02009R0152 — PL — 28.06.2022 — 008.001

Dokument ten służy wyłącznie do celów informacyjnych i nie ma mocy prawnej. Unijne instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego treść. Autentyczne wersje odpowiednich aktów prawnych, włącznie z ich preambułami, zostały opublikowane w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej i są dostępne na stronie EUR-Lex. Bezpośredni dostęp do tekstów urzędowych można uzyskać za pośrednictwem linków zawartych w dokumencie

►B ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) nr 152/2009 z dnia 27 stycznia 2009 r. ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz (Tekst mający znaczenie dla EOG) (Dz.U. L 054 z 26.2.2009, s. 1)

zmienione przez:









▼B

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) nr 152/2009

z dnia 27 stycznia 2009 r.

ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz

(Tekst mający znaczenie dla EOG)







▼M3

Artykuł 1

Pobieranie próbek do celów urzędowej kontroli pasz, w szczególności w zakresie oznaczania składników, w tym materiału zawierającego organizmy zmodyfikowane genetycznie, składającego się z nich lub produkowanego z nich, dodatków paszowych zdefiniowanych w rozporządzeniu (WE) nr 1831/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady ( 1 ) oraz niepożądanych substancji zdefiniowanych w dyrektywie 2002/32/WE Parlamentu Europejskiego i Rady ( 2 ) przeprowadzane jest zgodnie z metodami opisanymi w załączniku I.

Metoda pobierania próbek opisana w załączniku I ma zastosowanie do kontroli pasz w zakresie oznaczania pozostałości pestycydów zgodnie z definicją w rozporządzeniu (WE) nr 396/2005 Parlamentu Europejskiego i Rady ( 3 ) oraz do kontroli zgodności z rozporządzeniem (UE) nr 619/2011.

▼B

Artykuł 2

Przygotowanie próbek do analizy i wyrażanie wyników odbywa się zgodnie z metodami opisanymi w załączniku II.

Artykuł 3

Badania do celów urzędowej kontroli pasz przeprowadzane są z wykorzystaniem metod określonych w załącznikach III (Metody analizy składu materiałów i mieszanek paszowych), IV (Metody analizy do celów kontroli poziomu dopuszczonych dodatków w paszach), V (Metody analizy do celów kontroli zawartości niepożądanych substancji w paszach) oraz VI (Metody analizy dotyczące oznaczania składników pochodzenia zwierzęcego do celów urzędowej kontroli pasz).

Artykuł 4

Wartość energetyczna mieszanek paszowych dla drobiu obliczana jest zgodnie z załącznikiem VII.

Artykuł 5

Określone w załączniku VIII metody analizy mające na celu kontrolę nielegalnej obecności w paszach dodatków, które już nie są dopuszczone, stosowane są do celów potwierdzania.

Artykuł 6

Dyrektywy 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/WE, 98/64/WE, 1999/27/WE, 1999/76/WE, 2000/45/WE, 2002/70/WE i 2003/126/WE tracą moc.

Odesłania do uchylonych dyrektyw rozumiane są jako odesłania do niniejszego rozporządzenia i interpretuje zgodnie z tabelami korelacji w załączniku IX.

Artykuł 7

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie dwudziestego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie stosuje się od dnia 26 sierpnia 2009 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.

▼M3









ZAŁĄCZNIK I

METODY POBIERANIA PRÓBEK

1. CEL I ZAKRES

Próbki przeznaczone do urzędowej kontroli pasz pobierane są zgodnie z metodami opisanymi poniżej. Próbki otrzymane w ten sposób uważa się za reprezentatywne dla kontrolowanych części.

Celem reprezentatywnego pobierania próbek jest uzyskanie niewielkiej frakcji partii w sposób gwarantujący, że oznaczenie jakiejkolwiek cechy szczególnej tej frakcji stanowi średnią cech całej partii. Próbki danej partii można pobierać poprzez wielokrotne pobieranie próbek pierwotnych w różnych miejscach partii. Próbki pierwotne są łączone poprzez ich zmieszanie w celu stworzenia próbki zbiorczej, z której przygotowuje się reprezentatywne próbki końcowe poprzez podział reprezentatywny.

Jeżeli kontrola wzrokowa wskazuje, że części paszy, z której mają być pobrane próbki, różnią się jakością od pozostałej części paszy z tej samej partii, części te oddziela się od pozostałej części paszy i traktuje jako oddzielną podpartię. Jeżeli podział paszy na oddzielne podpartie nie jest możliwy, należy pobrać próbki z paszy jako z jednej partii. W takim przypadku informację o tym należy umieścić w sprawozdaniu z pobierania próbek.

Jeżeli pasza, z której pobrano próbki zgodnie z przepisami niniejszego rozporządzenia, zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, i jest ona częścią partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

2. DEFINICJE

— Partia : określona ilość paszy mająca wspólne cechy, takie jak pochodzenie, odmiana, rodzaj opakowania, pakujący, wysyłający lub etykietowanie, a w przypadku procesu produkcyjnego – jednostka produkcyjna wytworzona w jednym zakładzie z wykorzystaniem jednolitych parametrów produkcyjnych lub pewna ilość takich jednostek, w przypadku gdy są one produkowane w sposób ciągły i przechowywane razem.

— Kontrolowana część : partia lub określona część partii lub podpartii.

— Próbka zapieczętowana : próbka zapieczętowana w sposób uniemożliwiający dostęp do niej bez złamania lub usunięcia pieczęci.

— Próbka pierwotna : ilość pobrana z jednego miejsca kontrolowanej części.

— Próbka zbiorcza : sumaryczna ilość pierwotnych próbek pobranych z tej samej kontrolowanej części.

— Próbka zredukowana : część próbki zbiorczej otrzymana z niej w procesie reprezentatywnej redukcji.

— Próbka końcowa : część zredukowanej próbki lub zhomogenizowanej próbki zbiorczej.

— Próbka laboratoryjna : próbka przeznaczona do celów laboratoryjnych (otrzymana przez laboratorium), która może być próbką końcową, zredukowaną lub zbiorczą.

3. PRZEPISY OGÓLNE

— Personel pobierający próbki: próbki pobierane są przez osoby upoważnione do tego celu przez właściwy organ.

— Próbka musi być zapieczętowana w sposób uniemożliwiający dostęp do niej bez złamania lub usunięcia pieczęci. Znak pieczęci musi być łatwo identyfikowalny i widoczny. Ewentualnie próbka może zostać umieszczona w pojemniku, który może być zamknięty w sposób uniemożliwiający jego ponowne otwarcie bez nieodwracalnego uszkodzenia pojemnika, co zapobiega jego ponownemu użyciu.

— Identyfikacja próbki: próbka musi być oznaczona w sposób trwały i być zidentyfikowana w sposób pozwalający na jej jednoznaczne powiązanie ze sprawozdaniem z pobierania próbek.

— Z każdej próbki zbiorczej pobierane są co najmniej dwie próbki końcowe: co najmniej jedna w celu kontroli (przestrzeganie przepisów) oraz jedna dla podmiotu działającego na rynku pasz (obrona). Jedna próbka końcowa może zostać pobrana do celów referencyjnych. Jeżeli kompletna próbka zbiorcza zostaje zhomogenizowana, próbki końcowe pobierane są ze zhomogenizowanej próbki zbiorczej, chyba że procedura taka jest sprzeczna z przepisami państw członkowskich dotyczącymi praw podmiotu działającego na rynku pasz.

4. SPRZĘT

4.1. Sprzęt do pobierania próbek musi być wykonany z materiałów, które nie zanieczyszczą kontrolowanego produktu. Sprzęt przeznaczony do wielokrotnego użytku musi być łatwy do utrzymania w czystości w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.

4.2. Sprzęt zalecany do pobierania próbek pasz stałych 4.2.1. Ręczne pobieranie próbek 4.2.1.1. Szufelka o płaskim dnie i prostopadłych ściankach bocznych. 4.2.1.2. Ostrze probiercze z długą szczeliną lub z przegródkami. Wymiary ostrza probierczego muszą być dostosowane do charakterystyki kontrolowanej części (głębokość pojemnika, wymiary worka itp.) i do wielkości cząstek paszy. Jeżeli ostrze probiercze ma kilka otworów, w celu zagwarantowania pobierania próbek w różnych miejscach wzdłuż ostrza, należy oddzielić je przegródkami lub zastosować naprzemienne otwory rozmieszczone sekwencyjnie. 4.2.2. Mechaniczne pobieranie próbek Stosowne urządzenie mechaniczne może być użyte do pobierania próbek paszy w ruchu. „Stosowne” oznacza, że próbki zostają pobrane co najmniej z całego odcinka przepływu. Pobieranie próbek paszy w ruchu (przy dużym natężeniu przepływu) może być prowadzone przy użyciu automatycznych urządzeń. 4.2.3. Rozdzielacz Jeżeli jest to możliwe i stosowne, w celu przygotowania próbek zredukowanych w sposób reprezentatywny powinien być stosowany sprzęt przeznaczony do rozdzielania próbki na w przybliżeniu równe części.

5. WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE LICZBY PRÓBEK PIERWOTNYCH

— Wymogi ilościowe określone w pkt 5.1 i 5.2, dotyczące liczby próbek pierwotnych, mają zastosowanie do kontrolowanych części do wielkości maksymalnie 500 ton, które mogą być kontrolowane w reprezentatywny sposób. Procedura pobierania próbek jest ważna również w odniesieniu do rozmiarów większych niż podana wielkość maksymalna, pod warunkiem że zignorowana zostanie maksymalna liczba próbek pierwotnych podana w tabelach poniżej, zaś ilość próbek pierwotnych zostanie określona poprzez zastosowanie wzoru pierwiastkowego podanego w stosownej części procedury (zob. pkt 5.3), a minimalna wielkość próbki zbiorczej zostanie proporcjonalnie zwiększona. Powyższe nie stoi na przeszkodzie podzieleniu dużej partii na mniejsze podpartie i pobraniu próbek z każdej podpartii zgodnie z procedurą opisaną w pkt 5.1 i 5.2.

— Wielkość kontrolowanej części musi umożliwiać pobranie próbek każdej części składowej.

— W odniesieniu do bardzo dużych partii lub podpartii (> 500 ton) oraz partii transportowanych lub przechowywanych w sposób uniemożliwiający pobranie próbek zgodnie z procedurą przewidzianą w pkt 5.1 i 5.2 niniejszego rozdziału, stosuje się procedurę pobierania próbek przewidzianą w pkt 5.3.

— Jeżeli podmiot działający na rynku pasz jest prawnie zobowiązany do spełnienia wymogów niniejszego rozporządzenia w ramach obowiązkowego systemu monitorowania, może on odejść od spełnienia wymogów ilościowych przewidzianych w niniejszym rozdziale w celu uwzględnienia charakterystyki operacyjnej pod warunkiem wykazania, w sposób wymagany przez właściwy organ, równoważności procedury pobierania próbek w odniesieniu do reprezentatywności oraz po zatwierdzeniu przez właściwy organ.

— W wyjątkowych przypadkach, jeżeli spełnienie wymogów ilościowych metody pobierania próbek nie jest możliwe ze względu na wystąpienie nieakceptowalnego komercyjnego uszkodzenia partii (ze względu na formy opakowań, środki transportu, sposób przechowywania itp.), możliwe jest zastosowanie alternatywnej metody pobierania próbek, pod warunkiem że jest ona możliwie jak najbardziej reprezentatywna, w pełni opisana i udokumentowana.

5.1. Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy

5.1.1. Pasze stałe luzem







Rozmiar kontrolowanej części Minimalna liczba próbek pierwotnych ≤ 2,5 tony 7 > 2,5 tony √ dwudziestokrotność liczby ton stanowiących wagę kontrolowanej części (*1), do 40 próbek pierwotnych ( *1 ) Jeżeli uzyskana liczba jest ułamkiem, należy ją zaokrąglić w górę do najbliższej liczby całkowitej.

5.1.2. Pasze płynne luzem







Rozmiar kontrolowanej części Minimalna liczba próbek pierwotnych ≤ 2,5 tony lub ≤ 2 500 litrów 4 (*1) > 2,5 tony lub > 2 500 litrów 7 (*1) ( *1 ) Jeżeli nie jest możliwe uzyskanie homogenicznej cieczy, należy zwiększyć liczbę próbek pierwotnych.

5.1.3. Pasze opakowane

Pasze (stałe i płynne) mogą być pakowane w torby, worki, puszki, beczki itd., określone w tabeli jako „jednostki”. Duże jednostki (≥ 500 kg lub litrów) muszą być kontrolowane zgodnie z przepisami dotyczącymi paszy luzem (zob. pkt 5.1.1 i 5.1.2).







Rozmiar kontrolowanej części Minimalna liczba jednostek, z których należy pobrać (co najmniej) jedną próbkę pierwotną (*1) 1–20 jednostek 1 jednostka (*2) 21–150 jednostek 3 jednostki (*2) 151–400 jednostek 5 jednostek (*2) > 400 jednostek ¼ √ liczby jednostek stanowiących kontrolowaną część (*3), do 40 jednostek ( *1 ) W przypadku gdy otwarcie jednostki może wpłynąć na analizę (np. łatwo psujące się mokre pasze), próbką pierwotną jest nieotwarta jednostka. ( *2 ) W przypadku jednostek, których zawartość nie przekracza 1 kg lub 1 litra, próbką pierwotną jest zawartość jednej oryginalnej jednostki. ( *3 ) Jeżeli uzyskana liczba jest ułamkiem, należy ją zaokrąglić w górę do najbliższej liczby całkowitej.

5.1.4. Bloki paszy i lizawki mineralne

Kontroli należy poddać co najmniej jeden blok lub jedną lizawkę na kontrolowaną część 25 jednostek, maksymalnie do czterech bloków lub lizawek.

W przypadku bloków lub lizawek ważących maksymalnie 1 kg próbką pierwotną jest zawartość jednego bloku lub jednej lizawki.

5.1.5. Pasze objętościowe i włókniste







Rozmiar kontrolowanej części Minimalna liczba próbek pierwotnych (*1) ≤ 5 ton 5 > 5 ton √ pięciokrotność liczby ton stanowiących wagę kontrolowanej części (*2), do 40 próbek pierwotnych ( *1 ) Uznaje się, że w niektórych sytuacjach (np. kiszonki) nie jest możliwe pobranie wymaganej liczby próbek pierwotnych bez nieakceptowalnego uszkodzenia partii. W takich przypadkach można zastosować alternatywną metodę pobierania próbek, zaś przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia opracowane zostaną wytyczne dla pobierania próbek w odniesieniu do takich partii. ( *2 ) Jeżeli uzyskana liczba jest ułamkiem, należy ją zaokrąglić w górę do najbliższej liczby całkowitej.

5.2. Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w odniesieniu do kontroli składników lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy

Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych należy stosować w następujących przypadkach:

— kontrola aflatoksyn, sporyszu żyta, pozostałych mikotoksyn i szkodliwych zanieczyszczeń botanicznych w materiałach paszowych,

— kontrola zanieczyszczenia krzyżowego przez składnik, w tym materiał modyfikowany genetycznie, lub substancję, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w paszy.

Jeżeli organ kontrolny podejrzewa, że niejednolite rozmieszczenie ma miejsce również w przypadku zanieczyszczenia krzyżowego przez składnik lub substancję w mieszankach paszowych, można zastosować wymogi ilościowe określone w tabeli poniżej.







Rozmiar kontrolowanej części Minimalna liczba próbek pierwotnych < 80 ton Zob. wymogi ilościowe w pkt 5.1. Liczbę próbek pierwotnych, które należy pobrać, mnoży się przez 2,5. ≥ 80 ton 100

5.3. Wymogi ilościowe dotyczące próbek pierwotnych w przypadku bardzo dużych partii

W przypadku dużych kontrolowanych części (> 500 ton) liczba próbek pierwotnych, które należy pobrać, wynosi 40 próbek pierwotnych + √ ton w odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy lub 100 próbek pierwotnych + √ ton w odniesieniu do kontroli składników lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w materiałach paszowych.

6. WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE PRÓBKI ZBIORCZEJ







Wymagana jest jedna próbka zbiorcza na kontrolowaną część. Rodzaj paszy Minimalna wielkość próbki zbiorczej (*1) (*2) 6.1. Pasze luzem 4 kg 6.2. Pasze pakowane 4 kg (*3) 6.3. Pasze płynne lub półpłynne 4 litry 6.4. Bloki paszy lub lizawki mineralne: 6.4.1. o wadze większej niż 1 kg 4 kg 6.4.2. o wadze nie większej niż 1 kg waga czterech oryginalnych bloków lub lizawek 6.5. Pasze objętościowe i włókniste 4 kg (*4) ( *1 ) Jeżeli kontrolowana jest pasza o wysokiej wartości, może zostać pobrana mniejsza próbka zbiorcza, pod warunkiem że zostanie to opisane i udokumentowane w sprawozdaniu z pobierania próbek. ( *2 ) Zgodnie z przepisami rozporządzenia Komisji (UE) nr 619/2011 z dnia 24 czerwca 2011 r. ustanawiającego metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli paszy pod kątem występowania materiału genetycznie zmodyfikowanego, dla którego procedura wydawania zezwolenia jest w toku lub dla którego zezwolenie wygasło (Dz.U. L 166 z 25.6.2011, s. 9), próbka zbiorcza do kontroli występowania materiału genetycznie zmodyfikowanego musi zawierać co najmniej 35 000 nasion/ziaren. Oznacza to, że w przypadku kukurydzy wielkość próbki zbiorczej musi wynosić co najmniej 10,5 kg, zaś soi – 7 kg. W przypadku innych nasion i ziaren, takich jak jęczmień, proso, owies, ryż, żyto, pszenica i rzepak, wielkość próbki zbiorczej wynosząca 4 kg odpowiada ponad 35 000 nasion. ( *3 ) W przypadku paszy opakowanej, w zależności od rozmiaru indywidualnych jednostek, może nie być możliwe uzyskanie 4 kg próbki zbiorczej. ( *4 ) W przypadku pasz objętościowych i włóknistych o niskim ciężarze właściwym (np. siano, słoma) próbka zbiorcza powinna mieć wielkość co najmniej 1 kg.

7. WYMOGI ILOŚCIOWE DOTYCZĄCE PRÓBEK KOŃCOWYCH

Próbki końcowe

Wymagana jest analiza co najmniej jednej próbki końcowej. Ilość próbki końcowej potrzebnej do analizy jest nie mniejsza niż:







Pasze stałe 500 g (*1) (*2) (*3) Pasze płynne lub półpłynne 500 ml (*1) ( *1 ) Zgodnie z przepisami rozporządzenia Komisji (UE) nr 619/2011 próbka końcowa do celów kontroli pod kątem występowania materiału genetycznie zmodyfikowanego musi zawierać co najmniej 10 000 nasion/ziaren. Oznacza to, że w przypadku kukurydzy wielkość próbki końcowej musi wynosić co najmniej 3 000 g, zaś soi – 2 000 g. W przypadku innych nasion i ziaren, takich jak jęczmień, proso, owies, ryż, żyto, pszenica i rzepak, wielkość próbki końcowej wynosząca 500 g odpowiada ponad 10 000 nasion. ( *2 ) Jeżeli próbka zbiorcza jest znacznie mniejsza niż 4 kg lub litry (zob. przypisy do pkt 6), może zostać pobrana mniejsza próbka końcowa, pod warunkiem że zostanie to opisane i udokumentowane w sprawozdaniu z pobierania próbek. ( *3 ) W przypadku pobierania próbek nasion roślin strączkowych, ziaren zbóż i orzechów z drzew orzechowych w celu oznaczania pozostałości pestycydów, minimalna wielkość próbki końcowej wynosi 1 kg zgodnie z przepisami dyrektywy Komisji 2002/63/WE (Dz.U. L 187 z 16.7.2002, s. 30).

8. METODA POBIERANIA PRÓBEK W PRZYPADKU BARDZO DUŻYCH PARTII LUB PARTII PRZECHOWYWANYCH LUB TRANSPORTOWANYCH W SPOSÓB POWODUJĄCY, ŻE POBIERANIE PRÓBEK Z CAŁEJ PARTII NIE JEST MOŻLIWE

8.1. Zasady ogólne

Jeżeli sposób transportu lub przechowywania partii nie zezwala na pobieranie próbek pierwotnych z całej partii, próbki powinny w miarę możliwości być pobierane z partii w ruchu.

W przypadku dużych magazynów przeznaczonych do przechowywania paszy podmioty należy zachęcać do instalowania w nich sprzętu umożliwiającego (automatyczne) pobieranie próbek z całej przechowywanej partii.

W przypadku stosowania procedury pobierania próbek przewidzianej w niniejszym rozdziale 8 podmiot działający na rynku pasz lub jego przedstawiciel jest informowany o procedurze pobierania próbek. Jeżeli procedura ta zostanie zakwestionowana przez podmiot działający na rynku pasz lub jego przedstawiciela, umożliwiają oni właściwemu organowi pobieranie próbek w całej partii na koszt podmiotu lub jego przedstawiciela.

8.2. Duże partie transportowane statkiem

8.2.1. Dynamiczne pobieranie próbek z dużych partii transportowanych statkiem

Próbki z dużych partiach na statkach powinny być w miarę możliwości pobierane, gdy produkt jest w ruchu (dynamiczne pobieranie próbek).

Próbki pobiera się w podziale na ładownie (jednostkę, którą można fizycznie rozdzielić). Ładownie są jednak opróżniane częściowo jedna po drugiej, więc początkowy podział fizyczny nie występuje po przetransportowaniu do miejsca przechowywania. Próbki można zatem pobierać w ramach początkowego podziału fizycznego lub w ramach podziału po transporcie do miejsca przechowywania.

Rozładunek statku może trwać kilka dni. Próbki należy zazwyczaj pobierać w regularnych odstępach czasu podczas całego rozładunku. Jednakże nie zawsze jest możliwe lub stosowne, aby urzędowy inspektor był obecny przy pobieraniu próbek podczas całego rozładunku. Dlatego zezwala się na pobieranie próbek (kontrolowanej) części partii. Liczbę próbek pierwotnych ustala się przy uwzględnieniu rozmiaru kontrolowanej części.

W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

Nawet jeżeli oficjalna próbka jest pobierana automatycznie, obecność inspektora jest wymagana. Jednakże jeżeli próbki pobierane są automatycznie przy wcześniejszym ustawieniu parametrów, których nie można zmienić w procesie pobierania próbek, zaś próbki pierwotne zbierane są do zapieczętowanego pojemnika, uniemożliwiając ewentualne oszustwa, wówczas obecność inspektora jest wymagana tylko na początku pobierania próbek, przy każdej zmianie pojemnika i pod koniec pobierania próbek.

8.2.2. Statyczne pobieranie próbek z partii transportowanych statkiem

Jeżeli pobieranie próbek odbywa się w sposób statyczny, należy zastosować procedurę przewidzianą dla miejsc przechowywania (silosów) dostępnych od góry (zob. pkt 8.4.1).

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii/ładowni (od góry). Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.3. Pobieranie próbek z dużych partii przechowywanych w magazynach

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii. Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.4. Pobieranie próbek z miejsc przechowywania (silosów)

8.4.1. Pobieranie próbek z silosów (łatwo) dostępnych od góry

Próbki muszą być pobierane z dostępnej części partii. Liczbę próbek pierwotnych określa się poprzez uwzględnienie rozmiaru kontrolowanej części. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.4.2. Pobieranie próbek z silosów niedostępnych od góry (silosów zamkniętych)

8.4.2.1. Silosy niedostępne od góry (zamknięte) o rozmiarze > 100 ton

Pasze przechowywane w takich silosach nie mogą być kontrolowane w sposób statyczny. Jeżeli muszą być pobrane próbki z paszy przechowywanej w silosie i nie ma możliwości jej przeniesienia, należy uzgodnić z podmiotem, że poinformuje on inspektora o rozładunku silosu w celu umożliwienia pobrania próbek paszy w ruchu.

8.4.2.2. Silosy niedostępne od góry (zamknięte) o rozmiarze < 100 ton

Procedura pobierania próbek polega na umieszczeniu 50–100 kg w pojemniku i pobraniu z niego próbek. Wielkość próbki zbiorczej odpowiada wielkości całej partii, a liczba próbek pierwotnych odpowiada ilości pobranej z silosu do pojemnika w celu pobrania próbek. W przypadku pobierania próbek części partii paszy tej samej klasy lub o takim samym opisie, jeżeli część ta zostaje uznana za niespełniającą wymogów UE, uznaje się, że cała pasza należąca do tej partii nie spełnia tych wymogów, chyba że z przeprowadzonej szczegółowej oceny wynika, że nie ma dowodów wykazujących, że pozostała część partii nie spełnia wymogów UE.

8.5. Pobieranie próbek z paszy luzem w dużych zamkniętych pojemnikach

Próbki z takich partii mogą być pobrane jedynie po rozładunku. W niektórych przypadkach nie jest możliwy rozładunek w miejscu przywozu lub kontroli, w związku z czym próbki powinny zostać pobrane w momencie rozładunku takich pojemników.

9. INSTRUKCJE POBIERANIA, PRZYGOTOWANIA I PAKOWANIA PRÓBEK

9.1. Uwagi ogólne

Próbki należy pobierać i przygotowywać bez zbędnej zwłoki, przy zachowaniu środków ostrożności gwarantujących, że produkt nie ulegnie zmianie lub zanieczyszczeniu. Stosowany sprzęt, a także powierzchnie i pojemniki przeznaczone na próbki muszą być czyste i suche.

9.2. Próbki pierwotne

Próbki pierwotne należy pobrać losowo z całej partii przy zachowaniu w przybliżeniu jednakowej ich wielkości.

Rozmiar próbki pierwotnej wynosi co najmniej 100 g lub 25 g w przypadku pasz objętościowych i włóknistych o niskim ciężarze właściwym.

Jeżeli, zgodnie z procedurą pobierania próbek ustanowioną w pkt 8, pobranych ma zostać mniej niż 40 próbek pierwotnych, rozmiar próbek pierwotnych ustala się na podstawie wymaganej wielkości próbki zbiorczej, jaką należy osiągnąć (zob. pkt 6).

W przypadku pobierania próbek z małych partii opakowanej paszy, jeżeli zgodnie z wymogami ilościowymi pobrana ma zostać ograniczona liczba próbek pierwotnych, próbką pierwotną jest zawartość jednej oryginalnej jednostki, nieprzekraczająca 1 kg lub litra.

W przypadku pobierania próbek paszy opakowanej, składającej się z małych jednostek (np. < 250 g), rozmiar próbki pierwotnej zależy od rozmiaru jednostki.

9.2.1. Pasze luzem

W stosownych przypadkach próbki mogą być pobierane, gdy kontrolowana partia paszy jest w ruchu (załadunek lub wyładunek).

9.2.2. Pasze opakowane

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, część zawartości każdej jednostki należy usunąć przy użyciu próbnika lub szufli. W miarę potrzeby próbki należy pobierać po opróżnieniu każdej jednostki oddzielnie.

9.2.3. Homogeniczne lub nadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, należy w razie potrzeby zhomogenizować zawartość i pobrać próbkę z każdej jednostki.

Próbki pierwotne mogą być pobierane w trakcie opróżniania zawartości pojemnika.

9.2.4. Nienadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne

Po wybraniu wymaganej liczby jednostek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, należy pobrać próbki z różnych poziomów.

Próbki mogą być także pobierane w trakcie opróżniania pojemników, przy czym pierwszą frakcję należy odrzucić.

W każdym przypadku całkowita pobrana objętość nie może być mniejsza niż 10 litrów.

9.2.5. Bloki paszy i lizawki mineralne

Po wybraniu wymaganej liczby bloków i lizawek w celu pobrania próbek zgodnie z rozdziałem 5, należy pobrać część każdego bloku lub lizawki. Jeżeli podejrzewa się, że blok lub lizawka nie są homogeniczne, jako próbkę można pobrać cały blok lub lizawkę.

W przypadku bloków lub lizawek ważących maksymalnie 1 kg próbką pierwotną jest zawartość jednego bloku lub jednej lizawki.

9.3. Przygotowanie próbek zbiorczych

Próbki pierwotne miesza się w jedną próbkę zbiorczą.

9.4. Przygotowanie próbek końcowych

Materiał zawarty w próbce zbiorczej należy dokładnie wymieszać ( 4 ).

— Każdą próbkę należy umieścić w odpowiednim pojemniku. Należy podjąć wszelkie środki ostrożności, aby zapobiec zmianie składu próbki, zanieczyszczeniu lub sfałszowaniu, które mogą nastąpić w czasie transportu lub przechowywania.

— W przypadku kontroli składników lub substancji jednolicie rozmieszczonych w paszy próbka zbiorcza może zostać w sposób reprezentatywny zredukowana do co najmniej 2,0 kg lub 2,0 litrów (próbka zredukowana) ( 5 ), w miarę możliwości przy użyciu rozdzielacza mechanicznego lub automatycznego. W przypadku pobierania próbek nasion roślin strączkowych, ziaren zbóż i orzechów z drzew orzechowych w celu oznaczania pozostałości pestycydów minimalna wielkość próbki zredukowanej wynosi 3 kg. Jeżeli charakter paszy nie zezwala na zastosowanie rozdzielacza lub rozdzielacz nie jest dostępny, próbka może zostać zredukowana metodą ćwiartowania. Z próbek zredukowanych należy przygotować próbki końcowe (do celów kontroli, obrony i odniesienia) w przybliżeniu tej samej wielkości i dostosowane do ilościowych wymagań określonych w rozdziale 7. W przypadku kontroli składników, w tym materiału zmodyfikowanego genetycznie, lub substancji, które mogą nie być jednolicie rozmieszczone w materiałach paszowych, próbka zbiorcza musi zostać: — całkowicie zhomogenizowana i następnie podzielona na próbki końcowe, lub — zredukowana do co najmniej 2 kg lub 2 litrów ( 6 ) przy użyciu rozdzielacza mechanicznego lub automatycznego. Jedynie w przypadku gdy charakter paszy nie zezwala na zastosowanie rozdzielacza, próbka może zostać zredukowana metodą ćwiartowania. Do celów kontroli pod kątem występowania materiału genetycznie zmodyfikowanego zgodnie z rozporządzeniem (UE) nr 619/2011 próbka zredukowana musi zawierać co najmniej 35 000 nasion/ziaren, tak aby umożliwić uzyskanie próbek końcowych do celów kontroli przestrzegania przepisów, obrony i odniesienia zawierających co najmniej 10 000 nasion/ziaren (zob. przypis (**) w rozdziale 6 i przypis (*) w rozdziale 7).

9.5. Opakowanie próbek

Pojemniki lub opakowania są zapieczętowane i opatrzone etykietą w sposób uniemożliwiający otwarcie bez zniszczenia pieczęci. Całość etykiety musi być opieczętowana.

9.6. Wysyłka próbek do laboratorium

Próbkę wysyła się bezzwłocznie do wyznaczonego laboratorium analitycznego wraz z informacjami niezbędnymi dla analityka.

10. PROTOKÓŁ POBIERANIA PRÓBEK

Po każdym pobraniu próbek należy sporządzić protokół umożliwiający jednoznaczną identyfikację każdej kontrolowanej części i jej wielkości.

W protokole należy zapisać wszelkie przypadki odejścia od procedury pobierania próbek przewidzianej w niniejszym rozporządzeniu.

Oprócz udostępnienia protokołu urzędowemu laboratorium kontrolnemu zostaje on również udostępniony podmiotowi działającemu na rynku pasz i/lub laboratorium wyznaczonemu przez ten podmiot.









ZAŁĄCZNIK II

PRZEPISY OGÓLNE DOTYCZĄCE METODYKI ANALIZY PASZ

A. PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO ANALIZY

1. Cel

Poniżej opisane procedury dotyczą przygotowania do badań próbek przesyłanych do laboratoriów kontrolnych po pobraniu zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I.

Próbki te muszą być przygotowane w taki sposób, aby odważone ilości, jak przewidziano w metodyce analizy, były homogeniczne i reprezentatywne w odniesieniu do próbek końcowych.

2. Niezbędne środki ostrożności

Wybór procedury przy przygotowaniu próbek zależy od stosowanych metod analizy oraz składników lub substancji, które mają zostać poddane kontroli. Z tego względu bardzo ważne jest upewnienie się, czy wybrana procedura przygotowania próbki jest właściwa w odniesieniu do stosowanej metody analizy oraz składników lub substancji, które mają zostać poddane kontroli.

Wszystkie konieczne czynności należy wykonywać w taki sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zmianie składu próbki do badań.

Rozdrabnianie, mieszanie i przesiewanie należy wykonywać bezzwłocznie, przy ograniczonym dostępie powietrza i światła do próbki. Nie należy stosować młynków i rozdrabniaczy, które podczas pracy powodują znaczące nagrzewanie próbki do badań.

W przypadku pasz szczególnie wrażliwych na ciepło zaleca się ręczne rozdrabnianie. Ponadto zastosowany sprzęt nie może stanowić źródła zanieczyszczenia.

Jeżeli przygotowanie próbki do badań nie może być przeprowadzone bez znacznych zmian poziomu wilgotności próbki, poziom jej wilgotności oznacza się przed przygotowaniem i po przygotowaniu próbki do badań zgodnie z metodą, o której mowa w załączniku III część A.

3. Procedura

3.1. Procedura ogólna

Podwielokrotność do badań pobiera się z próbki końcowej. Stożkowanie i dzielenie na ćwiartki nie są zalecane, ponieważ może to skutkować podwielokrotnościami do badań o dużym błędzie podziału.

3.1.1. Pasze, które mogą być zmielone

— Przesianą próbkę końcową zmieszać oraz zgromadzić w odpowiednim czystym, suchym pojemniku, wyposażonym w hermetyczny korek. Zmieszać ponownie w celu zagwarantowania pełnej homogenizacji natychmiast przed odważeniem ilości przeznaczonej do analizy (podwielokrotności do badań).

3.1.2. Pasze, które mogą być zmielone po wysuszeniu

— Jeśli nie ustalono inaczej w metodzie analizy, wysuszyć próbkę końcową w celu obniżenia jej poziomu wilgotności do 8–12 %, zgodnie ze wstępną procedurą suszenia opisaną pkt 4.3 metodyki oznaczania wilgotności, o której mowa w załączniku III część A. Następnie postępować zgodnie z procedurą wskazaną w sekcji 3.1.1.

3.1.3. Pasze płynne lub półpłynne

— Próbkę końcową umieścić w odpowiednim, czystym i suchym pojemniku, wyposażonym w hermetyczny korek. Zmieszać dokładnie w celu zagwarantowania pełnej homogenizacji natychmiast przed odważeniem ilości przeznaczonej do analizy (podwielokrotności do badań).

3.1.4. Inne pasze

— Próbki końcowe, które nie mogą być przygotowane zgodnie z jedną z powyższych procedur, należy przygotować w taki sposób, aby odważone ilości wymagane do analizy (podwielokrotność do badań) były homogeniczne i reprezentatywne dla próbki końcowej.

3.2. Procedura szczególna w przypadku badania metodą inspekcji wzrokowej lub mikroskopowej lub w przypadku gdy cała próbka zbiorcza jest zhomogenizowana

— W przypadku badania metodą inspekcji wzrokowej (bez mikroskopu) do badania stosuje się całą próbkę laboratoryjną.

— W przypadku badania mikroskopem laboratorium może zredukować próbkę zbiorczą lub zredukować próbkę zredukowaną. Próbki końcowe do celów obrony oraz ostatecznego odniesienia pobiera się zgodnie z procedurą równoważną procedurze pobierania próbek w celu kontroli przestrzegania przepisów.

— Jeżeli cała próbka zbiorcza jest zhomogenizowana, próbki końcowe pobiera się ze zhomogenizowanej próbki zbiorczej.

4. Przechowywanie próbek

Próbki należy przechowywać w temperaturze, która nie spowoduje zmiany ich składu. Próbki przeznaczone do badania witamin lub substancji, które są szczególnie wrażliwe na światło, należy przechowywać w warunkach gwarantujących, że światło nie wywrze na nie niekorzystnego wpływu.

B. PRZEPISY DOTYCZĄCE ODCZYNNIKÓW I APARATURY UŻYWANEJ W METODYCE ANALIZY

1. Jeżeli w metodyce analizy nie ustalono inaczej, wszystkie stosowane odczynniki muszą mieć stopień czystości do analizy. W przypadku oznaczania mikroelementów czystość odczynników należy sprawdzić przez wykonanie ślepej próby. Zależnie od uzyskanych wyników może być konieczne dalsze oczyszczanie odczynników.

2. Jeżeli w metodyce analizy nie podano konkretnego rozpuszczalnika lub rozcieńczalnika, w przypadku czynności wymagających przygotowania roztworów, rozcieńczania, spłukiwania lub przemywania należy stosować wodę. Co do zasady należy stosować wodę demineralizowaną lub destylowaną. W szczególnych przypadkach, wymienionych w metodyce analizy, wodę należy oczyścić w specjalny sposób.

3. Ze względu na aparaturę i sprzęt, które zwykle stosuje się w laboratoriach kontrolnych, w metodyce analizy wymienia się tylko tę aparaturę i sprzęt, które wymagają szczególnego zastosowania lub mają specjalny charakter. Wszystkie urządzenia muszą być czyste, zwłaszcza gdy są oznaczane bardzo małe ilości substancji.

C. STOSOWANIE METODYKI ANALIZY I WYRAŻANIE WYNIKÓW

1. Postępowanie ekstrakcyjne

W kilku metodach określono konkretne postępowanie ekstrakcyjne. Z reguły można zastosować inne postępowanie ekstrakcyjne niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie ma równoważną wydajność ekstrakcji w odniesieniu do analizowanej matrycy.

2. Postępowanie oczyszczające

W kilku metodach określono konkretne postępowanie oczyszczające. Z reguły można zastosować inne postępowanie oczyszczające niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie daje równoważne wyniki analityczne w odniesieniu do analizowanej matrycy.

3. Liczba oznaczeń

W przypadku analizy substancji niepożądanych, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia jest znacznie (o > 50 %) niższy niż wartość ustalona w specyfikacji, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest druga analiza (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Do weryfikacji zgodności stosuje się średnią z dwóch oznaczeń przy uwzględnieniu niepewności pomiaru.

W przypadku kontroli deklarowanej zawartości substancji lub składnika, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia potwierdza deklarowaną zawartość, tj. wyniki analizy mieszczą się w dopuszczalnym zakresie zmienności co do deklarowanej zawartości, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W innych przypadkach konieczna jest druga analiza (drugie oznaczenie) w celu wykluczenia możliwości wewnętrznego zanieczyszczenia krzyżowego lub przypadkowego wymieszania się próbek. Do weryfikacji zgodności stosuje się średnią z dwóch oznaczeń przy uwzględnieniu niepewności pomiaru.

W niektórych przypadkach dopuszczalny zakres zmienności określono w prawodawstwie, np. w rozporządzeniu Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 767/2009 z dnia 13 lipca 2009 r. w sprawie wprowadzania na rynek i stosowania pasz, zmieniającym rozporządzenie (WE) nr 1831/2003 Parlamentu Europejskiego i Rady i uchylającym dyrektywę Rady 79/373/EWG, dyrektywę Komisji 80/511/EWG, dyrektywy Rady 82/471/EWG, 83/228/EWG, 93/74/EWG, 93/113/WE i 96/25/WE oraz decyzję Komisji 2004/217/WE ( 7 ).

4. Podawanie zastosowanych metod analizy w sprawozdaniu

W sprawozdaniu z analizy określa się zastosowaną metodykę.

5. Podawanie wyników analizy

Wynik analizy wyraża się w sposób podany w metodyce analizy, zawiera on odpowiednią liczbę cyfr znaczących i, jeżeli to konieczne, musi być korygowany do wilgotności próbki końcowej przed przygotowaniem.

6. Niepewność pomiaru i stopień odzysku w przypadku analizy substancji niepożądanych

W odniesieniu do substancji niepożądanych w rozumieniu dyrektywy 2002/32/WE uznaje się, że produkt przeznaczony na paszę jest niezgodny pod względem ustalonej zawartości maksymalnej, w przypadku gdy wynik analizy dotyczący paszy o zawartości wilgoci wynoszącej 12 % wskazuje na przekroczenie zawartości maksymalnej z uwzględnieniem rozszerzonej niepewności pomiaru i poprawki na stopień odzysku. Badane stężenie po uwzględnieniu poprawki na stopień odzysku i odjęciu rozszerzonej niepewności pomiaru od wyniku stanowi podstawę oceny zgodności. Procedura ta ma zastosowanie jedynie w przypadkach, gdy stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności pomiaru i stopnia odzysku (nie jest to możliwe np. w przypadku analizy mikroskopowej).

Wynik analizy przedstawia się w sposób następujący (o ile stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności pomiaru i stopnia odzysku):

a) jako skorygowany na stopień odzysku, przy czym stopień ten należy wskazać. Korekta na odzysk nie jest konieczna, jeśli stopień odzysku wynosi 90–110 %.

b) jako x +/– U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U rozszerzoną niepewność pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia w wysokości 2, który daje wynik w przedziale ufności ok. 95 %.

Jeżeli wynik analizy jest jednak znacznie (o > 50 %) niższy niż wartość ustalona w specyfikacji oraz pod warunkiem że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości, a analiza wykonywana jest jedynie do celów sprawdzenia zgodności z przepisami prawnymi, wynik analizy można podać bez korekty na odzysk; w takim przypadku można pominąć podawanie stopnia odzysku i niepewności pomiaru.

▼B









ZAŁĄCZNIK III

METODY ANALIZY SKŁADU MATERIAŁÓW I MIESZANEK PASZOWYCH

A. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania wilgotności pasz. Należy zauważyć, że w przypadku pasz zawierających substancje lotne, np. kwasy organiczne, podczas oznaczania wilgotności oznaczana jest również znaczna ilość substancji lotnych.

Metody nie stosuje się do badania produktów mlecznych występujących jako materiały paszowe, związków mineralnych, mieszanin składających się głównie ze związków mineralnych, tłuszczów i olejów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego oraz nasion i owoców roślin oleistych.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w warunkach dostosowanych do właściwości pasz. Obniżenie masy jest określane przez ważenie. Jeżeli pasze stałe zawierają duże ilości wilgotności, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego suszenia.

3. Aparatura i sprzęt

3.1. Rozdrabniacz wykonany z materiałów niepochłaniających wilgotności, łatwy do czyszczenia, pozwalający na szybkie i równomierne rozdrobnienie materiału bez nadmiernego ogrzewania, w sposób ograniczający do minimum kontakt z powietrzem, spełniający wymagania określone w pkt 4.1.1 i pkt 4.1.2 (np. młotek, chłodzony wodą mikrorozdrabniacz, składany stożkowy młynek albo rozdrabniacz wolnoobrotowy lub wyposażony w koło zębate).

3.2. Waga analityczna ważąca z dokładnością do 1 mg.

3.3. Suche naczynka z nierdzewnego metalu lub ze szkła z przykrywkami umożliwiającymi hermetyczne zamknięcie, o powierzchni roboczej umożliwiającej równomierne rozprowadzenie badanej próbki w warstwie 0,3 g/cm2.

3.4. Suszarka elektryczna z termostatem (± 2 oC), dobrze wentylowana i pozwalająca na szybką regulację temperatury ( 8 ).

3.5. Termostatowana suszarka próżniowa zaopatrzona w pompę olejową oraz mechanizm umożliwiający nawiew gorącego suchego powietrza lub wprowadzenie czynnika suszącego (np. tlenku wapnia).

3.6. Eksykator z płytką z grubego perforowanego metalu lub porcelany, zawierający efektywny czynnik suszący.

4. Sposób postępowania

Uwaga : Czynności opisane w tej części należy wykonywać natychmiast po otworzeniu opakowania próbki. Analizę należy wykonać co najmniej w 2 powtórzeniach.

4.1. Przygotowanie

4.1.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.1.2 i pkt 4.1.3

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Jeżeli to konieczne, rozdrobnić lub podzielić w taki sposób, aby zapobiec jakimkolwiek zmianom zawartości wilgotności (zob. pkt 6).

4.1.2. Zboża i kasze

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Rozdrobnić na cząstki, które przechodzą przez oczka sita o średnicy 0,5 mm co najmniej w 50 % i pozostają w ilości nie wyższej niż 10 % na sicie o oczkach o średnicy 1 mm.

4.1.3. Pasze ciekłe lub w postaci pasty, pasze z przewagą olejów lub tłuszczów

Pobrać 25 g próbki, zważyć z dokładnością do 10 mg, dodać odpowiednią ilość bezwodnego piasku odważonego z dokładnością do 10 mg i zmieszać do uzyskania homogennego produktu.

4.2. Suszenie

4.2.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.2.2 i 4.2.3

Zważyć, z dokładnością do 1 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 103 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez cztery godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 103 oC. Nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

Pasze z przeważającym udziałem oleju lub tłuszczu suszyć ponownie w suszarce przez 30 minut w temperaturze 130 oC. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.2.2. Zboża, mąki, kasze i mączki

Zważyć, z dokładnością do 0,5 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g rozdrobnionej próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 130 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez dwie godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 130 oC. Nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg.

4.2.3. Mieszanki paszowe zawierające ponad 4 % sacharozy lub laktozy: materiały paszowe, takie jak chleb świętojański, hydrolizowane produkty zbożowe, słód jęczmienny, susz buraczany, hydrolizaty rybne i cukrowe, mieszanki z ponad 25 % udziałem soli mineralnych zawierających wodę krystalizacyjną.

Zważyć, z dokładnością do 0,5 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki próżniowej (pkt 3.5), podgrzanej do temperatury od 80 do 85 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe.

Podwyższyć ciśnienie do 100 Torr i pozostawić w celu wysuszenia na cztery godziny pod działaniem tego ciśnienia, w strumieniu gorącego, suchego powietrza albo stosując czynnik suszący (ok. 300 g na 20 próbek). W drugim przypadku odłączyć pompę próżniową po uzyskaniu odpowiedniego ciśnienia. Czas suszenia liczyć od chwili, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę od 80 do 85 oC. Ostrożnie zrównać ciśnienie w suszarce z ciśnieniem atmosferycznym. Otworzyć suszarkę, szybko nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30–45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć ponownie w suszarce próżniowej przez 30 minut o temperaturze od 80 do 85 oC i zważyć powtórnie. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności.

4.3. Suszenie wstępne

4.3.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.3.2

Pasze stałe o wysokim poziomie wilgotności, trudne do rozdrabniania, należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób:

Odważyć 50 g, z dokładnością do 10 mg, nierozdrobnionej próbki (pasze sprasowane lub zbrylone można w razie potrzeby wstępnie rozdzielić) do odpowiedniego naczynia (np. płytka aluminiowa o wymiarach 20 cm × 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce o temperaturze od 60 do 70 oC, aż poziom wilgotności obniży się do 8–12 %. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić bez przykrycia do schłodzenia w laboratorium przez godzinę i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując w sposób określony w pkt 4.1.1, i suszyć w sposób określony w pkt 4.2.1 lub 4.2.3, w zależności od rodzaju paszy.

4.3.2. Zboża

Ziarno zbóż o wilgotności wyższej niż 17 % należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób:

Odważyć, z dokładnością do 10 mg, 50 g nierozdrobnionego ziarna do odpowiedniego naczynia (np. płytka aluminiowa o wymiarach 20 × 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce od 5 do 7 minut w temperaturze 130 oC. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić bez przykrycia do schłodzenia w laboratorium przez dwie godziny i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując w sposób określony w pkt 4.1.2, i suszyć w sposób określony w pkt 4.2.2.

5. Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następujących wzorów:

5.1. Suszenie bez wstępnego podsuszania

gdzie:

m = początkowa masa w g badanej próbki

m0 = masa w g badanej próbki po wysuszeniu

5.2. Suszenie z podsuszaniem

gdzie:

m = początkowa masa w g badanej próbki

m1 = masa w g badanej próbki po wstępnym podsuszaniu

m2 = masa w g badanej próbki po rozdrobnieniu

m0 = masa w g badanej próbki po wysuszeniu

5.3. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,2 % bezwzględnej wartości wilgotności.

6. Objaśnienia

Jeżeli rozdrabnianie próbki jest konieczne i wpływa na poziom wilgotności w produkcie, wyniki analizy składników paszowych należy skorygować o poziom wilgotności w początkowym stanie próbki.

B. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI OLEJÓW I TŁUSZCZÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO I ROŚLINNEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wody i substancji lotnych w tłuszczach i olejach pochodzenia zwierzęcego oraz roślinnego.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest suszona w temperaturze 103 oC do uzyskania stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami musi być równy lub mniejszy niż 1 mg). Ubytek masy jest określany metodą wagową.

3. Aparatura i sprzęt

3.1. Naczynie z płaskim dnem wykonane z materiału nierdzewnego, o średnicy od 8 do 9 cm i wysokości około 3 cm.

3.2. Termometr rtęciowy ze wzmocnionym zbiornikiem i ekspansyjną rurką w górnym końcu, z podziałką od 80 do co najmniej 110 oC i o długości około 10 cm.

3.3. Łaźnia piaskowa lub elektryczna płyta grzewcza.

3.4. Eksykator zawierający efektywny środek suszący.

3.5. Waga analityczna.

4. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 20 g homogennej próbki do suchego, zważonego naczynia (3.1), zawierającego termometr (3.2). Ogrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzewczej (3.3) ciągle mieszając termometrem, tak aby uzyskać wzrost temperatury do 90 oC w czasie około 7 minut.

Zmniejszyć ogrzewanie, obserwując częstotliwość odrywania się pęcherzyków powietrza od dna naczynia. Temperatura nie może przekroczyć 105 oC. Kontynuować mieszanie, pocierając dno naczynia do czasu, aż przestaną się tworzyć pęcherzyki.

W celu całkowitego odparowania wilgotności, ogrzewać próbkę kilka razy do temperatury 103 oC ± 2 oC, schładzając do 93 oC pomiędzy kolejnymi ogrzewaniami. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej w eksykatorze (3.4) i zważyć. Powtarzać ogrzewanie, dopóki ubytek masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie większy niż 2 mg.

Uwaga : Wzrost masy próbki po powtórnym ogrzewaniu wskazuje na utlenienie się tłuszczu. W takim przypadku do obliczenia wyniku wziąć ostatnią masę próbki, przed wzrostem jej masy.

5. Obliczanie wyników

Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m = masa w g badanej próbki

m1 = masa w g naczynia z zawartością przed ogrzewaniem

m2 = masa w g naczynia z zawartością po ogrzewaniu

Wyniki oznaczania niższe niż 0,05 % należy zapisać, używając określenia „niższe niż 0,05 %”.

Powtarzalność

Różnica wilgotności pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,05 % wartości bezwzględnej.

C. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA SUROWEGO

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości białka surowego w paszach na podstawie zawartości azotu oznaczonego metodą Kjeldahla.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest mineralizowana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Kwaśny roztwór jest alkalizowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu. Amoniak destyluje się i zbiera w znanej ilości roztworu kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany mianowanym roztworem wodorotlenku sodu.

Ewentualnie uwolniony amoniak jest destylowany do nadmiaru roztworu kwasu borowego, a następnie miareczkowany roztworem kwasu chlorowodorowego lub siarkowego.

3. Odczynniki i roztwory

3.1. Siarczan potasu.

3.2. Katalizator: tlenek miedzi(II) CuO lub siarczan miedzi(II) CuSO4 5H2O pentahydrat.

3.3. Granulowany cynk.

3.4. Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Kwas siarkowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Kwas siarkowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Kwas siarkowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Czerwień metylowa, wskaźnik: rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu, σ = 95–96 % (v/v).

3.9. Wodorotlenek sodu (może być techniczny), roztwór o stężeniu β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Wodorotlenek sodu, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Wodorotlenek sodu, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Granulowany pumeks, przemyty kwasem chlorowodorowym i wyprażony.

3.13. Acetanilid (temperatura topnienia = 114 oC, zawartość N = 10,36 %).

3.14. Sacharoza, niezawierająca azotu.

3.15. Kwas borowy (H3BO3).

3.16. Roztwór czerwieni metylowej, wskaźnik: rozpuścić 100 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu lub metanolu.

3.17. Roztwór zieleni bromokrezolowej: rozpuścić 100 mg zieleni bromokrezolowej w 100 ml etanolu lub metanolu.

3.18. Roztwór kwasu borowego (od 10 g/l do 40 g/l, w zależności od stosowanej aparatury i sprzętu)

Przy stosowaniu kolorymetrycznego punktu końcowego do roztworów kwasu borowego należy dodać wskaźniki czerwieni metylowej i zieleni bromokrezolowej. Jeżeli przygotowuje się 1 l roztworu kwasu borowego, przed dostosowaniem objętości należy dodać 7 ml roztworu czerwieni metylowej (3.16) i 10 ml roztworu zieleni bromokrezolowej (3.17).

Odczyn pH roztworu kwasu borowego może różnić się między seriami w zależności od użytej wody. Często do uzyskania pozytywnej próby ślepej konieczne jest dostosowanie pH przy pomocy małej objętości zasady.

Uwaga : Dodanie ok. 3–4 ml NaOH (3.11) do 1 l kwasu borowego o stężeniu 10 g/l zwykle zapewnia dobre dostosowanie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej oraz chronić przed światłem i źródłami oparów amoniaku.

3.19 Kwas chlorowodorowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(HCl) = 0,10 mol/l.

Uwaga : Można zastosować inne stężenia roztworów objętościowych (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 i 3.19), jeżeli zostanie to uwzględnione w obliczeniach. Stężenie należy podawać zawsze z dokładnością do czterech miejsc po przecinku.

4. Aparatura i sprzęt

Aparatura i sprzęt odpowiedni do przeprowadzenia mineralizacji, destylacji i miareczkowania według metody Kjeldahla.

5. Sposób postępowania

5.1. Mineralizacja

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1g próbki i przenieść do kolby aparatu do mineralizacji. Dodać 15 g siarczanu potasu (3.1), odpowiednią ilość katalizatora (3.2) (od 0,3 do 0,4 g tlenku miedzi(II) lub od 0,9 do 1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi(II)), 25 ml kwasu siarkowego (3.4) oraz, w razie potrzeby, kilka granulek pumeksu (3.12) i zamieszać.

Początkowo ogrzewać kolbę ostrożnie, w razie konieczności mieszając od czasu do czasu, aż do zwęglenia substancji i zaniku piany; następnie zwiększyć intensywność ogrzewania aż do trwałego wrzenia roztworu. Ogrzewanie jest właściwe, jeżeli wrzący kwas kondensuje się na ściankach kolby. Zapobiegać przegrzewaniu się ścianek i przylepianiu do nich organicznych cząstek.

Od chwili gdy roztwór stanie się klarowny i przyjmie jasnozieloną barwę, kontynuować ogrzewanie przez dwie godziny, a następnie pozostawić do schłodzenia.

5.2. Destylacja

Ostrożnie dodać do kolby ilość wody wystarczającą do całkowitego rozpuszczenia siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie w razie potrzeby dodać kilka granulek cynku (3.3). Postępować zgodnie z pkt 5.2.1 lub 5.2.2.

5.2.1. Destylacja do kwasu siarkowego

Umieścić w odbieralniku aparatu destylacyjnego odmierzone 25 ml kwasu siarkowego (3.5 lub 3.7), zależnie od przewidywanej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (3.8).

Podłączyć kolbę mineralizacyjną do chłodnicy aparatu destylacyjnego i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w kolbie odbieralnika na głębokość co najmniej 1 cm (zob. objaśnienia pkt 8.3). Powoli wlać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.9) do kolby mineralizacyjnej, nie dopuszczając do strat amoniaku (zob. objaśnienia pkt 8.1). Ogrzewać kolbę aż do całkowitego oddestylowania amoniaku.

5.2.2. Destylacja do kwasu borowego

Jeżeli miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie wykonywane jest ręcznie, zastosowanie ma poniższe postępowanie. Jeżeli aparat destylacyjny jest w pełni zautomatyzowany i obejmuje miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie, należy stosować się do instrukcji producenta aparatu.

Umieścić kolbę odbieralnika zawierającą od 25 do 30 ml roztworu kwasu borowego (3.18) pod ujściem chłodnicy w taki sposób, aby rurka doprowadzająca znajdowała się pod powierzchnią nadmiaru roztworu kwasu borowego. Ustawić aparat destylacyjny, aby podał 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.9). Obsługiwać aparat destylacyjny zgodnie z instrukcjami producenta i oddestylować amoniak uwolniony w wyniku dodania roztworu wodorotlenku sodu. Zebrać destylat w roztworze kwasu borowego. Ilość destylatu (czas destylacji z parą wodną) zależy od zawartości azotu w próbce. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta.

Uwaga : W przypadku półautomatycznego aparatu destylacyjnego dodawanie nadmiaru wodorotlenku sodu i destylacja z parą wodną przeprowadzane są automatycznie.

5.3. Miareczkowanie

Postępować zgodnie z pkt 5.3.1 lub 5.3.2.

5.3.1. Kwas siarkowy

Miareczkować nadmiar kwasu siarkowego w kolbie odbieralnika roztworem wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11), w zależności od stężenia zastosowanego kwasu siarkowego, do uzyskania punktu końcowego.

5.3.2. Kwas borowy

Miareczkować zawartość kolby odbieralnika mianowanym roztworem objętościowym kwasu chlorowodorowego (3.19) lub kwasu siarkowego (3.6) przy pomocy biurety i odczytać ilość zużytego titrantu.

Przy stosowaniu kolorymetrycznego punktu końcowego punkt końcowy osiąga się w momencie pojawienia się pierwszego śladu różowego zabarwienia cieczy. Określić odczyt biurety z dokładnością do 0,05 ml. W wizualizacji punktu końcowego pomocna jest podświetlana płyta mieszadła magnetycznego lub detektor fotometryczny.

Można to przeprowadzić automatycznie za pomocą parowego aparatu destylacyjnego z funkcją automatycznego miareczkowania.

Przy obsłudze konkretnego aparatu destylacyjnego lub aparatu do miareczkowania stosować się do instrukcji producenta.

Uwaga : Jeżeli stosowany jest system automatycznego miareczkowania, rozpoczyna się ono bezpośrednio po destylacji i stosowany jest 1 % roztwór kwasu borowego (3.18). Jeżeli stosowany jest w pełni automatyczny aparat destylacyjny, automatyczne miareczkowanie amoniaku można przeprowadzić również z wykryciem punktu końcowego przy pomocy potencjometrycznego systemu pH. W tym przypadku stosowany jest automatyczny aparat do miareczkowania z pehametrem. Pehametr musi być odpowiednio skalibrowany w zakresie od pH 4 do pH 7 za pomocą zwykłych laboratoryjnych metod kalibracji pH. Punkt końcowy pH w miareczkowaniu osiąga się przy wartości pH równej 4,6 , co stanowi najwyższy punkt krzywej miareczkowania (punkt przegięcia).

5.4. Ślepa próba

W celu potwierdzenia, że zastosowane odczynniki nie zawierają azotu, przeprowadzić ślepą próbę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (3.14) zamiast próbki.

6. Obliczanie wyników

Obliczenia wykonywane są zgodnie z pkt 6.1 lub 6.2.

6.1. Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.1

Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

V0 = objętość w ml NaOH (3.10 lub 3.11) zużytego do ślepej próby

V1 = objętość w ml NaOH (3.10 lub 3.11) zużytego do miareczkowania próbki

c = stężenie w mol/l wodorotlenku sodu (3.10 lub 3.11)

m = masa w g próbki

6.2 Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.2

6.2.1. Miareczkowanie kwasem chlorowodorowym

Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m = masa naważki w g

c = stężenie w mol/l mianowanego roztworu objętościowego kwasu chlorowodorowego (3.19)

V0 = objętość w ml kwasu chlorowodorowego użytego do próby ślepej

V1 = objętość w ml kwasu chlorowodorowego użytego do naważki

6.2.2. Miareczkowanie kwasem siarkowym

Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru:

gdzie:

m = masa naważki w g

c = stężenie w mol/l mianowanego roztworu objętościowego kwasu siarkowego (3.6)

V0 = objętość w ml kwasu siarkowego (3.6) użytego do próby ślepej

V1 = objętość w ml kwasu siarkowego (3.6) użytego do naważki

7. Sprawdzenie metody

7.1. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 0,2 % wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższej niż 20 %,

— 1,0 % najwyższego wyniku, dla zawartości białka surowego od 20 do 40 %,

— 0,4 % wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego wyższej niż 40 %.

7.2. Dokładność

Przeprowadzić analizę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując od 1,5 do 2,0 g acetanilidu (3.13) w obecności 1 g sacharozy (3.14); 1 g acetanilidu zużywa 14,80 ml kwasu siarkowego (3.5). Stopień odzysku musi wynosić co najmniej 99 %.

8. Objaśnienia

8.1. Sprzęt i aparatura mogą być obsługiwane ręcznie, półautomatycznie lub być całkowicie zautomatyzowane. W przypadku konieczności przeniesienia urządzenia pomiędzy etapami mineralizacji i destylacji, czynność tę należy wykonać bez jakichkolwiek strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu natychmiast przed podłączeniem kolby do chłodnicy, wlewając ciecz powoli po ściankach.

8.2. Jeżeli roztwór przechodzi w postać stałą, ponownie przeprowadzić oznaczanie, stosując większe ilości kwasu siarkowego (3.4) niż podano wyżej.

8.3. W przypadku produktów o niskiej zawartości azotu objętość kwasu siarkowego (3.7), która ma zostać dodana do kolby odbieralnika, może być w miarę potrzeby zmniejszona do 10 lub 15 ml i uzupełniona wodą do objętości 25 ml.

8.4. Do celów rutynowego badania można stosować inne metody analizy w odniesieniu do oznaczania białka surowego, ale metoda Kjeldahla opisana w niniejszej części C stanowi metodę referencyjną. Równoważność wyników uzyskanych inną metodą (np. DUMAS) w porównaniu z metodą referencyjną musi zostać wykazana odrębnie dla każdej matrycy. Ze względu na fakt, iż nawet po potwierdzeniu równoważności wyniki uzyskane inną metodą mogą się nieznacznie różnić od wyników uzyskanych metodą referencyjną, konieczne jest podanie w sprawozdaniu z badań metody analitycznej zastosowanej do oznaczenia białka surowego.

D. OZNACZANIE MOCZNIKA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości mocznika w paszach.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka ze środkiem klarującym tworzy w wodzie zawiesinę. Zawiesina jest filtrowana. Zawartość mocznika w filtracie jest oznaczana po dodaniu 4-dwumetyloaminobenzaldehydu (4-DMAB) poprzez pomiar gęstości optycznej przy długości fali 420 nm.

3. Odczynniki i roztwory

3.1. Roztwór 4-dwumetyloaminobezaldehydu: rozpuścić 1,6 g 4-DMAB w 100 ml 96 % etanolu i dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (ρ201,19 g/ml). Trwałość tego odczynnika wynosi nie więcej niż dwa tygodnie.

3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynkowego Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasowego K4Fe(CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą.

3.4. Aktywny węgiel nieabsorbujący mocznika (sprawdzony).

3.5. Roztwór 0,1 % (w/v) mocznika.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Mikser (tumbler): ok. 35 do 40 obr./min.

4.2. Probówki: 160 × 16 mm ze szklanymi, szlifowanymi korkami.

4.3. Spektrofotometr.

5. Sposób postępowania

5.1. Analiza próbki

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2 g próbki i umieścić razem z 1 g aktywnego węgla (3.4) w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody i 5 ml roztworu Carreza I (3.2), mieszać przez ok. 30 sekund, a następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.3). Mieszać przez 30 minut w mikserze. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, wstrząsnąć i przefiltrować.

Do probówek ze szklanymi szlifowanymi korkami przenieść po 5 ml przezroczystego, bezbarwnego filtratu, dodać 5 ml roztworu 4-DMAB (3.1) i zamieszać. Wstawić probówki do łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 20 oC (+/- 4 oC). Po 15 minutach zmierzyć gęstość optyczną roztworu próbki spektrofotometrem przy długości fali 420 nm. Pomiar porównać ze ślepą próbą odczynnikową.

5.2. Krzywa kalibracyjna

Do kolb miarowych o pojemności 100 ml nalać 1, 2, 4, 5 i 10 ml roztworu mocznika (3.5) i uzupełnić do pełnej objętości kolb wodą. Odlać 5 ml każdego z roztworów, dodać do każdej kolby po 5 ml roztworu 4-DMAB (3.1), wymieszać i zmierzyć gęstość optyczną w podany wyżej sposób, porównując z roztworem kontrolnym zawierającym 5 ml 4-DMAB i 5 ml wody pozbawionej mocznika. Wykreślić krzywą kalibracyjną.

6. Obliczanie wyników

Na podstawie krzywej kalibracyjnej oznaczyć zawartość mocznika w próbce.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

7. Objaśnienia

7.1. W przypadku gdy zawartość mocznika jest wyższa niż 3 %, zmniejszyć masę próbki do 1 g lub rozcieńczyć pierwotny roztwór tak, aby w 500 ml nie znajdowało się więcej niż 50 mg mocznika.

7.2. W przypadku niskiej zawartości mocznika zwiększać masę próbki tak, aby filtrat pozostał przezroczysty i bezbarwny.

7.3. Jeśli próbka zawiera proste związki azotowe takie jak aminokwasy, gęstość optyczną należy mierzyć przy długości fali 435 nm.

E. OZNACZANIE LOTNYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH

I. METODA MIKRODYFUZYJNA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania w paszach zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana wodą, a roztwór – klarowany i filtrowany. Lotne związki azotowe są oddzielane metodą mikrodyfuzji z użyciem roztworu węglanu potasu, zbierane w roztworze kwasu borowego i miareczkowane kwasem siarkowym.

3. Odczynniki i roztwory

3.1. Kwas trójchlorooctowy, roztwór 20 % (w/v).

3.2. Wskaźnik: rozpuścić 33 mg zieleni bromokrezolowej i 65 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu o stężeniu od 95 do 96 % (v/v).

3.3. Kwas borowy, roztwór: w kolbie miarowej o pojemności 1 l rozpuścić 10 g kwasu borowego w 200 ml etanolu o stężeniu od 95 do 96 % (v/v) i 700 ml wody. Dodać 10 ml wskaźnika (3.2). Zamieszać i, jeżeli to konieczne, doprowadzić barwę roztworu do jasnoczerwonej przez dodanie roztworu wodorotlenku sodu. 1 ml tego roztworu będzie pochłaniał maksymalnie 300 μg NH3.

3.4. Węglan potasu, roztwór nasycony: rozpuścić 100 g węglanu potasu w 100 ml wrzącej wody. Schłodzić i przefiltrować.

3.5. Kwas siarkowy o stężeniu 0,01 mol/l.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Mikser (tumbler): ok. 35 do 40 obr./min.

4.2. Szklane lub plastykowe naczynka Conwaya (zob. rysunek).

4.3. Mikrobiurety ze skalą 1/100 ml.

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g próbki do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, energicznie wstrząsnąć i przefiltrować przez karbowany filtr.

Pipetą wprowadzić 1 ml roztworu kwasu borowego (3.3) do środkowej części naczynka Conwaya i 1 ml filtratu próbki na obrzeże naczynka. Częściowo przykryć nasmarowaną przykrywką. Szybko dodać kroplami 1 ml nasyconego roztworu węglanu potasu (3.4) na obrzeże naczynka i zamknąć pokrywką, tak aby naczynko było hermetyczne. Obracać ostrożnie naczynkiem w płaszczyźnie poziomej, aby doprowadzić do zmieszania dwóch odczynników. Inkubować przez co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej lub godzinę w temperaturze 40 oC.

Mikrobiuretą (4.3) miareczkować lotne związki zaabsorbowane w kwasie borowym, stosując roztwór kwasu siarkowego (3.5).

Ślepą próbę przeprowadzić w ten sam sposób, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy.

6. Obliczanie wyników

1 ml H2SO4 o stężeniu 0,01 mol/l odpowiada 0,34 mg amoniaku.

Przedstawić wynik jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać:

— 10 % wartości względnej, dla zawartości amoniaku poniżej 1,0 %,

— 0,1 % wartości bezwzględnej, dla zawartości amoniaku równej lub wyższej niż 1,0 %.

7. Objaśnienia

Jeżeli zawartość amoniaku w próbce przekracza 0,6 %, rozcieńczyć filtrat.

II. METODA DESTYLACYJNA

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak, w mączkach rybnych niezawierających mocznika. Metoda ma zastosowanie dla zawartości amoniaku niższej niż 0,25 %.

2. Sposób przeprowadzenia metody

Próbka jest ekstrahowana wodą, a uzyskany roztwór klarowany i filtrowany. Lotne związki azotowe są oddzielane w punkcie wrzenia poprzez dodanie tlenku magnezu i zbierane w określonej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu.

3. Odczynniki i roztwory

3.1. Kwas trójchlorooctowy, roztwór 20 % (w/v).

3.2. Tlenek magnezu.

3.3. Emulsja zapobiegająca spienieniu (np. silikon).

3.4. Kwas siarkowy o stężeniu 0,05 mol/l.

3.5. Wodorotlenek sodu, roztwór o stężeniu 0,1 mol/l.

3.6. Czerwień metylowa, roztwór 0,3 % w alkoholu etylowym 95 %–96 % (v/v).

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min.

4.2. Aparat do destylacji typu Kjeldahla.

5. Sposób postępowania

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g próbki do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, energicznie wstrząsnąć i filtrować przez karbowany filtr.

Pobrać taką ilość klarownego filtratu, która odpowiada spodziewanej zawartości lotnych związków azotowych, co zwykle odpowiada objętości 100 ml. Rozcieńczyć do 200 ml, dodać 2 g tlenku magnezu (3.2) i kilka kropli emulsji zapobiegającej spienieniu (3.3). Roztwór musi wykazywać alkaliczność wobec papierka lakmusowego, w przeciwnym razie dodać nieco tlenku magnezu (3.2). Postępować zgodnie z pkt 5.2 i 5.3 metody analitycznej dotyczącej oznaczania zawartości białka surowego (część C niniejszego załącznika).

Ślepą próbę przeprowadzić w ten sam sposób, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy.

6. Obliczanie wyników

1 ml H2SO4 o stężeniu 0,05 mol/l odpowiada 1,7 mg amoniaku.

Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń, wykonanych dla tej samej próbki, nie może przekraczać 10 % wartości względnej amoniaku.

F. OZNACZANIE AMINOKWASÓW (Z WYJĄTKIEM TRYPTOFANU)

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości wolnych (syntetycznych i naturalnych) oraz całkowitych (związanych i wolnych peptydów) aminokwasów w paszach z użyciem analizatora aminokwasów. Metoda ma zastosowanie do następujących aminokwasów: cystyny (cysteiny), metioniny, lizyny, treoniny, alaniny, argininy, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, tyrozyny i waliny.

Metoda nie pozwala odróżnić soli aminokwasów, a także form D i L aminokwasów. Nie można jej stosować do oznaczania tryptofanu lub hydroksyanalogów aminokwasów.

2. Sposób przeprowadzenia metody

2.1. Wolne aminokwasy

Wolne aminokwasy są ekstrahowane rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Wyekstrahowane jednocześnie makrocząsteczki związków azotowych są wytrącane kwasem sulfosalicylowym i usuwane przez filtrowanie. Filtrowany roztwór jest dostosowany do pH 2,20 . Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane z zastosowaniem reakcji z ninhydryną, poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm.

2.2. Aminokwasy całkowite

Wybór sposobu postępowania zależy od oznaczanych aminokwasów. Cystynę (cysteinę) i metioninę przed hydrolizą poddać utlenianiu, odpowiednio do kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny. Tyrozyna musi być oznaczana w hydrolizatach próbek niepoddanych utlenieniu. Pozostałe aminokwasy wymienione w pkt 1 mogą być oznaczane w próbce utlenionej albo niepoddanej utlenianiu.

Utlenianie jest przeprowadzane w temperaturze 0 oC z użyciem mieszaniny kwasu nadmrówkowego i fenolu. Nadmiar odczynnika utleniającego jest rozkładany z użyciem dwusiarczku sodu. Utleniona albo niepoddana utlenianiu próbka jest hydrolizowana kwasem chlorowodorowym (3.20) przez 23 godziny. Hydrolizat jest dostosowany do pH 2,20 . Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane na drodze reakcji z ninhydryną, przez fotometryczną detekcję przy 570 nm (440 nm w przypadku proliny).

3. Odczynniki i roztwory

Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub podobnej jakości (przewodność < 10 μS).

3.1. Nadtlenek wodoru, w (w/w) = 30 %.

3.2. Kwas mrówkowy, w (w/w) = 98–100 %.

3.3. Fenol.

3.4. Dwusiarczyn sodu.

3.5. Wodorotlenek sodu.

3.6. Kwas 5-sulfosalicylowy dwuhydrat.

3.7. Kwas chlorowodorowy, gęstość około 1,18 g/ml.

3.8. Cytrynian trisodu, dwuhydrat.

3.9. 2,2 ' tiodwuetanol (tiodwuglikol).

3.10. Chlorek sodu.

3.11. Ninhydryna.

3.12. Eter naftowy o temperaturze wrzenia 40–60 oC.

3.13. Norleucyna lub inny związek odpowiedni do stosowania jako wzorzec wewnętrzny.

3.14. Azot gazowy (< 10 ppm tlenu).

3.15. 1-oktanol.

3.16. Aminokwasy.

3.16.1. Substancje wzorcowe określone w pkt 1. Czyste związki, niezawierające wody krystalizacyjnej. Suszyć w warunkach próżni w obecności P2O5 lub H2SO4 przez tydzień przed użyciem.

3.16.2. Kwas cysteinowy.

3.16.3. Sulfon metioniny.

3.17. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 7,5 mol/l:

Rozpuścić 300 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.18. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l:

Rozpuścić 40 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.19. Roztwór kwasu mrówkowego i fenolu:

Zmieszać 889 g kwasu mrówkowego (3.2) z 111 g wody i dodać 4,73 g fenolu (3.3).

3.20. Mieszanina hydrolizująca, c = 6 mol HCl/l, zawierająca 1 g fenolu/l:

Dodać 1 g fenolu (3.3) do 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.21. Mieszanina ekstrakcyjna, c = 0,1 mol HCl/l, zawierająca 2 % tiodwuglikolu: Pobrać 8,2 ml HCl (3.7), rozpuścić w około 900 ml wody, dodać 20 ml tiodwuglikolu (3.9) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą (nie mieszać bezpośrednio odczynników określonych w pkt 3.7 i 3.9.).

3.22. Kwas 5-sulfosalicylowy, ß = 6 %:

Rozpuścić 60 g kwasu 5-sulfosalicylowego (3.6) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą.

3.23. Mieszanina utleniająca (kwas nadmrówkowy – fenol):

Zmieszać w małej zlewce 0,5 ml nadtlenku wodoru (3.1) z 4,5 ml roztworu kwasu mrówkowego i fenolu (3.19). Inkubować w temperaturze od 20 do 30 oC przez godzinę w celu utworzenia kwasu nadmrówkowego, następnie schłodzić w lodowej łaźni wodnej (15 minut) przed dodaniem tej mieszaniny do próbki.

Uwaga: Unikać kontaktu ze skórą i nosić odzież ochronną.

3.24. Bufor cytrynianowy, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20 :

Rozpuścić 19,61 g cytrynianu trisodu (3.8), 5 ml tiodwuglikolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) i 16,50 ml HCl (3.7) w około 800 ml wody. Dostosować pH do 2,20 . Uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.25. Bufor wymywający, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (4.9).

3.26. Odczynnik ninhydrynowy, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (4.9).

3.27. Wzorcowe roztwory aminokwasów. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC.

3.27.1. Podstawowy wzorcowy roztwór aminokwasów (3.16.1).

Każdy o stężeniu c = 2,5 μmol/ml, w kwasie chlorowodorowym.

Mogą być otrzymane w handlu.

3.27.2. Podstawowe wzorcowe roztwory kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny, c = 1,25 μmol/ml.

Rozpuścić 0,2115 g kwasu cysteinowego (3.16.2) i 0,2265 g sulfonu metioniny (3.16.3) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie miarowej o pojemności 1 l i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 12 miesięcy. Roztworu nie stosuje się, jeżeli podstawowy wzorcowy roztwór (3.27.1) zawiera kwas cysteinowy i sulfon metioniny.

3.27.3. Podstawowy wzorcowy roztwór wzorca wewnętrznego, proponuje się zastosować norleucynę, c = 20 μmol/ml.

Rozpuścić 0,6560 g norleucyny (3.13) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie miarowej i uzupełnić kolbę do objętości 250 ml buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 6 miesięcy.

3.27.4. Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do użycia z hydrolizatami, c = 5 nmol/50 μl kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny i c = 10 nmol/50 μl innych aminokwasów. Rozpuścić 2,2 g chlorku sodu (3.10) w zlewce o pojemności 100 ml z 30 ml buforu cytrynianowego (3.24). Dodać 4,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego aminokwasów (3.27.1), 4,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny (3.27.2) i, jeżeli jest stosowany, 0,5 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3). Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18).

Przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (3.24) i zmieszać.

Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 3 miesiące.

Zob. również objaśnienia pkt 9.1.

3.27.5. Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do stosowania z hydrolizatami przygotowanymi w sposób określony w pkt 5.3.3.1 i do użycia z ekstraktami (5.2). Roztwór kalibracyjny przygotowuje się w sposób określony w pkt 3.27.4, z pominięciem chlorku sodu.

Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 3 miesiące.

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Kolba okrągłodenna o pojemności 100 lub 250 ml z chłodnicą zwrotną.

4.2. Butelka ze szkła borokrzemowego o pojemności 100 ml z nakrętką pokrytą gumą/teflonem (np. Duran, Schott) do stosowania w suszarce.

4.3. Suszarka z silnym nawiewem i możliwością regulacji temperatury z dokładnością większą niż ±2 oC.

4.4. Pehametr (dokładność do trzech miejsc po przecinku).

4.5. Filtr membranowy (0,22 μm).

4.6. Wirówka.

4.7. Obrotowa wyparka próżniowa.

4.8. Mechaniczna wytrząsarka lub mieszadło magnetyczne.

4.9. Analizator aminokwasów lub wyposażenie do HPLC z kolumną jonowymienną, przystawką do ninhydryny, postkolumnową derywatyzacją i detektorem fotometrycznym.

Kolumna jest wypełniona sulfonowaną żywicą polistyrenową mającą zdolność rozdziału aminokwasów od siebie i od innych składników reagujących z ninhydryną. Przepływ buforu i ninhydryny jest przeprowadzany przez pompy o stabilności przepływu 0,5 % w czasie testowania kalibracyjnych roztworów, jak i analizy próbek.

W niektórych analizatorach aminokwasów mogą być stosowane metody hydrolizy, w których hydrolizat zawiera stężenie sodu c = 0,8 mol/l i całą pozostałość kwasu mrówkowego z etapu utleniania. Inne analizatory nie dają zadowalającego rozdziału niektórych aminokwasów, jeżeli hydrolizat zawiera nadmiar kwasu mrówkowego lub wysokie stężenie jonów sodowych. W tym przypadku objętość kwasu jest zmniejszana przez odparowanie do objętości około 5 ml, które wykonuje się po hydrolizie i przed dostosowaniem pH. Odparowywanie należy prowadzić w warunkach próżni w temperaturze nie wyższej niż 40 oC.

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę, tak aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgotności przed rozdrobnieniem należy wysuszyć albo suchym powietrzem o temperaturze nieprzekraczającej 50 oC, albo przez zamrożenie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed rozdrobnieniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.12).

5.2. Oznaczanie wolnych aminokwasów w paszach i premiksach

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby stożkowej i dodać 100 ml mieszaniny ekstrakcyjnej (3.21). Wstrząsać mieszaninę przez 60 minut, używając mechanicznej wytrząsarki lub mieszadła magnetycznego (4.8). Odstawić do sedymentacji osadu i pobrać pipetą 10 ml supernatantu roztworu do zlewki o objętości 100 ml.

Dodać, mieszając, 5,0 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego (3.22) i kontynuować mieszanie z użyciem mieszadła magnetycznego przez 5 minut. Przefiltrować lub odwirować supernatant w celu usunięcia osadu. Umieścić 10,0 ml otrzymanego roztworu w zlewce o objętości 100 ml, dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18), przenieść do wolumetrycznej kolby o odpowiedniej pojemności, z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) i uzupełnić roztworem buforu cytrynianowego do pełnej objętości tej kolby (3.24).

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, dodać 1,00 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) na każde 100 ml końcowego roztworu i uzupełnić roztworem buforu cytrynianowego (3.24) do pełnej objętości kolby.

Przeprowadzić rozdział chromatograficzny w sposób określony w pkt 5.4.

Jeżeli ekstrakty nie będą oznaczane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 oC.

5.3. Oznaczanie całkowitej zawartości aminokwasów

5.3.1. Utlenianie

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do:

— kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml (4.1) do hydrolizy otwartej (5.3.2.3), lub

— kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (4.1), jeżeli wymagane jest niskie stężenie sodu (5.3.3.1), lub

— butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (4.2), w przypadku hydrolizy zamkniętej (5.3.2.4).

Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu, a poziom wilgotności nie może przekraczać 100 mg.

Umieścić kolbę lub butelkę w lodowej łaźni wodnej i oziębić do temperatury 0 oC, dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (3.23) i zamieszać, używając szklanej bagietki z wygiętym końcem. Uszczelnić kolbę/butelkę wraz z bagietką, stosując hermetyczny film, umieścić wraz z lodową łaźnią wodną w lodówce o temperaturze 0 oC i pozostawić na 16 godzin. Po 16 godzinach wyjąć z lodówki i rozłożyć nadmiar odczynnika utleniającego przez dodanie 0,84 g dwusiarczynu sodu (3.4).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.1.

5.3.2. Hydroliza

5.3.2.1. Hydroliza próbek utlenionych

Do utlenionej próbki, przygotowanej w sposób określony w pkt 5.3.1, dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20), zwracając uwagę, aby zmyć pozostałości próbki przywierające do bocznych ścianek naczynia i bagietki.

W zależności od sposobu przeprowadzonej hydrolizy postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.2. Hydroliza próbek nieutlenionych

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby okrągłodennej o pojemności 100 lub 250 ml (4.1) lub do butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (4.2). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu. Ostrożnie dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20) i zmieszać z próbką. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hydroliza otwarta

Do kolby z mieszaniną, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, dodać 3 szklane perełki i gotować, utrzymując stan wrzenia ze zwrotem skroplin przez 23 godziny. Po zakończonej hydrolizie przemyć chłodnicę od dołu 5 ml buforu cytrynianowego (3.24). Odłączyć kolbę i schłodzić w łaźni lodowej.

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.2.4. Hydroliza zamknięta

Umieścić butelkę zawierającą mieszaninę, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, w suszarce (4.3) w temperaturze 110 oC. W czasie 1 godziny hydrolizy, aby uniknąć gwałtownego wzrostu ciśnienia w wyniku powstawania substancji gazowych i wybuchu, umieścić nakrętkę na naczyniu. Nie zamykać naczynia korkiem. Po godzinie dokręcić nakrętkę i pozostawić w suszarce (4.3) przez 23 godziny. Po zakończeniu hydrolizy wyjąć butelkę z suszarki, ostrożnie odkręcić nakrętkę i umieścić butelkę w lodowej łaźni wodnej. Pozostawić do schłodzenia.

W zależności od sposobu dostosowania pH (5.3.3) przenieść ilościowo zawartość butelki do zlewki lub kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml, stosując bufor cytrynianowy (3.24).

Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3.

5.3.3. Dostosowanie pH

W zależności od tolerancji analizatora aminokwasów (4.9) na sód pH dostosowuje się w sposób określony w pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2.

5.3.3.1. Dla systemów chromatograficznych (4.9) wymagających niskiego stężenia sodu

Wskazane jest zastosowanie podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3), gdy analizatory aminokwasów wymagają niskiego stężenia sodu, w przypadku gdy należy zredukować objętość kwasu.

W tym przypadku dodać 2,00 ml podstawowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) do hydrolizatu przed odparowaniem.

Dodać 2 krople 1-oktanolu (3.15) do hydrolizatu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4.

Stosując obrotową wyparkę próżniową (4.7) zmniejszyć w warunkach próżni i w temperaturze 40 oC objętość do 5–10 ml. Jeżeli objętość roztworu zostanie przypadkowo zredukowana poniżej 5 ml, hydrolizat należy wyrzucić i powtórzyć analizę.

Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18) i postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.3.2. Dla pozostałych analizatorów aminokwasów (4.9)

Pobrać hydrolizaty otrzymane w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4 i częściowo je zneutralizować poprzez mieszanie, ostrożnie dodając 17 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.17), zwracając uwagę, aby temperatura roztworu nie była wyższa niż 40 oC.

Dostosować pH do 2,20 w temperaturze pokojowej, dodając roztwór wodorotlenku sodu (3.17), a pod koniec roztwór wodorotlenku sodu (3.18). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.4.

5.3.4. Roztwór próbki do analizy chromatograficznej

Przenieść ilościowo hydrolizaty o dostosowanym pH (5.3.3.1 lub 5.3.3.2) z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) do kolby miarowej o pojemności 200 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (3.24).

Jeżeli wcześniej nie dodawano wzorca wewnętrznego, dodać 2,00 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) i uzupełnić buforem cytrynianowym (3.24) do pełnej objętości kolby. Dokładnie zmieszać.

Przejść do analizy chromatograficznej (5.4).

Jeżeli roztwory próbek nie będą analizowane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 oC.

5.4. Chromatografia

Przed analizą chromatograficzną doprowadzić ekstrakt (5.2) lub hydrolizat (5.3.4) do temperatury pokojowej. Wstrząsnąć mieszaniną i przefiltrować jej odpowiednią ilość przez filtr membranowy 0,22 μm (4.5). Otrzymany klarowny roztwór jest poddawany chromatografii jonowymiennej przy wykorzystaniu analizatora aminokwasów (4.9).

Dozowanie wykonuje się ręcznie lub automatycznie. Ważne jest, aby na kolumnę nanieść takie same ilości roztworów z dokładnością ± 0,5 % zarówno w przypadku analizy wzorców, jak i badanych próbek, z wyjątkiem gdy jest stosowany wzorzec wewnętrzny, oraz aby stosunek sodu do aminokwasu w roztworze badanej próbki był jak najbardziej zbliżony do tego w roztworze wzorcowym.

Zasadniczo częstość przeprowadzania kalibracji zależy od stabilności odczynnika ninhydrynowego i od systemu analitycznego. Wzorzec lub próbka są wymywane buforem cytrynianowym (3.24), tak aby powierzchnia piku wzorca odpowiadała od 30 do 200 % powierzchni piku badanej próbki aminokwasu.

Analiza chromatograficzna aminokwasów będzie różnić się nieznacznie w zależności od typu stosowanego analizatora i żywicy. Wybrany system musi mieć zdolność oddzielenia od siebie aminokwasów oraz od innych substancji dających z ninhydryną reakcje. W badanym zakresie stosowany system chromatograficzny musi dawać liniową odpowiedź na zmiany ilości aminokwasów dodawanych na kolumnę.

W czasie analizy chromatograficznej opisany poniżej stosunek doliny do wysokości piku odnosi się do przypadku, gdy jest analizowany równomolowy roztwór oznaczanego aminokwasu. Równomolowy roztwór aminokwasu musi zawierać co najmniej 30 % maksymalnej zawartości każdego aminokwasu, który można aktualnie oznaczyć z użyciem danego analizatora aminokwasów (4.9).

Dla oddzielenia treoniny od seryny stosunek doliny do wysokości piku niższego z pokrywających się aminokwasów na chromatografie nie może przekraczać 2:10, w przypadku gdy oznaczane są tylko cystyna (cysteina), metionina, treonina i lizyna, niewystarczające oddzielenie od sprzężonych pików będzie ujemnie wpływało na oznaczenie. Dla wszystkich innych aminokwasów rozdział musi być lepszy niż 1:10.

System musi zapewniać oddzielenie lizyny od „artefaktów lizyny” i od ornityny.

6. Obliczanie wyników

Powierzchnię pików próbki i wzorca mierzy się dla każdego pojedynczego aminokwasu i obliczana jest zawartość aminokwasu (X) w g/kg próbki.

Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, wyrażenie należy pomnożyć przez:

gdzie:

A = powierzchnia piku hydrolizatu lub ekstraktu

B = powierzchnia piku wzorcowego roztworu kalibracyjnego

C = powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w hydrolizacie lub ekstrakcie

D = powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w roztworze wzorcowym kalibracyjnym

M = masa cząsteczkowa oznaczanego aminokwasu

c = stężenie wzorca w μmol/ml

m = masa próbki w g przeliczona na masę oryginalnej próbki w przypadku odtłuszczania lub podsuszania

V = hydrolizat ogółem w ml (5.3.4) lub obliczona ogólna objętość w ml rozcieńczonego ekstraktu (6.1)

Cystyna i cysteina są oznaczane jako kwas cysteinowy w hydrolizatach utlenionej próbki, ale są obliczane jak cystyna (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), stosując M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).

Metionina jest oznaczana jako sulfon metioniny w hydrolizatach utlenionej próbki, ale jest obliczana jak metionina, stosując M metioniny: 149,21 g/mol.

Dodana wolna metionina jest oznaczana po ekstrakcji jako metionina, przy czym dla obliczeń stosowana jest taka sama wartość M.

6.1. Ogólną objętość rozcieńczonych ekstraktów (F) w przypadku oznaczania zawartości wolnych aminokwasów (5.2) obliczyć według następującego wzoru:

V = objętość końcowego

7. Ocena metody

Międzynarodowe badania porównawcze metody były przeprowadzone w 1990 r. z użyciem czterech pasz (mieszanki paszowej dla świń, mieszanki paszowej dla brojlerów, koncentratu białkowego i premiksu). Po odrzuceniu wyników odbiegających, średnie wyniki i odchylenia standardowe są przedstawione w tabelach zawartych w niniejszym punkcie:







Średnie wielkości w g/kg Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Koncentrat białkowy 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiks 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.

7.1. Powtarzalność

Powtarzalność wyrażona jako „odchylenie standardowe wewnątrz laboratorium” omawianego powyżej porównawczego badania jest przedstawiona w poniższych tabelach:







Odchylenie standardowe wewnątrz laboratorium (Sr) w g/kg Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Koncentrat białkowy 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiks 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.







Współczynnik zmienności (%) dla odchylenia standardowego wewnątrz laboratorium (Sr) Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Koncentrat białkowy 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiks 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.

7.2. Odtwarzalność

Wyniki odchylenia standardowego między laboratoriami otrzymane w wyniku przeprowadzenia omawianego powyżej porównawczego badania są przedstawione w poniższej tabeli:







Odchylenie standardowe między laboratoriami (SR) w g/kg Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Koncentrat białkowy 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiks 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.







Współczynnik zmienności (%) dla odchylenia standardowego między laboratoriami (SR) Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Koncentrat białkowy 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiks 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.

8. Stosowanie materiałów odwoławczych

Prawidłowe stosowanie metody należy weryfikować przez wykonywanie powtarzalnych oznaczeń certyfikowanych materiałów odwoławczych, jeżeli takie są dostępne. Zalecana jest także kalibracja z zastosowaniem certyfikowanych kalibracyjnych roztworów aminokwasów.

9. Objaśnienia

9.1. Z powodu różnic pomiędzy analizatorami aminokwasów końcowe stężenia kalibracyjnych roztworów aminokwasów wzorcowych (zob. 3.27.4 i 3.27.5) oraz hydrolizatu (zob. 5.3.4) należy traktować jako przykładowe.

Zakres liniowej odpowiedzi aparatu należy sprawdzić dla wszystkich aminokwasów.

Roztwór wzorcowy jest rozcieńczany buforem cytrynianowym, tak aby otrzymać powierzchnię piku o średnim zasięgu.

9.2. Jeżeli do analizy produktów hydrolizy jest wykorzystywany wysoko sprawny chromatograf cieczowy, należy zoptymalizować warunki doświadczalne analizy zgodnie z zaleceniami producenta.

9.3. Przy stosowaniu tej metody do pasz zawierających więcej niż 1 % chlorków (koncentraty, mieszanki mineralne, mieszanki paszowe uzupełniające) wyniki oznaczania metioniny mogą być zaniżone i należy stosować specjalne postępowanie.

G. OZNACZANIE TRYPTOFANU

1. Cel i zakres stosowania metody

Metoda służy do oznaczania zawartości całkowitego i wolnego tryptofanu w paszach. Metoda nie wyróżnia form D i L.

2. Sposób przeprowadzenia metody

W celu oznaczenia całkowitego tryptofanu próbka jest hydrolizowana w środowisku zasadowym z użyciem nasyconego roztworu wodorotlenku baru i ogrzewana do 110 oC przez 20 godzin. Po hydrolizie dodawany jest wzorzec wewnętrzny.

W celu oznaczenia wolnego tryptofanu próbka jest ekstrahowana w warunkach lekko kwaśnych w obecności wzorca wewnętrznego.

Tryptofan i wzorzec wewnętrzny w hydrolizacie lub w ekstrakcie jest oznaczony metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

3. Odczynniki i roztwory

3.1. Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub o porównywalnej jakości (przewodnictwo < 10 μS/cm).

3.2. Substancja wzorcowa: tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu.

3.3. Substancja wzorcowa wewnętrzna: α-metylo-tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu.

3.4. Wodorotlenek baru, oktahydrat (należy uważać, aby nie wystawiać Ba(OH)2 · 8H2O na nadmierne działanie powietrza, aby uniknąć tworzenia się BaCO3, który mógłby utrudniać oznaczenie) (zob. objaśnienia pkt 9.3).

3.5. Wodorotlenek sodu.

3.6. Kwas ortofosforowy, w (w/w) = 85 %.

3.7. Kwas chlorowodorowy, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Metanol do HPLC.

3.9. Eter naftowy o temperaturze wrzenia od 40 do 60 oC.

3.10. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l:

Rozpuścić 40,0 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1).

3.11. Kwas chlorowodorowy, c = 6 mol/l:

Odmierzyć 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.12. Kwas chlorowodorowy, c = 1 mol/l:

Odmierzyć 82 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.13. Kwas chlorowodorowy, c = 0,1 mol/l:

Odmierzyć 8,2 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą.

3.14. Kwas ortofosforowy, c = 0,5 mol/l:

Odmierzyć 34 ml kwasu ortofosforowego (3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1).

3.15. Stężony roztwór tryptofanu (3.2), c = 2,50 μmol/ml:

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2553 g tryptofanu (3.2) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18 oC nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

3.16. Stężony roztwór wzorca wewnętrznego, c = 2,50 μmol/ml:

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2728 g α-metylo-tryptofanu (3.3) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18 oC nie dłużej niż przez 4 tygodnie.

3.17. Kalibracyjny roztwór wzorcowy tryptofanu i wzorca wewnętrznego:

Odmierzyć 2,00 ml stężonego roztworu tryptofanu (3.15) i 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (3.16). Rozcieńczyć wodą (3.1) i metanolem (3.8) w przybliżeniu do tej samej objętości i tego samego stężenia metanolu (10–30 %) jak w końcowym hydrolizacie.

Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Chronić przed bezpośrednim działaniem światła podczas przygotowywania.

3.18. Kwas octowy.

3.19. 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanol.

3.20. Etanoloamina w (w/w) > 98 %.

3.21. Roztwór 1 g 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w 100 ml metanolu (3.8).

3.22. Faza ruchoma do HPLC: 3,00 g kwasu octowego (3.18) + 900 ml wody (3.1) +50,0 ml roztworu (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w metanolu (3.8) (1 g/100 ml). Dostosować pH do 5,00 , stosując etanoloaminę (3.20). Uzupełnić do objętości 1 000 ml wodą (3.1).

4. Aparatura i sprzęt

4.1. Wyposażenie HPLC z detektorem spektrofluorometrycznym.

4.2. Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważne.

4.3. Pehametr.

4.4. Kolba propylenowa o pojemności 125 ml, z szeroką szyjką i nakrętką.

4.5. Filtr membranowy, 0,45 μm.

4.6. Autoklaw, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1 ) bar.

4.7. Wstrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne.

4.8. Mieszadło Vortex.

5. Sposób postępowania

5.1. Przygotowanie próbek

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgotności przed rozdrobnieniem wysuszyć albo na powietrzu w temperaturze nieprzekraczającej 50 oC, albo przez wymrażanie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed rozdrobnieniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.9).

5.2. Oznaczanie wolnego tryptofanu (ekstrakt)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w 5.1 do kolby stożkowej. Dodać 100,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.13) i 5,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16). Wstrząsać lub mieszać przez 60 minut z użyciem wstrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić do oddzielenia się osadu i przenieść pipetą 10,0 ml supernatantu roztworu do zlewki. Dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (3.14). Dostosować pH do 3 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.10). Dodać odpowiednią ilość metanolu (3.8), aby uzyskać stężenie od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości właściwej dla chromatografii (objętość zbliżona do objętości kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17)).

Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4.

Roztwór wzorcowy i ekstrakty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty można przechowywać w temperaturze 5 oC nie dłużej niż przez 3 dni.

5.3. Oznaczanie całkowitego tryptofanu (hydrolizat)

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby propylenowej (4.4). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu. Dodać 8,4 g oktahydratu wodorotlenku baru (3.4) i 10 ml wody. Mieszać z użyciem mieszadła Vortex (4.8) lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić osłonięty teflonem magnes w mieszaninie. Spłukać ściany naczynia z użyciem 4 ml wody. Nałożyć nakrętkę i