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl-Δ- 5,23-cholestadien-3β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]- 24-etyl-Δ- 5,25-cholastadien-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]- 24-etyl-Δ- 5-cholestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-etyliden-5-cholesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl-Δ- 5,24-cholestadien-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-etyl-Δ- 7,24-cholestadien-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7 avenasterol [24Z]- 24-etyliden-Δ- 7-cholesten-3β-ol 1,16 1,16

Rysunek 1 Chromatografia gazowa frakcji steroli nierafinowanej oliwy z oliwek

Rysunek 2 Chromatografia gazowa frakcji steroli nierafinowanej oliwy z oliwek









ZAŁĄCZNIK VI

OZNACZANIE ERYTRODIOLU I UVAOLU

WSTĘP

Erytrodiol (ogólna nazwa stosowana powszechnie w odniesieniu do glikoli; erytrodiolu i uvaolu) jest składnikiem substancji nie zmydlającej się, która występuje w pewnych substancjach tłuszczowych. Jego oznaczanie może służyć do sprawdzenia obecności ekstraktu oliwy z oliwek, przy czym jego stężenie jest w niej zdecydowanie większe niż w innych rodzajach oliwy (oliwa tłoczona z oliwek, oliwa z nasion winogron).

1. ZAKRES

przedstawiona tu metoda opisuje sposób oznaczania zawartości erytrodiolu w substancjach tłuszczowych.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

substancja tłuszczowa zmydlana Jest roztworem wodorotlenku potasu w etanolu. Frakcja niezmydlająca się jest następnie ekstrahowana eterem dietylowym, czyszczona w kolumnie siarczanu glinu i rozdzielana metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelu krzemionkowego.

Następnie rozdzielane są pasma frakcji sterolowej i erytrodiolowej. Oddzielone na płytkach sterole i erytrodiol są przekształcane w trimetylsilyletery i analizowane metodą chromatografii gazowej.

Wyniki podaje się w procentach erytrodiolu w mieszaninie erytrodiolu i steroli.

3. APARATURA

3.1. aparatura opisana w załączniku V (oznaczanie zawartości steroli).

4. ODCZYNNIKI

4.1. odczynniki wymienione w załączniku v (oznaczanie zawartości steroli).

4.2. 5 % roztwór wzorcowy erytrodiolu w chloroformie.

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie substancji nieulegającej zmydleniu.

Zgodnie z opisem podanym w pkt. 5.1.2 załącznika V.

5.2. Oddzielanie erytrodiolu i steroli.

5.2.1. Patrz pkt. 5.2.1 metody podanej w załączniku V.

5.2.2. Patrz pkt. 5.2.2 metody podanej w załączniku V.

5.2.3. Przygotować roztwór substancji nieulegającej zmydleniu (5 %) w chloroformie. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 0,1 ml rozprowadzić na płytce chromatograficznej w odległości około 1,5 cm od jej dolnej krawędzi, 0,3 ml wspomnianego roztworu w postaci możliwie jak najcieńszej i jednorodnej linii. Na jednym końcu płytki umieścić jako wzorzec kilka mikrolitrów roztworu cholesterolu i erytrodiolu.

5.2.4. Umieścić płytkę wewnątrz komory jak podano w pkt. 5.2.1. Temperatura otoczenia powinna wynosić około 20 °C. Bezzwłocznie zamknąć pokrywę komory pozostawiając w niej próbkę w celu eluacji, dopóki rozpuszczalnik nie dotrze na odległość 1 cm od górnej części płytki. Następnie wyjąć płytkę z komory i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza.

5.2.5. Spryskać równomiernie płytkę roztworem 2,7-dichlorofluoresceiny. Badając płytkę w świetle ultrafioletowym wyszukać pasma steroli i erytrodiolu przyrównując do składników wzorcowych; następnie zaznaczyć ostrym przyrządem nieco poza krawędziami fluoryzującej substancji.

5.2.6. Zdrapać żel krzemionkowy umieszczony na zaznaczonych obszarach za pomocą metalowej szpatułki. Umieścić materiał usunięty z płytki w kolbie o pojemności 50 ml. Dodać 15 ml gorącego chloroformu, całość starannie wymieszać i przefiltrować w kolbie z filtrem porowatym przenosząc żel krzemionkowy na filtr. Przepłukać trzykrotnie w ciepłym chloroformie (używając każdorazowo około 10 ml) i zebrać filtrat w kolbie o pojemności 100 ml. Odparowywać aż do uzyskania objętości rzędu 4 do 5 ml, przelać do probówki wirówkowej z dnem stożkowym o pojemności 10 ml, uprzednio zważonej, osuszyć ogrzewając lekko w strumieniu azotu i zważyć.

5.3. Przygotowanie trimetylsilyloeterów

Postępować zgodnie z pkt. 5.3 metody opisanej w załączniku V.

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej.

Postępować zgodnie z pkt. 5.4 tej samej metody. Analiza metodą chromatografii gazowej powinna być prowadzona w warunkach umożliwiających przestrzeganie wymogów analizy steroli i rozdzielania TMSE erytrodiolu i uvaolu.

Po wstrzyknięciu próbki pozostawić papier tak, aby rozwijał się aż do całkowitej elucji występujących w niej steroli — erytrodiolu i uvaolu. Następnie określić położenie wartości szczytowych (względne wartości czasu zatrzymania erytrodiolu i uvaolu w stosunku do B-sitosterolu wynoszą odpowiednio około 1,45 i 1,55). Następnie obliczyć powierzchnie według zasady podanej dla steroli.

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

gdzie:

A1 = obszar wartości szczytowej dla erytridiolu ►M6 ————— ◄ ;

A2 = obszar wartości szczytowej dla uvaolu ►M6 ————— ◄ ;

Asteroli = łączny obszar wartości szczytowej dla steroli ►M6 ————— ◄ .

Wynik jest podawany do jednego miejsca po przecinku.

▼M21









ZAŁĄCZNIK VII

OZNACZANIE ZAWARTOŚCI PROCENTOWEJ 2-MONOPALMITYNIANU GLICEROLU

1. CEL I ZAKRES STOSOWANIA

Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości procentowej kwasu palmitynowego w pozycji 2 triglicerydów metodą oznaczania 2-monopalmitynianu glicerolu.

Niniejsza metoda dotyczy olejów roślinnych płynnych w temperaturze pokojowej (20 °C).

2. ZASADA

Po przygotowaniu próbkę oleju poddaje się działaniu lipazy trzustkowej: częściowa i swoista hydroliza w pozycjach 1 i 3 cząsteczki triglicerydu powoduje pojawienie się monoglicerydów w pozycji 2. Zawartość procentowa 2-monopalmitynianu glicerolu we frakcji monoglicerydów jest oznaczana, po sililowaniu, metodą chromatografii gazowej na kolumnie kapilarnej.

3. APARATURA I MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE

3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.

3.2. Zlewki o pojemności 100, 250 i 300 ml.

3.3. Szklana kolumna chromatograficzna (wewnętrzna średnica: 21–23 mm, długość: 400 mm), wyposażona w płytkę ze spieku szklanego i kranik.

3.4. Cylindry miarowe o pojemności 10, 50, 100 i 200 ml.

3.5. Kolby o pojemności 100 i 250 ml.

3.6. Wyparka obrotowa.

3.7. Probówki do wirowania o pojemności 10 ml, ze szlifowanym korkiem.

3.8. Wirówka do probówek o pojemności 10 i 100 ml.

3.9. Termostat umożliwiający utrzymanie temperatury na poziomie 40 °C ± 0,5 °C.

3.10. Biurety z podziałką co 1 i 2 ml.

3.11. Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml.

3.12. Mikrostrzykawka o pojemności 100 μl.

3.13. Lejek, 1 000 ml.

3.14. Chromatograf gazowy do kolumn kapilarnych, wyposażony w dozownik do nastrzykiwania „na kolumnę” na zimno w celu bezpośredniego wprowadzania próbki do kolumny oraz w piecyk zapewniający utrzymanie wybranej temperatury z dokładnością do 1 °C.

3.15. Układ nastrzykowy „na kolumnę” na zimno, w celu bezpośredniego wprowadzenia próbki do kolumny.

3.16. Detektor płomieniowo-jonizacyjny i elektrometr.

3.17. Rejestrujący integrator współpracujący z elektrometrem, z szybkością odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru.

3.18. Kolumna kapilarna ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m i średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokryta 5 % polimetylosiloksanem lub polifenylo-metylosiloksanem, o grubości 0,10–0,30 μm, którą można stosować w temperaturze 370 °C.

3.19. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni, o długości co najmniej 7,5 cm, przeznaczona do wykonywania bezpośrednich nastrzyków na kolumnę.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 0,063 do 0,200 mm (70/280 mesh), przygotowany następująco: umieścić żel krzemionkowy w kapsule porcelanowej, suszyć w suszarce w temperaturze 160 °C przez 4 godziny, schłodzić do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodać objętość wody równoważną 5 % masy żelu krzemionkowego, w następujący sposób: do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml odważyć 152 g żelu krzemionkowego i dodać 8 g wody destylowanej, zatkać kolbę i delikatnie wstrząsać do uzyskania równomiernego rozprowadzenia wody. Odstawić na co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2. n-heksan (do chromatografii).

4.3. Izopropanol.

4.4. Izopropanol, roztwór wodny 1/1 (V/V).

4.5. Lipaza trzustkowa. Użyta lipaza musi wykazywać aktywność w zakresie od 2,0 do 10 jednostek lipazy na mg (W handlu dostępne są lipazy trzustkowe o aktywności w zakresie od 2 do 10 jednostek na mg enzymu).

4.6. Roztwór buforowy tris-hydroksymetyloaminometan: roztwór wodny 1 M doprowadzony do pH 8 (kontrola potencjometryczna) stężonym HCI (1/1 V/V).

4.7. Cholan sodu, jakości enzymatycznej, roztwór wodny o stężeniu 0,1 % (roztwór ten należy wykorzystać w ciągu 15 dni od sporządzenia).

4.8. Chlorek wapnia, 22 % roztwór wodny.

4.9. Eter dietylowy do chromatografii.

4.10. Rozpuszczalnik rozwijający: mieszanina n-heksanu/eteru dietylowego (87/13) (V/V).

4.11. Wodorotlenek sodu, roztwór 12 % wagowo.

4.12. Fenoloftaleina, roztwór 1 % w etanolu.

4.13. Gaz nośny: wodór lub hel do chromatografii gazowej.

4.14. Gazy pomocnicze: – wodór w stężeniu minimum 99 %, pozbawiony wilgoci i substancji organicznych – oraz powietrze do chromatografii gazowej o takiej samej czystości.

4.15. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania: mieszanina pirydyna/heksametylodisilazan/trimetylochlorosilan w proporcji 9/3/1 (V/V/V) (W handlu dostępne są roztwory gotowe do użycia. Można zastosować również inne odczynniki wywołujące reakcję sililowania, jak np. bis-trimetylosilyltrifluoraocetamid + 1 % trimetylochlorosilan, rozcieńczone taką samą objętością bezwodnika pirydyny).

4.16. Próbki wzorcowe: czyste monoglicerydy lub mieszaniny monoglicerydów o znanym składzie procentowym podobnym do występującego w próbce badanej.

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie próbki

5.1.1. Oleje o wolnej kwasowości poniżej 3 % nie wymagają zobojętnienia przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Oleje o wolnej kwasowości powyżej 3 % muszą być zobojętnione zgodnie z ppkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do lejka o pojemności 1 000 ml (3.13) wlać 50 g oleju i 200 ml n-heksanu. Dodać 100 ml izopropanolu i ilość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 12 % (4.11) odpowiadającą wolnej kwasowości oleju powiększonej o 5 %. Wstrząsać energicznie przez jedną minutę. Dodać 100 ml wody destylowanej, ponownie wstrząsnąć i odstawić. Po dekantacji usunąć dolną warstwę mydła. Usunąć także wszystkie pośrednie warstwy (śluzy, substancje nierozpuszczalne). Płukać roztwór heksanu i zobojętnionego oleju kolejnymi porcjami 50–60 ml roztworu izopropanol/woda w proporcji 1/1 (V/V) (4.4), aż zniknie różowa barwa fenoloftaleiny. Usunąć większość heksanu za pomocą destylacji w próżni (wykorzystać do tego celu na przykład wyparkę obrotową) i przenieść olej do kolby o pojemności 100 ml (3.5). Suszyć olej w próżni do całkowitego usunięcia rozpuszczalnika. Pod koniec tej czynności kwasowość oleju musi wynosić poniżej 0,5 %.

5.1.2. Wprowadzić 1,0 g oleju przygotowanego w sposób wskazany powyżej do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i rozpuścić go w 10 ml mieszaniny rozwijającej (4.10). Odstawić roztwór na co najmniej 15 minut przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Jeżeli roztwór jest mętny, odwirować go w celu zapewnienia optymalnych warunków wykonywania chromatografii. (Można zastosować gotowe do użycia wkłady żelu krzemionkowego SPE o masie 500 mg).

5.1.3. Przygotowanie kolumny chromatograficznej Nanieść na kolumnę (3.3) około 30 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10), za pomocą szklanej pałeczki wprowadzić wacik do dolnej części kolumny; przycisnąć w celu usunięcia powietrza. Przygotować w zlewce zawiesinę 25 g żelu krzemionkowego (4.1) w około 80 ml rozpuszczalnika rozwijającego i przelać ją do kolumny przy użyciu lejka. Sprawdzić, czy cały żel krzemionkowy został wprowadzony do kolumny; przemyć rozpuszczalnikiem rozwijającym (4.10), otworzyć kranik i poczekać, aż poziom płynu osiągnie wysokość około 2 mm poniżej górnego poziomu żelu krzemionkowego.

5.1.4. Chromatografia na kolumnie Do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) odważyć dokładnie 1,0 g próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1. Rozpuścić próbkę w 10 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10). Wlać roztwór do kolumny chromatograficznej przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1.3. Starać się nie poruszyć powierzchni kolumny. Otworzyć kranik i zlać roztwór próbki, aż osiągnie poziom żelu krzemionkowego. Rozwinąć poprzez dodanie 150 ml rozpuszczalnika rozwijającego. Ustawić szybkość przepływu na 2 ml/min (tak aby 150 ml przeszło przez kolumnę w ciągu około 60–70 minut). Zebrać odciek z kolumny do wcześniej wytarowanej kolby o pojemności 250 ml. Odparować rozpuszczalnik w próżni i usunąć jego resztkowe pozostałości pod strumieniem azotu. Zważyć kolbę i obliczyć ilość zebranego ekstraktu. (W przypadku korzystania z gotowych do użytku wkładów krzemionkowych SPE postępować następująco: wprowadzić 1 ml roztworu (5.1.2) do wkładów przygotowanych wcześniej przy użyciu 3 ml n-heksanu. Po perkolacji roztworu rozwinąć chromatogram poprzez dodanie 4 ml n-heksanu/eteru dietylowego w proporcji 9/1 (V/V). Zebrać odciek z kolumny do probówki o pojemności 10 ml i poddać go odparowywaniu do sucha pod strumieniem azotu. Poddać suchą pozostałość działaniu lipazy trzustkowej (5.2). Bezwzględnie konieczne jest sprawdzenie składu kwasów tłuszczowych przed przepuszczeniem i po przepuszczeniu przez wkład SPE).

5.2. Hydroliza przez lipazę trzustkową

5.2.1. Do probówki do wirowania odważyć 0,1 g oleju przygotowanego zgodnie z ppkt 5.1. Dodać 2 ml roztworu buforowego (4.6), 0,5 ml roztworu cholanu sodu (4.7) i 0,2 ml roztworu chlorku wapnia, dobrze wstrząsając po dodaniu każdej z tych substancji. Zamknąć probówkę szlifowanym korkiem i umieścić ją w termostacie o temperaturze 40 ± 0,5 °C.

5.2.2. Dodać 20 mg lipazy, ostrożnie wstrząsać (nie dopuszczając do zwilżenia korka) i włożyć probówkę do termostatu na dokładnie 2 minuty, następnie wyjąć ją, wstrząsać energicznie i dokładnie przez 1 minutę i odstawić do schłodzenia.

5.2.3. Dodać 1 ml eteru dietylowego, zatkać korkiem i wstrząsać energicznie, następnie odwirować i przenieść roztwór eteru do czystej i suchej probówki przy użyciu mikrostrzykawki.

5.3. Przygotowanie pochodnych silanizowanych i chromatografii gazowej

5.3.1. Przy użyciu mikrostrzykawki wprowadzić 100 μl roztworu (5.2.3) do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml.

5.3.2. Usunąć rozpuszczalnik pod słabym strumieniem azotu, dodać 200 μl odczynnika wywołującego reakcję sililowania (4.15), zatkać probówkę i odstawić na 20 minut.

5.3.3. Po 20 minutach dodać od 1 do 5 ml n-heksanu (zależnie od warunków chromatografowania): uzyskany roztwór jest gotowy do chromatografii gazowej.

5.4. Chromatografia gazowa

Warunki robocze są następujące:

— temperatura urządzenia nastrzykującego (nastrzyk „na kolumnę”) niższa od temperatury wrzenia roztworu (68 °C),

— temperatura detektora: 350 °C,

— temperatura kolumny: zaprogramowanie temperatury pieca: 60 °C przez 1 minutę, ze zwiększaniem temperatury o 15 °C na minutę aż do 180 °C, następnie o 5 °C na minutę do 340 °C, następnie 340 °C przez 13 minut,

— gaz nośny: wodór lub hel, z regulacją do odpowiedniej liniowej szybkości przepływu w celu uzyskania rozdzielczości przedstawionej na rysunku 1. Czas retencji triglicerydu C54 musi wynosić 40 ± 5 minut (patrz: rysunek 2); (Wskazane powyżej warunki robocze zostały zaproponowane orientacyjnie. Każdy operator musi je zoptymalizować w celu uzyskania pożądanej rozdzielczości. Wysokość piku odpowiadającego 2-monopalmitynianowi glicerolu musi wynosić minimum 10 % skali rejestratora),

— ilość nastrzykiwanej substancji: 0,5–1 μl roztworu (5 ml) n-heksanu (5.3.3.).

5.4.1. Identyfikacja pików

Poszczególne monoglicerydy są identyfikowane według czasów retencji oraz przez porównanie z pikami uzyskanymi ze standardowymi mieszaninami monoglicerydów analizowanymi w tych samych warunkach.

5.4.2. Ocena ilościowa

Oblicza się pole pod każdym pikiem przy użyciu elektronicznego integratora.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

Zawartość procentową monopalmitynianu glicerolu oblicza się na podstawie stosunku pola pod odpowiednim pikiem do sumy pól pod pikami wszystkich monoglicerydów (patrz: rysunek 2), na podstawie wzoru:

Glyceril monopalmitate (%):

gdzie:

Ax = pole pod pikiem odpowiadającym monopalmitynianowi glicerolu

ΣA = suma pól pod wszystkimi pikami monoglicerydów

Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

7. SPRAWOZDANIE Z ANALAIZY

Sprawozdanie z testu powinno zawierać:

— odwołanie do niniejszej metody,

— wszelkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próbki,

— wynik analizy,

— wszelkie odchylenia od metody będące wynikiem decyzji zainteresowanych stron lub zaistniałe z innego powodu,

— dane identyfikujące laboratorium, datę analizy i podpisy osób odpowiedzialnych za tę ostatnią.

Rysunek 1

Chromatogram produktów reakcji sililowania uzyskanych po zadziałaniu lipazą na rafinowaną oliwę z oliwek, do której dodano 20 % zestryfikowanego oleju (100 %)

Objaśnienie: „Acides gras libres” = Wolne kwasy tłuszczowe; „Huile d’olive raffinée” = Rafinowana oliwa z oliwek – „+ 20 % huile estérifiée” = + 20 % oliwa z oliwek estryfikowana; „1-2 monopalmitine” = 1-2 monopalmityn – „1-2 monopalmitoléine” = 1-2 monopalmitoleina; „1-2 mono C18 insat.” = 1-2 mono C18 nenasyc.; Squalène = Skwalen

Rysunek 2

Chromatogram:

A) nie estryfikowanej oliwy z oliwek, po zadziałaniu na nią lipazą; po sililowaniu; w podanych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Objaśnienie: 1 = Wolne kwasy tłuszczowe 2 = Monoglicerydy 3 = Diglicerydy 4 = Triglicerydy * = 2-monopalmityn ** = Trigliceryd C54

Chromatogram:

B) oliwy estryfikowanej po zadziałaniu lipazą; po sililowaniu; w tych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Objaśnienie: 1 = Wolne kwasy tłuszczowe 2 = Monoglicerydy 3 = Diglicerydy 4 = Triglicerydy * = 2-monopalmityn ** = Trigliceryd C54

8. UWAGI

PRZYGOTOWANIE LIPAZY

W handlu dostępne są lipazy o zadowalającej aktywności. Możliwe jest również ich przygotowanie w laboratorium w następujący sposób:

Schłodzić w 0 °C 5 kg świeżej trzustki wieprzowej. Usunąć tłuszcz stały i otaczającą go tkankę łączną i utrzeć w młynku do uzyskania płynnej pasty. Wymieszać tę pastę z 2,5 litra bezwodnego acetonu w czasie od 4 do 6 godzin, następnie odwirować. Poddać pozostałość jeszcze trzykrotnej ekstrakcji taką samą objętością bezwodnego acetonu, a następnie dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną acetonu i eteru dietylowego w stosunku 1 do 1 (V/V) i dwukrotnej ekstrakcji eterem dietylowym.

Suszyć pozostałość w próżni przez 48 godzin w celu uzyskania stabilnego proszku nadającego się do przechowywania przez dłuższy czas w lodówce, w miejscu chronionym przed wilgocią.

KONTROLA DZIAŁANIA LIPAZY

Przygotować emulsję oliwy z oliwek w następujący sposób:

Wstrząsać przez 10 minut w mieszadle mieszaninę składającą się ze 165 ml roztworu gumy arabskiej o stężeniu 100 g/l, 15 g skruszonego lodu i 20 ml wcześniej zobojętnionej oliwy z oliwek.

Do zlewki o pojemności 50 ml wlać 10 ml tej emulsji, a następnie 0,3 ml roztworu cholanu sodu o stężeniu 0,2 g/ml i 20 ml wody destylowanej.

Umieścić zlewkę w termostacie, którego temperatura utrzymywana jest na poziomie 37 °C; umieścić w nim elektrody pH-metru i mieszadło spiralne.

Za pomocą biurety dodawać kroplami 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie wartość 8,3.

Dodać dostateczną objętość wodnej zawiesiny lipazy w proszku (0,1 g/ml lipazy). Z chwilą gdy pH-metr wskaże 8,3, włączyć stoper i rozpocząć wkraplanie roztworu wodorotlenku sodu z prędkością umożliwiającą utrzymanie pH na poziomie 8,3. Co minutę zapisywać objętość zużytego roztworu.

Nanieść zanotowane wartości na diagram, zaznaczając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych liczby mililitrów 0,1 N roztworu zasadowego zużytego w celu utrzymania stałego pH. W wyniku tego powinno się otrzymać linię prostą.

Aktywność lipazy wyrażoną w jednostkach lipazowych na mg oblicza się według następującego wzoru:

gdzie:

A oznacza aktywność w jednostkach lipazowych/mg

V oznacza liczbę mililitrów 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu na minutę (obliczoną na podstawie wykresu)

N oznacza normalność roztworu wodorotlenku sodu

m oznacza masę w mg oznaczanej lipazy.

Jednostkę lipazową definiuje się jako ilość enzymu uwalniającą 10 mikroekwiwalentów kwasu na minutę.

▼M20 —————

▼M25









ZAŁĄCZNIK IX

BADANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNE W ULTRAFIOLECIE

WPROWADZENIE

Dzięki badaniu spektrofotometrycznemu w ultrafiolecie można uzyskać informacje o jakości substancji tłuszczowej, jej stanie zachowania i zmianach wywołanych procesami technologicznymi.

Efekty absorpcji fal o długości określonej w tej metodzie są wywołane obecnością sprzężonych systemów dienowych i trienowych. Wielkość takiej absorpcji jest wyrażana jako właściwa gęstość optyczna E 1 % 1 cm (gęstość optyczna 1 % roztworu substancji tłuszczowej w określonym rozpuszczalniku, dla warstwy o grubości 1 cm) oznaczona zgodnie z konwencją jako K (zwana również „współczynnikiem ekstynkcji”).

1. ZAKRES

W ramach metody opisuje się procedurę przeprowadzania badania spektrofotometrycznego oliwy z oliwek (opisanej w dodatku) w ultrafiolecie.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

Badana substancja tłuszczowa jest rozpuszczana w wymaganym rozpuszczalniku, a następnie dokonywane jest oznaczenie gęstości optycznej roztworu dla określonych długości fal w porównaniu z czystym rozpuszczalnikiem. Na podstawie odczytów spektrofotometrycznych oblicza się właściwe gęstości optyczne. Oblicza się absorbancję właściwą przy 232 nm i 268 nm w izooktanie lub przy 232 nm i 270 nm w cykloheksanie dla stężenia 1 g na 100 ml w ogniwie 10 mm.

3. URZĄDZENIA

3.1. Spektrofotometr do pomiaru gęstości optycznej w ultrafiolecie w zakresie od 220 do 360 nm z możliwością odczytu pojedynczych jednostek nanometrycznych. Zaleca się, aby przed użyciem spektrometru sprawdzić jego skale długości fal i absorbancji w niżej opisany sposób. 3.1.1. Skala długości fal: Można ją sprawdzić poprzez zastosowanie materiału wzorcowego złożonego z filtra ze szkła optycznego zawierającego tlenek holmu o charakterystycznych pasmach absorpcyjnych. Materiał wzorcowy służy do weryfikacji i kalibracji skali długości fal w spektrofotometrach w świetle widzialnym i nadfiolecie o nominalnej spektralnej szerokości wiązki do 5 nm. Przeprowadza się pomiar filtra ze szkła optycznego w trybie absorbancji względem próbki wzorcowej z powietrzem otoczenia, w zakresie długości fal od 640 do 240 nm. Dla każdej spektralnej szerokości wiązki (0,10 – 0,25 – 0,50 – 1,00 – 1,50 – 2,00 i 3,00) przeprowadzana jest korekta bazowa przy pustym pojemniku na ogniwo. Długości fal dla określonej spektralnej szerokości wiązki są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego zgodnie z normą ISO 3656. 3.1.2. Skala absorbancji: Można ją sprawdzić poprzez zastosowanie materiału wzorcowego złożonego z 4 roztworów dichromianu potasu w kwasie nadchlorowym szczelnie zamkniętych w kwarcowych ogniwach ultrafioletowych oraz zmierzenie wartości referencyjnej liniowości i dokładności fotometrycznej w ultrafiolecie. Dokonuje się pomiaru ogniw wypełnionych dichromianem potasu (40 mg/ml, 60 mg/ml, 80 mg/ml i 100 mg/ml) względem próbki wzorcowej z kwasem nadchlorowym. Wartości absorbancji netto są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego zgodnie z normą ISO 3656.

3.2. Prostokątne ogniwa kwarcowe z pokrywkami mają długość optyczną równą 1 cm. Po napełnieniu ich wodą lub innym odpowiednim rozpuszczalnikiem ogniwa nie powinny się różnić między sobą o więcej niż 0,01 jednostki gęstości optycznej.

3.3. Kolby miarowe o pojemności 25 ml.

3.4. Waga analityczna z dokładnością odczytu do najbliższego 0,0001 g.

4. ODCZYNNIKI

Jeżeli nie ma innych wskazań, należy używać wyłącznie odczynników o uznanej klasie analitycznej.

Rozpuszczalnik: izooktan (2,2,4-trimetylopentan) do pomiaru przy 232 nm i 268 nm lub cykloheksan do pomiaru przy 232 nm i 270 nm, przy czym absorbancja wynosi mniej niż 0,12 przy 232 nm i mniej niż 0,05 przy 250 nm w stosunku do wody destylowanej; pomiar w ogniwie 10 mm.

5. PROCEDURA

5.1. Badana próbka musi być całkowicie jednorodna i pozbawiona wszelkich zanieczyszczeń występujących w postaci zawiesiny. Oleje pozostające w stanie płynnym w temperaturze otoczenia są filtrowane przez filtr papierowy w temperaturze około 30 °C, tłuszcze stałe są homogenizowane i filtrowane w temperaturze, która nie przekracza ich temperatury topnienia o więcej niż o 10 °C.

5.2. Odważyć około 0,25 g (z dokładnością do najbliższego 1 mg) przygotowanej w ten sposób próbki w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, uzupełnić wskazanym rozpuszczalnikiem i poddać homogenizacji. Uzyskany roztwór musi być idealnie przezroczysty. W razie wystąpienia opalizacji lub mętnienia przefiltrować szybko przez papierowy filtr.

5.3. Napełnić kwarcowe ogniwo otrzymanym roztworem i dokonać pomiaru gęstości optycznych, stosując jako wzorzec zastosowany rozpuszczalnik, dla właściwej długości fal mieszczącej się w przedziale od 232 do 276 nm. Zarejestrowane wartości gęstości optycznej muszą mieścić się w przedziale od 0,1 do 0,8. Jeżeli się nie mieszczą, należy powtórzyć pomiary, stosując odpowiednio silniejsze lub słabsze roztwory. UWAGA: Nie jest konieczne dokonywanie pomiaru absorbancji dla całego zakresu długości fal.

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

6.1. Należy zarejestrować właściwe gęstości optyczne (współczynniki ekstynkcji) dla różnych długości fal, obliczając je w następujący sposób: gdzie: Κλ = właściwa gęstość optyczna przy długości fali λ, Ελ = gęstość optyczna zmierzona przy długości fali λ; c = stężenie roztworu w g/100 ml; s = grubość ogniw kwarcowych w cm. Wyniki należy podawać z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6.2. Zmienność właściwej gęstości optycznej (ΔΚ) Spektrofotometryczna analiza oliwy z oliwek zgodna z urzędową metodą określoną w przepisach Unii obejmuje również oznaczenie zmienności wartości bezwzględnej właściwej gęstości optycznej (ΔΚ), którą określa wzór: gdzie Km oznacza właściwą gęstość optyczną dla długości fal m; długość fal dla maksymalnej absorpcji zależy od zastosowanego rozpuszczalnika: 270 nm dla cykloheksanu i 268 nm dla izooktanu.









Dodatek







WŁAŚCIWOŚCI OLIWY Z OLIWEK Kategoria Estry metylowe kwasu tłuszczowego (FAME) i estry etylowe kwasu tłuszczowego (FAEE) Kwasowość (%) (*) Liczba nadtlenkowa mEq 02/kg (*) Woski mg/kg (**) 2-monopalmitynian glicerolu (%) Stigmastadien mg/kg (1) Różnica między HPLC ECN42 a teoretycznym ECN42 K232 (*) K270 (*) „K 270 lub K 268 (5)” Delta-K (*) (5) Ocena organoleptyczna Mediana błędów (Md) (*) Ocena organoleptyczna Mediana owocowości (Mf) (*) 1. Oliwa z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg lub 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg oraz (FAEE/FAME) ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 3. Oliwa z oliwek typu lampante — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 4. Rafinowana oliwa z oliwek — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 5. Oliwa z oliwek złożona z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0, jeśli % zawartość kwasu palmitynowego ogółem > 14 % 6. Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Suma izomerów, które mogłyby (lub nie mogłyby) być oddzielone kolumną kapilarną. (2) Lub jeżeli mediana błędów jest mniejsza lub równa 3,5, a mediana owocowości wynosi 0. (3) Oliwa z zawartością wosków między 300 mg/kg a 350 mg/kg jest uznawana za oliwę lampante, jeżeli całkowita zawartość alkoholi alifatycznych jest mniejsza lub równa 350 mg/kg lub jeżeli zawartość procentowa erytrodiolu i uwaolu jest niższa lub równa 3,5. (4) Oliwa z zawartością wosków między 300 mg/kg a 350 mg/kg jest uznawana za surową oliwę z wytłoczyn oliwek, jeżeli całkowita zawartość alkoholi alifatycznych wynosi powyżej 350 mg/kg i jeżeli zawartość procentowa erytrodiolu i uwaolu jest większa niż 3,5. (5) K 270, jeżeli rozpuszczalnikiem jest cykloheksan; K 268, jeżeli rozpuszczalnikiem jest izooktan.

▼B









ZAŁĄCZNIK X A

ANALIZA METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH

1. ZAKRES

Niniejsza metoda zawiera ogólne wytyczne stosowania chromatografii gazowej, z wykorzystaniem wypełnionych lub kapilarnych kolumn, do oznaczania składu jakościowego i ilościowego mieszaniny estrów metanowych kwasów tłuszczowych według sposobu podanego w załączniku X B.

Metoda nie znajduje zastosowania w przypadku spolimeryzowanych kwasów tłuszczowych.

2. ODCZYNNIKI

2.1. Gaz nośny

Gaz obojętny (azot, hel, argon, wodór itp.) dokładnie wysuszony i zawierający mniej niż 10 mg/kg tlenu.

Uwaga 1:

Wodór wykorzystywany w charakterze gazu nośnego wyłącznie w kolumnach kapilarnych pozwala podwoić prędkość analizy, ale stwarza zagrożenia. Istnieją jednak urządzenia zabezpieczające.

2.2. Gazy pomocnicze

2.2.1. Wodór (czystość ≥ 99,9 %) niezawierający zanieczyszczeń organicznych.

2.2.2. Powietrze lub tlen niezawierające zanieczyszczeń organicznych.

2.3. Produkty wzorcowania

Mieszanina czystych estrów metylowych kwasów tłuszczowych lub estrów metylowych substancji tłuszczowej o znanym składzie, o ile to możliwe jak najbardziej zbliżonym do składu substancji tłuszczowej poddawanej analizie.

Przedsięwziąć wszelkie środki ostrożności, aby uniknąć utlenienia nienasyconych polikwasów tłuszczowych.

3. APARATURA

Podane zalacenia dotycza powszechnie stosowanego sprzętu do chromatografii gazowej z wykorzystaniem napełnionych kolumn i/lub kapilar i płomieniowego detektora jonizacyjnego. Odpowiednia jest każda aparatura charakteryzująca się taką samą efektywnością i rozdzielczością jak aparatura wymieniona w pkt. 4.1.2.

3.1. Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy składa się z następujących składników:

3.1.1. System wtryskowy.

Stosować system wtryskowy:

a) z wypełnionymi kolumnami, gdy martwa przestrzeń systemu jest możliwie jak najmniejsza (w takim przypadku system wtryskowy musi być zdolny do podgrzania go do temperatury 20 °C do 50 °C wyższej od temperatury kolumny); lub

b) z kolumnami kapilarnymi, w którym to przypadku system musi być specjalnie skonstruowany, aby można było go wykorzystać z takimi kolumnami. Może ono być systemem typu rozdzielacza lub iniektora całkowitego na wlocie do schłodzonej kolumny (iniektor bezkolumnowy).

Uwaga 2:

W razie braku substancji tłuszczowej zawierającej kwasy tłuszczowe o mniejszej ilości atomów węgla niż 16, można zastosować iniektor igłowy.

3.1.2. Piec

Piec musi być w stanie nagrzać kolumnę do temperatury co najmniej 260 °C i utrzymać określoną temperaturę z dokładnością do 1 °C w przypadku kolumny z wypełnieniem i z dokładnością do 0,1 °C w przypadku kolumny kapilarnej. Ta ostatnia właściwość jest szczególnie istotna w razie stosowania rury z topionej krzemionki.

Stosowanie urządzenia wyposażonego w programator temperatury jest zalecane we wszystkich przypadkach, w szczególności w przypadku występowania kwasów tłuszczowych zawierających poniżej 16 atomów węgla.

3.1.3. Kolumna wypełniona

3.1.3.1. Kolumna z materiału obojętnego w stosunku do substancji analizowanej (ze szkła lub w razie braku stali nierdzewnej) o następujących wymiarach: a) długość: 1 do 3 m. Stosunkowo krótka kolumna będzie stosowana w przypadku występowania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu (powyżej C20). W razie analizowania kwasów o liczbie atomów węgla C4 do C6 zaleca się stosowanie kolumny o długości 2 m; b) średnica wewnętrzna: od 2 do 4 mm. Uwaga 3: W razie występowania składników nienasyconych z większą ilością podwójnych wiązań niż trzy, kolumna ze stali nierdzewnej może spowodować ich rozpad. Uwaga 4:Można stosować system z podwójną kolumną z wypełnieniem.

3.1.3.2. Wypełnienie obejmujące następujące składniki a) podłoże: ziemia okrzemkowa wypłukana w kwasach i potraktowana krzemowodorami, lub jakiekolwiek inne stosowne obojętne podłoże o w miarę jednolitym uziarnieniu (25 mm w granicach od 125 do 200 mm), przy czym średni wymiar jest powiązany z wewnętrzną średnicą i długością kolumny; b) faza nieruchoma: faza biegunowa typu poliestrowego (na przykład polibursztynian butanodiolu, poliadypinian etylenoglikolu, itp.), cyianosilikony lub jakakolwiek inna faza umożliwiająca rozdzielenie chromatograficzne (patrz pkt. 4). Faza nieruchoma powinna mieścić się w granicach