1991R2568 — PL — 01.11.2003 — 020.001

Dokument ten służy wyłącznie do celów dokumentacyjnych i instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego zawartość

zmienione przez:







(*) Akt ten nie został nigdy opublikowany w języku polskim.









▼B

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 2568/91

z dnia 11 lipca 1991 r.

w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy







KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą, uwzględniając rozporządzenie Rady nr 136/66/EWG z dnia 22 września 1966 r. w sprawie ustanowienia wspólnej organizacji rynku olejów i tłuszczów ( 1 ), ostatnio zmienione rozporządzeniem (EWG) nr 3577/90 ( 2 ), w szczególności jego art. 35a, a także mając na uwadze, co następuje: a także mając na uwadze, co następuje: załącznik do rozporządzenia nr 136/66/EWG zawiera opisy i definicje oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek, wprowadzanych do obrotu w każdym Państwie Członkowskim, w handlu wewnątrzwspólnotowym oraz w handlu z państwami trzecimi; w celu zróżnicowania rodzajów oliwy z oliwek należy określić ich fizyczne i chemiczne właściwości oraz właściwości organoleptyczne oliwy z pierwszego tłoczenia, aby zagwarantować czystość i jakość danych produktów, bez uszczerbku dla innych istniejących przepisów; charakterystyczne właściwości różnych rodzajów oliwy należy określać w sposób jednolity na terytorium całej Wspólnoty; w tym celu należy ustalić wspólnotowe metody analizy chemicznej i oceny organoleptycznej; należy zezwolić na stosowanie w okresie przejściowym innych metod analiz stosowanych w Państwach Członkowskich, pod warunkiem, że w razie występowania różnic w wynikach, wynikami ostatecznymi są wyniki uzyskane wspólną metodą; definicja fizycznych i chemicznych właściwości oliwy z oliwek i metod analizy pociąga za sobą zmiany dodatkowych uwag do rozdziału 15 Nomenklatury Scalonej; metoda oceny właściwości organoleptycznych oliwy z pierwszego tłoczenia obejmuje ustanowienie zespołów wybranych i wyszkolonych degustatorów; w związku z tym należy wyznaczyć niezbędny termin dla utworzenia takiej struktury; mając na względzie trudności, które niektóre Państwa Członkowskie napotkają w związku z powoływaniem zespołów degustatorów, należy zezwolić na korzystanie z zespołów innych Państw Członkowskich; w celu zapewnienia, że system opłat stosowanych w odniesieniu do przywozu wytłoczyn z oliwek funkcjonuje w sposób prawidłowy, należy wprowadzić jednolitą metodę oznaczania zawartości oleju w tych produktach; aby nie zakłócać handlu, należy ustanowić przepis dla oleju zapakowanego przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia, który ma być zbyty w określonym czasie; konieczne jest uchylenie rozporządzenia Komisji (EWG) nr 1058/77 ( 3 ), ostatnio zmienionego rozporządzeniem (EWG) nr 1858/88 ( 4 ); Komitet Zarządzający ds. Olejów i Tłuszczów nie wydał opinii w terminie ustalonym przez przewodniczącego, PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:







▼M20

Artykuł 1

1. Oleje, których właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 1 i 2 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. a) i b) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawane są za oliwę z oliwek pierwszego tłoczenia.

2. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 3 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 1 lit. c) Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek typu lampante.

3. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 4 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 2 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z oliwek.

4. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 5 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 3 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z oliwek złożoną z rafinowanej oliwy z oliwek.

5. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 6 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 4 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za surową oliwę z wytłoczyn oliwek.

6. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 7 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 5 rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za rafinowaną oliwę z wytłoczyn oliwek.

7. Olej, którego właściwości pokrywają się z właściwościami określonymi w pkt 8 załącznika I do niniejszego rozporządzenia, w rozumieniu pkt 6 Załącznika do rozporządzenia nr 136/66/EWG, uznawany jest za oliwę z wytłoczyn oliwek.

▼B

Artykuł 2

1. Właściwości olejów wymienione w załączniku I oznacza się określonymi poniżej metodami:

— metoda przedstawiona w załączniku II do oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych wyrażonych jako procentowa część kwasu oleinowego,

— metoda przedstawiona w załączniku III do oznaczania wskaźnika nadtlenku,

▼M19

— for determination of the wax content, the method given in Annex IV,

▼B

— metoda przedstawiona w załączniku V do oznaczania zawartości sterolu,

— metoda przedstawiona w załączniku VI do oznaczania erytrodiolu i uvaolu,

— metoda przedstawiona w załączniku VII do oznaczania nasyconych kwasów tłuszczowych w pozycji 2 triglicerynianu,

▼M20 —————

▼B

— metoda przedstawiona w załącznik IX do przeprowadzania analizy spektrofotometrycznej,

— metoda przedstawiona w załączniku X A i X B do oznaczania składu kwasu tłuszczowego,

— metoda przedstawiona w załączniku XI do oznaczania lotnych rozpuszczalników fluorowcowanych,

— metoda przedstawiona w załączniku XII do oznaczania właściwości organoleptycznych oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia,

▼M20 —————

▼M11

— metoda przedstawiona w zał. XVII do oznaczenia stigmastadienów,

▼M13

— for determining the content of triglycerides with ECN42, the method set out in Annex XVIII,

▼M19

— for determination of the aliphatic alcohol content, the method given in Annex XIX.

▼M19

2. Verification by national authorities or their representatives of the organoleptic characteristics of virgin oils shall be effected by tasting panels approved by the Member States.

The organoleptic characteristics of an oil as referred to in the first subparagraph shall be deemed consonant with the category declared if a panel approved by the Member State confirms the grading.

Should the panel not confirm the category declared as regards the organoleptic characteristics, at the interested party's request the national authorities or their representatives shall have two counter-assessments carried out by other approved panels, at least one by a panel approved by the producer Member State concerned. The characteristics concerned shall be deemed consonant with the characteristics declared if at least two of the counter-assessments confirm the declared grade. If that is not the case, the interested party shall be responsible for the cost of the counter-assessments.

▼M17

3. When the national authorities or their representatives verify the characteristics of the oil as provided for in paragraph 1, samples shall be taken in accordance with international standards EN ISO 661 on the preparation of test samples and EN ISO 5555 on sampling. However, notwithstanding point 6.8 of standard EN ISO 5555, in the case of batches of such oils in immediate packaging not exceeding 100 litres, the sample shall be taken in accordance with Annex Ia to this Regulation.

▼M19

Without prejudice to standard EN ISO 5555 and Chapter 6 of standard EN ISO 661, the samples taken shall be put in a dark place away from strong heat as quickly as possible and sent to the laboratory for analysis no later than:

— the tenth working day after they are taken, during the period from October to May, and

— the fifth working day after they are taken, during the period from June to September.

▼M17

4. ►M20 Do celów sprawdzenia przewidzianego w ust. 3, analizy określone w załącznikach II, III, IX, X i XII oraz, jeżeli ma zastosowanie, jakakolwiek analiza porównawcza wymagana na mocy prawa krajowego, zostają przeprowadzone przed datą ważności. Jeżeli pobieranie próbek dokonane jest więcej niż cztery miesiące przed datą ważności, analizy zostają przeprowadzone najpóźniej cztery miesiące po pobraniu próbek. Żaden termin nie ma zastosowania do innych analiz przewidzianych w tym rozporządzeniu. ◄

Unless the sample was taken less than one month before the minimum durability date, if the results of the analyses do not match the characteristics of the category of olive oil or olive-residue oil declared, the party concerned shall be notified no later than one month before the end of the period laid down in the first subparagraph.

▼M19

5. For the purpose of determining the characteristics of olive oils by the methods provided for in paragraph 1, the analysis results shall be directly compared with the limits laid down in this Regulation.

▼M20

Artykuł 2a

Organy krajowe lub ich przedstawiciele mogą sprawdzić, czy próbka jest zgodna ze zgłoszoną kategorią:

a) bądź realizując, w jakimkolwiek celu, analizy przewidziane w załączniku I;

b) bądź według kolejności określonej w załączniku Ib w sprawie schematu decyzyjnego aż do osiągnięcia jednej z decyzji wymienionych w niniejszym schemacie decyzyjnym.

▼M19 —————

▼M5

Artykuł ►M19 3 ◄

Jeżeli stwierdzono, że cechy organoleptyczne oliwy nie odpowiadają jej opisowi, zainteresowane Państwo Członkowskie zastosuje, bez uszczerbku dla wszelkich innych kar, administracyjne kary finansowe, które zostaną określone w świetle tego, jak poważna jest wykryta nieprawidłowość.

Podczas oceny nieprawidłowości zwraca się w szczególności uwagę na zmiany naturalne właściwości oliwy przechowywanej w normalnych warunkach.

Na początku każdego półrocza Państwa Członkowskie informują Komisję o liczbie i rodzaju wykrytych nieprawidłowości oraz karach zastosowanych w poprzednim półroczu.

▼M5

Artykuł 4

▼M19

1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.

The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:

— the requirements of Annex XII.4 are met,

— the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,

— continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.

Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph.

▼M5

2. Jeżeli Państwa Członkowskie napotykają trudności w utworzeniu na swoim terytorium zespołów degustatorów, mogą wezwać zespół degustatorów zatwierdzony w innym Państwie Członkowskim.

3. Każde Państwo Członkowskie sporządza wykaz zespołów degustatorów utworzonych przez organizacje zawodowe lub międzybranżowe zgodnie z warunkami ustanowionymi w ust. 1 i zapewnia przestrzeganie tych warunków.

▼M19 —————

▼B

Artykuł 6

1. Zawartość oleju w makuchu i innych wytłokach powstających przy ekstrakcji oliwy z oliwek (kody CN 2306 90 11 i 2306 90 19) oznaczane są metodą przedstawioną w załączniku XV.

2. Zawartość oleju, określona w ust. 1, wyrażana jest jako procent masy oleju w stosunku do masy suchej substancji.

▼M20

Artykuł 7

Przepisy wspólnotowe dotyczące zawartości zanieczyszczeń stosuje się.

W odniesieniu do rozpuszczalników chlorowcowanych limity dla wszystkich kategorii oliwy z oliwek są następujące:

— maksymalna zawartość wykrytych rozpuszczalników chlorowcowanych: 0,1 mg/kg,

— całkowita maksymalna zawartość wykrytych rozpuszczalników chlorowcowanych: 0,2 mg/kg.

▼B

Artykuł 8

1. Państwa Członkowskie powiadamiają Komisję o środkach podjętych w celu wprowadzenia w życie niniejszego rozporządzenia.

2. Państwa Członkowskie przesyłają Komisji na początku każdego półrocza oświadczenie o danych analitycznych dotyczących badań przeprowadzonych w ciągu poprzedniego półrocza.

Wyniki analizowane są przez Komitet Zarządzający ds. Olejów i Tłuszczów zgodnie z procedurą ustaloną w art. 39 rozporządzenia nr 136/66/EWG.

Artykuł 9

Niniejszym rozporządzenie (EWG) nr 1058/77 traci moc.

Artykuł 10

1. Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie trzeciego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Jednakże metodę określoną w załączniku XII stosuje się od ►M1 dnia 1 listopada 1992 r. ◄ , z wyjątkiem działań odnoszących się do systemu interwencyjnego.

▼M5

Metody tej nie stosuje się do oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia przygotowanej na rynek przed dniem 1 listopada 1992 r.

▼B

2. Niniejsze rozporządzenie nie stosuje się do oliwy z oliwek i oleju z wytłoczyn z oliwek pakowanych przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia oraz wprowadzonych do obrotu do dnia 31 października 1992 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Państwach Członkowskich.









ZAŁĄCZNIK I

Streszczenie







ZAŁĄCZNIK I: Właściwości oliwy z oliwek ▼M17 ZAŁĄCZNIK Ia: Pobieranie próbek oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek dostarczonych w bezpośrednim opakowaniu nieprzekraczającym 100 litrów ▼M20 ZAŁĄCZNIK Ib: Schemat decyzyjny ▼B ZAŁĄCZNIK II: Oznaczanie wolnych kwasów tłuszczowych ZAŁĄCZNIK III: Oznaczanie liczby nadtlenkowej ZAŁĄCZNIK IV: ►M6 Określanie zawartości wosku przez chromatografię gazową/cieczową z użyciem kolumny kapilarnej ◄ ZAŁĄCZNIK V: Oznaczanie składu i zawartości steroli metodą kapilarnej chromatografii gazowej ZAŁĄCZNIK VI: Oznaczanie erytrodiolu i uvaolu ZAŁĄCZNIK VII: Oznaczanie nasyconych kwasów tłuszczowych w pozycji 2 triglicerydu ▼M20 ————— ▼B ZAŁĄCZNIK IX: Badanie spektrofotometryczne w ultrafiolecie ZAŁĄCZNIK X A: Analiza metodą chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych Annex X B: Preparation of the fatty acid methyl esters from olive oil and olive-pomace oil ZAŁĄCZNIK XI: Oznaczanie lotnych fluorowcowanych rozpuszczalników oliwy z oliwek Annex XII: Organoleptic assessment of virgin olive oils ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ZAŁĄCZNIK XV: Zawartość oleju w pozostałości z oliwek ZAŁĄCZNIK XVI: Oznaczenie liczby jodowej ▼M11 ZAŁĄCZNIK XVII: Oznaczanie stigmastadienów w olejach roślinnych ▼M13 ANNEX XVIII: Method for determining the content of triglycerides with ECN ▼M19 ANNEX XIX: Method for determining aliphatic alcohol content

▼M20









ZAŁĄCZNIK I

WŁAŚCIWOŚCI OLIWY Z OLIWEK







Kategoria Kwasowość (%) (*) Liczba nadtlenkowa mEq O2/kg (*) Woski mg/kg (**) Nasycone kwasy w pozycji 2 triglicerydu (%) Stigmastadienymg/kg (1) Różnica między HPLC ECN42 a teoretycz- nym ECN42 K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Ocena organolep- tyczna Mediana błędów (Md) (*) Ocena organolep- tyczna Mediana owocowości (Mf) (*) 1. Oliwa z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 1,5 ≤ 0,15 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 2. Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 1,5 ≤ 0,15 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md≤ 2,5 Mf > 0 3. Oliwa z oliwek typu lampante > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 1,5 ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 2,5 (2) — 4. Rafinowana oliwa z oliwek ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 1,8 — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 < 0,16 — — 5. Oliwa z oliwek złożona z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 1,8 — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — 6. Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek — — > 350 (4) ≤ 2,2 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 2,2 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 2,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — (1) Suma izomerów, które mogłyby (lub nie mogłyby) być oddzielone kolumną kapilarną. (2) Lub jeżeli mediana błędów jest niższa niż lub równa 2,5, a mediana owocowości wynosi 0. (3) Oliwa z zawartością wosków między 300 mg/kg a 350 mg/kg uznawana jest jako oliwa lampante, jeżeli całkowita zawartość alkoholi alifatycznych jest niższa lub równa 350 mg/kg lub jeżeli zawartość erytrodiolu i uvaolu jest niższa lub równa 3,5 %. (4) Oliwa z zawartością wosków między 300 mg/kg a 350 mg/kg uznawana jest jako surowa oliwa z wytłoczyn oliwek, jeżeli całkowita zawartość alkoholi alifatycznych wynosi powyżej 350 mg/kg i jeżeli zawartość erytrodiolu and uvaolu jest większa niż 3,5 %.







Kategoria (1)Zawartość kwasów tłuszczowych Suma izomerów transoleinowych (%) Suma izomerów translinolowych i translinolenowych (%) Skład steroli Łącznie sterole (mg/kg) Erytrodiol i uvaol (%) ** Mirystynowy (%) Linolenowy (%) Arachidowy (%) Arachidynowy (%) Behenowy (%) Lignocerynowy (%) Cholesterol (%) Brassikasterol (%) Kampes-terol (%) Stigmas-terol (%) Beta-sitosterol (%) (2) Delta-7-Stigmasterol (%) 1. Oliwa z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Oliwa z oliwek typu lampante ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Rafinowana oliwa z oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Oliwa z oliwek złożona z rafinowanej oliwy z oliwek oraz oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Surowa oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2500 > 4,5 (4) 7. Rafinowana oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Oliwa z wytłoczyn oliwek ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 <Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 (1) Zawartość innych kwasów tłuszczowych (%): palmitynowy: 7,5 do 20,0; palmitolejowy: 0,3 do 3,5; heptadekanowy: ≤ 0,3; heptadekanowy: ≤ 0,3; stearynowy: 0,5 do 5,0; olejowy: 55,0 do 83,0; linolowy: 3,5 do 21,0. (2) Suma: Delta-5-23-Stigmastadienol + Cholerosterol + Beta-Sitosterol + Sitostanol + Delta-5-Avenasterol + Delta-5-24-Stigmastadienol. (3) Oliwa z zawartością wosków między 300 mg/kg a 350 mg/kg uznawana jest jako oliwa lampante, jeżeli całkowita zawartość alkoholi alifatycznych jest niższa lub równa 350 mg/kg lub jeżeli zawartość erytrodiolu i uvaolu jest niższa lub równa 3,5 %. (4) Oliwa z zawartością wosków między 300 mg/kg a 350 mg/kg uznawana jest jako surowa oliwa z wytłoczyn oliwek jeżeli całkowita zawartość alkoholi alifatycznych wynosi powyżej 350 mg/kg i jeżeli zawartość erytrodiolu i uvaolu jest większa niż 3,5 %. Uwagi: a) Wyniki analiz muszą być wyrażone wskazując tą samą liczbę miejsc dziesiętnych jak te, które są użyte dla każdej charakterystyki. Ostatnia cyfra musi być powiększona o jeden, jeżeli następna cyfra jest niż 4. b) Wystarczy, że jedna właściwość nie jest zgodna z wartościami wskazanymi, a kategoria oliwy może być zmieniona lub zgłoszona jako niezgodna w odniesieniu do czystości do celów niniejszego rozporządzenia. c) Jeżeli właściwość oznaczona jest gwiazdką *, odnosząc się do jakości oliwy, oznacza to, że: — dla oliwy lampante, odpowiednie limity jej dotyczące nie muszą być równocześnie przestrzegane — dla oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia, jeżeli co najmniej jeden z tych limitów różni się od wartości wskazanych, kategoria oliwy będzie zmieniona, chociaż będą one klasyfikowane w jednej z kategorii oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia. d) Jeżeli właściwość oznaczona jest dwiema gwiazdkami ** oznacza to, że dla wszystkich typów oliwy z wytłoczyn oliwek, odpowiednie limity jej dotyczące mogą nie być równocześnie przestrzegane.









ZAŁĄCZNIK Ia

Pobieranie próbek oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek dostarczonych w bezpośrednim opakowaniu nieprzekraczającym 100 litrów

Tę metodę pobierania próbek stosuje się do dostaw oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek nieprzekraczającej 125 000 litrów, włożonej do bezpośrednich opakowań nieprzekraczających 100 litrów.

Jeżeli dostawa przekracza 125 000 litrów, zostaje ona podzielona na partie równe 125 000 litrom lub poniżej. Jeżeli dostawa jest mniejsza niż 125 000 litrów, stanowi ona jedną partię. Metodę stosuje się więc do każdej partii.

Minimalna liczba podstawowych próbek ustalona jest według wielkości partii zgodnie z tabelą wymienioną w pkt 1.

Wielkość podstawowej próbki ustalona jest na podstawie pojemności bezpośredniego opakowania, zgodnie z tabelą wymienioną w pkt 2.1.

Przez „dostawę”, „podstawową próbkę” i „próbkę laboratoryjną” rozumie się definicje określone w normach EN ISO 5555.

Przez „partię” rozumie się zbiór jednostek sprzedaży, które są produkowane, wytwarzane i pakowane w okolicznościach takich, że oliwa zawarta w każdej jednostce sprzedaży uznawana jest jako jednorodna dla wszystkich właściwości analitycznych.

1. LICZBA PODSTAWOWYCH PRÓBEK

Minimalna liczba podstawowych próbek będzie ustalona według wielkości partii zgodnie z następującą tabelą:







Wielkość partii (w litrach) mniej niż Minimalna liczba podstawowych próbek 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

Bezpośrednie opakowania wybrane aby utworzyć podstawową próbkę muszą przylegać do każdej innej w partii.

W przypadku wątpliwości, Państwa Członkowskie zwiększają liczbę podstawowych próbek.

2. ZAWARTOŚĆ PODSTAWOWYCH PRÓBEK

2.1 Każda podstawowa próbka składa się z:



Jeżeli opakowanie bezpośrednie ma pojemność Podstawowa próbka składa się z oliwy z: a) 5 litrów lub więcej a) 3 bezpośrednich opakowań b) 3 litry lub więcej, ale nie mniej niż 5 litrów b) 3 bezpośrednich opakowań c) 2 litry lub więcej, ale nie mniej niż 3 litry c) 3 bezpośrednich opakowań d) 1 litr lub więcej, ale nie mniej niż 2 litry d) 6 bezpośrednich opakowań e) 0,75 litra lub więcej, ale nie mniej niż 1 litr e) 6 bezpośrednich opakowań f) mniej niż 0,75 litra f) trzy razy oliwa z minimalnej ilości opakowań, których całkowita pojemność przekracza 1,5 litra

2.2 Podstawowe próbki należy trzymać w opakowaniach bezpośrednich do czasu analiz. Oliwa z próbki podstawowej jest następnie, jeżeli jest to właściwe, podzielona na trzy próbki laboratoryjne w celu przeprowadzenia: a) analiz określonych w załączniku II, III, IX i X, b) analiz określonych w załączniku XII, c) innych analiz.

2.3 Opakowania składające się z próbki podstawowej podzielone są zgodnie z procedurami kontroli przewidzianymi przez prawo krajowe.

3. ANALIZY I WYNIKI

a) Każda z podstawowych próbek określonych w pkt 1 zostaje podzielona na próbki laboratoryjne, zgodnie z pkt 2.5 normy EN ISO 5555 i podlega następującym analizom: — oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych, określonych w art. 2 ust. 1 tiret pierwsze, — oznaczania liczby nadtlenkowej, określonej w art. 2 ust. 1 tiret drugie, — analizie spektrofotometrycznej, określonej w art. 2 ust. 1 tiret ósme, — oznaczania składu kwasu tłuszczowego, określonego w art. 2 ust. 1 tiret dziewiąte.

b) Jeżeli wyniki analiz określonych w lit. a) dla przynajmniej jednej z próbek podstawowych pobranych z tej samej partii nie są zgodne z właściwościami kategorii oliwy zgłoszonej, całość danej partii jest zgłoszona jako niezgodna. Jeżeli wyniki analiz określonych w lit. a) dla każdej próbki podstawowej pobranej z tej same partii nie są jednorodne, biorąc pod uwagę właściwości powtarzalności danych metod, całość partii zostaje zgłoszona jako niejednorodna, a każda próbka podstawowa poddana jest innej wymaganej analizie. Inaczej, jedna próbka podstawowa z tej partii poddana jest innej wymaganej analizie.

c) Jeżeli jeden z wyników analiz określonych w lit. b) akapit drugi nie jest zgodny z właściwościami kategorii oliwy zgłoszonej, całość danej partii zostaje zgłoszona jako niezgodna. Jeżeli wszystkie wyniki analiz określonych w lit. b) akapit drugi są zgodne z właściwościami kategorii oliwy zgłoszonej, całość partii zostaje zgłoszona jako zgodna.

▼M20









ZAŁĄCZNIK Ib

SCHEMAT DECYZYJNY DLA SPRAWDZENIA ZGODNOŚCI PRÓBKI OLIWY Z OLIWEK Z KATEGORIĄ ZGŁOSZONĄ

Analiza zgodności oliwy z oliwek lub oliwy z wytłoczyn oliwek z kategorią zgłoszoną może być przeprowadzona:

a) bądź przez przeprowadzenie w jakiejkolwiek kolejności analiz przewidzianych do celów sprawdzenia zgodności z właściwościami określonymi w załączniku I; lub

b) przez przeprowadzenie w kolejności wskazanej w schemacie decyzyjnym analiz tam określonych, aż do osiągnięcia jednej z decyzji wymienionych w niniejszym schemacie decyzyjnym.

Analizy odnoszące się do zanieczyszczeń, niezbędne do sprawdzenia zgodności z normami Wspólnoty Europejskiej, należy przeprowadzić oddzielnie.

Schemat decyzyjny stosuje się do wszystkich kategorii oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek. Składa się on z tabeli numerowanych od 1 do 11, z których nalezy korzystać, biorąc pod uwagę kategorię oliwy zgłoszonej w kolejności wymienionej w ogólnej tabeli.

Klucz od tabeli ogólnej do tabeli 11:

— podwójna linia (=) wskazuje ścieżkę, według której należy postępować w przypadku zgodności (odpowiedź pozytywna) z kryterium określonym w poprzednim polu. Linia kropkowana (…) wskazuje alternatywną ścieżkę, według której należy postępować w przypadku niezgodności,

— nagłówki pól znajdujących się w tabelach 1–11 odnoszą się do analiz przewidzianych w niniejszym rozporządzeniu na podstawie tabeli równoważności określonej w dodatku 1 do niniejszego załącznika,

— litery w nawiasach znajdujące się okręgach decyzji negatywnej w tabelach 1–11 odpowiadają indykatywnym informacjom wymienionym w dodatku 2 do niniejszego załącznika. Litery nie pociągają za sobą obowiązku dokonania analiz lub prawdziwości wymienionych założeń.









Dodatek 1

Tabela równoważności między załącznikami do niniejszego rozporządzenia a analizami określonymi w schemacie decyzyjnym







- Kwasowość załącznik II Oznaczanie wolnych kwasów tłuszczowych - Liczba nadtlenkowa załącznik III Oznaczanie liczby nadtlenkowej - Spektrometria UV załącznik IX Analiza spektrofotometryczna - Ocena organoleptyczna załącznik XII Ocena organoleptyczna oliwy z oliwek pierwszego tłoczenia - 3,5-stigmastadieny załącznik XVII Metoda oznaczania stigmastadienów w olejach roślinnych - Trans izomery kwasów tłuszczowych załącznik Xa i Analiza metodą kapilarnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych załącznik Xb Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych - Zawartość kwasów tłuszczowych załącznik Xa i Analiza metodą kapilarnej chromatografii gazowej estrów metylowych kwasów tłuszczowych załącznik Xb Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych - AECN42 załącznik XVIII Oznaczanie składu triglicerydów z ECN42 (różnica między danymi HPLC a zawartością teoretyczną) - Skład i całkowita zawartość steroli załącznik V Oznaczanie składu i zawartości steroli metodą kapilarnej chromatografii gazowej - Erytrodiol i uvaol załącznik VI Oznaczanie erytrodiolu i uvaolu - Woski załącznik IV Oznaczanie zawartości wosku metodą kapilarnej chromatografii gazowej - Alkohole alifatyczne załącznik XIX Oznaczanie zawartości alkoholi alifatycznych metodą kapilarnej chromatografii gazowej - Nasycone kwasy tłuszczowe w pozycji 2 załącznik VII Oznaczanie nasyconych kwasów tłuszczowych w pozycji 2 triglicerydu









Dodatek 2

Tabela 1

a) Patrz oliwa z pierwszego tłoczenia lub lampante (kryteria jakości tabela 2 lub kryteria jakości i czystości tabela 4)

b) Patrz oliwa z oliwek lampante (kryteria jakości i czystości tabela 4)

Tabela 2

a) Patrz oliwa z oliwek lampante (kryteria jakości i czystości tabela 4)

b) Patrz oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia (kryteria jakości tabela 1)

Tabela 3

a) Obecność oleju rafinowanego (oliwa lub inne)

b) Obecność oliwy z wytłoczyn oliwek

Tabela 4

a) Patrz oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia extra i oliwa z oliwek pierwszego tłoczenia (kryteria jakości tabela 1 i tabela 2)

b) Obecność oleju rafinowanego (oliwa lub inne)

c) Obecność oliwy z wytłoczyn oliwek

d) Obecność olejów estryfikowanych

Tabela 7

a) Obecność oliwy z wytłoczyn oliwek

b) Obecność olejów estryfikowanych

Tabela 8

a) Obecność oleju rafinowanego (oliwa lub inne)

b) Patrz oliwa z oliwek lampante (kryteria jakości i czystości tabela 4)

c) Obecność olejów estryfikowanych

Tabela 11

a) Obecność olejów estryfikowanych estryfikowanych

▼B









ZAŁĄCZNIK II

OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH

1. OZNACZANIE KWASOWOŚCI

Oznaczenie wolnych kwasów tłuszczowych w oliwie z oliwek. Zawartość wolnych kwasów tłuszczowych wyrażona jest w postaci kwasowości obliczonej metodami konwencjonalnymi.

1.1. Zasada

Próbkę rozpuszcza się w mieszaninie rozpuszczalników, a obecne w niej wolne kwasy tłuszczowe miareczkuje przy użyciu roztworu wodorotlenku potasu w etanolu.

1.2. Odczynniki

Wszystkie odczynniki powinny posiadać zatwierdzoną jakość kwalifikującą je do stosowania w laboratorium a woda stosowana powinna być destylowana lub o podobnym stopniu czystości.

1.2.1. Eter dietylowy; etanol 95 % (v/v), mieszanina jednakowych objętościowo części. Uwaga: Eter dietylowy jest substancją bardzo łatwo palną i może tworzyć nadtlenki o właściwościach wybuchowych. Stosując tę substancję należy zachować szczególną ostrożność. Zobojętnić dokładnie w momencie stosowania za pomocą roztworu wodorotlenku potasowego (1.2.2) z dodatkiem 0,3 ml roztworu fenoloftaleiny (1.2.3) na 100 ml mieszaniny. Uwaga: Jeżeli zastosowanie tlenku etylenowego nie jest możliwe, można użyć mieszaniny rozpuszczalników zawierającej etanol i toluen. W razie potrzeby etanol można zastąpić propanolem-2.

1.2.2. Wodorotlenek potasu, miareczkowany roztwór etanolowy, c(KOH) o stężeniu 0,1 mol/l lub w razie potrzeby c(KOH) o stężeniu około 0,5 mol/l. Konieczna jest znajomość dokładnego stężenia roztworu wodorotlenku potasu w etanolu, które należy sprawdzić bezpośrednio przed użyciem. Stosować roztwór przygotowany co najmniej pięć dni przed użyciem i zdekantowany do butelki z brązowego szkła z gumowym korkiem. Roztwór powinien być bezbarwny lub mieć barwę słomkową. Uwaga: Stabilny bezbarwny roztwór wodorotlenku potasu można przygotować w następujący sposób: doprowadzić do wrzenia 1 000 ml etanolu z 8 g wodorotlenku potasu i 0,5 g opiłków aluminiowych i nadal gotować w układzie zwrotnym skroplin przez godzinę. Następnie poddać bezzwłocznie destylacji. Rozpuścić w destylacie wymaganą ilość wodorotlenku potasu. Odstawić na kilka dni, a następnie zdekantować przejrzystą wartwę cieczy znad osadu węglanu potasu. Roztwór można także przygotować z pominięciem procesu destylacji w następujący sposób: do 1 000 ml etanolu dodać 4 ml butylanu glinu i odstawić mieszaninę na kilka dni. Zdekantować sklarowaną nad osadem ciecz i rozpuścić w niej wymaganą ilość wodorotlenku potasu. Roztwór jest gotowy do użycia.

1.2.3. Fenoloftaleina, roztwór 10g/l w 95 lub 96 % etanolu (v/v) lub błękit zasadowy (w przypadku silnie zabarwionych tłuszczów), roztwór 20 g/l 95 lub 9 % etanolu (v/v).

1.3. Aparatura

Normalnie stosowany sprzęt laboratoryjny, w skład którego wchodzą:

1.3.1. waga analityczna.

1.3.2. kolba stożkowa (Erlenmeyera) o pojemności 250 ml.

1.3.3. biureta na 10 ml skalowana co 0,05 ml.

1.4. Procedura

1.4.1. Przygotowanie próbki do badania (Badanie przeprowadzać na przefiltrowanej próbce. W przypadku, gdy łączna zawartość wilgoci i zanieczyszczeń jest mniejsza niż 1 %, wykorzystać próbkę bez dalszej obróbki; gdy zawartość ta przekracza 1 %, próbka musi być przefiltrowana.)

1.4.2. Pobieranie próbki W zależności od zakładanej liczby kwasowej pobierać próbkę według poniższej tabeli:



Przewidywana liczba kwasowa Masa próbki g Dokładność ważenia g < 1 20 0,05 1 do 4 10 0,02 4 do 15 2,5 0,01 15 do 75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 Próbkę należy ważyć w kolbie stożkowej (1.3.2)

1.4.3. Oznaczenie Rozpuścić próbkę (1.4.2) w 50 do 150 ml poprzednio zobojętnionej mieszaniny eteru dietylowego i etanolu (1.2.1). Miareczkować mieszając 0,1 M roztworem wodorotlenku potasu (1.2.2) (patrz Uwaga 2) dopóki nie nastąpi wskaźnikowa zmiana (różowa barwa fenoloftaleiny utrzymuje się przez 10 sekund). Uwaga 1: miareczkowany roztwór wodorotlenku potasu w etanolu (1.2.2) można zastąpić wodnym roztworem wodorotlenku potasu lub sodu, pod warunkiem, że ilość dodanej wody nie powoduje rozdzielnia faz. Uwaga 2: jeżeli wymagana ilość 0,1-molowego wodorotlenku potasu przekracza 10 ml, należy zastosować roztwór 0,5 M Uwaga 3: jeżeli w trakcie miareczkowania rozwór zaczyna mętnieć należy dodać dostateczną ilość rozpuszczalników (1.2.1), aby uzyskać przejrzysty roztwór.

1.5. Kwasowość: wyrażona w postaci procentowej części kwasu oleinowego

Kwasowość wyrażona jako procentowa część w stosunku do masy wynosi:

gdzie:

V = objętość użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu w mililitrach;

c = dokładne stężenie molowe użytego do miareczkowania rotworu wodorotlenku potasu;

M = molowa masa w gramach na mol kwasu użytego do podania wyniku (= 282);

m = masa próbki w gramach.

Jako wynik należy przyjąć średnią arytmetyczną ►M6 dwóch obliczeń ◄ .









ZAŁĄCZNIK III

OZNACZENIE LICZBY NADTLENKOWEJ

1. ZAKRES

Niniejsza norma zawiera opis metody oznaczania liczby nadtlenkowej olejów i tłuszczów.

2. ZAKRES ZASTOSOWANIA

Niniejsza norma stosuje się w odniesieniu do olejów i tłuszczów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego.

3. DEFINICJA

Liczba nadtlenkowa jest to wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram zawartość w próbce tych substancji, które utleniają jodek potasu w opisanych warunkach technologicznych.

4. ZASADA

Poddanie Badanej części próbki, w roztworze kwasu octowego i chloroformu, działaniu roztworu jodku potasu. Miareczkowanie uwolnionego jodu znormalizowanym roztworem tiosiarczanu sodu.

5. APARATURA

W użytym sprzęcie nie mogą występować substancje redukujące lub utleniające.

Uwaga: Nie pokrywać tłuszczem powierzchni szlifowanych.

5.1. Łyżka szklana o pojemności 3 ml.

5.2. Kolby stożkowe ze szlifowanymi szyjkami i korkami o pojemności około 250 ml, wysuszone i napełnione czystym, obojętnym gazem (azotem lub najlepiej ditlenkiem węgla).

5.3. Biureta o pojemności 25 lub 50 ml wyskalowana co 0,1 ml.

6. ODCZYNNIKI

6.1 Chloroform, którego jakość spełnia wymogi stawiane odczynnikom laboratoryjnym, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przezeń silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

6.2. Kwas octowy lodowaty, którego jakość spełnia wymogi stawiane odczynnikom laboratoryjnym, pozbawiony tlenu poprzez przepuszczanie przezeń silnego strumienia czystego suchego gazu obojętnego.

6.3. Jodek potasu w postaci nasyconego roztworu wodnego, świeżo przygotowany, niezawierający jodu i jodanów.

6.4. Tiosiarczan sodu, 0,01 lub 0,002 mol/l z dokładnie nastawionym mianem tuż przed użyciem.

6.5. Roztwór skrobi, rozproszenie wodne o stężeniu 10 g/l, świeżo przygotowany z naturalnej rozpuszczalnej skrobi.

7. PRÓBKA

Należy zadbać, aby próbka była pobrana i składowana w ciemnym i chłodnym miejscu w całkowicie napełnionych szklanych pojemnikach, zamkniętych hermetycznie zatyczkami szlifowanymi szklanymi lub z korka.

8. PROCEDURA

Badanie wykonuje się w rozproszonym świetle dziennym lub w świetle sztucznym. Odważyć szklaną łyżką (5.1) lub, w przypadku jej braku, w kolbie (5.2) z dokładnością do 0,001 g masę próbki według poniższej tabeli stosownie do oczekiwanej liczby nadtlenkowej:







Przewidywana liczba nadtlenkowa Ciężar próbki częściowej 0 do 12 5,0 do 2,0 12 do 20 2,0 do 1,2 20 do 30 1,2 do 0,8 30 do 50 0,8 do 0,5 50 do 90 0,5 do 0,3

Wyjąć korek z kolby (5.2) i wprowadzić do niej szklaną łyżkę z badaną częścią próbki. Dodać 10 ml chloroformu (6.1). Rozpuścić szybko badaną próbkę mieszając. Dodać 15 ml kwasu octowego (6.2), a następnie 1 ml roztworu jodku potasu (6.3). Szybko zakorkować kolbę, wstrząsać przez jedną minutę i pozostawić dokładnie na pięć minut w nieoświetlonym miejscu o temperaturze od 15 do 25 °C.

Dodać około 75 ml wody destylowanej. Miareczkować uwolniony jod roztworem tiosiarczanu sodu (6.4) (roztworem 0,002 mol/l dla przewidywanych wartości poniżej 12 i roztworem 0,01 mol/l dla przewidywanych wartości powyżej 12) intensywnie wstrząsając, stosując roztwór skrobi jako wskaźnik (6.5).

Przeprowadzić dwa oznaczenia tej samej próbki.

Jednocześnie przeprowadzić ślepą próbę. Jeżeli wynik ślepej próby przekracza 0,05 ml 0,01 mol/l roztworu tiosiarczanu sodu (6.4) należy wymienić zanieczyszczone odczynniki.

9. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

LICZBA NADTLenkowa (LN) wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram określana jest wzorem:

gdzie:

V = ilość ml nastawionego roztworu tiosiarczanu (6.4) użytego w badaniu, skorygowana w celu uwzględnienia ślepej próby

T = dokładna molarność użytego roztworu tiosiarczanu sodu (6.4)

m = masa badanej części próbki w gramach

Jako wynik przyjąć średnią arytmetyczną dwóch oznaczeń.

▼M6









ZAŁĄCZNIK IV

OKREŚLANIE ZAWARTOŚCI WOSKU PRZEZ CHROMATOGRAFIĘ GAZOWO - CIECZOWĄ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ

1. ZAKRES

Niniejsza metoda opisuje procedurę określania zawartości wosku w niektórych tłuszczach i olejach w warunkach testowych.

Może być ona stosowana w szczególności do rozróżniania między oliwą z oliwek uzyskaną z tłoczenia i oliwą z ekstrakcji (oliwa z wytłoczyn oliwek).

2. ZASADA

Dodanie odpowiedniego wzorca wewnętrznego do tłuszczu lub oleju, następnie frakcjonowanie z wykorzystaniem metody chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym. Odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą chromatografii gazowo - cieczowej z użyciem kolumny kapilarnej.

3. APARATURA

3.1. Kolba Erlenmeyera 25-ml.

3.2. Szklana kolumna do chromatografii, średnica wewnętrzna 15 mm i długość 30–40 cm.

3.3. Odpowiedni chromatograf gazowo - cieczowy z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z: 3.3.1 Kontrolowanego termostatem piecyka do kolumn, zdolnego utrzymać pożądaną temperaturę z dokładnością do 1 oC. 3.3.2. Zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny. 3.3.3. Detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera - wzmacniacza. 3.3.4. Rejestrującego integratora współpracującego z konwerterem-wzmacniaczem (3.3.3.), o szybkości odpowiedzi poniżej 1 sekundy, z różną prędkością papieru. 3.3.5. Kolumny kapilarnej, ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 10–15 m i średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokrytej od środka płynem SE-52 lub SE-54 lub ich odpowiednikami, dla uzyskania jednolitej grubość 0,10–0,30 μm.

3.4. Mikrostrzykawki umożliwiającej wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μm, wyposażonej w igłę o utwardzonej powierzchni.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Żel krzemionkowy, sito 70/230, art. 7754 Merck. Umieścić żel w piecyku w temperaturze 500 oC na cztery godziny. Schłodzić, następnie dodać 2 % wody utlenionej. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny. Trzymać w zaciemnionym miejscu, przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.

4.2. n-heksan, do chromatografii.

4.3. Eter etylowy, do chromatografii.

4.4. n-heptan, do chromatografii.

4.5. Mianowany roztwór arachidynianu laurylowego w heksanie (wzorzec wewnętrzny), w proporcjach 0,1 % (m/v).

4.6. Gaz nośny: wodór, czysty, do chromatografii gazowo - cieczowej.

4.7. Gazy pomocnicze: — wodór, czysty, do chromatografii gazowo - cieczowej, — powietrze, czyste, do chromatografii gazowo - cieczowej.

5. PROCEDURA

5.1. Oddzielenie frakcji wosku.

5.1.1 Przygotowanie kolumny chromatograficznej. Sporządzić zawiesinę 15 g uwodnionego żelu krzemionkowego w 2 % bezwodnym n-heksanie i wprowadzić do kolumny. Pozostawić do osadzenia. Następnie wytrącić osad przy użyciu wytrząsarki elektrycznej, tak aby pasmo chromatograficzne było bardziej jednolite. Przesączyć 30 ml n-heksanu, by usunąć wszelkie zanieczyszczenia.

5.1.2. Chromatografia kolumnowa Odważyć dokładnie 500 mg próbki do kolby 25-ml i dodać odpowiednią ilość wzorca wewnętrznego, w zależności od założonej zawartości wosku, tj. dodać 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek i 0,25–0,5 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek. Do próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1. dodać dwie porcje po 2-ml n-heksanu i tak przygotowaną próbkę przenieść do kolumny chromatograficznej. Wprowadzić próbkę tak, aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu. Następnie rozpocząć wymywanie chromatograficzne; pobrać 140 ml mieszaniny n-heksan/eter etylowy w proporcji 99:1, przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund (2,1 ml/min.). Osuszyć otrzymaną frakcję w obrotowym aparacie wyparnym aż do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usunąć ostatnie 2 lub 3 ml rozpuszczalnika przy pomocy słabego strumienia azotu, a następnie dodać 10 ml n-heptanu.

5.2. Analiza metodą chromatografii gazowo - cieczowej

5.2.1. Procedura wstępna, kondycjonowanie kolumny. 5.2.1.1. Umieścić kolumnę w chromatografie gazowo-cieczowym, łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Sprawdzić aparaturę do chromatografii gazowo - cieczowej (działanie pętli gazowych, wydajność detektora i przyrządu rejestrującego itp.). 5.2.1.2. Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowo-cieczowej. Stopniowo podgrzewać do temperatury przynajmniej o 20 oC wyższej od temperatury pracy (patrz: uwaga). Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej dwie godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (zadać natężenie przepływu gazu, płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego, ustawić temperaturę piecyka dla kolumny, ustawić detektor itd.). Rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość wymagana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików i linia ta powinna mieć pewne nachylenie. Ujemne nachylenie linii oznacza, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została prawidłowo kondycjonowana. Uwaga: Przez cały czas utrzymywać temperaturę kondycjonowania na poziomie co najmniej o 20 °C poniżej maksymalnej temperatury wyszczególnionej dla używanego eluentu.

5.2.2. Dobór warunków roboczych. 5.2.2.1. Warunki pracy są następujące: — temperatura kolumny: początkowa 80 oC, wzrastająca z prędkością 30 oC/min. do 120 oC, a następnie zaprogramowana na wzrost o 5 oC/min. do 340 oC, — temperatura detektora: 350 oC, — prędkość liniowa gazu nośnego: wodór, 20–35 cm/sek., — czułość urządzenia: 4–16 razy większa od minimalnego tłumienia, — czułość przyrządu rejestrującego: 1–2 mV, od dołu skali, — prędkość przesuwu papieru: 30 cm/godz., — porcja wstrzykiwana: 0,5–1 μl roztworu. Warunki te mogą być modyfikowane w taki sposób, by pasowały do charakterystyk kolumn i aparatów do chromatografii gazowo-cieczowej (tak, aby otrzymywane chromatogramy spełniały następujące wymagania: czas retencji wzorca wewnętrznego C32 musi wynosić 25 ± 2 minuty, a najbardziej reprezentacyjny pik dla wosków musi zawierać się między 60 a 100 %, od dołu skali). 5.2.2.2. Ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pola powierzchni rozpatrywanego piku.

5.2.3. Przeprowadzenie analizy 5.2.3.1. Pobrać 1 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki 10 μl; odciągnąć tłoczek aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do systemu iniekcji i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po około pięciu sekundach delikatnie wyciągnąć igłę. 5.2.3.2. Przeprowadzić rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków. Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania (5.2.1.2).

5.2.4. Identyfikacja pików Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach. Rysunek 1 przedstawia chromatogram wosku oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.

5.2.5. Analiza ilościowa 5.2.5.1. Przy pomocy integratora ustalić pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu i estrom alifatycznym od C40 do C46. 5.2.5.2. Ustalić zawartość wosków każdego z estrów, gdzie: Ax = pole pod pikiem dla każdego estru; As = pole pod pikiem odpowiadające arachidynianowi laurylowemu; ms = masa dodanego arachidynianu laurylowego w miligramach; m = masa badanej próbki pobranej, w gramach.

6. PREZENTACJA WYNIKÓW

Podać zawartość poszczególnych wosków oraz sumę tych wosków w mg/kg tłuszczu.









Określenie liniowej prędkości gazu

Wstrzyknąć 1–3 μl metanu (propanu) do aparatury do chromatografii gazowej/cieczowej, dostosowawszy ją uprzednio do normalnych warunków pracy. Zmierzyć czas przepływa gazu przez kolumnę, od momentu wstrzyknięcia próbki do pojawienia się piku (tM).

Prędkość liniową w cm/sek. wylicza się ze wzoru L/tM, gdzie L jest długością kolumny w cm, a tM jest czasem mierzonym w sekundach.

Rysunek 1: Chromatogram wosku dla oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.

▼B









ZAŁĄCZNIK V

OZNACZENIE SKADU I ZAWARTOŚCI STEROLI METODĄ KAPILARNEJ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1. ZAKRES

metoda opisuje sposoby oznaczania zawartości prostych i łącznych steroli w substancjach tłuszczowych.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

Substancja tluszczowa, do której został dodany β-cholesterol w charakterze wewnętrznego mianowanego roztworu, jest zmydlana przy użyciu roztworu wodorotlenku potasu w etanolu, następnie część nieulegająca zmydleniu jest ekstrahowana eterem dietylowym.

Frakcja sterolowa jest oddzielana od nieulegającego zmydleniu ekstraktu metodą chromatograficzną na podstawowej płytce z żelu krzemionkowego; sterole uzyskane z żelu krzemionkowego przekształcane są w trimetylsilyletery i analizowane w chromatografie gazowym z kolumną kapilarną.

3. APARATURA

3.1. Kolba o pojemności 250 ml wyposażona w chłodnicę zwrotną ze szlifowanymi końcówkami.

3.2. Rozdzielacz 500 ml.

3.3. Kolby o pojemności 250 ml.

3.4. Kompletny zestaw do chromatografii cienko-warstwowej łącznie z płytkami szklanymi 20 × 20 cm.

3.5. Źródło światła ultrafioletowego o częstotliwości 366 lub 244 nm.

3.6. Mikrostrzykawka o pojemności 100 i 500 ml.

3.7. Cylindryczny lejek do sączenia z porowatym filtrem G3 (wielkość porów 15 do 40 mm) o średnicy około 2 cm i głębokości 5 cm z końcówką przystosowaną do filtracji w próżni i końcówką z zewnętrznym szlifem 12/21.

3.8. Kolba o pojemności 50 ml z końcówką z wewnętrznym szlifem 12/21 do łączenia z lejkiem do sączenia (3.7).

3.9. Probówka ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml i szczelnym korkiem.

3.10. Chromatograf gazowy dostawany do współpracy z kolumną kapilarną wyposażony w system oddzielania składający się z: 3.10.1 komory termostatycznej dla kolumn w celu utrzymania wymaganej temperatury z dokładnością do 1 °C. 3.10.2. termostatycznego zespołu odparowującego z otworem wtryskowym ze szkła krzemowanego 3.10.3. Detektor jonizacyjny płomienia oraz wzmacniacza-konwertera 3.10.4. współpracującego ze wzmacniaczem-konwerterem (3.10.3) rejestratora całkującego, którego czas reakcji nie przekracza jednej sekundy, o zmiennej prędkości podawania papieru.

3.11. Kolumna kapilarna ze szkła lub topionej krzemionki o długości 20 do 30 m, o wewnętrznej średnicy 0,25 do 0,32 mm, całkowicie pokryta od wewnątrz warstwą płynu SE-52 lub SE-54 lub im podobną, o jednakowej grubości od 0,10 do 0,30 μm.

3.12. Mikrostrzykawka do chromatografii gazowej o pojemności 10 μl z hartowaną igłą.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Wodorotlenek potasu, w przybliżeniu roztwór 2 mol/l w etanolu: 130 g wodorotlenku potasu (o stężeniu co najmniej 85 %) rozpuszcza się z jednoczesnym schładzaniem w 200 ml destylowanej wody, a następnie uzupełnia etanolem do objętości jednego litra. Roztwór powinien być przechowywany w dobrze zakorkowanej butelce z ciemnego szkła.

4.2. Czysty laboratoryjny eter dietylowy.

4.3. Czysty laboratoryjny bezwodny siarczan sodu.

4.4. Płytki szklane pokryte żelem krzemionkowym, nie zawierającym wskaźnika fluorscencyjnego, o grubości 0,25 mm (dostępne w handlu w postaci gotowej do użytku)

4.5. Wodorotlenek potasu, roztwór 0,2 mol/l w etanolu; rozpuścić 13 g wodorotlenku potasu w 20 ml wody destylowanej uzupełnianych do 1 litra etanolem.

4.6. Benzen do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.7. Aceton do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.8. Heksan, do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.9. Eter dietylowy do chromatografii (patrz 5.2.2)

4.10. Chloform do chromatografii.

4.11. Roztwór chłodzący stosowany w chromatografii płytkowej: roztwór cholesterolu lub fitosterolu w chloroformie o stężeniu ►M6 2 % ◄ .

4.12 0,2 % roztwór 2,7-dichlorofluorosceiny w etanolu. Uzyskuje on nieco zasadowy charakter w wyniku dodania kilku kropel 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w alkoholu.

4.13. Bezwodnik piridyny do chromatografii.

4.14. Heksametyldizylazyna

4.15. Trimetylchlorosilan.

4.16. Roztwory eterów trimetylosilanowych steroli; należy je przygotowywać tuż przed użyciem ze steroli czystych lub mieszanek steroli, uzyskanych z zawierających je olejów.

4.17. 0,2 % roztwór (m/V) a-cholestanolu w chloroformie (wewnętrzny mianowany roztwór).

4.18. Gazy nośne: czysty wodór i hel do celów chromatografii gazowej.

4.19. Gazy pomocnicze: — czysty wodór do celów chromatografii gazowej, — powietrze, do celów chromatografii gazowej.

5. PROCEDURA

5.1 Przygotowanie substancji nie ulegającej zmydleniu. 5.1.1. Do kolby o pojemności 250 ml wprowadzić za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 500 μl pewną objętość 0,2 % roztworu β-cholestanolu w chloroformie (4.17) zawierającą ilość cholestanolu odpowiadającą w przybliżeniu 10 % steroli zawartych w części próbki, która ma być pobrana do badania. Na przykład w przypadku próbki oliwy z oliwek o wielkości 5 g należy dodać 500 μl, a w przypadku próbki ►M6 ————— ◄ makuchów oliwek takiej samej wielkości — 1 500 μl 0,2 % roztworu β-cholestanu. Odparować do wysuszenia w strumieniu azotu, a następnie odważyć dokładnie 5 g suchej przefiltrowanej próbki w tej samej kolbie. W przypadku ►M6 olejów ◄ zawierających znaczne ilości cholesterolu, może pojawić się wartość szczytowa odpowiadająca takiemu samemu czasowi zatrzymania jak cholestanol. W takich przypadkach należy dokonać podwójnej analizy frakcji steroli — bez dodawania mianowanego roztworu i z dodaniem tego roztworu ►M6 lub wykorzystać betulinol zamiast cholestanolu ◄ . 5.1.2. Dodać 50 ml 2 mol/l roztworu wodorotlenku potasu w etanolu, uruchomić chłodzenie zwrotne, podgrzać w łaźni wodnej do temperatury lekkiego wrzenia cały czas mieszając intensywnie aż do zmydlenia (roztwór staje się przejrzysty). Kontynuować podgrzewanie przez 20 minut, a następnie dodać 50 ml wody destylowanej do górnej części chłodnicy, odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury około 30 °C. 5.1.3. Przenieść zawartość kolby do rozdzielacza o pojemności 500 ml płucząc ją kilkakrotnie wodą destylowaną, łącznie około 50 ml wody. Dodać około 80 ml eteru etylowego, mieszać energicznie przez 30 sekund i odstawić do rozdzielnia faz (Uwaga 1). Oddzielić dolną fazę wodną dekantując ją do innej kolby. Przeprowadzić jeszcze dwie ekstrakcje na fazie wodnej w ten sam sposób stosując każdorazowo około 60 do 70 ml eteru dietylowego. Uwaga 1: Wszelkie powstałe emulsje można wyeliminować dodając w tym celu za pomocą tryskawki niewielką ilość alkoholu etylowego lub metylowego. 5.1.4. Zebrać wszystkie eterowe ekstrakty do jednego rozdzielacza i wypłukać wodą destylowaną (każdorazowo stosując 50 ml) aż do uzyskania obojętnego odczynu wody popłucznej. Usunąć wodę popłuczną, wysuszyć bezwodnikiem siarczanu sodu i przefiltrować przez bezwodnik siarczanu sodu do zważonej uprzednio kolby o pojemności 250 ml, płucząc rozdzielacz i filtr niewielkimi ilościami eteru dietylowego. 5.1.5. Eter jest ulatniany delikatnym ogrzewaniem do kilku ml, a następnie osuszyć w słabej próżni lub w strumieniu azotu, zakończyć proces około 15-minutowym suszeniem w piecu w temperaturze 100 °C, a po schłodzeniu zważyć w eksykatorze.

5.2. Oddzielanie frakcji steroli. 5.2.1. Przygotowanie płytek podstawowych: zanurzyć całkowicie płytki z żelu krzemionkowego (4.4) w 0,2 mol/l roztworze wodorotlenku potasu w etanolu (4.5) na 10 sekund, a następnie zamknąć je na dwie godziny pod wyciągiem, a na koniec umieścić na godzinę w piecu nagrzanym do temperatury 100 °C. Wyjąć z pieca i umieścić w eksykatorze z chlorku wapnia aż do czasu ich użycia (poddane takiej obróbce płytki powinny być wykorzystane w ciągu 15 dni). Uwaga 2: Zastosowanie płytek z żelu krzemionkowego do oddzielania frakcji steroli, eliminuje potrzebę poddawania nie ulegających zmydleniu substancji działaniu tlenku glinu. W ten sposób wszystkie związki kwasowe (kwasy tłuszczowe i inne) zatrzymują się na linii osadzania. Uzyskuje się dzięki temu pasmo steroli, które jest wyraźnie oddzielone od pasma alkoholi alifatycznych i terpenowych. 5.2.2. Napełnić komorę chromatograficzną mieszaniną benzenu i acetonu w proporcji 95:5 (v/v) do poziomu około 1 cm. Zamiennie można użyć mieszaniny heksanu i eteru dietylowego w stosunku 65:35 (v/v). Zamknąć komorę i pozostawić na co najmniej 1 godzinę w celu uzyskania równowagi układu ciecz–para. Na wewnętrznych powierzchniach komory można umieścić paski papieru filtracyjnego, tak, aby były one zanurzone w eluencie: pozwala to zmniejszyć do mniej więcej jednej trzeciej czas przemieszczenia linii cieczy i uzyskania bardziej jednorodnej elucji składników. Uwaga 3. Przy każdej analizie mieszaninę należy wymienić w celu uzyskania powtarzalnych warunków elucji. 5.2.3. Przygotować około 5 % roztwór substancji nieulegającej zmydlaniu (5.1.5) w chloroformie i za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 100 μl rozprowadzić 300 μl ml tego roztworu równomiernie w postaci jednolitego pasma o jak najmniejszej grubości na płytce chromatograficznej w odległości około 2 cm od krawędzi płytki. Na przedłużeniu taśmy umieścić na jednym końcu płytki 2 do 3 μl wzorcowego roztworu sterolu (4.11) w celu określenia pasma steroli podczas ostatniego rozwinięcia. 5.2.4. Wewnątrz komory chromatograficznej umieścić płytkę przygotowaną w sposób opisany w pkt. 5.2.2. Temperatura otoczenia powinna być utrzymywana w granicach od 15 do 20 °C. Bezzwłocznie zamknąć pokrywę komory pozostawiając w niej próbkę w celu eluacji, dopóki rozpuszczalnik nie dotrze na odległość 1 cm z górnej części płytki. Następnie wyjąć płytkę z komory i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza lub pozostawić płytkę na chwilę pod wyciągiem. 5.2.5 Spryskać lekko i równomiernie płytkę roztworem 2,7-dichlorofluoresceiny. Wyszukać pasmo steroli przyrównując do plamy utworzonej za pomocą roztworu wzorcowego; oddzielić pasmo czarnym ołówkiem wzdłuż fluoryzujących krawędzi. 5.2.6 Zdrapać żel krzemionkowy znajdujący się na zaznaczonym obszarze za pomocą metalowej szpatułki. Usunięty materiał rozdrobnić i wprowadzić do lejka do sączenia (3.7), dodać 10 ml gorącego chloroformu i całość starannie wymieszać metalową szpatułką i przefiltrować w próżni, przy czym filtrat jest zbierany do stożkowej kolby (3.8) połączonej z lejkiem do sącznia. Pozostałość na filtrze przepłukać 3/10 ml eterem dietylowym a filtrat jest zbierany do tej samej kolby połączonej z lejkiem. Filtrat jest odparowany do objętości wynoszącej około 4 do 5 ml i pozostały roztwór przelany do probówki o pojemności 10 ml (3.9), która przedtem została zważona; probówka jest suszona przez lekkie podgrzewanie w słabym strumieniu azotu. Ponownie pozostałość jest rozpuszczona paroma kroplami acetonu, ponownie osuszona, następnie umieszczona w piecu w temperaturze 105 °C przez 10 minut, wyjęta, schłodzona w eksykatorze i zważona. Pozostałość w probówce to frakcja steroli.

5.3. Przygotowanie trimetylsilyloeterów. 5.3.1. Do próbówki zawierającej frakcję steroli dodawać odczynnik wywołujący reakcję silylowania składający się z mieszaniny pirydyny- heksametyldisilazanu-trimetylchlorosilanu w proporcji 9:3:1 (v/v/v) w ilości 50 μl na każdy miligram steroli, w sposób pozwalający uniknąć wchłaniania wilgoci (Uwaga 5). Uwaga 4: W handlu dostępne są roztwory gotowe do wykorzystania; ponadto inne odczynniki silanizujące jak np. bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylochlorosilanu przeznaczone do wymieszania z taka samą objętością bezwodnika pirydyny. 5.3.2 Zatkać próbówkę, wstrząsać (bez odwracania) aż do uzyskania pełnej stabilizacji steroli. Pozostawić na 15 minut w temperaturze otoczenia, następnie wirować przez kilka minut: przejrzysty roztwór może być poddany analizie metodą chromatografii gazowej. Uwaga 5: Ewentualne pojawienie się lekkiej opalizacji jest zjawiskiem normalnym i nie stanowi żadnej przeszkody. Biała zawiesina lub różowe zabarwienie wskazują na obecność wilgoci lub zmian w odczynniku. W takim przypadku próbę należy powtórzyć.

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej. 5.4.1. Operacje wstępne, przygotowanie kolumny. 5.4.1.1. Osadzić kolumnę w chromatografie gazowym łącząc końcówkę wlotową z wyparką podłączoną do systemu rozszczepiającego, a końcówkę wylotową z detektorem. Dokonać ogólnych kontroli zespołu chromatografu (szczelność układu zasilania gazem, sprawność detektora, sprawność systemu rozszczepiania i systemu zapisu itp.). 5.4.1.2 Jeżeli kolumna jest wykorzystywana po raz pierwszy, zalecane jest jej odpowiednie przygotowanie. Przepuścić przez kolumnę słaby strumień gazu nośnego, następnie zapalić zespół chromatrografu gazowego i rozpocząć stopniowe podgrzewanie do temperatury co najmniej o 20 °C wyższej niż temperatura robocza (Uwaga 6). Podtrzymywać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie doprowadzić zespół do stanu pracy (regulacja strumienia gazu i układu rozszczepiania, zapalenie płomienia, połączenie z rejestratorem elektronicznym, regulacja temperatury komory kolumny, detektora i inicjatora itd.) i dokonać zapisu sygnału z czułością co najmniej dwa razy większą od przewidzianej czułości analizy. Przebieg uzyskanej linii podstawowej musi mieć charakter liniowy, jest pozbawionym jakiejkolwiek wartości szczytowej i nie powinny w nim występować przesunięcia. Ujemne przesunięcie prostoliniowe wskazuje na złą szczelność połączeń kolumny, dodatnie przemieszczenie wskazuje na niedostateczne przygotowanie kolumny Uwaga 6: Temperatura przygotowywania kolumny powinna być zawsze niższa co najmniej o 20 °C od maksymalnej przewidywanej temperatury użytej cieczy rozdzielającej. 5.4.2. Dobór warunków roboczych. 5.4.2.1. Wytyczne warunki robocze są następujące: — temperatura kolumny 260 °C ± 5 °C, — temperatura wyparki: 280 °C — temperatura detektora: 290 °C — prędkość liniowa gazu nośnego: hel — 20 do 35 cm/s; wodór — 30 do 50 cm/s, — stosunek rozdzielania: 1: 50 do 1: 100, — czułość przyrządów; 4 do 16 razy minimalne tłumienie — czułość rejestratora: 1 do 2 mV f.s., — prędkość przesuwu papieru: 30 do 60 cm na godzinę — ilość wprowadzonej substancji: 0,5 do 1 μl roztworu TMSE. Warunki te mogą być zmieniane w zależności od charakterystyki kolumny i chromatografu gazowego w taki sposób, aby uzyskiwać chromatogramy spełniające następujące warunki: — czas zatrzymania b-sitosterolu powinien wynosić 20 ± 5 minut, — szczytowa wartość dla kampesterolu powinna wynosić: dla oliwy z oliwek (średnia zawartość 3 %) 15 ± 5 % skali tła, a dla oleju sojowego (średnia zawartość) 80 ± 10 % skali tła, — musi nastąpić oddzielenie wszystkich występujących w próbce steroli; konieczne jest, aby inne wartości szczytowe były również całkowicie oddzielone, co oznacza, że wykres wartości szczytowej powinien łączyć się z podstawą zanim pojawi się następna wartość szczytowa. Niepełna rozdzielczość jest jednak tolerowana pod warunkiem, że jest ona mierzalna wzdłuż prostopadłej do wartości szczytowej w punkcie TRR 1,02. 5.4.3. Wykonanie analizy. 5.4.3.1. Pobrać za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl 1 μl heksanu, zassać 0,5 μl powietrza, a następnie 0,5 — 1 μl roztworu próbki; pociągnąć tłoczek tak, aby opróżnić igłę. Wprowadzić igłę przez membranę zespołu iniekcyjnego i po upływie 1 do 2 sekund szybko opróżnić strzykawkę i powoli, tzn. mniej więcej po 5 sekundach, wyjąć igłę. 5.4.3.2. Prowadzić rejestrację do momentu całkowitego wypłukania TMSE występujących w próbce steroli. Linia podstawowa powinna zawsze spełniać wymagane warunki (5.4.1.2). 5.4.4. Wyznaczenie wartości szczytowych. Wyznaczenie poszczególnych wartości szczytowych odbywa się w oparciu o okresy zatrzymania i przez porównanie z mieszaniną TMSE steroli poddanych analizie w tych samych warunkach. Sterole podlegają elucji w następującej kolejności: cholesterol, brassikasterol, 24-metylen- cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7- kampesterol, Δ 5,23 stigmastadienol, klerosterol, β-sitosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, Δ 5,24 stigmastadienol, Δ 7-stigmastenol, Δ 7-avenasterol. Tabela 1 podaje czasy zatrzymania w odniesieniu do sitosterolu dla kolumn SE-52 i SE-54. Rysunek 1 i 2 przedstawiają typowe chromatogramy kilku rodzajów oleju. 5.4.5. Ocena ilościowa. 5.4.5.1 Przystąpić do obliczania za pomocą integratora powierzchni wartości szczytowych β-cholesterolu i steroli. Nie uwzględniać ewentualnych wartości szczytowych związków nie wymienionych w tabeli 1. Współczynnik charakterystyki GLV β-cholesterolu przyjmuje się jako 1. 5.4.5.2. Obliczyć zawartość każdego prostego sterolu w mg/100 g substancji tłuszczowej w następujący sposób: gdzie: Ax = powierzchnia wartości szczytowej odpowiadającej obecności sterolu × ►M6 ————— ◄ 2 As = powierzchnia wartości szczytowej odpowiadającej obecności β-cholestanolu ►M6 ————— ◄ 2 ms = masa dodanego β-cholestanolu w miligramach m = masa próbki pobranej do badania w gramach

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

6.1. PODAĆ zawartości każdego sterolu w mg/100g substancji tłuszczowej, a ich sumę jako „sterole łączne”.

6.2. Procentową zawartość każdego sterolu oblicza się ze stosunku powierzchni odpowiedniej wartości szczytowej do sumy powierzchni wartości szczytowych steroli. gdzie: Ax = powierzchnia wartości szczytowej dla x; ΣA = łączna powierzchnia wartości szczytowej.









DODATEK

Oznaczenie prędkości liniowej gazu

Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze wprowadzić 1 do 3 µl metanu lub propanu i mierzyć chronometrem czas, którego gaz potrzebuje, aby przejść przez kolumnę począwszy od momentu wstrzyknięcia do spadku wartości szczytowej (tM).

Prędkość liniowa w cm/s określona jest jako L/tM, gdzie L jest długością kolumny w centymetrach, a tMczasem zmierzonym w sekundach.







Tabela 1 Względne wielkości czasu zatrzymania dla steroli Wartość szczytowa Oznaczenie Względna wielkość czasu zatrzymania SE 54 Kolumna SE 52 Kolumna 1 cholesterol Δ-5-cholesten-3β-ol 0,67 0,63 2 cholestanol 5α -cholestan-3β-ol 0,68 0,64 3 brassikasterol [24S]- 24-metyl-Δ-5,22-cholestadien-3β-ol 0,73 0,71 4 24-metylen-cholesterol 24-metylen-Δ-5,24-cholesten-3β-ol 0,82 0,80 5 kampesterol [24R]- 24-metyl-Δ-5 cholesten-3β-ol 0,83 0,81 6 kampestanol [24R]- 24-metyl-cholestan 0,85 0,82 7 stigmasterol [24R]-etyl- Δ− 5,22-cholestadien-3β-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-kampesterol [24R]-metyl- Δ− 7-cholesten-3β-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl-Δ− 5,23-cholestadien-3β-ol 0,95 0,95 10 chlerosterol [24S]- 24-etyl-Δ− 5,25-cholastadien-3β-ol 0,96 0,96 11 β-sitosterol [24R]- 24-etyl-Δ− 5-cholestan-3β-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etyl-cholestan-3β-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-avenasterol [24Z]- 24-etyliden-5-cholesten-3β-ol 1,03 1,03 14 Δ-5,24-stigmastadienol [24R, S]- 24-etyl-Δ− 5,24-cholestadien-3β-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-stigmastenol [24R, S]- 24-etyl-Δ− 7,24-cholestadien-3β-ol 1,12 1,12 16 Δ-7 avenasterol [24Z]- 24-etyliden-Δ− 7-cholesten-3β-ol 1,16 1,16

Rysunek 1

Chromatografia gazowa frakcji steroli nierafinowanej oliwy z oliwek

Rysunek 2

Chromatografia gazowa frakcji steroli nierafinowanej oliwy z oliwek









ZAŁĄCZNIK VI

OZNACZANIE ERYTRODIOLU I UVAOLU

WSTĘP

Erytrodiol (ogólna nazwa stosowana powszechnie w odniesieniu do glikoli; erytrodiolu i uvaolu) jest składnikiem substancji nie zmydlającej się, która występuje w pewnych substancjach tłuszczowych. Jego oznaczanie może służyć do sprawdzenia obecności ekstraktu oliwy z oliwek, przy czym jego stężenie jest w niej zdecydowanie większe niż w innych rodzajach oliwy (oliwa tłoczona z oliwek, oliwa z nasion winogron).

1. ZAKRES

przedstawiona tu metoda opisuje sposób oznaczania zawartości erytrodiolu w substancjach tłuszczowych.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

substancja tłuszczowa zmydlana Jest roztworem wodorotlenku potasu w etanolu. Frakcja niezmydlająca się jest następnie ekstrahowana eterem dietylowym, czyszczona w kolumnie siarczanu glinu i rozdzielana metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach z żelu krzemionkowego.

Następnie rozdzielane są pasma frakcji sterolowej i erytrodiolowej. Oddzielone na płytkach sterole i erytrodiol są przekształcane w trimetylsilyletery i analizowane metodą chromatografii gazowej.

Wyniki podaje się w procentach erytrodiolu w mieszaninie erytrodiolu i steroli.

3. APARATURA

3.1. aparatura opisana w załączniku V (oznaczanie zawartości steroli).

4. ODCZYNNIKI

4.1. odczynniki wymienione w załączniku v (oznaczanie zawartości steroli).

4.2. 5 % roztwór wzorcowy erytrodiolu w chloroformie.

5. PROCEDURA

5.1. Przygotowanie substancji nieulegającej zmydleniu.

Zgodnie z opisem podanym w pkt. 5.1.2 załącznika V.

5.2. Oddzielanie erytrodiolu i steroli.

5.2.1. Patrz pkt. 5.2.1 metody podanej w załączniku V.

5.2.2. Patrz pkt. 5.2.2 metody podanej w załączniku V.

5.2.3. Przygotować roztwór substancji nieulegającej zmydleniu (5 %) w chloroformie. Za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 0,1 ml rozprowadzić na płytce chromatograficznej w odległości około 1,5 cm od jej dolnej krawędzi, 0,3 ml wspomnianego roztworu w postaci możliwie jak najcieńszej i jednorodnej linii. Na jednym końcu płytki umieścić jako wzorzec kilka mikrolitrów roztworu cholesterolu i erytrodiolu.

5.2.4. Umieścić płytkę wewnątrz komory jak podano w pkt. 5.2.1. Temperatura otoczenia powinna wynosić około 20 °C. Bezzwłocznie zamknąć pokrywę komory pozostawiając w niej próbkę w celu eluacji, dopóki rozpuszczalnik nie dotrze na odległość 1 cm od górnej części płytki. Następnie wyjąć płytkę z komory i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza.

5.2.5. Spryskać równomiernie płytkę roztworem 2,7-dichlorofluoresceiny. Badając płytkę w świetle ultrafioletowym wyszukać pasma steroli i erytrodiolu przyrównując do składników wzorcowych; następnie zaznaczyć ostrym przyrządem nieco poza krawędziami fluoryzującej substancji.

5.2.6. Zdrapać żel krzemionkowy umieszczony na zaznaczonych obszarach za pomocą metalowej szpatułki. Umieścić materiał usunięty z płytki w kolbie o pojemności 50 ml. Dodać 15 ml gorącego chloroformu, całość starannie wymieszać i przefiltrować w kolbie z filtrem porowatym przenosząc żel krzemionkowy na filtr. Przepłukać trzykrotnie w ciepłym chloroformie (używając każdorazowo około 10 ml) i zebrać filtrat w kolbie o pojemności 100 ml. Odparowywać aż do uzyskania objętości rzędu 4 do 5 ml, przelać do probówki wirówkowej z dnem stożkowym o pojemności 10 ml, uprzednio zważonej, osuszyć ogrzewając lekko w strumieniu azotu i zważyć.

5.3. Przygotowanie trimetylsilyloeterów

Postępować zgodnie z pkt. 5.3 metody opisanej w załączniku V.

5.4. Analiza metodą chromatografii gazowej.

Postępować zgodnie z pkt. 5.4 tej samej metody. Analiza metodą chromatografii gazowej powinna być prowadzona w warunkach umożliwiających przestrzeganie wymogów analizy steroli i rozdzielania TMSE erytrodiolu i uvaolu.

Po wstrzyknięciu próbki pozostawić papier tak, aby rozwijał się aż do całkowitej elucji występujących w niej steroli — erytrodiolu i uvaolu. Następnie określić położenie wartości szczytowych (względne wartości czasu zatrzymania erytrodiolu i uvaolu w stosunku do B-sitosterolu wynoszą odpowiednio około 1,45 i 1,55). Następnie obliczyć powierzchnie według zasady podanej dla steroli.

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

gdzie:

A1 = obszar wartości szczytowej dla erytridiolu ►M6 ————— ◄ ;

A2 = obszar wartości szczytowej dla uvaolu ►M6 ————— ◄ ;

∑ Asteroli = łączny obszar wartości szczytowej dla steroli ►M6 ————— ◄ .

Wynik jest podawany do jednego miejsca po przecinku.









ZAŁĄCZNIK VII

OZNACZANIE NASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W POZYCJI 2 TRIGLICERYDU

1. ZAKRES

niniejsza norma zawiera opis metody oznaczania składu frakcji kwasów tłuszczowych w oleju lub estryfikowanej substancji tłuszczowej w pozycji 2 (lub pozycji wewnętrznej) glicerolu.

2. ZAKRES STOSOWANIA

niniejsza norma odnosi się do olejów i substancji tłuszczowych o temperaturze topnienia poniżej 45 °C, z uwagi na parametry działania lipazy trzustkowej.

Dotyczy ona z pewnymi ograniczeniami olejów i substancji tłuszczowych z dużą ilością kwasów tłuszczowych zawierających liczbę atomów węgla równą lub mniejszą niż 12 (olej kokosowy i palmowy, substancja tłuszczowa masłowa), kwasy tłuszczowe o wysokim stopniu nienasycenia (posiadające więcej niż cztery wiązania podwójne) posiadające liczbę atomów węgla równą lub większą niż 12 (oleje z ryb i zwierząt morskich) lub kwasy tłuszczowe zawierające inne grupy tlenowe niż grupa kwasowa.

3. ZASADA

ewentualne zobojętnienie olejów i kwasów tłuszczowych w rozpuszczalniku. Oczyszczenie na drodze przepuszczania przez złoże siarczanu glinowego. Częściowa hydroliza triglicerydów za pomocą lipazy trzustkowej przez z góry ustalony okres czasu. Oddzielenie monoglicerydów powstałych podczas chromatografii cienkowarstwowej i metanolizamonoglicerydów. Analiza estrów metylowych metodą chromatografii gazowej/ciekłej.

4. APARATURA

4.1. kolba o pojemności 100 ml.

4.2. Kolba o pojemności 25 ml ze szlifowaną szyjką.

4.3. Chłodnica powietrzna o długości 1 m, którą można połączyć z kolbą z pkt. 4.2.

4.4. Kolba stożkowa o pojemności 250 ml.

4.5. Zlewka o pojemności 50 ml.

4.6. Rozdzielacz o pojemności 500 ml.

4.7. Szklana kolumna chromatograficzna (wewnętrzna średnica: 13 mm; długość: 400 mm) wyposażona w płytkę szklaną ze spieku szklanego i kranik.

4.8. Probówka do wirowania o pojemności 10 ml ze szlifowanym korkiem.

4.9. Biureta na 5 ml z podziałką co 0,05 ml.

4.10. Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml z cienką igłą.

4.11. Mikrostrzykawka do zakraplania o pojemności od 3 do 4 μl.

4.12. Skrapiarka do chromatografii cienkowarstwowej.

4.13. Płytki szklane do chromatografii cienkowarstwowej (20 × 20 cm).

4.14. Szklana komora chromatograficzna do chromatografii cienkowarstwowej ze szlifowaną pokrywką dostosowana do płytek 20 × 20 cm.

4.15. Rozpylacz do chromatografii cienkowarstwowej.

4.16. Suszarka nastawiona na 103 ± 2 °C

4.17. Termostat z zakresem regulacji od 30 do 45 °C o dokładności około 0,5 °C.

4.18. Wyparka obrotowa.

4.19. Elektryczne mieszadło wibracyjne umożliwiające intensywne mieszanie probówki do odwirowywania.

4.20. Źródło światła ultrafioletowego do badania płytek do chromatrografii cienkowarstwowej.

4.21. pH-metr 4.22. Mieszadło spiralne. 4.23. Biureta o pojemności 5 ml. 4.24. Stoper.

4.25. Mieszadło laboratoryjne nadające się do rozproszenia i mieszania substancji niejednorodnych.

5. ODCZYNNIKI

5.1. N — heksan lub, w razie jego braku, frakcja ropy naftowej (30 °C do 50 °C) nadająca się do chromatografii.

5.2. 2-propanol (lub etanol), 95 °C (v/v) jakość laboratoryjna odczynnika.

5.3. 2-propanol (lub etanol) w postaci roztworu wodnego 1:1.

5.4. Eter dietylowy pozbawiony nadtlenków.

5.5. Aceton.

5.6. Kwas mrówkowy o stężeniu co najmniej 98 % (m/m).

5.7. Rozpuszczalnik chromatograficzny: mieszanina n-heksanu (5.1). eteru dietylowego (5.4) i kwasu mrówkowego (5.6) w proporcjach 70:30:1 (v/v/v).

5.8. Aktywny siarczan glinu do chromatografii, obojętny, o I stopniu aktywności Brockmanna.

5.9. Sproszkowana krzemionka zawierająca odpowiednią jakość nadającą się do chromatografii cienkowarstwowej.

5.10. Lipaza trzustkowa o odpowiedniej jakości (uwagi 1 i 2).

5.11. Wodny roztwór wodorotlenku sodu (120 g/l).

5.12. Wodny roztwór kwasu solnego (6 Mol/1).

5.13. Wodny roztwór chlorku wapnia (CaCl2) (220 g/ l).

5.14. Wodny roztwór enzymatycznego cholanu sodu (1 g/ l).

5.15. Roztwór buforowy: 1 M wodny roztwór tri-hydroksymetylaminometanu, którego pH 8 zostało uzyskane przez dodanie kwasu solnego (5.12) (kontrola za pomocą potencjometru).

5.16. Roztwór fenoloftaleiny (10 g/l) w etanolu o stężeniu 95 % (v/v).

5.17. Roztwór dichloro-2- 7-fluoresceiny (2 g/l) w etanolu o stężeniu 95 % (v/v) o słabo zasadowym odczynie uzyskanym przez dodanie jednej kropli 1 N roztworu wodorotlenku sodu na 100 ml.

5.18. Zobojętniony olej. 5.19. 0,1 M wodny roztwór wodorotlenku sodu. 5.20. Wodny roztwór enzymatycznego cholanu sodu (200 g/l). 5.21. Guma arabska, wodny roztwór 100 g/l.

6. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

jeżeli kwasowośá próbki oznaczona według załącznika II jest niższa niż 3 %, oczyścić bezpośrednio na złożu z siarczanu glinu jak podano w pkt. 6.2.

Jeżeli kwasowość próbki oznaczona według załącznika II jest większa niż 3 %, zobojętnić roztworem zasady jak podano w pkt. 6.1, a następnie przepuścić przez siarczan glinu, jak podano w pkt. 6.2.

6.1. Zobojętnienie roztworem zasady. Wprowadzić do rozdzielacza (4.6) około 10 g ropy naftowej i dodać 100 ml heksanu (5.1), 50 ml 2-propanolu (5.2), kilka kropli roztworu fenoloftaleiny (5.16) oraz ilość roztworu wodorotlenku sodu (5.11) odpowiadającą zawartości kwasów tłuszczowych zwiększoną o 0,3 %. Wstrząsać intensywnie przez jedną minutę, dodać 50 ml wody destylowanej, ponownie wstrząsnąć i odstawić. Po rozdzieleniu usunąć dolną warstwę mydła. Usunąć także wszystkie pośrednie warstwy (zawiesiny ciał białkowych, substancje nierozpuszczalne). Płukać roztwór heksanu i zobojętnionego oleju kilkoma porcjami 25 do 30 ml roztworu 2-propanolu (5.3) dopóki nie zniknie różowa barwa fenoloftaleiny. Usunąć większość heksanu za pomocą destylacji w próżni w wyparce obrotowej (4.18) i suszyć olej w temperaturze 30—40 oC (cały czas w próżni) za pomocą strumienia czystego azotu do momentu usunięcia heksanu.

6.2. Oczyszczenie na drodze przepuszczania przez siarczan glinu. Przygotować zawiesinę złożoną z 15 g aktywnego siarczanu glinu (5.8) w 50 ml heksanu (5.1) i przelać cały czas mieszając do kolumny chromatograficznej (4.7). Zagęścić siarczan glinu i pozwolić na opadnięcie poziomu rozpuszczalnika do około 1 do 2 mm powyżej pochłaniacza. Wylać ostrożnie na kolumnę roztwór składający się z 5 g oliwy w 25 ml heksanu (5.1). Zebrać całość odcieku z kolumny w kolbie o okrągłym dnie (4.1).

7. Przygotowanie płytek chromatograficznych Oczyścić dokładnie szklane płytki. (4.13) etanolem, eterem, ropą naftową i acetonem w celu usunięcia wszelkich śladów tłuszczu. Wsypać do stożkowej kolby 30 g sproszkowanej krzemionki (5.9). Dodać 60 ml destylowanej wody. Zamknąć i intensywnie wstrząsać przez okres jednej minuty. Bezzwłocznie przenieść zawiesinę do skrapiarki (4.12) i rozprowadzić na czystych płytkach w postaci warstwy o grubości 0,25 mm. Suszyć płytki przez 15 minut w powietrzu, a następnie przez jedną godzinę w piecu (4.16) w temperaturze 103 ± 2 °C. Przed użyciem ostudzić płytki do temperatury otoczenia w eksykatorze. Gotowe płytki są dostępne w handlu.

8. PROCEDURA 8.1. Hydroliza przy pomocy lipazy trzustkowej. Odważyć około 0,1 g próbki przygotowanej we fiolce do odwirowywania (4.8). Jeżeli próbka jest płynną substancją tłuszczową, należy postąpić jak poniżej. Dodać 20 ml lipazy (5.10) i 2 ml roztworu buforowego (5.15). Wstrząsnąć dobrze zachowując ostrożność, a następnie dodać 0,5 ml roztworu cholanu sodu (5.14) i 0,2 ml roztworu chlorku wapnia (5.13). Zamknąć fiolkę szlifowanym korkiem, ostrożnie wstrząsnąć (tak, aby nie zmoczyć korka) i bezzwłocznie umieścić fiolkę w termostatcie (4.17) w temperaturze 40 ± 0, 5 °C. Mieszać w ręku dokładnie przez jedną minutę. Wyjąć fiolkę z termostatu i mieszać za pomocą mieszadła elektrycznego (4.19) przez dwie minuty. Natychmiast schłodzić pod bieżącą wodą; dodać 1 ml kwasu solnego (5.12) i 1 ml eteru dietylowego (5.4). Zamknąć i intensywnie zamieszać za pomocą mieszadła elektrycznego. Odstawić do uspokojenia i w razie potrzeby usunąć po odwirowaniu warstwę organiczną za pomocą strzykawki (4.10). 8.2. Rozdzielanie monoglicerydów metodą chromatografii cienkowarstwowej Nałożyć ekstrakt na płytkę chromatograficzną w postaci jak najwęższej jednorodnej cienkiej warstwy za pomocą mikrostrzykawki (4.11) w odległości około 1,5 cm od krawędzi dna. Umieścić płytkę w dobrze nasyconej komorze (4.14) i rozwinąć za pomocą rozpuszczalnika (5.7) o temperaturze około 20 °C na odcinku sięgającym na odległość około 1 cm od krawędzi płytki. Osuszyć płytkę na powietrzu, w temperaturze pieca i naprysnąć roztwór dichloro-2- 7-fluoresceiny (5.17). Zaznaczyć pasmo monoglicerydów (Rf około 0,035) w świetle ultrafioletowym (4.20). 8.3. Analiza monoglicerydów za pomocą chromatografii gazowej/cieczowej. Zebrać pasmo uzyskane w pkt. 8.2 za pomocą szpatułki (unikając zebrania składników pozostałych na linii podstawowej) umieścić w naczyniu do metylowania (4.2). Poddać zebraną krzemionkę bezpośrednio obróbce metodami opisanymi w załączniku X B w sposób pozwalający przekształcić monoglicerydy w estry metylowe, a następnie zbadać estry metodą chromatografii gazowej jak podano w załączniku X A.

9. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW Określić skŁad frakcji zawierającej kwasy tłuszczowe w pozycji 2, podając wynik z dokładnością do jednego miejsca po przecinku (Uwaga 3).

10. UWAGI Uwaga 1: Kontrola działania lipazy. Przygotować emulsję oleju przez wymieszanie w odpowiednim mieszadle mieszaniny składającej się ze 165 ml roztworu gumy arabskiej (5.21), 15 g kruszonego lodu i 20 ml zobojętnionego oleju (5.18). Do zlewki (4.5) wlać 10 ml tej emulsji, następnie 0,3 ml roztworu cholanu sodu (5.20) i 20 ml wody destylowanej. Umieścić zlewkę w termostacie, którego temperatura utrzymywana jest na poziomie 37 ± 5 °C (Uwaga 4); umieścić elektrody pH-metru (4.21) i mieszadło spiralne (4.22). Za pomocą biurety (4.23) dodawać kroplami roztwór wodorotlenu sodu dopóki pH nie osiągnie wartości 8,5. Dodać dostateczną ilość wodnej zawiesiny lipazy (patrz poniżej). Z chwilą, gdy pH-metr wskaże 8,3 włączyć stoper (4.24) i rozpocząć wkraplanie roztworu wodorotlenku sodu (5.19) z prędkością umożliwiającą utrzymanie stałego pH na poziomie 8,3. Co minutę zapisywać objętość zużytego roztworu zasadowego. Nanieść zanotowane wartości na diagram zaznaczając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych ilości roztworu zasadowego w ml potrzebne dla utrzymania stałego pH. W wyniku tego powinno otrzymać się linię prostą. Zawiesina wspomnianej wyżej lipazy jest zawiesiną w wodzie o proporcji 1 do 1 000 (m/m). Do każdej próby należy wykorzystać dostateczną ilość, około 1 ml alkalicznego roztworu tak, aby została ona zużyta w ciągu czterech do pięciu minut. Zazwyczaj potrzebna jest ilość proszku wynosząca od 1 do 5 mg. Jednostka lipazowa jest definiowana jako ilość enzymów, które uwalniają 10 μl kwasu na minutę. Wyrażona w jednostkach lipazowych na miligram aktywność-A użytego proszku jest obliczana za pomocą następującego wzoru: gdzie: V: objętość wodorotlenku sodu (5.19) zużytego w ciągu minuty obliczona, z wykresu, m: masa analizowanej próbki proszku w mg. Uwaga 2: Przygotowanie lipazy. Lipazy charakteryzujące się dostatecznym poziomem aktywności są dostępne w handlu, ale można je także otrzymać w następujący sposób: Schłodzić 5 kg świeżej trzustki wieprzowej do temperatury 0 °C; usunąć tkankę tłuszczową i tkankę łączną, a następnie ucierać w mieszalniku aż do uzyskania płynnej pasty. Wymieszać tę masę w mieszadle (4.25) z 2,5 l bezwodnego acetonu przez cztery i sześć godzin, następnie odwirować. Ekstrahować jeszcze trzy razy z pozostałości stosując tę samą ilość acetonu, a następnie esktrahować dwa razy mieszaniną acetonu i eteru dietylowego w stosunku 1 do 1 (v/v) i dwa razy eterem dietylowym. Suszyć pozostałość w próżni przez 48 godzin w celu uzyskania stabilnego proszku nadającego się do przechowywania w lodówce. Uwaga 3: We wszystkich przypadkach zaleca się oznaczenie składu łącznych kwasów tłuszczowych w tej samej próbce ponieważ porównanie tej zawartości z zawartością kwasów w pozycji 2 pozwoli dokonać interpretacji uzyskanych wyników liczbowych. Uwaga 4: Temperatura hydrolizy ustalona jest na poziomie 37 °C, ponieważ stosowana jest płynny olej. Jednak temperatura próbki jest ustalona na poziomie 40 °C, aby można było przeanalizować substancje tłuszczowe, których temperatura topnienia może osiągnąć 45 °C.

▼M20 —————

▼B









ZAŁĄCZNIK IX

BADANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNA W ULTRAFIOLECIE

WPROWADZENIE

Badanie spektrofotometryczne w ultrafiolecie moŻe dostarczyć informacji o jakości substancji tłuszczowej, jej stanie zachowania i zmianach wywołanych procesami technologicznymi. Efekty absorpcji fal o długości ustalonej w tej metodzie wywołane są obecnością sprzężonych systemów dienowych i trienowych.

Wielkość takiej absorpcji wyrażana jest jako właściwa gęstość optyczna (gęstość optyczna 1 % roztworu substancji tłuszczowej w zaleconym rozpuszczalniku, dla warstwy o grubości 1 cm) oznaczona warunkowo jako K (określona także „współczynnikiem ekstynkcji”).

1. ZAKRES

Metoda ta opisuje metodĘ sposobu wykonania badania spektrofotometrycznego oliwy z oliwek w ultrafiolecie.

2. PODSTAWOWA ZASADA METODY

Badana substancja tŁuszczowa rozpuszczana jest w wymaganym rozpuszczalniku, a następnie dokonywane jest oznaczenie gęstości optycznej roztworu dla zaleconej długości fal w porównaniu z czystym rozpuszczalnikiem. Na podstawie odczytów spektrofotometrycznych oblicza się właściwe gęstości optyczne.

3. URZĄDZENIA

3.1. Spektrofotometr do pomiaru gęstości optycznej w ultrafiolecie w zakresie od 220 do 360 nm z możliwością odczytu dla każdej jednostki nanometrycznej

3.2. Komory z kwarcu pryzmatycznego z pokrywą, o optycznej długości 1 cm. Napełnione wodą lub innym stosownym rozpuszczalnikiem komory nie powinny wykazywać różnic przekraczających 0,01 jednostki gęstości optycznej.

3.3. Kolba pomiarowa o pojemności 25 ml.

▼M6

3.4. Kolumna chromatograficzna z górną częścią o długości 270 mm i średnicy 35 mm oraz z dolną częścią o długości 270 mm i średnicy około 10 mm.

▼B

4. ODCZYNNIKI

4.1. Izooktan (2,2,4-trimetylopentan) o czystości pozwalającej na stosowanie go w spektrofotometrii: jego przepuszczalność w porównaniu z wodą destylowaną nie powinna być mniejsza niż 60 % przy 220 nm i nie mniejsza niż 95 % przy 250 nm; lub — cykloheksan o czystości pozwalającej na stosowanie go w spektrofotometrii: jego przepuszczalność w porównaniu z wodą destylowaną nie powinna być mniejsza niż 40 % przy 220 nm i nie mniejsza niż 95 % przy 250 nm. ▼M6 ————— ▼B

4.2. Zasadowy siarczan glinu do chromatografii kolumnowej przygotowany i kontrolowany w sposób opisany w dodatku I.

4.3. n-heksan do chromatografii.

5. PROCEDURA

5.1. Badana próbka Powinna być jednorodna i pozbawiona wszelkich zanieczyszczeń występujących w postaci zawiesiny. Oleje pozostające w stanie płynnym w temperaturze otoczenia filtrowane są przez filtr papierowy w temperaturze około 30 °C, tłuszcze stałe są homogenizowane i filtrowane w temperaturze, która nie przekracza ich temperatury topnienia o więcej niż o 10 °C.

5.2. Odważyć około 0,25 g przygotowanej w ten sposób próbki w kolbie pomiarowej o pojemności 25 ml, uzupełnić zalecanym rozpuszczalnikiem i poddać homogenizacji. Uzyskany roztwór powinien być idealnie przezroczysty. W razie wystąpienia opalizacji lub mętnienia przefiltrować szybko przez papierowy filtr.

5.3. Napełnić komorę otrzymanym roztworem i dokonać pomiaru gęstości optycznych stosując jako wzorzec zastosowany rozpuszczalnik dla długości fali świetlnej mieszczącej się w granicach od 232 do 276 nm. Odczytane wartości gęstości optycznej powinny mieścić się w przedziale od 0,1 do 0,8; jeżeli jest odwrotnie, należy powtórzyć pomiary stosując odpowiednio silniejsze lub słabsze roztwory.

5.4. W przypadku konieczności oznaczenia właściwych gęstości optycznych po przepuszczeniu przez siarczan glinu, sposób postępowania jest następujący: wprowadzić do kolumny chromatograficznej 30 g zasadowego siarczanu glinu w postaci zawiesiny w heksanie; usunąć nadmiar heksanu po osadzeniu się absorbentu, a w każdym bądź razie do poziomu około 1 cm powyżej górnego poziomu siarczanu glinu. Rozpuścić 10 g substancji tłuszczowej, poddanej uprzednio homogenizacji i przefiltrowanej zgodnie z pkt. 5.1, w 100 ml heksanu i wlać ten roztwór do kolumny. Zebrać eluent i odparować rozpuszczalnik w próżni w temperaturze poniżej 25 °C. Bezzwłocznie poddać próbkę substancji tłuszczowej obróbce opisanej w pkt. 5.2.

6. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

6.1. OKREŚLIĆ właściwe gęstości optyczne (współczynniki ekstyncji) dla różnych długości fal, obliczając je w sposób następujący: gdzie: Kλ = właściwa gęstość optyczna przy długości fali λ; Eλ = gęstość optyczna zmierzona przy długości fali λ; c = stężenie roztworu w g/100 ml; s = grubość kuwety w centymetrach. Wyniki podawane są z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6.2 Badanie spektrofotometryczne oliwy z oliwek zgodnie z oficjalną metodą określoną w urzędowych przepisach EWG, przewiduje oznaczenie właściwej gęstości optycznej roztworu w izooktanie dla długości fali od 232 do 270 nm oraz oznaczenie K określonego jako: gdzie Km oznacza właściwą gęstość optyczną dla długości fali m, długość fali maksymalnej absorpcji w granicach 270 nm.









DODATEK I

prygotwanie siarczanu glini i badanie jego aktywności

A.1.1. Przygotowanie siarczanu glinu

Umieścić w zamykanym hermetycznie pojemniku siarczan glinu, uprzednio suszony przez 3 godziny w piecu w temperaturze 380-400 oC, dodać wodę destylowaną w ilości 5 ml na 100 g siarczanu glinu, szybko zamknąć pojemnik, kilkakrotnie wstrząsnąć, a następnie przed użyciem odstawić na co najmniej 12 godzin.

A.1.2 Kontrola aktywności siarczanu glinu

Przygotować kolumnę chromatograficzną z 30 g siarczanu glinu. Postępując zgodnie z pkt. 5.4. przepuścić przez kolumnę mieszaninę składającą się z:

— 95 % oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, której właściwa gęstość optyczna dla fali o długości 268 nm jest mniejsza niż 0,18,

— 5 % oleju arachidowego poddanego podczas rafinacji oczyszczeniu za pomocą ziemi, o właściwej gęstości optycznej dla fali o długości 268 nm nie mniejszej niż 4

przez kolumnę.

Jeżeli po przepuszczeniu przez kolumnę mieszanina charakteryzuje się właściwą gęstością optyczną dla fali o długości 268 nm większa niż 0,11, siarczan glinu może być stosowany, jeżeli nie, to należy zwiększyć poziom uwodnienia.









DODATEK II

kalibracja spektrofotometru

A.2. Sprzęt powinien być sprawdzany okresowo (co najmniej co sześć miesięcy) bądź pod kątem zgodności długości fali, bądź pod względem dokładności reakcji.

A.2.1 Kontrola reakcji długości fali może być dokonana za pomocą lampy rtęciowej lub odpowiednich filtrów.

A.2.2 W celu kontroli komórki fotoelektrycznej i fotomnożnika postępować w sposób następujący: odważyć 0,2 g czystego chromianu potasu do badań spektrofotometrycznych, rozpuścić w roztworze 0,05 N wodorotlenku potasu i uzupełnić do objętości w kolbie o pojemności 1 000 ml i zaznaczyć. Następnie pobrać dokładnie 25 ml otrzymanego roztworu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 500 ml po czym uzupełnić do zaznaczonej objętości tym samym roztworem wodorotlenku potasu. Zmierzyć gęstość optyczną otrzymanego w ten sposób roztworu dla długości fali 275 nm, używając roztworu wodorotlenku potasu jako wzorca. Gęstość optyczna zmierzona przy użyciu komory optycznej o grubości 1 cm powinna wynosić 0,200 ± 0,005.









ZAŁĄCZNIK X A

ANALIZA METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH

1. ZAKRES

Niniejsza metoda zawiera ogólne wytyczne stosowania chromatografii gazowej, z wykorzystaniem wypełnionych lub kapilarnych kolumn, do oznaczania składu jakościowego i ilościowego mieszaniny estrów metanowych kwasów tłuszczowych według sposobu podanego w załączniku X B.

Metoda nie znajduje zastosowania w przypadku spolimeryzowanych kwasów tłuszczowych.

2. ODCZYNNIKI

2.1. Gaz nośny

Gaz obojętny (azot, hel, argon, wodór itp.) dokładnie wysuszony i zawierający mniej niż 10 mg/kg tlenu.

Uwaga 1:

Wodór wykorzystywany w charakterze gazu nośnego wyłącznie w kolumnach kapilarnych pozwala podwoić prędkość analizy, ale stwarza zagrożenia. Istnieją jednak urządzenia zabezpieczające.

2.2. Gazy pomocnicze

2.2.1. Wodór (czystość ≥ 99,9 %) niezawierający zanieczyszczeń organicznych.

2.2.2. Powietrze lub tlen niezawierające zanieczyszczeń organicznych.

2.3. Produkty wzorcowania

Mieszanina czystych estrów metylowych kwasów tłuszczowych lub estrów metylowych substancji tłuszczowej o znanym składzie, o ile to możliwe jak najbardziej zbliżonym do składu substancji tłuszczowej poddawanej analizie.

Przedsięwziąć wszelkie środki ostrożności, aby uniknąć utlenienia nienasyconych polikwasów tłuszczowych.

3. APARATURA

Podane zalacenia dotycza powszechnie stosowanego sprzętu do chromatografii gazowej z wykorzystaniem napełnionych kolumn i/lub kapilar i płomieniowego detektora jonizacyjnego. Odpowiednia jest każda aparatura charakteryzująca się taką samą efektywnością i rozdzielczością jak aparatura wymieniona w pkt. 4.1.2.

3.1. Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy składa się z następujących składników:

3.1.1. System wtryskowy.

Stosować system wtryskowy:

a) z wypełnionymi kolumnami, gdy martwa przestrzeń systemu jest możliwie jak najmniejsza (w takim przypadku system wtryskowy musi być zdolny do podgrzania go do temperatury 20 °C do 50 °C wyższej od temperatury kolumny); lub

b) z kolumnami kapilarnymi, w którym to przypadku system musi być specjalnie skonstruowany, aby można było go wykorzystać z takimi kolumnami. Może ono być systemem typu rozdzielacza lub iniektora całkowitego na wlocie do schłodzonej kolumny (iniektor bezkolumnowy).

Uwaga 2:

W razie braku substancji tłuszczowej zawierającej kwasy tłuszczowe o mniejszej ilości atomów węgla niż 16, można zastosować iniektor igłowy.

3.1.2. Piec

Piec musi być w stanie nagrzać kolumnę do temperatury co najmniej 260 °C i utrzymać określoną temperaturę z dokładnością do 1 °C w przypadku kolumny z wypełnieniem i z dokładnością do 0,1 °C w przypadku kolumny kapilarnej. Ta ostatnia właściwość jest szczególnie istotna w razie stosowania rury z topionej krzemionki.

Stosowanie urządzenia wyposażonego w programator temperatury jest zalecane we wszystkich przypadkach, w szczególności w przypadku występowania kwasów tłuszczowych zawierających poniżej 16 atomów węgla.

3.1.3. Kolumna wypełniona

3.1.3.1. Kolumna z materiału obojętnego w stosunku do substancji analizowanej (ze szkła lub w razie braku stali nierdzewnej) o następujących wymiarach: a) długość: 1 do 3 m. Stosunkowo krótka kolumna będzie stosowana w przypadku występowania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu (powyżej C20). W razie analizowania kwasów o liczbie atomów węgla C4 do C6 zaleca się stosowanie kolumny o długości 2 m; b) średnica wewnętrzna: od 2 do 4 mm. Uwaga 3: W razie występowania składników nienasyconych z większą ilością podwójnych wiązań niż trzy, kolumna ze stali nierdzewnej może spowodować ich rozpad. Uwaga 4: Można stosować system z podwójną kolumną z wypełnieniem.

3.1.3.2. Wypełnienie obejmujące następujące składniki a) podłoże: ziemia okrzemkowa wypłukana w kwasach i potraktowana krzemowodorami, lub jakiekolwiek inne stosowne obojętne podłoże o w miarę jednolitym uziarnieniu (25 mm w granicach od 125 do 200 mm), przy czym średni wymiar jest powiązany z wewnętrzną średnicą i długością kolumny; b) faza nieruchoma: faza biegunowa typu poliestrowego (na przykład polibursztynian butanodiolu, poliadypinian etylenoglikolu, itp.), cyianosilikony lub jakakolwiek inna faza umożliwiająca rozdzielenie chromatograficzne (patrz pkt. 4). Faza nieruchoma powinna mieścić się w granicach od 5 % do 20 % (m/m). W niektórych przypadkach oddzielania można stosować fazy niebiegunowe.

3.1.3.3. Przygotowanie kolumny. Po odłączeniu kolumny, jeżeli to możliwe, od detektora, nagrzać stopniowo piec do temperatury 185 °C i utrzymywać kolumnę, przygotowaną w strumieniu obojętnego gazu o natężeniu 20 do 60 ml/min, przez okres 16 godzin w tej temperaturze, a później przez 2 godziny w temperaturze 195 °C.

3.1.4. Kolumna kapilarna

3.1.4.1. Rura z materiału obojętnego w stosunku do badanej substancji (na ogół ze szkła lub topionej krzemionki). Wewnętrzna średnica powinna mieści się w granicach od 0,2 do 0,8 mm. Musi ona być poddana odpowiedniej obróbce od wewnątrz (przygotowanie powierzchni, dezaktywacja) przed nałożeniem warstwy fazy nieruchomej. W większości przypadków długość 25 mm jest wystarczająca.

3.1.4.2. Faza nieruchoma, głównie typu poliglikolowego [poli (etylen glikolu) 20 000], poliestry (polibursztynian butanodiolu) lub polisiloksany biegunowe (cyjanosilikony). Mogą być stosowane szczepione lub usieciowane kolumny. Uwaga 5: Istnieje ryzyko, że polisilioksany biegunowe mogą spowodować trudności przy określaniu i rozdzielaniu kwasu linolenowego i kwasów o C20. Warstwy powinny być cienkie, tzn. 0,1 do 0,2 mm.

3.1.4.3. Montaż i przygotowanie kolumny Przestrzegać normalnych środków ostrożności obowiązujących przy montażu kolumn kapilarnych, to znaczy umieszczenie kolumny w piecu (podłoże), dobór i montaż połączeń (szczelność), rozmieszczenie końcówek kolumny w iniektorze i detektorze (zmniejszenie martwych przestrzeni). Umieścić kolumnę pod strumieniem gazu nośnego (na przykład o ciśnieniu 0,3 bara (30 kPa) dla kolumny o długości 25 mm i średnicy wewnętrznej 0,3 mm). Przygotować kolumnę programując wzrost temperatury pieca na 3 °C/min od poziomu temperatury otoczenia aż do temperatury niższej o 10 °C od granicznej wartości temperatury, w której następuje rozpad fazy nieruchomej. Utrzymywać tę temperaturę przez jedną godzinę do momentu stabilizacji linii podstawowej. Obniżyć temperaturę do 180 °C, aby praca była kontynuowana w warunkach stałej temperatury. Uwaga 6: Odpowiednio przygotowane kolumny dostępne są w handlu.

3.1.5. Detektor, najlepiej taki, który można nagrzać do temperatury przekraczającej temperaturę kolumny.

3.2. Strzykawka

Strzykawka powinna mieć pojemność najwyżej 10 μl i być wyskalowana co 0,1 μl.

3.3. Rejestrator

Gdy zarejestrowana krzywa jest wykorzystywana do obliczania składu analizowanej mieszaniny, należy stosować urządzenie elektroniczne o dużej dokładności, kompatybilne ze stosowaną aparaturą i charakteryzujące się następującymi parametrami:

a) szybkość reakcji poniżej 1,5 s, najlepiej 1 s (szybkością reakcji jest czas wymagany, aby pisak rejestratora przemieścił się od wartości 0 % do 90 % przy nagłym doprowadzeniu sygnału o wartości 100 %);

b) szerokość papieru minimum 20 cm;

c) prędkość odwijania papieru podlegająca regulacji w granicach od 0,4 do 2,5 cm/min.

3.4. Integrator

Zastosowanie integratora elektronicznego umożliwia szybkie i dokładne obliczenia. Reaguje on liniowo przy dostatecznej czułości, a korekta odchylenia linii podstawowej jest zadawalająca.

4. PROCEDURA

Szczegółowe zasady postĘpowania podane w pkt. 4.1 do 4.3 odnoszą się do stosowania płomieniowego detektora jonizacyjnego.

W rozwiązaniu zamiennym można stosować aparat do chromatografii gazowej z detektorem termokonduktometrycznym (działającym na zasadzie termicznych zmian przewodzenia). Warunki pracy powinny być w takiej sytuacji zmienione zgodnie z opisem zamieszczonym w pkt. 6.

4.1. Warunki badania

4.1.1. Dobór optymalnych warunków pracy 4.1.1.1. W przypadku kolumny z wypełnieniem W celu dokonania doboru warunków pracy należy uwzględnić następujące zmienne: a) długość i średnica kolumny; b) charakter i ilość fazy nieruchomej; c) temperatura kolumny; d) natężenie przepływu gazu nośnego; e) oczekiwana rozdzielczość; f) wielkość badanej próbki dobrana w taki sposób, aby zespół detektora i elektrometru dawał reakcję liniową; g) czas trwania analizy. Na ogół wartości podane w tabeli 1 i tabeli 2 będą wartościami określającymi wymagane wyniki, to znaczy liczba teoretycznych półek, wynosząca co najmniej 2 000 na metr kolumny dla stearynianu metylu i jego elucja w czasie około 15 minut. Gdy aparat na to pozwala, iniektor powinien mieć temperaturę zbliżoną do 200 °C, a detektor temperaturę równą lub wyższą niż temperatura kolumny. Na ogół stosunek natężenia przepływu wodoru płomieniowego detektora jonizacyjnego do gazu nośnego waha się od 1: 2 do 1: 1 zależnie od średnicy kolumny. Natężenie przepływu tlenu jest około 5 do 10 razy większe niż wodoru.



Tabela 1 Wewnętrzna średnica kolumny w mm Przepływ gazu nośnego w ml/min 2 15 do 25 3 20 do 40 4 40 do 60



Tabela 2 Stężenie fazy nieruchomej % (m/m) Temperatura kolumny °C 5 175 10 180 15 180 20 185 4.1.1.2. Kolumna kapilarna Właściwości sprawności i przenikalności kolumn kapilarnych sprawiają, że rozdzielanie składników i czas trwania analizy zależą w bardzo dużym stopniu od natężenia przepływu gazu nośnego w kolumnie. Niezbędne będzie na drodze oddziaływania tym parametrem (lub po prostu spadkiem wysokości ciśnienia w kolumnie) dokonanie optymalizacji warunków pracy w zależności od tego czy dąży się do uzyskania lepszego rozdziału, czy też szybkiego przeprowadzenia analizy.

4.1.2. Oznaczenie liczby teoretycznych półek (sprawność) i rozdzielczości (patrz rysunek 1) Przeprowadzić analizę mieszaniny stearynianu i oleinianu metylu wymieszanych ze sobą w jednakowych zasadniczo proporcjach (na przykład estry metylowe masła kakaowego). Dobrać wielkość próbki, temperaturę kolumny i natężenie przepływu nośnego w taki sposób, aby maksymalna wartość szczytowa stearynianu metylu została zarejestrowana w 15 minut po szczytowej wartości rozpuszczalnika i aby ta wartość szczytowa odpowiadała trzem czwartym pełnej skali. Obliczyć liczbę teoretycznych półek n za pomocą wzoru: rozdzielczość R za pomocą wzoru: gdzie: dr1 odległość retencji w milimetrach zmierzona od początku chromatogramu do maksymalnej wartości szczytowej stearynianu metylu; ω1 and ω2 zerokości w milimetrach szczytowych wartości stearynianu i oleinianu metylu zmierzone między punktami przecięcia z linią podstawową stycznych do punktów ugięcia krzywej; Δ odległość w milimetrach między względnymi maksymalnymi punktami wartości szczytowych stearynianu i oleinianu metylu; ▼M2 oraz indeks rozdziału, lr, określony za pomocą wyrażenia gdzie: a = wysokość najmniejszego piku mierzona od linii podstawowej; b = wysokość najniższego punktu położonego między dwoma sąsiadującymi pikami, mierzona od linii podstawowej. ▼B Rysunek 1. Chromatogram oznaczania liczby teoretycznych półek (sprawność) i rozdzielczości PoczątekWarunki robocze są wyznaczone przez liczbę teoretycznych półek dla stearynianu metylu co najmniej równą 2 000 na metr kolumny i rozdzielczości co najmniej 1,25.

4.2. Pobranie próbki

Za pomocą strzykawki (3.2) pobrać 0,1 do 2 ml roztworu estrów metylowych uzyskanego metodą opisaną w załączniku X B i wstrzyknąć do kolumny.

W przypadku estrów bez rozpuszczalników przygotować roztwór ze 100 mg/ml w heptanie przeznaczonym do chromatografii gazowej i wstrzyknąć 0,1 do 1 ml tego roztworu.

W celu zbadania obecności składników występujących w ilościach śladowych można zwiększyć wielkość próbki (nawet 10-krotnie).

4.3. Analiza

W zwykłych przypadkach prowadzić analizę w warunkach określonych w pkt. 4.1.1.

Można jednak pracować przy niższej temperaturze kolumny, w przypadku, w którym zachodzi konieczność dozowania kwasów tłuszczowych, których liczba atomów węgla jest mniejsza niż 12, lub wyższej w przypadku, w którym zachodzi konieczność dozowania kwasów tłuszczowych, których liczba atomów węgla jest większa niż 20. W obu przypadkach istnieje ewentualnie możliwość pracy w temperaturze zaprogramowanej. Jeżeli na przykład próbka zawiera estry metylowe kwasów tłuszczowych zawierające co najmniej 12 atomów węgla, wstrzyknąć próbkę o temperaturze 100 °C (lub 50-60oC, jeżeli występuje w niej kwas masłowy) i bezzwłocznie zaprogramować na wzros