Dokument ten s łuży wyłącznie do celów dokumentacyjnych i instytucje nie ponosz ą żadnej odpowiedzialno ści za jego 
zawartość 
►B ROZPORZ ĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 440/2008  
z dnia 30 maja 2008 r.  
ustalające metody bada ń zgodnie z rozporz ądzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu 
Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwole ń i stosowanych 
ogranicze ń w zakresie chemikaliów (REACH)  
(Tekst maj ący znaczenie dla EOG)  
(Dz.U. L 142 z 31.5.2008, s. 1)  
zmienione przez:  
Dziennik Urz ędowy  
nr strona  data  
►M1 Rozporz ądzenie Komisji (WE) nr 761/2009 z dnia 23 lipca 2009 r.  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Rozporz ądzenie Komisji (UE) nr 1152/2010 z dnia 8 grudnia 2010 r.  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Rozporz ądzenie Komisji (UE) nr 640/2012 z dnia 6 lipca 2012 r.  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Rozporz ądzenie Komisji (UE) nr 260/2014 z dnia 24 stycznia 2014 r.  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Rozporz ądzenie Komisji (UE) nr 900/2014 z dnia 15 lipca 2014 r.  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1
ROZPORZ ĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 440/2008  
z dnia 30 maja 2008 r.  
ustalające metody bada ń zgodnie z rozporz ądzeniem (WE) 
nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwole ń i stosowanych ogranicze ń 
w zakresie chemikaliów (REACH)
 
(Tekst maj ący znaczenie dla EOG)  
KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,  
uwzględniając Traktat ustanawiaj ący Wspólnot ę Europejsk ą, 
uwzględniając rozporz ądzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europej ­
skiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, 
udzielania zezwole ń i stosowanych ogranicze ń w zakresie chemikaliów 
(REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniaj ące 
dyrektyw ę 1999/45/WE oraz uchylaj ące rozporz ądzenie Rady (EWG) 
nr 793/93 i rozporz ądzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak równie ż 
dyrektyw ę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 
93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE (  1 ), w szczególno ści jego 
art. 13 ust. 3,  
a także mając na uwadze, co nast ępuje:  
(1) Zgodnie z rozporz ądzeniem (WE) nr 1907/2006, je żeli dla wyge ­
nerowania informacji o swoistych w łaściwościach substancji 
wymagane s ą badania, przeprowadza si ę je przy u życiu metod 
badań określonych na poziomie Wspólnoty.  
(2) Dyrektywa Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. 
w sprawie zbli żenia przepisów ustawodawczych, wykonawczych 
i administracyjnych odnosz ących się do klasyfikacji, pakowania 
i etykietowania substancji niebezpiecznych (  2 ) ustanawia 
w załączniku V metody okre ślania właściwości fizyko-chemicz ­
nych, toksyczno ści oraz ekotoksyczno ści substancji i preparatów. 
Załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG zosta ł skreślony dyrek ­
tywą 2006/121/WE Parlamentu Europejskiego i Rady ze skut ­
kiem od dnia 1 czerwca 2008 r.  
(3) Należy włączyć do niniejszego rozporz ądzenia metody bada ń 
zawarte w za łączniku V do dyrektywy 67/548/EWG.  
(4) Niniejsze rozporz ądzenie nie wyklucza stosowania innych metod 
badań, pod warunkiem że ich stosowanie jest zgodne z art. 13. 
ust. 3 rozporz ądzenia 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1; sprostowanie w Dz.U. L 136 z 29.5.2007, 
s. 3. 
( 2 ) Dz.U. 196 z 16.8.1967, s. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektyw ą 
2006/121/WE Parlamentu Europejskiego i Rady (Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 850; sprostowanie w Dz.U. L 136 z 29.5.2007, s. 281).
 (5) Przy opracowywaniu metod bada ń należy w pełni uwzgl ędnić 
zasady zast ępowania bada ń na zwierz ętach innymi metodami, 
ograniczania skali bada ń na zwierz ętach i doskonalenia metod 
tego rodzaju bada ń, zwłaszcza je śli dostępne są odpowiednie 
zatwierdzone metody zast ępowania, ograniczania i doskonalenia 
badań na zwierz ętach.  
(6) Przepisy niniejszego rozporz ądzenia s ą zgodne z opini ą 
Komitetu powo łanego na mocy art. 133 rozporz ądzenia (WE) 
nr 1907/2006,  
PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZ ĄDZENIE:  
Artykuł 1 
Metody bada ń stosowanych do celów rozporz ądzenia 1907/2006/WE 
określa się w załączniku do niniejszego rozporz ądzenia.  
Artykuł 2 
W stosownych przypadkach Komisja dokona przegl ądu metod bada ń 
określonych w niniejszym rozporz ądzeniu pod k ątem możliwości zastę­
powania, ograniczania i doskonalenia bada ń na zwierz ętach kręgowych.  
Artykuł 3 
Wszelkie odes łania do za łącznika V do dyrektywy 67/548/EWG s ą 
traktowane jako odes łania do niniejszego rozporz ądzenia.  
Artykuł 4 
Niniejsze rozporz ądzenie wchodzi w życie nast ępnego dnia po jego 
opublikowaniu w  Dzienniku Urz ędowym Unii Europejskiej . 
Niniejsze rozporz ądzenie stosuje si ę od dnia 1 czerwca 2008 r.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
ZAŁĄCZNIK  
CZĘŚĆ  A: METODY USTALANIA W ŁAŚCIWOŚCI FIZYKO- 
CHEMICZNYCH  
SPIS TRE ŚCI 
A.1. TEMPERATURA TOPNIENIA/KRZEPNI ĘCIA 
A.2. TEMPERATURA WRZENIA 
A.3. G ĘSTOŚĆ WZGLĘDNA 
A.4. CI ŚNIENIE PARY 
A.5. NAPI ĘCIE POWIERZCHNIOWE 
A.6. ROZPUSZCZALNO ŚĆ W WODZIE 
A.8. WSPÓ ŁCZYNNIK PODZIA ŁU 
A.9. TEMPERATURA ZAP ŁONU 
A.10. ZAPALNO ŚĆ (CIAŁA STAŁE) 
A.11. ZAPALNO ŚĆ (GAZY) 
A.12. ZAPALNO ŚĆ (W KONTAKCIE Z WOD Ą) 
A.13. W ŁAŚCIWOŚCI PIROFORYCZNE CIA Ł STAŁYCH I CIECZY 
A.14. W ŁAŚCIWOŚCI WYBUCHOWE 
A.15. TEMPERATURA SAMOZAP ŁONU (CIECZE I GAZY) 
A.16. WZGL ĘDNA TEMPERATURA SAMOZAP ŁONU DLA CIA Ł 
STAŁYCH 
A.17. W ŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJ ĄCE (CIAŁA STAŁE) 
A.18. ŚREDNIA LICZBOWA MASA CZ ĄSTECZKOWA 
I ROZKŁAD MASY CZ ĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW 
A.19. ZAWARTO ŚĆ POLIMERÓW O MA ŁEJ MASIE CZ ĄSTECZ­
KOWEJ 
A.20. ZACHOWANIE POLIMERÓW W WODZIE – ROZPUSZCZA ­
NIE/EKSTRAKCJA 
A.21. W ŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJ ĄCE (CIECZE) 
A.22. WA ŻONA DŁUGOŚCIĄ ŚREDNIA GEOMETRYCZNA ŚRED­
NICA W ŁÓKIEN  
▼M4 
A.23. WSPÓ ŁCZYNNIK PODZIA ŁU (1-OKTANOL/WODA): 
METODA POWOLNEGO MIESZANIA  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. TEMPERATURA TOPNIENIA/KRZEPNI ĘCIA 
1. METODA  
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotycz ­ 
ących bada ń (1). Podstawowe zasady podano w pozycjach biblio ­
graficznych (2) i (3).  
1.1. WPROWADZENIE  
Opisane metody i urz ądzenia powinny by ć stosowane do ustalania 
temperatury topnienia substancji, bez ogranicze ń związanych z ich 
stopniem czysto ści. 
Wybór metody zale ży od charakteru badanej substancji. 
W konsekwencji, czynnikiem ograniczaj ącym będzie to, czy 
substancja łatwo, z trudno ścią czy też wcale nie poddaje si ę sprosz­
kowaniu.  
W przypadku niektórych substancji bardziej w łaściwe jest ozna ­
czanie temperatury zamarzania lub krzepni ęcia, przy czym 
w wytycznych uwzgl ędniono tak że normy dla tych oznacze ń. 
Jeżeli z powodu szczególnych w łaściwości substancji żaden 
z powyższych parametrów nie mo że być zmierzony w sposób 
konwencjonalny, mo że być stosowne okre ślenie temperatury p łynię­
cia. 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Temperatur ę topnienia definiuje si ę jako temperatur ę, w której 
przejście fazowe ze stanu sta łego do stanu ciek łego zachodzi pod 
ciśnieniem atmosferycznym i niniejsza temperatura idealnie odpo ­
wiada temperaturze krzepni ęcia. 
Ponieważ przechodzenie z jednego stanu skupienia do drugiego 
w przypadku wielu substancji zachodzi w szerokim zakresie tempe ­
ratury, cz ęsto opisuje si ę go jako zakres temperatury topnienia.  
Jednostki konwersji (ze stopni K na  o C) 
t = T – 273,15  
t: temperatura Celsjusza, stopie ń Celsjusza (  o C) 
T: temperatura termodynamiczna, stopie ń Kelwina (K)  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
Niektóre substancje kalibracyjne wymieniono w pozycji bibliogra ­
ficznej (4).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Temperatura (zakres temperatur) przej ścia fazowego ze stanu sta łego 
do stanu ciek łego lub ze stanu ciek łego w stan sta ły jest ustalona. 
W praktyce podczas podgrzewania/sch ładzania próbki substancji 
badanej pod ci śnieniem atmosferycznym ustalane s ą temperatury 
etapu pocz ątkowego topnienia/krzepni ęcia i ko ńcowego etapu 
topnienia/krzepni ęcia. Opisano pi ęć rodzajów metod, mianowicie 
metodę kapilarną, metody ze stolikami grzewczymi, ustalanie tempe ­
ratur krzepni ęcia, metody analiz termicznych, i ustalanie temperatury 
płynięcia (według rozwini ętych opracowa ń dla olejów naftowych).  
W niektórych przypadkach wygodniejsze jest zmierzenie temperatury 
krzepnięcia w miejsce temperatury topnienia.  
1.4.1.  Metoda kapilarna  
1.4.1.1.  Przyrz ądy do oznaczania temperatury topnienia z łaźnią cieczową 
Niewielką ilość drobno zmielonej substancji umieszcza si ę w rurce 
kapilarnej i ciasno upakowuje. Rurk ę podgrzewa si ę łącznie 
z termometrem, reguluj ąc wzrost temperatury w ten sposób, aby 
wynosił mniej ni ż 1 K/min w trakcie topnienia. Oznacza si ę 
początkową i końcową temperatur ę topnienia.  
1.4.1.2.  Przyrz ądy do oznaczania temperatury topnienia z blokiem metalu  
Zgodnie z opisem w ppkt 1.4.1.1, z tym że rurka kapilarna 
i termometr s ą umieszczone w podgrzewanym bloku metalu, przy 
czym mo żna je obserwowa ć przez znajduj ące się w nim otwory.  
1.4.1.3.  Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej  
Próbka w rurce kapilarnej jest automatycznie podgrzewana 
w cylindrze metalowym. Wi ązka światła jest automatycznie kiero ­
wana przez substancj ę, poprzez dziur ę w cylindrze, do precyzyjnie 
skalibrowanej komórki fotoelektrycznej. W łaściwości optyczne wi ęk­
szości substancji zmieniaj ą się z nieprzezroczystych na przezroczyste 
podczas topnienia. Nat ężenie światła docieraj ącego do komórki foto ­
elektrycznej zwi ększa się, w wyniku czego wysy łany jest sygna ł 
zatrzymania do cyfrowego wska źnika odczytuj ącego temperatur ę 
z platynowego termometru oporowego umieszczonego w komorze 
grzejnej. Metoda ta nie ma zastosowania do niektórych intensywnie 
zabarwionych substancji.  
1.4.2.  Płyty grzewcze  
1.4.2.1.  Płyta grzewcza Koflera  
W metodzie p łyty grzewczej Koflera wykorzystuje si ę dwa kawa łki 
metalu o ró żnym przewodnictwie cieplnym, podgrzewane elektrycz ­
nie, przy czym stolik jest zaprojektowany w taki sposób, aby gradient temperatury by ł prawie liniowy wzd łuż jego długości. 
Temperatura rozgrzanej p łyty może dochodzi ć od 283 do 573 K, 
przy czym odczytywana jest ona przy pomocy specjalnego urządzenia do odczytywania temperatury, sk ładającego si ę 
z suwaka ze wska źnikiem i klapki przeznaczonej dla odpowiedniego 
stolika. W celu ustalenia temperatury topnienia, substancj ę umieszcza 
się cienką warstwą bezpośrednio na powierzchni gor ącej płyty. 
W ciągu kilku sekund pokazuje si ę ostra linia oddzielaj ąca ciecz 
od fazy sta łej. Temperatur ę na wysoko ści linii dziel ącej odczytuje 
się przez ustawienie wska źnika w taki sposób, aby spoczywa ł na tej 
linii.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Mikroskop do badania topnienia  
Szereg mikroskopowych p łyt grzewczych wykorzystuje si ę do usta­
lania temperatury przy u życiu bardzo ma łych ilości materia łu. 
W większości płyt grzewczych temperatur ę mierzy si ę przy pomocy 
czułego termoogniwa, jednak czasem wykorzystywane s ą także 
termometry rt ęciowe. Typowy przyrz ąd mikroskopowy do ozna ­
czania temperatury topnienia metod ą podgrzewania p łyty jest wypo ­
sażony w komor ę grzewcz ą, która zawiera p łytkę metalow ą, na 
której umieszczana jest próbka na szkie łku. W środku płytki meta ­
lowej znajduje si ę otwór, przez któr ą wchodzi światło z lusterka 
oświetlającego mikroskopu. W trakcie u życia, komora jest zamkni ęta 
przez szklan ą płytę w celu odci ęcia powietrza od obszaru próbki.  
Podgrzewanie próbki jest regulowane za pomoc ą reostatu. Dla 
bardzo precyzyjnych pomiarów dla substancji optycznie anizotropo ­
wych, stosuje si ę światło spolaryzowane.  
1.4.2.3.  Metoda menisku  
Metodę tę wykorzystuje si ę głównie w odniesieniu do poliamidów.  
W sposób wizualny oznacza si ę temperatur ę, przy której zachodzi 
przemieszczenie menisku oleju silikonowego, zawartego mi ędzy 
płytą grzewcz ą i szklan ą przykrywk ą opartą na próbce badanego 
poliamidu.  
1.4.3.  Metoda oznaczania temperatury krzepni ęcia 
Próbkę umieszcza si ę w specjalnej probówce i umieszcza 
w przyrz ądzie dla oznaczania temperatury krzepni ęcia. Próbka jest 
delikatnie i ci ągle mieszana w trakcie ch łodzenia, a temperatura jest 
mierzona w odpowiednich przedzia łach. Gdy tylko temperatura 
pozostaje na sta łym poziomie podczas kilku kolejnych odczytów 
(skorygowanych o b łąd termometru), zapisuje si ę ją jako temperatur ę 
krzepnięcia. 
Należy zapobiega ć szybkiemu sch ładzaniu przez utrzymywanie 
równowagi mi ędzy fazą stałą i fazą ciekłą. 
1.4.4.  Analiza termiczna  
1.4.4.1.  Różnicowa analiza termiczna (DTA)  
Niniejsza technika rejestruje ró żnicę w temperaturach mi ędzy daną 
substancją i materia łem odniesienia w funkcji temperatury, w trakcie 
poddawania danej substancji i materia łu odniesienia temu samemu 
programowi kontrolowania temperatury. W momencie gdy próbka ulega przemianie poci ągającej zmian ę entalpii, zmiana ta jest wska ­
zywana przez odchylenie endotermiczne (topnienie) lub egzoter ­
miczne (krzepni ęcie) od linii bazowej zapisu temperatury.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)  
Niniejsza technika rejestruje ró żnicę w energii pobranej przez dan ą 
substancję i materia ł odniesienia, w funkcji temperatury, w trakcie 
poddawania danej substancji i materia łu odniesienia temu samemu 
programowi kontrolowania temperatury. Niniejsza energia jest 
energią konieczn ą do osi ągnięcia zerowej ró żnicy temperatury 
między daną substancj ą a materia łem odniesienia. W momencie, 
gdy próbka ulega przemianie poci ągającej zmian ę entalpii, zmiana 
ta jest wskazywana przez odchylenie endotermiczne (topnienie) lub 
egzotermiczne (krzepni ęcie) od linii bazowej zapisu przep ływu 
ciepła. 
1.4.5.  Temperatura p łynięcia 
Niniejsza metoda zosta ła opracowana dla olejów naftowych i jest 
właściwa do zastosowania dla substancji olejowych o niskich tempe ­
raturach topnienia.  
Po ogrzaniu wst ępnym próbka jest ch łodzona z w łaściwą szybkością 
i badane s ą w odst ępach co 3 K charakterystyki przep ływu. 
Najniższa temperatura, przy której jest obserwowany ruch substancji, 
jest odczytywana jako temperatura p łynięcia. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Stosowalno ść i dokładność różnych metod wykorzystywanych do 
oznaczania temperatury topnienia/zakres temperatur topnienia przed ­
stawiono w poni ższej tabeli:  
TABELA: STOSOWALNO ŚĆ METOD  
A. Metody kapilarne  
Metoda pomiaru Substancje łatwo 
proszkowalne Substancje trudno 
proszkowalne Zakres 
temperatury Założona 
dokładność ( 1 ) Istniejąca norma  
Przyrządy do 
pomiaru tempera ­
tury topnienia z łaźnią cieczową tak Tylko niektóre 273 do 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Przyrządy do 
pomiaru tempera ­
tury topnienia z blokiem metalu tak Tylko niektóre 293 do 
> 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Wykrywanie przy 
pomocy komórki 
fotoelektrycznej tak Poszczególne 
z zastosowanie ­
m urządzeń 253 do 573 K ± 0,5 K
 
( 1 ) W zale żności od typu przyrz ądu i stopnia czysto ści substancji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Metody temperaturowe i sch ładzania  
Metoda pomiaru Substancje łatwo 
proszkowalne Substancje trudno 
proszkowalne Zakres 
temperatury Założona 
dokładność ( 1 ) Istniejąca norma  
Płyta grzewcza 
Koflera tak nie 283 do 
> 573 K ± 1 K ANSI/ASTM 
D 3451-76 
Mikroskop do 
badania topnienia tak Tylko niektóre 273 do 
> 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Metoda menisku nie Specyficzna dla 
poliamidów 293 do 
> 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Metody badania 
temperatur krzep ­
nięcia tak tak 223 do 573 K ± 0,5 K e.g. BS 4695  
( 1 ) W zale żności od typu przyrz ądu i stopnia czysto ści substancji.  
C. Analizy termiczne  
Metoda pomiaru Substancje łatwo 
proszkowalne Substancje trudno 
proszkowalne Zakres 
temperatury Założona 
dokładnoś ( 1 ) Istniejąca norma  
Różnicowa analiza 
termiczna tak tak 173 do 
1 273 K do 600 
K ± 0,5 K do 
1 273 K ± 
2,0 K ASTM E 537-76 
Rożnicowa kalo ­
rymetria skanin ­
gowa tak tak 173 do 
1273 K do 600 
K ± 0,5 K do 
1 273 K 
± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) W zale żności od typu przyrz ądu stopnia czysto ści substancji.  
D. Temperatura p łynięcia 
Metoda pomiaru Substancje latwo 
proszkowalne Substancje trudno 
proszkowalne Zakres 
temperatury Założona 
dokładnoś ( 1 ) Istniejąca norma  
Temperatura 
płynięcia Dla olejów 
naftowych 
i substancji 
oleistych Dla olejów 
naftowych 
i substancji 
oleistych 223 do 323 K ± 0,3 K ASTM D 97-66  
( 1 ) W zale żności od typu przyrz ądu i stopnia czysto ści substancji.  
1.6. OPIS METOD  
Procedury przeprowadzenia oznacze ń według prawie wszystkich 
metod opisano w normach mi ędzynarodowych i krajowych (zob. 
dodatek 1).  
1.6.1.  Metody z wykorzystaniem rurki kapilarnej  
Drobno sproszkowane substancje poddawane powolnemu wzrostowi 
temperatury, zwykle wykazuj ą etapy topnienia przedstawione na 
rys. 1.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Rysunek 1
  
W trakcie ustalania temperatury tapnienia odnotowuje si ę tempera­
tury na pocz ątku topnienia i na etapie ko ńcowym.  
1.6.1.1.  Przyrz ąd do badania temperatury topnienia z łaźnią cieczową 
Na rysunku 2 przedstawiono rodzaj znormalizowanego przyrz ądu do 
badania temperatury topnienia wykonanego ze szk ła (JTS K 0064); 
wszystkie wymiary podano w milimetrach.  
Rysunek 2
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Łaźnia cieczowa:  
Należy wybrać odpowiedni ą ciecz. Wybór cieczy zale ży od tempe ­
ratury topnienia, która ma by ć oznaczona, na przyk ład ciekła para­
fina dla temperatur topnienia nie wy ższych od 473 K, olej siliko ­
nowy dla temperatur topnienia nie wy ższych niż 573 K.  
Dla temperatur topnienia powy żej 523 K mo żna wykorzysta ć 
mieszanin ę składającą się z trzech cz ęści kwasu siarkowego 
i dwóch cz ęści siarczanu potasu (wagowo). Nale ży podjąć stosowne 
środki ostro żności przy stosowaniu mieszaniny takiej jak niniejsza.  
Termometr:  
Należy używać wyłącznie termometrów spe łniających wymagania 
następujących norm lub norm równowa żnych:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Procedura:  
Suchą substancj ę należy drobno sproszkowa ć w mo ździerzu 
i wprowadzi ć do rurki kapilarnej zatopionej na ko ńcu, tak aby 
poziom nape łnienia wynosi ł około 3 mm po ciasnym upakowaniu. 
Aby uzyska ć jednolicie upakowan ą próbkę, należy spuścić rurkę 
kapilarną z wysoko ści około 700 mm przez rurk ę szklaną, pionowo 
na szkiełko zegarkowe.  
Napełnioną rurkę kapilarną umieszcza si ę w łaźni tak, by środkowa 
część rtęciowej ba ńki termometru styka ła się z rurką kapilarn ą 
w części, w której umieszczona jest próbka. Zwykle rurk ę kapilarną 
wprowadza si ę do przyrz ądu o temperaturze o oko ło 10 K ni ższej od 
temperatury topnienia.  
Ciecz łaźni jest podgrzewana w ten sposób, aby temperatura ros ła 
o około 3 K/min. Ciecz nale ży mieszać. Przy oko ło 10 K poni żej 
oczekiwanej temperatury topnienia szybko ść przyrostu temperatury 
ustawia si ę na maksimum 1 K/min.  
Obliczenie:  
Temperatur ę topnienia oblicza si ę na podstawie nast ępującego 
wzoru:  
T = T  D + 0,00016 (T  D – T  E ) n 
gdzie:  
T = skorygowana temperatura topnienia w stopniach K,  
T D = odczyt temperatury z termometru D w stopniach K,  
T E = odczyt temperatury z termometru E w stopniach K,  
n = liczba kresek podzia łki słupka rtęci na termometrze D przy 
rurce wyj ściowej.  
1.6.1.2.  Przyrz ądy do pomiaru temperatury topnienia z metalowym blokiem  
Przyrząd: 
Składa się z: 
— cylindrycznego bloku metalowego, którego górna cz ęść jest 
wydrążona i tworzy komor ę (zob. rysunek 3),  
— zatyczki metalowej z dwiema lub wi ększą liczbą dziur, która 
pozwala na montowanie probówek na bloku metalowym,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— systemu grzejnego do podgrzewania bloku metalowego, wyposa ­ 
żonego na przyk ład w grza łki oporowe elektryczne zamkni ęty 
w bloku,  
— reostatu do regulacji zasilania, je żeli stosowane jest podgrze ­
wanie elektryczne,  
— czterech okienek ze szk ła żaroodpornego na poprzecznych ścia­
nach komory, zorientowanych pod k ątem prostym wzgl ędem 
siebie. Przed ka żdym z okienek zamontowany jest okular do 
obserwacji rurki kapilarnej. Pozosta łe trzy okienka s ą wykorzy ­
stywane do o świetlania wn ętrza zamkni ęcia przy pomocy lamp,  
— rurki kapilarnej ze szk ła żaroodpornego, zamkni ętej na jednym 
końcu (zob. ppkt 1.6.1.1).  
Zob. normy wspomniane w ppkt 1.6.1.1. Stosuje si ę także termoelek ­
tryczne przyrz ądy pomiarowe o porównywalnej dok ładności. 
Rysunek 3
  
1.6.1.3.  Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej  
Przyrząd i procedura:  
Przyrząd składa się z komory metalowej z automatycznym systemem 
grzewczym. Trzy rurki kapilarne s ą napełniane zgodnie z ppkt 
1.6.1.1 i umieszczane w piecu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Możliwych jest kilka liniowych ustawie ń narastania temperatury 
w celu skalibrowania przyrz ądu, przy czym w łaściwy wzrost tempe ­
ratury jest regulowany elektrycznie na z góry okre śloną stałą 
i szybkość liniową. Rejestratory pokazuj ą rzeczywist ą temperatur ę 
pieca i temperatur ę substancji w rurkach kapilarnych.  
1.6.2.  Płyty grzewcze  
1.6.2.1.  Płyta grzewcza Koflera  
Zob. dodatek.  
1.6.2.2.  Mikroskop do badania topnienia  
Zob. dodatek.  
1.6.2.3.  Metoda menisku (poliamidy)  
Zob. dodatek.  
Szybkość grzania w obr ębie temperatury topnienia powinna by ć 
mniejsza ni ż 1 K/min.  
1.6.3.  Metody oznaczania temperatury krzepni ęcia 
Zob. dodatek.  
1.6.4.  Analiza termiczna  
1.6.4.1.  Różnicowa analiza termiczna  
Zob. dodatek.  
1.6.4.2.  Różnicowa kalorymetria skaningowa  
Zob. dodatek.  
1.6.5.  Oznaczanie temperatury p łynięcia 
Zob. dodatek.  
2. DANE  
W niektórych przypadkach konieczna jest korekcja termometru.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— zastosowana metoda,  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia) i wst ępny etap oczyszczenia, je śli wykonano,  
— ocena dok ładności. 
Jako temperatur ę topnienia przedstawia si ę średnią z co najmniej 
dwóch pomiarów znajduj ących się w granicach oszacowanej dok ład­
ności pomiarowej (zob. tabele).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Jeżeli różnica między temperatur ą na początku i na ko ńcowym etapie 
topnienia znajduje si ę w granicach dok ładności metody, za tempera ­
turę topnienia przyjmuje si ę temperatur ę na końcowym etapie topnie ­
nia; w innym przypadku podaje si ę obie temperatury.  
Jeżeli substancja przed osi ągnięciem temperatury topnienia rozk łada 
się lub sublimuje, podawana jest temperatura, w której obserwowane 
są te efekty.  
Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji 
wyników, w szczególno ści w odniesieniu do zanieczyszcze ń i stanu 
skupienia substancji.  
4. LITERATURA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803–834.  
(3) R. Weissberger éd.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, 505–515.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Dodatek  
W celu uzyskania dodatkowych szczegó łów technicznych mo żna zapozna ć się na 
przykład z nast ępującymi normami.  
1. Metody kapilarne  
1.1. Urz ądzenia do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the melting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of 
melting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapilarverfarehn 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products.
 
1.2. Urz ądzenia do pomiaru temperatury topnienia z blokiem metalowym 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen 
ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of 
„melting point”  
2. P łyty grzewcze  
2.1. P łyta grzewcza Koflera 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric powder coatings  
2.2. Mikroskop do badania topnienia 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststoffen  
2.3. Metoda menisku (dla poliamidów) 
ISO 1218 (E) Plastics – polyamides – determination 
of „melting point”  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion mate ­
rials 
NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination 
du „point de fusion” méthode du 
menisque  
3. Metody ustalania temperatury krzepni ęcia 
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of petroleum wax (Cooling Curve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de petrole: determination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsiiuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines 
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Analiza termiczna  
4.1. Ró żnicowa analiza termiczna 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by 
methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Ró żnicowa kalorymetria skaningowa 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
 
5. Oznaczanie temperatury p łynięcia 
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits 
du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite – Monsterneming 
en ontleding van aardolieproducten: 
Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils – Determination of pour 
point
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. TEMPERATURA WRZENIA  
1. METODA  
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotycz ­ 
ących bada ń (1). Podstawowe zasady podano w (2) i (3).  
1.1. WPROWADZENIE  
Urządzenia i metody tutaj opisane stosuje si ę do cieczy i nisko 
topliwych substancji, pod warunkiem że nie ulegaj ą one reakcji 
chemicznej poni żej ich temperatury wrzenia (jak na przyk ład: samo­
utlenieniu, wtórnemu przekszta łceniu, rozk ładowi i tak dalej). 
Metody te mog ą być stosowane do czystych i zanieczyszczonych 
ciekłych substancji.  
Kładzie się nacisk na metody wykorzystuj ące wykrywanie za 
pomocą komórki fotoelektrycznej i analiz ę termiczn ą, poniewa ż 
metody te pozwalaj ą na oznaczenie zarówno temperatury topnienia 
jak i temperatury wrzenia. Ponadto, pomiary mog ą być wykonywane 
w sposób automatyczny.  
„Metoda dynamiczna” ma t ę zaletę, że można ją także wykorzy ­
stywać do oznaczenia ci śnienia pary i nie jest konieczna korekcja 
temperatury wrzenia do ci śnienia normalnego (101,325 kPa), gdy ż 
można regulowa ć ciśnienie normalne podczas pomiaru.  
Uwagi:  
Wpływ zanieczyszcze ń na oznaczanie temperatury wrzenia w du żym 
stopniu zale ży od charakteru zanieczyszczenia. Je żeli w próbce znaj ­
dują się lotne zanieczyszczenia mog ące wpływać na wyniki, badan ą 
substancję należy oczyścić. 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Temperatura wrzenia normalna jest zdefiniowana jako temperatura, 
przy której pr ężność pary cieczy wynosi 101,325 kPa.  
Jeżeli temperatura wrzenia nie jest mierzona w normalnym ci śnieniu 
atmosferycznym, zale żność prężności pary od temperatury opisuje 
się równaniem Clausiusa – Clapeyrona:  
log p ¼ ΔH v 
2; 3RT þ const : 
gdzie:  
P = pr ężność pary substancji w paskalach,  
ΔH V = jej ciep ło parowania w J mol  -1 , 
R = uniwersalna molowa sta ła gazowa = 8,314 J mol  -1 K -1 , 
T = temperatura termodynamiczna w stopniach K.  
Temperatura wrzenia jest ustalona w odniesieniu do ci śnienia 
otoczenia w czasie trwania pomiaru.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Konwersje  
Ciśnienie (jednostki: kPa)  
100 kPa = l bar = 0,1 MPa 
(jednostka „bar” jest wci ąż dozwolona, ale nie jest zale ­
cana)  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 tor 
(jednostki „mm H” i „Torr” nie s ą dozwolone)  
1 atm = standardowa atmosfera = 101 325 Pa 
(jednostka „atm” jest niedozwolona)  
Temperatura (jednostki: K)  
t = T - 273,15  
t: temperatura Celsjusza, stopie ń Celsjusza (  o C) 
T: temperatura termodynamiczna, Kelwin (K)  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
Niektóre substancje kalibracyjne wymieniono w opisach metod 
wymienionych w dodatku.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Pięć metod ustalania temperatury wrzenia (zakresu wrzenia) jest 
oparte na pomiarze temperatury wrzenia, dwie inne oparte s ą 
o analizę termiczn ą. 
1.4.1.  Wyznaczanie za pomoc ą ebuliometru  
Ebuliometry zosta ły pierwotnie opracowane w celu oznaczania masy 
cząsteczkowej poprzez podwy ższanie temperatury wrzenia, jednak 
nadają się także do dok ładnych pomiarów tej temperatury. Bardzo 
prosty przyrz ąd opisano w ASTM D 1120-72 (zob. dodatek). Ciecz 
jest podgrzewana w tym przyrz ądzie w warunkach równowagi, pod 
ciśnieniem atmosferycznym, do wrzenia.  
1.4.2.  Metoda dynamiczna  
Metoda ta obejmuje pomiar temperatury ponownej kondensacji pary 
przy pomocy w łaściwego termometru w wykroplinach podczas wrze ­
nia. Podczas stosowania tej metody ci śnienie mo że być zmienne.  
1.4.3.  Metoda destylacji dla wyznaczania temperatury wrzenia  
Metoda ta obejmuje destylacj ę cieczy i pomiar temperatury 
ponownej kondensacji pary oraz oznaczenie ilo ści destylatu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Metoda wed ług Siwolobowa  
Próbkę podgrzewa si ę w probówce, która jest zanurzona w cieczy 
w gorącej łaźni. W probówce zanurzona jest z kolei zatopiona na 
końcu rurka kapilarna, zawieraj ąca pęcherzyk powietrza w dolnej 
części. 
1.4.5.  Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej  
Zgodnie z zasad ą według Siwolobowa wykonuje si ę automatyczny 
pomiar fotoelektryczny z wykorzystaniem unosz ących się pęcherzyków.  
1.4.6.  Ró żnicowa analiza termiczna  
Niniejsza technika rejestruje ró żnicę w temperaturach mi ędzy 
substancją i materia łem odniesienia jako funkcj ę temperatury, gdy 
substancja oraz materia ł odniesienia podlegaj ą temu samemu progra ­
mowi kontrolowania temperatury. W momencie gdy próbka podlega przejściu pociągającym za sob ą zmianę entalpii, zmiana ta jest wska ­
zywana przez endotermiczne odchylenie (wrzenie) od linii bazowej 
zapisu temperatury.
 
1.4.7.  Ró żnicowa kalorymetria skaningowa  
Niniejsza technika rejestruje ró żnicę w energii pobranej przez 
substancję oraz materia ł odniesienia, jako funkcj ę temperatury, gdy 
substancja oraz materia ł odniesienia podlegaj ą temu samemu progra ­
mowi kontrolowania temperatury. Niniejsza energia jest energi ą 
konieczną do ustalenia zerowej ró żnicy temperatury mi ędzy 
substancją i materia łem odniesienia. W momencie gdy próbka 
podlega przej ściu pociągającym za sob ą zmianę entalpii, zmiana ta 
jest wskazywana przez endotermiczne odchylenie (wrzenie) od linii 
bazowej zapisu przep ływu ciep ła. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Zastosowanie i dok ładność różnych metod wykorzystywanych do 
ustalania temperatury wrzenia/zakres temperatury wrzenia przedsta ­
wiono w tabeli 1.  
Tabela 1  
Porównanie metod  
Metoda pomiaru Za łożona dokładność Istniej ąca norma  
Ebuliometr ± 1,4 K (do 313 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (do 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Metody dynamiczne ± 0,5 K (do 600 K) (  2 ) 
Proces destylacji (zakres wrzenia) ± 0,5 K (do 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Według Siwolobowa ± 2 K (do 600 K) (  2 ) 
Wykrywanie za pomoc ą komórki 
fotoelektrycznej ± 0,3 K (do 373 K) (  2 ) 
Różnicowa kalorymetria termiczna ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K) ASTM E 537-76 
Różnicowa kalorymetria skanin ­
gowa ± 0,5 K (do 600 K) 
± 2,0 K (do 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Niniejsza dok ładność obowiązuje tylko dla prostego urz ądzenia, jak na przyk ład opisano w ASTM Dl 120-72; mo żna 
ją poprawić bardziej z łożonymi urz ądzeniami ebuliometru. 
( 2 ) Ważna jedynie dla czystych substancji. U życie w innych okoliczno ściach powinno by ć uzasadnione.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. OPIS METOD  
Procedury dotycz ące niektórych metod badania opisano w normach 
międzynarodowych i krajowych (zob. dodatek).  
1.6.1.  Ebuliometr  
Zob. dodatek  
1.6.2.  Metoda dynamiczna  
Zob. metoda badania A.4 dla oznaczania pr ężności pary.  
Odnotowuje si ę temperatur ę wrzenia stwierdzon ą pod przy łożonym 
ciśnieniem 101,325 kPa.  
1.6.3.  Proces destylacji (zakres wrzenia)  
Zob. dodatek.  
1.6.4.  Metoda wed ług Siwolobowa  
Próbka jest podgrzewana w przyrz ądzie do oznaczania temperatury 
topnienia w probówce o średnicy oko ło 5 mm (rysunek 1).  
Rysunek 1 pokazuje rodzaj znormalizowanego przyrz ądu do badania 
temperatury topnienia i wrzenia (JIS K 0064) (wykonanego ze szk ła, 
wszystkie wymiary w milimetrach).  
Rysunek 1
  
Rurkę kapilarną (kapilara do badania wrzenia), zatopion ą na wyso ­
kości około 1 cm powy żej dolnego ko ńca, umieszcza si ę 
w probówce. Badan ą substancj ę wprowadza si ę w ten sposób, aby 
zatopiony odcinek kapilary znalaz ł się poniżej powierzchni cieczy. 
Probówkę zawieraj ącą kapilarę albo przymocowuje si ę do termo ­
metru przy pomocy ta śmy gumowej, albo umocowuje z boku na 
wsporniku (zob. rysunek 2).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Rysunek 2  
Zasada wed ług Siwolobowa  Rysunek 3  
Zmodyfikowana zasada
  
Ciecz do łaźni należy wybrać w zależności od temperatury wrzenia. 
Przy temperaturach do 573 K stosuje si ę olej silikonowy. Ciek ła 
parafina jest stosowana tylko do 473 K. Pocz ątkowo grzanie łaźni 
cieczowej ustawia si ę na wzrost temperatury 3 K/min. Ciecz łaźni 
musi być mieszana. W temperaturze oko ło 10 K poni żej spodzie ­
wanej temperatury wrzenia szybko ść wzrostu temperatury ustawia si ę 
na maksimum 1 K/min. Przy zbli żaniu się do temperatury wrzenia 
z wrzącej zawarto ści kapilary zaczynaj ą unosić się pęcherzyki.  
Temperatura wrzenia to temperatura, w której przy chwilowym 
schłodzeniu łańcuszek p ęcherzyków przestaje powstawa ć i ciecz 
w kapilarze nagle zaczyna si ę unosić. Odpowiadaj ący temu odczyt 
temperatury to temperatura wrzenia substancji.  
W zmodyfikowanej zasadzie pomiaru (rysunek 3) temperatura 
wrzenia jest oznaczana w kapilarze od ustalania temperatury topnie ­
nia. Jest ona wyci ągnięta do przew ężenia o długości około 2 cm (a) 
i zassana jest w niej ma ła ilość próbki. Otwarty koniec cienkiej 
kapilary jest zamkni ęty poprzez obtopienie w taki sposób, że na 
jej końcu znajduje si ę mały pęcherzyk powietrza. Podczas ogrze ­
wania w aparacie do ustalania temperatury topnienia (b), p ęcherzyk 
powietrza rozszerza si ę. Temperaturze wrzenia odpowiada taka 
temperatura, przy której zatyczka z substancji badanej osi ąga poziom 
powierzchni cieczy łaźni (c).  
1.6.5.  Wykrywanie za pomoc ą komórki fotoelektrycznej  
Próbka jest ogrzewana w rurce kapilarnej umieszczonej wewn ątrz 
podgrzewanego bloku metalowego.  
Wiązka światła przechodzi poprzez odpowiednie otwory w bloku, 
poprzez badan ą substancj ę na precyzyjnie skalibrowan ą komórkę 
fotoelektryczn ą. 
W czasie wzrostu temperatury próbki pojedyncze p ęcherzyki 
powietrza pojawiaj ą się w kapilarze. Gdy osi ągnięta jest temperatura 
wrzenia, ilo ść pęcherzyków gwa łtownie wzrasta. Powoduje to 
zmianę intensywno ści światła rejestrowanego przez komórk ę foto­
elektryczn ą i powoduje wys łanie sygna łu zatrzymania do wska źnika 
odczytującego temperatur ę z platynowego termometru rezystancyj ­
nego umieszczonego w bloku.  
Niniejsza metoda jest szczególnie u żyteczna, gdy ż pozwala na ozna ­
czania poni żej temperatury pokojowej do 253,15 K (-20  o C) bez 
żadnych zmian w przyrz ądzie. Przyrz ąd umieszcza si ę jedynie 
w łaźni chłodzącej. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Analiza termiczna  
1.6.6.1.  Różnicowa analiza termiczna  
Zob. dodatek.  
1.6.6.2.  Różnicowa kalorymetria skaningowa  
Zob. dodatek.  
2. DANE  
Przy niewielkich odchyleniach od ci śnienia normalnego (maksimum 
± 5 kPa) temperatur ę wrzenia normalizuje si ę do T  n na podstawie 
następującego wzoru równania Sidneya-Younga:  
T n = T + (f  T × Δp) 
gdzie:  
Δp = (101,325 – p) [uwaga na znak],  
P = pomiar ci śnienia w kPa,  
f T = szybko ść zmian temperatury wrzenia z ci śnieniem w K/Kpa,  
T = zmierzona temperatura wrzenia w K,  
T n = temperatura wrzenia skorygowana do ci śnienia normalnego 
w K.  
Współczynniki korekcji temperatury, f  T , i wzory na ich przybli żone 
obliczanie zawarto we wspomnianych wy żej normach mi ędzynaro­
dowych i krajowych dla wielu substancji.  
Na przyk ład w metodzie DIN 53171 wymieniono nast ępujące, przy­
bliżone poprawki dla rozpuszczalników zawartych w farbach:  
Tabela 2  
Temperatura – wspó łczynniki korekcji f  T 
Temperatura T (K) Wspó łczynnik korekcji f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— zastosowana metoda,  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość 
i zanieczyszczenia) i wst ępny etap oczyszczenia, je śli wykonano,  
— ocena dok ładności. 
Średnią co najmniej dwóch pomiarów znajduj ących się w zakresie 
oszacowanej dok ładności (zob. tabela 1) przedstawia si ę jako tempe ­
raturę wrzenia.  
Należy podać zmierzone temperatury wrzenia i ich średnią, a także 
ciśnienie (ci śnienia), w którym (których) by ły wykonywane pomiary, 
w kPa. Najkorzystniej jest, gdy ci śnienie jest zbli żone do normal ­
nego ciśnienia atmosferycznego.  
Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji 
wyników, w szczególno ści w odniesieniu do zanieczyszcze ń i stanu 
skupienia substancji.  
4. LITERATURA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the 
Council C (81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental ther ­
modynamics, Butterworths, London 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publi ­
cations, New York, 1959, vol. I, part I, chapter VIII.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Dodatek  
W celu uzyskania dodatkowych szczegó łów technicznych mo żna zapozna ć się na 
przykład z nast ępującymi normami.  
1. Ebuliometr  
1.1. Urz ądzenia do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Proces destylacji (zakres wrzenia)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: determination du rendement 
et de l’intervalle de distillation  
3. Ró żnicowa analiza termiczna i ró żnicowa kalorymetria skanin ­
gowa  
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of diffe ­
rential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. GĘSTOŚĆ WZGLĘDNA  
1. METODA  
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotycz ­ 
ących bada ń (1). Podstawowe zasady podano w pozycjach biblio ­
graficznych (2) i (3).  
1.1. WPROWADZENIE  
Opisane metody oznaczania g ęstości względnej stosuj ą się do 
substancji sta łych i płynnych, bez ogranicze ń związanych z ich stop ­
niem czysto ści. Różne metody mo żliwe do zastosowania wymie ­
niono w tabeli 1.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Gęstość względna ciał stałych lub cieczy jest stosunkiem mi ędzy 
masą objętości badanej substancji, ustalon ą w 20  o C, oraz mas ą tej 
samej obj ętości wody, ustalon ą w 4  o C. Gęstość względna jest 
bezwymiarowa.  
Gęstość, ρ, substancji jest ilorazem masy, m, i jej obj ętości, v.  
Gęstość, ρ, w układzie jednostek SI jest dana w kg/m  3 . 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA (1), (3)  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
1.4. ZASADA METOD  
Stosowane s ą cztery klasy metod.  
1.4.1.  Metody wyporu hydrostatycznego  
1.4.1.1.  Areometr  (dla substancji ciek łych) 
Wystarczaj ąco dokładne i szybkie oznaczenia g ęstości można 
uzyskać przy użyciu areometrów p ływakowych, które pozwalaj ą na 
obliczenie g ęstości cieczy na podstawie g łębokości zanurzenia, przez 
odczyt na skali z podzia łką. 
1.4.1.2.  Waga hydrostatyczna  (dla substancji p łynnych i sta łych) 
Różnicę między wagą badanej próbki zmierzon ą w powietrzu i w 
odpowiedniej cieczy (na przyk ład w wodzie) wykorzystuje si ę do 
oznaczenia jej g ęstości. 
W przypadku cia ł stałych zmierzona g ęstość jest charakterystyczna 
jedynie dla okre ślonej, zastosowanej próbki. W przypadku ozna ­
czania gęstości cieczy, ich ilo ść o znanej obj ętości, v, wa ży się 
najpierw w powietrzu, a potem w cieczy.  
1.4.1.3.  Metoda zanurzeniowa  (dla substancji ciek łych) (4)  
Metoda ta polega na oznaczaniu g ęstości cieczy na podstawie 
różnicy między wynikami zwa żenia cieczy przed i po zanurzeniu 
w nim cia ła o znanej obj ętości. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Metody piknometryczne  
W przypadku cia ł stałych lub cieczy mo żna się posłużyć piknomet ­
rami o ró żnych kszta łtach i o znanych wymiarach. G ęstość oblicza 
się na podstawie ró żnicy masy mi ędzy napełnionym i pustym pikno ­
metrem oraz jego znanej obj ętości. 
1.4.3.  Piknometr wykonuj ący pomiar porównawczy w powietrzu  (dla 
ciał stałych) 
Gęstość ciała stałego w dowolnej formie mo żna zmierzy ć 
w temperaturze pokojowej przy u życiu piknometru wykonuj ącego 
pomiary porównawcze w gazie. Obj ętość substancji mierzy si ę 
w powietrzu lub w gazie oboj ętnym w cylindrze o zmiennej, wyka ­
librowanej obj ętości. Dla obliczenia g ęstości wykonuje si ę jeden 
pomiar masy po zako ńczeniu pomiaru obj ętości. 
1.4.4.  Densytometr oscylacyjny  (5, 6, 7)  
Gęstość cieczy mo żna zmierzy ć przy pomocy densytometru oscyla ­
cyjnego. Mechaniczny oscylator skonstruowany w postaci U-rurki drga w cz ęstotliwości rezonansowej zale żnej od jego masy. Wpro ­
wadzenie badanej próbki zmienia cz ęstotliwość rezonansow ą oscyla­
tora. Przyrz ąd należy skalibrowa ć przy użyciu dwóch substancji 
płynnych o znanej g ęstości. Najkorzystniej, aby substancje te wybra ć 
tak, aby ich g ęstości były bliskie zakresowi, który ma by ć mierzony.
 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Zastosowania poszczególnych metod wykorzystywanych do ozna ­
czania gęstości względnej wymieniono w tabeli.  
1.6. OPIS METOD  
W dodatku za łączono normy podane jako przyk łady, z którymi 
należy się zapozna ć w celu uzyskania informacji o dodatkowych 
szczegółach technicznych.  
Badania nale ży przeprowadza ć w temperaturze 20  o C, przy czym 
konieczne jest wykonanie co najmniej dwóch pomiarów.  
2. DANE  
Zob. normy.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— zastosowana metoda,  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszczenia) 
i wstępny etap oczyszczania, je śli wykonano.  
Gęstość względną, D 20 
4 , należy podawa ć w sposób okre ślony w ppkt 
1.2, łącznie ze stanem skupienia mierzonej substancji.  
Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji 
wyników, w szczególno ści w odniesieniu do zanieczyszcze ń i stanu 
skupienia substancji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Tabela  
Zastosowanie metod  
Metoda pomiaru Gęstość Maksymalna 
możliwa lepko ść 
dynamiczna Istniejące normy 
ciało stałe ciecz  
1.4.1.1. Areometr tak 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Waga hydrostatyczna a) ciała stałe tak ISO 1183 (A) 
b) ciecze tak 5 Pa s ISO 901 i 758 
1.4.1.3. Metoda zanurzeniowa tak 20 Pa s DIN 53217 1.4.2. Piknometr ISO 3507 
a) ciała stałe tak ISO 1183(B), 
NF T 20-053 
b) ciecze tak 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Piknometr wykonuj ący 
pomiar porównawczy 
w powietrzu tak DIN 55990 Teil 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Densytometr oscylacyjny tak 5 Pa s
 
4. LITERATURA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., chapter IV, Interscience 
Publ. , New York, 1959, vol. I, part 1.  
(3) IUPAC, Recommended reference materials for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 508.
 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte 
von Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. 11, 
427–430.  
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Erzeug ­
nissen – Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeu ­
tische Industrie, 1975, vol. 37, 717–726.  
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digital en Dichtemessung im 
Brauereilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, 253–255.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Dodatek  
Dla uzyskania dodatkowych szczegó łów technicznych mo żna zapozna ć się na 
przykład z nast ępującymi normami.  
1. Metody wyporu hydrostatycznego  
1.1. Aerometr 
DIN 12790, ISO 387 Hydrometer; general instructions 
DIN 12791 Part I: Density hydrometers; construction, 
adjustment and use 
Part II: Density hydrometers; standardized 
sizes, designation 
Part III: Use and test 
ISO 649-2 Laboratory glassware: Density hydrome ­
ters for general purpose 
NF T 20-050 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of liquids – 
Areometric method 
DIN 12793 Laboratory glassware: range find hydro ­
meters  
1.2. Waga hydrostatyczna  
Dla substancji sta łych 
ISO 1183 Method A: Methods for determining the 
density and relative density of plastics excluding cellular plastics 
NF T 20-049 Chemical products for industrial use – 
Determination of the density of solids 
other than powders and cellular products 
– Hydrostatic balance method 
ASTM-D-792 Specific gravity and density of plastics by 
displacement 
DIN 53479 Testing of plastics and elastomers; deter ­
mination of density
 
Dla substancji ciek łych 
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testing of mineral oils and related mate ­
rials; determination of density 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 i ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method 
BS 4714 Density, specific gravity or API gravity of 
crude petroleum and liquid petroleum products by hydrometer method
 
1.3. Metoda zanurzeniowa 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
coating materials; determination of 
density; immersed body method  
2. Metody piknometryczne  
2.1. Dla substancji ciek łych 
ISO 3507 Pycnometers 
ISO 758 Liquid chemical products; determination 
of density at 20  o C 
DIN 12797 Gay-Lussac pycnometer (for non-volatile 
liquids which are not too viscous) 
DIN 12798 Lipkin pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 
100,10  -6 m 2 s- 1 at 15  o C) 
DIN 12800 Sprengel pycnometer (for liquids as DIN 
12798) 
DIN 12801 Reischauer pycnometer (for liquids with 
a kinematic viscosity of less than 
100,10-  6 m 2 s- 1 at 20  o C, applicable in 
particular also to hydrocarbons and aqueous solutions as well as to liquids with higher vapour pressure, approxima ­
tely 1 bar at 90
 o C) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Hubbard pycnometer (for viscous liquids 
of all types which do not have too high 
a vapour pressure, in particular also for paints, varnishes and bitumen) 
DIN 12807 Bingham pycnometer (for liquids, as in 
DIN 12801) 
DIN 12808 Jaulmes pycnometer (in particular for 
ethanol – water mixture) 
DIN 12809 Pycnometer with ground-in thermometer 
and capillary side tube (for liquids 
which are not too viscous) 
DIN 53217 Testing of paints, varnishes and similar 
products; determination of density by 
pycnometer 
DIN 51757 Point 7: Testing of mineral oils and 
related materials; determination of density 
ASTM D 297 Section 15: Rubber products – chemical 
analysis 
ASTM D 2111 Method C: Halogenated organic compo ­
unds 
BS 4699 Method for determination of specific 
gravity and density of petroleum products 
(graduated bicapillary pycnometer method) 
BS 5903 Method for determination of relative 
density and density of petroleum products by the capillary- stoppered pycnometer method 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Dla substancji sta łych 
ISO 1183 Method B: Methods for determining the 
density and relative density of plastics 
excluding cellular plastics 
NF T 20-053 Chemical products for industrial use – 
Determination of density of solids in powder and liquids – Pyknometric 
method 
DIN 19683 Determination of the density of soils
 
3. Piknometr wykonuj ący pomiar porównawczy w powietrzu  
DIN 55990 Part 3: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichrungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. PRĘŻNOŚĆ PARY  
1. METODA  
Niniejsza metoda odpowiada wytycznej OECD TG 104 (2004).  
1.1. WST ĘP 
Niniejsza zmieniona wersja metody A.4 (1) zawiera jedn ą dodatkow ą 
metodę: metodę efuzji, opart ą na termograwimetrii izotermicznej, 
przeznaczon ą do substancji chemicznych o bardzo niskich ci śnie­
niach (do 10  –10 Pa). Wobec zapotrzebowania na procedury, 
zwłaszcza dotycz ące wyznaczania ci śnienia pary dla substancji 
o bardzo niskim ci śnieniu pary, dokonano ponownej oceny innych 
procedur niniejszej metody pod wzgl ędem zakresu stosowalno ści. 
W stanie równowagi termodynamicznej ci śnienie pary substancji 
czystej jest jedynie funkcj ą temperatury. Podstawowe zasady opisano 
w innym miejscu (2)(3).  
Nie ma jednej procedury pomiarowej, która mia łaby zastosowanie do 
całego zakresu ci śnień pary, od poni żej 10  –10 aż do 10  5 Pa. Niniejsza 
metoda obejmuje osiem metod pomiaru ci śnienia pary, które mog ą 
być stosowane w ró żnych zakresach ci śnienia. Porównanie poszcze ­
gólnych metod pod wzgl ędem zastosowania i zakresu pomiarowego 
przedstawiono w tabeli 1. Metody te mo żna stosowa ć tylko do 
związków, które nie rozk ładają się w warunkach badania. 
W przypadkach gdy ze wzgl ędów technicznych nie mo żna zasto­
sować metod do świadczalnych, ci śnienie pary mo żna równie ż osza­
cować, a zalecan ą metodę szacowania przedstawiono w dodatku.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Ciśnienie pary substancji okre śla się jako ciśnienie nasycenia nad 
substancją w stanie sta łym lub ciek łym. 
Należy używać jednostki ci śnienia obowi ązującej w uk ładzie SI, 
którą jest paskal (Pa). Poni żej podano inne jednostki, które by ły 
stosowane historycznie, wraz z ich wspó łczynnikami przeliczenio ­
wymi: 
1 tor = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfera = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
Jednostką temperatury w uk ładzie SI jest kelwin (K). Przeliczenia 
stopni Celsjusza na kelwiny dokonuje si ę według wzoru:  
T = t + 273,15  
gdzie T jest temperatur ą w skali Kelwina lub temperatur ą termody­
namiczną, zaś t jest temperatur ą w skali Celsjusza.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Tabela 1  
Metoda pomiarowa Substancje Szacowana 
powtarzalno ść Szacowana 
odtwarzalno ść Zalecany zakres 
Stałe Ciek łe 
Metoda dyna ­
miczna Łatwotopliwe Tak do 25 % 
1–5 % do 25 % 
1–5 % 10 3 Pa do 2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa do 10  5 Pa 
Metoda statyczna Tak Tak 5–10 % 5–10 % 10 Pa do 10  5 Pa 
10 –2 Pa do 10  5 Pa (  1 ) 
Metoda izotenisko ­
powa Tak Tak 5–10 % 5–10 % 10  2 Pa do 10  5 Pa 
Metoda efuzji: 
równowaga ciśnienia pary Tak Tak 5–20 % do 50 % 10
 –3 do 1 Pa 
Metoda efuzji: 
komórka Knudsena Tak Tak 10–30 % — 10  –10 do 1 Pa 
Metoda efuzji: 
grawimetria izoter ­
miczna Tak Tak 5–30 % do 50 % 10  –10 do 1 Pa 
Metoda nasycania 
gazu Tak Tak 10–30 % do 50 % 10  –10 do 10  3 Pa 
Metoda wiruj ącego 
rotora Tak Tak 10–20 % — 10  –4 do 0,5 Pa  
( 1 ) Używając manometru pojemno ściowego.  
1.3. ZASADA BADANIA  
Na ogół ciśnienie pary wyznacza si ę w różnych temperaturach. 
W ograniczonym zakresie temperatury logarytm ci śnienia pary 
substancji czystej jest liniow ą funkcją odwrotno ści temperatury 
termodynamicznej, zgodnie z uproszczonym równaniem Clapey ­
rona-Clausiusa:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ stała 
gdzie:  
p = ci śnienie pary w paskalach,  
ΔHv = ciep ło parowania w J mol  –1 , 
R = uniwersalna sta ła gazowa: 8,314 J mol  –1 K –1 , 
T = temperatura w K.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie ma potrzeby stosowania substancji odniesienia. S łużą one 
głównie do sporadycznego sprawdzenia dzia łania metody, jak 
również do umożliwienia porównania wyników uzyskanych ró żnymi 
metodami.  
1.5. OPIS METODY  
1.5.1.  Metoda dynamiczna (metoda Cottrella)  
1.5.1.1.  Zasada  
Ciśnienie pary wyznacza si ę, mierząc temperatur ę wrzenia substancji 
przy różnych okre ślonych warto ściach ciśnienia w przybli żonych 
granicach od 10  3 do 10  5 Pa. Metoda ta jest równie ż zalecana do 
wyznaczania temperatury wrzenia. Do tego celu jest ona u żyteczna 
do temperatury 600 K. Temperatury wrzenia cieczy s ą o około 
0,1 °C wy ższe na g łębokości 3 do 4 cm ni ż na powierzchni 
z powodu ci śnienia słupa cieczy. W metodzie Cottrella (4) termometr 
umieszcza si ę w parze powy żej powierzchni cieczy tak, i ż wrząca 
ciecz w sposób ci ągły omywa zbiornik termometru. Zbiornik termo ­
metru pokrywa cienka warstwa cieczy, która jest w równowadze 
z parą pod ciśnieniem atmosferycznym. W ten sposób termometr 
wskazuje rzeczywist ą temperatur ę wrzenia, bez b łędów powodowa ­
nych przegrzaniem lub ci śnieniem hydrostatycznym. Pomp ę pierwo­
tnie zastosowan ą przez Cottrella przedstawiono na rysunku 1. Rurka 
A zawiera wrz ącą ciecz. Wtopiony w dno platynowy drut B u łatwia 
równomierne wrzenie. Boczna rurka C prowadzi do skraplacza, za ś 
osłona D zapobiega przedostawaniu si ę zimnych skroplin do termo ­
metru E. Podczas wrzenia cieczy zawartej w rurce A wychwycone 
przez lejek p ęcherzyki i ciecz s ą wylewane poprzez dwa ramiona 
pompki F na zbiornik termometru.  
Rysunek 1
  Rysunek 2
  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Pompa Cottrella (4)  
A: Termopara  
B: Próżniowa obj ętość buforowa  
C: Ciśnieniomierz  
D: Próżnia 
E: Punkt pomiarowy  
F: Element grzewczy ok. 150 W  
1.5.1.2.  Przyrz ąd 
Na rysunku 2 przedstawiono bardzo dok ładny przyrz ąd wykorzys ­
tujący zasad ę Cottrella. Sk łada się on z rurki z sekcj ą wrzenia 
w dolnej cz ęści, chłodnicą w części środkowej oraz wylotem 
i kołnierzem w cz ęści górnej. Pompa Cottrella jest umieszczona 
w sekcji wrzenia, która jest ogrzewana za pomoc ą wkładu elektrycz ­
nego. Temperatura jest mierzona przez termopar ę z osłoną lub 
termometr oporowy wprowadzony poprzez ko łnierz u góry. Wylot 
jest podłączony do uk ładu regulacji ci śnienia. Uk ład ten zawiera 
pompę próżniową, objętość buforow ą, manostat do wpuszczania 
azotu celem regulacji ci śnienia oraz manometr.  
1.5.1.3.  Procedura  
Substancj ę umieszcza si ę w sekcji wrzenia. W przypadku niesprosz ­
kowanych cia ł stałych można napotka ć problemy, lecz niekiedy 
można je rozwi ązać, ogrzewaj ąc płaszcz chłodzący. Przyrz ąd zamyka 
się szczelnie na ko łnierzu, a substancj ę poddaje si ę odgazowaniu. 
Metoda ta nie nadaje si ę do pomiaru substancji pieni ących się. 
Następnie nastawia si ę najniższe żądane ciśnienie i w łącza się ogrze­
wanie. Równocze śnie czujnik temperatury pod łącza się do rejestra ­
tora. 
Równowaga jest osi ągnięta, gdy przy sta łym ciśnieniu rejestrowana 
jest stała temperatura wrzenia. Nale ży zachowa ć szczególn ą ostroż­
ność, aby nie dopu ścić do uderzenia podczas wrzenia. Ponadto musi 
nastąpić całkowite skroplenie na ch łodnicy. Podczas oznaczania 
ciśnienia pary łatwotopliwych substancji sta łych należy zachowa ć 
ostrożność, aby nie dopu ścić do zablokowania skraplacza.  
Po zarejestrowaniu punktu równowagi nastawia si ę wyższe ciśnienie. 
Proces kontynuuje si ę w ten sposób a ż do osiągnięcia ciśnienia 10  5 
Pa (uzyskuj ąc ogółem około 5 do 10 punktów pomiarowych). Dla 
sprawdzenia nale ży powtórzy ć punkty równowagi przy malej ących 
ciśnieniach.  
1.5.2.  Metoda statyczna  
1.5.2.1.  Zasada  
W metodzie statycznej (5) ci śnienie pary w stanie równowagi termo ­
dynamicznej wyznacza si ę w określonej temperaturze. Metoda ta 
nadaje si ę do substancji i cieczy wielosk ładnikowych oraz cia ł 
stałych w przedziale od 10  –1 do 10  5 Pa, a pod warunkiem zacho ­
wania staranno ści równie ż w przedziale od 1 do 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Przyrz ąd 
Przyrząd pomiarowy sk łada się z łaźni stałotemperaturowej (dok ład­
ność ± 0,2 K), pojemnika na próbk ę podłączonego do przewodu 
próżniowego, manometru oraz uk ładu do regulacji ci śnienia. Komora 
próbki (rysunek 3a) jest pod łączona do przewodu pró żniowego 
poprzez zawór i manometr ró żnicowy (U-rurk ę zawieraj ącą odpo­
wiednią ciecz manometryczn ą), który s łuży jako wska źnik zera. Do 
zastosowania w manometrze ró żnicowym nadaj ą się: rtęć, silikony 
i ftalany, w zale żności od zakresu ci śnienia i zachowania si ę badanej 
substancji pod wzgl ędem chemicznym. Ze wzgl ędu na ochron ę 
środowiska naturalnego nale ży w miar ę możliwości unikać stoso­
wania rtęci. Badana substancja nie mo że w dostrzegalny sposób 
rozpuszcza ć się w cieczy zawartej w U-rurce ani wchodzi ć z nią 
w reakcje. Zamiast U-rurki mo żna użyć ciśnieniomierza (rysunek 
3b). W manometrze mo żna stosowa ć rtęć w zakresie od ci śnienia 
normalnego do 10  2 Pa, natomiast p łyny silikonowe i ftalany nadaj ą 
się do użycia w zakresie ci śnienia poni żej 10  2 Pa aż do 10 Pa. 
Istnieją inne ciśnieniomierze, których mo żna używać przy ciśnieniu 
poniżej 10  2 Pa, zaś podgrzewanych przeponowych manometrów 
pojemnościowych mo żna używać nawet przy ci śnieniu poni żej 
10 –1 Pa. Temperatur ę mierzy si ę na zewn ętrznej ścianie zbiornika 
zawierającego próbk ę lub w samym zbiorniku.  
1.5.2.3.  Procedura  
Używając przyrządu przedstawionego na rysunku 3a, nape łnić U- 
rurkę wybraną cieczą, którą przed dokonaniem odczytów nale ży 
odgazowa ć w podwy ższonej temperaturze. Badan ą substancj ę 
umieszcza si ę w przyrz ądzie i odgazowuje w obni żonej temperatu ­
rze. W przypadku próbki wielosk ładnikowej temperatura powinna 
być dostatecznie niska dla zapewnienia, że skład materia łu nie 
ulegnie zmianie. Równowag ę można osiągnąć szybciej dzi ęki 
mieszaniu. Próbk ę można schłodzić za pomoc ą ciekłego azotu lub 
suchego lodu, lecz nale ży zachowa ć ostrożność, aby nie dopu ścić do 
skroplenia powietrza lub cieczy pompy. Przy otwartym zaworze nad 
zbiornikiem próbki w łącza się na kilka minut zasysanie, aby usun ąć 
powietrze. W razie potrzeby operacj ę odgazowania powtarza si ę 
wielokrotnie.  
Rysunek 3a
  Rysunek 3b
  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Gdy próbka jest podgrzewana przy zamkni ętym zaworze, ci śnienie 
pary wzrasta. Powoduje to zmian ę równowagi cieczy w U-rurce. 
Aby skompensowa ć tę zmianę, do przyrz ądu wprowadza si ę azot 
lub powietrze, a ż do ponownego wyzerowania si ę różnicowego 
wskaźnika ciśnienia. Wymagane do tego ci śnienie mo żna odczyta ć 
z manometru lub z przyrz ądu o wyższej dokładności. Ciśnienie to 
odpowiada ci śnieniu pary substancji w temperaturze pomiaru. 
Używając przyrządu przedstawionego na rysunku 3b, ci śnienie 
pary odczytuje si ę bezpośrednio.  
Ciśnienie pary wyznacza si ę w odpowiednio ma łych odstępach czasu 
(w sumie oko ło 5–10 punktów pomiarowych) a ż do żądanego 
maksimum temperatury.  
Dla sprawdzenia nale ży powtórzy ć odczyty przy malej ącej tempera ­
turze. Je żeli warto ści otrzymane z powtórzonych odczytów nie 
pokrywaj ą się z krzyw ą uzyskan ą dla temperatury rosn ącej, to 
może to wynika ć z jednej z nast ępujących sytuacji:  
(i) próbka nadal zawiera powietrze (np. w przypadku substancji 
o dużej lepkości) lub substancje o niskiej temperaturze wrzenia, 
wydzielaj ące się podczas ogrzewania;  
(ii) substancja ulega reakcji chemicznej w badanym zakresie tempe ­
ratury (np. rozk ładowi, polimeryzacji).  
1.5.3.  Metoda z u życiem izoteniskopu  
1.5.3.1.  Zasada  
Izoteniskop (6) oparty jest na zasadzie metody statycznej. Metoda ta 
polega na umieszczeniu próbki w ba ńce utrzymywanej w sta łej 
temperaturze i pod łączonej do manometru oraz pompy pró żniowej. 
Zanieczyszczenia bardziej lotne od badanej substancji usuwa si ę 
przez odgazowanie przy obni żonym ciśnieniu. Ci śnienie pary próbki 
w wybranych temperaturach jest równowa żone znanym ci śnieniem 
gazu oboj ętnego. Izoteniskop zosta ł skonstruowany do pomiaru 
ciśnienia pary pewnych ciek łych węglowodorów, lecz nadaje si ę 
również do badania substancji sta łych. Metoda ta zwykle nie nadaje 
się do układów wielosk ładnikowych. Wyniki obci ążone są jedynie 
nieznacznym b łędem w przypadku próbek zawieraj ących zanieczysz ­
czenia nielotne. Zalecany zakres wynosi od 10  2 do 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Przyrz ąd 
Przykład urządzenia pomiarowego przedstawiono na rysunku 
4. Pełny opis mo żna znaleźć w ASTM D 2879–86 (6).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Procedura  
W przypadku cieczy badana substancja sama s łuży jako p łyn 
w manometrze ró żnicowym. Do izoteniskopu wprowadza si ę ilość 
cieczy wystarczaj ącą do wype łnienia ba ńki i krótszego ramienia 
manometru. Izoteniskop przy łącza się do układu próżniowego 
i usuwa z niego powietrze, a nast ępnie nape łnia azotem. Opró żnianie 
i oczyszczanie uk ładu powtarza si ę dwukrotnie, aby usun ąć resztki 
tlenu. Nape łniony izoteniskop ustawia si ę w położeniu poziomym, 
tak aby próbka roz łożyła się cienką warstwą w bańce próbnej 
i manometrze. Ci śnienie w uk ładzie obni ża się do 133 Pa, 
a próbkę łagodnie si ę ogrzewa, a ż zacznie wrze ć (usunięcie rozpusz ­
czonych gazów). Nast ępnie izoteniskop ustawia si ę, tak aby próbka 
powróciła do bańki i nape łniła krótsze rami ę manometru. Ci śnienie 
utrzymywane jest na poziomie 133 Pa. Wyci ąganą końcówkę bańki 
próbkowej podgrzewa si ę małym płomieniem, a ż wydzielona 
z próbki para rozpr ęży się dostatecznie, aby wyprze ć część próbki 
z górnej cz ęści bańki i ramienia manometru, tworz ąc wypełnioną 
parą przestrze ń wolną od azotu. Izoteniskop umieszcza si ę następnie 
w łaźni stałotemperaturowej, a ci śnienie azotu nastawia si ę, tak aby 
równe by ło ciśnieniu próbki. W stanie równowagi ci śnienie azotu 
równe jest ci śnieniu pary substancji.  
Rysunek 4
  
W przypadku substancji sta łych i w zale żności od zakresu ci śnienia 
i temperatury stosuje si ę ciecze manometryczne, takie jak p łyny 
silikonowe lub ftalany. Odgazowan ą ciecz manometryczn ą 
umieszcza si ę w bańce wykonanej na d ługim ramieniu izoteniskopu. 
Następnie badan ą substancj ę stałą wkłada się do bańki próbkowej 
i odgazowuje w podwy ższonej temperaturze. Po wykonaniu tego 
izoteniskop przechyla si ę, tak aby ciecz manometryczna mog ła 
wpłynąć do U-rurki.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Metoda efuzji: równowaga ci śnienia pary  (7) 
1.5.4.1.  Zasada  
Próbkę badanej substancji ogrzewa si ę w małym piecu i umieszcza 
w dzwonie szklanym, w którym wytworzono pró żnię. Piec przykryty 
jest pokryw ą, która posiada niewielkie otwory o znanej średnicy. 
Ulatniająca się przez otwory para substancji kierowana jest na 
szalę wagi o wysokiej czu łości, która równie ż jest zamkni ęta 
w opróżnionym dzwonie szklanym. W niektórych rozwi ązaniach 
konstrukcyjnych szala wagi umieszczona jest w komorze ch łodzącej, 
która zapewnia odprowadzenie ciep ła na zewn ątrz. Promieniowanie 
powoduje och łodzenie szali wagi, tak i ż ulatniająca się para skrapla 
się na niej. P ęd strumienia pary dzia ła na szal ę jak siła. Ciśnienie 
pary można wyprowadzi ć dwoma sposobami: bezpo średnio z si ły 
działającej na szal ę wagi oraz z szybko ści parowania przy u życiu 
równania Hertza-Knudsena (2):  
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M s 
gdzie:  
G = szybko ść parowania (kg s  –1 m –2 ), 
M = masa molowa (g mol  –1 ), 
T = temperatura (K),  
R = uniwersalna sta ła gazowa (J mol  –1 K –1 ), 
P = ciśnienie pary (Pa).  
Zalecany zakres wynosi od 10  –3 do 1 Pa.  
1.5.4.2.  Przyrz ąd 
Schemat ideowy przyrz ądu pomiarowego zilustrowano na rysunku 5.  
Rysunek 5
  
A: Płyta podstawy F: Komora ch łodząca i pręt chłodzący 
B: Przyrz ąd z ruchom ą cewką G: Piec wyparki 
C: Dzwon szklany H: Naczynie Dewara z ciek łym azotem 
D: Waga z szal ą I: Pomiar temperatury próbki 
E: Urz ądzenie do pomiaru pró żni J: Badana substancja  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Metoda efuzji: komórka Knudsena  
1.5.5.1.  Zasada  
Metoda ta polega na oszacowaniu masy badanej substancji w postaci 
pary wyp ływającej w jednostce czasu z komórki Knudsena (8) przez 
mikrootwór w warunkach wysokiej pró żni. Masę pary, która wyp ły­
nęła, można określić poprzez wyznaczenie straty masy komórki lub 
przez skroplenie pary w niskiej temperaturze i wyznaczenie masy ulotnionej substancji przy pomocy chromatografii. Ci śnienie pary 
oblicza si ę stosując zależność Hertza-Knudsena (zob. sekcja 1.5.4.1) 
ze współczynnikami korekcji w zale żności od parametrów przyrz ądu 
pomiarowego (9). Zalecany zakres wynosi od 10
 –10 do 1 Pa (10) ­
(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Przyrz ąd 
Schemat ideowy przyrz ądu pomiarowego zilustrowano na rysunku 6.  
Rysunek 6
  
1: Podłączenie do uk ładu próżniowego 7: Pokrywa gwintowana 
2: Pochwy platynowego termometru oporo ­
wego lub urz ądzenia do pomiaru 
i regulacji temperatury 8: Nakr ętki motylkowe 
3: Pokrywa zbiornika pró żniowego 9: Śruby 
4: Pierścień uszczelniaj ący (O-ring) 10: Komórki efuzyjne ze stali nierdzewnej 
5: Aluminiowy zbiornik pró żniowy 11: Wk ładka grzewcza 
6: Urządzenie do zak ładania i wyjmowania 
komórek efuzyjnych  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Metoda efuzji: termograwimetria izotermiczna  
1.5.6.1.  Zasada  
Metoda ta polega na wyznaczeniu szybko ści przyspieszonego paro ­
wania badanej substancji w podwy ższonych temperaturach i pod 
ciśnieniem otoczenia przy pomocy grawimetrii (10)(15)(16)(17)(18) ­
(19)(20). Warto ści szybko ści parowania v  T otrzymuje si ę, poddając 
wybrany zwi ązek działaniu atmosfery powoli p łynącego gazu oboj ęt­
nego i obserwuj ąc utratę ciężaru w okre ślonych, sta łych temperatu ­
rach T (wyra żonych w kelwinach) w ci ągu odpowiednich okresów. 
Wartości ciśnienia pary p  T oblicza si ę na podstawie warto ści v  T przy 
użyciu liniowej zale żności pomiędzy logarytmem ci śnienia pary 
i logarytmem szybko ści parowania. W razie potrzeby mo żna 
dokonać ekstrapolacji do temperatur 20 i 25 °C za pomoc ą analizy 
regresji log p  T w zależności od 1/T. Metoda ta nadaje si ę do 
substancji o ci śnieniu pary si ęgającym minimum 10  –10 Pa (10  –12 
mbar) i o czysto ści możliwie jak najbli ższej 100 % dla unikni ęcia 
błędnej interpretacji zmierzonych warto ści utraty ci ężaru. 
1.5.6.2.  Przyrz ąd 
Schemat ideowy zestawu do świadczalnego przedstawiono na 
rysunku 7.  
Rysunek 7
  
Płytka nośna próbki, zawieszona na mikrowadze w komorze 
o regulowanej temperaturze, jest omiatana strumieniem suchego 
gazowego azotu, który porywa odparowane cz ąsteczki badanej 
substancji. Po opuszczeniu komory strumie ń gazu jest oczyszczany 
przez urz ądzenie sorpcyjne.  
1.5.6.3.  Procedura  
Badaną substancj ę nakłada się na powierzchni ę chropowatej p łytki 
szklanej w postaci jednorodnej warstwy. W przypadku substancji sta łych 
płytkę zwilża się równomiernie roztworem substancji w odpowiednim 
rozpuszczalniku i suszy w atmosferze oboj ętnej. Do celu pomiaru 
pokrytą płytkę zawiesza si ę w analizatorze termograwimetrycznym, 
a następnie mierzy si ę w sposób ci ągły utratę jej ciężaru w funkcji czasu.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
Szybkość parowania v  T w określonej temperaturze oblicza si ę na 
podstawie utraty ci ężaru Δm płytki próbnej za pomoc ą wzoru:  
v T ¼ Δm 
F Ö t Í 
gcm  –2 h –1 Î 
gdzie F jest polem powierzchni na łożonej substancji badanej, zwykle 
równym polu powierzchni p łytki próbnej, za ś t jest czasem utraty 
ciężaru Δm. 
Ciśnienie pary p  T oblicza si ę na podstawie szybko ści parowania v  T , 
za pomoc ą wzoru:  
Log p  T = C + D log v  T 
gdzie C i D s ą stałymi charakterystycznymi dla u żytego zestawu 
doświadczalnego, zale żnymi od średnicy komory pomiarowej i od 
natężenia przep ływu gazu. Sta łe te nale ży wyznaczy ć raz poprzez 
wykonanie pomiaru dla grupy zwi ązków o znanym ci śnieniu pary 
i dokonanie regresji zale żności log p  T od log v  T (11)(21)(22).  
Zależność pomiędzy ciśnieniem pary p  T a temperatur ą T w kelwi ­
nach jest dana wzorem:  
Log p  T = A + B 1/T  
gdzie A i B s ą stałymi uzyskanymi z regresji zale żności log p  T od 
1/T. Za pomoc ą tego równania mo żna obliczy ć ciśnienie pary dla 
dowolnej innej temperatury przez ekstrapolacj ę. 
1.5.7.  Metoda nasycania gazu  (23)  
1.5.7.1.  Zasada  
Gaz oboj ętny o temperaturze pokojowej przepuszcza si ę przy 
znanym nat ężeniu przep ływu przez próbk ę badanej substancji lub 
ponad nią dostatecznie powoli, aby zapewni ć nasycenie. Osi ągnięcie 
nasycenia w fazie gazowej ma decyduj ące znaczenie. Przenoszona 
substancja jest wychwytywana (zwykle przy u życiu sorbentu), po 
czym okre śla się jej ilość. Alternatywnie wobec wychwytywania 
i analizy pary, do okre ślenia ilości przenoszonego materia łu można 
wykorzysta ć współbieżne techniki analityczne, np. chromatografi ę 
gazową. Ciśnienie pary oblicza si ę w oparciu o za łożenia, że zacho­
wane jest prawo gazu doskona łego i że całkowite ci śnienie miesza ­
niny gazów jest równe sumie ci śnień gazów b ędących jej sk ładni­
kami. Ci śnienie cz ąstkowe badanej substancji, tj. ci śnienie pary, 
oblicza si ę ze znanej ca łkowitej obj ętości gazu i masy przenoszonego 
materiału. 
Procedura nasycania gazu ma zastosowanie do sta łych lub ciek łych 
substancji chemicznych. Mo że być stosowana do ci śnień pary sięgaj­ 
ących minimum 10  –10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Metoda ta jest 
najbardziej pewna dla ci śnień pary poni żej 10  3 Pa. Powy żej tej 
wartości ciśnienie pary jest zwykle oszacowywane zbyt wysoko, 
prawdopodobnie na skutek tworzenia si ę aerozolu. Poniewa ż 
pomiary ci śnienia pary wykonuje si ę w temperaturze pokojowej, 
nie ma konieczno ści ekstrapolacji danych z wysokich temperatur 
i unika si ę wynikających stąd często poważnych błędów.  
1.5.7.2.  Przyrz ąd 
Procedura wymaga u życia komory sta łotemperaturowej. Szkic na 
rysunku 8 przedstawia komor ę zawieraj ącą po trzy pojemniki na 
próbki sta łe i ciekłe, które umo żliwiają potrojenie analizy próbki 
stałej substancji sta łej lub ciek łej. Temperatura jest regulowana 
z dokładnością do ± 0,5 °C lub lepsz ą. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Rysunek 8
  
Zwykle jako oboj ętny gaz no śny używany jest azot, lecz niekiedy 
może być wymagany inny gaz (24). Gaz no śny musi by ć suchy. 
Strumień gazu zostaje rozdzielony na 6 strumieni regulowanych 
przez zawory iglicowe (o wielko ści otworu ok. 0,79 mm) 
i wpływa do skrzynki poprzez rurk ę miedzian ą o średnicy 
wewnętrznej 3,8 mm. Po wyrównaniu si ę temperatury gaz przep ływa 
przez próbk ę i pułapkę sorbentow ą, a następnie wyp ływa z komory.  
Próbki substancji sta łych umieszcza si ę w rurce szklanej o średnicy 
wewnętrznej 5 mm pomi ędzy korkami z waty szklanej (zob. rysunek 
9). Rysunek 10 przedstawia pojemnik na próbk ę ciekłą i układ 
sorbentu. Najwy ższą odtwarzalno ść pomiaru ci śnienia pary cieczy 
zapewnia metoda polegaj ąca na oblaniu ciecz ą perełek szklanych 
lub obojętnego sorbentu (np. krzemionki) i nape łnieniu zbiornika 
tymi pere łkami. Alternatywnie gaz no śny można przepu ścić przez 
grubą frytę, a następnie w postaci p ęcherzyków przez kolumn ę 
z badaną substancj ą ciekłą. 
Rysunek 9
  Rysunek 10
  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
Układ sorbentu zawiera przedni ą i rezerwow ą sekcję sorbentu. Przy 
bardzo niskich ci śnieniach pary na sorbencie zatrzymywane s ą 
jedynie ma łe ilości i powa żnym problemem mo że być adsorpcja na 
wełnie szklanej i rurce szklanej pomi ędzy próbk ą a sorbentem.  
Innym skutecznym sposobem zbierania odparowanego materia łu są 
pułapki chłodzone sta łym CO  2 . Nie powoduj ą one wstecznego 
ciśnienia na kolumnie saturatora, a ponadto łatwe jest wybranie 
wychwyconego materia łu w sposób ilo ściowy.  
1.5.7.3.  Procedura  
Natężenie przep ływu wyp ływającego gazu no śnego mierzy si ę 
w temperaturze pokojowej. Nat ężenie przep ływu jest cz ęsto spraw ­
dzane w trakcie do świadczenia w celu zapewnienia jego odpowied ­
niej warto ści dla łącznej obj ętości gazu no śnego. Zaleca si ę pomiar 
ciągły za pomoc ą przepływomierza masowego. Nasycenie fazy 
gazowej mo że wymaga ć znacznego czasu kontaktu, a zatem do ść 
niskiego nat ężenia przep ływu gazu (25).  
Na koniec do świadczenia analiz ę przeprowadza si ę oddzielnie dla 
przedniej i rezerwowej sekcji sorbentu. Zwi ązek w ka żdej sekcji 
desorbuje si ę przez dodanie rozpuszczalnika. Otrzymane w wyniku 
tego roztwory poddaje si ę analizie ilo ściowej w celu okre ślenia masy 
zdesorbowanej z ka żdej sekcji. O wyborze metody analitycznej (a 
także o wyborze sorbentu i rozpuszczalnika desorbuj ącego) decyduje 
charakter badanej substancji. Sprawno ść desorpcji wyznacza si ę 
przez wstrzykni ęcie znanej ilo ści próbki do sorbentu, zdesorbowanie 
jej i przeprowadzenie analizy odzyskanej ilo ści. Ważne jest, aby 
sprawność desorpcji sprawdzi ć przy stężeniu próbki wyst ępującym 
w warunkach badania lub zbli żonym do niego.  
Aby zapewni ć nasycenie gazu no śnego badan ą substancj ą stosuje si ę 
trzy różne natężenia przep ływu. Jeżeli obliczone ci śnienie pary 
wykazuje brak zale żności od nat ężenia przep ływu, gaz uznaje si ę 
za nasycony.  
Ciśnienie pary oblicza si ę przy pomocy równania:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
gdzie:  
p = ciśnienie pary (Pa),  
W = masa odparowanej substancji (g),  
V = obj ętość nasyconego gazu (m  3 ), 
R = uniwersalna sta ła gazowa 8,314 (J mol  –1 K –1 ), 
T = temperatura (K),  
M = masa molowa badanej substancji (g mol  –1 ). 
Zmierzone warto ści należy skorygowa ć pod wzgl ędem różnic 
ciśnienia i temperatury pomi ędzy przep ływomierzem a saturatorem.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Wiruj ący rotor  
1.5.8.1.  Zasada  
Metoda ta wykorzystuje lepko ściomierz z wiruj ącym rotorem, 
w którym elementem pomiarowym jest kulka stalowa zawieszona 
w polu magnetycznym i wprowadzana w ruch przez wiruj ące pola 
(26)(27)(28). Pomiar pr ędkości jej wirowania umo żliwiają cewki 
przetwornikowe. Po osi ągnięciu przez kulk ę określonej prędkości 
obrotowej (zwykle oko ło 400 obrotów na sekund ę) zasilanie energi ą 
zostaje wy łączone i nast ępuje wytracanie pr ędkości spowodowane 
tarciem gazu. Spadek pr ędkości obrotowej mierzony jest w funkcji 
czasu. Ci śnienie pary wyznacza si ę na podstawie zale żnego od 
ciśnienia spowalniania ruchu kulki stalowej. Zalecany zakres wynosi 
od 10  –4 do 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Przyrz ąd 
Schemat zestawu do świadczalnego pokazano na rysunku 
11. Głowicę pomiarow ą umieszcza si ę w komorze o sta łej tempera ­
turze regulowanej z dok ładnością do 0,1 °C. Pojemnik z próbk ą 
umieszcza si ę w oddzielnej komorze, w której temperatura jest 
również regulowana z dok ładnością do 0,1 °C. Wszystkie pozosta łe 
części zestawu s ą utrzymywane w wy ższej temperaturze, aby zapo ­
biec kondensacji. Ca ły przyrząd połączony jest z uk ładem wysokop ­
różniowym.  
Rysunek 11
  
2. DANE I SPORZ ĄDZENIE SPRAWOZDANIA  
2.1. DANE  
Ciśnienie pary badane dowoln ą z powyższych metod nale ży wyznaczy ć 
dla co najmniej dwóch temperatur. Zaleca si ę przeprowadzenie 
pomiarów dla trzech lub wi ęcej wartości temperatury w przedziale od 
0 do 50 °C, aby sprawdzi ć liniowość krzywej ci śnienia pary. 
W przypadku metody efuzji (komórki Knudsena i termograwimetrii 
izotermicznej) oraz metody nasycania gazu zaleca si ę zakres temperatury 
pomiaru w granicach od 120 do 150 °C, zamiast od 0 do 50 °C.  
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
— wskazanie zastosowanej metody,  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— dokładne okre ślenie substancji (nazwa i zanieczyszczenia) oraz 
zabieg wst ępnego oczyszczania, o ile jest zastosowany,  
— co najmniej dwie — a najlepiej trzy lub wi ęcej — warto ści 
ciśnienia pary i temperatury wymagane w przedziale od 0 do 
50 °C (lub od 120 do 150 °C),  
— co najmniej jedna z warto ści temperatury powinna wynosi ć 
25 °C lub poni żej, jeżeli jest to technicznie mo żliwe zgodnie 
z wybran ą metodą, 
— wszystkie dane wyj ściowe,  
— krzyw ą zależności log p od 1/T,  
— oszacowanie ci śnienia pary w temperaturze 20 lub 25 °C.  
Jeśli obserwowana jest przemiana (zmiana stanu, rozk ład), to nale ży 
podać następujące informacje:  
— charakter zmiany,  
— temperatur ę, w której zachodzi zmiana przy ci śnieniu atmosfe ­
rycznym,  
— ciśnienie pary w temperaturze 10 i 20 °C poni żej temperatury 
przemiany oraz 10 i 20 °C powy żej tej temperatury (chyba że 
przemiana zachodzi ze stanu sta łego w gazowy).  
Należy podać wszystkie informacje i uwagi maj ące znaczenie dla 
interpretacji wyników, zw łaszcza w odniesieniu do zanieczyszcze ń 
i fizycznego stanu substancji.  
3. LITERATURA  
(1) Dziennik Urz ędowy Wspólnot Europejskich  L 383 A, 26–47 
(1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., Vodar, B., Eds., Butterworths, London.  
(3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, 
Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. 
Chapter IX, Interscience Publ., New York.  
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, New York.  
(5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10
 –1 to 10  5 Pa — Static 
method.  
(6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest 
Management Science 56, 521–532.  
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000).  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22–28.  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269–278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- 
dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122.  
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147.
 
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400.
 
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., 
A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients 
Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relation ­
ship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168.
 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 
45 (1995) 27–31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512–20.
 
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 
81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C.
 
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 
(2002).  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Regis ­
ter, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. 
Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Dodatek  
Metoda szacowania  
WSTĘP 
Szacunkowych warto ści ciśnienia pary mo żna użyć: 
— do ustalenia, która z metod do świadczalnych jest odpowiednia,  
— do podania warto ści szacunkowej lub granicznej w przypadkach, gdy 
z powodów technicznych nie mo żna zastosowa ć metody do świadczalnej.  
METODA SZACOWANIA  
Ciśnienie pary substancji ciek łych i sta łych można oszacowa ć przy użyciu 
zmodyfikowanej korelacji Watsona (a). Jedyn ą wymagan ą daną doświadczaln ą 
jest normalna temperatura wrzenia. Metoda ta ma zastosowanie w przedziale ciśnienia od 10
 5 Pa do 10  –5 Pa. 
Szczegółowe informacje na temat tej metody podano w publikacji „Handbook of 
Chemical Property Estimation Methods” (b). Zob. tak że: OECD Environmental 
Monograph No. 67 (c).  
PROCEDURA OBLICZENIOWA  
Ciśnienie pary oblicza si ę następująco: 
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – Í 
3 – 2  T 
T b Î 
m 
T 
T b – 2m Í 
3 – 2  T 
T b Î 
m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 6 6 6 4 3 
7 7 7 7 7 5
 
gdzie:  
T = rozpatrywana temperatura,  
T b = normalna temperatura wrzenia,  
P VP = ciśnienie pary w temperaturze T,  
ΔH Vb = ciepło parowania,  
ΔZ b = współczynnik ściśliwości (oszacowany na 0,97),  
m = wspó łczynnik empiryczny zale żny od stanu fizycznego w rozpatrywanej 
temperaturze.  
Dalej  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
gdzie K  F jest wspó łczynnikiem empirycznym uwzgl ędniającym polarno ść 
substancji. Dla szeregu typów zwi ązków wspó łczynniki K  F podano 
w opracowaniu (b).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
Dość często dostępne są dane, w których podana jest temperatura wrzenia przy 
obniżonym ciśnieniu. W takim przypadku ci śnienie pary oblicza si ę następująco: 
ln P vp ≈ ln P 1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m T 1 
T – 2m Í 
3 – 2  T 
T 1 Î 
m – 1 
ln T 
T 1 " #  
gdzie T  1 jest temperatur ą wrzenia przy obni żonym ciśnieniu P  1 . 
SPRAWOZDANIE  
W przypadku u życia metody szacowania sprawozdanie powinno zawiera ć 
wyczerpuj ącą dokumentacj ę obliczeń. 
LITERATURA  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asses ­
sment (1993).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. NAPI ĘCIE POWIERZCHNIOWE  
1. METODA  
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotycz ­ 
ących bada ń (1). Podstawowe zasady podano w pozycji bibliogra ­
ficznej (2).  
1.1. WPROWADZENIE  
Opisywane metody s ą stosowane do pomiarów napi ęcia powierzch ­
niowego roztworów wodnych.  
Przed przeprowadzeniem tych bada ń dobrze jest mie ć wstępne infor­
macje na temat rozpuszczalno ści w wodzie, budowy, w łaściwości 
hydrolitycznych i st ężenia krytycznego dla tworzenia si ę micelli 
substancji.  
Poniższe metody mo żna stosowa ć w odniesieniu do wi ększości 
substancji chemicznych, bez jakichkolwiek ogranicze ń związanych 
z ich stopniem czysto ści. 
Pomiar napi ęcia powierzchniowego metod ą tensjometru pier ścienio­
wego jest zastrze żony wyłącznie dla roztworów wodnych o lepko ści 
dynamicznej mniejszej ni ż około 200 mPa s.  
1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI  
Jako napi ęcie powierzchniowe okre śla się entalpi ę wolnej 
powierzchni na jednostk ę pola powierzchni.  
Napięcie powierzchniowe jest podawane jako:  
N/rn (układ SI) lub  
mN/m (uk ład SI)  
1 N/m = 103 dyn/cm  
1 mN/m = 1 dyna/cm w niewa żnym systemie CGS  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
Substancje odniesienia, które obejmuj ą szeroki zakres napi ęć 
powierzchniowych, podano w pozycjach bibliograficznych (1) i (3).  
1.4. ZASADA METOD  
Metody te opieraj ą się na pomiarach maksymalnej si ły, jaką trzeba 
wywierać pionowo na mieszad ło lub pier ścień w kontakcie 
z powierzchni ą badanej cieczy umieszczonej naczyniu miarowym, 
aby oddzieli ć ją od tej powierzchni, b ądź też na płytkę, której 
krawędź wchodzi w kontakt z powierzchni ą, aby poci ągnąć do 
góry utworzon ą błonkę. 
Substancje o rozpuszczalno ści w wodzie przynajmniej w st ężeniu 
1 mg/l badane s ą w roztworach wodnych w pojedynczych st ęże­
niach.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Metody te zapewniaj ą większą precyzję niż wymagana na ogó ł do 
ocen przy przegl ądach środowiskowych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. OPIS METOD  
Roztwór substancji przygotowuje si ę w wodzie destylowanej. 
Stężenie tego roztworu powinno wynosi ć 90 % rozpuszczalno ści 
nasycenia w wodzie, je żeli to stężenie przekracza 1 g/l, do badania 
stosuje si ę stężenie 1 g/l. Nie podlegaj ą badaniu substancje, których 
rozpuszczalno ść w wodzie jest mniejsza ni ż 1 mg/l.  
1.6.1.  Metoda p łytkowa  
Zob. ISO 304 i NF T 73-060 (Surface active agents – determination 
of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.2.  Metoda zawieszki  
Zob. ISO 304 and NF T 73-060 (Surface active agents – determi ­
nation of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.3.  Metoda pier ścieniowa  
Zob. ISO 304 and NF T 73-060 (Surface active agents – determi ­
nation of surface tension by drawing up liquid films).  
1.6.4.  Zharmonizowana metoda pier ścieniowa OECD  
1.6.4.1.  Przyrz ąd 
Do tego pomiaru mo żna wykorzysta ć dostępne w handlu tensjo ­
metry. Sk ładają się one z nast ępujących elementów:  
— ruchomy stó ł próbki,  
— system pomiaru si ły, 
— ciało pomiarowe (pier ścień), 
— naczynie pomiarowe.  
1.6.4.1.1. R u c h o m y s t ó ł p r ó b k i  
Ruchomy stó ł z próbk ą jest wykorzystywany jako wspornik dla 
naczynia pomiarowego z kontrolowan ą temperatur ą, w którym znaj ­
duje się badana ciecz. Razem z uk ładem do pomiaru si ły stół ten jest 
montowany na stojaku.  
1.6.4.1.2. S y s t e m p o m i a r u s i ł y 
Układ do pomiaru si ły (zob. rysunek) mie ści się ponad sto łem 
z próbką. Błąd pomiaru si ły nie mo że przekracza ć ± 10  -6 N, co 
odpowiada granicy b łędu wynosz ącej ± 0,1 mg w przypadku 
pomiaru masy. W wi ększości przypadków skal ę pomiarow ą dostęp­
nych na rynku tensjometrów kalibruje si ę w mN/m, tak aby napi ęcie 
powierzchniowe mo żna było odczytywa ć bezpośrednio w mN/m, 
z dokładnością do 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. C i a ł o p o m i a r o w e ( p i e r ś c i e ń ) 
Pierścień na ogó ł jest wykonany z drutu platynowo-irydowego 
o grubości około 0,4 mm i średnim obwodzie 60 mm. Pier ścień 
drutu zwiesza si ę horyzontalnie z metalowego sworznia 
i drucianego wspornika, tak aby stworzy ć połączenie z uk ładem do 
pomiaru si ły (zob. rysunek).  
Rysunek  
Ciało pomiarowe  
(Wszystkie wymiary w milimetrach)
  
1.6.4.1.4. N a c z y n i e p o m i a r o w e  
Naczynie pomiarowe z badanym roztworem musi by ć naczyniem 
szklanym z kontrolowan ą temperatur ą. Musi by ć tak zaprojektowane, 
aby w trakcie pomiaru temperatura roztworu badanego i fazy gazowej nad jego powierzchni ą pozosta ły stałe, a próbka nie 
mogła wyparowa ć. Dopuszczalne s ą cylindryczne, szklane naczynia 
o średnicy wewn ętrznej nie mniejszej ni ż 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Przygotowanie przyrz ądu 
1.6.4.2.1. C z y s z c z e n i e  
Szklane naczynia musz ą być starannie oczyszczone. W razie 
potrzeby nale ży je przep łukać gorącym kwasem chromowo-siarko ­
wym, a nast ępnie kwasem fosforowym o konsystencji syropu (od 83 
do 98 % wagowo H  3 PO 4 ), potem starannie przep łukać pod wod ą 
z kranu, a wreszcie umy ć dwukrotnie destylowan ą wodą do uzys ­
kania reakcji oboj ętnej, a na ko ńcu wysuszy ć lub przep łukać częścią 
płynnej próbki mierzonej.  
Pierścień należy najpierw starannie op łukać w wodzie w celu 
usunięcia wszelkich substancji rozpuszczalnych w tej cieczy, 
następnie na krótki czas zanurzy ć w kwasie chromowo-siarkowym, 
później umy ć dwukrotnie destylowan ą wodą do uzyskania reakcji 
obojętnej, a na ko ńcu krótko podgrza ć nad płomieniem metanolo ­
wym.  
Uwaga:  
Zanieczyszczenia substancjami, które nie ulegaj ą rozpuszczeniu ani 
zniszczeniu wskutek oddzia ływania kwasu chromo-siarkowego lub 
fosforowego, takimi jak silikony, nale ży usunąć przy pomocy odpo ­
wiedniego rozpuszczalnika organicznego.  
1.6.4.2.2. K a l i b r a c j a p r z y r z ą d u 
Weryfikacja przyrz ądu polega na sprawdzeniu punktu zerowego 
i takim jego wyregulowaniu, aby wskazania instrumentu pozwala ły 
na niezawodne oznaczenia w mN/m.  
Montaż: 
Przyrząd musi by ć wypoziomowany, na przyk ład przy pomocy 
poziomnicy alkoholowej, u podstawy tensjometru, przez wyregulo ­
wanie śrub poziomuj ących u podstawy.  
Ustawienie punktu zero:  
Po zamontowaniu pier ścienia na przyrz ądzie, przed jego zanurzeniem 
w cieczy, wskazania tensjometru nale ży wyregulowa ć do zera 
i sprawdzi ć, czy pier ścień jest ustawiony równolegle do powierzchni 
cieczy. W tym celu powierzchni ę cieczy mo żna wykorzysta ć jako 
lustro.  
Kalibracje:  
Kalibrację przy pomocy rzeczywistego badania mo żna dokona ć przy 
pomocy jednej z dwóch procedur:  
a) używając masę: procedura wykorzystuj ąca koniki wagi o znanej 
masie od 0,1 do 1,0 g umieszczane na pier ścieniu. Wspó łczynnik 
kalibracyjny Φ a , przez który nale ży pomno żyć wszystkie 
wskazania instrumentu, nale ży ustalić według następującego 
wzoru (1):  
Φ a ¼ σ r 
σ a 
gdzie:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = masa konika wagi (g),  
g = przyspieszenie grawitacyjne (981 cm/sek  -2 na wysoko ści 
poziomu morza),  
b = średni obwód pier ścienia (cm),  
σ a = odczyt tensjometru po umieszczeniu konika na pier ścieniu 
(mN/m);  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) używając wodę: procedura stosuj ąca czystą wodę, której napi ęcie 
powierzchniowe przy na przyk ład 23  o C jest równe 72,3 mN/m. 
Niniejsza procedura jest wykonywana szybciej ni ż kalibracja 
wagowa, lecz wyst ępuje przy niej zawsze niebezpiecze ństwo, że 
napięcie powierzchniowe wody jest zafa łszowane śladowymi 
zanieczyszczeniami zwi ązków powierzchniowo czynnych.  
Współczynnik kalibracyjny Φ b , przez który nale ży pomno żyć 
wszystkie wskazania instrumentu, nale ży ustalić według nastę­
pującego wzoru (2):  
Φ b ¼ σ o 
σ g 
gdzie:  
σ o = cytowana w literaturze warto ść napięcia powierzchnio ­
wego wody (mN/m),  
σ g = zmierzona warto ść napięcia powierzchniowego wody 
(mN/m), obie w tej samej temperaturze.  
1.6.4.3.  Przygotowanie próbek  
Należy sporządzić roztwory wodne badanych substancji, u żywając 
odpowiednich st ężeń w wodzie. Nie mog ą one zawiera ć substancji 
w stanie nierozpuszczonym.  
Roztwór nale ży utrzymywa ć w stałej temperaturze (± 0,5  o C). 
Ponieważ napięcie powierzchniowe roztworu w naczyniu pomia ­
rowym zmienia si ę w czasie, nale ży wykona ć kilka pomiarów 
w różnych momentach i nakre ślić krzywą pokazuj ącą napięcie 
powierzchniowe w funkcji czasu. Brak jakichkolwiek dalszych 
zmian oznacza, że osiągnięto stan równowagi.  
Zanieczyszczenie py łami i gazami innych substancji przeszkadza 
w pomiarze. Dlatego badanie musi by ć prowadzone pod przykryw ą 
ochronną. 
1.6.5.  Warunki badania  
Pomiar nale ży przeprowadzi ć w temperaturze oko ło 20  o C, która 
musi by ć kontrolowana w ten sposób, aby utrzymywa ła się 
w zakresie ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Wykonanie badania  
Roztwory do pomiaru nale ży wprowadzi ć do starannie wyczyszczo ­
nego naczynia pomiarowego, dok ładając wszelkich stara ń, aby 
uniknąć wytwarzania piany, a nast ępnie naczynie umieszcza si ę na 
stoliku przyrz ądu do bada ń. Blat stolika z naczyniem pomiarowym 
należy unieść do momentu zanurzenia pier ścienia poni żej 
powierzchni roztworu badanego. Nast ępnie blat stolika opuszcza 
się stopniowo i równo (z szybko ścią około 0,5 cm/min), tak aby 
oddzielić pierścień od powierzchni, do momentu osi ągnięcia maksy ­
malnej si ły. Warstwa cieczy do łączona do pier ścienia nie mo że się 
od niego oddzieli ć. Po wykonaniu pomiarów pier ścień należy 
ponownie zanurzy ć poniżej powierzchni i powtórzy ć pomiary, a ż 
zostanie osi ągnięta stała wartość napięcia powierzchniowego. 
W przypadku ka żdego oznaczenia nale ży zapisać czas odprzenie ­
sienia roztworu do naczynia pomiarowego. Odczyty nale ży wyko­
nywać przy maksymalnej sile potrzebnej do oderwania pier ścienia od 
powierzchni cieczy.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. DANE  
W celu obliczenia napi ęcia powierzchniowego warto ść odczytan ą 
w mN/m na przyrz ądzie należy na pocz ątku pomno żyć przez wspó ł­
czynnik kalibracyjny Φ a lub Φ b (zależnie od zastosowanej procedury 
kalibracyjnej). Da to warto ść jedynie przybli żoną, dlatego wymaga 
korekcji.  
Harkins i Jordan (4) empirycznie ustalili wspó łczynniki korekcji dla 
wartości napięcia powierzchniowego zmierzonych metod ą pierście­
nia. Zależą one od wymiarów pier ścienia, gęstości cieczy i napi ęcia 
powierzchniowego tej ostatniej.  
Ponieważ ustalanie wspó łczynnika korekcji dla ka żdego kolejnego 
pomiaru na podstawie tabel Harkinsa i Jordana jest pracoch łonne, 
do obliczenia napi ęcia powierzchniowego roztworów wodnych 
można wykorzysta ć procedur ę uproszczon ą wykonywania odczytów 
skorygowanych warto ści napięcia powierzchniowego bezpo średnio 
z tabeli. (W przypadku gdy odczytane warto ści znajduj ą się między 
tymi, które podano w tabeli, nale ży zastosowa ć interpolacj ę). 
Tabela  
Korekcja zmierzonego napi ęcia powierzchniowego  
Tylko dla roztworów wodnych, ρ e¼ 1 g/cm  3 
r = 9,55 mm ( średni promie ń pierścienia) 
r = 0,185 mm (promie ń drutu pier ścienia)  
Wartość doświadczalna (mN/m) Wartość skorygowana (mN/m) 
Kalibracja wagowa (zob. 1.6.4.2.2 
lit. a)) Kalibracja wod ą (zob. 1.6.4.2.2 lit.b))  
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 
30 26,2 28,1 | 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Wartość doświadczalna (mN/m) Wartość skorygowana (mN/m) 
Kalibracja wagowa (zob. 1.6.4.2.2 
lit. a)) Kalibracja wod ą (zob. 1.6.4.2.2 lit.b))  
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 
74 69,2 — 
76 71,2 — 78 73,2 —
 
Niniejsza tabela zosta ła zestawiona na podstawie poprawki Harkinsa- 
Jordana. Jest ona zbli żona do tej w normie (DIN 53914) dla wody 
i roztworów wodnych (g ęstość ρ = 1 g/cm  3 ) i dla dost ępnych 
w handlu pier ścieni o wymiarach R = 9,55 mm ( średni promie ń 
pierścienia) i r = 0,185 mm (promie ń drutu pier ścienia). W tabeli 
podano skorygowane warto ści pomiarów napi ęcia powierzchniowego 
wykonanych po kalibracji odwa żnikowej lub przy pomocy wody.  
Alternatywnie, bez poprzednio opisanej kalibracji, napi ęcie 
powierzchniowe mo żna obliczy ć na podstawie nast ępującego wzoru:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
gdzie:  
F = siła zmierzona dynamometrem przy zerwaniu b łonki,  
R = promie ń pierścienia,  
f = wspó łczynnik korekcji (1).  
3. SPORZ ĄDZENIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— zastosowana metoda,  
— rodzaj zastosowanej wody lub zastosowanego roztworu,  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— wyniki pomiaru: napi ęcie powierzchniowe (odczyt), z podaniem 
zarówno poszczególnych odczytów, jak i ich średniej arytme ­
tycznej oraz skorygowanej średniej (z wzi ęciem pod uwag ę 
współczynnika przyrz ądu i tabeli korekcji),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— stężenie roztworu,  
— temperatura badania,  
— wiek zastosowanego roztworu; w szczególno ści czas od przygo ­
towania do zmierzenia w łaściwości roztworu,  
— opis zale żności napięcia powierzchniowego od czasu po przenie ­
sieniu roztworu do naczynia pomiarowego,  
— należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpre ­
tacji wyników, w szczególno ści w odniesieniu do zanieczyszcze ń 
i stanu skupienia substancji.  
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Zważywszy że destylowana woda posiada napi ęcie powierzchniowe 
72,75 mN/m w 20  o C, substancje wykazuj ące napięcie powierzch ­
niowe niższe niż 60 mN/m zgodnie z warunkami niniejszej metody 
należy uznać za materia ły będące powierzchniowo czynnymi.  
4. LITERATURA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I, chapter XIV.
 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, 1751.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. ROZPUSZCZALNO ŚĆ W WODZIE  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 105 (OECD TG 105) (1995). 
Niniejsza metoda badawcza stanowi zmienion ą wersję pierwotnej metody 
opisanej w OECD TG 105, przyj ętej w 1981 r. Pomi ędzy aktualn ą wersją 
a wersją z 1981 r. nie ma zasadniczych ró żnic. Zmiany dotyczy ły przede 
wszystkim formatu. Przegl ąd był oparty o metod ę badawcz ą UE „Water 
solubility” (Rozpuszczalno ść w wodzie) (  1 ). 
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE  
2. Na rozpuszczalno ść substancji w wodzie w sposób istotny mo że wpłynąć 
obecność zanieczyszcze ń. Niniejsza metoda badawcza dotyczy oznaczania 
rozpuszczalno ści w wodzie substancji zasadniczo czystych, które w wodzie 
są stabilne i nie maj ą charakteru lotnego. Przed oznaczeniem rozpuszczal ­
ności w wodzie przydatne jest posiadanie pewnych wst ępnych informacji na 
temat substancji badanej, takich jak wzór strukturalny, ci śnienie pary, sta ła 
dysocjacji i hydroliza jako funkcja pH.  
3. W niniejszym opisie metody badawczej podano dwie metody: metod ę 
wymywania, s łużącą do oznaczania rozpuszczalno ści niższej niż 10  –2 g/l, 
i metodę wytrząsania w kolbie, s łużącą do wyznaczania rozpuszczalno ści 
wyższej. Opisano równie ż proste badanie wst ępne. Umo żliwia ono wyzna ­
czenie w przybli żeniu odpowiedniej ilo ści próbki, jaka ma by ć użyta 
w ostatecznym badaniu, jak równie ż czasu niezb ędnego do uzyskania 
roztworu nasyconego.  
DEFINICJE I JEDNOSTKI  
4. Rozpuszczalno ść substancji w wodzie jest to st ężenie masowe substancji 
w nasyconym roztworze wodnym w okre ślonej temperaturze.  
5. Rozpuszczalno ść w wodzie wyra ża się jako mas ę substancji rozpuszczonej 
na objętość roztworu. Jednostk ą w układzie SI jest kg/m  3 , można równie ż 
stosować jednostk ę g/l. 
SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
6. Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia przy okre ślaniu 
rozpuszczalno ści substancji badanej.  
OPIS METOD  
Warunki badania  
7. Najkorzystniej jest przeprowadzi ć badanie w temperaturze 20 ± 0,5 °C. 
Wybrana temperatura powinna by ć utrzymywana na sta łym poziomie we 
wszystkich istotnych cz ęściach sprz ętu. 
Badanie wst ępne 
8. Stosowana jest procedura sekwencyjna. Do ok. 0,1 g próbki (substancje 
stałe należy sproszkowa ć) znajduj ącej się w cylindrze miarowym 
o pojemno ści 10 ml, zamkni ętym korkiem szklanym, dodaje si ę 
w temperaturze pokojowej kolejne jednostki obj ętości wody. Po ka żdym 
dodaniu jednostki wody mieszanin ę wstrząsa się przez 10 minut 
i kontroluje wzrokowo pod k ątem jakichkolwiek nierozpuszczonych cz ęści 
próbki. Je żeli po dodaniu 10 ml wody próbka lub jej cz ęść pozostają nieroz­
puszczone, do świadczenie kontynuuje si ę przy użyciu cylindra miarowego  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
o objętości 100 ml. Przybli żoną rozpuszczalno ść podano w tabeli 1 poni żej 
pod taką objętością wody, w jakiej dochodzi do pe łnego rozpuszczenia 
próbki. Je żeli rozpuszczalno ść jest ma ła, do rozpuszczenia substancji 
badanej mo że być potrzebne du żo czasu i nale ży ją pozostawi ć na co 
najmniej 24 godziny. Je żeli po 24 godzinach substancja badana pozostaje 
nierozpuszczona, nale ży ją pozostawi ć na dłużej (do 96 godzin) lub 
poczynić próbę dalszego rozcie ńczenia w celu stwierdzenia, czy nale ży 
zastosowa ć metodę wymywania, czy metod ę wytrząsania w kolbie.  
Tabela 1  
ml wody na 0,1 g substancji 
rozpuszczalnej 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Przybliżona rozpuszczalno ść 
w g/l > 1 000 1 000–2 ­
00 200–100 100–50 50–10 10–1 < 1  
Metoda wymywania  
Zasady ogólne  
9. Niniejsza metoda jest oparta na wymywaniu wod ą substancji badanej 
z mikrokolumny wype łnionej oboj ętnym nośnikiem pokrytym uprzednio 
nadmiarem badanej substancji (2). Rozpuszczalno ść w wodzie podawana 
jest jako st ężenie masowe eluatu po osi ągnięciu warto ści plateau 
w funkcji czasu.  
Przyrząd 
10. Przyrz ąd składa się z mikrokolumny (rysunek 1) utrzymywanej w sta łej 
temperaturze. Po łączona jest ona z pomp ą recyrkulacyjn ą (rysunek 2) lub 
z naczyniem poziomuj ącym (rysunek 3). Mikrokolumna zawiera oboj ętny 
nośnik utrzymywany na miejscu ma łą zatyczką z waty szklanej, która s łuży 
także do odfiltrowywania cz ąstek. Jako no śnik można zastosowa ć szklane 
kulki, ziemi ę okrzemkow ą lub inny oboj ętny materia ł. 
11. Mikrokolumna przedstawiona na rysunku 1 nadaje si ę do zestawu z pomp ą 
recyrkulacyjn ą. W górnej cz ęści kolumny znajduje si ę przestrze ń mieszcząca 
pięć objętości złoża (ilość usuwaną na pocz ątku doświadczenia) i pi ęć 
próbek (pobieranych do analizy podczas do świadczenia). Alternatywnie jej 
rozmiar mo że być zmniejszony, je żeli do uk ładu można dodawa ć wody 
podczas do świadczenia w celu zast ąpienia pięciu objętości złoża usuniętych 
wraz z zanieczyszczeniami. Kolumna jest po łączona rurk ą z obojętnego 
materiału z pomp ą recyrkulacyjn ą o wydajno ści około 25 ml/godz. Pompa 
recyrkulacyjna mo że być na przyk ład pompą perystaltyczn ą lub membra ­
nową. Należy uważać, aby nie dosz ło do zanieczyszczenia lub adsorpcji na 
materiale rurki.  
12. Schematyczny uk ład obejmuj ący naczynie poziomuj ące przedstawiono na 
rysunku 3. W tym przypadku mikrokolumna wyposa żona jest w zawór 
jednostronnie odcinaj ący. Podłączenie do naczynia poziomuj ącego składa 
się ze szlifowanego z łącza szklanego i rurki z oboj ętnego materia łu. Pręd­
kość wypływu z naczynia poziomuj ącego powinna wynosi ć w przybli żeniu 
25 ml/godz.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Rysunek 1
  
Wymiary w mm  
A. Połączenie szlifowanego z łącza szklanego  
B. Przestrze ń nadpowierzchniowa  
C. Wewn ętrz 5  
D. Zewn ętrz 19  
E. Zatyczka z waty szklanej  
F. Zawór odcinaj ący 
Rysunek 2
  
A. Wyrównywanie ci śnienia do atmosferycznego  
B. Przep ływomierz  
C. Mikrokolumna  
D. Pompa cyrkulacyjna kontrolowana termostatycznie  
E. Pompa recyrkulacyjna  
F. Zawór dwudro żny do próbkowania  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Rysunek 3
  
A. Naczynie poziomuj ące (np. 2,5-litrowa kolba)  
B. Kolumna  
C. Odbiornik frakcji  
D. Termostat  
E. Rurka teflonowa  
F. Szlifowane z łącze szklane  
G. Linia wodna (pomi ędzy termostatem i kolumn ą, średnica wewn ętrzna 
około 8 mm)  
13. Około 600 mg materia łu nośnika przenie ść do kolby okr ągłodennej 
o pojemno ści 50 ml. Stosown ą ilość substancji badanej rozpu ścić 
w lotnym rozpuszczalniku o czysto ści analitycznej i doda ć odpowiedni ą 
ilość tego roztworu do no śnika. Rozpuszczalnik podda ć całkowitemu odpa ­
rowaniu, np. w wyparce obrotowej, poniewa ż w innym razie no śnik nie 
zostanie ca łkowicie nasycony wod ą podczas etapu wymywania z powodu 
podziału faz na powierzchni no śnika. Upakowany no śnik pozostawi ć do 
nasączenia na dwie godziny w oko ło 5 ml wody, a nast ępnie zawiesin ę 
wlać do mikrokolumny. Alternatywnie mo żna wsypa ć suchy, upakowany 
nośnik do mikrokolumny wype łnionej wod ą i pozostawi ć na dwie godziny 
do ustalenia stanu równowagi.  
14. Upakowanie no śnika może stwarza ć problemy prowadz ące do błędnych 
wyników, np. je żeli substancja badana osadza si ę jako olej. Problemy te 
należy zbadać, a szczegó ły zamieścić w sprawozdaniu.  
Procedura z zastosowaniem pompy recyrkulacyjnej  
15. Uruchomi ć przepływ przez kolumn ę. Zalecane jest stosowanie szybko ści 
przepływu oko ło 25 ml/godz. – odpowiada to 10 obj ętościom złoża na 
godzinę dla opisanej tu kolumny. Odrzuci ć co najmniej pi ęć pierwszych 
wypełnień złoża w celu usuni ęcia rozpuszczalnych w wodzie zanieczysz ­
czeń. Następnie uruchomi ć pompę aż do uzyskania równowagi, definio ­
wanej poprzez wyniki pomiarów dla pi ęciu kolejnych próbek, w których 
stężenie nie ró żni się o więcej niż ± 30 % przy losowym rozk ładzie różnic. 
Próbki te powinny zosta ć od siebie oddzielone w odst ępach czasowych 
odpowiadaj ących przej ściu eluentu w ilo ści co najmniej dziesi ęciokrotnej 
objętości złoża. W zale żności od zastosowanej metody analitycznej lepsz ą 
metodą może być wykreślenie krzywej zale żności stężenia od czasu w celu 
wykazania osi ągnięcia stanu równowagi.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 63
 
Procedura z zastosowaniem naczynia poziomuj ącego  
16. Zebra ć kolejne frakcje eluatu i wykona ć analizę wybraną metodą. Do ozna ­
czenia rozpuszczalno ści wykorzystuje si ę frakcje ze środkowego zakresu 
eluatu, gdzie st ężenia są stałe w granicach ± 30 % w co najmniej pi ęciu 
kolejnych frakcjach.  
17. Preferowanym eluentem jest woda podwójnie destylowana. Mo żna równie ż 
użyć wody zdejonizowanej o rezystywno ści powy żej 10 ΜΩ/cm 
i całkowitej zawarto ści węgla organicznego poni żej 0,01 %.  
18. W obu procedurach wykonuje si ę drugą serię pomiarów przy po łowie pręd­
kości przepływu zastosowanej w pierwszej serii. Je żeli wyniki obu serii s ą 
zgodne, badanie nale ży uznać za zadowalaj ące. Jeżeli zmierzona rozpusz ­
czalność przy ni ższej prędkości przepływu jest wi ększa, wtedy nale ży 
powtarzać procedur ę zmniejszania tej pr ędkości o połowę tak długo, dopóki 
w dwóch kolejnych seriach nie uzyska si ę takiej samej rozpuszczalno ści. 
19. W obu procedurach nale ży kontrolowa ć frakcje pod k ątem obecno ści 
zawiesin koloidalnych przez sprawdzenie, czy nie wyst ępuje efekt Tyndalla. 
Obecność takich cz ąstek powoduje niewa żność badania i po poprawieniu 
działania filtruj ącego kolumny nale ży je powtórzy ć. 
20. Nale ży zmierzy ć pH każdej próbki, najlepiej przy u życiu specjalnych 
pasków wska źnikowych.  
Metoda wytrz ąsania w kolbie  
Zasady ogólne  
21. Substancj ę badaną (ciała stałe muszą zostać sproszkowane) rozpu ścić 
w wodzie w temperaturze nieco wy ższej od temperatury badania. Po uzys ­
kaniu nasycenia mieszanin ę schłodzić i utrzymywa ć w temperaturze bada ­
nia. Alternatywnie, je żeli za pomoc ą właściwego pobierania próbek upew ­
niono się co do osi ągnięcia stanu równowagi nasycenia, pomiar mo że być 
wykonywany bezpo średnio w temperaturze badania. Nast ępnie przy pomocy 
odpowiedniej metody analitycznej oznaczy ć stężenie masowe substancji 
badanej w roztworze wodnym, który nie mo że zawiera ć żadnych nieroz ­
puszczonych cz ąstek (3).  
Przyrząd 
22. Potrzebne s ą następujące materia ły: 
— zwykłe szkło laboratoryjne i instrumenty,  
— urządzenie służące do mieszania roztworów w kontrolowanej, sta łej 
temperaturze,  
— o ile jest potrzebna w przypadku emulsji – wirówka (najlepiej 
z termostatem), oraz  
— sprzęt do wykonywania analiz.  
Procedura  
23. Na podstawie badania wst ępnego oszacowa ć ilość substancji badanej 
niezbędną do nasycenia po żądanej obj ętości wody. Odwa żyć około pięcio­
krotność tej ilości do każdego z trzech naczy ń szklanych wyposa żonych 
w korki szklane (np. probówek wirówkowych, kolb). Do ka żdego naczynia 
dodać pewną objętość wody zale żną od wybranej metody analitycznej 
i zakresu rozpuszczalno ści. Następnie mocno zatkane korkiem naczynia 
wytrząsać w temperaturze 30 °C. Nale ży użyć wytrząsarki lub mieszarki, 
która mo że działać w stałej temperaturze, np. mieszad ła magnetycznego 
w łaźni wodnej z temperatur ą kontrolowan ą termostatem. Po jednym dniu 
jedno z naczy ń pozostawi ć do ustalenia stanu równowagi na 24 godziny 
w temperaturze badania, przy czym od czasu do czasu nale ży je wstrz ąsnąć. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
Zawartość naczynia podda ć następnie wirowaniu w temperaturze badania 
i oznaczy ć stężenie substancji badanej w klarownej fazie wodnej za pomoc ą 
odpowiedniej metody analitycznej. Z pozosta łymi dwiema kolbami post ąpić 
podobnie po pocz ątkowym ustaleniu stanu równowagi w temperaturze 
30 °C przez, odpowiednio, dwa i trzy dni. Je żeli wyniki oznaczenia st ężenia 
w co najmniej dwóch ostatnich naczyniach nie ró żnią się o więcej niż 15 %, 
badanie nale ży uznać za zadowalaj ące. Jeżeli wyniki dla naczy ń 1, 2 i 3 
wykazują tendencj ę do wzrastaj ących warto ści, całe badanie nale ży powtó­
rzyć, stosując dłuższe okresy ustalania równowagi.  
24. Badanie mo żna równie ż wykonać bez wstępnej inkubacji w 30 °C. W celu 
oceny szybko ści ustalania si ę równowagi nasycenia próbki pobiera si ę do 
momentu, gdy czas mieszania nie wywiera ju ż wpływu na mierzone st ęże­
nie. 
25. Nale ży zmierzy ć pH każdej próbki, najlepiej przy u życiu specjalnych 
pasków wska źnikowych.  
Oznaczenia analityczne  
26. Najkorzystniejsza jest metoda specyficzna dla substancji, gdy ż małe ilości 
rozpuszczalnych zanieczyszcze ń mogą spowodowa ć duże błędy wyników 
pomiarów rozpuszczalno ści. Przyk ładami takich metod s ą: chromatografia 
gazowa lub cieczowa, miareczkowanie, fotometria, woltamperometria.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
Metoda wymywania  
27. W ka żdej serii nale ży obliczy ć wartość średnią i odchylenie standardowe dla 
co najmniej pi ęciu kolejnych próbek pobranych przy plateau nasycenia. 
Wartości średnie uzyskane w dwóch badaniach przy ró żnych prędkościach 
przepływu nie powinny si ę różnić o więcej niż 30 %.  
Metoda wytrz ąsania w kolbie  
28. Wyniki pomiarów dla ka żdej z trzech kolb, które nie powinny si ę różnić 
o więcej niż 15 %, uśrednia się. 
Sprawozdanie z badania  
Metoda wymywania  
29. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
— wyniki badania wst ępnego,  
— nazwa chemiczna i informacje o zanieczyszczeniach (oczyszczanie 
wstępne, jeżeli zostało przeprowadzone),  
— stężenia, prędkości przepływu i pH dla ka żdej próbki,  
— średnie i odchylenia standardowe dla co najmniej pi ęciu próbek przy 
plateau nasycenia dla ka żdej serii,  
— średnia z co najmniej dwóch kolejnych serii,  
— temperatura wody w czasie procesu nasycania,  
— metoda analityczna,  
— charakter no śnika,  
— upakowanie no śnika,  
— zastosowany rozpuszczalnik,  
— dowody niestabilno ści chemicznej substancji w trakcie badania,  
— wszystkie informacje istotne dla interpretacji wyników, szczególnie 
w odniesieniu do zanieczyszcze ń i stanu fizycznego substancji badanej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Metoda wytrz ąsania w kolbie  
30. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
— wyniki badania wst ępnego,  
— nazwa chemiczna i informacje o zanieczyszczeniach (oczyszczanie 
wstępne, jeżeli zostało przeprowadzone),  
— poszczególne oznaczenia analityczne, a w przypadku gdy dla ka żdej 
kolby była oznaczana wi ęcej niż jedna warto ść, ich średnia,  
— pH ka żdej próbki,  
— średnia warto ści dla różnych kolb, które by ły zgodne,  
— temperatura badania,  
— metoda analityczna,  
— dowody na jak ąkolwiek niestabilno ść chemiczn ą substancji w trakcie 
badania,  
— wszystkie informacje istotne dla interpretacji wyników, szczególnie 
w odniesieniu do zanieczyszcze ń i stanu fizycznego substancji badanej.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Dyrektywa Komisji 92/69/EWG z dnia 31 lipca 1992 r. dostosowuj ąca po 
raz siedemnasty do post ępu technicznego dyrektyw ę 67/548/EWG w sprawie 
zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych 
odnoszących się do klasyfikacji i etykietowania substancji niebezpiecznych 
(Dz.U. L 383 z 29.12.1992, s. 113).  
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with low solu ­
bility – Column elution method.  
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial 
use – Determination of water solubility of solids and liquids with high 
solubility – Flask method.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8. WSPÓ ŁCZYNNIK PODZIA ŁU 
1. METODA  
Opisana metoda „wstrz ąsania kolby” jest oparta na wytycznych 
OECD dotycz ących bada ń (1). 
1.1. WPROWADZENIE  
Dla wykonania niniejszego badania korzystne jest posiadanie infor ­
macji wst ępnych dotycz ących wzoru strukturalnego, sta łej dysocjacji, 
rozpuszczalno ści w wodzie, hydrolizy, rozpuszczalno ści w n-okta ­
nolu i napi ęcia powierzchniowego substancji.  
Pomiary na substancjach ulegaj ących jonizacji powinny by ć wyko­
nane tylko na ich niezjonizowanej postaci (wolny kwas lub wolna zasada) uzyskanej przez u życie właściwego buforu o pH co najmniej 
jedną jednostk ę mniejszą (wolny kwas) lub wi ększą (wolna zasada) 
od pK.
 
Niniejsza metoda badania zawiera dwie oddzielne procedury: metoda 
wstrząsania kolby i chromatografii cieczowej wysokiej wydajno ści 
(HPLC). Pierwsz ą stosuje si ę gdy warto ść log P  ow (zob. definicje 
poniżej) wypada w zakresie od - 2 do 4, drug ą w zakresie od 0 do 
6. Przed przeprowadzeniem procedury do świadczalnej, nale ży 
wpierw wst ępnie uzyska ć oszacowanie wspó łczynnika podzia łu. 
Metodę wstrząsania kolby stosuje si ę jedynie do zasadniczo czystych 
substancji rozpuszczalnych w wodzie i n-oktanolu. Nie stosuje si ę jej 
do materia łów powierzchniowo czynnych (dla takich nale ży podać 
wartość obliczon ą lub oszacowan ą opartą na rozpuszczalno ści danej 
substancji w n-oktanolu i w wodzie).  
Metody HPLC nie stosuje si ę dla silnych kwasów i zasad, zwi ązków 
kompleksowych metali, materia łów powierzchniowo czynnych lub 
substancji, które reaguj ą z rozpuszczalnikiem wymywaj ącym. Dla 
takich materia łów należy podać wartość obliczon ą lub oszacowan ą 
opartą na rozpuszczalno ści danej substancji w n-oktanolu i w 
wodzie.  
Metoda HPLC jest mniej czu ła na obecno ść zanieczyszcze ń 
w badanym zwi ązku niż metoda wstrz ąsania kolby. Pomimo tego, 
zanieczyszczenia w niektórych przypadkach mog ą czynić interpre­
tację wyników trudn ą, poniewa ż wyznaczenie piku jest niepewne. 
Dla mieszanin daj ących nieczytelne pasmo, nale ży ustalić górną 
i dolną granicę log P.  
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI  
Współczynnik podzia łu (P) definiuje si ę jako stosunek st ężeń równo­
wagi (c  i ) substancji rozpuszczonej w uk ładzie dwufazowym, sk ładaj­ 
ącym się z dwóch zasadniczo niemieszaj ących się ze sobą rozpusz­
czalników. W przypadku n-oktanolu i wody:  
p ow ¼ c nÄoctanol  
c water 
Dlatego wspó łczynnik podzia łu (P) jest ilorazem dwóch st ężeń, przy 
czym na ogó ł podaje si ę go w postaci jego logarytmu o podstawie 10 
(log P).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Metoda wstrz ąsania kolby  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
Metoda HPLC  
W celu skorelowania danych zmierzonych metod ą HPLC danego 
związku z jego warto ścią P należy ustalić krzywą kalibracji log 
P w zale żności od danych chromatograficznych, u żywając co 
najmniej 6 punktów odniesienia. Jest zadaniem u żytkownika wybór 
właściwych substancji odniesienia. W ka żdym przypadku, gdy 
będzie możliwe, co najmniej jedna substancja odniesienia powinna 
posiadać P ow powyżej tego dla substancji badanej, a druga powinna 
posiadać P  ow poniżej substancji badanej. Dla warto ści log 
P mniejszej ni ż 4 kalibracja musi by ć oparta o dane uzyskane 
metodą wstrząsania kolby. Dla warto ści log P wi ększej od 4 kalib ­
racja powinna by ć oparta na wa żnych warto ściach literaturowych, 
jeżeli są one zgodne z warto ściami wyliczonymi. Celem uzyskania 
lepszej dok ładności, zalecane jest wybór takich substancji odniesie ­
nia, które s ą strukturalnie zbli żone do badanej substancji.  
Rozszerzone wykazu warto ści log P  ow dla wielu grup zwi ązków 
chemicznych s ą dostępne w pozycjach bibliograficznych (2) i (3). 
Jeżeli dane wspó łczynnika podzia łu strukturalnie zbli żonych 
związków nie s ą dostępne, należy zastosowa ć bardziej ogóln ą kalib­
rację, ustaloną w oparciu o inne zwi ązki odniesienia.  
Wykaz zalecanych substancji odniesienia i ich warto ści P  ow podano 
w dodatku 2.  
1.4. ZASADA METODY  
1.4.1.  Metoda wstrz ąsania kolby  
W celu ustalenia wspó łczynnika podzia łu należy uzyskać równowag ę 
między wszystkimi wchodz ącymi w interakcje sk ładnikami uk ładu, 
przy czym nale ży ustalić stężenie substancji rozpuszczonych 
w dwóch fazach. Studia w zakresie literatury na ten temat wskazuj ą, 
że możliwe jest u życie kilku ró żnych technik dla rozwi ązania niniej ­
szego problemu, to jest poprzez zmieszanie dwóch faz oraz kolejno 
ich rozdzielenie w celu ustalenia st ężenia równowagi badanej 
substancji.  
1.4.2.  Metoda HPLC  
HPLC jest wykonywana na kolumnach analitycznych wype łnionych 
handlowo dost ępną fazą stałą zawierającą długo łańcuchowe w ęglo­
wodory (np. C  8 , C 18 ) chemicznie zwi ązane na krzemionce. Zwi ązki 
chemiczne wstrzykni ęte do takiej kolumny przesuwaj ą się w niej 
z różnymi szybko ściami z powodu ró żnych stopni ich podzia łu 
między fazą ruchomą oraz węglowodorow ą fazą stacjonarn ą. Miesza­
niny związków chemicznych s ą wymywane w kolejno ści ich hydro ­
fobowości, pierwsze wymywane s ą związki chemiczne rozpuszczalne 
w wodzie, a na ko ńcu związki chemiczne rozpuszczalne w olejach, 
proporcjonalnie do ich wspó łczynnika podzia łu między węglowo­
dory oraz wod ę. Umożliwia to uzyskanie zale żności między czasem 
retencji na takiej kolumnie (odwrócona faza) i ustalenie wspó łczyn­
nika podzia łu n-oktanol/woda. Wspó łczynnik podzia łu jest wyprowa ­
dzany ze wspó łczynnika obj ętości k, podanego wyra żeniem:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
w której t  r = czas retencji badanej substancji, t  o = średni czas 
przejścia cząsteczek rozpuszczalnika przez kolumn ę (czas martwy).  
Nie są wymagane analizy ilo ściowe, a konieczne jest tylko ozna ­
czenie czasu wymywania.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
1.5.1.  Powtarzalno ś 
Metoda wstrz ąsania kolby  
W celu zapewnienia precyzji wspó łczynnika podzia łu należy prze­
prowadzić dwukrotne oznaczenia w trzech ró żnych warunkach bada ­
nia, przy czym mo żna zmienia ć ilość oznaczanej substancji oraz 
stosunek obj ętości rozpuszczalników. Ustalone warto ści współczyn­
nika podzia łu wyrażone jako ich wspólne logarytmy powinny 
zawierać się w przedziale ± 0,3 jednostek logarytmicznych.  
Metoda HPLC  
W celu zwi ększenia poziomu ufno ści pomiaru, nale ży wykona ć 
podwójne oznaczenia. Warto ści log P wyprowadzone z poszczegól ­
nych pomiarów powinny mie ścić się w zakresie ± 0,1 jednostek 
logarytmicznych.  
1.5.2.  Czu łość 
Metoda wstrz ąsania kolby  
Zakres pomiarowy metody ustala si ę na podstawie granicy wykry ­
walności procedury analitycznej. Powinno to pozwala ć na ocen ę 
wartości log P  ow w zakresie od - 2 do 4 (wyj ątkowo, gdy zezwalaj ą 
warunki, niniejszy zakres mo że być rozszerzony do log P  ow do 5), 
gdy stężenie rozpuszczenia w jednej z faz jest nie wi ększe niż 0,01 
mola na litr.  
Metoda HPLC  
Metoda HPLC umo żliwia ocen ę współczynnika podzia łu w zakresie 
log P  ow od 0 do 6.  
Zwykle wspó łczynnik podzia łu danego zwi ązku może być oszaco­
wany z dok ładnością w obrębie zakresu ± 1 jednostki logarytmicznej 
wartości uzyskanej z metody wstrz ąsania kolby. Typowe korelacje 
można znaleźć w pozycjach bibliograficznych (4), (5), (6), (7) i (8). 
Wyższą dokładność można zwykle uzyska ć, gdy krzywe korelacji s ą 
oparte na strukturalnie zbli żonych zwi ązkach odniesienia (9).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Specyficzno ś 
Metoda wstrz ąsania kolby  
Prawo podzia łu Nernsta obowi ązuje jedynie w warunkach sta łej 
temperatury, sta łego ciśnienia i sta łego pH, w przypadku rozcie ń­
czonych roztworów. W sposób ścisły dotyczy czystej substancji 
zdyspergowanej mi ędzy dwoma czystymi rozpuszczalnikami. 
Istnienie kilku ró żnych substancji rozpuszczonych w jednej lub 
dwóch fazach mo że wpłynąć na uzyskane wyniki.  
Zjawiska dysocjacji lub asocjacji rozpuszczonych cz ąsteczek 
prowadzą do odchyle ń od prawa podzia łu Nernsta. Na takie odchy ­
lenia wskazuje fakt, że współczynnik podzia łu staje si ę zależny od 
stężenia roztworu.  
Ze względu na szereg ró żnych badanych stanów równowagi, ta 
metoda badania nie powinna by ć stosowana w odniesieniu do 
związków ulegaj ących jonizacji bez zastosowania korekcji. Nale ży 
rozważyć użycie roztworów buforowych w miejsce wody dla takich 
związków; pH buforu powinno ró żne przynajmniej o jedn ą jednostkę 
pH od pKa substancji i by ć w zgodno ści z pH badanego środowiska.  
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Wst ępna ocena wspó łczynnika podzia łu 
Bardziej wskazana jest ocena wspó łczynnika podzia łu za pomoc ą 
metody obliczeniowej (zob. dodatek 1) lub, je śli stosowne, ze 
stosunków rozpuszczalno ści badanej substancji w czystych rozpusz ­
czalnikach (10).  
1.6.2.  Metoda wstrz ąsania kolby  
1.6.2.1.  Przygotowanie  
N-oktanol: oznaczenie wspó łczynnika podzia łu należy wykona ć przy 
użyciu odczynnika jako ści analitycznej o wysokiej czysto ści. 
Woda: nale ży użyć wody destylowanej lub dwa razy destylowanej z 
przyrządu szklanego lub kwarcowego. Je żeli jest uzasadnione, dla 
związków ulegaj ących jonizacji, nale ży użyć roztworów buforowych 
w miejsce wody.  
Uwaga:  
Nie można stosowa ć wody pochodz ącej bezpo średnio z wymieniacza 
jonowego.  
1.6.2.1.1. W s t ę p n e n a s y c e n i e r o z p u s z c z a l n i k ó w  
Przed ustaleniem wspó łczynnika podzia łu wykonuje si ę wzajemne 
nasycenie faz uk ładu rozpuszczalników przez wytrz ąsanie 
w temperaturze prowadzenia eksperymentu. Aby to uzyska ć, 
wygodnie jest zastosowa ć wytrząsanie dwóch du żych butli magazy ­
nowych z n-oktanolem lub wod ą wysokiej czysto ści do analiz 
z wystarczaj ącą ilością drugiego rozpuszczalnika, przez 24 godziny, 
na mechanicznej wytrz ąsarce, a nast ępnie odstawienie ich na okres 
tak długi, aby dosz ło do rozdzielenia faz i uzyskania stanu nasyce ­
nia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r z y g o t o w a n i e d o b a d a n i a  
Cała objętość układu dwufazowego powinna prawie wype łniać 
naczynie do badania. Pomo że to w niedopuszczeniu do utraty mate ­
riału z powodu jego ulatniania si ę. Stosunek obj ętościowy i ilo ści 
substancji, które nale ży zastosowa ć, ustala si ę na podstawie nast ępuj­ 
ących informacji:  
— wstępna ocena wspó łczynnika podzia łu (zob. powy żej), 
— minimalna ilo ść substancji badanej wymagana do procedury 
analitycznej, oraz  
— ograniczenie maksymalnego st ężenia w ka żdej z faz do 0,01 
mola na litr.  
Przeprowadza si ę trzy badania. W pierwszym u żywa się wyliczonej 
wielkości stosunku n-oktanolu do wody; w drugiej ten stosunek 
dzieli się przez dwa; i w trzecim stosunek ten mno ży się przez 
dwa (np. 1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. S u b s t a n c j a b a d a n a  
Roztwór podstawowy przygotowuje si ę w n-oktanolu wst ępnie nasy ­
conym wod ą. Stężenie takiego roztworu podstawowego musi by ć 
precyzyjnie oznaczone, przed u życiem go w oznaczaniu wspó łczyn­
nika podzia łu. Roztwór ten powinien by ć przechowywany 
w warunkach zapewniaj ących jego stabilno ść. 
1.6.2.2.  Warunki badania  
Powinna by ć utrzymywana sta ła temperatura badania (± 1  o C) 
i mieścić się w zakresie od 20 do 25  o C. 
1.6.2.3.  Procedura pomiarowa  
1.6.2.3.1. U s t a l e n i e r ó w n o w a g i p o d z i a ł u 
Dla każdego z warunków badania nale ży przygotowa ć po dwa 
naczynia do bada ń zawieraj ące wymagane, dok ładnie odmierzone 
ilości obu rozpuszczalników, łącznie z niezb ędną ilością roztworu 
podstawowego.  
Fazy n-oktanolu powinny by ć mierzone obj ętościowo. Naczynia do 
badania nale ży albo ustawi ć na odpowiedniej wytrz ąsarce, albo 
wytrząsać w ręce. Przy zastosowaniu wirowania probówki zalecan ą 
metodą jest obrócenie szybko probówki o oko ło 180  o względem jej 
poprzecznej osi, tak by nie doprowadzi ć do jakiegokolwiek wzrostu 
ilości powietrza w obu fazach. Do świadczenie pokaza ło, że 50 takich 
obrotów jest zwykle wystarczaj ące dla ustalenia równowagi podzia łu. 
Dla pewno ści zaleca si ę 100 obrotów w ci ągu pięciu minut.  
1.6.2.3.2. R o z d z i e l e n i e f a z  
Jeżeli jest konieczne w celu rozdzielenia faz, nale ży zastosowa ć 
wirowanie mieszaniny. Do tego celu nale ży użyć wirówki laborato ­
ryjnej utrzymywanej w temperaturze pokojowej b ądź też, w razie 
wykorzystywania wirówki o niekontrolowanej temperaturze, nale ży 
zapewnić uzyskanie ponownego stanu równowagi probówek do 
wirówki w temperaturze badania na co najmniej jedn ą godzinę 
przed analiz ą. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Analiza  
W celu oznaczenia wspó łczynnika podzia łu konieczne jest ustalenie 
stężenia substancji badanej w obu fazach. Mo żna tego dokona ć przez 
pobranie podwielokrotno ści każdej z obu faz z ka żdej z probówek 
dla każdych warunków badania i poddanie tych podwielokrotno ści 
analizie ich przy u życiu wybranej procedury. Nale ży obliczy ć całko­
witą ilość substancji obecnej w obu fazach i porówna ć ją z ilością 
pierwotnie wprowadzonej substancji.  
Należy pobrać próbki fazy wodnej przy u życiu procedury zmniej ­
szającej do minimum ryzyko pobrania śladów n-oktanolu: do 
pobrania próbki fazy wodnej mo żna użyć szklanej strzykawki 
z wyjmowan ą igłą. Strzykawka powinna zosta ć na pocz ątku 
częściowo wype łniona powietrzem. Nale ży delikatnie wypchn ąć 
powietrze, wprowadzaj ąc igłę przez warstw ę n-oktanolu. Pobiera 
się odpowiedni ą objętość fazy wodnej do strzykawki. Nast ępnie 
strzykawk ę szybko wyjmuje si ę z roztworu i od łącza igłę. Zawarto ść 
strzykawki mo żna wykorzysta ć jako próbk ę fazy wodnej. 
Najkorzystniej jest ustali ć stężenie w dwóch rozdzielonych fazach 
przy użyciu metody specyficznej dla substancji. Przyk ładami właści­
wych metod analitycznych s ą: 
— metody fotometryczne,  
— chromatografia gazowa,  
— wysokosprawna chromatografia cieczowa.  
1.6.3.  Metoda HPLC  
1.6.3.1.  Przygotowanie  
Przyrząd 
Wymagany jest chromatograf cieczowy, wyposa żony w bezimpul ­
sową pompę i odpowiednie urz ądzenie do wykrywania. Zalecane 
jest użycie zaworu wtryskowego z obiegiem wtrysku. Obecno ść 
grup polarnych w fazie stacjonarnej mo że poważnie zakłócić dzia­ 
łanie kolumny HPLC. Zatem fazy stacjonarne powinny posiada ć 
minimaln ą zawartość grup polarnych (11). Mo żna stosowa ć dostępne 
w handlu mikrocz ąsteczkowe wype łnienia dla fazy odwróconej lub 
gotowe wype łnione kolumny. Kolumna ochronna powinna by ć 
umieszczona mi ędzy systemem wtrysku a kolumn ą analityczn ą. 
Faza ruchoma  
Do przygotowania rozpuszczalnika wymywaj ącego, odgazowywa ­
nego przed u życiem, używa się metanolu oraz wody o czysto ści 
HPLC. Wykorzystuje si ę elucję izokratyczn ą. Należy zastosowa ć 
stosunki metanol/woda o minimalnej zawarto ści wody 25 %. Miesza ­
nina metanol-woda o typowym stosunku 3:1 (obj.) jest zadawalaj ąca 
do wymywania zwi ązków o log P 6 w ci ągu jednej godziny, przy 
szybkości przepływu 1 ml/mm. Dla zwi ązków o wysokim log 
P może być konieczne skrócenie czasu elucji (oraz zwi ązków odnie ­
sienia) poprzez zmniejszenie polarno ści fazy ruchomej lub d ługości 
kolumny.  
Substancje o bardzo niskiej rozpuszczalno ści w n-oktanolu wykazuj ą 
tendencję do dawania nienormalnie niskich warto ści log P  ow przy 
metodzie HPLC; piki takich zwi ązków czasem towarzysz ą czołu 
rozpuszczalnika. Zjawisko to jest prawdopodobnie zwi ązane 
z faktem, że proces podzia łu jest za powolny do uzyskania równo ­
wagi w czasie branym pod uwag ę przy zwyk łym rozdzielaniu 
metodą HPLC. Zmniejszenie szybko ści przepływu i/lub obni żenie 
stosunku metanol/woda mo że być zatem w tym przypadku skuteczne 
do osiągnięcia rzeczywistej warto ści. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Związki badane i odniesienia musz ą być rozpuszczalne w fazie 
ruchomej w st ężeniach wystarczaj ących do umo żliwienia ich wykry ­
cia. Tylko w wyj ątkowych przypadkach mo żna zastosowa ć dodatki 
do mieszaniny metanol/woda, poniewa ż dodatki zmieniaj ą właści­
wości kolumny. Dla chromatogramów z dodatkami obowi ązkowe 
jest użycie oddzielnej kolumny tego samego typu. Je śli układ meta­
nol-woda nie jest odpowiedni, mo żna użyć innych mieszanin orga ­
nicznych rozpuszczalników, na przyk ład etanol-woda lub acetonitryl- 
woda.  
Wartość pH eluentu jest krytyczna dla zwi ązków ulegaj ących joni ­
zacji. Powinno by ć ono w obr ębie zakresu roboczego pH kolumny, 
które zwykle wynosi mi ędzy 2 i 8. Zalecane jest buforowanie. 
Należy zachowa ć ostrożność, aby nie dopu ścić do wytr ącania się 
soli i zniszczenia kolumny, co zachodzi dla niektórych mieszanin faza organiczna/bufor. Pomiary HPLC faz stacjonarnych opartych na krzemionce powy żej pH 8 nie s ą polecane, gdy ż użycie zasa ­
dowej fazy ruchomej powoduje gwa łtowne pogorszenie si ę wydaj­
ności kolumny.
 
Substancje rozpuszczone  
Związki odniesienia powinny by ć o najwy ższej dostępnej czysto ści. 
Związki używane do celów badania lub kalibracji s ą rozpuszczone, 
o ile to mo żliwe, w fazie ruchomej.  
Warunki badania  
Temperatura w trakcie wykonywania pomiarów nie mo że zmienia ć 
się więcej niż ± 2 K.  
1.6.3.2.  Pomiar  
Obliczenie czasu martwego t  o 
Czas martwy t  o ustala si ę albo przez zastosowanie szeregów 
homologicznych (np. n-alkilometyloketonów), albo nieustalonych związków organicznych (np. tiomocznik lub formamid). Dla obli ­
czenia czasu martwego t
 o z użyciem szeregów homologicznych, 
zestaw co najmniej siedmiu reprezentantów szeregu jest wtryskiwany 
i oznacza si ę poszczególne czasy retencji. Wst ępne czasy retencji 
t r(nc + 1)  są wykreślane w funkcji t  r(n c)  , oraz punkt przeci ęcia 
a oraz nachylenie b równania regresji:  
t r(nc + 1)  = a + b t  r (nc) 
są ustalane (n  c = ilość atomów w ęgla). Czas martwy to jest zatem 
dany przez:  
t o = a/(1 – b)  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Krzywa kalibracji  
Następnym krokiem jest sporz ądzenie wykresu korelacji warto ści log 
k w zale żności od log P dla w łaściwych zwi ązków odniesienia. 
W praktyce zestaw mi ędzy 5 a 10 standartowych zwi ązków odnie ­
sienia, których log P jest wokó ł oczekiwanego zakresu jest kolejno 
wtryskiwany i oznaczane s ą czasy retencji, najkorzystniej przez inte ­
grator rejestruj ący podłączony do systemu detekcji. Odpowiadaj ące 
logarytmy masowych stosunków podzia łów, log k, s ą wyliczane 
i wykreślane w funkcji log P ustalonego metod ą wstrząsania kolby. 
Kalibracja jest prowadzona w regularnych odst ępach czasu co 
najmniej raz dziennie, tak aby mo żliwe zmiany wydajno ści kolumny 
mogły być akceptowane.  
Oznaczanie masowego stosunku podzia łu badanej substancji  
Badana substancja jest wtryskiwana do tak ma łej ilości fazy 
ruchomej jak to mo żliwe. Oznacza si ę czas retencji (podwójnie), 
pozwalający na obliczenie masowego stosunku podzia łu k. 
Z wykresu korelacji zwi ązków odniesienia, mo żna interpolowa ć 
współczynnik podzia łu badanej substancji. Dla bardzo niskich oraz 
dla bardzo wysokich wspó łczynników podzia łu konieczna jest 
ekstrapolacja. W tych przypadkach nale ży zwróci ć szczególn ą 
uwagę na granice ufno ści linii regresji.  
2. DANE  
Metoda wstrz ąsania kolby  
Niezawodno ść ustalonych warto ści P można sprawdzi ć przez porów ­
nanie średnich wyników dwukrotnych oznacze ń ze średnią wszyst­
kich wyników.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— tam gdzie metody nie nadaj ą się do zastosowania (np. dla mate ­
riałów powierzchniowo czynnych), nale ży przedstawi ć obliczon ą 
lub oszacowan ą wartość w oparciu o poszczególne rozpuszczal ­
ności w n-oktanolu i wodzie,  
— należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpre ­
tacji wyników, w szczególno ści w odniesieniu do zanieczyszcze ń 
i stanu skupienia substancji.  
Dla metody wstrz ąsania kolby:  
— wynik wst ępnej oceny, o ile wykonano,  
— temperatura oznaczania,  
— dane na temat procedur analitycznych zastosowanych do ozna ­
czenia stężeń, 
— czas i szybko ść wirowania, o ile zastosowano,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— zmierzone st ężenia w obu fazach dla ka żdego oznaczenia (co 
oznacza, że całkowita liczba 12 st ężeń znajdzie si ę 
w sprawozdaniu),  
— waga substancji badanej, obj ętość każdej fazy zastosowanej 
w każdym naczyniu oraz ca łkowita obliczona obj ętość substancji 
badanej obecnej w ka żdej z faz po uzyskaniu stanu równowagi,  
— należy podać obliczone warto ści współczynnika podzia łu (P) 
oraz średniej dla ka żdego zestawu warunków badania, podobnie 
jak średnie z wszystkich oznacze ń. W przypadku gdy istniej ą 
dane przemawiaj ące za zale żnością współczynnika podzia łu od 
stężenia, nale ży to odnotowa ć w sprawozdaniu,  
— należy podać odchylenia standardowe poszczególnych warto ści 
P ponad ich średnią, 
— średnie warto ści P uzyskane na podstawie wszystkich oznacze ń 
należy także podać jako ich logarytm (o podstawie 10),  
— teoretyczne obliczenie P  ow , gdy warto ść ta została oznaczona lub 
gdy zmierzona warto ść jest > 10  4 , 
— pH używanej wody oraz fazy wodnej w czasie trwania ekspery ­
mentu,  
— jeżeli używane są bufory, nale ży podąć uzasadnienie dla ich 
użycia w miejsce wody, sk ład, stężenia i pH buforów, pH fazy 
wodnej przed i po eksperymencie.  
Dla metody HPLC:  
— wynik wst ępnej oceny, o ile wykonano,  
— substancje badane i odniesienia oraz ich czysto ść, 
— zakres temperatury oznacze ń, 
— pH, przy którym wykonano oznaczenia,  
— szczegó ły kolumn analitycznej i ochronnej, fazy ruchomej 
i środków detekcji,  
— dane retencji oraz literaturowe warto ści log P dla zwi ązków 
odniesienia u żytych w kalibracji,  
— szczegó ły dopasowania linii regresji (log k w zale żności od 
log P),  
— dane średniej retencji i interpolowana warto ść log P badanego 
związku, 
— opis wyposa żenia i warunki pracy,  
— profile wymywania,  
— ilość badań oraz substancje odniesienia substancji wprowadzo ­
nych do kolumny,  
— czas martwy i sposób jego pomiaru.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. LITERATURA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the 
Council C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) – Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygärd, Chemos ­
phere, 1980, vol. 80, 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D’Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, 219.  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, 1.  
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, 
675. 
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, 
vol. 15, 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band I/1, 223–339.  
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses. Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical prqducts for industrial 
use -Determination of partition coefficient – Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth and P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 
1459.  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
525. 
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci. Tech ­
nol., 1974, vol. 8, 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
382. 
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York 1979.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, 
Amsterdam 1984,  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Base11978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor; J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, 615.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Dodatek 1  
Metody obliczenia/szacowania  
WPROWADZENIE  
Ogólne wprowadzenie do metod obliczeniowych, dane i przyk łady są przedsta­
wione w pozycji „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (a).  
Stosuje si ę obliczon ą wartość P ow : 
— w celu zadecydowania która z metod do świadczalnych jest w łaściwa (zakres 
metody wstrz ąsania kolby: log P  ow : od - 2 do 4, zakres metody HPLC: log 
P ow : od 0 do 6),  
— do wyboru w łaściwych warunków badania (np. substancji odniesienia dla 
procedur HPLC, stosunek obj ętości n-oktanolu do wody dla metody 
wytrząsania kolby),  
— jako wewn ętrzne laboratoryjne sprawdzenie mo żliwych błędów doświadczal­
nych,  
— dla uzyskania oszacowanej P  ow w przypadkach, gdy z przyczyn technicznych 
metody do świadczalne nie mog ą być stosowane.  
METODA SZACOWANIA  
Wstępne oszacowanie wspó łczynnika podzia łu 
Wartość współczynnika podzia łu może być oszacowana, stosuj ąc rozpuszczal ­
ności badanej substancji w czystych rozpuszczalnikach:  
Do tego:  
P szacowanie ¼ nasycenie  nÄoktanol  
nasycenie  woda 
METODY OBLICZE Ń 
Zasada metod obliczeniowych  
Wszystkie metody obliczeniowe s ą oparte o formaln ą fragmentacj ę cząsteczki 
na odpowiednie podstruktury, dla których pewne przyrosty log P  ow są 
znane. Log P  ow całej cząsteczki jest nast ępnie obliczany jako suma warto ści, 
odpowiadaj ąc jej fragmentom plus suma sk ładników korekcji dla oddzia ływań 
wewnątrzcząsteczkowych.  
Wykaz sta łych fragmentów i sk ładników korekcji s ą dostępne w pozycjach 
bibliograficznych (b), (c), (d) i (e). Niektóre s ą regularnie aktualizowane (b).  
Kryteria jako ści 
Ogólnie, wiarygodno ść metod obliczeniowych obni ża się ze wzrostem z łożoności 
badanych zwi ązków. W przypadku prostych cz ąsteczek o niskiej masie cz ąstecz­
kowej i jednej lub dwu grupach funkcyjnych, mo żna oczekiwa ć odchylenia od 
0,1 do 0,3 jednostek log P  ow między wynikami ró żnych metod fragmentaryzacji 
i wartościami pomierzonymi. W przypadku bardziej z łożonych cz ąsteczek 
margines b łędu może być większy. Zale ży to od rzetelno ści i dostępności stałych 
fragmentu, jak równie ż zdolności rozpoznania oddzia ływań wewnątrzcząsteczko­
wych (np. wi ązania wodorowe) i poprawno ści użycia składników korekcji 
(oprócz problemów z oprogramowaniem komputerowym CLOGP-3) (b). 
W przypadku zwi ązków zjonizowanych wa żne jest właściwe rozwa żenie ładunku 
lub stopnia jonizacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Procedury oblicze ń 
π-Metoda Hanscha  
Oryginalna sta ła podstawienia hydrofobowego, wprowadzona przez Fujita 
i współpracowników (f) jest zdefiniowana jako:  
π x = log P  ow (PhX) – log P  ow (PhH)  
gdzie P  ow (PhX) jest wspó łczynnikiem podzia łu pochodnej aromatycznej, a P  ow 
(PhH) zwi ązku macierzystego  
(np. π Cl = log P  ow (C 6 H 5 Cl) – log P  ow (C 6 H 6 ) = 2,84 – 2,13 = 0,71).  
Zgodnie z t ą definicją π-metoda stosowana jest g łównie dla podstawienia aroma ­
tycznego. N-warto ści dla większej liczby podstawników zosta ło stabelaryzowane 
w pozycjach bibliograficznych (b), (c) i (d). S ą one stosowane dla oblicze ń log 
P ow cząsteczek aromatycznych lub podstruktur.  
Metoda Rekkera  
Zgodnie z Rekkerem (g) warto ść log P  ow jest obliczana, jak nast ępuje:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j (warunki oddzia ływania),  
gdzie f  i reprezentuje ró żne stałe fragmentów cz ąsteczki, natomiast a  i – częstotli­
wość ich wyst ępowania w badanej cz ąsteczce. Sk ładniki korekcji mog ą być 
wyrażone jako ca łkowita wielokrotno ść pojedynczej sta łej C  m (tak zwana „sta ła 
magiczna”). Sta łe fragmentu f  i , i C  m zostały ustalone z wykazu 1 054 do świad­
czalnych warto ści P  ow (825 zwi ązków) poprzez wielokrotn ą analizę regresyjn ą 
(c), (h). Ustalenie sk ładników oddzia ływań przeprowadzono zgodnie z zestawem 
zasad opisanych w pozycjach bibliograficznych (e), (h) i (i).  
Metoda Hansch-Leo  
Zgodnie z Hansch i Leo (c) warto ść log P  ow jest obliczana z:  
log P  ow ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
gdzie f  i przedstawia ró żne stałe fragmentu cz ąsteczkowego, F  j składniki korekcji 
oraz a  i , b  i odpowiadaj ące częstotliwości występowania. Wyprowadzony 
z doświadczalnych warto ści P  ow , wykaz atomowych i fragmentów grup warto ści 
oraz wykaz sk ładników korekcji F  j (tak zwanych „wspó łczynników”) zosta ły 
ustalone metod ą prób i b łędów. Składniki korekcji zosta ły uporządkowane 
w kilka ró żnych klas (a), (c). Wzi ęcie pod uwag ę wszystkich zasad 
i składników korekcji jest wzgl ędnie skomplikowane i zu żywające czas. Opra ­
cowano pakiet oprogramowania (b).  
Metoda po łączona  
Obliczenie log P  ow złożonych cząsteczek mo że być znacząco poprawione, je żeli 
cząsteczka zostanie rozci ęta w większe podstruktury, dla których godne zaufania 
wartości log P  ow są dostępne, albo z tabeli z pozycji bibliograficznych (b), (c), 
albo z w łasnych pomiarów. Takie fragmenty (np. heterocykle, antrachinon, 
azobenzen) mog ą być zatem po łączone z warto ściami π Hanscha lub ze sta łymi 
fragmentów Rekkera lub Leo.  
Uwagi:  
(i) metody obliczeniowe mog ą być stosowane tylko do cz ęściowo lub ca łko­
wicie zjonizowanych zwi ązków, gdzie mo żliwe jest branie pod uwag ę 
koniecznych wspó łczynników korekcji;  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
(ii) jeżeli można założyć wewnątrzcząsteczkowe wi ązania wodorowe, odpowia ­
dające składniki korekcji (od oko ło + 0,6 do + 1,0 log P  ow , jednostek) 
muszą być dodane (a). Wskazania obecno ści takich wi ązań można uzyska ć 
z przestrzennych modeli lub danych spektroskopowych cz ąsteczki;  
(iii) jeżeli jest mo żliwe wyst ępowanie kilku postaci tautomerycznych, podstaw ą 
do oblicze ń powinna by ć najbardziej prawdopodobna posta ć; 
(iv) należy starannie prowadzi ć weryfikacje wykazu sta łych dla fragmentów.  
Sprawozdanie  
Jeżeli stosuje si ę metody obliczenia/oceny, raport z bada ń powinien, o ile to 
możliwe, zawiera ć następujące informacje:  
— opis substancji (mieszanina, zanieczyszczenia itp.),  
— wskazanie wszystkich mo żliwych wewn ątrzcząsteczkowych wi ązań wodoro­
wych, dysocjacji, ładunkui wszystkich innych niezwyk łych oddzia ływań (np. 
tautomeria),  
— opis metody obliczenia,  
— identyfikacja lub zasób bazy danych,  
— cechy wyró żniające wyboru fragmentów,  
— pełna dokumentacja obliczenia.  
LITERATURA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in 
Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. -Chill. Ther. 1979, vol. 14, 
479. 
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, 5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS, American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Dodatek 2  
Zalecane substancje odniesienia dla metody HPLC  
Nr substancja odniesienia log P  ow pKa 
1 2-butanon 0,3 
2 4-acetylopirydyna 0,5 
3 anilina 0,9 
4 acetanilid 1,0 
5 alkohol benzylowy 1,1 6 p-metoksyfenol 1,3 pKa = 10,26 
7 kwas fenoksyoctowy 1,4 pKa = 3,12 
8 fenol 1,5 pKa = 9,92 
9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitryl 1,6 11 fenyloacetonitryl 1,6 
12 alkohol 4-metylobenzylowy 1,6 
13 acetofenon 1,7 
14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 kwas 3-nitrobenzoesowy 1,8 pKa = 3,47 16 4-chloroanilina 1,8 pKa = 4,15 
17 nitrobenzen 1,9 
18 alkohol cynamonowy 1,9 
19 kwas benzoesowy 1,9 pKa = 4,19 
20 p-krezol 1,9 pKa = 10,17 21 kwas cynamonowy 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 
22 anizol 2,1 
23 benzoesan metylu 2,1 
24 benzen 2,1 
25 kwas 3-metylobenzoesowy 2,4 pKa = 4,27 26 4-chlorofenol 2,4 pKa = 9,1 
27 trichloroetylen 2,4 
28 atrazyna 2,6 
29 benzoesan etylu 2,6 
30 2,6-dichlorobenzonitryl 2,6 31 kwas 3-chlorobenzoesowy 2,7 pKa = 3,82 
32 toluen 2,7 
33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dichloroanilina 2,8 
35 chlorobenzen 2,8 
36 allilofenyloeter 2,9 
37 bromobenzen 3,0
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Nr substancja odniesienia log P  ow pKa 
38 etylobenzen 3,2 
39 benzofenon 3,2 40 4-fenylofenol 3,2 pKa = 9,54 
41 tymol 3,3 42 1,4-dichlorobenzen 3,4 43 difenyloamina 3,4 pKa = 0,79 44 naftalen 3,6 45 benzoesan fenylu 3,6 
46 izopropylobenzen 3,7 
47 2,4,6-trichlorofenol 3,7 pKa = 6 48 bifenyl 4,0 49 benzoesan benzylu 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butylofenol 4,1 51 1,2,4-trichlorobenzen 4,2 52 kwas dodekanowy 4,2 53 difenyloeter 4,2 54 n-butylobenzen 4,5 55 fenantren 4,5 56 fluoranten 4,7 
57 dibenzyl 4,8 
58 2,6-difenylopirydyna 4,9 59 trifenyloamina 5,7 60 DDT 6,2 
Inne substancje odniesienia o niskim log P
 ow 
1 kwas nikotynowy - 0,07  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. TEMPERATURAZAP ŁONU  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Jest użyteczne posiadanie wst ępnych informacji na temat zapalno ści 
substancji przed przeprowadzeniem niniejszego badania. Procedura 
badania jest odpowiednia dla ciek łych substancji, które mog ą być 
zapalone źródłem zap łonu. Metody badania zamieszczone 
w niniejszym tek ście są godne zaufania tylko dla zakresów zap łonu, 
które są wyszczególnione w pojedynczych metodach.  
Przy wyborze stosowanej metody nale ży rozważyć możliwość 
chemicznych reakcji substancj ą a uchwytem próbki.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Temperatura zap łonu jest najni ższą temperatur ą, skorygowan ą do 
ciśnienia 101,325 kPa, w której ciecz wydziela pary, w warunkach 
określonych w metodzie badania, w takiej ilo ści, że wytwarzana jest 
mieszanina palna para/powietrze w naczyniu badawczym.  
Jednostki:  o C 
t = T – 273,15  
(t w  o C i T w  o K) 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
1.4. ZASADA METODY  
Substancja jest umieszczana w naczyniu badawczym i podgrzewana 
lub chłodzona to temperatury badania zgodnej z procedur ą opisaną 
w indywidualnej metodzie badania. Próby zap łonu są przeprowa ­
dzane w celu stwierdzenia, czy próbka zap łonie lub nie 
w temperaturze badania.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
1.5.1.  Powtarzalno ść 
Powtarzalno ść zmienia si ę zgodnie z zakresem temperatury zap łonu 
i zastosowanej metody badania; maksymalnie 2  o C. 
1.5.2.  Czu łość 
Czułość zależy od zastosowanej metody badania.  
1.5.3.  Specyficzno ść 
Specyficzno ść niektórych metod badania jest ograniczona do niektó ­
rych amplitud temperatury zap łonu i zale ży od cech samej substancji 
(np. wysoka lepko ść). ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Przygotowania  
Próbka badanej substancji jest umieszczana w przyrz ądzie badaw ­
czym zgodnie z 1.6.3.1 i/lub 1.6.3.2.  
Dla bezpiecze ństwa zalecane jest, by w metodzie u żywać próbki 
o małej liczności. Około 2 cm  3 stosuje si ę dla substancji wysokoe ­
nergetycznych lub toksycznych.  
1.6.2.  Warunki badania  
Przyrząd powinien, tak dalece jak jest to zgodne z bezpiecze ństwem, 
być umieszczony w pozycji wolnej od przeci ągów powietrza.  
1.6.3.  Przeprowadzenie badania  
1.6.3.1.  Metoda równowagi  
Zob. ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Metoda nierównowagi  
Przyrząd Abela:  
Zob. BS 2000 cz ęść 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Przyrząd Abel-Pensky:  
Zob. EN 57, DIN 51755 cz ęść 1 (dla temperatur od 5 do 65  o C), 
DIN 51755 cz ęść 2 (dla temperatur poni żej 5  o C), NF M07-036.  
Przyrząd Tag:  
Zob. ASTM D 56.  
Przyrząd Pensky-Martens:  
Zob. ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF 
M07-019.  
Uwagi:  
Jeżeli temperatura zap łonu, oznaczona metoda nierównowagi, 
według 1.6.3.2, wynosi 0 ± 2  o C, 21 ± 2  o C lub 55 ± 2  o C, należy 
je potwierdzi ć metodą równowagi, stosuj ąc ten sam przyrz ąd. 
Tylko te metody, które podaj ą temperatur ę jako temperatur ę zapłonu, 
stosuje si ę do zgłoszenia.  
Dla oznaczenia temperatury zap łonu lepkich cieczy (farby, gumy 
oraz podobne) zawieraj ących rozpuszczalniki mo żna używać tylko 
przyrządów i metod bada ń stosownych dla oznaczania temperatury 
zapłonu cieczy lepkich.  
Zob. ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 cz ęść 1. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. DAN  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— stwierdzenie zastosowania danej metody, jak równie ż 
o wszystkich mo żliwych odchyleniach,  
— wyniki i wszystkie dodatkowe uwagi dotycz ące interpretacji 
wyników.  
4. LITERATURA  
Brak.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  ZAPALNO ŚĆ (CIAŁA STAŁE) 
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Dla przeprowadzenia badania przydatne jest posiadanie wst ępnych 
informacji na temat ewentualnych w łaściwości wybuchowych 
substancji.  
Niniejsze badanie nale ży stosowa ć jedynie do substancji sproszko ­
wanych, ziarnistych i pastopodobnych.  
Aby nie uwzgl ędniać wszystkich substancji, które mo żna zapali ć, 
a tylko te, które pal ą się szybko lub te, których zachowanie si ę 
przy spalaniu jest z jakichkolwiek wzgl ędów szczególnie niebez ­
pieczne, jedynie substancje, których szybko ść spalania przekracza 
pewne warto ści graniczne, uwa ża się za wysoce łatwopalne.  
Jest szczególnie niebezpieczne, je żeli inkandescencja rozchodzi si ę 
poprzez proszek metalu, z powodu trudno ści z ugaszeniem ognia. 
Proszki metali nale ży uznać za wysoce łatwopalne, je żeli podtrzy ­
mują one rozszerzanie inkandescencji w masie w czasie okre ślonego 
czasu.  
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI  
Czas spalania jest wyra żony w sekundach.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie wyszczególniono.  
1.4. ZASADA METODY  
Substancja jest formowana w nieprzerwan ą wstęgę lub proszkow ą 
smugę o długości około 250 mm i przeprowadza si ę wstępne badanie 
klasyfikacyjne do okre ślenia, czy zachodzi zap łon przez p łomień 
gazu, rozprzestrzenianie przez przypalanie p łomieniem lub tlenie 
się. Jeżeli zachodzi rozprzestrzenianie ponad 200 mm 
w sformowanym materiale w obr ębie określonego czasu, przeprowa ­
dzany jest program pe łnego badania w celu okre ślenia szybko ści 
spalania.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Nie ustalono.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Wst ępne badanie klasyfikacyjne  
Substancja jest formowana w nieprzerwan ą wstęgę lub proszkow ą 
smugę o długości około 250 mm, 20 mm szeroko ści i 10 mm wyso ­
kości na niepalnej, nieporowatej p łycie bazowej o niskim przewod ­
nictwie ciep ła. Gorącym płomieniem palnika gazowego (minimalna 
średnica 5mm), dzia ła się na jeden z ko ńców smugi proszku do 
momentu zapalenia si ę proszku lub przez maksimum 2 minuty 
(5 minut dla proszków metali lub stopów metali). Nale ży zanotowa ć, 
czy spalanie rozchodzi wzd łuż 200 mm smugi w obr ębie czasu 
badania 4 minut (lub 40 minut dla proszków metali). Je żeli 
substancja nie zapala si ę i nie podtrzymuje spalania albo przez 
spalanie z p łomieniem lub z tleniem si ę wzdłuż 200 mm smugi 
proszku w obr ębie czasu 4 minut (lub 40 minut) czasu trwania 
badania, wtedy substancji nie uwa ża się za wysoce łatwopalną 
i dalsze badania nie s ą wymagane. Je żeli substancja podtrzymuje 
spalenie si ę smugi proszku d ługości 200 mm w czasie mniejszym 
od 4 minut, lub mniejszym od 40 minut dla proszków metali, nale ży 
przeprowadzi ć procedur ę niżej opisaną (ppkt 1.6.2. i nast ępne).  
1.6.2.  Badanie szybko ści spalania  
1.6.2.1.  Przygotowanie  
Sproszkowanymi lub ziarnistymi substancjami swobodnie nape łnia 
się formę długą na 250 mm, o trójk ątnym przekroju wewn ętrznej 
wysokości 10 mm i szeroko ści 20 mm. Z obu stron formy 
w kierunku wzd łużnym montuje si ę dwie metalowe p łyty 
z ograniczeniami poprzecznymi, które wystaj ą 2 mm poza górn ą 
krawędź obszaru przekroju trójk ątnego (rysunek). Form ę zrzuca si ę 
następnie trzykrotnie z wysoko ści 2 cm na tward ą powierzchni ę. 
W razie potrzeby nape łnia się wtedy form ę ponownie. Poprzeczne 
ograniczenia s ą następnie zdejmowane i zeskrobuje si ę nadmiar 
substancji. P łytę bazową, niepalną, nieporowat ą i o niskim przewod ­
nictwie cieplnym umieszcza si ę na górze formy, przyrz ąd odwraca 
się i zdejmuje form ę. 
Substancjami pastopodobnymi powleka si ę w postaci liny o d ługości 
250 mm i przekroju oko ło 1 cm  2 , niepalną, nieporowat ą i o niskim 
przewodnictwie cieplnym p łytę bazową. 
1.6.2.2.  Warunki badania  
W przypadku substancji wra żliwych na wilgo ć badanie nale ży prze­
prowadzić jak najszybciej po ich wyj ęciu z pojemnika.  
1.6.2.3.  Przeprowadzenie badania  
Ustawić stos w kierunku prostopad łym do ci ągu powietrza w szafie 
wyciągowej.  
Szybkość przepływu powietrza powinna by ć wystarczaj ąca do zapo ­
bieżenia przedostaniu si ę dymu do laboratorium i nie powinna by ć 
zmieniana w trakcie badania. Wokó ł przyrządu należy ustawić ekran 
chroniący przed ci ągiem powietrza.  
Stosuje si ę gorący płomień z palnika gazowego (minimalna średnica 
5 mm) do zapalenia z jednego ko ńca stosu. Gdy stos spali si ę na 
długości 80 mm, na nast ępnych 100 mm mierzy si ę szybkość spala­
nia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Badanie przeprowadza si ę sześć razy, używając za każdym razem 
czystej, ch łodnej płyty, niezale żnie od wcze śniej obserwowanego 
pozytywnego wyniku.  
2. DANE  
Istotne z punktu widzenia oceny s ą czas spalania z wst ępnego 
badania klasyfikacyjnego (1.6.1) i najkrótszy z sze ściu zbadanych 
(1.6.2.3) czas spalania.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— opis substancji badanej i jej stanu fizycznego, w tym zawarto ści 
wilgoci,  
— wyniki z wst ępnego badania klasyfikacyjnego i z badania szyb ­
kości spalania je śli przeprowadzono,  
— wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.  
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Sproszkowane, ziarniste lub pastopodobne substancje s ą uważane za 
wysoce łatwopalne, je żeli czas spalania w jakimkolwiek badaniu 
przeprowadzonym zgodnie z procedur ą opisaną w 1.6.2 jest mniejszy 
niż 45 sekund. Proszki metali lub stopów metali, uwa ża się za 
wysoce łatwopalne, je żeli zapalaj ą się i płomień lub strefa reakcji 
rozszerza si ę w całej próbce w czasie 10 minut lub mniejszym.  
4. LITERATURA  
NF T 20-042 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Dodatek  
Rysunek  
Forma i akcesoria do przygotowania stosu  
(wszystkie wymiary w milimetrach)
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  ZAPALNO ŚĆ (GAZY)  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Niniejsza metoda pozwala na oznaczenie, czy gazy zmieszane z 
powietrzem w temperaturze pokojowej (oko ło 20  o C) i pod ci śnie­
niem atmosferycznym s ą palne, a je śli tak, to w jakim zakresie 
stężeń. Mieszaniny badanego gazu z powietrzem we wzrastaj ącym 
stężeniu poddaje si ę działaniu iskry elektrycznej i obserwuje si ę, czy 
dochodzi do zap łonu. 
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI  
Zakres palno ści to zakres st ężenia między doln ą i górną granicą 
wybuchowo ści. Dolna i górna granica wybuchowo ści to granice 
stężenia palnego gazu zmieszanego z powietrzem, przy których nie 
dochodzi do propagacji p łomienia.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie wyszczególniono.  
1.4. ZASADA METODY  
Stężenie gazu w powietrzu zwi ększa się w kolejnych etapach, przy 
czym na ka żdym etapie mieszanin ę tę poddaje si ę działaniu iskry 
elektrycznej.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Nie ustalono.  
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Przyrz ąd 
Naczynie do badania to prosty cylinder szklany o minimalnej śred­
nicy wewn ętrznej wynosz ącej 50 mm i minimalnej wysoko ści 
300 mm. Elektrody zap łonowe są umieszczone w odleg łości 3 do 
5 mm od siebie, 60 mm ponad dnem cylindra. Cylinder jest wypo ­
sażony w otwór dekompresyjny. Przyrz ąd musi by ć osłonięty w taki 
sposób, aby ograniczy ć wszelkie szkody zwi ązane z ewentualnym 
wybuchem.  
Iskra o sta łej indukcji o czasie trwania 0,5 s, generowana 
z wysokonapi ęciowego transformatora o napi ęciu wyjściowym od 
10 do 15 kV (maksymalna moc zasilaj ąca 300 W), stosowana jest 
jako źródło zapłonu. Przyk ład odpowiedniego przyrz ądu opisano 
w pozycji bibliograficznej (2).  
1.6.2.  Warunki badania  
Badanie nale ży wykona ć w temperaturze pokojowej (oko ło 20  o C). ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Przeprowadzenie badania  
Przy użyciu pomp dozuj ących do szklanego cylindra wprowadza si ę 
znane stężenia gazu w powietrzu. Przez mieszanin ę przepuszcza si ę 
iskrę i obserwuje si ę, czy od źródła zapłonu oddzieli si ę płomień 
i czy będzie on ulega ć niezależnej propagacji. St ężenie gazu zmienia 
się etapowo o 1 % obj., a ż dojdzie do zap łonu w sposób opisany 
powyżej. 
Jeżeli budowa chemiczna gazu wskazuje, że może on być niepalny, 
a skład mieszaniny stechiometrycznej z powietrzem mo że być obli­
czony, nale ży zbadać tylko mieszaniny w zakresie 10 % poni żej 
składu stechiometrycznego oraz 10 % powy żej tego sk ładu, 
w krokach co 1 %.  
2. DANE  
Jedyną istotną informacj ą dla ustalenia omawianej w łaściwości jest 
informacja na temat propagacji p łomienia.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— opis zastosowanego przyrz ądu, z podaniem wymiarów,  
— temperatura, w której wykonano badanie,  
— stężenia badane i uzyskane wyniki,  
— wynik badania: gaz niepalny lub gaz wysoce łatwopalny,  
— jeżeli ustalono, że gaz jest niepalny, nale ży wtedy potwierdzi ć 
zakres stężenia, w którym badano go w odst ępach co 1 %,  
— należy przedstawi ć wszelkie informacje i uwagi istotne dla inter ­
pretacji wyników.  
4. LITERATURA  
(1) NF T 20-041 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W.Berthold, D.Conrad, T.Grewer, H.Grosse-Wortmann, T.Re ­
deker und H.Schacke. „Entwicklung einer Standard-Apparatur 
zur Messung von Explosionsgrenzen”. Chem.-Ing.-Tech. 1984, vol. 56, 2, 126-127.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  ZAPALNO ŚĆ (W KONTAKCIE Z WOD Ą) 
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Niniejszą metodę badania mo żna wykorzystywa ć do ustalenia, czy 
reakcja substancji z wod ą prowadzi do tworzenia si ę niebezpiecz ­
nych ilości gazu lub gazów, które mog ą być wysoce łatwopalne.  
Metodę badania mo żna stosowa ć w odniesieniu zarówno do cia ł 
stałych, jak i cieczy. Metoda ta nie ma zastosowania do substancji, 
które ulegaj ą spontanicznemu zap łonowi w kontakcie z powietrzem.  
1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI  
Wysoce łatwopalny: Substancje i preparaty, które, w kontakcie 
z wodą lub wilgotnym powietrzem, uwalniaj ą wysoce łatwopalne 
gazy w niebezpiecznych ilo ściach z minimaln ą szybkością 1 litr/kg 
na godzin ę. 
1.3. ZASADA METODY  
Substancj ę bada się w wieloetapowej sekwencji opisanej poni żej; 
gdy dojdzie do zap łonu na dowolnym z etapów, kontynuowanie 
badania nie jest potrzebne. Je żeli wiadomo, że substancja nie reaguje 
gwałtownie z wod ą, należy postępować zgodnie z etapem 4 (1.3.4).  
1.3.1.  Etap 1  
Substancj ę badaną umieszcza si ę w rynience z wod ą destylowan ą 
w temperaturze 20  o C i zapisuje si ę, czy uwolniony gaz zapali si ę, 
czy nie.  
1.3.2.  Etap 2  
Substancj ę badaną umieszcza si ę na bibule filtracyjnej p ływającej na 
powierzchni naczynia zawieraj ącego wod ę destylowan ą 
w temperaturze 20  o C, po czym zapisuje si ę, czy uwolniony gaz 
zapali się, czy nie. Rol ą bibuły filtracyjnej jest jedynie utrzymywanie 
substancji w jednym miejscu, tak aby zwi ększyć szanse na uzyskanie 
zapłonu. 
1.3.3.  Etap 3  
Z substancji badanej tworzy si ę stos o wysoko ści około 2 cm 
i średnicy 3 cm. Do stosu dodaje si ę kilka kropli wody i zapisuje 
się, czy dochodzi do zapalenia si ę uwolnionego gazu, czy nie.  
1.3.4.  Etap 4  
Substancj ę badaną miesza si ę z wodą destylowan ą w temperaturze 
20 o C, po czym mierzy si ę szybkość uwalniania gazu w czasie 
siedmiu godzin w odst ępach jednogodzinnych. Je żeli oznaczana 
szybkość uwalniania wykazuje niesystematyczne wahania lub 
wzrasta po siedmiu godzinach, czas pomiaru nale ży wydłużyć do 
maksimum pi ęciu dni. Badanie mo żna przerwa ć, gdy mierzona szyb ­
kość w dowolnym momencie przekroczy 1 litr/kg na godzin ę. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie wyszczególniono.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Nie ustalono.  
1.6. OPIS METOD  
1.6.1.  Etap 1  
1.6.1.1.  Warunki badania  
Badanie wykonywane jest w temperaturze pokojowej (oko ło 20  o C). 
1.6.1.2.  Wykonanie badania  
Niewielką ilość (o średnicy oko ło 2 mm) substancji badanej nale ży 
umieścić w rynience zawieraj ącej wodę destylowan ą. Należy zapisać, 
czy (i) uwalnia si ę jakikolwiek gaz oraz czy (ii) dochodzi do zapa ­
lenia się gazu. W przypadku gdy dochodzi do zapalenia si ę gazu, nie 
są potrzebne dalsze badania substancji, gdy ż substancj ę taką uważa 
się za niebezpieczn ą. 
1.6.2.  Etap 2  
1.6.2.1.  Przyrz ąd 
Na powierzchni wody destylowanej w dowolnym, w łaściwym naczy ­
niu, np. w parownicy o średnicy 100 mm, k ładzie się płasko bibu łę 
filtracyjną. 
1.6.2.2.  Warunki badania  
Badanie wykonywane jest w temperaturze pokojowej (oko ło 20  o C). 
1.6.2.3.  Przeprowadzenie badania  
Niewielką ilość substancji badanej (o średnicy oko ło 2 mm) 
umieszcza si ę na środku bibu ły filtracyjnej. Nale ży zapisać, czy (i) 
uwalnia si ę jakikolwiek gaz oraz czy (ii) dochodzi do zapalenia si ę 
gazu. W przypadku gdy dochodzi do zapalenia si ę gazu, nie s ą 
potrzebne dalsze badania substancji, gdy ż substancj ę taką uważa 
się za niebezpieczn ą. 
1.6.3.  Etap 3  
1.6.3.1.  Warunki badania  
Badanie wykonywane jest w temperaturze pokojowe (oko ło 20  o C). 
1.6.3.2.  Przeprowadzenie badania  
Z substancji badanej nale ży zrobić stos o wysoko ści około 2 cm 
i średnicy 3 cm, z wr ębem u góry. Do wg łębienia dodaje si ę kilka 
kropli wody i zapisuje si ę, czy: (i) uwalnia si ę jakikolwiek gaz oraz 
czy (ii) dochodzi do zapalenia si ę gazu. W przypadku gdy dochodzi 
do zapalenia si ę gazu, nie s ą potrzebne dalsze badania substancji, 
gdyż substancj ę taką uważa się za niebezpieczn ą. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Etap 4  
1.6.4.1.  Przyrz ąd 
Przyrząd jest ustawiony jak pokazano na rysunku.  
1.6.4.2.  Warunki badania  
Sprawdzi ć pojemnik substancji badanej na jakikolwiek proszek 
< 500 μm (wielko ść ziarna). Je żeli proszek tworzy wi ęcej niż 1 % 
wagowo ca łości lub jeżeli próbka jest krucha, wtedy ca łą substancj ę 
należy zmielić na proszek przed badaniem dla umo żliwienia zmniej ­
szenia wielko ści ziarna w czasie przechowywania i pos ługiwania si ę 
nią; w innych przypadkach bada si ę substancj ę taką, jak otrzymano. 
Badanie nale ży wykona ć w temperaturze pokojowej (oko ło 20  o C) 
i pod ciśnieniem atmosferycznym.  
1.6.4.3.  Przeprowadzenie badania  
Od 10 do 20 ml wody umieszcza si ę we wkraplaczu przyrz ądu, a 10 
g substancji umieszcza si ę w kolbie sto żkowej. Obj ętość uwalniaj ą­
cego się gazu mo żna zmierzy ć dowolną, właściwą metodą. Otwiera 
się kurek wkraplacza w celu wpuszczenia wody do kolby sto żkowej 
i uruchamia si ę stoper. Wydzielanie gazu mierzone jest co godzin ę 
w trakcie okresu siedmiu godzin. Je żeli w ciągu tego okresu czasu, 
wydzielanie gazu jest nierówne, lub pod koniec tego okresu, szyb ­
kość wydzielania gazu wzrasta, wtedy pomiary nale ży kontynuowa ć 
do pięciu dni. Je żeli w dowolnym momencie pomiaru szybko ść 
wydzielania gazu przekracza 1 litr/kg na godzin ę, należy przerwa ć 
badanie. Badanie nale ży przeprowadzi ć trzykrotnie.  
Jeżeli nie jest znana chemiczna to żsamość gazu, nale ży go podda ć 
analizie. Je żeli gaz zawiera wysoce łatwopalne sk ładniki i nie 
wiadomo, czy mieszanina jest wysoce łatwopalna, nale ży przygo ­
tować mieszanin ę o takim samym sk ładzie i podda ć badaniu przy 
użyciu metody A.11.  
2. DANE  
Substancja jest uwa żana za niebezpieczn ą, jeżeli: 
— samozap łon ma miejsce na ka żdy etapie procedury badania,  
lub 
— występuje wydzielanie gazu palnego o szybko ści większej niż 1 
litr/kg substancji na godzin ę. 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— szczegó ły każdego wstępnego przygotowania badanej substancji,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— wyniki bada ń (etapy 1, 2, 3 i 4),  
— tożsamość chemiczna wydzielanego gazu,  
— szybko ść wydzielania gazu, je żeli przeprowadzono etap 4 (1.6.4),  
— wszystkie dodatkowe uwagi stosowne do interpretacji wyników.  
4. LITERATURA  
(1) Recommendations on the transport of dangerous goods, test and 
criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the hydrolysis of solid and liquid products.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Dodatek  
Rysunek  
Przyrząd
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13.  WŁAŚCIWOŚCI PIROFORYCZNE CIA Ł STAŁYCH I CIECZY  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Procedura bada ń ma zastosowanie do sta łych lub ciek łych substancji, 
które w ma łych ilościach samorzutnie zapalaj ą się w krótkim czasie 
po wejściu z powietrzem w temperaturze pokojowej (oko ło 20  o C). 
Substancje, które wymagaj ą wystawienia na powietrze na okres 
godzin lub dni w temperaturze pokojowej lub w podwy ższonej 
temperaturze, zanim zajdzie zap łon nie są objęte niniejsz ą metodą 
badania.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Substancje uwa ża się za posiadaj ące właściwości piroforyczne, je żeli 
zapalają się lub ulegaj ą zwęglaniu zgodnie z warunkami opisanymi 
w 1.6.  
Samozapalno ść cieczy mo że wymaga ć również zbadania za pomoc ą 
metody A.15 Temperatura samozap łonu (ciecze i gazy).  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie wyszczególniono.  
1.4. ZASADA METODY  
Substancja, czy w postaci cia ła stałego czy cieczy, jest dodawana do 
obojętnego no śnika i poddawana kontaktowi z powietrzem 
w temperaturze otoczenia na okres pi ęciu minut. Je żeli substancje 
nie zapalaj ą się, absorbuje si ę je na bibule filtracyjnej i wystawia na 
powietrze w temperaturze otoczenia (oko ło 20  o C) na czas pi ęciu 
minut. Je żeli ciało stałe lub ciecz zapala si ę, lub ciecz zapala si ę lub 
zwęgla bibułę filtracyjn ą, wtedy substancj ę uważa się za pirofo ­
ryczną. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Powtarzalno ść: ze wzgl ędów istotnych dla bezpiecze ństwa poje ­
dynczy pozytywny wynik jest wystarczaj ący do uznania substancji 
za piroforyczn ą. 
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Przyrz ąd 
Tygiel porcelanowy o średnicy oko ło 10 cm nape łnia się ziemią 
okrzemkow ą do wysoko ści około 5 mm w temperaturze pokojowej.  
Uwaga:  
Ziemię okrzemkow ą lub dowoln ą inną porównywaln ą, obojętną 
substancję, która jest powszechnie dost ępna, bierze si ę jako repre ­
zentacyjn ą dla gleby, na któr ą badana substancja mo że się uwolnić 
w razie wypadku.  
Do badania cieczy, które nie zapalaj ą się w kontakcie z powietrzem, 
gdy poddaje si ę je kontaktowi z oboj ętnym nośnikiem, wymagana 
jest sucha bibu ła filtracyjna.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Przeprowadzenie badania  
a) Sproszkowane cia ła stałe 
Od 1 do 2 cm  3 badanej substancji w proszku sypie si ę z wysoko ści 
około 1 m na niepaln ą powierzchni ę i obserwuje si ę, czy substancja 
ta ulegnie zapaleniu podczas spadania lub w ci ągu pięciu minut od 
opadnięcia. 
Badanie przeprowadza si ę sześć razy, niezale żnie od wyst ąpienia 
zapalenia si ę. 
b) Ciecze  
Około 5 cm  3 badanej cieczy wlewa si ę do przygotowanego tygla 
porcelanowego i obserwuje si ę, czy substancja zapali si ę w ciągu 
pięciu minut.  
Jeżeli w sześciu badaniach nie nast ąpi zapłon, należy przeprowadzi ć 
następujące badania:  
0,5 ml badanej próbki za pomoc ą strzykawki przenosi si ę na wgnie ­
cioną bibułę filtracyjn ą i obserwuje si ę, czy nast ąpi zapalenie si ę lub 
zwęglenie bibu ły filtracyjnej w czasie pi ęciu minut po naniesieniu 
cieczy. Niezale żnie od tego, czy zachodzi zapalenie si ę lub zwęgle­
nie, badanie przeprowadza si ę trzy razy.  
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Wykonywania bada ń można zaprzesta ć, gdy tylko w jednym z nich 
uzyska si ę dodatni wynik.  
2.2. OCENA  
Jeżeli substancja zapala si ę w czasie pi ęciu minut od dodania oboj ęt­
nego nośnika i wystawienia na powietrze, lub ciek ła substancja 
zwęgla lub zapala bibu łę filtracyjn ą w czasie pi ęciu minut po nanie ­
sieniu i wystawieniu na powietrze, jest uwa żana za piroforyczn ą. 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— wyniki bada ń, 
— wszystkie dodatkowe uwagi dotycz ące interpretacji wyników.  
4. LITERATURA  
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  WŁAŚCIWOŚCI WYBUCHOWE  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Metoda dostarcza schematu badania do okre ślenia, czy cia ło stałe lub 
substancja pastopodobna przedstawia niebezpiecze ństwo wybuchu, 
gdy poddaje si ę ją działaniu płomienia (wra żliwość cieplna) lub 
uderzeniu lub tarciu (wra żliwość na bodźce mechaniczne), i czy 
ciekła substancja przedstawia niebezpiecze ństwo wybuchu, gdy 
podda się ją działaniu płomienia lub uderzeniu.  
Metoda sk łada się z trzech cz ęści: 
a) badanie wra żliwości cieplnej (1);  
b) badanie wra żliwości mechanicznej na uderzenia (1);  
c) badanie wra żliwości mechanicznej na tarcie (1).  
Metoda pozwala uzyska ć dane pozwalaj ące na ocen ę prawdopodo ­
bieństwa zainicjowania wybuchu przy pomocy niektórych 
powszechnie wyst ępujących bod źców. Metoda nie jest przeznaczona 
do stwierdzenia, czy substancja jest zdolna do wybuchu w ka żdych 
warunkach.  
Metoda jest w łaściwa do okre ślenia, czy substancja mo że przedsta ­
wiać niebezpiecze ństwo wybuchu (wra żliwość cieplna i mecha ­
niczna) w szczególnych warunkach okre ślonych w dyrektywie. Jest 
oparta o pewn ą ilość typów przyrz ądów, które s ą szeroko mi ędzy­
narodowo stosowane (1) i które zwykle daj ą w pełni znaczące 
wyniki. Uznane jest, że metoda nie jest ostateczna. Mo żna stosowa ć 
alternatywne przyrz ądy do tych celów, zapewniaj ąc że są znane 
międzynarodowo i wyniki mog ą być stosownie skorelowane z tymi 
z wymaganych przyrz ądów.  
Nie ma potrzeby przeprowadzania bada ń, gdy dost ępne są informacje 
termodynamiczne (np. ciep ło tworzenia, ciep ło rozkładu) i/lub 
nieobecne s ą pewne reaktywne grupy (2) we wzorze strukturalnym, 
ustanawiaj ące poza wszelkimi w ątpliwościami, że substancja jest 
niezdolna do gwa łtownego rozk ładu z wydzieleniem gazów lub 
uwolnieniem ciep ła (to jest, materia ł nie przedstawia żadnego ryzyka 
wybuchu). Badanie wra żliwości mechanicznej w odniesieniu do 
tarcia nie jest wymagane dla cieczy.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Materiały wybuchowe:  
Substancje, które wybuchaj ą pod dzia łaniem płomienia lub które s ą 
wrażliwe na uderzenie lub tarcie w wymaganych przyrz ądach (lub 
bardziej wra żliwe mechanicznie ni ż 1,3-dinitrobenzen w alterna ­
tywnym przyrz ądzie).  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
1,3-dinitrobenzen, techniczny, krystaliczny, przesiany przez sito 
0,5 mm, dla metod tarcia i uderzenia.  
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyna (RDX, heksogen, cyklonit-CAS 
121-82-4), rekrystalizowany z wodnego cykloheksanonu, przesie ­
wany na mokro przez sito 250 mikrometrów ( μm) i zatrzymywany 
na sicie 150 μm oraz suszony w 103 ± 2  o C (przez 4 godziny) do 
drugiej serii bada ń na tarcie i uderzenia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. ZASADA METODY  
Badania wst ępne są konieczne dla ustalenia bezpiecznych warunków 
przeprowadzenia trzech bada ń wrażliwości. 
1.4.1.  Badania bezpiecznego post ępowania z substancj ą (3) 
Ze względów bezpiecze ństwa, przed przeprowadzeniem g łównych 
badań, bardzo ma łe próbki (oko ło 10 mg) substancji s ą poddawane 
ogrzaniu bez zamkni ęcia w p łomieniu gazu, wstrz ąsowi 
w dogodnym przyrz ądzie i tarciu przez u życie młotka i kowad ła 
lub jakiejkolwiek maszyny ciernej. Celem jest stwierdzenie, czy 
substancja jest tak wra żliwa i wybuchowa, że przepisane badania 
wrażliwości, szczególnie wra żliwość cieplna, powinny by ć prowa­
dzone ze specjalnymi środkami bezpiecze ństwa, by zapobiec 
zranieniu operatora.  
1.4.2.  Wra żliwość cieplna  
Metoda obejmuje podgrzewanie substancji w stalowej rurze, 
zamkniętej kryzami z otworami o ró żnej średnicy, dla okre ślenia, 
czy substancja jest podatna na wybuch w warunkach intensywnego ogrzewania pod okre ślonym przykryciem.
 
1.4.3.  Wra żliwość mechaniczna (uderzenie)  
Metoda obejmuje poddawanie substancji uderzeniu spowodowanemu 
przez zrzucenie okre ślonej masy z okre ślonej wysoko ści. 
1.4.4.  Wra żliwość mechaniczna (tarcie)  
Metoda obejmuje poddawanie cia ła stałego lub substancji pastopo ­
dobnych tarciu mi ędzy znormalizowanymi powierzchniami 
w określonych warunkach obci ążenia i ruchu wzgl ędnego.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Nie ustalono.  
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Wra żliwość cieplna (dzia łanie płomienia)  
1.6.1.1.  Przyrz ąd 
Przyrząd składa się z nienadaj ącej się do ponownego zastosowania 
rury stalowej z zamkni ęciami wielokrotnego u żytku (rysunek 1), 
zainstalowanej w urz ądzeniu do podgrzewania i zabezpieczaj ącym. 
Każda rura jest wykonana z arkusza stali g łęboko tłoczonej (zob. 
dodatek) i posiada wewn ętrzną średnicę 24 mm, d ługość 75 mm 
i grubość ścianek 0,5 mm. Rury s ą kołnierzowane na otwartych 
końcach dla umo żliwienia ich zamkni ęcia przez zestaw p łyty kryzo ­
wej. Składa się on z odpornej na ci śnienie płyty kryzy, z centralnie 
położonym otworem, przykr ęconej mocno do rury za pomoc ą 
dwuczęściowych z łącz śrubowych (nakr ętka i gwintowany pier ścień). 
Nakrętka i gwintowany pier ścień są wykonane ze stali chromoman ­
ganowej (zob. dodatek), beziskrowej do temperatury 800  o C. Kryzy 
są grubości 6 mm, wykonane ze stali żaroodpornej (zob. dodatek), 
i są dostępne w zakresie ró żnych średnic otworów.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Warunki badania  
Zwykle substancje s ą badane tak jak je otrzymano, chocia ż 
w niektórych przypadkach, na przyk ład gdy s ą sprasowane, odle ­
wane lub w inny sposób skondensowane, mo że być konieczne 
badanie substancji po skruszeniu. Dla cia ł stałych masa materia łu 
użytego w ka żdym badaniu jest okre ślana w dwuetapowej proce ­
durze przebiegu próbnego. Wytarowana rura jest nape łniana 9 cm  3 
substancji i substancja jest ubijana si łą 80 N przy łożoną w poprzek 
całkowitego przekroju rury. Z powodów bezpiecze ństwa lub 
w przypadkach, gdzie posta ć fizyczna próbki zmienia si ę przez 
ściśnięcie, można użyć inną procedur ę napełniania; przyk ładowo, 
gdy substancja jest bardzo wra żliwa na tarcie, wtedy ubijanie nie 
jest odpowiednie. Je żeli materia ł jest ściśliwy, wtedy dodaje si ę go 
więcej i ubija do momentu wype łnienia rury do 55 mm od góry. 
Całkowita masa u żyta do wype łnienia rury do poziomu 55 mm jest 
określona i dodaje si ę następnie dwie dodatkowe porcje, ka żda 
ubijana z si łą 80 N. Nast ępnie materia ł jest albo dodawany 
z ubijaniem, albo wyjmowany, w zale żności od wymaga ń, celem 
pozostawienia rury wype łnionej do poziomu 15 mm od góry. Wyko ­
nuje się drugi przebieg próbny, rozpoczynaj ąc z ubitą ilością trzeciej 
masy ca łkowitej znalezionej w pierwszym etapie przebiegu 
próbnego. Do tych przyrostów dodaje si ę dwa więcej z ubijaniem 
o sile 80 N i poziomem substancji w rurze ustawionym na 15 mm od 
góry, poprzez dodawanie lub ujmowanie materia łu zgodnie 
z wymaganiem. Ilo ść ciała stałego ustalona w drugim etapie prze ­
biegu próbnego jest stosowana do ka żdej próby. Nape łnianie prze ­
prowadzono w trzech równych ilo ściach, każdej ściśniętej do 9 cm  3 
z konieczn ą siłą (można to upro ścić przez zastosowanie pier ścieni 
dystansowych).  
Ciecze i żele są ładowane do rury na wysoko ść 60 mm, zwracaj ąc 
szczególn ą uwagę na żele, by zapobiec tworzeniu si ę pustych prze ­
strzeni. Gwintowany pier ścień jest wsuwany w rur ę od dołu, 
umieszcza si ę stosowną płytę kryzową i dokręca nakrętkę po nasma ­
rowaniu ma łą ilością smaru na bazie disiarczku molibdenu. Jest 
podstawow ą 
zasadą sprawdzenie, czy nie uwi ęziono substancji mi ędzy kołnierzem 
i płytą, lub w gwincie.  
Podgrzewanie jest prowadzone za pomoc ą propanu pobieranego 
z butli przemys łowej, wyposa żonej w zawór regulacyjny ci śnienia 
(60 do 70 mbar), poprzez miernik i równomiernie rozprowadzany 
(co wskazuje wizualna obserwacja p łomieni z palników) poprzez 
dysze do czterech palników. Palniki s ą umieszczone dooko ła komory 
badawczej, jak pokazano na rysunku 1. Cztery palniki posiadaj ą 
łączne zużycie około 3,2 litra propanu na minut ę. Można zastosowa ć 
alternatywne gazy palne i palniki, ale szybko ść ogrzewania musi by ć 
jak wyspecyfikowano na rysunku 3. Dla wszystkich przyrz ądów 
szybkość ogrzewania musi by ć okresowo sprawdzana u żywając 
rury wype łnione ftalanem dibutylu, jak wskazano na rysunku 3.  
1.6.1.3.  Przeprowadzenie badania  
Każde badanie jest przeprowadzane do momentu albo rozerwania 
rury, albo ogrzania w czasie pi ęciu minut. Badanie, wynikiem 
którego jest fragmentacja rury na trzy lub wi ęcej części, które 
w niektórych przypadkach mog ą być połączone jedna do drugiej 
wąskimi tasiemkami metalu jak pokazano na rysunku 2, ocenia si ę 
jako dające wybuch. Badanie wynikiem którego jest mniej frag ­
mentów lub wcale, jest uwa żane jako niedaj ące wybuchu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Wpierw wykonuje si ę serie trzech bada ń z płytą kryzową o średnicy 
6,0 mm, je śli nie uzyska si ę wybuchów, przeprowadza si ę drugą 
serię trzech bada ń z płyta kryzow ą o średnicy 2,0 mm. Je żeli 
wybuch zachodzi w jednej z dwóch serii bada ń, niewymagane s ą 
następne badania.  
1.6.1.4.  Ocena  
Wynik badania jest uwa żany za pozytywny, je żeli wybuch zachodzi 
w jednej z dwóch powy ższych serii bada ń. 
1.6.2.  Wra żliwość mechaniczna (uderzenie)  
1.6.2.1.  Przyrz ąd (rysunek 4)  
Podstawowe cz ęści przyrz ądu spadowego m łota są wykonane 
z bloku ze staliwa z podstaw ą, kowadła, kolumny, prowadnic, bija ­
ków, mechanizmu zwalniaj ącego i uchwytu próbki. Kowad ło stalowe 
100 mm ( średnica) × 70 mm (wysoko ść) jest przykr ęcone do góry 
bloku stalowego 230 mm (d ługość) × 250 mm (szeroko ść) × 
200 mm (wysoko ść) z podstaw ą staliwną 450 mm (d ługość) × 
450 mm (szeroko ść) × 60 mm (wysoko ść). Kolumna wykonana 
z bezszwowej ci ągnionej rury stalowej, jest zabezpieczona 
w uchwycie przykr ęconym do tylnej ściany bloku stalowego. Cztery 
śruby mocuj ą przyrząd do stałego betonowego bloku 60 × 60 × 
60 cm w taki sposób, że szyny prowadnicy s ą całkowicie pionowe 
i bijak opada swobodnie. Stosownymi do u życia są bijaki 5 oraz 
10 kg, wykonane z stali uspokojonej. G łowica uderzeniowa ka żdego 
bijaka jest z utwardzonej stali HRC 60 do 63, i posiada minimaln ą 
średnicę 25 mm.  
Próbka podlegaj ąca badaniu jest zawarta w przyrz ądzie uderze ­
niowym sk ładającym się z dwóch wspó łosiowych cylindrów ze 
stali uspokojonej, jeden powy żej drugiego, w wydr ążonym stalowym 
pierścieniu prowadz ącym. Cylindry ze stali uspokojonej powinny 
posiadać średnicę 10 (- 0,003, - 0,005) mm i wysoko ść 10 mm 
oraz posiada ć polerowane powierzchnie, zaokr ąglone kraw ędzie 
(promień krzywizny 0,5 mm) i twardo ść HRC 58 do 65. Dr ążony 
cylinder musi posiada ć zewnętrzną średnicę 16 mm, polerowany 
otwór wiertniczy 10 (+ 0,005, + 0,010) mm i wysoko ść 13 mm. 
Przyrząd uderzeniowy jest wyposa żony w po średnie kowad ło (śred­
nica 26 mm i 26 mm wysoko ść) wykonane ze stali i centrowane 
pierścieniem z otworami, pozwalaj ącymi na ucieczk ę dymów.  
1.6.2.2.  Warunki badania  
Objętość próbki powinna wynosi ć 40 mm  3 lub objętość właściwą dla 
dowolnego alternatywnego przyrz ądu. Stałe substancje powinny by ć 
badane w stanie suchym i przygotowywane, jak nast ępuje:  
a) sproszkowane substancje nale ży przesia ć (wielkość oczek sita: 
0,5 mm); do badania wykorzystuje si ę całą ilość substancji, 
która przesz ła przez sito;  
b) sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane 
substancje s ą kruszone w ma łe kawałki i przesiewane; przesiane 
frakcje średnicy od 0,5 do 1 mm s ą używane do badania i musz ą 
być reprezentatywne dla substancji oryginalnej.  
Substancje zwykle dostarczane jako pasty, powinny by ć badane 
w stanie suchym, tam gdzie to mo żliwe, lub w ka żdym razie, po 
usunięciu maksymalnie mo żliwej ilo ści rozpuszczalnika. Ciek łe 
substancje s ą badane ze szczelin ą 1mm mi ędzy dolnym i górnym 
stalowym cylindrem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Przeprowadzenie bada ń 
Przeprowadza si ę serie sze ściu bada ń, spuszczaj ąc masę 10 kg 
z wysoko ści 0,40 m (40 J). Je żeli w trakcie sze ściu badań przy 40 
J uzyska si ę wybuch, nale ży wykona ć serię dalszych sze ściu badań, 
spuszczaj ąc masę 5 kg z 0,15 m (7,5 J). W innym przyrz ądzie 
próbka jest porównywana z wybran ą substancj ą odniesienia, stosuj ąc 
ustaloną procedur ę (np. technik ę w górę-w dół itd.).  
1.6.2.4.  Ocena  
Wynik badania uwa ża się za pozytywny, je żeli zachodzi wybuch 
(zapalenie si ę gwałtownym p łomieniem jest równowa żne wybuchowi 
i przedstawiane w sprawozdaniu) przynajmniej raz we wszystkich badaniach z okre ślonym przyrz ądem uderzeniowym lub próbka jest 
bardziej wra żliwa niż 1,3-dinitrobenzen lub RDX w alternatywnym 
badaniu na uderzenie.
 
1.6.3.  Wra żliwość mechaniczna (tarcie)  
1.6.3.1.  Przyrz ąd (rysunek 5)  
Przyrząd do tarcia sk łada się z płyty bazowej staliwnej, na której 
zamocowany jest przyrz ąd tarcia. Sk łada się on z umocowanych 
porcelanowych pr ętów i ruchomej porcelanowej p łyty. Płyta porcela ­
nowa jest umieszczona w wózku poruszaj ącym się w dwóch prowad ­
nicach. Wózek jest do łączony do silnika elektrycznego poprzez 
korbowód, krzywk ę mimośrodową i odpowiedni ą przekładnię, tak 
że porcelanowa p łyta przesuwa si ę tylko raz, w ty ł i naprzód poni żej 
porcelanowego pr ęta w odleg łości 10 mm. Pr ęt porcelanowy mo że 
być obciążony przyk ładowo 120 lub 360 N.  
Płaska porcelanowa p łyta jest wykonana z porcelany technicznej 
(chropowato ść 9 do 32 μm) i posiada wymiary 25 mm (d ługość) × 
25 mm (szeroko ść) × 5 mm (wysoko ść). Cylindryczny pr ęt porcela­
nowy jest równie ż wykonany z bia łej technicznej porcelany i ma 
długość 15 mm, średnicę 10 mm oraz schropowacon ą końcową 
powierzchni ę sferyczn ą o promieniu krzywizny 10 mm.  
1.6.3.2.  Warunki badania  
Objętość próbki powinna wynosi ć 10 mm3 lub obj ętość odpowiedni ą 
dla każdego przyrz ądu alternatywnego.  
Stałe substancje powinny by ć badane w stanie suchym 
i przygotowywane jak nast ępuje:  
a) sproszkowane substancje nale ży przesia ć (wielkość oczek sita: 
0,5 mm); do badania wykorzystuje si ę całą ilość substancji, 
która przesz ła przez sito;  
b) sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane 
substancje s ą kruszone w ma łe kawałki i przesiewane; do bada ń 
używane są przesiane frakcje średnicy mniejszej od 0,5 mm.  
Substancje zwykle dostarczane jako pasty powinny by ć badane 
w stanie suchym, tam gdzie to mo żliwe. Jeżeli substancja nie 
może być przygotowana w stanie suchym, pasta (po usuni ęciu 
maksymalnie mo żliwej ilo ści rozpuszczalnika) jest badana jako 
warstwa 0,5 mm grubo ści, 2 mm szeroko ści, 10 mm d ługości, przy­
gotowana przy u życiu szablonu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Przeprowadzenie bada ń 
Pręt porcelanowy jest po łożony na badan ą próbkę i obciążany. 
Podczas przeprowadzania badania ślady gąbki na p łytce porcela ­
nowej musz ą być położone poprzecznie w stosunku do kierunku 
ruchu. Nale ży uważać, aby pręt spoczywa ł na próbce, aby wystar ­
czająco dużo materia łu badanego znajdowa ło się pod prętem i aby 
płytka porusza ła się prawidłowo pod pr ętem. Dla substancji 
w postaci past do nanoszenia substancji na p łytę stosuje si ę szablon 
o grubości 0,5 mm ze szczelin ą 2 × 10 mm. Porcelanowa p łyta 
przesuwa si ę o 10 mm wprzód i do ty łu pod porcelanowym pr ętem 
w czasie 0,44 sekundy. Ka żda część powierzchni p łyty i pręta 
używana jest tylko raz; dwa ko ńce każdego pręta służą dla dwóch 
prób, a dwie powierzchnie p łyty służą każda do trzech prób.  
Serię sześciu badań przeprowadza si ę z obciążeniem 360 N. Je żeli 
uzyskuje si ę pozytywne zdarzenie w czasie trwania tych sze ściu 
badań, następną serię sześciu badań należy wykona ć z obciążeniem 
120 N. W innych przyrz ądach, próbka jest porównywana z wybran ą 
substancją odniesienia, stosuj ąc ustaloną procedur ę (np. technik ę „w 
górę-w dół” itp.).  
1.6.3.4.  Ocena  
Wynik badania jest uwa żany za pozytywny, je żeli zaszed ł wybuch 
(zapalenie si ę gwałtownym p łomieniem jest równowa żne wybuchowi 
i przedstawiane w sprawozdaniu) przynajmniej raz w jakimkolwiek 
z badań przy użyciu wyspecyfikowanego przyrz ądu do tarcia lub 
odpowiada kryteriom równowa żności w alternatywnym badaniu 
przez tarcie.  
2. DANE  
W zasadzie, w sensie dyrektywy, substancja jest uwa żana za przed ­
stawiając niebezpiecze ństwo wybuchu, je żeli uzyskano pozytywny 
wynik w badaniach wra żliwości na ciep ło, uderzenie i tarcie.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— tożsamość, skład, czysto ść, zawarto ść wilgoci itd., badanej 
substancji,  
— postać fizyczna próbki i czy lub nie by ła kruszona, rozdrabniana 
i/lub przesiewana,  
— obserwacje z czasu trwania bada ń wrażliwości cieplnej (np. masa 
próbki, ilo ść fragmentów itp.),  
— obserwacje z czasu trwania bada ń wrażliwości mechanicznej (np. 
tworzenie znacznych ilo ści dymu lub ca łkowity rozk ład bez deto ­
nacji, płomienie, iskry, detonacja, gwa łtowne zapalenie itp.),  
— wyniki ka żdego rodzaju badania,  
— w przypadku gdy wykorzystano alternatywny przyrz ąd, należy 
podać uzasadnienie naukowe oraz dowody na korelacj ę między 
wynikami uzyskanymi przy pomocy podanego przyrz ądu 
i przyrządu równowa żnego,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— wszelkie u żyteczne uwagi, takie jak odniesienie do bada ń 
produktów podobnych, które mog ą być istotne dla prawid łowej 
interpretacji wyników.  
— wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.  
3.2. INTERPRETACJA I OCENA WYNIKÓW  
W sprawozdaniu z bada ń należy podać wszelkie wyniki uznane za 
fałszywe, stanowi ące anomali ę lub niereprezentatywne. W przypadku 
gdyby którykolwiek z wyników powinien zosta ć odrzucony, nale ży 
podać wszelkie alternatywne lub dodatkowe badania. Pomimo wyt łu­
maczenia anomalnych wyników musz ą być zaakceptowane ich 
wartość nominalne i zastosowane do zgodnej z nimi klasyfikacji 
substancji.  
4. LITERATURA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, 6-13 and 30-42.  
(4) NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial 
use –Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Dodatek  
Przykłady specyfikacji materia łowych do badania wra żliwości cieplnej (zob. 
DIN 1623)  
(1) Tube: Material specification No 1.0336.505 g  
(2) Orifice plate: Material specification No 1.4873  
(3) Threaded collar and nut: Material specification No 1.3817  
Rysunek 1  
Przyrząd badawczy do wra żliwości cieplnej  
(wszystkie wymiary w mm)
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Rysunek 2  
Badanie wra żliwości cieplnej  
(przykłady fragmentacji)
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Rysunek 3  
Kalibracja szybko ści podgrzewania dla badania wra żliwości cieplnej
  
Krzywa temperatura/czas uzyskana przy podgrzewaniu ftalanu dibutylu (27 cm  3 ) w zamkni ętej 
rurze (1,5 mm p łyta kryzowa) przy u życiu szybko ści przeprywu propanu 3,2 litra/min. Tempe ­
raturę pomierzono termoogniwem chromel/alumel w os łonie ze stali nierdzewnej średnicy 
l mm, umieszczonego centrycznie 43 mm poni żej obrzeża rury. Szybko ść grzania mi ędzy 
135  o C i 285  o C powinna wynosi ć między 185 i 215 K/min.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Rysunek 4  
Przyrząd do badania wra żliwości na uderzenie  
(wszystkie wymiary w mm)
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Rysunek 4  
Ciąg dalszy
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Rysunek 5  
Przyrząd do badania wra żliwości na tarcie
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  TEMPERATURA SAMOZAP ŁONU (CIECZE I GAZY)  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Badaniu temu nale ży poddać substancje wybuchowe i substancje 
ulegające samoistnemu zapaleniu w kontakcie z powietrzem 
w temperaturze otoczenia. Procedura badania nadaje si ę do stoso ­
wania dla gazów, cieczy i par, które w obecno ści powietrza mog ą 
zapalić się od gorącej powierzchni.  
Temperatura samozap łonu może ulec znacznemu zmniejszeniu 
w obecno ści zanieczyszcze ń katalitycznych, przez powierzchni ę 
materiału lub większą objętość naczynia do badania.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Stopień samozapalno ści jest wyra żony w warunkach temperatury 
samozapłonu. Temperatura ta to najni ższa temperatura, w której 
badana substancja zapali si ę po zmieszaniu jej z powietrzem 
w warunkach podanych w opisie metody badania.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Substancje odniesienia zacytowano w normach (zob. 1.6.3). Powinny 
one służyć głównie do sprawdzenia od czasu do czasu zdolno ści 
metody i umo żliwiać porównanie z wynikami uzyskanymi innymi 
metodami.  
1.4. ZASADA METODY  
Metoda wyznacza minimaln ą temperatur ę powierzchni wewn ętrznej 
obudowy, która powoduje zapalenie si ę gazu, pary lub cieczy 
wtryśniętej do obudowy.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Powtarzalno ść zmienia si ę w zależności zakresu temperatur samoza ­
płonu i zastosowanej metody badania.  
Czułość i specyficzno ść zależą od zastosowanej metody badania.  
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Przyrz ąd 
Przyrząd jest opisany w metodzie podanej w 1.6.3.  
1.6.2.  Warunki badania  
Badanie próbki substancji badanej przeprowadza si ę zgodnie 
z metodą określoną w 1.6.3.  
1.6.3.  Przeprowadzenie badania  
Zob. IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, 
NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. DANE  
Zapisać temperatur ę badania, ci śnienie atmosferyczne, ilo ść wyko­
rzystanej próbki, odst ęp czasowy do uzyskania zap łonu. 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— precyzyjna specyfikacja substancji (to żsamość i zanieczyszcze ­
nia), 
— ilość użytej próbki, ci śnienie atmosferyczne,  
— zastosowany przyrz ąd, 
— wyniki pomiarów (temperatury badania, wyniki dotycz ące 
zapłonu, odpowiednie opó źnienia),  
— wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.  
4. LITERATURA  
Brak.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  WZGL ĘDNA TEMPERATURA SAMOZAP ŁONU DLA 
CIAŁSTAŁYCH  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Badaniu temu nie nale ży poddawa ć substancji wybuchowych 
i substancji ulegaj ących samoistnemu zapaleniu w kontakcie z 
powietrzem w temperaturze otoczenia.  
Celem niniejszego badania jest przedstawienie wst ępnych informacji 
na temat samozap łonu substancji sta łych w podwy ższonych tempe ­
raturach.  
W przypadku gdy temperatura powsta ła albo w reakcji substancji 
z tlenem lub podczas rozk ładu egzotermicznego nie zostaje wystar ­
czająco szybko utracona do otoczenia, dochodzi do samopodgrzania, 
co z kolei prowadzi do samozap łonu. Do samozap łonu dochodzi 
więc wtedy, gdy szybko ść wytwarzania ciep ła przekracza szybko ść 
jego utraty.  
Procedura badania jest przydatna jako wst ępne badanie klasyfika ­
cyjne substancji sta łych. Ze wzgl ędu na złożony charakter zap łonu 
i spalania si ę ciał stałych temperatura samozap łonu ustalona przy 
użyciu tej metody badania powinna by ć wykorzystywana wy łącznie 
do celów porównawczych.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Temperatura samozap łonu uzyskana przy u życiu tej metody to mini ­
malna temperatura otoczenia wyra żona w  o C, w której pewna obj ę­
tość substancji b ędzie ulega ć zapaleniu w okre ślonych warunkach.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY  
Pewna ilo ść substancji do bada ń jest umieszczana w piecu 
w temperaturze pokojowej; krzywa temperatura/czas wi ążąca 
warunki w środku próbki jest rejestrowana do momentu, gdy tempe ­
ratura pieca wzro śnie do 400  o C, lub do temperatury topnienia, je śli 
jest niższa, z szybko ścią 0,5  o C/min. Do celu niniejszego badania, 
temperatura pieca w której temperatura próbki osi ągnie 400  o C przez 
samopodgrzanie jest zwana temperatur ą samozap łonu. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Brak.  
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Przyrz ąd 
1.6.1.1.  Piec  
Piec laboratoryjny (o obj ętości około 2 litrów) z programatorem 
temperatury wyposa żony w obieg naturalnego powietrza i zawór 
przeciwwybuchowy. W celu zapobie żenia ewentualnemu ryzyku 
wybuchu wszystkie gazy pochodz ące z rozk ładu nie mog ą wejść 
w kontakt z elementami ogrzewania elektrycznego.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Kostka z siatki drucianej  
Kawałek drucianej siatki stalowej o otworach oczek 0,045 mm 
należy wyciąć zgodnie z szablonem przedstawionym na rysunku 
1. Siatkę składa się i zabezpiecza drutem u góry otwartego kubka.  
1.6.1.3.  Termoogniwa  
Odpowiednie termoogniwa.  
1.6.1.4.  Rejestrator  
Dowolny rejestrator dwukana łowy, wykalibrowany od 0 do 600  o C 
lub o odpowiednim napi ęciu. 
1.6.2.  Warunki badania  
Substancje s ą badane w stanie otrzymanym.  
1.6.3.  Przeprowadzenie badania  
Kostkę napełnia się badaną substancj ą i łagodnie uklepuje, dodaj ąc 
substancję, aż kostka b ędzie całkowicie wype łniona. Nast ępnie 
próbkę zawiesza si ę pośrodku pieca w temperaturze pokojowej. 
Jedno termoogniwo umieszcza si ę pośrodku kostki, a drugie mi ędzy 
kostką i ścianą pieca w celu zapisywania temperatury w piecu.  
Prowadzi si ę ciągły zapis temperatury pieca i próbki podczas 
podwyższania temperatury pieca do 400  o C lub do temperatury 
topnienia substancji sta łej, jeżeli ta ostatnia jest ni ższa, 
z szybkością 0,5  o C/min.  
Gdy substancja si ę zapali, termoogniwo w próbce poka że bardzo 
ostry wzrost temperatury powy żej temperatury w piecu.  
2. DANE  
Temperatura pieca przy której temperatura próbki osi ąga 400  o C 
przez samopodgrzanie jest stosowana do oblicze ń (zob. rysunek 2).  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— opis badanej substancji,  
— wyniki pomiarów, w łącznie z krzyw ą zależności temperatura/ ­
czas,  
— wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.  
4. BIBLIOGRAFIA  
NF T 20-036 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Rysunek 1  
Szablon kostki do bada ń 20 mm
  
Rysunek 2  
Typowa krzywa zale żności temperatura/czas
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJ ĄCE (CIA ŁA STAŁE) 
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Do przeprowadzenia badania przydatne jest posiadanie wst ępnych 
informacji na temat ewentualnych w łaściwości wybuchowych 
substancji.  
Niniejsze badanie nie jest przeznaczone dla cieczy, gazów, substancji 
wysoce łatwopalnych i wybuchowych lub nadtlenków organicznych.  
Niniejsze badanie nie musi by ć prowadzone, gdy analiza wzoru 
strukturalnego chemicznego ustala ponad wszelkie w ątpliwości, że 
substancja jest niezdolna do egzotermicznego reagowania 
z materia łem palnym.  
W celu upewnienia si ę, czy badanie nie powinno by ć przeprowa ­
dzone z zastosowaniem szczególnych środków ostro żności, należy 
wykonać badanie wst ępne. 
1.2. DEFINICJAI JEDNOSTKI  
Czas spalania: czas reakcji, w sekundach, jaki zabiera strefie reak ­
cyjnej przej ście wzdłuż stosu, zgodnie z procedur ą określoną w 1.6.  
Szybkość spalania: wyra żana w milimetrach na sekund ę. 
Maksymalna szybko ść spalania: najwi ększe warto ści szybko ści 
spalania uzyskane w przypadku mieszanin zawieraj ących od 10 do 
90 % wagowych utleniacza.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Azotan baru (czysto ści analitycznej) jest u żywany jako substancja 
odniesienia w próbie w łaściwej i w badaniu wst ępnym.  
Mieszanin ą odniesienia jest ta mieszanina azotanu baru ze sproszko ­
waną celulozą, przygotowana zgodnie z ppkt 1.6, która charaktery ­
zuje się maksymaln ą szybkością spalania (zazwyczaj mieszanina 
z 60 % azotanem baru wagowo).  
1.4. ZASADA METODY  
Dla zachowania bezpiecze ństwa przeprowadza si ę badanie wst ępne. 
Nie wymaga si ę prowadzenia dalszych bada ń, gdy wst ępne badanie 
wyraźnie wskazuje, że badana substancja posiada w łaściwości utle­
niające. Jeżeli to nie jest ten przypadek, substancja musi by ć przed­
miotem pe łnego badania.  
W pełnym badaniu substancj ę badaną i określoną substancj ę palną 
należy mieszać z różną szybkością. Z każdej mieszaniny formuje si ę 
następnie stos, który jest zapalany z jednej strony. Maksymaln ą 
ustaloną szybkość spalania porównuje si ę z maksymaln ą szybkością 
spalania mieszaniny odniesienia.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
W razie potrzeby mo żna zastosowa ć dowolną metodę mielenia 
i mieszania, o ile ró żnica maksymalnej szybko ści spalania 
w sześciu oddzielnych badaniach b ędzie odbiega ć od warto ści śred­
niej arytmetycznej o nie wi ęcej niż 10 %.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Przygotowanie  
1.6.1.1.  Substancja badana  
Zmniejszy ć wielkość ziarna badanej próbki do wielko ści ziarna 
< 0,125 mm, stosuj ąc następującą procedur ę: przesia ć badaną 
substancję, rozdrobni ć pozostałą frakcję, powtarza ć procedur ę do 
momentu, gdy ca ła porcja do bada ń przejdzie przez sito.  
Można zastosowa ć dowolną metodę mielenia lub przesiewania spe ł­
niającą kryteria jako ściowe.  
Przed przygotowaniem mieszaniny substancj ę suszy si ę 
w temperaturze 105  o C, do uzyskania sta łej masy. W przypadku 
rozkładu badanej substancji w temperaturze poni żej 105  o C 
substancję tę należy wysuszy ć w odpowiedniej, ni ższej temperaturze.  
1.6.1.2.  Substancja palna  
Jako substancj ę palną wykorzystuje si ę sproszkowan ą celulozę. Celu­
loza powinna by ć rodzaju stosowanego w chromatografii cienkowar ­
stwowej lub chromatografii kolumnowej. Odpowiednim spraw ­
dzonym typem jest celuloza z wi ęcej niż 80 % w łókien o d ługości 
między 0,020 i 0,075 mm. Proszek celulozy jest przesiewany przez 
sito o wymiarze oczka 0,125 mm. Poprzez ca łe badanie stosuje si ę tę 
samą partię celulozy.  
Przed przygotowaniem mieszaniny sproszkowana celuloza jest 
suszona w 105  o C do chwili uzyskania sta łej masy.  
Jeżeli w badaniu wst ępnym stosowana jest m ączka drzewna, nale ży 
przygotowa ć mączkę drzewną z miękkiego drewna, poprzez zebranie 
porcji, która przechodzi oczko siatki 1,6 mm, energicznie wymie ­
szać, a następnie suszy ć w 105  o C przez cztery w warstwie nie 
grubszej ni ż 25 mm. Och łodzić i przechowywa ć w hermetycznym 
pojemniku, w pe łni wypełnionym jak to praktycznie wymagane, 
najlepiej w obr ębie czasu 24 godzin od wysuszenia.  
1.6.1.3.  Źródło zapłonu 
Jako źródła zapłonu nale ży użyć gorącego płomienia gazowego 
palnika ( średnicy minimum 5 mm). Je żeli stosuje si ę inne źródło 
zapłonu (np. przy badaniu w atmosferze oboj ętnej), nale ży przed­
stawić w sprawozdaniu opis i uzasadnienie.  
1.6.2.  Przeprowadzenie badania  
Uwaga:  
Mieszaniny utleniaczy z celuloz ą lub mączką drzewną muszą być 
traktowane jako potencjalnie wybuchowe i nale ży obchodzi ć się 
z nimi z nale żytą ostrożnością. 
1.6.2.1.  Badanie wst ępne 
Wysuszona substancja jest wymieszana z wysuszon ą celulozą lub 
mączką drzewną w proporcjach 2 cz ęści substancji badanej na 1 
część celulozy lub m ączki drzewnej wagowo, po czym 
z mieszaniny kszta łtuje się mały, stożkowaty stos o wymiarach 
3,5 cm (średnica podstawy) × 2,5 cm (wysoko ść) przez nape łnienie, 
bez ubijania, sto żkowatej formy (np. szklanego lejka laboratoryjnego 
z zatkaną szyjką). ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Stos umieszcza si ę na chłodnej, niepalnej, nieporowatej p łycie 
bazowej o niskim przewodnictwie cieplnym. Badanie nale ży prze­
prowadzić w szafie wyci ągowej, tak jak opisano w 1.6.2.2.  
Źródło zapłonu wchodzi w kontakt ze sto żkiem. Nale ży zaobser ­
wować i zapisać intensywno ść i czas trwania ostatecznej reakcji.  
Substancja jest uwa żana za utleniaj ącą, jeżeli reakcja zachodzi gwa ł­
townie.  
W każdym przypadku, gdy wynik mo żna podda ć w wątpliwość, 
konieczne jest przeprowadzenie pe łnej serii bada ń opisanych powy ­ 
żej. 
1.6.2.2.  Badanie impulsowe  
Przygotowa ć kolejne porcje mieszaniny utleniacza/celulozy zawie ­
rające od 10 do 90 % wagowych cz ęści utleniacza w odst ępach co 
10 %. Dla granicznych przypadków nale ży użyć mieszanin po śred­
nich utleniacz/celuloza, dla uzyskania maksymalnej szybko ści 
spalania bardziej precyzyjnie.  
Należy uformowa ć stos przy pomocy formy. Forma jest wykonana 
z metalu, ma d ługość 250 mm i trójk ątny przekrój, przy czym jej 
wewnętrzna wysoko ść wynosi 10 mm, a wewn ętrzna szeroko ść – 
20 mm. Po obu stronach formy w kierunku wzd łużnym montuje 
się dwie blaszki jako ograniczenia poprzeczne wystaj ące na 2 mm 
poza górn ą krawędź trójkątnego przekroju (rysunek). Niniejszy uk ład 
jest luźno napełniany lekkim nadmiarem mieszaniny. Po jedno ­
krotnym upuszczeniu formy z wysoko ści 2 cm na tward ą 
powierzchni ę pozostały nadmiar substancji nale ży zeskroba ć przy 
pomocy sko śnie ustawionego arkusza. Nast ępnie ograniczenia 
poprzeczne nale ży usunąć i wygładzić pozosta ły proszek przy 
pomocy wa łka. Następnie na górze formy umieszcza si ę niepalną, 
nieporowat ą o niskim przewodnictwie cieplnym, p łytę bazową, 
odwraca przyrz ąd i zdejmuje form ę. 
Ustawić stos w kierunku prostopad łym do ci ągu powietrza w szafie 
wyciągowej.  
Szybkość przepływu powietrza powinna by ć wystarczaj ąca do zapo ­
bieżenia przedostaniu si ę dymu do laboratorium i nie powinna by ć 
zmieniana w trakcie badania. Wokó ł przyrządu należy ustawić ekran 
chroniący przed ci ągiem powietrza.  
Ze względu na higroskopijno ść celulozy i badanych substancji, 
badanie nale ży przeprowadzi ć jak najszybciej.  
Zapalić jeden z ko ńców stosu przez dotkni ęcie płomieniem.  
Zmierzyć czas reakcji na odleg łości 200 mm po tym, jak strefa 
reakcji rozprzestrzeni si ę z początkowej odleg łości 30 mm.  
Badanie przeprowadza si ę z substancj ą odniesienia i przynajmniej 
raz dla ka żdego z zakresów mieszanin badanej substancji z celuloz ą. 
Jeżeli maksymalna szybko ść spalania okazuje si ę być znacząco 
większa niż ta z mieszaniny odniesienia, badanie nale ży wstrzyma ć; 
poza tym badanie musi by ć powtarzane pi ęć razy dla ka żdej z trzech 
mieszanin daj ących najwi ększą szybkość spalania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
Jeżeli wynik podejrzewany jest o nieprawdziwie pozytywny, nale ży 
powtórzy ć badanie, stosuj ąc obojętną substancj ę o podobnej wiel ­
kości ziarna, tak ą jak diatomit w miejsce celulozy. Alternatywnie 
mieszanina badana substancja/celuloza o najwi ększej szybko ści 
spalania powinna by ć ponownie zbadana w oboj ętnej atmosferze 
(< 2 % wagowych zawarto ści tlenu).  
2. DANE  
Ze względów bezpiecze ństwa maksymalna szybko ść spalania – nie 
jej wartość średnia – musi by ć uważana za charakterystyczn ą właści­
wością utleniającą substancji badanej.  
Istotne znaczenie dla oceny ma najwy ższa warto ść szybkości 
spalania w serii sze ściu badań danej mieszaniny.  
Sporządzić wykres najwy ższej warto ści szybko ści spalania dla 
każdej mieszaniny w zale żności od stężenia utleniacza. Z wykresu 
należy wziąć maksymaln ą szybkość spalania.  
Sześć zmierzonych warto ści szybko ści spalania w obr ębie serii uzys ­
kanej z mieszanin ą z maksymaln ą szybkością spalania nie mo że 
odbiegać od warto ści średniej arytmetycznej o wi ęcej niż 10 %; 
w innym przypadku nale ży poprawi ć metody mielenia i mieszania.  
Należy porówna ć maksymaln ą uzyskan ą szybko ść spalania 
z maksymaln ą szybkością spalania mieszaniny odniesienia (zob. 1.3).  
Jeżeli badania przeprowadzono w oboj ętnej atmosferze, maksymaln ą 
szybkość reakcji porównuje si ę z tą z mieszaniny odniesienia 
w atmosferze oboj ętnej. 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— tożsamość, skład, czysto ść, zawarto ść wilgoci i tym podobne 
dane badanej substancji,  
— wszelkie procesy przetwarzania, którym by ła poddawana próbka 
badana (np. mielenie, suszenie itp.),  
— źródło zapłonu używane w badaniach,  
— wyniki pomiarów,  
— sposób zachodzenia reakcji (np. b łyskawiczne spalanie na 
powierzchni, spalanie w ca łej masie, wszelkie informacje 
dotyczące produktów spalania itp.),  
— wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników, 
włącznie z opisem intensywno ści reakcji (p łomienie, iskry, 
dymy, powolne tlenie si ę itp.) oraz przybli żony czas trwania 
uzyskany we wst ępnym badaniu ze wzgl ędów bezpiecze ństwa/­
klasyfikacyjnym w przypadku zarówno substancji badanej, jak i substancji odniesienia,
 
— wyniki bada ń substancji oboj ętnej, jeśli stosowano,  
— wyniki z bada ń w obojętnej atmosferze, je śli stosowano.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETACJA WYNIKU  
Substancja jest uwa żana za substancj ę utleniającą, gdy:  
a) we wst ępnym badaniu zachodzi gwa łtowna reakcja;  
b) w pełnym badaniu maksymalna szybko ść spalania badanych 
mieszanin jest wy ższa lub równa maksymalnej szybko ści spalania 
mieszaniny odniesienia z celulozy i azotanu baru.  
W celu zapobie żenia wynikom nieprawdziwie pozytywnym wyniki 
uzyskane przy badaniu substancji zmieszanej z materia łem 
obojętnym i/lub przy badaniu w atmosferze oboj ętnej musz ą być 
także rozważone przy interpretacji wyników.  
4. LITERATURA  
NF T 20-035 (September 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Dodatek  
Rysunek  
Forma i akcesoria do przygotowania stosu  
(wszystkie wymiary w milimetrach)
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  ŚREDNIA LICZBOWA MASA CZ ĄSTECZKOWA I ROZK ŁAD 
MASY CZ ĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW  
1. METODA  
Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC) jest 
powtórzeniem OECD TG 118 (1996). Podstawowe zasady i dalsze 
informacje techniczne s ą podane w pozycji bibliograficznej (1).  
1.1. WPROWADZENIE  
Skoro w łaściwości polimerów s ą tak zró żnicowane, nie istnieje 
możliwość opisania jednej metody ustalaj ącej dokładnie warunki 
rozdzielania i oceny, która obejmuje wszystkie ewentualno ści 
i specyficzne przypadki wyst ępujące przy rozdzielaniu polimerów. 
W szczególno ści złożone systemy polimerów nie ulegaj ą często 
chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Je śli GPC nie jest prak ­
tykowana, masa cz ąsteczkowa mo że być oznaczona za pomoc ą 
innych metod (zob. za łącznik). W takich przypadkach powinny 
zostać podane pe łne dane szczegó łowe i uzasadnienia dla wykorzys ­
tanych metod.  
Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegó łowe 
informacje o tym, w jaki sposób maj ą być przeprowadzane do świad­
czenia oraz w jaki sposób ocenia ć dane, mo żna znaleźć w powyższej 
normie DIN. W przypadku gdy niezb ędne są modyfikacje warunków 
doświadczalnych, zmiany te musz ą być uzasadnione. Inne normy 
mogą być używane jedynie, gdy istniej ą do nich pe łne odniesienia. 
Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidys ­
persyjności do kalibracji i mo że istnieć konieczno ść zmodyfikowania 
jej, aby by ła odpowiednia dla niektórych polimerów, np. rozpusz ­
czalnych w wodzie oraz polimerów o d ługich rozga łęzionych łańcu­
chach.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Średnia liczbowo masa cz ąsteczkowa M  n i średnia wagowo masa 
cząsteczkowa M  w są oznaczane, wykorzystuj ąc następujące równa ­
nia: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
gdzie:  
H i jest poziomem sygna łu detektora z linii podstawowej dla obj ętości 
retencji V  i , 
M i jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy obj ętości 
retencji V  i , oraz  
n jest liczb ą punktów pomiarowych.  
Rozpiętość rozkładu masy cz ąsteczkowej, która jest miar ą stopnia 
dyspersji systemu, jest podana na podstawie stosunku M  w /M n . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
GPC jest metod ą względną i w związku z tym musi zosta ć podjęta 
kalibracja. Zwykle do tego celu jest wykorzystywany polistyren w niewielkim stopniu rozproszony, o liniowej budowie, posiadaj ący 
średnie masy cz ąsteczkowe M
 n i M  w oraz znany rozk ład masy 
cząsteczkowej. Krzywa kalibracji mo że być wykorzystywana 
w oznaczaniu masy cz ąsteczkowej nieznanej próbki wy łącznie, jeżeli 
warunki rozdzielenia próbki oraz wzorce zosta ły wybrane 
w identyczny sposób.  
Określony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji 
jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach, w których prze ­
prowadzane jest konkretne do świadczenie. Warunki obejmuj ą przede 
wszystkim temperatur ę, rozpuszczalnik (lub mieszanin ę rozpuszczal ­
ników), warunki chromatografii oraz kolumn ę rozdzielaj ącą lub 
systemy kolumn.  
Masy cząsteczkowe próbki oznaczone w ten sposób s ą odpowied ­
nimi warto ściami oraz s ą opisane jako „ci ężar równowa żnikowy 
polistyrenu”. Oznacza to, że w zale żności od strukturalnych 
i chemicznych ró żnic między próbk ą a wzorcami masy cz ąsteczkowe 
mogą odchylać się od warto ści absolutnych/ca łkowitych w wi ększym 
lub mniejszym stopniu. Je żeli wykorzystywane s ą inne wzorce, np. 
glikolu polietylenowego, tlenku polietylenu, metaakrylanu polime ­
tylu, kwasu poliakrylowego, nale ży podać odpowiednie przyczyny.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zarówno rozk ład masy cz ąsteczkowej próbki jak i średnie masy 
cząsteczkowe (M  n, M w ) mogą być oznaczane, wykorzystuj ąc 
GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, 
w której próbka jest rozdzielana wed ług hydrodynamicznych obj ę­
tości pojedynczych sk ładników (2).  
Rozdzielenie nast ępuje, kiedy próbka przechodzi przez kolumn ę, 
która jest wype łniona porowatym materia łem – zazwyczaj orga ­
nicznym żelem. Ma łe cząsteczki mog ą wnikać w pory, podczas 
gdy duże cząsteczki są wykluczane. Droga du żych cząsteczek jest 
z tego wzgl ędu krótsza i to one s ą poddane procesowi elucji 
w pierwszej kolejno ści. Średnich rozmiarów cz ąsteczki wnikaj ą 
w niektóre pory i s ą później poddawane elucji. Najmniejsze 
cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym ni ż 
pory żelu, mogą wnikać we wszystkie pory. Poddawane s ą elucji na 
końcu. 
W sytuacji idealnej rozdzielanie jest kontrolowane wy łącznie przez 
wielkość czasteczki gatunku, ale w praktyce trudno jest unikn ąć co 
najmniej niewielkich zak łócających efektów absorbcyjnych. 
Nierówne wype łnienia kolumny oraz obj ętości martwe mog ą pogor­
szyć sytuację (2). 
Detekcji dokonuje si ę przez np. wspó łczynnik za łamania światła lub 
pochłaniania promieni UV i daje w wyniku nieskomplikowan ą 
krzywą rozkładu. Jednak że w celu przypisania rzeczywistych 
wartości masy cz ąsteczkowej do krzywej niezb ędne jest poddanie 
kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie 
cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, 
np. różnych wzorców polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstaj ąca 
zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest ma łymi „ogonami” 
skierowanymi w stron ę małych mas cz ąsteczkowych, o ś pionowa 
wskazuje jako ść w masie ró żnych wyeluowanych odmian polisty ­
renu, a o ś pozioma wskazuje logarytm z masy cz ąsteczkowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Powtarzalno ść (względne odchylenie standardowe: RSD) obj ętości 
eluowania powinna by ć lepsza ni ż 0,3 %. Wymagana powtarzalno ść 
analizy musi by ć zapewniona przez korekt ę dokonywan ą poprzez 
wzorce wewn ętrzne, je żeli chromatogram jest uzyskiwany 
w zależności od czasu i nie odpowiada wy żej wspomnianym kryte ­
riom (1). Polidyspersyjno ści są zależne od mas cz ąsteczkowych 
wzorców. W przypadku wzorców polistyrenowych typowe warto ści 
to: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku)  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.6.1.  Przygotowanie roztworów wzorcowych polistyrenu  
Wzorce polistyrenu s ą rozpuszczane przez ostro żne mieszanie 
w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy musz ą być uwzględnione 
w trakcie przygotowania roztworu.  
Stężenia wybranych wzorców s ą zależne od wielu czynników, np. od 
objętości wstrzykiwanej substancji, lepko ści roztworu oraz czu łości 
detektora analitycznego. Maksymalna obj ętość injekcji musi by ć 
dostosowana do d ługości kolumny, w celu unikni ęcia przeładowania. 
Typowe obj ętości injekcji dla analitycznego rozdzielenia przy u życiu 
GPC z kolumn ą o wymiarach 30 cm × 7,8 mm wynosz ą na ogół 
40–100 μl. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekra ­
czać 250 μl. Optymalny stosunek mi ędzy objętością injekcji 
a stężeniem musi by ć określony przed rzeczywist ą kalibracj ą 
kolumny.  
1.6.2.  Przygotowywanie roztworu próbki  
Zasadniczo te same wymagania stosuje si ę do przygotowywania 
roztworów próbek. Próbka jest rozpuszczana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrz ąsa­
nie. W żadnym okoliczno ściach nie powinno si ę rozpuszcza ć próbki 
w wannie ultrad źwiękowej. W razie konieczno ści próbka roztworu 
jest oczyszczana poprzez membranowy filtr posiadaj ący pory 
o wymiarach mi ędzy 0,2 a 2 μ m.
 
Obecność nierozpuszczalnych cz ąstek musi by ć zapisana 
w sprawozdaniu ko ńcowym, poniewa ż może to być odpowiednie 
dla próbek o du żej masie cz ąsteczkowej. Powinna zosta ć wykorzys ­
tana odpowiednia metoda w celu okre ślenia udzia łu procentowego 
w masie rozpuszczonych cz ąstek. Roztwór powinien zosta ć wyko­
rzystany w ci ągu 24 godzin.  
1.6.3.  Aparatura:  
— zbiornik na rozpuszczalnik,  
— odgazowywacz (w danym przypadku),  
— pompa,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— nawilżacz pulsowy (w danym przypadku),  
— system wtryskowy,  
— kolumny chromatograficzne,  
— detektor,  
— przepływomierz (w danym przypadku),  
— urządzenie rejestruj ące dane,  
— naczynie na odpady.  
Należy zapewni ć, że system GPC jest oboj ętny w odniesieniu do 
stosowanych rozpuszczalników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF).
 
1.6.4.  System wtryskowy i system dostarczaj ący rozpuszczalnik  
Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie 
albo wykorzystuj ąc automatyczny próbnik, albo r ęcznie w ściśle 
określonej strefie. Zbyt szybkie wycofywanie lub zni żanie tłoka 
nurnikowego, je śli jest wykonywane r ęcznie, mo że spowodowa ć 
zmiany w obserwowanym rozk ładzie masy cz ąsteczkowej. System 
dostarczaj ący rozpuszczalnik, na ile jest to mo żliwe, powinien by ć 
wolny od pulsacji, co mo żna osiągnąć przez wbudowanie do niego 
tłumika pulsacji. Szybko ść przepływu wynosi 1 ml/min.  
1.6.5.  Kolumna  
W zależności od próbki w łaściwości polimeru oznacza si ę albo za 
pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn po łączonych 
w sekwencj ę. Pewna ilo ść materia łów porowatych kolumn 
o określonych w łaściwościach dost ępna jest w ogólnej sprzeda ży 
(np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielaj ącego 
lub długość kolumny jest uzale żniona zarówno od w łaściwości 
próbki (obj ętości hydrodynamiczne, rozk ład masy cz ąsteczkowej), 
jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpusz ­
czalnik, temperatura i pr ędkość przepływu (1) (2) (3).  
1.6.6.  Pó łki teoretyczne  
Kolumna lub po łączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania 
musi być scharakteryzowana przez ilo ść półek teoretycznych. Obej ­
muje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnikia eluencyjnego, 
umieszczenie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich 
niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolumnie o znanej długości. Liczba pó łek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie 
następującego równania: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
lub N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 
2 
gdzie:  
N = jest liczb ą półek teoretycznych,  
V e = jest obj ętością eluecyjn ą w maksimum piku,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = jest podstawow ą szerokością piku,  
W 1/2 = jest szeroko ścią piku w po łowie wysoko ści. 
1.6.7.  Wydajno ść rozdzielania  
Oprócz liczby pó łek teoretycznych, która jest okre ślającą ilościowo 
szerokością pasma, wa żną rolę odgrywa tak że wydajno ść rozdziele ­
nia, będąca określana przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. 
Wydajność rozdzielania kolumny jest uzyskiwana z nast ępującego 
stosunku:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
pole przekroju poprezecznego kolumny ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
gdzie:  
V e, Mx = jest obj ętością elucyjn ą dla polistyrenu o masie 
cząsteczkowej M  x , 
V e,(10.Mx)  = jest obj ętością elucyjną dla polistyrenu o 10-krotnie 
większej masie cz ąsteczkowej M  x . 
Rozkład systemu jest zwykle okre ślany w nast ępujący sposób:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
Gdzie:  
V e1 , V e2 = są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polisty ­
renowych w maksimum piku,  
W 1 , W  2 = są szerokościami piku linii podstawowej,  
M 1 , M  2 = są masami cz ąsteczkowymi w maksimum piku 
(powinny ró żnić się współczynnikiem o 10).  
Wartość R dla systemu kolumn powinna by ć większa niż 1, 7 (4).  
1.6.8.  Rozpuszczalniki  
Wszystkie rozpuszczalniki musz ą posiadać wysoką czystość (dla 
THF używana jest czysto ść 99,5 %). Zbiornik na rozpuszczalnik 
(o ile jest to konieczne – w atmosferze gazu oboj ętnego) musi by ć 
odpowiednio du ży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. 
Rozpuszczalnik musi by ć odgazowany zanim zostanie przeniesiony 
do kolumny za pomoc ą pompy.  
1.6.9.  Kontrola temperatury  
Temperatura krytycznych komponentów wewn ętrznych (p ętla wtry­
skowa, kolumny, detektor i przewody) powinna by ć stała i zgodna 
z wyborem rozpuszczalnika.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detektor  
Zadaniem detektora jest rejestracja ilo ściowa st ężenia próbki 
eluowanej z kolumny. W celu unikni ęcia niepotrzebnego posze ­
rzenia pików, obj ętość kuwety komórki detektora musi by ć tak 
mała, jak to tylko jest mo żliwe. Nie powinna by ć większa niż 
10 μl, z wyj ątkiem detektorów mierz ących światło rozproszone 
oraz lepko ść. W celu detekcji zazwyczaj u żywana jest refrak ­
tometria ró żnicowa. Jednak że jeżeli wymagaj ą tego w łaściwości 
próbki lub w łaściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mog ą być 
używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory 
lepkości itd.  
2. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDA Ń 
2.1. DANE  
Powinno nast ąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania 
szczegółowych kryteriów oceny, jak równie ż do wymogów odnosz ­ 
ących się do zbierania i przetwarzania danych.  
Dla każdej próbki musz ą zostać przeprowadzone dwa niezale żne 
doświadczenia. Próbki musz ą być analizowane pojedynczo.  
Dla każdego pomiaru musz ą być zapewnione M  n , M  w , M  w /M n , M  p. . 
Niezbędne jest wyra źne wskazanie, że zmierzone warto ści są 
wartościami wzgl ędnymi, równowa żnymi masom cz ąsteczkowym 
użytych wzorców.  
Po określeniu obj ętości retencji lub czasów retencji (mo żliwie 
poprawionych, wykorzystuj ąc wzorzec wewn ętrzny) warto ści 
logarytmu M  p (M p będącego maksymaln ą wartością piku 
wzorca kalibracji) s ą wykreślane w oparciu o jedn ą z tych 
wielkości. Niezb ędne są co najmniej dwa punkty kalibracji 
na dekad ę masy cz ąsteczkowej oraz wymagane jest co 
najmniej pi ęć punktów pomiarowych dla ca łkowitej krzywej, 
która powinna obejmowa ć oszacowan ą masę cząsteczkową 
próbki. Niska warto ść punktu ko ńcowego masy cz ąsteczkowej 
krzywej wzorcowania jest oznaczana za pomoc ą n-heksyloben ­
zenu lub innego odpowiedniego niepolarnego roztworu. Średnia liczbowo i średnia wagowo masa cz ąsteczkowa s ą 
zwykle okre ślane za pomoc ą przetwarzania danych elektronicz ­
nych, w oparciu o wzory z sekcji 1.2. W przypadku gdy 
używana jest r ęczna digitalizacji, mo żna powo łać się na 
ASTMD 3536-91 (3).
 
Krzywa rozk ładu musi by ć dostarczona w formie tabeli lub 
ilustracji (ró żnicowa cz ęstotliwość lub procent sumy 
w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cz ąsteczkowej powinna mie ć normalnie oko ło 
4 cm szeroko ści, a maksymalna warto ść szczytowa oko ło 
8 cm wysoko ści. W przypadku krzywych ca łkowego rozk ładu 
różnica w rz ędnych mi ędzy 0 a 100 % powinna wynosi ć 
około 10 cm.
 
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
2.2.1.  Substancja badana:  
— dostępne informacje dotycz ące substancji badanej (to żsamość, 
dodatki, zanieczyszczenia),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy.  
2.2.2.  Oprzyrz ądowanie:  
— zbiornik z eluentem, oboj ętny gaz, odgazowywanie eluenta, sk ład 
eluenta, zanieczyszczenia,  
— pompa, pulsowy t łumik, system wtryskowy,  
— kolumny rozdzielaj ące (wytwórca, wszystkie informacje 
dotyczące właściwościach kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj 
rozdzielaj ącego materia łu itd., liczba, d ługość oraz kolejno ść 
użytych kolumn),  
— liczba teoretycznych pó łek kolumny (lub po łączonych kolumn), 
wydajność rozdzielania, (rozdzielczo ść tego systemu),  
— informacja dotycz ąca symetrii pików,  
— temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperatur ą, 
— detektor (zasada pomiarów, rodzaj, obj ętość kuwety),  
— przepływomierz w przypadkach, kiedy jest u żywany (wytwórca, 
zasada pomiarów),  
— system umo żliwiający rejestracj ę i przetwarzanie danych (osprz ęt 
i oprogramowanie).  
2.2.3.  Kalibracja systemu:  
— szczegó łowy opis metody u żywanej w celu skonstruowania 
krzywej kalibracji,  
— informacja dotycz ąca kryteriów jako ściowych dla tej metody (np. 
współczynnik korelacji, b łąd sumy kwadratów itd.),  
— informacje dotycz ące ekstrapolacji, za łożenia i przybli żenia, 
poczynione w trakcie procedury do świadczalnej oraz szacowania 
i przetwarzania danych,  
— wszystkie pomiary przeprowadzone w celu konstrukcji krzywej 
kalibracji powinny by ć udokumentowane w tabelach, które 
zawierają następujące informacje dla ka żdego z punktów kalibra ­
cji: 
— nazwa próbki,  
— wytwórca próbki,  
— warto ści charakterystyczne wzorców: M  p , M  n , M  w oraz 
M w /M n , dostarczone przez wytwórc ę lub na podstawie odpo ­
wiednich pomiarów, razem ze szczegó łami dotycz ącymi 
metody oznaczania,  
— objętość oraz stężenie wstrzykiwanej próbki,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— warto ść M p używana dla kalibracji,  
— objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony 
przy maksimach piku,  
— M  p obliczone przy maksimum piku,  
— błąd procentowy wyliczonej M  p oraz warto ść kalibracyjna.  
2.2.4.  Ocena:  
— ocena na podstawie czasu: wszystkie metody maj ące na celu 
zapewnienie wymaganej odtwarzalno ści (metoda poprawiania, 
wzorce wewn ętrzne itd.)  
— informacja dotycz ąca tego, czy ocena zosta ła przeprowadzona na 
podstawie obj ętości eluencyjnej lub czasu retencji,  
— informacja dotycz ąca ogranicze ń oceny, je żeli pik nie zosta ł 
poddany analizie w ca łości, 
— opis metod wyg ładzających, jeżeli są wykorzystywane,  
— procedury przygotowawcze oraz wst ępnego przetworzenia 
próbki,  
— obecno ść nierozpuszczalnych cz ąstek, jeżeli istniej ą, 
— objętość wtrysku ( μl) oraz st ężenie wtrysku (mg/ml),  
— uwagi wskazuj ące skutki, które prowadz ą do odchyle ń od ideal­
nego profilu GPC,  
— szczegó łowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych,  
— szczegó ły dotyczące zakresów b łędów,  
— wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do 
interpretacji wyników.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tertrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.  
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and MolecularWeight Distribution of Polysty ­
rene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Dodatek  
Przykłady innych metod okre ślania średniej liczbowo masy cz ąsteczkowej 
(M n ) w odniesieniu do polimerów  
Chromatografia żelowo-permeacyjna (GPC) jest preferowan ą metodą określania 
M n , w szczególno ści kiedy dost ępny jest zestaw wzorców, których struktura jest 
porównywalna ze struktur ą polimerów. Jednak że, w przypadku gdy istniej ą trud­
ności praktyczne w wykorzystywaniu GPC lub ju ż istnieje przypuszczenie, że 
substancja nie b ędzie podlega ła kryterium reguluj ącym M  n (a które wymaga 
potwierdzenia), dost ępne są metody alternatywne, takie jak:  
1. Wykorzystywanie w łasności koligatywnych  
1.1. Ebuliometria/kriometria:  
obejmuje pomiar podwy ższenia temperatury wrzenia (ebuliometria) 
lub spadku temperatury zamarzania (kriometria) rozpuszczalnika, 
kiedy dodany zostaje polimer. Metoda oparta jest na fakcie, że 
skutek rozpuszczonego polimeru na temperatur ę wrzenia/zamarzania 
płynu zależy od masy cz ąsteczkowej polimeru (1) (2).  
Zastosowanie: M  n < 20 000.  
1.2. Zmniejszanie ci śnienia pary:  
obejmuje pomiar ci śnienia pary wybranego p łynu odniesienia przed 
i po dodaniu znanych ilo ści polimeru (1) (2).  
Zastosowanie: M  n < 20 000 (teoretycznie; jednak że w praktyce 
wartości są ograniczone).  
1.3. Osmometria membranowa:  
opiera się na zasadzie osmozy, tzn. naturalnej sk łonności cząsteczek 
rozpuszczalnika do przenikania przez pó łprzepuszczaln ą membran ę 
z rozcieńczonego do st ężonego roztworu a ż do osiągnięcia równo ­
wagi. W trakcie badania rozcie ńczony roztwór posiada zerowe 
stężenie polimeru, natomiast st ężony roztwór zawiera polimer. Skut ­
kiem przepuszczenia rozpuszczalnika przez membran ę jest zróżnico­
wanie ciśnienia, które zale żne jest od st ężenia i masy cz ąsteczkowej 
polimeru (1) (3)(4).  
Zastosowanie: M  n w zakresie 20 000–200 000.  
1.4. Osmometria fazy parowania:  
obejmuje porównanie wska źnika parowania czystego rozpuszczal ­
nika aerozolu do co najmniej trzech aerozoli zawieraj ących polimer 
o różnych stężeniach (1) (5) (6).  
Zastosowanie: M  n < 20 000.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Analiza grupy ko ńcowej  
W celu wykorzystania tej metody potrzeba wiedzy zarówno 
o całkowitej strukturze polimeru, jak i o charakterze łańcucha 
kończącego grupy ko ńcowe (która musi by ć możliwa do odró żnienia 
od głównego szkieletu, np. przez NMR lub miareczkowanie/ ­
różniczkowanie). Oznaczenie st ężenia cząsteczkowego grup ko ńco­
wych obecnych w polimerze mo że prowadzi ć do wyprowadzenia 
wartości masy cz ąsteczkowej (7) (8) (9).  
Zastosowanie, M  n do 50 000 (ze zmniejszaj ącą się wiarygodno ścią). 
3. Bibliografia  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., 
John Wiley, New York, 1984.  
(2) Glover, C.A., Absolute Colligative Property Methods. Chapter 
4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York, 1975.
 
(3) ASTM D 3750-79, Standard Practice for Determination of 
Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Phila ­
delphia, Pennsylvania, 1979.
 
(4) Coll, H., Membrane Osmometry. In: Determination of Mole ­
cular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, 1989, pp. 
25–52.  
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.  
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Deter ­
minationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
 
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 
In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
 
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139- 
2146.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  ZAWARTO ŚĆ POLIMERÓW O MA ŁEJ MASIE 
CZĄSTECZKOWEJ  
1. METODA  
Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej jest powtórze ­
niem OECD TG 119 (1996). Podstawowe zasady i dalsze informacje 
techniczne s ą podane w odniesieniach.  
1.1. WPROWADZENIE  
Ze względu na to, że właściwości polimerów s ą tak zróżnicowane, 
nie istnieje mo żliwość opisania pojedynczej metody ustalaj ącej 
dokładnie warunki rozdzielenia i oceny, która obejmuje wszystkie 
ewentualno ści i właściwości pojawiaj ące się w trakcie rozdzielania 
polimerów. W szczególno ści złożone systemy polimerów cz ęsto nie 
ulegają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Je śli GPC 
nie jest stosowane, masa cz ąsteczkowa mo że być ustalona za 
pomocą innych metod (zob. za łącznik). W takich przypadkach 
powinny zosta ć podane wszystkie szczegó ły i uzasadnienia dla 
wykorzystanych metod.  
Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegó łowe 
informacje dotycz ące tego, w jaki sposób przeprowadza ć doświad­
czenia oraz w jaki sposób ocenia ć dane, mo żna znaleźć w niniejszej 
normie DIN. W przypadku gdy niezb ędne są zmiany warunków 
doświadczeń, wspomniane zmiany musz ą być uzasadnione. Inne 
normy mog ą być wykorzystywane tylko w przypadku, gdy istniej ą 
do nich pe łne odniesienia. Opisana metoda wykorzystuje próbki 
polistyrenu o znanej polidyspersyjno ści w odniesieniu do kalibracji 
oraz może wystąpić konieczno ść jej zostać zmodyfikowania, tak aby 
była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. polimerów rozpusz ­
czalnych w wodzie i polimerów o d ługich rozga łęzieniach łańcucha.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Mała masa cz ąsteczkowa jest arbitralnie okre ślana jako masa 
cząsteczkowa poni żej 1 000 daltonów.  
Średnia liczbowo masa cz ąsteczkowa M  n i średnia wagowo masa 
cząsteczkowa M  w jest określana przy u życiu następujących równa ń: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
gdzie:  
H I = jest poziomem detektora sygna łu z linii podstawowej dla 
objętości retencyjnej V  i , 
M i = jest mas ą cząsteczkową polimerowej frakcji przy obj ętości 
retencyjnej V  i , i n jest liczb ą punktów pomiarowych.  
Szerokość rozkładu masy cz ąsteczkowej, który jest miar ą dyspersyj ­
ności systemu, jest podana na podstawie stosunku M  w /M n . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Ze względu na to, że GPC jest metod ą względną, musi zosta ć 
podjęta kalibracja. Zwykle do tego celu u żywane są wzorce polisty ­
renowe ma ło rozproszone, o linearnej budowie, posiadaj ące średnie 
masy cząsteczkowe M  n i M  w oraz znany rozk ład masy cz ąsteczko­
wej. Krzywa kalibracji mo że być wykorzystywana wy łącznie w celu 
określania masy cz ąsteczkowej nieznanej próbki, je żeli warunki 
rozdzielenia próbki oraz wzorca zosta ły dobrane w identyczny 
sposób.  
Ustalony zwi ązek między masą cząsteczkową oraz obj ętością elucji 
jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach danego do świad­
czenia. Warunki obejmuj ą przede wszystkim temperatur ę, rozpusz ­
czalnik (lub mieszanin ę rozpuszczalników), warunki chromatografii 
oraz kolumn ę rozdzielaj ącą lub systemy kolumn.  
Masy cząsteczkowe próbki ustalone w ten sposób s ą względnymi 
wartościami oraz s ą opisane jako równowa żnik mas cz ąsteczkowych 
polistyrenowych. Oznacza to, że w zale żności od strukturalnych 
i chemicznych ró żnic między próbk ą a wzorcami, masy cz ąstecz­
kowe mog ą odchylać się od warto ści absolutnych w wi ększym lub 
mniejszym stopniu. Je śli wykorzystywane s ą inne wzorce, np. 
glikolu polietylenu, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu czy kwasu poliakrylowego, powinny zosta ć podane odpowiednie 
przyczyny.
 
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zarówno rozk ład masy cz ąsteczkowej próbki, jak i średnie masy 
cząsteczkowe (M  n , M  w ) mogą być ustalane, wykorzystuj ąc GPC. 
GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest oddzielana wed ług hydrodynamicznych wiel ­
kości pojedynczych sk ładników (2).
 
Rozdzielenie nast ępuje wówczas, gdy próbka przechodzi przez 
kolumnę, która jest wype łniona porowatym materia łem – jest to 
zazwyczaj organiczny żel. Małe cząsteczki mog ą wnikać w pory, 
podczas gdy du że cząsteczki są wykluczane. Ścieżka dużych cząste­
czek jest niniejszym krótsza i to one s ą najpierw poddane procesowi 
eluacji. Średnie cz ąsteczki wnikaj ą w niektóre pory i s ą później 
poddawane eluacji. Najmniejsze cz ąsteczki o średnim hydrodyna ­
micznym promieniu, mniejszym ni ż pory żelu, mog ą wnikać we 
wszystkie pory. S ą poddawane eluacji na ko ńcu. 
W sytuacji idealnej oddzielanie jest kontrolowane ca łkowicie 
rozmiarem odmian cz ąsteczkowych, ale w praktyce trudno jest 
uniknąć co najmniej niewielkich efektów absorbcyjnych. Nierówne 
wypełnienie kolumny oraz obj ętość martwa mog ą tylko pogorszy ć 
sytuację (2). 
Na detekcj ę ma wpływ np. wspó łczynnik za łamania lub poch łanianie 
promieni UV oraz wydajno ści nieskomplikowanej krzywej rozk ładu. 
Jednakże w celu przypisania rzeczywistych warto ści masy cz ąstecz­
kowej do krzywej niezb ędne jest poddanie kolumny kalibracji przez 
przepuszczanie polimerów o znanej masie cz ąsteczkowej oraz, 
w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. ró żnych wzorców 
polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstaj ąca zazwyczaj w ten 
sposób, czasami wypaczona jest ma łymi „ogonami” skierowanymi 
w stronę małych mas cz ąsteczkowych, o ś pionowa wskazuje jako ść 
w masie ró żnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a o ś pozioma 
wskazuje logarytm z masy cz ąsteczkowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
Zawartość niskich mas cz ąsteczkowych jest uzyskiwana na 
podstawie krzywej. Obliczenia mog ą być tylko wtedy dok ładne, 
gdy odmiany o ma łych masach cz ąsteczkowych odpowiadaj ą poli­
merowi jako ca łości. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Powtarzalno ść (względne odchylenie standardowe: RSD) obj ętości 
eluowania powinna by ć lepsza ni ż 0,3 %. Wymagana powtarzalno ść 
analizy musi by ć zapewniona przez korekt ę dokonywan ą poprzez 
wewnętrzne wzorce, je żeli chromatogram jest oceniany w oparciu 
o czas i nie odpowiada wy żej wspomnianym kryteriom (1). Polidys ­
persyjności są zależne od mas cz ąsteczkowych wzorców. 
W przypadku wzorców polistyrenowych typowe warto ści to: 
M p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku)  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.6.1.  Przygotowanie wzorcowych roztworów polistyrenu  
Wzorce polistyrenu s ą rozpuszczane przez ostro żne mieszanie 
w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy musz ą zostać uwzględ­
nione w trakcie przygotowywania roztworów.  
Stężenia wybranych wzorców s ą zależne od wielu czynników, np. od 
objętości injekcji, lepko ści roztworu oraz czu łości detektora anali ­
tycznego. Maksymalna obj ętość injekcji musi by ć dostosowana do 
długości kolumny, w celu unikni ęcia przeładowania. Typowe obj ę­
tości injekcji dla analitycznych rozdziele ń, wykorzystuj ąc GPC 
z kolumn ą o wymiarach 30 cm × 7,8 mm, wynosz ą zazwyczaj 
40–100 μl. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekra ­
czać 250 μl. Optymalny stosunek mi ędzy objętością injekcji oraz 
stężeniem musi by ć określony przed rzeczywist ą kalibracj ą kolumny.  
1.6.2.  Przygotowywanie roztworu próbki  
Zasadniczo te same wymagania stosuje si ę do przygotowywania 
roztworów próbek. Próbka jest rozpuszczana w odpowiednim 
rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrz ąsa­
nie. W żadnych okoliczno ściach nie powinno si ę rozpuszcza ć próbki 
w wannie ultrad źwiękowej. W razie konieczno ści, próbka roztworu 
jest oczyszczana przez membranowy filtr posiadaj ący pory 
o wymiarach mi ędzy 0,2 i 2 μ m. 
Obecność nierozpuszczalnych cz ąstek musi by ć uwzględniona 
w sprawozdaniu ko ńcowym, jako że może być to wa żne 
w odniesieniu do próbek o wysokiej masie cz ąsteczkowej. Powinna 
zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu okre ślenia procentu 
wagowego nierozpuszczonych cz ąstek. Roztwór musi zosta ć wyko­
rzystany w ci ągu 24 godzin.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Korekta w odniesieniu do zawarto ści zanieczyszcze ń oraz 
dodatków  
Zazwyczaj niezb ędna jest korekta udzia łu zawarto ści odmian M < 
1 000 w odniesieniu do udzia łu niepolimerowych szczególnych 
obecnych sk ładników (np. zanieczyszczenia i/lub dodatki), chyba 
że zmierzona zawarto ść wynosi ju ż < 1 %. Osi ągane jest to przez 
bezpośrednią analizę roztworu polimerowego lub eluentu metod ą 
GPC.  
W przypadkach gdy eluent po przej ściu przez kolumn ę jest za 
bardzo rozcie ńczony, aby mo żna go by ło poddać dalszej analizie, 
musi zosta ć zagęszczony. Mo że okazać się niezbędne odparowanie 
eluentu do sucha oraz ponowne jego rozpuszczenie. St ężenie eluentu 
musi zosta ć uzyskane w warunkach, które zapewniaj ą, że nie 
pojawią się żadne zmiany w eluencie. Obróbka eluentu po fazie 
GPC jest zale żna od wykorzystanej metody analitycznej wykorzy ­
stywanej do oznaczania ilo ściowego.  
1.6.4.  Aparatura  
Aparatura GPC sk łada się z następujących części składowych:  
— zbiornik na rozpuszczalnik,  
— odgazowywacz (w miar ę potrzeb),  
— pompa,  
— nawilżacz pulsowy (w miar ę potrzeb),  
— system wtryskowy,  
— kolumny chromatograficzne,  
— detektor,  
— przepływomierz (w miar ę potrzeb),  
— urządzenia rejestruj ące dane,  
— naczynie na odpady.  
Musi zosta ć zapewnione, że system GPC b ędzie jest oboj ętny 
w odniesieniu do stosowanych rozpuszczalników (np. przez wyko ­
rzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF).  
1.6.5.  System wtryskowy i system dostarczaj ący rozpuszczalnik  
Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie 
albo przy u życiu automatycznego próbnika, albo r ęcznie do ściśle 
określonej strefy. Zbyt szybkie wstrzykiwanie, je śli jest wykonywane 
ręcznie, mo że spowodowa ć zmiany w obserwowalnym rozk ładzie 
masy cząsteczkowej. System dostarczaj ący rozpuszczalnik, na ile 
jest to mo żliwe, powinien by ć wolny od pulsacji, co mo żna osiągnąć 
poprzez wbudowanie do niego t łumika pulsacji. Prawid łowa pręd­
kość przepływu wynosi 1 ml/min.  
1.6.6.  Kolumna  
W zależności od próbki w łaściwości polimeru okre śla się albo za 
pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn po łączonych 
w sekwencj ę. Pewna ilo ść materia łów porowatych kolumn 
o określonych w łaściwościach dost ępna jest w ogólnej sprzeda ży 
(np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielaj ącego 
lub długość kolumny jest uzale żniona zarówno od w łaściwości 
próbki (obj ętości hydrodynamiczne, rozk ład masy cz ąsteczkowej), 
jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpusz ­
czalnik, temperatura i pr ędkość przepływu (1) (2) (3).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Pó łki teoretyczne  
Kolumna lub po łączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania 
musi być scherakteryzowana przez ilo ść półek teoretycznych. Obej ­
muje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnikia eluencyjnego, 
umieszczenie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich 
niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolumnie o znanej długości. Liczba pó łek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie 
następującego równania: 
N ¼ 5; 54 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
lub N ¼ 16 Í 
V e 
W Î 2 
gdzie:  
N = jest liczb ą półek teoretycznych,  
V e = jest obj ętością eluencyjn ą w maksimum piku,  
W = jest wyj ściową szerokością piku,  
W 1/2 = jest szeroko ścią piku w po łowie wysoko ści. 
1.6.8.  Wydajno ść rozdzielania  
Oprócz liczby pó łek teoretycznych, która jest okre ślającą ilościowo 
szerokością pasma, wa żną rolę odgrywa tak że wydajno ść rozdziele ­
nia, będąca określana przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. 
Wydajność rozdzielania kolumny jest uzyskiwana z nast ępującego 
stosunku:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
kolonelės skerspjūvio plotas ≥ 6; 0 cm 3 
cm 2 " #  
gdzie:  
V e, M x = jest obj ętością eluencyjn ą dla polistyrenu o masie 
cząsteczkowej M  x , 
V e, (10.Mx)  = jest obj ętością eluencyjn ą dla polistyrenu o 10-krotnie 
większej masie cz ąsteczkowej.  
Rozdzielczo ść systemu jest zwykle okre ślana w nast ępujący sposób:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
gdzie:  
Ve1, V  e2 = są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polisty ­
renowych w maksimum piku;  
W 1 , W  2 = są największymi szeroko ściami piku w lini podstawo ­
wej; 
M 1 , M  2 = są masami cz ąsteczkowymi przy maksimum piku 
(powinny ró żnić się współczynnikiem o 10).  
Wartość R w odniesieni do systemu kolumn powinna by ć wyższa 
niż 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Rozpuszczalniki  
Wszystkie rozpuszczalniki musz ą posiadać wysoką czystość (dla 
THF używana jest czysto ść 99,5 %). Zbiornik na rozpuszczalnik 
(o ile jest to konieczne – w atmosferze gazu oboj ętnego) musi by ć 
odpowiednio du ży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. 
Rozpuszczalnik musi by ć odgazowany zanim zostanie przeniesiony 
do kolumny za pomoc ą pompy.  
1.6.10.  Kontrola temperatury  
Temperatura krytycznych komponentów wewn ętrznych (p ętla wtry­
skowa, kolumny, detektor i przewody) powinna by ć stała i zgodna 
z wyborem rozpuszczalnika.  
1.6.11.  Detektor  
Zadaniem detektora jest rejestracja ilo ściowa stężenia próbki eluo ­
wanej z kolumny. W celu unikni ęcia niepotrzebnego poszerzenia 
pików obj ętość kuwety komórki detektora musi by ć tak mała, jak 
to tylko jest mo żliwe. Nie powinna by ć większa niż 10 μl, 
z wyjątkiem detektorów mierz ących światło rozproszone oraz 
lepkość. W celu detekcji zazwyczaj u żywana jest refraktometria 
różnicowa. Jednak że jeżeli wymagaj ą tego właściwości próbki lub 
właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mog ą być używane inne 
rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepko ści itd.  
2. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDA Ń 
2.1. DANE  
Powinno nast ąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania 
szczegółowych kryteriów oceny, jak równie ż do wymogów odnosz ­ 
ących się do zbierania i przetwarzania danych.  
Dla każdej próbki musz ą zostać przeprowadzone dwa niezale żne 
doświadczenia. Próbki musz ą być analizowane pojedynczo. We 
wszystkich przypadkach zasadnicze jest ustalenie danych równie ż z 
prób ślepych, poddawanych przetworzeniu w takich samych warun ­
kach co próbka.  
Niezbędne jest wyra źne wskazanie, że zmierzone warto ści są 
wartościami wzgl ędnymi, równowa żnymi masom cz ąsteczkowym 
użytych wzorców.  
Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (mo żliwie popra ­
wionych wykorzystuj ąc wzorzec wewn ętrzny) warto ści logarytmu 
M p (M p będącego maksymaln ą wartością piku wzorca kalibracji) 
są wykreślane w oparciu o jedn ą z tych wielko ści. Niezb ędne są 
co najmniej dwa punkty kalibracji na dekad ę masy cz ąsteczkowej 
oraz wymagane jest co najmniej pi ęć punktów pomiarowych dla 
całkowitej krzywej, która powinna obejmowa ć oszacowan ą masę 
cząsteczkową próbki. Niska warto ść punktu ko ńcowego masy 
cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest okre ślana za pomoc ą n- 
heksylobenzenu lub innego odpowiedniego niepolarnego roztworu. 
Część krzywej odpowiadaj ąca masom cz ąsteczkowym poni żej 
1 000 jest ustalana i korygowana w razie konieczno ści 
w odniesieniu do zanieczyszcze ń oraz dodatków. Krzywe eluacji 
są zazwyczaj oceniane za pomoc ą elektronicznego przetwarzania 
danych W przypadku gdy u żywana jest r ęczna digitalizacja, mo żna 
powołać się na ASTMD 3536-91 (3).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Jeśli jakikolwiek nierozpuszczalny polimer jest zachowany 
w kolumnie, jego masa cz ąsteczkowa mo że być wyższa niż masa 
cząsteczkowa frakcji rozpuszczalnej, a je śli nie jest brana pod uwag ę 
może skutkowa ć nadmiernym oszacowaniem zawarto ści niskiej masy 
cząsteczkowej. Wskazówki w odniesieniu do korygowania zawar ­
tości niskiej masy cz ąsteczkowej w odniesieniu do nierozpuszczal ­
nego polimeru s ą przewidziane w za łączniku.  
Krzywa rozk ładu musi by ć przewidziana w formie tabeli lub ilust ­
racji (ró żnicowa cz ęstotliwość lub procent sumy w oparciu 
o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy 
cząsteczkowej powinna mie ć normalnie oko ło 4 cm szeroko ści, 
a maksymalna warto ść szczytowa oko ło 8 cm wysoko ści. 
W przypadku krzywych ca łkowego rozk ładu różnica w rz ędnych 
między 0 a 100 % powinna wynosi ć około 10 cm.  
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
2.2.1.  Substancja badana:  
— dostępne informacje dotycz ące badanej substancji (to żsamość, 
dodatki, zanieczyszczenia),  
— opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy.  
2.2.2.  Oprzyrz ądowanie:  
— zbiornik z eluentem, oboj ętny gaz, odgazowywanie eluentu, 
skład eluentu, zanieczyszczenia,  
— pompa, pulsowy t łumik, system wtryskowy,  
— kolumny rozdzielaj ące (wytwórca, wszystkie informacje 
dotyczące właściwości kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj 
rozdzielaj ącego materia łu itd., liczba, d ługość oraz kolejno ść 
użytych kolumn),  
— liczba pó łek teoretycznych kolumny (lub po łączonych), wydaj ­
ność rozdzielania, (rozdzielczo ść systemu),  
— informacja dotycz ąca symetrii pików,  
— temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperatur ą, 
— detektor (zasada pomiarów, rodzaj, obj ętość kuwetowa),  
— przepływomierz w przypadkach, gdy jest u żywany (wytwórca, 
zasada pomiarów),  
— system umo żliwiający rejestracj ę i przetwarzanie danych (osprz ęt 
i oprogramowanie).  
2.2.3.  Kalibracja systemu  
— szczegó łowy opis metody u żywanej do przygotowania krzywej 
kalibracji,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informacja dotycz ąca kryteriów jako ściowych dla niniejszej 
metody (np. wspó łczynnik korelacji, b łąd sumy kwadratów itd.),  
— informacja dotycz ąca ekstrapolacji, za łożenia i przybli żenia 
poczynione w trakcie procedury do świadczalnej oraz oszaco ­
wanie i przetwarzanie danych,  
— wszystkie pomiary przeprowadzone w celu przygotowania 
krzywej kalibracji powinny by ć udokumentowane w tabelach, 
które zawieraj ą następujące informacje dla ka żdego punktu kalib ­
racji:  
— nazwa próbki,  
— producent próbki,  
— właściwości wartości wzorców M  p , M  n , M  w oraz M  w /M n , jak 
przewidziano przez wytwórc ę lub uzyskane na podstawie 
kolejnych pomiarów, razem ze szczegó łami dotycz ącymi 
metody wyznaczania,  
— objętość wtrysku oraz st ężenie wtrysku,  
— warto ść M p używanej dla kalibracji,  
— objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony 
przy maksimach piku,  
— M  p obliczone przy maksimum piku,  
— błąd procentowy wyliczonej M  p oraz warto ść kalibracji.  
2.2.4.  Informacja dotycz ąca zawarto ści polimerów o niskiej masie 
cząsteczkowej:  
— opis metod stosowanych w analizach i sposobie, w jaki przepro ­
wadzone zosta ły doświadczenia,  
— informacja dotycz ąca zawarto ści procentowej frakcji o ma łej 
masie cząsteczkowej w odniesieniu do masy ca łkowitej próbki,  
— informacja dotycz ąca zanieczyszcze ń, dodatków i innych niepo ­
limerowych sk ładnikach w procentach w odniesieniu do masy 
całkowitej próbki.  
2.2.5.  Ocena:  
— ocena na podstawie czasu: wszystkie metody maj ące na celu 
zapewnienie wymaganej odtwarzalno ści (metoda poprawiania, 
wzorce wewn ętrzne itd.),  
— informacja dotycz ąca tego, czy ocena zosta ła przeprowadzona na 
podstawie obj ętości eluencyjnej lub czasu retencji,  
— informacja dotycz ąca ogranicze ń oceny, je żeli pik nie zosta ł 
poddany analizie w ca łości, 
— opis metod wyg ładzających, jeżeli są wykorzystywane,  
— procedury przygotowawcze oraz wst ępnego przetworzenia 
próbki,  
— obecno ść nierozpuszczalnych cz ąstek, jeżeli istniej ą, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— objętość wtrysku ( μl) oraz st ężenie wtrysku (mg/ml),  
— uwagi wskazuj ące skutki, które prowadz ą do odchyle ń od ideal­
nego profilu GPC,  
— szczegó łowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych,  
— szczegó ły dotyczące zakresów b łędów,  
— wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do 
interpretacji wyników.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Poly ­
styrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Załącznik  
Wytyczne dotycz ące korygowania zawarto ści związków o niskiej masie 
cząsteczkowej w odniesieniu do obecno ści nierozpuszczalnych polimerów  
Jeśli w próbce obecny jest nierozpuszczalny polimer, skutkiem tego jest utrata 
masy podczas analizy GPC. Nierozpuszczalny polimer pozostaje nieodwracalnie 
w kolumnie lub na filtrze próbkowym, podczas gdy rozpuszczalna cz ęść próbki 
przechodzi przez kolumn ę. W przypadku gdy inkrement wspó łczynnika za ła­
mania światła (dn/dc) polimeru mo że zostać oszacowany lub zmierzony, 
można oszacowa ć utratę masy próbki na kolumnie. W takim przypadku przepro ­
wadza się korektę, wykorzystuj ąc zewnętrzną kalibracj ę wzorcowymi materia łami 
o znanym st ężeniu oraz dn/dc w celu kalibracji reakcji refraktometru. 
W poniższym przyk ładzie wykorzystywany jest wzorzec metaakrylanu polime ­
tylu (pMMA).  
W zewn ętrznej kalibracji, w celu analizy akrylowych polimerów, wzorzec 
pMMA, o znanym st ężeniu w tetrahydrofuranie, jest analizowany przez GPC, 
a otrzymane dane s ą wykorzystywane w celu znalezienia sta łej refraktometru 
zgodnie ze wzorem:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
gdzie:  
K = sta ła refraktometru (w mikrowoltosekundach/ml),  
R = wska źnik wzorca pMMA (w mikrowoltosekundach),  
C = st ężenie wzorca pMMA (w mg/ml),  
V = obj ętość dozowana (w ml), oraz  
dn/dc = inkrement wspó łczynnika za łamania światła dla pMMA 
w tetrahydrofuranie (w ml/mg)  
Następujące dane s ą typowe dla wzorca pMMA:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg  
Uzyskana warto ść K, 3,05 × 10  11 , jest nast ępnie wykorzystywana w celu obli ­
czania teoretycznej reakcji detektora, je żeli 100 % wtry śniętego polimeru eluo ­
wało przez detektor.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  ZACHOWANIE POLIMERÓW W WODZIE – ROZPUSZCZA ­
NIE/EKSTRAKCJA  
1. METODA  
Opisana metoda jest powtórzeniem wersji poprawionej OECD WT 
120 (1997). Dalsze informacje techniczne podane s ą w pozycji 
bibliograficznej (1).  
1.1. WPROWADZENIE  
W odniesieniu do niektórych polimerów, takich jak np. polimerów 
emulsyjnych, zanim mo żna zastosowa ć metodę opisaną poniżej, 
konieczne mog ą być wstępne prace przygotowawcze. Metoda ta 
nie ma zastosowania do polimerów p łynnych oraz do polimerów, 
które reaguj ą z woda w warunkach badania.  
Jeżeli metoda nie jest praktyczna lub nie jest mo żliwe jej zastoso ­
wanie, zachowanie rozpuszczanie/ekstrakcja mo że zostać zbadane za 
pomocą innych metod. W takich przypadkach nale ży podać pełne 
szczegóły oraz uzasadnienie dla zastosowania metody.  
1.2. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zachowanie polimerów rozpuszczanie/ekstrakcja w środowisku 
wodnym ustalane jest przy wykorzystaniu metody kolbowej (zob. A.6. Rozpuszczalno ść w wodzie, metoda kolbowa) ze zmianami 
opisanymi poni żej.
 
1.4. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.5. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.5.1.  Sprz ęt 
W odniesieniu do tej metody wymagany jest nast ępujący sprzęt: 
— przyrz ąd zgniataj ący, np. m łyn do wytwarzania cz ąstek o znanym 
rozmiarze,  
— aparatura do wstrz ąsania z mo żliwością kontroli temperatury,  
— system filtrowania membranowego,  
— właściwy sprz ęt analityczny,  
— znormalizowane sita.  
1.5.2.  Przygotowanie próbki  
Próbka reprezentatywna musi zosta ć najpierw zmniejszona do wiel ­
kości cząsteczek mi ędzy 0,125 i 0,25 mm, wykorzystuj ąc właściwe 
sita. W odniesieniu do stabilno ści próbki lub w odniesieniu do 
procesu mielenia wymagane mo że być chłodzenie. Materia ły 
o właściwościach podobnych do gumy mog ą być kruszone 
w temperaturze ciek łego azotu (1).  
Jeżeli wymagana frakcja wielko ści cząsteczki jest nieosi ągalna, 
powinno zosta ć podjęte działanie w celu zmniejszenia wielko ści 
cząsteczek do najmniejszej mo żliwej wielko ści oraz z łożone spra­
wozdanie o wyniku. W sprawozdaniu niezb ędne jest wskazanie 
sposobu, w jaki skruszona próbka by ła składowana przed badaniem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Procedura  
Trzy próbki o masie 10 g s ą odważane do trzech naczy ń wyposa­ 
żonych w szklane korki i dodaje si ę po 1 000 ml wody do ka żdego 
z naczyń. Jeżeli zastosowanie ilo ści 10 g polimeru okazuje si ę 
niewykonalne, powinna zosta ć wykorzystana najwi ększa najbli ższa 
tej wartości ilość, jaką można zastosowa ć, a objętość wody powinna 
zostać odpowiednio dostosowana.  
Naczynia s ą szczelnie zamykane korkiem, a nast ępnie wstrz ąsane 
w temperaturze 20  o C. Powinno zosta ć wykorzystane urz ądzenie 
wstrząsające lub mieszaj ące, działające w sta łej temperaturze. Po 
okresie 24 godzin zawarto ść każdego naczynia jest odwirowywana 
lub filtrowana, a st ężenie polimeru w czystej fazie wodnej ustalane 
jest za pomoc ą odpowiedniej metody. Je żeli odpowiednie metody 
analityczne w odniesieniu do fazy wodnej nie s ą dostępne, całkowitą 
rozpuszczalno ść/podatność na ekstrakcj ę można oszacowa ć z suchej 
masy pozosta łości filtracyjnej lub z odwirowanego str ątu. 
Zazwyczaj niezb ędne jest ilo ściowe zró żnicowanie mi ędzy zanie ­
czyszczeniami i dodatkami, z jednej strony, oraz odmianami o małej masie cz ąsteczkowej, z drugiej strony. W przypadku ozna ­
czania grawimetrycznego wa żne jest tak że przeprowadzenie próby 
ślepej bez wykorzystania substancji badanej, w celu uwzgl ędnienia 
pozostałości powstaj ących w wyniku metody do świadczalnej.
 
Zachowanie polimerów rozpuszczanie/ekstrakcja w wodzie 
w temperaturze 37  o C przy pH 2 i pH 9 mo że zostać ustalone 
w ten sam sposób, jak opisano w odniesieniu do przeprowadzania 
doświadczenia w temperaturze 20  o C. Warto ści pH mo żna osiągnąć 
przez dodanie albo odpowiednich roztworów buforowych, albo odpowiednich kwasów lub zasad, takich jak kwas solny, kwas octowy, wodorotlenek sodu lub potasu o czysto ści analitycznej lub 
NH
 3 . 
W zależności od wykorzystanej metody analizy, nale ży przeprowa ­
dzić jedno lub dwa badania. Je żeli dostępne są wystarczaj ąco szcze­
gółowe metody w odniesieniu do bezpo średniej analizy fazy wodnej 
dla komponentu polimerowego, wystarczy przeprowadzi ć jedno 
badanie, jak opisano powy żej. Jednak że jeżeli takie metody nie s ą 
dostępne, a okre ślenie zachowania rozpuszczania/ekstrakcji polimeru 
jest ograniczone do analizy po średniej przez ustalanie tylko ca łko­
witej zawarto ści węgla organicznego (TOC) ekstraktu wodnego, 
powinno zosta ć przeprowadzone dodatkowe badanie. Takie dodat ­
kowe badanie nale ży także przeprowadzi ć trzykrotnie, stosuj ąc dzie­
sięciokrotnie mniejsze próbki polimeru oraz takie same ilo ści wody 
jak ilości wykorzystane w pierwszym badaniu.  
1.5.4.  Analiza  
1.5.4.1.  Badanie przeprowadzane z próbk ą jednego rozmiaru  
Mogą być dostępne metody analizy bezpo średniej komponentów 
polimerowych w fazie wodnej. Alternatywnie mo żna rozwa żyć 
pośrednią analizę rozpuszczonych/ekstrahowanych komponentów 
polimerowych przez okre ślenie całkowitej zawarto ści części rozpusz ­
czalnych i korekt ę w odniesieniu do komponentów, które nie s ą 
właściwe dla polimerów.  
Możliwa jest analiza fazy wodnej dla ogó łu odmian polimerowych:  
albo przez wystarczaj ącą czułą metodę, np.:  
— TOC, wykorzystuj ącą ekstrahowanie na ciep ło nadsiarczanu lub 
dwuchromianu, w celu otrzymania CO  2 , a następnie wykonanie 
oznaczenia za pomoc ą podczerwieni IR lub analizy chemicznej,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— spektometrie absorpcji atomowej (AAS) lub jej równowa żnik 
emisji indukcyjnie wzbudzonej plazmy (ICP) dla krzemu lub 
polimerów zawieraj ących metale,  
— pochłanianie UV lub spektrofluorometrie dla polimerów arylu,  
— LC-MS dla próbek o ma łej masie cz ąsteczkowej,  
lub przez odparowywanie w warunkach pró żniowych do sucha 
ekstraktu wodnego i analiz ę spektroskopow ą (IR, UV itd.) lub 
analizę AAS/ICP pozosta łości. 
Jeżeli niemo żliwa jest analiza samej fazy wodnej, roztwór wodny 
należy ekstrahowa ć za pomoc ą organicznego rozpuszczalnika 
niemieszaj ącego się z woda, np. chlorowanego w ęglowodoru. 
Rozpuszczalnik jest nast ępnie odparowywany, a pozosta łość analizo­
wana pod k ątem podanej zawarto ści polimeru w sposób okre ślony 
powyżej. Wszelkie komponenty w tej pozosta łości, które s ą identy­
fikowane jako zanieczyszczenia lub dodatki, maj ą zostać odjęte 
w celu okre ślenia stopnia rozpuszczenia/ekstrakcji samego polimeru.  
Jeżeli obecne s ą względnie duże ilości takich substancji, mo że 
wystąpić konieczno ść poddania pozosta łości np. analizie HPLC lub 
GC, w celu odró żnienia zanieczyszcze ń od obecnego monomeru 
i frakcji pochodnych monomeru, tak aby mo żna było ustalić ich 
rzeczywist ą zawartość. 
W niektórych przypadkach wystarczaj ące może być zwykłe odparo­
wanie organicznego rozpuszczalnika do sucha i zwa żenie suchej 
pozostałości. 
1.5.4.2.  Badanie przeprowadzane z dwoma próbkami o ró żnych rozmiarach 
cząsteczek  
Wszystkie ekstrakty wodne analizuje w odniesieniu do TOC.  
Oznaczanie grawimetryczne przeprowadzane jest na 
nierozpuszczonej/niewyekstrahowanej cz ęści próbki. Je żeli po odwi ­
rowaniu lub filtrowaniu zawarto ści każdego z naczy ń pozostałości 
polimerów pozostaj ą przytwierdzone do ścianek naczynia, naczynie 
powinno zosta ć przepłukane filtratem do momentu oczyszczenia 
naczynia ze wszystkich widocznych pozosta łości. Następnie filtrat 
ponownie jest ponownie odwirowywany oraz filtrowany. Pozosta ­ 
łości na filtrze lub w rurze wirnikowej s ą suszone w temperaturze 
40 o C w próżni oraz wa żone. Suszenie kontynuuje si ę do momentu 
osiągnięcia stałej wagi.  
2. DANE  
2.1. BADANIE PRZEPROWADZANE Z PRÓBK Ą JEDNEGO 
ROZMIARU CZ ĄSTEK  
Powinny zosta ć podane poszczególne wyniki dla ka żdej z trzech 
kolb oraz warto ści średnie, wyra żone jednostkach masy na obj ętość 
roztworu (zwykle mg/l) lub masy na mas ę próbki polimeru (zwykle 
mg/g). Dodatkowo powinna zosta ć również podana utrata wagi 
próbki (obliczona jako masa substancji rozpuszczonej podzielona przez mas ę pierwszej próbki). B łędy względne powinny zosta ć odli­
czone (RSD). Dla ca łej substancji (polimer + niezb ędne substancje 
dodane itd.) oraz dla samego polimeru (tj. po odj ęciu substancji 
dodanych) nale ży podąć oddzielne dane liczbowe.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. BADANIE PRZEPROWADZANE Z DWOMA PRÓBKAMI 
O RÓŻNYCH ROZMIARACH CZ ĄSTECZKI  
Powinny zosta ć podane poszczególne warto ści TOC ekstraktów 
wodnych dwóch trzykrotnie przeprowadzanych do świadczeń oraz 
średnich warto ść dla ka żdego do świadczenia, wyra żone 
w jednostkach masy na obj ętość roztworu (zwykle mg/l) oraz 
w jednostkach masy na wag ę pierwszej próbki (zwykle mgC/g).  
Jeżeli nie istnieje ró żnica między wynikami w wysokich oraz niskich 
współczynnikach proporcji próbka/woda, mo że to wskazywa ć na to, 
że wszystkie mo żliwe do wyekstrahowania komponenty zosta ły 
faktycznie wyekstrahowane. W takim przypadku analiza bezpośrednia zazwyczaj nie by łaby konieczna. Powinny zosta ć 
podane masy poszczególnych pozosta łości, wyrażone jako udzia ł 
początkowych mas próbek.
 
Dla każdego eksperymentu powinny zosta ć obliczone warto ści śred­
nie. Różnice pomi ędzy warto ścią 100 i otrzymanymi procentami 
wyrażają procenty materia łu rozpuszczonego i ekstrahowanego 
w pierwotnej próbce.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDA Ń 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
3.1.1.  Substancja badana:  
— dostępne informacje dotycz ące substancji badanej (to żsamość, 
substancje dodane, zanieczyszczenia, zawarto ść odmian o malej 
masie cząsteczkowej).  
3.1.2.  Warunki przeprowadzania do świadczenia  
— opis wykorzystanych procedur i warunków przeprowadzania 
doświadczenia,  
— opis metod analizy i wykrywania.  
3.1.3.  Wyniki:  
— wyniki rozpuszczalno ści/podatno ści na ekstrakcj ę w mg/l; 
wartości poszczególne i średnie dla bada ń ekstrakcji 
w poszczególnych roztworach rozbite na zawarto ść polimerów 
oraz zanieczyszcze ń, dodatki itd.,  
— wyniki rozpuszczalno ści/podatno ści na ekstrakcj ę w mg/g poli ­
meru,  
— warto ści TOC ekstraktów wodnych, masa substancji rozpusz ­
czonej oraz udzia ły procentowe je żeli zostały zmierzone,  
— pH ka żdej próbki,  
— informacje dotycz ące wartości ślepej próby,  
— w miar ę potrzeb odniesienia do niestabilno ści chemicznej 
substancji badanej, zarówno podczas procesu badania, jak 
i podczas procesu analitycznego,  
— wszystkie informacje które s ą ważne w odniesieniu do interpre ­
tacji wyników.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
fur Prufzwecke.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJ ĄCE (CIECZE)  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Ta metoda badawcza jest przeznaczona do pomiaru potencja łu 
substancji ciek łej do zwi ększenia szybko ści spalania oraz intensyw ­
ności spalania materia łów palnych lub do tworzenia mieszanin 
z materia łami palnymi, które spontanicznie zapalaj ą się, kiedy s ą 
ze sobą dokładnie wymieszane. Jest oparta na badaniu ONZ dla 
cieczy utleniaj ących (1) i jest z nim równowa żna, jakkolwiek metoda 
A.21 jest przede wszystkim zaprojektowana, aby spe łniać wyma­
gania rozporz ądzenia 1907/2006, gdzie wymagane jest porównanie 
tylko z jedn ą substancj ą odniesienia. Konieczne mo że być badanie 
i porównanie z dodatkowymi substancjami odniesienia, gdyby wyniki bada ń miały być wykorzystywane do innych celów (
 1 ). 
To badanie nie musi by ć przeprowadzone, je żeli badanie wzoru 
strukturalnego wyja śnia ponad wszelk ą zasadną wątpliwość, że ta 
substancja nie jest zdolna do reakcji egzotermicznej z materia łem 
palnym.  
Przed przeprowadzeniem tego badania przydatne jest posiadanie 
wstępnych informacji na temat jakichkolwiek potencjalnych w łaści­
wości wybuchowych substancji.  
Badanie to nie ma zastosowania do cia ł stałych, gazów, substancji 
wybuchowych lub łatwopalnych b ądź nadtlenków organicznych.  
Można nie przeprowadza ć tego badania, je żeli są już dostępne dla 
substancji badanej wyniki próby ONZ dla cieczy utleniaj ących (1).  
1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI  
Średni czas wzrostu ci śnienia jest warto ścią średnią mierzonych 
czasów, w jakich badana mieszanina spowoduje wzrost ci śnienia 
z 690 kPa do 2 070 kPa powy żej ciśnienia atmosferycznego.  
1.3. SUBSTANCJAODNIESIENIA  
Jako substancja odniesienia wymagany jest 65 % (m/m) roztwór 
wodny kwasu azotowego (czysty do analizy) (  2 ). ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Jak na przyk ład w ramach przepisów transportowych ONZ. 
( 2 ) Kwas powinien by ć miareczkowany przed badaniem, aby potwierdzi ć jego stężenie.
 Ewentualnie, je żeli osoba badaj ąca przewiduje, że wyniki tego 
badania b ędą mogły ostatecznie zosta ć użyte do innych celów, 
może być również właściwe badanie dodatkowych substancji 
odniesienia (  1 ). 
1.4. ZASADY METODY BADAWCZEJ  
Badana ciecz jest mieszana w stosunku wagowym 1 do 1 z celuloz ą 
włóknistą i wprowadzana do komory ci śnieniowej. Je żeli podczas 
mieszania lub nape łniania nast ępuje spontaniczny zap łon, nie s ą 
konieczne dalsze badania.  
Jeżeli nie nast ępuje spontaniczny zap łon, przeprowadza si ę pełne 
badanie. Mieszanina jest ogrzewana w komorze ci śnieniowej 
i mierzony jest średni czas potrzebny do podniesienia ci śnienia od 
690 kPa do 2 070 kPa powy żej ciśnienia atmosferycznego. Otrzy ­
mana warto ść jest porównywana ze średnim czasem wzrostu 
ciśnienia dla mieszaniny substancji odniesienia i celulozy 
w stosunku 1:1.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
W serii pi ęciu prób przeprowadzonych na pojedynczej substancji 
żaden wynik nie powinien odbiega ć od średniej arytmetycznej 
o więcej niż 30 %. Wyniki ró żniące się od średniej o wi ęcej niż 
30 % powinny zosta ć odrzucone, procedura mieszania i nape łniania 
powinna zosta ć poprawiona, a badanie powtórzone.  
1.6. OPIS METODY  
1.6.1.  Przygotowanie  
1.6.1.1.  Substancja palna  
Jako materia ł palny jest u żywana sucha, w łóknista celuloza 
o długości włókna od 50 do 250 μm i średniej średnicy równej 
25 μm (  2 ). Jest suszona do sta łej masy, w warstwie o grubo ści 
nieprzekraczaj ącej 25 mm w temperaturze 105  o C przez 4 godziny 
i trzymana w suszarce, ze środkiem susz ącym, aż do ochłodzenia 
i do momentu, gdy b ędzie potrzebna do u życia. Zawarto ść wody 
w suchej celulozie powinna by ć mniejsza ni ż 0,5 % suchej masy (  3 ). 
W razie potrzeby nale ży przedłużyć czas suszenia a ż do osiągnięcia 
tego stanu (  4 ). W całym badaniu musi by ć używana ta sama partia 
celulozy.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Np. 50 % (m/m) kwasu chlorowego (VII) i 40 % (m/m) chlorku sodowego stosuje si ę 
w pozycji bibliograficznej (1). 
( 2 ) Np. proszek celulozowy do kolumn chromatograficznych Whatmana CF 11, 
nr katalogowy 4021 050. 
( 3 ) Potwierdzone przez np. miareczkowanie metod ą Karla-Fishera. 
( 4 ) Alternatywnie, t ę zawartość wody mo żna równie ż osiągnąć przez np. ogrzewanie w 105  
o C w próżni przez 24 godz.
 1.6.1.2.  Aparatura  
1.6.1.2.1. K o m o r a c i ś n i e n i o w a  
Potrzebna jest komora ci śnieniowa. Komora ta sk łada się 
z cylindrycznego, stalowego zbiornika ci śnieniowego o d ługości 
89 mm i średnicy zewn ętrznej 60 mm (zob. rysunek 1). Po przeciw ­
ległych stronach cylindra s ą ścięte dwie p łaszczyzny (zmniejszaj ące 
przekrój poprzeczny komory do 50 mm), aby u łatwić trzymanie 
podczas monta żu zapłonnika i wk ładki odpowietrzaj ącej. Komora, 
która ma otwór o średnicy 20 mm, jest od wewn ątrz na obu ko ńcach 
rozwiercona do g łębokości 19 mm oraz nagwintowana, tak aby 
można było wkręcić w nią rurę o średnicy 1" wed ług norm British 
Standard Pipe (BSP) lub odpowiednik wed ług układu metrycznego. 
Urządzenie do pomiaru ci śnienia, w postaci ramienia bocznego, jest 
przykręcone do zakrzywionej powierzchni zewn ętrznej komory 
ciśnieniowej w odleg łości 35 mm od jednego ko ńca, pod k ątem 
90° do ściętej płaszczyzny. Gniazdo dla niego jest nawiercone na 
głębokość 12 mm i nagwintowane, tak aby mo żna było wkręcić 
w nie gwint o średnicy 1/2" wed ług BSP (lub odpowiednik wed ług 
układu metrycznego), znajduj ący się na końcu ramienia bocznego. 
W razie potrzeby stosuje si ę obojętną uszczelk ę w celu zapewnienia 
gazoszczelno ści. Rami ę boczne wystaje na 55 mm poza korpus 
komory ci śnieniowej i ma wywiercony otwór o średnicy 6 mm. 
Koniec ramienia bocznego jest rozwiercony i nagwintowany, tak 
aby można było osadzić manometr przeponowy. Mo że być stoso­
wane dowolne urz ądzenie do pomiaru ci śnienia, pod warunkiem że 
będzie odporne na dzia łanie gorących gazów lub produktów rozk ładu 
i będzie zdolne reagowa ć na zmiany wzrostu ci śnienia w zakresie 
690–2 070 kPa w czasie nie d łuższym niż 5 ms.  
Koniec komory ci śnieniowej najbardziej oddalony od ramienia bocz ­
nego jest zamkni ęty zapłonnikiem, który jest wyposa żony w dwie 
elektrody, jedn ą izolowan ą, a drugą uziemion ą do jego korpusu. 
Drugi koniec komory ci śnieniowej jest zamkni ęty membran ą bezpie­
czeństwa (ciśnienie uderzeniowe wynosi oko ło 2 200 kPa) utrzymy ­
waną w swojej pozycji przy pomocy wk ładki ustalaj ącej, która ma 
otwór o średnicy 20 mm. W razie potrzeby, w celu zapewnienia 
dopasowania gazoszczelnego, przy zap łonniku stosowana jest 
uszczelka oboj ętna. Stojak (rysunek 2) utrzymuje zestaw podczas 
użytkowania na odpowiedniej wysoko ści. Składa się on zwykle z 
płytki podstawy, wykonanej z mi ękkiej stali, o wymiarach 
235 mm × 184 mm × 6 mm i z profilu kwadratowego o d ługości 
185 mm i wymiarach 70 mm × 70 mm × 4 mm.  
Z każdego z przeciwleg łych boków na jednym ko ńcu na długości 
profilu kwadratowego wyci ęto fragment, tak że powstała konstrukcja 
mająca dwie nó żki o płaskich ściankach, na której jest nienaruszony 
przekrój skrzynkowy o d ługości 86 mm. Ko ńce tych p łaskich 
ścianek są przycięte pod kątem 60° do poziomu i przyspawane do 
płytki podstawy. W jednym boku górnego ko ńca głównego profilu 
wycięto szczelin ę o szeroko ści 22 mm i g łębokości 46 mm, żeby 
podczas wk ładania zestawu komory ci śnieniowej, najpierw koniec 
z zapłonnikiem, do uchwytu z przekroju skrzynkowego rami ę boczne 
mieściło się w szczelinie. Kawa łek stali o szeroko ści 30 mm 
i grubości 6 mm jest przyspawany do dolnej wewn ętrznej ścianki 
przekroju skrzynkowego i dzia ła jako rozpórka. Dwie śruby skrzy ­
dełkowe o średnicy 7 mm, przykr ęcone do przeciwleg łej ścianki, 
służą do trzymania komory ci śnieniowej mocno na miejscu. Dwa 
paski o szeroko ści 12 mm ze stali o grubo ści 6 mm, przyspawane 
do części bocznych, przylegaj ąc do podstawy przekroju skrzynko ­
wego, podpieraj ą komorę ciśnieniową od dołu. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. S y s t e m z a p ł o n u  
System zap łonu składa się drutu Ni/Cr o d ługości 25 cm o średnicy 
0,6 mm i oporze 3,85 om/m. Drut jest zwini ęty, przy pomocy pr ęta 
o średnicy 5 mm, w kszta łt cewki i pod łączony do elektrod zap łon­
nika. Cewka powinna mie ć jedną z konfiguracji przedstawionych na 
rysunku 3. Odst ęp pomiędzy dnem komory a spodem cewki zap ło­
nowej powinien wynosi ć 20 mm. Je żeli elektrody nie s ą nastawne, 
końce przewodu zap łonowego pomi ędzy cewk ą a dnem komory 
powinny by ć izolowane os łoną ceramiczn ą. Przewód jest ogrzewany 
prądem stałym o nat ężeniu przynajmniej 10 A.  
1.6.2.  Prowadzenie badania  ( 1 ) 
Aparatura, z łożona w ca łości z przetwornikiem ci śnieniowym 
i systemem ogrzewania, ale bez za łożonej membrany bezpiecze ń­
stwa, jest trzymana ko ńcem z zap łonnikiem na dó ł. 2,5 g cieczy 
przeznaczonej do badania jest mieszane z 2,5 g wysuszonej celulozy 
w zlewce szklanej przy pomocy szklanej bagietki (  2 ). Dla bezpie ­
czeństwa mieszanie powinno by ć prowadzone za os łoną bezpiecze ń­
stwa umieszczon ą między operatorem a mieszanin ą. Jeżeli miesza ­
nina zapali si ę podczas mieszania lub nape łniania, nie b ędą 
konieczne żadne dalsze badania. Mieszanina jest podawana do 
komory ci śnieniowej ma łymi porcjami z lekkim ubijaniem. Nale ży 
przy tym zapewni ć, żeby była dobrze upakowana wokó ł cewki 
zapłonowej i żeby się z nią dobrze styka ła. Ważne jest, żeby nie 
poruszyć cewki podczas procesu upakowywania, poniewa ż może to 
prowadzić do błędnych wyników (  3 ). Membrana bezpiecze ństwa jest 
umieszczana na swoim miejscu, a nakr ętka zabezpieczaj ąca jest 
mocno przykr ęcana. Na ładowana komora jest przenoszona 
membran ą bezpiecze ństwa do góry do stojaka, który powinien by ć 
umieszczony w odpowiednim, opancerzonym dygestorium lub komorze zap łonowej. Do zewn ętrznych ko ńcówek zap łonnika 
podłącza się zasilanie i podaje pr ąd o natężeniu 10 A. Czas od 
rozpoczęcia mieszania do w łączenia zasilania nie powinien przekra ­
czać 10 min.
 
Sygnał generowany przez przetwornik ci śnieniowy jest zapisywany 
przez odpowiedni system, który pozwala zarówno na ocen ę, jak 
i tworzenie ci ągłego zapisu profilu zmiany ci śnienia w czasie 
(np. przej ściowy rejestrator pod łączony do rejestratora graficznego). 
Mieszanina jest ogrzewana a ż do przerwania membrany bezpiecze ń­
stwa lub do up ływu 60 s. Je żeli membrana bezpiecze ństwa 
nie zostanie zerwana, nale ży pozwoli ć mieszaninie ostygn ąć 
przed ostro żnym demonta żem aparatury, podejmuj ąc środki 
bezpiecze ństwa na wypadek wzrostu ci śnienia. Z substancj ą badaną 
i z substancj ą(-ami) odniesienia wykonuje si ę pięć prób. Zapisywany 
jest czas potrzebny na zwi ększenie ci śnienia od 690 kPa do 2 070 
kPa powy żej ciśnienia atmosferycznego. Obliczany jest średni czas 
wzrostu ci śnienia.  
W niektórych przypadkach substancje mog ą wytwarza ć wzrost 
ciśnienia (zbyt du ży lub zbyt ma ły) wskutek reakcji chemicznych 
niecharakteryzuj ących właściwości utleniaj ących substancji. W tych 
przypadkach do wyja śnienia przebiegu reakcji mo że być konieczne 
powtórzenie badania z substancj ą obojętną np. diatomitem (ziemia 
okrzemkowa) zamiast celulozy.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) Mieszaniny utleniaczy z celuloz ą muszą być traktowane jako potencjalnie wybuchowe 
i należy z nimi post ępować z należytą ostrożnością. 
( 2 ) Można to osiągnąć w praktyce, przygotowuj ąc mieszanin ę w stosunku 1:1 cieczy prze ­
znaczonej do badania i celulozy z ilo ści większej, ni ż jest potrzebna, do próby 
i przenosz ąc 5 ± 0,1 g do komory ci śnieniowej. Mieszanina powinna by ć świeżo przy­
gotowywana do ka żdej próby. 
( 3 ) W szczególno ści należy unikać zetknięcia sąsiednich zwojów cewki.
 2. DANE  
Czasy wzrostu ci śnienia zarówno dla substancji badanej, jak 
i substancji odniesienia. Czasy wzrostu ci śnienia dla bada ń 
z substancj ą obojętną, jeżeli zostały przeprowadzone.  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Oblicza si ę średnie czasy wzrostu ci śnienia zarówno dla substancji 
badanej, jak i dla substancji odniesienia.  
Oblicza si ę średni czas wzrostu ci śnienia dla bada ń z substancj ą 
obojętną (jeżeli przeprowadzono).  
Przykładowe wyniki zosta ły przedstawione w tabeli 1.  
Tabela 1  
Przykładowe wyniki  ( a ) 
Substancja (  b ) Średnia warto ść wzrostu ci śnienia dla mieszaniny 1:1 
z celulozą 
(ms) 
Dwuchromian amonu; nasycony roztwór wodny 20 800 
Azotan amonu, nasycony roztwór wodny 6 700 Azotan żelaza, nasycony roztwór wodny 4 133 
Nadchloran litu, nasycony roztwór wodny 1 686 Nadchloran magnezu, nasycony roztwór wodny 777 Azotan niklu, nasycony roztwór wodny 6 250 Kwas azotowy, 65 % 4 767 (
 c ) 
Kwas nadchlorowy, 50 % 121 (  c ) 
Kwas nadchlorowy, 55 % 59 Azotan potasu, 30 % roztwór wodny 26 690 Azotan srebra, nasycony roztwór wodny (
 d ) 
Chloran sodu, 40 % roztwór wodny 2 555 (  c ) 
Azotan sodu, 45 % roztwór wodny 4 133  
Substancja oboj ętna 
Woda: celuloza (  d ) 
( a ) Zob. poz. lit. (1) dla klasyfikacji wed ług programu transportu ONZ. 
( b ) Roztwór nasycony powinien zosta ć przygotowany w 20  o C. 
( c ) Warto ść średnia dla mi ędzylaboratoryjnych prób porównawczych. 
( d ) Nie osi ągnięto maksymalnego ci śnienia 2 070 kPa.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno zawiera ć następujące informacje:  
— identyfikacj ę, skład, stopie ń czystości itp. badanej substancji,  
— stężenie badanej substancji,  
— procedur ę suszenia celulozy,  
— zawarto ść wody w u żytej celulozie,  
— wyniki pomiarów,  
— ewentualne wyniki bada ń z zastosowaniem substancji oboj ętnej, 
— obliczone średnie czasy wzrostu ci śnienia,  
— jakiekolwiek odchylenia od tej metody i ich przyczyny,  
— wszystkie dodatkowe informacje lub uwagi istotne dla interpre ­
tacji wyników.  
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW (  1 ) 
Wyniki s ą oceniane na podstawie:  
a) czy mieszanina substancji badanej i celulozy zapala si ę sponta­
nicznie; oraz  
b) porównania średniego czasu potrzebnego do wzrostu ci śnienia od 
690 kPa do 2 070 kPa z t ą samą wartością dla substancji odnie ­
sienia.  
Ciecz jest uznawana za utleniacz, je żeli: 
a) mieszanina w stosunku wagowym 1:1 badanej substancji 
i celulozy zapala si ę spontanicznie; lub  
b) mieszanina w stosunku wagowym 1:1 substancji badanej 
i celulozy wykazuje średni czas wzrostu ci śnienia ni ższy lub 
równy średniemu czasowi wzrostu ci śnienia mieszaniny 1:1, 
wagowo, dla 65 % (m/m) roztworu wodnego kwasu azotowego i celulozy.
 
Aby unikn ąć fałszywych wyników pozytywnych, w razie potrzeby 
przy interpretacji wyników nale ży również uwzględnić wyniki otrzy ­
mane w badaniu substancji z materia łem obojętnym.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Zob. pozycja bibliograficzna (1) w celu interpretacji wyników wed ług programu trans ­
portu ONZ.
 4. BIBILIOGRAFIA  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, 
Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. Publikacja ONZ Nr: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, s. 342. Badanie O.2: 
Badanie na utlenianie cieczy.
 
Rysunek 1  
Komora ci śnieniowa
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Rysunek 2  
Stojak
  
Rysunek 3  
Układ zapłonu
 
Uwaga: Mo że zostać użyta którakolwiek z tych konfiguracji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  WA ŻONA D ŁUGOŚCIĄ ŚREDNIA GEOMETRYCZNA 
ŚREDNICA W ŁÓKIEN  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
W opisie metody przedstawiono procedur ę stosowan ą do określenia 
ważonej długością średniej geometrycznej średnicy w łókna 
(LWGMD) sztucznych w łókien mineralnych luzem (MMMF). 
Ponieważ LWGMD populacji z prawdopodobie ństwem 95 % znaj ­
dzie się między dwoma 95 % poziomami ufno ści (LWGMD ± dwa 
błędy standardowe) próby, warto ścią przedstawian ą (wartością 
testową) będzie niższy przedzia ł ufności próby (tj. LWGMD — 2 
błędy standardowe). Metoda opiera si ę na aktualizowanej (czerwiec 
1994) wst ępnej wersji procedury HSE w przemy śle, uzgodnionej na 
spotkaniu ECFIA z HSE w Chester 26.09.1993 i opracowanej dla 
i na podstawie wyników drugiego testu mi ędzylaboratoryjnego 
(1, 2). Ta metoda pomiaru mo że być stosowana do charakteryzo ­
wania średnicy w łókien substancji luzem lub produktów zawieraj ­ 
ących MMMF, w tym ogniotrwa łych włókien ceramicznych (RCF), 
sztucznych w łókien szklistych (MMVF), w łókien krystalicznych 
i polikrystalicznych.  
Ważenie długością jest sposobem kompensowania efektu rozk ładu 
średnicy w łókien, spowodowanego łamaniem si ę długich włókien 
w czasie pobierania próbek lub manipulowania materia łem. Do 
pomiaru rozk ładu średnic MMMF stosuje si ę parametry statystyczne 
(średnia geometryczna), poniewa ż średnice te maj ą zwykle rozk ład 
wielkości zbliżony do lognormalnego.  
Pomiar d ługości, a także średnicy, jest żmudny i czasoch łonny, ale 
jeśli mierzone s ą tylko te w łókna, które dotykaj ą nieskończenie cien ­
kiej linii w polu widzenia skaningowego mikroskopu elektronowego, to prawdopodobie ństwo wybrania danego w łókna jest proporcjonalne 
do jego d ługości. Poniewa ż w obliczeniach wa żonych długością 
uwzględniona jest d ługość, to jedyn ą wymagan ą miarą jest średnica 
i LWGMD-2SE mo że być obliczana, jak opisano.
 
1.2. DEFINICJE  
Cząstka: obiekt o stosunku d ługości do szeroko ści mniejszym 
niż 3:1.  
Włókno : obiekt o stosunku d ługości do szeroko ści (wydłużenie) co 
najmniej 3:1.  
1.3. ZAKRES I OGRANICZENIA  
Metoda ta zosta ła opracowana w celu obserwacji rozk ładu średnic, 
które charakteryzuj ą się medianą od 0,5 μm do 6 μm. Większe 
średnice mog ą być mierzone przy zastosowaniu mniejszego powi ęk­
szenia mikroskopu, ale zastosowanie metody jest coraz bardziej ograniczone w miar ę zmniejszania si ę włókien i dla mediany średnic 
poniżej 0,5 μm zaleca si ę stosowanie TEM (transmisyjny mikroskop 
elektronowy).
 ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. ZASADA METODY TESTOWEJ  
Z włókniny lub w łókien luzem pobierana jest pewna liczna repre ­
zentatywnych próbek rdzeniowych. W procedurze kruszenia zmniejsza si ę długość włókien luzem i reprezentatywna podpróbka 
jest rozprowadzana w wodzie. Alikwoty s ą ekstrahowane i filtrowane 
przez filtry poliw ęglanowe o otworach 0,2 μm i przygotowywane do 
badań przy zastosowaniu techniki skaningowego mikroskopu elek ­
tronowego (SEM). Średnice w łókien są mierzone przy powi ększeniu  
× 10 000 lub wi ększym (
 1 ) przy zastosowaniu metody przeci ęcia 
linii, aby otrzyma ć nieprzek łamaną szacunkow ą wielkość średnicy. 
Obliczany jest ni ższy 95 % przedzia ł ufności (na podstawie testu 
jednostronnego) w celu uzyskania szacunkowej najni ższej warto ści 
średniej geometrycznej średnicy w łókien materia łu. 
1.5. OPIS METODY TESTOWEJ  
1.5.1.  Bezpiecze ństwo/środki ostro żności 
Należy ogranicza ć kontakt z zawieszonymi w powietrzu w łóknami 
i przy manipulowaniu suchymi w łóknami nale ży stosowa ć wyciąg 
lub komor ę rękawicową. Należy przeprowadza ć okresowy monito ­
ring ekspozycji w celu okre ślenia skuteczno ści zastosowanych metod 
zabezpieczenia. Przy pracy z MMMF nale ży używać rękawic jedno ­
razowych, aby zmniejszy ć podrażnienie skóry i zapobiec ska żeniu 
krzyżowemu.  
1.5.2.  Aparatura/sprz ęt 
— Prasa (o nacisku co najmniej 10 MPa) i formy,  
— poliw ęglanowy filtr o porach kapilarnych średnicy 0,2 μm (śred­
nica filtra 25 mm),  
— celulozowy filtr membranowy stosowany jako filtr wst ępny, 
— szklana aparatura filtracyjna (lub jednorazowe systemy filtra ­
cyjne) do umocowania filtrów (np. szklany zestaw do mikroana ­
lizy Millipore, typ nr XX10 025 00),  
— świeżo destylowana woda, która zosta ła przefiltrowana przez filtr 
o średnicy porów 0,2 μm w celu usuni ęcia mikroorganizmów,  
— napylarka do napylania z łotem lub z łotem/palladem,  
— skaningowy mikroskop elektronowy o rozdzielczo ści do 10 nm 
i mogący pracowa ć przy powi ększeniu × 10 000,  
— dodatkowe: szpatu łki, ostrza skalpeli typ 24, pincety, rurki SEM, 
klej węglowy lub w ęglowa taśma klejąca, srebro koloidalne,  
— sonda ultrad źwiękowa lub podr ęczna myjka ultrad źwiękowa,  
— urządzenie do pobierania próbek rdzeniowych lub korkoci ąg do 
pobierania próbek rdzeniowych z w łókniny MMMF.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Ta skala powi ększenia jest wskazana dla w łókien 3 μm, dla w łókien 6 μm właściwsze 
może być powiększenie × 5 000.
 1.5.3.  Procedura testowa  
1.5.3.1.  Pobieranie próbek  
W przypadku w łókniny i p łatów materia łu do pobierania prób prze ­
kroju stosuje si ę 25 mm urz ądzenie do pobierania prób rdzeniowych 
lub korkoci ąg. Próbki powinny by ć pobierane z miejsc rozmieszczo ­
nych równomiernie na ca łej szeroko ści włókniny, je śli ma ona 
niewielką długość lub miejsc losowych w przypadku d ługich płatów 
włókniny. Te same urz ądzenia mog ą być używane do pobierania 
losowych próbek z w łókien luzem. Je śli to możliwe należy pobiera ć 
sześć próbek, aby uwzgl ędnić zróżnicowanie przestrzenne materia łu 
luzem.  
Sześć próbek rdzeniowych nale ży pokruszy ć w formie o średnicy 
50 mm, stosuj ąc nacisk 10 MPa. Materia ł mieszany jest szpatu łką 
i powtórnie prasowany przy zastosowaniu nacisku 10 MPa. Materia ł 
następnie wyjmuje si ę z formy i umieszcza w szczelnej szklanej 
butelce.  
1.5.3.2.  Przygotowanie próby  
Jeśli to konieczne, mo żna usunąć organiczny środek wiążący przez 
umieszczenie w łókien na oko ło 1 godzin ę w piecu o temperaturze 
450 °C.  
Próby podzieli ć przez sto żkowanie i ćwiartkowanie (nale ży to zrobi ć 
w komorze odpylaj ącej). 
Szpatułką dodać niewielk ą ilość (< 0,5 g) próbki do 100 ml świeżo 
destylowanej wody, która zosta ła przefiltrowana przez filtr membra ­
nowy 0,2 μm (można użyć alternatywnych źródeł ultraczystej wody, 
jeśli wykazano, że są zadowalaj ącej jako ści). Rozprowadzi ć 
dokładnie sond ą ultradźwiękową przy mocy roboczej 100 W, usta ­
wionej tak, aby zachodzi ła kawitacja. (Je śli nie ma sondy zastosowa ć 
następującą metodę: wytrząsać wielokrotnie i odwróci ć na 30 
sekund; umie ścić w myjce ultrad źwiękowej na pi ęć minut; nast ępnie 
wielokrotnie wytrz ąsać i odwróci ć ponownie na 30 sekund).  
Natychmiast po rozproszeniu w łókien pobra ć kilka alikwot (np. trzy 
alikwoty 3, 6 i 10 ml) przy u życiu szerokiej pipety (pojemno ści 
2–5 ml).  
Każdą alikwotę przefiltrowa ć próżniowo przez 0,2 μm filtr poliw ęg­
lanowy z dodatkowym filtrem wst ępnym MEC o średnicy porów 5 
μm, stosuj ąc 25 mm szklany lejek z cylindrycznym zbiornikiem. Do 
lejka nale ży wlać 5 ml przefiltrowanej wody destylowanej, 
a alikwot ę należy wolno pipetowa ć do wody, przy czym jej 
końcówka powinna znajdowa ć się poniżej menisku. Po pipetowaniu 
należy dokładnie spłukać pipetę i zbiorniczek, poniewa ż cienkie 
włókna często zalegaj ą na powierzchni.  
Uważnie wyjąć filtr i przed umieszczeniem w naczyniu do suszenia 
oddzielić go od dodatkowego filtra.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Odciąć ćwiartkę lub połowę przekroju filtru przefiltrowanego osadu 
ostrzem skalpela typu 24, stosuj ąc ruch wahad łowy. Ostro żnie przy­
mocować odcięty przekrój do stolika SEM, stosuj ąc klej węglowy 
lub węglową taśmę klejącą. Srebro koloidalne nale ży nałożyć przy­
najmniej w trzech miejscach, aby zapewni ć lepszy kontakt elek ­
tryczny na kraw ędziach filtra i stolika. Po wyschni ęciu kleju/srebra 
koloidalnego napyli ć ok. 50 nm warstw ę złota lub z łota/palladu na 
powierzchni ę osadu.  
1.5.3.3.  Kalibracja i obs ługa SEM  
1.5.3.3.1. K a l i b r a c j a  
Kalibracja SEM powinna by ć sprawdzana przynajmniej raz 
w tygodniu (najlepiej codziennie) przy u życiu certyfikowanej siatki 
kalibracyjnej. Kalibracja powinna by ć porównywana 
z certyfikowanym wzorcem i je śli zmierzona warto ść (SEM) nie 
mieści się w granicach ± 2 % warto ści wzorcowej, nale ży przepro ­
wadzić kalibracj ę SEM i powtórzy ć kontrolę. 
Mikroskop SEM powinien mie ć rozdzielczo ść wystarczaj ącą co 
najmniej do zidentyfikowania widzialnej średnicy 0,2 μm przy 
użyciu prawdziwego materia łu próbki przy powi ększeniu × 2 000.  
1.5.3.3.2. O b s ł u g a  
SEM powinien dzia łać przy powi ększeniu 10 000 razy (  1 ) 
w warunkach, które zapewniaj ą dobrą rozdzielczo ść, przy mo żliwej 
do przyjęcia jakości obrazu i przy niskiej pr ędkości skanowania, na 
przykład 5 sekund na obraz. Wprawdzie wymagania operacyjne 
mogą się różnić w przypadku poszczególnych SEM, ale generalnie, 
aby otrzyma ć najlepsz ą widzialno ść i rozdzielczo ść z materia łami 
o stosunkowo niskiej masie atomowej powinno si ę stosować napięcia 
przyspieszaj ące 5–10 keV, przy stosunkowo ma łej średnicy plamki 
i niewielkiej odleg łości roboczej. Poniewa ż przeprowadzane jest 
przesuwanie liniowe, nale ży zastosowa ć pochylenie 0°, aby zmini ­
malizowa ć konieczno ść ponownego ustawienia ogniskowej lub, je śli 
SEM wyposa żony jest w stolik eucentryczny, nale ży zastosowa ć 
eucentryczn ą odległość roboczą. Mniejsze powi ększenia mo żna 
stosować, jeśli materia ł nie zawiera ma łych (pod wzgl ędem średnicy) 
włókien i wszystkie średnice w łókien są > 5 μm. 
1.5.3.4.  Rozmiary  
1.5.3.4.1. B a d a n i e p r z y m a ł y m p o w i ę k s z e n i u , a b y o c e n i ć 
p r ó b k ę 
Najpierw nale ży obejrze ć próbkę przy ma łym powi ększeniu, aby 
sprawdzić, czy wyst ępują skupienia du żych włókien i oceni ć gęstość 
włókien. W przypadku nadmiernej grudkowato ści zaleca si ę przygo­
towanie nowej próbki.  
Aby zapewni ć statystyczn ą dokładność konieczne jest zmierzenie 
minimalnej liczby w łókien, a wysoka g ęstość włókien mo że zostać 
uznana za przydatn ą właściwość, poniewa ż badanie pustych pól jest 
czasochłonne i niewiele wnosi do analizy. Je śli jednak filtr jest 
przeładowany, dokonanie pomiaru wszystkich mo żliwych do zmie ­
rzenia włókien staje si ę trudne, a poniewa ż małe włókna mog ą być 
zasłaniane przez wi ększe, można je przeoczy ć. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) W przypadku w łókien 3 μm zob. poprzedni przypis.
 Tendencja do pope łniania błędu przeszacowania LWGMD mo że 
wynikać z gęstości włókien powy żej 150 włókien na milimetr linio ­
wego przesuni ęcia. Z drugiej strony niskie zag ęszczenie w łókien 
wydłuża czas analizy i cz ęsto przygotowanie próbki 
z zagęszczeniem w łókien bli ższym optimum jest bardziej ekono ­
miczne ni ż poleganie na zliczeniach na filtrach o niskim zag ęszcze­
niu. Przy optymalnym zag ęszczeniu, na pole widzenia przy powi ęk­
szeniu 5 000 razy powinno przypada ć średnio jedno lub dwa poli ­
czalne włókna. Optymalne zag ęszczenie zale ży jednak od wielko ści 
(średnicy) w łókien, tak wi ęc konieczne jest, aby operator korzysta ł 
ze specjalistycznych ocen, które pozwol ą mu stwierdzi ć czy zagęsz­
czenie włókien jest bliskie optymalnemu czy nie.  
1.5.3.4.2. W a ż e n i e d ł u g o ś c i ą ś r e d n i c w ł ó k i e n  
Liczone s ą tylko te w łókna, które dotykaj ą (lub przecinaj ą) (nieskoń­
czenie) cienkiej linii na ekranie SEM. Z tego powodu przez środek 
ekranu przebiega pozioma (lub pionowa) linia.  
Alternatywn ą możliwością jest umieszczenie jednego punktu na 
środku ekranu i sta łe skanowanie przez filtr w jednym kierunku. 
Średnica ka żdego włókna o wspó łczynniku smuk łości większym 
niż 3:1 i dotykaj ącym tego punktu lub go przecinaj ącym jest 
mierzona, a wyniki s ą rejestrowane.  
1.5.3.4.3. W y z n a c z a n i e w i e l k o ś c i w ł ó k i e n  
Zaleca si ę, aby zmierzy ć co najmniej 300 w łókien. Ka żde włókno 
mierzone jest tylko raz w punkcie przeci ęcia z lini ą lub punktem 
narysowanym na obrazie (lub blisko punktu przeci ęcia, jeśli brzegi 
włókna są niewyraźne). Jeśli napotyka si ę włókna o niejednorodnym 
przekroju, nale ży stosowa ć miarę mówiącą o średniej średnicy 
włókna. Nale ży zachowa ć ostrożność przy wyznaczaniu kraw ędzi 
i mierzeniu najmniejszej odleg łości między brzegami w łókien. 
Pomiary mog ą być przeprowadzane  on-line  lub off-line  na zapisa ­
nych obrazach lub fotografiach. Zaleca si ę stosowanie pó łautoma­
tycznych systemów pomiarów obrazu, które ładują dane 
bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego, poniewa ż oszczędzają one 
czas, eliminuj ą błędy transkrypcji, a obliczenia mog ą być zautoma ­
tyzowane.  
Końce długich włókien powinny by ć sprawdzane przy ma łych 
powiększeniach, aby upewni ć się, że włókna te nie zwijaj ą się z 
powrotem, nie wracaj ą do pola widzenia i że są mierzone tylko raz.  
2. DANE  
2.1. POST ĘPOWANIE Z WYNIKAMI  
Zwykle średnice w łókien nie odbiegaj ą od rozk ładu normalnego. 
Dokonując jednak przekszta łcenia logarytmicznego, mo żliwe jest 
uzyskanie rozk ładu, który w przybli żeniu odpowiada normalnemu.  
Obliczyć średnią arytmetyczn ą (średnia lnD) i odchylenie standar ­
dowe (SD  lnD ) wartości logarytmu logarytmu naturalnego (lnD) 
średnic n w łókien (D). 
średnia lnD ¼ ΣlnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
ΣðlnD – średnia lnDÞ 2 
n – 1 s 
(2) 
Odchylenie standardowe dzieli si ę przez pierwiastek kwadratowy 
liczby pomiarów (n) w celu obliczenia b łędu standardowego (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Odjąć dwa błędy standardowe od średniej i obliczy ć wykładnik dla 
tej wartości (średnia minus dwa b łędy standardowe), aby otrzyma ć 
średnią geometryczn ą minus dwa b łędy standardowe. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðśrednia lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. RAPORTOWANIE  
RAPORT Z TESTU  
Raport z przeprowadzonego testu musi zawiera ć przynajmniej nast ę­
pujące informacje:  
— warto ść LWGMD-2SE,  
— wszelkie odst ępstwa od procedury, a w szczególno ści te, które 
mogą mieć wpływ na precyzj ę lub dok ładność wyników, 
z odpowiednimi wyja śnieniami.  
4. LITERATURA  
(1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
(2) G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to 
measure the length-weighted geometric mean fibre diameter: Results 
of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Labora ­
tory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23.  WSPÓŁCZYNNIK PODZIA ŁU (1-OKTANOL/WODA): METODA 
POWOLNEGO MIESZANIA  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 123 (2006). Warto ści współczyn­
nika podzia łu 1-oktanol/woda (P  OW ) aż do log P  OW = 8,2 wyznaczono 
w sposób dok ładny za pomoc ą metody powolnego mieszania (1). Jest to 
zatem podej ście eksperymentalne odpowiednie do bezpo średniego wyzna ­
czania P  OW dla silnie hydrofobowych substancji.  
2. Inne metody wyznaczania wspó łczynnika podzia łu 1-oktanol/woda (P  OW ) to 
metoda wytrz ąsania w kolbie (2) oraz wyznaczanie P  OW za pomoc ą badania 
retencji w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) 
z odwróconymi fazami (3). Metoda wytrz ąsania w kolbie jest podatna na 
artefakty zwi ązane z przechodzeniem mikrokropelek oktanolu do fazy 
wodnej. W miar ę wzrostu P  OW obecność tych kropelek w fazie wodnej 
prowadzi do coraz wi ększego przeszacowywania st ężenia substancji badanej 
w wodzie. Zastosowanie metody jest zatem ograniczone do substancji o log 
P OW < 4. Druga metoda oparta jest na wiarygodnych, bezpo średnio wyzna ­
czonych warto ściach P  OW , które służą do kalibracji zale żności pomiędzy 
retencją w HPLC a mierzonymi warto ściami P  OW . Dostępny był projekt 
wytycznych OECD w sprawie wyznaczania wspó łczynników podzia łu 1- 
oktanol/woda dla substancji podatnych na dysocjacj ę (4), ale nie nale ży 
już z nich korzysta ć. 
3. Niniejsz ą metodę badawcz ą opracowano w Niderlandach. Precyzja opisanej 
tutaj metody zosta ła zwalidowana i zoptymalizowana w mi ędzylaborato ­
ryjnym badaniu walidacyjnym, w którym bra ło udział 15 laboratoriów (5).  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE  
Znaczenie i zastosowanie  
4. Wykazano, że dla oboj ętnych substancji organicznych wyst ępuje bardzo 
istotna zale żność pomiędzy wspó łczynnikiem podzia łu 1-oktanol/woda 
(P OW ) a ich bioakumulacj ą w rybach. Wykazano ponadto, że P  OW jest 
skorelowany z toksyczno ścią dla ryb, jak równie ż z sorpcj ą substancji 
chemicznych przez cia ła stałe takie jak gleby i osady. Wyczerpuj ący prze­
gląd tych zale żności znajduje si ę w pozycji literaturowej (6).  
5. Okre ślono wiele ró żnorodnych zale żności pomiędzy wspó łczynnikiem 
podziału 1-oktanol/woda a innymi w łaściwościami substancji maj ącymi 
znaczenie dla toksykologii i chemii środowiska. W rezultacie wspó łczynnik 
podziału 1-oktanol/woda sta ł się kluczowym parametrem w szacowaniu 
ryzyka stosowania chemikaliów dla środowiska, jak równie ż 
w przewidywaniu losów chemikaliów w środowisku.  
Zakres  
6. Doświadczenie oparte na powolnym mieszaniu w za łożeniach ma na celu 
ograniczenie tworzenia mikrokropelek 1-oktanolu w fazie wodnej. 
W rezultacie nie dochodzi do przeszacowania st ężenia w roztworze wodnym 
będącego skutkiem obecno ści cząsteczek substancji badanej w takich kropel ­
kach. Metoda powolnego mieszania nadaje si ę zatem szczególnie do wyzna ­
czania P  OW dla substancji, dla których oczekiwana warto ść log P  OW wynosi 
5 i więcej i dla których metoda wytrz ąsania w kolbie (2) mo że dawać 
błędne wyniki.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINICJA I JEDNOSTKI  
7. Wspó łczynnik podzia łu substancji mi ędzy wodę a rozpuszczalnik lipofilowy 
(1-oktanol) jest miar ą podziału w stanie równowagi danej substancji mi ędzy 
dwie fazy. Wspó łczynnik podzia łu między wodę a 1-oktanol (P  OW ) definiuje 
się jako stosunek st ężeń w stanie równowagi substancji badanej w 1-okta ­
nolu nasyconym wod ą (C O ) i w wodzie nasyconej 1-oktanolem (C  W ). 
P OW ¼ C O=C W 
Jako stosunek st ężeń jest to wielko ść bezwymiarowa. Najcz ęściej podawana 
jest w formie logarytmu dziesi ętnego (log P  OW ). Współczynnik P  OW zależy 
od temperatury i podawane dane powinny obejmowa ć temperatur ę pomiaru.  
ZASADA METODY  
8. Aby wyznaczy ć współczynnik podzia łu, ustala si ę stan równowagi dla 
wody, 1-oktanolu i substancji badanej zmieszanych ze sob ą w stałej tempe­
raturze. Nast ępnie wyznacza si ę stężenia substancji badanej w obu fazach.  
9. W proponowanym tutaj do świadczeniu metod ą powolnego mieszania mo żna 
ograniczy ć problemy zwi ązane z tworzeniem mikrokropelek 
w doświadczeniu metod ą wytrząsania w kolbie. W do świadczeniu metod ą 
powolnego mieszania stan równowagi dla wody, 1-oktanolu i substancji badanej ustala si ę w reaktorze z termostatem, w którym zachodzi mieszanie. 
Przyspiesza ono wymian ę pomiędzy fazami. Mieszanie wprowadza 
niewielkie turbulencje zwi ększające stopień wymiany mi ędzy 1-oktanolem 
a wodą bez tworzenia mikrokropelek (1).
 
ZAKRES ZASTOSOWANIA METODY BADANIA  
10. Poniewa ż na wspó łczynnik aktywno ści substancji badanej mo że wpłynąć 
obecność innych substancji, nale ży badać substancj ę w formie czystej. Do 
wyznaczania wspó łczynnika podzia łu 1-oktanol/woda nale ży użyć substancji 
o największym stopniu czysto ści, jaka jest dost ępna w handlu.  
11. Niniejsza metoda ma zastosowanie do substancji czystych, które nie ulegaj ą 
dysocjacji ani asocjacji i nie wykazuj ą znaczącej aktywno ści na granicy faz. 
Metodę można stosowa ć do wyznaczania wspó łczynnika podzia łu 1-oktanol/ 
woda takich substancji oraz mieszanin. W przypadku stosowania tej metody 
do mieszanin wyznaczone wspó łczynniki podzia łu 1-oktanol/woda s ą 
warunkowe i zale żą od składu chemicznego badanej mieszaniny oraz od 
składu elektrolitowego fazy wodnej. Metod ę można równie ż zastosowa ć, 
pod warunkiem podj ęcia dodatkowych kroków, do zwi ązków dysocjuj ących 
lub asocjuj ących (pkt 12).  
12. Poniewa ż przy podziale substancji dysocjuj ących, takich jak kwasy orga ­
niczne i fenole oraz zasady organiczne i zwi ązki metaloorganiczne, 
w wodzie i 1-oktanolu wyst ępuje wiele stanów równowagi, wspó łczynnik 
podziału 1-oktanol/woda jest w takich przypadkach sta łą warunkow ą, której 
wartość jest silnie zale żna od składu elektrolitowego (7) (8). Wyznaczenie 
współczynnika podzia łu 1-oktanol/woda wymaga zatem kontrolowania 
i podania w sprawozdaniu warto ści pH oraz sk ładu elektrolitowego podczas 
doświadczenia. Do oceny tych wspó łczynników podzia łu wymagana jest 
specjalistyczna wiedza. Na podstawie sta łej (stałych) dysocjacji nale ży 
wybrać odpowiednie warto ści pH, takie, aby wyznaczy ć współczynnik 
podziału dla każdego stopnia jonizacji. Przy badaniu zwi ązków metaloorga ­
nicznych wymagane jest stosowanie takich substancji buforowych, które nie 
tworzą kompleksów (8). Nale ży dobrać warunki do świadczenia, uwzgl ęd­
niając aktualny stan wiedzy na temat chemii roztworów wodnych (sta łych 
trwałości kompleksów, sta łych dysocjacji), w taki sposób, aby mo żna było 
oszacowa ć specjację chemiczn ą substancji badanej w fazie wodnej. Nale ży 
zapewnić identyczn ą moc jonow ą we wszystkich do świadczeniach poprzez 
zastosowanie elektrolitu podstawowego.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. Przy badaniu substancji o bardzo ma łej rozpuszczalno ści w wodzie lub 
wysokim P  OW mogą pojawić się problemy w zwi ązku ze st ężeniami 
substancji w wodzie tak niskimi, że ich dok ładne oznaczenie b ędzie trudne. 
Niniejsza metoda badawcza obejmuje wytyczne w zakresie rozwi ązywania 
tego problemu.  
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ  
14. Nale ży stosowa ć odczynniki czyste do analizy lub o wy ższej klasie czys ­
tości. Zaleca si ę stosowanie nieznakowanych substancji badanych o znanym 
składzie chemicznym i preferowanej czysto ści co najmniej 99 % lub znako ­
wanych izotopowo substancji badanych o znanym sk ładzie chemicznym 
i czystości radiochemicznej. W przypadku u życia znacznika o krótkim 
czasie po łowicznego rozpadu nale ży zastosowa ć poprawki na rozpad. 
W przypadku substancji badanych znakowanych izotopowo nale ży zasto­
sować specyficzn ą chemicznie metod ę analityczn ą w celu zagwarantowania, 
że mierzona promieniotwórczo ść jest bezpo średnio zwi ązana z substancj ą 
badaną. 
15. Oszacowanie log P  OW można uzyska ć za pomoc ą dostępnego w handlu 
oprogramowania do szacowania log P  OW lub też przy pomocy stosunku 
rozpuszczalno ści w obu rozpuszczalnikach.  
16. Przed wyznaczeniem P  OW metodą powolnego mieszania powinny by ć znane 
następujące informacje na temat substancji badanej:  
a) wzór strukturalny;  
b) metody analityczne odpowiednie do oznaczenia st ężenia danej sunstancji 
w wodzie i w 1-oktanolu;  
c) stała (stałe) dysocjacji substancji podatnych na dysocjacj ę (wytyczna 
OECD nr 112 (9));  
d) rozpuszczalno ść w wodzie (10);  
e) hydroliza abiotyczna (11);  
f) szybka biodegradowalno ść (12);  
g) prężność pary (13).  
OPIS METODY  
Wyposażenie i przyrz ąd 
17. Wymagane jest standardowe wyposa żenie laboratoryjne, w szczególno ści 
następujące sprzęty: 
— mieszad ła magnetyczne i pokryte teflonem mieszad ła magnetyczne 
służące do mieszania fazy wodnej,  
— instrumenty analityczne odpowiednie do oznaczania st ężenia substancji 
badanej na oczekiwanych poziomach st ężenia,  
— naczynie do mieszania z zaworem w dolnej cz ęści. W zale żności od 
oszacowania log P  OW i granicy wykrywalno ści (LOD) zwi ązku bada ­
nego nale ży rozważyć zastosowanie naczynia reakcyjnego o takiej samej 
geometrii i pojemno ści większej niż litr, tak aby mo żna było uzyska ć 
wystarczaj ącą objętość wody do celów ekstrakcji i analizy chemicznej. 
Dzięki temu uzyskane zostanie wy ższe stężenie w wyci ągu wodnym 
i oznaczenie analityczne b ędzie bardziej wiarygodne. Tabela 
z podanymi oszacowaniami minimalnej potrzebnej obj ętości, LOD dla 
danego zwi ązku, szacowanej dla niego warto ści log P  OW oraz rozpusz ­
czalności w wodzie znajduje si ę w dodatku 1. Dane w tabeli podano na 
podstawie zale żności pomiędzy log P  OW a stosunkiem rozpuszczalno ści 
w oktanolu i wodzie zgodnie z publikacj ą Pinsuwan  et al.  (14):  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
gdzie:  
SR ¼ S oct=S w (wyrażone jako st ężenia molowe);  
oraz podanej przez Lymana (15) zale żności pozwalaj ącej przewidywa ć 
rozpuszczalno ść w wodzie. Rozpuszczalno ść w wodzie obliczon ą 
według równania podanego w dodatku 1 trzeba traktowa ć jako pierwsze 
oszacowanie. Nale ży zauwa żyć, że użytkownik ma swobod ę 
w szacowaniu rozpuszczalno ści w wodzie dowoln ą metodą, którą uznaje 
się za lepsze odzwierciedlenie zale żności między hydrofobowo ścią 
a rozpuszczalno ścią. W przypadku zwi ązków stałych zaleca si ę na przy­
kład uwzgl ędnienie temperatury topnienia w przewidywaniu rozpusz ­
czalności. Jeżeli stosuje si ę równanie zmodyfikowane, nale ży się upew­
nić, czy równanie s łużące do obliczania rozpuszczalno ści w oktanolu 
nadal jest poprawne. Schematyczny rysunek naczynia z p łaszczem 
szklanym do termostatowania z mieszad łem, o obj ętości ok. 1 litra znaj ­
duje się w dodatku 2. Proporcje naczynia przedstawionego w dodatku 2 
okazały się korzystne i nale ży je utrzyma ć w przypadku u żywania przy ­
rządu o innych rozmiarach,  
— podczas do świadczenia wykonywanego metod ą powolnego mieszania 
konieczny jest sprz ęt do utrzymywania temperatury na sta łym poziomie.  
18. Naczynia powinny by ć wykonane z oboj ętnego materia łu, tak aby efekt 
adsorpcji na powierzchni naczynia by ł nieznaczny.  
Przygotowanie roztworów do badania  
19. Wyznaczenie P  OW należy przeprowadza ć przy u życiu 1-oktanolu 
o najwyższej czysto ści, jaka jest dost ępna w handlu (co najmniej +99 %). 
Zaleca si ę oczyszczanie 1-oktanolu poprzez ekstrakcj ę kwasem, zasad ą 
i wodą, a następnie osuszanie. Do oczyszczania 1-oktanolu mo żna ponadto 
zastosowa ć destylacj ę. Oczyszczony 1-oktanol s łuży do przygotowania stan ­
dardowych roztworów substancji badanych. Woda wykorzystywana w wyznaczeniu P
 OW powinna by ć destylowana w destylatorze szklanym 
lub wykonanym ze szk ła kwarcowego, b ądź uzyskana z uk ładu oczyszcza ­
nia, można też użyć wody o czysto ści HPLC. W przypadku wody destylo ­
wanej wymagane jest filtrowanie przez filtr 0,22 μm, należy także przepro ­
wadzić ślepe próby w celu sprawdzenia, czy w st ężonych ekstraktach nie ma 
zanieczyszcze ń, które mog ą wpływać na substancj ę badaną. W przypadku 
gdy stosowany jest filtr z w łókna szklanego, nale ży go oczy ścić poprzez 
wypalanie przez co najmniej trzy godziny w temperaturze 400 °C.  
20. Oba rozpuszczalniki przed wykonaniem do świadczenia powinny zosta ć 
wzajemnie nasycone w drodze ustalania stanu równowagi w wystarczaj ąco 
dużym naczyniu. Stan równowagi osi ąga się poprzez powolne mieszanie 
układu dwufazowego przez dwa dni.  
21. Wybra ć odpowiednie st ężenie substancji badanej i rozpu ścić substancj ę w 1- 
oktanolu (nasyconym wod ą). Należy wyznaczy ć współczynnik podzia łu 1- 
oktanol/woda w rozcie ńczonych roztworach w 1-oktanolu oraz w wodzie. 
Stężenie substancji badanej nie powinno zatem przekracza ć 70 % jej 
rozpuszczalno ści, przy st ężeniu w obu fazach wynosz ącym maksymalnie 
0,1 M (1). Roztwory w 1-oktanolu u żywane w do świadczeniu musz ą być 
wolne od zawiesiny nierozpuszczonych cz ąstek substancji badanej.  
22. Odpowiedni ą ilość substancji badanej rozpu ścić w 1-oktanolu (nasyconym 
wodą). Jeżeli szacowana warto ść log P  OW przekracza 5, nale ży dopilnowa ć, 
aby roztwory w 1-oktanolu u żywane w do świadczeniu by ły wolne od zawie ­
siny nierozpuszczonych cz ąstek substancji badanej. W tym celu stosuje si ę 
następującą procedur ę dla chemikaliów o szacowanej warto ści log P  OW > 5: 
— substancj ę badaną rozpuścić w 1-oktanolu (nasyconym wod ą), ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— pozostawi ć roztwór na czas wystarczaj ący, aby zawieszone nierozpusz ­
czone cząstki substancji opad ły na dno. Podczas osiadania monitorowa ć 
stężenie substancji badanej,  
— po ustabilizowaniu si ę wartości mierzonych st ężeń w roztworze 1-okta ­
nolu rozcie ńczyć roztwór podstawowy dodaj ąc odpowiedni ą objętość 1- 
oktanolu,  
— wykona ć pomiar st ężenia roztworu podstawowego. Je żeli zmierzone 
stężenie odpowiada rozcie ńczeniu, mo żna użyć rozcieńczonego roztworu 
w doświadczeniu metod ą powolnego mieszania.  
Ekstrakcja i analiza próbek  
23. Do oznaczenia substancji badanej nale ży użyć zwalidowanej metody anali ­
tycznej. Wykonuj ący badanie musz ą wykazać, że stężenia w 1-oktanolu 
nasyconym wod ą oraz w fazie wodnej nasyconej 1-oktanolem podczas 
doświadczenia przekraczaj ą granicę oznaczalno ści w stosowanych metodach 
analitycznych. W przypadkach, w których potrzebne s ą metody ekstrakcji, 
przed doświadczeniem trzeba ustali ć odzysk analityczny substancji badanej 
z fazy wodnej i 1-oktanolu. Sygna ły analityczne nale ży skorygowa ć o ślepą 
próbę i dopilnowa ć, aby nie by ło możliwe przeniesienie analitu z jednej 
próbki do innej.  
24. Przed analiz ą może być potrzebna ekstrakcja fazy wodnej za pomoc ą 
rozpuszczalnika organicznego oraz wst ępne zatężanie ekstraktu w zwi ązku 
z dość niskimi st ężeniami hydrofobowych substancji badanych w fazie 
wodnej. Z tego samego powodu konieczne jest zmniejszenie st ężeń dla 
ewentualnych ślepych prób. W tym celu trzeba stosowa ć rozpuszczalniki 
o wysokiej czysto ści, najlepiej rozpuszczalniki do analizy pozosta łości. 
W unikni ęciu zanieczyszcze ń krzyżowych mo że ponadto pomóc u żywanie 
starannie wyczyszczonego sprz ętu szklanego (np. mytego w rozpuszczalniku 
lub wypalanego w podwy ższonej temperaturze).  
25. Oszacowanie log P  OW można uzyska ć z programu s łużącego do szacowania 
lub na podstawie specjalistycznej wiedzy. Je żeli oszacowana warto ść prze­
kracza 6, nale ży bliżej przyjrze ć się korektom o ślepą próbę oraz przeno ­
szeniu analitu. W przypadku gdy oszacowana warto ść log P  OW jest większa 
od 6, obowi ązkowe jest równie ż zastosowanie wzorca zast ępczego do 
określenia korekty o odzysk, tak aby mo żna było uzyskać wysoki wspó ł­
czynnik zat ężenia wstępnego. W handlu dost ępnych jest szereg programów 
komputerowych s łużących do szacowania log P  OW ( 1 ) , np. Clog P (16), 
KOWWIN (17), ProLogP (18) czy ACD log P (19). Opis metod szacowania 
można znaleźć w pozycjach literaturowych (20–22).  
26. Granice oznaczalno ści (LOQ) dla oznaczania substancji badanej w 1-okta ­
nolu i w wodzie ustali ć zatwierdzonymi metodami. Zasadniczo za granic ę 
oznaczalno ści danej metody mo żna przyjąć takie stężenie w wodzie lub 1- 
oktanolu, dla którego stosunek sygna łu do szumu wynosi 10. Nale ży wybrać 
odpowiedni ą metodę ekstrakcji i zat ężania wstępnego, a tak że określić 
odzysk analityczny. Aby otrzyma ć sygnał o odpowiedniej mocy, przy ozna ­
czaniu analitycznym wybiera si ę odpowiedni wspó łczynnik zat ężania wstęp­
nego.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Informacje te podano tylko dla wygody u żytkowników. Mo żna korzysta ć z innych, 
równoważnych programów komputerowych, je żeli da się wykazać, że wyniki oblicze ń 
są takie same.
 27. Na podstawie parametrów metody analitycznej i oczekiwanych st ężeń 
wyznaczy ć przybliżoną wielkość próbki potrzebnej do dok ładnego ozna ­
czenia st ężenia związku. Nale ży unikać używania próbek fazy wodnej 
zbyt małych, aby uzyska ć wystarczaj ący sygna ł analityczny. Nie nale ży 
również stosowa ć nadmiernie du żych próbek fazy wodnej, poniewa ż 
mogłoby pozosta ć zbyt ma ło wody, aby przeprowadzi ć wymagan ą mini­
malną liczbę analiz (n = 5). W dodatku 1 minimalna obj ętość próbki podana 
jest jako funkcja obj ętości naczynia, granicy wykrywalno ści substancji 
badanej i jej rozpuszczalno ści. 
28. Ilościowego oznaczenia substancji badanych dokonuje si ę poprzez porów ­
nanie z krzywymi kalibracyjnymi dla odpowiedniego zwi ązku chemicznego. 
Wartości stężeń w analizowanych próbkach musz ą mieścić się pomiędzy 
wartościami stężeń wzorców.  
29. W przypadku substancji badanych o szacowanej warto ści log P  OW przekra­
czającej 6 przed ekstrakcj ą należy dodać do próbki fazy wodnej wzorzec 
zastępczy w celu rejestracji strat zachodz ących podczas ekstrakcji 
i wstępnego zat ężania próbek fazy wodnej. Dla dok ładnego obliczenia 
korekty o odzysk wzorce zast ępcze musz ą mieć właściwości bardzo zbli ­ 
żone do substancji badanej lub z ni ą identyczne. Do tego celu najlepiej jest 
użyć analogów danej substancji (trwale) znakowanych izotopowo (np. 
deuterowanych w maksymalnym stopniu lub znakowanych  13 C). Jeżeli nie 
jest możliwe zastosowanie znakowanych izotopów trwa łych, tj.  13 C lub  2 H, 
należy za pomoc ą wiarygodnych danych literaturowych wykaza ć, że właści­
wości fizykochemiczne substancji zast ępczej są bardzo bliskie w łaści­
wościom substancji badanej. Przy ekstrakcji ciecz-ciecz z fazy wodnej 
mogą powstawa ć emulsje. Mo żna to ograniczy ć poprzez dodanie soli 
i pozostawienie emulsji na noc, aby osiad ła. Metody ekstrakcji 
i wstępnego zat ężania próbek trzeba poda ć w sprawozdaniu.  
30. Próbki pobrane z fazy 1-oktanolu mo żna w razie potrzeby rozcie ńczyć 
odpowiednim rozpuszczalnikiem przed analiz ą. Ponadto zaleca si ę użycie 
wzorca zast ępczego do obliczenia korekty o odzysk w przypadku substancji, 
dla których wyniki do świadczeń z odzyskiem wykaza ły dużą zmienno ść 
(względne odchylenie standardowe > 10 %).  
31. Szczegó ły metody analitycznej trzeba zamie ścić w sprawozdaniu. Obejmuje 
to metod ę ekstrakcji, wspó łczynniki wst ępnego zat ężania i rozcie ńczania, 
parametry przyrz ądów, procedur ę kalibracji, zakres kalibracji, odzysk anali ­
tyczny substancji badanej z wody, dodawanie wzorców zast ępczych w celu 
obliczenia korekty o odzysk, warto ści ślepych prób, granice wykrywalno ści 
i granice oznaczalno ści. 
Wykonanie badania  
Optymalny stosunek obj ętości 1-oktanol/woda  
32. Przy dobieraniu odpowiednich obj ętości wody i 1-oktanolu nale ży 
uwzględnić LOQ w 1-oktanolu i wodzie, wspó łczynniki zat ężania wstęp­
nego stosowane do próbek wody, obj ętości próbek pobranych z fazy 1- 
oktanolu i wody oraz oczekiwane st ężenia. Dla u łatwienia do świadczenia 
należy wybrać taką objętość 1-oktanolu w uk ładzie powolnego mieszania, 
aby warstwa 1-oktanolu mia ła grubość wystarczaj ącą (> 0,5 cm) do pobie ­
rania próbek z fazy 1-oktanolu bez jej naruszania.  
33. Typowe obj ętości faz stosowane przy oznaczaniu zwi ązków o log P  OW 
równych 4,5 i wi ęcej to 20–50 ml 1-oktanolu i 950–980 ml wody 
w naczyniu jednolitrowym.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Warunki badania  
34. W trakcie badania za pomoc ą termostatu ustali ć temperatur ę w naczyniu 
reakcyjnym tak, aby ograniczy ć wahania temperatury do warto ści poniżej 
1 °C. Oznaczenie nale ży przeprowadzi ć w temperaturze 25 °C.  
35. Układ doświadczalny nale ży chronić przed światłem słonecznym poprzez 
przeprowadzanie do świadczenia w ciemnym pomieszczeniu albo przykrycie 
naczynia reakcyjnego foli ą aluminiow ą. 
36. Doświadczenie nale ży przeprowadza ć w środowisku wolnym od py łu (w jak 
największym stopniu).  
37. Układ 1-oktanol-woda miesza ć aż do osi ągnięcia stanu równowagi. 
W doświadczeniu pilota żowym ocenia si ę długość okresu ustalania stanu 
równowagi poprzez przeprowadzenie do świadczenia metod ą powolnego 
mieszania i okresowe pobieranie próbek wody oraz 1-oktanolu. Próbki 
należy pobiera ć nie częściej niż co pięć godzin.  
38. Każda procedura wyznaczania P  OW musi obejmowa ć co najmniej trzy nieza ­
leżne doświadczenia metod ą powolnego mieszania.  
Wyznaczanie czasu ustalania stanu równowagi  
39. Przyjmuje si ę, że stan równowagi jest ustalony wtedy, gdy krzywa regresji 
stosunku st ężeń w 1-oktanolu/wodzie wzgl ędem czasu przez cztery punkty 
czasowe ma nachylenie nieró żniące się znacznie od zera przy granicznym 
poziomie istotno ści równym 0,05. Minimalny czas ustalania równowagi 
przed rozpocz ęciem pobierania próbek to jeden dzie ń. Z reguły pobieranie 
próbek substancji o szacowanej warto ści log P  OW mniejszej ni ż 5 można 
przeprowadzi ć na drugi i trzeci dzie ń. W przypadku zwi ązków bardziej 
hydrofobowych mo że zajść konieczno ść wydłużenia czasu ustalania równo ­
wagi. Dla zwi ązku o log P  OW = 8,23 (dekachlorobifenyl) do ustalenia stanu 
równowagi wystarczy ły 144 godziny. Stan równowagi ocenia si ę poprzez 
powtarzanie pobierania próbek z pojedynczego naczynia.  
Rozpoczynanie do świadczenia  
40. Na pocz ątku doświadczenia nape łnić naczynie reakcyjne wod ą nasyconą 1- 
oktanolem. Nale ży pozostawi ć układ na czas wystarczaj ący do osi ągnięcia 
temperatury ustalonej za pomoc ą termostatu.  
41. Do naczynia reakcyjnego ostro żnie dodać pożądaną ilość substancji badanej 
(rozpuszczon ą w wymaganej ilo ści 1-oktanolu nasyconego wod ą). Jest to 
kluczowy etap do świadczenia, poniewa ż konieczne jest unikni ęcie gwałtow­
nego zmieszania obu faz. W tym celu faz ę 1-oktanolow ą można powoli 
podawać pipetą na ściankę naczynia, blisko powierzchni wody. Roztwór 
spłynie wzdłuż szklanej ścianki i utworzy film na powierzchni fazy wodnej. 
Należy zawsze unika ć wlewania 1-oktanolu bezpo średnio do naczynia – 
krople 1-oktanolu nie powinny wpada ć bezpośrednio do wody.  
42. Po rozpocz ęciu mieszania jego pr ędkość należy powoli zwi ększać. Jeżeli nie 
da się odpowiednio wyregulowa ć silników mieszad ła, należy rozważyć 
zastosowanie transformatora. Pr ędkość mieszania nale ży wyregulowa ć tak, 
aby powsta ł wir na styku wody i 1-oktanolu, o g łębokości od 0,5 do 
maksymalnie 2,5 cm. Pr ędkość mieszania nale ży zmniejszy ć, jeśli grubość 
wiru przekroczy 2,5 cm; w przeciwnym razie z kropelek 1-oktanolu w fazie 
wodnej mog ą powstać mikrokropelki, co mo że spowodowa ć przeszacowanie 
stężenia substancji badanej w wodzie. Maksymaln ą prędkość mieszania 
powodującą powstanie 2,5 cm wiru zaleca si ę na podstawie wyników 
międzylaboratoryjnego badania walidacyjnego (5). Jest to kompromis 
pomiędzy szybkim ustalaniem równowagi a zapobieganiem tworzeniu 
mikrokropelek 1-oktanolu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Pobieranie i przygotowywanie próbek  
43. Przed pobieraniem próbek mieszad ło należy wyłączyć i pozostawi ć układ, 
aż płyny znieruchomiej ą. Po uko ńczeniu pobierania próbek uruchomi ć 
mieszadło ponownie na wolnych obrotach, jak opisano powy żej, 
i stopniowo zwi ększa się prędkość mieszania.  
44. Próbk ę fazy wodnej pobiera si ę przez zawór znajduj ący się w dolnej cz ęści 
naczynia reakcyjnego. Nale ży zawsze odrzuca ć objętość martwą wody znaj ­
dującą się w kranach (dla naczynia przedstawionego w dodatku 2 jest to 
około 5 ml). Woda w kranach nie ulega mieszaniu, a zatem nie znajduje si ę 
w równowadze z ca łym układem. Nale ży odnotowa ć objętość próbek wody 
i upewni ć się, że przy ustalaniu bilansu masy wzi ęto pod uwag ę ilość 
substancji badanej obecnej w odrzuconej wodzie. Nale ży minimalizowa ć 
straty zwi ązane z parowaniem poprzez umo żliwienie spokojnego przep ływu 
wody do rozdzielacza, tak aby warstwa styku wody/1-oktanolu pozosta ła 
nienaruszona.  
45. Próbki fazy 1-oktanolu uzyskuje si ę poprzez pobranie ma łej podwielokrotnej 
części (ok. 100 μl) z warstwy 1-oktanolu za pomoc ą strzykawki o obj ętości 
100 mikrolitrów wykonanej wy łącznie ze szk ła i metalu. Nale ży uważać, 
aby nie naruszy ć warstwy styku rozpuszczalników. Obj ętość pobranej cieczy 
jest zapisywana. Wystarczy ma ła podwielokrotno ść, poniewa ż próbka fazy 
1-oktanolu b ędzie rozcie ńczana.  
46. Nale ży unikać zbędnych etapów polegaj ących na przenoszeniu próbki. 
W tym celu obj ętość próbki nale ży wyznaczy ć grawimetrycznie. 
W przypadku próbek fazy wodnej mo żna to uzyska ć poprzez pobieranie 
próbki roztworu do rozdzielacza, który zawiera ju ż potrzebn ą objętość 
rozpuszczalnika.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
47. Zgodnie z niniejsz ą metodą badawcz ą P OW wyznacza si ę, wykonuj ąc trzy 
doświadczenia metod ą powolnego mieszania (w trzech jednostkach 
doświadczalnych) dla badanego zwi ązku, w identycznych warunkach. 
Analiza metod ą regresji zastosowana do wykazania, że osiągnięty został 
stan równowagi, powinna by ć oparta na wynikach co najmniej czterech 
oznaczeń C O /C W w następujących po sobie punktach czasowych. Umo żliwia 
to obliczenie wariancji jako miary niepewno ści wartości średniej otrzymanej 
przez każdą jednostk ę doświadczaln ą. 
48. P  OW można określić przez wariancj ę danych otrzymanych dla ka żdej jedno ­
stki doświadczalnej. Informacje te wykorzystuje si ę do obliczenia P  OW jako 
średniej wa żonej z wyników poszczególnych jednostek do świadczalnych. 
Wagą jest odwrotno ść wariancji wyników dla jednostek do świadczalnych. 
W efekcie dane, dla których zmienno ść (wyrażana jako wariancja) jest du ża, 
a zatem maj ące mniejsz ą wiarygodno ść, wpływają na wynik w mniejszym 
stopniu ni ż dane, dla których wariancja jest ma ła. 
49. Analogicznie oblicza si ę ważone odchylenie standardowe. Jest ono miar ą 
powtarzalno ści pomiarów P  OW . Niska warto ść ważonego odchylenia stan ­
dardowego wskazuje na to, że wyznaczenie P  OW w ramach jednego labo ­
ratorium dawa ło bardzo powtarzalne wyniki. Formalne opracowanie staty ­
styczne danych przedstawiono w skrócie poni żej. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Opracowanie wyników  
Wykazanie, że stan równowagi zosta ł osiągnięty 
50. Dla ka żdego pobierania próbek oblicza si ę logarytm stosunku st ężeń 
substancji badanej w 1-oktanolu i w wodzie (log (C  O /C w )). Osiągnięcie 
równowagi chemicznej wykazuje si ę za pomoc ą wykresu tego stosunku 
względem czasu. Plateau pojawiaj ące się na tym wykresie dla co najmniej 
czterech kolejnych punktów czasowych wskazuje na osi ągnięcie równowagi 
oraz na rzeczywiste rozpuszczenie zwi ązku w 1-oktanolu. W razie jego 
braku badanie trzeba kontynuowa ć aż do momentu, gdy nachylenie dla 
czterech kolejnych punktów czasowych nie b ędzie znacz ąco różne od zera 
przy granicznym poziomie istotno ści równym 0,05, co wskazuje na nieza ­
leżność log C  o /C w od czasu.  
Obliczanie log P  OW 
51. Warto ść log P  OW dla jednostki do świadczalnej oblicza si ę jako średnią 
ważoną log C  o /C w dla tej cz ęści krzywej log C  o /C w względem czasu, dla 
której wykazano osi ągnięcie stanu równowagi. Średnią ważoną oblicza si ę 
poprzez stosowanie do danych wag b ędących odwrotno ścią wariancji, tak 
aby wpływ na wynik ko ńcowy był odwrotnie proporcjonalny do niepew ­
ności danych.  
Wartość średnia log P  OW 
52. Warto ść średnią log P  OW dla różnych jednostek do świadczalnych oblicza si ę 
jako średnią wyników dla poszczególnych jednostek do świadczalnych 
ważoną ich odpowiednimi wariancjami.  
Obliczenie wykonuje si ę w następujący sposób:  
log P  OW ;Av ¼ ðSw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðSw i Þ –1 
gdzie:  
log P  OW,i = wartość log P  OW dla jednostki do świadczalnej,  
log P  OW,Av  = średnia wa żona warto ści dla poszczególnych oznacze ń log 
P OW , 
w i = waga statystyczna przypisana warto ści log P  OW dla jednostki 
doświadczalnej i.  
Odwrotno ść wariancji log P  OW,i występuje jako w  i ðw i ¼ varðlog P  OW ;i Þ –1 Þ. 
53. Błąd średniej log P  OW szacowany jest jako powtarzalno ść log C  o /C w wyzna­
czanych w fazie równowagi w poszczególnych jednostkach do świadczal­
nych. Wyra żany jest jako wa żone odchylenie standardowe log P  OW,Av  
(σ log Pow,Av  ), które z kolei jest miar ą błędu związanego z log P  OW,Av  . 
Ważone odchylenie standardowe mo żna obliczy ć z wariancji wa żonej (var  log 
Pow,Av  ) w następujący sposób:  
var log Pow ;Av ¼ ðSw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðSw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
Symbol n oznacza liczb ę jednostek do świadczalnych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Sprawozdanie z badania  
54. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancja badana  
— nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny 
(z zaznaczeniem miejsca znakowania, je żeli używa się substancji 
znakowanej izotopowo) oraz istotne w łaściwości fizykochemiczne 
(zob. pkt 17),  
— stopie ń czystości substancji badanej (zanieczyszczenia),  
— czysto ść radiochemiczna dla znakowanych substancji chemicznych 
i aktywno ść molowa (w stosownych przypadkach),  
— wstępne oszacowanie log P  ow oraz metoda zastosowana do wyprowa ­
dzenia tej warto ści. 
Warunki badania  
— daty wykonywania bada ń, 
— temperatura podczas do świadczenia,  
— objętości 1-oktanolu i wody na pocz ątku badania,  
— objętości pobranych próbek 1-oktanolu i wody,  
— objętości 1-oktanolu i wody pozosta łe w naczyniach u żywanych do 
badania,  
— opis naczy ń używanych do badania i zastosowanych warunków 
mieszania (geometria mieszad ła i naczynia u żywanego do badania, 
wysokość wiru w mm oraz, je żeli jest znana, pr ędkość mieszania),  
— metody analityczne wykorzystane do oznaczenia substancji badanej oraz 
granice oznaczalno ści danych metod,  
— czasy pobierania próbek,  
— pH fazy wodnej i zastosowane substancje buforowe w przypadku regu ­
lowania pH w celu badania cz ąsteczek podatnych na dysocjacj ę, 
— liczba powtórze ń. 
Wyniki  
— powtarzalno ść i czułość zastosowanych metod analitycznych,  
— oznaczone st ężenia substancji badanej w 1-oktanolu i w wodzie 
w funkcji czasu,  
— wykazanie bilansu masy,  
— temperatura oraz odchylenie standardowe zakresu temperatur podczas 
doświadczenia,  
— regresja stosunku st ężeń względem czasu,  
— średnia warto ść log P  ow,Av  i jej błąd standardowy,  
— omówienie i interpretacja wyników,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— przyk łady surowych danych liczbowych z reprezentatywnej analizy 
(wszystkie surowe dane musz ą być przechowywane zgodnie ze standar ­
dami DPL), w tym odzysk substancji zast ępczych oraz liczba poziomów 
zastosowanych w kalibracji (wraz z kryteriami dla wspó łczynnika kore ­
lacji krzywej kalibracyjnej) oraz wyniki zapewniania jako ści/kontroli 
jakości (QA/QC),  
— jeśli jest dost ępne: sprawozdanie z walidacji procedury oznaczania 
(wskazane w śród odno śników literaturowych).  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of 
octanol/water partition coefficients with the „slow-stirring” method. Envi ­
ron. Toxicol. Chem. 8: 499–512.  
(2) Rozdzia ł A.8 niniejszego za łącznika. Wspó łczynnik podzia łu. 
(3) Rozdzia ł A.8 niniejszego za łącznika. Wspó łczynnik podzia łu. 
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable 
Substances. Pary ż. 
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation 
methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.  
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental 
Organic Chemistry. Wiley, Nowy Jork, NY.  
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwa ­
rzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning 
of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  Environ. 
Sci. Technol.  31: 2596–2602.  
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Disso ­
ciation Constants in Water. Paris.  
(10) Rozdzia ł A.6 niniejszego za łącznika. Rozpuszczalno ść w wodzie.  
(11) Rozdzia ł C.7 niniejszego za łącznika. Rozpad – rozpad abiotyczny: hydro ­
liza jako funkcja pH  
(12) Rozdzia ł C.4 – cz ęść II–VII (metody A–F) niniejszego za łącznika. Ozna ­
czenie szybkiej biodegradowalno ści. 
(13) Rozdzia ł A.4 niniejszego za łącznika. Pr ężność pary.  
(14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients,  J. Chem. Eng. Data.  40: 
623–626.  
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. W: Handbook of Chemical Property 
Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, 
Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 do 2-52.
 
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight 
Chemical Information Systems, Irvine, CA.  
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.  
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapeszt.  
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario 
M5H 3V9, Kanada 2001.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 171
 
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. W: Lyman WJ, 
Reehl WF, Rosenblatt DH, eds,  Handbook of chemical property estimation , 
American Chemical Society, Washington, D.C.  
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An 
extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  14: 
479–488.  
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl (red.),  Methoden der Organischen 
Chemie : 386–390.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Dodatek 1  
Arkusz kalkulacyjny do obliczania minimalnych obj ętości wody 
wymaganych dla wykrywania substancji badanych o ró żnych warto ściach 
LOG P  OW w fazie wodnej  
Założenia:  
— Maksymalna obj ętość poszczególnych podwielokrotnych cz ęści = 10 % obj ę­
tości całkowitej; 5 podwielokrotnych cz ęści = 50 % obj ętości całkowitej.  
— Stężeniesubstancjibadanych  ¼ 0; 7 Ü rozpuszczalno śćwobufazach. 
W przypadku ni ższych stężeń wymagane s ą większe objętości. 
— Objętość do wyznaczania LOD = 100 ml.  
— Relacje log P  ow vs. log S  w oraz log P  ow vs. SR (S  oct /S w ) w uzasadnionym 
zakresie odzwierciedlaj ą związki dla substancji badanych.  
Oszacowanie S  w 
log P  ow Równanie log S  w S w (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 –3,192 6,427E-04  
Oszacowanie S  oct 
log P  ow Równanie S  oct (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Masa całkowita 
substancji badanej 
(mg) Masa  oktanolu  / 
Masa  wody Masa  H2O 
(mg) Stęż H2O 
(mg/l) Masa  oktanolu  
(mg) Stęż oktanolu  
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 
3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 
4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Obliczanie obj ętości 
Minimalna obj ętość wymagana dla fazy H  2 O przy ka żdym stężeniu LOD  
log K  ow LOD (mikrogram/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Objętość zasto­
sowana dla LOD (I) 0,1
 
Legenda do oblicze ń 
Stanowi < 10 % ca łkowitej obj ętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równo ­
wagi o obj ętości 1 litra.  
Stanowi < 10 % ca łkowitej obj ętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równo ­
wagi o obj ętości 2 litrów.  
Stanowi < 10 % ca łkowitej obj ętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równo ­
wagi o obj ętości 5 litrów.  
Stanowi < 10 % ca łkowitej obj ętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równo ­
wagi o obj ętości 10 litrów.  
Przekracza 10 % nawet dla 10-litrowego naczynia do ustalania równowagi.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Przegląd wymaganych obj ętości jako funkcji rozpuszczalno ści w wodzie i log P  OW 
Minimalna obj ętość wymagana dla fazy H  2 O przy ka żdym stężeniu LOD (ml)  
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogram/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  ow S w (mg/l) LOD (mikrogram/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Objętość zastosowana dla 
LOD (I) 0,1 
Dodatek 2  
Przykład naczynia z p łaszczem szklanym do wyznaczania P  OW metodą 
powolnego mieszania
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
CZĘŚĆ  B: METODY OZNACZANIA TOKSYCZNO ŚCI I INNYCH 
SKUTKÓW ZDROWOTNYCH  
SPIS TRE ŚCI 
WPROWADZENIE OGÓLNE 
B.1 bis. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA POKARMOWA – PROCEDURA 
Z WYKORZYSTANIEM STA ŁEJ DAWKI 
B.1 ter. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA POKARMOWA – METODA KLAS 
OSTREJ TOKSYCZNO ŚCI 
B.2. OSTRA TOKSYCZNO ŚĆ INHALACYJNA 
B.3. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA (DERMALNA) 
B.4. OSTRA TOKSYCZNO ŚĆ: PODRA ŻNIENIA/KOROZJA 
SKÓRY 
B.5. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA: PODRA ŻNIENIE/KOROZJA OCZU 
B.6. SENSYBILIZACJA SKÓRY 
B.7. 28-DNIOWE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI DOUSTNEJ 
WYWOŁANEJ POWTARZANYM DAWKOWANIEM 
U GRYZONI 
B.8. TOKSYCZNO ŚĆ PODOSTRA – NARA ŻENIE INHALA ­
CYJNE: BADANIE 28-DNIOWE 
B.9. TOKSYCZNO ŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (DER ­
MALNA) 
B.10. MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE ABERRACJI CHROMOSO ­
MOWEJ SSAKÓW  IN VITRO  
B.11. MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE ABERRACJI CHROMOSO ­
MOWEJ SZPIKU KOSTNEGO  IN VIVO  
B.12. MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE MIKROJ ĄDROWE ERYTRO ­
CYTÓW  IN VIVO  U SSAKÓW 
B.13/14. MUTAGENNO ŚĆ: BADANIE MUTACJI POWROTNYCH 
W KOMÓRKACH BAKTERYJNYCH 
B.15 BADANIE MUTAGENNO ŚCI I BADANIE PRZESIEWOWE 
NA RAKOTWÓRCZO ŚĆ MUTACJA GENU – SACCHARO ­
MYCES CEREVISIAE  
B.16. BADANIE REKOMBINACJI GENETYCZNEJ –  SACCHARO ­
MYCES CEREVISIAE  
B.17. MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE MUTACJI GENETYCZNEJ IN 
VITRO U SSAKÓW 
B.18. USZKODZENIE I NAPRAWA DNA – NIEREGULARNA 
SYNTEZA DNA – KOMÓRKI SSAKÓW  IN VITRO  
B.19. TEST WYMIANY CHROMATYD SIOSTRZANYCH  IN VITRO  
B.20. BADANIA SPRZ ĘŻONYCH Z P ŁCIĄ RECESYWNYCH CECH 
LETALNYCH U  DROSOPHILA MELANOGASTER  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. BADANIE PRZEMIANY KOMÓRKOWEJ SSAKÓW  IN VITRO  
B.22. BADANIE DOMINUJ ĄCEGO GENU LETALNEGO 
GRYZONIA 
B.23. BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SPERMATO ­
GONIÓW U SSAKÓW 
B.24. TEST PLAMKOWY U MYSZY B.25. TRANSLOKACJA DZIEDZICZNO ŚCI U MYSZY 
B.26. BADANIE TOKSYCZNO ŚCI PODPRZEWLEK ŁEJ DROG Ą 
POKARMOW Ą – STUDIUM TOKSYCZNO ŚCI NA GRYZO ­
NIACH METOD Ą POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI 
DROGĄ POKARMOW Ą 
B.27. BADANIE TOKSYCZNO ŚCI PODPRZEWLEK ŁEJ DROG Ą 
POKARMOW Ą – BADANIA TOKSYCZNO ŚCI NA NIEGRY ­
ZONIACH METOD Ą POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI 
DROGĄ POKARMOW Ą 
B.28. BADANIE PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNO ŚCI SKÓRY – 
90-DNIOWE BADANIA POWTARZANEGO DAWKOWANIA 
NA SKÓRZE Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW GRYZONI 
B.29. TOKSYCZNO ŚĆ PODPRZEWLEK ŁA – NARA ŻENIE INHA ­
LACYJNE: BADANIE 90-DNIOWE 
B.30. BADANIA TOKSYCZNO ŚCI PRZEWLEK ŁEJ 
B.31. BADANIE PRZEDURODZENIOWEJ TOKSYCZNO ŚCI 
ROZWOJOWEJ 
B.32. BADANIA RAKOTWÓRCZO ŚCI 
B.33. ŁĄCZONE BADANIA TOKSYCZNO ŚCI PRZEWLEK ŁEJ/ 
RAKOTWÓRCZO ŚCI 
B.34. BADANIE TOKSYCZNO ŚCI REPRODUKCJI JEDNEGO 
POKOLENIA 
B.35. DWUPOKOLENIOWE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI REPRO ­
DUKCYJNEJ 
B.36. TOKSYKOKINETYKA 
B.37. OPÓ ŹNIONA NEUROTOKSYCZNO ŚĆ SUBSTANCJI FOSFO ­
ROORGANICZNYCH PO DU ŻEJ EKSPOZYCJI 
B.38. OPÓ ŹNIONA NEUROTOKSYCZNO ŚĆ SUBSTANCJI FOSFO ­
ROORGANICZNYCH – 28-DNIOWE BADANIE WIELO ­
KROTNEJ DAWKI 
B.39. TEST POREPERACYJNEJ SYNTEZY DNA Z KOMÓRKAMI 
WĄTROBY SSAKÓW  IN VIVO  
B.40. BADANIE NISZCZENIA SKÓRY METOD Ą IN VITRO: TEST 
PRZEZSKÓRNEGO OPORU ELEKTRYCZNEGO (TER) 
B.40 bis. BADANIE ZNISZCZENIA SKÓRY METOD Ą IN VITRO:  
BADANIE MODELU SKÓRY LUDZKIEJ  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. BADANIE FOTOTOKSYCZNO ŚCI 3T3 NRU IN VITRO 
B.42. DZIA ŁANIE UCZULAJ ĄCE NA SKÓR Ę: BADANIE LOKAL ­
NYCH W ĘZŁÓW CHŁONNYCH 
B.43. BADANIE NEUROTOKSYCZNO ŚCI U GRYZONI 
B.44. ABSORPCJA PRZEZ SKÓR Ę: METODA  IN VIVO  
B.45. ABSORPCJA PRZEZ SKÓR Ę: METODA  IN VITRO  
B.46. DZIA ŁANIE DRA ŻNIĄCE NA SKÓR Ę IN VITRO : BADANIE 
NA MODELU ZREKONSTRUOWANEGO LUDZKIEGO 
NASKÓRKA 
B.47. METODA BADANIA ZM ĘTNIENIA I PRZEPUSZCZALNO ŚCI 
ROGÓWKI U BYD ŁA DO CELÓW IDENTYFIKACJI 
SUBSTANCJI ŻRĄCYCH I SILNIE DRA ŻNIĄCYCH DLA 
OCZU 
B.48. METODA BADANIA NA IZOLOWANYM OKU KURZYM DO 
CELÓW IDENTYFIKACJI SUBSTANCJI ŻRĄCYCH I SILNIE 
DRAŻNIĄCYCH DLA OCZU 
B.49. BADANIE MIKROJ ĄDROWE  IN VITRO  W KOMÓRKACH 
SSAKÓW 
B.50. DZIA ŁANIE UCZULAJ ĄCE NA SKÓR Ę: BADANIE LOKAL ­
NYCH W ĘZŁÓW CHŁONNYCH DA 
B.51. DZIA ŁANIE UCZULAJ ĄCE NA SKÓR Ę: BADANIE LOKAL ­
NYCH W ĘZŁÓW CHŁONNYCH BRDU-ELISA  
▼M4 
B.52. OSTRA TOKSYCZNO ŚĆ INHALACYJNA – METODA KLAS 
OSTREJ TOKSYCZNO ŚCI 
▼M5 
B.53. BADANIE NEUROTOKSYCZNO ŚCI ROZWOJOWEJ 
B.54. TEST BIOLOGICZNY WZROSTU MACICY U GRYZONI: 
KRÓTKOTERMINOWE BADANIE PRZESIEWOWE W ŁAŚCI­
WOŚCI ESTROGENNYCH 
B.55. TEST BIOLOGICZNY HERSHBERGERA NA SZCZURACH: 
KRÓTKOTERMINOWE BADANIE PRZESIEWOWE 
WŁAŚCIWOŚCI (ANTY)ANDROGENNYCH 
B.56. ROZSZERZONE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI REPRODUK ­
CYJNEJ JEDNEGO POKOLENIA 
B.57. TEST STEROIDOGENEZY H295R 
B.58. BADANIE MUTACJI GENOWEJ KOMÓREK SOMATYCZ ­
NYCH I GERMINALNYCH U GRYZONI TRANSGENICZ ­
NYCH  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
WPROWADZENIE OGÓLNE  
A. CHARAKTERYSTYKA SUBSTANCJI TESTOWANEJ  
Skład substancji testowanej, w tym g łówne zanieczyszczenia oraz jej 
istotne w łaściwości fizyko-chemiczne w łącznie z trwa łością, 
powinny by ć znane przed rozpocz ęciem każdego badania toksycz ­
ności. 
Właściwości fizyko-chemiczne substancji testowanej dostarczaj ą 
ważnych informacji przy wyborze drogi aplikowania, projektowaniu 
każdego poszczególnego badania oraz pos ługiwaniu si ę 
i przechowywaniu substancji testowanej.  
Rozpoczęcie badania powinno poprzedza ć zastosowanie metody 
analitycznej w celu jako ściowego i ilo ściowego oznaczenia 
substancji testowanej (wraz z g łównymi zanieczyszczeniami, je żeli 
możliwe) w o środku dawkuj ącym i materiale biologicznym.  
Wszystkie informacje dotycz ące identyfikacji, w łaściwości fizyko- 
chemicznych, czysto ści i zachowania substancji testowanej powinny 
być zawarte w sprawozdaniu z testu.  
B. UTRZYMANIE ZWIERZ ĄT 
Rygorystyczna kontrola warunków otoczenia i w łaściwe techniki 
utrzymania zwierz ąt są niezbędne przy testowaniu toksyczno ści. 
(i) Warunki, w których przebywaj ą zwierzęta 
Warunki otoczenia w pomieszczeniach dla zwierz ąt doświadczalnych 
i zagrodach powinny by ć odpowiednie dla badanego gatunku. Odpo ­
wiednimi warunkami dla szczurów, myszy i świnek morskich s ą: 
temperatura pokojowa wynosz ąca 22  o C ± 3  o C i wilgotno ść 
względna 30–70 %; dla królików temperatura powinna wynosi ć 
20 o C ± 3  o C przy wilgotno ści względnej 30–70 %.  
Niektóre techniki eksperymentalne s ą szczególnie wra żliwe na 
wpływ temperatury i w takich przypadkach szczegó ły odpowiednich 
warunków s ą zawarte w opisie metody badania. We wszystkich 
badaniach dzia łania toksycznego temperatura i wilgotno ść powinny 
być monitorowane, rejestrowane i zawarte w ko ńcowym sprawoz ­
daniu z badania.  
Oświetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 
godzin ciemno. Szczegó ły form o świetlenia powinny by ć rejestro­
wane i zawarte w ko ńcowym sprawozdaniu z badania.  
Przy braku innych wskaza ń w danej metodzie zwierz ęta mogą być 
umieszczane pojedynczo, lub umieszczane w klatkach w ma łych 
grupach o tej samej p łci; w przypadku umieszczania grupowego, 
nie więcej niż pięć zwierząt powinno by ć umieszczanych w jednej 
klatce.  
W sprawozdaniach z eksperymentów na zwierz ętach, ważne jest 
wskazanie stosowanego typu umieszczania zwierz ąt w klatkach 
i liczby zwierz ąt umieszczanych w ka żdej klatce zarówno podczas 
ekspozycji na zwi ązek chemiczny, jak i w pó źniejszym okresie 
obserwacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
(ii) Warunki żywienia  
Diety powinny w pe łni spełniać zapotrzebowanie pokarmowe 
gatunku poddanego testowi. W przypadkach gdy substancje testo ­
wane są podawane zwierz ętom w ich po żywieniu, warto ść pokar­
mowa mo że być zredukowana przez interakcj ę tej substancji ze 
składnikiem pokarmowym. Mo żliwość takiej reakcji powinna by ć 
rozważona przy interpretacji wyników testów. Konwencjonalne 
diety laboratoryjne mog ą być stosowane przy nieograniczonym 
dostarczaniu wody pitnej. Na wybór diety mo że mieć wpływ 
potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki substancji testowanej przy podawaniu powy ższą metodą.
 
Pokarmowe substancje zanieczyszczaj ące, o których wiadomo, że 
wpływają na toksyczno ść, nie powinny by ć obecne w st ężeniach 
przeszkadzaj ących.  
C. TESTOWANIE ALTERNATYWNE  
Unia Europejska jest zaanga żowana w promowanie rozwijania 
i zatwierdzania technik alternatywnych, które mog ą dostarczy ć ten 
sam poziom informacji jak obecne testy na zwierz ętach, ale które 
stosują mniej zwierz ąt, powoduj ą mniejsze cierpienie lub ca łkowicie 
unikają wykorzystania zwierz ąt. 
Takie metody, w przypadku gdy stan ą się dostępne, musz ą być 
rozważane, gdziekolwiek jest to mo żliwe, przy charakteryzowaniu 
zagrożenia i późniejszym klasyfikowaniu i etykietowaniu wewn ętrz­
nych zagro żeń. 
D. OCENA I INTERPRETACJA  
Podczas oceny i interpretacji testów, musz ą być rozważone ograni ­
czenia zakresu, w którym wyniki bada ń na zwierz ętach i  in vitro  
mogą być odniesione bezpo średnio do cz łowieka i dlatego tam, gdzie 
dostępne są dowody niekorzystnych skutków dla ludzi, mog ą one 
być użyte do potwierdzenia wyników testowania.  
D. BIBLIOGRAFIA  
Większość tych metod jest opracowana w ramach programu OECD 
– wskazówki dotycz ące testowania, i powinny by ć one realizowane 
zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej, aby zapewni ć 
możliwie najszersz ą „wzajemn ą akceptacj ę danych”.  
Dodatkowe informacje mog ą być odnalezione w bibliografii wska ­
zówek OECD i odpowiedniej literaturze publikowanej w innych 
źródłach. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1 bis.  TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA POKARMOWA – PROCEDURA 
Z WYKORZYSTANIEM STA ŁEJ DAWKI  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest kopi ą OECD TG 420 (2001)  
1.1. WPROWADZENIE  
Tradycyjne metody oceny ostrej toksyczno ści wykorzystuj ą śmierć 
zwierząt jako punkt ko ńcowy. W 1984 r. Brytyjskie Towarzystwo 
Toksykologiczne zaproponowa ło nowe podej ście do okre ślania ostrej 
toksyczno ści, oparte na podawaniu serii dawek o sta łym stężeniu (1). 
To podej ście umożliwia unikni ęcie śmierci zwierz ąt jako punktu 
końcowego, wykorzystuj ąc jako alternatyw ę obserwacje wyra źnych 
objawów zatrucia na danym etapie podawania serii dawek o sta łym 
stężeniu. W nast ępstwie bada ń weryfikacyjnych  in vivo , przeprowa ­
dzonych przez Zjednoczone Królestwo (2) oraz na szczeblu mi ędzy­
narodowym (3), procedura ta zosta ła przyjęta jako metoda badawcza 
w 1992 r. Jednocze śnie, wykorzystuj ąc w szeregu bada ń modele 
matematyczne, poddano ocenie w łaściwości statystyczne Procedury 
stałych dawek (4)(5)(6). Zarówno badania  in vivo , jak i badania 
z wykorzystaniem modeli wykaza ły, że procedura ta jest powta ­
rzalna, wymaga mniejszej liczby zwierz ąt i powoduje mniej cierpie ń 
niż metody tradycyjne oraz że możliwa jest dzi ęki niej ocena 
substancji w podobny sposób, jak to ma miejsce z wykorzystaniem innych metod.
 
Wytyczne dotycz ące wyboru najbardziej odpowiedniej metody 
badawczej dla indywidualnych przypadków zosta ły zamieszczone 
w Wytycznych dotycz ących badania ostrej toksyczno ści drogą 
pokarmow ą (7). Wytyczne te zawieraj ą także dodatkowe informacje 
na temat przeprowadzania i interpretacji metody badawczej B.1 bis.  
Zasadniczo w badaniu g łównym z wykorzystaniem niniejszej metody 
stosuje si ę jedynie umiarkowane toksycznie dawki oraz unika si ę 
dawek mog ących spowodowa ć śmierć. Nie jest równie ż konieczne 
podawanie dawek mog ących powodowa ć silny ból lub stres wyni ­
kający z dzia łania żrącego lub podra żniającego. Zwierz ęta w stanie 
agonalnym lub w oczywisty sposób cierpi ące albo chore 
i przeżywające strach powinny zosta ć uśmiercone w humanitarny 
sposób i uwzgl ędniane w interpretacji wyników bada ń jako zwierz ęta 
padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do 
uśmiercenia zwierz ąt w stanie agonalnym lub cierpi ących ból oraz 
wytyczne dotycz ące rozpoznania przewidywanego lub zbli żającego 
się zgonu są zawarte w oddzielnych Wytycznych (8).  
Metoda umo żliwia przedstawienie informacji na temat niebezpiecz ­
nych właściwości danej substancji i pozwala na ocen ę i klasyfikacj ę 
zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem (GHS) 
klasyfikuj ącym związki chemiczne pod wzgl ędem ich ostrej toksycz ­
ności (9).  
Laboratorium badawcze powinno uwzgl ędnić wszystkie dost ępne 
informacje na temat badanej substancji przed rozpocz ęciem bada ń. 
Informacje te powinny obejmowa ć nazwę i budow ę chemiczn ą 
substancji; w łaściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych bada ń 
toksyczno ści in vitro  lub  in vivo ; dane dotycz ące toksyczno ści 
substancji zbli żonych pod wzgl ędem budowy; przewidywane zasto ­
sowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te s ą niezbędne 
celem spe łnienia wszelkich wymogów dotycz ących ochrony zdrowia 
ludzkiego, i pomocne w wyborze odpowiedniej dawki wyj ściowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINICJE  
Toksyczno ść ostra pokarmowa:  oznacza niepo żądane skutki poja ­
wiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki 
substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin.  
Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje 
się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada pó źniej w 14-dniowym 
okresie obserwacyjnym.  
Dawka:  oznacza ilo ść podawanej substancji badanej. Dawka 
jest wyra żana jako masa próbki na jednostk ę masy zwierz ęcia 
(np. mg/kg).  
Wyraźne działanie toksyczne:  jest ogólnym terminem opisuj ącym 
wyraźne objawy zatrucia wyst ępujące w nast ępstwie podania 
substancji badanej (zob. (3) celem uzyskania przyk ładów), pozwa ­
lające oczekiwa ć, że u większości zwierząt następna najwy ższa stała 
dawka spowoduje b ądź silny ból, przewlek łe oznaki strachu, stan 
agonalny (kryteria s ą przedstawione w Wytycznych dotycz ących 
humanitarnego punktu ko ńcowego (8)), b ądź zgon u wi ększości 
badanych zwierz ąt. 
GHS:  Globalny zharmonizowany system klasyfikacji substancji 
i mieszanin chemicznych. Po łączone dzia łania OECD (w dziedzinie 
zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ 
w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie w łaści­
wości fizyko-chemicznych) i Mi ędzynarodowej Organizacji Pracy 
(ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpiecze ństw), 
koordynowane w ramach Mi ędzyorganizacyjnego programu na rzecz 
właściwego zarz ądzania zwi ązkami chemicznymi (IOMC).  
Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku gdy przewiduje si ę 
wystąpienie stanu agonalnego lub śmierci przed nast ępnym zaplano ­
wanym czasem obserwacji. Objawy wskazuj ące na ten stan mog ą 
obejmowa ć u gryzonia konwulsje, u łożenie na boku, pozycja le żąca 
oraz drgawki (zob. Wytyczne dotycz ące humanitarnego punktu 
końcowego (9) celem uzyskania szczegó łowych informacji).  
LD 50 (średnia dawka śmiertelna):  jest statystycznie wyprowadzon ą 
pojedyncz ą dawką substancji, która powoduje zgon 50 % zwierz ąt 
przy podaniu drog ą pokarmow ą. Wartość LD  50 jest wyra żona 
w wadze substancji badanej na jednostk ę masy badanego zwierz ęcia 
(mg/kg).  
Dawka graniczna:  oznacza górn ą dawkę graniczn ą w badaniach 
(2 000 lub 5 000 mg/kg).  
Stan agonalny:  stan śmierci lub niezdolno ści do prze życia nawet 
w przypadku zastosowania leczenia (zob. Wytyczne dotycz ące 
humanitarnego punktu ko ńcowego (8) w celu uzyskania danych 
szczegółowych).  
Przewidywalna śmierć: obecność objawów klinicznych wskazuj ­ 
ących na nadchodz ący zgon przed planowanym zako ńczeniem 
eksperymentu, na przyk ład: niezdolno ść do dotarcia do wody lub 
pożywienia (zob. Wytyczne dotycz ące humanitarnego punktu ko ńco­
wego (8) w celu uzyskania danych szczegó łowych).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Grupom zwierz ąt tej samej p łci podaje si ę, zgodnie z procedur ą 
stopniową, stałe dawki na poziomie 5, 50, 300 i 2 000 mg/kg (w 
wyjątkowych wypadkach mo żna rozważyć podanie dodatkowej sta łej 
dawki wynosz ącej 5 000 mg/kg, zob. sekcja 1.6.2). Poziom pierw ­
szej stałej dawki jest okre ślany na podstawie badania pogl ądowego 
na poziomie, który spowoduje wyst ąpienie okre ślonych objawów 
zatrucia, lecz nie spowoduje ci ężkich zatru ć lub śmierci. Objawy 
kliniczne oraz objawy kojarzone z bólem, cierpieniem i zbli żającą 
się śmiercią zostały opisane w oddzielnych Wytycznych OECD (8). 
Następnej grupie zwierz ąt może zostać podana wy ższa bądź niższa 
stała dawka, w zale żności od obecno ści lub braku objawów zatrucia 
lub śmiertelno ści. Taka procedura jest powtarzana a ż do osiągnięcia 
dawki powoduj ącej wyraźne zatrucie lub powoduj ącej nie wi ęcej niż 
jeden przypadek śmiertelny, lub w przypadku braku skutków 
w następstwie podania najwy ższej dawki, b ądź w przypadku zgonu 
przy najni ższej dawce.  
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, cho ć dopuszcza si ę 
wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogó ł w doświadcze­
niach wykorzystuj ę się samice (7). Wynika to z faktu, znajduj ącego 
swoje potwierdzenie w literaturze dotycz ącej konwencjonalnych 
badań LD  50 , że różnice między płciami są znikome, lecz tam 
gdzie wyst ępują, samice s ą z reguły nieznacznie bardziej wra żliwe 
(10). Jednak że jeżeli wiedza na temat w łaściwości toksykologicznych 
i toksykokinetycznych zwi ązków o pokrewnej budowie wskazuje, że 
samce mog ą być bardziej wra żliwe, w takim przypadku nale ży 
wybrać do badania t ę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na 
samcach, nale ży podać uzasadnienie.  
Zaleca si ę wykorzystanie zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt 
pochodzących ze szczepów na ogó ł wykorzystywanych 
w laboratorium. Samice powinny by ć bezdzietne i nieci ężarne. 
Każde zwierz ę na pocz ątku cyklu laboratoryjnego powinno by ć 
w wieku mi ędzy 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna prze ­
kraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wyko ­
rzystywanych uprzednio zwierz ąt. 
1.4.2.  Warunki przebywania i warunki żywieniowe  
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 22  o C (±3  o C). Chocia ż wilgotno ść względna powinna 
wynosić co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie przekracza ła 
70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno by ć 
utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć 
sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia 
można stosowa ć konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograni ­
czonym dost ępem do wody pitnej. Zwierz ęta mogą być grupowane 
w klatkach w sposób nieograniczaj ący łatwej obserwacji pojedyn ­
czych sztuk.  
1.4.3.  Przygotowanie zwierz ąt 
Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umo żliwiający 
identyfikacj ę poszczególnych osobników, i przetrzymywane 
w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierw ­
szej dawki, co umo żliwia aklimatyzacj ę do warunków laboratoryj ­
nych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Przygotowanie dawek  
Na ogół badana substancja powinna by ć podawana w dawkach 
o stałej objętości przy zmianie st ężenia dawkowanego preparatu. 
Jednakże w przypadku badania ko ńcowego produktu b ędącego 
cieczą lub mieszaniny, dla celów oceny niebezpiecznego dzia łania 
tej substancji, bardziej stosowne mo że okazać się wykorzystanie 
substancji nierozcie ńczonej. tj. substancji o sta łym stężeniu. 
Wymóg ten mo że być ponadto okre ślony w niektórych przepisach 
wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie 
maksymalnej obj ętości przewidzianej do podania. Maksymalna obj ę­
tość cieczy podanej jednorazowo zale ży od wielko ści badanego 
zwierzęcia. Dla gryzoni obj ętość ta nie powinna przekracza ć 1 ml/100 
g masy cia ła: jednak że w przypadku roztworów wodnych dopusz ­
czalne jest przyj ęcie dawki 2 ml/100 g masy cia ła. Jeżeli chodzi 
o przygotowywanie dozowanego preparatu, nale ży użyć, o ile to 
możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, nast ępnie rozwa żyć 
przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kuku ­
rydzianym), a dopiero w nast ępnej kolejno ści roztworów innych 
nośników. W przypadkach stosowania no śnika różnego od wody 
muszą być znane jego w łaściwości toksykologiczne. Dawki musz ą 
być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilno ść 
przygotowanego preparatu w okresie w jakim ma on by ć stosowany 
jest znana i mo żliwa do przyj ęcia. 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Podawanie dawki  
Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez 
zgłębnik przy u życiu sondy prze łykowej lub odpowiedniej kaniuli 
intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemo żliwe jest 
podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka mo że zostać rozbita 
na mniejsze porcje i podawana w odst ępach czasowych w okresie 
nieprzekraczaj ącym 24 godzin.  
Zwierzęta powinny by ć wyposzczone przed podaniem dawki (np. 
szczurom nale ży wstrzyma ć podawanie jedzenia przez noc, lecz 
nie wstrzymywa ć wody, myszom nale ży wstrzyma ć jedzenie przez 
3–4 godziny, lecz nie wstrzymywa ć wody). Nast ępnie, po wyposz ­
czeniu, zwierz ęta należy zważyć oraz poda ć im substancj ę badaną. 
W przypadku szczurów, po podaniu substancji badanej mo żna 
wstrzyma ć podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, a w przypadku 
myszy przez 1–2 godziny. Je żeli dawka jest podawana porcjami 
przez okre ślony czas, mo że być konieczne podanie pokarmu 
i wody w zale żności od długości okresu podawania dawki.  
1.5.2.  Badania pogl ądowe  
Celem bada ń poglądowych jest wybranie odpowiedniej dawki 
początkowej dla bada ń zasadniczych. Substancja badana jest poda ­
wana poszczególnym zwierz ętom w sposób sekwencyjny, zgodnie ze 
schematem post ępowania zawartym w za łączniku 1. Badania 
poglądowe są przerywane, gdy mo żliwe jest podj ęcie decyzji co 
do ilości dawki wyj ściowej (lub nast ępuje śmierć w wyniku podania 
najmniejszej sta łej dawki).  
Dawka pocz ątkowa wyznaczona do badania pogl ądowego danej 
substancji jest wybierana w oparciu o dane eksperymentalne z badań in vivo  i in vitro  tej samej substancji lub substancji pokrew ­
nych pod wzgl ędem budowy, spo śród stałych dawek okre ślonych na 
poziomie 5, 50, 300, i 2 000 mg/kg, jako dawka, która powinna 
wywołać wyraźną toksyczno ść. W przypadku braku danych na 
temat takich substancji nale ży ustalić dawkę wyjściową na poziomie 
300 mg/kg.
 
Dopuszczalna jest nie krótsza ni ż 24-godzinna przerwa w podawaniu 
dawki jednemu zwierz ęciu. Wszystkie zwierz ęta należy objąć obser­
wacją przez przynajmniej 14 dni.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
W wyjątkowych okoliczno ściach i wy łącznie jeżeli wymagaj ą tego 
określone potrzeby regulacyjne, mo żna rozwa żyć podanie dawki 
dodatkowej sta łej na górnym poziomie 5 000 mg/kg (zob. za łącznik 
3). Z uwagi na dobrostan zwierz ąt badania na zwierz ętach w zakresie 
kategorii 5 GSH (2 000 i 5 000 mg/kg) s ą odradzane i powinny by ć 
rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobie ństwa, 
że wyniki takich bada ń przynios ą bezpośrednie korzy ści dla ochrony 
zdrowia ludzkiego, zwierz ąt lub środowiska naturalnego.  
W przypadku gdy zwierz ę, któremu w badaniach pogl ądowych 
została podana najni ższa stała dawka (5 mg/kg), ginie, normaln ą 
procedurą jest przerwanie bada ń i przypisanie substancji do kategorii 
1 GSH (jak to przedstawiono w za łączniku 1). Jednak że 
w przypadku gdy wymagane jest potwierdzenie klasyfikacji wst ęp­
nej, możliwe jest przeprowadzenie procedury dodatkowej, zgodnie z 
poniższym opisem. Drugie zwierz ę otrzymuje dawk ę 5 mg/kg. Je żeli 
również ono pada, przypisanie do kategorii 1 GHS zostaje potwier ­
dzone, a badanie zostaje natychmiastowo przerwane. Je żeli drugie 
zwierzę przeżyje, dawk ę 5 mg/kg podaje si ę maksymalnie trzem 
kolejnym zwierz ętom. Z uwagi na wysokie ryzyko śmiertelno ści 
dawki powinny by ć podawane sekwencyjnie, co zapewni optymaln ą 
ochronę zwierząt. Przerwy w podawaniu dawek ka żdemu zwierz ęciu 
powinny pozwala ć na uzyskanie pewno ści, że poprzednie zwierz ę 
przeżyje. W momencie wyst ąpienia drugiego przypadku śmiertelnego 
sekwencyjne podawanie dawek zostaje natychmiast przerwane, a podawanie dawek kolejnym zwierz ętom wstrzymane. Poniewa ż 
wystą
pienie drugiego przypadku śmiertelnego (niezale żnie od liczby 
zwierząt poddanych badaniu do momentu ich przerwania) mie ści się 
w wyniku A (2 lub wi ęcej przypadków śmiertelnych), stosowana jest 
zasada klasyfikacji okre ślona w za łączniku 2, zgodnie z któr ą 
stężenie stałej dawki wynosi 5 mg/kg. Dodatkowo, do momentu 
przyjęcia nowego GHS, obowi ązujące są wytyczne zawarte 
w załączniku 4, dotycz ące klasyfikacji substancji w ramach systemu 
WE. 
1.5.3.  Badania zasadnicze  
1.5.3.1.  Liczba zwierz ąt i poziomy dawek  
Działania, jakie maj ą być podjęte w nast ępstwie przeprowadzenia 
badań przy pomocy dawek wyj ściowych, s ą przedstawione na sche ­
macie post ępowania zawartym w za łączniku 2. Wymagany jest jeden 
z trzech schematów post ępowania; b ądź przerwanie testów 
i przypisanie do jednej z klas klasyfikacji niebezpiecze ństwa, 
zbadanie zwierz ęcia przy pomocy wy ższej stałej dawki, b ądź jego 
zbadanie przy pomocy ni ższej stałej dawki. Jednak że w celu ochrony 
zwierząt poziom, który spowodowa ł śmierć zwierzęcia w trakcie 
badań poglądowych, nie b ędzie powtórnie wykorzystany 
w badaniach zasadniczych (zob. za łącznik 2). Do świadczenie wyka ­
zuje, że najbardziej prawdopodobny wynik na poziomie wyj ściowym 
stałej dawki umo żliwi klasyfikacj ę substancji, skutkiem czego nie 
będą konieczne dalsze badania.  
Normalnie wykorzystuje si ę ogólną liczbę pięciu zwierz ąt jednej p łci 
dla każdego badanego poziomu dawki. Liczba ta obejmuje jedno 
zwierzę zbadane w trakcie bada ń poglądowych przy pomocy 
wybranej dawki oraz cztery inne zwierz ęta (z wyj ątkiem sytuacji, 
w których poziom dawki wykorzystanej w badaniach zasadniczych 
nie był wcześniej zastosowany w badaniach pogl ądowych).  
Odstępy między podawaniem dawek na ka żdym poziomie okre śla się 
na podstawie czasu wyst ąpienia, długości trwania i dokuczliwo ści 
objawów zatrucia. Podanie zwierz ęciu następnej dawki powinno 
zostać opóźnione do momentu uzyskania pewno ści co do mo żliwości 
przeżycia zwierz ąt, którym podano ostatni ą dawkę. Zalecana jest 
przerwa rz ędu 3 lub 4 dni mi ędzy podaniem kolejnych dawek, 
o ile wyst ąpi taka potrzeba, w celu umo żliwienia obserwacji 
opóźnionego zatrucia. Odst ęp ten mo że zostać przedłużony np. 
w przypadku niejednoznacznej reakcji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
W przypadku stosowania górnej dawki granicznej na poziomie 5 000 
mg/kg nale ży stosowa ć procedur ę przedstawion ą w załączniku 3 
(zob. także sekcja 1.6.2).  
1.5.3.2.  Badanie graniczne  
Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badaj ący posiada 
informacje sugeruj ące, że badany materia ł może być nietoksyczny 
np. posiada toksyczno ść na poziomie przekraczaj ącym nieznacznie 
dawki graniczne okre ślone przepisami wykonawczymi. Informacje 
na temat toksyczno ści można uzyska ć na podstawie wiedzy na 
temat podobnych zbadanych zwi ązków lub podobnych badanych 
mieszanin lub produktów, z uwzgl ędnieniem to żsamości 
i zawarto ści procentowej sk ładników, o których wiadomo, że mają 
znaczenie z punktu widzenia toksyczno ści. W sytuacji niewystar ­
czającej ilości lub braku informacji na temat toksyczno ści materia łu 
badanego lub w przypadku gdy oczekuje si ę, że badany materia ł 
może być toksyczny, nale ży przeprowadzi ć badanie zasadnicze.  
W przypadku zastosowania normalnej procedury badanie graniczne 
dla potrzeb niniejszych wytycznych polega na podaniu dawki wyjściowej badania pogl ądowego, a nast ępnie podaniu substancji 
czterem pozosta łym zwierz ętom.
 
1.6. OBSERWACJE  
Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz 
w ciągu pierwszych 30 minut po podaniu dawki, okresowo przez 
pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzgl ędnieniem pierwszych 4 
godzin, a nast ępnie codziennie, ogólnie przez 14 dni, z wyj ątkiem 
sytuacji, w których musz ą one zosta ć wyeliminowane z bada ń 
i uśmiercone w sposób humanitarny z uwagi na ich dobrostan, lub 
gdy padły. Jednak że czas trwania obserwacji nie powinien by ć usta­
lany wed ług ścisłych reguł. Powinien zale żeć od działania toksycz ­
nego, czasu wyst ąpienia skutków i d ługości okresu powrotu do stanu 
normalnego, i mo że skutkiem tego by ć wydłużony, w przypadku gdy 
zostanie to uznane za stosowne. Czas, w jakim pojawiaj ą się 
i zanikają objawy zatrucia, jest istotny, szczególnie w przypadku 
występowania opó źnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie 
spostrzeżenia są systematycznie zapisywane w ewidencji prowa ­
dzonej osobno dla ka żdego osobnika.  
Dodatkowe obserwacje s ą wymagane, je żeli zwierz ęta wciąż wyka­
zują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczy ć zmian na skórze 
i futrze, oczach i b łonach śluzowych, a tak że w układach oddecho ­
wym, krążenia, autonomicznym i centralnym uk ładzie nerwowym 
oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowań. Szczególn ą uwagę należy poświęcić obserwacjom dr że­
nia, konwulsji, ślinienia si ę, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Nale ży 
przestrzega ć zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotycz ­ 
ących humanitarnego punktu ko ńcowego (8). Zwierz ęta, u których 
stwierdzono stan agonalny, oraz zwierz ęta wykazuj ące objawy 
silnego bólu, powinny zosta ć uśmiercone w sposób humanitarny. 
W przypadku u śmiercenia zwierz ąt z przyczyn humanitarnych lub 
ich zgonu, czas zgonu powinien zosta ć zapisany najdok ładniej jak to 
możliwe.
 
1.6.1.  Masa cia ła 
Masa każdego zwierz ęcia powinna zosta ć określona na krótko przed 
podaniem substancji badanej i przynajmniej w odst ępie tygodnia od 
jej podania. Zmiany masy powinny zosta ć obliczone i zapisane. Po 
zakończeniu bada ń zwierz ęta, które prze żyły, są ważone 
i uśmiercane w sposób humanitarny.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patologia  
Wszystkie badane zwierz ęta (włączając zwierz ęta, które pad ły 
podczas bada ń lub zosta ły wyeliminowane z bada ń ze względu na 
ich dobrostan) powinny zosta ć poddane ca łkowitej sekcji zw łok. 
Wszystkie ca łkowite zmiany patologiczne powinny zosta ć zapisane 
oddzielnie dla ka żdego zwierz ęcia. Badanie mikroskopowe organów 
wykazujących wyra źne zmiany patologiczne u zwierz ąt, które prze ­ 
żyły 24 lub wi ęcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mog ą 
również zostać rozważone, poniewa ż mogą one dostarczy ć użytecz­
nych informacji.  
2. DANE  
Należy podać dane dla ka żdego zwierz ęcia. Dodatkowo, wszystkie 
dane powinny zosta ć streszczone w tabeli, pokazuj ącej dla ka żdej 
badanej grupy liczb ę wykorzystanych sztuk, liczb ę zwierząt wyka­
zujących objawy zatrucia, liczb ę zwierząt padłych w trakcie bada ń 
lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszcze ­
gólnych zwierz ąt, opis oraz przebieg w czasie skutków zatrucia oraz 
powrotu do stanu normalnego, a tak że wyniki sekcji zw łok. 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące informacje, je śli są 
one stosowne:  
Substancja badana:  
— charakter fizyczny, czysto ść, i jeśli to stosowne, w łaściwości 
fizyko-chemiczne (w łączając rodzaj izomerii),  
— identyfikacj ę w tym numer CAS.  
Nośnik (jeśli był użyty):  
— uzasadnienie wyboru no śnika, jeśli jest inny ni ż woda.  
Zwierzęta badane:  
— użyty gatunek/szczep,  
— stan mikrobiologiczny zwierz ęcia, jeśli jest znany,  
— liczbę, wiek i p łeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasad ­
nienie wykorzystania samców zamiast samic),  
— źródło, warunki środowiska, po żywienie itp.  
Warunki bada ń: 
— szczegó ły dotyczące postaci substancji badanej, w łączając stan 
skupienia podawanego środka,  
— szczegó ły dotycz ące podawania substancji badanej, w łączając 
objętość dawki oraz czas podawania dawki,  
— szczegó ły dotyczące jakości pożywienia i wody (w łączając w to 
rodzaj/źródło diety, źródło wody),  
— uzasadnienie wyboru dawki wyj ściowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Wyniki:  
— tabelę przedstawiaj ącą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla 
każdego zwierz ęcia (np. zwierz ąt wykazuj ących objawy zatrucia, 
włączając śmiertelno ść, a także charakter, intensywno ść oraz 
trwałość objawów),  
— tabelę zawieraj ącą informacj ę na temat masy cia ła oraz zmiany 
masy ciała, 
— masę indywidualn ą zwierząt w dniu podania dawki, nast ępnie 
w odstępach tygodniowych, a tak że w momencie śmierci lub 
uśmiercenia,  
— data i czas śmierci, o ile nast ąpiła przed przewidywanym u śmier­
ceniem,  
— przebieg w czasie objawów zatrucia i informacje, czy by ły one 
odwracalne w przypadku ka żdego zwierz ęcia, 
— wyniki sekcji zw łok oraz bada ń histopatologicznych dla ka żdego 
zwierzęcia, jeżeli są dostępne. 
Omówienie i interpretacja wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of 
substances and preparation on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.
 
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. 
(1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparation for their acute toxicity. Human 
Toxicol., 6, 279–291.
 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, 
A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose proce ­
dure as an alternative to the classical LD  50 test. Fd. Chem. 
Toxicol. 28, 469–482.  
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation 
of the fixed-dose procedure. Fd. Chem.Toxicol., 30, 313–324.  
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in 
the fixed-dose procedure. Human Exptl.Toxicol. 14, 
315–323. Human Exptl. Toxicol.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statis ­
tical evaluation of the revised fixed doseprocedure. Hum. Exp. 
Toxicol., 21, 183–196.  
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environ ­
mental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ ­
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no- 
24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and- 
Down, Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity 
Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223–231.  
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, 
USA.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 1  
SCHEMAT DZIA ŁAŃ DLA BADA Ń POGLĄDOWYCH

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 2  
SCHEMAT DZIA ŁAŃ DLA BADA Ń ZASADNICZYCH

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
ZAŁĄCZNIK 3  
KRYTERIA KLASYFIKACJI SUBSTANCJI BADANYCH 
O OCZEKIWANYCH WARTO ŚCIACH LD  50 PRZEKRACZAJ ĄCYCH 
2 000 MG/KG, Z POMINI ĘCIEM BADA Ń 
Kryteria kategorii niebezpiecze ństwa 5 maj ą w zamierzeniu umo żliwiać identy­
fikację substancji badanych, które charakteryzuj ą się niskim niebezpiecze ństwem 
ostrej toksyczno ści, lecz które w okre ślonych okoliczno ściach mog ą okazać się 
niebezpieczne dla populacji podatnych na zatrucie. Przewiduje si ę, że takie 
substancje charakteryzuj ą się pokarmowym lub skórnym LD  50 mieszczącym się 
w zakresie 2 000–5 000 mg/kg lub odpowiadaj ą analogicznym dawkom 
w przypadku innych szlaków kontaktu z substancj ą. Substancja mo że zostać 
zaklasyfikowana do kategorii niebezpiecze ństwa przy nast ępujących cechach: 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (kategoria 5 wed ług GHS) 
w następujących przypadkach:  
a) jeżeli została przypisana do tej kategorii w wyniku zastosowania jednego ze 
schematów przedstawionych w za łączniku 2, w oparciu o poziom śmiertel­
ności; 
b) jeżeli dostępne są wiarygodne dowody wskazuj ące, że LD  50 powinno znale źć 
się w obrębie kategorii 5; b ądź jeżeli inne badania na zwierz ętach lub ostre 
skutki u ludzi sugeruj ą niebezpiecze ństwo dla zdrowia ludzkiego spowodo ­
wane ostrym dzia łaniem;  
c) jeżeli okazuje si ę, w wyniku przeprowadzenia ekstrapolacji, szacunków lub 
pomiaru danych, że przypisanie do wy ższej klasy zagro żenia nie jest uzasad ­
nione oraz:  
— dostępne są wiarygodne informacje wskazuj ące na silne skutki toksyczne 
u ludzi, lub  
— zaobserwowano przypadki zgonu w toku pomiarów do warto ści kategorii 
4 w przypadku podania substancji droga pokarmow ą, lub  
— jeżeli ocena eksperta potwierdzi wyra źne kliniczne objawy toksyczno ści, 
w trakcie pomiarów do warto ści kategorii 4, z wyj ątkiem przypadków 
biegunki, piloerekcji lub wygl ądu odbiegaj ącego w sposób negatywny 
od normy, lub  
— jeżeli ocena eksperta potwierdzi wiarygodno ść informacji wskazuj ących 
na potencjalne, znaczne, ostre dzia łanie, uzyskanych w wyniku innych 
badań na zwierz ętach.  
BADANIA PRZY DAWKACH PRZEKRACZAJ ĄCYCH 2 000 MG/KG  
W wyjątkowych okoliczno ściach i wy łącznie jeżeli wymagaj ą tego okre ślone 
potrzeby regulacyjne, mo żna rozwa żyć podanie dawki dodatkowej sta łej na 
górnym poziomie 5 000 mg/kg. Z uwagi na dobrostan zwierz ąt badania przy 
5 000 mg/kg s ą odradzane i powinny by ć brane pod uwag ę wyłącznie 
w przypadku znacznego prawdopodobie ństwa, że wyniki takich bada ń przynios ą 
bezpośrednie korzy ści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierz ąt lub środowiska 
naturalnego (9).  
Badanie pogl ądowe  
Zakres przepisów niniejszej decyzji dotycz ących procedury sekwencyjnej 
określonej w za łączniku 1 zostaje rozszerzony o poziom dawki wynosz ący 
5 000 mg/kg. W zwi ązku z tym, je żeli w przypadku zastosowania w badaniu 
poglądowym dawki pocz ątkowej wynosz ącej 5 000 mg/kg wyst ąpi wynik 
A (zgon), nale ży zbadać następne zwierz ę z wykorzystaniem dawki 2 000 mg/kg; 
pojawienie si ę wyników B i C (wyra źne zatrucie lub brak zatrucia) pozwoli na 
wybranie dawki 5 000 mg/kg jako dawki wyj ściowej ma by ć: jako dawki 
wyjściowej badania g łównego. Podobnie, je żeli zostanie u żyta inna dawka ni ż 
5 000 mg/kg, badanie b ędzie zmierza ło do zastosowania dawki 5 000 mg/kg 
w przypadku wyst ąpienia wyników B lub C przy 2 000 mg/kg; pojawienie si ę 
następnie wyniku A przy dawce 5 000 mg/kg wyznaczy dawk ę wyjściową 
w badaniu zasadniczym przy 2 000 mg/kg, natomiast pojawienie si ę wyników 
B lub C wyznaczy dawk ę wyjściową w badaniu g łównym na 5 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Badanie g łówne  
Zakres przepisów niniejszej decyzji dotycz ących procedury sekwencyjnej 
określonej w za łączniku 2 zostaje rozszerzony o poziom dawki wynosz ący 
5 000 mg/kg. W zwi ązku z tym, w przypadku gdy dawka wyj ściowa badania 
zasadniczego wynosi 5 000 mg/kg, wynik A ( ≥ 2 przypadki śmiertelne) b ędzie 
wymagał zbadania drugiej grupy przy 2 000 mg/kg; wynik B (wyra źna toksycz ­
ność i/lub ≤ 1) lub wynik C (brak toksyczno ści) spowoduje niesklasyfikowanie 
substancji w ramach GHS. Podobnie, w przypadku zastosowania innej dawki początkowej ni ż 5 000 mg/kg, badanie b ędzie zmierza ło do 5 000 mg/kg przy 
wyniku C przy 2 000 mg/kg; pojawienie si ę następnie wyniku A przy 5 000 
mg/kg spowoduje przypisanie substancji do kategorii 5 GHS, natomiast poja ­
wienie się wyników B lub C spowoduje niesklasyfikowanie substancji.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 4  
METODA BADAWCZA B.1 bis  
Wytyczne dotycz ące klasyfikacji zgodnie z systemem WE obowi ązującej w okresie przej ściowym do momentu pe łnego wdro żenia Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji 
(GHS) (wytyczne pochodz ą z pozycji bibliograficznej (8))

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1 ter.  TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA POKARMOWA – METODA KLAS 
OSTREJ TOKSYCZNO ŚCI 
1. METODA  
Niniejsza metoda badawcza jest kopi ą OECD TG 423 (2001).  
1.1. WPROWADZENIE  
Metoda klas ostrej toksyczno ści (1) przyj ęta w tym badaniu jest 
procedurą stopniow ą, w której dla ka żdego stopnia wykorzystywane 
są trzy osobniki zwierz ąt jednej p łci. Zależnie od śmiertelno ści oraz/­
lub stanu agonalnego zwierz ąt do stwierdzenia ostrej toksyczno ści 
badanej substancji konieczne mog ą być średnio 2–4 etapy. Niniejsza 
procedura jest powtarzalna, w jej toku wykorzystuje si ę niewiele 
zwierząt i daje ona mo żliwość klasyfikacji substancji w sposób 
podobny do innych metod badania ostrej toksyczno ści. Metoda 
klas ostrej toksyczno ści opiera si ę na ocenach biometrycznych (2) ­
(3)(4)(5) przeprowadzonych z wykorzystaniem sta łych dawek, 
oddzielonych w odpowiedni sposób umo żliwiający ocenę substancji 
dla celów klasyfikacji i oceny niebezpiecze ństwa. Metoda ta zosta ła 
przyjęta w 1996 r. i by ła poddawana intensywnej weryfikacji  in vivo  
w oparciu o dane o LD  50 uzyskane z literatury, zarówno na szczeblu 
narodowym (6), jak i mi ędzynarodowym (7).  
Wytyczne dotycz ące wyboru najbardziej odpowiedniej metody 
badawczej dla danego przypadku zosta ły zamieszczone 
w Wytycznych dotycz ących badania toksyczno ści ostrej pokarmowej 
(8). Wytyczne te zawieraj ą ponadto dodatkowe informacje na temat 
przeprowadzania i interpretacji Metody badawczej B.1ter.  
Nie jest równie ż konieczne podawanie dawek mog ących powodowa ć 
silny ból lub strach wynikaj ący z dzia łania żrącego lub podra żniają­
cego. Zwierz ęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cier ­
piące albo chore i do świadczające strachu powinny zosta ć uśmier­
cone w humanitarny sposób i uwzgl ędniane w interpretacji wyników 
badań jako zwierz ęta padłe w trakcie badania. Kryteria podej ­
mowania decyzji co do u śmiercenia zwierz ąt w stanie agonalnym 
lub cierpi ących ból oraz wytyczne dotycz ące rozpoznawania przewi ­
dywalnego lub zbli żającego się zgonu, s ą zawarte w oddzielnych 
Wytycznych (9).  
Metoda opiera si ę na wcze śniej okre ślonych dawkach, a wyniki 
uzyskane w wyniku jej zastosowania pozwalaj ą na ocen ę 
i klasyfikacj ę zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem 
klasyfikacji zwi ązków chemicznych pod wzgl ędem ich ostrej 
toksyczno ści (10).  
W zasadzie niniejsza metoda nie pozwala na dok ładne obliczenie 
LD 50 , lecz pozwala na okre ślenie zakresu ekspozycji, tam gdzie 
oczekiwana jest śmiertelno ść, poniewa ż śmierć określonego odsetka 
zwierząt nadal stanowi jeden z g łównych punktów ko ńcowych bada ­
nia. Metoda umo żliwia okre ślenie warto ści LD  50 wyłącznie 
w przypadku, gdy przynajmniej dwie dawki spowodowa ły śmiertel­
ność wyższą niż 0 %, lecz mniejsz ą niż 100 %. Wykorzystanie 
selekcji wcze śniej okre ślonych dawek, niezale żnie od substancji 
badanej, której klasyfikacja jest wyra źnie powi ązana z liczb ą 
zwierząt obserwowanych na poszczególnych etapach, poprawia 
możliwości laboratoriom w zakresie konsekwencji i powtarzalno ści 
sprawozda ń laboratoryjnych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Laboratorium badawcze powinno uwzgl ędniać wszystkie dost ępne 
informacje na temat badanej substancji przed rozpocz ęciem bada ń. 
Informacje te powinny obejmowa ć tożsamość i budow ę chemiczn ą 
substancji; w łaściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych bada ń 
toksyczno ści in vitro  lub in vivo  substancji; dane dotycz ące toksycz ­
ności substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy; przewidywane 
zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te s ą 
niezbędne celem spe łnienia wszelkich wymogów dotycz ących 
ochrony zdrowia ludzkiego i umo żliwienia wyboru najbardziej odpo ­
wiedniej dawki wyj ściowej.  
1.2. DEFINICJE  
Toksyczno ść ostra pokarmowa:  oznacza niepo żądane skutki poja ­
wiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki 
substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin.  
Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje 
się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada pó źniej w 14-dniowym 
okresie obserwacyjnym.  
Dawka:  oznacza ilo ść podanej substancji badanej. Dawka jest wyra ­ 
żana w wadze próbki na jednostk ę masy zwierz ęcia (np. mg/kg).  
GHS:  Globalny Zharmonizowany System Klasyfikacji Substancji 
i Mieszanin Chemicznych. Po łączone dzia łania OECD (w dziedzinie 
zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ 
w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie w łaści­
wości fizyko-chemicznych) i Mi ędzynarodowej Organizacji Pracy 
(ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpiecze ństw), 
koordynowane w ramach Mi ędzyorganizacyjnego programu na rzecz 
właściwego zarz ądzania zwi ązkami chemicznymi (IOMC).  
Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku, gdy przewiduje 
się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierć przed nast ępnym zapla ­
nowanym punktem czasowym obserwacji. Objawy wskazuj ące 
na ten stan mog ą obejmowa ć u gryzonia konwulsje, u łożenie na 
boku, pozycj ę leżącą oraz drgawki (zob. Wytyczne dotycz ące huma­
nitarnego punktu ko ńcowego (9) celem uzyskania szczegó łowych 
informacji).  
LD 50 (średnia dawka śmiertelna):  jest statystycznie wyprowadzon ą 
pojedyncz ą dawką substancji, która powoduje zgon 50 procent 
zwierząt, przy podaniu drog ą pokarmow ą. Wartość LD  50 jest wyra ­ 
żona w wadze substancji badanej na jednostk ę masy badanego zwie ­
rzęcia (mg/kg).  
Dawka graniczna:  oznacza górn ą dawkę graniczn ą w badaniach 
(2 000 lub 5 000 mg/kg).  
Stan agonalny:  stan śmierci lub niezdolno ści do prze życia nawet 
w przypadku zastosowania leczenia (zob. Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu ko ńcowego (
 9 ) w celu uzyskania 
danych szczegó łowych).  
Przewidywana śmierć: obecność objawów klinicznych wskazuj ­ 
ących na nadchodz ący zgon w przewidzianym czasie w przysz łości 
przed planowanym zako ńczeniem eksperymentu, na przyk ład: 
niezdolno ść do dotarcia do wody lub po żywienia (zob. Wytyczne 
metodyczne dotycz ące humanitarnego punktu ko ńcowego (9) 
w celu uzyskania danych szczegó łowych).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Zasadą badania jest to, że w oparciu o procedur ę etapową z użyciem 
minimalnej liczby zwierz ąt na każdym etapie uzyskiwane s ą wystar­
czające informacje na temat ostrej toksyczno ści substancji badanej 
w celu jej zaklasyfikowania. Substancja jest podawana doustnie 
grupie zwierz ąt laboratoryjnych w jednej z okre ślonych dawek. 
Substancja jest badana przy u życiu procedury etapowej, na ka żdym 
etapie wykorzystywane s ą trzy zwierz ęta jednej p łci (na ogó ł sami­
ce). Brak lub obecno ść śmiertelno ści związanej z podaniem odczyn ­
nika zwierz ętom determinuje nast ępny etap, tj.:  
— dalsze badania s ą zbyteczne,  
— dawka zostaje podana trzem nast ępnym zwierz ętom, 
— dawka na nast ępnym niższym bądź wyższym poziomie zostaje 
podana trzem nast ępnym zwierz ętom. 
Szczegóły procedury s ą opisane w za łączniku 1. Metoda pozwala na 
ocenę w odniesieniu do przypisania substancji badanej do jednej 
z szeregu klas toksyczno ści określonych poprzez ustalone warto ści 
odcinania D  50 . 
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, cho ć dopuszcza si ę 
wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogó ł 
w doświadczeniach wykorzystuj ę się samice (9). Wynika to 
z faktu, znajduj ącego swoje potwierdzenie w literaturze na temat 
konwencjonalnych bada ń LD  50 , że różnice między płciami są 
znikome, lecz tam gdzie wyst ępują, samice s ą z reguły nieznacznie 
bardziej wra żliwe (11). Jednak że jeżeli wiedza na temat w łaściwości 
toksykologicznych i toksokinetycznych zwi ązków o podobnej 
budowie wskazuje na to, że samce mog ą być bardziej wra żliwe, 
w takim przypadku nale ży wybrać do badania t ę płeć. Jeżeli badanie 
jest przeprowadzane na samcach, nale ży podać uzasadnienie.  
Zaleca si ę wykorzystanie zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt 
pochodzących ze szczepów na ogó ł wykorzystywanych 
w laboratorium. Samice powinny by ć bezdzietne i nieci ężarne. 
Każde zwierz ę na pocz ątku cyklu laboratoryjnego powinno by ć 
w wieku mi ędzy 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna prze ­
kraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wyko ­
rzystywanych uprzednio zwierz ąt. 
1.4.2.  Warunki przebywania i warunki żywieniowe  
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 20  o C (± 3  o C). Chocia ż wilgotno ść względna powinna 
wynosić co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie przekracza ła 
70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno by ć 
utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć 
sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia 
można stosowa ć konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograni ­
czonym dost ępem do wody pitnej. Zwierz ęta mogą być grupowane 
w klatkach w sposób nieograniczaj ący łatwej obserwacji pojedyn ­
czych sztuk.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Przygotowanie zwierz ąt 
Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umo żliwiający 
identyfikacj ę pojedynczych osobników i przetrzymywane w swoich 
klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, 
co umożliwia aklimatyzacj ę do warunków laboratoryjnych.  
1.4.4.  Przygotowanie dawek  
Na ogół badana substancja powinna by ć podawana w dawkach 
o stałej objętości przy zmianie st ężenia dawkowanego preparatu. 
Jednakże w przypadku badania ko ńcowego produktu b ędącego 
cieczą lub mieszanin ą dla celów oceny ryzyka tej substancji bardziej 
stosowne mo że okazać się wykorzystanie w badaniach substancji 
nierozcieńczonej. tj. substancji o sta łym stężeniu. Wymóg ten 
może być ponadto okre ślony w niektórych przepisach wykonaw ­
czych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksy ­
malnej obj ętości przewidzianej do podania. Maksymalna obj ętość 
cieczy podanej jednorazowo zale ży od wielko ści badanego zwierz ę­
cia. Dla gryzoni obj ętość ta nie powinna przekracza ć 1 ml/100g 
masy cia ła: jednak że w przypadku roztworów wodnych dopusz ­
czalne jest przyj ęcie dawki 2 ml/100 g masy cia ła. Jeżeli chodzi 
o przygotowywanie dozowanego preparatu nale ży użyć, o ile to 
możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, nast ępnie rozwa żyć 
przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kuku ­
rydzianym), a dopiero w nast ępnej kolejno ści roztworów innych 
nośników. W przypadkach stosowania no śnika różnego od wody 
muszą być znane jego w łaściwości toksykologiczne. Dawki musz ą 
być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilno ść 
przygotowanego preparatu w okresie w jakim ma on by ć stosowany 
jest znana i mo żliwa do przyj ęcia. 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Podawanie dawki  
Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez 
zgłębnik przy u życiu sondy prze łykowej lub odpowiedniej kaniuli 
intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemo żliwe jest 
podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka mo że zostać rozbita 
na mniejsze porcje i podawana w odst ępach czasowych w okresie 
nieprzekraczaj ącym 24 godzin.  
Zwierzęta powinny by ć wyposzczone przed podaniem dawki (np. 
szczurom nale ży wstrzyma ć podawanie jedzenia przez noc, lecz 
nie wstrzymywa ć podawania wody, myszom nale ży wstrzyma ć 
podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, lecz nie wstrzymywa ć 
wody). Nast ępnie, po wyposzczeniu, zwierz ęta należy zważyć oraz 
podać im substancj ę badaną. W przypadku szczurów, po podaniu 
substancji badanej mo żna wstrzyma ć podawanie jedzenia przez 3–4 
godziny, a w przypadku myszy przez 1–2 godziny. Je żeli dawka jest 
podawana porcjami przez okre ślony czas, mo że być konieczne 
podanie pokarmu i wody w zale żności od długości okresu podawania 
dawki.  
1.5.2.  Liczba zwierz ąt i poziomy dawki  
Na każdym etapie wykorzystywane s ą trzy zwierz ęta. Poziom dawki, 
która ma by ć wykorzystana jako dawka wyj ściowa, jest wybierana 
z jednego z czterech sta łych poziomów 5, 50, 300 i 2 000 mg/kg 
masy ciała. Poziom wyj ściowy dawki powinien by ć taki, żeby powo ­
dował śmiertelno ść u niektórych zwierz ąt, którym j ą zaaplikowano. 
Schemat post ępowania zamieszczony w za łączniku 1 opisuje proce ­
durę, którą należy podjąć dla każdej dawki wyj ściowej. Dodatkowo, 
do momentu przyj ęcia nowego GHS, obowi ązujące są wytyczne 
zawarte w za łączniku 4, dotycz ące klasyfikacji substancji 
w ramach systemu WE.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Jeżeli dostępne informacje sugeruj ą brak prawdopodobie ństwa śmier­
telności przy najwy ższym poziomie dawki (2 000 mg/kg masy cia ła), 
powinno zosta ć przeprowadzone badanie graniczne. W przypadku 
braku informacji na temat danej substancji, która ma by ć badana, 
z uwagi na dobrostan zwierz ąt zalecane jest zastosowanie dawki 
wyjściowej 300 mg/kg masy cia ła. 
Odstępy między podawaniem dawek na ka żdym poziomie okre śla się 
na podstawie czasu wyst ąpienia, długości trwania i dokuczliwo ści 
objawów zatrucia. Podanie zwierz ęciu następnej dawki powinno 
zostać opóźnione do momentu uzyskania pewno ści co do mo żliwości 
przeżycia zwierz ąt, którym podano ostatni ą dawkę. 
W wyjątkowych okoliczno ściach i wy łącznie jeżeli wymagaj ą tego 
określone potrzeby regulacyjne, mo żna rozwa żyć podanie dawki 
dodatkowej ustalonej na górnym poziomie 5 000 mg/kg (zob. 
załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierz ąt badania na zwierz ętach 
w zakresie kategorii 5 GSH (2 000 i 5 000 mg/kg) s ą odradzane 
i powinny by ć rozważane wyłącznie w przypadku znacznego praw ­
dopodobie ństwa, że wyniki takich bada ń przynios ą bezpośrednie 
korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierz ąt lub środowiska 
naturalnego.  
1.5.3.  Badanie graniczne  
Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badaj ący posiada 
informacje sugeruj ące, że badany materia ł może być nietoksyczny 
np. posiada toksyczno ść na poziomie przekraczaj ącym nieznacznie 
dawki graniczne okre ślone przepisami wykonawczymi. Informacje 
na temat toksyczno ści mogą zostać uzyskane na podstawie wiedzy 
na temat podobnych zbadanych zwi ązków lub podobnych zbadanych 
mieszanin lub produktów, z uwzgl ędnieniem to żsamości i zawarto ści 
procentowej sk ładników, o których wiadomo, że mają znaczenia z 
punktu widzenia toksyczno ści. W sytuacji niewystarczaj ącej ilości 
lub braku informacji na temat toksyczno ści materia łu testowego 
lub w przypadku gdy, zgodnie z oczekiwaniami, badany materia ł 
może być toksyczny, nale ży przeprowadzi ć badanie zasadnicze.  
Badanie graniczne dla jednej dawki na poziomie 2 000 mg/kg masy 
ciała może zostać przeprowadzone na sze ściu zwierz ętach (trzy na 
każdym etapie). W wyj ątkowych okoliczno ściach dopuszczalne jest 
przeprowadzenie badania granicznego przy jednej dawce na poziomie 5 000 mg/kg na trzech zwierz ętach (zob. za łącznik 2). 
W przypadku wyst ąpienia śmiertelno ści związanej z substancj ą 
badaną konieczne mo że okazać się przeprowadzenie badania na 
następnym niższym poziomie.
 
1.6. OBSERWACJE  
Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz 
w ciągu pierwszych 30 min. po podaniu dawki, okresowo przez 
pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzgl ędnieniem pierwszych 
4 godzin, a nast ępnie codziennie ogólnie przez 14 dni, z wyj ątkiem 
sytuacji w których musz ą one zosta ć wyeliminowane z bada ń 
i humanitarnie zabite ze wzgl ędu na ich dobro, lub zosta ły znale­
zione martwe. Jednak że czas trwania obserwacji nie powinien by ć 
ustalany wed ług ścisłych reguł. Powinien on by ć zależny od dzia ­ 
łania toksycznego, czasu wyst ąpienia skutków i d ługości okresu 
powrotu do stanu normalnego, i mo że skutkiem tego by ć przedłu­ 
żany, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas 
w jakim pojawiaj ą się i zanikaj ą objawy zatrucia jest istotny, szcze ­
gólnie w przypadku wyst ępowania opó źnionych objawów zatrucia 
(11). Wszystkie obserwacje s ą systematycznie zapisywane 
w ewidencji prowadzonej osobno dla ka żdego zwierz ęcia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Dodatkowe obserwacje b ędą wymagane, je żeli zwierz ęta wciąż 
wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczy ć zmian na 
skórze i futrze, oczach i śluzówce a tak że w układach oddechowym, 
krążenia, autonomicznym i centralnym uk ładzie nerwowym oraz 
zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zacho ­
wania. Szczególn ą uwagę należy poświęcić obserwacjom dr żenia, 
drgawek, ślinienia si ę, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Nale ży prze­
strzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotycz ących 
humanitarnego punktu ko ńcowego. Zwierz ęta u których stwierdzono 
stan agonalny oraz zwierz ęta wykazuj ące objawy silnego bólu 
powinny zosta ć uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku 
uśmiercenia zwierz ąt z przyczyn humanitarnych lub stwierdzenia 
u nich zgonu, czas zgonu powinien zosta ć zapisany najdok ładniej, 
jak to jest mo żliwe.  
1.6.1.  Masa cia ła 
Masa każdego zwierz ęcia powinna zosta ć określona na krótko przed 
podaniem substancji badanej i przynajmniej w odst ępie tygodnia od 
jej podania. Zmiany masy powinny zosta ć obliczone i zapisane. Po 
zakończeniu bada ń zwierz ęta, które prze żyły, są ważone 
i humanitarnie u śmiercane.  
1.6.2.  Patologia  
Wszystkie badane zwierz ęta (włączając zwierz ęta, które pad ły 
podczas bada ń lub zosta ły wyeliminowane z bada ń ze względu na 
ich dobro) powinny zosta ć poddane ca łkowitej sekcji zw łok. 
Wszystkie ca łkowite zmiany patologiczne powinny zosta ć zapisane 
oddzielnie dla ka żdego zwierz ęcia. Badanie mikroskopowe organów 
wykazujących ewidentne zmiany patologiczne u zwierz ąt, które prze ­ 
żyły 24 lub wi ęcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mog ą 
również zostać wzięte pod uwag ę, poniewa ż mogą one dostarczy ć 
użytecznych informacji.  
2. DANE  
Należy podać dane dla ka żdego zwierz ęcia. Dodatkowo, wszystkie 
dane powinny zosta ć streszczone w tabeli pokazuj ącej dla ka żdej 
badanej grupy liczb ę wykorzystanych sztuk, liczb ę zwierząt wyka­
zujących objawy zatrucia, liczb ę zwierząt, u których stwierdzono 
zgon w trakcie bada ń lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, 
czas zgonu poszczególnych zwierz ąt, opis oraz przebieg w czasie 
objawów zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a tak że wyniki 
sekcji.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. Sprawozdanie z bada ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące informacje, o ile s ą 
one stosowne:  
Substancja badana:  
— charakter fizyczny, czysto ść, i jeśli to stosowne, w łaściwości 
fizyko-chemiczne (w łączając rodzaj izomerii),  
— identyfikacja, w tym numer CAS.  
Nośnik (jeśli był użyty):  
— uzasadnienie wyboru no śnika, jeśli jest inny ni ż woda.  
Zwierzęta badane:  
— użyty gatunek/szczep,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— stan mikrobiologiczny zwierz ęcia, jeśli jest znany,  
— liczbę, wiek i p łeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasad ­
nienie wykorzystania samców zamiast samic),  
— źródło, warunki środowiska, po żywienie itp.  
Warunki bada ń: 
— szczegó ły dotyczące postaci substancji badanej, w łączając stan 
skupienia podawanego środka,  
— szczegó ły dotycz ące podawania substancji badanej, w łączając 
objętość dawki oraz czas podawania dawki,  
— szczegó ły dotyczące jakości pożywienia i wody (w łączając w to 
rodzaj/źródło diety, źródło wody),  
— uzasadnienie wyboru dawki wyj ściowej.  
Wyniki:  
— tabelę przedstawiaj ącą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla 
każdego zwierz ęcia (np. zwierz ąt wykazuj ących objawy zatrucia, 
włączając śmiertelno ść, charakter, intensywno ść oraz trwa łość 
objawów),  
— tabelę zawieraj ącą informacje na temat masy cia ła oraz zmian 
masy ciała, 
— masę indywidualn ą zwierząt w dniu podania dawki, nast ępnie 
w tygodniowych odst ępach, a tak że w momencie śmierci lub 
uśmiercenia,  
— data i czas śmierci, o ile nast ąpiła przed przewidywanym u śmier­
ceniem,  
— przebieg w czasie objawów zatrucia i czy by ły one odwracalne 
w przypadku ka żdego zwierz ęcia, 
— wyniki sekcji oraz bada ń histopatologicznych w odniesieniu do 
każdego zwierz ęcia, jeżeli są dostępne. 
Omówienie i interpretacja wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspec ­
tives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.
 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336–341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. 
(1994). The Biometric Evaluation of the Acute- Toxic-Class Metoda (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559–610.
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729–734.
 
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Meto ­
das: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX16, 129–134.  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). 
A National Validation Study of the Acute-Toxic- Class 
Method. An Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, 
455–470.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The 
International Validation Study of the Acute- Toxic-Class 
Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659–670.  
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Grade N. 24. Paris.
 
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Grade 
and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experi ­
mental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment N 19.
 
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working 
Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 
[http://webnet1.oecd.org/oecd/stronas/home/displaygeneral/ ­
0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]
 
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, 
Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and 
Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conven ­
tional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. 
Chem. Toxicol 33, 223–231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology.  Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
ZAŁĄCZNIK 1  
PROCEDURA REALIZOWANA W PRZYPADKU DAWEK 
WYJŚCIOWYCH  
UWAGI OGÓLNE  
Dla każdej dawki wyj ściowej, odpowiednie schematy bada ń zawarte 
w niniejszym za łączniku przedstawiaj ą procedur ę, jaką należy zastosowa ć. 
— ZAŁĄCZNIK 1a: Dawka pocz ątkowa wynosi 5 mg/kg.  
— ZAŁĄCZNIK 1b: Dawka pocz ątkowa wynosi 50 mg/kg.  
— ZAŁĄCZNIK 1c: Dawka pocz ątkowa wynosi 300 mg/kg.  
— ZAŁĄCZNIK 1d: Dawka pocz ątkowa wynosi 2 000 mg/kg.  
W zależności od liczby zwierz ąt uśmierconych w sposób humanitarny lub mart ­
wych zwierz ąt procedura bada ń przebiega zgodnie z kierunkiem wyznaczanym 
przez strza łki. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 1A  
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJ ŚCIOWEJ 5 MG/KG MASY CIA ŁA

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 1B  
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJ ŚCIOWEJ 50 MG/KG MASY CIA ŁA

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 1C  
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJ ŚCIOWEJ 300 MG/KG MASY CIA ŁA

 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 211
 ▼B 
ZAŁĄCZNIK 1D  
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJ ŚCIOWEJ 2 000 MG/KG MASY CIA ŁA

 ZAŁĄCZNIK 2  
KRYTERIA KLASYFIKACJI SUBSTANCJI BADANYCH 
O OCZEKIWANYCH WARTO ŚCIACH LD  50 PRZEKRACZAJ ĄCYCH 
2 000 mg/kg, Z POMINI ĘCIEM BADA Ń 
Kryteria kategorii niebezpiecze ństwa 5 maj ą w zamierzeniu umo żliwiać identy­
fikację substancji badanych, które charakteryzuj ą się niskim niebezpiecze ństwem 
ostrej toksyczno ści, lecz które, w okre ślonych okoliczno ściach mog ą okazać się 
niebezpieczne dla populacji podatnych na zatrucie. Przewiduje si ę, że takie 
substancje charakteryzuj ą się pokarmowym lub skórnym LD  50 mieszczącym się 
w zakresie 2 000–5 000 mg/kg lub odpowiadaj ą analogicznym dawkom 
w przypadku innych szlaków kontaktu z substancj ą. Substancja mo że zostać 
zaklasyfikowana do kategorii niebezpiecze ństwa przy nast ępujących cechach: 
2 000 mg/kg < LD  50 < 5 000 mg/kg (kategoria 5 wed ług GHS) 
w następujących przypadkach:  
a) jeżeli została przypisana do tej kategorii w wyniku zastosowania jednego ze 
schematów przedstawionych w za łącznikach 1a–1d, w oparciu o poziom 
śmiertelno ści; 
b) jeżeli dostępne są wiarygodne dowody wskazuj ące, że LD  50 powinno znale źć 
się w obrębie kategorii 5; b ądź jeżeli inne badania na zwierz ętach lub ostre 
skutki u ludzi sugeruj ą niebezpiecze ństwo dla zdrowia ludzkiego spowodo ­
wane ostrym dzia łaniem;  
c) jeżeli okazuje si ę, w wyniku przeprowadzenia ekstrapolacji, szacunków lub 
pomiaru danych, że przypisanie do wy ższej klasy niebezpiecze ństwa nie jest 
uzasadnione oraz:  
— dostępne są wiarygodne informacje wskazuj ące na silne skutki toksyczne 
u ludzi, lub  
— zaobserwowano przypadki zgonu w toku pomiarów do warto ści kategorii 
4 w przypadku podania substancji droga pokarmow ą, lub  
— jeżeli ocena eksperta potwierdzi wyra źne kliniczne objawy toksyczno ści, 
w trakcie pomiarów do warto ści kategorii 4, z wyj ątkiem przypadków 
biegunki, piloerekcji lub wygl ądu odbiegaj ącego w sposób negatywny 
od normy, lub  
— jeżeli ocena eksperta potwierdzi wiarygodno ść informacji wskazuj ących 
na potencjalne, znaczne, ostre dzia łanie uzyskanych w wyniku innych 
badań na zwierz ętach zwierz ąt. 
BADANIA PRZY DAWKACH PRZEKRACZAJ ĄCYCH 2 000 MG/KG  
Uznając potrzeb ę dbałości o dobrostan zwierz ąt, badanie zwierz ąt w ramach 
kategorii 5 (5 000 mg/kg) jest odradzane i powinno by ć rozważane, wyłącznie 
jeżeli występuje wysokie prawdopodobie ństwo, że wynik takich bada ń będzie 
miał bezpośredni wp ływ na bezpiecze ństwo i zdrowie ludzi i zwierz ąt (10). 
Nie należy prowadzi ć badań przy zastosowaniu wy ższych poziomów dawek.  
W przypadku konieczno ści przeprowadzenia badania przy zastosowaniu dawki 
5 000 mg/kg wymagane jest przeprowadzenie jednego etapu (tj. przy wykorzys ­
taniu trzech zwierz ąt). Jeżeli pierwsze zwierz ę padnie, nast ępnemu podaje si ę 
2 000 mg/kg, zgodnie ze schematem dzia łań zamieszczonym w za łączniku 
1. Jeżeli pierwsze zwierz ę przeżyje, dawka podawana jest dwóm nast ępnym. 
Jeżeli pada wy łącznie jedno zwierz ę, przyjmuje si ę, że wartość LD  50 przekracza 
5 000 mg/kg. Je żeli padają oba zwierz ęta, podawanie kontynuuje si ę na poziomie 
2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
ZAŁĄCZNIK 3  
METODA BADAWCZA B.1 ter Wytyczne dotycz ące klasyfikacji zgodnie z systemem WE 
obowiązującej w okresie przej ściowym do momentu pe łnego wdro żenia Globalnego 
Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji (GHS) (wytyczne pochodz ą z pozycji 
bibliograficznej (8))
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 213
 
▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 214
 
▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 215
 
▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 216
 
B.2. OSTRA TOKSYCZNO ŚĆ INHALACYJNA  
WSTĘP 
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 403 (OECD TG 403) (2009) 
(1). Dotycz ącą badań ostrej toksyczno ści inhalacyjnej wytyczn ą nr 403 
(TG 403) przyj ęto po raz pierwszy w 1981 r. Niniejsza zmieniona metoda 
badawcza B.2 (równowa żna zmienionej wytycznej TG 403) zosta ła zapro­
jektowana jako bardziej elastyczna i maj ąca na celu zmniejszenie wykorzys ­
tania zwierz ąt oraz zaspokojenie potrzeb regulacyjnych. W ramach zmie ­
nionej metody badawczej przewidziano dwa rodzaje bada ń: tradycyjny 
protokół LC  50 oraz protokó ł „stężenie × czas” (C × t). Podstawowe cechy 
niniejszej metody badawczej to mo żliwość uzyskania zale żności stężenie- 
odpowied ź, od efektów nieletalnych po letalne, w celu wyprowadzenia 
mediany st ężenia śmiertelnego (LC  50 ), stężenia progowego niepowoduj ą­
cego przypadków śmiertelnych (np. LC01) czy nachylenia krzywej, jak 
również w celu okre ślenia potencjalnej podatno ści ze wzgl ędu na płeć. 
Protokół C × t powinno si ę stosować wtedy, gdy istnieje szczególna, wyni ­
kająca z regulacji lub powodów naukowych potrzeba przeprowadzenia 
badań na zwierz ętach z zastosowaniem wielu okresów trwania nara żenia, 
np. do celów planowania dzia łań w sytuacjach wyj ątkowych [przyk ładowo 
do wyliczenia warto ści dla wytycznych w sprawie poziomów nara żenia 
ostrego (Acute Exposure Guideline Levels – AEGL), wytycznych 
w sprawie planowania dzia łań w sytuacjach wyj ątkowych (Emergency 
Response Planning Guidelines – ERPG) b ądź poziomów progowych dla 
narażenia ostrego (Acute Exposure Threshold Levels – AETL)], czy te ż 
do celów zagospodarowania przestrzennego.  
2. Wytyczne w sprawie przeprowadzania bada ń niniejszą metodą badawcz ą 
oraz interpretacji ich wyników mo żna znaleźć w wytycznych dotycz ących 
ostrej toksyczno ści inhalacyjnej (Guidance Document on Acute Inhalation 
Toxicity Testing) (GD 39) (2).  
3. Definicje stosowane w kontek ście niniejszej metody badawczej znajduj ą się 
na końcu tego rozdzia łu i w GD 39 (2).  
4. Niniejsza metoda badawcza umo żliwia scharakteryzowanie badanej 
substancji chemicznej oraz ilo ściową ocenę ryzyka, jak równie ż pozwala 
na ocen ę i klasyfikacj ę badanych substancji chemicznych zgodnie 
z rozporz ądzeniem (WE) nr 1272/2008 (3). W dokumencie GD 39 (2) 
znajdują się wytyczne dotycz ące wyboru odpowiedniej metody badawczej 
dla badania toksyczno ści ostrej. W przypadku gdy potrzebne s ą tylko infor ­
macje dotycz ące klasyfikacji i oznakowania, zasadniczo zalecany jest 
rozdział B.52 niniejszego za łącznika (4) [zob. GD 39 [2]). Niniejsza metoda 
badawcza B.2 nie jest przeznaczona konkretnie do badania materia łów 
specjalnych, takich jak s łabo rozpuszczalne materia ły izometryczne lub 
włókniste czy te ż wytworzone nanomateria ły. 
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE  
5. Aby zminimalizowa ć wykorzystanie zwierz ąt, przed rozwa żeniem wyko ­
nania bada ń według niniejszej metody badawczej laboratorium przeprowa ­
dzające badanie powinno wzi ąć pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje 
na temat badanej substancji chemicznej, w tym wyniki istniej ących bada ń 
(np. wykonanych metod ą B.52 opisan ą w niniejszym za łączniku (4)), dzi ęki 
którym mo żna byłoby unikn ąć wykonywania dodatkowych bada ń. Informa ­
cje, które mog ą być pomocne w doborze najbardziej odpowiedniego 
gatunku, szczepu, p łci i sposobu nara żenia oraz odpowiednich st ężeń do 
badania obejmuj ą nazwę, struktur ę chemiczn ą i właściwości fizykoche ­
miczne badanej substancji chemicznej; wyniki wszelkich bada ń toksyczno ści 
in vitro  lub in vivo ; spodziewane zastosowania i potencjalne nara żenie ludzi; 
dostępne dane dotycz ące (Q)SAR oraz dane toksykologiczne na temat struk ­
turalnie powi ązanych zwi ązków [zob. GD 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 217
 
6. Nale ży w zakresie, w jakim jest to mo żliwe, unika ć badania żrących lub 
drażniących substancji chemicznych w st ężeniach, które mog ą powodowa ć 
silny ból lub stres. Potencjalne dzia łanie żrące/drażniące należy ocenić na 
podstawie specjalistycznej wiedzy, wykorzystuj ąc dowody, takie jak 
doświadczenia z bada ń na ludziach i zwierz ętach (np. z u życiem dawki 
powtarzanej w st ężeniach, w których dana substancja nie jest żrąca/nie 
powoduje podra żnienia), istniej ących danych  in vitro  (np. uzyskanych meto ­
dami z rozdzia łów B.40 (5), B.40bis (6) niniejszego za łącznika lub 
z wytycznej OECD TG 435 (7)), warto ści pH, informacji dotycz ących 
podobnych substancji lub wszelkich innych odno śnych danych, tak aby 
zbadać możliwość rezygnacji z dalszych bada ń. Dla zaspokojenia szczegól ­
nych potrzeb regulacyjnych (np. do celów planowania dzia łań w sytuacjach 
wyjątkowych) mo żna użyć niniejszej metody badawczej przy poddawaniu 
zwierząt działaniu tych materia łów, poniewa ż daje to kierownikowi badania 
bądź głównemu badaczowi kontrol ę nad wyborem st ężeń docelowych. 
Stężenia te nie powinny jednak mie ć działania podra żniającego/żrącego, 
ale powinny by ć wystarczaj ące do przed łużenia krzywej st ężenie-odpowied ź 
do poziomu, przy którym zostanie osi ągnięty cel regulacyjny i naukowy 
danego badania. St ężenia nale ży dobiera ć indywidualnie w ka żdym przy ­
padku, a wybór uzasadnia ć [zob. GD 39 (2)].  
ZASADA BADANIA  
7. Niniejsza zmieniona metoda badawcza B.2 zosta ła zaprojektowana w celu 
uzyskania wystarczaj ących informacji na temat ostrej toksyczno ści badanej 
substancji chemicznej w celu umo żliwienia jej klasyfikacji i otrzymania 
danych dotycz ących śmiertelno ści (np. LC  50 , LC  01 i nachylenia) dla jednej 
lub obu p łci, potrzebnych do ilo ściowych ocen ryzyka. Niniejsza metoda 
badawcza obejmuje dwie metody. Pierwsza z nich to protokó ł tradycyjny, 
w którym grupy zwierz ąt narażane są na działanie stężenia granicznego 
(badanie graniczne) lub szeregu st ężeń w procedurze sekwencyjnej przez 
określony z góry czas, zazwyczaj 4 godziny. Dla poszczególnych celów 
regulacyjnych mog ą obowiązywać inne czasy trwania nara żenia. Druga 
metoda to protokó ł (C x t), w ramach którego grupy zwierz ąt naraża się 
na działanie jednego st ężenia (stężenia granicznego) lub szeregu ró żnych 
stężeń przez ró żny czas.  
8. Zwierz ęta w stanie agonalnym lub zwierz ęta wykazuj ące oczywiste oznaki 
bólu czy oznaki ostrego i przewlek łego stresu powinny zosta ć uśmiercone 
w humanitarny sposób i uwzgl ędnione w interpretacji wyników bada ń w ten 
sam sposób, co zwierz ęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania 
decyzji co do u śmiercenia zwierz ąt w stanie agonalnym lub cierpi ących 
silny ból oraz wytyczne dotycz ące rozpoznawania prognozowanego lub 
nieuchronnie zbli żającego się zgonu s ą zawarte w dotycz ących 
humanitarnego punktu ko ńcowego wytycznych OECD nr 19 (8).  
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
9. Zaleca si ę użycie zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt pochodz ących ze 
szczepów powszechnie wykorzystywanych w laboratorium. Preferowanym 
gatunkiem jest szczur, a w przypadku wykorzystania innego gatunku nale ży 
podać uzasadnienie.  
Przygotowanie zwierz ąt 
10. Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą być w ciąży. W dniu nara żenia 
zwierzęta powinny by ć młodymi doros łymi osobnikami w wieku 8–12 
tygodni, a ich masa cia ła powinna mie ścić się w zakresie ± 20 % średniej 
masy dla ka żdej płci zwierz ąt w tym samym wieku poddanych uprzednio 
narażeniu. Zwierz ęta wybiera si ę losowo i oznacza w sposób umo żliwiający 
identyfikacj ę poszczególnych osobników. Zwierz ęta przetrzymuje si ę 
w klatkach przez co najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem badania, aby 
umożliwić ich aklimatyzacj ę do warunków laboratoryjnych. Zwierz ęta 
powinny równie ż być przyzwyczajane do przyrz ądów używanych 
w badaniu przez krótki okres przed badaniem, poniewa ż zmniejszy to ich 
stres spowodowany wprowadzeniem do nowego środowiska.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 218
 
Hodowla zwierz ąt 
11. Temperatura w pomieszczeniach, w których przebywaj ą zwierzęta doświad­
czalne, powinna wynosi ć 22 ± 3 °C. Najlepiej by łoby, gdyby wilgotno ść 
względna była utrzymywana w przedziale 30–70 %, chocia ż może to być 
niemożliwe w przypadku stosowania wody jako no śnika. Przed nara żeniem 
i po nim zwierz ęta powinny zasadniczo by ć trzymane w klatkach w grupach 
podzielonych ze wzgl ędu na płeć i badane st ężenie, ale liczba zwierz ąt 
w klatce nie powinna zak łócać możliwości obserwacji ka żdego zwierz ęcia 
i powinna by ć taka, aby zminimalizowa ć straty spowodowane kanibalizmem 
i walkami. Je żeli zwierz ęta mają być poddane nara żeniu tylko przez nos, 
konieczne mo że być przyzwyczajenie ich do rur unieruchamiaj ących. Rury 
unieruchamiaj ące nie powinny powodowa ć nadmiernego stresu fizycznego 
i termicznego dla zwierz ąt ani stresu spowodowanego unieruchomieniem. 
Unieruchomienie mo że mieć wpływ na fizjologiczne punkty ko ńcowe, takie 
jak temperatura cia ła (hipertermia) lub minutowa pojemno ść oddechowa. 
Jeżeli dostępne są dane ogólne, na podstawie których mo żna wykaza ć, że 
takie zmiany nie wyst ępują w znacz ącym stopniu, uprzednia adaptacja do 
rur unieruchamiaj ących nie jest konieczna. Zwierz ęta, których ca ła 
powierzchnia cia ła jest nara żana na dzia łanie aerozolu, w trakcie nara żenia 
powinny by ć trzymane oddzielnie, aby zapobiec filtrowaniu badanego aero ­
zolu przez futro innych zwierz ąt w tej samej klatce. Mo żna stosowa ć pasze 
konwencjonalne oraz certyfikowane pasze laboratoryjne, z wyj ątkiem 
okresów poddawania nara żeniu, nale ży także zapewni ć nieograniczony 
dostęp do wody pitnej z instalacji wodoci ągowej. O świetlenie powinno 
być sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. 
Komory inhalacyjne  
12. Przy wyborze komory inhalacyjnej nale ży wziąć pod uwag ę charakter 
badanej substancji chemicznej i cel badania. Preferowan ą drogą narażenia 
jest narażenie tylko przez nos (poj ęcie to obejmuje nara żenie tylko g łowy, 
narażenie tylko przez nos lub nara żenie tylko pyska). Nara żenie tylko przez 
nos jest na ogó ł preferowane w badaniach aerozoli ciek łych lub sta łych oraz 
par, które mog ą skraplać się, tworząc aerozole. Nara żenie całego ciała może 
bardziej sprzyja ć osiągnięciu szczególnych celów badania, taki wybór 
należy jednak uzasadni ć w sprawozdaniu z badania. Aby zagwarantowa ć 
stabilność atmosfery przy zastosowaniu komory do poddawania nara żeniu 
całego ciała, łączna objętość badanych zwierz ąt nie powinna przekracza ć 
5 % objętości komory. Zasady technik nara żenia tylko przez nos oraz 
przez powierzchni ę całego ciała oraz ich szczególne zalety i wady 
omówiono w GD 39 (2).  
WARUNKI NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE SUBSTANCJI  
Stosowanie st ężeń 
13. Nara żenie tylko przez nos w przypadku szczurów mo że trwać do 6 godzin. 
Jeżeli narażeniu tylko przez nos poddaje si ę myszy, czas nara żenia nie 
powinien zasadniczo przekracza ć 4 godzin. Je żeli potrzebne s ą badania 
z dłuższym czasem trwania nara żenia, nale ży podać uzasadnienie [zob. 
GD 39 (2)]. Zwierz ęta poddane dzia łaniu aerozoli w komorach do 
poddawania nara żeniu całego ciała należy przetrzymywa ć pojedynczo, aby 
zapobiec po łykaniu badanej substancji chemicznej przy wylizywaniu innych 
zwierząt znajdujących się w tej samej klatce. W okresie nara żenia na dzia ­ 
łanie substancji nale ży wstrzyma ć podawanie paszy. Podczas poddawania 
narażeniu całego ciała można zapewni ć dostęp do wody.  
14. Zwierz ęta są poddawane nara żaniu na dzia łanie badanej substancji 
chemicznej w postaci gazu, pary, aerozolu lub mieszaniny tych postaci. Stan fizyczny, który ma by ć przedmiotem badania, zale ży od właściwości 
fizykochemicznych badanej substancji chemicznej, wybranego st ężenia lub 
formy fizycznej, która najprawdopodobniej b ędzie wyst ępować podczas 
postępowania z badan ą substancj ą chemiczn ą i jej stosowania. Substancje 
chemiczne o charakterze higroskopijnym oraz chemicznie reaktywne nale ży 
badać w suchej atmosferze. Nale ży zachowa ć ostrożność, aby unikn ąć 
osiągnięcia stężenia wybuchowego.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 219
 
Rozkład wielko ści cząstek 
15. W odniesieniu do wszystkich aerozoli oraz par, które mog ą skraplać się, 
tworząc aerozole, nale ży dokona ć klasyfikacji cz ąstek wed ług wielko ści. 
W celu umo żliwienia nara żenia wszystkich odpowiednich cz ęści dróg odde ­
chowych na dzia łanie danej substancji zaleca si ę aerozole o średnicy aero ­
dynamicznej mediany rozk ładu masowego (MMAD) wynosz ącej od 1 do 
4 μm przy geometrycznym standardowym odchyleniu ( σ g ) równym od 1,5 
do 3,0 (2) (9) (10). Nale ży dołożyć uzasadnionych stara ń, aby spe łnić tę 
normę, jednak w razie niemo żności jej osiągnięcia należy przedstawi ć ocenę 
eksperta. Przyk ładowo pary metali mog ą zawierać cząstki mniejsze, ni ż 
przewiduje to norma, a cz ąstki naładowane, w łókna i materia ły higrosko ­
pijne (których rozmiar zwi ększa się w wilgotnym środowisku uk ładu odde ­
chowego) mog ą tę normę przekracza ć. 
Przygotowanie badanej substancji chemicznej w no śniku  
16. Do uzyskania odpowiedniego st ężenia i rozmiaru cz ąstek badanej substancji 
chemicznej w atmosferze mo żna zastosowa ć nośnik. Zasadniczo prefero ­
wanym no śnikiem powinna by ć woda. Materia ły stałe można podda ć 
obróbce mechanicznej w celu uzyskania wymaganego rozk ładu wielko ści 
cząstek, jednak nale ży zachowa ć ostrożność, aby badana substancja 
chemiczna nie uleg ła rozkładowi ani zmianom. W przypadkach, 
w których mo żna przypuszcza ć, że w wyniku procesów mechanicznych 
zmienił się skład badanej substancji chemicznej (np. w ekstremalnych 
temperaturach powstaj ących na skutek tarcia przy nadmiernie intensywnym 
mieleniu), nale ży go zweryfikowa ć metodami analitycznymi. Nale ży 
dołożyć odpowiednich stara ń, aby unikn ąć zanieczyszczenia badanej 
substancji chemicznej. Nie ma potrzeby badania materia łów granulowanych 
niemających charakteru sypkiego, które s ą celowo przygotowywane tak, aby 
nie ulega ły wdychaniu. Nale ży wykona ć próbę na ścieranie w celu wyka ­
zania, że przy post ępowaniu z materia łem granulowanym nie powstaj ą 
cząstki respirabilne. Je żeli w wyniku próby na ścieranie powstan ą substancje 
respirabilne, nale ży wykona ć badanie toksyczno ści inhalacyjnej.  
Zwierzęta kontrolne  
17. Wykorzystanie równoleg łej ujemnej (poddanej dzia łaniu powietrza) grupy 
kontrolnej nie jest konieczne. W przypadku wykorzystania no śnika innego 
niż woda w celu wytworzenia atmosfery na potrzeby badania nale ży użyć 
grupy kontrolnej no śnika tylko wtedy, gdy brak jest dost ępnych danych 
historycznych na temat toksyczno ści inhalacyjnej. Je żeli badanie toksycz ­
ności dla badanej substancji chemicznej zmieszanej z no śnikiem nie wyka że 
toksyczno ści, wynika z tego, że dany no śnik jest nietoksyczny w badanych 
stężeniach, a zatem nie ma potrzeby tworzenia grupy kontrolnej no śnika.  
MONITOROWANIE WARUNKÓW NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE 
SUBSTANCJI  
Przepływ powietrza w komorze  
18. Przep ływ powietrza przez komor ę należy starannie kontrolowa ć 
i monitorowa ć w sposób ci ągły, jak równie ż rejestrowa ć podczas nara żania 
na działanie substancji nie rzadziej ni ż co godzin ę. Monitorowanie st ężenia 
(lub stabilno ści) w atmosferze uzyskanej na potrzeby badania jest pomiarem 
całościowym wszystkich parametrów dynamicznych i umo żliwia w sposób 
pośredni kontrol ę wszystkich istotnych parametrów dynamicznych 
w zakresie generowania atmosfery. Nale ży w szczególno ści uwzgl ędnić 
kwestię zapobiegania ponownemu wdychaniu w komorach przeznaczonych 
do narażenia wyłącznie przez nos w przypadkach, gdy przep ływ powietrza 
przez układ podawania substancji jest nieodpowiedni do zapewnienia dyna ­
micznego przep ływu powietrza zawieraj ącego badan ą substancj ę chemiczn ą. 
Istnieją zalecane metody, które mo żna zastosowa ć do wykazania, że 
w wybranych warunkach ponowne wdychanie nie zachodzi (2) (11). Stężenie tlenu powinno wynosi ć co najmniej 19 %, a st ężenie dwutlenku 
węgla nie powinno przekracza ć
 1 %. Jeżeli istnieje uzasadnione przypusz ­
czenie, że norm tych nie da si ę spełnić, należy mierzy ć stężenia tlenu 
i dwutlenku w ęgla. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 220
 
Temperatura i wilgotno ść względna w komorze  
19. W komorze nale ży utrzymywa ć temperatur ę na poziomie 22 ± 3 °C. Wilgot ­
ność względną w strefie oddychania zwierz ąt – zarówno dla nara żenia tylko 
przez nos, jak i dla nara żenia całego ciała – nale ży monitorowa ć 
i rejestrowa ć co najmniej trzykrotnie podczas okresów poddawania dzia łaniu 
substancji trwaj ących do 4 godzin, a podczas okresów krótszych – co 
godzinę. Należy utrzymywa ć wilgotno ść względną w przedziale 30–70 %, 
choć może to być nieosiągalne (np. przy badaniu mieszanin na bazie wody) 
lub niemo żliwe do zmierzenia w przypadku zak łócenia danej metody 
badawczej przez badan ą substancj ę chemiczn ą. 
Badana substancja chemiczna: st ężenie nominalne  
20. Tam, gdzie to mo żliwe, nale ży obliczy ć i zarejestrowa ć stężenie nominalne 
w komorze badawczej. St ężenie nominalne jest to masa wytworzonej 
badanej substancji chemicznej podzielona przez ca łkowitą objętość powiet­
rza, które przesz ło przez uk ład komory. St ężenie nominalne nie s łuży do 
charakterystyki nara żenia zwierz ąt – porównanie st ężenia nominalnego 
i rzeczywistego stanowi wskazówk ę co do efektywno ści wytwarzania 
w układzie doświadczalnym, a zatem mo żna je wykorzysta ć do wykrycia 
problemów zwi ązanych z wytwarzaniem.  
Badana substancja chemiczna: st ężenie rzeczywiste  
21. Stężenie rzeczywiste jest to st ężenie badanej substancji chemicznej w strefie 
oddychania zwierz ąt w komorze inhalacyjnej. St ężenia rzeczywiste mo żna 
uzyskać metodami swoistymi (np. bezpo średnie pobieranie próbek, metody 
adsorpcyjne lub z wykorzystaniem reaktywno ści chemicznej, a nast ępnie 
badanie metodami analitycznymi) lub nieswoistymi, takimi jak analiza grawimetryczna przy zastosowaniu filtra. Zastosowanie metody grawimet ­
rycznej jest akceptowalne tylko w przypadku aerozoli proszkowych zawie ­
rających jeden sk ładnik lub aerozoli cieczy o niskiej lotno ści i należy wtedy 
przed badaniem wykona ć odpowiedni ą analizę, swoistą dla badanej 
substancji chemicznej. Za pomoc ą metody grawimetrycznej mo żna równie ż 
określić stężenie wielosk ładnikowego aerozolu proszkowego. Do tego s ą 
jednak konieczne dane analityczne, za pomoc ą których mo żna wykaza ć, 
że skład materia łu znajduj ącego się w powietrzu jest podobny do sk ładu 
materiału wyjściowego. W razie braku takich informacji mo że być 
konieczna ponowna analiza badanej substancji chemicznej (najlepiej znaj ­
dującej się w powietrzu) w toku badania, w regularnych odst ępach czaso ­
wych. W przypadku środków w formie aerozoli, które mog ą ulec odparo ­
waniu lub sublimacji, nale ży wykaza ć, że przy zastosowaniu wybranej 
metody zebrano wszystkie fazy. W sprawozdaniu z badania nale ży podać 
stężenia docelowe, nominalne i rzeczywiste, ale w analizach statystycznych 
do wyliczenia warto ści stężeń śmiertelnych uwzgl ędnia się tylko stężenia 
rzeczywiste.  
22. Jeżeli to mo żliwe, nale ży używać badanej substancji chemicznej 
pochodzącej z jednej partii, a badan ą próbkę należy przechowywa ć 
w warunkach zapewniaj ących jej czysto ść, jednorodno ść i stabilno ść. 
Przed rozpocz ęciem badania nale ży scharakteryzowa ć badaną substancj ę 
chemiczn ą, w tym jej czysto ść, oraz, o ile jest to wykonalne 
z technicznego punktu widzenia, okre ślić tożsamość oraz ilości zidentyfiko ­
wanych domieszek i zanieczyszcze ń. Można to wykaza ć, między innymi, za 
pomocą następujących danych: czasu retencji i wzgl ędnej powierzchni 
sygnału, masy cz ąsteczkowej uzyskanej w drodze spektrometrii masowej 
lub chromatografii gazowej b ądź innych oszacowa ń. Mimo że identyfikacja 
badanej próbki nie nale ży do obowi ązków laboratorium badawczego, 
rozsądne może być potwierdzenie przez to laboratorium charakterystyki, 
którą przedstawi ł sponsor, przynajmniej w ograniczonym zakresie (np. 
koloru, cech fizycznych itp.).  
23. Podczas badania nale ży utrzymywa ć możliwie niezmienn ą atmosfer ę 
i monitorowa ć ją stale lub co pewien czas, w zale żności od metody anali ­
tycznej. Je żeli stosuje si ę pobieranie próbek co pewien czas, podczas czte ­
rogodzinnego badania nale ży pobiera ć próbki powietrza w komorze nie 
rzadziej ni ż dwa razy podczas badania. Je żeli z powodu ograniczonej pr ęd­
kości przepływu powietrza lub niskich st ężeń jest to niemo żliwe, mo żna ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 221
 
pobrać jedną próbkę na cały okres nara żenia. W razie wyst ąpienia znacz ­
nych fluktuacji pomi ędzy próbkami dla kolejnych badanych st ężeń należy 
pobrać cztery próbki na okres nara żenia. Warto ści stężeń w komorze dla 
poszczególnych próbek nie powinny odbiega ć od stężenia średniego 
o więcej niż ± 10 % dla gazów i par oraz o wi ęcej niż ± 20 % dla aerozoli 
ciekłych lub sta łych. Nale ży obliczy ć i zapisa ć okres wyrównania st ężeń 
w komorze (t  95 ). Czas trwania nara żenia obejmuje czas wprowadzania 
badanej substancji chemicznej do komory przy uwzgl ędnieniu czasu 
potrzebnego do osi ągnięcia t  95 . Wytyczne dotycz ące szacowania t  95 
można znaleźć w GD 39 (2).  
24. W przypadku bardzo z łożonych mieszanin sk ładających się z gazów/par 
i aerozoli (np. w przypadku atmosfery spalania i badanych substancji 
chemicznych wydzielanych ze specjalnych produktów/urz ądzeń do zastoso ­
wania ko ńcowego) ka żda faza mo że zachowywa ć się inaczej w komorze 
inhalacyjnej, nale ży zatem wybra ć co najmniej jedn ą substancj ę wskaźni­
kową (analit) z ka żdej fazy (gaz/para i aerozol) – zazwyczaj jest to g łówna 
substancja czynna mieszaniny. Je żeli badana substancja chemiczna jest 
mieszanin ą, należy podać stężenie analityczne w odniesieniu do ca łej 
mieszaniny, a nie tylko substancji czynnej lub sk ładnika aktywnego (anali ­
tu). Dodatkowe informacje na temat st ężeń rzeczywistych mo żna znaleźć 
w GD 39 (2).  
Badana substancja chemiczna: Rozk ład wielko ści cząstek 
25. Rozk ład wielko ści cząstek aerozoli nale ży określać co najmniej dwa razy 
podczas ka żdego czterogodzinnego okresu nara żenia za pomoc ą impaktora 
kaskadowego lub innego instrumentu, takiego jak aerodynamiczny spektro ­
metr pomiaru cz ąstek. Jeżeli można wykaza ć równowa żność wyników uzys ­
kanych za po średnictwem impaktora kaskadowego lub innego instrumentu, 
ten inny instrument mo że być stosowany przez ca ły okres badania. W celu 
potwierdzenia sprawno ści zatrzymywania cz ąstek przez instrument g łówny 
należy równolegle do tego instrumentu stosowa ć drugie urz ądzenie, takie jak 
filtr grawimetryczny lub odpylacz/be łkotkę. Stężenie masowe uzyskane na 
podstawie analizy wielko ści cząstek powinno mie ścić się w rozsądnych 
granicach st ężenia masowego uzyskanego poprzez analiz ę filtrów [zob. 
GD 39 (2)]. Je śli można wykaza ć równowa żność w pocz ątkowej fazie 
badania, dalsze pomiary potwierdzaj ące można pomin ąć. Ze wzgl ędu na 
dobrostan zwierz ąt należy podjąć środki maj ące na celu zminimalizowanie 
ilości danych niejednoznacznych, które mog ą prowadzi ć do konieczno ści 
powtórzenia nara żenia. Klasyfikacj ę cząstek według wielko ści należy prze­
prowadzić w odniesieniu do par, je żeli istnieje jakakolwiek mo żliwość 
tworzenia si ę aerozolu wskutek kondensacji par lub je śli cząstki są wykry­
wane w atmosferze parowej maj ącej potencja ł tworzenia faz mieszanych 
(zob. pkt 15).  
PROCEDURA  
26. Poni żej opisano dwa rodzaje bada ń: protokół tradycyjny oraz protokó ł C × t. 
Oba protoko ły mogą obejmowa ć badanie rozpoznawcze, badanie g łówne lub 
badanie graniczne (protokó ł tradycyjny) albo badanie przy st ężeniu 
granicznym (C × t). Je żeli wiadomo, że podatno ść zależy od płci, kierownik 
badania mo że zdecydowa ć o przeprowadzeniu bada ń przy użyciu tylko 
osobników tej p łci, która jest bardziej podatna. Je śli gatunki gryzoni inne 
niż szczury poddaje si ę narażeniu tylko przez nos, maksymalne okresy 
narażenia można dostosowa ć, by zminimalizowa ć charakterystyczny dla 
danego gatunku stres. Przed rozpocz ęciem badania nale ży uwzględnić 
wszelkie dost ępne dane w celu zminimalizowania wykorzystania zwierz ąt. 
Przykładowo dzi ęki danym powsta łym przy u życiu metody B.52 opisanej 
w niniejszym za łączniku (4) mo żna wyeliminowa ć potrzebę przeprowa ­
dzenia badania rozpoznawczego oraz wykaza ć większą podatno ść którejś 
z płci [zob. GD 39 (2)].  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 222
 
PROTOKÓ Ł TRADYCYJNY  
Zasady ogólne: protokó ł tradycyjny  
27. W badaniu zgodnie z protoko łem tradycyjnym grupy zwierz ąt poddawane s ą 
działaniu badanej substancji chemicznej przez okre ślony czas (zazwyczaj 4 
godziny) tylko przez nos lub w komorze do poddawania nara żeniu całego 
ciała. Zwierz ęta poddawane s ą działaniu stężenia granicznego (badanie 
graniczne) lub dzia łaniu co najmniej trzech st ężeń w procedurze sekwen ­
cyjnej (badanie g łówne). Przed badaniem g łównym mo żna przeprowadzi ć 
badanie rozpoznawcze, chyba że istnieją już pewne informacje dotycz ące 
badanej substancji chemicznej, takie jak uprzednio przeprowadzone badanie 
metodą B.52 [zob. GD 39 (2)].  
Badanie rozpoznawcze: protokó ł tradycyjny  
28. Badanie rozpoznawcze s łuży do oszacowania si ły działania badanej 
substancji chemicznej, identyfikacji zwi ązanych z p łcią różnic 
w podatno ści oraz pomocniczo w doborze poziomów st ężenia podczas nara ­ 
żenia dla badania g łównego lub badania granicznego. Przy wyborze 
poziomów st ężenia na potrzeby badania rozpoznawczego nale ży wyko­
rzystać wszystkie dost ępne informacje, w tym dost ępne dane 
dotyczące (Q)SAR i podobnych chemikaliów. Na dzia łanie każdego stężenia 
należy narażać nie więcej niż trzech samców i trzy samice (trzy zwierz ęta 
każdej płci mogą być potrzebne do ustalenia zró żnicowania podatno ści 
pomiędzy płciami). Badanie rozpoznawcze mo że obejmowa ć jedno stężenie, 
ale w razie potrzeby mo żna zbadać więcej stężeń. Badanie rozpoznawcze 
nie powinno przypomina ć badania g łównego pod wzgl ędem liczby bada ­
nych zwierz ąt i użytych stężeń. W miejsce badania rozpoznawczego mo żna 
wykorzysta ć uprzednio przeprowadzone badanie metod ą B.52 (4) [zob. GD 
39 (2)].  
Badanie graniczne: protokó ł tradycyjny  
29. Badanie graniczne stosuje si ę wtedy, gdy badana substancja chemiczna jest 
znana lub mo żna się spodziewa ć, że jest ona praktycznie nietoksyczna, tzn. 
powoduje efekt toksyczny dopiero powy żej stężenia granicznego przewi ­
dzianego przepisami. W badaniu granicznym pojedyncz ą grupę składającą 
się z trzech samców i trzech samic poddaje si ę działaniu badanej substancji 
chemicznej w st ężeniu granicznym. Informacje na temat toksyczno ści 
badanej substancji chemicznej mo żna uzyska ć na podstawie wiedzy na 
temat podobnych zbadanych chemikaliów, z uwzgl ędnieniem to żsamości 
i zawarto ści procentowej sk ładników, o których wiadomo, że mają 
znaczenie z punktu widzenia toksyczno ści. W sytuacji niewystarczaj ącej 
ilości lub braku informacji na temat toksyczno ści badanej substancji 
chemicznej lub w przypadku, gdy substancja ta zgodnie z oczekiwaniami 
może być toksyczna, nale ży przeprowadzi ć badanie g łówne.  
30. Dobór st ężeń granicznych zazwyczaj zale ży od wymogów regulacyjnych. 
Jeśli stosowane jest rozporz ądzenie (WE) nr 1272/2008, st ężenia graniczne 
dla gazów, par i aerozoli wynosz ą odpowiednio 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 
mg/l (lub maksymalne st ężenie możliwe do uzyskania) (3). W przypadku 
niektórych badanych substancji chemicznych wytworzenie st ężeń granicz­
nych może być trudne technicznie, w szczególno ści dla substancji wyst ępuj­ 
ących w postaci par i aerozoli. Przy badaniu aerozoli celem podstawowym 
powinno by ć osiągnięcie takiego rozmiaru cz ąstek, aby mog ły one ulec 
wdychaniu (MMAD od 1 do 4 μm). Dla wi ększości badanych substancji 
chemicznych jest to mo żliwe przy st ężeniu 2 mg/l. Próby badania aerozoli 
przy stężeniu większym ni ż 2 mg/l nale ży przeprowadza ć tylko 
w przypadku, gdy mo żliwe jest uzyskanie cz ąstek o rozmiarze takim, aby 
mogły ulec wdychaniu [zob. GD 39 (2)]. W rozporz ądzeniu (WE) 
nr 1272/2008 nie zaleca si ę badań z użyciem stężeń większych od st ężenia 
granicznego ze wzgl ędu na dobrostan zwierz ąt (3). St ężenie graniczne 
należy brać pod uwag ę tylko w przypadku znacznego prawdopodobie ństwa, 
że wyniki takich bada ń przynios ą bezpośrednie korzy ści dla ochrony 
zdrowia ludzi (3), a w sprawozdaniu z badania nale ży podać uzasadnienie. 
W przypadku badanych substancji chemicznych, które s ą potencjalnie wybu ­
chowe, nale ży dołożyć starań w celu unikni ęcia warunków sprzyjaj ących 
wybuchowi. Aby unikn ąć zbędnego wykorzystywania zwierz ąt, należy 
przed badaniem granicznym przeprowadzi ć test próbny bez udzia łu zwierząt 
w celu upewnienia si ę, że warunki w komorze do przeprowadzenia badania 
granicznego s ą możliwe do osi ągnięcia. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Jeżeli przy st ężeniu granicznym obserwowana jest śmiertelno ść lub stany 
agonalne, wyniki badania granicznego mog ą pełnić rolę badania rozpoznaw ­
czego dla dalszych bada ń przy innych st ężeniach (zob. badanie g łówne). 
Jeżeli właściwości fizyczne lub chemiczne badanej substancji chemicznej 
uniemożliwiają osiągnięcie stężenia granicznego, nale ży przeprowadzi ć 
badanie przy maksymalnym osi ągalnym st ężeniu. Jeżeli przy maksymalnym 
osiągalnym st ężeniu wyst ępuje śmiertelno ść mniejsza ni ż 50 %, dalsze 
badania nie s ą konieczne. Je żeli uzyskanie st ężenia granicznego by ło 
niemożliwe, w sprawozdaniu z badania nale ży to wyja śnić i na dowód 
podać odpowiednie dane. Je żeli maksymalne mo żliwe do uzyskania st ężenie 
pary nie wywo łuje toksyczno ści, może być konieczne podanie badanej 
substancji chemicznej jako aerozolu ciek łego. 
Badanie g łówne: protokó ł tradycyjny  
32. Badanie g łówne wykonuje si ę zazwyczaj przy wykorzystaniu pi ęciu samców 
i pięciu samic (lub 5 zwierz ąt płci podatnej na dzia łanie substancji, je śli jest 
znana) na ka żdy poziom st ężenia i dla co najmniej trzech st ężeń. Należy 
użyć poziomów st ężeń wystarczaj ących do wykonania rzetelnej analizy 
statystycznej. Odst ępy czasowe mi ędzy podawaniem dawek w ka żdej grupie 
poddawanej nara żeniu okre śla się na podstawie czasu wyst ąpienia, długości 
trwania i ostro ści oznak toksyczno ści. Należy odwlec nara żenie zwierz ąt na 
działanie kolejnego st ężenia do momentu, gdy mo żna w sposób uzasadniony 
uznać, że uprzednio badane zwierz ęta przeżyły. Dzięki temu kierownik 
badania mo że dopasowa ć stężenie docelowe dla kolejnej grupy poddawanej 
narażeniu. Jednak z powodu zale żności od zaawansowanych technologii 
rozwiązanie takie nie zawsze daje si ę w praktyce zastosowa ć podczas 
badań toksyczno ści inhalacyjnej, zatem o nara żeniu zwierz ąt na dzia łanie 
substancji przy kolejnym poziomie st ężenia nale ży zdecydowa ć na 
podstawie uprzednich do świadczeń i osądu naukowego. W przypadku 
badania mieszanin nale ży wziąć pod uwag ę GD 39 (2).  
PROTOKÓ Ł „STĘŻENIE × CZAS” (C × t)  
Zasady ogólne: protokó ł C × t  
33. Alternatyw ą dla protoko łu tradycyjnego przy ocenie toksyczno ści inhala­
cyjnej mo że być wykonywane w procedurze sekwencyjnej badanie C × 
t (12) (13) (14). Metoda ta umo żliwia nara żanie zwierz ąt na dzia łanie 
badanej substancji chemicznej przy wielu poziomach st ężeń i przez wiele 
okresów trwania. Wszystkie badania przeprowadza si ę w komorze do 
poddawania nara żeniu tylko przez nos (w tym protokole zastosowanie 
komór do poddawania nara żeniu całego ciała byłoby niepraktyczne). 
Protokół zilustrowany jest diagramem w dodatku 1. Zgodnie z wynikami 
analizy symulacyjnej zarówno protokó ł tradycyjny, jak i protokó ł C × 
t mogą dawać odporne warto ści LC  50 , ale w wyniku zastosowania protoko łu 
C × t uzyskuje si ę lepsze warto ści LC  01 i LC  10 (15).  
34. W analizie symulacyjnej wykazano, że przy badaniu 4 st ężeń i 5 okresów 
narażenia w badaniu g łównym zasadniczo odpowiednie mo że być wyko­
rzystanie dwóch osobników na interwa ł C × t (jeden z ka żdej płci, jeśli 
wykorzystywane s ą samce i samice, lub dwa osobniki p łci bardziej podat ­
nej). W pewnych okoliczno ściach kierownik badania mo że zdecydowa ć 
o wykorzystaniu dwóch szczurów ka żdej płci na interwa ł C × t (15). Dzi ęki 
wykorzystaniu dwóch osobników ka żdej płci na każdy punkt oznaczaj ący 
dane stężenie przy danym czasie mo żna zmniejszy ć błędy systematyczne 
i zmienno ść szacunków, zwi ększyć dokładność szacunków i poprawi ć prze­
dział ufności. Jednak w przypadku, gdy rozrzut danych jest zbyt du ży, aby 
wyprowadzi ć oszacowanie (przy wykorzystaniu jednego osobnika danej p łci 
lub dwóch osobników p łci bardziej podatnej) mo że wystarczy ć również 
zastosowanie nara żenia na dzia łanie substancji przy pi ątej wartości stężenia. 
Dalsze wytyczne co do liczby zwierz ąt i stężeń, jakie maj ą być wykorzys ­
tane w badaniu C × t, znajduj ą się w GD 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Badanie rozpoznawcze: protokó ł C × t  
35. Badanie rozpoznawcze s łuży do oszacowania si ły działania badanej 
substancji chemicznej oraz pomocniczo w doborze poziomów st ężenia 
podczas nara żenia dla badania g łównego. Aby dobra ć odpowiednie st ężenie 
początkowe do badania g łównego i zminimalizowa ć liczbę wykorzystanych 
zwierząt, może być potrzebne badanie rozpoznawcze przy wykorzystaniu do 
trzech zwierz ąt na płeć i stężenie [szczegó ły można znaleźć w dodatku III 
do GD 39 (2)]. Do ustalenia ró żnicy związanej z p łcią może być konieczne 
wykorzystanie trzech osobników ka żdej płci. Zwierz ęta te nale ży poddać 
narażeniu przez jeden okres, zazwyczaj 240 min. Nale ży ocenić możliwość 
wytworzenia odpowiednich atmosfer do świadczalnych podczas wst ępnych 
badań technicznych przeprowadzanych bez udzia łu zwierz ąt. Zazwyczaj 
nie ma potrzeby przeprowadzania badania rozpoznawczego, je śli dostępne 
są dane dotycz ące śmiertelno ści z bada ń przeprowadzonych metod ą B.52 
(4). Przy doborze pocz ątkowych st ężeń docelowych w badaniu metod ą B.2 
kierownik badania powinien uwzgl ędnić wzorce śmiertelno ści zaobserwo ­
wane we wszelkich dost ępnych badaniach przeprowadzonych metod ą B.52 
(4) dla obu p łci i wszystkich przebadanych st ężeń [zob. GD 39 (2)].  
Stężenie pocz ątkowe: protokó ł C × t  
36. Stężenie pocz ątkowe (sesja nara żenia I) (dodatek 1) to st ężenie graniczne 
albo stężenie dobrane przez kierownika badania na podstawie badania 
rozpoznawczego. Na dzia łanie tego st ężenia wystawiane s ą grupy po 
jednym osobniku ka żdej płci przez wiele okresów trwania (np. po 15, 30, 
60, 120 lub 240 minut), łącznie 10 zwierz ąt (tak zwana sesja nara żenia I) 
(dodatek 1).  
37. Dobór st ężeń granicznych zazwyczaj zale ży od wymogów regulacyjnych. 
Jeśli stosowane jest rozporz ądzenie (WE) nr 1272/2008, st ężenia graniczne 
dla gazów, par i aerozoli wynosz ą odpowiednio 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 
mg/l (lub maksymalne st ężenie możliwe do uzyskania) (3). W przypadku 
niektórych badanych substancji chemicznych wytworzenie st ężeń granicz­
nych może być trudne technicznie, w szczególno ści dla substancji wyst ępuj­ 
ących w postaci par i aerozoli. Przy badaniu aerozoli celem powinno by ć 
uzyskanie cz ąstek o rozmiarze takim, aby mog ły ulec wdychaniu (tzn. 
o MMAD od 1 do 4 μm) przy st ężeniu granicznym równym 2 mg/l. Jest 
to możliwe dla wi ększości badanych substancji chemicznych. Próby badania 
aerozoli przy st ężeniu większym ni ż 2 mg/l nale ży przeprowadza ć tylko 
w przypadku, gdy mo żliwe jest uzyskanie cz ąstek o rozmiarze takim, aby 
mogły ulec wdychaniu [zob. GD 39 (2)]. W rozporz ądzeniu (WE) 
nr 1272/2008 nie zaleca si ę badań z użyciem stężeń większych od st ężenia 
granicznego ze wzgl ędu na dobrostan zwierz ąt (3). Badanie st ężeń więk­
szych od st ężenia granicznego nale ży brać pod uwag ę tylko w przypadku 
znacznego prawdopodobie ństwa, że wyniki takich bada ń przynios ą 
bezpośrednie korzy ści dla ochrony zdrowia ludzi (3), a w sprawozdaniu 
z badania nale ży podać uzasadnienie. W przypadku badanych substancji 
chemicznych, które s ą potencjalnie wybuchowe, nale ży dołożyć starań 
w celu unikni ęcia warunków sprzyjaj ących wybuchowi. Aby unikn ąć zbęd­
nego wykorzystywania zwierz ąt, należy przed badaniem z u życiem stężenia 
początkowego przeprowadzi ć test próbny bez udzia łu zwierząt w celu upew ­
nienia się, że warunki w komorze do przeprowadzenia badania przy tym 
stężeniu są możliwe do osi ągnięcia. 
38. Jeżeli przy st ężeniu pocz ątkowym obserwowana jest śmiertelno ść lub stany 
agonalne, wyniki bada ń przy tym st ężeniu mog ą pełnić rolę punktu 
początkowego dla dalszych bada ń przy innych st ężeniach (zob. badanie 
główne). Je żeli właściwości fizyczne lub chemiczne badanej substancji 
chemicznej uniemo żliwiają osiągnięcie stężenia granicznego, nale ży prze­
prowadzić badanie przy maksymalnym osi ągalnym st ężeniu. Jeżeli przy 
maksymalnym osi ągalnym st ężeniu wyst ępuje śmiertelno ść mniejsza ni ż 
50 %, dalsze badania nie s ą konieczne. Je żeli uzyskanie st ężenia granicz ­
nego było niemożliwe, w sprawozdaniu z badania nale ży to wyja śnić i na 
dowód poda ć odpowiednie dane. Je żeli maksymalne mo żliwe do uzyskania 
stężenie pary nie wywo łuje toksyczno ści, może być konieczne podanie 
badanej substancji chemicznej jako aerozolu ciek łego. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Badanie g łówne: protokó ł C × t  
39. Stężenie pocz ątkowe (sesja nara żenia I) (dodatek 1) w badaniu g łównym to 
stężenie graniczne albo st ężenie dobrane przez kierownika badania na 
podstawie badania rozpoznawczego. Je żeli podczas sesji nara żenia I lub 
po niej wyst ąpi śmiertelno ść, stężenia i okresy nara żenia dla sesji nara żenia 
II należy dobrać na podstawie minimalnego nara żenia (C × t), które 
prowadzi do zgonu. Ka żda kolejna sesja nara żenia zależy od sesji poprzed ­
niej (zob. dodatek 1).  
40. Dla wielu badanych substancji chemicznych wyniki otrzymane przy st ężeniu 
początkowym wraz z trzema dodatkowymi sesjami nara żenia charakteryzuj ­ 
ącymi się drobniejsz ą siatką czasową (daną szeregiem geometrycznym 
okresów nara żenia okre ślonym wspó łczynnikiem pomi ędzy kolejnymi okre ­
sami, zazwyczaj √2) będą wystarczaj ące do ustalenia zale żności śmiertel­
ności C × t (15), ale zastosowanie nara żenia przy pi ątej wartości stężenia 
może również przynieść pewne korzy ści [zob. dodatek 1 oraz GD 39 (2)]. 
Sposób matematycznego opracowania wyników zastosowania protoko łu C × 
t podano w dodatku 1.  
OBSERWACJE  
41. Zwierz ęta w trakcie okresu nara żenia nale ży często poddawa ć obserwacji 
klinicznej. Po nara żeniu nale ży prowadzi ć obserwacje kliniczne – w dniu 
narażenia co najmniej dwukrotnie, lub cz ęściej, jeśli wskazuje na to reakcja 
zwierząt na poddawanie dzia łaniu substancji, a po tym dniu co najmniej raz 
dziennie przez łącznie 14 dni. D ługość okresu obserwacji nie jest okre ślona, 
należy ją jednak ustali ć na podstawie charakteru i czasu wyst ąpienia 
objawów klinicznych oraz d ługości okresu zdrowienia. Czas, w jakim poja ­
wiają się i zanikaj ą oznaki toksyczno ści, jest istotny, szczególnie 
w przypadku tendencji do wyst ępowania opó źnionych oznak toksyczno ści. 
Wszystkie obserwacje s ą systematycznie zapisywane w ewidencji prowa ­
dzonej osobno dla ka żdego zwierz ęcia. Zwierz ęta, u których stwierdzono 
stan agonalny, oraz zwierz ęta wykazuj ące objawy silnego bólu lub stresu 
należy ze wzgl ędu na ich dobrostan u śmiercić w sposób humanitarny. Przy 
badaniu pod k ątem klinicznych oznak toksyczno ści należy zachowa ć ostroż­
ność, aby nie pomyli ć początkowego z łego wygl ądu i przej ściowych zmian 
oddechowych, b ędących skutkiem procedury nara żenia, z toksyczno ścią 
związaną z badaną substancj ą chemiczn ą, która wymaga łaby wcze śniejszego 
uśmiercenia zwierz ąt. Należy przestrzega ć zasad i kryteriów streszczonych 
w wytycznych dotycz ących humanitarnego punktu ko ńcowego (GD 19) (7). 
W przypadku u śmiercenia zwierz ąt z przyczyn humanitarnych lub stwier ­
dzenia ich zgonu nale ży możliwie najdok ładniej zapisa ć czas zgonu.  
42. Obserwacje zwierz ąt w klatkach powinny obejmowa ć zmiany skóry i sier ści, 
oczu i b łon śluzowych; jak równie ż zmiany w uk ładzie oddechowym 
i układzie krążenia, zmiany w autonomicznym i o środkowym uk ładzie 
nerwowym oraz zmiany w aktywno ści somatycznej i sposobie zachowania. 
O ile to mo żliwe, nale ży odnotowa ć rozróżnienie pomi ędzy skutkami miej ­
scowymi i ogólnoustrojowymi. Szczególn ą uwagę należy poświęcić obser­
wacjom dr żenia, konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki. 
Pomiar temperatury w odbycie mo że dostarczy ć dodatkowych dowodów 
potwierdzaj ących odruchowe spowolnienie oddechu lub hipo-/hipertermi ę 
w związku z poddawaniem dzia łaniu substancji lub przetrzymywaniem 
w zamkni ęciu. 
Masa cia ła 
43. Nale ży odnotowywa ć masę ciała poszczególnych zwierz ąt: raz podczas 
okresu aklimatyzacji, w dniu nara żenia przed nara żeniem (dzie ń 0), oraz 
przynajmniej w dniach 1, 3 i 7 (a nast ępnie co tydzie ń), jak równie ż 
w momencie zgonu lub eutanazji, je śli śmierć nastąpi później niż w dniu 
1. Masę ciała uznaje si ę za krytyczny wska źnik toksyczno ści, zatem zwie ­
rzęta wykazuj ące stały spadek wagi na poziomie ≥ 20 % w porównaniu 
z wartościami przed badaniem nale ży ściśle monitorowa ć. Po zako ńczeniu 
okresu po nara żeniu zwierz ęta, które prze żyły, są ważone i humanitarnie 
uśmiercane.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologia  
44. Wszystkie badane zwierz ęta, włączając te, które pad ły podczas bada ń lub 
zostały poddane eutanazji i wyeliminowane z bada ń ze wzgl ędu na ich 
dobrostan, nale ży poddać pełnemu rozpoznaniu histopatologicznemu. Je żeli 
sekcji zw łok nie mo żna przeprowadzi ć natychmiast po znalezieniu 
martwego zwierz ęcia, zwierz ę należy schłodzić (nie zamrozi ć) do tempera ­
tury wystarczaj ąco niskiej do zminimalizowania autolizy. Sekcj ę zwłok 
należy przeprowadzi ć możliwie szybko, zwykle w ci ągu jednego lub 
dwóch dni. W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia należy odnotowa ć 
wszystkie makroskopowe zmiany patologiczne ze szczególnym uwzgl ędnie­
niem wszelkich zmian w drogach oddechowych.  
45. Można rozwa żyć przeprowadzenie dodatkowych, uprzednio zaprojektowa ­
nych testów w celu zwi ększenia warto ści interpretacyjnej badania, np. 
pomiaru masy p łuc u szczurów, które prze żyły, czy dostarczenia dowodów 
na podra żnienie poprzez badanie dróg oddechowych pod mikroskopem. 
Można równie ż objąć badaniem organy wykazuj ące wyraźne zmiany pato ­
logiczne u zwierz ąt, które prze żyły 24 lub wi ęcej godzin, oraz organy, co do 
których wiadomo lub mo żna oczekiwa ć, że narażenie miało na nie wp ływ. 
Z badania mikroskopowego ca łego układu oddechowego mo żna uzyska ć 
użyteczne informacje na temat badanych substancji chemicznych, które 
reagują z wod ą, takich jak kwasy i badane substancje chemiczne 
o właściwościach higroskopijnych.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
46. Nale ży podać dane dotycz ące masy cia ła i wyników sekcji zw łok dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt. Dane z obserwacji klinicznych nale ży zestawi ć 
w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do ka żdej badanej grupy 
liczbę wykorzystanych zwierz ąt, liczbę zwierząt wykazuj ących specyficzne 
oznaki toksyczno ści, liczbę zwierząt padłych w trakcie trwania badania lub 
uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych 
zwierząt, opis skutków toksycznych oraz ich przebieg w czasie 
i odwracalno ść, a także wyniki sekcji zw łok. 
Sprawozdanie z badania  
47. Sprawozdanie z badania powinno w stosownych przypadkach zawiera ć 
następujące informacje:  
Badane zwierz ęta i ich hodowla  
— opis warunków przetrzymywania w klatkach, w tym: liczba (lub zmiana 
liczby) zwierz ąt na klatk ę, ściółka, temperatura otoczenia i wilgotno ść 
względna, fotoperiod i okre ślenie diety,  
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie zastosowania gatunków 
innych ni ż szczur,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— metoda randomizacji,  
— szczegó łowe informacje na temat jako ści pożywienia i wody (w łączając 
w to rodzaj/ źródło diety oraz źródło wody),  
— opis wszelkich przygotowa ń przed badaniem, w tym diety, kwarantanny 
i leczenia chorób,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść oraz w stosownych przypadkach w łaściwości 
fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),  
— dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract 
Services (CAS), je żeli jest znany,  
Nośnik 
— uzasadnienie zastosowania no śnika oraz uzasadnienie wyboru no śnika 
(jeżeli jest inny ni ż woda),  
— dane historyczne lub uzyskane równolegle wykazuj ące, że nośnik nie 
zakłóca wyniku badania,  
Komora inhalacyjna  
— szczegó łowy opis komory inhalacyjnej, w tym jej rozmiary i obj ętość, 
— źródło i opis wyposa żenia wykorzystywanego do celów nara żenia 
zwierząt, jak równie ż do wytwarzania atmosfery,  
— wyposa żenie do pomiaru temperatury, wilgotno ści, rozmiaru cz ąstek 
i stężenia rzeczywistego,  
— źródło powietrza, metoda oczyszczania dostarczanego/pobieranego 
powietrza oraz system klimatyzacji,  
— metody kalibracji wyposa żenia w celu zapewnienia jednorodnej atmos ­
fery na potrzeby badania,  
— różnica ciśnienia (dodatnia lub ujemna),  
— porty nara żenia w komorze (nara żenie tylko przez nos); lokalizacja 
zwierząt w układzie (nara żenie całego ciała), 
— jednorodno ść/stabilność w czasie atmosfery na potrzeby badania,  
— lokalizacja czujników temperatury i wilgotno ści oraz pobieranie próbek 
powietrza w komorze,  
— natężenie przep ływu powietrza, nat ężenie przep ływu powietrza/port 
narażenia (nara żenie tylko przez nos) lub ładunek zwierz ąt/komorę 
(narażenie całego ciała), 
— informacje na temat wyposa żenia stosowanego do pomiaru zawarto ści 
tlenu i dwutlenku w ęgla, w stosownych przypadkach,  
— czas potrzebny na wyrównanie st ężeń w komorze inhalacyjnej (t  95 ), 
— liczba zmian obj ętości na godzin ę, 
— urządzenia pomiarowe (w stosownych przypadkach),  
Dane dotycz ące narażenia 
— uzasadnienie wyboru docelowego st ężenia w badaniu g łównym,  
— stężenia nominalne (ca łkowita masa badanej substancji chemicznej 
wprowadzonej do komory inhalacyjnej podzielona przez obj ętość 
powietrza przepuszczonego przez komor ę), 
— rzeczywiste st ężenia badanej substancji chemicznej w próbkach ze strefy 
oddychania zwierz ąt; w przypadku mieszanin, które tworz ą heteroge ­
niczne formy fizyczne (gazy, pary, aerozole), ka żdą substancj ę można 
analizowa ć oddzielnie,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— wszystkie st ężenia substancji w powietrzu nale ży podawa ć 
w jednostkach masy (np. mg/l, mg/m  3 itd.); w nawiasie mo żna podać 
również jednostki obj ętości (np. ppm, ppb itd.),  
— rozkład wielko ści cząstek, średnica aerodynamiczna mediany rozk ładu 
masowego (MMAD) oraz geometryczne odchylenie standardowe ( σg), 
w tym metody ich obliczania. Nale ży odnotowa ć poszczególne analizy 
wielkości cząstek, 
Warunki badania  
— szczegó łowe informacje na temat przygotowania badanej substancji 
chemicznej, w tym szczegó ły dotyczące wszelkich procedur zastosowa ­
nych w celu zmniejszenia rozmiaru cz ąstek ciał stałych lub przygoto ­
wania roztworów badanej substancji chemicznej. W przypadkach, gdy procesy mechaniczne mog ły wpłynąć na zmian ę składu badanej 
substancji chemicznej, nale ży zamieścić wyniki analiz maj ących na 
celu weryfikacj ę składu badanej substancji chemicznej,
 
— opis (najlepiej wraz ze schematem) wyposa żenia wykorzystywanego do 
wytworzenia atmosfery na potrzeby badania i nara żania zwierz ąt na jej 
działanie,  
— szczegó łowe informacje na temat zastosowanej metody analizy 
chemicznej oraz walidacji metody (w tym wydajno ść odzysku badanej 
substancji chemicznej ze środka do pobierania próbek),  
— uzasadnienie wyboru badanych st ężeń, 
Wyniki  
— tabelaryczne zestawienie temperatury, wilgotno ści i przep ływu powietrza 
w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących nominalnego 
i rzeczywistego st ężenia w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących rozmiaru cz ąstek, w tym 
danych dotycz ących gromadzenia próbek analitycznych, rozk ładu wiel­
kości cząstek oraz obliczenia MMAD i σ g , 
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących reakcji i poziomu st ężenia 
dla każdego zwierz ęcia (tj. zwierz ąt wykazuj ących oznaki toksyczno ści, 
w tym śmiertelno ść, rodzaj, ostro ść, czas pojawienia si ę i czas trwania 
objawów),  
— masy cia ła poszczególnych zwierz ąt zarejestrowane w trakcie badania, 
data i godzina zgonu, je śli nastąpił przed planow ą eutanazj ą, przebieg 
w czasie oznak toksyczno ści i informacje, czy by ły one odwracalne 
w przypadku ka żdego zwierz ęcia, 
— wyniki sekcji zw łok oraz bada ń histopatologicznych w odniesieniu do 
każdego zwierz ęcia, jeżeli są dostępne, 
— oszacowania dotycz ące śmiertelno ści (np. LC  50 , LD  01 ), w tym granice 
przedziału ufności 95 % i nachylenie (je żeli w wyniku zastosowania 
danej metody oceny je uzyskano),  
— relacja statystyczna, w tym oszacowanie wyk ładnika n (protokó ł C × t). 
Należy podać nazwę zastosowanego oprogramowania do oblicze ń staty­
stycznych,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Omówienie i interpretacja wyników  
— szczególny nacisk nale ży położyć na opis metod zastosowanych w celu 
spełnienia kryteriów niniejszej metody badawczej, np. dotycz ących 
stężenia granicznego lub rozmiaru cz ąstek, 
— należy uwzględnić respirabilno ść cząstek w świetle wyników ogólnych, 
szczególnie je żeli nie mo żna było spełnić kryterium rozmiaru cz ąstek, 
— należy przedstawi ć wyjaśnienie, je żeli zaistnia ła konieczno ść humanitar ­
nego uśmiercenia zwierz ąt wykazuj ących oznaki bólu lub objawy 
ostrego i przewlek łego stresu, zgodnie z kryteriami zawartymi 
w wytycznych OECD dotycz ących humanitarnego punktu ko ńcowego 
(8), 
— jeżeli przerwano badania metod ą opisaną w rozdziale B.52 niniejszego 
załącznika (4) na rzecz niniejszej metody badawczej B.2, nale ży podać 
uzasadnienie,  
— w ogólnej ocenie badania nale ży uwzględnić spójność metod zastoso ­
wanych w celu okre ślenia nominalnego i rzeczywistego st ężenia oraz 
relacji mi ędzy stężeniem rzeczywistym a nominalnym,  
— należy uwzględnić prawdopodobn ą przyczyn ę zgonu i dominuj ący 
sposób dzia łania (ogólnoustrojowy w porównaniu z miejscowym).  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403, OECD, Pary ż. Dokument dost ępny pod 
adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment nr 39, OECD, Pary ż. Dokument dost ępny pod adresem: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(3) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006 (Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1).
 
(4) Rozdzia ł B.52 niniejszego za łącznika, Ostra toksyczno ść inhalacyjna – 
Metoda klas ostrej toksyczno ści. 
(5) Rozdzia ł B.40 niniejszego za łącznika – Badanie niszczenia skóry metod ą in 
vitro: test przezskórnego oporu elektrycznego (TER).  
(6) Rozdzia ł B.40bis niniejszego za łącznika – Badanie zniszczenia skóry 
metodą in vitro: badanie modelu skóry ludzkiej.  
(7) OECD (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corro ­
sion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pary ż. 
Dokument dost ępny pod adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment nr 19, OECD, Pary ż. Dokument 
dostępny pod adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
 
(10) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (wyd. 
2) Informa Healthcare, Nowy Jork.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J i Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167.  
(12) Zwart JHE, Art.s JM, ten Berge WF, Appelman LM (1992). Alternative 
Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing. Reg. Toxicol. Pharmacol. 15: 278–290.
 
(13) Zwart JHE, Art.s JM, Klokman-Houweling ED, Schoen ED (1990). Deter ­
mination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values. Inhal. Toxicol. 2: 105–117.
 
(14) Ten Berge WF i Zwart A (1989). More Efficient Use of Animals in Acute 
Inhalation Toxicity Testing. J. Haz. Mat. 21: 65–71.  
(15) OECD (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C x 
t Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment nr 104, OECD, Pary ż. Dokument dost ępny pod adresem: [http://www.oecd.org/ 
env/testguidelines]
 
(16) Finney DJ (1977). Probit Analysis, wyd. 3. Cambridge University Press, 
Londyn/Nowy Jork.  
DEFINICJA  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Dodatek 1  
Protokół C × t  
1. Alternatyw ą do protoko łu tradycyjnego przy ocenie toksyczno ści inhala­
cyjnej mo że być wykonywane w procedurze sekwencyjnej badanie „st ężenie 
× czas” (C × t) (12) (13) (14). Protokó ł ten najlepiej jest stosowa ć wtedy, 
gdy istnieje szczególna, wynikaj ąca z regulacji lub powodów naukowych 
potrzeba przeprowadzenia bada ń na zwierz ętach przy zastosowaniu wielu 
okresów trwania nara żenia, np. do celów planowania dzia łań w sytuacjach 
wyjątkowych czy te ż gospodarowania gruntami. Badania w ramach tego 
podejścia zaczyna si ę zazwyczaj od st ężenia granicznego (sesja nara żenia 
I), przy którym zwierz ęta poddawane s ą działaniu badanej substancji 
chemicznej przez pi ęć okresów trwania (np. 15, 30, 60, 120 i 240 minut), 
tak aby w jednej sesji nara żenia otrzyma ć wiele okresów nara żenia (zob. 
rysunek 1). Je śli stosowane jest rozporz ądzenie (WE) nr 1272/2008, st ężenia 
graniczne dla gazów, par i aerozoli wynosz ą odpowiednio 20 000 ppm, 20 
mg/l i 5 mg/l. Poziomy te mo żna przekroczy ć tylko wtedy, je żeli istnieje 
wynikająca z regulacji lub powodów naukowych potrzeba przeprowadzenia 
badań przy tych st ężeniach (zob. pkt 37 w tek ście głównym dotycz ącym 
metody B.2).  
2. W sytuacji niewystarczaj ącej ilości lub braku informacji na temat toksycz ­
ności badanej substancji chemicznej nale ży przeprowadzi ć badanie 
rozpoznawcze, w którym grupy sk ładające się z nie wi ęcej niż 3 zwierz ąt 
każdej płci poddawane s ą działaniu dobranych przez kierownika badania 
stężeń docelowych, zazwyczaj przez 240 min.  
3. Jeżeli podczas sesji nara żenia I zbadane zosta ło stężenie graniczne 
i wystąpiła śmiertelno ść mniejsza ni ż 50 %, nie ma potrzeby przeprowa ­
dzania dodatkowych bada ń. Jeżeli istnieje wynikaj ąca z regulacji lub 
powodów naukowych potrzeba ustalenia relacji st ężenie/czas/reakcja przy 
poziomach wy ższych niż wskazane st ężenie graniczne, nale ży przeprowa ­
dzić kolejne nara żenie na dzia łanie wyższego stężenia, np. dwukrotnego 
stężenia granicznego (tzn. 2L na rysunku 1).  
4. Jeżeli przy st ężeniu granicznym obserwowana jest toksyczno ść, konieczne 
jest przeprowadzenie dodatkowych bada ń (badania g łównego). Dodatkowe 
sesje nara żenia przeprowadza si ę albo przy ni ższych stężeniach (sesje nara ­ 
żenia II, III lub IV’ na rysunku 1), albo przy wy ższych stężeniach przez 
krótszy czas (sesja nara żenia IV na rysunku 1) przy zastosowaniu odpo ­
wiednio dostosowanych okresów trwania nara żenia i krótszego czasu 
między nimi.  
5. Badanie (dla st ężenia wstępnego i st ężeń dodatkowych) przeprowadza si ę 
przy wykorzystaniu 1 zwierz ęcia każdej płci na stężenie/czas lub 2 zwierz ąt 
płci bardziej podatnej na st ężenie/czas. W pewnych okoliczno ściach 
kierownik badania mo że zdecydowa ć o wykorzystaniu 2 szczurów ka żdej 
płci na stężenie/czas (lub 4 zwierz ąt płci bardziej podatnej na st ężenie/czas) 
(15). Dzi ęki wykorzystaniu dwóch osobników ka żdej płci na stężenie/czas 
zazwyczaj zmniejsza si ę błędy systematyczne i zmienno ść szacunków, 
zwiększa dok ładność szacunków i poprawia przedzia ł ufności dotycz ący 
opisanego tu protoko łu. Dalsze szczegó ły podano w GD 39 (2).  
6. W idealnym przypadku ka żda sesja nara żenia realizowana jest jednego dnia. 
Umożliwia to opó źnienie kolejnego nara żenia do momentu, gdy b ędzie 
można w uzasadniony sposób za łożyć, że zwierzęta przeżyły, i pozwala 
kierownikowi badania na dostosowanie docelowych st ężeń i czasów trwania 
przy następnej sesji nara żenia. Zaleca si ę rozpoczęcie każdej sesji nara żenia 
od grupy, która b ędzie poddawana nara żeniu najd łużej, tzn. od grupy 
poddawanej 240-minutowemu nara żeniu, nast ępnie bada ć grupę poddawan ą 
narażeniu przez 120 minut i tak dalej. Przyk ładowo, je śli zwierzęta w grupie 
240-minutowej po 90 minutach zdychaj ą lub wykazuj ą poważne oznaki 
toksyczno ści (np. ekstremalne zmiany w sposobie oddychania, takie jak 
trudności z oddychaniem), nara żanie grupy przez 120 minut nie ma sensu, 
ponieważ śmiertelno ść najprawdopodobniej wyniesie 100 %. Dla tego 
stężenia kierownik badania powinien zatem wybra ć krótsze okresy nara żenia 
(np. 90, 65, 45, 33 i 25 minut).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Stężenie w komorze nale ży często mierzy ć w celu wyznaczenia wa żonej 
czasowo średniej st ężenia na ka żdy czas trwania nara żenia. Tam, gdzie to 
możliwe, w analizie statystycznej nale ży użyć czasu zgonu ka żdego zwie ­
rzęcia (a nie czasu trwania nara żenia).  
8. Wyniki pierwszych czterech sesji nara żenia nale ży przeanalizowa ć w celu 
znalezienia luki w danych dla krzywej st ężenie-czas (zob. rysunek 1). 
W przypadku gdy dopasowanie jest niewystarczaj ące, można przeprowadzi ć 
dodatkowe nara żenie (przy pi ątej wartości stężenia). Stężenie i czas trwania 
narażenia dla pi ątej sesji nale ży dobrać tak, by wype łnić tę lukę w danych.  
9. Do obliczenia relacji st ężenie-czas-reakcja za pomoc ą analizy statystycznej 
(16) wykorzystuje si ę wszystkie sesje nara żenia (w tym pierwsz ą). O ile to 
możliwe, dla ka żdego interwa łu C × t nale ży użyć ważonej czasowo średniej 
stężenia i czasu trwania nara żenia aż do zgonu (je śli zgon nast ąpi podczas 
narażenia).  
Rysunek 1  
Hipotetyczna ilustracja relacji st ężenie-czas- śmiertelno ść u szczurów
  
Symbole bez wype łnienia = zwierz ęta, które prze żyły; symbole pe łne = 
zwierzęta padłe 
Trójkąty = samice; kó łka = samce  
Linia ciągła = warto ści LC  50 (zakres 7,5–240 min) dla samców przy n = 1  
Linia przerywana = warto ści LC  50 (zakres 7,5–240 min) dla samic przy 
n = 1  
Linie kropkowane = linie hipotetycznych warto ści LC  50 dla samców 
i samic, gdyby warto ść n wynosi ła 2 (12).  
Glosariusz  
Stężenie:  
Czas trwania nara żenia: ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Poni żej podano przyk ład procedury sekwencyjnej:  
Sesja nara żenia I – Badanie przy st ężeniu granicznym (zob. rysunek 1)  
— 1 zwierz ę/płeć dla relacji st ężenie/czas; łącznie 10 zwierz ąt ( a ). 
— Stężenie docelowe (  b ) = stężenie graniczne.  
— Pięć grup zwierz ąt poddaje si ę narażeniu przy tym st ężeniu docelowym 
przez okresy odpowiednio 15, 30, 60, 120 i 240 minut.  
↓ 
Sesja nara żenia II  ( c ) – Badanie g łówne  
— 1 zwierz ę/płeć na stężenie/czas; łącznie 10 zwierz ąt. 
— Pięć grup zwierz ąt poddaje si ę narażeniu przy ni ższym stężeniu (  d ) 
(1/2L) przez nieco d łuższe okresy (przeskalowane wspó łczynnikiem 
√2, zob. rysunek 1).  
↓ 
Sesja nara żenia III – Badanie g łówne  
— 1 zwierz ę/płeć na stężenie/czas; łącznie 10 zwierz ąt. 
— Pięć grup zwierz ąt poddaje si ę narażeniu przy ni ższym stężeniu (  d ) 
(1/4L) przez nieco d łuższe okresy (przeskalowane wspó łczynnikiem 
√2, zob. rysunek 1).  
↓ 
Sesja nara żenia IV’ – Badanie g łówne  
— 1 zwierz ę/płeć na stężenie/czas; łącznie 10 zwierz ąt. 
— Pięć grup zwierz ąt poddaje si ę narażeniu przy ni ższym stężeniu (  d ) 
(1/8L) przez nieco d łuższe okresy (przeskalowane wspó łczynnikiem 
√2, zob. rysunek 1).  
↓ albo  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) W razie braku dost ępnych informacji na temat podatno ści związanej z płcią wykorzystuje 
się szczury obu p łci, tzn. 1 zwierz ę/płeć na każde stężenie. Na podstawie istniej ących 
informacji b ądź gdy podczas tej sesji nara żenia stanie si ę oczywiste, że jedna z p łci jest 
bardziej podatna, podczas kolejnych bada ń wykorzystuje si ę 10 zwierz ąt podatnej p łci (2 
osobniki na st ężenie/czas) przy ka żdym poziomie st ężenia. 
( b ) Jeśli stosowane jest rozporz ądzenie (WE) nr 1272/2008, st ężenia graniczne dla gazów, 
par i aerozoli wynosz ą odpowiednio 20 000 ppm, 20 mg/l i 5 mg/l. W przypadku 
oczekiwanej toksyczno ści lub na podstawie wyników badania rozpoznawczego nale ży 
wybrać niższe stężenia pocz ątkowe. Je żeli jest taka potrzeba, wynikaj ąca z regulacji lub 
powodów naukowych, mo żna zastosowa ć wyższe stężenia. 
( c ) Najlepiej odwlec nara żenie zwierz ąt przy kolejnym st ężeniu do momentu, gdy mo żna 
rozsądnie uzna ć, że zwierzęta poddane poprzednio nara żeniu prze żyły. Dzięki temu 
kierownik badania mo że dopasowa ć stężenie docelowe i czas trwania dla kolejnej sesji 
narażenia. 
( d ) Kolejną kombinacj ę stężenia i czasu trwania nara żenia ustala si ę, biorąc jako wytyczn ą 
minimaln ą dawkę (stężenie × czas), która spowodowa ła śmiertelno ść podczas badania 
przy stężeniu pocz ątkowym (pierwsza sesja nara żenia). Zazwyczaj st ężenie zmniejsza si ę 
dwukrotnie (1/2L) i zwierz ęta poddawane s ą narażeniu w nowym zakresie czasowym 
charakteryzuj ącym się krótszymi odst ępami między sesjami nara żenia, wyznaczonymi 
przy zastosowaniu dzielenia geometrycznego okresów nara żenia przez wspó łczynnik 
1,4 (√2, zob. pozycja literaturowa 11), zaczynaj ąc od czasu trwania odpowiadaj ącego 
poziomowi minimalnej dawki śmiertelnej (czas × st ężenie) zaobserwowanemu podczas 
pierwszego nara żenia. W zilustrowanym przypadku (rysunek 1) zaobserwowano śmier­
telność w sesji nara żenia I po 15 minutach; czasy trwania nara żenia podczas sesji II s ą 
zatem dobrane w odniesieniu do środkowego punktu 30 minut i s ą równe 15, 21, 30, 42 
i 60 minut. Po pierwszych dwóch sesjach nara żenia zdecydowanie zaleca si ę przedsta ­
wienie danych w formie wykresu podobnego do powy ższego i sprawdzenie, czy linia 
obrazująca relację między stężeniem i czasem tworzy k ąt 45 stopni (n = 1), ma nachy ­
lenie mniejsze (np. n = 2), czy te ż większe (np. n = 0,8). W tym ostatnim przypadku 
zdecydowanie zaleca si ę stosowne dostosowanie kolejnych st ężeń i czasów trwania.
 Sesja nara żenia IV – badanie g łówne  
— 1 zwierz ę/płeć na stężenie/czas; łącznie 10 zwierz ąt. 
— Pięć grup zwierz ąt poddaje si ę narażeniu przy wy ższym stężeniu (  e ) (2L) 
przez nieco krótsze okresy (przeskalowane wspó łczynnikiem √2, zob. 
rysunek 1).  
Opracowanie matematyczne wyników zastosowania protoko łu C × t  
11. W procedurze C × t obejmuj ącej 4 lub 5 st ężeń substancji i pi ęć czasów 
trwania nara żenia uzyskuje si ę odpowiednio 20 lub 25 punktów pomiaro ­
wych. Na ich podstawie mo żna obliczy ć relację C × t za pomoc ą analizy 
statystycznej (16):  
Równanie 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
gdzie: C = st ężenie; t = czas trwania nara żenia, lub  
Równanie 2:  
Reakcja ¼ ƒðC n tÞ 
gdzie:  n ¼ b 1=b 2: 
Za pomoc ą równania 1 mo żna obliczy ć wartość LC  50 dla danego czasu 
trwania (np. 4 godziny, 1 godzina, 30 minut, lub dowolnego czasu trwania w badanym zakresie), podstawiaj ąc P = 5 (reakcja 50 %). Nale ży zauważyć, 
że reguła Habera ma zastosowanie tylko dla n = 1. LC
 01 można obliczy ć 
podstawiaj ąc P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) W niektórych przypadkach mo że być konieczne zwi ększenie st ężenia (2L) w nowym 
zakresie czasowym charakteryzuj ącym się jeszcze krótszymi odst ępami czasowymi, 
wyznaczonymi przy zastosowaniu dzielenia geometrycznego okresów nara żenia przez 
współczynnik 1,4 ( √2), zaczynaj ąc od czasu trwania odpowiadaj ącego poziomowi mini ­
malnej dawki śmiertelnej zaobserwowanemu podczas pierwszego nara żenia. Minimalny 
czas trwania nara żenia powinien by ć dłuższy niż 5 minut, maksymalny za ś nie przekra ­
czać 8 godzin.
 B.3. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA (DERMALNA)  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. A).  
1.2. DEFINICJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. B).  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Substancj ę badaną nakłada się na skórę w stopniowanych dawkach 
kilku grupom zwierz ąt doświadczalnych, po jednej dawce na grup ę. 
Następnie obserwuje si ę skutki podania substancji i zgony. Zwie ­
rzęta, które zdechn ą w trakcie badania, i te, które prze żyją po jego 
zakończeniu, poddaje si ę sekcji zw łok. 
Zwierzęta wykazuj ące ciężkie i trwa łe oznaki stanu zagro żenia i bólu 
mogą wymaga ć humanitarnego u śmiercenia. Dozowanie badanych 
substancji na drodze znanej z powodowania znacz ącego bólu 
i stany zagro żenia z powodu w łaściwości żrących lub dra żniących 
nie może być przeprowadzane.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Przygotowania  
Zwierzęta muszą być trzymane w do świadczalnych warunkach 
pobytu i karmienia przez co najmniej pi ęć dni przed przeprowadze ­
niem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, m łode, 
dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do poszcze ­
gólnych grup otrzymuj ących substancj ę. Na około 24 godziny przed 
przeprowadzeniem badania nale ży usunąć sierść z grzbietowej 
powierzchni tu łowia zwierz ąt przez przyci ęcie lub ogolenie. Podczas 
przycinania lub golenia sier ści należy uważać, aby nie uszkodzi ć 
skóry, gdy ż mogłoby to zmieni ć jej przepuszczalno ść. Nie mniej 
niż 10 % powierzchni cia ła powinno by ć wolne do zastosowania 
substancji badanej. W przypadku badania cia ł stałych, które powinny 
zostać sproszkowane, o ile jest to w łaściwe, substancja badana 
powinna zosta ć wystarczaj ąco zwilżona wodą lub w razie koniecz ­
ności odpowiednim pod łożem zapewniaj ącym dobry kontakt ze 
skórą. W przypadku wykorzystania pod łoża należy uwzględnić 
jego wpływ na penetracj ę substancji badanej przez skór ę. Płynne 
substancje badane stosuje si ę na ogół w stanie nierozcie ńczonym.  
1.6.2.  Warunki badania  
1.6.2.1.  Zwierz ęta doświadczalne  
Można wykorzysta ć dorosłe szczury lub króliki. Mo żna równie ż 
wykorzysta ć inne gatunki, jednak wymaga to uzasadnienia. Nale ży 
wykorzystywa ć powszechnie stosowane szczepy laboratoryjne. Dla 
każdej płci na pocz ątku badania zakres zmienno ści wagowej u żytych 
zwierząt nie powinien przekracza ć ± 20 % w łaściwej warto ści śred­
niej. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Liczba i p łeć 
Co najmniej pi ęć zwierząt jest używanych dla ka żdej wielko ści 
dawki. Powinny by ć one wszystkie jednakowej p łci. Jeżeli stosuje 
się samice, powinny by ć one nieródkami i nie mog ą być w ciąży. 
Jeżeli dostępna jest informacja wskazuj ąca, że dana p łeć jest 
znacząco bardziej czu ła, należy użyć do dawkowania zwierz ąt tej 
płci. 
Uwaga:  W badaniach ostrej toksyczno ści u zwierz ąt wyższego rzędu 
niż gryzonie nale ży rozważyć użycie mniejszej ilo ści. Dawki musz ą 
być starannie wybrane oraz nale ży dołożyć wszelkich stara ń by nie 
przekracza ć dawek średniej toksyczno ści. Należy unikać podawania 
w takich badaniach dawek śmiertelnych substancji badanej.  
1.6.2.3.  Poziomy dawkowania  
Powinno si ę zapewni ć odpowiedni ą liczbę, co najmniej trzy, przy 
czym nale ży zachowa ć odpowiednie odst ępy między nimi, tak aby 
uzyskać grupy badane ró żniące się istotnie efektami toksycznymi 
i umieralno ścią. Przy podejmowaniu decyzji co do wielko ści 
dawek nale ży uwzględniać wszelkie dzia łania drażniące i żrące. 
Dane powinny by ć wystarczaj ące do opracowania krzywej zale żności 
odpowiedzi od dawki oraz, o ile to b ędzie możliwe, do ustalenia 
w możliwy do przyj ęcia sposób warto ści LD  50 . 
1.6.2.4.  Badanie graniczne  
Przeprowadza si ę badanie graniczne przy jednej wielko ści dawki, 
przynajmniej 2 000 mg/kg masy cia ła, w grupie sk ładającej się z 
pięciu samców i pi ęciu samic, stosuj ąc procedur ę powyżej opisan ą. 
Jeżeli zachodzi zwi ązek śmiertelno ści z badan ą substancj ą, należy 
rozważyć wykonanie pe łnego badania.  
1.6.2.5.  Okres obserwacji  
Okres obserwacji powinien wynosi ć co najmniej 14 dni. Jednak że 
nie powinien on by ć sztywno ustalony. Powinien zale żeć od reakcji 
toksycznych, szybko ści ich pojawiania si ę oraz okresu powrotu do 
zdrowia po ich wyst ąpieniu; w zwi ązku z tym mo żna go wyd łużyć, 
jeżeli uzna si ę to za konieczne. Wa żny jest czas, po jakim pojawiaj ą 
się i znikają objawy toksyczno ści, oraz czas zgonu, zw łaszcza gdy 
istnieje tendencja do opó źnionych zgonów.  
1.6.3.  Procedura  
Zwierzęta powinny by ć trzymane w oddzielnych klatkach. 
Substancja badana powinna zosta ć nałożona w sposób równomierny 
na obszar równy oko ło 10 % ca łkowitej powierzchni cia ła. 
W przypadku substancji wysoce toksycznych mo żna je nanie ść na 
mniejszą powierzchni ę, jednak nale ży dążyć do tego, aby pokry ć jak 
największy obszar jak najcie ńszą i jak najbardziej równomiern ą 
warstwą badanego zwi ązku. 
Substancje badane powinny by ć utrzymywane w kontakcie ze skór ą 
dzięki zastosowaniu porowatego opatrunku z gazy i niedra żniącej 
taśmy w trakcie ekspozycji zapewnianej przez 24 godziny. Miejsce 
badania nale ży dodatkowo przykry ć w taki sposób, aby utrzyma ć 
opatrunek z gazy i substancj ę badaną i zapewni ć, aby zwierz ęta 
nie mog ły zjeść tej ostatniej. W celu zapobie żenia spo życiu 
substancji badanej mo żna uwiązać zwierzę, jednak pe łna immobili ­
zacja nie jest zalecan ą metodą. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
Pod koniec okresu ekspozycji nale ży usunąć resztki badanej substan ­
cji, w miar ę możliwości stosując wodę lub jakie ś inne, w łaściwe 
metody oczyszczania skóry.  
Obserwacje nale ży odnotowywa ć w sposób systematyczny, w miar ę 
ich zbierania. Nale ży prowadzi ć oddzielne zapisy dla ka żdego zwie ­
rzęcia. Obserwacja powinna by ć częsta w ciągu pierwszego dnia. 
Staranne badanie kliniczne nale ży przeprowadza ć co najmniej raz 
każdego dnia roboczego. Inne obserwacje nale ży przeprowadza ć 
codziennie, podejmuj ąc odpowiednie dzia łania maj ące na celu 
zmniejszenie do minimum utraty zwierz ąt podczas badania, np. 
sekcję zwłok lub zamra żanie tych zwierz ąt, które zostan ą znalezione 
martwe, oraz izolacj ę lub usypianie zwierz ąt słabych lub śmiertelnie 
chorych.  
Obserwacje przy klatce zwierz ęcia powinny obejmowa ć zmiany 
sierści, traktowanej substancj ą skóry, oczu i b łon śluzowych oraz 
zmiany uk ładu oddechowego, kr ążenia, autonomicznego 
i ośrodkowego uk ładu nerwowego, jak te ż wzorców aktywno ści 
somatomotorycznej i wzorca zachowania. Szczególn ą uwagę należy 
zwrócić na obserwacje dr żeń, drgawek, zwi ększonego wydzielania 
śliny, biegunki, stanów zwi ększonej senno ści, snu i śpiączki. Nale ży 
jak najprecyzyjniej odnotowa ć termin zgonu. Zwierz ęta, które 
zdechną w trakcie badania, i te, które prze żyją po jego zako ńczeniu, 
poddaje si ę sekcji zw łok. Należy odnotowa ć wszelkie makroskopowe 
zmiany patologiczne. O ile jest to wskazane, nale ży pobrać wycinki 
tkanek do badania histopatologicznego.  
Ocena toksyczno ści dla innej p łci 
Po zakończeniu bada ń jednej płci, przeprowadza si ę dawkowanie na 
przynajmniej jednej grupie pi ęciu zwierz ąt płci przeciwnej, w celu 
ustalenia czy zwierz ęta tej płci nie są znacząco bardziej wra żliwe na 
substancję badaną. Użycie mniejszej ilo ści zwierząt musi by ć uzasad­
nione w indywidualnych okoliczno ściach. Je żeli dostępna jest 
stosowna informacja pokazuj ąca, że zwierz ęta badanej p łci są 
znacznie bardziej wra żliwe, drug ą płeć można pomin ąć. 
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w skrócie w formie tabelarycznej, z poda ­
niem – dla ka żdej badanej grupy – liczby zwierz ąt na pocz ątku 
badania, terminów zgonu poszczególnych zwierz ąt, liczby zwierz ąt 
wykazujących inne objawy toksyczno ści, opisu efektów toksycznych 
i wyniku sekcji zw łok. Należy określić masę ciała poszczególnych 
zwierząt i zapisa ć ją tuż przed podaniem badanej substancji, 
a później co tydzie ń i w momencie zgonu. Nale ży oblicza ć zmiany 
masy cia ła i zapisywa ć je, gdy zwierz ę przeżyje więcej niż jedną 
dobę. Zwierzęta humanitarnie zabite z powodu bólu i zagro żenia 
związanego z dan ą substancj ą są zapisywane jako u śmiercone 
w związku z substancj ą. Można ustalić LD  50 przy użyciu uznanej 
metody.  
Ocena danych powinna obj ąć istnienie ewentualnej wspó łzależności 
pomiędzy ekspozycj ą zwierząt na substancj ę badaną a częstością 
i ciężkością wszelkich zaburze ń, włącznie z zaburzeniami zacho ­
wania i klinicznymi, zmianami makroskopowymi, zmianami masy ciała, umieralno ścią i wszelkimi innymi efektami toksycznymi.
 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.,  
— warunki badania (w łączając metodę oczyszczania skóry i typ 
opatrunku: okluzyjny lub nieokluzyjny),  
— wielko ści dawek (wraz z pod łożem, o ile jest wykorzystane, 
i stężeniami),  
— płeć zwierząt poddanych dawkowaniu,  
— tabelaryczne przedstawienie danych reakcji toksycznej w rozbiciu 
na płcie i wielko ść dawki (to jest liczba pad łych zwierz ąt lub 
zabitych w czasie trwania badania, liczba zwierz ąt wykazuj ących 
oznaki dzia łania toksycznego, liczba zwierz ąt poddanych 
ekspozycji),  
— czas zgonu po dawkowaniu, przyczyny i kryteria przyj ęte przy 
humanitarnym zabijaniu zwierz ąt, 
— wszystkie obserwacje,  
— warto ść LD  50 dla płci poddanej pe łnym badaniom ustalonym na 
14 dni (wraz z okre śloną metodą oznaczania),  
— 95 % przedzia ł ufności dla LD  50 (o ile mo żna go przedstawi ć), 
— krzywa zale żności umieralno ści od dawki i jej nachylenie (o ile 
metoda oznaczania pozwala na ustalenie tych danych),  
— wyniki sekcji zw łok, 
— wszelkie wyniki bada ń histopatologicznych,  
— wyniki wszystkich bada ń płci przeciwnej,  
— omówienie wyników (nale ży zwróci ć szczególn ą uwagę, że 
humanitarne zabicie zwierz ąt w czasie trwania badania wp ływa 
na obliczon ą wartość LD  50 ), 
— interpretacja wyników.  
3.2. OCENA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. D).  
4. LITERATURA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. E).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. OSTRA TOKSYCZNO ŚĆ: PODRA ŻNIENIA/KOROZJA SKÓRY  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest kopi ą OECD TG 404 (2002).  
1.1. WPROWADZENIE  
W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody specjaln ą 
uwagę poświęcono mo żliwym ulepszeniom w zakresie zagadnie ń 
dotyczących dobrostanu zwierz ąt, a także ocenie wszystkich dost ęp­
nych informacji na temat substancji badanej, w celu unikni ęcia 
niepotrzebnych bada ń na zwierz ętach laboratoryjnych. Niniejsza 
metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przyst ąpieniem 
do opisywanego badania  in vivo  na korozj ę/podrażnienia skórne 
wywołane przez dan ą substancj ę, zostanie przeprowadzona analiza 
wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniej ących danych. Je żeli 
dostępne dane s ą niewystarczaj ące, mogą zostać opracowane przy 
pomocy bada ń sekwencyjnych (1). Strategia bada ń zawiera wykaz 
zweryfikowanych i zaakceptowanych bada ń in vitro  i stanowi 
załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo, tam gdzie to stosowne, 
zamiast jednoczesnej aplikacji zwierz ęciu trzech łat testowych, zale ­
cane jest stosowanie aplikacji sekwencyjnej, zamiast symultanicznej, 
we wstępnych badaniach  in vivo.  
Z uwagi na dobrze poj ęty interes nauki i dobrostan zwierz ąt badania  
in vivo  nie powinny by ć podejmowane, je żeli wszystkie dost ępne 
dane odnosz ące się do potencjalnego dzia łania korozyjnego/ ­
podrażniającego skór ę w wyniku dzia łania substancji nie zosta ły 
uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane b ędą zawierały 
dowody z wykonanych bada ń na ludziach oraz/lub zwierz ętach 
laboratoryjnych, dowody korozji/podra żnień wywołanych przez 
jedną lub wiele substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy 
lub mieszanin takich substancji, dane wskazuj ące na siln ą kwaso­
wość lub alkaliczno ść substancji (2)(3) oraz wyniki zweryfikowa ­
nych i zaakceptowanych bada ń in vivo  lub  ex vivo  (4)(5)(5a). 
Takie analizy powinny ograniczy ć potrzebę badań in vivo  pod 
kątem korozji/podra żnień skórnych wywo łane przez substancje, 
w odniesieniu do których ju ż istnieje wystarczaj ący materia ł dowo­
dowy w odniesieniu do dwóch odno śnych punktów docelowych, 
zgromadzony w wyniku prowadzenia innych bada ń. 
Preferowan ą strategię badań sekwencyjnych, obejmuj ącą przeprowa ­
dzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych bada ń in vivo  i ex vivo  
działania korozyjnego/podra żniającego, zawiera za łącznik do 
niniejszej metody. Strategia ta zosta ła opracowana i jednomy ślnie 
zalecona przez uczestników warsztatów OECD (6), a nast ępnie 
zatwierdzona jako zalecana strategia bada ń w ramach Globalnego 
Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji Zwi ązków Chemicznych 
(GHS) (7). Zaleca si ę realizacj ę tej strategii bada ń przed podj ęciem 
badań in vivo.  Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym 
stopniowym podej ściem badawczym s łużącym opracowywaniu 
danych warto ściowych z naukowego punktu widzenia dotycz ących 
korozyjnego/podra żniającego dzia łania substancji na skór ę. 
W odniesieniu do istniej ących substancji, na temat których brak 
wystarczaj ących danych co do ich dzia łania korozyjnego/ ­
podrażniającego, strategia ta powinna zosta ć wykorzystana w celu 
uzupełnienia brakuj ących danych. U życie innych strategii badaw ­
czych bądź procedur lub decyzja o nieprzyj ęciu stopniowego 
podejścia badawczego wymaga uzasadnienia.  
Jeżeli określenie korozyjno ści lub podra żnienia nie mo że zostać 
przeprowadzone przy u życiu analizy wagi dowodów, która jest 
zbieżna ze strategi ą badań sekwencyjnych, nale ży rozważyć badanie  
in vivo  (zob. załącznik).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. DEFINICJE  
Podrażnienie skórne:  jest wynikiem odwracalnych uszkodze ń skóry 
wynikających z zastosowania substancji badanej przez okres czterech 
godzin.  
Korozja skórna:  jest wynikiem nieodwracalnego uszkodzenia skóry; 
mianowicie widocznej martwicy przebiegaj ącej przez naskórek 
w głąb skóry, spowodowanej zaaplikowaniem substancji badanej 
na okres nieprzekraczaj ący czterech godzin. Rodzaje korozji obej ­
mują wrzody, krwawienie, strupy oraz – po zako ńczeniu 14-dniowej 
obserwacji – odbarwienia wynik łe ze zbielenia skóry, obszary jedno ­
litej alopecji, a tak że blizny. Celem oceny niejasnych zmian mo żna 
przeprowadzi ć badanie histopatologiczne.  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Substancja, która ma by ć zbadana, jest nak ładana na skór ę 
zwierzęcia doświadczalnego w pojedynczej dawce, cz ęść skóry 
niepoddana zabiegowi s łuży jako cz ęść kontrolna. Stopie ń 
korozji/podra żnienia jest oceniany przy pomocy punktacji 
w określonych odst ępach i zapisywany, a nast ępnie dodatkowo 
opisywany w celu ca łkowitego oszacowania skutków dzia łania. 
Czas trwania badania powinien by ć wystarczaj ący do oceny odwra ­
calności lub nieodwracalno ści zaobserwowanych skutków.  
Zwierzęta wykazuj ące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na 
jakimkolwiek etapie bada ń powinny zosta ć uśmiercone w sposób 
humanitarny, a substancja oceniona stosownie do zaobserwowanych 
skutków. Kryteria podejmowania decyzji co do u śmiercenia zwierz ąt 
w stanie agonalnym lub cierpi ących ból zosta ły określone 
w załączniku (8).  
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Przygotowanie do bada ń in vivo  
1.4.1.1.  Wybór gatunku zwierz ąt 
Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierz ąt laboratoryjnych. 
Wykorzystywane s ą zdrowe m łode doros łe króliki. W przypadku 
wykorzystania innych gatunków nale ży podać uzasadnienie.  
1.4.1.2.  Przygotowanie zwierz ąt 
Na około 24 godziny przed badaniem nale ży usunąć futro z tu łowia 
zwierzęcia poprzez g ładkie wygolenie obszaru skóry na grzbiecie. 
Należy unikać otarć naskórka. Nale ży wykorzystywa ć wyłącznie 
zwierzęta ze zdrow ą nienaruszon ą skórą. 
Niektóre szczepy królików posiadaj ą kępy futra, których g ęstość jest 
większa w okre ślonych porach roku. Takie obszary g ęstego futra nie 
powinny by ć używane jako miejsca bada ń. 
1.4.1.3.  Warunki przebywania i warunki żywieniowe  
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 20  o C (± 3  o ) dla królików. Chocia ż wilgotno ść względna 
powinna wynosi ć co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie prze ­
kraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem 
powinno by ć utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. O świetlenie 
powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. 
Do żywienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze laboratoryjne 
z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Procedura bada ń 
1.4.2.1.  Podanie substancji badanej  
Substancja badana powinna zosta ć zaaplikowana na ma łym obszarze 
skóry (oko ło 6 cm  2 ) i przykryta łatą gazy przytrzymywan ą na 
miejscu przy pomocy niepodra żniającego plastra. W przypadku 
gdy zaaplikowanie substancji bezpo średnio nie jest niemo żliwe 
(np. w przypadku cieczy lub niektórych past), substancja badana powinna zosta ć najpierw na łożona na gaz ę, a następnie na skór ę. 
Gaza powinna lu źno przylega ć do skóry i powinna by ć przyczepiona 
do skóry na czas trwania ekspozycji przy pomocy odpowiedniego opatrunku pó łokluzyjnego. Je żeli substancja badana zosta ła podana 
na łacie, powinna ona by ć przyczepiona do skóry w sposób zapew ­
niający dobry kontakt i równomierne rozprowadzenie substancji na 
skórze. Nale ży zapobiec dost ępowi zwierz ęcia do gazy oraz spo życiu 
lub inhalacji substancji badanej przez zwierz ę.
 
Ciekłe substancje badane s ą na ogół stosowane w stanie nierozcie ń­
czonym. W przypadku badania substancji sta łych (których posta ć 
można zmieni ć na postać proszkow ą, o ile zachodzi tak konieczno ść) 
substancja badana powinna zosta ć rozcieńczona przy u życiu mini ­
malnej ilo ści wody (lub, o ile to konieczne, innego odpowiedniego 
nośnika), wystarczaj ącej do zapewnienia dobrego kontaktu ze skór ą. 
Jeżeli stosowany jest inny no śnik niż woda, potencjalny wp ływ na 
podrażnienia skóry przez t ą substancj ę powinien by ć minimalny lub 
żaden.  
O ile to mo żliwe, na zako ńczenie okresu ekspozycji, który na ogó ł 
trwa cztery godziny, pozosta łości substancji badanej powinny zosta ć 
usunięte przy u życiu wody lub innego odpowiedniego rozcie ńczal­
nika, w sposób pozwalaj ący na unikni ęcie zmian w zaistnia łej reakcji 
oraz nienaruszenie naskórka.  
1.4.2.2.  Poziom dawki  
Aplikowana jest dawka 0,5 ml cieczy lub 0,5 g cia ła stałego lub 
pasty na badany obszar skóry.  
1.4.2.3.  Badanie wst ępne (Badanie in vivo podra żnienia/korozji skóry przy 
użyciu jednego zwierz ęcia) 
Stanowczo zaleca si ę, aby badania  in vivo  były przeprowadzane 
wstępnie przy u życiu jednego zwierz ęcia, zwłaszcza w przypadku 
podejrzeń, że substancja jest potencjalnie korozyjna. Jest to zgodne 
z sekwencyjn ą strategią badawcz ą (zob. załącznik 1).  
Jeżeli oceniono, że substancja mo że mieć właściwości korozyjne na 
podstawie analizy wagi dowodów, nie s ą wymagane dalsze badania 
na zwierz ętach. W przypadku wi ększości substancji, w odniesieniu 
do których istnieje podejrzenie korozyjno ści, nie wymagane s ą 
zazwyczaj dodatkowe badania  in vivo.  Jednakże w przypadkach 
gdzie istnieje potrzeba dostarczenia dodatkowych danych z uwagi na niewystarczaj ące dowody, mog ą zostać przeprowadzone ograni ­
czone badania na zwierz ętach z zastosowaniem nast ępującej proce ­
dury: na skór ę zwierzęcia nakłada się maksymalnie do trzech łat 
testowych. Pierwsza łata jest usuwana po trzech minutach. Je żeli 
nie zaobserwowano żadnych powa żnych reakcji skórnych, nak ładana 
jest druga łata i usuwana po godzinie. Je żeli obserwacje na tym 
etapie wskazuj ą na to, że ekspozycja mo że być humanitarnie prze ­
prowadzana, nale ży wydłużyć jej czas do czterech godzin, trzecia 
łata jest nak
ładana i zdejmowana po czterech godzinach, a reakcja 
punktowana.  
Jeżeli działanie korozyjne jest stwierdzone po jednej z trzech 
sekwencyjnych ekspozycji, badanie jest natychmiast przerywane. W przypadku niestwierdzenia dzia łania korozyjnego po usuni ęciu 
ostatniej łaty, zwierz ę jest poddawane obserwacji w okresie 14 dni, 
o ile wcze śniej nie rozwinie si ę korozja.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
W przypadku gdy nie przewiduje si ę, że substancja badana mo że 
powodowa ć korozję, lecz mo że wywoływać podrażnienia, powinna 
ona zosta ć zaaplikowana jednemu zwierz ęciu na czas czterech 
godzin.  
1.4.2.4.  Badanie potwierdzaj ące (Badanie in vivo podra żnienia skórnego 
przy wykorzystaniu dodatkowych zwierz ąt) 
W przypadku niestwierdzenia dzia łań korozyjnych w badaniach 
wstępnych dzia łanie podra żniające lub jego brak nale ży potwierdzi ć 
przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierz ąt. 
Każde powinno zosta ć zbadane przy pomocy jednej łaty 
w czterogodzinnym okresie ekspozycji. W przypadku stwierdzenia 
działania podra żniającego w badaniu wst ępnym, badanie potwier ­
dzające może zostać przeprowadzone w sposób sekwencyjny lub 
poprzez ekspozycj ę dwóch dodatkowych zwierz ąt jednocze śnie. 
W wyjątkowym przypadku nieprzeprowadzania badania wst ępnego, 
można zbada ć dwa lub trzy zwierz ęta, z których ka żde zostanie 
poddane dzia łaniu jednej łaty, usuni ętej następnie po czterech godzi ­
nach. Jeżeli w przypadku wykorzystywania dwóch zwierz ąt, obydwa 
wykazują te same reakcje, nie wymaga si ę przeprowadzania dalszych 
badań. W innym wypadku zbadane zostaje równie ż trzecie zwierz ę. 
Niejednoznaczna reakcja mo że wymaga ć oceny z wykorzystaniem 
dodatkowych zwierz ąt. 
1.4.2.5.  Okres obserwacji  
Długość trwania obserwacji powinien by ć wystarczaj ący do pe łnej 
oceny odwracalno ści zaobserwowanych efektów. Jednak że ekspery ­
ment powinien zosta ć przerwany, skoro tylko zwierz ę zacznie wyka ­
zywać trwałe objawy silnego bólu lub strachu. W celu okre ślenia 
odwracalno ści skutków zwierz ę powinno by ć obserwowane maksy ­
malnie przez okres 14 dni od usuni ęcia łat. W przypadku zaobser ­
wowania odwracalno ści przed up ływem 14 dni, eksperyment powi ­
nien zosta ć przerwany.  
1.4.2.6.  Obserwacja kliniczna i ocena punktowa reakcji skóry  
Zwierzęta powinny zosta ć zbadane pod k ątem wyst ąpienia objawów 
rumienia i obrz ęku oraz reakcji odnotowanych po 60 minutach, 
a następnie po 24, 48 oraz 72 godzinach od usuni ęcia łaty. 
W badaniu wst ępnym przeprowadzanym na jednym zwierz ęciu 
miejsce zaaplikowania substancji badanej jest badane równie ż 
natychmiast po usuni ęciu łaty. Reakcje skórne s ą oceniane przy 
pomocy warto ści punktowych i zapisywane zgodnie z punktacj ą 
podaną w tabeli poni żej. W przypadku uszkodzenia naskórka, 
którego nie mo żna zidentyfikowa ć jako podra żnienia ani korozji po 
72 godzinach, w celu okre ślenia odwracalno ści efektów konieczne 
może okazać się prowadzenie obserwacji do 14 dnia. Oprócz 
spostrzeżeń na temat podra żnień należy w pe łni opisa ć 
i zarejestrowa ć wszelkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak 
odtłuszczenie skóry oraz wszelkie ogólnoustrojowe niekorzystne 
skutki (np. skutki klinicznych objawów zatrucia i utrata masy cia ła). 
Celem wyja śnienia niejednoznacznych reakcji mo żna posłużyć się 
badaniem histopatologicznym.  
Ocena punktowa reakcji skóry jest z konieczno ści subiektywna. 
Celem propagowania harmonizacji oceny punktowej reakcji skóry 
oraz zapewnienia pomocy laboratoriom badawczym oraz osobom 
zaangażowanym w prowadzenie oraz interpretacj ę obserwacji, 
personel prowadz ący obserwacje powinien by ć odpowiednio prze ­
szkolony w zakresie stosowanego systemu oceny (zob. tabela poni ­ 
żej). Pomocne mog ą okazać się ilustrowane instrukcje dotycz ące 
klasyfikacji podra żnień i innych zmian skóry (9).  
2. DANE  
2.1. PREZENTACJA WYNIKÓW  
Streszczenie wyników bada ń powinno zosta ć przedstawione 
w formie tabeli w sprawozdaniu ko ńcowym z bada ń, która powinna 
zawierać wszystkie pozycje wymienione w sekcji 3.1.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. OCENA WYNIKÓW  
Wartości punktowe podra żnienia skóry winny by ć ocenianie 
stosownie do natury oraz nat ężenia zmian, oraz w świetle ich odwra ­
calności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowi ą normy 
bezwzględnej właściwości podra żniających danego materia łu, 
ponieważ ocenie poddawane s ą również pozostałe skutki ekspozycji 
na badany materia ł. Alternatywnie, poszczególne wyniki powinny 
być traktowane jako warto ści odniesienia, które musz ą być oceniane 
w świetle wszystkich pozosta łych spostrze żeń z badań. 
W ocenie reakcji podra żnienia pod uwag ę powinna by ć brana odwra ­
calność zmian skóry. Je żeli reakcje takie jak alopecja (na ograni ­
czonej powierzchni), hiperkeratoza, hiperplazja i łuszczenie s ą 
nadal obecne wraz z up ływem 14-dniowego okresu obserwacji, 
substancja badana powinna zosta ć uznana za dra żniącą. 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące informacje:  
Uzasadnienie bada ń in vivo:  analizę wagi dowodów, w łączając 
wyniki realizacji strategii bada ń sekwencyjnych:  
— opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych 
badań, 
— dane uzyskane w wyniku realizacji ka żdego etapu strategii 
badawczej,  
— opis przeprowadzonych bada ń in vitro,  włączając szczegó łowe 
dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,
 
— analiza wagi dowodów istniej ących danych dla celów przeprowa ­
dzenia bada ń in vivo . 
Substancja badana:  
— identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czysto ść, znane zanie ­
czyszczenia, numer osobnika),  
— stan skupienia i w łaściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotno ść, 
rozpuszczalno ść, stabilno ść), 
— w przypadku mieszaniny sk ład i zawarto ść procentow ą składni­
ków.  
Nośnik: 
— identyfikacja, st ężenie (jeżeli dotyczy), u żyta objętość, 
— uzasadnienie wyboru no śnika.  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania 
zwierząt innych ni ż białe króliki,  
— liczba zwierz ąt każdej płci, 
— indywidualna masa cia ła na pocz ątku i na ko ńcu badań, 
— wiek na pocz ątku badań, 
— źródło pochodzenia zwierz ąt, warunki przetrzymywania, dieta itp.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Warunki bada ń: 
— technika przygotowywania miejsc przy łożenia łat, 
— szczegó łowy opis materia łu, z którego wykonane s ą łaty, 
i sposób ich przyk ładania,  
— szczegó ły dotyczące przygotowania, zaaplikowania i usuni ęcia 
substancji badanej.  
Wyniki:  
— tabele wyników podra żnienia/korozji dla ka żdego zwierz ęcia 
w każdym punkcie czasowym pomiaru,  
— opis wszelkich zaobserwowanych zmian,  
— słowny opis rodzaju i stopnia zaobserwowanego podra żnienia lub 
korozji oraz wszystkie dane histopatologiczne,  
— opis innych niekorzystnych zmian miejscowych i ogólnoustrojo ­
wych (np. odt łuszczenie skóry) towarzysz ących podra żnieniu lub 
korozji skóry.  
Omówienie wyników  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I.,Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P.(1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. 
ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410–429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  InVitro,  2, 19–26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation 
of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. 
ATLA 26, 709–720.  
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, „Skin Irritation”, Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
 
(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 
(http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemi ­
cals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ ­
HCL6.htm).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Grade 
and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experi ­
mental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United 
States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides 
and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.  
[Dostępne na wniosek w sekretariacie OECD].  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabela I  
PUNKTOWA OCENA REAKCJI SKÓRY  
Tworzenie rumienia i obrz ęku 
Brak rumienia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Bardzo lekki rumie ń (prawie niewidoczny) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Wyraźny rumień . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Rumień umiarkowany do mocnego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Mocny rumie ń (czerwie ń przypominaj ąca barwę mięsa czerwonego) do 
form obrz ęku wykluczaj ących klasyfikacj ę zmiany jako rumienia . . . . . 4  
Maksymalna mo żliwa warto ść punktowa: 4  
Tworzenie si ę obrzęku 
Brak obrz ęku . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Bardzo słaby obrzęk (prawie niewidoczny) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Lekki obrz ęk (dobrze wyodr ębniony) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Umiarkowany obrz ęk (wzniesienie na oko ło 1 mm) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Mocny obrz ęk (wniesienie ponad 1 mm, si ęgający poza obszar 
eksponowania) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4  
Maksymalna mo żliwa warto ść punktowa: 4  
Celem wyja śnienia reakcji niejednoznacznych mo żna przeprowadzi ć badanie 
histopatologiczne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
ZAŁĄCZNIK  
Strategia bada ń sekwencyjnych podra żnienia i korozji skóry  
ROZWA ŻANIA OGÓLNE  
Zarówno w dobrze poj ętym interesie nauki, jak i dobrostanu zwierz ąt, istotne jest 
uniknięcie niepotrzebnego wykorzystywania zwierz ąt oraz minimalizacja bada ń, 
które mog ą powodowa ć silne reakcje u zwierz ąt. Wszystkie informacje na temat 
danej substancji wa żne z punktu widzenia jej potencjalnego dzia łania 
podrażniającego/korozyjnego na skór ę powinny zosta ć poddane ocenie przed 
podjęciem bada ń in vivo.  Wystarczaj ące dowody, pozwalaj ące na sklasyfiko ­
wanie substancji badanej jako potencjalnie korozyjnej lub żrącej, mog ą być 
dostępne na dzie ń dzisiejszy, skutkiem czego zbyteczne b ędzie przeprowadzanie 
badań na zwierz ętach laboratoryjnych. Dlatego wykorzystanie analizy wagi 
dowodów pochodz ących z istniej ących danych oraz strategii bada ń sekwencyj ­
nych zminimalizuje potrzeb ę badań in vivo,  zwłaszcza je żeli substancja mo że 
powodowa ć silne reakcje.  
Zalecane jest wykorzystanie analizy wagi dowodów celem oceny istniej ących 
informacji dotycz ących podra żnienia i korozji skóry przez substancje, a tak że 
celem stwierdzenia, czy nale ży przeprowadzi ć dodatkowe badania, inne ni ż 
badania skóry  in vivo,  celem scharakteryzowania takiego potencjalnego dzia łania 
substancji. Je żeli niezbędne są dalsze badania, zaleca si ę realizowanie strategii 
badań sekwencyjnych celem uzyskania odpowiednich danych do świadczalnych. 
W odniesieniu do substancji, które nie posiadaj ą historii bada ń, strategia bada ń 
sekwencyjnych powinna zosta ć zastosowana w celu uzyskania kompletu danych 
potrzebnych do oceny potencjalnego dzia łania korozyjnego/podra żniającego 
danej substancji na skór ę. Strategia bada ń opisana w niniejszym za łączniku 
została opracowana w trakcie warsztatów OECD (1), a nast ępnie potwierdzona 
i rozszerzona w ramach Zharmonizowanego Zintegrowanego Systemu klasyfi ­
kacji substancji chemicznych zagra żających zdrowiu ludzkiemu i środowisku, 
zatwierdzonym w wyniku prac w ramach 28. Wspólnego spotkania Komitetu ds. Związków Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Zwi ązków Chemicznych 
w listopadzie 1998 roku (2).
 
Pomimo że strategia bada ń sekwencyjnych nie jest integraln ą częścią metody 
badawczej B.4, uto żsamia ona zalecane podej ście do okre ślania cech korozji/ ­
podrażnienia skóry. Wspomniane podej ście reprezentuje zarówno najlepsz ą prak­
tykę, jak i wzorzec etyczny dla bada ń in vivo  podrażnień/korozji skóry. 
Omawiana metoda badawcza stanowi wytyczne dotycz ące prowadzenia bada ń 
in vivo  i streszcza czynniki, jakim nale ży poświęcić uwagę przed rozpocz ęciem 
takich bada ń. Strategia okre śla podejście do oceny istniej ących danych na temat 
właściwości podra żniających/korozyjnych substancji badanej na skór ę oraz 
podejście warstwowe do generowania odpowiednich danych dotycz ących 
substancji wymagaj ących dodatkowych bada ń lub takich, w odniesieniu do 
których nie przeprowadzono jak dot ąd badań. W ramach strategii zalecane jest 
ponadto przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych bada ń in vivo  lub 
ex vivo  korozji/podra żnienia skóry w okre ślonych okoliczno ściach.  
OPIS STRATEGII OCENY I BADA Ń 
Przed podj ęciem bada ń w ramach strategii bada ń sekwencyjnych (rysunek) 
należy poddać ocenie wszystkie dost ępne informacje w celu okre ślenia potrzeby 
prowadzenia bada ń in vivo  na skórze. Chocia ż istotne informacje mog ą zostać 
uzyskane na podstawie oceny pojedynczych parametrów (np. warto ści skrajnych 
pH), nale ży wziąć pod uwag ę ogół istniejących informacji. Nale ży poddać ocenie 
wszystkie dane dotycz ące skutków dzia łania danej substancji lub substancji 
analogicznych, w podejmowaniu decyzji dotycz ącej wagi dowodów, oraz nale ży 
przedstawi ć racjonalne uzasadnienie powzi ętej decyzji. G łówny nacisk nale ży 
położyć na istniej ące dane na temat dzia łania substancji na ludzi oraz zwierz ęta, 
a w następnej kolejno ści na wyniki bada ń in vivo  lub ex vivo.  O ile to mo żliwe, 
należy uniknąć badań in vivo  substancji powoduj ących korozj ę. Czynniki 
uwzględniane w omawianej strategii bada ń obejmują: ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Ocenę istniejących danych na temat dzia łania substancji na ludzi i zwierz ęta 
(etap 1).  W pierwszej kolejno ści należy wziąć pod uwag ę istniejące dane 
dotyczące działania na ludzi, np. badania kliniczne lub dane na temat stanowisk 
pracy, a tak że studia konkretnych przypadków oraz/lub dane pochodz ące z bada ń 
przeprowadzonych na zwierz ętach, np. pojedyncze lub wielokrotne badania 
ekspozycji na substancje toksyczne, poniewa ż dostarczaj ą informacji 
bezpośrednio zwi ązanych z oddzia ływaniem na skór ę. Substancje o znanym dzia ­ 
łaniu podra żniającym lub korozyjnym, a tak że substancje wyra źnie niewywie ­
rające skutków korozyjnych lub podra żniających nie musz ą być badane  in vivo.  
Analiza zale żności aktywno ści i struktury (SAR) (etap 2).  Należy uwzględnić 
wyniki bada ń substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy, o ile s ą one 
dostępne. W przypadku dost ępności wystarczaj ących danych na temat oddzia ­ 
łania na ludzi i/lub zwierz ęta substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy lub 
mieszanin takich substancji, wskazuj ących na ich potencjalne dzia łanie 
korozyjne/podra żniające na skór ę, można domniemywa ć, że substancja badana 
poddawana ocenie spowoduje tak ą samą reakcję. W takich przypadkach 
substancja ta nie musi by ć poddawana badaniu. Negatywne wyniki z bada ń na 
temat substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy lub mieszanin takich 
substancji nie s ą wystarczaj ącym dowodem na brak dzia łań podrażniających 
lub korozyjnych danej substancji w świetle strategii bada ń sekwencyjnych. 
Zweryfikowane i zaakceptowane podej ście SAR powinno zosta ć wykorzystane 
w celu zidentyfikowania potencjalnego oddzia łania korozyjnego i podra żniają­
cego na skór ę. 
Właściwości fizyko-chemiczne i reaktywno ść chemiczna (etap 3).  Substancje 
charakteryzuj ące się skrajnym pH ≥ 2,0 i ≤ 11,5 mog ą mieć silne dzia łanie 
miejscowe. Je żeli takie skrajne pH jest podstaw ą do identyfikacji substancji 
jako korozyjnej dla skóry, mo żliwe jest wykorzystanie jej rezerwy 
kwasowej/alkalicznej (tj. zdolno ści buforowej) (3)(4). Je żeli zdolno ść buforowa 
wskazuje na to, że substancja mo że nie być korozyjna dla skóry, nale ży prze­
prowadzić dalsze badania w celu potwierdzenia tej cechy, najlepiej przy u życiu 
zweryfikowanych i zaakceptowanych bada ń in vivo lub  ex vivo  (zob. 
etapy 5 i 6).  
Toksyczno ść skórna (etap 4).  Jeżeli dana substancja chemiczna okaza ła się być 
bardzo toksyczna na skór ę, badanie  in vivo  podrażnień/korozji skórnej mo że 
okazać się niemożliwe do przeprowadzenia, poniewa ż ilość substancji badanej 
normalnie podawanej mog łaby przekroczy ć bardzo toksyczn ą dawkę, co 
w konsekwencji powodowa łoby śmierć lub silne cierpienie zwierz ąt. Dodatkowo, 
jeżeli badania toksyczno ści skórnej na bia łych królikach ju ż zostały przeprowa ­
dzone do poziomu dawki granicznej 2 000 mg/kg masy cia ła lub wyższego, i nie 
zaobserwowano skutków korozyjnych lub podra żniających, dodatkowe badania 
podrażnienia/korozji skóry mog ą okazać się niepotrzebne. Nale ży uwzględnić 
wiele czynników w trakcie oceny ostrej toksyczno ści skórnej 
w przeprowadzonych uprzednio badaniach. Na przyk ład przedstawione infor ­
macje na temat zmian skóry mog ą być niekompletne. Badania i obserwacje 
mogły być przeprowadzone na innych ni ż króliki gatunkach, które mog ą wyka­
zywać znaczące różnice w zakresie wra żliwości reakcji. Tak że postać substancji 
badanej zaaplikowanej zwierz ętom mogła być nieodpowiednia do oceny dzia łania 
korozyjnego/podra żniającego na skór ę (np. poziom rozcie ńczenia substancji do 
badań toksyczno ści skórnej (5)). Jednak że w przypadku w łaściwie zaprojektowa ­
nych i przeprowadzonych bada ń toksyczno ści u królików wyniki negatywne 
mogą stanowić wystarczaj ące dowody na to, że dana substancja nie jest koro ­
zyjna lub podra żniająca. 
Wyniki bada ń in vitro lub ex vivo (etap 5 i 6).  Substancje, które wykazuj ą 
właściwości korozyjne lub silnie podra żniające w zweryfikowanych 
i zaakceptowanych badaniach  in vitro  lub  ex vivo  (6)(7), przewidziane do 
oceny tych specyficznych skutków, nie musz ą być badane na zwierz ętach. 
Można przyjąć, że substancje te dadz ą podobne wyniki  in vivo.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Badania in vivo na królikach (etap 7 i 8).  W przypadku podj ęcia, na podstawie 
analizy wagi dowodów, decyzji dotycz ącej przeprowadzenia bada ń in vivo , 
badanie takie powinno rozpocz ąć się badaniem wst ępnym na jednym zwierz ęciu. 
Jeżeli wyniki tego badania wskazuj ą, że substancja ma dzia łanie korozyjne na 
skórę, dalsze badania powinny zosta ć wstrzymane. W przypadku niestwierdzenia 
działania korozyjnego w badaniu wst ępnym reakcja podra żniająca lub negatywna 
powinna zosta ć potwierdzona przy u życiu maksymalnie dwóch dodatkowych 
zwierząt poddanych ekspozycji przez czas czterech godzin. W przypadku 
wystąpienia podra żnienia we wst ępnym badaniu nale ży przeprowadzi ć sekwen­
cyjne badanie potwierdzaj ące lub jednoczesn ą ekspozycj ę obydwu zwierz ąt. 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test method. Held on Solna, Sweden, 22–24 January 1996 
(http://www 1 .oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ ­
Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD 
Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709–720.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19–26.
 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro 
Test Method for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and 
Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 1- 56032-356-6, Chapter 31,411–436.
 
(6) Testing Method B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., 
Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The 
ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi ­
vity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
RYSUNEK STRATEGIA BADA Ń I OCENY PODRA ŻNIEŃ/KOROZJI SKÓRY
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA: PODRA ŻNIENIE/KOROZJA OCZU  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest kopi ą OECD TG 405 (2002).  
1.1. WPROWADZENIE  
W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody 
specjalną uwag ę poświęcono mo żliwym ulepszeniom 
w zakresie zagadnie ń dotycz ących dobrostanu zwierz ąt, 
a także ocenie wszystkich dost ępnych informacji na temat 
substancji badanej, w celu unikni ęcia niepotrzebnych bada ń 
na zwierz ętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zale ­
cenie, zgodnie z którym przed przyst ąpieniem do opisywa ­
nego badania  in vivo  na korozj ę/podrażnienia oka wywo łane 
przez dan ą substancj ę zostanie przeprowadzona analiza wagi 
dowodów uzyskanych na podstawie istniej ących danych (1). 
Jeżeli dostępne dane s ą niewystarczaj ące, mog ą zostać opra­
cowane przy pomocy bada ń sekwencyjnych (2)(3). Strategia 
badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych 
badań in vitro  i stanowi za łącznik do niniejszej metody. 
Dodatkowo zalecane jest przeprowadzenie bada ń in vivo  
podrażnień/korozji skóry w celu oszacowania korozji oka 
przed przyst ąpieniem do bada ń in vivo  oka.  
Z uwagi na dobrze poj ęty interes nauki i dobrostan zwierz ąt 
badania  in vivo  nie powinny by ć podejmowane, je żeli 
wszystkie dost ępne dane odnosz ące się do potencjalnego dzia ­ 
łania korozyjnego/podra żniającego skór ę w wyniku dzia łania 
substancji nie zosta ły uzyskane z analizy wagi dowodów. 
Takie dane b ędą zawiera ły dowody z wykonanych bada ń 
na ludziach oraz/lub zwierz ętach laboratoryjnych, dowody 
korozji/podra żnień wywo łanych przez jedn ą lub wiele 
substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy lub mieszanin 
takich substancji, dane wskazuj ące na siln ą kwasowo ść lub 
alkaliczno ść substancji (4)(5) oraz wyniki zweryfikowanych 
i zaakceptowanych bada ń in vivo  lub  ex vivo  (6)(6a). 
Takie badania mog ą być przeprowadzone przed lub 
w następstwie analizy wagi dowodów.  
W przypadku pewnych substancji takie analizy mog ą wska­
zywać na potrzeb ę badań in vivo  potencjalnego korozyjnego/ ­
drażniącego dzia łania danej substancji na oko. W ka żdym 
takim przypadku przed podj ęciem bada ń in vivo  oka zostan ą 
przeprowadzone najpierw badania  in vivo  skutków dzia łania 
substancji na skór ę, zgodnie z metod ą badawcz ą B.4 (7). 
Zastosowanie analizy wagi dowodów i strategii bada ń 
sekwencyjnych powinno ograniczy ć potrzeb ę prowadzenia 
badań in vivo  pod k ątem korozji/podra żnienia oka przez 
substancje, w odniesieniu do których ju ż istnieje wystar ­
czający materia ł dowodowy, zgromadzony w wyniku prowa ­
dzenia innych bada ń. Jeżeli nie jest mo żliwe okre ślenie 
potencjalnego dzia łania korozyjnego lub dra żniącego na oka 
przy zastosowaniu strategii bada ń sekwencyjnych, nawet po 
przeprowadzeniu bada ń in vivo  pod k ątem korozji 
i podrażnienia skóry, mo żna przeprowadzi ć badania  in vivo  
pod kątem korozji/podra żnienia oka.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Załącznik do niniejszej metody zawiera preferowan ą strategię badań 
sekwencyjnych, obejmuj ącą przeprowadzenie zweryfikowanych 
i zaakceptowanych bada ń in vivo  i ex vivo  działania korozyjnego/ ­
podrażniającego. Strategia ta zosta ła opracowana i jednomy ślnie 
zalecona przez uczestników warsztatów OECD (8), a nast ępnie 
zatwierdzona jako zalecana strategia bada ń w ramach Globalnego 
Zharmonizowanego Systemu klasyfikacji zwi ązków chemicznych 
(GHS) (9). Zaleca si ę realizacj ę tej strategii bada ń przed podj ęciem 
badań in vivo.  Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym 
stopniowym podej ściem badawczym s łużącym opracowywaniu 
wartościowych z naukowego punktu widzenia danych dotycz ących 
korozyjnego/podra żniającego dzia łania substancji. W odniesieniu do 
istniejących substancji, na temat których brak wystarczaj ących 
danych co do ich dzia łania korozyjnego/podra żniającego, strategia 
ta powinna zosta ć wykorzystana w celu uzupe łnienia brakuj ących 
danych. U życie innych strategii badawczych b ądź procedur lub 
decyzja o nieprzyj ęciu stopniowego podej ścia badawczego wymaga 
uzasadnienia.  
1.2. DEFINICJE  
Podrażnienie oka:  zmiany w oku spowodowane zaaplikowaniem 
substancji badanej na wierzchni ą warstwę oka, które w pe łni odwra­
calne w ci ągu 21 dni po zaaplikowaniu.  
Korozja oka:  uszkodzenie tkanki oka lub powa żne fizyczne uszko ­
dzenie wzroku, spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na 
wierzchni ą warstwę oka, które nie jest w pe łni odwracalne w ci ągu 
21 dni po zaaplikowaniu.  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Substancja, która ma by ć zbadana, jest nak ładana na jedno oko 
zwierzęcia doświadczalnego, drugie oko jest wykorzystywane do 
badania kontrolnego. Stopie ń korozji/podra żnienia jest oceniany 
poprzez ocen ę punktow ą zmian spojówki, rogówki oraz t ęczówki 
w określonych odst ępach. Inne zmiany w oku i niekorzystne skutki 
ogólnoustrojowe s ą również opisywane w celu uzyskania kompletnej 
oceny skutków. D ługość trwania badania powinien by ć odpowiedni 
do oszacowania odwracalno ści lub nieodwracalno ści obserwowanych 
skutków.  
Zwierzęta wykazuj ące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na 
jakimkolwiek etapie badania powinny zosta ć uśmiercone w sposób 
humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Kryteria dotycz ące 
podjęcia decyzji o u śmierceniu w sposób humanitarny zwierz ąt 
w stanie agonalnym i silnie cierpi ących zawiera za łącznik (10).  
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Przygotowanie do bada ń in vivo  
1.4.1.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierz ąt laboratoryjnych. 
Wykorzystywane s ą zdrowe m łode doros łe króliki. W przypadku 
wykorzystania innych gatunków nale ży podać uzasadnienie.  
1.4.1.2.  Przygotowanie zwierz ąt 
Obydwoje oczu zwierz ęcia doświadczalnego wst ępnie wybranego do 
badania powinny by ć zbadane na 24 godziny przed przyst ąpieniem 
do badań. Zwierzęta z objawami podra żnienia oczu, wad wzroku lub 
uszkodzeń rogówki nie powinny by ć wykorzystywane w badaniu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Warunki przetrzymywani i karmienia  
Zwierzęta powinny by ć przetrzymywane oddzielnie. Temperatura 
w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosi ć 
20 o C (± 3  o C) dla królików. Chocia ż wilgotno ść względna powinna 
wynosić co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie przekracza ła 
70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno 
być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do 
żywienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze laboratoryjne 
z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.
 
1.4.2.  Procedura bada ń 
1.4.2.1.  Podawanie substancji  
Substancja badana powinna zosta ć umieszczona na spojówce 
jednego oka ka żdego ze zwierz ąt po delikatnym odsuni ęciu powieki 
z gałki ocznej. Powieki s ą następnie delikatnie zamykane na oko ło 
jedną sekundę w celu zapobie żenia utraty materia łu badanego. 
Drugie, nienaruszone oko jest przedmiotem badania kontrolnego.  
1.4.2.2.  Nawil żanie 
Oczy zwierz ąt badanych nie powinny by ć przepłukiwane przez przy ­
najmniej 24 godziny po wkropleniu substancji badanej, z wyj ątkiem 
badania cia ł stałych (zob. sekcja 1.4.2.3.2) i przypadków natychmias ­
towego dzia łania korozyjnego lub podra żniającego. O ile to 
stosowne, po 24 godzinach mo żna przepłukać oczy.  
Włączanie dodatkowej satelickiej grupy zwierz ąt w celu zbadania 
skutków przep łukiwania nie jest zalecane, chyba że ma to uzasad ­
nienie naukowe. W przypadku potrzeby grupy satelickiej nale ży 
użyć dwóch królików. Warunki przep łukiwania powinny by ć 
dokładnie dokumentowane np. czas przep łukiwania, sk ład 
i temperatura roztworu, d ługość trwania, obj ętość i szybko ść apliko­
wania.  
1.4.2.3.  Poziom dawki  
1.4.2.3.1.  Badanie cieczy  
W badaniu cieczy stosuje si ę dawkę o objętości 0,1 ml. Nie powinno 
się stosowa ć cieczy pod ci śnieniem do aplikowania substancji 
bezpośrednio na oko. Struga cieczy powinna zosta ć rozprężona 
i zebrana w zbiorniku przed aplikowaniem jej 0,1 ml na oko.  
1.4.2.3.2.  Badanie substancji sta łych 
W badaniu cia ł stałych, past i cz ąstek stałych stosowana ilo ść 
powinna mie ć objętość 0,1 ml lub wag ę nie większą niż 100 mg. 
Badany materia ł powinien zosta ć sproszkowany. Obj ętość ciała 
stałego powinna by ć mierzona po delikatnym zbiciu np. poprzez 
ostukanie pojemnika pomiarowego. Je żeli substancja badana 
w formie cia ła stałego nie zosta ła usunięta w wyniku dzia łania 
mechanizmów fizjologicznych w pierwszym punkcie czasowym 
obserwacji po up łynięciu godziny, oko mo że zostać przepłukane 
roztworem soli fizjologicznej lub wod ą destylowan ą. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Badanie aerozoli  
Zaleca si ę, aby wszystkie strugi cieczy pod ci śnieniem i aerozole 
zostały rozprężone i zebrane przed osadzeniem na oku. Wyj ątek 
stanowią substancje w aerozolach znajduj ące się w pojemnikach 
pod ciśnieniem, które nie mog ą zostać zebrane z powodu ich paro ­
wania. W takich przypadkach nale ży przytrzyma ć oko w pozycji 
otwartej i zaaplikowa ć substancj ę badaną do oka jednym 
podmuchem, trwaj ącym około sekundy, z odleg łości 10 cm prosto ­
padle do oka. Ta odleg łość może zależeć w znacznym stopniu od 
ciśnienia w rozpylaczu i jego zawarto ści. Należy uważać, aby nie 
doszło do uszkodzenia oka z powodu ci śnienia w rozpylaczu. 
W odpowiednich przypadkach, mo że być niezbędna ocena mo żli­
wości potencjalnego „mechanicznego” uszkodzenia oka spowodowa ­
nego siłą rozpylacza.  
Oszacowanie dawki aerozolu mo że być wykonane poprzez nast ę­
pującą symulacj ę badania: substancja jest napylana na papierek 
wagowy przez otwór o rozmiarze oka królika znajduj ący się 
bezpośrednio przed papierkiem. Poziom wzrostu wagi papierka 
wykorzystuje si ę celem okre ślenia przybli żonej ilości jaka by łaby 
zaaplikowana do oka. Dla substancji lotnych, dawka mo że zostać 
oszacowana poprzez zwa żenie pojemnika odbiorczego przed i po 
badanego materia łu. 
1.4.2.4.  Badanie wst ępne (Badanie in vivo podra żnienia/korozji oka 
z wykorzystaniem jednego zwierz ęcia) 
Zgodnie ze strategi ą badań sekwencyjnych (zob. za łącznik 1) 
stanowczo zaleca si ę, aby badania  in vivo  były przeprowadzane 
wstępnie przy u życiu jednego zwierz ęcia 
Jeżeli wyniki takich bada ń wskazują, że substancja ma w łaściwości 
korozyjne lub powoduje silne podra żnienia oka, procedura przewi ­
duje zaprzestanie dalszych bada ń podrażnień oczu.  
1.4.2.5.  Znieczulenie miejscowe  
Znieczulenie miejscowe mo że zostać zastosowane na podstawie 
analizy wyników uzyskanych w indywidualnych przypadkach. Je żeli 
analiza wagi dowodów wskazuje na to, że substancja mo że poten­
cjalnie powodowa ć ból, lub badania wst ępne pozwalaj ą sądzić, że 
pojawią się bolesne reakcje, mo żna zastosowa ć miejscowe znieczu ­
lenie przed zaaplikowaniem substancji badanej. Rodzaj, st ężenie 
i dawka znieczulenia miejscowego powinny zosta ć uważnie 
wybrane, tak aby zapewni ć, że różnice w reakcji na substancj ę 
badaną nie są wynikiem zastosowania znieczulenia. Oko kontrolne 
powinno równie ż zostać znieczulone.  
1.4.2.6.  Badanie potwierdzaj ące (Badanie in vivo podra żnienia oka na 
dodatkowych zwierz ętach)  
W przypadku niestwierdzenia dzia łań korozyjnych w badaniu 
wstępnym dzia łanie podra żniające lub jego brak nale ży potwierdzi ć 
przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierz ąt. 
Jeżeli obserwuje si ę silne dzia łanie podra żniające w badaniu wst ęp­
nym, zaleca si ę, aby badanie potwierdzaj ące zostało przeprowadzone 
w sposób sekwencyjny na jednym zwierz ęciu, a niejednocze śnie na 
dwóch zwierz ętach. Jeżeli działanie na drugim zwierz ęciu okaże się 
korozyjne lub silnie podra żniające, badanie nie b ędzie kontynuo ­
wane. Dodatkowe zwierz ę może być potrzebne w celu potwierdzenia 
słabego lub średniego dzia łania podra żniającego.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Okres obserwacji  
Długość trwania obserwacji powinien by ć wystarczaj ący do oceny 
pełnej odwracalno ści obserwowanych efektów. Jednak że ekspery ­
ment powinien zosta ć przerwany w momencie, gdy zwierz ę wyka­
zuje objawy silnego bólu lub strachu (9). W celu okre ślenia odwra ­
calności efektów w normalnych okoliczno ściach zwierz ę powinno 
być obserwowane przez 21 dni po zaaplikowaniu substancji badanej. 
Jeżeli odwracalno ść jest obserwowana przed up ływem 21 dni, 
eksperyment powinien zosta ć przerwany w tym momencie.  
1.4.2.7.1.  Obserwacje kliniczne i ocena reakcji oka  
Oczy powinny zosta ć zbadane po 1, 24, 48 i 72 godzinach od 
podania substancji badanej. Zwierz ęta powinny by ć pod obserwacj ą 
nie dłużej niż to konieczne do uzyskania wszystkich informacji. 
Zwierzęta wykazuj ące objawy ci ągłego silnego bólu lub strachu 
powinny zosta ć bezzwłocznie uśmiercone w sposób humanitarny, 
a substancja odpowiednio oceniona. U śmiercone w sposób humani ­
tarny powinny zosta ć zwierzęta z nast ępującymi zmianami oka 
zaszłymi w nast ępstwie zaaplikowania substancji: perforacja lub 
owrzodzenie rogówki, w łączając garbiak; krwawienie z tylnej 
komory oka; zm ętnienie rogówki równe 4 utrzymuj ące się 48 
godzin; brak odbicia światła (reakcja rogówki o warto ści punktowej 
2) utrzymuj ący się 72 godziny; owrzodzenie b łony spojówki; mart ­
wica spojówki lub b łony mrużnej; lub oddzielaj ąca się tkanka mart ­
wicza. Wynika to z faktu, że tego typu zmiany s ą na ogół nieodwra ­
calne.  
Zwierzęta, u których nie wyst ąpiły zmiany oczne, mog ą zostać 
uśmiercone nie wcze śniej niż 3 dni od zaaplikowania substancji. 
Zwierzęta z łagodnymi lub umiarkowanymi zmianami powinny prze ­
bywać pod obserwacj ą do czasu zanikni ęcia zmian lub przez 21 dni, 
po których badanie zostaje przerwane. Obserwacje powinny by ć 
prowadzone 7., 14. i 21. dnia w celu okre ślenia stanu zmian oraz 
ich odwracalno ści lub nieodwracalno ści. 
Wartości punktowe reakcji oka (spojówki, rogówki i t ęczówki) 
powinny by ć zapisywane dla ka żdego badania (tabela I). Nale ży 
również podać informacje na temat innych zmian oka (np. prze ­
krwienie, plamy) lub innych niekorzystnych skutków ogólnoustrojo ­
wych.  
Badanie reakcji mo że zostać wykonane przy zastosowaniu lupy 
stereoskopowej, r ęcznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub 
innego odpowiedniego urz ądzenia. Po zapisaniu obserwacji w 24 
godzinie oko mo że zostać poddane dalszym badaniom przy pomocy 
fluoresceiny.  
Ocena odpowiedzi ocznej jest z konieczno ści subiektywna. W celu 
zharmonizowania oceny reakcji ocznej i w celu wsparcia laborato ­
riów badawczych i osób bior ących udzia ł w interpretacjach 
i obserwacjach nale ży przeprowadzi ć odpowiednie szkolenia 
w zakresie stosowanego systemu.  
2. DANE  
2.2. OCENA WYNIKÓW  
Wartości punktowe podra żnienia skóry winny by ć ocenianie 
stosownie do natury oraz nat ężenia zmian, oraz w świetle ich odwra ­
calności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowi ą normy 
bezwzględnej właściwości podra żniających danego materia łu, 
ponieważ ocenie poddawane s ą również pozostałe skutki ekspozycji 
na badany materia ł. Alternatywnie, poszczególne wyniki powinny 
być traktowane jako warto ści odniesienia, które musz ą być oceniane 
w świetle wszystkich pozosta łych spostrze żeń z badań. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące informacje:  
Uzasadnienie bada ń in vivo:  analizę wagi dowodów, w łączając 
wyniki realizacji strategii bada ń sekwencyjnych:  
— opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych 
badań, 
— dane uzyskane w wyniku realizacji ka żdego etapu strategii 
badawczej,  
— opis przeprowadzonych bada ń in vitro , włączając szczegó łowe 
dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,
 
— opis przeprowadzonych bada ń in vitro podra żnień/korozji skóry, 
wraz z otrzymanymi wynikami,  
— analiza wagi dowodów dla celów przeprowadzenia bada ń in vivo . 
Substancja badana:  
— identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czysto ść, znane zanie ­
czyszczenia, numer osobnika),  
— stan skupienia i w łaściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotno ść, 
rozpuszczalno ść, stabilno ść, reakcyjno ść z wodą), 
— w przypadku mieszaniny sk ład i zawarto ść procentowa sk ładni­
ków,  
— jeżeli zastosowano znieczulenie miejscowe, identyfikacja, czys ­
tość, rodzaj, dawka i mo żliwe interakcje z substancj ą badaną. 
Nośnik: 
— identyfikacja, st ężenie (jeżeli dotyczy) u żyta objętość, 
— uzasadnienie u życia nośnika.  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania 
zwierząt innych ni ż białe króliki,  
— wiek ka żdego zwierz ęta na pocz ątku badań, 
— liczba zwierz ąt każdej płci w grupie badanej i kontrolnej (je żeli 
występuje),  
— indywidualna masa cia ła na pocz ątku i na ko ńcu badań, 
— źródło zwierząt, warunki przetrzymywania, dieta itp.  
Warunki bada ń: 
— opis zastosowanej metody wykorzystywanej do punktowej oceny 
podrażnienia w ka żdym punkcie czasowym (np. r ęczna lampa 
szczelinowa, biomikroskop, fluoresceina),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— tabela wyników reakcji podra żnienia/korozji, dla ka żdego zwie ­
rzęcia w ka żdym punkcie czasowym pomiaru, do momentu 
wyeliminowania zwierz ęcia z bada ń, 
— narracyjny opis stopnia i natury obserwowanego podra żnienia lub 
korozji,  
— opis jakichkolwiek innych zmian zaobserwowanych w oku (np. 
waskularyzacja, przekrwienie, adhezje, plamy),  
— opis innych niekorzystnych miejscowych i ogólnoustrojowych 
niedotycz ących oczu zmian oraz wyniki badania histopatologicz ­
nego, o ile s ą dostępne. 
Omówienie wyników.  
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Transponowanie wyników bada ń podrażnienia oka u zwierz ąt labo­
ratoryjnych na ludzi ma sens tylko w ograniczonym stopniu. W wielu przypadkach bia łe króliki s ą bardziej wra żliwe niż ludzie 
na podrażnienia lub korozj ę oka.
 
W interpretacji danych nale ży zadbać o pomini ęcie podra żnienia oka 
będącego wynikiem infekcji wtórnej.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of 
Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410–429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N. (1997) Evaluation of 
Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35,159–164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H. (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26.
 
(5) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12,227–231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483–524.
 
(6a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
(7) Testing Method B.4. Acute toxicity: dermal irritation/corrosion.  
(8) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final 
Report of the OECD Workshop on Harmonization of Valida ­
tion and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological 
Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 
(http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 258
 
(9) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of 
Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).
 
(10) Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 
(http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabela I  
OCENA PUNKTOWA ZMIAN OKA  
Rogówka  
Zmętnienie: stopie ń gęstości (odczyt powinien dotyczy ć obszaru o najwi ększej 
gęstości) (*) 
Brak owrzodzenia lub zm ętnienia 0 
Rozrzucone lub rozmyte obszary zm ętnienia (inne od lekkiego zmato ­
wienia normalnego po łysku); 1 
wyraźnie widoczne szczegó ły tęczówki Jasno okre ślone obszary 
półprzezroczyste; lekko zaciemnione detale t ęczówki 2 
Obszary o kolorze per łowym; brak widocznych szczegó łów tęczówki; 
rozmiar źrenicy trudny do okre ślenia 3 
Zmatowienie rogówka; t ęczówka niewidoczna z powodu zm ętnienia 4  
Maksymalna mo żliwa warto ść punktowa: 4  
UWAGI  
(*) Nale ży zapisać obszar zm ętnienia rogówki.  
Tęczówka  
W normie 0 
Głęboko pomarszczona, zastój krwi, opuchlizna, przekrwienie oko łoro­
gówkowe; lub; t ęczówka reaguje na światło (przyjmuje si ę, że powolna 
reakcja stanowi skutek) 1 
Krwawienie, silne zniszczenia, lub brak reakcji na światło 2  
Maksymalna mo żliwa warto ść punktowa: 2  
Spojówka  
Zaczerwienienie (dotyczy spojówki powieki i ga łki ocznej; wy łączając rogówk ę 
i tęczówkę) 
w normie 0 
Niektóre naczynia krwiono śne przekrwione 1 
Rozmycie, kolor karmazynowy; pojedyncze naczynia trudno widoczne 2 Rozmycie, kolor mi ęsa czerwonego 3
 
Maksymalna mo żliwa warto ść punktowa: 3  
Obrzęk spojówki  
Opuchlizna (dotyczy powiek i/lub b łony mrużnej) 
W normie 0 
Niewielka opuchlizna powy żej normy 1 
Widoczna opuchlizna z cz ęściowym wynicowaniem powieki 2 
Opuchlizna, z powiekami zamkni ętymi w po łowie 3 
Opuchlizna, z powiekami zamkni ętymi więcej niż w połowie 4  
Maksymalna mo żliwa warto ść punktowa: 4  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
ZAŁĄCZNIK  
Strategia badania sekwencyjnego podra żnień i korozji oka  
ROZWA ŻANIA OGÓLNE  
Zarówno w dobrze poj ętym interesie nauki, jak i z uwagi na dobrostan zwierz ąt, 
istotne jest unikni ęcie niepotrzebnego wykorzystywania zwierz ąt oraz minimali ­
zacja bada ń mogących powodowa ć silne reakcje u zwierz ąt. Wszystkie infor ­
macje na temat danej substancji wa żne z punktu widzenia jej potencjalnego 
działania podra żniającego/korozyjnego na oko, powinny zosta ć poddane ocenie 
przed podj ęciem bada ń in vivo.  Wystarczaj ące dowody, pozwalaj ące na sklasy ­
fikowanie substancji badanej jako potencjalnie korozyjnej lub żrącej, mogą być 
dostępne już teraz, skutkiem czego zbyteczne b ędzie przeprowadzanie bada ń na 
zwierzętach laboratoryjnych. Dlatego wykorzystanie analizy wagi dowodów 
pochodzących z istniej ących danych oraz strategii bada ń sekwencyjnych zmini ­
malizuje potrzeb ę badań in vivo,  zwłaszcza je żeli substancja mo że powodowa ć 
silne reakcje.  
Zalecane jest wykorzystanie analizy wagi dowodów celem oceny istniej ących 
informacji dotycz ących podra żnienia i korozji skóry przez substancje, a tak że 
celem stwierdzenia, czy nale ży przeprowadzi ć dodatkowe badania, inne ni ż 
badania  in vivo,  celem scharakteryzowania takiego potencjalnego dzia łania 
substancji. Je żeli niezbędne są dalsze badania, zaleca si ę realizowanie strategii 
badań sekwencyjnych celem uzyskania odpowiednich danych do świadczalnych. 
W odniesieniu do substancji, które nie posiadaj ą historii bada ń, strategia bada ń 
sekwencyjnych powinna zosta ć zastosowana w celu uzyskania kompletu danych 
potrzebnych do oceny potencjalnego dzia łania korozyjnego/podra żniającego 
danej substancji na oczy. Strategia bada ń opisana w niniejszym za łączniku 
została opracowana w trakcie warsztatów OECD (1), a nast ępnie potwierdzona 
i rozszerzona w ramach Zharmonizowanego Zintegrowanego Systemu klasyfi ­
kacji substancji chemicznych zagra żających zdrowiu ludzkiemu i środowisku, 
zatwierdzonym w wyniku prac w ramach 28. Wspólnego spotkania Komitetu 
ds. Związków Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Zwi ązków Chemicznych 
w listopadzie 1998 r. (2).  
Pomimo że strategia bada ń sekwencyjnych nie jest integraln ą częścią metody 
badawczej B.5, uto żsamia ona zalecane podej ście do okre ślania cech korozji/ ­
podrażnienia oczu. Wspomniane podej ście reprezentuje zarówno najlepsz ą prak­
tykę, jak i wzorzec etyczny dla bada ń in vivo  podrażnień/korozji. Omawiana 
metoda badawcza stanowi wytyczne dotycz ące prowadzenia bada ń in vivo  
i streszcza czynniki, jakim nale ży poświęcić uwagę przed rozpocz ęciem takich 
badań. Strategia okre śla podejście do oceny istniej ących danych na temat w łaści­
wości podrażniających/korozyjnych substancji badanej na oczy oraz podej ście 
warstwowe do generowania odpowiednich danych dotycz ących substancji wyma ­
gających dodatkowych bada ń, lub takich, w odniesieniu do których nie przepro ­
wadzono jak dot ąd badań. W ramach strategii zalecane jest ponadto przeprowa ­
dzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych bada ń in vivo  lub ex vivo,  a dopiero 
w następnej kolejno ści zastosowanie metody badawczej badania korozji/ ­
podrażniania skóry B.4 w specyficznych okoliczno ściach (3)(4).  
OPIS KROKOWEJ STRATEGII BADA Ń 
Przed podj ęciem bada ń w ramach strategii bada ń sekwencyjnych (rysunek), 
należy poddać ocenie wszystkie dost ępne informacje w celu okre ślenia potrzeby 
prowadzenia bada ń in vivo  na oku. Chocia ż istotne informacje mog ą zostać 
uzyskane na podstawie oceny pojedynczych parametrów (np. warto ści skrajnych 
pH), nale ży wziąć pod uwag ę ogół istniejących informacji. Nale ży poddać ocenie 
wszystkie dane dotycz ące skutków dzia łania danej substancji, lub substancji 
analogicznych, w podejmowaniu decyzji dotycz ącej wagi dowodów, oraz nale ży 
przedstawi ć racjonalne uzasadnienie powzi ętej decyzji. G łówny nacisk nale ży 
położyć na istniej ące dane na temat dzia łania substancji na ludzi oraz zwierz ęta, 
a w następnej kolejno ści na wyniki bada ń in vivo  lub ex vivo.  O ile to mo żliwe, 
należy uniknąć badań in vivo  substancji powoduj ących korozj ę. Czynniki 
uwzględniane w omawianej strategii bada ń obejmują: ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Oszacowanie wyników dotycz ących ludzi i zwierz ąt (etap 1).  W pierwszej kolejno ści 
należy wziąć pod uwag ę istniejące dane dotycz ące działania na ludzi, np. badania 
kliniczne lub dane na temat stanowisk pracy a tak że studia konkretnych przy ­
padków oraz/lub dane pochodz ące z bada ń przeprowadzonych na zwierz ętach, 
np. pojedyncze lub wielokrotne badania ekspozycji na substancje toksyczne, 
ponieważ dostarczaj ą informacji bezpo średnio zwi ązanych z oddzia ływaniem 
na oko. Nast ępnie nale ży poddać ocenie dost ępne dane uzyskane w wyniku 
badań na ludziach/zwierz ętach dotycz ących dzia łania drażniącego/korozji skóry. 
Substancje o znanym dzia łaniu korozyjnym lub powoduj ących dotkliwe podra ż­
nienia oczu nie powinny by ć aplikowane do oczu zwierz ąt, podobnie substancje 
powodujące działanie korozyjne i/lub podra żniające dla skóry. Takie substancje 
również powinny zosta ć uznane za korozyjne i/lub podra żniające oczy. Substan ­
cje, wobec których istniej ą wystarczaj ące dowody, uzyskane w poprzednich 
badaniach okulistycznych, świadczące o braku dzia łania korozyjnego lub podra ż­
niającego, równie ż nie powinny by ć poddawane badaniu  in vivo  na oku.  
Analiza zale żności między struktur ą a aktywno ścią (SAR) (etap 2).  Należy uwzględnić 
wyniki bada ń substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy, o ile s ą one dostępne. 
W przypadku dost ępności wystarczaj ących danych na temat oddzia łania na ludzi i/lub 
zwierzęta substancji pokrewnych pod wzgl ędem budowy lub mieszanin takich 
substancji, wskazuj ących na ich potencjalne dzia łanie korozyjne/podra żniające na 
oko, można domniemywa ć, że substancja badana poddawana ocenie spowoduje 
taką samą reakcję. W takich przypadkach substancja ta nie musi by ć poddawana 
badaniu. Negatywne wyniki z bada ń na temat substancji pokrewnych pod wzgl ędem 
budowy lub mieszanin takich substancji nie s ą wystarczaj ącym dowodem na brak 
działań podrażniających lub korozyjnych danej substancji w świetle strategii bada ń 
sekwencyjnych. Zweryfikowane i zaakceptowane podej ście SAR powinno zosta ć 
wykorzystane w celu zidentyfikowania potencjalnego oddzia łania korozyjnego 
i podrażniającego na skór ę i oko.  
Właściwości fizyko-chemiczne i reaktywno ść chemiczna (etap 3).  Substancje 
charakteryzuj ące się skrajnym pH ≥ 2,0 i ≤ 11,5 mog ą mieć silne dzia łanie 
miejscowe. Je żeli takie skrajne pH jest podstaw ą do identyfikacji substancji 
jako korozyjnej dla oka, mo żliwe jest wykorzystanie jej rezerwy kwasowej/ ­
alkalicznej (tj. zdolno ści buforowej) (5)(6). Je żeli zdolno ść buforowa wskazuje 
na to, że substancja mo że nie by ć korozyjna dla oka, nale ży przeprowadzi ć 
dalsze badania w celu potwierdzenia tej cechy, najlepiej przy u życiu zweryfiko ­
wanych i zaakceptowanych bada ń in vivo lub  ex vivo  (zob. krok 5 i 6).  
Uwzględnienie innych istniej ących informacji (etap 4).  Wszystkie dost ępne infor­
macje na temat ogólnoustrojowej toksyczno ści skórnej powinny zosta ć poddane 
ocenie na tym etapie. Ponadto nale ży uwzględnić ostrą toksyczno ść skórną 
powodowan ą przez substancj ę badaną. Jeżeli wykazano, że substancja badana 
jest bardzo toksyczna w kontakcie ze skór ą, badanie na oku mo że okazać się 
zbyteczne. Pomimo że zależność między ostrą toksyczno ścią skórną a działaniem 
podrażniającym/korozyjnym na oko nie jest zawsze oczywista, mo żna założyć, że 
jeśli reagent jest bardzo toksyczny w kontakcie ze skór ą, będzie wykazywa ł 
wysoką toksyczno ść po zaaplikowaniu na oko. Dane na ten temat mog ą również 
zostać rozpatrzone mi ędzy realizacj ą etapów 2 i 3.  
Wyniki z bada ń in vitro lub ex vivo (etapy 5 i 6).  Substancje, które wykazuj ą 
właściwości korozyjne lub silnie podra żniające w zweryfikowanych 
i zaakceptowanych badaniach  in vitro  lub ex vivo  (7)(8), które by ły zweryfiko ­
wane i zaakceptowane na potrzeby oceny dzia łania korozyjnego/podra żniającego 
na skórę lub oko, nie musz ą być badane na zwierz ętach. Można założyć, że takie 
substancje powoduj ą podobnie silne reakcje  in vivo.  Jeżeli zweryfikowane 
i zaakceptowane badania  in vivo/ex vivo  nie są dostępne, nale ży pominąć etap 
5 i 6, a nast ępnie przej ść bezpośrednio do etapu 7.  
Ocena bada ń in vivo podra żnień lub korozji skórnej w wyniku dzia łania 
substancji (etap 7).  Jeżeli nie istniej ą wystarczaj ące dowody do przeprowadzenia 
jednoznacznej analizy wagi dowodów na temat potencjalnego dzia łania 
korozyjnego/podra żniającego na oko, w oparciu o na wynikach bada ń przedsta­
wionych powy żej, w pierwszej kolejno ści należy ocenić potencjalne dzia łanie 
podrażniające/korozyjne na skór ę, z wykorzystaniem metody badawczej B.4 (4) 
i towarzysz ącego jej za łącznika (9). Je żeli w wyniku bada ń okaże się, że 
substancja powoduje korozj ę lub silne podra żnienia skóry, nale ży uznać ją za 
korozyjną lub podra żniającą dla oka, chyba że istnieją inne informacje 
prowadzące do przeciwnych wniosków. W świetle tych informacji badanie  in 
vivo może okazać się zbyteczne. Je żeli substancja jest niekorozyjna lub nie 
powoduje silnego podra żnienia skóry, badania  in vivo  oka powinny zosta ć prze­
prowadzone.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Badania in vivo na królikach (etap 8 i 9):  Okulistyczne badania  in vivo  powinny 
rozpoczyna ć się od bada ń wstępnych z wykorzystaniem jednego zwierz ęcia. 
Jeżeli wyniki tych bada ń świadczą o silnym dzia łaniu podra żniającym lub koro ­
zyjnym dla oka, dalsze badania powinny zosta ć wstrzymane. Je żeli to badanie 
nie wskazuje na żadne korozyjne lub silnie podra żniające skutki, nale ży przepro ­
wadzić badanie potwierdzaj ące na dwóch dodatkowych zwierz ętach.  
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicological Testing Methods. Held in Solna, Sweden, 
22–24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and 
the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ ­
ehs/Class/HCL6.htm).
 
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.  
(4) Testing method B.4. Acute Toxicity: dermal irritation/corrosion.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alka ­
line Substance Without Testing on Animals. Toxicol.  In Vitro,  2, 19–26.  
(6) Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential 
of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
227–231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 
pp. 483.524.
 
(8) Testing Method B.40 Skin Corrosion.  
(9) Annex to Testing Method B.4: A Sequential Testing Strategy for Skin 
Irritation and Corrosion.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
(2) Rysunek  
Strategia bada ń i oceny podra żnień/korozji oka
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. SENSYBILIZACJA SKÓRY  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Uwagi:  
Czułość i zdolno ść testów do wykrywania potencjalnych sensybili ­
zatorów ludzkiej skóry uwa ża się za ważne w systemie klasyfikacji 
toksyczno ści odnosz ącej się do zdrowia publicznego.  
Nie ma jednej metody badania, która w łaściwie zidentyfikuje 
wszystkie substancje z potencja łem do sensybilizowania ludzkiej 
skóry i która odnosi si ę do wszystkich substancji.  
Czynniki, takie jak fizyczne charakterystyki substancji, w tym jej 
zdolność do wnikania w skór ę, muszą być wzięte pod uwag ę przy 
wyborze testu.  
Są wykorzystywane dwa typy testów stosuj ących świnki morskie: 
testy ze środkiem wspomagaj ącym, w których stan alergiczny jest 
potęgowany przez rozpuszczenie lub utworzenie zawiesiny substancji 
testowanej w kompletnym środku wspomagaj ącym Freunda (FCA), 
i testy niewspomagane.  
Testy ze środkiem wspomagaj ącym mog ą być bardziej precyzyjne 
w przewidywaniu prawdopodobnego dzia łania substancji prowadz ą­
cego do sensybilizacji skóry u ludzi ni ż metody nie stosuj ące 
kompletnego środka wspomagaj ącego Freunda i s ą zatem metodami 
preferowanymi.  
Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT) jest szeroko stoso ­
wanym testem ze środkiem wspomagaj ącym. Pomimo i ż kilka 
innych metod mo że być wykorzystanych w celu wykrycia potencja łu 
substancji do wywo łania reakcji sensybilizacji skóry, GPMT uwa ża 
się za preferowan ą technikę wspomagaj ącą. 
W przypadku wielu kategorii zwi ązków chemicznych testy niewspo ­
magane (preferowany jest test Buehlera) uwa ża się za mniej czu łe. 
W niektórych przypadkach mog ą istnieć słuszne powody wyboru 
testu Buehlera, wymagaj ącego aplikowania miejscowego zamiast 
iniekcji śródskórnej, wykorzystywanej w te ście maksymalizacyjnym 
świnki morskiej. W przypadku stosowania testu Buehlera powinno 
być podane naukowe uzasadnienie.  
Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT) i test Buehlera s ą 
opisane w niniejszej metodzie. Inne metody mog ą być stosowane, 
pod warunkiem że są potwierdzone i podane jest naukowe uzasad ­
nienie.  
Jeżeli uzyskano wynik pozytywny w ogólnie przyj ętym badaniu 
sortującym, substancja testowana mo że być nazwana potencjalnym 
sensybilizatorem i przeprowadzanie testu świnki morskiej mo że nie 
być konieczne. Jednak że jeżeli uzyskano wynik negatywny w takim 
teście, test świnki morskiej musi zosta ć przeprowadzony, 
z zastosowaniem procedury opisanej w tej metodzie badania.  
Zob. także Wprowadzenie ogólne w cz ęści B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINICJE  
Sensybilizacja skóry:  (alergiczne kontaktowe zapalenie skóry) jest 
immunologiczn ą reakcją skórną na substancj ę. U ludzi reakcje 
mogą charakteryzowa ć się swędzeniem, rumieniem, obrz ękiem, 
grudkami, p ęcherzykami, wzniesieniami naskórka wype łnionymi 
przezroczyst ą, wodną cieczą lub po łączeniem tych objawów. 
W przypadku innych gatunków reakcje mog ą się różnić i mogą 
być zaobserwowane tylko rumie ń i obrzęk. 
Ekspozycja indukcyjna:  eksperymentalna ekspozycja podmiotu na 
substancję testowan ą z zamiarem wywo łania stanu nadwra żliwego.  
Okres indukcji:  okres co najmniej jednego tygodnia nast ępujący po 
ekspozycji indukcyjnej, podczas którego stan nadwra żliwy może się 
rozwinąć. 
Ekspozycja prowokacyjna:  eksperymentalna ekspozycja podmiotu 
poddanego wcze śniej dzia łaniu substancji testowanej, nast ępująca 
po okresie indukcji w celu ustalenia, czy podmiot reaguje 
w sposób nadwra żliwy.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Czułość i niezawodno ść stosowanej techniki eksperymentalnej 
powinna by ć oceniana co sze ść miesięcy przez zastosowanie 
substancji, o których wiadomo, że mają właściwości od słabej do 
miarkowanej sensybilizacji skóry.  
We właściwie przeprowadzonym te ście powinno si ę spodziewa ć 
reakcji co najmniej 30 % w te ście ze środkiem wspomagaj ącym 
i co najmniej 15 % w te ście niewspomaganym dla s łabych/­
umiarkowanych sensybilizatorów.  
Preferowane s ą następujące substancje:  
Numery CAS Numery EINECS Nazwy EINECS Nazwy zwyczajowe  
101-86-0 202-983-3 aldehyd α-heksylocynamo ­
nowy aldehyd α-heksylocynamonowy 
149-30-4 205-736-8 benzotiazolo-2-tiol (2-merkap ­
tobenzotiazol) kaptaks 
94-07-7 202-303-5 anestezyna nordcaine  
Mogą istnieć sytuacje, w których, bior ąc pod uwag ę zadowalaj ące 
uzasadnienie, mog ą być stosowane inne substancje kontrolne spe ł­
niające powyższe kryteria.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Zwierzęta badane s ą początkowo poddane dzia łaniu substancji testo ­
wanej przez śródskórne iniekcje i/lub aplikowanie naskórkowe (eks ­
pozycja indukcyjna). W nast ępstwie 10- do 14-dniowego okresu 
odpoczynku (okres indukcji), podczas którego mo że się rozwinąć 
reakcja odporno ściowa, zwierz ęta są poddane dzia łaniu dawki 
prowokacyjnej. Rozmiar i stopie ń reakcji skórnej na ekspozycj ę 
prowokacyjn ą u zwierz ąt badanych jest porównywany ze wykazy ­
wanym przez zwierz ęta kontrolne, które s ą poddawane pozorowanej 
terapii podczas indukcji i ulegaj ą ekspozycji prowokacyjnej.  
1.5. OPIS METOD BADANIA  
Jeżeli uważa się za konieczne usuni ęcie substancji testowanej, 
powinno ono by ć dokonane przy u życiu wody lub odpowiedniego 
rozpuszczalnika, bez zmiany istniej ącej reakcji lub integralno ści 
naskórka.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT)  
1.5.1.1. P r z y g o t o w a n i a  
Zdrowe, m łode, doros łe, albinotyczne osobniki świnki morskiej s ą 
aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 
dni przed rozpocz ęciem testu. Przed testem zwierz ęta są losowo 
przydzielane do grup. Sier ść jest usuwana przez strzy żenie, golenie 
lub możliwie przez chemiczn ą depilacj ę, zależnie od stosowanej 
metody badania. Przedmiotem troski powinno by ć unikanie otarcia 
skóry. Zwierz ęta są ważone przed rozpocz ęciem i na ko ńcu testu.  
1.5.1.2. W a r u n k i t e s t u  
1.5.1.2.1. Zwierz ęta badane  
Wykorzystywane s ą powszechnie u żywane laboratoryjne rasy albi ­
notyczne świnek morskich.  
1.5.1.2.2. Liczba i p łeć 
Samce i/lub samice zwierz ąt mogą być wykorzystane. Je żeli wyko­
rzystane s ą samice, powinny one by ć nieciężarne i takie, które nie 
rodziły. 
W grupie badanej jest wykorzystane co najmniej 10 zwierz ąt i co 
najmniej 5 zwierz ąt w grupie kontrolnej. Je żeli użyto mniej ni ż 20 
badanych i 10 kontrolnych świnek morskich i nie jest mo żliwy 
wniosek, że testowana substancja jest sensybilizatorem, zdecydo ­
wanie zalecane jest badanie dodatkowych zwierz ąt, aby otrzyma ć 
w sumie co najmniej 20 badanych i 10 kontrolnych zwierz ąt. 
1.5.1.2.3. Poziomy dawki  
Stężenie substancji testowanej stosowane przy ka żdej ekspozycji 
indukcyjnej powinno by ć systematycznie dobrze tolerowane 
i powinno by ć najwyższe, powoduj ące od słabego do umiarkowa ­
nego podra żnienia skóry. St ężenie stosowane przy ekspozycji prowo ­
kacyjnej powinno by ć najwyższą dawką niedrażniącą. Jeżeli 
konieczne, w łaściwe stężenia mog ą być określone na podstawie 
badania pilota żowego wykorzystuj ącego dwa lub trzy zwierz ęta. 
W tym celu powinno by ć rozważone wykorzystanie zwierz ąt 
poddanych dzia łaniu FCA.  
1.5.1.3. P r o c e d u r a  
1.5.1.3.1. Indukcja  
Dzień 0 – grupa badana  
Trzy pary śródskórnych iniekcji o obj ętości 0,1 ml s ą podawane 
w okolicę barku, która jest oczyszczona z sier ści tak, aby iniekcje 
każdej pary le żały po obu stronach linii środkowej.  
Iniekcja 1: mieszanina 1:1 (obj ętościowo) FCA/woda lub fizjolo ­
giczny roztwór soli.  
Iniekcja 2: substancja testowana w odpowiednim no śniku 
w wybranym st ężeniu.  
Iniekcja 3: substancja testowana przygotowana w wybranym st ężeniu 
w mieszaninie 1:1 (obj ętościowo) FCA/woda lub fizjologicznym 
roztworze soli.  
W iniekcji 3 substancje rozpuszczalne w wodzie s ą rozpuszczane w fazie 
wodnej przed zmieszaniem z FCA. Przygotowuje si ę zawiesinę w FCA 
substancji rozpuszczalnych w t łuszczach i nierozpuszczalnych przed 
połączeniem z faz ą wodną. Końcowe stężenie substancji testowanej 
musi być równe stężeniu użytemu w iniekcji 2.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
Iniekcje 1 i 2 s ą podawane blisko siebie i najbli żej głowy, podczas gdy 3 
jest podawana w kierunku cz ęści ogonowej powierzchni badanej.  
Dzień 0 – grupa kontrolna  
Trzy pary śródskórnych iniekcji o obj ętości 0,1 ml s ą podawane w te 
same miejsca, co u zwierz ąt badanych.  
Iniekcja 1: mieszanina 1:1 (obj ętościowo) FCA/woda lub fizjolo ­
giczny roztwór soli.  
Iniekcja 2: nierozcie ńczony no śnik. 
Iniekcja 3: Preparat no śnika o st ężeniu wagowym 50 % 
w mieszaninie 1:1 (obj ętościowo) FCA/woda lub fizjologicznym 
roztworze soli.  
Dzień 5–7 – grupy badana i kontrolna  
Na około 24 godziny przed zastosowaniem miejscowej indukcji, 
jeżeli substancja nie jest środkiem dra żniącym skór ę, badana 
powierzchnia, po dok ładnym strzy żeniu i/lub goleniu, jest 
poddawana dzia łaniu 0,5 ml laurylosiarczanu (VI) sodu 
w wazelinie o st ężeniu 10 %, w celu wywo łania miejscowego 
podrażnienia.  
Dzień 6–8 – grupa badana  
Powierzchnia badana jest ponownie oczyszczana z sier ści. Bibuła 
filtracyjna (2 × 4 cm) jest dok ładnie pokrywana substancj ą testowan ą 
w odpowiednim no śniku oraz nak ładana na powierzchni ę badaną 
i utrzymywana w kontakcie za pomoc ą szczelnego opatrunku przez 
48 godzin. Wybór no śnika powinien by ć uzasadniony. Substancje 
stałe są drobno rozcierane i łączone z odpowiednim no śnikiem. 
Ciecze mog ą być stosowane bez rozcie ńczania, je żeli właściwe.  
Dzień 6–8 – grupa kontrolna  
Powierzchnia badana jest ponownie oczyszczana z sier ści. Nakładany 
jest tylko no śnik, w podobny sposób na powierzchni ę badaną 
i utrzymywany w kontakcie za pomoc ą szczelnego opatrunku przez 48 
godzin.  
1.5.1.3.2. Prowokacja  
Dzień 20–22 – grupa badana i kontrolna  
Boki badanych i kontrolnych zwierz ąt są oczyszczane z sier ści. Łata lub 
komora wype łniona substancj ą testowan ą jest nakładana na jeden bok 
zwierząt oraz, w odpowiednim przypadku, łata lub komora wype łniona 
tylko nośnikiem mo że być nałożona na drugi bok. Łaty są utrzymywane 
w kontakcie za pomoc ą szczelnego opatrunku przez 24 godziny.  
1.5.1.3.3. Obserwacja i klasyfikacja: grupy: badana i kontrolna:  
— około 21 godzin po usuni ęciu łaty powierzchnia prowokacji jest 
czyszczona i dok ładnie strzy żona i/lub golona i, je żeli to 
konieczne, depilowana,  
— około 3 godzin pó źniej (w przybli żeniu 48 godzin od pocz ątku 
stosowania prowokacji) reakcja skóry jest obserwowana 
i odnotowywana zgodnie z klasami wskazanymi w dodatku,  
— około 24 godziny po tej obserwacji przeprowadza si ę drugą 
obserwacj ę (72 godziny) i ponownie odnotowuje.  
Ślepy odczyt wyników bada ń zwierząt badanych i kontrolnych jest 
wskazany.  
Jeżeli konieczne jest wyja śnienie wyników otrzymanych w pierwszej 
prowokacji, powinna by ć rozważona druga prowokacja (tj. powtórna 
prowokacja), gdzie w łaściwe z now ą grupą kontrolną, w przybli żeniu 
jeden tydzie ń po pierwszej. Powtórna prowokacja mo że być również 
przeprowadzona na pierwotnej grupie kontrolnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Wszystkie reakcje skórne i jakiekolwiek niezwyk łe wyniki bada ń, 
w tym reakcje ogólnoustrojowe, wynikaj ące z procedur indukcji 
i prowokacji powinny by ć obserwowane i odnotowywane zgodnie 
ze skalą klasyfikacyjn ą Magnusson/Kligman (zob. dodatek). W celu 
wyjaśnienia w ątpliwych reakcji mog ą być przeprowadzone inne 
procedury, np. badanie histopatologiczne, pomiar grubo ści fałdy 
skórnej.  
1.5.2.  Test Buehlera  
1.5.2.1. P r z y g o t o w a n i a  
Zdrowe, m łode, doros łe, albinotyczne osobniki świnki morskiej s ą 
aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 
dni przed rozpocz ęciem testu. Przed testem zwierz ęta są losowo 
przydzielane do grup. Sier ść jest usuwana przez strzy żenie, golenie 
lub możliwie przez chemiczn ą depilacj ę, zależnie od stosowanej 
metody badania. Nale ży uważać, aby unikn ąć otarcia skóry. Zwie ­
rzęta są ważone przed rozpocz ęciem i na ko ńcu testu.  
1.5.2.2. W a r u n k i t e s t u  
1.5.2.2.1. Zwierz ęta badane  
Wykorzystywane s ą powszechnie u żywane laboratoryjne rasy albi ­
notyczne świnek morskich.  
1.5.2.2.2. Liczba i p łeć 
Mogą być wykorzystane samce i/lub samice zwierz ąt. Jeżeli wyko­
rzystane s ą samice, powinny one by ć nieciężarne i takie, które nie 
rodziły. 
W grupie badanej jest wykorzystanych co najmniej 20 zwierz ąt i co 
najmniej 10 zwierz ąt w grupie kontrolnej.  
1.5.2.2.3. Poziomy dawki  
Stężenie substancji testowanej stosowane przy ka żdej ekspozycji 
indukcyjnej powinno by ć możliwie najwy ższe, by spowodowa ć 
słabe, ale nie nadmierne podra żnienie. St ężenie stosowane przy 
ekspozycji prowokacyjnej powinno by ć najwyższą dawką niedraż­
niącą. Jeżeli konieczne, w łaściwe stężenia mog ą być wyznaczone 
na podstawie badania pilota żowego wykorzystuj ącego dwa lub trzy 
zwierzęta. 
W przypadku materia łów testowanych rozpuszczalnych w wodzie, 
właściwe jest stosowanie jako no śnika wody lub rozcie ńczonego 
niedrażniącego roztworu środka powierzchniowo czynnego. 
W przypadku innych materia łów testowanych 80 % roztwór etanol/ ­
woda jest preferowany dla indukcji i aceton dla prowokacji.  
1.5.2.3. P r o c e d u r a  
1.5.2.3.1. Indukcja  
Dzień 0 – grupa badana  
Jeden bok jest oczyszczany z sier ści (dokładne strzy żenie). System 
łat powinien by ć całkowicie wype łniony substancj ą testowan ą 
w odpowiednim no śniku (wybór no śnika powinien by ć uzasadniony; 
ciekłe substancje testowane mog ą być stosowane bez rozcie ńczania, 
jeżeli właściwe).  
System łat jest nak ładany na powierzchni ę testowan ą i utrzymywany 
w kontakcie ze skór ą za pomoc ą szczelnej łaty lub komory 
i odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
System łat musi by ć szczelny. Odpowiedni jest bawe łniany tampon, 
który może być okrągły lub kwadratowy, o przybli żonej powierzchni 
4–6 cm  2 . W celu zapewnienia szczelno ści preferowane jest unieru ­
chomienie badanego osobnika przy u życiu odpowiedniego elementu 
unieruchamiaj ącego. Jeżeli zastosowane jest owijanie, mog ą być 
potrzebne dodatkowe ekspozycje.  
Dzień 0 – grupa kontrolna  
Jeden bok jest oczyszczany z sier ści (dokładne strzy żenie). Nak ła­
dany jest tylko no śnik, w sposób podobny do stosowanego 
w doniesieniu do grupy badanej. System łat jest utrzymywany 
w kontakcie ze skór ą za pomoc ą szczelnej łaty lub komory 
i odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin. Je żeli można wykaza ć, 
że nie jest konieczna symulowana grupa kontrolna, mo żna się 
posłużyć naturalną grupą kontroln ą. 
Dzień 6–8 i 13–15 – grupa badana i kontrolna  
Przeprowadza si ę takie samo aplikowanie jak w dniu 0, na t ę samą 
powierzchni ę badaną (oczyszczenie z sier ści w razie konieczno ści) 
tego samego boku, w dniu 6–8 i ponownie w dniu 13–15.  
1.5.2.3.2. Prowokacja  
Dzień 27–29 – grupa badana i kontrolna  
Bok zwierz ąt badanych i kontrolnych, który nie by ł wykorzystywany 
do badania, jest oczyszczany z sier ści (dokładne strzy żenie). Na 
zadnią część nieużywanego boku zwierz ąt badanych i kontrolnych 
nakładana jest łata lub komora, zawieraj ąca odpowiedni ą ilość 
substancji testowanej w maksymalnym niedra żniącym stężeniu.  
Jeżeli ma to znaczenie, szczelna łata lub komora tylko z no śnikiem 
jest równie ż nakładana na przedni ą część nieużywanego boku 
zarówno badanych, jak i kontrolnych zwierz ąt. Łaty i komory s ą 
utrzymywane w kontakcie ze skór ą za pomoc ą odpowiedniego opat ­
runku przez 6 godzin.  
1.5.2.3.3. Obserwacja i klasyfikacja:  
— około 21 godzin po usuni ęciu łaty powierzchnia prowokowana 
jest oczyszczana z sier ści, 
— około 3 godziny pó źniej (w przybli żeniu 30 godzin po przy ło­ 
żeniu łaty prowokuj ącej) reakcje skórne s ą obserwowane 
i odnotowywane zgodnie z klasami wskazanymi w dodatku,  
— około 24 godziny pó źniej po 30-godzinnej obserwacji (w przy ­
bliżeniu 54 godziny po przy łożeniu łaty prowokuj ącej) reakcje 
skórne są ponownie obserwowane i odnotowywane.  
Ślepy odczyt zwierz ąt badanych i kontrolnych jest wskazany.  
Jeżeli konieczne jest wyja śnienie wyników otrzymanych z pierwszej 
prowokacji, powinna by ć rozważona druga prowokacja (tj. powtórna 
prowokacja), gdzie w łaściwe, z now ą grupą kontroln ą, 
w przybli żeniu jeden tydzie ń po pierwszej. Powtórna prowokacja 
może być również przeprowadzona na pierwotnej grupie kontrolnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Wszystkie reakcje skórne i jakiekolwiek nietypowe wyniki bada ń, 
w tym reakcje ogólnoustrojowe, wynikaj ące z procedur indukcji 
i prowokacji powinny by ć zaobserwowane i odnotowywane zgodnie 
ze skalą klasyfikacyjn ą Magnusson/Kligman (zob. dodatek). W celu 
wyjaśnienia w ątpliwych reakcji mog ą być przeprowadzone inne 
procedury, np. badanie histopatologiczne, pomiar grubo ści fałdy 
skórnej.  
2. DANE (GPMT i test buehlera)  
Dane powinny by ć podsumowane w formie tabeli, przedstawiaj ąc 
reakcje skórne ka żdego zwierz ęcia podczas ka żdej obserwacji.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA (GPMT I TEST 
BUEHLERA)  
Jeżeli jest wykonana próba sortuj ąca przed testem świnki morskiej, 
muszą być podane opis i odniesienie do testu (np. miejscowa próba 
węzła chłonnego (LLNA), test obrz ęku ucha myszy (MEST)), w tym 
szczegóły procedury, wraz z wynikami testu, oraz wynikami zasto ­
sowania substancji odniesienia.  
Sprawozdanie z testu (GMPT i test Buehlera)  
Sprawozdanie z testu obejmuje, je żeli możliwe, nast ępujące informa ­
cje: 
Zwierzęta badane:  
— wykorzystana rasa świnki morskiej,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki, w których przebywaj ą zwierzęta, dieta itp.,  
— indywidualna waga zwierz ąt na pocz ątku testu.  
Warunki testu:  
— technika przygotowania miejsca przy łożenia łaty, 
— szczegó ły dotyczące materia łu łaty i techniki jej przyk ładania,  
— wynik badania pilota żowego z wnioskiem, dotycz ącym stężeń 
indukcyjnych i prowokacyjnych, które maj ą być zastosowane 
w teście, 
— szczegó ły dotycz ące przygotowania, aplikowania i usuwania 
substancji testowanej,  
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— stężenia no śnika i substancji testowanej zastosowane 
w ekspozycji indukcyjnej i prowokacyjnej oraz ca łkowita ilo ść 
substancji u żytej do indukcji i prowokacji.  
Wyniki:  
— podsumowanie wyników ostatniej kontroli czu łości 
i niezawodno ści (zob. 1.3) wraz z informacj ą dotyczącą stoso­
wanej substancji, st ężenia i no śnika, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— dotycz ące każdego zwierz ęcia wraz z systemem klasyfikacji,  
— opisowa relacja dotycz ąca natury i zakresu obserwowanych skut ­
ków,  
— wszelkie wyniki histopatologiczne.  
Rozpatrzenie wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 423.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Dodatek  
TABELA  
Skala klasyfikacji Magnusson/Kligman do oceny szkodliwych reakcji na łatę 
prowokacyjn ą 
0 = brak widocznych zmian  
1 = odosobniony lub niejednolity rumie ń 
2 = umiarkowany i zlewaj ący się rumień 
3 = silny rumie ń i obrzęk ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7. 28-DNIOWE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI DOUSTNEJ 
WYWOŁANEJ POWTARZANYM DAWKOWANIEM U GRYZONI  
WSTĘP 
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna dotycz ącej badań wytycznej 
OECD nr 407 (OECD Test Guideline 407) (2008). Pierwotn ą dotyczącą 
badań wytyczn ą nr 407 przyj ęto w 1981 r. W 1995 r. przyj ęto wersję 
zmienioną w celu uzyskania dodatkowych informacji na podstawie badania 
wykorzystanych zwierz ąt, w szczególno ści w zakresie neurotoksyczno ści 
i immunotoksyczno ści. 
2. W 1998 r. OECD podj ęła działania o najwy ższym priorytecie maj ące na 
celu przejrzenie istniej ących wytycznych dotycz ących bada ń i opracowanie 
nowych wytycznych dla odsiewania i badania substancji potencjalnie zabu ­
rzających funkcjonowanie uk ładu hormonalnego (8). Jednym z elementów 
tych dzia łań jest uzupe łnienie istniej ącej wytycznej OECD „Repeated dose 
28-day oral toxicity study in rodents” („28-dniowe badanie toksyczno ści 
doustnej wywo łanej powtarzanym dawkowaniem u gryzoni”) (OECD TG 
407) o parametry odpowiednie do wykrywania potencja łu zaburzania funk ­
cjonowania uk ładu hormonalnego przez badane substancje chemiczne. 
Procedurę tę zrealizowano w ramach szeroko zakrojonego programu 
międzynarodowego maj ącego na celu zbadanie istotno ści i praktyczno ści 
dodatkowych parametrów, efektów zastosowania tych parametrów do 
substancji chemicznych o dzia łaniu (anty)estrogenowym, dzia łaniu (anty)an ­
drogenowym i dzia łaniu (anty)tyroidowym, odtwarzalno ści wewnątrzlabora­
toryjnej i mi ędzylaboratoryjnej oraz interferencji nowych parametrów 
z parametrami wymaganymi w poprzedniej wersji OECD TG 407. Uzys ­
kaną w ten sposób du żą ilość danych opracowano i szczegó łowo oceniono 
w kompleksowym sprawozdaniu OECD (9). Niniejsza zaktualizowana metoda badawcza B.7 (jako metoda równowa żna OECD TG 407) stanowi 
efekt doświadczeń i wyników uzyskanych podczas mi ędzynarodowego 
programu badawczego. Niniejsza metoda badawcza umo ż
liwia umieszczenie 
pewnych skutków zwi ązanych z uk ładem hormonalnym w kontek ście 
innych skutków toksycznych.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
3. Przy szacowaniu i ocenie w łaściwości toksycznych substancji chemicznej 
oznaczenie toksyczno ści doustnej przy zastosowaniu powtarzanego dawko ­
wania mo żna prowadzi ć po uzyskaniu pocz ątkowej informacji 
o toksyczno ści na podstawie bada ń toksyczno ści ostrej. Niniejsza metoda 
badawcza ma na celu zbadanie skutków dla wielu ró żnych potencjalnych 
celów toksycznego dzia łania. Dostarcza ona informacji dotycz ących możli­
wych zagro żeń dla zdrowia, które mog ą się pojawiać się pod wp ływem 
wielokrotnego nara żenia przez wzgl ędnie ograniczony okres, w tym 
skutków dla uk ładu nerwowego, immunologicznego i hormonalnego. 
W odniesieniu do tych punktów ko ńcowych metoda powinna s łużyć do 
identyfikacji zwi ązków chemicznych o potencjale neurotoksycznym, co 
może dawać podstawy do dalszego dog łębnego badania tego aspektu, jak 
również związków chemicznych zak łócających fizjologi ę tarczycy. Metoda 
ta może również dostarcza ć danych na temat substancji chemicznych, które 
wpływają na męskie lub żeńskie narz ądy rozrodcze u m łodych, doros łych 
osobników zwierz ąt, i których dzia łanie może wskazywa ć na skutki dla 
układu immunologicznego.  
4. Wyniki bada ń wykonanych niniejsz ą metodą badawcz ą B.7 nale ży wyko­
rzystywać do identyfikacji zagro żeń i oceny ryzyka. Wyniki uzyskane za 
pomocą parametrów zwi ązanych z uk ładem hormonalnym nale ży rozpat­
rywać w kontek ście dokumentu „OECD Conceptual Framework for Testing 
and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” („Ramy koncepcyjne OECD dotycz ące testowania i oceny substancji chemicznych zaburzaj ących 
funkcjonowanie uk ładu hormonalnego”) (11). Metoda obejmuje podstawowe 
badanie toksyczno ści wywołanej powtarzanym dawkowaniem, które mo żna 
przeprowadzi ć w przypadku substancji chemicznych, dla których nie ma 
obowiązku wykonania badania 90-dniowego (np. wtedy, gdy wielko ść 
produkcji nie przekracza pewnych limitów) lub jako wst ęp do badania 
długoterminowego. Czas trwania nara żenia powinien wynosi ć 28 dni.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 275
 
5. Wyniki mi ędzynarodowego programu walidacji parametrów odpowiednich 
do potencjalnego wykrywania zaburzania funkcjonowania uk ładu hormonal ­
nego przez badan ą substancj ę chemiczn ą pokazały, że jakość danych uzys ­
kanych za pomoc ą niniejszej metody badawczej B.7 zale ży w dużym 
stopniu od do świadczenia laboratorium prowadz ącego badanie. Dotyczy to 
w szczególno ści histopatologicznego okre ślenia cyklicznych zmian 
w żeńskich narz ądach rozrodczych oraz wyznaczania masy ma łych, trud ­
nych do wyci ęcia narządów hormonozale żnych. Opracowano wytyczne 
dotyczące badań histopatologicznych (19). S ą one dost ępne na publicznej 
stronie internetowej OECD po święconej wytycznym dotycz ącym bada ń. 
Wytyczne maj ą na celu wsparcie patologów w badaniach i zwi ększenie 
czułości oznaczenia. Znaleziono szereg ró żnych parametrów, które wskazuj ą 
na toksyczno ść związaną z układem hormonalnym, i zosta ły one włączone 
do niniejszej metody badawczej. Parametry, dla których brakowa ło dostęp­
nych danych maj ących na celu wykazanie ich u żyteczności lub dla których 
w toku programu walidacji uzyskano jedynie s łabe dowody na ich przydat ­
ność do wykrywania substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu 
hormonalnego, zaproponowano jako opcjonalne punkty ko ńcowe (zob. 
dodatek 2).  
6. Na podstawie danych otrzymanych w procesie walidacji nale ży podkreślić, 
że czułość tego testu jest niewystarczaj ąca do identyfikacji wszystkich 
substancji o dzia łaniu (anty)androgenowym lub (anty)estrogenowym (9). 
Niniejszej metody badawczej nie stosuje si ę na takim etapie życia, na 
którym wyst ępuje najwi ększa wra żliwość na zaburzanie funkcjonowania 
układu hormonalnego. Mimo to podczas procesu walidacji za pomoc ą 
niniejszej metody badawczej zidentyfikowano substancje, które w ma łym 
i dużym stopniu zaburzaj ą funkcjonowanie tarczycy, jak równie ż substancje 
silnie i średnio zaburzaj ące funkcjonowanie uk ładu hormonalnego poprzez 
receptory androgenowe i estrogenowe, jednak w wi ększości przypadków nie 
udało się zidentyfikowa ć substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu 
hormonalnego s łabo wp ływających na receptory estrogenowe 
i androgenowe. Nie mo żna jej zatem uzna ć za test przesiewowy dla poten ­
cjału zaburzania funkcjonowania uk ładu hormonalnego.  
7. A zatem brak skutków zwi ązanych z tymi sposobami dzia łania nie mo że 
być dowodem na brak dzia łania na uk ład hormonalny. Nie mo żna zatem 
scharakteryzowa ć substancji w zakresie skutków zwi ązanych z uk ładem 
hormonalnym tylko na podstawie wyników niniejszej metody badawczej – powinna ona by ć stosowana w ramach podej ścia opartego na wadze dowo ­
dów, obejmuj ącego wszystkie istniej ące dane na temat substancji chemicz ­
nej, prowadz ącego do scharakteryzowania potencja łu zaburzania funkcjono ­
wania uk ładu hormonalnego. Z tego powodu decyzje regulacyjne dotycz ące 
zaburzania funkcjonowania uk ładu hormonalnego (charakterystyka substan ­
cji) powinny by ć oparte na ustaleniach wynik łych z zastosowania szerokiego 
podejścia, nie za ś podejmowane tylko na podstawie wyników zastosowania 
niniejszej metody badawczej.
 
8. Uznaje si ę, że wszystkie procedury oparte na wykorzystaniu zwierz ąt będą 
przeprowadzane zgodnie z lokalnymi normami dotycz ącymi utrzymania 
zwierząt; opisy ich utrzymania i poddawania dzia łaniu substancji podane 
poniżej stanowi ą standardy minimalne, a przepisy lokalne, je śli są bardziej 
rygorystyczne, maj ą przed nimi pierwsze ństwo. Dalsze wskazówki 
dotyczące humanitarnego traktowania zwierz ąt podano w dokumencie 
OECD (14).  
9. Definicje u żytych poj ęć podano w dodatku 1.  
ZASADA BADANIA  
10. Badana substancja chemiczna jest codziennie podawana doustnie 
w stopniowanych dawkach kilku grupom zwierz ąt doświadczalnych – 
jeden poziom dawkowania na grup ę przez okres 28 dni. Podczas okresu 
dawkowania ka żdego dnia zwierz ęta są dokładnie obserwowane w celu 
wykrycia oznak toksyczno ści. Zwierz ęta, które padn ą lub zostan ą poddane 
eutanazji w czasie trwania badania, poddawane s ą sekcji zw łok, a przy 
zakończeniu badania zwierz ęta, które prze żyły, równie ż są uśmiercane 
i poddawane sekcji zw łok. W 28-dniowym badaniu mo żna uzyska ć infor­
macje na temat skutków powtarzanego nara żenia drog ą doustną i określić ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 276
 
potrzebę przeprowadzenia dalszych bada ń obejmuj ących dłuższy okres. 
Można równie ż uzyskać informacje dotycz ące wyboru st ężeń do bada ń 
długoterminowych. Dane otrzymane w drodze zastosowania niniejszej 
metody badawczej powinny umo żliwić scharakteryzowanie toksyczno ści 
badanej substancji chemicznej, okre ślenie zwi ązku dawka-odpowied ź oraz 
wyznaczenie poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę szkodli­
wych zmian (NOAEL).  
OPIS METODY  
Dobór gatunków zwierz ąt 
11. Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, cho ć dopuszcza si ę wykorzy ­
stywanie innych gatunków gryzoni. W przypadku gdy parametry okre ślone 
w niniejszej metodzie badawczej B.7 badane s ą z wykorzystaniem innego 
gatunku gryzoni, nale ży poda ć uzasadnienie. Mimo że 
z biologicznego punktu widzenia jest mo żliwe, że zwierz ęta innych 
gatunków b ędą reagowa ć na substancje toksyczne w podobny sposób do 
szczurów, wykorzystanie gatunków mniejszych zwierz ąt może spowodowa ć 
zwiększenie zmienno ści wyników z powodu trudno ści technicznych z sekcj ą 
mniejszych narz ądów. Szczur by ł jedynym gatunkiem wykorzystywanym 
w międzynarodowym programie walidacyjnym dotycz ącym substancji zabu ­
rzających funkcjonowanie uk ładu hormonalnego. Zaleca si ę wykorzystanie 
zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt pochodz ących ze szczepów 
powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. Samice powinny by ć 
nieródkami i nie mog ą być w ciąży. Dawkowanie powinno si ę rozpocząć 
jak najszybciej po odsadzeniu od matki, a w ka żdym przypadku przed 
ukończeniem dziewi ęciu tygodni. W momencie rozpocz ęcia badania odchy ­
lenia mas cia ła wśród wykorzystywanych zwierz ąt powinny by ć jak 
najniższe i nie powinny przekracza ć ± 20 % średniej masy cia ła u każdej 
z płci. Kiedy przeprowadza si ę badanie z zastosowaniem powtarzanego 
dawkowania doustnego jako badanie wst ępne do badania d ługotermino ­
wego, w obu badaniach nale ży użyć zwierząt tego samego szczepu, 
pochodzących z tego samego źródła. 
Warunki przetrzymywania i karmienia  
12. Wszystkie procedury powinny by ć zgodne z lokalnymi normami utrzymy ­
wania zwierz ąt laboratoryjnych. Temperatura w pomieszczeniu, w którym 
przetrzymuje si ę zwierzęta doświadczalne, powinna wynosi ć 22 °C (± 3 
°C). Wilgotno ść względna, poza okresem sprz ątania pomieszczenia, 
powinna wynosi ć co najmniej 30 % i raczej poni żej 70 %, nale ży starać 
się ją utrzymać na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, 
w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. Do karmienia mo żna 
stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem 
do wody pitnej. Na wybór diety mo że mieć wpływ potrzeba zapewnienia 
odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej przy podawaniu 
w ramach niniejszej metody. Zwierz ęta należy przetrzymywa ć razem, 
w małych grupach sk ładających się z osobników tej samej p łci; można je 
przetrzymywa ć pojedynczo, je śli jest to uzasadnione z naukowego punktu 
widzenia. W przypadku przetrzymywania w grupach w jednej klatce nale ży 
umieszcza ć nie więcej niż pięć zwierząt. 
13. Pasz ę należy regularnie analizowa ć pod kątem obecno ści zanieczyszcze ń. 
Próbkę paszy nale ży zachowa ć do momentu uko ńczenia sprawozdania.  
Przygotowanie zwierz ąt 
14. Zdrowe m łode doros łe osobniki zwierz ąt są losowo przypisane do grup 
kontrolnych oraz grup poddawanych dzia łaniu substancji. Klatki nale ży 
rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizowa ć potencjalny wp ływ ich 
układu. Zwierz ęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane 
w klatkach przez co najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem badania 
z poddawaniem dzia łaniu substancji, żeby umo żliwić aklimatyzacj ę do 
warunków laboratoryjnych.  
Przygotowanie dawek  
15. Badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę za pomoc ą sondy b ądź wraz 
z pokarmem lub wod ą pitną. Metoda podawania drog ą doustną zależy od 
celu badania oraz w łaściwości fizycznych/chemicznych/toksykokinetycz ­
nych badanej substancji chemicznej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. W razie potrzeby badan ą substancj ę chemiczn ą rozpuszcza si ę lub sporz ądza 
się jej zawiesin ę w odpowiednim no śniku. Zaleca si ę, aby – je żeli to 
możliwe – najpierw rozwa żyć użycie wodnego roztworu/zawiesiny, 
następnie roztworu/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero 
potem roztworu w innych no śnikach. W przypadku no śników innych ni ż 
woda charakterystyka toksyczna no śnika musi by ć znana. Nale ży określić 
stabilność badanej substancji chemicznej w no śniku.  
PROCEDURA  
Liczba i p łeć zwierząt 
17. Dla ka żdego poziomu dawkowania nale ży wykorzysta ć co najmniej 10 
zwierząt (pięć samic i pi ęć samców). Je żeli planowana jest eutanazja 
zwierząt w trakcie trwania do świadczenia, ich liczba powinna zosta ć 
powiększona o liczb ę zwierząt, które maj ą być poddane eutanazji przed 
zakończeniem badania. Nale ży rozważyć włączenie dodatkowej satelitarnej 
grupy 10 zwierz ąt (po 5 ka żdej płci) do grupy kontrolnej i grupy otrzy ­
mującej najwy ższe dawki w celu obserwacji odwracalno ści, trwałości lub 
opóźnionego wyst ępowania skutków toksycznych przez co najmniej 14 dni 
po zakończeniu podawania substancji.  
Dawkowanie  
18. Zasadniczo nale ży wykorzysta ć co najmniej trzy grupy badane i grup ę 
kontrolną, jednak je żeli z oceny innych danych nale żałoby oczekiwa ć 
braku objawów przy dawce 1 000 mg/kg masy cia ła/dzień, można przepro ­
wadzić badanie graniczne. Je żeli nie są dostępne odpowiednie dane, mo żna 
wykonać badanie ustalaj ące zakres (z wykorzystaniem zwierz ąt tego samego 
szczepu, pochodz ących z tego samego źródła) w celu okre ślenia dawek, 
które maj ą być zastosowane. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu badanej 
substancji chemicznej, zwierz ęta z grupy kontrolnej nale ży traktowa ć 
w taki sam sposób jak zwierz ęta z grup badanych. Je żeli przy podawaniu 
badanej substancji chemicznej jest stosowany no śnik, grupa kontrolna 
powinna otrzyma ć największą użytą objętość nośnika.  
19. Poziomy dawkowania nale ży dobiera ć przy uwzgl ędnieniu wszelkich istniej ­ 
ących danych o toksyczno ści i danych (toksyko)kinetycznych dost ępnych 
dla badanej substancji chemicznej lub powi ązanych zwi ązków chemicznych. 
Należy wybrać taki najwy ższy poziom dawkowania, który powoduje oznaki 
toksyczno ści, ale nie zgon lub silne cierpienie. Nast ępnie nale ży dobiera ć 
poziomy dawkowania w sekwencji malej ącej w taki sposób, aby ukaza ć 
wszystkie reakcje powi ązane z dawkowaniem i brak obserwowanych szkod ­
liwych zmian przy najmniejszym poziomie dawkowania (NOAEL). Cz ęsto 
do ustalenia malej ących poziomów dawkowania optymalne jest zastoso ­
wanie poziomów dawkowania ró żniących się od dwu- do czterokrotnie, 
a zamiast stosowa ć bardzo odleg łe (np. różniące się więcej niż 10-krotnie) 
poziomy dawkowania, cz ęsto lepiej jest doda ć czwartą grupę badaną. 
20. Jeśli obserwowana jest ogólna toksyczno ść (np. zmniejszenie masy cia ła, 
wpływ na wątrobę, serce, p łuca lub nere iitp.) b ądź inne zmiany, które nie 
muszą być efektami toksycznymi (np. zmniejszone pobieranie pokarmu, 
powiększenie w ątroby), interpretacji obserwowanych skutków dla punktów 
końcowych w postaci wp ływu na uk ład immunologiczny, neurologiczny lub 
hormonalny nale ży dokonywa ć ostrożnie. 
Badanie graniczne  
21. Jeżeli badanie przy jednym poziomie dawkowania równym co najmniej 
1 000 mg/kg masy cia ła/dzień lub, w przypadku podawania w po żywieniu 
lub wodzie pitnej, równowa żnemu procentowi w po żywieniu lub wodzie 
pitnej (okre ślonemu na podstawie masy cia ła), przy zastosowaniu procedur 
opisanych dla tego badania, nie wywo łuje widocznych oznak toksyczno ści 
i jeżeli na podstawie danych dotycz ących strukturalnie powi ązanych 
związków nie nale żałoby spodziewa ć się toksyczno ści, pełne badanie przy 
użyciu trzech poziomów dawkowania mo że nie by ć konieczne. Takie 
badanie graniczne stosuje si ę z wyjątkiem przypadków, w których nara żenie 
ludzi wskazuje na konieczno ść użycia wyższego poziomu dawkowania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 278
 
Podawanie dawek  
22. Zwierz ętom podaje si ę badaną substancj ę chemiczn ą codziennie, siedem dni 
w tygodniu przez okres 28 dni. Gdy badana substancja chemiczna jest podawana przez sond ę, należy ją podawa ć zwierzętom w pojedynczej 
dawce przy u życiu sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. 
Maksymalna obj ętość cieczy, jak ą można podać jednorazowo, zale ży od 
wielkości badanego zwierz ęcia. Objętość ta nie powinna przekracza ć 1 
ml/100 g masy cia ła, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których 
można zastosowa ć 2 ml/100 g masy cia ła. Z wyj ątkiem dra żniących 
i żrących substancji chemicznych, dla których zazwyczaj przy wy ższych 
stężeniach wyst ępują zaostrzone objawy, nale ży zminimalizowa ć zmienno ść 
objętości substancji badanej przez dostosowanie st ężenia tak, aby przy 
wszystkich poziomach dawkowania obj ętość
 była stała. 
23. W przypadku substancji chemicznych podawanych w pokarmie lub wodzie 
pitnej wa żne jest dopilnowanie, aby takie ilo ści badanej substancji 
chemicznej nie zak łócały normalnego od żywiania ani bilansu wodnego 
organizmu. Przy podawaniu badanej substancji chemicznej wraz 
z pokarmem mo żna zastosowa ć stałe stężenie w pokarmie (ppm) lub te ż 
stały poziom dawki w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia; trzeba poda ć 
zastosowany wariant. W przypadku podawania substancji chemicznej przez 
sondę dawkę należy podawa ć każdego dnia o zbli żonej porze i w razie 
konieczno ści modyfikowa ć, aby utrzyma ć stały poziom dawkowania 
w odniesieniu do masy cia ła zwierz ęcia. W przypadku gdy badanie 
z powtarzanym dawkowaniem jest przeprowadzane jako badanie wst ępne 
do badania d ługoterminowego, nale ży w obu badaniach stosowa ć podobną 
dietę. 
Obserwacje  
24. Okres obserwacji powinien wynosi ć 28 dni. Zwierz ęta z grupy satelitarnej 
przeznaczone do obserwacji uzupe łniających nale ży trzymać co najmniej 14 
dni bez podawania substancji w celu wykrycia opó źnionego pojawienia si ę, 
utrzymywania lub ust ąpienia oznak toksyczno ści. 
25. Ogólne obserwacje kliniczne nale ży przeprowadza ć co najmniej raz dzien ­
nie, najlepiej o tej samej porze ka żdego dnia, bior ąc pod uwag ę szczytowy 
okres wyst ępowania przewidywanych objawów po dawkowaniu. Nale ży 
rejestrowa ć stan zdrowia zwierz ąt. Co najmniej dwa razy dziennie wszystkie 
zwierzęta poddaje si ę obserwacjom pod k ątem zachorowalno ści 
i śmiertelno ści. 
26. Dla wszystkich zwierz ąt należy przeprowadza ć szczegó łowe obserwacje 
kliniczne: jeden raz przed pierwszym nara żeniem (w celu umo żliwienia 
porównania badanych zwierz ąt), a nast ępnie co najmniej raz w tygodniu. 
Obserwacji nale ży dokonywa ć poza klatk ą zwierz ęcia, najlepiej 
w warunkach standardowych i za ka żdym razem o tej samej porze. Obser ­
wacje nale ży starannie odnotowywa ć, najlepiej za pomoc ą systemów punk ­
tacji wyra źnie określonych przez laboratorium badawcze. Nale ży dołożyć 
starań w celu dopilnowania, aby odchylenia w warunkach badania by ły 
minimalne, preferowane jest prowadzenie obserwacji przez osoby, które 
nie wiedz ą, jaka substancja jest podawana. Odnotowane objawy powinny 
obejmowa ć między innymi zmiany w skórze, futrze, oczach, b łonach śluzo­
wych, wyst ąpienie wydzielin i wydalin oraz aktywno ść autonomicznej 
części układu nerwowego (np. łzawienie, piloerekcj ę, rozmiar źrenicy, niety ­
powy rytm oddychania). Nale ży odnotowa ć także zmiany w sposobie 
chodzenia, postawie i reakcji na dotyk, jak równie ż obecność ruchów 
klonicznych lub tonicznych, zachowa ń stereotypowych (np. nadmierne 
czyszczenie si ę, powtarzaj ące się krążenie w kó łko) oraz dziwnych 
zachowań (np. samookaleczanie si ę, chodzenie do ty łu) (2).  
27. W czwartym tygodniu nara żenia należy przeprowadzi ć ocenę reaktywno ści 
sensorycznej na ró żnego typu bod źce (2) (np. bod źce słuchowe, wzrokowe 
i proprioceptywne) (3) (4) (5), ocen ę siły uchwytu (6) i aktywno ści moto­
rycznej (7). Dalsze szczegó łowe informacje na temat procedur, jakie mo żna 
zastosowa ć, podano w odno śnych źródłach literaturowych. Mo żna jednak 
zastosowa ć również procedury inne ni ż te podane w bibliografii.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 279
 
28. Obserwacje czynno ściowe przeprowadzane w czwartym tygodniu nara żenia 
można pomin ąć, gdy badanie prowadzone jest jako badanie wst ępne do 
późniejszego (90-dniowego) badania toksyczno ści podprzewlek łej. 
W takim przypadku obserwacje czynno ściowe nale ży zamieścić w tym 
badaniu uzupe łniającym. Z drugiej strony, dost ępność danych dotycz ących 
obserwacji czynno ściowych z badania z powtarzanym dawkowaniem mo że 
zwiększyć możliwości doboru poziomów dawkowania do celów pó źnie­
jszego badania toksyczno ści podprzewlek łej. 
29. Wyjątkowo mo żna pomin ąć obserwacje czynno ściowe równie ż 
w odniesieniu do grup, które oprócz tego przejawiaj ą oznaki toksyczno ści 
nasilone na tyle, że mogłyby znacznie zak łócić wykonanie badania czyn ­
nościowego.  
30. Podczas sekcji zw łok można (opcjonalnie) okre ślić cykl estrogenowy 
wszystkich samic za pomoc ą rozmazów śluzówki pochwy. Z tych obser ­
wacji uzyskuje si ę informacje dotycz ące etapu cyklu estrogenoweo 
w momencie u śmiercenia zwierz ęcia oraz dane do oceny histologicznej 
tkanek wra żliwych na dzia łanie estrogenów [zob. wytyczne dotycz ące histo­
patologii (19)].  
Masa cia ła i spożycie pokarmu/wody  
31. Wszystkie zwierz ęta należy ważyć przynajmniej raz na tydzie ń. Pomiarów 
spożycia pokarmu nale ży dokonywa ć nie rzadziej ni ż co tydzie ń. Jeśli 
badana substancja chemiczna jest podawana w wodzie pitnej, nale ży 
mierzyć również spożycie wody, nie rzadziej ni ż raz w tygodniu.  
Hematologia  
32. Pod koniec okresu badania nale ży przeprowadzi ć następujące analizy hema ­
tologiczne: hematokryt, st ężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, liczba 
retikulocytów, ca łkowita i ró żnicowa liczba leukocytów, liczba p łytek 
krwi i pomiar czasu krzepni ęcia krwi. Je śli badana substancja chemiczna 
lub jej potencjalne metabolity maj ą właściwości utleniaj ące lub podejrzewa 
się, że mogą mieć takie właściwości, należy równie ż przeprowadzi ć inne 
oznaczenia, w tym st ężenia methemoglobiny i cia łek Heinza.  
33. Próbki krwi nale ży pobiera ć z wyznaczonego miejsca tu ż przed eutanazj ą 
zwierząt lub jako element jej procedury, i przechowywa ć w odpowiednich 
warunkach. Zwierz ęta w noc przed eutanazj ą nie powinny otrzymywa ć 
pokarmu (  1 ). 
Biochemia kliniczna  
34. Oznaczenia parametrów biochemii klinicznej w celu zbadania g łównych 
skutków toksycznych w tkankach, a w szczególno ści skutków dla nerek 
i wątroby, nale ży wykona ć na próbkach krwi pobranych od ka żdego zwie ­
rzęcia tuż przed eutanazj ą lub jako element jej procedury (z wyj ątkiem 
zwierząt, które przed zako ńczeniem badania znalaz ły się w stanie 
agonalnym lub zosta ły uśmiercone). Badania osocza i surowicy musz ą obej­
mować oznaczenia sodu, potasu, glukozy, cholesterolu ca łkowitego, mocz ­
nika, kreatyniny, ca łkowitego bia łka i albuminy, co najmniej dwóch 
enzymów wskazuj ących na stan komórek w ątroby (takich jak aminotransfe ­
raza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, fosfataza alkaliczna, 
transpeptydaza gammaglutamylowa i dehydrogenaza glutaminianowa) oraz kwasów żółciowych. W pewnych okoliczno ściach przydatnych informacji 
mogą dostarczy ć pomiary dodatkowych enzymów (pochodzenia w ątrobo­
wego lub innego) oraz bilirubiny.
 
35. Opcjonalnie mo żna w ciągu ostatniego tygodnia bada ń przeprowadzi ć nastę­
pujące oznaczenia analityczne w moczu przy u życiu zebranej w okre ślonym 
czasie obj ętości moczu: wygl ąd, objętość, osmolalno ść lub masa w łaściwa, 
pH, białko, glukoza i krew/komórki krwi.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) W odniesieniu do niektórych pomiarów dotycz ących surowicy i osocza, w szczególno ści 
dla glukozy, zaleca si ę wstrzymanie podawania pokarmu przez noc. Zalecenie to wynika 
głównie z faktu, że zwiększona zmienno ść, którą nieuchronnie powoduje brak wstrzy ­
mania podawania pokarmu, cz ęsto maskuje bardziej subtelne skutki, co utrudnia inter ­
pretację wyników. Z drugiej strony jednak wstrzymanie podawania pokarmu przez noc 
może wpływać na ogólny metabolizm zwierz ąt i w szczególno ści w badaniach żywie­
niowych mo że zakłócać dzienne nara żenie na dzia łanie badanej substancji chemicznej. 
Jeżeli przyjęte jest wstrzymanie podawania po żywienia przez ca łą noc, biochemiczne 
oznaczenia kliniczne nale ży wykona ć po przeprowadzeniu obserwacji czynno ściowych 
w czwartym tygodniu badania.
 36. Ponadto nale ży rozważyć zastosowanie do bada ń osocza lub surowicy 
znaczników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które nale ży 
wykonać, jeżeli znane w łaściwości badanej substancji chemicznej mog ą 
wpływać na pokrewne profile metaboliczne lub podejrzewa si ę taki wpływ, 
obejmują oznaczenia wapnia, fosforanów, trójglicerydów, poszczególnych 
hormonów i pseudocholinesterazy. Nale ży je okre ślić dla substancji 
chemicznych nale żących do niektórych klas lub indywidualnie w ka żdym 
przypadku.  
37. Mimo że w toku mi ędzynarodowej oceny punktów ko ńcowych zwi ązanych 
z układem hormonalnym nie wykazano oczywistych zalet oznaczania 
hormonów tarczycy (T  3 , T 4 ) i TSH, u żyteczne mo że być zachowanie próbek 
osocza lub surowicy w celu zmierzenia poziomów T  3 , T 4 i TSH (opcjonal ­
nie), je żeli istniej ą przypuszczenia co do skutków dla osi 
przysadkowo-tarczycowej. Próbki te mo żna przechowywa ć w stanie zamro ­ 
żonym, w temperaturze -20 °C. Na zmienno ść i warto ści bezwzgl ędne 
stężeń przy oznaczaniu hormonów mog ą mieć wpływ następujące czynniki:  
— czas u śmiercenia zwierz ęcia w zwi ązku z dobow ą zmienno ścią stężeń 
hormonów,  
— metoda u śmiercenia zastosowana w celu unikni ęcia zbędnego stresu dla 
zwierząt mogącego wpłynąć na stężenia hormonów,  
— zestawy do oznaczania hormonów, których krzywe standardowe mog ą 
się różnić. 
Wyniki identyfikacji substancji chemicznych dzia łających na tarczyc ę uzys­
kane na podstawie analizy histopatologicznej s ą bardziej wiarygodne ni ż 
identyfikacja na podstawie poziomów hormonów.  
38. Próbki osocza przeznaczone konkretnie do oznaczenia poziomu hormonów 
należy pobiera ć o porównywalnej porze dnia. Zaleca si ę, aby na podstawie 
zmian histopatologicznych w tarczycy rozwa żyć oznaczenie T  3 , T 4 i TSH. 
Wartości liczbowe uzyskane w toku analizy st ężeń hormonów ró żnią się 
w zależności od zastosowanego dost ępnego w handlu zestawu testowego. 
Uzyskanie kryteriów w oparciu o jednorodne dane historyczne mo że zatem 
być niemożliwe. Alternatywnie laboratoria powinny d ążyć do utrzymywania 
kontrolnych wspó łczynników zmienno ści poniżej 25 w odniesieniu do T  3 
i T 4 , a w odniesieniu do TSH – poni żej 35. Wszystkie st ężenia zapisuje si ę 
w ng/ml.  
39. Jeżeli historyczne dane odniesienia s ą niewystarczaj ące, należy rozważyć 
oznaczenie zmiennych hematologicznych i biochemii klinicznej przed 
rozpoczęciem podawania dawek lub, lepiej, w grupie zwierz ąt niebędących 
zwierzętami doświadczalnymi.  
PATOLOGIA  
Pełne rozpoznanie histopatologiczne  
40. Wszystkie zwierz ęta w badaniu podlegaj ą szczegółowemu pe łnemu rozpoz ­
naniu histopatologicznemu, które obejmuje staranne badanie zewn ętrznej 
powierzchni cia ła, wszystkich otworów cia ła, jamy czaszkowej, klatki pier ­
siowej i jamy brzusznej oraz ich zawarto ści. Wątroba,  nerki,  nadnercza,  
jądra, najądrza,  prostata +  pęcherzyki nasienne wraz z  gruczołami koaguluj ­ 
ącymi jako ca łość, grasica,  śledziona,  mózg i  serce wszystkich zwierz ąt (z 
wyjątkiem tych, które przed zako ńczeniem badania znalaz ły się w stanie 
agonalnym lub zosta ły uśmiercone) powinny by ć odpowiednio okrojone 
z wszelkich przylegaj ących tkanek i nale ży niezwłocznie po sekcji zmierzy ć 
ich mokrą masę w celu zapobie żenia wyschni ęciu. Należy zachowa ć ostroż­
ność przy okrajaniu zespo łu prostaty, aby unikn ąć przebicia wype łnionych 
płynem pęcherzyków nasiennych. Alternatywnie mo żna okroić i zważyć 
pęcherzyki nasienne i prostat ę po utrwaleniu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 281
 
41. Ponadto opcjonalnie mo żna zważyć kolejne dwa zespo ły tkanek 
niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu unikni ęcia wyschni ęcia: 
parę jajników (mokra masa) i macic ę wraz z szyjk ą (wytyczne w zakresie 
wycinania i przygotowania tkanek macicy w celu pomiaru masy podane s ą 
w OECD TG 440 (18)).  
42. Masę tarczycy mo żna (opcjonalnie) okre ślić po utrwaleniu. Nale ży 
zachować dużą ostrożność przy okrawaniu i wykonywa ć je dopiero po 
utrwaleniu, w celu unikni ęcia uszkodzenia tkanek. Mog łoby ono zak łócić 
analizę histopatologiczn ą. 
43. Nast ępujące tkanki nale ży zachowa ć w roztworze utrwalaj ącym najbardziej 
odpowiednim zarówno dla rodzaju tkanki, jak i planowanego pó źniejszego 
badania histopatologicznego (zob. punkt 47): wszystkie  makroskopowe  
zmiany patologiczne,  mózg (reprezentatywne regiony, w tym kresomózgo ­
wie, móżdżek i most),  rdzeń kręgowy,  oko,  żołądek, jelito cienkie i grube 
(w tym k ępki Peyera),  wątrobę, nerki,  nadnercza,  śledzionę, serce,  grasicę, 
tarczycę, tchawicę i płuca (zakonserwowane przez nape łnienie środkiem 
utrwalającym i nast ępnie zanurzenie),  gonady (j ądra i jajniki),  płciowe  
narządy dodatkowe (macic ę i szyjkę macicy, naj ądrza, prostat ę + pęcherzyki 
nasienne wraz z gruczo łami koaguluj ącymi),  pochwę, pęcherz moczowy,  
węzły chłonne [poza najbli ższym węzłem chłonnym nale ży pobrać inny 
węzeł w zależności od doświadczenia laboratorium (15)],  nerw obwodowy 
(kulszowy lub piszczelowy), najlepiej w bliskiej odleg łości od mi ęśnia, 
mięsień szkieletowy i  kość szkieletow ą wraz ze  szpikiem kostnym (wycinek 
lub ewentualnie świeżo pobrany szpik kostny). Zaleca si ę utrwalenie j ąder 
poprzez zanurzenie w utrwalaczu Bouina lub zmodyfikowanym utrwalaczu 
Davidsona (16) (17). B łonę białawą trzeba delikatnie i p łytko przek łuć igłą 
na obu biegunach narz ądu w celu umo żliwienia szybkiego przenikni ęcia 
płynu utrwalaj ącego do utrwalacza. Wyniki bada ń klinicznych i innych 
testów mog ą wskazać na konieczno ść zbadania dodatkowych tkanek. 
Organy uznane w oparciu o znane w łaściwości badanej substancji 
chemicznej za prawdopodobne organy docelowe tak że należy zachowa ć. 
44. Ważnych wskazówek co do efektów zwi ązanych z uk ładem hormonalnym 
mogą dostarczy ć badania nast ępujących tkanek: gonad (jajników i j ąder), 
płciowych narz ądów dodatkowych (macicy wraz z szyjk ą, najądrzy, 
pęcherzyków nasiennych z gruczo łami koagulacyjnymi, cz ęści 
grzbietowo-bocznej i brzusznej prostaty), pochwy, przysadki mózgowej, 
męskich gruczo łów mlekowych, tarczycy i gruczo łu nadnerczowego. 
Zmiany w m ęskich gruczo łach mlekowych nie s ą zbyt dobrze udokumen ­
towane, ale parametr ten mo że być bardzo czu ły na substancje o dzia łaniu 
estrogenowym. Badania organów/tkanek niewymienionych w pkt 43 s ą 
opcjonalne (zob. dodatek 2).  
45. W wytycznych dotycz ących histopatologii (19) podano dodatkowe infor ­
macje dotycz ące wycinania, utrwalania, dzielenia i histopatologii tkanek 
układu hormonalnego.  
46. W mi ędzynarodowym programie badawczym uzyskano dowody na to, że 
nieznaczne skutki dzia łania na uk ład hormonalny substancji chemicznych 
o niewielkiej sile dzia łania na homeostaz ę hormonów p łciowych mo żna 
wykryć poprzez zak łócenie synchronizacji cyklu estrogenowego 
w różnych tkankach, nie za ś poprzez bezpo średnie zmiany histopatologiczne 
w żeńskich organach p łciowych. Mimo że definitywne dowody na takie 
oddziaływanie nie s ą znane, zaleca si ę uwzględnienie dowodów na mo żliwą 
desynchronizacj ę cyklu estrogenowego w interpretacji bada ń histopatolo ­
gicznych jajników (komórek p ęcherzykowych, os łonkowych i warstwy ziar ­
nistej p ęcherzyka Graffa), macicy, szyjki macicy oraz pochwy. 
W porównaniu tym mo żna uwzgl ędnić również etap cyklu estrogenowego 
określony na podstawie rozmazów śluzówki pochwy, o ile wykonano tak ą 
ocenę. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologia  
47. Pełne badanie histopatologiczne nale ży przeprowadzi ć na zakonserwowa ­
nych narz ądach i tkankach wszystkich zwierz ąt z grupy kontrolnej i grupy 
otrzymującej najwy ższe dawki. Badania te powinny by ć rozciągnięte na 
wszystkie inne grupy badane, je śli w grupie otrzymuj ącej najwy ższe 
dawki obserwuje si ę zmiany zwi ązane z dzia łaniem substancji.  
48. Wszystkie makroskopowe zmiany patologiczne musz ą być zbadane.  
49. Jeśli wykorzystuje si ę grupę satelitarn ą, należy przeprowadzi ć badanie histo ­
patologiczne tych tkanek i organów, w których – w grupach otrzymuj ących 
substancję badaną – stwierdzono skutki podania substancji.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
50. Nale ży przedstawi ć dane dotycz ące poszczególnych zwierz ąt. Ponadto 
wszystkie dane nale ży zestawi ć w postaci tabeli, przedstawiaj ąc 
w odniesieniu do ka żdej badanej grupy liczb ę zwierząt na pocz ątku badania, 
liczbę zwierząt padłych w trakcie trwania badania lub poddanych eutanazji 
z przyczyn humanitarnych wraz z okre śleniem czasu zgonu lub eutanazji, 
liczbę zwierząt wykazuj ących oznaki toksyczno ści, opis obserwowanych 
oznak toksyczno ści, w tym czas ich pojawienia si ę, czas trwania, nasilenie 
wszelkich skutków toksycznych, liczb ę zwierząt wykazuj ących zmiany pato ­
logiczne, typ takich zmian, ich nasilenie oraz procent zwierz ąt wykazuj ­ 
ących każdy typ zmiany.  
51. O ile to mo żliwe, wyniki liczbowe nale ży poddawa ć ocenie za pomoc ą 
właściwych i ogólnie przyj ętych metod statystycznych. Przy porównywaniu 
skutków dla ró żnych dawek nale ży unikać stosowania wielokrotnego porów ­
nywania testem t-Studenta. Metody statystyczne nale ży wybrać podczas 
planowania badania.  
52. Proponuje si ę, aby do celów kontroli jako ści zbiera ć historyczne dane 
kontrolne i oblicza ć współczynniki zmienno ści dla danych liczbowych, 
szczególnie w odniesieniu do parametrów zwi ązanych z wykrywaniem 
substancji zak łócających funkcjonowanie uk ładu hormonalnego. Dane te 
można wykorzysta ć do celów porównawczych przy ocenie bie żących bada ń. 
Sprawozdanie z badania  
53. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść i własności fizykochemiczne,  
— dane identyfikacyjne.  
Nośnik (w stosownych przypadkach)  
— uzasadnienie wyboru no śnika (jeżeli jest inny ni ż woda).  
Zwierzęta badane  
— wykorzystany gatunek/szczep,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki przebywania, pokarm itp.,  
— masa cia ła poszczególnych zwierz ąt na pocz ątku badania,  
— uzasadnienie wyboru gatunku, je śli jest inny ni ż szczur.  
Warunki badania  
— uzasadnienie wyboru poziomu dawek,  
— szczegó ły dotyczące postaci u żytkowej badanej substancji chemicznej/ 
przygotowania pokarmu, osi ągnięte stężenie, stabilno ść i jednorodno ść 
preparatu,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— szczegó ły dotyczące podawania badanej substancji chemicznej,  
— wskaźnik konwersji st ężenia badanej substancji chemicznej 
w pokarmie/wodzie pitnej (ppm) do dawki rzeczywistej (mg/kg masy 
ciała/dzień), jeśli ma to zastosowanie,  
— szczegó łowe informacje na temat jako ści pokarmu i wody.  
Opcjonalne badane punkty ko ńcowe  
— lista opcjonalnych badanych punktów ko ńcowych.  
Wyniki  
— masa cia ła/zmiany masy cia ła, 
— dane dotycz ące spożycia pokarmu oraz wody, w stosownych przypad ­
kach,  
— dane dotycz ące efektu toksycznego wed ług płci i poziomu dawki, w tym 
oznaki toksyczno ści, 
— rodzaj, nasilenie i czas trwania obserwowanych objawów klinicznych 
(tak odwracalnych, jak i nieodwracalnych),  
— oceny aktywno ści sensorycznej, si ły uchwytu i aktywno ści motorycznej,  
— badania hematologiczne wraz z odpowiednimi warto ściami odniesienia,  
— badania biochemii klinicznej wraz z odpowiednimi warto ściami odnie ­
sienia,  
— masa cia ła w momencie eutanazji oraz dane dotycz ące masy organów,  
— wyniki sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników bada ń histopatologicznych,  
— dane dotycz ące wchłaniania, je śli są dostępne, 
— w stosownych przypadkach statystyczne opracowanie wyników.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Działanie androgenowe  jest to zdolno ść substancji chemicznej do dzia łania 
przypominaj ącego dzia łanie naturalnego hormonu androgenowego (np. testoste ­
ronu) w organizmach ssaków.  
Działanie antyandrogenowe  jest to zdolno ść substancji chemicznej do hamo ­
wania dzia łania naturalnego hormonu androgenowego (np. testosteronu) 
w organizmach ssaków.  
Działanie antyestrogenowe  jest to zdolno ść substancji chemicznej do hamo ­
wania dzia łania naturalnego hormonu estrogenowego (np. 17ß-estradiolu) 
w organizmach ssaków.  
Działanie antytyroidowe  jest to zdolno ść substancji chemicznej do hamowania 
działania naturalnego hormonu tarczycy (np. T  3 ) w organizmach ssaków.  
Dawkowanie  jest to okre ślenie ogólne obejmuj ące wysoko ść dawki, cz ęstotli­
wość jej podawania i czas trwania podawania substancji.  
Dawka  jest to ilo ść podawanej badanej substancji chemicznej. Dawk ę wyraża się 
jako mas ę badanej substancji chemicznej na jednostk ę masy cia ła zwierzęcia 
doświadczalnego na dzie ń (np. mg/kg masy cia ła/dzień) lub jako sta łe stężenie 
w diecie.  
Wyraźna toksyczno ść jest to okre ślenie ogólne opisuj ące wyraźne oznaki 
toksyczno ści występujące po podaniu badanej substancji chemicznej. Powinny 
one być wystarczaj ące do oceny ryzyka i takie, że można oczekiwa ć, iż zwięk­
szenie podawanej dawki spowoduje pojawienie si ę silnych oznak toksyczno ści 
i prawdopodobn ą śmiertelno ść. 
NOAEL  jest to skrót oznaczaj ący poziom dawkowania, przy którym nie obser ­
wuje się szkodliwych zmian. Jest to najwy ższy poziom dawkowania, przy 
którym nie obserwuje si ę szkodliwych efektów zwi ązanych z podawaniem 
substancji na skutek jej podawania.  
Działanie estrogenowe  jest to zdolno ść substancji chemicznej do dzia łania przy ­
pominającego dzia łanie naturalnego hormonu estrogenowego (np. 17ß-estradiolu) 
w organizmach ssaków.  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  
Działanie tyroidowe  jest to zdolno ść substancji chemicznej do dzia łania przy ­
pominającego dzia łanie naturalnego hormonu tarczycy (np. T  3 ) w organizmach 
ssaków.  
Walidacja  jest to proces naukowy maj ący na celu scharakteryzowanie wymogów 
operacyjnych i ogranicze ń metody badawczej i wykazanie jej wiarygodno ści oraz 
odpowiednio ści do danego celu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Dodatek 2  
Punkty ko ńcowe zalecane do wykrywania substancji zaburzaj ących 
funkcjonowanie uk ładu hormonalnego w niniejszej metodzie badawczej B.7  
Obowiązkowe punkty ko ńcowe Opcjonalne punkty ko ńcowe 
Masa  
— Jądra 
— Najądrza 
— Nadnercza 
— Prostata + p ęcherzyki nasienne 
wraz z gruczo łami koaguluj ącymi — Jajniki 
— Macica wraz z szyjk ą 
— Tarczyca  
Histopatologia  
— Gonady: 
— Jądra oraz 
— Jajniki 
— Płciowe narz ądy dodatkowe: 
— Najądrza, 
— Prostata + p ęcherzyk nasienny 
wraz z gruczo łami koaguluj ­ 
ącymi 
— Macica wraz z szyjk ą 
— Nadnercze 
— Tarczyca 
— Pochwa — Rozmazy śluzówki pochwy 
— Męskie gruczo ły mlekowe 
— Przysadka mózgowa  
Pomiar poziomu hormonów  
— Poziomy T  3 i T 4 we krwi 
— Poziomy TSH we krwi  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (Pary ż, 1992). Chairman’s Report of the Meeting of the ad hoc 
Working Group of Experts on Systemic Short-term and (Delayed) Neuro ­
toxicity.  
(2) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document nr 60.
 
(3) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
(4) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol Environ. Health 9: 691–704.  
(5) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.  
(6) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 286
 
(7) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 
(8) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 
1998, ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(9) OECD. (2006). Report of the Validation of the Updated Test Guideline 
407: Repeat Dose 28-day Oral Toxicity Study in Laboratory Rats. Series on Testing and Assessment nr 59, ENV/JM/MONO(2006)26.
 
(10) OECD (2002). Detailed Review Paper on the Appraisal of Test Methods 
for Sex Hormone Disrupting Chemicals. Series on Testing and Assessment 
nr 21, ENV/JM/MONO(2002)8.  
(11) OECD (2012). Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals. http://www.oecd.org/document/58/ 0,3343,fr_2649_37407_2348794_1_1_1_37407,00.htm l
 
(12) OECD (2006). Final Summary report of the meeting of the Validation 
Management Group for mammalian testing. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)2.  
(13) OECD. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endoc ­
rine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
(14) OECD (2000). Guidance document on the recognition, assessment and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment nr 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7.  
(15) Haley P, Perry R, Ennulat D, Frame S, Johnson C, Lapointe J-M, Nyska A, 
Snyder PW, Walker D, Walter G (2005). STP Position Paper: Best Practice 
Guideline for the Routine Pathology Evaluation of the Immune System. 
Toxicol Pathol 33: 404–407.  
(16) Hess RA, Moore BJ (1993). Histological Methods for the Evaluation of the 
Testis. In: Methods in Reproductive Toxicology, Chapin RE and Heindel JJ (eds). Academic Press: San Diego, CA, ss. 52–85.
 
(17) Latendresse JR, Warbrittion AR, Jonassen H, Creasy DM.(2002) Fixation 
of testes and eyes using a modified Davidson’s fluid: comparison with Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524–533.
 
(18) OECD (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N°440: Uterot ­
rophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic 
properties.  
(19) OECD (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of 
Endocrine and Reproductive Tests in Rodents ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. TOKSYCZNO ŚĆ PODOSTRA – NARA ŻENIE INHALACYJNE: 
BADANIE 28-DNIOWE  
STRESZCZENIE  
Niniejszą zmienion ą metodę badawcz ą B.8 opracowano w celu otrzymania pe łnej 
charakterystyki toksyczno ści badanej substancji chemicznej wskutek nara żenia 
inhalacyjnego po powtarzanym nara żeniu przez ograniczony okres (28 dni) 
oraz uzyskania danych na potrzeby ilo ściowych ocen ryzyka dotycz ącego nara ­ 
żenia inhalacyjnego. Grupy co najmniej 5 samców i 5 samic gryzoni s ą w ciągu 
28 dni przez 6 godzin dziennie nara żane na dzia łanie: a) badanej substancji 
chemicznej przy co najmniej trzech poziomach st ężenia; b) powietrza filtrowa ­
nego (ujemna grupa kontrolna); lub c) no śnika (grupa kontrolna no śnika). Na 
ogół zwierzęta narażane są na działanie substancji przez 5 dni w tygodniu, ale 
narażenie przez 7 dni w tygodniu równie ż jest dozwolone. Zawsze bada si ę 
samce i samice, lecz je śli wiadomo, że jedna p łeć jest bardziej podatna na 
daną badaną substancj ę chemiczn ą, zwierzęta różnych płci mogą być poddane 
narażeniu przy ró żnych poziomach st ężenia. Metoda ta pozwala kierownikowi 
badania na elastyczno ść, jeżeli chodzi o w łączenie do badania grup satelitarnych 
(badania odwracalno ści), płukania oskrzelowo-p ęcherzykowego, testów neurolo ­
gicznych oraz dodatkowych bada ń z zakresu patologii klinicznej 
i histopatologicznych w celu lepszego scharakteryzowania toksyczno ści badanej 
substancji chemicznej.  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 412 (OECD TG 412) (2009). 
Pierwotną dotyczącą badań podostrej toksyczno ści inhalacyjnej wytyczn ą 
nr 412 (TG 412) przyj ęto w 1981 r. (1). Niniejsza metoda badawcza B.8 
(równowa żna zmienionej wytycznej TG 412) zosta ła zaktualizowana w celu 
odzwierciedlenia stanu wiedzy naukowej oraz zaspokojenia obecnych i przyszłych potrzeb regulacyjnych.
 
2. Niniejsza metoda umo żliwia scharakteryzowanie szkodliwych zmian 
w następstwie powtarzanego codziennego nara żenia inhalacyjnego na dzia ­ 
łanie badanej substancji chemicznej przez 28 dni. Dane pochodz ące z 28- 
dniowych bada ń podostrej toksyczno ści inhalacyjnej mog ą być wykorzysty ­
wane do ilo ściowych ocen ryzyka [o ile nie zostanie nast ępnie przeprowa ­
dzone 90-dniowe badanie toksyczno ści podprzewlek łej wskutek nara żenia 
inhalacyjnego (rozdzia ł B.29 niniejszego za łącznika)]. Z danych tych mo żna 
również uzyskać informacje dotycz ące doboru st ężeń do bada ń dłuższych, 
takich jak 90-dniowe badanie podprzewlek łej toksyczno ści inhalacyjnej. 
Niniejsza metoda badawcza nie jest przeznaczona do badania nanomateria ­ 
łów. Definicje stosowane w kontek ście niniejszej metody badawczej znaj ­
dują się na końcu tego rozdzia łu i w wytycznych (GD) nr 39 (2).  
WSTĘPNE ROZWA ŻANIA  
3. Przed przeprowadzeniem badania laboratorium badawcze powinno wzi ąć 
pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji 
chemicznej w celu poprawienia jako ści badania oraz zminimalizowania 
wykorzystania zwierz ąt. Informacje, które b ędą pomocne w wyborze odpo ­
wiednich badanych st ężeń, mogą obejmowa ć nazwę chemiczn ą, struktur ę 
chemiczn ą i właściwości fizykochemiczne badanej substancji chemicznej; 
wyniki wszelkich bada ń toksyczno ści in vitro  lub in vivo ; przewidywane 
zastosowania i potencjalne nara żenie ludzi; dost ępne dane 
dotyczące (Q)SAR i dane toksykologiczne dotycz ące strukturalnie powi ąza­
nych zwi ązków oraz dane pochodz ące z bada ń ostrej toksyczno ści inhala­
cyjnej. Je żeli w trakcie badania oczekiwana lub obserwowana jest neuroto ­
ksyczność, kierownik badania mo że zdecydowa ć o włączeniu do badania 
odpowiednich ocen, takich jak zestaw bada ń czynno ściowych 
i obserwacyjnych i pomiar aktywno ści motorycznej. Mimo że 
w przypadku okre ślonych bada ń decydujące znaczenie mo że mieć termin 
narażenia na dzia łanie substancji, przeprowadzanie tych dodatkowych czyn ­
ności nie powinno kolidowa ć z podstawowym projektem badania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. Rozcie ńczenia badanych substancji chemicznych maj ących dzia łanie żrące 
lub drażniące można badać przy stężeniach, które dadz ą pożądany stopie ń 
toksyczno ści [zob. GD 39 (2)]. Podczas nara żania zwierz ąt na działanie tych 
substancji st ężenia docelowe powinny by ć na tyle niskie, aby nie powo ­
dować silnego bólu i stresu, a zarazem wystarczaj ące do przed łużenia 
krzywej st ężenie-odpowied ź do poziomów, które pozwalaj ą osiągnąć regu­
lacyjny i naukowy cel badania. St ężenia te nale ży wybiera ć indywidualnie 
dla każdego przypadku, najlepiej w oparciu o odpowiednio zaprojektowane 
badanie ustalaj ące zakres, które dostarcza informacji na temat 
krytycznego punktu ko ńcowego, wszelkich progów powoduj ących dzia łanie 
drażniące oraz czasu pojawienia si ę objawów (zob. pkt 11–13). Nale ży 
podać uzasadnienie wyboru st ężenia.  
5. Zwierz ęta w stanie agonalnym oraz zwierz ęta wykazuj ące oczywiste oznaki 
bólu czy objawy ostrego i przewlek łego stresu powinny zosta ć uśmiercone 
w sposób humanitarny. Zwierz ęta w stanie agonalnym traktuje si ę tak samo 
jak zwierz ęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do 
uśmiercenia zwierz ąt w stanie agonalnym lub cierpi ących silny ból oraz 
wytyczne dotycz ące rozpoznawania prognozowanego lub nieuchronnie zbli ­ 
żającego się zgonu s ą zawarte w wytycznych OECD dotycz ących 
humanitarnego punktu ko ńcowego (3).  
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
6. Nale ży wykorzysta ć powszechnie stosowane laboratoryjne szczepy zdro ­
wych, młodych, doros łych gryzoni. Preferowanym gatunkiem jest szczur. 
Jeżeli wykorzystuje si ę inny gatunek, nale ży podać uzasadnienie.  
Przygotowanie zwierz ąt 
7. Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą być w ciąży. W dniu rando ­
mizacji zwierz ęta powinny by ć młodymi doros łymi osobnikami w wieku od 
7 do 9 tygodni. Masa cia ła powinna mie ścić się w granicach ± 20 % śred­
niej masa dla ka żdej płci. Zwierz ęta są wybierane losowo, oznaczane 
w sposób umo żliwiający identyfikacj ę poszczególnych osobników 
i przetrzymywane w klatkach przynajmniej przez 5 dni przed rozpocz ęciem 
badania, żeby umożliwić aklimatyzacj ę do warunków laboratoryjnych.  
Hodowla zwierz ąt 
8. W celu u łatwienia obserwacji i unikni ęcia pomy łek zwierz ęta powinny by ć 
indywidualnie oznakowane przy pomocy, o ile to mo żliwe, podskórnych 
transponderów. Temperatura w pomieszczeniach, w których przetrzymuje się zwierzęta doświadczalne, powinna wynosi ć 22 ± 3 °C. Najlepiej by łoby, 
gdyby wilgotno ść względna była utrzymywana w przedziale 30–70 %, 
chociaż może to być niemożliwe w przypadku stosowania wody jako 
nośnika. Przed nara żeniem i po nim zwierz ęta na ogó ł należy trzyma ć 
w klatkach w grupach podzielonych wed ług płci i badanego st ężenia, lecz 
liczba zwierz ąt w klatce nie powinna przeszkadza ć w dokładnej obserwacji 
każdego zwierz ęcia, a tak że powinna umo żliwiać zminimalizowanie strat 
w zwierz ętach spowodowanych kanibalizmem i walkami. Je żeli zwierz ęta 
mają być poddane nara żeniu tylko przez nos, konieczne mo że być przyzwy ­
czajenie ich do rur unieruchamiaj ą
cych. Rury unieruchamiaj ące nie powinny 
powodowa ć u zwierz ąt nadmiernego stresu fizycznego, termicznego czy 
związanego z unieruchomieniem. Unieruchomienie mo że wpłynąć na fizjo­
logiczne punkty ko ńcowe, takie jak temperatura cia ła (hipertermia) lub 
minutowa pojemno ść oddechowa. Je żeli dostępne są dane ogólne, na 
podstawie których mo żna wykaza ć, że takie zmiany nie wyst ępują 
w znaczącym stopniu, uprzednia adaptacja do rur unieruchamiaj ących nie 
jest konieczna. Zwierz ęta, których ca ła powierzchnia cia ła jest nara żana na 
działanie aerozolu, w trakcie nara żenia powinny by ć trzymane oddzielnie, 
aby zapobiec filtrowaniu badanego aerozolu przez futro innych zwierz ąt 
w tej samej klatce. Mo żna stosowa ć konwencjonalne oraz certyfikowane 
pasze laboratoryjne, z wyj ątkiem okresów poddawania nara żeniu, nale ży 
także zapewni ć nieograniczony dost ęp do wody pitnej z miejscowej insta ­
lacji wodoci ągowej. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin 
światła, 12 godzin ciemno ści. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Komory inhalacyjne  
9. Przy wyborze komory inhalacyjnej nale ży wziąć pod uwag ę charakter 
badanej substancji chemicznej i przedmiot badania. Preferowan ą drogą nara­ 
żenia jest nara żenie tylko przez nos (poj ęcie to obejmuje nara żenie tylko 
głowy, nara żenie tylko przez nos lub nara żenie tylko pyska). Nara żenie 
tylko przez nos jest na ogó ł preferowane w badaniach aerozoli ciek łych 
lub stałych oraz par, które mog ą skraplać się, tworząc aerozole. Nara żenie 
całego ciała może lepiej sprzyja ć osiągnięciu szczególnych celów badania, 
taki wybór nale ży jednak uzasadni ć w sprawozdaniu z badania. Aby zagwa ­
rantować stabilność atmosfery przy zastosowaniu komory do poddawania 
narażeniu całego ciała, całkowita „obj ętość” badanych zwierz ąt nie powinna 
przekracza ć 5 % obj ętości komory. Zasady technik nara żenia tylko przez 
nos i przez powierzchni ę całego ciała oraz ich szczególne zalety i wady 
omówiono w GD 39 (2).  
BADANIA TOKSYCZNO ŚCI 
Stężenia graniczne  
10. W przeciwie ństwie do bada ń toksyczno ści ostrej w 28-dniowych badaniach 
podostrej toksyczno ści inhalacyjnej nie ma okre ślonych st ężeń granicznych. 
Przy wyborze maksymalnego badanego st ężenia nale ży uwzględnić: 1) 
maksymalne st ężenie możliwe do uzyskania; 2) poziom nara żenia ludzi 
w najgorszym przypadku; 3) konieczno ść utrzymania wystarczaj ącej podaży 
tlenu; lub 4) trosk ę o dobrostan zwierz ąt. W przypadku braku warto ści 
granicznych opartych na danych mo żna stosowa ć granice toksyczno ści 
ostrej okre ślone w rozporz ądzeniu (WE) nr 1272/2008 (13) (tj. do maksy ­
malnego st ężenia 5 mg/l dla aerozoli, 20 mg/l dla par i 20 000 ppm dla 
gazów); zob. GD 39 (2). Je żeli podczas badania gazów lub wysoce lotnych 
badanych substancji chemicznych (np. czynników ch łodniczych) konieczne 
jest przekroczenie tych granic, nale ży podać uzasadnienie. St ężenie 
graniczne powinno wywo ływać wyraźną toksyczno ść bez powodowania 
zbędnego stresu dla zwierz ąt ani wpływania na d ługość ich życia (3).  
Badanie ustalaj ące zakres  
11. Przed rozpocz ęciem badania g łównego mo że być konieczne przeprowa ­
dzenie badania ustalaj ącego zakres. Badanie ustalaj ące zakres jest bardziej 
rozległe niż badanie rozpoznawcze, poniewa ż nie jest ograniczone do 
wyboru st ężenia. Wiedza zdobyta poprzez badanie ustalaj ące zakres mo że 
doprowadzi ć do powodzenia badania g łównego. Badanie ustalaj ące zakres 
może na przyk ład dostarcza ć informacji technicznych na temat metod anali ­
tycznych, klasyfikacji cz ąstek wed ług wielko ści, odkrycia mechanizmów 
toksycznych, danych z zakresu patologii klinicznej i histopatologicznych 
oraz oszacowa ń NOAEL i MTC (ang.  maximum tolerable concentration  – 
maksymalne tolerowane st ężenie) w badaniu g łównym. Kierownik badania 
może postanowi ć wykorzysta ć badanie ustalaj ące zakres do okre ślenia 
progu dzia łania drażniącego na drogi oddechowe (np. przy pomocy histo ­
patologii dróg oddechowych, badania czynno ści płuc lub p łukania 
oskrzelowo-p ęcherzykowego), górnego poziomu st ężenia, który jest tolero ­
wany bez zb ędnego stresu dla zwierz ąt, oraz parametrów, które najlepiej 
scharakteryzuj ą toksyczno ść badanej substancji chemicznej.  
12. Badanie ustalaj ące zakres mo że obejmowa ć jeden poziom st ężenia lub 
większą ich liczb ę. Na dzia łanie każdego stężenia należy narażać nie więcej 
niż trzech samców i trzy samice. Badanie ustalaj ące zakres powinno trwa ć 
co najmniej 5 dni i zazwyczaj nie wi ęcej niż 14 dni. Uzasadnienie wyboru 
stężeń na potrzeby badania g łównego nale ży podać w sprawozdaniu 
z badania. Celem badania g łównego jest wykazanie zale żności stężenie- 
odpowied ź w oparciu o przewidywany najczulszy punkt ko ńcowy. Najlepiej 
byłoby, gdyby najni ższe stężenie było stężeniem, przy którym nie obserwuje 
się szkodliwych zmian, natomiast najwy ższe stężenie powinno wywo ływać 
wyraźną toksyczno ść bez powodowania zb ędnego stresu dla zwierz ąt ani 
wpływania na d ługość ich życia (3).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Przy wyborze poziomów st ężenia na potrzeby badania ustalaj ącego zakres 
należy wziąć pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje, w tym zale żności 
struktura-aktywno ść i dane dotycz ące podobnych chemikaliów (zob. pkt 3). 
W ramach badania ustalaj ącego zakres mo żna zweryfikowa ć/obalić punkty 
końcowe, które uwa ża się za najczulsze oparte na mechanistycznym modelu 
punkty, np. inhibicj ę pseudocholinesterazy przez zwi ązki fosforoorganiczne, 
tworzenie methemoglobiny przez zwi ązki toksyczne dla erytrocytów, 
hormony tarczycy (T  3 , T 4 ) w odniesieniu do zwi ązków tyreotoksycznych, 
białka, LDH lub neutrofile w p łukaniu oskrzelowo-p ęcherzykowym 
w odniesieniu do nieszkodliwych s łabo rozpuszczalnych cz ąstek lub aerozoli 
mających dzia łanie drażniące na płuca. 
Badanie g łówne  
14. Główne badanie toksyczno ści podostrej na ogó ł obejmuje trzy poziomy 
stężenia, a tak że w razie potrzeby równoleg łe ujemne (poddane dzia łaniu 
powietrza) grupy kontrolne lub grupy kontrolne no śnika (zob. pkt 17). Jako 
pomoc w wyborze odpowiednich poziomów nara żenia nale ży wykorzysta ć 
wszystkie dost ępne dane, w tym wyniki bada ń toksyczno ści ogólnoustrojo ­
wej, metabolizmu i kinetyki (szczególn ą uwagę należy zwrócić na unikanie 
wysokich st ężeń, które prowadz ą do nasycenia procesów kinetycznych). 
W skład każdej badanej grupy wchodzi co najmniej 10 gryzoni (5 samców 
i 5 samic), które s ą narażane na dzia łanie badanej substancji chemicznej 
przez 6 godzin dziennie, 5 dni w tygodniu, przez okres 4 tygodni (ca łkowity 
czas trwania badania wynosi 28 dni). Zwierz ęta mogą być również 
poddawane nara żeniu przez 7 dni w tygodniu (np. podczas badania wziew ­
nych produktów farmaceutycznych). Je śli wiadomo, że jedna p łeć jest 
bardziej podatna na dzia łanie danej badanej substancji chemicznej, osobniki 
różnej płci mogą być narażane na dzia łanie tej substancji przy ró żnych 
poziomach st ężenia, aby zoptymalizowa ć zależność stężenie-odpowied ź 
zgodnie z pkt 15. Je śli gatunki gryzoni inne ni ż szczury poddaje si ę nara­ 
żeniu tylko przez nos, maksymalne okresy nara żenia można dostosowa ć, by 
zminimalizowa ć charakterystyczny dla danego gatunku stres. W przypadku 
stosowania okresu nara żenia krótszego ni ż 6 godzin dziennie lub gdy 
konieczne jest przeprowadzenie badania d ługotrwałego nara żenia całego 
ciała (np. przez 22 godziny dziennie), nale ży przedstawi ć uzasadnienie 
[zob. GD 39 (2)]. W okresie nara żenia należy zaprzesta ć podawania zwie ­
rzętom paszy, chyba że okres ten przekracza 6 godzin. Podczas ca łego 
okresu poddawania nara żeniu całego ciała można zapewni ć dostęp do wody.  
15. Wybrane st ężenia docelowe powinny oddzia ływać na organy docelowe 
i wykazywa ć wyraźną zależność stężenie-odpowied ź: 
— wysokie st ężenie powinno prowadzi ć do skutków toksycznych, ale nie 
powinno powodowa ć przewlek łych objawów lub śmiertelno ści, które 
uniemożliwiłyby miarodajn ą ocenę, 
— pośrednie stężenia powinny by ć tak zróżnicowane, aby osi ągnąć stop­
niowanie skutków toksycznych powodowanych przez st ężenie najni ższe 
i najwyższe, 
— najniższe stężenie powinno nie dawa ć żadnych objawów toksyczno ści 
bądź dawać niewielkie objawy.  
Badanie satelitarne (badanie odwracalno ści) 
16. Badanie satelitarne (badanie odwracalno ści) może być wykorzystywane do 
obserwacji odwracalno ści, trwałości lub opó źnionego wyst ąpienia toksycz ­
ności przez odpowiednio d ługi okres po poddaniu dzia łaniu substancji, 
jednak przez nie mniej ni ż 14 dni. Grupy satelitarne (grupy w badaniu 
odwracalno ści) składają się z pięciu samców i pi ęciu samic poddanych 
narażeniu równocze śnie ze zwierz ętami doświadczalnymi w badaniu g łów­
nym. Grupy satelitarne (grupy w badaniu odwracalno ści) powinny by ć nara­ 
żone na dzia łanie badanej substancji chemicznej przy najwy ższym stężeniu, 
a w razie potrzeby nale ży zastosowa ć równoleg łe grupy kontrolne poddane 
działaniu powietrza lub grupy kontrolne no śnika (zob. pkt 17).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Zwierzęta z grupy kontrolnej  
17. Zwierz ęta z równoleg łej ujemnej grupy kontrolnej (poddanej dzia łaniu 
powietrza) powinny by ć traktowane w taki sam sposób jak zwierz ęta 
z grupy badanej, wyj ąwszy fakt, że są one nara żane na dzia łanie filtrowa ­
nego powietrza zamiast badanej substancji chemicznej. W przypadku gdy do 
ułatwienia wytworzenia atmosfery na potrzeby badania stosowana jest woda 
lub inna substancja, do badania nale ży włączyć grupę kontroln ą nośnika 
zamiast ujemnej grupy kontrolnej (poddanej dzia łaniu powietrza). 
W miarę możliwości wykorzystywanym no śnikiem powinna by ć woda. 
Jeżeli w charakterze no śnika używana jest woda, zwierz ęta z grupy kontro ­
lnej powinny by ć narażone na dzia łanie powietrza o takiej samej wilgotno ści 
względnej jak grupy nara żone na dzia łanie danej substancji. Wybór 
odpowiedniego no śnika powinien opiera ć się na właściwie przeprowa ­
dzonym badaniu wst ępnym lub danych historycznych. Je żeli toksyczno ść 
nośnika nie jest dobrze znana, kierownik badania mo że postanowi ć 
o zastosowaniu zarówno ujemnej grupy kontrolnej (poddanej dzia łaniu 
powietrza), jak i grupy kontrolnej no śnika, lecz jest to zdecydowanie odra ­
dzane. Je śli dane historyczne wskazuj ą na to, że nośnik jest nietoksyczny, 
nie ma potrzeby stosowania ujemnej grupy kontrolnej (poddanej dzia łaniu 
powietrza) i nale ży jedynie wykorzysta ć grupę kontroln ą nośnika. Jeśli 
badanie wst ępne badanej substancji chemicznej zawartej w no śniku nie 
wskazuje na toksyczno ść, wynika z tego, że dany no śnik jest nietoksyczny 
przy badanym st ężeniu i że należy zastosowa ć grupę kontrolną tego nośnika.  
WARUNKI NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE SUBSTANCJI  
Stosowanie st ężeń 
18. Zwierz ęta są poddawane nara żeniu na dzia łanie badanej substancji 
chemicznej w formie gazu, pary, aerozolu lub mieszaniny tych postaci. 
Stan fizyczny, który ma by ć przedmiotem badania, zale ży od właściwości 
fizykochemicznych badanej substancji chemicznej, wybranego st ężenia lub 
postaci fizycznej, która najprawdopodobniej b ędzie wyst ępować podczas 
postępowania z badan ą substancj ą chemiczn ą i jej stosowania. Badane 
substancje chemiczne o charakterze higroskopijnym oraz reaktywne chemicznie nale ży badać w suchej atmosferze. Nale ży zachowa ć ostrożność, 
aby unikn ąć osiągnięcia stężenia wybuchowego. Cz ąstki stałe można poddać 
procesom mechanicznym w celu zmniejszenia wielko ści cząstek. Dalsze 
wytyczne przedstawiono w GD 39 (2).
 
Rozkład wielko ści cząstek 
19. W odniesieniu do wszystkich aerozoli oraz par, które mog ą skraplać się, 
tworząc aerozole, nale ży dokona ć klasyfikacji cz ąstek wed ług wielko ści. 
W celu umo żliwienia nara żenia wszystkich odpowiednich cz ęści dróg odde ­
chowych na dzia łanie danej substancji zalecane s ą aerozole o średnicy aero ­
dynamicznej mediany rozk ładu masowego (MMAD) wynosz ącej od 1 do 
3 μm przy geometrycznym standardowym odchyleniu ( σ g ) równym od 1,5 
do 3,0 (4). Nale ży dołożyć rozsądnych stara ń, aby spe łnić tę normę, jednak 
w razie niemo żności jej osiągnięcia należy przedstawi ć ocenę eksperta. Na 
przykład cząstki par metali b ędą mniejsze od tej normy, a na ładowane 
cząstki i włókna mog ą ją przekracza ć. 
Przygotowanie badanej substancji chemicznej w no śniku  
20. Najlepiej by łoby analizowa ć badaną substancj ę chemiczn ą bez nośnika. 
Jeżeli w celu osi ągnięcia odpowiedniego st ężenia i wielko ści cząstek 
badanej substancji chemicznej konieczne jest stosowanie no śnika, prefero ­
wanym no śnikiem powinna by ć woda. Zawsze kiedy badana substancja 
chemiczna jest rozpuszczona w no śniku, nale ży wykaza ć jej stabilno ść. 
MONITOROWANIE WARUNKÓW NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE 
SUBSTANCJI  
Przepływ powietrza w komorze  
21. Przep ływ powietrza przez komor ę inhalacyjn ą powinien by ć dokładnie 
kontrolowany, monitorowany w sposób ci ągły i rejestrowany przynajmniej 
co godzin ę podczas ka żdego nara żenia. Monitorowanie w czasie rzeczy ­
wistym st ężenia (lub jego czasowej stabilno ści) badanej substancji 
w atmosferze do świadczalnej jest ca łościowym pomiarem wszystkich para ­
metrów dynamicznych i stanowi po średni sposób kontrolowania wszystkich  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 292
 
istotnych dynamicznych parametrów inhalacyjnych. Je śli stężenie jest moni ­
torowane w czasie rzeczywistym, cz ęstotliwość pomiaru przep ływu 
powietrza mo że być zmniejszona do jednego pomiaru dziennie na nara żenie. 
Szczególn ą uwagę należy zwróci ć na unikanie ponownego wdychania 
w komorach s łużących do nara żania tylko przez nos. St ężenie tlenu powinno 
wynosić co najmniej 19 %, a st ężenie dwutlenku w ęgla nie powinno prze ­
kraczać 1 %. Je żeli istniej ą powody, by przypuszcza ć, że normy tej nie 
można osiągnąć, należy mierzy ć stężenia tlenu i dwutlenku w ęgla. Jeśli 
w pierwszym dniu nara żenia pomiary wyka żą, że stężenia tych gazów s ą 
odpowiednie, dalsze pomiary nie powinny by ć konieczne.  
Temperatura i wilgotno ść względna w komorze  
22. W komorze nale ży utrzymywa ć temperatur ę na poziomie 22 ± 3 °C. Wilgot ­
ność względna w strefie oddychania zwierz ąt powinna by ć stale monitoro ­
wana i rejestrowana co godzin ę podczas ka żdego nara żenia, jeżeli to 
możliwe, zarówno w przypadku nara żenia tylko przez nos, jak i nara żenia 
całego ciała. Wilgotno ść względna powinna by ć utrzymywana w przedziale 
od 30 do 70 %, lecz mo że to być albo nieosi ągalne (np. przy badaniu 
mieszanin na bazie wody), albo niemierzalne z powodu interferencji badanej 
substancji chemicznej z metod ą badawcz ą. 
Badana substancja chemiczna: st ężenie nominalne  
23. Tam, gdzie to mo żliwe, nale ży obliczy ć i zarejestrowa ć stężenie nominalne 
w komorze badawczej. St ężenie nominalne jest to masa wytworzonej 
badanej substancji chemicznej podzielona przez ca łkowitą objętość 
powietrza przepuszczonego przez uk ład komory inhalacyjnej. St ężenie 
nominalne nie s łuży do charakteryzowania nara żenia zwierz ąt, lecz porów ­
nanie stężenia nominalnego i st ężenia rzeczywistego umo żliwia okre ślenie 
w przybli żeniu efektywno ści wytwarzania w uk ładzie badawczym, a tym 
samym mo żna je wykorzysta ć do wykrywania problemów z wytwarzaniem.  
Badana substancja chemiczna: st ężenie rzeczywiste  
24. Stężenie rzeczywiste to st ężenie badanej substancji chemicznej w próbkach 
pobranych w strefie oddychania zwierz ąt w komorze inhalacyjnej. St ężenie 
rzeczywiste mo żna obliczy ć za pomoc ą metod specyficznych (np. 
bezpośredniego pobierania próbek, metod adsorpcji lub reakcji chemicznej, 
a następnie charakterystyki analitycznej) lub metod niespecyficznych, takich 
jak analiza grawimetryczna przy zastosowaniu filtra. Zastosowanie metody 
grawimetrycznej jest akceptowalne tylko w przypadku aerozoli proszkowych 
zawierających jeden sk ładnik lub aerozoli cieczy o niskiej lotno ści i należy 
wtedy przed badaniem wykona ć odpowiedni ą, specyficzn ą dla badanej 
substancji chemicznej charakterystyk ę. Za pomoc ą metody grawimetrycznej 
można równie ż określić stężenie wielosk ładnikowego aerozolu proszko ­
wego. Do tego jednak konieczne s ą dane analityczne, za pomoc ą których 
można wykaza ć, że skład materia łu znajduj ącego się w powietrzu jest 
podobny do sk ładu materia łu wyjściowego. W razie braku takich informacji 
może być konieczna ponowna analiza badanej substancji chemicznej (naj ­
lepiej znajduj ącej się w powietrzu) w toku badania, w regularnych odst ępach 
czasowych. W przypadku środków w formie aerozoli, które mog ą ulec 
odparowaniu lub sublimacji, nale ży wykaza ć, że stosując wybran ą metodę, 
zebrano wszystkie fazy.  
25. O ile to mo żliwe, przez ca ły czas trwania badania nale ży używać jednej 
partii badanej substancji chemicznej, a badana próbka powinna by ć prze­
chowywana w warunkach zapewniaj ących zachowanie jej czysto ści, jedno­
rodności i stabilno ści. Przed rozpocz ęciem badania nale ży scharakteryzowa ć 
badaną substancj ę chemiczn ą, w tym okre ślić jej czysto ść oraz, o ile jest to 
wykonalne z technicznego punktu widzenia, to żsamość oraz ilości zidenty ­
fikowanych domieszek i zanieczyszcze ń. Można to przedstawi ć między 
innymi za pomoc ą następujących danych: czasu retencji i wzgl ędnej 
powierzchni sygna łu, masy cz ąsteczkowej uzyskanej w drodze spektrometrii 
masowej lub chromatografii gazowej b ądź innych oszacowa ń. Mimo że 
tożsamość badanej próbki nie nale ży do obowi ązków laboratorium badaw ­
czego, rozs ądne może być potwierdzenie przez to laboratorium charaktery ­
styki, któr ą przedstawi ł sponsor, przynajmniej w ograniczonym zakresie (np. 
koloru, cech fizycznych itp.).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 293
 
26. Podczas nara żenia nale ży utrzymywa ć możliwie niezmienn ą atmosfer ę 
doświadczaln ą. W celu wykazania stabilno ści warunków nara żenia można 
wykorzysta ć urządzenie umo żliwiające monitorowanie w czasie rzeczywis ­
tym, takie jak fotometr w przypadku aerozoli lub analizator w ęglowodorów 
całkowitych w przypadku par. St ężenie rzeczywiste w komorze powinno 
być mierzone co najmniej 3 razy w ci ągu każdego dnia nara żenia dla 
każdego poziomu nara żenia. Jeśli nie jest to mo żliwe ze wzgl ędu na ograni ­
czone nat ężenie przep ływu powietrza lub niskie st ężenie, dopuszczalne jest 
pobieranie jednej próbki na okres nara żenia. Najlepiej by łoby, gdyby 
w takim przypadku próbka by ła pobierana przez ca ły okres nara żenia. 
Poszczególne próbki st ężenia w komorze nie powinny odbiega ć od śred­
niego stężenia w komorze o wi ęcej niż ± 10 % dla gazów i par oraz 
o więcej niż ± 20 % dla aerozoli ciek łych lub sta łych. Nale ży obliczy ć 
i podać okres wyrównania st ężeń w komorze (t  95 ). Czas trwania nara żenia 
obejmuje czas wprowadzania badanej substancji chemicznej do komory. Uwzględnia się w tym okres wyrównania st ężeń w komorze (t
 95 ) i czas 
rozpadu. Wytyczne dotycz ące szacowania t  95 można znaleźć w GD 39 (2).  
27. W przypadku bardzo z łożonych mieszanin sk ładających się z gazów/par 
i aerozoli (np. w przypadku atmosfery spalania i badanych substancji 
chemicznych wydzielanych ze specjalnych produktów/urz ądzeń do zastoso ­
wania ko ńcowego) ka żda faza mo że zachowywa ć się inaczej w komorze 
inhalacyjnej. W zwi ązku z tym nale ży wybrać co najmniej jedn ą substancj ę 
wskaźnikową (analit) dla ka żdej fazy (gaz/pary i aerozol), zwykle g łówną 
substancję czynną w mieszaninie. Je żeli badana substancja chemiczna jest 
mieszanin ą, należy podać stężenie analityczne w odniesieniu do ca łej 
mieszaniny, a nie tylko sk ładnika aktywnego lub substancji wska źnikowej 
(analitu). Dodatkowe informacje na temat st ężeń rzeczywistych mo żna 
znaleźć w GD 39 (2).  
Badana substancja chemiczna: rozk ład wielko ści cząstek 
28. Rozk ład wielko ści cząstek aerozoli nale ży określać co najmniej raz 
w tygodniu w odniesieniu do ka żdego poziomu st ężenia za pomoc ą impak­
tora kaskadowego lub innego instrumentu, takiego jak aerodynamiczny spektrometr pomiaru cz ąstek. Jeżeli można wykaza ć równowa żność 
wyników uzyskanych za po średnictwem impaktora kaskadowego i innego 
instrumentu, to ten inny instrument mo że być stosowany przez ca ły okres 
badania.
 
29. W celu potwierdzenia sprawno ści zatrzymywania cz ąstek przez instrument 
główny nale ży równolegle do tego instrumentu stosowa ć drugie urz ądzenie, 
takie jak filtr grawimetryczny lub odpylacz/be łkotka. Stężenie masowe uzys ­
kane na podstawie analizy wielko ści cząstek powinno mie ścić się 
w rozsądnych granicach st ężenia masowego uzyskanego poprzez analiz ę 
filtrów [zob. GD 39 (2)]. Dalsze pomiary potwierdzaj ące można pomin ąć, 
jeśli można wykaza ć równowa żność w odniesieniu do wszystkich st ężeń 
badanych w pocz ątkowej fazie badania. Ze wzgl ędu na dobrostan zwierz ąt 
należy podjąć środki maj ące na celu zminimalizowanie ilo ści danych niejed ­
noznacznych, które mog ą spowodowa ć konieczno ść powtórzenia badania.  
30. Klasyfikacj ę cząstek według wielko ści należy przeprowadzi ć w odniesieniu 
do par, je żeli istnieje jakakolwiek mo żliwość tworzenia si ę aerozolu 
wskutek kondensacji par lub je śli cząstki są wykrywane w atmosferze 
parowej maj ącej potencja ł tworzenia faz mieszanych.  
OBSERWACJE  
31. Zwierz ęta powinny by ć poddane obserwacji klinicznej przed okresem nara ­ 
żenia, w jego trakcie i po nim. W zale żności od reakcji zwierz ąt podczas 
narażenia wskazane mo że być częstsze dokonywanie obserwacji. Je żeli 
obserwacja zwierz ąt jest utrudniona wskutek zastosowania rur unierucha ­
miających zwierz ęta, słabo oświetlonych komór do nara żania całego ciała 
lub nieprzejrzysto ści powietrza, zwierz ęta powinny by ć uważnie obserwo ­
wane po nara żeniu. W ramach obserwacji przed kolejnym dniem nara żenia 
można ocenić odwracalno ść lub nasilenie skutków toksycznych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 294
 
32. Wszystkie obserwacje s ą systematycznie zapisywane, przy czym 
w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia prowadzone s ą indywidualne rejestry. 
W przypadku u śmiercenia zwierz ąt z przyczyn humanitarnych lub stwier ­
dzenia ich zgonu nale ży możliwie najdok ładniej zapisa ć czas zgonu.  
33. Obserwacje zwierz ąt w klatkach powinny obejmowa ć zmiany skóry i sier ści, 
oczu i błon śluzowych; zmiany w uk ładzie oddechowym i uk ładzie krąże­
nia; zmiany w uk ładzie nerwowym oraz zmiany w aktywno ści somatycznej 
i sposobie zachowania si ę. Należy poświęcić uwagę obserwacjom dr żenia, 
konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Pomiar temperatury 
w odbycie mo że dostarczy ć dodatkowych dowodów potwierdzaj ących 
odruchowe spowolnienie oddechu lub hipo-/hipertermi ę w zwi ązku 
z poddawaniem dzia łaniu substancji lub przetrzymywaniem w zamkni ęciu. 
W protokole badania mo żna uwzgl ędnić dodatkowe oceny, takie jak 
dotyczące: kinetyki, biomonitoringu, czynno ści płuc, zatrzymywania s łabo 
rozpuszczalnych substancji, które gromadz ą się w tkance p łuc, oraz zmian 
w zachowaniu.  
MASA CIA ŁA 
34. Masę ciała poszczególnych zwierz ąt należy odnotowa ć tuż przed pierwszym 
narażeniem (dzie ń 0), następnie dwa razy w tygodniu (na przyk ład w piątki 
i poniedzia łki, aby wykaza ć zdrowienie przez weekend, kiedy nie dochodzi 
do narażenia, lub w odst ępach czasu pozwalaj ących na ocen ę toksyczno ści 
ogólnoustrojowej) oraz w chwili zgonu lub eutanazji. Je żeli w ciągu pierw­
szych 2 tygodni nie wyst ąpią żadne skutki, przez pozosta ły czas badania 
masę ciała można mierzy ć co tydzie ń. Zwierzęta z grupy satelitarnej (grupy 
w badaniu odwracalno ści) (jeżeli są wykorzystywane) nale ży ważyć co 
tydzień przez cały okres zdrowienia. Na koniec badania wszystkie zwierz ęta 
należy zważyć tuż przed u śmierceniem, aby umo żliwić obiektywne obli ­
czenie stosunku masy poszczególnych organów do masy cia ła. 
SPOŻYCIE POKARMU I WODY  
35. Spożycie pokarmu nale ży mierzyć raz w tygodniu. Spo życie wody równie ż 
można mierzy ć. 
PATOLOGIA KLINICZNA  
36. Oceny z zakresu patologii klinicznej nale ży przeprowadza ć dla wszystkich 
zwierząt, w tym zwierz ąt z grupy satelitarnej (grupy w badaniu odwracal ­
ności), gdy s ą one uśmiercane. Nale ży odnotowa ć odstęp czasu pomi ędzy 
zakończeniem nara żenia a pobraniem krwi, szczególnie gdy odtworzenie 
danego punktu ko ńcowego zachodzi szybko. Pobranie próbek po zako ń­
czeniu nara żenia wskazane jest w przypadku tych parametrów, które charak ­
teryzują się krótkim okresem pó łtrwania w osoczu (np. COHb, CHE 
i MetHb).  
37. Tabela 1 zawiera wykaz parametrów analizy patologicznej, które s ą na ogół 
wymagane we wszystkich badaniach toksykologicznych. Badanie moczu nie 
jest wymagane jako badanie rutynowe, lecz mo żna je wykona ć, gdy zostanie 
to uznane za przydatne na podstawie spodziewanej lub obserwowanej toksyczno ści. Kierownik badania mo że zdecydowa ć o ocenie dodatkowych 
parametrów, aby lepiej scharakteryzowa ć toksyczno ść badanej substancji 
chemicznej (np. pseudocholinesterazy, lipidów, hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, methemoglobiny lub cia łek Heinza, kinazy kreatyno ­
wej, stosunku komórek mieloidalnych do erytroidalnych, troponin, gazów 
krwi tętniczej, dehydrogenazy mleczanowej, dehydrogenazy sorbitolowej, 
dehydrogenazy glutaminianowej oraz gamma-glutamylotranspeptydazy).
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 295
 
Tabela 1  
Standardowe parametry analizy patologicznej  
Hematologia  
Liczba czerwonych krwinek 
Hematokryt 
Stężenie hemoglobiny 
Średnia masa hemoglobiny w krwince 
czerwonej 
Średnia obj ętość krwinki czerwonej 
Średnie st ężenie hemoglobiny 
w krwince czerwonej 
Retikulocyty Całkowita liczba leukocytów 
Różnicowa liczba leukocytów 
Liczba płytek krwi 
Krzepliwo ść (wybra ć jedną 
opcję): 
— Czas protrombinowy 
— Czas krzepni ęcia 
— Czas cz ęściowej trombopla ­
styny po aktywacji  
Chemia kliniczna  
Glukoza (*) 
Cholesterol ca łkowity 
Trójglicerydy 
Azot mocznikowy we krwi Bilirubina ca łkowita 
Kreatynina 
Białko całkowite 
Albumina Globulina Aminotransferaza alaninowa 
Aminotransferaza asparaginia ­
nowa 
Fosfataza alkaliczna Potas Sód 
Wapń 
Fosfor Chlorek
 
Badanie moczu (opcjonalne)  
Wygląd (barwa i m ętność) 
Objętość 
Ciężar właściwy lub osmolalno ść 
pH Białko całkowite 
Glukoza Krew/komórki krwi
 
(*) Poniewa ż długi okres wstrzymywania podawania pokarmu mo że prowadzi ć do 
błędów systematycznych w pomiarach glukozy u zwierz ąt poddawanych dzia łaniu 
substancji w porównaniu ze zwierz ętami z grupy kontrolnej, kierownik badania powi ­
nien zdecydowa ć, czy wstrzymanie karmienia zwierz ąt jest właściwe. Jeżeli stosowane 
jest wstrzymanie podawania pokarmu, jego okres powinien by ć odpowiedni dla wyko ­
rzystywanych gatunków zwierz ąt; w przypadku szczura mo że to by ć 16 
h (niekarmienie przez noc). Oznaczenie glukozy na czczo mo żna przeprowadzi ć po 
wstrzymaniu podawania po żywienia przez ca łą noc w ciągu ostatniego tygodnia nara ­ 
żenia lub po ca łonocnym niekarmieniu przed sekcj ą zwłok (w tym ostatnim przypadku 
wraz z pomiarem wszystkich innych parametrów analizy patologicznej).  
38. Jeżeli istniej ą dowody na to, że dolne drogi oddechowe (tj. p ęcherzyki 
płucne) są głównym miejscem osadzania si ę i zatrzymywania danej substan ­
cji, preferowan ą techniką ilościowej analizy hipotetycznych parametrów 
efektu dawki zwi ązanych z zapaleniem p ęcherzyków p łucnych, zapaleniem 
płuc i fosfolipidoz ą może być płukanie oskrzelowo-p ęcherzykowe. Umo ż­
liwia to w łaściwe zbadanie zale żności dawka-odpowied ź i zmian uszkodze ń 
pęcherzyków p łucnych w funkcji czasu. Pop łuczyny oskrzelowo-p ęcherzy­
kowe mo żna badać pod kątem całkowitej i ró żnicowej liczby leukocytów, 
białka całkowitego oraz dehydrogenazy mleczanowej. Innymi parametrami, 
które mo żna wziąć pod uwag ę, są te, które wskazuj ą na uszkodzenia lizo ­
somów, fosfolipidoz ę, zwłóknienie oraz stan zapalny wskutek podra żnienia 
lub stan alergiczny, który mo że wymaga ć oznaczenia cytokin/chemokin 
prozapalnych. Pomiary pop łuczyn oskrzelowo-p ęcherzykowych na ogó ł 
uzupełniają wyniki bada ń histopatologicznych, lecz nie mog ą ich zastępo­
wać. Wytyczne dotycz ące przeprowadzania p łukania oskrzelowo-p ęcherzy­
kowego mo żna znaleźć w GD 39 (2).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
WYRAŹNE ZMIANY PATOLOGICZNE I MASA ORGANÓW  
39. Wszystkie badane zwierz ęta, w tym te, które pad ły podczas badania lub 
zostały wyeliminowane z badania ze wzgl ędu na ich dobrostan, powinny 
zostać poddane ca łkowitemu wykrwawieniu (je żeli to mo żliwe) i pe łnemu 
rozpoznaniu histopatologicznemu. Nale ży odnotowa ć czas pomi ędzy zakoń­
czeniem ostatniego nara żenia każdego zwierz ęcia a jego u śmierceniem. 
Jeżeli sekcji zw łok nie mo żna przeprowadzi ć natychmiast po znalezieniu 
martwego zwierz ęcia, zwierz ę należy schłodzić (nie zamrozi ć) do tempera ­
tury wystarczaj ąco niskiej do zminimalizowania autolizy. Sekcj ę zwłok 
należy przeprowadzi ć możliwie szybko, zwykle w ci ągu jednego lub 
dwóch dni. W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia należy odnotowa ć 
wszystkie makroskopowe zmiany patologiczne ze szczególnym uwzgl ędnie­
niem wszelkich zmian w drogach oddechowych.  
40. Tabela 2 zawiera wykaz organów i tkanek, które nale ży zachowa ć 
w odpowiednim środku w trakcie pe łnego rozpoznania histopatologicznego 
na potrzeby badania histopatologicznego. Organy i tkanki [wymienione 
w nawiasach kwadratowych] oraz wszelkie inne organy i tkanki mo żna 
zachować według uznania kierownika badania. Organy wymienione  
czcionką pogrubion ą należy okroić i zważyć w stanie wilgotnym 
niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu unikni ęcia wyschni ęcia. 
Tarczycę i najądrza nale ży zważyć wyłącznie wówczas, gdy jest to 
konieczne, poniewa ż okrajanie artefaktów mo że utrudnić ocenę histopatolo ­
giczną. Tkanki i organy nale ży utrwali ć w 10 % roztworze buforowanej 
formaliny lub innej odpowiedniej substancji utrwalaj ącej niezw łocznie po 
przeprowadzeniu sekcji zw łok i nie pó źniej niż na 24–48 godzin przed 
okrojeniem, w zale żności od stosowanej substancji utrwalaj ącej. 
Tabela 2  
Organy i tkanki zachowywane w trakcie pe łnego rozpoznania histopatologicznego  
Nadnercza  
Szpik kostny (lub świeży aspirat)  
Mózg  (w tym wycinki kresomózgowia, 
móżdżku i rdzenia/mostu)  
[Oczy (siatkówka, nerw wzrokowy) 
i powieki]  
Serce  
Nerki  
Krtań (3 poziomy, w tym 1 zawieraj ący 
podstawę nagłośni) 
Wątroba  
Płuco (wszystkie p łaty na jednym poziomie, 
w tym oskrzela g łówne)  
Węzły chłonne z okolicy wn ęki płuca, szcze ­
gólnie w przypadku bada ń słabo rozpuszczal ­
nych badanych substancji chemicznych mających posta ć cząstek stałych. Na potrzeby 
bardziej pog łębionych bada ń lub bada ń 
immunologicznych mo żna wziąć pod uwag ę 
dodatkowe w ęzły chłonne, np. z cz ęści śród­
piersiowej, szyjnej/pod żuchwowej lub usznej.
 
Tkanki nosogard ła (co najmniej 4 poziomy; 1 
poziom ma obejmowa ć przewód 
nosowo-gard łowy i tkank ę limfatyczn ą 
związaną ze śluzówką nosa (NALT))  
Przełyk 
[Opuszka w ęchowa]  
Jajniki  Pęcherzyki nasienne  
Rdzeń kręgowy (odcinek szyjny, śródpier­
siowy i l ędźwiowy)  
Śledziona  
Żołądek 
Jądra 
Grasica  
Tarczyca  
Tchawica (co najmniej 2 wycinki,  
w tym 1 wycinek pobrany pod łużnie 
poprzez ostrog ę i 1 wycinek pobrany  
poprzecznie)  
[Pęcherz moczowy]  
Macica  
Wszystkie makroskopowe zmiany patolo ­
giczne  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Płuca należy usunąć w stanie nienaruszonym, zwa żyć i zaaplikowa ć odpo­
wiednią substancj ę utrwalaj ącą pod ciśnieniem 20–30 cm wody celem 
zapewnienia utrzymania ich struktury (5). Wycinki nale ży pobrać dla 
wszystkich p łatów na jednym poziomie, w tym z oskrzeli g łównych, lecz 
w przypadku przeprowadzania p łukania oskrzelowo-p ęcherzykowego 
z nieprzep łukanego p łatu należy pobrać wycinki na trzech poziomach (nie 
szeregowo).  
42. Nale ży zbadać co najmniej 4 poziomy tkanek nosogard ła, z których jeden 
powinien obejmowa ć przewód nosowo-gard łowy (5, 6, 7, 8, 9), aby umo ż­
liwić odpowiednie zbadanie nab łonka płaskiego, przej ściowego (oddecho ­
wego nieurz ęsionego), oddechowego (oddechowego urz ęsionego) 
i węchowego, a tak że tkanki limfatycznej zwi ązanej ze śluzówką nosa 
(NALT; 10, 11). Nale ży zbadać trzy poziomy krtani, a jeden z tych 
poziomów powinien obejmowa ć podstaw ę nagłośni (12). Nale ży zbadać 
co najmniej dwa poziomy tchawicy, w tym pobra ć jeden wycinek pobrany 
podłużnie przez ostrog ę rozgałęzienia oskrzeli pozap łucnych i jeden 
wycinek pobrany poprzecznie.  
HISTOPATOLOGIA  
43. Ocen ę histopatologiczn ą wszystkich organów i tkanek wymienionych 
w tabeli 2 nale ży przeprowadzi ć w odniesieniu do grupy kontrolnej 
i grupy otrzymuj ącej wysokie st ężenie substancji, a tak że wszystkich 
zwierząt, które pad ły lub zosta ły uśmiercone podczas badania. Szczególn ą 
uwagę należy zwróci ć na drogi oddechowe, organy docelowe 
i makroskopowe zmiany patologiczne. Organy i tkanki zwierz ąt z grupy 
otrzymującej wysokie st ężenie substancji, w których stwierdzono zmiany 
patologiczne, nale ży zbadać we wszystkich grupach. Kierownik badania 
może zdecydowa ć o przeprowadzeniu ocen histopatologicznych dla dodat ­
kowych grup, aby wykaza ć wyraźną zależność stężenie-odpowied ź. Jeśli 
używa się grupy satelitarnej (grupy w badaniu odwracalno ści), należy prze­
prowadzić ocenę histopatologiczn ą wszystkich tkanek i organów, w których 
stwierdzono skutki podania substancji w grupach otrzymuj ących substancj ę 
badaną. W przypadku wyst ępowania nadmiernej liczby wczesnych zgonów 
lub innych problemów w grupie poddawanej wysokiemu nara żeniu, które 
negatywnie wp ływają na istotno ść danych, badania histopatologiczne nale ży 
przeprowadzi ć w grupie otrzymuj ącej daną substancj ę o kolejnym, ni ższym 
stężeniu. Nale ży podjąć próbę skorelowania wyników ca łości obserwacji 
z wynikami bada ń mikroskopowych.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
44. W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia należy przedstawi ć dane dotycz ące 
masy ciała, spożycia pokarmu, patologii klinicznej, wyra źnych zmian pato ­
logicznych, masy organów i histopatologii. Dane z obserwacji klinicznych 
należy zestawi ć w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do ka żdej 
badanej grupy liczb ę wykorzystanych zwierz ąt, liczbę zwierząt wykazuj ­ 
ących specyficzne objawy toksyczno ści, liczbę zwierząt padłych w trakcie 
trwania badania lub u śmierconych z przyczyn humanitarnych, czasu zgonu 
poszczególnych zwierz ąt, opis skutków toksycznych oraz ich przebieg 
w czasie i odwracalno ść, a także wyniki sekcji zw łok. Wszystkie wyniki 
ilościowe i dodatkowe nale ży ocenić za pomoc ą właściwej metody staty ­
stycznej. Mo żna zastosowa ć dowolną ogólnie przyj ętą metodę statystyczn ą, 
przy czym wyboru metod statystycznych nale ży dokona ć podczas przygo ­
towywania projektu badania.  
Sprawozdanie z badania  
45. Sprawozdanie z badania powinno w stosownych przypadkach zawiera ć 
następujące informacje:  
Badane zwierz ęta i ich hodowla  
— opis warunków przetrzymywania w klatkach, w tym: liczba (lub zmiana 
liczby) zwierz ąt na klatk ę, ściółka, temperatura otoczenia i wilgotno ść 
względna, fotoperiod i okre ślenie diety,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie zastosowania gatunków 
innych ni ż szczur. Mo żna przedstawi ć źródło i dane historyczne, je żeli 
dotyczą one zwierz ąt poddanych podobnemu nara żeniu oraz warunkom 
przebywania i żywieniowym,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— metoda randomizacji,  
— opis wszelkich przygotowa ń przed badaniem, w tym diety, kwarantanny 
i leczenia chorób.  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść oraz w stosownych przypadkach w łaściwości 
fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),  
— dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract 
Services (CAS), je żeli jest znany.  
Nośnik 
— uzasadnienie zastosowania no śnika oraz uzasadnienie wyboru no śnika 
(jeżeli jest inny ni ż woda),  
— dane historyczne lub równoleg łe wykazuj ące, że nośnik nie zak łóca 
wyniku badania.  
Komora inhalacyjna  
— szczegó łowy opis komory inhalacyjnej, w tym jej rozmiary i schemat,  
— źródło i opis wyposa żenia wykorzystywanego do celów nara żenia 
zwierząt, jak równie ż do wytwarzania atmosfery,  
— wyposa żenie do pomiaru temperatury, wilgotno ści, rozmiaru cz ąstek 
i stężenia rzeczywistego,.  
— źródło powietrza i system klimatyzacji,  
— metody kalibracji wyposa żenia w celu zapewnienia jednorodnej atmos ­
fery na potrzeby badania,  
— różnica ciśnienia (dodatnia lub ujemna),  
— porty nara żenia w komorze (nara żenie tylko przez nos); lokalizacja 
zwierząt w komorze (nara żenie całego ciała), 
— stabilno ść atmosfery do świadczalnej,  
— lokalizacja czujników temperatury i wilgotno ści oraz pobieranie próbek 
powietrza w komorze,  
— oczyszczanie dostarczanego/odprowadzanego powietrza,  
— natężenie przep ływu powietrza, nat ężenie przep ływu powietrza/port 
narażenia (nara żenie tylko przez nos) lub ładunek zwierz ąt/komorę 
(narażenie całego ciała), 
— okres wyrównania st ężeń w komorze inhalacyjnej (t  95 ), 
— liczba zmian obj ętości na godzin ę, 
— urządzenia pomiarowe (w stosownych przypadkach).  
Dane dotycz ące narażenia 
— uzasadnienie wyboru docelowego st ężenia w badaniu g łównym,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— stężenia nominalne (ca łkowita masa badanej substancji chemicznej 
wprowadzonej do komory inhalacyjnej podzielona przez ilo ść powietrza 
przepuszczonego przez komor ę), 
— rzeczywiste st ężenia badanej substancji chemicznej w próbkach ze strefy 
oddychania zwierz ąt; w przypadku mieszanin, które tworz ą heteroge ­
niczne formy fizyczne (gazy, pary, aerozole), ka żdą substancj ę można 
analizowa ć oddzielnie,  
— wszystkie st ężenia substancji w powietrzu nale ży podawa ć 
w jednostkach masy (mg/l, mg/m  3 itd.), a nie w jednostkach obj ętości 
(ppm, ppb itd.),  
— rozkład wielko ści cząstek, średnica aerodynamiczna mediany rozk ładu 
masowego (MMAD) oraz geometryczne standardowe odchylenie ( σ g ), 
w tym metody ich obliczania. Nale ży odnotowa ć poszczególne analizy 
wielkości cząstek. 
Warunki badania  
— szczegó łowe informacje na temat przygotowania badanej substancji 
chemicznej, w tym szczegó ły dotyczące wszelkich procedur zastosowa ­
nych w celu zmniejszenia rozmiaru cz ąstek ciał stałych lub przygoto ­
wania roztworów badanej substancji chemicznej,  
— opis (najlepiej wraz ze schematem) wyposa żenia wykorzystywanego do 
wytworzenia atmosfery na potrzeby badania i nara żania zwierz ąt na jej 
działanie,  
— szczegó łowe informacje na temat wyposa żenia stosowanego do monito ­
rowania temperatury, wilgotno ści i przep ływu powietrza w komorze (tj. 
opracowanie krzywej kalibracyjnej),  
— szczegó łowe informacje na temat wyposa żenia stosowanego do pobie ­
rania próbek na potrzeby okre ślenia stężenia w komorze i rozk ładu 
wielkości cząstek, 
— szczegó łowe informacje na temat zastosowanej metody analizy 
chemicznej oraz walidacji metody (w tym wydajno ść odzysku badanej 
substancji chemicznej ze środka do pobierania próbek),  
— metoda randomizacji przypisywania zwierz ąt do grupy badanej i grupy 
kontrolnej,  
— szczegó łowe informacje na temat jako ści pożywienia i wody (w łączając 
w to rodzaj/ źródło diety, źródło wody),  
— uzasadnienie wyboru badanych st ężeń. 
Wyniki  
— tabelaryczne zestawienie temperatury, wilgotno ści i przep ływu powietrza 
w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących nominalnego 
i rzeczywistego st ężenia w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących rozmiaru cz ąstek, w tym 
danych dotycz ących gromadzenia próbek analitycznych, rozk ładu wiel­
kości cząstek oraz obliczenia średnicy aerodynamicznej mediany 
rozkładu masowego (MMAD) i σ g , 
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących reakcji i poziomu st ężenia 
dla każdego zwierz ęcia (tj. zwierz ąt wykazuj ących oznaki toksyczno ści, 
w tym śmiertelno ść, rodzaj, ostro ść, czas pojawienia si ę i czas trwania 
objawów),  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— tabelaryczne zestawienie masy poszczególnych zwierz ąt, 
— tabelaryczne zestawienie spo życia pokarmu,  
— tabelaryczne zestawienie danych z zakresu patologii klinicznej,  
— wyniki sekcji zw łok oraz bada ń histopatologicznych w odniesieniu do 
każdego zwierz ęcia, jeżeli są dostępne, 
— tabelaryczne zestawienie wszelkich innych mierzonych parametrów.  
Omówienie i interpretacja wyników  
— szczególny nacisk nale ży położyć na opis metod zastosowanych w celu 
spełnienia kryteriów niniejszej metody badawczej, np. dotycz ących 
stężenia granicznego lub rozmiaru cz ąstek, 
— należy uwzględnić respirabilno ść cząstek w świetle wyników ogólnych, 
szczególnie je żeli nie mo żna było spełnić kryterium rozmiaru cz ąstek, 
— w ogólnej ocenie badania nale ży uwzględnić spójność metod zastoso ­
wanych w celu okre ślenia nominalnego i rzeczywistego st ężenia oraz 
relacji mi ędzy stężeniem rzeczywistym a nominalnym,  
— należy uwzględnić prawdopodobn ą przyczyn ę zgonu i dominuj ący 
sposób dzia łania (ogólnoustrojowy w porównaniu z miejscowym),  
— należy przedstawi ć wyjaśnienie, je żeli zaistnia ła konieczno ść humanitar ­
nego uśmiercenia zwierz ąt wykazuj ących oznaki bólu lub objawy ostrego 
i przewlek łego stresu, zgodnie z kryteriami zawartymi w wytycznych 
OECD dotycz ących humanitarnego punktu ko ńcowego (3),  
— należy określić organy docelowe,  
— należy określić NOAEL i LOAEL.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, pierwotna wersja 
dotyczącej badań wytycznej OECD nr 412, Dyrekcja ds. Środowiska, 
OECD, Pary ż. 
(2) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pary ż. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment nr 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paryż.
 
(4) Whalan JE and Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and 
Limit Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Biuro ds. Programów Stosowania Pestycydów, Agencja Ochrony Środowiska Stanów 
Zjednoczonych.
 
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (rozdzia ł 9) w: Toxicology of Inhaled 
Material, Witschi, H.P. i Brain, J.D. (red.), Springer Verlag Heidelberg, s. 
229–258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. W: Waalkes MP i Ward JM (eds) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, Nowy Jork, 215–263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats 
and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasop ­
haryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
(11) Kuper CF, Art. JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
(13) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania 
i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006 (Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Dodatek 1  
DEFINICJA  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.;  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOKSYCZNO ŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI 
(DERMALNA)  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. A).  
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. B).  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Substancj ę badaną podaje si ę na skórę w stopniowanych dawkach 
kilku grupom zwierz ąt doświadczalnych, po jednej dawce na grup ę, 
przez okres 28 dni. W okresie podawania prowadzi si ę codzienn ą 
obserwacj ę zwierząt w celu wykrycia objawów toksyczno ści. Zwie­
rzęta, które zdechn ą w trakcie badania, i te, które prze żyją po jego 
zakończeniu, poddaje si ę sekcji zw łok. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Przygotowania  
Zwierzęta muszą być trzymane w do świadczalnych warunkach 
pobytu i karmienia przez co najmniej pi ęć dni przed przeprowadze ­
niem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, m łode, 
dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do poszcze ­
gólnych grup poddanych dzia łaniu substancji i kontrolnych. Na 
krótko przed rozpocz ęciem eksperymentu nale ży usunąć sierść 
z grzbietowej powierzchni tu łowia zwierz ąt przez przyci ęcie lub 
ogolenie. Mo żna zastosowa ć ogolenie, jednak nale ży je przeprowa ­
dzić na około 24 godziny przed rozpocz ęciem badania. Na ogó ł 
konieczne jest powtarzanie przycinania lub golenia sier ści 
w odstępach oko ło jednego tygodnia. Podczas przycinania lub 
golenia sier ści należy uważać, aby nie uszkodzi ć skóry. Nie mniej 
niż 10 % powierzchni cia ła powinno by ć wolne w celu zastosowania 
substancji badanej. Przy podejmowaniu decyzji o wielko ści 
powierzchni cia ła, jaką należy oczyścić, oraz o rozmiarach pokrycia 
tej powierzchni substancj ą należy uwzględnić masę ciała zwierzęcia. 
Przy badaniu cia ła stałego, które mo żna sproszkowa ć gdy to 
stosowne, substancja badana powinna by ć wystarczaj ąco nawilżona 
wodą lub, w miar ę potrzeby, stosownym pod łożem dla zapewnienia 
dobrego kontaktu ze skór ą. Płynne substancje badane stosuje si ę na 
ogół w stanie nierozcie ńczonym. Substancj ę stosuje si ę codziennie 
przez pięć do siedmiu dni w tygodniu.  
1.6.2.  Warunki badania  
1.6.2.1.  Zwierz ęta doświadczalne  
Można wykorzysta ć dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. 
Można stosowa ć inne gatunki, lecz ich u życie wymaga uzasadnienia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
Na początku badania zmienno ść masy cia ła zastosowanych zwierz ąt 
nie powinna przekracza ć ± 20 % odpowiedniej warto ści średniej.  
1.6.2.2.  Liczba i p łeć 
Wykorzystuje si ę co najmniej 10 zwierz ąt (pięć samic i pi ęciu 
samców) ze zdrow ą, nienaruszon ą skórą w przypadku ka żdego 
poziomu dawkowania. Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą 
być w ciąży. Jeżeli planuje si ę uśmiercanie zwierz ąt w międzyczasie, 
ogólna ich liczba powinna by ć zwiększona o liczb ę zwierząt zapla­
nowanych do u śmiercenia przed zako ńczeniem badania. Dodatkowo, 
grupa satelicka 10 zwierz ąt (pięć zwierząt każdej płci) może być 
poddana dzia łaniu wysokiego poziomu dawki przez 28 dni 
i obserwowana, przez 14 dni po dawkowaniu, pod k ątem odwracal ­
ności, trwałości i opóźnionego wyst ąpienia objawów zatrucia. Jest 
także stosowana grupa satelicka 10 zwierz ąt kontrolnych (pi ęć 
zwierząt każdej płci). 
1.6.2.3.  Wielko ści dawek  
Należy zastosowa ć co najmniej trzy wielko ści dawek z grup ą 
kontrolną lub grup ą kontroln ą otrzymuj ącą podłoże, o ile to ostatnie 
jest stosowane. Czas ekspozycji powinien wynosi ć co najmniej sze ść 
godzin na dob ę. Substancj ę badaną należy podawa ć o podobnej 
porze każdego dnia, przy czym wielko ści dawek nale ży tak dosto ­
sowywać w odpowiednich odst ępach czasu (co tydzie ń lub co dwa 
tygodnie), aby utrzyma ć stałą wielkość dawki w przeliczeniu na 
masę ciała zwierzęcia. Z wyj ątkiem zastosowania substancji badanej, 
ze zwierz ętami grupy kontrolnej powinno si ę obchodzi ć w sposób 
identyczny jak z podmiotami grupy badanej. W przypadku stoso ­
wania pod łoża w celu u łatwienia dawkowania, u zwierz ąt kontro­
lnych otrzymuj ących pod łoże należy stosowa ć samo to pod łoże 
w taki sam sposób, jak w grupach otrzymuj ących substancj ę badaną, 
w takiej samej dawce, jak stosowana w grupie otrzymuj ącej 
najwyższą dawkę. Najwyższa dawka powinna by ć tak dobrana, 
aby wywiera ła działanie toksyczne, jednak nie prowadzi ła do 
zgonów lub prowadzi ła do jedynie niewielu zgonów. Najni ższa 
dawka nie powinna dawa ć żadnych objawów toksyczno ści. 
W przypadku gdy istnieje mo żliwa do wykorzystania, oszacowana 
wielkość ekspozycji u ludzi, najni ższy poziom dawkowania powinien 
ją przewyższać. W idealnej sytuacji po średni poziom dawkowania 
powinien prowadzi ć do uzyskania minimalnych dostrzegalnych 
efektów toksycznych. W przypadku gdy zostanie wykorzystana więcej niż jedna dawka po średnia, wielko ści dawek powinny by ć 
tak rozstawione, aby uzyska ć stopniowanie dzia łań toksycznych. 
W grupach otrzymuj ących niskie i po średnie dawki oraz 
w grupach kontrolnych cz ęstość występowania zgonów powinna 
być niska, aby umo żliwić
 znaczącą ocenę wyników.  
W przypadku gdy zastosowanie substancji badanej wi ąże się 
z ciężkim działaniem dra żniącym na skór ę, stężenia nale ży zmniej­
szyć, przy czym mo że to spowodowa ć zmniejszenie pojawiania si ę 
lub brak innych skutków toksycznych przy najwy ższym poziomie 
dawkowania. Ponadto w przypadku znacznego uszkodzenia skóry 
może być konieczne przerwanie badania i podj ęcie nowego ekspery ­
mentu z zastosowaniem ni ższych stężeń. 
1.6.2.4.  Czas ekspozycji  
W przypadku gdy w badaniu wst ępnym z zastosowaniem dawki 
1 000 mg/kg lub wy ższej, odpowiadaj ącej potencjalnej ekspozycji 
u ludzi, o ile taki poziom jest znany, nie zostan ą stwierdzone 
żadne efekty toksyczne, mo żna uznać, że dalsze badania nie s ą 
potrzebne.  
1.6.2.5.  Okres obserwacji  
Zwierzęta doświadczalne nale ży obserwowa ć codziennie pod k ątem 
występowania objawów toksyczno ści. Należy zapisać czas zgonu 
zwierzęcia i czas pojawienia si ę i ustąpienia objawów toksyczno ści. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Procedura  
Zwierzęta powinny by ć trzymane w oddzielnych klatkach. 
W idealnej sytuacji podaje si ę im substancj ę badaną przez siedem 
dni w tygodniu przez okres 28 dni. Zwierz ęta w grupach satelickich, 
w których planuje si ę późniejszą obserwacj ę, powinny zosta ć prze­
trzymane przez nast ępnych 14 dni bez podawania im substancji 
w celu stwierdzenia ust ępowania lub utrzymywania si ę działań 
toksycznych. Czas ekspozycji powinien wynosi ć co najmniej sze ść 
godzin na dob ę. 
Substancja badana powinna zosta ć nałożona w sposób równomierny 
na obszar równy oko ło 10 % ca łkowitej powierzchni cia ła. 
W przypadku substancji wysoce toksycznych mo żna je nanie ść na 
mniejszą powierzchni ę, jednak nale ży dążyć do tego, aby pokry ć jak 
największy obszar jak najcie ńszą i jak najbardziej równomiern ą 
warstwą badanego zwi ązku. 
W trakcie ekspozycji substancja badana jest utrzymywana 
w kontakcie ze skór ą dzięki zastosowaniu porowatego opatrunku 
z gazy i niedra żniącej taśmy. Miejsce badania nale ży dodatkowo 
przykryć w taki sposób, aby utrzyma ć opatrunek z gazy 
i substancj ę badaną i zapewni ć, aby zwierz ęta nie mog ły zjeść tej 
ostatniej. W celu zapobie żenia spożyciu substancji badanej mo żna 
uwiązać zwierzę, jednak pe łna immobilizacja nie jest zalecan ą 
metodą. Jako alternatyw ę można zastosowa ć „kołnierzowy przyrz ąd 
zabezpieczaj ący”. 
Pod koniec okresu ekspozycji nale ży usunąć resztki badanej substan ­
cji, w miar ę możliwości stosując wodę lub jakie ś inne, w łaściwe 
metody oczyszczania skóry.  
Wszystkie zwierz ęta należy obserwowa ć codziennie i odnotowywa ć 
występujące u nich objawy toksyczno ści, włącznie z czasem ich 
pojawienia si ę, stopniem ich ci ężkości i czasem trwania. Obserwacje 
przy klatce zwierz ęcia powinny obejmowa ć zmiany skóry i sier ści, 
oczu i błon śluzowych oraz zmiany uk ładu oddechowego, kr ążenia, 
autonomicznego i o środkowego uk ładu nerwowego, jak te ż wzorców 
aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Co tydzie ń 
należy ważyć zwierzęta. Zaleca si ę także przeprowadzanie cotygo ­
dniowych pomiarów wielko ści spożycia karmy. Regularna obser ­
wacja zwierz ąt jest niezb ędna do tego, aby w mo żliwym zakresie 
nie straci ć zwierząt badanych z takich przyczyn, jak kanibalizm, 
autoliza tkanek lub przemieszczenie. Pod koniec okresu badania wszystkie osobniki, które prze żyły w grupach innych ni ż satelicka, 
poddaje si ę sekcji zw łok. Zwierz ęta konają
ce oraz zwierz ęta przeja­
wiające ostre cierpienie i ból powinny by ć usuwane, gdy zostanie to 
zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zw łok. 
Następujące badania nale ży wykona ć pod koniec okresu badania 
u wszystkich zwierz ąt, włącznie z osobnikami w grupie kontrolnej:  
1) badania hematologiczne, w tym co najmniej hematokryt, st ężenie 
hemoglobiny, liczba erytrocytów, liczba leukocytów z rozmazem i oznaczenie parametrów krzepni ęcia;
 
2) laboratoryjne badania biochemiczne krwi zawieraj ące co najmniej 
jeden parametr funkcji w ątroby i nerek: aktywno ść aminotransfe ­
razy alaninowej (uprzednio nazywanej transferaz ą glutaminia ­
nowo-piro- gronow ą) w surowicy, aktywno ść aminotransferazy 
asparaginianowej (uprzednio nazywanej transferaz ą glutaminia ­
nowo-szczawiooctow ą) w surowicy, st ężenie azotu moczniko ­
wego, albumin, kreatyniny we krwi, ca łkowite stężenie bilirubiny 
i całkowite st ężenie białka w surowicy.  
Do innych oznacze ń, które mog ą okazać się niezbędne do odpowied ­
niej oceny toksykologicznej, nale żą oznaczenia st ężenia wapnia, 
fosforu, chlorków, sodu, potasu, glukozy na czczo, lipidogram, 
stężenia hormonów i oznaczenia równowagi kwasowo-zasadowej, 
stężenia methemoglobiny oraz aktywno ści cholinesterazy.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
W razie potrzeby mo żna zastosowa ć dodatkowe oznaczenia bioche ­
miczne, aby rozszerzy ć badania zaobserwowanych dzia łań toksycz­
nych.  
1.6.4.  Pe łne badanie patomorfologiczne  
Wszystkie zwierz ęta objęte badaniem powinny zosta ć poddane 
pełnemu makroskopowemu badaniu patomorfologicznemu. Nale ży 
zważyć wątrobę, nerki, nadnercza i j ądra w stanie wilgotnym, 
najszybciej, jak to b ędzie możliwe po rozci ęciu zwłok, aby unikn ąć 
wysuszenia. Narz ądy i tkanki, tj. prawid łową i poddawan ą 
ekspozycji na substancj ę skórę, wątrobę, nerki i narz ądy docelowe 
(czyli narz ądy wykazuj ące makroskopowe zmiany patologiczne lub 
o nieprawid łowych wymiarach) nale ży zakonserwowa ć 
w odpowiednim środku w celu przeprowadzenia ewentualnych, przy ­
szłych bada ń histopatologicznych.  
1.6.5.  Badania histopatologiczne  
W grupie otrzymuj ącej najwy ższą dawkę i w grupie kontrolnej 
należy wykona ć badanie histologiczne zakonserwowanych narz ądów 
i tkanek. We wszystkich grupach otrzymuj ących niższe dawki nale ży 
przeprowadzi ć badanie tych narz ądów i tkanek, w których stwier ­
dzono zmiany przypisywane badanej substancji przy zastosowaniu 
najwyższych dawek. Nale ży również przeprowadzi ć badanie histolo ­
giczne zwierz ąt w grupie satelickiej, ze szczególnym naciskiem na te 
narządy i tkanki, w których stwierdzono skutki podania substancji 
w innych badanych grupach.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w skrócie w formie tabelarycznej, z poda ­
niem – dla ka żdej badanej grupy – liczby zwierz ąt na pocz ątku 
badania oraz liczby zwierz ąt z każdym rodzajem zmiany patologicz ­
nej. 
Wszystkie zaobserwowane zmiany nale ży ocenić przy pomocy 
właściwej metody statystycznej. Mo żna zastosowa ć dowolną, uznaną 
metodę statystyczn ą. 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— dane zwierz ąt (gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, 
dieta itp.),  
— warunki badania (w łączając typ opatrunku: okluzyjny lub 
nieokluzyjny),  
— wielko ści dawek (w łączając podłoże, o ile jest wykorzystane) 
i stężenia,  
— poziom niewywieraj ący działania, o ile to mo żliwe,  
— dane reakcji toksycznej w rozbiciu na p łci i dawki,  
— czas zgonu w trakcie badania lub fakt, że zwierzęta przeżyły do 
jego zako ńczenia,  
— działania toksyczne lub inne,  
— czas zaobserwowania ka żdego nieprawid łowego objawu 
i późniejszy przebieg zmian,  
— dane na temat karmy i masy cia ła, 
— zastosowane badania hematologiczne i ich wyniki,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— zastosowane laboratoryjne badania biochemiczne i ich wyniki,  
— wyniki sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,  
— gdzie to mo żliwe, statystyczna obróbka wyników,  
— omówienie wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. OCENA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. D).  
4. LITERATURA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B lit. E).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE ABERRACJI CHROMOSO ­
MOWEJ SSAKÓW  IN VITRO  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 473, metody badania aber ­
racji chromosomowej ssaków  in vitro  (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Celem badania chromosomowej aberracji u ssaków jest zidentyfiko ­
wanie czynników, które powoduj ą strukturalne chromosomowe aber ­
racje w hodowanych komórkach ssaków (1)(2)(3). Strukturalne aber ­
racje mog ą występować w dwóch typach, chromosomowym lub 
chromatydowym. W przypadku mutagenów chemicznych wi ększość 
wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, ale mog ą się poja­
wiać aberracje typu chromosomowego. Wzrost poliploidalno ści może 
wskazywa ć, że substancja chemiczna ma potencja ł do wywo ływania 
aberracji liczbowej. Jednak że metoda ta nie jest wykorzystywana do 
pomiarów aberracji liczbowych i nie jest rutynowo wykorzystywana do tego celu. Mutacje chromosomowe oraz powi ązane z nimi 
zdarzenia s ą przyczyn ą wielu chorób genetycznych u ludzi oraz 
istnieje dowód na to, że mutacje chromosomowe oraz zwi ązane 
z nimi zdarzenia powoduj ące zmiany w onkogenach oraz genach 
hamowania nowotworów komórek somatycznych s ą odpowiedzialne 
za wywoływanie raka u ludzi oraz zwierz ąt doświadczalnych.
 
Aberracja chromosomowa  in vitro  może wykorzystywa ć ustano­
wione linie komórkowe, łańcuchy komórkowe lub pierwotne 
hodowle komórek. Wykorzystane komórki s ą wybierane na 
podstawie mo żliwości wzrostu hodowli, stabilno ści kariotypu, liczby 
chromosomów, zró żnicowania chromosomów oraz spontanicznych 
częstotliwości aberracji.  
Badania przeprowadzane  in vitro  wymagaj ą wykorzystania źródła 
egzogennego aktywacji metabolicznej. Ten system aktywacji meta ­
bolicznej nie mo że imitowa ć w całości warunków  in vivo  
w odniesieniu do ssaków. Powinna zosta ć zachowana ostro żność 
w celu unikni ęcia warunków, które mog łyby prowadzi ć do pozytyw ­
nych wyników, które nie odzwierciedlaj ą wewnętrznej mutagenno ści 
oraz mog ą wynikać ze zmian w pH, st ężeniu osmolalnym lub wyso ­
kich poziomów cytotoksyczno ści (4)(5).  
Badanie to jest wykorzystywane w celu sprawdzenia mo żliwych 
czynników mutagennych oraz rakotwórczych dla ssaków. Wiele 
związków, które maj ą charakter dodatni w tym badaniu, s ą czynni­
kami rakotwórczymi dla ssaków, jednak że nie istnieje idealne powi ­ 
ązanie między tym badaniem a rakotwórczo ścią. Powiązanie zale żne 
jest od klasy chemicznej oraz jest coraz wi ęcej dowodów na to, że 
istnieją czynniki rakotwórcze, które nie s ą wykrywane w drodze tego 
badania, poniewa ż wydaje si ę, iż działają one poprzez mechanizmy 
inne niż bezpośrednie niszczenie DNA.  
Zob. równie ż Ogólne wprowadzenie do cz ęści B.  
1.2. DEFINICJE  
Aberracja typu chromatydowego:  strukturalne uszkodzenie chro ­
mosomu, wyra żone jako p ękanie pojedynczych chromatydów lub 
pękanie oraz ponowne łączenie mi ędzy chromatydami.  
Aberracja typu chromosomowego:  strukturalne uszkodzenie chro ­
mosomu, wyra żone jako p ękanie pojedynczych chromatydów lub 
pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej 
lokalizacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endoreduplikacja:  proces, w którym po okresie replikacji DNA 
jądro nie ulega mitozie, ale rozpoczyna nowy okres S. Wynikiem 
są chromosomy o 4, 8, 16, … chromatydach.  
Szczelina:  achromatyczne uszkodzenie mniejsze ni ż szerokość chro­
matydu, powoduj ące minimalne wypaczenie chromatydu.  
Indeks mitotyczny:  stosunek komórek w metafazie podzielony 
przez całkowitą liczba komórek zaobserwowany w populacji komó ­
rek; wskazanie stopnia proliferacji tej populacji.  
Aberracja liczbowa:  zmiana w ilo ści chromosomów w odniesieniu 
do normalnej ilo ści charakterystycznej dla wykorzystywanych komó ­
rek. 
Poliploidalno ść: wielokrotno ść ilości chromosomów haploidalnych 
(n) inna niż liczba diploidalna (np. 3 n, 4n itd.).  
Aberracja strukturalna:  zmiana w strukturze chromosomu, wykry ­
walna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podzia łu komó­
rek, zaobserwowana jako usuni ęcia oraz fragmenty, zmiany 
(zachodzące – wewn ątrz oraz mi ędzy chromosomami).  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Hodowle komórek s ą poddane dzia łaniu substancji badanej zarówno 
z aktywacj ą, jak i bez aktywacji metabolicznej. Substancje s ą 
poddawane dzia łaniu metafazy zatrzymuj ącej (np. Colcemid® lub 
kolchicyna) substancje we wcze śniej okre ślonych odst ępach czasu 
po poddaniu hodowli komórek dzia łaniu substancji badanej, komórki 
pobrane, zabarwione oraz komórki metafazy s ą analizowane mikro ­
skopowo na obecno ść aberracji chromosomowych.  
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Preparaty  
1.4.1.1.  Komórki  
Wykorzystywane mog ą być rozmaite linie komórkowe, łańcuchy lub 
pierwotne hodowle komórek łącznie z komórkami ludzkimi (np. 
fibroblasty chomika chi ńskiego, limfocyty krwi obwodowej ludzi 
lub ssaków).  
1.4.1.2.  Warunki dotycz ące podłoża hodowli i hodowli  
W utrzymywaniu hodowli powinny by ć stosowane odpowiednie 
warunki pod łoża hodowli oraz inkubacji (naczynia do hodowli, 
stężenie CO  2 , temperatura oraz wilgotno ść). Ustanowione linie 
komórkowe oraz szczepy powinny by ć rutynowo sprawdzane pod 
kątem stabilno ści zmiennej ilo ści chromosomów oraz nieobecno ści 
zanieczyszczenia mykoplazm ą oraz nie powinny by ć wykorzysty ­
wane, jeżeli są zanieczyszczone. Normalny czas cyklów komórko ­
wych oraz wykorzystywane warunki dotycz ące hodowli powinny 
być znane.  
1.4.1.3.  Preparaty hodowli  
Ustanowione linie komórkowe oraz łańcuchy: komórki s ą rozmna­ 
żane z hodowli podstawowej, siane na pod łożu hodowli w takiej 
gęstości, że hodowle nie osi ągną zrastania si ę przed czasem pobie ­
rania, oraz s ą inkubowane w temperaturze 37  o C. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Limfocyty: krew pe łna jest poddawana dzia łaniu antykoagulantu (np. 
heparyny) lub oddzielone limfocyty uzyskane ze zdrowych przed ­
miotów s ą dodawane do pod łoża hodowli zawieraj ącego mitogen 
(np. phytohaemagglutinin) oraz inkubowane w temperaturze 37  o C. 
1.4.1.4.  Aktywacja metaboliczna  
Komórki powinny zosta ć poddane dzia łaniu substancji badanej 
zarówno w obecno ści, jak i w nieobecno ści odpowiedniego systemu 
aktywacji metabolicznej. Najpowszechniej wykorzystywanym systemem jest frakcja przes ączu znad mitochondriów uzupe łniona 
o kofaktor, przygotowana z w ątroby gryzoni poddanej dzia łaniu 
substancji, czynnikami pobudzaj ącymi enzymy, takimi jak Aroklor 
1254 (6)(7)(8)(9) lub mieszanina fanobarbitonu oraz β-naftoflawonu 
(10)(11)(12).
 
Frakcja przes ączu znad mitochondriów jest zazwyczaj wykorzysty ­
wana w st ężeniach w zakresie 1–10 % obj ętościowo w ko ńcowym 
nośniku badania. Warunki systemu aktywacji metabolicznej mog ą 
być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. 
W niektórych przypadkach w łaściwe może być wykorzystanie wi ęcej 
niż jednego st ężenia frakcji przes ączu znad mitochondriów.  
Pewna liczba ulepsze ń, w tym konstrukcja genetycznie modyfikowa ­
nych linii komórkowych wyra żających szczególne enzymy akty ­
wujące, mog ą zapewni ć możliwość aktywacji endogenicznej. 
Wybór wykorzystanych linii komórkowych powinien by ć uzasad­
niony naukowo (np. przez znaczenie izoenzymu cyto-chromowego P450 dla metabolizmu substancji).
 
1.4.1.5.  Substancja badana/przygotowanie  
Stała substancja badana powinna zosta ć rozpuszczona lub zawie ­
szona w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczona, jeżeli jest to odpowiednie, przed poddaniem jej dzia ­ 
łaniu komórek. P łynne substancje badane mog ą być dodawane 
bezpośrednio do systemu badawczego i/lub rozcie ńczane przed 
poddaniem ich dzia łaniu komórek. Powinny zosta ć wykorzystane 
świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotycz ące stabil­
ności wskazuj ą, iż dopuszczalne jest sk ładowanie substancji.  
1.4.2.  Warunki badania  
1.4.2.1.  Rozpuszczalnik/no śnik 
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien mie ć możliwości reagowania 
chemicznego z substancj ą badaną oraz powinien by ć zgodny z prze ­ 
żywaniem komórek oraz aktywno ścią S9. Jeśli inne niż dobrze znane 
rozpuszczalniki/no śniki są wykorzystywane, ich w łączenie do 
badania powinno by ć wsparte danymi wskazuj ącymi ich zgodno ść. 
Zaleca się, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści rozważone 
zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/no śników. 
Badając substancje nietrwa łe w wodzie, wykorzystane rozpuszczal ­
niki organiczne powinny by ć wolne od wody. Woda mo że zostać 
usunięta przez zastosowanie sita molekularnego.  
1.4.2.2.  Stężenia poddania dzia łaniu substancji  
Wśród kryteriów, które maj ą zostać uwzględnione przy okre ślaniu 
najwyższego stężenia, znajduje si ę cytotoksyczno ść, rozpuszczalno ść 
w systemie oraz zmiany pH lub osmolalno ść. 
Cytotoksyczno ść powinna zosta ć określona z aktywacj ą lub bez 
aktywacji metabolicznej w ramach g łównego do świadczenia, przy 
wykorzystaniu odpowiedniego wskazania dotycz ącego integralno ści 
komórki oraz wzrostu, takiego, jak stopie ń zrastania si ę, liczba 
komórek zdolnych do życia lub indeksy mitotyczne. Mo że to być 
użyteczne do oznaczenia cytotoksyczno ści oraz rozpuszczalno ści 
w doświadczeniu wst ępnym.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Powinny zosta ć wykorzystane co najmniej trzy nadaj ące się do 
analizy st ężenia. W przypadku gdy pojawia si ę cytotoksyczno ść, 
stężenia te powinny obejmowa ć zakres od najwy ższej do ma łej 
toksyczno ści lub jej braku; b ędzie to zazwyczaj oznacza ć, że stężenia 
powinny zosta ć rozdzielone przez nie wi ęcej niż jeden czynnik 
między 2 a √10. W czasie pobierania wyhodowanych komórek 
najwyższe stężenia powinny wskazywa ć znaczące zmniejszenie 
w stopniu zrastania si ę, liczbie komórek lub indeksie mitotycznym 
(wszystkie wy ższe niż 50 %). Indeks mitotyczny jest jedynie 
bezpośrednią miarą skutków cytotoksycznych/cytostatycznych oraz 
jest zależny od czasu po poddaniu dzia łaniu substancji. Jednak że 
indeks mitotyczny jest dopuszczalny w odniesieniu do hodowli zawiesinowych, w których inne pomiary toksyczno ści mogą być 
niewygodne i niepraktyczne. Informacje w sprawie kinetyki komó ­
rek, takie jak średnie czasy tworzenia si ę (AGT), mog ą być wyko­
rzystywane jako informacje dodatkowe. Jednak że AGT jest ogóln ą
 
średnią, która nie zawsze ujawnia istnienie opó źnionych podpopula ­
cji, a nawet delikatne wzrosty średnich czasów tworzenia si ę mogą 
być związane z bardzo zasadniczym opó źnieniem w czasie optymal ­
nych wydajno ści aberracji.  
W odniesieniu do substancji wzgl ędnie niecytotoksycznych maksy ­
malne stężenie badawcze powinno wykosi ć 5 μl/ml, 5 mg/ml lub 
0,01 M, w zale żności od tego, które z nich jest najni ższe. 
W odniesieniu do substancji wzgl ędnie nierozpuszczalnych, które nie 
są toksyczne w st ężeniach ni ższych niż stężenia nierozpuszczalne, 
najwyższa wykorzystana dawka powinna by ć stężeniem powy żej 
limitu rozpuszczalno ści w końcowym pod łożu hodowli na koniec 
okresu poddawania dzia łaniu substancji. W niektórych przypadkach 
(np. kiedy toksyczno ść pojawia si ę wyłącznie przy wy ższym niż 
najniższe stężeniu nierozpuszczalnym) s łuszne jest przeprowadzenie 
badania na jednym wi ększym stężeniu z widocznym str ącaniem si ę. 
Użyteczna mo że być ocena rozpuszczalno ści na pocz ątku oraz na 
końcu poddawania dzia łaniu substancji, ze wzgl ędu na to, że 
rozpuszczalno ść może zmienia ć się w trakcie trwania poddania dzia ­ 
łaniu substancji w systemie badawczym spowodowana obecno ścią 
komórek, surowicy S9 itp. Nierozpuszczalno ść może zostać wykryta 
okiem nieuzbrojonym. St ężanie nie powinno zak łócać oceny.  
1.4.2.3.  Kontrole pozytywne i negatywne  
Równoleg łe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik lub 
nośnik), zarówno z aktywacj ą metaboliczn ą, jak i bez niej, powinny 
zostać objęte każdym doświadczeniem. Kiedy wykorzystywana jest 
aktywacja metaboliczna, pozytywna kontrolna substancja chemiczna jest substancj ą, która wymaga aktywacji w celu wywo łania reakcji 
mutagennej.
 
Pozytywne kontrole powinny wykorzystywa ć znany elastogen przy 
poziomie poddania dzia łaniu substancji, od którego oczekuje si ę 
wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu poza t ło, 
które wskazuje czu łość systemu.  
Stężenia pozytywnych kontroli powinny zosta ć wybrane tak, aby 
były jasne, ale by badaj ącemu nie ujawnia ły bezpośrednio to żsa­
mości zakodowanych szkie łek laboratoryjnych. Przyk łady pozytyw ­
nych substancji kontrolnych obejmuj ą: 
Warunki aktywacji metabolicznej Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Nieobecno ść egzogenicznej 
aktywacji metabolicznej Metanosulfonat metylu 66-27-3 200-625-0 
Metanosulfonat etylu 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Warunki aktywacji metabolicznej Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Nitrozomocznik etylu 759-73-9 212-072-2 
Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 
N-tlenek-4-nitrokwinolinu 56-57-5 200-281-1 
Obecność egzogenicznej akty ­
wacji metabolicznej Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 
Cyklofosfamid 
Cyklofosfamid monohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Mogą być wykorzystane inne w łaściwe substancje kontroli pozytyw ­
nych. Wykorzystanie substancji chemicznej z klasy powi ązanej 
z kontrol ą pozytywn ą powinno zosta ć rozważone, jeżeli jest 
dostępne. 
Kontrole negatywne, sk ładające się z rozpuszczalników lub samego 
nośnika w pod łożu poddania dzia łaniu substancji, oraz poddanie 
działaniu substancji w ten sam sposób co hodowle poddane dzia łaniu 
substancji, powinny zosta ć włączone w ramy ka żdego okresu pobie ­
rania hodowli. Dodatkowo wykorzystywane powinny by ć kontrole, 
w ramach których nie poddaje si ę działaniu substancji, chyba że 
istnieją dane historyczne dotycz ące kontroli wskazuj ące na to, że 
inne skutki szkodliwe lub mutagenne s ą wywołane wybranym 
rozpuszczalnikiem.  
1.4.3.  Procedura  
1.4.3.1.  Poddanie dzia łaniu substancji badanej  
Komórki rozmna żające się wegetatywnie s ą poddawane dzia łaniu, 
wykorzystuj ąc substancj ę badaną w obecno ści oraz nieobecno ści 
systemu aktywacji metabolicznej. Przetwarzanie limfocytów powinno następować w około 48 godzin po stymulacji mitogenicznej.
 
1.4.3.2.  Hodowle reprodukcyjne powinny normalnie by ć wykorzystywane przy 
każdym stężeniu oraz s ą one silnie zalecane w odniesieniu do 
negatywnych/rozpuszczalnikowych hodowli kontrolnych. W przypadku 
gdy na podstawie danych historycznych mog ą zostać przedstawione 
minimalne zmiany mi ędzy hodowlami reprodukcyjnymi (13)(14), 
dopuszczalne mo że być, aby pojedyncze hodowle mia ły być wykorzy ­
stywane przy ka żdym badaniu.  
Substancje gazowe lub lotne powinny by ć badane odpowiednia 
metodą, taką jak badanie w szczelnie zamkni ętych naczyniach do 
hodowli (15)(16).  
1.4.3.3.  Czas pobierania hodowli  
W pierwszym do świadczeniu komórka powinna by ć poddana dzia ­ 
łaniu substancji badanej, zarówno z aktywacja metaboliczn ą, jak 
i bez niej, przez 3–6 godzin oraz próbki powinny zosta ć pobrane 
w czasie równowa żnym długości około 1,5 cyklu komórkowego po 
rozpoczęciu poddawania dzia łaniu substancji (12). Je żeli ten protokó ł 
daje negatywne wyniki, zarówno z aktywacj ą, jak i bez niej, 
powinno zosta ć przeprowadzone dodatkowe do świadczenie, 
z ciągłym poddawaniem dzia łaniu substancji badanej do momentu 
pobrania próbek w czasie równowa żnym długości 1,5 cyklu komór ­
kowego. Niektóre substancje chemiczne mog ą być wykryte 
z mniejszym trudem przez czasy poddawania dzia łaniu substancji 
badanej/pobierania próbek d łuższe niż długości 1,5 cyklu. Wyniki 
negatywne z metaboliczn ą aktywacj ą muszą zostać ustalone na zasa ­
dzie jednostkowych przypadków. W tych przypadkach, gdy potwier ­
dzenie negatywnych wyników nie jest uznawane za niezb ędne, 
powinno zosta ć zapewnione uzasadnienie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Preparaty chromosomów  
Hodowle komórek s ą poddawane dzia łaniu Colcemidu® lub kolchi ­
cyny zazwyczaj przez 1–3 godzin przed pobraniem hodowli. Ka żda 
hodowla komórek jest pobierana oraz poddawana dzia łaniu 
substancji oddzielnie w celu przygotowania chromosomów. Przygo ­
towanie chromosomów obejmuje hipotoniczne przetwarzanie komó ­
rek, wiązanie oraz barwienie.  
1.4.3.5.  Analiza  
Wszystkie szkie łka mikroskopowe, w łącznie z tymi dotycz ącymi 
pozytywnych oraz negatywnych kontroli, powinny zosta ć odpo­
wiednio zakodowane przed analiz ą mikroskopow ą. Ze wzgl ędu na 
to, że procedury wi ązania, utrwalania barwnika cz ęsto skutkuj ą prze­
rwaniem stosunku komórek metafazy do straty chromosomów, 
oceniane komórki powinny z tego wzgl ędu zawiera ć liczbę centro­
merów równ ą zmiennej liczbie ± 2 dla wszystkich rodzajów komó ­
rek. Powinno zosta ć ocenione przynajmniej 200 dobrze rozci ągnię­
tych metafaz na st ężenie oraz kontrole, równo podzielonych mi ędzy 
wtórniki, je żeli ma to zastosowanie. Liczba ta mo że zostać zreduko­
wana, jeśli zaobserwowana jest wysoka liczba aberracji.  
Chociaż celem badania jest wykrycie strukturalnych aberracji chro ­
mosomowych, wa żne jest odnotowanie poliploidalno ści oraz endore ­
duplikacji, je śli zaobserwowane s ą te zdarzenia.  
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Jednostką doświadczaln ą jest komórka, a z tego wzgl ędu udzia ł 
procentowy komórek ze strukturaln ą aberracją chromosomow ą powi­
nien zosta ć poddany ocenie. Ró żne typy strukturalnej aberracji chro ­
mosomowej powinny zosta ć wymienione wraz z ich ilo ściami oraz 
częstotliwościami w odniesieniu do hodowli do świadczalnych oraz 
kontrolnych. Szczeliny s ą oddzielnie odnotowywane oraz zg łaszane, 
ale ogólnie nie s ą włączane do cz ęstotliwości aberracji ogó łem. 
Równoleg łe pomiary cytotoksyczno ści w odniesieniu do wszystkich 
przetwarzanych oraz negatywnych hodowli kontrolnych w ramach głównych do świadczeń aberracji powinny równie ż zostać odnoto­
wane.
 
Powinny zosta ć dostarczone dane dotycz ące poszczególnych 
hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny zosta ć podsumowane 
w formie tabelarycznej.  
Nie istnieje wymóg jasnej reakcji pozytywnej w odniesieniu do wery ­
fikacji. Niejednoznaczne wyniki powinny zosta ć wyjaśnione w drodze 
dalszych bada ń, w szczególno ści z wykorzystaniem modyfikacji 
warunków do świadczalnych. Potrzeba potwierdzenia wyników nega ­
tywnych zosta ła omówiona w ppkt 1.4.3.3. Modyfikacje parametrów 
badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych warunków powinna zosta ć rozważona w dalszych do świadczeniach. Parametry 
badawcze, które mog ą być zmodyfikowane, obejmuj ą zakres st ężenia 
oraz warunki aktywacji metabolicznej.
 
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany ze st ężeniem wzrost odtwarzalno ści w pewnej ilo ści 
komórek z aberracjami chromosomowymi. Biologiczne znaczenie 
wyników powinno zosta ć wzięte pod uwag ę w pierwszej kolejno ści. 
Metody statystyczne mog ą zostać wykorzystane jako metody pomoc ­
nicze w przeprowadzaniu oceny wyników (3)(13). Znaczenie staty ­
styczne nie powinno by ć jedynym czynnikiem okre ślającym 
w odniesieniu do reakcji pozytywnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Wzrost ilo ści komórek poliploidalnych mo że wskazywa ć, że 
substancja badana ma potencja ł do wstrzymywania procesów mito ­
tycznych oraz pobudzania liczbowych aberracji chromosomowych. Wzrost liczby komórek z endoreduplikowanymi chromosomami może wskazywa ć, że substancje badane maj ą potencja ł wstrzymy ­
wania post ępowania cyklu komórkowego (17)(18).
 
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w tym syste ­
mie. 
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ło w jasny sposób 
pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych b ędzie uniemo żliwiał dokonanie ostatecznej oceny 
dotyczącej aktywno ści substancji badanej. Wyniki mog ą pozostać 
niejednoznaczne lub sporne, niezale żnie od tego, ile razy do świad­
czenia by ły powtarzane.
 
Wyniki pozytywne z badania chromosomowej aberracji  in vitro  
wskazują, że substancja badana wywo łuje aberracje. Wyniki nega ­
tywne wskazuj ą, że w warunkach badawczych substancja badana nie 
wywołuje aberracji chromosomowej hodowanych komórek soma ­
tycznych ssaków.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Komórki:  
— rodzaj i źródło komórek,  
— cechy kariotyczne oraz odpowiednio ść wykorzystanych komórek,  
— nieobecno ść mykoplazmy, je żeli ma zastosowanie,  
— informacja w sprawie d ługości cyklu komórkowego,  
— płeć dawcy krwi, krew ca łkowita lub oddzielone limfocyty, 
wykorzystany mitogen,  
— liczba przej ść, jeżeli ma zastosowanie,  
— metoda utrzymania hodowli komórek, je żeli ma zastosowanie,  
— zmienna liczba chromosomów.  
Warunki badania:  
— tożsamość metafazy zatrzymuj ącej substancj ę, jej stężenie oraz 
czas trwania poddania dzia łania substancji,  
— racjonalne uzasadnienie wyboru st ężeń oraz liczby hodowli, 
w tym np. dane dotycz ące cytotoksyczno ści oraz ogranicze ń 
rozpuszczalno ści, jeżeli są dostępne, 
— skład podłoża, stężenie CO  2 , jeżeli ma zastosowanie,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— stężenie substancji badanej,  
— objętość nośnika oraz dodanej substancji badanej,  
— temperatura inkubacji,  
— czas inkubacji,  
— czas trwania poddania dzia łaniu substancji,  
— gęstość komórki w czasie osadzania, je żeli właściwe,  
— typ oraz sk ład systemu aktywacji metabolicznej w łącznie 
z kryteriami dopuszczalno ści, 
— kontrole pozytywne i negatywne,  
— metody przygotowania szkie łek mikroskopowych,  
— kryteria w odniesieniu do oceniaj ącej aberracji,  
— liczba przeanalizowanych metafaz,  
— metody pomiarów toksyczno ści, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne, negatywne lub niejed ­
noznaczne,  
Wyniki:  
— oznaki toksyczno ści, np. stopie ń zrastania si ę strumieni, dane 
dotyczące cyklu komórkowego, obliczenia liczby komórek, 
indeks mitotyczny,  
— oznaki str ącania,  
— dane dotycz ące pH oraz osmolalno ści podłoża poddania dzia łaniu 
substancji, je żeli są określone,  
— definicje aberracji, w tym szczelin,  
— liczba komórek z aberracjami chromosomowymi oraz typ aber ­
racji chromosomowej podane osobno w odniesieniu do ka żdej 
poddanej dzia łaniu substancji badanej oraz kontrolnej hodowli,  
— zmiany poliploidalno ści, jeżeli są znane,  
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, w miarę możliwości, 
— analizy statystyczne, je żeli istniej ą, 
— dane dotycz ące równoleg łych negatywnych (rozpuszczalnik/ ­
nośnik) oraz pozytywnych kontroli,  
— historyczne dane dotycz ące negatywnych (rozpuszczalnik/no śnik) 
oraz pozytywnych kontroli, ze średnimi oraz standardowymi 
odchyleniami.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. ODNIESIENIA  
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting 
Chemical Mutagens, w:  Chemical mutagens, Principles 
and Methods for their Detection,  Vol. 4, Hollaender, A. 
(ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1–29.  
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (19 8 5), The  In vitro  Chro­
mosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in:  Progress in Mutation 
Research,  Vol. 5, Ashby, J. et al., (eds) Elsevier Science 
Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427–432.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F., 
Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese 
hamster ovary cellS: Evaluation of 108 chemicals,  Environs, 
Molec. Mutagen  10 (suppl.10), pp. 1–175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M. Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity 
under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation Res., 257, pp.  147–204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells,  Mutation  Res., 268, pp. 297–305.
 
(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test,  
Mutation Res.,  31, pp. 347–364.
 
(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173–215.
 
(1) (8) Natarajan, A. T., Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, 
M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of 
Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal 
System  In vitro,  I. Induction of Chromosome Aberrations 
and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dime-thylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in 
the Presence of Rat-Liver Microsomes,  Mutation Res.,  37, 
pp. 83–90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), 
Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined 
with S9 Mix  In vitro, Mutation Res.,  66, pp. 277–290.  
(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, 
D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. 
(1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in  
In vitro  Genotoxicity Assays,  Mutagenesis, 7,  pp. 175–177.
 
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A. Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, 
F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds),  In 
vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing,  Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88.
 
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. 
L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P., Sofu-mi, T. (1994), Report from Working Group on in  In vitro  Tests 
for Chromosomal Aberrations,  Mutation Res.,  312, pp. 
241–261.
 
(13) Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., 
Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data 
from  In vitro  Cytogenetic Assays, w:  Statistical Evaluation 
of Mutagenicity Test Data,  Kirkland, D. J., (cd) Cambridge 
University Press, Cambridge, pp. 141–154.  
(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks 
are not Necessary for  In vitro  Chromosome Aberration 
Assays in CHO Cells,  Mutation Res.,  312, pp. 139–149.  
(15) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. 
M. (eds),  Genotoxic Effects of Airborne Agents,  New York, 
Plenum, pp. 91–103.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells 
Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay,  Environ ­
mental Mutagenesis,  5, pp. 795–801.
 
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese 
hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest,  
Mutation Res.,  119, pp. 403–413.  
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidico ­
lin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  
Cancer Res.,  43, pp. 1362–1364.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE ABERRACJI CHROMOSO ­
MOWEJ SZPIKU KOSTNEGO  IN VIVO  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 475, metody badania aber ­
racji chromosomowej szpiku kostnego (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Badanie aberracji chromosomowej ssaków  in vivo  jest wykorzysty ­
wane w celu wykrycia strukturalnych aberracji chromosomowych 
komórek szpiku kostnego zwierz ąt, zwykle gryzoni, wywo łanych 
przez substancje badane (1)(2)(3)(4). Strukturalne aberracje mog ą 
występować w dwóch typach, chromosomowym lub chromatydo ­
wym. Wzrost poliploidalno ści może wskazywa ć, że substancja 
chemiczna ma potencja ł do wywo ływania aberracji liczbowej. 
W przypadku mutagenów chemicznych wi ększość wywołanych aber ­
racji jest typu chromatydowego, ale mog ą pojawia ć się również 
aberracje typu chromosomowego. Mutacje chromosomowe oraz 
powiązane z nimi zdarzenia s ą przyczyn ą wielu ludzkich chorób 
genetycznych oraz istnieje dowód na to, że mutacje chromosomowe 
oraz związane z nimi zdarzenia powoduj ące zmiany w onkogenach 
oraz genach hamowania nowotworów komórek somatycznych s ą 
odpowiedzialne za wywo ływanie raka u ludzi oraz zwierz ąt doświad­
czalnych.  
Rutynowo w badaniach tych wykorzystuje si ę gryzonie. Docelow ą 
komórką w tym badaniu jest szpik kostny, ze wzgl ędu na to, że jest 
on wysoce unaczynion ą tkanką oraz zawiera populacje komórek 
o szybkich cyklach, które mog ą być bez trudu wyizolowane oraz 
poddane dzia łaniu substancji. Inne gatunki oraz tkanki docelowe 
nie są przedmiotem wykorzystania tej metody.  
To badanie chromosomowej aberracji ma szczególne znaczenie 
w odniesieniu do oceny zagro żenia mutagennego, w zwi ązku 
z czym pozwala ono na wykorzystanie st ężenia czynników metabo ­
lizmu  in vivo,  farmakokinetyków oraz procesów naprawy DNA, 
chociaż mogą one różnić się od siebie w zale żności od gatunku 
oraz tkanek. Badanie  in vivo  jest równie ż użyteczne w odniesieniu 
do dalszych bada ń wyników mutagennych wykrytych w badaniu  in 
vitro . 
Jeżeli istnieje dowód na to, że substancja badana lub metabolit reak ­
cyjny nie dotrze do tkanki docelowej, niew łaściwe jest wykorzys ­
tanie tej metody.  
Zob. równie ż Ogólne wprowadzenie do cz ęści B.  
1.2. DEFINICJE  
Aberracja typu chromatydowego:  strukturalne uszkodzenie chro ­
mosomu, wyra żone jako p ękanie pojedynczych chromatydów lub 
pękanie oraz ponowne łączenie mi ędzy chromatydami.  
Aberracja typu chromosomowego:  strukturalne uszkodzenie chro ­
mosomu, wyra żone jako p ękanie pojedynczych chromatydów lub 
pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej 
lokalizacji.  
Endoreduplikacja:  proces, w którym po okresie replikacji DNA 
jądro nie ulega mitozie, ale rozpoczyna nowy okres S. Wynikiem 
są chromosomy o 4, 8, 16, ... chromatydach.  
Szczelina:  achromatyczne uszkodzenie mniejsze ni ż szerokość chro­
matydu, powoduj ąca minimalne wypaczeniu chromatydu(-ów).  
Aberracja liczbowa:  zmiana w ilo ści chromosomów w odniesieniu do 
normalnej ilo ści charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploidalno ść: wielokrotno ść ilości chromosomów haploidalnych 
(n) inna ni ż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.).  
Aberracja strukturalna:  zmiana w strukturze chromosomu, wykry ­
walna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podzia łu komó­
rek, zaobserwowana jako usuni ęcia oraz fragmenty, zmiany 
(zachodzące – wewn ątrz oraz mi ędzy chromosomami).  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zwierzęta są poddane dzia łaniu substancji badanej odpowiedni ą 
drogą oraz są uśmiercane w odpowiednim czasie po badaniu. 
Przed uśmierceniem zwierz ęta są poddane dzia łaniu metafazy zatrzy ­
mującej substancje (np. Colcemid® lub kolchicyna). Nast ępnie doko ­
nuje się przygotowania chromosomu ze szpiku kostnego oraz zabar ­
wienia, a komórki metafazy s ą analizowane w odniesieniu do aber ­
racji chromosomowej.  
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Preparaty  
1.4.1.1.  Wybór gatunku zwierz ąt 
Szczury, myszy i chomiki chi ńskie są powszechnie wykorzystywane, 
chociaż może zostać wykorzystany ka żdy odpowiedni gatunek 
ssaków. Powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy 
młodych, zdrowych, doros łych zwierz ąt powinny zosta ć wykorzys ­
tane w badaniu. W czasie przeprowadzania badania ró żnice w masie 
zwierząt powinny by ć minimalne oraz nie powinny przekracza ć ± 
20 % średniej masy ka żdej płci. 
1.4.1.2.  Warunki pobytu i karmienia  
Ogólne warunki okre ślone w ogólnym wprowadzeniu do cz ęści 
B mają zastosowanie, chocia ż celem w odniesieniu do wilgotno ści 
powinien by ć poziom wilgotno ści 50–60 %.  
1.4.1.3.  Preparaty zwierz ęce 
Zdrowe m łode doros łe osobniki zwierz ąt są losowo przypisane do 
grup kontrolnych oraz grup poddanych dzia łaniu substancji. Klatki 
powinny zosta ć przygotowane w sposób minimalizuj ący możliwe 
skutki negatywne wynikaj ące z umieszczenia w klatce. Zwierz ęta 
są identyfikowane oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryj ­
nych przynajmniej przez okres pi ęciu dni.  
1.4.1.4.  Przygotowanie dawek  
Substancje badane sta łe powinny zosta ć rozpuszczone lub zawie ­
szone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczone, je żeli stosowne, przed dozowaniem zwierz ętom. 
Substancje badane p łynne mog ą być dawkowane bezpo średnio lub 
mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zosta ć 
wykorzystane świeżo przygotowane substancje, chyba że dane 
dotyczące stabilno ści wskazuj ą, iż dopuszczalne jest sk ładowanie 
substancji.  
1.4.2.  Warunki badania  
1.4.2.1.  Rozpuszczalnik/no śnik 
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien wywo ływać skutków toksycznych 
przy wykorzystywanych dawkach oraz nie powinien mie ć możliwości 
reagowania chemicznego z substancj ą badaną. Jeśli inne ni ż dobrze 
znane rozpuszczalniki/no śniki są wykorzystywane, ich w łączenie do 
doświadczenia powinno by ć wsparte danymi wskazuj ącymi ich zgod ­
ność. Zaleca si ę, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści 
rozważone zosta ło wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/ ­
nośników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Kontrole  
Równoleg łe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/ ­
nośnik) powinny zosta ć przeprowadzone w odniesieniu do ka żdej 
płci w ramach ka żdego badania. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu 
substancji badanej zwierz ęta w grupie kontrolnej powinny by ć przed­
miotem identycznych dzia łań w porównaniu ze zwierz ętami w grupie 
poddanej dzia łaniu substancji.  
Kontrole pozytywne powinny wywo ływać strukturalne aberracje  in 
vivo przy poziomie poddania dzia łaniu substancji, w odniesieniu do 
którego oczekuje si ę wykrywalnego wzrostu powy żej tło. Dawki 
kontroli pozytywnych powinny zosta ć dobrane tak, aby wyniki 
były jasne, ale by badaj ącemu nie ujawnia ły bezpośrednio to żsa­
mości sporządzonych szkie łek mikroskopowych. Dopuszczalne jest, 
aby pozytywne kontrole podawane by ły inną drogą niż substancje 
badane oraz aby ich próbki pobierane by ły tylko jeden raz. Wyko ­
rzystanie substancji chemicznych kontroli pozytywnych powi ązanych 
z klasą chemiczn ą może być brane pod uwag ę, jeżeli są one 
dostępne. Przyk łady substancji pozytywnych kontroli obejmuj ą: 
Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Metanosulfonat etylu 62-50-0 200-536-7 
Nitrozomocznik etylu 759-73-9 212-072-2 
Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 
Cyklofosfamid 
Cyklofosfamid monohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietylenomelamina 51-18-3 200-083-5  
Negatywne kontrole z poddaniem dzia łaniu samego rozpuszczalnika lub 
nośnika, a w innych przypadkach poddanie dzia łaniu w ten sam sposób 
jak grupy poddane dzia łaniu substancji, powinny zosta ć objęte 
każdorazowym pobieraniem próbek, chyba że zmienno ść oraz częstot­
liwości komórek z aberracjami chromosomowymi s ą dostępne 
w historycznych danych dotycz ących kontroli. Je żeli stosowane jest 
jednokrotne pobieranie próbek w odniesieniu do negatywnych kontroli, 
najbardziej odpowiednim czasem jest pierwsze pobranie próbek. Dodat ­
kowo kontrole bez poddania dzia łaniu substancji powinny by ć również 
wykorzystywane, chyba że istnieją historyczne lub opublikowane dane 
dotyczące kontroli wykazuj ące, że wybrany rozpuszczalnik/no śnik nie 
wywołuje żadnych skutków szkodliwych lub mutagennych.  
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Liczba oraz p łeć zwierząt 
Każda z poddanych dzia łaniu substancji oraz kontrolnych grup obejmuje 
przynajmniej pi ęć nadających się do poddania analizie zwierz ąt każdej 
płci. Jeżeli w czasie badania istniej ą dostępne dane z bada ń naukowych 
dotyczących tego samego gatunku oraz z wykorzystaniem tej samej 
drogi poddania dzia łania substancji, które wykazuj ą, że nie istniej ą 
zasadnicze ró żnice w toksyczno ści między płciami, wówczas badanie 
na jednej p łci będzie wystarczaj ące. W przypadku gdy poddanie cz ło­
wieka dzia łaniu substancji chemicznej mo że być zależne od płci, jak na 
przykład w odniesieniu do niektórych czynników środków farmaceu ­
tycznych, badanie powinno zosta ć przeprowadzone na zwierz ętach 
odpowiedniej p łci. 
1.5.2.  Harmonogram poddawania dzia łaniu substancji  
Substancje badane s ą podawane przede wszystkim jako pojedynczy 
zabieg. Substancje badane mog ą być również podawane jako dawka 
rozbita na cz ęści, np. dwa zabiegi, tego samego dnia w odst ępie nie 
dłuższym niż kilku godzin, w celu u łatwienia podawania jako du ża 
objętość substancji. Inne re żimy dawki powinny zosta ć naukowo 
uzasadnione.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Próbki powinny by ć pobierane dwukrotnie w ci ągu jednego dnia po 
poddaniu dzia łaniu substancji. W odniesieniu do gryzoni pierwszy 
odstęp czasu mi ędzy pobieraniem trwa 1,5 d ługości normalnego 
cyklu komórkowego (ten ostatni trwa przeci ętnie 12–18 godzin) po 
poddaniu dzia łaniu substancji. Ze wzgl ędu na to, że czas wymagany 
na pobór oraz przemian ę materii substancji badanej, jak równie ż jej 
skutki na kinetyk ę cyklu komórkowego mo że wpływać na opty ­
malny czas wykrywania aberracji chromosomowej, zalecane jest późniejsze pobieranie próbek w 24 godziny po pobraniu pierwszej 
próbki. Je żeli wykorzystywane s ą reżimy dawki wi ększe niż jeden 
dzień, zastosowany powinien zosta ć jeden okres pobierania próbek 
w czasie1,5 d ługości trwania normalnego cyklu komórkowego po 
przeprowadzeniu ko ńcowego poddania dzia łaniu substancji.
 
Przed uśmierceniem zwierz ętom wstrzykuje si ę wewnątrzotrzew ­
nowo odpowiedni ą dawkę czynnika zatrzymuj ącego metafaz ę (np. 
Colcemid® lub kolchicyna). W nast ępnej kolejno ści pobiera si ę 
próbki od zwierz ąt w odpowiednich odst ępach czasu. 
W odniesieniu do myszy odst ęp czasu mi ędzy pobieraniem próbek 
wynosi 3–5 godzin; w odniesieniu do chomików ten odst ęp czasu 
wynosi 4–5 godzin. Komórki s ą pobierane ze szpiku kostnego oraz 
analizowane pod k ątem wyst ępowania aberracji chromosomowych.  
1.5.3.  Poziomy dawek  
Jeżeli zakres bada ń jest przeprowadzanych ze wzgl ędu na to, że nie 
istnieją dostępne odpowiednie dane, powinny by ć one prowadzone 
w tym samym laboratorium, wykorzystuj ąc ten sam re żim gatunku, 
szczepu, p łci oraz poddawania dzia łaniu substancji, który ma zosta ć 
zastosowany do g łównego badania (5). Je żeli istnieje toksyczno ść, 
trzy poziomy dawek s ą stosowane w odniesieniu do pierwszego 
okresu pobierania próbek. Trzy poziomy dawek powinny obj ąć 
zakres od maksimum do niskiej toksyczno ści lub do jej braku. 
W trakcie pó źniejszego okresu pobierania próbek musz ą zostać 
wykorzystane jedynie najwy ższe dawki. Najwy ższa dawka jest 
określona jako dawka wywo łująca oznaki toksyczno ści, a wyższe 
poziomy dawek oparte na tym samym re żimie dawkowania mog łyby 
być śmiertelne. Substancje o szczególnej aktywno ści biologicznej 
przy niskich nietoksycznych dawkach (takie jak hormony 
i mitogeny) mog ą stanowić wyjątek w odniesieniu do kryteriów 
ustalania dawki i powinny by ć oceniane na zasadzie jednostkowych 
przypadków. Najwy ższa dawka mo że być również określona jako 
dawka, która wywo łuje pewne wskazania toksyczno ści w szpiku 
kostnym (np. wy ższa niż 50 % redukcja indeksu mitotycznego).  
1.5.4.  Badanie ograniczone  
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek o przynajmniej 2 000 
mg/kg masy cia ła, wykorzystuj ące pojedyncze poddanie dzia łaniu 
substancji, lub jak dwa zabiegi poddania dzia łaniu substancji tego samego 
dnia, nie daje dostrzegalnych wyników toksycznych, oraz je żeli nie podej ­
rzewa się genotoksyczno ści w oparciu o dane dotycz ące substancji powi ­ 
ązanych strukturalnie, wó wczas przeprowadzenie pe łnego badania mo że 
nie być konieczne. W odniesieniu do bada ń o dłuższym czasie trwania 
ograniczenie dawki wynosi 2 000 mg/kg/masa cia ła/dzień w odniesieniu 
do poddawania dzia łaniu substancji trwaj ącego do 14 dni oraz 1 000 mg/ ­
kg/masa cia ła/dzień w odniesieniu do poddawania dzia łaniu substancji 
trwającego dłużej niż 14 dni. Spodziewa si ę, iż poddanie cz łowieka dzia ­ 
łaniu substancji mo że wykazać potrzebę wykorzystania wi ększej dawki 
w badaniu ograniczonym.  
1.5.5.  Dawkowanie  
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zg łębnik żołądkowy 
lub odpowiedni ą rurkę intubacyjn ą, lub przez wstrzykni ęcie wewnątrzot­
rzewnowe. Inne drogi poddania dzia łaniu substancji mog ą być dopusz­
czalne w przypadku, gdy ich wykorzystanie jest uzasadnione. Maksy ­
malna obj ętość płynu, jaka mo że być podana przez zg łębnik lub 
wstrzykni ęta jednorazowo, zale ży od wielko ści badanego zwierz ęcia. 
Objętość nie powinna przekracza ć 2 ml/100 g masy cia ła. Wykorzys ­
tanie objętości wyższych niż te musi by ć uzasadnione. Z wyj ątkiem 
podrażniających lub żrących substancji, które zazwyczaj ujawniaj ą 
zwiększone skutki o du żym stężeniu, zmienno ści w objętości substancji 
badanej powinny zosta ć zminimalizowane przez dostosowanie st ężenia 
w celu zapewnienia sta łej objętości przy wszystkich poziomach dawek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Preparaty chromosomów  
Zaraz po u śmierceniu zwierz ęcia, uzyskuje si ę szpik kostny, poddany 
działaniu roztworu hipotonicznego oraz ustabilizowany. Komórki s ą 
następnie rozmieszczane na szkie łku mikroskopu i barwione.  
1.5.7.  Analiza  
Indeks mitotyczny powinien zosta ć oznaczony jako miara cytoto ­
ksyczności w przynajmniej 1 000 komórek na zwierz ę 
w odniesieniu do wszystkich poddanych dzia łaniu substancji 
zwierząt (łącznie z pozytywnymi kontrolami) lub kontrolowanych 
zwierząt, które nie zosta ły poddane dzia łaniu substancji.  
Przynajmniej 100 komórek powinno zosta ć poddane analizie 
w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia. Liczba ta mo że zostać zmniej­
szona, jeśli zaobserwowano du żą liczbę aberracji. Wszystkie szkie łka 
mikroskopowe, w tym dotycz ące negatywnych i pozytywnych 
kontroli, powinny by ć niezależnie zakodowane przed analiz ą mikro­
skopową. Poniewa ż procedury przygotowania szkie łka mikroskopo ­
wego często skutkuj ą przerwaniem proporcji mi ędzy metafaz ą ze 
stratą chromosomów, oceniane komórki powinny z tego wzgl ędu 
zawierać pewną liczbę centromerów równ ą 2n ± 2.  
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Dane dotycz ące poszczególnych zwierz ąt powinny zosta ć przedsta ­
wione w formie tabelarycznej. Jednostk ą doświadczaln ą jest zwierz ę. 
W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia ocenione powinny zosta ć: 
liczba ocenionych komórek, liczba aberracji przypadaj ących na 
komórkę oraz udzia ł procentowy komórek ze strukturalnymi aberra ­
cjami chromosomowymi. Ró żne typy strukturalnej aberracji chromo ­
somowej powinny by ć wymienione wraz z ich ilo ściami oraz cz ęs­
totliwościami w odniesieniu do grupy poddanej dzia łaniu substancji 
oraz kontrolnej. Szczeliny s ą oddzielnie odnotowywane oraz zg ła­
szane, ale ogólnie nie s ą włączane do cz ęstotliwości aberracji 
ogółem. Jeżeli nie ma dowodu na ró żnicę między płciami, dane 
dotyczące obu p łci mogą zostać połączone dla przeprowadzenia 
analizy statystycznej.  
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany z dawk ą wzrost odpowiedniej ilo ści komórek z aberracjami 
chromosomowymi lub wyra źny wzrost w ilo ści komórek 
z aberracjami w grupie pojedynczej dawki przy jednym okresie pobierania próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zosta ć 
wzięte pod uwag ę w pierwszej kolejno ści. Metody statystyczne mog ą 
zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu 
oceny wyników (6). Znaczenie statystyczne nie powinno by ć 
jedynym czynnikiem okre ślającym w odniesieniu do reakcji pozy ­
tywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zosta ć wyjaśnione przez 
dalsze badanie, w szczególno ści z wykorzystaniem modyfikacji 
warunków do świadczalnych.
 
Wzrost liczby komórek poliploidalnych mo że wskazywa ć, że 
substancja badana ma potencja ł wywoływania liczbowych aberracji 
chromosomowych. Wzrost endoreduplikacji chromosomami mo że 
wskazywa ć, że substancje badane maj ą potencja ł wstrzymywania 
postępowania cyklu komórkowego (7)(8).  
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w tym badaniu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ła w jasny sposób 
pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw 
danych wyklucza dokonanie ostatecznej oceny dotycz ącej aktyw ­
ności badanej substancji. Wyniki mog ą pozostać niejednoznaczne 
lub sporne niezale żnie od liczby powtórzonych do świadczeń. 
Wyniki pozytywne z badania aberracji chromosomowej wskazuj ą, że 
substancja badana wywo łuje chromosomow ą aberracj ę w szpiku 
kostnym badanych gatunków. Wyniki negatywne wskazuj ą, że 
w warunkach badawczych substancja badana nie pobudza aberracji 
chromosomowej w szpiku kostnym badanych zwierz ąt. 
Prawdopodobie ństwo, że substancja badana lub jej metabolity docie ­
rają do ogólnego obiegu lub w szczególno ści do tkanki docelowej 
(np. toksyczno ść systemowa), powinno zosta ć wzięte pod uwag ę. 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Badane zwierz ęta: 
— gatunek/szczep wykorzystany,  
— liczba, wiek oraz p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki przetrzymywania, od żywianie itp.,  
— indywidualna masa zwierz ęcia na pocz ątku badania, łącznie 
z zakresem masy cia ła, średnimi oraz standardowymi odchyle ­
niami dla ka żdej grupy.  
Warunki badania:  
— pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/no śnik) kontrole,  
— dane z zakresu studium dotycz ącego okre ślania zakresu badania, 
jeżeli zostały przeprowadzone,  
— racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do zamkni ętego wyboru 
dawek,  
— szczegó ły dotyczące przygotowania substancji badanej,  
— szczegó ły dotyczące podawania substancji badanej,  
— racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,  
— metody sprawdzania, czy substancja badana dotar ła do ogólnego 
obiegu lub tkanki docelowej, je żeli ma zastosowanie,  
— zmiana st ężenia substancji badanej w od żywianiu/wodzie pitnej 
(ppm) na rzeczywist ą dawkę (mg/kg masy cia ła/dzień), jeżeli ma 
zastosowanie,  
— szczegó ły dotyczące jakości pokarmu oraz wody,  
— szczegó łowy opis harmonogramów poddawania dzia łaniu 
substancji oraz pobierania próbek,  
— metody pomiarów toksyczno ści, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— tożsamość metafazy zatrzymuj ącej substancje, jej st ężenie oraz 
czas trwania poddania dzia łaniu substancji,  
— metody przygotowania szkie łek mikroskopowych,  
— kryteria w odniesieniu do aberracji oceniaj ącej, 
— liczba komórek obj ętych analiz ą przypadaj ąca na zwierz ę, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne, negatywne lub niejed ­
noznaczne.  
Wyniki:  
— oznaki toksyczno ści, 
— indeks mitotyczny,  
— typ oraz liczba aberracji, podane oddzielnie dla ka żdego zwie ­
rzęcia, 
— liczba aberracji ogó łem na grup ę ze średnimi i standardowymi 
odchyleniami,  
— liczba komórek z aberracjami na grup ę ze średnimi 
i standardowymi odchyleniami,  
— zmiany poliploidalno ści, jeżeli są znane,  
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, w miarę możliwości, 
— analizy statystyczne, je żeli istniej ą, 
— dane dotycz ące równoleg łych kontroli negatywnych,  
— historyczne dane dotycz ące negatywnych kontroli, z zakresami, 
średnimi oraz standardowymi odchyleniami,  
— dane dotycz ące równoleg łych pozytywnych kontroli.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. ODNIESIENIA  
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, w:  
Mutagenicity Testing: a Practical Approach,  S. Venitt and 
J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275–306.
 
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., 
McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian  In vivo  
Cytogenetic AssayS: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells,  Mutation Res.,  189, pp. 157–165.
 
(1) (3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., 
Bootman, J. and Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic 
Assays, w: D. J. Kirkland (ed.),  Basic Mutagenicity Tests, 
UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee 
on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised,  Cambridge University Press, Cambridge, New 
York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
 
(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., 
Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson 
Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in  vivo  Mammalian Bone 
Marrow Chromosomal Aberration Test,  Mutation Res.,  312, 
pp. 305–312.
 
(5) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., 
Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental 
Mutagen Society Working Group: Dose setting in  In vivo  
Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and 
Savage, J. R. K. (19 8 9), Statistical Analysis of  In vivo  
Cytogenetic Assays, w: UKEMS  Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical 
Evaluation of Mutagenicity Test Data,  D. J. Kirkland (ed.) 
Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184–232.  
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese 
hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest,  
Mutation Res.,  119, pp. 403–413.  
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidico ­
lin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells,  
Cancer Res.,  43, pp. 1362–1364.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE MIKROJ ĄDROWE ERYTRYO ­
CYTOW  IN VIVO  U SSAKÓW  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 474, metody badania mikro ­
jądrowego erytrocytów in  vivo  u ssaków (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Badanie mikroj ądrowe erytrocytów u ssaków  in vivo  jest wykorzy ­
stywane w celu wykrycia uszkodze ń wywołanych przez chromosomy 
lub aparat mitotyczny erytroblastów przez analiz ę erytrocytu pobra ­
nego jako próbka szpiku kostnego lub komórek krwi obwodowej 
zwierząt, zazwyczaj gryzoni.  
Celem badania mikroj ądrowego jest identyfikacja substancji powo ­
dujących cytogenetyczne uszkodzenia, które skutkuj ą formowaniem 
się mikrojądra zawieraj ącego okrywaj ące fragmenty chromosomów 
lub całe chromosomy.  
Kiedy w erytrobla ście szpiku kostnego rozwija si ę w erytrocyt poli ­
chromatyczny, g łówne jądro jest wyrzucane; ka żde mikroj ądro, które 
zostało uformowane, mo że pozosta ć poza cytoplazm ą poddaną 
w inny sposób tworzeniu si ę zarodników. Wizualizacja mikroj ądra 
jest ułatwiona w tych komórkach, poniewa ż brak im g łównego j ądra. 
Wzrost cz ęstotliwości mikroj ądrowych polichromicznych erytro ­
cytów w zwierz ętach poddanych dzia łaniu substancji jest wskaza ­
niem wywo łanego uszkodzenia chromosomu.  
Szpik kostny gryzoni jest rutynowo wykorzystywany w tych bada ­
niach ze wzgl ędu na to, że erytrocyty polichromiczne produkowane 
są w tej tkance. Pomiar mikroj ądrowych niedojrza łych (polichro ­
micznych) erytrocytów w krwi obwodowej jest na równi dopusz ­
czalny w odniesieniu do jakiegokolwiek gatunku, co do którego 
wykazana zosta ła niezdolno ść śledziony do usuni ęcia mikroj ądro­
wego erytrocytu lub który wskaza ł odpowiedni ą czułość w celu 
wykrywania czynników, które powoduj ą strukturalne lub liczbowe 
aberracje chromosomowe. Mikroj ądro może być wyróżnione 
w oparciu o ró żne kryteria. Obejmuj ą one identyfikacje obecno ści 
lub nieobecno ści kinetochoru lub centromeru DNA w mikroj ądrze. 
Częstotliwość mikrojądrowych niedojrza łych (polichromicznych) 
erytrocytów jest g łównym punktem ko ńcowym. Liczba dojrza łych 
erytrocytów w krwi obwodowej, które zawieraj ą mikrojądro, pośród 
danej ilości dojrzałych erytrocytów mo że być również wykorzystana 
jako punkt ko ńcowy oznaczania, je śli zwierzęta są poddawane dzia ­ 
łaniu substancji przez cztery tygodnie lub d łużej. 
To badanie mikroj ądrowe erytrocytów u ssaków  in vivo  ma szcze ­
gólne znaczenie dla oceniania zagro żenia, w zwi ązku z czym 
pozwala ono na st ężenie czynników metabolizmu farmakokinetyków 
oraz procesów naprawy DNA chocia ż mogą one ró żnić się 
wzajemnie w zale żności od gatunku oraz tkanek, oraz genetycznych 
punktów ko ńcowych. Badanie  in vivo  jest równie ż użyteczne 
w odniesieniu do dalszych bada ń skutków mutagennych wykrytych 
w systemie  in vitro.  
Jeżeli istnieje dowód na to, że substancja badana lub metabolit reak ­
cyjny nie dotrze do tkanki docelowej, niew łaściwe jest wykorzys ­
tanie tego badania.  
Zob. równie ż Ogólne wprowadzenie do cz ęści B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINICJE  
Centromer (Kinetochor):  region(-y) chromosomu, w którym(-ch) 
mikrotubule wrzeciona podzia łowego s ą asocjowane w trakcie 
podziału komórki, dopuszczaj ąc uporządkowane przemieszczanie 
się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych.  
Mikrojądra: małe jądra, oddzielone oraz wyst ępujące dodatkowo 
w stosunku do j ądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telo ­
fazy mitozy (mejozy) przez okrywaj ące fragmenty chromosomów 
lub całe chromosomy.  
Erytrocyt normochromiczny:  dojrzały erytrocyt, któremu brakuje 
rybosomów oraz mo że być odróżniony od niedojrza łego, polichro ­
matycznych erytrocytów przez szczepy wybiórczo w odniesieniu dla rybosomów.
 
Erytrocyt polichromiczny:  niedojrza ły erytrocyt, w po średnim 
stadium rozwoju, który nadal zawiera rybosomy i z tego wzgl ędu 
może zostać odróżniony od dojrza łych, normochromicznych erytro ­
cytów, dzi ęki plamom selektywnym dla rybosomów.  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zwierzęta są poddane dzia łaniu substancji badanej odpowiedni ą 
drogą. Jeżeli wykorzystywany jest szpik kostny, zwierz ęta są uśmier­
cane w odpowiednim czasie po poddaniu dzia łaniu substancji, 
pobiera si ę szpik kostny, sporz ądzane są preparaty oraz dokonuje 
się barwienia (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Kiedy wykorzystywana jest 
krew obwodowa, krew pobierana jest w odpowiednim czasie po 
poddaniu dzia łaniu substancji oraz sporz ądzane są i barwione prepa ­
raty wymazowe (4)(8)(9)(10). W odniesieniu do bada ń z krwią 
obwodow ą powinno up łynąć możliwie jak najmniej czasu mi ędzy 
ostatnim poddaniem dzia łaniu substancji a pobraniem komórek. 
Preparaty s ą analizowane pod k ątem obecno ści mikroj ądra. 
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Preparaty  
1.4.1.1.  Wybór gatunku zwierz ąt 
Szczury lub myszy s ą zalecane, je śli wykorzystywany jest szpik 
kostny, chocia ż może zostać wykorzystany ka żdy odpowiedni 
gatunek ssaków. Je śli wykorzystywana jest krew obwodowa, zale ­
cane są myszy. Jednak że może zostać wykorzystany ka żdy odpo­
wiedni gatunek ssaków pod warunkiem, że jest gatunkiem, 
w którym śledziona nie usuwa mikroj ądrowych erytrocytów lub 
gatunkiem, który wykaza ł czułość odpowiedni ą do wykrycia czyn ­
ników powoduj ących strukturalne lub liczbowe aberracje chromoso ­
mowe. Powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy m łodych 
zdrowych doros łych zwierz ąt powinny zosta ć wykorzystane 
w badaniu. W czasie przeprowadzania badania ró żnice w masie 
zwierząt powinny by ć minimalne i nie powinny przekracza ć ± 
20 % średniej masy ka żdej płci. 
1.4.1.2.  Warunki przetrzymywania i karmienia  
Ogólne warunki okre ślone w ogólnym wprowadzeniu do cz ęści B są 
stosowane, chocia ż celem w odniesieniu do wilgotno ści powinien 
być poziom 50–60 %.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Przygotowanie zwierz ąt 
Zdrowe m łode doros łe osobniki zwierz ąt są losowo przypisane do 
grup kontrolnych oraz grup poddanych dzia łaniu substancji. Zwie ­
rzęta są identyfikowane w niepowtarzalny sposób. Zwierz ęta są akli­
matyzowane do warunków laboratoryjnych przynajmniej przez pi ęć 
dni. Klatki powinny zosta ć przygotowane w sposób minimalizuj ący 
możliwe negatywne skutki wynikaj ące z umieszczenia w klatce.  
1.4.1.4.  Przygotowanie dawek  
Substancje badane sta łe powinny zosta ć rozpuszczone lub zawie ­
szone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczone, je żeli to stosowne, przed dawkowaniem zwierz ętom. 
Substancje badane p łynne mog ą być dawkowane bezpo średnio lub 
mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zosta ć 
wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane 
dotyczące stabilno ści wskazuj ą, iż dopuszczalne jest sk ładowanie 
substancji.  
1.4.2.  Warunki badania  
1.4.2.1.  Rozpuszczalnik/no śnik 
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien wywo ływać skutków toksycz ­
nych przy wykorzystywanych poziomach dawek oraz nie powinien 
mieć możliwości reagowania chemicznego z substancj ą badaną. Jeśli 
inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/no śniki są wykorzystywane, 
ich włączenie do do świadczenia powinno by ć wsparte danymi wska ­
zującymi ich zgodno ść. Zaleca si ę, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej 
kolejności rozważone zosta ło wykorzystanie wodnych rozpuszczalni ­
ków/nośników.  
1.4.2.2.  Kontrole  
Równoleg łe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/ ­
nośnik) powinny zosta ć przeprowadzone w odniesieniu do ka żdej 
płci w ramach ka żdego badania. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu 
substancji badanej zwierz ęta w grupie kontrolnej powinny by ć przed­
miotem identycznych dzia łań w porównaniu ze zwierz ętami w grupie 
poddanej dzia łaniu substancji.  
Kontrole pozytywne powinny wytwarza ć mikrojądro przy poziomie 
poddania dzia łaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje si ę 
wykrywalnego wzrostu wzgl ędem tła. Dawki kontroli pozytywnych 
powinny zosta ć wybrane tak, aby wyniki by ły jasne, ale nie ujaw ­
niały bezpośrednio to żsamości zakodowanych szkie łek mikroskopo ­
wych badaj ącemu. Dopuszczalne jest, aby pozytywne kontrole poda ­
wane były inną drogą niż substancje badane oraz aby ich próbki 
pobierane by ły tylko jeden raz. Dodatkowo wykorzystanie substancji 
chemicznych pozytywnych powi ązanych z klas ą chemiczn ą kontroli 
może być brane pod uwag ę, jeżeli są one dost ępne. Przyk łady pozy­
tywnych substancji kontrolnych obejmuj ą: 
Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Etyl metanosulfonowy 62-50-0 200-536-7 
N-etylo-N-nitrozomocznik 759-73-9 212-072-2 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 Cyklofosfamid 
Cyclofosfamid monohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Trietyleneomelamina 51-18-3 200-083-5
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Negatywne kontrole z poddaniem dzia łaniu samego rozpuszczalnika 
lub nośnika, a w innych przypadkach poddane dzia łaniu w ten sam 
sposób jak grupy poddane dzia łaniu substancji, powinny zosta ć 
objęte każdorazowym pobieraniem próbek, chyba że dopuszczalna 
zmienność oraz częstotliwości komórek z aberracjami chromosomo ­
wymi są dostępne z historycznych danych dotycz ących kontroli. 
Jeżeli stosowane jest jednokrotne pobieranie próbek w odniesieniu 
do negatywnych kontroli, najbardziej odpowiednim czasem jest pierwszy okres pobrania próbek. Dodatkowo kontrole bez poddania 
działaniu substancji powinny by ć również wykorzystywane, chyba że 
istnieją historyczne lub opublikowane dane dotycz ące kontroli wyka ­
zujące, że wybrany rozpuszczalnik/no śnik nie wywo łuje żadnych 
skutków szkodliwych lub mutagennych.
 
Jeżeli wykorzystywana jest krew obwodowa, dopuszczalna mo że być 
również próbka sprzed poddania dzia łaniu substancji jako równoleg ła 
kontroli negatywnej, ale tylko w krótkich badaniach krwi obwo ­
dowej (np. 1–3 zabiegów poddania dzia łaniu substancji), je śli wyni­
kające z badania dane mieszcz ą się w spodziewanym zakresie 
w odniesieniu do kontroli historycznych.  
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Liczba oraz p łeć zwierząt 
Każda z poddanych dzia łaniu substancji oraz kontrolnych grup obej ­
muje przynajmniej pi ęć nadających się do poddania analizie zwierz ąt 
z każdej płci (11). Je żeli w czasie badania istniej ą dostępne dane 
z badań naukowych dotycz ących tego samego gatunku oraz 
z wykorzystaniem tej samej drogi poddania dzia łania substancji, 
które wykazuj ą, że nie istniej ą zasadnicze ró żnice w toksyczno ści 
między płciami, wówczas badanie na jednej p łci będzie wystar ­
czające. Gdy poddanie cz łowieka dzia łaniu substancji chemicznej 
może być zależne od płci, jak na przyk ład w odniesieniu do niektó ­
rych środków farmaceutycznych, badanie powinno zosta ć przepro­
wadzone na zwierz ętach odpowiedniej p łci. 
1.5.2.  Harmonogram poddawania dzia łaniu substancji  
Nie można zaleci ć żadnego harmonogramu poddawania dzia łaniu 
substancji (np. jeden, dwa albo wi ęcej zabiegów poddawania dzia ­ 
łaniu substancji w 24-godzinnych odst ępach czasu). Próbki 
z rozszerzonych re żimów dawkowania s ą dopuszczalne, o ile wyka ­
zane zosta ły pozytywne wyniki w odniesieniu do tego badania, 
w odniesieniu do badania negatywnego, o ile wykazana zosta ła 
toksyczno ść lub zosta ła wykorzystana dawka ograniczona oraz 
kontynuowano dawkowanie do momentu okresu pobierania próbek. 
Substancja badana mo że być również podawana jako dawka podzie ­
lona, np. dwa zabiegi poddania dzia łaniu substancji tego samego 
dnia, w odst ępie nie wi ęcej niż kilku godzin, w celu u łatwienia 
podawania du żej objętości substancji.  
Badanie mo żna przeprowadzi ć na dwa sposoby:  
a) zwierz ęta są poddawane dzia łaniu substancji badanej jeden raz. 
Próbki szpiku kostnego s ą pobierane przynajmniej dwukrotnie, 
rozpoczynaj ąc nie wcze śniej niż w 24 godziny po poddaniu dzia ­ 
łaniu substancji badanej, ale nie przed łużając poza okres 48 
godzin po poddaniu dzia łaniu substancji badanej 
z odpowiednimi odst ępami czasu mi ędzy pobieraniem próbek. 
Stosowanie próbek wcze śniej niż 24 godziny po leczeniu 
powinno by ć uzasadnione. Próbki krwi obwodowej s ą pobierane 
przynajmniej dwukrotnie, rozpoczynaj ąc nie wcze śniej niż w 36 
godzin po poddaniu dzia łaniu substancji badanej z odpowiednimi 
odstępami czasu po pobraniu pierwszej próbki, ale nieprzed łużaj­ 
ącymi się powyżej 72 godzin. Je żeli rozpoznano pozytywn ą 
reakcję przy jednym okresie pobierania próbek, nie jest wyma ­
gane dodatkowe pobieranie próbek;  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) jeżeli wykorzystywane s ą dwa lub wi ęcej zabiegów poddawania 
działaniu substancji badanej dziennie (np. dwa lub wi ęcej 
zabiegów poddawania dzia łaniu substancji przy 24-godzinnych 
odstępach czasu), próbki powinny zosta ć zebrane w okresie 
między 18 a 24 godzin ą po końcowym poddaniu dzia łaniu 
substancji w odniesieniu do szpiku kostnego oraz mi ędzy 36 
a 48 godzin ą po poddaniu dzia łaniu substancji w odniesieniu 
do krwi obwodowej (12).  
Można stosowa ć dodatkowo inne okresy pobierania próbek, je żeli są 
one odpowiednie.  
1.5.3.  Poziomy dawek  
Jeżeli studium okre ślające zakres badania jest przeprowadzane ze 
względu na to, że nie istniej ą dostępne odpowiednie dane, powinno 
być ono prowadzane w tym samym laboratorium, wykorzystuj ąc ten 
sam reżim gatunku, szczepu, p łci oraz poddawania dzia łaniu substan ­
cji, który ma zosta ć zastosowany do g łównego badania (13). Je żeli 
istnieje toksyczno ść, trzy poziomy dawek s ą wykorzystywane 
w odniesieniu do pierwszego okresu pobierania próbek. Te poziomy 
dawek powinny obj ąć zakres od najwy ższej do niskiej toksyczno ści 
lub do jej braku. W trakcie pó źniejszego okresu pobierania próbek 
muszą zostać wykorzystane jedynie najwy ższe dawki. Najwy ższa 
dawka jest okre ślona jako dawka wywo łująca oznaki toksyczno ści, 
a wyższe poziomy dawek oparte na tych samych re żimach dotycz ­ 
ących dawkowania mog łyby być zabójcze. Substancje o szczególnej 
aktywności biologicznej przy niskich nietoksycznych dawkach (takie 
jak hormony i mitogeny) mog ą stanowić wyjątek w odniesieniu do 
kryteriów ustalania dawki i powinny by ć oceniane na zasadzie jedno ­
stkowych przypadków. Najwy ższa dawka mo że być również 
określona jako dawka, która wywo łuje pewne wskazania toksycz ­
ności w szpiku kostnym (np. redukcja udzia łu niedojrza łych erytro ­
cytów po śród erytrocytów ogó łem w szpiku kostnym lub krwi obwo ­
dowej).  
1.5.4.  Badanie ograniczone  
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek w odniesieniu do 
zwierząt o przynajmniej 2 000 mg/kg masy cia ła, wykorzystuj ące 
pojedyncze poddanie dzia łaniu substancji lub dwa zabiegi poddania 
działaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych 
skutków toksycznych, oraz je żeli nie podejrzewa si ę genotoksycz ­
ności w oparciu o dane dotycz ące substancji powi ązanych struktu ­
ralnie, wówczas przeprowadzenie pe łnego badania mo że nie by ć 
konieczne. W odniesieniu do bada ń o dłuższym czasie trwania, ogra ­
niczenie dawki wynosi 2 000 mg/kg/masa cia ła/dzień w odniesieniu 
do poddania dzia łaniu substancji trwaj ącego do 14 dni oraz 1 000 
mg/kg/masa cia ła/dzień w odniesieniu do poddania dzia łaniu 
substancji trwaj ącego dłużej niż 14 dni. Spodziewane poddanie cz ło­
wieka dzia łaniu substancji mo że wykaza ć potrzebę wykorzystania 
większej dawki w badaniu ograniczonym.  
1.5.5.  Dawkowanie  
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zg łębnik żołąd­
kowy lub odpowiedni ą rurkę intubacyjn ą lub wstrzykni ęcie 
wewnątrzotrzewnowe. Inne drogi poddania dzia łaniu substancji 
mogą być dopuszczalne, w przypadku gdy ich wykorzystanie mo że 
być uzasadnione. Maksymalna obj ętość płynu, jaka mo że być 
podana przez zg łębnik lub wstrzykni ęta jednorazowo, zale ży od 
wielkości badanego zwierz ęcia. Objętość nie powinna przekracza ć 
2 ml/100 g masy cia ła. Wykorzystanie obj ętości wyższych musi 
być uzasadnione. Z wyj ątkiem podra żniających lub żrących substan ­
cji, które zazwyczaj ujawniaj ą zwiększone skutki o wy ższym stęże­
niu, zmienno ści w obj ętości substancji badanej powinny zosta ć 
zminimalizowane przez dostosowanie st ężenia w celu zapewnienia 
stałej objętości przy wszystkich poziomach dawek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Przygotowanie szpiku kostnego/krwi  
Komórki szpiku kostnego s ą zazwyczaj uzyskiwane z ko ści udowych 
lub piszczeli bezpo średnio po u śmierceniu. Powszechnie komórki s ą 
usuwane z ko ści udowych lub piszczeli, preparowane oraz barwione, 
wykorzystuj ąc ustalone metody. Krew obwodowa jest uzyskiwana 
z tętnicy szyjnej lub innego odpowiedniego naczynia krwiono śnego. 
Komórki krwi s ą natychmiast barwione (8)(9)(10) lub sporz ądzane są 
preparaty wymazowe, a nast ępnie są barwione. Wykorzystanie szcze ­
gólnego barwnika DNA (np. oran ż akrydynowy (14) lub Hoechst 
33258 plus pyronina-Y (15)) mo że wyeliminowa ć niektóre spo śród 
artefaktów zwi ązanych z barwnikiem nienadaj ącym się do szczegól ­
nego szczepu DNA. Ta korzy ść nie wyklucza zastosowania 
zwykłych barwników (np. Giemsa). Dodatkowe systemy (np. 
kolumny celulozowe w celu usuni ęcia komórek j ądrowych (16)) 
mogą być również wykorzystane pod warunkiem, że wykazano, i ż 
systemy te odpowiednio dzia łają w odniesieniu do przygotowywania 
mikrojądra w laboratorium.  
1.5.7.  Analiza  
Udział niedojrza łych erytrocytów po śród ogó łu (dojrza łych 
i niedojrza łych) erytrocytów jest oznaczana podliczaj ąc ogół przy­
najmniej 200 erytrocytów w odniesieniu do szpiku kostnego oraz 
1 000 erytrocytów w odniesieniu do krwi obwodowej (17). 
Wszystkie szkie łka mikroskopowe, łącznie z tymi dotycz ącymi pozy ­
tywnych i negatywnych kontroli, powinny by ć niezależnie kodowane 
przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Przynajmniej 
2 000 niedojrza łych erytrocytów przypadaj ących na zwierz ę jest 
oceniane w odniesieniu do zapadalno ści niedojrza łych erytrocytów. 
Analizując szkiełka mikroskopowe, udzia ł niedojrza łych erytrocytów 
nie powinien by ć mniejszy ni ż 20 % warto ści kontrolnej. Je żeli 
zwierzęta są poddawane dzia łaniu substancji nieprzerwanie przez 
cztery tygodnie lub d łużej, przynajmniej 2 000 dojrza łych erytro ­
cytów na zwierz ę może zostać ocenione w odniesieniu do cz ęstości 
występowania mikroj ądra. Systemy automatycznej analizy (analiza 
obrazowa oraz przep ływowa analiza cytometryczna zawiesin komór ­
kowych) s ą dopuszczalne alternatywnie w odniesieniu do to oceny 
manualnej, je żeli są odpowiednio uzasadnione oraz je żeli stwier ­
dzono ich wa żność. 
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Dane dotycz ące poszczególnych zwierz ąt powinny zosta ć przedsta ­
wione w formie tabelarycznej. Liczba ocenionych niedojrza łych eryt­
rocytów, liczba mikroj ądrowych niedojrza łych erytrocytów oraz 
liczba niedojrza łych erytrocytów po śród erytrocytów ogó łem 
powinna zosta ć wymieniona oddzielnie w odniesieniu do ka żdego 
zwierzęcia poddanego analizie. Je żeli zwierz ęta są poddawane dzia ­ 
łaniu substancji nieprzerwanie przez cztery tygodnie lub d łużej, dane 
dotyczące dojrza łych erytrocytów powinny zosta ć podane, je żeli 
zostały one zebrane. Udzia ł niedojrza łych erytrocytów po śród eryt­
rocytów ogó łem oraz, je żeli uznaje si ę to za maj ące zastosowanie, 
udział procentowy mikroj ądrowych erytrocytów podawany jest dla 
każdego zwierz ęcia. Jeżeli nie ma dowodu na ró żnicę między 
płciami, dane dotycz ące obu płci mogą zostać połączone celem prze ­
prowadzenia analizy statystycznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany z dawk ą wzrost w odpowiedniej ilo ści komórek 
z aberracjami chromosomowymi lub wyra źny wzrost w ilo ści 
komórek z aberracjami w grupie pojedynczej dawki przy jednym 
okresie pobierania próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwag ę w pierwszej kolejno ści. Metody staty ­
styczne mog ą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze 
w przeprowadzaniu oceny wyników (18)(19). Znaczenie statystyczne 
nie powinno by ć jedynym czynnikiem okre ślającym w odniesieniu 
do reakcji pozytywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zosta ć 
wyjaśnione przez dalsze badanie, w szczególno ści 
z wykorzystaniem modyfikacji warunków do świadczalnych.
 
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w tym badaniu.  
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ło w jasny sposób 
pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw 
danych b ędzie wyklucza ł dokonanie ostatecznej oceny dotycz ącej 
aktywności substancji badanej. Wyniki mog ą pozostać niejedno ­
znaczne lub sporne niezale żnie od ilo ści powtórze ń doświadczenia.  
Wyniki pozytywne z badania mikroj ądrowego wskazuj ą, że 
substancja badana wywo łuje powstanie mikroj ądra, które jest 
wynikiem uszkodzenia chromosomowego albo uszkodzenia w erytrobla ście badanego gatunku. Wyniki negatywne wskazuj ą, że 
w warunkach badawczych substancja badana nie produkuje mikro ­
jądra w niedojrza łym erytrocycie badanego gatunku.
 
Prawdopodobie ństwo, że substancja badana lub jej metabolity docie ­
rają do ogólnego obiegu lub w szczególno ści tkanki docelowej (np. 
toksyczno ść systemowa), powinno zosta ć rozpatrzone.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Badane zwierz ęta: 
— gatunek/szczep wykorzystany,  
— liczba, wiek oraz p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki przetrzymywania, od żywianie itp.,  
— indywidualna masa cia ła zwierzęcia na pocz ątku badania, łącznie 
z zakresem masy cia ła, średnimi oraz standardowymi odchyle ­
niami dla ka żdej grupy.  
Warunki badania:  
— dane dotycz ące pozytywnych i negatywnych (rozpuszczalnik/ ­
nośnik) kontroli,  
— dane z zakresu studium okre ślania zakresu badania, je żeli zostało 
przeprowadzone,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do wyboru poziomu 
dawek,  
— szczegó ły dotyczące preparatów substancji,  
— szczegó ły dotyczące podawania substancji badanej,  
— racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,  
— metody sprawdzania, czy substancja testowa dotar ła do ogólnego 
obiegu lub tkanki docelowej, je żeli mają zastosowanie,  
— zmiana st ężenia substancji badanej w od żywianiu/wodzie pitnej 
(ppm) na rzeczywist ą dawkę (mg/kg masy cia ła/dzień), jeżeli ma 
zastosowanie,  
— szczegó ły dotyczące jakości pokarmu oraz wody,  
— szczegó łowy opis harmonogramów leczenia oraz pobierania 
próbek,  
— metody przygotowania slajdów,  
— metody pomiarów toksyczno ści, 
— kryteria w odniesieniu do oceniaj ącej aberracji mikroj ądrowych 
niedojrzałych erytrocytów,  
— liczba przeanalizowanych komórek przypadaj ąca na zwierz ę, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne, negatywne lub niejed ­
noznaczne.  
Wyniki:  
— oznaki toksyczno ści, 
— udział niedojrza łych erytrocytów po śród erytrocytów ogó łem, 
— liczba mikroj ądrowych niedojrza łych erytrocytów podana 
oddzielnie w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia, 
— średnia ± mikroj ądrowych niedojrza łych erytrocytów przypa ­
dająca na grup ę, 
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, w miarę możliwości, 
— analizy statystyczne, je żeli istniej ą, 
— dane dotycz ące równoleg łych oraz historycznych kontroli nega ­
tywnych,  
— dane dotycz ące równoleg łych pozytywnych kontroli.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. ODNIESIENIA  
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid  In vivo  Test for Chromosomal 
Damage,  Mutation Res.,  18, pp. 187–190.  
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test,  Mutation Res.,  31, 
pp. 9–15.  
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavo ­
urnin, K, MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (198 3), The 
Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity,  Muta­
tion Res.  123, pp. 61–118.  
(4) Mavournin, K H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. 
F. and Heddle, J. A. (1990), The  In vivo  Micronucleus Assay 
in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of 
the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox 
Program,  Mutation Res.,  239, pp. 29–80.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J. T., Schlegel, R., Choy, W. N. and Wehr, C. M. 
(1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, w:  Developments in Science and Practice of 
Toxicology,  ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T. S. Miya. 
Elsevier, Amsterdam, pp. 555–558.
 
(6) MacGregor, J. T., Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H., 
Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R., and Wild, D. (19 8 7), 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, 
pp. 103–112.
 
(7) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., Henika, P. R. and Shelby, M. 
E. (1990), The in  vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measu ­
rement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies,  Fund. Appl. Toxicol.  14, pp. 
513–522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofumi, T. and Ishidate, 
M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides,  
Mutation Res.,  245, pp. 245–249.  
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). 
Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by 
Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 
5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS,  Mutation 
Res.,  278, pp. 83–98.  
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis 
Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan) ­
(1995), Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53–159.  
(11) Hayashi, M., Tice, R. R., MacGregor, J. T., Anderson, D., 
Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchic ­
rotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. 
(19 94), in  vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay,  
Mutation Res.,  312, pp. 293–304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313–319.  
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., Doe, 
J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen 
Society Working Group: Dose Setting in  In vivo  Mutagenicity 
Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313–319.
 
(14) Hayashi, M., Sofumi, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An Appli ­
cation of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micro ­
nucleus Test,  Mutation Res.,  120, pp. 241–247.  
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), 
A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y,  
Mutation Res.,  120, pp. 269–275.  
(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone 
marrow micronucleus test,  Mutation Res.,  213, pp. 91–104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for 
the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte 
ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 
347, pp. 97–99.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, 
w: D. J. Kirkland (ed.), Basic  Mutagenicity tests, UKEMS 
Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guide ­
lines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised,  
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.  
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K (1989), Staticical Analysis of  In vivo  Cytoge­
netic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.),  Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III,  Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, pp. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13/14.  MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE MUTACJI POWROTNYCH 
W KOMORKACH BAKTERYJNYCH  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 471, badania mutacji 
powrotnych w komórkach bakteryjnych (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych wykorzys ­
tuje aminokwasy wymagaj ące szczepów  Salmonella typhimurium  
oraz Escherichia coli  w celu wykrycia mutacji punktowych, które 
obejmują zastępowanie (substytucja), dodanie lub usuni ęcie jednego 
lub większej liczby par zasad DNA (1)(2)(3). Zasad ą tego badania 
mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych jest to, że wykrywa 
ono mutacje, które powoduj ą powrót mutacji obecnych w badanych 
szczepach oraz przywracaj ą funkcjonaln ą zdolność bakterii do synte ­
zowania podstawowego aminokwasu. Odpowiednie bakterie s ą 
wykrywane przez ich zdolno ść do wzrostu w razie nieobecno ści 
aminokwasu wymaganego przez macierzysty badany szczep.  
Mutacje punktowe s ą przyczyn ą wielu chorób genetycznych u ludzi 
oraz istnieje podstawowy dowód na to, że mutacje punktowe 
w onkogenach i genach hamuj ących nowotwory komórek somatycz ­
nych są odpowiedzialne za nowotwory u ludzi oraz zwierz ąt bada­
nych. Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych jest szybkie, tanie oraz wzgl ędnie proste do przeprowadzenia. Wiele 
szczepów badanych posiada wiele cech, które czyni ą je bardziej 
czułymi na wykrywanie mutacji łącznie z reakcyjnymi sekwencjami 
DNA w lokalizacjach powrotnych, wzmo żoną przenikalno ścią do 
dużych cząsteczek oraz eliminacj ą systemów naprawy DNA lub 
wzmocnieniem procesu naprawy DNA sk łonnego do b łędów. Specy ­
ficzność badanych szczepów mo że zapewni ć pewne u żyteczne infor ­
macje w sprawie typów mutacji, które s ą wywołane czynnikami 
genotoksycznymi. Bardzo du ża baza danych wyników 
w odniesieniu do szerokiej ró żnorodności struktur jest dost ępna 
w odniesieniu do badania mutacji powrotnych w komórkach bakte ­
ryjnych oraz dobrze ustalone metodologie zosta ły opracowane 
w odniesieniu do badanych substancji chemicznych o ró żnych 
właściwościach fizyczno-chemicznych łącznie ze zwi ązkami lotnymi.
 
Zob. równie ż Ogólne wprowadzenie do cz ęści B.  
1.2. DEFINICJE  
Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych  
w Salmonella typhimurium  albo  Escherichia coli  wykrywa mutacje 
w szczepie wymagaj ącym aminokwasów (histydyny lub tryptofanu, 
odpowiednio) w celu wytworzenia szczepu niezale żnie od zewn ętrz­
nych dostaw aminokwasów.  
Pary zasad podstawiania mutagenów  są czynnikami, które powo ­
dują zasadowe zmiany w DNA. W badaniu powrotnym ta zmiana 
może wystąpić w miejscu oryginalnej mutacji lub w drugim miejscu 
w genomie bakteryjnym.  
Mutageny powoduj ące zmiany fazy odczytu  są czynnikami, które 
powodują dodanie lub usuni ęcie jednej lub wi ększej liczby par zasad 
w DNA, zmieniaj ąc w ten sposób odczyt RNA.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. WST ĘPNE ROZWA ŻANIA  
Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych wykorzys ­
tuje komórki prokariotyczne, które ró żnią się od komórek ssaków 
takimi czynnikami jak pobór, przemiana materii, struktura chromo ­
somowa procesy naprawy DNA. Badania przeprowadzane  in vitro  
ogólnie wymagaj ą wykorzystania egzogenicznego źródła aktywacji 
metabolicznej. Systemy aktywacji metabolicznej  in vitro  nie mog ą 
naśladować całkowicie warunków  in vivo . Badanie z tego wzgl ędu 
nie dostarcza bezpo średnich informacji w sprawie potencja łu muta­
genności oraz rakotwórczo ści substancji u ssaków.  
Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych jest 
powszechnie wykorzystywane jako wst ępny przegl ąd aktywno ści 
genotoksycznej oraz, w szczególno ści w odniesieniu aktywacji 
wywołującej mutacje punktowe. Rozleg ła baza danych wykaza ła, 
że wiele substancji chemicznych, które s ą pozytywne w tym badaniu, 
ujawnia równie ż aktywno ść mutagenn ą w innych badaniach. Istniej ą 
przykłady czynników mutagennych, które nie s ą wykryte przez to 
badanie, powody tych niedoborów mog ą zostać przypisane szczegól ­
nemu charakterowi wykrytego punktu ko ńcowego, ró żnicom mi ędzy 
aktywacją metaboliczn ą lub różnicom w biodost ępności. Z drugiej 
strony, czynniki, które wzmacniaj ą wrażliwość badania mutacji 
powrotnych w komórkach bakteryjnych, mog ą prowadzi ć do zbyt 
wysokiego oszacowania aktywno ść mutagennej.  
Badanie mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych mo że być 
nieodpowiednie w odniesieniu do oceny niektórych klas substancji 
chemicznych, na przyk ład wysoce bakteriobójczych zwi ązków (np. 
niektóre antybiotyki) oraz tych, które uznaje si ę za (które znane s ą) 
zakłócające szczególnie system replikacji komórek ssaków (np. 
niektóre czynniki hamuj ące topoizomeraz ę oraz niektóre nuklozy ­
dowe substancje analogiczne). W takich przypadkach badanie 
mutacji u ssaków mo że być bardziej odpowiednie.  
Chociaż wiele zwi ązków, które s ą pozytywne w tym badaniu, jest 
czynnikami rakotwórczymi dla ssaków, korelacja nie jest zupe łna. 
Zależy to od klasy substancji chemicznej oraz istniej ą czynniki rako ­
twórcze, które nie s ą wykrywane przez substancje badan ą, poniewa ż 
działają one przez inne niegenotoksyczne mechanizmy lub mecha ­
nizmy nieobecne w komórkach bakteryjnych.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zawiesiny komórek bakteryjnych s ą poddane dzia łaniu substancji 
badanej, w obecno ści oraz w nieobecno ści egzogenicznego systemu 
aktywacji metabolicznej. W metodzie w łączania płytki te zawiesiny 
są zmieszane z na łożonym agarem oraz nak ładane na minimalne 
podłoże. W odniesieniu do obu technik, po dwóch lub trzech dniach 
inkubacji, powrotne hodowle s ą podliczane oraz porównywane 
z ilością spontanicznie powracaj ących hodowli na rozpuszczalniko ­
wych płytkach kontrolnych.  
Zostało opisanych wiele procedur w odniesieniu do przeprowadzania 
badania mutacji powrotnych w komórkach bakteryjnych. W śród tych 
powszechnie wykorzystywanych znajduj ą się metoda w łączająca 
płytkę (1)(2)(3)(4), metoda uprzedniej inkubacji (2)(3)(5)(6)(7)(8), 
metoda fluktuacji (9)(10) oraz metoda zawiesinowa (11). 
Zostały opisane modyfikacje w odniesieniu do badania gazów lub 
oparów (12).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Procedury opisane w tej metodzie odnosz ą się przede wszystkim do 
metod włączenia płytki oraz uprzedniej inkubacji. Żadna z nich nie 
jest dopuszczalna w odniesieniu do przeprowadzania do świadczeń 
zarówno z aktywacj ą metaboliczn ą, jak i bez niej. Niektóre 
substancje mog ą zostać wykryte w bardziej skuteczny sposób, wyko ­
rzystując metodę uprzedniej inkubacji. Substancje te nale żą do klas 
chemicznych, które obejmuj ą nitrozaminy o krótkich łańcuchach, 
metale dwuwarto ściowe, aldehydy, barwniki azowe oraz zwi ązki 
diazowe oraz alkaloidy pirolizydynowe, zwi ązki allilowe oraz 
związki azotowe (3). Rozpoznano tak że, że niektóre klasy muta ­
genów nie s ą zawsze wykrywane, wykorzystuj ąc procedury standar ­
dowe, takie jak metoda w łączająca płytki lub metoda uprzedniej 
inkubacji. Powinny by ć one uznawane za „szczególne przypadki” 
i silnie zalecane jest, i ż powinny zosta ć wykorzystane alternatywne 
procedury. Nast ępujące „szczególne przypadki” mog ą zostać ziden­
tyfikowane (wraz z przyk ładami procedur, które mog łyby zosta ć 
wykorzystane w odniesieniu do ich wykrycia) barwniki azowe oraz 
związki diazowe (3)(5)(6)(13), gazy oraz lotne substancje chemiczne 
(12)(14)(15)(16) oraz glikozydy (17)(18). Odchylenie od standar ­
dowej procedury musi zosta ć naukowo uzasadnione.  
1.5. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.5.1.  Preparaty  
1.5.1.1.  Bakterie  
Świeże kultury bakterii powinny by ć hodowane do pó źnej fazy 
wykładniczej lub wczesnej fazy stacjonarnej wzrostu (w przybli żeniu 
10 9 komórek na ml). Kultury bakteryjne w pó źnej fazie stacjonarnej 
nie powinny by ć wykorzystywane. Zasadnicze jest, aby kultury 
bakteryjne wykorzystywane w badaniu zawiera ły wysokie miano 
bakterii zdolnych do życia. Miano mo że być wykazane zarówno 
z historycznych danych dotycz ących kontroli krzywych wzrostu, 
w każdym oznaczaniu przez okre ślenie ilości zdolnych do życia 
komórek przez do świadczenie platerowania.  
Zalecaną temperatur ą inkubacji jest 37  o C. 
Powinno zosta ć wykorzystane przynajmniej pi ęć szczepów bakterii. 
Powinno to obejmowa ć cztery szczepy  S. typhimurium  (TA 1535; 
TA 1537 lub TA97a lub TA97; TA98; oraz TA100), które zosta ły 
pokazane jako maj ące być rzetelne oraz odtwarzalnie reaguj ące 
między laboratoriami. Te cztery szczepy  S. typhimurium  posiadaj ą 
GC pary bazowe w miejscu podstawowego powrotu oraz wiadome 
jest, że nie mog ą one wykrywa ć utleniających mutagenów, czyn ­
ników sieciuj ących oraz hydrazyny. Takie substancje mog ą być 
wykrywane przez szczepy  E. coli  WP2 lub  S. typhimurium  TA1 
02 (19), które posiadaj ą pary zasad AT w miejscu podstawowego 
powrotu. Z tego wzgl ędu zalecan ą kombinacj ą szczepów jest:  
— S. typhimurium  TA1 535, oraz  
— S. typhimurium  TA1 537 lub TA97, lub TA97a, oraz  
— S. typhimurium  TA98, oraz  
— S. typhimurium  TA100, oraz  
— E. coli  WP2 uvrA lub  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), lub  S. 
typhimurium  TA102.  
W celu wykrycia mutagenów sieciuj ących preferowane mo że być 
objęcie TA102 lub dodanie wprawnych w naprawianie DNA 
szczepów  E. coli  (np.  E. coli  WP2 lub  E. coli  WP2 (pKM101)).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Powinny by ć wykorzystywane ustalone procedury przygotowania 
hodowli podstawowych, weryfikacja markerem oraz sk ładowanie. 
Wymogi w odniesieniu do wzrostu, dotycz ące aminokwasu, powinny 
być wykazane dla ka żdego zamro żonego preparatu hodowli podsta ­
wowych (histydyna dla szczepów  S. typhimurium  oraz tryptofan dla 
szczepów  E. coli ). Inne w łaściwości fenotypowe powinny zosta ć 
sprawdzone w podobny sposób, mianowicie: obecno ść lub nieobec ­
ność plazmidów czynnika R, gdzie stosowne (np. odporno ść na 
ampicylin ę w szczepach TA98, TA100 oraz TA97a lub TA97, 
WP2 uvrA oraz WP2 uvrA (pKM101), oraz odporno ść na 
ampicylin ę + tetracyklin ę w szczepie TA 102); (np. rfa mutacja 
w S. typhimurium  przez wra żliwość na fiolet krystaliczny oraz 
uvrA mutacja w  E. coli  lub uvrB mutacja w  S. typhimurium  przez 
wrażliwość na światło ultrafioletowe) (2)(3). Szczepy powinny 
również wytwarza ć spontaniczne kolonie powrotne w ramach 
zakresów cz ęstotliwości oczekiwanych na podstawie historycznych 
danych laboratoryjnych oraz przewa żnie w zakresie odnotowanym 
w literaturze.  
1.5.1.2.  Podłoże 
Wykorzystywany jest odpowiedni minimalny agar (np. zawieraj ące 
Vogel-Bonner minimalne pod łoże E oraz glukoza) oraz powlekaj ący 
agar zawieraj ący histydyn ę oraz biotyn ę lub tryptofan w celu umo ż­
liwienia podzia łu kilku komórek (1)(2)(9).  
1.5.1.3.  Aktywacja metaboliczna  
Bakterie powinny by ć poddane dzia łaniu substancji badanej zarówno 
w obecno ści, jak i w nieobecno ści odpowiedniego systemu aktywacji 
metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzystywanym 
systemem jest uzupe łniana wspó łczynnikiem frakcja pomitochond ­
rialna (S9) przygotowana z w ątroby gryzoni poddanych dzia łaniu 
czynników pobudzaj ących enzymy takimi jak Aroklor 1254 (1)(2) 
lub kombinacj ą feno-barbitonu oraz B nafoflavonu (18)(20)(21). 
Frakcja pomitochondrialna jest zazwyczaj wykorzystywana 
w stężeniach w zakresie od 5 do 30 % obj ętościowo 
w mieszaninie S9. Wybór oraz warunki systemu metabolicznej akty ­
wacji mog ą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. 
W niektórych przypadkach w łaściwe może być wykorzystanie wi ęcej 
niż jednego st ężenia frakcji pomitochondrialnej. W odniesieniu do 
barwników azowych oraz zwi ązków diazowych, przy wykorzystaniu 
systemu aktywacji metabolicznej, mo że być bardziej odpowiednie 
(6)(13).  
1.5.1.4.  Substancja testowa/preparat  
Stała substancja badana powinna zosta ć rozpuszczona lub zawie ­
szona w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczona, je żeli jest to odpowiednie przed poddaniem bakterii 
działaniu substancji. P łynne substancje badane mog ą być dodawane 
bezpośrednio do systemu badawczego i/lub rozcie ńczane przed 
poddaniem dzia łaniu substancji. Powinny zosta ć wykorzystane 
świeże preparaty, chyba że dane dotycz ące stabilno ści wykazuj ą 
dopuszczalno ść składowania.  
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien mie ć możliwości reagowania 
chemicznego z substancj ą badaną oraz powinien by ć zgodny z prze ­ 
żywaniem bakterii oraz aktywno ścią S9. Jeśli inne ni ż dobrze znane 
rozpuszczalniki/no śniki są wykorzystywane, ich w łączenie do 
doświadczenia powinno by ć wsparte danymi wskazuj ącymi ich 
zgodność. Zaleca si ę, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści 
rozważone zosta ło wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/ ­
nośników. Badaj ąc substancje niestabilne w wodzie, wykorzystane 
rozpuszczalniki organiczne powinny by ć wolne od wody.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Warunki badawcze  
1.5.2.1.  Szczepy badane (zob. ppkt 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Stężenie poddania dzia łaniu substancji  
Wśród kryteriów, które maj ą być uwzględnione, oznaczaj ąc 
najwyższą ilość substancji badanej, które ma zosta ć wykorzystana, 
jest cytotoksyczno ść oraz rozpuszczalno ść w końcowej mieszaninie, 
której dzia łaniu poddawane s ą szczepy.  
Użyteczne mo że być oznaczenie toksyczno ści oraz nierozpuszczal ­
ności w doświadczeniu wst ępnym. Cytotoksyczno ść może zostać 
wykryta przez redukcj ę ilości powrotnych hodowli, oczyszczenie 
lub zmniejszenie pod łoża lub stopie ń przeżywania poddanych dzia ­ 
łaniu substancji hodowli. Cytotoksyczno ść substancji mo że być 
zmieniana w obecno ści systemów aktywacji metabolicznej. Nieroz ­
puszczalno ść powinna zosta ć oceniona jako wytr ącanie w ko ńcowej 
mieszaninie w rzeczywistych warunkach badania oraz oczywistych 
dla oka nieuzbrojonego.  
Zalecane najwy ższe stężenie badawcze w odniesieniu do rozpusz ­
czalnych niecytotoksycznych substancji stanowi 5 mg/p łytkę lub 5 
μl/płytkę. W odniesieniu do niecytotoksycznych substancji, które nie 
są rozpuszczalne przy 5 mg/p łytkę lub 5 μl/płytkę, jedno lub wi ęcej 
badanych st ężeń powinno by ć nierozpuszczalne w ko ńcowej miesza ­
ninie cytotoksycznej. Str ącanie nie powinno zak łócać oceny.  
Przynajmniej pi ęć różnych nadaj ących się do analizowania st ężeń 
substancji badanej powinno zosta ć wykorzystane przy 
w przybli żeniu połowie logarytmu (np. √1 0) odstępów czasu mi ędzy 
punktami badawczymi w odniesieniu do wst ępnego do świadczenia. 
Krótsze odst ępy czasu mog ą być odpowiednie, je śli reakcja st ężenia 
jest badana. Badanie powy żej stężenia 5 mg/p łytkę lub 5 μl/płytkę 
może być brane pod uwag ę, oceniając substancje zawieraj ące podsta ­
wowe ilo ści potencjalnie mutagennych zanieczyszcze ń. 
1.5.2.3.  Negatywne i pozytywne kontrole  
Równoleg łe, specyficzne co do szczepu pozytywne i negatywne 
(rozpuszczalnik lub no śnik) kontrole, zarówno z aktywacj ą metabo­
liczną, jak i bez niej, powinny by ć włączone w ramy ka żdego ozna ­
czania. Powinien zosta ć przeprowadzony wybór uwzgl ędniania pozy ­
tywnych kontroli, które wykazuj ą skuteczne dzia łanie każdego ozna ­
czania.  
W odniesieniu do oznacze ń wykorzystuj ących system metabolicznej 
aktywacji, substancja(-e) wzorcowa(-e) kontroli pozytywnych powinna(-y) zosta ć wybrana(-e) na podstawie typu wykorzystanego 
szczepu bakterii.
 
Następujące substancje stanowi ą przykłady odpowiednich substancji 
pozytywnych kontroli w odniesieniu do oznaczania z metaboliczna 
aktywacją: 
Substancja Nr CAS Nr Einecs  
9,10-dimetyloantracen 781-43-1 212-308-4 
7,12-dimetylobenzo[a]antracen 57-97-6 200-359-5 
Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 
2-aminoantracen 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
Cyklofosfamid monohydrat 6055-19-2  
Następująca substancja jest odpowiedni ą kontrol ą pozytywn ą 
w odniesieniu do metody redukcyjnej aktywacji metabolicznej:  
Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Congo Red 573-58-0 209-358-4  
2-aminoantracen nie powinien by ć wykorzystywany jako wy łączny 
wskaźnik skuteczno ści mieszaniny S9. Je śli wykorzystywany jest 2- 
aminoantracen, ka żda partia S9 powinna by ć również charakteryzo ­
wana mutagenem, który wymaga metabolicznej aktywacji przez 
enzymy mikrosomowe, np. benzo[a]piren, dimetylobenzoantracen.  
Następujące substancje s ą przykładami specyficznych co do szczepu 
kontroli pozytywnych dla bada ń przeprowadzanych bez egzogenicz ­
nego systemu aktywacji metabolicznej:  
Substancje Nr CAS Einecs No Szczep  
Azydek sodu 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 i TA 100 
2-nitrofluoren 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-aminoakrydyna 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 i TA 97a 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 i TA 97a 
Hydronadtlenek 
kumenu 80-15-9 201-254-7 TA 102 
Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA i TA 102 
N-etylo-N-nitro- 
N-nitrozoguani ­
dyna 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2uvrA i WP2uvrA 
(pKM101) 
1-tlenek 4-nitro ­
kwinolinu 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2uvrA i WP2uvrA 
(pKM101) 
Furylofuramid 
(AF2) 3688-53-7 Szczepy zawieraj ące plazmidy  
Mogą być wykorzystane inne odpowiednie substancje kontroli pozy ­
tywnych. Wykorzystanie substancji powi ązanych klas ą 
z substancjami kontroli pozytywnych powinno zosta ć uwzględnione, 
jeżeli są one dost ępne. 
Negatywne kontrole, sk ładające się z samego rozpuszczalnika lub 
nośnika bez substancji badanej, oraz w innych przypadkach poddane 
działaniu w ten sam sposób jak grupy poddane dzia łaniu substancji 
powinny zosta ć objęte kontrol ą. Dodatkowo kontrole bez poddania 
działaniu substancji powinny by ć również wykorzystywane, chyba że 
istnieją historyczne dane dotycz ące kontroli wykazuj ące, że brak 
szkodliwych lub mutagennych skutków wywo ływanych wybranym 
rozpuszczalnikiem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Procedura  
W odniesieniu do metody w łączającej płytkę (1)(2)(3)(4), bez akty ­
wacji metabolicznej, zazwyczaj 0,05 ml lub 0,1 ml st ężenia badaw ­
czego, 0,1 ml świeżej hodowli bakteryjnej (zawieraj ącej 
w przybli żeniu 108 zdolnych do życia komórek) oraz 0,5 ml steryl ­
nego bufora jest mieszane z 2,0 ml pokrywaj ącego agaru. 
W odniesieniu do oznaczania z aktywacj ą metaboliczn ą zazwyczaj 
0,5 ml mieszaniny aktywacji metabolicznej zawieraj ącej odpo ­
wiednie ilo ści pomitochondrialnej frakcji (w zakresie 5–30 % obj ę­
tościowo w mieszaninie aktywacji metabolicznej) s ą mieszane z 
pokrywaj ącym agarem (2,0 ml), łącznie z roztworem substancji 
badanej. Zawarto ści każdej z rurek s ą mieszane oraz wylewane na 
powierzchni ę minimalnej p łytki agarowej. Agar pokrywaj ący 
krzepnie przed inkubacj ą. 
W odniesieniu do metody uprzedniej inkubacji (2)(3)(5)(6) 
substancja badana/roztwór badany jest uprzednio inkubowany ze 
szczepem badanym (zawieraj ącym w przybli żeniu 108 zdolnych do 
życia komórek) oraz sterylnym roztworem buforowym lub systemem 
metabolicznej aktywacji (0,5 ml) zazwyczaj przez 20 minut lub 
dłużej w temperaturze 30–37  o C przed mieszaniem z pokrywaj ącym 
agarem oraz polewaj ąc na powierzchni ę minimalnej p łytki agarowej. 
Zazwyczaj 0,05 lub 0,1 ml substancji badanej/roztworu badanego, 0,1 ml i bakterii oraz 0,5 ml mieszaniny S9 lub sterylnego roztworu 
buforowego s ą mieszane z 2,0 ml pokrywaj ącego agaru. Rurki 
powinny zosta ć napowietrzone w trakcie uprzedniej inkubacji, wyko ­
rzystując wstrząsarkę.
 
W odniesieniu do odpowiedniego szacowania zmienno ści trzykrotne 
pokrywanie p łytkami powinno zosta ć wykorzystane przy ka żdej 
dawce badanej. Wykorzystanie podwójnego pokrywania p łytkami 
jest dopuszczalne, je żeli jest to naukowo uzasadnione. Okazjonalna 
strata płytki niekoniecznie czyni oznaczanie niewa żnym.  
Gazowe lub lotne substancje powinny by ć badane odpowiednimi 
metodami, takimi jak np. w szczelnie zamkni ętych naczyniach (12) ­
(14)(15)(16).  
1.5.4.  Inkubacja  
Wszystkie p łytki w danym oznaczeniu powinny by ć inkubowane 
w temperaturze 37  o C przez 48–72 godzin. Po okresie inkubacji 
podliczana jest liczba powrotnych kolonii.  
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Dane powinny zosta ć przedstawione jako liczba kolonii przypadaj ąca 
na płytkę. Liczba powrotnych kolonii zarówno w p łytkach negatyw ­
nych (kontrola rozpuszczalnikowa oraz kontrola bez poddania dzia ­ 
łaniu substancji, je żeli zostały wykorzystane), jak i pozytywnych 
kontroli powinny zosta ć również podane. Podlicza si ę poszczególne 
płytki, średnia liczba powrotnych kolonii przypadaj ąca na płytkę 
powinna zosta ć przedstawiona w odniesieniu do substancji badanej 
oraz pozytywnej i negatywnej (bez poddania dzia łaniu substancji 
badanej i/lub rozpuszczalnikowej) kontroli.  
Nie istnieje wymóg jasnej reakcji pozytywnej w odniesieniu do 
weryfikacji. Niejednoznaczne wyniki powinny zosta ć wyjaśnione 
w drodze dalszych bada ń, w szczególno ści z wykorzystaniem mody ­
fikacji warunków do świadczalnych. Wyniki negatywne musz ą zostać 
potwierdzone na zasadzie jednostkowych przypadków. Modyfikacja 
parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych 
warunków powinna zosta ć rozważona w dalszych do świadczeniach. 
Parametry badawcze, które mog ą być zmodyfikowane, obejmuj ą 
zakres st ężenia, metod ę poddania dzia łaniu substancji badanej 
(włączenie płytek lub uprzednia inkubacja) oraz warunki aktywacji 
metabolicznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany z dawk ą wzrost ilo ści powrotnych kolonii powy żej zakres 
badanych i/lub odtwarzalno ści przy jednym lub wi ększej ilo ści 
stężeń, przypadaj ących na p łytkę w przynajmniej jednym szczepie 
z lub bez systemu aktywacji metabolicznej. Biologiczne znaczenie wyników powinno zosta ć wzięte pod uwag ę w pierwszej kolejno ści. 
Metody statystyczne mog ą zostać wykorzystane jako metody pomoc ­
nicze w przeprowadzaniu oceny wyników (24). Jednak że znaczenie 
statystyczne nie powinno by ć jedynym czynnikiem okre ślającym 
w odniesieniu do reakcji pozytywnej.
 
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w tym bada ­
niu. 
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ło w jasny sposób 
pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych b ędzie wyklucza ł dokonanie ostatecznej oceny dotycz ącej 
aktywności badanej substancji. Wyniki mog ą pozostać niejedno ­
znaczne lub sporne niezale żnie od liczby powtórzonych do świad­
czeń.
 
Wyniki pozytywne z badania mutacji powrotnych w komórkach 
bakteryjnych wskazuj ą, że substancja badana wywo łuje mutacje 
punktowe przez zast ąpienie lub mutacje fazy odczytu w genomie 
albo Salmonella typhimurium  i/lub  Escherichia coli.  Wyniki nega ­
tywne wskazuj ą, że w warunkach badawczych substancja badana nie 
jest mutagenna w badanym gatunku.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika/no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Szczepy:  
— wykorzystane szczepy,  
— liczba komórek przypadaj ąca na kultur ę, 
— właściwości szczepu.  
Warunki badania:  
— ilość substancji badanej przypadaj ąca na płytkę (mg/płytkę lub 
μl/płytkę) wraz z racjonalnym uzasadnieniem wyboru dawki 
i liczby p łytek przypadaj ącej na stężenie,  
— wykorzystane pod łoże, 
— rodzaj oraz sk ład systemu aktywacji metabolicznej, w tym 
dopuszczalno ść kryteriów,  
— procedura poddania dzia łaniu substancji badanej,  
Wyniki:  
— oznaki toksyczno ści, 
— oznaki wytr ącania,  
— liczba poszczególnych p łytek, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— średnia liczba powrotnych kolonii przypadaj ących na koloni ę 
oraz standardowe odchylenie,  
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, w miarę możliwości, 
— analizy statystyczne, je żeli istniej ą, 
— dane dotycz ące równoleg łych oraz kontroli negatywnych 
i pozytywnych (rozpuszczalnik/no śnik), wraz z zakresami, śred­
nimi oraz standardowymi odchyleniami,  
— dane dotycz ące historycznych kontroli negatywnych 
i pozytywnych, rozpuszczalnik/no śnik), wraz z zakresami, śred­
nimi oraz standardowymi odchyleniami.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. ODNIESIENIA  
(1) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki E. (1975), 
Methods of Detecting Carcinogens and Mutagens with 
the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  
Mutation Res.,  31, pp. 347–364.  
(2) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.,  113, pp. 
173–215.  
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E. (1994), Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays,  Mutation Res.,  312, pp. 217–233.
 
(4) Kier, L. D., Brusick D.J., Auletta, A. E., Von Halle, E. S., 
Brown, M. M., Simmon, V. F., Dunkel, V., McCann, J., 
Mortelmans, K., Prival, M., Rao, T. K. and Ray V. (1986),  
The Salmonella  typhimurium/Mammalian Microsomal Assay: 
A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene- 
Tox Program,  Mutation Res.,  168, pp. 69–240.  
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y. Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y. (1975), Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives,  Cancer Letters  1, 
pp. 91–96.
 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M. (1980), Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests, w:  Short-term Test Systems for Detecting 
Carcinogens,  ed. Norpoth K. H. and Garner, R. C., Springer, 
Berlin-Heidelberg-New York, pp. 273–285.  
(7) Gatehouse, D. G., Rowland, I. R., Wilcox, P., Callender, R. D. 
and Foster, R. (1980), Bacterial Muta tion Assays, w:  Basic 
Mutagenicity TestS: UKEMS Part 1 Revised, ed. D.J. Kirkland,  
Cambridge University Press, pp. 13–61.  
(8) Aeschacher, H. U., Wolleb, U. and Porchet, L. (1987), Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods, J.  Food Safety,  8, 
pp. 167–177.  
(9) Green, M. H. L., Muriel, W. J. and Bridges, B. A. (1976), Use 
of a simplified fluctuation test to detect low levels of muta ­
gens,  Mutation Res.,  38, pp. 33–42.  
(10) Hubbard, S. A., Green, M. H. L., Gatehouse, D. and Bridges, 
J. W. (1984), The Fluctuation Test in Bacteria, w:  Handbook 
of Mutagenicity Test Procedures,  2nd Edition, ed. Kilbey, B.J., 
Legator, M., Nichols, W. and Ramel, C., Elsevier, Amsterdam- 
New York-Oxford, pp. 141–161.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E. D. and Melampy, P. J. (1981), An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains  of Salmonella typhimurium, Environmental Mutagene ­
sis, 3, pp. 453–465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and Matsushima, T. (1994), 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous 
Compounds by Using a Gas Sampling Bag,  Mutation Res.,  
307, pp. 335–344.  
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V. D., Reipert, M. D. and 
Vaughan, V. L. (1984), Mutagenicity of Benzidine and Benzi ­
dine-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified Salmonella Assay,  Mutation Res.,  136, pp. 33–47.
 
(14) Zeiger, E., Anderson, B. E., Haworth, S., Lawlor, T. and 
Mortelmans, K. (1992), Salmonella Mutagenicity Tests. V. 
Results from the Testing of 311 Chemicals,  Environ. Mol. 
Mutagen.,  19, pp. 2–141.  
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R. G. (1977), Muta ­
genic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water, in  
Progress in Genetic Toxicology,  D. Scott, B. Bridges and F., 
Sobels (eds.) Elsevier, Amsterdam, pp. 249–258.  
(16) Hughes, T.J., Simmons, D. M., Monteith, I. G. and Claxton, 
L. D. (1987), Vaporisation Technique to Measure 
Mutagenic Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/Salmonella Assay,  Environmental Mutagenesis,  9, 
pp. 421–441.
 
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., 
and Sugimura, T. (19 79), Mutagenicity of the Naturally Occurring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Methane Conjugates in  Salmonella typhimurium, Cancer 
Res.,  39, pp. 3780–3782.
 
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B. N. 
(1980), Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glyco ­
sides to Mutagens by Intestinal Flora,  Proc. Natl. Acad. Sci.  
USA, 77, pp. 4961–4965.  
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D. J. and Gatehouse, D. G. 
(1990), Comparison of  Salmonella typhimu rium  TA 102 with  
Escherichia coli  WP2 Tester strains,  Mutagenesis,  5, pp. 
285–291.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as 
an Inducer or Metabolic Activation Systems, w:  In vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis Testing,  eds. F. J. de Serres et 
al. Elsevier, North Holland, pp. 85–88.  
(21) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), 
Alternatives to Aroclor 1254-inducedS9  ininvitro  Genotoxicity 
Assays,  Mutagenesis, 7,  pp. 175–177.  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B. N. (1981), 
Compatibility of Organic Solvents with the Salmonella/ ­
Microsome Test,  Mutation Res.,  88, pp. 343–350.  
(23) Claxton, L. D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., 
Nestmann, E. and Zeiger, E. (1987), Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity,  Mutation Res.,  189, pp. 83–91.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G. A. T., Green, M. H. L., Middleton, B., Mitchel, I., 
Robinson, W. D. and Tweats, D. J. (1989), Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays, w:  UKEMS Sub-Committee on 
Guidelines for Mutagenicity Testing, Part II. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data,  ed. Kirkland, D.J., 
Cambridge University Press, pp. 28–65.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  BADANIE MUTAGENNO ŚCI I BADANIE PRZESIEWOWE NA 
RAKOTWÓRCZO ŚĆ MUTACJA GENU —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Odmiana haploidalnych i diploidalnych szczepów bakterii dro żdży 
Saccharomyces cerevisiae  może zostać użyta w celu dokonania 
pomiaru produkcji mutacji genu wywo łanych czynnikami chemicz ­
nymi z udzia łem oraz bez aktywacji metabolitycznej.  
Używane by ły wczesne systemy mutacji w szczepach haploidalnych, 
takie jak pomiar mutacji od czerwonych mutantów wymagaj ących do 
wzrostu adeniny ( ade-1, ade -2) do bia łych mutantów z podwójn ą 
mutacją adeninow ą oraz selektywne systemy, takie jak indukcja 
oporności na kanawain ę i cykloheksimid.  
Najszerzej uznawany system mutacji wstecznych (rewersji) wymaga 
użycia haploidalnego szczepu XV 185–14C, posiadaj ący nonsen ­
sowną mutację ochre  ade 2–1,  arg 4–17,  lys 1–1 i  trp 5–48, który 
może rewertowa ć głównie przez mutacje zast ępcze indukuj ące 
mutacje specyficzne co do miejsca lub mutacje supresora ochre. 
XV 185-14C posiada tak że marker  his 1–7, niezmys łową mutację, 
która mo że rewertowa ć głównie przez mutacje zewn ątrzgenowe, 
i marker  hom  3–10 rewertowany przez mutageny powoduj ące 
zmianę fazy odczytu.  
Wśród diploidalnych szczepów  S. cerevisiae  jedynym szeroko 
używanym szczepem jest D  7 , który jest homozygotyczny wzgl ędem 
ilv 1–92.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Roztwory testowanych substancji chemicznych i próbki kontrolne 
powinny by ć przygotowywane tu ż przed testem, przy u życiu odpo ­
wiednich no śników. W przypadku zwi ązków organicznych, które nie 
są rozpuszczalne w wodzie, nale ży używać nie więcej niż 2-procen ­
towych (obj ętościowo) roztworów rozpuszczalników organicznych, 
takich jak etanol, aceton, czy dimetylosulfotlenek (DMSO). 
Końcowe stężenie nośnika nie powinno znacz ąco wpływać na 
żywotność komórek i charakterystyk ę wzrostu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
A k t y w a c j a m e t a b o l i c z n a  
Komórki nale ży podda ć oddziaływaniu testowych substancji 
chemicznych zarówno w przypadku obecno ści, jak i braku obecno ści 
właściwego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej.  
Najpowszechniej u żywanym systemem jest wspó łczynnik uzupe ł­
niony postmitochondrialn ą frakcją z wątrób gryzoni wcze śniej prze­
badanych enzymem wywo łującym czynniki. Wykorzystanie innych 
gatunków, tkanek, postmitochondrialnych frakcji lub procedur 
również może być właściwe dla aktywacji matabolicznej.  
Warunki badania  
S z c z e p y t e s t o w e  
Haploidalny szczep XV185–14C i diploidalny szczep D  7 są 
najczęściej używanymi szczepami w badaniach mutacji genu. Inne 
szczepy równie ż mogą być właściwe.  
P o ż y w k a d o h o d o w l i s z c z e p u  
Wykorzystuje si ę właściwe pożywki do hodowli szczepu celem usta ­
lenia liczby komórek, które zachowa ły żywotność i komórek zmuto ­
wanych.  
S t o s o w a n i e k o n t r o l i p o z y t y w n e j i n e g a t y w n e j  
Próbki kontrolne pozytywne, niepoddane dzia łaniu substancji i z 
dodatkiem rozpuszczalnika, musz ą być przygotowane jednocze śnie. 
Odpowiednie substancje do kontroli pozytywnej powinny by ć użyte 
na zakończenie ka żdej mutacji.  
S t ę ż e n i e d o c e l ó w e k s p o z y c j i  
Należy użyć co najmniej pi ęć odpowiednio rozmieszczonych st ężeń 
substancji testowej. W odniesieniu do substancji toksycznych, 
najwyższa wielko ść testowego st ężenia nie powinna obni żać liczby 
komórek, które zachowa ły żywotność poniżej poziomu 5–10 %. 
Odpowiednio, nale ży zbadać substancje rozpuszczalne w wodzie 
do granicy ich rozpuszczalno ści, wykorzystuj ąc właściwe procedury. 
W odniesieniu do nietoksycznych substancji łatwo rozpuszczalnych 
w wodzie, najwy ższe stężenie należy ustalić dla każdego przypadku 
oddzielnie.  
W a r u n k i i n k u b a c j i  
Płytki inkubuj ą się cztery do siedmiu dni w temperaturze 28–30  o C 
bez dostępu światła. 
C z ę s t o t l i w o ś ć m u t a c j i s a m o r z u t n e j .  
Należy użyć subkultury z normalnym zakresem cz ęstotliwości 
mutacji samorzutnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
L i c z b a r e p l i k a c j i  
Należy użyć co najmniej trzech szalek replikacji na dane st ężenie dla 
oznaczenia prototrofów produkowanych przez mutacj ę genu 
i żywotności komórki. W przypadku bada ń z wykorzystaniem znacz ­
ników takich jak  horn  3–10 o niskim wska źniku mutacji liczba 
szalek musi zosta ć powiększona w celu dostarczenia istotnych 
danych statystycznych.  
Procedura  
Badanie szczepów  S. cerevisiae zazwyczaj  przeprowadzane jest 
według procedury badania w środowisku p łynnym w łączając albo 
komórki stacjonarne albo wzrostowe. Badania wst ępne należy prze­
prowadzić na komórkach wzrostowych: 1–5 × 10  7 komórek/ml jest 
poddanych ekspozycji na testow ą substancj ę chemiczn ą przez 18 
godzin przy temperaturze 28–37  o C ze wstrz ąsaniem; podczas czyn ­
ności badawczych, w odpowiednich przypadkach, dodawana jest 
odpowiednia ilo ść substancji systemu aktywacji metabolicznej. Na 
zakończenie bada ń komórki poddawane s ą odwirowaniu, oczysz ­
czaniu i umieszczeniu na w łaściwej pożywce do hodowli szczepu. 
Po okresie inkubacji p łytki poddawane s ą analizie w celu ustalenia 
ilości komórek, które zachowa ły żywotność i komórek wywo łuj­ 
ących mutacj ę genu. Jeżeli pierwsze badanie daje negatywny wynik, 
następne doświadczenie powinno by ć przeprowadzane z u życiem 
komórek znajduj ących się w fazie stacjonarnej. Je żeli pierwsze 
badanie daje wynik pozytywny, to potwierdzane jest nast ępnym, 
niezależnym badaniem.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli, wskazuj ąc liczbę zliczo­
nych kolonii, liczb ę mutantów, liczb ę komórek żywych i mutantów. 
Wszystkie wyniki nale ży potwierdzi ć w odpowiednim niezale żnym 
badaniu. Dane nale ży ocenić za pomoc ą właściwych metod staty ­
stycznych.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— użyty szczep,  
— warunki testu: komórki w fazie stacjonarnej b ądź w fazie 
wzrostu, sk ład pożywki, temperatura i czas inkubacji, system 
aktywacji metabolicznej,  
— warunki badania: wielko ść stężenia substancji podczas ekspozycji 
na jej dzia łanie, procedura i czas trwania badania, temperatura 
zastosowana do badania, pozytywne i negatywne kontrole,  
— liczba zliczonych kolonii, liczba mutantów, liczba komórek 
żywych i mutantów, stosunek dawki do reakcji 
w odpowiednich przypadkach, dane oceny statystycznej,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  BADANIE REKOMBINACJI GENETYCZNEJ –  SACCHARO ­
MYCES CEREVISIAE  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Mitotyczna rekombinacja u  Saccharomyces cerevisiae  może być 
wykryta mi ędzy genami (lub ogólnie mi ędzy genem a jego centro ­
merem) i wewn ątrz genów. Ten pierwszy przypadek posiada nazw ę 
„mitotyczne  crossing-over ” i generuje symetryczny produkt, podczas 
gdy drugi przypadek najcz ęściej generuje niesymetryczne produkty 
i posiada nazw ę „konwersja genów”. Zaj ście crossing-over  jest 
widoczne dzi ęki wytwarzaniu si ę kolonii homozygot recesywnych, 
lub sektorów wytworzonych w szczepach heterozygotycznych, 
podczas gdy konwersja genów uwidacznia si ę przez wytworzenie 
prototroficznych rewertantów w auksotroficznych, heteroallelicznych szczepach posiadaj ących dwa ró żne nieprawid łowe allele tego 
samego genu. Do detekcji mitotycznej konwersji genów najcz ęściej 
używa się szczepów D
 4 (heteroalleliczny pod wzgl ędem ade 2 i trp 
5), D  7 (heteroalleliczny pod wzgl ędem trp 5), BZ  34 (heteroalleliczny 
pod wzgl ędem arg 4) i JD1 (heteroalleliczny pod wzgl ędem his 4 
i trp 5). Mitotyczne  crossing-over , którego skutkiem jest powstanie 
czerwonych i ró żowych sektorów komórek homozygotycznych, 
może być wykrywane przy u życiu szczepów D  5 lub D  7 (które 
również wskazuj ą na mitotyczn ą konwersj ę genów i wsteczn ą 
mutację przy  ilv 1–92). Obydwa szczepy s ą heteroalleliczne pod 
względem odpowiadaj ących sobie alleli  ade 2.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Roztwory testowych substancji chemicznych i próbki kontrolne 
powinny by ć przygotowywane tu ż przed badaniem, przy u życiu 
odpowiednich no śników. W przypadku zwi ązków organicznych, 
które nie s ą rozpuszczalne w wodzie, nale ży używać nie więcej 
niż 2 % (obj ętościowo) roztworów rozpuszczalników organicznych, 
takich jak etanol, aceton, czy dimetylosulfotlenek (DMSO). 
Końcowe stężenie nośnika nie powinno w sposób znacz ący wpływać 
na żywotność komórek i charakterystyk ę wzrostu.  
A k t y w a c j a m e t a b o l i c z n a  
Komórki nale ży podda ć oddziaływaniu testowych substancji 
chemicznych zarówno w przypadku obecno ści, jak i braku obecno ści 
właściwego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej. 
Najpowszechniej u żywanym systemem jest wspó łczynnik uzupe ł­
niony postmitochondrialn ą frakcją z wątrób gryzoni wcze śniej prze­
badanych enzymem wywo łującym czynniki. Wykorzystanie innych 
gatunków, tkanek, postmitochondrialnych frakcji lub procedur 
również może być właściwe dla aktywacji metabolicznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Warunki badania  
B a d a n e s z c z e p y  
Najczęściej wykorzystywanymi szczepami s ą szczepy diploidalne 
D 4 , D 5 , D 7 i JD1. Inne szczepy równie ż mogą być właściwe.  
P o ż y w k a d o h o d o w l i s z c z e p u  
Wykorzystuje si ę właściwe pożywki do hodowli szczepu celem usta ­
lenia liczby komórek pozosta łych przy życiu i cz ęstotliwości gene­
tycznych rekombinacji.  
U ż y c i e k o n t r o l i p o z y t y w n e j i n e g a t y w n e j  
Próbki kontrolne pozytywne, niepoddane dzia łaniu substancji i z 
dodatkiem rozpuszczalnika, musz ą być przygotowane jednocze śnie. 
Odpowiednie substancje do kontroli pozytywnej powinny by ć użyte 
na zakończenie ka żdej mutacji.  
S t ę ż e n i e e k s p o z y c j i  
Należy użyć co najmniej pi ęć odpowiednio rozmieszczonych st ężeń 
substancji testowej. Nale ży uwzględnić między innymi takie czyn ­
niki, jak cytotoksyczno ść i rozpuszczalno ść. Najniższe stężenie nie 
może wpływać na żywotność komórki. W odniesieniu do substancji 
toksycznych najwy ższa wielko ść badanego st ężenia nie powinna 
obniżać liczby komórek, które zachowa ły żywotność poniżej 
poziomu 5–10 %. Odpowiednio, nale ży zbadać substancje rozpusz ­
czalne w wodzie do granicy ich rozpuszczalno ści, wykorzystuj ąc 
właściwe procedury. W odniesieniu do nietoksycznych substancji 
łatwo rozpuszczalnych w wodzie najwy ższe stężenie nale ży ustalić 
dla każdego przypadku oddzielnie.  
Komórki mog ą zostać poddane oddzia ływaniu substancji testowej 
albo w fazie stacjonarnej, albo podczas wzrastania przez okres do 
18 godzin. Jednak że, w przypadku d ługotrwałych bada ń, kultury 
należy poddać badaniu mikroskopowemu w celu wykrycia formacji 
zarodnika, którego obecno ść unieważnia badanie.  
W a r u n k i i n k u b a c j i  
Płytki są inkubowane w ciemno ści od czterech do siedmiu dni 
w temperaturze 28–30  o C. Płytki użyte do oznaczenia czerwonych 
i różowych sektorów homozygot wytworzonych przez mitotyczny  
crossing-over  powinny by ć przechowywane w lodówce (w tempera ­
turze oko ło 4 o C) przez dalsze 1–2 dni przed oznaczeniem wyników, 
aby umożliwić rozwój odpowiednich zabarwionych kolonii.  
C z ę s t o t l i w o ś ć s a m o r z u t n e j r e k o m b i n a c j i g e n e ­
t y c z n e j  
Należy użyć subkultur z normalnym zakresem cz ęstotliwości samo­
rzutnej rekombinacji genetycznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
L i c z b a r e p l i k a c j i  
Powinny by ć użyte co najmniej trzy szalki na okre ślone stężenie, 
w celu oznaczenia prototrofów wytworzonych za pomoc ą mito­
tycznej konwersji genów i w celu oznaczenia żywotności komórek. 
W przypadku oznaczania recesywnych homozygot wytworzonych 
przez mitotyczny  crossing-over  liczba p łytek powinna by ć zwięk­
szona, aby dostarczy ć odpowiedni ą liczbę kolonii.  
Procedura  
Badanie szczepów  S. cerevisiae zazwyczaj  przeprowadzane jest 
według procedury badania w środowisku p łynnym, w łączając 
komórki stacjonarne albo wzrostowe. Pocz ątkowe badania nale ży 
przeprowadzi ć na komórkach wzrostowych: 1–5 × 10  7 komórek/ml 
jest poddanych ekspozycji na testow ą substancj ę chemiczn ą przez 18 
godzin przy temperaturze 28–37  o C ze wstrz ąsaniem; w okresie 
trwania bada ń, w odpowiednich przypadkach, dodawana jest odpo ­
wiednia ilo ść systemu aktywacji metabolicznej.  
Na zakończenie bada ń komórki poddawane s ą odwirowaniu, oczysz ­
czaniu i umieszczane na w łaściwej pożywce do hodowli szczepu. Po 
okresie inkubacji p łytki poddawane s ą analizie w celu ustalenia 
liczby komórek, które zachowa ły żywotność i komórek wywo łuj­ 
ących mutacj ę genu.  
Jeżeli pierwsze badanie daje wynik negatywny, nast ępne doświad­
czenie powinno by ć przeprowadzane z u życiem komórek znajduj ­ 
ących się w fazie stacjonarnej. Je żeli pierwsze badanie daje wynik 
pozytywny, to potwierdzane jest nast ępnym, niezale żnym badaniem.  
2. DANE  
Dane powinny by ć przedstawione w formie tabeli, która wskazuje 
liczbę zliczonych kolonii, ilo ść rekombinantów, liczb ę komórek 
żywych i cz ęstotliwość wystąpienia rekombinacji. Wyniki powinny 
być potwierdzone niezale żnym badaniem. Dane powinny by ć 
ocenione przy u życiu odpowiednich metod statystycznych.  
Dane nale ży ocenić za pomoc ą właściwych metod statystycznych.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— użyty szczep,  
— warunki bada ń: komórki fazy stacjonarnej lub wzrostowej, sk ład 
pożywki, temperatura i okres trwania inkubacji, system aktywacji 
metabolicznej,  
— warunki badania: wielko ść stężenia substancji, procedura i czas 
trwania badania, temperatura zastosowana do badania, pozytywne 
i negatywne grupy kontrolne,  
— liczba zliczonych kolonii, liczba rekombinantów, liczba komórek 
żywych i cz ęstotliwość wyst ąpienia rekombinacji, 
w odpowiednich przypadkach stosunek dawki do reakcji, dane analizy statystycznej,
 
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENNO ŚĆ – BADANIE MUTACJI GENETYCZNEJ  IN 
VITRO  U SSAKÓW  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 476, badania mutacji gene ­
tycznej  in vitro  u ssaków (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Badanie mutacji genetycznej  in vivo  u ssaków mo że być wykorzys ­
tane w celu wykrycia mutacji genu wywo łanej przez substancje 
chemiczne. Odpowiednie linie komórkowe, w łącznie z L5178Y 
mysimi komórkami ch łoniaków, linie komórkowe chomika chi ń­
skiego CHO, CHO-AS52 oraz V79, oraz ludzkie komórki TK6 limfoblastoidu (1). W tych liniach komórkowych najbardziej powszechnie wykorzystywane s ą pomiary genetycznych punktów 
końcowych przy kinazie tymidynowej (TK) oraz transferazie fosfo ­
rybozylowej hypoksantyny-guaniny (HPRT) oraz transgenie trans ­
ferazy fosforybozylowej ksantyny-guaniny (XPRT). Badania mutacji TK, HPRT oraz XPRT wykrywaj ą różne widma zdarze ń genetycz ­
nych. Autosomalne umiejscowienie TK oraz XPRT mo że pozwoli ć 
na wykrycie zdarze ń genetycznych (np. du żych delecji) nie wykry ­
wanych przy HPRT locus na X chromosomach (2)(3)(4)(5)(6).
 
W badaniu mutacji genetycznej  in vitro  u ssaków, mog ą być wyko­
rzystane hodowle ustanowionych linii komórkowych lub szczepy komórkowe. Wykorzystywane komórki wybierane s ą na podstawie 
zdolności do wzrostu w hodowli oraz stabilno ści spontanicznych 
częstotliwości mutacji.
 
Badania przeprowadzane  in vitro  wymagaj ą ogólnie wykorzystania 
egzogenicznego źródła aktywacji metabolicznej. Ten system akty ­
wacji metabolicznej nie mo że naśladować w całości warunków  in 
vivo u ssaków. Powinna zosta ć zachowana ostro żność w celu unik ­
nięcia warunków, które prowadzi łyby do wyników nie-odzwiercied ­
lających wrodzonej mutagenno ści. Pozytywne wyniki, które nie 
odzwierciedlaj ą wrodzonej mutagenno ści, mogą wynikać ze zmian 
w pH, osmolalno ści lub wysokiego poziomu cytotoksyczno ści (7).  
Badanie to jest wykorzystywane w celu wykrycia obecno ści możli­
wych mutagenów oraz czynników rakotwórczych dla ssaków. Wiele 
związków, które s ą pozytywne w tym badaniu s ą czynnikami rako ­
twórczymi dla ssaków, jednak że brak idealnego powi ązania między 
tym badaniem oraz rakotwórczo ścią. Powiązanie to jest zale żne od 
klasy substancji chemicznej oraz istnieje wzrastaj ący dowód na to, że 
istnieją czynniki rakotwórcze, które nie s ą wykrywane przez to bada ­
nie, poniewa ż wydaje si ę, iż działają one przez inne, niegenoto ­
ksyczne mechanizmy lub mechanizmy, których brak w komórkach bakteryjnych (6).
 
Zob. także Ogólne wprowadzenie do cz ęści B 
1.2. DEFINICJE  
Mutacja powoduj ąca zmian ę bądź utratę aktywno ści białka: 
mutacja genu z rodzaju macierzystego mutanta, który powoduje zmianę lub strat ę aktywno ści enzymatycznej funkcji zakodowanego 
białka.
 
Mutageny powoduj ące substytucj ę: substancje, które powoduj ą 
zastąpienie jednego lub wielu par zasad DNA.  
Mutageny powoduj ące mutacje zmiany fazy odczytu:  Substancje, 
które powoduj ą dodanie lub skre ślenie pojedynczej lub wielu par 
nukleotydów w cz ąstce DNA.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Czas ekspresji fenotypowej:  okres, w trakcie którego produkty 
genu niezmienionego s ą oddzielane od świeżo zmutowanej komórki.  
Częstotliwość mutacji:  liczba zaobserwowanych zmutowanych 
komórek podzielona przez liczb ę komórek zdolnych do życia.  
Względny wzrost ca łkowity:  wzrost liczby komórek w czasie 
w porównaniu z populacj ą kontroln ą komórek; obliczony jako 
stosunek wzgl ędnego wzrostu czasu skuteczno ści kloningu negatyw ­
nych kontroli wzgl ędem kontroli negatywnych.  
Względny wzrost zawieszania:  wzrost liczby komórek powy żej 
okresu ekspresji wzgl ędem kontroli negatywnych.  
Zdolność do życia:  skuteczno ść kloningu komórek poddanych dzia ­ 
łaniu substancji w czasie umieszczania w warunkach selektywnych 
po okresie ekspresji.  
Przeżywanie:  skuteczno ść kloningu komórek poddanych dzia łaniu 
substancji, kiedy s ą umieszczane na koniec okresu poddawania dzia ­ 
łaniu substancji; prze żywanie zazwyczaj wyra żane jest w odniesieniu 
do przeżywania populacji komórek kontrolnych.  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Brakujące komórki w kinazie tymidynowej (TK) z powodu mutacji 
TK +/- → TK-/- są odporne na skutki cytotoksyczne substancji analo ­
gicznej pirymidynie-trifluorotymidynie (TFT). Zdrowe komórki kinazy tymidynowej s ą wrażliwe na TFT, która powoduje wstrzy ­
manie komórkowej przemiany materii oraz zatrzymuje dalsze dzie ­
lenie się komórek. W ten sposób zmutowane komórki s ą w stanie 
rozmnażać się wege-tatywnie w obecno ści TFT, podczas gdy 
normalne komórki, które zawieraj ą kinazę tymidynow ą, nie są do 
tego zdolne. Podobnie komórki, którym brakuje HPRT lub XPRT, są wybierane w oparciu o odporno ść na 6-tioguanin ę (TG) lub 8- 
azaguanin ę (AG). W łaściwości substancji badanej powinny by ć 
ostrożnie wzięte pod uwag ę, jeżeli zasadowy element analogiczny 
lub związek związany z selektywnym czynnikiem jest badany 
w ramach jakiegokolwiek badania mutacji genów u ssaków. Na przykład jakakolwiek podejrzewana toksyczno ść selektywna ze 
strony substancji badanej w odniesieniu do komórek zmutowanych 
i niezmutowanych powinna zosta ć zbadana. W ten sposób przepro ­
wadzenie wyboru system/czynnik musi by ć potwierdzone, badaj ąc 
substancje chemiczne strukturalnie zawi ązane z czynnikami selek ­
tywnymi (8).
 
Komórki w zawiesinie lub w hodowli jednocz ąsteczkowej s ą 
poddawane dzia łaniu substancji badanej, zarówno z aktywacj ą, jak 
i bez aktywacji metabolicznej, przez odpowiedni okres oraz hodo ­
wane wtórnie w celu oznaczenia cytotoksyczno ści oraz w celu 
dopuszczenia do ekspresji fenotypowej przed wybraniem mutanta (9)(10)(11)(12)(13). Cytotoksyczno ść jest zazwyczaj oznaczana 
przez pomiar odpowiedniej skuteczno ści kloningu (prze żywania) 
lub odpowiedni wzrost hodowli ogó łem po okresie poddania dzia ­ 
łaniu substancji badanej. Hodowle, które zosta ły poddane dzia łaniu 
substancji badanej, s ą utrzymywane w pod łożu wzrostu przez 
wystarczaj ący okres czasu, charakterystyczny dla ka żdego wybra ­
nego locus oraz rodzaju komórki, w celu dopuszczenia do prawie 
optymalnej ekspresji fenotypowej wywo łanych mutacji. Cz ęstotli­
wość mutacji jest oznaczana przez osadzanie znanej ilo ści komórek 
w podłożu zawieraj ącym czynnik selektywny w celu wykrycia 
zmutowanych komórek oraz w pod łożu bez czynnika selektywnego 
w celu oznaczenia skuteczno ści kloningu (zdolno ść do życia). Po 
odpowiednim okresie inkubacji, hodowle s ą podliczane. Cz ęstotli­
wość mutacji jest uzyskiwana z ilo ści hodowli mutantów 
w selektywnym pod łożu oraz ilo ści hodowli w pod łożu nieselektyw
­
nym. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Preparaty  
1.4.1.1.  Komórki  
Różnorodność rodzajów komórek jest dost ępna do wykorzystania 
w tym badaniu, łącznie z subklonami L5171Y, CHO, CHO-AS52, 
V79 lub komórkami TK6. Rodzaje komórek wykorzystane w tym badaniu powinny posiada ć wykazan ą czułość na mutanty chemiczne, 
wysoką skuteczno ść kloningu oraz stabiln ą częstotliwość sponta­
nicznej mutacji. Komórki powinny by ć sprawdzone w odniesieniu 
do zanieczyszczenia mykoplazmy oraz w przypadku zanieczysz ­
czenia nie powinny by ć wykorzystywane.
 
Badanie powinno by ć tak opracowane, aby mia ło wcześniej ozna ­
czoną czułość. Liczba wykorzystanych komórek, hodowli oraz 
stężeń substancji badanej powinna odzwierciedla ć te określone para ­
metry (14). Minimalna liczba zdolnych do życia komórek, które 
przeżywają poddanie dzia łaniu substancji oraz wykorzystywanych 
na każdym etapie w badaniu, powinna by ć oparta na cz ęstotliwości 
mutacji spontanicznej. Ogóln ą wskazówk ą jest wykorzystanie liczby 
komórek, która jest przynajmniej 10-krotno ścią odwrotno ści częstot­
liwości mutacji spontanicznej. Jednak że zaleca si ę wykorzystanie 
przynajmniej 10  6 komórek. Odpowiednie dane historyczne dotycz ące 
wykorzystanego systemu komórkowego powinny by ć dostępne 
w celu wskazania spójnego sposobu przeprowadzenia badania.  
1.4.1.2.  Warunki dotycz ące podłoża oraz hodowli  
Odpowiednie pod łoże hodowli oraz warunki inkubacji (naczynia do 
hodowli, temperatura, st ężenie CO  2 oraz wilgotno ść) powinny by ć 
wykorzystane. Pod łoże powinno zosta ć wybrane wed ług systemu 
selektywnego oraz wykorzystanego rodzaju komórek w badaniu. Jest w szczególno ści ważne, aby zosta ły wybrane warunki hodowli, 
które zapewniaj ą optymalny wzrost komórek w trakcie okresu 
ekspresji oraz zdolno ści do formowania kolonii zarówno komórek 
zmutowanych, jak i niezmutowanych.
 
1.4.1.3.  Przygotowanie hodowli  
Komórki s ą rozmnażane z hodowli podstawowych, osadzonych 
w podłożu hodowli oraz inkubowanych w temperaturze 37  o C. 
Przed wykorzystaniem w tym badaniu, mo że istnieć potrzeba oczysz ­
czenia hodowli z istniej ących już wcześniej komórek zmutowanych.  
1.4.1.4.  Aktywacja metaboliczna  
Komórki powinny zosta ć poddane dzia łaniu substancji badanej 
zarówno w obecno ści, jak i w nieobecno ści odpowiedniego systemu 
aktywacji metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzysty ­
wanym systemem jest uzupe łniana wspó łczynnikiem frakcja pomito ­
chondrialna (S9) przygotowana z w ątroby gryzoni, otrzymuj ących 
czynniki pobudzaj ące enzymy takie jak Aroklor 1254 (15)(16)(17) ­
(18) lub kombinacja fenobarbitonu oraz β nafoflavonu (19)(20).  
Frakcja pomitochondrialna jest zazwyczaj wykorzystywana 
w stężeniach w zakresie 1–10 % obj ętościowo w ko ńcowym pod łożu 
badawczym. Wybór oraz warunki systemu aktywacji metabolicznej mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. 
W niektórych przypadkach w łaściwe może być wykorzystanie wi ęcej 
niż jednego st ężenia frakcji pomitochondrialnej.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Ilość rozwijania si ę komórek, w tym budowa genetycznie skonstruo ­
wanych linii komórkowych stanowi ących ekspresj ę szczególnych 
enzymów aktywuj ących, mo że przewidywa ć potencja ł aktywacji 
endogenicznej. Wybór wykorzystywanych linii komórkowych powi ­
nien być naukowo uzasadniony (np. przez relewancj ę izoenzymu 
cytochromu P450 dla przemiany materii substancji badanej).  
1.4.1.5.  Preparat substancji badanej  
Stałe substancje badane powinny zosta ć rozpuszczone lub zawie ­
szone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczone, je żeli jest to odpowiednie, zanim komórki zostan ą 
poddane dzia łaniu substancji badanej. P łynne substancje badane 
mogą być dodawane bezpo średnio do systemu badawczego i/lub 
rozcieńczane przed poddaniem dzia łaniu substancji badanej. 
Powinny zosta ć wykorzystane świeże preparaty, chyba że dane 
dotyczące stabilno ści wykazuj ą dopuszczalno ść ich składowania.  
1.4.2.  Warunki badania  
1.4.2.1.  Rozpuszczalnik/no śnik 
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien mie ć możliwości reagowania 
chemicznego z substancj ą badaną oraz powinien by ć zgodny z prze ży­
waniem komórek oraz aktywno ścią S9. Jeśli inne ni ż dobrze znane 
rozpuszczalniki/no śniki są wykorzystywane, ich w łączenie do 
doświadczenia powinno by ć wsparte danymi wskazuj ącymi ich zgod ­
ność. Zaleca si ę, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści 
rozważone zosta ło wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/ ­
nośników. Badaj ąc substancje niestabilne w wodzie, wykorzystane 
organiczne rozpuszczalniki powinny by ć wolne od wody. Woda 
może zostać usunięta przez dodanie sita cz ąsteczkowego.  
1.4.2.2.  Stężenia poddania dzia łaniu substancji  
Wśród kryteriów, które maj ą zostać uwzględnione, oznaczaj ąc 
najwyższe stężenia, znajduje si ę cytotoksyczno ść, rozpuszczalno ść 
w systemie badawczym, oraz zmiany pH lub osmolalno ści. 
Cytotoksyczno ść powinna by ć oznaczana z aktywacj ą metaboliczn ą 
oraz bez aktywacji metabolicznej w g łównym do świadczeniu, wyko ­
rzystując odpowiednie wskazanie integralno ści komórki oraz 
wzrostu, takie jak odpowiedni kloning (prze żywanie) lub odpowiedni 
wzrost ca łkowity. U żyteczne mo że być oznaczenie cytotoksyczno ści 
oraz rozpuszczalno ści w doświadczeniu wst ępnym.  
Powinny zosta ć wykorzystane przynajmniej cztery nadaj ące się do 
analizy st ężenia. W przypadku gdy istnieje cytotoksyczno ść, stężenia 
te powinny obejmowa ć zakres od maksymalnej do minimalnej 
toksyczno ści lub jej braku, b ędzie to zazwyczaj oznacza ć, że 
poziomy st ężenia powinny zosta ć oddzielone przez nie wi ęcej niż 
jeden czynnik mi ędzy 2 a √10. Jeżeli maksymalne st ężenie jest 
oparte na cytotoksyczno ści, wynikiem tego powinien by ć wzrost 
w przybli żeniu 10–20 % (ale nie mniejszy ni ż 10 %) wzgl ędnego 
przeżywania (wzgl ędna skuteczno ść kloningu) lub wzgl ędny wzrost. 
W odniesieniu do wzgl ędnie nietoksycznych substancji maksymalne 
stężenie badania powinno wynosi ć 5 mg/ml, 5 μl/ml, lub 1,01 M, 
w zależności od tego, które ze st ężeń jest najni ższe. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Względnie nierozpuszczalne substancje powinny by ć badane do 
granic ich rozpuszczalno ści lub poza granice rozpuszczalno ści 
w warunkach hodowli. Dowody na nierozpuszczalno ść powinny 
być oznaczane w ko ńcowym pod łożu podania substancji, dzia łaniu 
której komórki s ą poddawane. U żyteczna mo że być ocena rozpusz ­
czalności na pocz ątku oraz na ko ńcu podawania substancji, ze 
względu na to, że rozpuszczalno ść może się zmienia ć w czasie 
trwania poddania dzia łaniu substancji w systemie badawczym 
w wyniku obecno ści komórek, S9, surowicy itd. Nierozpuszczalno ść 
może być wykryta przez wykorzystanie oka nieuzbrojonego. 
Strącanie się nie powinno zak łócać oceny.  
1.4.2.3.  Kontrole  
Równoleg łe pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik lub no śnik) 
kontrole, zarówno z aktywacj ą metaboliczn ą, jak i bez aktywacji 
metabolicznej powinny zosta ć objęte każdym doświadczeniem. Je żeli 
wykorzystywana jest aktywacja metaboliczna, pozytywna kontrolna 
substancja chemiczna powinna by ć substancj ą, która wymaga akty ­
wacji w celu wywo łania reakcji mutagennej.  
Przykłady pozytywnych substancji kontrolnych obejmuj ą: 
Warunki aktywacji 
metabolicznej Locus Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Brak egzoge ­
nicznej aktywacji metabolicznej HPRT Etyl metanosulfonowy 62-50-0 200-536-7 
Etyl nitrozomocznikowy 759-73-9 212-072-2 
TK (małe 
i duże 
hodowle) Metyl metanosulfonowy 66-27-3 200-625-0 
XPRT Etyl metanosulfonowy 62-50-0 200-536-7 
Etyl nitrozomocznikowy 759-73-9 212-072-2 
Obecność egzoge­
nicznej aktywacji metabolicznej HPRT 3-Metylocholantren 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodimethylamine 62-75-9 200-549-8 
7,12-antracen dimetylobenzenu 57-97-6 200-359-5 
TK (małe 
i duże 
hodowle) Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
Cyklofosfamidomonohydrat 6055-19-2 Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5 3-Metylocholantren 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-Nitrozodometyloamina (dla 
wysokich poziomów S-9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]piren 50-32-8 200-028-5
 
Mogą zostać wykorzystane inne odpowiednie wzorcowe pozytywne 
substancje kontrolne, np. je śli laboratorium posiada dane historyczne 
w oparciu o 5-bromo 2'-deoksyurydyn ę (nr CAS 59-14-3, nr Einecs 
200-415-9), ta substancja wzorcowa mog łaby zosta ć również wyko­
rzystana. Powinno zosta ć uwzględnione wykorzystanie pozytywnych 
substancji kontrolnych zwi ązanych z klas ą substancji chemicznych, 
jeżeli są dostępne. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Powinny zosta ć objęte badaniem negatywne kontrole, sk ładające się 
z samego rozpuszczalnika lub no śnika w pod łożu, do którego doda ­
wana jest substancja, oraz w odniesieniu do których stosuje si ę 
identyczne dzia łania jak w odniesieniu do grupy poddanej dzia łaniu 
substancji badanej. Dodatkowo kontrole bez poddania dzia łaniu 
substancji powinny by ć również wykorzystane, chyba że istnieją 
historyczne dane dotycz ące kontroli wykazuj ące, że wybrany 
rozpuszczalnik nie wywo łuje żadnych szkodliwych lub mutagennych 
skutków.  
1.4.3.  Procedura  
1.4.3.1.  Poddawanie dzia łaniu substancji badanej  
Rozmnażające się komórki powinny zosta ć poddane dzia łaniu 
substancji badanej zarówno z aktywacj ą metaboliczn ą, jak i bez akty ­
wacji metabolicznej. Poddanie dzia łaniu substancji powinno trwa ć 
odpowiedni okres czasu (zazwyczaj skuteczny jest okres 3–6 godzin). Czas poddania dzia łaniu substancji badanej mo że zostać 
przedłużony na okres jednego lub wi ększej liczby cykli komórko ­
wych.
 
Albo komórki poddawane pojedynczo dzia łaniu substancji, albo 
poddawane podwojonemu dzia łaniu substancji badanej mog ą być 
wykorzystane przy ka żdym badanym st ężeniu. Jeżeli wykorzysty ­
wane są pojedyncze hodowle, ilo ść stężeń powinna zosta ć zwięk­
szona w celu zapewnienia odpowiedniej ilo ści hodowli do analizy 
(np. przynajmniej osiem st ężeń nadających się do analizy). Powinny 
zostać wykorzystane podwojone negatywne (rozpuszczalnik) 
hodowle kontrolne.  
Gazowe lub lotne substancje powinny by ć badane odpowiednimi 
metodami, takimi jak w szczelnie zamkni ętych naczyniach do 
hodowli (21)(22).  
1.4.3.2.  Pomiar prze żywania, zdolno ści do życia oraz cz ęstotliwości mutacji  
Na koniec okresu poddawania dzia łaniu substancji komórki s ą 
wymywane oraz hodowane w celu oznaczenia prze żywania oraz 
w celu umo żliwienia ekspresji genotypowej mutanta. Pomiar cytoto ­
ksyczności przez oznaczanie wzgl ędnej skuteczno ści kloningu (prze ­ 
żywanie) lub wzgl ędny wzrost ca łkowity zazwyczaj rozpoczyna si ę 
po okresie poddawania dzia łaniu substancji.  
Każdy locus posiada okre ślony wymóg w celu dopuszczania do 
prawie optymalnej ekspresji fenotypowej nowo powsta łych 
mutantów (HPRT oraz XPRT wymaga przynajmniej 6–8 dni, 
a TK przynajmniej 2 dni). Komórki s ą hodowane w pod łożu 
z czynnikami selektywnymi lub bez czynników selektywnych w odniesieniu do oznaczania ilo ści mutantów oraz wydajno ści klono­
wania, odpowiednio. Pomiary zdolno ści do życia (wykorzystywane 
do obliczania cz ęstotliwości mutacji) rozpoczynane s ą na koniec 
okresu ekspresji przez umieszczanie w nieselektywnym pod łożu.
 
Jeżeli substancja badana jest pozytywna w badaniu L5178Y TK  +/- , 
powinno zosta ć przeprowadzone sortowanie wed ług rozmiarów na 
przynajmniej jednej z badanych kolonii (najwy ższe pozytywne st ęże­
nie) oraz na pozytywnych i negatywnych kontrolach. Je żeli 
substancja badana jest negatywna w badaniu L5178Y TK  +/- , 
powinno zosta ć przeprowadzone sortowanie wed ług rozmiarów na 
negatywnych i pozytywnych kontrolach. W badaniach wykorzystuj ­ 
ących TK6TK  +/- może być również przeprowadzone sortowanie 
według rozmiarów kolonii.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Dane powinny obejmowa ć oznaczenie cytotoksyczno ści oraz zdol ­
ności do życia, liczb ę koloni oraz cz ęstotliwości mutacji 
w odniesieniu do hodowli, które zosta ły poddane dzia łaniu substancji 
oraz hodowli kontrolnych. W przypadku pozytywnej reakcji w badaniu L5178Y TK
 +/- , kolonie s ą oceniane wykorzystuj ąc 
kryteria ma łych oraz du żych kolonii na przynajmniej jednym 
stężeniu substancji badanej (najwy ższe pozytywne st ężenie) oraz 
na pozytywnych i negatywnych kontrolach. Charakter cytogene ­
tyczny oraz charakter budowy cz ąsteczkowej mutantów, zarówno 
małych, jak i du żych kolonii, zosta ł szczegółowo zbadany (23)(24). 
W badaniu TK  +/- kolonie s ą oceniane, wykorzystuj ąc kryteria 
normalnego wzrostu (du że) oraz wolnego wzrostu (ma łe) koloni 
(25). Zmutowane komórki, które najbardziej dotkliwie odczu ły 
uszkodzenie genetyczne, przed łużyły podwajanie okresów, a zatem 
tworzą małe kolonie. Uszkodzenie to zazwyczaj waha si ę w zakresie 
od strat ca łego genu do kariotypów widocznych aberracji chromoso ­
mowych. Wprowadzenie mutantów ma łych kolonii zosta ło powi­ 
ązane z substancjami chemicznymi, które wywo łują całkowite aber ­
racje chromosomowe (26). Mniej powa żnie dotkni ęte zmutowane 
komórki wzrastaj ą w zakresie podobnym do komórek macierzystych 
oraz tworz ą duże kolonie.  
Powinno zosta ć podane prze żywanie (wzgl ędna skuteczno ść 
kloningu) lub wzgl ędny wzrost ca łkowity. Cz ęstotliwość mutacji 
powinna by ć wyrażona jako liczba komórek mutantów przypadaj ­ 
ących na liczb ę komórek prze żywających.  
Powinny zosta ć dostarczone dane dotycz ące poszczególnych 
hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny zosta ć podsumowane 
w formie tabelarycznej.  
Nie istnieje wymóg sprawdzania jasnej reakcji pozytywnej. Niejed ­
noznaczne wyniki powinny zosta ć wyjaśnione przede wszystkim 
wykorzystuj ąc modyfikacje warunków do świadczalnych. Wyniki 
negatywne musz ą zostać potwierdzone na zasadzie jednostkowych 
przypadków. W przypadkach gdy potwierdzenie negatywnych wyników nie jest uznawane za niezb ędne, powinno zosta ć zapew­
nione uzasadnienie. Modyfikacje parametrów badawczych w celu 
rozszerzenia zakresu ocenianych warunków powinno by ć rozważone 
w dalszych do świadczeniach w odniesieniu do niejednoznacznych 
lub negatywnych wyników. Parametry badawcze, które mog ą zostać 
zmodyfikowane, obejmuj ą zakres st ężeń oraz warunki aktywacji 
metabolicznej.
 
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany z dawk ą wzrost lub wzrost odtwarzalno ści częstotliwości 
mutacji. Biologiczne znaczenie wyników powinno zosta ć wzięte pod 
uwagę w pierwszej kolejno ści. Metody statystyczne mog ą zostać 
wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny 
wyników (24). Znaczenie statystyczne nie powinno by ć jedynym 
czynnikiem okre ślającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej.  
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w tym syste ­
mie. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ła jasne pozytywne lub 
negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych b ędzie 
wyklucza ł dokonanie ostatecznej oceny dotycz ącej aktywno ści 
substancji badanej. Wyniki mog ą pozosta ć niejednoznaczne lub 
sporne niezale żnie od liczby powtórze ń doświadczenia.  
Wyniki pozytywne z badania mutacji genetycznej u ssaków wska ­
zują, że substancja badana wywo łuje mutacje genowe 
w hodowanych komórkach. Najwi ększe znaczenie ma reakcja pozy ­
tywna st ężenia. Wyniki negatywne wskazuj ą, że w warunkach 
badawczych, substancja badana nie wywo łuje mutacji genetycznych 
w wykorzystanych hodowanych komórkach ssaków.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi obejmowa ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru rozpuszczlnika/no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Komórki:  
— rodzaj oraz źródło komórek,  
— liczba hodowli komórek,  
— liczba przej ść komórek, je żeli ma zastosowanie,  
— metody utrzymania hodowli komórek, je żeli mają zastosowanie,  
— brak mykoplazmy.  
Warunki badania:  
— racjonalne uzasadnienie wyboru st ężeń oraz liczby hodowli, 
w tym np. dane dotycz ące cytotoksyczno ści oraz ogranicze ń 
rozpuszczalno ści, jeżeli są dostępne, 
— stężenie CO  2 , 
— stężenie substancji badanej,  
— objętość nośnika oraz dodanej substancji,  
— temperatura inkubacji,  
— czas inkubacji,  
— czas trwania poddania dzia łaniu substancji,  
— gęstość komórki w czasie poddania dzia łaniu substancji,  
— rodzaj oraz sk ład systemu aktywacji metabolicznej, w tym 
kryteria dopuszczalno ści, 
— pozytywne i negatywne kontrole,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— długość okresu ekspresji (w tym liczba sadzonych komórek oraz 
podhodowli i harmonogramy kar mienia, je żeli stosowne),  
— czynniki selektywne,  
— kryteria uznania badania za pozytywne, negatywne lub niejedno ­
znaczne,  
— metody wykorzystywane do wyliczenia liczby zdolnych do życia 
oraz zmutowanych komórek,  
— definicja kolonii, których rozmiary oraz typy s ą brane pod uwag ę 
(łącznie z kryteriami w odniesieniu do „ma łych” oraz „du żych” 
kolonii, gdzie stosowne).  
Wyniki:  
— oznaki toksyczno ści, 
— oznaki str ącania,  
— dane dotycz ące pH oraz osmolalno ści w trakcie poddania dzia ­ 
łaniu substancji badanej, je żeli jest oznaczona,  
— rozmiar kolonii/hodowli, je żeli jest oceniony, przynajmniej 
w odniesieniu do negatywnych oraz pozy tywnych kontroli,  
— dokładność laboratoryjna maj ąca na celu wykrycie mutantów 
małych kolonii/hodowli z systemem L5178Y TK  +/- , gdzie 
stosowne,  
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, w miarę możliwości, 
— analizy statystyczne, je żeli istniej ą, 
— dane dotycz ące równoleg łych negatywnych 
(rozpuszczalniki/no śnik) oraz pozytywnych kontroli,  
— historyczne negatywne (rozpuszczalnik/no śnik) oraz pozytywne 
dane z zakresami, odchyleniami śred nimi oraz standardowymi,  
— częstotliwość mutacji.  
— Omówienie wyników.  
— Wnioski.  
4. ODNIESIENIA  
(1) Moore, M. M., DeMarini, D. M., DeSerres, F. J. and Tindal, 
K. R. (eds.) (1987),  Banbury Report 28; Mammalian Cell 
Mutagenesis,  Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E. H. Y. and Malling H. V. (1968), Mammalian Cell 
Genetics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in Chinese Hamster Cells  In vitro, Proc. Natl. Acad. Sci.  USA, 
61, pp. 1306–1312.
 
(3) Liber, H. L. and Thilly, W. G. (1982), Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts,  
Mutation Res.  94, pp. 467–485.  
(4) Moore, M. M., Harington-Brock, K., Doerr, C. L. and Dear ­
field, K. L. (1989), Differential Mutant Quantitation at the 
Mouse Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci,  Mutagenesis,  
4, pp. 394–403.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C. S., and Stankowski, Jr. L. F., (1989), Comparison of 
the AS52/XPRT and the CHO/HPRT AssayS: Evaluation of 
Six Drug Candidates,  Mutation Res.  223, pp. 121–128.  
(6) Aaron, C. S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H. R., Moore, M., Nishi, 
Y., Stankowski, Jr. L. F., Theiss, J. and Thompson, E. (1994), Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group 
Report. Report of the International Workshop on Standardisa ­
tion of Genotoxicity Test Procedures.  Mutation Res.  312, pp. 
235–239.
 
(7) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R., Ishidate, M., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity 
Under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation Res.  257, pp. 147–204.
 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J. F. S., Piper, C. and Mavournin, 
K. H. (1983), Specific Gene Muta tions in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program,  Mutation Res.,  115, pp. 225–251.
 
(9) Li, A. P., Gupta, R. S., Heflich, R. H. and Wasson, J. S. 
(1988), A Review and Analysis of the Chinese Hamster 
Ovary/Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical AgentS: A Report of Phase III of the U. S. Environmental Protections 
Agency Gene-Tox Program,  Mutation Res.,  196, pp. 17–36.
 
(10) Li, A. P., Carver, J. H., Choy, W. N, Hsie, A. W., Gupta, R. 
S., Loveday, K. S., ÓNeill, J. P., Riddle, J. C, Stankowski, L. F. Jr. and Yang, L. L. (1987), A Guide for the Performance of 
the Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phos ­
phoribosyl Transferase Gene Mutation Assay,  Mutation Res.,  
189, pp. 135–141.
 
(11) Liber, H. L., Yandell, D. W. and Little, J. B. (1989), 
A Comparison of Mutation Induction at the TK and HPRT 
Loci in Human Lymphoblastoid CellS: Quantitative Diffe ­
rences are Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus,  Mutation Res.,  216, pp. 9–17.
 
(12) Stankowski, L. F. Jr., Tindal,, K. R., and Hsie, A. W. (1986), 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate – and ICR 191 -Induced Molecular Analyses of Ethyl Methanosulphonate – and ICR 191- Induced Mutation in AS52 Cells,  Mutation Res.,  160, pp. 133–147.
 
(13) Turner, N. T., Batson, A. G. and Clive, D. (19 84), Procedure 
for the L5178Y/TK  +/- – TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay, w: Kilbey, B. J. et al (eds.) Handbook of Mutagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, 
New York, pp. 239–268.
 
(14) Arlett, C. F., Smith, D. M., Clarke, G. M., Green, M. H. L., 
Cole, J., McGregor, D. B. and Asquith S. C. (1989), Mamma ­
lian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Forma ­
tion, w:  Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data,  
Kirkland, D. J., ed., Cambirdge University Press, pp. 66–101.  
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccoro, A. (1977), Induction of 6-Thioguanine- 
Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine,  Mutation 
Res. 46, pp. 365–373.  
(16) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), 
Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with 
the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test,  
Mutation Res.  31, pp. 347–364.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K. O., Spector, J. F. S., Batson A. G. and 
Brown M. M. M. (1979), Validation and Characterisation of 
the L5178Y/TK – Mouse Lymphoma Mutagen Assay System,  
Mutat. Res.  59, pp. 61–108.  
(18) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for 
the Salmonella Mutagenicity Test,  Mutation Res.  113, pp. 
173–215.  
(19) Elliott, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R., Gatehouse, D. 
G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R. C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-Induced S9 in:  In vitro  Genoto­
xicity Assays,  Mutagenesis 7,  pp. 175–177.
 
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. 
(1976), A Safe Substitute for Polycholrinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in:  In vitro Meta ­
bolic Activation in Mutagenesis Testing,  de Serres, F. J., Fouts, 
J. R., Bend, J. R. and Philpot, R. M. (eds), Elsevier, North- 
Holland, pp. 85–88.
 
(21) Krahn, D. F., Barsky, F. C. and McCooey, K. T. (1982), 
CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Vola ­
tile Liquids, in: Ticc, R. R., Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds),  
Genotoxic Effects of Airborne Agents,  New York, Plenum, pp. 
91–103.  
(22) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. 
(1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown 
on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in 
the CHO/HGPRT Mutation Assay,  Environmental Mutagene ­
sis, 5, pp. 795–801.  
(23) Applegate, M. L., Moore, M. M., Broder, C. B., Burrell, A. 
and Hozier, J. C. (1990), Molecular Dissection of Mutations at 
the Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse 
Lymphoma Cells,  Proc. Natl. Acad. Sci.  USA, 87, pp. 51–55.  
(24) Moore, M. M., Clive, D. Hozier, J. C, Howard, B. E., Batson, 
A. G., Turner, N. T. and Sawyer, J. (1985), Analysis of Trif ­
luoronthymidine, Resistant (TFT+) Mutants of L5178Y/TK  +/- – 
Mouse Lymphoma Cells,  Mutation Res.  151, pp. 161–174.  
(25) Yandell, D. W., Dryja, T. P. and Little, J. B. (1990), Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous Autosomal Locus in Human Cells,  Mutation Res.  229, pp. 
89–102.
 
(26) Moore, M. M. and Doerr, C. L. (1990), Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small Colony TK-Deficient Mutant Frequency in L5178Y/TK
 +/- – 3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells,  Mutagenesis,  5, pp. 609–614.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  USZKODZENIE I NAPRAWA DNA – NIEREGULARNA 
SYNTEZA DNA – KOMÓRKI SSAKÓW  IN VITRO  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Test niezaplanowanej syntezy DNA (UDS) mierzy syntez ę DNA po 
wycięciu i usuni ęciu odcinka DNA zawieraj ącego obszar uszko ­
dzony przez czynniki chemiczne lub fizyczne. Ten test jest oparty 
na inkorporacji tymidyny znakowanej trytem (  3 H-TdR) do DNA 
komórek ssaków, które nie znajduj ą się w fazie S cyklu komórko ­
wego. Przyj ęcie 3 H-TdR mo że być oznaczone metod ą autoradiografii 
lub zliczania w ciek łym scyntylatorze (LSC) DNA badanych komó ­
rek. Komórki ssaków w kulturach, o ile nie s ą to pierwotne hepato ­
cyty szczura, s ą poddawane dzia łaniu czynników testowych 
z obecno ścią lub bez obecno ści egzogennych systemów aktywacji 
metabolicznej. UDS mo że być także wykonywany w systemach  in 
vivo.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Substancje testowe i próbki kontrolne b ądź próbki odniesienia 
powinny by ć przygotowywane w po żywce wzrostowej, b ądź 
rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich no śnikach, 
a następnie rozcie ńczone w po żywce wzrostowej i u żyte do ozna ­
czenia. Ko ńcowe stężenie nośnika nie powinno wp ływać na żywot­
ność komórki.  
Kultury hepatocytów szczura, ludzkich limfocytów lub ustalonych 
linii komórkowych (np. ludzkich diploidalnych fibroblastów) mog ą 
być użyte do oznacze ń. 
Komórki nale ży podda ć działaniu substancji testowej zarówno 
w obecno ści, jak i przy braku obecno ści właściwego systemu akty ­
wacji metabolicznej.  
Warunki badania  
L i c z b a k u l t u r  
Konieczne jest wykorzystanie w ka żdym punkcie badania co 
najmniej dwóch kultur komórkowych do autoradiografii i sze ściu 
kultur (lub mniej w przypadku naukowego uzasadnienia) dla 
określenia UDS za pomoc ą LSC.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Do każdego badania nale ży włączyć równoleg łe pozytywne 
i negatywne grupy kontrolne (niezbadane i/lub którym podawano nośnik) przy obecno ści, jak i przy braku aktywacji metabolicznej.
 
Przykładami zwi ązków, które mog ą być dodawane do próbek 
kontrolnych pozytywnych, mog ą być 7, 12-dimetylobenzatracen 
(7,12-DMBA) lub 2-acetylaminofluoren (2-AAF). W przypadku ustalonych linii komórkowych 4-nitrochinolino-N-tlenek (4-NQO) jest przyk ładem zwi ązku mog ącego stanowi ć pozytywn ą kontrolę 
zarówno dla autoradiografii, jak i oznacze ń LSC wykonywanych 
bez aktywacji metabolicznej komórek; N-dimetylonitrozamina jest przykładem zwi ązku dodawanego do próbek kontrolnych, kiedy 
używane są systemy aktywacji metabolizmu.
 
S t ę ż e n i e w c e l u e k s p o z y c j i  
Należy użyć wielu st ężeń substancji testowej ponad zakres odpo ­
wiedni w celu okre ślenia reakcji. Najwy ższe stężenia powinny 
wywołać pewne objawy cytotoksyczno ści. Odpowiednio, substancje 
nierozpuszczalne w wodzie nale ży badać do granicy ich rozpusz ­
czalności. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych 
w wodzie wy ższe stężenie substancji testowej nale ży rozpatrywa ć 
dla każdego przypadku oddzielnie.  
K o m ó r k i  
W celu utrzymania kultury nale ży zastosowa ć właściwą pożywkę, 
stężenie CO  2 , temperatur ę oraz wilgotno ść. Ustalone linie komór ­
kowe nale ży okresowo sprawdza ć w celu wykrycia ska żenia miko ­
plazmą. 
A k t y w a c j a m e t a b o l i c z n a  
System aktywacji metabolicznej nie jest u żywany w przypadku pier ­
wotnych kultur hepatocytów. Ustalone linie komórkowe i limfocyty poddane ekspozycji na substancj ę testową zarówno przy obecno ści, 
jak i przy braku odpowiedniego systemu aktywacji metabolizmu.
 
Procedura  
P r z y g o t o w a n i e k u l t u r y  
Ustalone linie komórkowe s ą tworzone z kultur zapasowych (np. 
przez trypsynizacj ę bądź wytrz ąsanie), pasa żowanych 
w odpowiedniej g ęstości do naczy ń i inkubowanych 
w temperaturze 37  o C. 
Krótkoterminowe kultury hepatocytów szczura zak ładane są przez 
umożliwienie hepatocytom świeżo rozdzielonym na w łaściwej 
pożywce, zagnie żdżenie się na powierzchni wzrostowej.  
Kultury ludzkich limfocytów zak ładane są za pomoc ą właściwych 
technik.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
P o d d a n i e k u l t u r e k s p o z y c j i n a s u b s t a n c j ę 
t e s t o w ą 
Pierwotne hypocyty szczura  
Świeżo izolowane hepatocyty szczura s ą przez odpowiedni czas 
poddawane dzia łaniu substancji testowej w po żywce zawieraj ącej 
3 H-TdR. Pod koniec tego okresu po żywka powinna zosta ć 
odsączona, a komórki przep łukane, przygotowane i wysuszone. 
Szkiełka powinny by ć zanurzone w emulsji autoradiograficznej 
(ewentualnie mo żna użyć filmu), na świetlone, wywo łane, wybar ­
wione i zliczone.  
Ustalone linie komórkowe i limfocytowe  
Techniki autoradiograficzne: Kultury komórkowe s ą poddane 
ekspozycji na substancj ę testową przez odpowiedni okres czasu po 
zastosowaniu  3 H-TdR. Czas trwania ekspozycji na dzia łanie 
substancji zale ży od charakteru substancji, aktywno ści systemów 
metabolizuj ących oraz rodzaju komórek. W celu wykrycia szczytu 
UDS nale ży dodać 3 H-TdR równocze śnie z substancj ą testową albo 
w przeciągu kilku minut po ekspozycji na substancje testow ą. Wybór 
między tymi dwiema procedurami b ędzie uwarunkowany ewentual ­
nymi interakcjami mi ędzy substancj ą testową a 3 H-TdR. Aby 
odróżnić między UDS i semikonserwatywn ą replikacj ą DNA, to 
ostatnie powinno by ć zahamowane, na przyk ład przez u życie 
pożywki bez zawarto ści argininy, niewielkiej zawarto ści surowicy 
lub przez dodatek hydroksymocznika w po żywce.  
Badanie UDS przy pomocy LSC: Przed zastosowaniem 
substancji testowej powinno zosta ć zablokowane wej ście komórek 
w fazę S w taki sposób, jak opisano powy żej; komórki powinny 
być poddawane dzia łaniu substancji testowych tak, jak opisano dla 
autoradiografii. Po zako ńczeniu okres inkubacji DNA nale ży 
wydobyć z komórek oraz nale ży ustalić ogólną zawarto ść DNA 
oraz stopie ń zawartości 3 H-TdR.  
Należy zauważyć, że – w przypadku u życia ludzkich limfocytów 
w powyższych technikach – wymagane jest wyeliminowanie pó łkon­
serwatywnej replikacji DNA w niestymulowanych kulturach.  
Analiza  
O z n a c z e n i a a u t o r a d i o g r a f i c z n e  
Przy oznaczaniu UDS w komórkach danej kultury j ądra znajduj ące 
się w fazie S nie s ą zliczane. Nale ży zliczyć, co najmniej 50 
komórek na skupienie. Szkie łka powinny by ć opisywane przed 
zliczaniem. Kilka wyra źnie oddzielonych losowych pól powinno 
być policzonych na ka żdym szkie łku. Ilość 3H-TdR wbudowanego 
w cytoplazm ę powinna by ć oznaczona przez liczenie trzech terenów 
o kształcie jądra w cytoplazmie ka żdej ze zliczanych komórek.  
O z n a c z e n i e L S C  
Oznaczając LSC UDS, nale ży zastosowa ć odpowiedni ą liczbę kultur 
do każdej wielko ści stężenia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Wszystkie wyniki nale ży potwierdzi ć niezależnie przeprowadzonym 
badaniem.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli.  
2.1. USTALENIA AUTORADIOGRAFICZNE  
Należy oddzielnie odnotowa ć stopień zawarto ści 3 H-TdR 
w cytoplazmie oraz liczb ę ziaren wykryt ą w jądrze komórki.  
Średnia, mediana i tryb mog ą być użyte, aby opisa ć dystrybucj ę 
i stopień wbudowania  3 H-TdR do cytoplazmy i liczb ę ziaren na 
jądro. 
2.2. OZNACZENIE LSC  
Dla oznaczenia LSC nale ży zgłaszać zawartość 3 H-TdR jako dpm/ug 
DNA. Mo żna zastosowa ć średnią dpm/ug DNA z odchyleniem stan ­
dardowym w celu opisania dystrybucji zawarto ści. 
Dane nale ży ocenić za pomoc ą właściwych metod statystycznych.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— zastosowane komórki, g ęstość oraz liczba pasa ży trakcie badania, 
liczba kultur komórek,  
— metody u żyte w celu utrzymania kultury komórek, w łączając 
pożywkę, temperatur ę i stężenie CO  2 , 
— substancja badana, no śnik, stężenia i racjonalna podstawa 
wyboru wielko ści zastosowanych st ężeń w próbie,  
— szczegó ły systemów aktywacji metabolicznej,  
— zasady badania,  
— pozytywne i negatywne grupy kontrolne,  
— zastosowane techniki autoradiograficzne,  
— procedury u żyte w celu zablokowania wej ścia komórek do 
fazy S,  
— procedury zastosowane w celu wydobycia DNA oraz ustalenia 
ogólnej zawarto ści DNA w oznaczaniu LSC,  
— stosunek dawki do reakcji, je żeli to mo żliwe,  
— analiza statystyczna,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  TEST WYMIANY CHROMATYD SIOSTRZANYCH  IN VITRO  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE) jest krótkoterminowym 
badaniem maj ącym na celu wykrywanie wzajemnych wymian DNA 
między dwoma chromatydami siostrzanymi powielaj ącego się chro­
mosomu. SCE stanowi wymian ę produktów replikacji DNA 
w pozornie homologicznych miejscach. Proces wymiany przypusz ­
czalnie obejmuje rozerwanie i ponowne po łączenie DNA, chocia ż 
niewiele poznano na temat jego molekularnej podstawy. Wykry ­
wanie SCE wymaga niektórych sposobów odmiennego etykieto ­
wania chromatyd siostrzanych, co mo żna osiągnąć przez w łączenie 
bromodeoksyurydyna (BrdU) do chromosomowego DNA dla dwóch 
cykli komórkowych.  
Komórki ssaków  in vitro  poddane s ą ekspozycji na substancje 
testowe z u życiem lub bez u życia egzogennego systemu aktywacji 
metabolicznej, je żeli jest to odpowiednia metoda i hodowane przez 
okres dwóch cykli replikacyjnych w po żywce zawieraj ącej BrdU. Po 
dodaniu inhibitora hamuj ącego tworzenie si ę wrzeciona kariokine ­
tycznego (np. kolchicyny), umo żliwiającego nagromadzenie si ę 
komórek w stadium mitozy podobnym do metafazy (metafaza c), 
komórki s ą zbierane i przygotowywane s ą preparaty chromosomów.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania:  
— w teście mogą zostać wykorzystane pierwotne kultury, (ludzkie 
limfocyty) lub ustalone linie komórkowe (np. komórki jajnika chomika chi ńskiego). Linie komórkowe nale ży sprawdzi ć na 
skażenie mikoplazm ą,
 
— należy zastosowa ć właściwą pożywkę hodowlan ą i warunki inku ­
bacji (np. temperatura, zbiorniki hodowlane, st ężenie CO  2 
i wilgotno ść), 
— substancje testowe mo żna przygotowa ć na pożywce hodowlanej 
lub rozpu ścić lub zawiesi ć w odpowiednich no śnikach przed 
poddaniem badaniu w łaściwych komórek. St ężenie końcowe 
nośnika w systemie hodowli nie powinno znacznie wp łynąć na 
żywotność komórki ani na tempo wzrostu oraz nale ży monito ­
rować wpływ na cz ęstotliwość SCE przez kontrol ę somatyczn ą, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— komórki nale ży poddać działaniu substancji testowej zarówno 
w obecno ści, jak i braku obecno ści egzogenicznego systemu 
aktywacji metabolicznej ssaków. Alternatywnie, w przypadku użycia rodzaju komórek z wrodzonym systemem aktywno ści 
metabolicznej, tempo oraz charakter aktywno ści powinny by ć 
właściwe w odniesieniu z do badanej klasy chemicznej.
 
Warunki badania  
L i c z b a k u l t u r  
Należy użyć co najmniej podwójne kultury dla ka żdego punktu 
badania.  
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Pozytywne grupy kontrolne, u żywając zarówno bezpo średnio dzia ­ 
łającego związku, jak i zwi ązku wymagaj ącego metabolicznej akty ­
wacji, nale ży włączyć do każdego badania; nale ży uwzględnić 
również grupę kontroln ą, której podawany jest no śnik. 
Poniższe substancje s ą przykładami substancji, które mog ą być użyte 
jako pozytywne grupy kontrolne:  
— bezpo średnio dzia łające związki: 
— etylometanosulfonian,  
— pośrednio dzia łające związki: 
— cyklofosfamid.  
W odpowiednich przypadkach mo żna włączyć dodatkow ą pozy­
tywną grupę kontroln ą tej samej klasy chemicznej co substancja 
chemiczna u żywana w badaniu.  
S t ę ż e n i a d o c e l ó w e k s p o z y c j i  
Należy użyć co najmniej trzy odpowiednio rozmieszczone substancje 
testowe. Najwy ższe stężenie powinno wywo łać znaczne objawy 
toksyczno ści, ale umo żliwiać musi odpowiedni ą replikacj ę komórki. 
Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie nale ży badać 
do granicy ich rozpuszczalno ści, wykorzystuj ąc właściwe procedury. 
Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie 
wyższe stężenie substancji testowej nale ży rozpatrywa ć dla każdego 
przypadku oddzielnie.  
Procedura  
P r z y g o t o w a n i e h o d o w l i  
Ustalone linie komórkowe s ą tworzone z kultur zapasowych (np. 
przez trypsynizacj ę lub wytrz ąsanie), pasa żowanych w odpowiedniej 
gęstości do naczy ń i inkubowanych w temperaturze 37  o C. Dla 
kultur monowarstwowych ilo ść komórek na naczynie powinna by ć 
regulowana w ten sposób, że kultury stanowi ą niewiele wi ęcej niż 
50 % płynu w czasie zbierania komórek. Ewentualnie komórki mog ą 
być użyte w kulturze zawieszonej. Kultury ludzkich limfocytów s ą 
zakładane z heparynizowanej krwi z u życiem odpowiednich technik 
i inkubowane w temperaturze 37  o C. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
P o d d a n i e d z i a ł a n i u s u b s t a n c j i t e s t o w e j  
Komórki w fazie gwa łtownego wzrostu poddawane s ą ekspozycji na 
substancję testową przez odpowiedni okres czasu; w wi ększości 
wypadków wystarczy jedna lub dwie godziny w celu uzyskania pożądanych skutków, ale w niektórych przypadkach czas badania 
może być przedłużony do dwóch kompletnych cyklów komórko ­
wych. Komórki nieposiadaj ące odpowiedniego wrodzonego systemu 
aktywności metabolicznej nale ży podda ć działaniu testowej 
substancji chemicznej w obecno ści lub braku obecno ści odpowied ­
niego systemu aktywno ści metabolicznej. Po zako ńczeniu okresu 
ekspozycji komórki s ą oczyszczane z substancji testowej 
i hodowane przez okres dwóch cykli replikacyjnych w obecno ści 
BrdU. Alternatywnie, komórki mo żna podda ć procedurze równo ­
czesnej ekspozycji na substancj ę testową oraz BrdU przez ca łkowity 
okres hodowli dwóch cyklów komórkowych.
 
Kultury ludzkich limfocytów poddane s ą badaniu w chwili, gdy 
znajdują się w stadium pó łsynchronicznym.  
Komórki analizowane s ą podczas ich drugiego podzia łu, po 
poddaniu dzia łaniu substancji, co zapewnia, i ż najbardziej wra żliwe 
fazy podzia łu komórki zosta ły poddane dzia łaniu testowej substancji 
chemicznej. Wszystkie kultury, do których dodano BrdU, nale ży 
utrzymywa ć w środowisku braku światła lub świetle przy ćmionym 
pochodzącym z żarówek, do chwili zbioru komórek w celu zmini ­
malizowania fotolizy DNA zawieraj ącego BrdU.  
Z b i e r a n i e k o m ó r e k  
Kultury komórkowe poddawane s ą działaniu inhibitora (np. 
kolchiny) na godzin ę do czterech godzin przed zbiorem. Ka żda 
kultura jest zbierana i przetwarzana oddzielnie w celu przygotowania 
chromosomów.  
P r z y g o t o w a n i e c h r o m o s o m u i b a r w i e n i e  
Przygotowanie chromosomu dokonywane jest za pomoc ą standardo ­
wych technik cytogenetycznych. Barwienie preparatów w celu wyka ­
zania SCE mo żna przeprowadzi ć za pomoc ą kilku technik (np. 
metoda fluorescencyjna plus Giemsa).  
A n a l i z a  
Liczba komórek przeznaczonych do analizy powinna by ć oparta 
o częstotliwość samorzutnej kontroli SCE. Zazwyczaj co najmniej 
25 rozprzestrzeniaj ących się metafaz na kultur ę jest analizowanych 
pod wzgl ędem SCE. Preparty s ą oznaczane przed rozpocz ęciem 
analiz. W odniesieniu do ludzkich limfocytów jedynie metafazy 
zawierające 46 centromerów s ą poddawane analizie. W ustalonych 
liniach komórkowych jedynie metafazy zawieraj ące ± 2 centromery 
liczby modalnej s ą poddawane analizie. Powinno zosta ć stwierdzone, 
czy centromeryczny prze łącznik znacznika jest oznaczony jako SCE. 
Wszystkie wyniki nale ży potwierdzi ć niezależnie przeprowadzonym 
badaniem.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli. Liczba SCE dla ka żdej 
metafazy oraz liczba SCE na dany chromosom dla ka żdej metafazy 
powinna zosta ć oddzielnie wyszczególniona dla wszystkich kultur 
badanych i kontrolnych.  
Dane nale ży oszacowa ć za pomoc ą odpowiednich metod statystycz ­
nych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— użyte komórki, metody utrzymywania kultur komórek,  
— warunki bada ń: skład pożywki, stężenie CO  2 , stężenie substancji 
testowej, u żyty nośnik, temperatura inkubacji, czas poddania 
działaniu substancji, u żyty inhibitor, jego st ężenie oraz czas 
trwania badania z jego u życiem, rodzaj u żytego systemu meta ­
bolicznej aktywacji ssaków, pozytywne i negatywne grupy 
kontrolne,  
— liczba kultur komórkowych w danym punkcie badania,  
— szczegó ły dotyczące techniki zastosowanej w celu przygotowania 
preparatu,  
— liczba metafaz poddanych analizie (dane przedstawione 
oddzielnie dla ka żdej kultury),  
— średnia liczba SCE w danej komórce i w danym chromosomie 
(dane przedstawione oddzielnie dla ka żdej kultury),  
— kryteria obliczania SCE,  
— racjonalna podstawa wyboru dawki,  
— stosunek dawki do reakcji, w odpowiednich przypadkach,  
— statystyczna analiza,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  BADANIA SPRZ ĘŻONYCH Z P ŁCIĄ RECESYWNYCH CECH 
LETALNYCH U  DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Badanie sprz ężonych z p łcią recesywnych cech letalnych (SLRL) 
u Drosopbila melanogaster  wykrywa istnienie mutacji, zarówno 
punktowych, jak i niewielkich delecji, w linii zarodkowej owada. Niniejsze badanie jest poprzedzone testem mutacji zdolnym zbada ć 
około 800 miejsc na chromosomie X; stanowi to oko ło 80 % wszyst ­
kich miejsc chromosomu X. Chromosom X stanowi oko ło jednej 
piątej całego genomu haploidalnego.
 
Mutacje w chromosomie X u  Drosophila melanogaster  fenotypowo 
ujawniają się u samców przenosz ących gen nurtuj ący. Kiedy mutacja 
jest letalna u homozygot, jej obecno ść można wnioskowa ć na 
podstawie nieobecno ści jednej klasy m ęskiego potomstwa, podczas 
gdy heterozygotyczne samice normalnie wydaj ą dwa rodzaje 
męskiego potomstwa. Badanie SLRL wykorzystuje te aspekty za 
pomocą specjalnie oznaczonych i u łożonych chromosomów.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Z a s o b y  
Samce pochodz ące z dobrze zdefiniowanych zasobów dzikiego typu 
i samice z zasobu Muller-5 mog ą być używane. Inne odpowiednio 
oznaczone samice z wielokrotn ą inwersją chromosomu X tak że 
mogą być używane.  
S u b s t a n c j a t e s t o w a  
Substancje testowe powinny by ć rozpuszczone w wodzie. Substancje 
nierozpuszczalne w wodzie mog ą być rozpuszczone lub zawieszone 
w odpowiednich no śnikach (np. mieszaninie etanolu i Tween-60 lub 
80) i rozcie ńczone w wodzie lub roztworze soli przed podaniem. 
Dimetylosulfoksyd nie powinien by ć używany jako no śnik. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
L i c z b a z w i e r z ą t 
Test powinien by ć zaprojektowany z ustalonymi z góry czu łością 
i siłą. Częstotliwość samorzutnej mutacji obserwowana 
w odpowiedniej grupie kontrolnej w du żym stopniu wp łynie na 
liczbę badanych chromosomów, które nale ży poddać analizie.  
D r o g a p o d a w a n i a s u b s t a n c j i t e s t o w e j  
Poddanie dzia łaniu substancji mo że odbywa ć się drogą pokarmow ą, 
przez wstrzykni ęcie lub przez ekspozycj ę na gazy lub opary. 
Substancja testowa mo że być podawana w roztworze cukru. 
W przypadku gdy zaistnieje taka konieczno ść, substancje mog ą 
zostać rozpuszczone w 0,7 % roztworze NaCl oraz wstrzykni ęte 
do klatki piersiowej lub brzucha.  
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Należy rozwa żyć użycie negatywnych (u życie no śnika) 
i pozytywnych grup kontrolnych. Jednak że w przypadku dost ępności 
do odpowiednich laboratoryjnych danych bazowych nie jest wyma ­
gane wprowadzenie równoczesnych grup kontrolnych.  
P o z i o m y d a w e k  
Należy zastosowa ć trzy poziomy dawek. W celu dokonania wst ępnej 
analizy mo żna zastosowa ć jeden poziom dawki substancji testowej, 
której wielko ść będzie oscylowa ć na minimalnym tolerowanym 
poziomie st ężenia lub poziomie st ężenia wywo łującym pewne 
objawów i toksyczno ści. Odno śnie do substancji nietoksycznych 
należy użyć maksymaln ą stosowan ą wielkość stężenia substancji 
testowej.  
P r o c e d u r a  
Dzikie samce (trzy lub pi ęciodniowe) poddawane s ą działaniu 
substancji testowej oraz indywidualnie u żywane do krycia dziewi ­
czych samic pochodz ących z zasobu Muller-5 lub innego w łaściwie 
oznaczonego zasobu (z wielokrotnymi odwróconymi chromosomami X). Samice zast ępowane s ą nowymi dziewiczymi samicami co dwa 
lub trzy dni, w celu obj ęcia całego cyklu komórek zarodkowych. 
Potomstwo tych samic jest analizowane pod wzgl ędem wyst ąpienia 
skutków śmiertelno ści odpowiadaj ących wpływowi na dojrza łe plem­
niki, spermatydy średniego i pó źnego stadium, spermatydy wczes ­
nego stadium, spermatocyty i spermatogonia w czasie poddania dzia ­ 
łaniu.
 
Heterozygotyczne samice F  1 pochodzące z powy ższych krzy żówek 
kryte są indywidualnie (tj. jedna samica na fiolk ę) ich bra ćmi. 
W pokoleniu F  2 każda kultura liczona jest pod wzgl ędem braku 
dzikich samców. Je żeli okaże się, iż kultura powsta ła od samic F  1 
przenoszących cech ę śmiertelno ści w rodzicielskim chromosomie 
X (tj. nie zaobserwowano żadnych samców z badanym chromoso ­
mem), córki takich samic z tym samym genotypem nale ży zbadać 
w celu ustalenia, i ż cecha śmiertelno ści jest powtarzana w nast ępnym 
pokoleniu.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli w celu wykazania liczby 
zbadanych chromosomów X, liczby niep łodnych samców oraz liczby 
chromosomów z cech ą letalną przy każdej wielko ści stężenia oraz 
w każdym okresie krycia dla ka żdego samca poddanego dzia łaniu 
substancji testowej. Nale ży odnotowa ć liczbę klastrów ró żnego 
rozmiaru na danego samca. Niniejsze wyniki powinny zosta ć 
potwierdzone oddzielnym badaniem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Odpowiednie metody statystyczne powinny by ć użyte w ocenie cech 
letalnych sprz ężonych z p łcią. Skupianie si ę recesywnych cech letal ­
nych pochodz ących od jednego samca powinno by ć wzięte pod 
uwagę i przeanalizowane przy pomocy odpowiedniej metody staty ­
stycznej.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— zasoby: zastosowane zasoby lub szczepy  Drosophila , wiek 
owadów, liczba samców poddanych badaniu, liczba bezp łodnych 
samców, liczba ustalonych kultur F  2 , liczba kultur F  2 bez potom ­
stwa, liczba chromosomów przenosz ących cech ę letalną, wykrytą 
w każdej fazie komórki zarodkowej,  
— kryteria dla okre ślenia wielko ści badanych grup,  
— warunki badania: szczegó łowy opis badania i zasada pobierania 
próbek, poziomy ekspozycji, dane dotycz ące toksyczno ści, nega­
tywne (rozpuszczalnik) i pozytywne grupy kontrolne, odpo ­
wiednio do potrzeb,  
— kryteria s łużące ocenie mutacji letalnych,  
— zależność między objawami a poziomem ekspozycji, je żeli to 
możliwe,  
— dane dotycz ące analizy,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  BADANIE PRZEMIANY KOMÓRKOWEJ SSAKÓW  IN VITRO  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Systemy hodowli komórkowej ssaków mog ą być zastosowane 
w celu wykrycia zmian fenotypowych  in vitro  wywołanych substan ­
cjami chemicznymi zwi ązanymi ze z łośliwymi przemianami  in vivo.  
Powszechnie u żywane komórki, takie jak C3H10TV2, 3T3, SHE, 
szczura Fischera i testowe polegaj ą na ocenie zmian w morfologii 
komórki, formowania skupisk czy zale żności od zakotwiczenia 
w półstałym agarze. Istniej ą systemy rzadziej stosowane, które 
pozwalają wykryć inne zmiany fizjologiczne lub morfologiczne 
w komórkach w nast ępstwie ekspozycji na substancj ę rakotwórcz ą. 
Żadne testy ko ńcowe badania  in vitro  nie maj ą ustalonego 
bezpośredniego powi ązania z nowotworem. Niektóre systemy 
badawcze s ą w stanie wykry ć aktywatory guzów. Cytototoksyczno ść 
można ustalić przez okre ślenie wpływu badanego materia łu na zdol ­
ności formowania kolonii (wydajno ść klonowania) lub wska źniki 
wzrostu kultury. Pomiar cytotoksyczno ści ma na celu ustalenie, że 
ekspozycja na dzia łanie substancji testowej jest istotna pod 
względem toksykologicznym, ale nie mo że być wykorzystywana 
w celu obliczenia cz ęstotliwości przemian we wszystkich próbach, 
ponieważ niektóre mog ą obejmowa ć długotrwałą inkubacj ę i/lub 
pasażowanie.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
K o m ó r k i  
W zależności od stosowanego badania przemian dost ępne są różne 
linie komórkowe lub komórki podstawowe. Badacz musi zapewni ć, 
iż komórki wykorzystywane w przeprowadzanym badaniu wykazuj ą 
właściwe zmiany fenotypowe w nast ępstwie poddania dzia łaniu 
znanym czynnikom rakotwórczym oraz że badanie, przeprowadzane 
w laboratorium badacza, jest potwierdzone i posiada udokumento ­
waną wiarygodno ść. 
P o ż y w k a k u l t u r  
Należy zastosowa ć pożywkę oraz warunki do świadczalne w łaściwe 
dla prób przemiany komórkowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
S u b s t a n c j a t e s t o w a  
Substancja testowa mo że zostać przygotowana na po żywce hodow ­
lanej lub rozpuszczona lub zawieszona we w łaściwych no śnikach 
przed rozpocz ęciem badania komórek. St ężenie końcowe nośnika 
w systemie hodowli nie powinno wp ływać na żywotność komórki, 
tempo wzrostu ani na cz ęstotliwość przemian.  
A k t y w a c j a m e t a b o l i c z n a  
Komórki nale ży podda ć działaniu substancji testowej zarówno 
w obecno ści jak i przy braku obecno ści właściwego systemu akty ­
wacji metabolicznej. Alternatywnie, w przypadku u życia rodzaju 
komórek z wrodzon ą aktywacj ą metaboliczn ą, wskaźnik charakteru 
aktywności powinien by ć znany, aby by ł właściwy dla badanej klasy 
chemicznej.  
Warunki badania  
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Pozytywne grupy kontrolne, u żywając zarówno bezpo średnio dzia ­ 
łającego związku, jak i zwi ązku wymagaj ącego metabolicznej akty ­
wacji, nale ży włączyć do każdego badania; nale ży uwzględnić 
również negatywn ą grupę kontroln ą, której podawany jest no śnik. 
Poniższe substancje s ą przykładami substancji, które mog ą być użyte 
jako pozytywne grupy kontrolne:  
— związki działające bezpośrednio:  
— etylometanosulfonian,  
— ß-propiolakton,  
— związki wymagaj ące aktywacji metabolicznej:  
— acetylaminofluoren,  
— 4-dimetyloaminoazobenzen,  
— 7,12-dimetylobenzantracen.  
W odpowiednich przypadkach mo żna włączyć dodatkow ą pozy­
tywną grupę kontroln ą tej samej klasy chemicznej co zwi ązek 
używany w badaniu.  
S t ę ż e n i a o d d z i a ł u j ą c e j s u b s t a n c j i  
Należy użyć kilka st ężeń substancji testowej. Niniejsze st ężenia 
powinny wywo łać objawy toksyczno ści z nimi zwi ązane, przy 
najwyższym stężeniu powodowa ć niski poziom komórek pozosta łych 
przy życiu oraz poziom żywotności komórek przy najni ższym stęże­
niu, oscyluj ący w przybli żeniu na tym samym poziomie, co przy 
stężeniu użytym w negatywnej grupie kontrolnej. Odpowiednio, 
substancje nierozpuszczalne w wodzie nale ży badać do granicy ich 
rozpuszczalno ści, wykorzystuj ąc właściwe procedury. Dla substancji 
nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wy ższe stężenie 
substancji testowej nale ży rozpatrywa ć dla każdego przypadku 
oddzielnie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Procedura  
Komórki nale ży poddać działaniu substancji przez okre ślony okres 
czasu, w zale żności od stosowanego systemu bada ń, może to doty ­
czyć ponownego dawkowania wraz ze zmian ą pożywki do hodowli 
(i w miar ę potrzeby, świeżą mieszanin ę aktywacji metabolicznej) 
w przypadku d ługotrwałej ekspozycji na dzia łanie substancji testo ­
wej. Komórki nieposiadaj ące odpowiedniej wrodzonej aktywno ści 
metabolicznej nale ży podda ć ekspozycji na substancj ę testową 
w obecno ści i bez obecno ści właściwego systemu aktywno ści meta­
bolicznej. Pod koniec okresu ekspozycji komórki s ą przepłukiwane 
w celu usuni ęcia substancji testowej i hodowane w warunkach odpo ­
wiednich dla monitorowania momentu pojawienia si ę zmienionego 
fenotypu i zasi ęgu transformacji. Wszelkie wyniki potwierdzane s ą 
niezależnym badaniem.  
2. DANE  
Dane powinny by ć opracowane w formie tabeli i mog ą wymaga ć 
uwzględnienia ró żnorodności form zgodnie z metod ą oznaczenia, 
która zosta ła użyta, np. zliczanie p łytek, płytki pozytywne b ądź 
ilość stransformowanych komórek. Je żeli jest to odpowiednia 
metoda, ilo ść komórek, które prze żyły, powinna by ć wyrażona 
jako procent poziomu kontroli i cz ęstotliwości występowania 
ekspresji wyra żonej jako stosunek ilo ści komórek stransformowa ­
nych do komórek, które prze żyły ekspozycj ę. Dane nale ży przeana ­
lizować za pomoc ą właściwych metod statystycznych.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— rodzaj u żytej komórki, liczba kultur komórkowych, metody 
utrzymania kultur komórkowych,  
— warunki badania: st ężenie substancji, u żyty nośnik, czas inkuba ­
cji, czas trwania oraz cz ęstotliwość badania, g ęstość komórkowa 
podczas badania, rodzaj u żytego egzogenicznego systemu akty ­
wacji metabolicznej, pozytywne i negatywne grupy kontrolne, specyfikacja kontrolowanego fenotypu, zastosowany system 
wyboru (odpowiednio do potrzeb), racjonalna podstawa wyboru 
dawkowania,
 
— metody stosowane do liczenia żywych i zmienionych komórek,  
— statystyczna analiza,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  BADANIE DOMINUJ ĄCEGO GENU LETALNEGO 
GRYZONIA  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Dominujące cechy letalne powoduj ą śmierć embrionu lub p łodu. 
Indukcja dominuj ących cech letalnych przez ekspozycj ę na 
substancję chemiczn ą wskazuje na fakt, i ż substancja zaatakowa ła 
tkankę zarodkow ą badanego gatunku. Ogólnie przyjmuje si ę, iż 
dominujące cechy letalne spowodowane s ą uszkodzeniami chromo ­
somowymi (nieprawid łowości strukturalne i liczbowe). Śmierć 
zarodkowa, w przypadku badania samic, mo że również wynikać ze 
skutków toksyczno ści. 
Ogólnie, samce poddawane s ą działaniu badanego zwi ązku oraz 
wykorzystywane do krycia niebadanych dziewiczych samic. Ró żne 
fazy komórki zarodkowej mo żna podda ć oddzielnym badaniom 
przez zastosowanie sekwencyjnego krycia w odpowiednich odst ę­
pach czasu. Wzrost liczby martwych implantów na samic ę 
w grupie badanej ponad liczb ę martwych implantów na samic ę 
w grupie kontrolnej odzwierciedla straty poimplantacyjne. Straty przedimplantacyjne mo żna ocenić w oparciu o liczb ę ciałek żółtych 
lub przez porównanie ca łkowitej ilo ści implantów danej samicy 
w grupie badanej i grupach kontrolnych. Ca łkowity efekt dominuj ­ 
ących cech letalnych jest sum ą przedimplantacyjnych 
i poimplantacyjnych strat. Obliczenie ca łkowitego skutku dominuj ­ 
ących cech letalnych jest oparte na porównaniu żywych implantów 
danej samicy w grupie badanej do żywych implantów danej samicy 
w grupie kontrolnej. Zmniejszanie si ę ilości implantów w pewnych 
odstępach czasu mo że być skutkiem u śmiercania komórek (tj. sper ­
matocytów i/lub spermatogoniów).
 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Jeżeli to mo żliwe, substancje testowe nale ży rozpuścić lub zawiesi ć 
w izotonicznym roztworze soli. Substancje chemiczne nierozpusz ­
czalne w wodzie mog ą być rozpuszczone lub zawieszone we w łaści­
wych nośnikach. U żyty nośnik nie powinien ani kolidowa ć z testową 
substancją chemiczn ą, ani powodowa ć jakichkolwiek objawów 
toksyczno ści. Nale ży zastosowa ć świeże preparaty testowej 
substancji chemicznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Warunki badania  
D r o g a p o d a w a n i a  
Testowy zwi ązek chemiczny ogólnie nale ży podać tylko raz. 
W oparciu o informacje bada ń toksykologicznych mo żna zastosowa ć 
powtórzony harmonogram bada ń. Zwyczajowymi drogami poda ­
wania substancji testowej jest intubacja drog ą pokarmow ą lub 
przez iniekcj ę dootrzewnow ą. Inne drogi podawania substancji 
również mogą być właściwe.  
Z w i e r z ę t a b a d a n e  
Gatunkami zalecanymi do wykorzystania w badaniu s ą szczury 
i myszy. Zdrowe, w pe łni dojrzałe zwierzęta są losowo przydzielane 
do grupy badanej i grup kontrolnych.  
L i c z b a i p ł e ć 
Należy wykorzysta ć odpowiedni ą liczbę samców, uwzgl ędniając 
samoczynne zmiany cech biologicznych. Wybrana ilo ść powinna 
być oparta na wcze śniej oznaczonej czu łości detekcji i sile znacze ­
nia. Na przyk ład w typowym badaniu liczba samców w ka żdej 
grupie dawkowania powinna by ć wystarczaj ąca, aby zapewni ć 
30–50 ciężarnych samic w danym okresie krycia.  
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Ogólnie, do ka żdego badania nale ży włączyć równoleg łe negatywne 
i pozytywne grupy kontrolne (dawkowanie z u życiem no śnika). 
W przypadku dost ępności wyników pozytywnej grupy kontrolnej 
z badań ostatnio przeprowadzanych w tym samym laboratorium 
niniejsze wyniki mo żna zastosowa ć zamiast równoleg łej pozytywnej 
grupy kontrolnej. Nale ży użyć pozytywnych substancji kontrolnych 
przy odpowiednio niskiej dawce (np. MMS, dootrzewnowo, przy 
10 mg/kilogram) w celu wykazania czu łości badania.  
P o z i o m y d a w e k  
Zwyczajowo nale ży zastosowa ć trzy poziomy dawek. Najwy ższa 
wielkość dawki powinna powodowa ć objawów i toksyczno ści lub 
obniżoną płodność u badanych zwierz ąt. W niektórych przypadkach 
jednorazowe dawkowanie mo że okazać się wystarczaj ące. 
T e s t g r a n i c z n y  
Substancje nietoksyczne nale ży testowa ć przy 5 g/kilogram przy 
jednorazowym podaniu dawki lub przy 1 g/kilogram/dzie ń przy 
powtarzalnym podawaniu dawki.  
Procedura  
Dostępne jest kilka harmonogramów badania. Najszerzej stosowane 
jest jednorazowe podawanie substancji testowej. Mo żna stosowa ć 
inne odpowiednie harmonogramy bada ń. 
Poszczególne samce wykorzystywane s ą do krycia jednej lub dwóch 
niebadanych, dziewiczych samic sekwencyjnie w odpowiednich 
odstępach czasu po poddaniu dzia łaniu substancji. Samice nale ży 
pozostawi ć w obecno ści samca co najmniej przez czas trwania 
jednego cyklu rujowego lub do czasu wyst ąpienia krycia ustalonego 
przez obecno ść spermy w pochwie lub obecno ść czopu nasienia 
w pochwie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
Liczba kry ć następujących po zako ńczeniu badania jest regulowana 
harmonogramem badania i nale ży zapewni ć, iż zostaną pobrane 
próbki wszystkich faz komórki zarodkowej po zako ńczeniu badania.  
Samice u śmiercane s ą w drugiej po łowie okresu ci ąży, a zawarto ść 
macicy poddawana jest badaniu w celu ustalenia liczby żywych oraz 
martwych implantów. Mo żna przeprowadzi ć badanie jajników 
w celu ustalenia liczby cia łek żółtych.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli, wskazuj ąc liczbę samców, 
liczbę ciężarnych samic, oraz liczb ę nieciężarnych samic. Wyniki 
krycia, w łączając identyfikacj ę każdego samca i samicy, nale ży 
odnotowa ć indywidualnie. W odniesieniu do ka żdej samicy nale ży 
odnotowa ć tydzień, w którym nast ąpiło krycie, wielko ść dawki 
otrzymanej przez samca oraz ilo ść martwych i żywych implantów.  
Obliczenie ca łkowitego skutku dominuj ących cech letalnych jest 
oparte na porównaniu żywych implantów przypadaj ących na samic ę 
w grupie badanej do żywych implantów przypadaj ących na samic ę 
w grupie kontrolnej. Stosunek martwych implantów do żywych 
implantów w grupie badanej w porównaniu do tego samego stosunku w grupie kontrolnej jest analizowany w celu wykazania strat poim ­
plantacyjnych.
 
Jeżeli dane odnotowane s ąjako zgony wczesne i pó źne, należy ten 
fakt jasno sprecyzowa ć w tabeli. Je żeli dokonywana jest ocena strat 
przedimplantacyjnych, taki fakt nale ży odnotowa ć. Straty przed ­
implantacyjne mo żna obliczy ć jako ró żnicę między liczb ą ciałek 
żółtych oraz liczb ą implantów lub jako obni żenie średniej liczby 
implantów na dan ą macicę w porównaniu z kryciami kontrolnymi.  
Dane szacowane s ą z wykorzystaniem odpowiednich metod staty ­
stycznych.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— gatunki, szczep, wiek i waga badanych zwierz ąt, liczba zwierz ąt 
każdej płci w grupie badanej i grupach kontrolnych,  
— substancja testowa, no śnik, badane poziomy dawek oraz racjo ­
nalna podstawa wyboru dawki, negatywne i pozytywne grupy 
kontrolne, dane dotycz ące toksyczno ści, 
— droga oraz harmonogram bada ń, 
— harmonogram krycia,  
— metody stosowane w celu ustalenia zaistnienia krycia,  
— czas u śmiercenia zwierz ąt, 
— kryteria, wed ług których oznaczane s ą dominujące cechy letalne,  
— związek wysoko ści dawkowania z reakcj ą, w odpowiednich 
przypadkach,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— analiza statystyczna,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SPERMATOGO ­
NIOW U SSAKÓW  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 483, badania aberracji chro ­
mosomowej spermatogoniów u ssaków (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Celem badania aberracji chromosomowej spermatogoniów u ssaków 
in vivo  jest zidentyfikowanie substancji, które powoduj ą strukturalne 
aberracje chromosomowe w spermatogoniach ssaków (1)(2)(3)(4)(5). Strukturalne aberracje mog ą występować w dwóch typach, chromo ­
somowym lub chromatydowym. W przypadku mutagenów chemicz ­
nych większość wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, 
ale mogą pojawiać się aberracje typu chromosomowego. Metoda ta 
jest przeznaczona do pomiaru aberracji liczbowych oraz nie jest rutynowo wykorzystywana do tego celu. Mutacje chromosomowe 
oraz powi ązane z nimi zdarzenia s ą przyczyn ą wielu ludzkich chorób 
genetycznych.
 
Badanie to dokonuje pomiaru zdarze ń chromosomowych 
w komórkach zarodków oraz z tego wzgl ędu podejrzewa si ę, iż 
przewiduje wprowadzenie dziedzicznych mutacji w komórkach zarodków.
 
Zazwyczaj w tym badaniu wykorzystywane s ą gryzonie. Niniejsze 
badanie cytogenetyczne  in vivo  wykrywa aberracje chromosomowe 
podczas mitotycznego podzia łu spermatogoniów. Inne komórki doce ­
lowe nie podlegaj ą tej metodzie.  
W celu wykrycia aberracji typu chromatydowego w spermatogoniach 
pierwszy podzia ł komórki mitotycznej nast ępujący po poddaniu dzia ­ 
łaniu substancji powinien zosta ć zbadany, zanim te zmiany patolo ­
giczne są zgubione w toku dalszych podzia łów komórkowych. 
Dalsze informacje ze spermatogoniów macierzystych mog ą być 
uzyskane w drodze mejotycznej analizy w odniesieniu do aberracji typu chromosomowego w metafazie diakinezy, je żeli komórki 
poddane dzia łaniu substancji staj ą się spermatocytami.
 
Niniejsze badanie  in vivo  przeznaczone jest do zbadania, czy muta ­
geny komórek somatycznych s ą również czynne w komórkach 
zarodników. Dodatkowo badanie spermatogoniów jest w łaściwe do 
celów oceny zagro żenia mutagenno ści, w zwi ązku z czym pozwala 
na uwzgl ędnienie czynników metabolizmu  in vivo,  farmakokine ­
tyków oraz procesów naprawy DNA.  
Pewna ilo ść generacji spermatogoniów jest obecna w badaniu 
z widmem czu łości na przetwarzanie chemiczne. Zatem wykryte 
aberracje przedstawiaj ą zagregowan ą reakcję poddanych dzia łaniu 
substancji populacji spermatogoniów z wi ększą ilością zróżnicowa­
nych spermatogoniów przewa żających. W zale żności od ich pozycji 
w jądrze różne generacje spermatogoniów mog ą być narażone na 
ogólny obieg, ze wzgl ędu na barier ę komórek Sertoli oraz barier ę 
krew-jądro. 
Jeżeli istniej ą dowody na to, że substancja lub odpowiedni metabolit 
oddziałujący nie dotrze do komórki docelowej, w łaściwe jest wyko ­
rzystanie tego badania.  
Zob. także Ogólne wprowadzenie do cz ęści B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINICJE  
Aberracja typu chromatydowego:  strukturalne uszkodzenie chro ­
mosomu, wyra żone jako p ękanie pojedynczych chromatydów lub 
pękanie oraz ponowne łączenie mi ędzy chromatydami.  
Aberracja typu chromosomowego:  strukturalne uszkodzenie chro ­
mosomu, wyra żone jako p ękanie pojedynczych chromatydów lub 
pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej 
lokalizacji.  
Szczelina:  achromatyczne uszkodzenie mniejsze ni ż szerokość chro­
matydu, powoduj ące minimalne wypaczeniu chromatydu.  
Aberracja liczbowa:  zmiana w liczbie chromosomów w odniesieniu 
do normalnej liczby charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek.
 
Poliploidalno ść: wielokrotno ść liczby chromosomów haploidalnych 
(n) inna ni ż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.).  
Aberracja strukturalna:  zmiana w strukturze chromosomu, wykry ­
walna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podzia łu komó­
rek, zaobserwowana jako usuni ęcia oraz fragmenty, zmiany 
(zachodzące – wewn ątrz oraz mi ędzy chromosomami).  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Zwierzęta są poddane dzia łaniu substancji badanej odpowiedni ą 
drogą poddania dzia łaniu substancji oraz s ą uśmiercane 
w odpowiednim czasie po poddaniu ich dzia łaniu substancji badanej. 
Przed uśmierceniem zwierz ęta są poddawane dzia łaniu substancji 
zatrzymuj ącej metafaz ę (np. kolchicyna lub Colcemid®). Preparaty 
chromosomowe s ą sporządzane z komórek zarodników oraz 
barwione, a komórki metafazy s ą analizowane pod k ątem aberracji 
chromosomowych.  
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Preparaty  
1.4.1.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Powszechnie wykorzystywane s ą samce chomika chi ńskiego oraz 
myszy. Jednak że mogą być wykorzystane w badaniu samce innych 
odpowiednich gatunków saków. Powszechnie wykorzystywane 
szczepy laboratoryjne m łodych, zdrowych, dojrza łych zwierz ąt 
powinny zosta ć wykorzystane. W trakcie przeprowadzania badania 
różnice w masie cia ła zwierząt powinny by ć minimalne oraz nie 
powinny przekracza ć ± 20 % średniej masy.  
1.4.1.2.  Warunki przetrzymywania i karmienia  
Ogólne warunki okre ślone w Ogólnym wprowadzeniu do cz ęści B są 
stosowane, chocia ż celem w odniesieniu do wilgotno ści powinien 
być poziom 50–60 %.  
1.4.1.3.  Preparaty zwierz ęce 
Zdrowe, m łode, dojrza łe samce s ą losowo przypisywane do grup 
kontrolnych oraz grup poddawanych dzia łaniu substancji badanej. 
Klatki powinny by ć urządzone w taki sposób, aby mo żliwe skutki 
negatywne wynikaj ące z umieszczenia w klatce by ły zminimalizo ­
wane. Zwierz ęta są identyfikowane w niepowtarzalny sposób. Zwie ­
rzęta są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez przy ­
najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Przygotowanie dawek  
Substancje badane sta łe powinny zosta ć rozpuszczone lub zawie ­
szone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczone, je żeli stosowne, przed dawkowaniem zwierz ętom. 
Substancje badane p łynne mog ą być dawkowane bezpo średnio lub 
mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zosta ć 
wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane 
dotyczące stabilno ści wskazuj ą iż dopuszczalne jest sk ładowanie 
substancji.  
1.4.2.  Warunki badawcze  
1.4.2.1  Rozpuszczalnik/no śnik 
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien wywo ływać skutków toksycz ­
nych przy wykorzystywanych dawkach oraz nie powinien mie ć 
możliwości reagowania chemicznego z substancj ą badaną. Jeśli 
wykorzystywane s ą inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/no śniki, 
ich włączenie do do świadczenia powinno by ć wsparte danymi wska ­
zującymi ich zgodno ść. Zaleca si ę, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej 
kolejności rozwa żone zosta ło wykorzystanie wodnych 
rozpuszczalników/no śników.  
1.4.2.2.  Kontrole  
Równoleg łe pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/no śnik) 
kontrole powinny zosta ć objęte każdym badaniem. Z wyj ątkiem 
poddawania dzia łaniu substancji badanej, zwierz ęta w grupie kontro ­
lnej powinny by ć przedmiotem identycznych dzia łań w porównaniu 
ze zwierz ętami w grupie poddanej dzia łaniu substancji.  
Kontrole pozytywne powinny wywo ływać strukturalne aberracje 
w spermatogoniach, je żeli są podawane na poziomie poddania dzia ­ 
łaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje si ę wykrywal ­
nego wzrostu powy żej tło. 
Dawki kontroli pozytywnych powinny zosta ć dobrane tak, aby 
wyniki by ły jasne, ale nie ujawnia ły bezpośrednio tożsamości zako­
dowanych szkie łek mikroskopowych badaj ącemu. Dopuszczalne jest, 
aby pozytywne kontrole podawane by ły inną drogą niż substancje 
badane oraz aby ich próbki pobierane by ły tylko jeden raz. Wyko ­
rzystanie substancji chemicznych kontroli pozytywnych powi ązanych 
z klasą chemiczn ą może być brane pod uwag ę, jeżeli są one 
dostępne. Przyk łady substancji pozytywnych kontroli obejmuj ą: 
Substancja Nr CAS Nr Einecs  
Cyklofosfamid 
Cyklophosfamid monohydrat 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Cykloheksyloamina 108-91-8 203-629-0 
Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 Krylamid monomeryczny 79-06-1 201-173-7 Trietylenomelamina 51-18-3 200-083-5
 
Negatywne kontrole, poddane dzia łaniu rozpuszczalnika lub no śnika 
oraz w innym przypadku poddane dzia łaniu w ten sam sposób co 
grupy poddane dzia łaniu substancji, powinny zosta ć objęte badaniem 
w odniesieniu do ka żdego pobierania próbek, chyba że dopuszczalna 
jest wewn ątrz zwierz ęca zdolno ść do życia oraz cz ęstotliwości 
komórek z aberracjami chromosomowymi s ą wykazane przez dane 
historyczne. Dodatkowo, powinny zosta ć również wykorzystane 
kontrole bez poddawania dzia łaniu substancji, chyba że istnieją 
historyczne lub opublikowane dane wykazuj ące, że przez wybrany 
rozpuszczalnik/no śnik nie s ą wywoływane żadne szkodliwe lub 
mutagenne skutki.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Liczba zwierz ąt 
Każda grupa poddana dzia łaniu substancji oraz grupa kontrolna musi 
obejmowa ć przynajmniej pi ęć nadających się do analizy samców.  
1.5.2.  Harmonogram poddania dzia łaniu substancji  
Substancje badane s ą zazwyczaj podawane raz lub dwa razy (np. 
jako pojedyncza dawka lub jako dwa zabiegi poddawania dzia łaniu 
substancji). Substancje badane mog ą być również podawane jako 
dawka podzielona, np. dwa zabiegi poddania dzia łaniu substancji 
tego samego dnia w odst ępie czasu nie wi ększym ni ż kilka godzin, 
w celu u łatwienia podawania du żych objętości substancji. Inne 
reżimy dawki powinny by ć naukowo uzasadnione.  
W grupie najwy ższej dawki wykorzystywane s ą dwa okresy pobie ­
rania próbek po poddaniu dzia łaniu substancji badanej. Ze wzgl ędu 
na to, że na kinetyk ę komórkow ą może mieć wpływ substancja 
badana, wykorzystywany jest jeden wczesny oraz jeden pó źny 
okres pobierania próbek w oko ło 24–48 godzin po poddaniu dzia ­ 
łania substancji badanej. W odniesieniu do dawek innych ni ż dawka 
najwyższa powinien zosta ć uwzględniony 24-godzinny okres pobie ­
rania próbek lub 1,5 d ługości trwania cyklu komórkowego, chyba że 
w odniesieniu do innych okresów pobierania próbek uwa ża się, iż są 
one odpowiednie dla wykrycia skutków (6).  
Dodatkowo mog ą zostać wykorzystane inne okresy pobierania 
próbek. Na przyk ład w przypadku substancji chemicznych, które 
mogą wywoływać aberracje opó źnione lub mog ą wywiera ć skutki 
niezależne od S, odpowiednie mog ą być wcześniejsze okresy pobie ­
rania próbek (1).  
Odpowiednio ść powtarzanych harmonogramów poddawania dzia ­ 
łaniu substancji musi zosta ć zidentyfikowana na zasadzie jednostko ­
wych przypadków. Po powtarzanym zabiegu – poddania dzia łaniu 
substancji – zwierz ę powinno nast ępnie zosta ć uśmiercone w 24 
godziny (1,5 d ługości cyklu komórkowego) po ostatnim zabiegu 
poddania dzia łaniu substancji. Dodatkowe okresy pobierania próbek 
mogą zostać wykorzystane w przypadku, gdy jest to stosowne.  
Przed uśmierceniem zwierz ętom wstrzykuje si ę wewnątrzotrzew ­
nowo odpowiedni ą dawkę substancji zatrzymuj ącej metafaz ę (np. 
Colcemid® lub kolchicyn ę). Następnie pobiera si ę próbkę ze 
zwierząt w odpowiednich odst ępach czasu. W odniesieniu do 
myszy ten odst ęp czasu wynosi 3–5 godzin, w odniesieniu do 
chomików chi ńskich ten odst ęp czasu wynosi w przybli żeniu 4–5 
godzin.  
1.5.3.  Poziomy dawek  
Jeżeli przeprowadzane jest badanie ustalaj ące dawkę, poniewa ż nie 
istnieją dostępne odpowiednie dane, powinno zosta ć ono przeprowa ­
dzone w tym samym laboratorium, wykorzystuj ąc ten sam re żim 
gatunku, szczepu oraz poddania dzia łaniu substancji, który ma zosta ć 
wykorzystany w badaniu g łównym (7). Je żeli istnieje toksyczno ść, 
wykorzystywane s ą trzy poziomy dawek w odniesieniu do pierw ­
szego okresu pobierania próbek. Te poziomy dawek powinny obej ­
mować zakres od maksymalnej do ma łej toksyczno ści lub do jej 
braku. W czasie pó źniejszego okresu pobierania próbek musz ą zostać 
wykorzystane jedynie najwy ższe dawki. Najwy ższa dawka okre ślana 
jest jako dawka wywo łująca oznaki toksyczno ści, tak że wyższe 
dawki oparte na tym samym re żimie dawkowania mog łyby wywo łać 
śmiertelno ść. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
Substancje o szczególnej aktywno ści biologicznej przy niskotoksycz ­
nych dawkach (takie jak hormony oraz mitogeny) mog ą stanowić 
wyjątki w odniesieniu do kryteriów ustalania dawek oraz powinny by ć 
oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Najwy ższa dawka 
może być również określona jako dawka wytwarzaj ąca niektóre wska ­
zania toksyczno ści w spermatogoniach (np. zmniejszenie wska źnika 
mitotycznego podzia łu spermatogoniów do pierwszej oraz drugiej fazy 
mejotycznej; redukcja ta nie powinna przekroczy ć 50 %).  
1.5.4.  Badanie ograniczone  
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek w odniesieniu do 
zwierząt o przynajmniej 2 000 mg/kg masy cia ła, wykorzystuj ące poje­
dyncze poddanie dzia łaniu substancji lub dwa zabiegi poddania dzia ­ 
łaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych skutków 
toksycznych oraz je żeli nie podejrzewa si ę genotoksyczno ści 
w oparciu o dane dotycz ące substancji powi ązanych strukturalnie, 
wówczas przeprowadzenie pe łnego badania mo że nie być konieczne. 
Spodziewane poddanie cz łowieka dzia łaniu substancji mo że wykaza ć 
potrzebę wykorzystania wi ększej dawki w badaniu ograniczonym.  
1.5.5.  Dawkowanie  
Badana substancja jest zazwyczaj podawana przez zg łębnik żołąd­
kowy lub odpowiedni ą rurkę intubacyjn ą, lub przez wstrzykni ęcie 
wewnątrzotrzewnowe. Mog ą być dopuszczalne inne drogi poddania 
działaniu substancji, w przypadku gdy mog ą być uzasadnione. 
Maksymalna obj ętość płynu, jaka mo że być podana przez zg łębnik 
lub wstrzykni ęcie jednorazowo zale ży od wielko ści badanego zwie ­
rzęcia. Objętość nie powinna przekracza ć 2 ml/100 kg masy cia ła. 
Wykorzystanie pojemno ści wyższych niż te musi by ć uzasadnione. 
Z wyjątkiem substancji podra żniających lub żrących, które b ędą 
w normalnych warunkach ujawnia ć pogorszone skutki z wi ększymi 
stężeniami, zmienno ść w badanej obj ętości powinna zosta ć zminima ­
lizowana przez dostosowanie st ężenia w celu zapewnienia sta łej 
objętości przy wszystkich poziomach dawek.  
1.5.6.  Przygotowanie chromosomów  
Bezpośrednio po u śmierceniu zawiesiny komórkowe uzyskiwane s ą 
z jednego lub obu bada ń, poddanego dzia łaniu roztworu hipotonicz ­
nego oraz stabilizowane. Nast ępnie komórki s ą rozprowadzane na 
szkiełkach mikroskopowych oraz barwione.  
1.5.7.  Analiza  
W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia powinno zosta ć poddane 
analizie przynajmniej 100 dobrze rozprowadzonych metafaz (np. minimum 500 metafaz na grup ę). Liczba ta mo że zostać zmniej­
szona, je żeli zaobserwowane s ą duże liczby aberracji. Wszystkie 
szkiełka mikroskopowe, w łącznie z tymi z pozytywnych 
i negatywnych kontroli, powinny by ć niezależnie kodowane przed 
przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Ze wzgl ędu na to, że 
skutkiem procedur stabilizacji cz ęsto jest zerwanie proporcji udzia łu 
metafaz ze strat ą chromosomów, komórki oceniane powinny 
zawierać liczbę centromerów równ ą 2n ± 2.
 
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Dane dotycz ące poszczególnych zwierz ąt powinny zosta ć przedsta ­
wione w formie tabelarycznej. Jednostk ą doświadczaln ą jest zwierz ę. 
W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia liczba komórek z aberracjami 
chromosomowymi oraz liczba aberracji przypadaj ących na komórk ę 
powinny zosta ć ocenione. Ró żne typy strukturalnej aberracji chro ­
mosomowej powinny by ć wymienione wraz z ich ilo ściami oraz 
częstotliwościami w odniesieniu do grupy poddanej dzia łaniu 
substancji oraz grupy kontrolnej. Szczeliny s ą oddzielnie odnotowy ­
wane oraz zg łaszane, ale ogólnie nie s ą włączane do cz ęstotliwości 
aberracji ogó łem. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Jeżeli obserwuje si ę zarówno mitoz ę, jak i mejoz ę, powinien zosta ć 
oznaczony wska źnik podzia łu mitotycznego spermatogoniów 
w odniesieniu do pierwszej i drugiej metafazy majotycznej, jako miara cytotoksyczno ści dla wszystkich poddanych dzia łaniu 
substancji oraz zwierz ąt poddanych kontroli negatywnej 
w całkowitej próbce 100 dziel ących się komórek na zwierz ę, 
w celu ustalenia mo żliwego skutku cytotoksycznego. Je żeli zaobser ­
wowana jest jedynie mitoza, wska źnik mitozy powinien zosta ć ozna­
czony w przynajmniej 1 000 komórek przypadaj ących na zwierz ę.
 
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany z dawk ą wzrost wzgl ędnej ilości komórek z aberracjami 
chromosomowymi lub wyra źny wzrost w ilo ści komórek 
z aberracjami w pojedynczej dawce przy jednym pobieraniu próbek. 
Biologiczne znaczenie wyników powinno zosta ć wzięte pod uwag ę 
w pierwszej kolejno ści. Metody statystyczne mog ą zostać wykorzys ­
tane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników 
(8). Jednak że znaczenie statystyczne nie powinno by ć jedynym czyn ­
nikiem okre ślającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wyniki 
niejednoznaczne powinny zosta ć wyjaśnione przez dalsze badanie, 
w szczególno ści wykorzystuj ąc modyfikacj ę warunków do świadczal­
nych.  
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w tym bada ­
niu. 
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ła w jasny sposób 
pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych b ędzie wyklucza ł dokonanie ostatecznej oceny dotycz ącej 
aktywności badanej substancji. Wyniki mog ą pozostać niejedno ­
znaczne lub sporne niezale żnie od liczby powtórzonych do świad­
czeń.
 
Wyniki pozytywne z badania aberracji chromosomowych spermato ­
goniów  in vivo  wskazują, że substancja badana wywo łuje aberracje 
chromosomowe w komórkach zarodków badanych gatunków. 
Wyniki negatywne wskazuj ą, że w warunkach badawczych 
substancja badana nie jest mutagenna w badanym gatunku.  
Prawdopodobie ństwo, że substancja badana lub jej metabolity docie ­
rają do tkanki docelowej, powinno zosta ć omówione.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystane gatunki/szczepy,  
— liczba oraz wiek zwierz ąt, 
— źródło, warunki przetrzymywania, od żywianie itd.,  
— indywidualna masa cia ła zwierzęcia na pocz ątku badania, w tym 
zakres masy cia ła, średnie oraz stan dardowe odst ępstwa 
w odniesieniu do ka żdej z grup.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Warunki badania:  
— dane dotycz ące studium okre ślającego zakres badania, je żeli 
zostało przeprowadzone,  
— racjonalne uzasadnienie wyboru poziomu dawek,  
— racjonalne uzasadnienie wyboru drogi podawania substancji,  
— szczegó ły dotyczące substancji badanej,  
— szczegó ły dotyczące podawania substancji badanej,  
— racjonalne uzasadnienie czasów u śmiercania,  
— zmiana st ężenia substancji badanej w od żywianiu/wodzie pitnej 
(ppm) na rzeczywist ą dawkę (mg/kg masy cia ła/dzień), jeżeli ma 
zastosowanie,  
— szczegó ły dotyczące jakości wody oraz żywności, 
— szczegó łowy opis poddania dzia łaniu substancji oraz harmono ­
gramów pobierania próbek,  
— metody pomiaru toksyczno ści, 
— tożsamość substancji zatrzymuj ącej metafaz ę, jej stężenie oraz 
czas trwania poddania dzia łaniu substancji,  
— metody przygotowania szkie łek mikroskopowych,  
— kryteria w odniesieniu do aberracji oceniaj ących,  
— liczba poddanych analizie komórek przypadaj ących na zwierz ę, 
— kryteria uznawania badania za pozytywne, negatywne lub niejed ­
noznaczne.  
Wyniki:  
— oznaki toksyczno ści, 
— indeks mitotyczny,  
— stosunek podzia łu mitotycznego spermatogoniów w odniesieniu 
do pierwszej i drugiej metafazy mejotycznej,  
— typ oraz liczba aberracji, podany oddzielnie dla ka żdego zwie ­
rzęcia, 
— całkowita liczba aberracji przypadaj ąca na grup ę, 
— liczba komórek z aberracjami przypadaj ąca na grup ę, 
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, w miarę możliwości, 
— analizy statystyczne, je żeli istniej ą, 
— dane dotycz ące równoleg łych kontroli negatywnych,  
— dane dotycz ące historycznych kontroli negatywnych 
i pozytywnych, rozpuszczalnik/no śnik), wraz z zakresami, śred­
nimi oraz standardowymi odchyleniami,  
— dane dotycz ące równoleg łych kontroli pozytywnych,  
— zmiany w poliploidalno ści, jeżeli je dostrze żono. 
Omówienie wyników.  
Wnioski.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. ODNIESIENIA  
(1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Sper ­
matogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell- Cycle Specifications, w:  Genetic Toxicology of Environ ­
mental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied 
Mutagenesis,  Ramel, C, Lambert, B. and Magnusson, J. 
(eds) Liss, New York, pp. 477–484.
 
(2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, w:  
Mutagenicity Testing: a Practical Approach,  (ed.) S. Venitt 
and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275–306.
 
(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air- 
drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian 
Testes,  Cytogenetics and Cell Genetics,  3, pp. 289–294.  
(1) (4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and 
Henderson, L. (1990),  In vivo  Cytogenetic Assays, in: D. J. 
Kirkland (ed.),  Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recom ­
mended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines 
for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised,  Cambridge 
University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115–141.
 
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes,  
Mutation Res.,  52, pp. 207–209.  
(6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman, J., Favor, J., Gene ­
roso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. 
(1994), International Workshop on Standardisation of Geno ­
toxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests,  Mutation Res.,  312, 
pp. 313–318.
 
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R., Botham, P. A., 
Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, 
G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in  In vivo  
Mutagenicity Assays,  Mutagenesis, 7,  pp. 313–319.
 
(8) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., 
Clarc, G., Ferguson, R., Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of  In vivo  Cyto­
genetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.),  Statistical Evalua ­
tion of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on 
Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III.  
Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port 
Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184–232.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  TEST PLAMKOWY U MYSZY  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść E. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść E. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Niniejszy test jest testem  in vivo  u myszy, u których rozwijaj ące się 
zarodki eksponowane s ą na dzia łanie substancji chemicznych. 
Komórkami docelowymi u rozwijaj ących się zarodków s ą melanob ­
lasty, a docelowe geny s ą genami, które kontroluj ą pigmentacj ę 
sierści. Rozwijaj ące się zarodki s ą heterozygotyczne dla wielu takich 
genów odpowiedzialnych za kolor sier ści. Mutacja wewn ątrz lub 
strata (przez ró żnorodne procesy) allelu dominuj ącego takiego genu 
w melanobla ście prowadzi do ekspresji fenotypu recesywnego 
w komórkach potomnych, ujawniaj ąc się w postaci plamki 
o zmienionym kolorze na futrze myszy. Liczona jest liczba potom ­
stwa z takimi plamkami, mutacjami, a ich cz ęstotliwość porówny ­
wana jest z potomstwem wywodz ącym się od zarodków poddanych 
jedynie dzia łaniu rozpuszczalnika. Test plamkowy u myszy wykrywa 
domniemane somatyczne mutacje w komórkach p łodów.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Jeżeli to mo żliwe, substancje testowe rozpuszczane s ą lub zawie ­
szane w izotonicznym roztworze soli. Substancje chemiczne nieroz ­
puszczalne w wodzie s ą rozpuszczane lub zawieszane we w łaści­
wych nośnikach. Zastosowany no śnik nie powinien ani kolidowa ć 
z testow ą substancj ą chemiczn ą, ani powodowa ć jakichkolwiek 
objawów toksyczno ści. Należy zastosowa ć świeże preparaty testowej 
substancji chemicznej.  
Z w i e r z ę t a b a d a n e  
Myszy szczepu T (nie-agouti, a/a; szynszyla, ró żowe oczy, c  ch p/c ch p; 
brązowe, b/b; ja śniejsze, o krótkich uszach, d se/d se; łaciate, s/s) s ą 
krzyżowane zarówno ze szczepem HT (jasne, nie-agouti, brachypo ­
dia, pa a bp/pa a bp; grafitowe k ędzierzawe ln fz/ln fz; per łowe 
pe/pe), jak i ze szczepem C57 BL (nie-agouti, a/a). Inne w łaściwie 
krzyżówki, takie jak mi ędzy NMR1 (nie-agouti, a/a; albinos, c/c) 
a DBA (nie-agouti, a/a; br ązowe, b/b; ja śniejsze d/d) mog ą być 
stosowane pod warunkiem, że ich potomstwo b ędzie typu nie-agouti.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
L i c z b a i p ł e ć 
Odpowiednia liczna ci ężarnych samic poddana jest badaniu w celu 
uzyskania w łaściwej liczby żywego potomstwa w odniesieniu do 
każdego poziomu u żytej dawki. W łaściwy rozmiar próbki jest regu ­
lowany liczb ą plamek zaobserwowanych u badanych myszy oraz 
skalą danych kontrolnych. Negatywny wynik akceptowany jest 
jedynie wtedy, gdy w wynikach uwzgl ędniono co najmniej 300 
osobników potomstwa pochodz ących od samic poddanych dzia łaniu 
substancji testowej o najwy ższej wielko ści dawki.  
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Powinny zosta ć udostępnione dane z równoleg łej grupy kontrolnej 
w odniesieniu do myszy poddanych jedynie dzia łaniu nośnika (nega ­
tywne grupy kontrolne). Dane bazowe grup kontrolnych, pochodz ące 
z tego samego laboratorium, mog ą zostać włączone w celu podnie ­
sienia czu łości testu, pod warunkiem i ż są one jednorodne. Nale ży 
udostępnić dane z pozytywnej grupy kontrolnej ostatnio uzyskane 
w tym samym laboratorium w zwi ązku z poddaniem dzia łaniu 
substancji chemicznej, o której wiadomo, i ż wywołuje objawy muta ­
geniczności, w przypadku braku wykrycia mutageniczno ści 
związanej z dzia łaniem testowej substancji chemicznej.  
D r o g a p o d a w a n i a s u b s t a n c j i  
Zwyczajowe drogi podawania substancji to intubacja drog ą pokar­
mową lub przez iniekcj ę dootrzewnow ą stosowane u ci ężarnych 
samic. W odpowiednich przypadkach stosuje si ę podawanie 
substancji przez drogi inhalacyjne lub inne drogi podawania 
substancji testowej.  
P o z i o m y d a w e k  
Stosuje si ę co najmniej dwa poziomy dawek, w łączając jeden skut ­
kujący objawami toksyczno ści lub obni żoną wielkością miotu. 
W przypadku nietoksycznych substancji chemicznych nale ży zasto­
sować ekspozycj ę na maksymalny stosowany poziom dawki.  
Procedura  
Poddanie dzia łaniu dawki jednorazowej zazwyczaj stosowane jest 
w 8, 9 lub 10 dniu ci ąży, licząc dzień 1 jako dzie ń, w którym po 
raz pierwszy zaobserwowano czop nasienia w pochwie. Dni te odpo ­
wiadają 7,25, 8,25 i 9,25 dniom po pocz ęciu. Po tym okresie mo żna 
zastosowa ć kolejne podanie dawki.  
A n a l i z a  
Potomstwo jest oznaczane oraz liczone pod wzgl ędem plamek 
między trzecim i czwartym tygodniem po urodzeniu. Wyró żnia się 
trzy klasy plamek:  
a) białe plamki do 5 mm linii środkowo-brzusznej, które przypusz ­
czalnie powodowane s ą uśmiercaniem komórek (WMVS);  
b) żółte, podobne do agouti, c ętka występujące na sutku, genitaliach, 
gardle, w okolicach pach i pachwin oraz w okolicach środka 
czoła, które przypuszczalnie s ą wynikiem braku ró żnicowania 
(MDS); oraz  
c) zabarwione oraz bia łe plamki losowo rozmieszczone na sier ści, 
które przypuszczalnie wywodz ą się z mutacji somatycznych (RS).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Wszystkie trzy klasy s ą odnotowane jako wyniki, ale jedynie ostat ­
nia, RS, posiada przydatno ść genetyczn ą. Problemy z rozró żnieniem 
między MDS a RS mo żna rozwiązać przez fluorescencyjn ą mikro­
skopię próbek sier ści. 
Należy odnotowa ć oczywiste ra żące nieprawid łowości morfologiczne 
występujące u potomstwa.  
2. DANE  
Dane przedstawiane s ą jako ogólna liczba liczonego potomstwa oraz 
liczba osobników, u których zaobserwowano jedn ą lub wi ęcej 
plamek mutacji somatycznej. Dane z grupy badanej oraz negatywnej są porównywane za pomoc ą odpowiednich metod. Dane przedsta ­
wiane są również na tle poszczególnych miotów.
 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— szczepy zastosowane w krzy żówkach,  
— liczba ci ężarnych samic w grupie badanej i grupach kontrolnych,  
— średnia wielko ść miotu w grupie badanej i grupach kontrolnych 
w chwili urodzenia oraz po zako ńczeniu ssania,  
— wielko ść dawki (dawek) testowej substancji chemicznej,  
— zastosowany rozpuszczalnik,  
— dzień ciąży, w którym podano substancj ę testową, 
— droga podawania substancji testowej,  
— ogólna liczba badanego potomstwa oraz liczba potomstwa 
z WMVS, MDS i RS w grupie badanej i grupach kontrolnych,  
— rażące nieprawid łowości morfologiczne,  
— związek między poziomem dawki a reakcj ą osobników z RS, 
jeżeli to mo żliwe,  
— analiza statystyczna,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  TRANSLOKACJA DZIEDZICZNO ŚCI U MYSZY  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Badanie translokacji dziedziczno ści u myszy wykrywa strukturalne 
i ilościowe zmiany chromosomowe w komórkach zarodkowych 
ssaków, zregenerowane w pierwszym pokoleniu potomstwa. Typy wykrytych zmian chromosomowych to obustronne translokacje oraz, jeżeli włącza się potomstwo p łci żeńskiej, utrata chromosomu 
X. Nośniki translokacji i samice o genotypie XO wykazuj ą zmniej­
szoną płodność, która jest u żywana do wyboru potomstwa F
 1 do 
celów analizy cytogenetycznej. Ca łkowita bezp łodność jest spowo ­
dowana przez pewne typy translokacji (chromosom X-autosom 
i typu c-t). Translokacje s ą obserwowane w komórkach mejotycz ­
nych w diakinezie metafazy I u osobników m ęskich, równie ż F 1 , 
samców lub m ęskiego potomstwa samic F  1 . Samice o genotypie 
XO są identyfikowane cytogenetycznie dzi ęki obecno ści tylko 39 
chromosomów w komórkach szpiku kostnego przechodz ących 
mitozę. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Substancje testowe rozpuszczane s ą w izotonicznym roztworze soli. 
Substancje chemiczne nierozpuszczalne w wodzie s ą rozpuszczane 
lub zawieszane we w łaściwych no śnikach. Nale ży zastosowa ć świeże 
roztwory testowego zwi ązku chemicznego. Zastosowany no śnik nie 
powinien kolidowa ć z testową substancj ą chemiczn ą ani powodowa ć 
jakichkolwiek objawów toksyczno ści. 
D r o g i p o d a w a n i a s u b s t a n c j i  
Zwyczajowe drogi podawania substancji to intubacja drog ą pokar­
mową lub iniekcja dootrzewnowa. Inne drogi podawania substancji 
testowej mog ą być również właściwe.  
Z w i e r z ę t a b a d a n e  
W celu u łatwienia hodowli i cytologicznej weryfikacji niniejsze 
badania przeprowadzane s ą na myszach. Nie jest wymagany szcze ­
gólny szczep myszy. Jednak że średni rozmiar miotu powinien by ć 
większy niż osiem osobników i powinien by ć stosunkowo sta ły. 
Należy wykorzysta ć zdrowe, dojrza łe płciowo zwierz ęta. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
L i c z b a z w i e r z ą t 
Wymagana liczba zwierz ąt zależy od częstotliwości samorzutnej 
translokacji oraz minimalnego stopnia wywo ływania objawów, 
w celu uzyskania wyniku pozytywnego.  
Badanie zazwyczaj przeprowadzane jest przez analiz ę potomstwa 
samców F  1 . Należy poddać badaniu co najmniej 500 samców potom ­
stwa F  1 w danej grupie dawkowania. W przypadku w łączenia samic 
potomstwa F  1 wymagane jest 300 samców i 300 samic.  
U ż y c i e n e g a t y w n y c h i p o z y t y w n y c h g r u p k o n t r o ­
l n y c h  
Powinny zosta ć udostępnione odpowiednie dane uzyskane 
z równoleg łych i bazowych grup kontrolnych. W przypadku dost ęp­
ności wyników pozytywnej grupy kontrolnej, uzyskanych w z bada ń 
ostatnio przeprowadzanych w tym samym laboratorium, wyniki te 
można zastosowa ć zamiast równoleg łej pozytywnej grupy kontrolnej.  
P o z i o m y d a w e k  
Badany jest jeden poziom dawki, zazwyczaj najwy ższy poziom 
dawki zwi ązany jest z produkcj ą minimalnych objawów toksycz ­
ności, ale nie ma wp ływu na zachowania zwi ązane z rozrodczo ścią 
lub przeżyciem osobników. W celu ustalenia zale żności między 
poziomem dawki a reakcj ą wymagane jest zastosowanie dwóch 
dodatkowych poziomów dawek. W przypadku nietoksycznych 
substancji chemicznych nale ży zastosowa ć ekspozycj ę na 
najmniejszy stosowany poziom dawki.  
Procedura  
P o d d a n i e d z i a ł a n i u s u b s t a n c j i t e s t o w e j o r a z 
k r y c i e  
Wymagane s ą dwa harmonogramy podawania substancji. Najszerzej 
stosowane jest jednorazowe podanie substancji testowej. Stosowa ć 
można równie ż podawanie substancji testowej siedem dni 
w tygodniu przez okres 35 dni. Liczba kry ć po zako ńczeniu poda ­
wania substancji regulowana jest harmonogramem bada ń w celu 
zapewnienia uzyskania próbek z wszystkich faz komórki zarodko ­
wej. Po zako ńczeniu okresu krycia samice nale ży umieścić 
w pojedynczych klatkach. W przypadku porodu samic nale ży odno­
tować datę, wielkość miotu oraz p łeć potomstwa. Ca łe potomstwo 
zawierające osobniki samców jest odzwyczajane od ssania, 
a potomstwo zawieraj ące samice jest odrzucane, chyba że jest 
włączone do badania.  
B a d a n i e t r a n s l o k a c j i h e t e r o z y g o t y c z n o ś c i 
Stosowana jest jedna z dwóch mo żliwych metod:  
— badanie p łodności potomstwa F  1 i późniejsza weryfikacja ewen ­
tualnych no śników translokacji przez przeprowadzenie analiz 
cytogenicznych,  
— analizy cytogenetyczne ca łego męskiego potomstwa F  1 bez 
wcześniejszej selekcji przez badanie p łodności. 
a) Badanie p łodności 
Zmniejszona p łodność osobnika F  1 może być stwierdzona na 
podstawie obserwacji rozmiarów potomstwa i/lub analizy zawar ­
tości macic samic.  
Należy określić kryteria dla ustalania normalnej i obni żonej płod­
ności wykorzystanego szczepu myszy.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Obserwacje wielko ści miotu: samce F  1 przeznaczone do badania 
umieszczane s ą w klatkach pojedynczo z samicami zarówno 
z tego samego badania, jak i z koloni. Klatki kontroluje si ę 
codziennie, zaczynaj ąc od 18 dnia po kryciu. Wielko ść miotu 
oraz płeć potomstwa F  2 odnotowane s ą po urodzeniu, 
a następnie mioty s ą odrzucane. W przypadku badania potom ­
stwa żeńskiego F  1 potomstwo F  2 małych miotów jest zachowy ­
wane w celu przeprowadzenia dalszych bada ń. Żeńskie nośniki 
translokacji s ą weryfikowane za pomoc ą analiz translokacji u ich 
męskiego potomstwa. Samice XO s ą rozpoznawane przez zmian ę 
wskaźnika płci u ich potomstwa wynosz ącego od 1:1 do 1:2 
osobników samczych do samic. W procedurze sekwencyjnej normalne zwierz ęta F
 1 są eliminowane z dalszych bada ń, jeżeli 
pierwszy miot F  2 osiągnął lub przekroczy ł wcześniej ustalon ą 
wartość; w przeciwnym razie obserwacjom poddawany jest 
drugi lub trzeci miot F  2 . 
Zwierzęta F  1 , których nie mo żna zaklasyfikowa ć jako normalne 
po zakończeniu obserwacji trzech miotów F  2 , zostają poddane 
dalszemu badaniu przez analiz ę zawarto ści macicznych albo 
bezpośrednio poddawane analizom cytogenetycznym.  
Analiza zawarto ści macicznej: Redukcja rozmiaru miotu 
z nośnikami translokacji spowodowana jest śmiercią zarodkow ą, 
tak że wysoka liczba martwych implantów jest przejawem obec ­
ności translokacji u badanych zwierz ąt. Samce F  1 , mające być 
poddane badaniu, wykorzystywane s ą do krycia dwóch lub 
trzech samic ka żdy. Pocz ęcie ustalane jest przez codzienn ą 
poranną kontrolę czopu nasienia w pochwie. Samice u śmiercane 
są 14–16 dni pó źniej a żywe lub martwe implanty w ich maci ­
cach są odnotowywane.  
b) Analiza cytogeniczna  
Preparaty z j ąder przygotowywane s ą techniką suszenia powiet ­
rzem. No śniki translokacji rozpoznawane s ą przez obecno ść 
wielowarto ściowych konfiguracji w diakinezie metafazy I w 
podstawowych spermatocytach. Obserwacja co najmniej dwóch komórek z wielowarto ściowymi zwi ązkami stanowi wymagane 
dowody na potwierdzenie faktu, i ż zwierzę posiada no śnik trans­
lokacji.
 
Wszystkie samce F  1 należy zbadać cytogenetycznie, je żeli nie 
została przeprowadzona żadna selekcja podczas rozmna żania. 
Należy mikroskopowo oznaczy ć minimum 25 komórek diakinezy 
metafazy I danego samca. Analiza metafaz mitotycznych 
w spermatogoniach b ądź szpiku kostnym jest wymagana 
u samców F  1 z małymi jądrami i defektem mejozy przed diaki ­
nezą lub z samic F  1 z podejrzeniem genotypu XO. Obecno ść 
niezwykle d ługiego i/lub krótkiego chromosomu w ka żdej z 10 
komórek jest dowodem na szczególn ą męską translokacj ę 
prowadzącą do niepłodności (typ c-t). Niektóre translokacje chro ­
mosom X-autosom, które powoduj ą męską niepłodność mogą 
być zidentyfikowane tylko na podstawie analizy pasmowej chro ­
mosomów mitotycznych. Obecno ść 39 chromosomów we 
wszystkich 10 mitozach jest dowodem na istnienie XO u samicy.  
2. DANE  
Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli.  
W każdym okresie krycia nale ży odnotowa ć średni rozmiar miotu 
oraz stosunek p łci w potomstwie pochodz ącym z rodzicielskiej pary 
przy urodzeniu i w okresie odzwyczajania od ssania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Dla oszacowania p łodności zwierz ąt F  1 przedstawiane s ą średnie 
wielkości potomstwa pochodz ącego z normalnego krycia oraz ilo ść 
żyjących i nie żywych implantów z ka żdego krycia osobników F  1 , 
gdzie odnotowano wyst ępowanie no śników translokacji. W celu 
dokonania analizy zawarto ści macicznej nale ży odnotowa ć średnią 
liczbę żywych i martwych implantów potomstwa pochodz ącego 
z normalnego krycia oraz poszczególne liczby żyjących 
i martwych implantów dla ka żdego potomstwa gdzie odnotowano 
występowanie no śników translokacji.  
Aby dokona ć analizy cytogenetycznej diakinezy metafazy I, ilo ść 
typów wielowarto ściowych konfiguracji oraz ca łkowita liczba parze ń 
i czasu trwania krycia s ą odnotowywane.  
W odniesieniu do bezp łodnych osobników F  1 należy odnotowa ć 
ogólną liczbę kryć oraz czas trwania okresu krycia. Nale ży podać 
wagę jąder oraz szczegó ły wyników analizy cytogenetycznej.  
W odniesieniu do samic XO odnotowana jest średnia wielko ść 
miotu, stosunek p łci potomstwa F  2 oraz wyniki analizy cytogene ­
tycznej.  
Jeżeli możliwe, potomstwo F  1 z nośnikami translokacji poddawane 
jest wcze śniejszej selekcji przez badania p łodności, tabele musz ą 
zawierać informacj ę, ile z nich zosta ło potwierdzonych jako trans ­
lokacje heterozygotyczne.  
Należy odnotowa ć dane z bada ń negatywnych i pozytywnych grup 
kontrolnych.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— szczep myszy, wiek zwierz ąt, waga badanych zwierz ąt, 
— liczba rodzicielskich zwierz ąt każdej płci w grupie badanej 
i grupach kontrolnych,  
— warunki badania, szczegó łowy opis badania, wielko ści dawkowa ­
nia, rozpuszczalniki, harmonogram krycia,  
— liczba i p łeć potomstwa danej samicy, liczba i p łeć potomstwa 
hodowanego do analizy translokacji,  
— czas i kryteria analizy translokacyjnej,  
— liczba oraz szczegó łowy opis no śników translokacji, w łączając 
dane dotycz ące rozmna żania i dane dotycz ące zawarto ści macicz ­
nej, w odpowiednich przypadkach,  
— procedury cytogenetyczne i szczegó ły analizy mikroskopowej, 
najlepiej wraz ze zdj ęciami,  
— statystyczna analiza,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  BADANIE TOKSYCZNO ŚCI PODPRZEWLEK ŁEJ DROG Ą 
POKARMOW Ą – STUDIUM TOKSYCZNO ŚCI NA GRYZO ­
NIACH METOD Ą POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI 
DROGĄ POKARMOW Ą 
1. METODA  
Niniejsza metoda badania toksyczno ści podprzewlek łej drogą pokar­
mową jest kopi ą OECD TG 408 (1998).  
1.1. WPROWADZENIE  
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczno ści substancji chemicznej 
oznaczenie podprzewlek łej toksyczno ści drogą pokarmow ą, stosując 
powtarzane dawki, jest prowadzone po pocz ątkowej informacji 
o toksyczno ści, uzyskanej z 28-dniowych bada ń toksyczno ści ostrej 
lub powtarzanej. 90-dniowe badanie dostarcza informacji 
o możliwym niebezpiecze ństwie dla zdrowia, które prawdopodobnie 
powstanie z powtarzanego nara żenia w ci ągu przedłużonego okresu 
czasu, obejmuj ącego moment odstawienia od piersi, poprzez rozwój 
do dojrza łości. Badanie dostarczy informacji na temat g łównych 
toksycznych dzia łań, wskaże zaatakowane organy i mo żliwości 
akumulacji, dostarczy oceny poziomu ekspozycji na badania niepo ­
wodującego negatywnych skutków, któr ą stosuje si ę przy wyborze 
poziomów dawki dla bada ń przewlek łych i ustalania kryteriów 
bezpiecze ństwa dla nara żenia ludzi.  
Metoda k ładzie dodatkowy nacisk na aspekt neurologiczny 
i wskazuje oddzia ływania na uk ład immunologiczny i rozrodczy. 
Potrzeba starannej klinicznej obserwacji zwierz ąt, aby uzyska ć tak 
wiele informacji, jak to mo żliwe, jest równie ż stresująca. Niniejsze 
badanie powinno umo żliwić określenie substancji chemicznych, 
które mog ą potencjalnie powodowa ć działania neurotoksyczne, 
immunologiczne lub wp ływać na organy rozrodcze oraz uzasad ­
niające dalsze dog łębne ich zbadanie.  
Zob. także Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Dawka:  jest ilością podawanej substancji badanej. Dawka jest wyra ­ 
żana wagowo (g, mg) lub jako waga substancji badanej na jednostk ę 
wagi badanego zwierz ęcia (np. mg/kg), lub jako st ężenie stałe żywie­
niowe (ppm).  
Dawkowanie:  jest ogólnym poj ęciem obejmuj ącym dawk ę, jej częs­
totliwość i czas podawania dawki.  
NOAEL:  jest skrótem od poziomu, przy którym nie obserwuje si ę 
niekorzystnych skutków, oraz jest najwy ższym poziomem dawki, 
gdzie nie obserwuje si ę niekorzystnych efektów zale żnych od poda ­
wanej substancji.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Badana substancja jest codziennie podawana doustnie 
w stopniowanych dawkach kilku grupom zwierz ąt doświadczalnych, 
jeden poziom dawki na grup ę przez okres 90 dni. W czasie okresu 
podawania zwierz ęta są ściśle obserwowane w zakresie oznak zatru ­
cia. Zwierz ęta, które zmar ły lub zosta ły zabite w czasie trwania 
badania, s ą poddawane sekcji zw łok, po zako ńczeniu badania zwie ­
rzęta, które prze żyły, są również zabijane i poddawane sekcji zw łok. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. OPIS METODY BADANIA  
1.4.1.  Przygotowanie zwierz ąt 
Muszą zostać użyte zdrowe zwierz ęta, zaaklimatyzowane 
w warunkach laboratoryjnych przez przynajmniej pi ęć dni 
i niebędące przedmiotem wcze śniejszych procedur eksperymental ­
nych. Zwierz ęta badane musz ą charakteryzowa ć się gatunkiem, 
szczepem, źródłem, płcią, wagą i/lub wiekiem. Zwierz ęta muszą 
być losowo wyznaczane do do świadczeń kontrolnych i grup trakto ­
wanych. Klatki musz ą być rozmieszczone w taki sposób, aby 
możliwy wpływ wynikaj ący z ich przemieszczenia by ł minimalny. 
Każde zwierz ę musi by ć oznakowane niepowtarzalnym numerem 
identyfikacyjnym.  
1.4.2.  Przygotowanie dawek  
Substancja badana jest podawana przez zg łębnik lub w postaci 
pokarmu lub wody pitnej. Metoda podawania drog ą pokarmow ą 
jest zale żna od celu badania oraz w łaściwości fizycznych/ ­
chemicznych badanego materia łu. 
Tam gdzie jest to konieczne, badan ą substancje rozpuszcza si ę lub 
wykonuje zawiesin ę w odpowiednim no śniku. Zalecane jest, aby tam 
gdzie to jest mo żliwe, rozwa żyć wpierw u życie roztworu lub zawie ­
siny wodnej, a nast ępnie rozwa żyć wykonanie roztworu/zawiesiny 
w oleju (np. w oleju kukurydzianym) i dopiero nast ępnie w innych 
nośnikach. Dla no śników różnych od wody musz ą być znane cechy 
toksyczno ści. Powinna by ć określona stabilno ść badanej substancji 
w warunkach podawania dawek.  
1.4.3.  Warunki badania  
1.4.3.1.  Zwierz ęta eksperymentalne  
Zalecanym gatunkiem jest szczur, ale tak że inne gatunki gryzoni, np. 
mysz. Powinny by ć wykorzystane zwyk łe stosowane laboratoryjne 
szczepy zdrowych doros łych zwierz ąt. Samice musz ą być zero­
roczne, nieci ężarne. Dozowanie musi rozpocz ąć się tak szybko, jak 
to możliwe po od łączeniu od matki, a w ka żdym przypadku przed 
osiągnięciem wieku dziewi ęciu tygodni. Przy rozpocz ęciu badań, 
zmiany wagi wykorzystanych zwierz ąt muszą być minimalne i nie 
przekracza ć ± 20 % średniej wagi w ka żdej płci. W przypadku gdy 
badania s ą prowadzone jako wst ępne do bada ń toksyczno ści prze­
wlekłej długoterminowej, do obu bada ń należy wykorzysta ć zwie­
rzęta tego samego szczepu i źródła. 
1.4.3.2.  Ilość i płeć 
Co najmniej 20 zwierz ąt (10 samic i 10 samców) nale ży wyko­
rzystać w odniesieniu do ka żdego poziomu dawki. Je śli planuje si ę 
zabijanie po średnie, liczba musi by ć zwiększona o przewidzian ą 
ilość zwierząt do zabicia przed zako ńczeniem bada ń. W oparciu 
o wcześniejszą wiedzę o substancjach chemicznych i bliskich odpo ­
wiednikach nale ży rozważyć włączenie dodatkowej satelickiej grupy 
10 zwierz ąt (po 5 ka żdej płci) do grupy kontrolnej i grupy najwy żej 
dawkowanej, do celów obserwacji, po okresie traktowania, odwra ­
calności lub trwa łości jakichkolwiek skutków toksycznych. Czas 
trwania tego okresu po zako ńczeniu traktowania powinien by ć usta­
lony odpowiednio w odniesieniu do obserwowanych skutków.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Poziomy dawek  
Stosuje si ę co najmniej trzy poziomy dawek i równoczesne do świad­
czenie kontrolne, poza przypadkiem, gdy prowadzone jest badanie graniczne (zob. 1.4.3.4). Poziomy dawek mog ą być oparte na wyni ­
kach powtarzanej dawki lub badaniach ustalania zakres oraz 
powinny uwzgl ędniać wszelkie istniej ące dane toksykologiczne 
i toksykokinetyczne, dost ępne w odniesieniu do badanej substancji 
lub związanych z ni ą materiałów. Poza ograniczeniami natury fizy ­
kochemicznej i dzia łaniami biologicznymi substancji badanej, 
poziom najwy ższej dawki musi by ć wybrany w celu wzbudzenia 
objawów toksycznych, ale nie spowodowania śmierci czy te ż poważ­
nych cierpie ń. Opadaj ąca sekwencja poziomu dawki musi by ć 
wybrana w celu pokazania reakcji zwi ązanej z dawkowaniem 
i poziomem, przy którym nie obserwuje si ę negatywnych skutków 
(NOAEL) przy najni ższym poziomie dawki. Dwa do czterech 
zachodzące przedzia ły są często optymalne do ustalenia opadaj ących 
poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest cz ęsto pole­
cane dla zastosowania bardzo du żych odst ępów (np. wi ęcej niż 
współczynnik 6–10) mi ędzy dawkowaniami.
 
Grupa kontrolna musi by ć grupą nietraktowan ą lub grup ą kontroln ą 
nośnika, jeśli nośnik jest u żywany do podawania substancji badanej. 
Zwierzęta w grupie kontrolnej, poza nietraktowaniem jej substancj ą 
badaną, są obsługiwane w identyczny sposób jak w zwierz ęta 
w grupach badanych. Je śli stosowany jest no śnik, grupa kontrolna 
musi otrzymywa ć nośnik w maksymalnie stosowanej obj ętości. Gdy 
substancja badana jest podawana w diecie i powoduje zmniejszenie zapotrzebowania żywieniowego, wtedy grupa kontrolna z pary 
żywieniowej mo że być pomocna w rozró żnieniu mi ędzy zmniejsze ­
niem spowodowanym smaczno ścią lub zmianami toksykologicznymi 
w modelu badania.
 
Następujące cechy no śnika i innych dodatków musz ą być rozważone 
jako właściwe: wp ływ wchłaniania, rozk ładu, metabolizmu, retencji 
badanej substancji, wp ływ właściwości chemicznych substancji bada ­
nej, mogące zmieni ć jej cechy toksyczno ści oraz wp ływy zapotrze ­
bowania na żywność i wodę lub żywieniowy status zwierz ąt. 
1.4.3.4.  Badanie graniczne  
Jeśli badanie przy jednym poziomie dawki, równowa żnym co 
najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła/dzień, stosując procedur ę opisaną 
w odniesieniu do niniejszego badania, powoduje, że nie obserwuje 
się negatywnych skutków oraz je śli nie oczekuje si ę toksyczno ści na 
podstawie danych substancji strukturalnie zwi ązanych, wtedy pe łne 
badania z zastosowaniem trzech poziomów nie wydaj ą się konieczne. 
Badanie graniczne ma zastosowanie, z wyj ątkiem sytuacji, gdy nara ­ 
żenie ludzi wskazuje potrzeb ę zastosowania wy ższego poziomu 
dawki.  
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Podawanie dawek  
Zwierzętom dozuje si ę substancj ę badaną przez siedem dni ka żdego 
tygodnia w okresie 90 dni. Ka żdy inny sposób dozowania, na przy ­
kład pięć dni w tygodniu, wymaga uzasadnienia. Gdy substancja 
badana jest podawana przez zg łębnik, musi by ć to wykonane 
w pojedynczej dawce, przy u życiu sondy prze łykowej lub odpowied ­
niej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna obj ętość cieczy, która mo że 
być podana w jednym momencie, zale ży od rozmiarów zwierz ęcia 
badanego. Obj ętość nie może przekracza ć 1 ml/100 g masy cia ła, 
poza przypadkiem wodnych roztworów, gdzie mo żna zastosowa ć 
2 ml/100 g masy cia ła. Z wyj ątkiem substancji dra żniących 
i żrących, które zwykle ujawniaj ą silniejsze dzia łanie przy wy ższym 
stężeniu, zmienno ści w objętości badanej musz ą być zminimalizo ­
wane przez ustawienie st ężenia tak, aby zapewni ć stałą objętość we 
wszystkich poziomach dozowania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
W odniesieniu do substancji podawanych w pokarmie lub wodzie 
pitnej istotne jest zapewnienie, aby ilo ści danej substancji badanej 
nie kolidowa ły z normalnym od żywianiem lub równowag ą wodną. 
Gdy substancja badana jest podawana w pokarmie – w sta łym 
stężeniu w pokarmie (ppm) albo w sta łym poziomie dawki – mo że 
być zastosowana w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia; wykorzys ­
tana alternatywa musi by ć określona. W odniesieniu do substancji 
podawanej przez zg łębnik dawka musi by ć podana w podobnej porze 
każdego dnia i regulowana tak, by utrzyma ć stały poziom dawki 
w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia. W przypadku gdy badanie 
90-dniowe jest stosowane jako wst ępne do bada ń długoterminowych 
toksyczno ści przewlek łej, w obu badaniach powinien by ć użyty 
podobny pokarm.  
1.5.2.  Obserwacje  
Okres obserwacji powinien wynosi ć przynajmniej 90 dni. Zwierz ęta 
w grupie satelickiej, zaplanowanej do dalszej obserwacji, musz ą być 
trzymane przez stosowny okres bez traktowania w celu wykrycia 
wytrzyma łości na lub powrotu do normy od dzia łań toksycznych.  
Ogólne kliniczne obserwacje powinny by ć dokonywane przynaj ­
mniej raz na dzie ń, najlepiej o tej (tych) samej(-ych) porze (porach) 
każdego dnia, uwzgl ędniając szczytowy okres przewidywanego dzia ­ 
łania po dozowaniu. Stan kliniczny zwierz ąt powinien by ć rejestro­
wany. Co najmniej dwa razy dziennie, zwykle na pocz ątku i pod 
koniec ka żdego dnia, wszystkie zwierz ęta są kontrolowane 
w zakresie oznak zachorowa ń i śmiertelno ści. 
Przynajmniej raz przed pierwsz ą ekspozycj ą (uwzgl ędnić 
w granicach porównania) i raz tygodniowo pó źniej należy dokona ć 
szczegółowej obserwacji klinicznej na wszystkich zwierz ętach. 
Obserwacje te powinny by ć dokonywane poza klatk ą domową, 
najlepiej w warunkach standardowych za ka żdym razem 
w podobnych porach. Powinny one by ć starannie zapisane, najlepiej 
przez zastosowanie systemów punktacji, wyra źnie określonych przez 
laboratorium badawcze. Nale ży dołożyć starań w celu zapewnienia, 
aby zmiany w warunkach obserwacji by ły minimalne. Oznaki 
zauważone powinny obejmowa ć zmiany na skórze, futrze, oczach, 
błonach śluzowych, wyst ępowania wydzielin i czynno ści autono ­
miczne (np. łzawienie, piloerekcja, rozmiar źrenic, zmieniony rytm 
oddychania), lecz nie powinny by ć ograniczone tylko do nich. 
Zmiany w chodzie, postawie i reakcja na obchodzenie si ę, jak 
również obecność zachowa ń klonicznych i tonicznych, stereotypów 
(np. nadmierne zajmuj ą się sobą, kołowacizna) lub dziwaczne zacho ­
wanie (np. samookaleczanie, chodzenie wstecz) tak że muszą być 
zarejestrowane (1).  
Badanie oftalmologiczne przy u życiu oftalmoskopu lub równowa ż­
nego odpowiedniego przyrz ądu musi by ć wykonane przed podawa ­
niem dawek badanej substancji i przy uko ńczeniu bada ń, najlepiej na 
wszystkich zwierz ętach, ale przynajmniej w grupach wysokiej dawki 
i kontrolnej. Je śli wykryto zmiany w oczach, nale ży przebada ć 
wszystkie zwierz ęta. 
Odnośnie do ko ńca okresu ekspozycji, a w żadnym przypadku nie 
wcześniej niż w 11 tygodniu, nale ży przeprowadzi ć badania reak ­
tywności sensorycznej na bod źce różnych typów (1) (np. na bod źce 
słuchowe, optyczne i proprioreceptoryczne) (2)(3)(4), ocen ę siły 
chwytu (5) i ocen ę aktywno ści motorycznej (6). Dalsze szczegó ły 
procedur do przeprowadzenia s ą podane w odpowiednich odniesie ­
niach. Jednak że można także zastosowa ć procedury alternatywne do 
tych, do których dokonano odniesie ń. 
Obserwacje funkcjonalne prowadzone odno śnie do ko ńca badań 
mogą być pominięte, jeśli dane dotycz ące obserwacji funkcjonalnych 
są dostępne z innych bada ń i codzienne kliniczne obserwacje nie 
ujawniają żadnych deficytów funkcjonalnych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Wyjątkowo, obserwacje funkcjonalne mog ą być także pomini ęte 
w odniesieniu do grup, które w inny sposób przejawiaj ą oznaki 
zatrucia do tego stopnia, że mogłyby znacznie zak łócić wykonanie 
badania funkcjonalnego.  
1.5.2.1.  Waga cia ła i spożycie pokarmu/wody  
Wszystkie zwierz ęta powinny by ć ważone przynajmniej raz na 
tydzień. Pomiary spo życia pokarmu powinny by ć dokonywane przy ­
najmniej co tydzie ń. Jeśli substancja badana jest podawana w wodzie 
pitnej, spo życie wody musi by ć także mierzone przynajmniej coty ­
godniowo. Spo życie wody mo że być także rozważone w odniesieniu 
do badań pokarmowych lub zg łębnika, w czasie których pragnienie 
może się zmienić. 
1.5.2.2.  Biochemia kliniczna i hematologia  
Próbki krwi powinny by ć pobrane z nazwanego siedliska 
i przechowywane, je śli ma to zastosowanie, we w łaściwych warun ­
kach. Na ko ńcu okresu badania próbki s ą zbierane tu ż przed proce ­
durą zabijania zwierz ąt lub jako jej cz ęść. 
Następujące badania hematologiczne powinny by ć wykonane pod 
koniec okresu badania, a tak że gdy wszystkie po średnie próbki 
krwi musz ą zostać zebrane: hematokryt, st ężenie hemoglobiny, 
liczba erytrocytów, ca łkowita i ró żnicowa liczba leukocytów, liczba 
płytek krwi i pomiar czasu/potencja ł krzepnięcia krwi.  
Oznaczenia biochemii klinicznej do bada ń głównych skutków 
toksycznych w tkankach, w szczególno ści działań na nerki 
i wątrobę, powinny by ć wykonane na próbkach krwi, uzyskanych 
od każdego zwierz ęcia tuż przed lub jako cz ęść procedury zabijania 
zwierząt (oddzielnie od tych, które okaza ły się konające i/lub zabite 
w międzyczasie). W sposób podobny do bada ń hematologicznych 
może być wykonane pobieranie próbek w trakcie bada ń dla przepro ­
wadzenia klinicznych bada ń biochemicznych. Zaleca si ę przetrzy ­
manie zwierz ąt przez noc, przed pobraniem próbek krwi (  1 ). Ozna­
czenia w plazmie lub surowicy musz ą zawierać sód, potas, glukoz ę, 
całkowity cholesterol, mocznik, azot mocznikowy we krwi, kreaty ­
ninę, całkowite proteiny i albuminy i wi ęcej niż dwa enzymy charak ­
terystyczne efektów w ątrobokomórkowych (takich jak alanina, 
aminotransferaza, asparaginian aminotransferazy, fosfataza alka ­
liczna, gamma glutamylotranspeptydaza i dehydrogenaza sorbitolo ­
wa). Można także włączyć pomiary dodatkowych enzymów (w ątro­
bowego lub innego pochodzenia) i kwasów żółciowych, które pod 
pewnymi warunkami mog ą dostarczy ć użytecznych informacji.  
Fakultatywnie mo żna przeprowadzi ć następujące oznaczenia anali ­
tyczne w moczu, w ci ągu ostatniego tygodnia bada ń, stosując 
zebraną czasowo obj ętość moczu: przejrzysto ść, objętość, osmolality 
lub ciężar właściwy, pH, bia łka, glukoza i komórki krwi.  
Dodatkowo nale ży rozważyć zastosowanie do bada ń surowicy znacz ­
ników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które powinny 
być dokonane, je śli znane w łaściwości substancji badanej mog ą lub 
są podejrzane o wp ływ na przebieg metabolizmu, to wap ń, fosfor, 
trwałe trójglicerydy, specyficzne hormony, metahemoglobina 
i cholinoesteraza. Mog ą być one potrzebne do okre ślenia niektórych 
związków chemicznych w niektórych klasach lub na zasadzie jedno ­
stkowych przypadków.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) W odniesieniu do niektórych oznacze ń w surowicy i plazmie, najbardziej znacz ąco dla 
glukozy, zaleca si ę niekarmienie przez noc. G łówną przyczyn ą tego zalecenia jest wzrost 
zmienności, który nieuchronnie powstaje przy nieprzestrzeganiu tego zalecenia 
i powoduje tendencj ę maskowania bardziej subtelnych efektów, co czyni interpretacje 
wyników trudn ą. Z drugiej jednak strony, niekarmienie przez noc mo że zakłócać ogólny 
metabolizm zwierz ąt, w szczególno ści w badaniach żywieniowych, mo że przeszkadza ć 
w dziennej ekspozycji na dzia łanie substancji badanej. Je śli przyjęto metodę niekarmienia 
przez noc, kliniczne oznaczenia biochemiczne musz ą być wykonane po wprowadzeniu 
do badań uwag funkcjonalnych.
 Ogólnie, potrzebne jest elastyczne podej ście, w zale żności od 
gatunku oraz obserwowanych i/lub spodziewanych skutków 
pochodzących od danej substancji.  
Jeśli historyczne dane bazowe s ą nieodpowiednie nale ży rozważyć 
czy hematologiczne i kliniczne biochemiczne zmiany powinny by ć 
określone przed rozpocz ęciem dawkowania; zasadniczo nie jest zale ­
cane, aby te dane by ły gromadzone przed traktowaniem (7).  
1.5.2.3.  Całościowa sekcja zw łok 
Wszystkie zwierz ęta w badaniu podlegaj ą pełnej, szczegó łowej 
całościowej sekcji zw łok, która obejmuje staranne badanie 
zewnętrznej powierzchni organu, wszystkie otwory i czaszkowe, 
piersiowe i brzuszne jamy i ich zawarto ści. Wątroba, nerka, nadner ­
cza, jądra, najądrza, macica, jajniki, grasica, śledziona, mózg i serce 
wszystkich zwierz ąt (oddzielnie od tych, które okaza ły się konające 
i/lub zabite w mi ędzyczasie) powinny by ć okrojone z wszelkich 
przylegających tkanek, odpowiednio, i nale ży tak szybko jak to 
możliwe pomierzy ć ich mokr ą wagę po sekcji w celu zapobie żenia 
wyschnięciu. 
Następujące tkanki powinny by ć zakonserwowane w najw łaściwym 
środku utrwalaj ącym dla obu typów tkanek i zamierzonych kolej ­
nych bada ń histopatologicznych: wszystkie ca łkowite uszkodzenia, 
mózg (reprezentatywne obszary, w łączając płaszcz mózgu, mó żdżek 
i szpik/mostek), rdze ń kręgowy (na trzech poziomach: karkowym, 
środkowo-piersiowym i l ędźwiowym), przysadka, tarczyca, przytar ­
czyczka, grasica, prze łyk, gruczo ły ślinowe, żołądek, małe i duże 
jelita (włączając plamy Peyera), w ątroba, trzustka, nerki, nadnercza, 
śledziona, serce, tchawica i p łuca (zabezpieczone przez inflacj ę 
utrwaloną a następnie zanurzon ą), aorta, gonady, macica, dodatkowe 
organy p łciowe, żeńskie gruczo ły sutkowe, prostata, p ęcherz 
moczowy, p ęcherzyk żółciowy (mysz), w ęzły limfatyczne (najlepiej 
jeden węzeł pokrywaj ący drogę podawania i drugi odleg ły od drogi 
podawania aby obj ąć działania na uk ład), nerw peryferyjny (kul ­
szowy lub piszczelowy) zalecany w du żej blisko ści od mi ęśnia, 
fragment ko ści szpikowej (i/lub świeża kość z zassanym szpikiem), 
skóra i oczy (je śli zaobserwowano zmiany podczas bada ń oftalmo­
logicznych). Kliniczne i inne wyniki bada ń mogą zasugerowa ć 
konieczno ść zbadania dodatkowych tkanek. Tak że jakiekolwiek 
organy uznane za mog ące być celem w oparciu o znane w łaściwości 
badanej substancji powinny by ć zakonserwowane.  
1.5.2.4.  Histopatologia  
Pełna histopatologia powinna by ć przeprowadzona na zakonserwo ­
wanych cia łach i tkankach wszystkich zwierz ąt z grupy kontrolnej 
i wysokodawkowanej. Badania te powinny by ć rozciągnięte na 
wszystkie inne dawkowane grupy, je śli w wysokodawkowanej 
grupie obserwuje si ę zmiany zwi ązane z dzia łaniem środka.  
Należy przebada ć wszystkie zmiany patologiczne.  
Jeśli używa się grupy satelickiej, histopatologia powinna by ć prze­
prowadzona na tkankach i cia łach okre ślonych jako wykazuj ące 
działanie, w grupach traktowanych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. DANE  
Należy przedstawi ć dane osobnika. Dodatkowo wszystkie dane 
powinny by ć zestawione w postaci tabelarycznej, przedstawiaj ąc 
w odniesieniu do ka żdej badanej grupy liczb ę zwierząt na pocz ątku 
badania, liczb ę zwierząt, które ponios ły śmierć podczas trwania 
badania lub które zabito z przyczyn humanitarnych wraz z czasem, w którym nast ąpiła śmierć lub humanitarne zabicie, liczb ę wyka­
zującą oznaki zatrucia, opis obserwowanych oznak zatrucia, 
włączając czas zaistnienia, czas trwania, stopie ń ciężkości każdego 
działania toksycznego, liczb ę zwierząt wykazuj ącą zmiany patolo ­
giczne, typ zmian patologicznych i procent zwierz ąt obrazuj ący 
każdy typ zmiany patologicznej.
 
Gdy ma to zastosowanie, wyniki liczbowe powinny by ć szacowane 
właściwymi i ogólnie przyj ętymi metodami statystycznymi. Metody 
statystyczne i dane poddawane analizie powinny by ć wybrane 
w czasie przygotowania projektu bada ń. 
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie dotycz ące badań musi zawiera ć następujące informa ­
cje: 
2.2.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— charakter fizyczny, czysto ść i właściwości fizyko-chemiczne,  
— dane identyfikacyjne,  
— nośnik (jeśli jest to stosowne): uzasadnienie wyboru no śnika, 
jeśli jest różny od wody.  
2.2.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— użyte gatunki i szczep,  
— ilość, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki zamieszkiwania, pokarm itp.,  
— waga osobnicza zwierz ąt przy rozpocz ęciu badania.  
2.2.3.  Warunki badania:  
— racjonalne uzasadnienie wybranego poziomu dawkowania,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące składu badanej substancji/ ­
przygotowanie pokarmu, uzyskane st ężenie, stabilno ść 
i jednorodno ść przygotowania,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące podawania substancji badanej,  
— dawka rzeczywista (mg/kg waga cia ła/dzień), wskaźnik konwersji 
pokarm/woda pitna st ężenia badanej substancji (ppm) do dawki 
rzeczywistej, je śli ma to zastosowanie,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące jakości żywności i wody.  
2.2.4.  Wyniki:  
— waga cia ła oraz zmiany wagi cia ła, 
— spożycie żywności i wody, je śli ma to zastosowanie,  
— dane reakcji na zatrucie wed ług płci i poziomu dawki, w łączając 
oznaki zatrucia,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— charakter, surowo ść i czas trwania obserwacji klinicznych (stan 
odwracalny czy nie),  
— wyniki badania oftalmologicznego,  
— ocena czynno ści sensorycznych, si ły zacisku i czynno ści moto­
rycznych (gdy jest to dost ępne),  
— badania hematologiczne z odpowiednimi warto ściami poziomów 
tolerancji,  
— biochemiczne badania kliniczne z odpowiednimi warto ściami 
poziomów tolerancji,  
— końcowa waga cia ła, waga organów i proporcje wagi organ/cia ło, 
— ustalenia sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich histopatologicznych wyników 
badań, 
— dane dotycz ące absorpcji, je śli jest to dost ępne, 
— statystyczne opracowywanie wyników, tam gdzie jest to 
stosowne.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environ ­
mental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D. E., Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, pp. 999–1003.  
(3) Gad, S. C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indust ­
rial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, pp. 691–704.  
(4) Moser, V. C, Mc Daniel, K. M., Phillips, P. M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational 
Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. 
Pharmacol., 108, pp. 267–283.  
(5) Meyer O. A., Tilson H. A., Byrd W. C, Riley M. T. (1979). 
A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, 
pp. 233–236.
 
(6) Crofton K. M., Howard J. L., Moser V. C, Gill M. W., Reiter L. 
W., Tilson H. A., MacPhail R. C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
pp. 599–609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R. et al. (1996). „Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies”, Fundam. & Appl. Toxicol., 29, pp. 198–201.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  BADANIE TOKSYCZNO ŚCI PODPRZEWLEK ŁEJ DROG Ą 
POKARMOW Ą – BADANIA TOKSYCZNO ŚCI NA NIEGRY ­
ZONIACH METOD Ą POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI 
DROGĄ POKARMOW Ą 
1. METODA  
Niniejsza metoda badania toksyczno ści podprzewlek łej drogą pokar­
mową jest kopi ą OECD TG 409 (1998).  
1.1. WPROWADZENIE  
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczno ści substancji chemicznej 
oznaczenie podprzewlek łej toksyczno ści drogą pokarmow ą, stosując 
powtarzane dawki, mo że być prowadzone po pocz ątkowej informacji 
o toksyczno ści, uzyskanej z 28-dniowych bada ń toksyczno ści ostrej 
lub powtarzanej. 90-dniowe badanie dostarcza informacji o możliwym niebezpiecze ństwie dla zdrowia, które prawdopodobnie 
powstanie z powtarzanego nara żenia przez okres szybkiego rozwoju 
do wczesnej doros łości. Badanie dostarczy informacji na temat g łów­
nych toksycznych dzia łań, wskaże zaatakowane organy i mo żliwości 
akumulacji, dostarczy oceny poziomu ekspozycji nie powoduj ącego 
negatywnych skutków, któr ą stosuje si ę przy wyborze poziomów 
dawki dla bada ń przewlek łych i ustalania kryteriów bezpiecze ństwa 
dla narażenia ludzi.
 
Metoda badania umo żliwia okre ślenie u gatunków nale żących do 
niegryzoni negatywnych skutków ekspozycji na dzia łanie chemiczne 
oraz powinna by ć wykorzystywana tylko:  
— w przypadku gdy skutki zaobserwowane w innych badaniach 
wymagają wyjaśnienia/charakterystyki dla drugiego gatunku 
niegryzoni, lub  
— w przypadku gdy badania toksykokinetyczne wskazuj ą, że wyko­
rzystanie w łaściwego gatunku niegryzoni jest najbardziej trafnym 
wyborem ze zwierz ąt laboratoryjnych, lub  
— w przypadku gdy inne w łaściwe przyczyny usprawiedliwiaj ą 
wykorzystanie gatunku niegryzoni.  
Zob. także Ogólne wprowadzenie cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Dawka:  jest ilością podawanej substancji badanej. Dawka jest wyra ­ 
żana wagowo (g, mg) lub jako waga substancji badanej na jednostk ę 
wagi badanego zwierz ęcia (np. mg/kg), lub jako st ężenie stałe żywie­
niowe (ppm).  
Dawkowanie:  jest ogólnym poj ęciem obejmuj ącym dawk ę, jej częs­
totliwość i czas podawania dawki.  
NOAEL:  jest skrótem od poziomu, przy którym nie obserwuje si ę 
niekorzystnych skutków, oraz jest najwy ższym poziomem dawki, 
gdzie nie obserwuje si ę niekorzystnych efektów zale żnych od poda ­
wanej substancji.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Substancja badana jest codziennie podawana doustnie 
w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierz ąt doświadczalnych, 
jeden poziom dawki na grup ę przez okres 90 dni. W czasie okresu 
podawania zwierz ęta są ściśle obserwowane na oznaki zatrucia. 
Zwierzęta, które zmarly lub zosta ły zabite w czasie trwania badania, 
są poddawane sekcji zw łok po zako ńczeniu badania; zwierz ęta, które 
przeżyły są również zabijane i poddawane sekcji zw łok. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. OPIS METODY BADANIA  
1.4.1.  Dobór gatunków zwierz ąt 
Zwykle wykorzystywanym gatunkiem niegryzoni jest pies, który 
powinien by ć określonej rasy; cz ęsto wykorzystywany jest pies 
gończy. Inne gatunki, np. ma łe świnie, mog ą być również wykorzys ­
tane. Naczelne nie s ą zalecane, a ich wykorzystanie powinno by ć 
uzasadnione. Powinny by ć wykorzystane m łode, zdrowe zwierz ęta, 
a w przypadku psa wskazane jest rozpocz ęcie dawkowania w wieku 
4–6 miesi ęcy i nie pó źniejszym ni ż dziewięć miesięcy. W przypadku 
gdy badanie jest prowadzone jako wst ępne do bada ń toksyczno ści 
przewlekłej długoterminowej, w obu badaniach nale ży wykorzysta ć 
ten sam gatunek/ras ę. 
1.4.2.  Przygotowanie zwierz ąt 
Powinny by ć wykorzystane m łode zdrowe zwierz ęta, zaaklimatyzo ­
wane w warunkach laboratoryjnych i nie b ędące przedmiotem 
wcześniejszych procedur eksperymentalnych. Czas trwania aklimaty ­
zacji zale ży od wybranych gatunków badanych i ich źródła pocho­
dzenia. Zalecane jest przynajmniej pi ęć dni w odniesieniu do psów 
albo celowo hodowanej trzody od rezydenta kolonii i co najmniej 
dwa tygodnie w odniesieniu do zwierz ąt z zewn ętrznych źródeł. 
Zwierzęta badane powinny charakteryzowa ć się gatunkiem, szcze ­
pem, źródłem, płcią, wagą i/lub wiekiem. Zwierz ęta powinny by ć 
losowo wyznaczane do do świadczeń kontrolnych i grup traktowa ­
nych. Klatki powinny by ć rozmieszczone w taki sposób, aby 
możliwy wpływ wynikaj ący z ich umieszczania by ł zminimalizo ­
wany. Ka żde zwierz ę musi by ć oznakowane niepowtarzalnym 
numerem identyfikacyjnym.  
1.4.3.  Przygotowanie dawek  
Substancja badana jest podawana w postaci pokarmu lub wody 
pitnej, przez zg łębnik lub w kapsu łkach. Metoda podawania drog ą 
pokarmow ą jest zale żna od celu badania oraz w łaściwości fizyko- 
chemicznych badanego materia łu. 
Tam gdzie jest to konieczne, badan ą substancje rozpuszcza si ę lub 
wykonuje zawiesin ę w odpowiednim no śniku. Zalecane jest, aby tam 
gdzie to jest mo żliwe, rozwa żyć wpierw u życie roztworu lub zawie ­
siny wodnej, a nast ępnie rozwa żyć wykonanie roztworu/zawiesiny 
w oleju (np. w oleju kukurydzianym) i dopiero nast ępnie w innych 
nośnikach. Dla no śników różnych od wody musz ą być znane cechy 
toksyczno ści. Powinna by ć określona stabilno ść badanej substancji 
w warunkach podawania dawek.  
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Ilo ść i płeć zwierząt 
Co najmniej osiem zwierz ąt (cztery samice i cztery samce) nale ży 
wykorzysta ć w odniesieniu do ka żdego poziomu dawki. Je śli planuje 
się zabijanie w trakcie, liczba powinna by ć zwiększona 
o przewidzian ą ilość zwierząt do zabicia przed zako ńczeniem bada ń. 
Liczba zwierz ąt na końcu badania musi by ć odpowiednia do celów 
wnikliwego oszacowania toksycznych skutków. W oparciu o uprzedni ą znajomo ść substancji lub bliskiego odpowiednika nale ży 
rozważyć włączenie dodatkowej, satelickiej grupy o śmiu zwierz ąt 
(po cztery ka żdej płci) do grupy kontrolnej i grupy najwy żej dawko­
wanej do celów obserwacji po okresie czasu traktowania, odwracal ­
ności lub trwa łości jakichkolwiek skutków toksycznych. Czas 
trwania tego okresu po traktowaniu powinien by ć ustalony odpo ­
wiednio w odniesieniu do obserwowanych skutków.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Poziomy dawek  
Stosuje si ę co najmniej trzy poziomy dawek i równoczesne do świad­
czenie kontrolne, poza przypadkiem gdy prowadzone jest badanie graniczne (zob. 1.5.3). Poziomy dawek mog ą być oparte na wyni ­
kach powtarzanej dawki lub badaniach ustalania zakresu oraz 
powinny uwzgl ędniać wszelkie istniej ące dane toksykologiczne 
i toksykokinetyczne, dost ępne w odniesieniu do badanej substancji 
lub związanych z ni ą materiałów. Poza ograniczeniami natury fizy ­
kochemicznej i dzia łaniami biologicznymi substancji badanej, 
poziom najwy ższej dawki musi by ć wybrany w celu wzbudzenia 
objawów toksycznych, ale nie spowodowania śmierci czy te ż poważ­
nych cierpie ń. Opadaj ąca sekwencja poziomu dawki musi by ć 
wybrana w celu pokazania reakcji zwi ązanej z dawkowaniem 
i poziomem, przy którym nie obserwuje si ę negatywnych skutków 
(NOAEL) przy najni ższym poziomie dawki. Dwa do czterech 
zachodzące przedzialy s ą często optymalne do ustalenia opadaj ących 
poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest cz ęsto pole­
cane dla zastosowania bardzo du żych odst ępów (np. wi ęcej niż 
współczynnik 6–10) mi ędzy dawkowaniami.
 
Grupa kontrolna musi by ć grupą nietraktowan ą lub grup ą kontroln ą 
nośnika, jeśli nośnik jest u żywany do podawania substancji badanej. 
Zwierzęta w grupie kontrolnej, poza nietraktowaniem jej substancj ą 
badaną, są obsługiwane w identyczny sposób jak w zwierz ęta 
w grupach badanych. Je śli stosowany jest no śnik, grupa kontrolna 
musi otrzymywa ć nośnik w maksymalnie stosowanej obj ętości. Gdy 
substancja badana jest podawana w diecie i powoduje zmniejszenie zapotrzebowania żywieniowego, wtedy grupa kontrolna z pary 
żywieniowej mo że być pomocna w rozró żnieniu mi ędzy zmniejsze ­
niem spowodowanym odczuwaniem smaku lub zmianami toksyko ­
logicznymi w modelu badania.
 
Następujące cechy no śnika i innych dodatków musz ą być rozważone 
jako właściwe: wp ływ wchłaniania, rozk ładu, metabolizmu, retencji 
badanej substancji, wp ływ właściwości chemicznych substancji bada ­
nej, mogące zmieni ć jej cechy toksyczno ści, oraz wp ływy zapotrze ­
bowania na żywność i wodę lub żywieniowy status zwierz ąt. 
1.5.3.  Badanie graniczne  
Jeśli badanie przy jednym poziomie dawki, równowa żnym co 
najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła/dzień, stosując procedur ę opisaną 
w odniesieniu do niniejszego badania, powoduje, że nie obserwuje 
się negatywnych skutków oraz je śli nie oczekuje si ę toksyczno ści na 
podstawie danych substancji strukturalnie zwi ązanych, wtedy pe łne 
badania z zastosowaniem trzech poziomów nie wydaj ą się konieczne. 
Badanie graniczne ma zastosowanie z wyj ątkiem sytuacji, gdy nara ­ 
żenie ludzi wskazuje potrzeb ę zastosowania wy ższego poziomu 
dawki.  
1.5.4.  Podawanie dawek  
Zwierzętom dozuje si ę substancj ę badaną przez siedem dni ka żdego 
tygodnia w okresie 90 dni. Ka żdy inny sposób dozowania, na przy ­
kład pięć dni w tygodniu, wymaga uzasadnienia. Gdy substancja 
badana jest podawana przez zg łębnik, musi by ć to wykonane 
w pojedynczej dawce, przy u życiu sondy przelykowej lub odpowied ­
niej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna obj ętość cieczy, która mo że 
być podana w jednym momencie, zale ży od rozmiarów zwierz ęcia 
badanego. Zwykle obj ętość powinna by ć utrzymywana na mo żliwe 
najmniejszym poziomie. Z wyj ątkiem substancji dra żniących 
i żrących, które zwykle ujawniaj ą silniejsze dzia łanie przy wy ższym 
stężeniu, zmienno ści w objętości badanej musz ą być zminimalizo ­
wane przez ustawienie st ężenia tak, aby zapewni ć stałą objętość we 
wszystkich poziomach dozowania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
W odniesieniu do substancji podawanych w pokarmie lub wodzie 
pitnej istotne jest zapewnienie, aby ilo ści danej substancji badanej 
nie kolidowa ły z normalnym od żywianiem lub równowag ą wodną. 
Gdy substancja badana jest podawana w pokarmie – w sta łym 
stężeniu w pokarmie (ppm) albo w sta łym poziomie dawki – mo że 
być zastosowana w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia; wykorzys ­
tana alternatywa musi by ć określona. W odniesieniu do substancji 
podawanej przez zg łębnik, dawka musi by ć podana w podobnej 
porze każdego dnia i regulowana tak by utrzyma ć stały poziom 
dawki w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia. W przypadku gdy 
badanie 90-dniowe jest stosowane jako wst ępne do bada ń długoter­
minowych toksyczno ści przewlek łej, w obu badaniach powinien by ć 
użyty podobny pokarm.  
1.5.5.  Obserwacje  
Okres obserwacji powinien wynosi ć przynajmniej 90 dni. Zwierz ęta 
w grupie satelickiej, zaplanowanej do dalszej obserwacji, musz ą być 
trzymane przez stosowny okres bez traktowania w celu wykrycia 
wytrzyma łości na lub powrotu do normy od dzia łań toksycznych.  
Ogólne kliniczne obserwacje powinny by ć dokonywane przynaj ­
mniej raz na dzie ń, najlepiej o tej (tych) samej(-ych) porze (porach) 
każdego dnia, uwzgl ędniając szczytowy okres przewidywanego dzia ­ 
łania po dozowaniu. Stan kliniczny zwierz ąt powinien by ć rejestro­
wany. Co najmniej dwa razy dziennie, zwykle na pocz ątku i pod 
koniec ka żdego dnia, wszystkie zwierz ęta są kontrolowane 
w zakresie oznak zachorowa ń i śmiertelno ści. 
Przynajmniej raz przed pierwsz ą ekspozycj ą (uwzgl ędnić 
w granicach porównania) i raz tygodniowo pó źniej należy dokona ć 
szczegółowej obserwacji klinicznej na wszystkich zwierz ętach. 
Obserwacje te powinny by ć dokonywane poza klatk ą domową, 
najlepiej w warunkach standardowych za ka żdym razem 
w podobnych porach. Powinny one by ć starannie zapisane, najlepiej 
przez zastosowanie systemów punktacji, wyra źnie określonych przez 
laboratorium badawcze. Nale ży dołożyć starań w celu zapewnienia, 
aby zmiany w warunkach obserwacji by ły minimalne. Oznaki 
zauważone powinny obejmowa ć zmiany na skórze, futrze, oczach, 
błonach śluzowych, wyst ępowania wydzielin i czynno ści autono ­
miczne (np. łzawienie, piloerekcja, rozmiar źrenic, zmieniony rytm 
oddychania), lecz nie powinny by ć ograniczone tylko do nich. 
Zmiany w chodzie, postawie i reakcja na obchodzenie si ę, jak 
również obecność zachowa ń klonicznych i tonicznych, stereotypów 
(np. nadmierne zajmowanie si ę sobą, kolowacizna) lub dziwaczne 
zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie wstecz) tak że muszą 
być zarejestrowane.  
Badanie oftalmologiczne przy u życiu oftalmoskopu lub równowa ż­
nego odpowiedniego przyrz ądu musi by ć wykonane przed podawa ­
niem dawek badanej substancji i przy uko ńczeniu bada ń, najlepiej na 
wszystkich zwierz ętach, ale przynajmniej w grupach wysokiej dawki 
i kontrolnej. Je śli wykryto zmiany w oczach, nale ży przebada ć 
wszystkie zwierz ęta. 
1.5.5.1.  Waga cia ła i i spożycie pokarmu/wody  
Wszystkie zwierz ęta powinny by ć ważone przynajmniej raz na 
tydzień. Pomiary spo życia pokarmu powinny by ć dokonywane przy ­
najmniej co tydzie ń. Jeśli substancja badana jest podawana w wodzie 
pitnej, spo życie wody musi by ć także mierzone przynajmniej coty ­
godniowo. Spo życie wody mo że być także rozważone w odniesieniu 
do badań pokarmowych lub zg łębnika, w czasie których pragnienie 
może się zmienić. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Biochemia kliniczna i hematologia  
Próbki krwi powinny by ć pobrane z nazwanego siedliska 
i przechowywane, je śli ma to zastosowanie, we w łaściwych warun ­
kach. Na ko ńcu okresu badania próbki s ą zbierane tu ż przed proce ­
durą zabijania zwierz ąt lub jako jej cz ęść. 
Hematologia, w łączając hematokryt, st ężenie hemoglobiny, liczba 
erytrocytów, ca łkowita i ró żnicowa liczba leukocytów, liczba p łytek 
krwi i pomiar potencja łu krzepliwo ści takiego jak czas krzepliwo ści, 
czas protrombinowy i tromboplastynowy, powinna by ć zbadana na 
początku badania, nast ępnie albo w odst ępach miesi ęcznych albo 
w środku okresu badania oraz ostatecznie pod koniec okresu bada ­
nia. 
Oznaczenia biochemii klinicznej do bada ń głównych skutków 
toksycznych w tkankach, w szczególno ści działań na nerki 
i wątrobę, powinny by ć wykonane na próbkach krwi, uzyskanych 
od każdego zwierz ęcia na pocz ątku, nast ępnie albo odst ępach 
miesięcznych albo w środku okresu badania oraz ostatecznie pod 
koniec okresu badania. Dziedzinami bada ń, które musz ą być 
rozważone, są równowaga elektrolitów, metabolizm w ęglowodanów 
oraz funkcje w ątroby i nerek. Na wybór specyficznych bada ń wpły­
wają obserwacje sposobu dzia łania substancji badanej. Zwierz ęta 
powinny by ć przetrzymane przez okres odpowiedni do gatunku 
przed pobieraniem próbek krwi. Zalecane oznaczenia obejmuj ą 
wapń, fosfor, chlorki, sód, potas, glukoz ę, aminotransferaz ę alani­
nową, aminotransferaze asparaginow ą, dekarboksylaz ę ornityny, 
gamma glutamylow ą transpeptydaz ę, azot mocznikowy, albuminy, 
kreatynin ę krwi, całkowitą bilirubin ę i całkowitą surowicę białkową. 
Oznaczenia analityczne w moczu powinny by ć wykonane przynaj ­
mniej na pocz ątku, nast ępnie w środku i pod koniec badania, 
stosując zebraną czasowo obj ętość moczu. Oznaczenia moczu obej ­
mują przejrzysto ść, objętość, osmolality lub ci ężar właściwy, pH, 
białka, glukoza i komórki krwi. Inne parametry dodatkowo mog ą 
być oznaczane w miar ę potrzeb rozszerzenia badania zaobserwowa ­
nego(-ych) skutku(-ów).  
Ponadto nale ży rozważyć zastosowanie do bada ń surowicy znacz ­
ników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które mog ą 
być niezbędne do odpowiedniej oceny toksykologicznej, obejmuj ą 
lipidy, hormony, równowag ę kwasowo-zasadow ą, metahemoglobin ę, 
inhibitory cholinoesterazy. Dodatkowe badania kliniczne mog ą być 
wykorzystywane, gdy niezb ędne jest rozszerzenie badania zaobser ­
wowanych skutków. Mog ą być one potrzebne do okre ślenia niektó ­
rych związków chemicznych w niektórych klasach lub na zasadzie 
jednostkowych przypadków.  
Ogólnie, potrzebne jest elastyczne podej ście, w zale żności od 
gatunku oraz obserwowanych i/lub spodziewanych skutków pochodzących od danej substancji.
 
1.5.5.3.  Całościowa sekcja zw łok 
Wszystkie zwierz ęta w badaniu podlegaj ą pełnej, szczegó łowej 
brutto sekcji zw łok, która obejmuje staranne badanie zewn ętrznej 
powierzchni organu, wszystkie otwory i czaszkowe, piersiowe 
i brzuszne jamy i ich zawarto ści. Wątroba, nerka, nadnercza, j ądra, 
najądrza, macica, jajniki, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich 
zwierząt (oddzielnie od tych, które okaza ły się konające i/lub zabite 
w międzyczasie) powinny by ć okrojone z wszelkich przylegaj ących 
tkanek, odpowiednio, i nale ży tak szybko jak to mo żliwe pomierzy ć 
ich mokrą wagę po sekcji w celu zapobie żenia wyschni ęciu. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Następujące tkanki powinny by ć zakonserwowane 
w najwłaściwszym środku utrwalaj ącym dla obu typów tkanek 
i zamierzonych kolejnych bada ń histopatologicznych: wszystkie 
całkowite uszkodzenia, mózg (reprezentatywne obszary, w łączając 
płaszcz mózgowy, mó żdżek i szpik/mostek), rdze ń kręgowy (na 
trzech poziomach: karkowym, środkowo-piersiowym i l ędźwiowym), 
przysadka, tarczyca, przytarczyczka, grasica, prze łyk, gruczo ły 
ślinowe, żołądek, małe i duże jelita (w łączając plamy Peyera), 
wątroba, trzustka, nerki, nadnercza, śledziona, serce, tchawica 
i płuca (zabezpieczone przez inflacj ę utrwalon ą a następnie zanu ­
rzoną), aorta, gonady, macica, dodatkowe organy p łciowe, żeńskie 
gruczoły sutkowe, prostata, p ęcherz moczowy, p ęcherzyk żółciowy 
(mysz), w ęzły limfatyczne (najlepiej jeden w ęzeł pokrywaj ący drogę 
podawania i drugi odleg ły od drogi podawania, aby obj ąć działania 
na układ), nerw peryferyjny (kulszowy lub piszczelowy) zalecany 
w dużej bliskości od mięśnia, fragment ko ści szpikowej (i/lub świeża 
kość z zassanym szpikiem), skóra i oczy (je śli zaobserwowano 
zmiany podczas bada ń oftalmologicznych). Kliniczne i inne wyniki 
badań mogą zasugerowa ć konieczno ść zbadania dodatkowych 
tkanek. Tak że jakiekolwiek organy uznane za mog ące być celem 
w oparciu o znane w łaściwości badanej substancji powinny by ć 
zakonserwowane.  
1.5.5.4.  Histopatologia  
Pełna histopatologia powinna by ć przeprowadzona na zakonserwo ­
wanych cia łach i tkankach wszystkich zwierz ąt z grupy kontrolnej 
i wysokodawkowanej. Badania te powinny by ć rozciągnięte na 
wszystkie inne dawkowane grupy, je śli w wysokodawkowanej 
grupie obserwuje si ę zmiany zwi ązane z dzia łaniem środka.  
Należy przebada ć wszystkie zmiany patologiczne.  
Jeśli używa się grupy satelickiej, histopatologia powinna by ć prze­
prowadzona na tkankach i cia łach, okre ślonych jako wykazuj ące 
działanie, w grupach traktowanych.  
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. DANE  
Należy przedstawi ć dane osobnika. Dodatkowo, wszystkie dane 
powinny by ć zestawione w postaci tabelarycznej, przedstawiaj ąc 
w odniesieniu do ka żdej badanej grupy liczb ę zwierząt na pocz ątku 
badania, liczb ę zwierząt, które ponios ły śmierć podczas trwania 
badania lub które zabito z przyczyn humanitarnych wraz z czasem, w którym nast ąpiła śmierć lub humanitarne zabicie, liczb ę wyka­
zującą oznaki zatrucia, opis obserwowanych oznak zatrucia, 
włączając czas zaistnienia, czas trwania, stopie ń ciężkości każdego 
działania toksycznego, liczb ę zwierząt wykazuj ącą zmiany patolo ­
giczne, typ zmian patologicznych i procent zwierz ąt obrazuj ący 
każdy typ zmiany patologicznej.
 
Gdy ma to zastosowanie, wyniki liczbowe powinny by ć szacowane 
właściwymi i ogólnie przyj ętymi metodami statystycznymi. Metody 
statystyczne i dane poddawane analizie, powinny by ć wybrane 
w czasie przygotowania projektu bada ń. 
2.2. SPRAWOZDANIE DOTYCZ ĄCE BADA Ń 
Sprawozdanie dotycz ące badań musi zawiera ć następujące informacje:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— charakter fizyczny, czysto ść i właściwości fizyko-chemiczne,  
— dane identyfikacyjne,  
— nośnik (jeśli jest to stosowne): uzasadnienie wyboru no śnika, 
jeśli jest różny od wody.  
2.2.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— użyte gatunki i szczep,  
— ilość, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki zamieszkiwania, pokarm itp.,  
— waga osobnicza zwierz ąt przy rozpocz ęciu badania.  
2.2.3.  Warunki badania:  
— racjonalne uzasadnienie wybranego poziomu dawkowania,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące składu badanej substancji/ ­
przygotowanie pokarmu, uzyskane st ężenie, stabilno ść 
i jednorodno ść przygotowania,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące podawania substancji badanej,  
— dawka rzeczywista (mg/kg waga cia ła/dzień), wskaźnik konwersji 
pokarm/woda pitna st ężenia badanej substancji (ppm) do dawki 
rzeczywistej, je śli ma to zastosowanie,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące jakości żywności i wody.  
2.2.4.  Wyniki:  
— waga cia ła oraz zmiany wagi cia ła, 
— spożycie żywności i wody, je śli ma to zastosowanie,  
— dane reakcji na zatrucie wed ług płci i poziomu dawki, w łączając 
oznaki zatrucia,  
— charakter, surowo ść i czas trwania obserwacji klinicznych (stan 
odwracalny czy nie),  
— wyniki badania oftalmologicznego,  
— ocena czynno ści sensorycznych, si ły zacisku i czynno ści moto­
rycznych (gdy jest to dost ępne),  
— badania hematologiczne z odpowiednimi warto ściami poziomów 
tolerancji,  
— biochemiczne badania kliniczne z odpowiednimi warto ściami 
poziomów tolerancji,  
— końcowa waga cia ła, waga organów i proporcje wagi organ/cia ło, 
— ustalenia sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich histopatologicznych wyników 
badań, 
— dane dotycz ące absorpcji, je śli jest to dost ępne, 
— statystyczne opracowanie wyników, tam gdzie jest to stosowne.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  BADANIE PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNO ŚCI SKÓRY – 
90-DNIOWE BADANIA POWTARZANEGO DAWKOWANIA 
NA SKÓRZE Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW GRYZONI  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Substancja testowa jest nanoszona codziennie na skór ę, 
w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierz ąt badanych, jedna 
dawka na grup ę przez okres 90 dni. W okresie podawania dawki 
zwierzęta obserwowane s ą codziennie celem wykrycia objawów 
toksyczno ści. Zwierz ęta, które zdechn ą w czasie trwania badania, 
poddawane s ą sekcji zw łok, a na zako ńczenie badania zwierz ęta 
pozostałe przy życiu są zabijane i równie ż poddawane sekcji zw łok. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Zwierzęta podlegaj ą warunkom przebywania i żywieniowym usta ­
lonym do celów badania przez co najmniej pi ęć dni przed rozpocz ę­
ciem badania. Przed rozpocz ęciem badania m łode zdrowe zwierz ęta 
są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych. Tu ż przed 
rozpoczęciem badania futro zostaje ostrzy żone w cz ęści grzbietowej 
tułowia badanych zwierz ąt. Można zastosowa ć golenie, ale powinno 
być przeprowadzone oko ło 24 godziny przed rozpocz ęciem badania. 
Ponowne strzy żenie lub golenie jest zazwyczaj potrzebne 
w przybli żeniu co tydzie ń. Podczas strzy żenia lub golenia futra 
należy uważać, aby nie otrze ć skóry. Nie mniej ni ż 10 % 
powierzchni skóry powinno zosta ć oczyszczone w celu podania 
substancji testowej. Nale ży uwzględnić wagę zwierząt w chwili 
podjęcia decyzji o powierzchni oczyszczanej skóry oraz 
o powierzchni jej pokrycia. Badaj ąc substancje sta łe, które mog ą 
być ścierane w odpowiednich przypadkach, substancja testowa 
powinna by ć odpowiednio nawil żana wodą lub, w miar ę potrzeby, 
za pomoc ą odpowiedniego no śnika w celu zapewnienia dobrego 
kontaktu ze skór ą. Płynne substancje testowe na ogó ł są aplikowane 
nierozcieńczone. Substancja aplikowana jest zasadniczo przez pi ęć 
do siedmiu dni w tygodniu.  
Warunki badania  
Z w i e r z ę t a b a d a n e  
Wykorzystywa ć można dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. 
W chwili rozpocz ęcia badania rozpi ętość różnicy wagowej powinna 
wynosić ± 20 % wagi średniej. W przypadku przeprowadzania 
podchronicznych bada ń na skórze jako bada ń wstępnych do bada ń 
długoterminowych ten sam gatunek i szczep powinny by ć wykorzys ­
tane w obu badaniach.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
L i c z b a i p ł e ć 
Co najmniej 20 zwierz ąt (10 samic i 10 samców) ze zdrow ą skórą 
powinno by ć wykorzystanych na ka żdym z poziomów dawek. 
Samice powinny by ć nieciężarne i takie, które nie rodzi ły. Jeżeli 
planowane s ą zgony zwierz ąt, ich liczba powinna zosta ć powięk­
szona o liczb ę zwierząt planowanych do u śmiercenia przed zako ń­
czeniem bada ń. Ponadto grupa satelitarna w ilo ści 20 zwierz ąt (10 
zwierząt każdej płci) może zostać poddana wysokiej dawce przez 
okres 90 dni i obserwowana pod wzgl ędem odwracalno ści, odpor ­
ności, lub opó źnionego wyst ąpienia toksycznych skutków przez 28 
dni po przeprowadzeniu czynno ści badawczych.  
P o z i o m y d a w e k  
Powinny zosta ć wykorzystane co najmniej trzy poziomy dawek 
łącznie z dawk ą kontroln ą lub kontrol ą nośnika, jeżeli jest stoso ­
wany. Okres ekspozycji na substancj ę powinien wynosi ć co najmniej 
sześć godzin dziennie. Substancj ę należy stosowa ć o podobnych 
porach ka żdego dnia, a ilo ść stosowanej substancji dostosowana 
jest do odpowiednich odst ępów czasu (tygodniowych lub dwutygod ­
niowych), w celu utrzymania sta łej dawki w odniesieniu do wagi 
ciała zwierz ąt. Oprócz stosowania substancji testowej, zwierz ęta 
grupy kontrolnej powinny by ć traktowane w identyczny sposób co 
obiekty grupy badanej. W przypadku u życia nośnika w celu uspraw ­
nienia dawkowania grupa kontrolna przyjmuje dawki w ten sam sposób co grupy badane oraz otrzymuje t ę samą ilość nośnika co 
ilość podawana grupie otrzymuj ącej najwy ższą dawkę. Najwyższa 
dawka powinna wywo łać objawy toksyczno ści, ale nie powinna 
powodowa ć lub powodowa ć niewiele przypadków śmiertelno ści. 
Najniższa dawka nie powinna powodowa ć
 żadnych objawów 
toksyczno ści. W przypadku rozwa żenia ekspozycji cz łowieka 
najniższa dawka powinna j ą przekracza ć. Najlepiej by ło by, gdyby 
średnia dawka wywo ływała minimalne, daj ące się zaobserwowa ć 
skutki toksyczno ści. W przypadku u życia więcej niż jednej średniej 
dawki nale ży rozszerzy ć stosowane poziomy dawek w celu wywo ­ 
łania stopniowania skutków toksyczno ści. W grupach otrzymuj ących 
niskie oraz średnie dawki, oraz w grupach kontrolnych jakiekolwiek 
przypadki śmiertelno ści powinny by ć nieliczne w celu umo żliwienia 
dokonania miarodajnej oceny wyników bada ń. 
W przypadku gdy aplikowanie substancji testowej powoduje 
poważne podrażnienia skóry, st ężenie powinno zosta ć obniżone, co 
może doprowadzi ć do zmniejszenia lub braku innych objawów 
toksyczno ści w grupie najwy ższego dawkowania. Je żeli skóra zosta ła 
poważnie uszkodzona, konieczne mo że okazać się zakończenie bie ż­ 
ących bada ń i podjęcie nowych bada ń z niższymi stężeniami.  
Test graniczny  
Jeżeli wstępne badanie przy dawce w wysoko ści 1 000 mg/kilogram 
lub przy wy ższej dawce zwi ązanej z ewentualn ą ekspozycj ą czło­
wieka wywo łuje żadnych objawów toksyczno ści, dalsze badanie 
może być uznane za niepotrzebne.  
Okres obserwacji  
Zwierzęta badane powinny by ć codziennie obserwowane w celu 
wykrycia objawów toksyczno ści. Czas zgonu oraz czas pojawienia 
się i zaniku objawów toksyczno ści należy odnotowa ć. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
Procedura  
Zwierzęta powinny zosta ć umieszczone w osobnych klatkach. Zwie ­
rzęta należy poddać działaniu substancji testowej najlepiej siedem 
dni w tygodniu, przez okres 90 dni.  
Zwierzęta z grup satelitarnych przeznaczone do obserwacji uzupe ł­
niających powinny by ć trzymane przez dodatkowy okres 28 dni bez 
podawania jakichkolwiek substancji w celu stwierdzenia regeneracji lub odporno ści na skutki toksyczno ści. Czas ekspozycji powinien 
wynosić sześć godzin dziennie.
 
Substancja testowa powinna by ć aplikowana w sposób jednolity na 
powierzchni, która stanowi oko ło 10 % ogólnej powierzchni cia ła. 
W odniesieniu do substancji wysokotoksycznych pokryty obszar powierzchni cia ła może być mniejszy ale pozosta ła powierzchnia 
powinna by ć pokryta tak cienk ą i jednolit ą warstwą jak to mo żliwe.
 
W czasie ekspozycji substancja testowa wchodzi w kontakt ze skór ą 
za pomoc ą porowatego opatrunku z gazy i nie dra żniącej taśmy. 
Następnie badane miejsce powinno by ć w odpowiedni sposób okryte 
w celu utrzymania opatrunku z gazy oraz substancji testowej 
i zapewnienia, że zwierzę nie będzie w stanie spo żyć substancji 
testowej. W celu zapobie żenia spożycia substancji testowej mog ą 
zostać zastosowane środki zabezpieczaj ące ale całkowite unierucho ­
mienie nie jest zalecan ą metodą. 
Na zakończenie okresu ekspozycji, pozosta ła substancja testowa 
powinna zosta ć usunięta, w przypadku gdy to mo żliwe, za pomoc ą 
wody lub innej w łaściwej metody oczyszczania skóry.  
Wszystkie zwierz ęta powinny by ć obserwowane codziennie 
a objawy toksyczno ści powinny by ć odnotowane w łączając porę 
ich rozpocz ęcia, stopie ń oraz czas trwania. Obserwacje zwierz ąt 
w klatkach powinny obejmowa ć zmiany zachodz ące na ich skórze 
i futrze, zmiany oczu i b łony śluzowej a tak że zmiany uk ładu odde ­
chowego, kr ążenia oraz autonomicznego i centralnego uk ładu nerwo ­
wego, czynno ści somatomotorycznych oraz schematów zachowa ń. 
Powinny by ć dokonywane pomiary spo życia żywności oraz pomiary 
wagi ciała zwierząt raz w tygodniu. Regularne obserwacje zwierz ąt 
są konieczne w celu zapewnienia, że nie dochodzi do strat na zwie ­
rzętach w wyniku takich przypadków jak kanibalizm, autoliza tkanek 
lub nieprawid łowe umieszczenie. Na ko ńcu okresu badania 
wszystkie zwierz ęta pozosta łe przy życiu z niesatelitarnej grupy 
badanej zostaj ą zabite i poddane sekcji zw łok. Zwierz ęta konające 
powinny by ć usuwane i poddawane sekcji zw łok po stwierdzeniu 
takiego faktu.  
Wszystkie zwierz ęta, włączając zwierz ęta z grup kontrolnych, 
zwyczajowo poddawane s ą następującym badaniom:  
a) Badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub 
podobnego sprz ętu, powinno zosta ć przeprowadzone przed zasto ­
sowaniem substancji testowej oraz zako ńczeniem bada ń, najlepiej 
na wszystkich zwierz ętach, a co najmniej na zwierz ętach z grupy 
najwyższej dawki i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia 
zmian w oczach nale ży przebada ć wszystkie zwierz ęta. 
b) Hematologia, w łączając hematokryt, badanie st ężenia hemoglo ­
biny, ilości krwinek czerwonych, ogólnej ilo ści krwinek bia łych 
i obraz bia łokrwinkowy, pomiar wska źników krzepliwo ści krwi 
takich jak czas krzepni ęcia, czas protrombinowy, czas trombopla ­
stynowy, czy ilo ść płytek krwi powinny zosta ć zbadane na ko ńcu 
okresu badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) Powinno zosta ć przeprowadzone oznaczenie klinicznej biochemii 
krwi na ko ńcu okresu badania. Obszarami zainteresowania 
uważanymi za w łaściwe dla wszystkich bada ń są: równowaga 
elektrolityczna, metabolizm w ęglowodanów, funkcje w ątroby 
i nerek. Wybór szczególnych bada ń będzie uzale żniony od obser ­
wacji formy i dzia łania substancji. Sugerowane ustalenia to: 
pomiar wapnia, fosforu, chlorku, sodu, potasu, st ężenie glukozy 
na czczo (z okresem g łodzenia stosownym do gatunku zwierz ę­
cia), transaminaza pirogronianowo-glutaminowa surowicy (  1 ), 
transaminaza szczawiowooctowoglutamylowa surowicy (  2 ), 
dekarboksylazy ornityny, transpeptydaza gammaglutamylowa, mocznika azotu, albuminy, kreatyny krwi ca łkowitej bilirubiny 
oraz całkowitej surowicy bia łka. Inne ustalenia, które mog ą być 
niezbędne do w łaściwej analizy toksykologicznej obejmuj ą 
badania lipidów, hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, czynności metahemoglobiny i cholinoesteraza. Dodatkowa 
biochemia kliniczna mo że zostać zastosowana w miar ę potrzeby 
w celu rozszerzenia bada ń odnośnie obserwowanych skutków.
 
d) Analiza moczu nie jest wymagana jako badanie rutynowe, ale 
jedynie w przypadku spodziewanej lub obserwowanej toksycz ­
ności. 
Jeżeli dane bazowe s ą niewłaściwe, nale ży zwróci ć uwagę na 
określenie parametrów hematologicznych i klinicznej biochemii 
przed rozpocz ęciem dawkowania.  
C a ł k o w i t a s e k c j a z w ł o k 
Wszystkie zwierz ęta powinny by ć poddane ca łkowitej sekcji zw łok, 
która obejmuje badanie zewn ętrznej powierzchni cia ła, wszelkich 
otworów, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz 
ich zawarto ści. Wątroba, nerki, nadnercza oraz j ądra powinny by ć 
zważone niezw łocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu unikni ęcia 
wyschnięcia. Poni ższe organy i tkanki powinny by ć zachowane 
w odpowiednim pojemniku w celu ewentualnego przysz łego badania 
histopatologicznego: wszelkie zmiany patologiczne, mózg – 
włączając części rdzenia/most, mó żdżek i kora mózgowa, przysadka 
mózgowa, tarczyca/przytarczyca, tkanki grasicy, (tchawica), p łuca, 
serce, aorta, gruczo ły ślinowe, w ątroba, śledziona, nerki, nadnercza, 
trzustka, gruczo ły płciowe, macica, dodatkowe organy genitaliów, 
woreczek żółciowy (je żeli obecny), prze łyk, żołądek, dwunastnica, 
jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okr ężnica, odbytnica, p ęcherz 
moczowy, przedstawiciel pachowych w ęzłów chłonnych, ( żeńskie 
gruczoły malene), (umi ęśnienie uda), nerwy obwodowe, (oczy), 
(mostek wraz ze szpikiem kostnym), (ko ść udowa, w łączając 
powierzchnie stawowe), i (rdze ń kręgowy w trzech poziomach – 
szyjny, śródpiersiowy i l ędźwiowy) i (oczodo łowe gruczo ły łzo 
we). Tkanki wymienione w nawiasach b ędą wymaga ły przebadania 
w przypadku powstania objawów toksyczno ści lub zaanga żowania 
danych organów.  
B a d a n i a h i s t o p a t o l o g i c z n e  
a) Pełna histopatologia powinna zosta ć przeprowadzona na 
normalnej i badanej skórze oraz na organach i tkankach zwierz ąt 
w grupie kontrolnej i grupie najwy ższego dawkowania.  
b) Wszelkie zmiany patologiczne powinny zosta ć zbadane.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Obecnie znane pod nazw ą aminontransferaza alaninowa surowicy. 
( 2 ) Obecnie znane pod nazw ą aminotransferaza asparaginianowa surowicy.
 c) Organy docelowe dzia łania substancji w grupach innego dawko ­
wania powinny zosta ć zbadane.  
d) W przypadku gdy wykorzystywane s ą szczury, p łuca zwierz ąt 
w grupach niskiego i średniego dawkowania powinny zosta ć 
poddane badaniu histopatologicznemu w celu stwierdzenia 
dowodów infekcji, poniewa ż badanie to dostarcza dogodnej 
analizy stanu zdrowia zwierz ąt. Przeprowadzanie dalszych 
badań histopatologicznych nie musi by ć wymagane jako ruty ­
nowe w odniesieniu do zwierz ąt w tych grupach ale zawsze 
musi być przeprowadzane na organach, które wykazuj ą objawów 
zmian patologicznych w grupie najwy ższego dawkowania.  
e) W przypadku wykorzystywania grupy satelitarnej histopatologia 
powinna zosta ć przeprowadzona na tkankach i organach zidenty ­
fikowanych jako te wykazuj ące skutki w grupach poddanych 
badaniu.  
2. DANE  
Dane powinny zosta ć podsumowane w formie tabeli, wykazuj ącej 
liczbę zwierząt każdej badanej grupy na pocz ątku bada ń, liczbę 
zwierząt wykazuj ących zmiany patologiczne, rodzaj zmian oraz 
procent zwierz ąt wykazuj ących każdy z rodzajów zmian. Wyniki 
powinny zosta ć oszacowane w łaściwą metodą statystyczn ą. Można 
zastosowa ć każdą uznaną metodę statystyczn ą. 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń zawiera, w miar ę możliwości, następujące 
informacje:  
— gatunek lub szczep, źródło, warunki środowiska, po żywienie,  
— warunki badania,  
— dawkowanie (w łączając nośnik, jeżeli został użyty) oraz jego 
stężenie,  
— dane dotycz ące reakcji na toksyczno ść ze wzgl ędu na p łeć 
i dawkę, 
— brak skutków,  
— czas zgonu podczas bada ń lub informacja o tym, czy zwierz ęta 
przetrwały do czasu ich zako ńczenia,  
— opis skutków toksyczno ści lub innych,  
— okres obserwacji ka żdego nietypowego objawu i pó źniejszego 
postępowania,  
— brak skutków,  
— dane dotycz ące wagi cia ła i pożywienia,  
— wyniki bada ń oftalmologicznych,  
— zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,  
— zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie 
wyniki (w łączając wyniki wszelkich analiz moczu),  
— wyniki bada ń sekcji zw łok, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników bada ń histopatologicz ­
nych,  
— statystyczne uj ęcie wyników, je żeli to mo żliwe,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2 ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  TOKSYCZNO ŚĆ PODPRZEWLEK ŁA – NARA ŻENIE 
INHALACYJNE: BADANIE 90-DNIOWE  
STRESZCZENIE  
Niniejszą zmienion ą metodę badawcz ą B.29 opracowano w celu uzyskania pe łnej 
charakterystyki toksyczno ści badanej substancji chemicznej wskutek nara żenia 
inhalacyjnego przez okres toksyczno ści podprzewlek łej (90 dni) oraz zapew ­
nienia danych odpornych na potrzeby ilo ściowych ocen ryzyka zwi ązanego 
z narażeniem inhalacyjnym. Grupy 10 samców i 10 samic gryzoni s ą przez 6 
godzin dziennie w ci ągu 90 dni (13 tygodni) nara żane na dzia łanie a) badanej 
substancji chemicznej przy co najmniej trzech poziomach st ężenia; b) filtrowa ­
nego powietrza (ujemna grupa kontrolna); lub c) no śnika (grupa kontrolna no śni­
ka). Na ogó ł zwierzęta narażane są na dzia łanie substancji przez 5 dni 
w tygodniu, ale nara żenie przez 7 dni w tygodniu równie ż jest dozwolone. 
Zawsze bada si ę samców i samice, lecz je śli wiadomo, że jedna p łeć jest bardziej 
podatna na dzia łanie danej badanej substancji chemicznej, p łcie mogą być 
poddane nara żeniu przy ró żnych poziomach st ężenia. Metoda ta pozwala kierow ­
nikowi badania na elastyczno ść, jeżeli chodzi o w łączenie do badania grup 
satelitarnych (badania odwracalno ści), uśmiercanie zwierz ąt w trakcie trwania 
doświadczenia, a tak że wprowadzenie p łukania oskrzelowo-p ęcherzykowego, 
testów neurologicznych oraz dodatkowych bada ń z zakresu patologii klinicznej 
i histopatologicznych w celu lepszego scharakteryzowania toksyczno ści badanej 
substancji chemicznej.  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 413 (OECD TG 413) (2009). 
Pierwotną dotyczącą badań podprzewlek łej toksyczno ści inhalacyjnej 
wytyczną nr 413 (TG 413) przyj ęto w 1981 r. (1). Niniejsza metoda 
badawcza B.29 (równowa żna zmienionej wytycznej TG 413 (2009)) zosta ła 
zaktualizowana w celu odzwierciedlenia stanu wiedzy naukowej oraz zaspo ­
kojenia obecnych i przysz łych potrzeb regulacyjnych.  
2. Badania toksyczno ści podprzewlek łej wskutek nara żenia inhalacyjnego s ą 
wykorzystywane przede wszystkim w celu okre ślenia stężeń regulacyjnych 
na potrzeby oceny ryzyka pracowników w miejscu pracy. Stosuje si ę je 
także do ocenienia ryzyka dla ludzi zwi ązanego z zamieszkaniem 
i transportem oraz środowiskiem. Niniejsza metoda umo żliwia scharaktery ­
zowanie szkodliwych zmian w nast ępstwie powtarzanego codziennego nara ­ 
żenia inhalacyjnego na badan ą substancj ę chemiczn ą przez 90 dni (oko ło 
10 % długości życia szczura). Dane pochodz ące z bada ń toksyczno ści 
podprzewlek łej wskutek nara żenia inhalacyjnego mog ą być wykorzystywane 
do ilościowych ocen ryzyka oraz do wyboru st ężeń na potrzeby bada ń 
toksyczno ści przewlek łej. Niniejsza metoda badawcza nie jest przeznaczona 
do badania nanomateria łów. Definicje stosowane w kontek ście niniejszej 
metody badawczej znajduj ą się na ko ńcu tego rozdzia łu i w 
wytycznych (GD) nr 39 (2).  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE  
3. Przed przeprowadzeniem badania laboratorium badawcze powinno wzi ąć 
pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji 
chemicznej w celu poprawienia jako ści badania oraz aby zminimalizowa ć 
wykorzystanie zwierz ąt. Informacje, które b ędą pomocne w wyborze odpo ­
wiednich badanych st ężeń, mogą obejmowa ć nazwę chemiczn ą, struktur ę 
chemiczn ą i właściwości fizykochemiczne badanej substancji chemicznej; 
wyniki wszelkich bada ń toksyczno ści in vitro  lub in vivo ; przewidywane 
zastosowania i potencjalne nara żenie ludzi; dost ępne dane 
dotyczące (Q)SAR i dane toksykologiczne dotycz ące strukturalnie powi ąza­
nych zwi ązków oraz dane pochodz ące z innych bada ń narażenia powtarza ­
nego. Jeżeli w trakcie badania oczekiwana lub obserwowana jest neuroto ­
ksyczność, kierownik badania mo że postanowi ć o włączeniu do badania 
odpowiednich ocen, takich jak zestaw bada ń czynno ściowych 
i obserwacyjnych i pomiar aktywno ści motorycznej. Chocia ż w przypadku 
określonych bada ń decydujące znaczenie mo że mieć moment nara żenia na 
działanie substancji, przeprowadzanie tych dodatkowych czynno ści nie 
powinno kolidowa ć z podstawowym projektem badania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. Rozcie ńczenia badanych substancji chemicznych maj ących dzia łanie żrące 
lub drażniące można badać przy stężeniach, które dadz ą pożądany stopie ń 
toksyczno ści. Dalsze informacje mo żna znaleźć w GD 39 (2). Podczas 
narażania zwierz ąt na działanie tych substancji st ężenia docelowe powinny 
być na tyle niskie, aby nie powodowa ć silnego bólu i stresu, a zarazem 
wystarczaj ące do przed łużenia krzywej st ężenie-odpowied ź do poziomów, 
które pozwalaj ą osiągnąć regulacyjny i naukowy cel badania. St ężenia te 
należy dobiera ć indywidualnie dla ka żdego przypadku, najlepiej w oparciu 
o odpowiednio zaprojektowane badanie ustalaj ące zakres, które dostarcza 
informacji na temat krytycznego punktu ko ńcowego, wszelkich progów 
powodujących dzia łanie drażniące oraz czasu pojawienia si ę objawów 
(zob. pkt 11–13). Nale ży podać uzasadnienie doboru st ężenia.  
5. Zwierz ęta w stanie agonalnym oraz zwierz ęta wykazuj ące oczywiste oznaki 
bólu czy objawy ostrego i przewlek łego stresu powinny zosta ć uśmiercone 
w sposób humanitarny. Zwierz ęta w stanie agonalnym traktuje si ę tak samo 
jak zwierz ęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do 
uśmiercenia zwierz ąt w stanie agonalnym lub cierpi ących silny ból oraz 
wytyczne dotycz ące rozpoznawania prognozowanego lub nieuchronnie zbli ­ 
żającego się zgonu s ą zawarte w wytycznych OECD dotycz ących 
humanitarnego punktu ko ńcowego (3).  
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
6. Nale ży wykorzysta ć zdrowe, m łode, doros łe gryzonie pochodz ące ze 
szczepów powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. Preferowanym gatunkiem jest szczur. Je żeli wykorzystuje si ę inny gatunek, nale ży podać 
uzasadnienie.
 
Przygotowanie zwierz ąt 
7. Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą być w ciąży. W dniu rando ­
mizacji zwierz ęta powinny by ć młodymi doros łymi osobnikami w wieku od 
7 do 9 tygodni. Masa cia ła powinna mie ścić się w granicach ± 20 % śred­
niej masy dla ka żdej płci. Zwierz ęta są wybierane losowo, oznaczane 
w sposób umo żliwiający identyfikacj ę poszczególnych osobników 
i przetrzymywane w klatkach przynajmniej przez 5 dni przed rozpocz ęciem 
badania, żeby umożliwić aklimatyzacj ę do warunków laboratoryjnych.  
Hodowla zwierz ąt 
8. W celu u łatwienia obserwacji i unikni ęcia pomy łek zwierz ęta powinny by ć 
indywidualnie oznakowane, najlepiej za pomoc ą podskórnych transponde ­
rów. Temperatura w pomieszczeniach dla zwierz ąt doświadczalnych 
powinna wynosi ć 22 ± 3 °C. Najlepiej by łoby, gdyby wilgotno ść względna 
była utrzymywana w przedziale 30–70 %, chocia ż może to być niemożliwe 
w przypadku stosowania wody jako no śnika. Przed nara żeniem i po nim 
zwierzęta na ogó ł należy trzyma ć w klatkach w grupach podzielonych 
według płci i badanego st ężenia, lecz liczba zwierz ąt w klatce nie powinna 
przeszkadza ć w dokładnej obserwacji ka żdego zwierz ęcia, a tak że powinna 
umożliwiać zminimalizowanie strat w zwierz ętach spowodowanych kaniba ­
lizmem i walkami. Je żeli zwierz ęta mają być poddane nara żeniu tylko przez 
nos, konieczne mo że być ich przyzwyczajenie do rur unieruchamiaj ących. 
Rury unieruchamiaj ące nie powinny powodowa ć nadmiernego stresu fizycz ­
nego i termicznego dla zwierz ąt ani stresu spowodowanego unieruchomie ­
niem. Unieruchomienie mo że mieć wpływ na fizjologiczne punkty ko ńcowe, 
takie jak temperatura cia ła (hipertermia) lub minutowa pojemno ść odde­
chowa. Je żeli dostępne są dane ogólne, na podstawie których mo żna wyka­
zać, że takie zmiany nie wyst ępują w znacz ącym stopniu, uprzednia 
adaptacja do rur unieruchamiaj ących nie jest konieczna. Zwierz ęta, których 
cała powierzchnia cia ła jest nara żana na dzia łanie aerozolu, w trakcie nara ­ 
żenia powinny by ć trzymane oddzielnie, aby zapobiec filtrowaniu badanego 
aerozolu przez futro innych zwierz ąt w tej samej klatce. Z wyj ątkiem okresu 
narażenia stosowane mog ą być konwencjonalne i certyfikowane pasze labo ­
ratoryjne oraz umo żliwiony nieograniczony dost ęp do wody pitnej 
z instalacji wodoci ągowej. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 
godzin światła, 12 godzin ciemno ści. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 423
 
Komory inhalacyjne  
9. Przy wyborze komory inhalacyjnej nale ży wziąć pod uwag ę charakter 
badanej substancji chemicznej i cel badania. Preferowan ą drogą narażenia 
jest narażenie tylko przez nos (poj ęcie to obejmuje nara żenie tylko przez 
głowę, nos lub pysk). Metoda nara żenia tylko przez nos jest na ogó ł prefe­
rowana w badaniach aerozoli ciek łych lub sta łych oraz par, które mog ą 
skraplać się, tworząc aerozole. Nara żenie całego ciała może lepiej nadawa ć 
się do szczególnych celów badania, ale nale ży to uzasadni ć w sprawozdaniu 
z badania. Aby zagwarantowa ć stabilno ść atmosfery przy zastosowaniu 
komory do poddawania nara żeniu całego ciała, łączna objętość badanych 
zwierząt nie powinna przekracza ć 5 % obj ętości komory. Zasady technik 
narażenia tylko przez nos i przez powierzchni ę całego ciała oraz ich szcze ­
gólne zalety i wady omówiono w GD 39 (2).  
BADANIA TOKSYCZNO ŚCI 
Stężenia graniczne  
10. W przeciwie ństwie do bada ń toksyczno ści ostrej w badaniach toksyczno ści 
podprzewlek łej wskutek nara żenia inhalacyjnego nie ma okre ślonych st ężeń 
granicznych. Podczas doboru maksymalnego badanego st ężenia nale ży 
uwzględnić: 1) maksymalne st ężenie możliwe do uzyskania; 2) poziom 
narażenia ludzi w najgorszym przypadku; 3) konieczno ść utrzymania 
wystarczaj ącej poda ży tlenu; oraz 4) trosk ę o dobrostan zwierz ąt. 
W przypadku braku granic opartych na danych stosowane mog ą być granice 
toksyczno ści ostrej okre ślone w rozporz ądzeniu (WE) nr 1272/2008 (13) (tj. 
do maksymalnego st ężenia 5 mg/l dla aerozoli, 20 mg/l dla par i 20 000 
ppm dla gazów); zob. GD 39 (2). Je żeli podczas badania gazów lub wysoce 
lotnych badanych substancji chemicznych (np. czynników ch łodniczych) 
konieczne jest przekroczenie tych granic, nale ży podać uzasadnienie. 
Stężenie graniczne powinno wywo ływać wyraźną toksyczno ść bez powodo ­
wania zbędnego stresu dla zwierz ąt ani wpływania na d ługość ich życia (3).  
Badanie ustalaj ące zakres  
11. Przed rozpocz ęciem badania g łównego na ogó ł konieczne jest przeprowa ­
dzenie badania ustalaj ącego zakres. Badanie ustalaj ące zakres jest bardziej 
rozległe niż badanie rozpoznawcze, poniewa ż nie jest ograniczone do 
wyboru st ężenia. Wiedza zdobyta poprzez badanie ustalaj ące zakres mo że 
zadecydowa ć o powodzeniu badania g łównego. Badanie ustalaj ące zakres 
może na przyk ład dostarcza ć informacji technicznych na temat metod anali ­
tycznych, klasyfikacji cz ąstek wed ług wielko ści, odkrycia mechanizmów 
toksycznych, danych z zakresu patologii klinicznej i histopatologicznych oraz oszacowa ń NOAEL i MTC w badaniu g łównym. Kierownik badania 
może postanowi ć o zastosowaniu badania ustalaj ącego zakres do okre ślenia 
progu dzia łania drażniącego na drogi oddechowe (np. przy pomocy histo ­
patologii dróg oddechowych, badania czynno ści płuc lub p łukania 
oskrzelowo-p ęcherzykowego), górnego poziomu st ężenia, które jest tolero ­
wany bez zb ędnego stresu dla zwierz ąt, oraz parametrów, które najlepiej 
scharakteryzuj ą toksyczno ść badanej substancji chemicznej.
 
12. Badanie ustalaj ące zakres mo że obejmowa ć jeden poziom st ężenia lub 
większą ich liczb ę. Na każdym poziomie st ężenia należy poddać narażeniu 
od trzech do sze ściu samców i od trzech do sze ściu samic – w zale żności od 
wybranych punktów ko ńcowych. Badanie ustalaj ące zakres powinno trwa ć 
co najmniej 5 dni i na ogó ł nie więcej niż 28 dni. Uzasadnienie wyboru 
stężeń na potrzeby badania g łównego nale ży podać w sprawozdaniu 
z badania. Celem badania g łównego jest wykazanie zale żności stężenie- 
odpowied ź w oparciu o przewidywany najczulszy punkt ko ńcowy. Najlepiej 
byłoby, gdyby najni ższe stężenie było stężeniem, przy którym nie obserwuje 
się szkodliwych zmian, natomiast najwy ższe stężenie powinno wywo ływać 
wyraźną toksyczno ść bez powodowania zb ędnego stresu dla zwierz ąt ani 
wpływania na d ługość ich życia (3).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Przy wyborze poziomów st ężenia na potrzeby badania ustalaj ącego zakres 
należy wziąć pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje, w tym zale żności 
struktura-aktywno ść i dane dotycz ące podobnych chemikaliów (zob. pkt 3). 
W ramach badania ustalaj ącego zakres mo żna zweryfikowa ć/obalić punkty 
końcowe, które na podstawie modelu mechanistycznego uwa ża się za 
najczulsze, np. inhibicj ę pseudocholinesterazy przez zwi ązki fosforoorga ­
niczne, tworzenie methemoglobiny przez zwi ązki toksyczne dla erytrocytów, 
hormony tarczycy (T  3 , T 4 ) w odniesieniu do zwi ązków tyreotoksycznych, 
białka, LDH lub neutrofile w p łukaniu oskrzelowo-p ęcherzykowym 
w odniesieniu do nieszkodliwych s łabo rozpuszczalnych cz ąstek lub aerozoli 
mających dzia łanie drażniące na płuca. 
Badanie g łówne  
14. Główne badanie toksyczno ści podprzewlek łej na ogó ł obejmuje trzy 
poziomy st ężenia, a tak że w razie potrzeby równoleg łe ujemne (poddane 
działaniu powietrza) grupy kontrolne lub grupy kontrolne no śnika (zob. pkt 
18). Wszystkie dost ępne dane, w tym wyniki bada ń toksyczno ści ogólnou ­
strojowej, metabolizmu i kinetyki, powinny by ć wykorzystane jako pomoc 
w wyborze odpowiednich poziomów nara żenia (szczególn ą uwagę należy 
zwrócić na unikanie wysokich st ężeń, które prowadz ą do nasycenia 
procesów kinetycznych). W sk ład każdej badanej grupy wchodzi 10 samców 
i 10 samic gryzoni, które to zwierz ęta są narażane na dzia łanie badanej 
substancji chemicznej przez 6 godzin dziennie 5 dni w tygodniu przez okres 13 tygodni (ca łkowity czas trwania badania wynosi co najmniej 90 
dni). Zwierz ęta mogą być również poddawane nara żeniu przez 7 dni 
w tygodniu (np. podczas badania wziewnych produktów farmaceutycznych). Jeśli wiadomo, że jedna p łeć jest bardziej podatna na dzia łanie danej 
badanej substancji chemicznej, p łcie mogą być narażane na dzia łanie tej 
substancji przy ró żnych poziomach st ężenia, aby zoptymalizowa ć zależność 
stężenie-odpowied ź zgodnie z pkt 15. Je śli gatunki gryzoni inne ni ż szczury 
poddaje si ę narażeniu tylko przez nos, maksymalne okresy nara żenia można 
dostosowa ć, by zminimalizowa ć charakterystyczny dla danego gatunku 
stres. W przypadku stosowania okresu nara żenia krótszego ni ż 6 godzin 
dziennie lub gdy konieczne jest przeprowadzenie badania d ługotrwałego 
narażenia całego ciała (np. przez 22 godziny dziennie), nale ży przedstawi ć 
uzasadnienie (zob. GD 39) (2). W okresie nara żenia należy zaprzesta ć poda­
wania zwierz ętom paszy, chyba że okres ten przekracza 6 godzin. W trakcie 
okresu nara żenia całego ciała można podawa ć zwierzętom wodę. 
15. Wybrane st ężenia docelowe powinny oddzia ływać na organy docelowe 
i wykazywa ć wyraźną zależność stężenie-odpowied ź: 
— wysokie st ężenie powinno prowadzi ć do skutków toksycznych, ale nie 
powinno powodowa ć przewlek łych objawów lub śmiertelno ści, które 
uniemożliwiłyby miarodajn ą ocenę, 
— średnie stężenia powinny by ć zróżnicowane w celu osi ągnięcia stopnio ­
wania skutków toksycznych powodowanych przez st ężenie niskie 
i wysokie,  
— niskie st ężenie nie powinno dawa ć żadnych objawów toksyczno ści bądź 
niewielkie objawy.  
Uśmiercanie zwierz ąt w trakcie trwania do świadczenia  
16. Jeżeli planowane jest u śmiercanie zwierz ąt w trakcie trwania do świadczenia, 
liczba osobników na ka żdym poziomie nara żenia powinna by ć powiększona 
o liczbę zwierząt, którą planuje si ę uśmiercić przed zako ńczeniem badania. 
Należy podać uzasadnienie u śmiercania zwierz ąt w trakcie trwania do świad­
czenia oraz nale życie uwzgl ędnić te osobniki w analizach statystycznych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 425
 
Badanie satelitarne (badanie odwracalno ści) 
17. Badanie satelitarne (badanie odwracalno ści) może być wykorzystywane do 
obserwacji odwracalno ści, trwałości lub opó źnionego wyst ąpienia toksycz ­
ności przez odpowiednio d ługi okres po poddaniu dzia łaniu substancji, 
jednak przez nie mniej ni ż 14 dni. Grupy satelitarne (grupy w badaniu 
odwracalno ści) składają się z 10 samców i 10 samic poddanych nara żeniu 
równocze śnie ze zwierz ętami doświadczalnymi w badaniu g łównym. Grupy 
satelitarne (grupy w badaniu odwracalno ści) powinny by ć narażone na dzia ­ 
łanie badanej substancji chemicznej przy najwy ższym stężeniu, a w razie 
potrzeby nale ży zastosowa ć równoleg łe poddane dzia łaniu powietrza grupy 
kontrolne lub grupy kontrolne no śnika (zob. pkt 18).  
Zwierzęta z grupy kontrolnej  
18. Zwierz ęta z równoleg łej ujemnej (poddanej dzia łaniu powietrza) grupy 
kontrolnej powinny by ć traktowane w taki sam sposób jak zwierz ęta 
z grupy badanej, wyj ąwszy fakt, że są one nara żane na dzia łanie filtrowa ­
nego powietrza zamiast badanej substancji chemicznej. W przypadku gdy do 
ułatwienia wytworzenia atmosfery do świadczalnej stosowana jest woda lub 
inna substancja, do badania nale ży włączyć grupę kontrolną nośnika zamiast 
ujemnej (poddanej dzia łaniu powietrza) grupy kontrolnej. W miar ę możli­
wości wykorzystywanym no śnikiem powinna by ć woda. Je żeli 
w charakterze no śnika używana jest woda, zwierz ęta z grupy kontrolnej 
powinny by ć narażone na dzia łanie powietrza o takiej samej wilgotno ści 
względnej jak grupy nara żone na dzia łanie danej substancji. Wybór odpo ­
wiedniego no śnika powinien opiera ć się na właściwie przeprowadzonym 
badaniu wst ępnym lub danych historycznych. Je żeli toksyczno ść nośnika 
nie jest dobrze znana, kierownik badania mo że postanowi ć 
o zastosowaniu zarówno ujemnej (poddanej dzia łaniu powietrza) grupy 
kontrolnej, jak i grupy kontrolnej no śnika, lecz jest to zdecydowanie odra ­
dzane. Je śli dane historyczne wskazuj ą na to, że nośnik jest nietoksyczny, 
nie ma potrzeby stosowania ujemnej (poddanej dzia łaniu powietrza) grupy 
kontrolnej i nale ży jedynie wykorzysta ć grupę kontroln ą nośnika. Jeśli 
badanie wst ępne badanej substancji chemicznej zawartej w no śniku nie 
wskazuje na toksyczno ść, wynika z tego, że dany no śnik jest nietoksyczny 
przy badanym st ężeniu i że należy zastosowa ć grupę kontrolną tego nośnika.  
WARUNKI NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE SUBSTANCJI  
Stosowanie st ężeń 
19. Zwierz ęta są narażane na dzia łanie badanej substancji chemicznej w postaci 
gazu, pary, aerozolu lub ich mieszaniny. Stan fizyczny, który ma by ć przed­
miotem badania, zale ży od w łaściwości fizykochemicznych badanej 
substancji chemicznej, wybranych st ężeń lub formy fizycznej, która 
najprawdopodobniej b ędzie wyst ępować podczas post ępowania z badan ą 
substancją chemiczn ą i jej stosowania. Substancje chemiczne 
o charakterze higroskopijnym oraz chemicznie reaktywne nale ży badać 
w suchej atmosferze. Nale ży zachowa ć ostrożność, aby unikn ąć osiągnięcia 
stężenia wybuchowego. Cz ąstki stałe można poddawa ć procesom mecha ­
nicznym w celu zmniejszenia wielko ści cząstek. Dalsze wytyczne przedsta ­
wiono w GD 39 (2).  
Rozkład wielko ści cząstek 
20. W odniesieniu do wszystkich aerozoli oraz par, które mog ą skraplać się, 
tworząc aerozole, nale ży dokona ć klasyfikacji cz ąstek wed ług wielko ści. 
W celu umo żliwienia nara żenia wszystkich odpowiednich cz ęści dróg odde ­
chowych na dzia łanie danej substancji zalecane s ą aerozole o średnicy aero ­
dynamicznej mediany rozk ładu masowego (MMAD) wynosz ącej od 1 do 
3 μm przy geometrycznym standardowym odchyleniu ( σ g ) równym od 1,5 
do 3,0 (4). Nale ży dołożyć uzasadnionych stara ń, aby spe łnić tę normę, 
jednak w razie niemo żności jej osi ągnięcia trzeba przedstawi ć specjalis ­
tyczną opinię. Na przyk ład cząstki par metali b ędą mniejsze od tej normy, 
a naładowane cz ąstki i włókna mog ą ją przekracza ć. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 426
 
Przygotowywanie badanej substancji chemicznej w no śniku  
21. Najlepiej by łoby, gdyby badana substancja chemiczna by ła analizowana bez 
nośnika. Jeżeli w celu osi ągnięcia odpowiedniego st ężenia i wielko ści 
cząstek badanej substancji chemicznej konieczne jest stosowanie no śnika, 
preferowanym no śnikiem powinna by ć woda. Zawsze kiedy badana 
substancja chemiczna jest rozpuszczona w no śniku, nale ży wykaza ć jej 
stabilność. 
MONITOROWANIE WARUNKÓW NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE 
SUBSTANCJI  
Przepływ powietrza w komorze  
22. Przep ływ powietrza przez komor ę inhalacyjn ą powinien by ć dokładnie 
kontrolowany, monitorowany w sposób ci ągły i rejestrowany przynajmniej 
co godzin ę podczas ka żdego nara żenia. Monitorowanie w czasie rzeczy ­
wistym st ężenia (lub jego czasowej stabilno ści) badanej substancji 
w atmosferze do świadczalnej jest ca łościowym pomiarem wszystkich para ­
metrów dynamicznych i stanowi po średni sposób kontrolowania wszystkich 
istotnych dynamicznych parametrów inhalacyjnych. Je śli stężenie jest moni ­
torowane w czasie rzeczywistym, cz ęstotliwość pomiaru przep ływu 
powietrza mo że być zmniejszona do jednego pomiaru dziennie na nara żenie. 
Szczególn ą uwagę należy zwróci ć na unikanie ponownego wdychania 
w komorach s łużących do nara żania tylko przez nos. St ężenie tlenu powinno 
wynosić co najmniej 19 %, a st ężenie dwutlenku w ęgla nie powinno prze ­
kraczać 1 %. Jeżeli istnieją powody, by przypuszcza ć, że norma ta nie mo że 
zostać osiągnięta, należy mierzy ć stężenia tlenu i dwutlenku w ęgla. Jeśli 
w pierwszym dniu nara żenia pomiary wyka żą, że stężenia tych gazów s ą 
odpowiednie, dalsze pomiary nie powinny by ć konieczne.  
Temperatura i wilgotno ść względna w komorze  
23. Temperatura w komorze powinna by ć utrzymywana na poziomie 22 ± 3 °C. 
Wilgotno ść względna w strefie oddychania zwierz ąt powinna by ć stale 
monitorowana i rejestrowana co godzin ę podczas ka żdego nara żenia, jeżeli 
to możliwe, zarówno w przypadku nara żenia tylko przez nos, jak i nara żenia 
całego ciała. Wilgotno ść względna powinna by ć utrzymywana w przedziale 
od 30 do 70 %, lecz mo że to być albo nieosi ągalne (np. przy badaniu 
mieszanin na bazie wody), albo niemierzalne z powodu interferencji badanej 
substancji chemicznej z metod ą badawcz ą. 
Badana substancja chemiczna: st ężenie nominalne  
24. Stężenie nominalne w komorze inhalacyjnej powinno by ć obliczane 
i rejestrowane, gdy tylko jest to mo żliwe. Stężenie nominalne to masa 
wprowadzonej badanej substancji chemicznej podzielona przez ca łkowitą 
objętość powietrza przepuszczonego przez system komory inhalacyjnej. 
Stężenie nominalne nie s łuży do charakteryzowania nara żenia zwierz ąt, 
lecz porównanie st ężenia nominalnego i st ężenia rzeczywistego umo żliwia 
określenie w przybli żeniu efektywno ści układu badawczego, a tym samym 
może być używane do wykrywania problemów z funkcjonowaniem tego 
układu. 
Badana substancja chemiczna: st ężenie rzeczywiste  
25. Stężenie rzeczywiste to st ężenie badanej substancji chemicznej w próbkach 
pobranych w strefie oddychania zwierz ąt w komorze inhalacyjnej. St ężenie 
rzeczywiste mo żna obliczy ć za pomoc ą metod specyficznych (np. 
bezpośredniego pobierania próbek, metod adsorpcyjnych lub 
z wykorzystaniem reaktywno ści chemicznej, a nast ępnie charakterystyki 
analitycznej) lub metod niespecyficznych, takich jak analiza grawimetryczna przy zastosowaniu filtra. Zastosowanie metody grawimetrycznej jest dopusz ­
czalne tylko w przypadku jednosk ładnikowych aerozoli proszkowych lub 
aerozoli cieczy o niskiej lotno ści i powinno by ć poparte odpowiedni ą
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 427
 
charakterystyk ą badanej substancji chemicznej opracowan ą przed badaniem. 
Stężenie wielosk ładnikowego aerozolu proszkowego tak że można określić 
za pomoc ą metody grawimetrycznej. Wymaga to jednak danych analitycz ­
nych, które dowodz ą, że skład materia łu w powietrzu jest podobny do 
materiału wyjściowego. Je śli te informacje nie s ą dostępne, konieczna 
może być ponowna analiza badanej substancji chemicznej (najlepiej 
w stanie zawieszonym w powietrzu) w regularnych odst ępach czasu 
w trakcie trwania badania. W przypadku środków w aerozolu, które mog ą 
parować lub sublimowa ć, należy wykaza ć, że wszystkie fazy zebrano przy 
użyciu wybranej metody.  
26. O ile to mo żliwe, przez ca ły czas trwania badania nale ży używać jednej 
partii badanej substancji chemicznej, a badana próbka powinna by ć prze­
chowywana w warunkach zapewniaj ących zachowanie jej czysto ści, jedno­
rodności i stabilno ści. Przed rozpocz ęciem badania nale ży scharakteryzowa ć 
badaną substancj ę chemiczn ą, w tym okre ślić jej czysto ść oraz, jeżeli jest to 
technicznie mo żliwe, tożsamość i ilości zidentyfikowanych domieszek 
i zanieczyszcze ń. Można to przedstawi ć m.in. za pomoc ą następujących 
danych: czasu retencji i wzgl ędnej powierzchni sygna łu, masy cz ąstecz­
kowej uzyskanej w drodze spektrometrii masowej lub chromatografii 
gazowej b ądź innych oszacowa ń. Mimo że oznaczenie to żsamości badanej 
próbki nie nale ży do obowi ązków laboratorium badawczego, rozs ądne może 
być potwierdzenie przez to laboratorium charakterystyki, któr ą przedstawi ł 
sponsor, przynajmniej w ograniczonym zakresie (np. co do koloru, cech 
fizycznych itp.).  
27. Podczas badania nale ży utrzymywa ć możliwie niezmienn ą atmosfer ę. 
W celu wykazania stabilno ści warunków nara żenia można wykorzysta ć 
urządzenie umo żliwiające monitorowanie w czasie rzeczywistym, takie jak 
fotometr w przypadku aerozoli lub analizator w ęglowodorów ca łkowitych 
w przypadku par. St ężenie rzeczywiste w komorze powinno by ć mierzone 
co najmniej 3 razy w ci ągu każdego dnia nara żenia dla ka żdego poziomu 
narażenia. Jeśli nie jest to mo żliwe ze wzgl ędu na ograniczone nat ężenie 
przepływu powietrza lub niskie st ężenie, dopuszczalne jest pobieranie jednej 
próbki na okres nara żenia. Najlepiej by łoby, gdyby w takim przypadku 
próbka by ła pobierana przez ca ły okres nara żenia. Warto ści stężeń 
w komorze dla poszczególnych próbek nie powinny odbiega ć od średniego 
stężenia w komorze o wi ęcej niż ± 10 % dla gazów i par oraz o wi ęcej niż 
± 20 % dla aerozoli ciek łych lub sta łych. Nale ży obliczy ć i podać okres 
wyrównania st ężeń w komorze (t  95 ). Czas trwania nara żenia obejmuje czas 
wprowadzania badanej substancji chemicznej do komory. Uwzgl ędnia się 
w tym okres wyrównania st ężeń w komorze (t  95 ) i czas rozpadu. Wytyczne 
dotyczące szacowania t  95 można znaleźć w GD 39 (2).  
28. W przypadku bardzo z łożonych mieszanin sk ładających się z gazów/par 
i aerozoli (np. w przypadku atmosfery spalania i badanych substancji 
chemicznych wydzielanych ze specjalnych produktów/urz ądzeń do zastoso ­
wania ko ńcowego) ka żda faza mo że zachowywa ć się inaczej w komorze 
inhalacyjnej. W zwi ązku z tym nale ży wybrać co najmniej jedn ą substancj ę 
wskaźnikową (analit) ka żdej fazy (gaz/pary i aerozol), zwykle g łówny 
składnik aktywny w mieszaninie. Je żeli badana substancja chemiczna jest 
mieszanin ą, należy podać stężenie analityczne w odniesieniu do ca łej 
mieszaniny, a nie tylko sk ładnika aktywnego lub substancji wska źnikowej 
(analitu). Dodatkowe informacje na temat st ężeń rzeczywistych mo żna 
znaleźć w GD 39 (2).  
Badana substancja chemiczna: rozk ład wielko ści cząstek 
29. Rozkład wielko ści cząstek aerozoli nale ży określać co najmniej raz 
w tygodniu w odniesieniu do ka żdego poziomu st ężenia za pomoc ą impak­
tora kaskadowego lub innego instrumentu takiego jak aerodynamiczny spek ­
trometr pomiaru cz ąstek. Jeżeli można wykaza ć równowa żność wyników 
uzyskanych za po średnictwem impaktora kaskadowego i innego instrumentu, 
to ten inny instrument mo że być stosowany przez ca ły okres badania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 428
 
30. W celu potwierdzenia sprawno ści zatrzymywania cz ąstek przez instrument 
główny nale ży równolegle do tego instrumentu stosowa ć drugie urz ądzenie, 
takie jak filtr grawimetryczny lub odpylacz/be łkotka. Stężenie masowe uzys ­
kane na podstawie analizy wielko ści cząstek powinno mie ścić się 
w rozsądnych granicach st ężenia masowego uzyskanego poprzez analiz ę 
filtrów [zob. GD 39 (2)]. Dalsze pomiary potwierdzaj ące można pomin ąć, 
jeśli można wykaza ć równowa żność w odniesieniu do wszystkich st ężeń 
badanych w pocz ątkowej fazie badania. Ze wzgl ędu na dobrostan zwierz ąt 
należy podjąć środki maj ące na celu zminimalizowanie ilo ści danych niejed ­
noznacznych, które mog ą spowodowa ć konieczno ść powtórzenia badania.  
31. Klasyfikacj ę cząstek według wielko ści należy przeprowadzi ć w odniesieniu 
do par, je żeli istnieje jakakolwiek mo żliwość tworzenia si ę aerozolu 
wskutek kondensacji par lub je śli cząstki są wykrywane w atmosferze 
parowej maj ącej potencja ł tworzenia faz mieszanych.  
OBSERWACJE  
32. Zwierz ęta powinny by ć poddane obserwacji klinicznej przed okresem nara ­ 
żenia, w jego trakcie i po nim. W zale żności od reakcji zwierz ąt podczas 
narażenia wskazane mo że być częstsze dokonywanie obserwacji. Je żeli 
obserwacja zwierz ąt jest utrudniona wskutek zastosowania rur unierucha ­
miających zwierz ęta, słabo oświetlonych komór do nara żania całego ciała 
lub nieprzejrzysto ści powietrza, zwierz ęta powinny by ć uważnie obserwo ­
wane po nara żeniu. W ramach obserwacji przed kolejnym dniem nara żenia 
można ocenić odwracalno ść lub nasilenie skutków toksycznych.  
33. Wszystkie obserwacje s ą systematycznie zapisywane, przy czym 
w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia prowadzone s ą indywidualne rejestry. 
W przypadku u śmiercenia zwierz ąt z przyczyn humanitarnych lub stwier ­
dzenia u nich zgonu nale ży możliwie jak najdok ładniej zapisa ć czas zgonu.  
34. Obserwacje zwierz ąt w klatkach powinny obejmowa ć zmiany skóry i sier ści, 
oczu i błon śluzowych; zmiany w uk ładzie oddechowym i uk ładzie krąże­
nia; zmiany w uk ładzie nerwowym oraz zmiany w aktywno ści somatycznej 
i sposobie zachowania. Nale ży poświęcić uwagę obserwacjom dr żenia, 
konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Pomiar temperatury 
w odbycie mo że dostarczy ć dodatkowych dowodów odruchowego spowol ­
nienia oddechu lub hipo-/hipertermii w zwi ązku z poddawaniem dzia łaniu 
substancji lub przetrzymywaniem w zamkni ęciu. W protokole badania 
można uwzgl ędnić dodatkowe oceny, takie jak dotycz ące: kinetyki, biomo ­
nitoringu, czynno ści płuc, zatrzymywania s łabo rozpuszczalnych substancji, 
które gromadz ą się w tkance p łuc, oraz zmian w zachowaniu.  
MASA CIA ŁA 
35. Masę ciała poszczególnych zwierz ąt należy odnotowa ć tuż przed pierwszym 
narażeniem (dzie ń 0), następnie dwa razy w tygodniu (na przyk ład w piątki 
i poniedzia łki, aby wykaza ć zdrowienie przez weekend, kiedy nie dochodzi 
do narażenia, lub w odst ępach czasu pozwalaj ących na ocen ę toksyczno ści 
ogólnoustrojowej) oraz w chwili zgonu lub eutanazji. Je żeli w ciągu pierw­
szych 4 tygodni nie wyst ąpią żadne skutki, przez pozosta ły czas badania 
masę ciała można mierzy ć co tydzie ń. Zwierzęta z grupy satelitarnej (grupy 
w badaniu odwracalno ści) (jeżeli są wykorzystywane) nale ży ważyć co 
tydzień przez cały okres zdrowienia. Na koniec badania wszystkie zwierz ęta 
należy zważyć tuż przed u śmierceniem, aby umo żliwić obiektywne obli ­
czenie stosunku masy poszczególnych organów do masy cia ła. 
SPOŻYCIE POKARMU I WODY  
36. Spożycie pokarmu nale ży mierzyć raz w tygodniu. Spo życie wody równie ż 
można mierzy ć. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
PATOLOGIA KLINICZNA  
37. Oceny z zakresu patologii klinicznej nale ży przeprowadza ć dla wszystkich 
zwierząt, w tym zwierz ąt z grupy satelitarnej (grupy w badaniu odwracal ­
ności), gdy s ą one uśmiercane. Nale ży odnotowa ć odstęp czasu pomi ędzy 
zakończeniem nara żenia a pobraniem krwi, szczególnie gdy odtworzenie 
danego punktu ko ńcowego jest szybkie. Pobranie próbek po zako ńczeniu 
narażenia wskazane jest w przypadku tych parametrów, które charakteryzuj ą 
się krótkim okresem pó łtrwania w osoczu (np. COHb, CHE i MetHb).  
38. Tabela 1 zawiera wykaz parametrów analizy patologicznej, które s ą na ogół 
wymagane we wszystkich badaniach toksykologicznych. Badanie moczu nie jest wymagane jako badanie rutynowe, lecz mo że być wykonane, gdy 
zostanie to uznane za przydatne na podstawie spodziewanej lub obserwowanej 
toksyczno ści. Kierownik badania mo że postanowi ć o ocenie dodatkowych 
parametrów, aby lepiej scharakteryzowa ć toksyczno ść badanej substancji 
chemicznej (np. pseudocholinesterazy, lipidów, hormonów, równowagi 
kwasowo-zasadowej, methemoglobiny lub cia łek Heinza, kinazy kreatynowej, 
stosunku komórek mieloidalnych do erytroidalnych, troponiny, gazów krwi tętniczej, dehydrogenazy mleczanowej, dehydrogenazy sorbitolowej, dehydro ­
genazy glutaminianowej oraz gamma-glutamylotranspeptydazy).
 
Tabela 1  
Standardowe parametry analizy patologicznej  
Hematologia  
Liczba czerwonych krwinek 
Hematokryt 
Stężenie hemoglobiny 
Średnia masa hemoglobiny w krwince 
czerwonej 
Średnia obj ętość krwinki czerwonej 
Średnie st ężenie hemoglobiny 
w krwince czerwonej 
Retikulocyty Całkowita liczba leukocytów 
Różnicowa liczba leukocytów 
Liczba płytek krwi 
Krzepliwo ść (wybra ć jedną 
opcję): 
— Czas protrombinowy 
— Czas krzepni ęcia 
— Czas cz ęściowej trombopla ­
styny po aktywacji  
Chemia kliniczna  
Glukoza (*) 
Cholesterol ca łkowity 
Trójglicerydy Azot mocznikowy we krwi 
Bilirubina ca łkowita 
Kreatynina Białko całkowite 
Albumina 
Globulina Aminotransferaza alaninowa 
Aminotransferaza asparaginia ­
nowa 
Fosfataza alkaliczna 
Potas 
Sód Wapń 
Fosfor 
Chlorek
 
Badanie moczu (opcjonalne)  
Wygląd (barwa i m ętność) 
Objętość 
Ciężar właściwy lub osmolalno ść 
pH Białko całkowite 
Glukoza Krew/komórki krwi
 
(*) Poniewa ż długi okres wstrzymywania podawania pokarmu mo że prowadzi ć do 
błędów systematycznych w pomiarach glukozy u zwierz ąt poddawanych dzia łaniu 
substancji w porównaniu ze zwierz ętami z grupy kontrolnej, kierownik badania 
powinien zdecydowa ć, czy wstrzymanie karmienia zwierz ąt jest właściwe. Jeżeli 
stosowane jest wstrzymanie podawania pokarmu, jego okres powinien by ć odpo­
wiedni dla wykorzystywanych gatunków zwierz ąt; w przypadku szczura mo że to 
być 16 h (niekarmienie przez noc). Oznaczenie glukozy na czczo mo żna przepro ­
wadzić po wstrzymaniu podawania po żywienia przez ca łą noc w ci ągu ostatniego 
tygodnia nara żenia lub po ca łonocnym niekarmieniu przed sekcj ą zwłok (w tym 
ostatnim przypadku wraz z pomiarem wszystkich innych parametrów analizy 
patologicznej).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Jeżeli istniej ą dowody na to, że dolne drogi oddechowe (tj. p ęcherzyki 
płucne) są głównym miejscem osadzania si ę i zatrzymywania danej substan ­
cji, preferowan ą techniką ilościowej analizy hipotetycznych parametrów 
efektu dawki zwi ązanych z zapaleniem p ęcherzyków p łucnych, zapaleniem 
płuc i fosfolipidoz ą może być płukanie oskrzelowo-p ęcherzykowe. Umo ż­
liwia to w łaściwe zbadanie zale żności dawka-odpowied ź i zmian uszkodze ń 
pęcherzyków p łucnych w funkcji czasu. Pop łuczyny 
oskrzelowo-p ęcherzykowe mo żna bada ć pod k ątem ca łkowitej 
i różnicowej liczby leukocytów, bia łka całkowitego oraz dehydrogenazy 
mleczanowej. Innymi parametrami, które mo żna wziąć pod uwag ę, są te, 
które wskazuj ą na uszkodzenia lizosomów, fosfolipidoz ę, zwłóknienie oraz 
stan zapalny wskutek podra żnienia lub stan alergiczny, który mo że 
wymagać oznaczenia cytokin/chemokin prozapalnych. Pomiary pop łuczyn 
oskrzelowo-p ęcherzykowych na ogó ł uzupełniają wyniki bada ń histopatolo ­
gicznych, lecz nie mog ą ich zastępować. Wytyczne dotycz ące przeprowa ­
dzania płukania oskrzelowo-p ęcherzykowego mo żna znaleźć w GD 39 (2).  
BADANIE OFTALMOLOGICZNE  
40. Badania oftalmologiczne dna oka, refrakcji, t ęczówki i spojówki powinny 
być przeprowadzane za pomoc ą oftalmoskopu lub równowa żnego 
urządzenia u wszystkich zwierz ąt przed podaniem badanej substancji 
chemicznej, a w przypadku wszystkich grup otrzymuj ących wysokie 
stężenie substancji i kontrolnych na zako ńczenie badania. W przypadku 
wykrycia zmian w oczach nale ży przebada ć wszystkie zwierz ęta 
w pozosta łych grupach, w tym w grupie satelitarnej (grupie w badaniu 
odwracalno ści). 
WYRAŹNE ZMIANY PATOLOGICZNE I MASA ORGANÓW  
41. Wszystkie badane zwierz ęta, w tym te, które pad ły podczas badania lub 
zostały wyeliminowane z badania ze wzgl ędu na ich dobrostan, powinny 
zostać poddane ca łkowitemu wykrwawieniu (je żeli to mo żliwe) i pe łnemu 
rozpoznaniu histopatologicznemu. Nale ży odnotowa ć czas pomi ędzy zakoń­
czeniem ostatniego nara żenia każdego zwierz ęcia a jego u śmierceniem. 
Jeżeli sekcji zw łok nie mo żna przeprowadzi ć natychmiast po znalezieniu 
martwego zwierz ęcia, zwierz ę należy schłodzić (nie zamrozi ć) do tempera ­
tury wystarczaj ąco niskiej do zminimalizowania autolizy. Sekcj ę zwłok 
należy przeprowadzi ć możliwie szybko, zwykle w ci ągu dnia lub dwóch. 
W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia należy zarejestrowa ć wszystkie 
makroskopowe zmiany patologiczne ze szczególnym uwzgl ędnieniem 
wszelkich zmian w drogach oddechowych.  
42. Tabela 2 zawiera wykaz organów i tkanek, które nale ży zachowa ć 
w odpowiednim środku w trakcie pe łnego rozpoznania histopatologicznego 
na potrzeby badania histopatologicznego. Organy i tkanki  [wymienione 
w nawiasach kwadratowych ] oraz wszelkie inne organy i tkanki mo żna 
zachować według uznania kierownika badania. Organy wymienione  
czcionką pogrubion ą należy okroić i zważyć w stanie wilgotnym 
niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu unikni ęcia wyschni ęcia. 
Tarczycę i najądrza nale ży zważyć wyłącznie wówczas, gdy jest to 
konieczne, poniewa ż okrajanie artefaktów mo że utrudnić ocenę histopatolo ­
giczną. Tkanki i organy nale ży utrwali ć w 10 % roztworze buforowanej 
formaliny lub innej odpowiedniej substancji utrwalaj ącej niezw łocznie po 
przeprowadzeniu sekcji zw łok i nie pó źniej niż na 24–48 godzin przed 
okrojeniem, w zale żności od stosowanej substancji utrwalaj ącej. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 431
 
Tabela 2  
Organy i tkanki zachowywane w trakcie pe łnego rozpoznania histopatologicznego  
Nadnercza  
Aorta  
Szpik kostny (lub świeży aspirat)  
Mózg  (w tym wycinki kresomózgowia, 
móżdżku i rdzenia/mostu)  
Jelito ślepe 
Okrężnica 
Dwunastnica  
[Najądrza]  
[Oczy (siatkówka, nerw wzrokowy) 
i powieki]  
Kość udowa i staw kolanowy  
Woreczek żółciowy (je żeli występuje)  
[Gruczoły przyoczne]  
Serce  
Jelito kręte 
Jelito czcze  
Nerki  
[Gruczoły łzowe (zewn ątrzoczodo łowe)]  
Krtań (3 poziomy, w tym podstawa nag łośni) 
Wątroba  
Płuco (wszystkie p łaty na jednym poziomie, 
w tym oskrzela g łówne)  
Węzły chłonne z okolicy wn ęki płuca, szcze ­
gólnie w przypadku bada ń słabo rozpuszczal ­
nych badanych substancji chemicznych mających posta ć cząstek stałych. Na potrzeby 
bardziej pog łębionych bada ń lub bada ń 
immunologicznych mo żna wziąć pod uwag ę 
dodatkowe w ęzły chłonne, np. z cz ęści śród­
piersiowej, szyjnej/pod żuchwowej lub usznej
 
Węzły chłonne (dystalne w stosunku do wrót 
zakażenia)  
Gruczoł mlekowy (u samic)  
Mięsień (udo)  
Tkanki nosogard ła (co najmniej 4 poziomy; 1 
poziom ma obejmowa ć przewód 
nosowo-gard łowy i tkank ę limfatyczn ą 
związaną ze śluzówką nosa (NALT))  Przełyk 
[Opuszka w ęchowa]  
Jajniki  
Trzustka  
Przytarczyce  
Nerw obwodowy (kulszowy lub piszcze ­
lowy, najlepiej blisko mi ęśnia) 
Przysadka  
Prostata  
Odbytnica  
Gruczoły ślinowe  
Pęcherzyki nasienne  
Skóra  
Rdzeń kręgowy (odcinek szyjny, śródpier­
siowy i l ędźwiowy)  
Śledziona  
Mostek  
Żołądek 
Zęby 
Jądra 
Grasica  
Tarczyca  
[Język] 
Tchawica (co najmniej 2 wycinki, w tym 1 
wycinek pobrany pod łużnie poprzez ostrog ę 
i 1 wycinek pobrany poprzecznie)  
[Moczowód]  
[Cewka moczowa]  
Pęcherz moczowy  
Macica  
Organy docelowe  
Wszystkie makroskopowe zmiany patolo ­
giczne i masy  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Płuca należy usunąć w stanie nienaruszonym, zwa żyć i zaaplikowa ć odpo­
wiednią substancj ę utrwalaj ącą pod ciśnieniem 20–30 cm wody celem 
zapewnienia utrzymania ich struktury (5). Wycinki nale ży pobrać dla 
wszystkich p łatów na jednym poziomie, w tym z oskrzeli g łównych, lecz 
w przypadku przeprowadzania p łukania oskrzelowo-p ęcherzykowego 
z nieprzep łukanego p łatu należy pobrać wycinki na trzech poziomach (nie 
szeregowo).  
44. Nale ży zbadać co najmniej 4 poziomy tkanek nosogard ła, z których jeden 
powinien obejmowa ć przewód nosowo-gard łowy (5) (6) (7) (8) (9), aby 
umożliwić odpowiednie zbadanie nab łonka płaskiego, przej ściowego (odde ­
chowego nieurz ęsionego), oddechowego (oddechowego urz ęsionego) 
i węchowego, a tak że tkanki limfatycznej zwi ązanej ze śluzówką 
nosa (NALT) (10) (11). Nale ży zbadać trzy poziomy krtani, a jeden 
z tych poziomów powinien obejmowa ć podstaw ę nagłośni (12). Nale ży 
zbadać co najmniej dwa poziomy tchawicy, w tym pobra ć jeden wycinek 
pobrany pod łużnie przez ostrog ę rozgałęzienia oskrzeli pozap łucnych i jeden 
wycinek pobrany poprzecznie.  
HISTOPATOLOGIA  
45. Ocen ę histopatologiczn ą wszystkich organów i tkanek wymienionych 
w tabeli 2 nale ży przeprowadzi ć w odniesieniu do grupy kontrolnej 
i grupy otrzymuj ącej wysokie st ężenie substancji, a tak że wszystkich 
zwierząt, które pad ły lub zosta ły uśmiercone podczas badania. Szczególn ą 
uwagę należy zwróci ć na drogi oddechowe, organy docelowe 
i makroskopowe zmiany patologiczne. Organy i tkanki zwierz ąt z grupy 
otrzymującej wysokie st ężenie substancji, w których stwierdzono zmiany 
patologiczne, nale ży zbadać we wszystkich grupach. Kierownik badania 
może postanowi ć o przeprowadzeniu ocen histopatologicznych dodatkowych 
grup, aby wykaza ć wyraźną zależność stężenie-odpowied ź. Jeśli używa się 
grupy satelitarnej (grupy w badaniu odwracalno ści), należy przeprowadzi ć 
ocenę histopatologiczn ą wszystkich tkanek i organów, w których stwier ­
dzono skutki podania substancji w grupach otrzymuj ących substancj ę 
badaną. W przypadku wyst ępowania nadmiernej liczby wczesnych zgonów 
lub innych problemów w grupie poddawanej wysokiemu nara żeniu, które 
negatywnie wp ływają na istotno ść danych, badania histopatologiczne nale ży 
przeprowadzi ć w grupie otrzymuj ącej daną substancj ę o kolejnym, ni ższym 
stężeniu. Nale ży podjąć próbę skorelowania wyników ca łości obserwacji 
z wynikami bada ń mikroskopowych.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
46. W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia należy przedstawi ć dane dotycz ące 
masy ciała, spożycia pokarmu, patologii klinicznej, wyra źnych zmian pato ­
logicznych, masy organów i histopatologii. Dane z obserwacji klinicznych 
należy zestawi ć w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do ka żdej 
badanej grupy liczb ę wykorzystanych zwierz ąt, liczbę zwierząt wykazuj ­ 
ących specyficzne oznaki toksyczno ści, liczbę zwierząt padłych w trakcie 
trwania badania lub u śmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu 
poszczególnych zwierz ąt, opis skutków toksycznych oraz ich przebieg 
w czasie i odwracalno ść, a także wyniki sekcji zw łok. Wszystkie wyniki 
ilościowe i dodatkowe nale ży ocenić za pomoc ą właściwej metody staty ­
stycznej. Mo żna zastosowa ć dowolną ogólnie przyj ętą metodę statystyczn ą, 
przy czym wyboru metod statystycznych nale ży dokona ć podczas przygo ­
towywania projektu badania.  
Sprawozdanie z badania  
47. Sprawozdanie z badania powinno w stosownych przypadkach zawiera ć 
następujące informacje:  
Badane zwierz ęta i ich hodowla  
— opis warunków przetrzymywania w klatkach, w tym: liczba (lub zmiana 
liczby) zwierz ąt na klatk ę, ściółka, temperatura otoczenia i wilgotno ść 
względna, fotoperiod i okre ślenie diety,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie zastosowania gatunków 
innych ni ż szczur. Mo żna przedstawi ć źródło i dane historyczne, je żeli 
dotyczą one zwierz ąt poddanych podobnemu nara żeniu oraz warunkom 
przebywania i żywieniowym,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— metoda randomizacji,  
— opis wszelkich przygotowa ń przed badaniem, w tym diety, kwarantanny 
i leczenia chorób.  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść oraz w stosownych przypadkach w łaściwości 
fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),  
— dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract 
Services (CAS), je żeli jest znany.  
Nośnik 
— uzasadnienie zastosowania no śnika oraz uzasadnienie wyboru no śnika 
(jeżeli jest inny ni ż woda),  
— dane historyczne lub równoleg łe, wykazuj ące, że nośnik nie zak łóca 
wyniku badania.  
Komora inhalacyjna  
— szczegó łowy opis komory inhalacyjnej, w tym jej rozmiary i schemat,  
— źródło i opis wyposa żenia wykorzystywanego do celów nara żenia, jak 
również do wytwarzania atmosfery,  
— wyposa żenie do pomiaru temperatury, wilgotno ści, rozmiaru cz ąstek 
i stężenia rzeczywistego,  
— źródło powietrza i system klimatyzacji,  
— metody kalibracji wyposa żenia w celu zapewnienia jednorodnej atmos ­
fery na potrzeby badania,  
— różnica ciśnienia (dodatnia lub ujemna),  
— porty nara żenia w komorze (nara żenie tylko przez nos); lokalizacja 
zwierząt w komorze (nara żenie całego ciała), 
— stabilno ść atmosfery do świadczalnej,  
— lokalizacja czujników temperatury i wilgotno ści oraz pobieranie próbek 
powietrza w komorze,  
— oczyszczanie dostarczanego/odprowadzanego powietrza,  
— natężenie przep ływu powietrza, nat ężenie przep ływu powietrza/port 
narażenia (nara żenie tylko przez nos) lub ładunek zwierz ąt/komorę 
(narażenie całego ciała), 
— okres wyrównania st ężeń w komorze inhalacyjnej (t  95 ), 
— liczba zmian obj ętości na godzin ę, 
— urządzenia pomiarowe (w stosownych przypadkach).  
Dane dotycz ące narażenia 
— uzasadnienie wyboru docelowego st ężenia w badaniu g łównym,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— stężenia nominalne (ca łkowita masa badanej substancji chemicznej 
wprowadzonej do komory inhalacyjnej podzielona przez obj ętość 
powietrza przepuszczonego przez komor ę), 
— rzeczywiste st ężenia badanej substancji chemicznej w próbkach ze strefy 
oddychania zwierz ąt; w przypadku mieszanin, które tworz ą heteroge ­
niczne formy fizyczne (gazy, pary, aerozole), ka żdą substancj ę można 
przeanalizowa ć oddzielnie,  
— wszystkie st ężenia substancji w powietrzu nale ży podawa ć 
w jednostkach masy (mg/l, mg/m  3 itd.), a nie w jednostkach obj ętości 
(ppm, ppb itd.),  
— rozkład wielko ści cząstek, średnica aerodynamiczna mediany rozk ładu 
masowego (MMAD) oraz geometryczne standardowe odchylenie ( σ g ), 
w tym metody ich obliczania. Nale ży odnotowa ć poszczególne analizy 
wielkości cząstek. 
Warunki badania  
— szczegó łowe informacje na temat przygotowania badanej substancji 
chemicznej, w tym szczegó ły dotyczące wszelkich procedur zastosowa ­
nych w celu zmniejszenia rozmiaru cz ąstek ciał stałych lub przygoto ­
wania roztworów badanej substancji chemicznej,  
— opis (najlepiej wraz ze schematem) wyposa żenia wykorzystywanego do 
wytworzenia atmosfery na potrzeby badania i nara żania zwierz ąt na jej 
działanie,  
— szczegó łowe informacje na temat wyposa żenia stosowanego do monito ­
rowania temperatury, wilgotno ści i przep ływu powietrza w komorze (tj. 
opracowanie krzywej kalibracyjnej),  
— szczegó łowe informacje na temat wyposa żenia stosowanego do pobie ­
rania próbek na potrzeby okre ślenia stężenia w komorze i rozk ładu 
wielkości cząstek, 
— szczegó łowe informacje na temat zastosowanej metody analizy 
chemicznej oraz walidacji metody (w tym wydajno ść odzysku badanej 
substancji chemicznej ze środka do pobierania próbek),  
— metoda randomizacji przypisywania zwierz ąt do grupy badanej i grupy 
kontrolnej,  
— szczegó łowe informacje na temat jako ści pożywienia i wody (w łączając 
w to rodzaj/ źródło diety oraz źródło wody),  
— uzasadnienie wyboru badanych st ężeń. 
Wyniki  
— tabelaryczne zestawienie temperatury, wilgotno ści i przep ływu powietrza 
w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących nominalnego 
i rzeczywistego st ężenia w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących rozmiaru cz ąstek, w tym 
danych dotycz ących gromadzenia próbek analitycznych, rozk ładu wiel­
kości cząstek oraz obliczenia MMAD i σ g , 
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących reakcji i poziomu st ężenia 
dla każdego zwierz ęcia (tj. zwierz ąt wykazuj ących oznaki toksyczno ści, 
w tym śmiertelno ść, rodzaj, ostro ść, czas pojawienia si ę i czas trwania 
objawów),  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— tabelaryczne zestawienia masy poszczególnych zwierz ąt, 
— tabelaryczne zestawienia spo życia pokarmu,  
— tabelaryczne zestawienie danych z zakresu patologii klinicznej,  
— wyniki sekcji zw łok oraz bada ń histopatologicznych w odniesieniu do 
każdego zwierz ęcia, jeżeli są dostępne. 
Omówienie i interpretacja wyników  
— szczególny nacisk nale ży położyć na opis metod zastosowanych w celu 
spełnienia kryteriów niniejszej metody badawczej, np. dotycz ących 
stężenia granicznego lub rozmiaru cz ąstek, 
— należy uwzględnić respirabilno ść cząstek w świetle wyników ogólnych, 
szczególnie je żeli nie mo żna było spełnić kryterium rozmiaru cz ąstek, 
— w ogólnej ocenie badania nale ży uwzględnić spójność metod zastoso ­
wanych w celu okre ślenia nominalnego i rzeczywistego st ężenia oraz 
relacji mi ędzy stężeniem rzeczywistym a nominalnym,  
— należy uwzględnić prawdopodobn ą przyczyn ę zgonu i dominuj ący 
sposób dzia łania (ogólnoustrojowy w porównaniu z miejscowym),  
— należy przedstawi ć wyjaśnienie, je żeli zaistnia ła konieczno ść humanitar ­
nego uśmiercenia zwierz ąt wykazuj ących oznaki bólu lub objawy ostrego 
i przewlek łego stresu, zgodnie z kryteriami zawartymi w wytycznych 
OECD dotycz ących humanitarnego punktu ko ńcowego (3),  
— należy określić organy docelowe,  
— należy określić NOAEL i LOAEL.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing , pierwotna wersja 
dotyczącej badań wytycznej OECD nr 413, Dyrekcja ds. Środowiska, 
OECD, Pary ż. 
(2) OECD (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing,  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pary ż. 
(3) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment nr 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paryż.
 
(4) Whalan E i Redden JC (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Biuro ds. Programów 
Stosowania Pestycydów, Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczo ­
nych.  
(5) Dungworth DL, Tyler WS, Plopper CE (1985). Morphological Methods for 
Gross and Microscopic Pathology (rozdzia ł 9) w:  Toxicology of Inhaled 
Material , Witschi, H.P. i Brain, J.D. (red.), Springer Verlag Heidelberg, s. 
229–258.  
(6) Young JT (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity. 
Fundam. Appl. Toxicol. 1: 309–312.  
(7) Harkema JR (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants. Environ. Health Perspect. 85: 
231–238.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen RA, Garderen-Hoetmer A, van Slootweg PJ, Feron VJ (1994). 
Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and in 
humans. W: Waalkes MP i Ward JM (red.) Carcinogenesis. Target Organ Toxicology Series, Raven Press, Nowy Jork, 215–263.
 
(9) Mery S, Gross EA, Joyner DR, Godo M, Morgan KT (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats 
and mice. Toxicol. Pathol. 22: 353–372.  
(10) Kuper CF, Koornstra PJ, Hameleers DMH, Biewenga J, Spit BJ, Duijves ­
tijn AM, Breda Vriesman van PJC, Sminia T (1992). The role of nasop ­
haryngeal lymphoid tissue. Immunol. Today 13: 219–224.  
(11) Kuper CF, Art. JHE, Feron VJ (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue. Toxicol. Lett. 140–141: 281–285.  
(12) Lewis DJ (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia. Journal of 
Anatomy 132(3): 419–428.  
(13) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania 
i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006 (Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Dodatek 1  
DEFINICJA  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  BADANIA TOKSYCZNO ŚCI PRZEWLEK ŁEJ 
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 452 (OECD TG 452) (2009). 
Pierwotną TG nr 452 przyj ęto w 1981 r. Opracowanie niniejszej zmienionej 
metody badawczej B.30 uznano za konieczne w celu odzwierciedlenia ostat ­
nich zmian w dziedzinie dobrostanu zwierz ąt i wymogów regulacyjnych (1) 
(2) (3) (4). Aktualizacj ę niniejszej metody badawczej B.30 przeprowadzono 
równolegle z zmianami rozdzia łu B.32 niniejszego za łącznika, dotycz ącego 
badań rakotwórczo ści, oraz rozdzia łu B.33 niniejszego za łącznika, dotycz ą­
cego łączonych bada ń toksyczno ści przewlek łej/rakotwórczo ści, w celu 
uzyskania dodatkowych informacji na podstawie zwierz ąt wykorzystanych 
w badaniu oraz w celu zapewnienia dalszych szczegó łowych informacji na 
temat doboru dawek. Niniejsz ą metodę badawcz ą opracowano w celu jej 
wykorzystywania w badaniach szerokiego zakresu chemikaliów, w tym pestycydów i chemikaliów przemys łowych.
 
2. Większość badań toksyczno ści przewlek łej przeprowadza si ę 
z wykorzystaniem gatunków gryzoni, w zwi ązku z czym niniejsza metoda 
badawcza przewidziana jest do stosowania przede wszystkim w badaniach 
z wykorzystaniem takich gatunków. W razie konieczno ści przeprowadzenia 
takich bada ń z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie mo żna także 
zastosowa ć zasady i procedury okre ślone w niniejszej metodzie badawczej, 
przy wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji, wraz z zasadami 
i procedurami okre ślonymi w rozdziale B.27 niniejszego za łącznika, dotycz ­ 
ącym 90-dniowego badania toksyczno ści pokarmowej wywo łanej powta ­
rzanym dawkowaniem z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie 
(5), zgodnie z wytycznymi OECD nr 116 dotycz ącymi opracowywania 
i przeprowadzania bada ń toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści (6).  
3. Trzy g łówne drogi podania stosowane w badaniach toksyczno ści przewlek łej 
to droga pokarmowa, dermalna i inhalacyjna. Wybór drogi podania zale ży od 
fizycznych i chemicznych w łaściwości badanej substancji chemicznej oraz 
głównej drogi nara żenia ludzi. Dodatkowe informacje na temat wyboru 
drogi nara żenia przedstawiono w wytycznych OECD nr 116 (6).  
4. W ramach niniejszej metody badawczej k ładzie się nacisk na nara żenie 
drogą pokarmow ą, która jest drog ą najczęściej stosowan ą w badaniach 
toksyczno ści przewlek łej. Przeprowadzenie d ługoterminowych bada ń obej­
mujących nara żenie drog ą dermaln ą lub inhalacyjn ą może być również 
konieczne do oceny ryzyka dla zdrowia ludzi lub wymagane w ramach pewnych systemów regulacji, jednak obydwie te drogi nara żenia wymagaj ą 
badań bardzo z łożonych technicznie. Takie badania b ędą musiały zostać 
opracowane dla poszczególnych przypadków, jednak opisana 
w niniejszym rozdziale metoda badawcza maj ąca na celu ocen ę 
i oszacowanie toksyczno ści przewlek łej przy pokarmowej drodze podania 
może stanowi ć podstaw ę dla protoko łu badania z zastosowaniem inhala ­
cyjnej lub dermalnej drogi podania, z zastrze żeniem zalece ń dotyczących 
okresów poddawania dzia łaniu substancji, parametrów klinicznych, para ­
metrów analizy patologicznej itp. Dost ępne s
ą wytyczne OECD dotycz ące 
podawania badanych substancji chemicznych drog ą inhalacyjn ą (6) (7) 
i drogą dermaln ą (6). Podczas opracowywania bada ń uwzględniających 
dłuższy okres nara żenia drog ą inhalacyjn ą należy w szczególno ści wziąć 
pod uwag ę rozdział B.8 niniejszego za łącznika (8) oraz rozdzia ł B.29 niniej ­
szego załącznika (9), a tak że wytyczne OECD dotycz ące badania ostrej 
toksyczno ści inhalacyjnej (7). W przypadku bada ń przeprowadzanych 
drogą dermalną należy uwzględnić rozdział B.9 niniejszego za łącznika (10).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Badanie toksyczno ści przewlek łej dostarcza informacji na temat potencjal ­
nych zagro żeń dla zdrowia, których pojawienie si ę jest prawdopodobne 
w przypadku nara żenia powtarzaj ącego się przez znaczn ą część długości 
życia gatunku wykorzystanego w badaniu. Badanie dostarczy informacji 
na temat skutków toksycznych badanej substancji chemicznej oraz wska że 
organy docelowe i mo żliwość akumulacji. Badanie mo że także dostarczy ć 
szacunkowych informacji na temat poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych zmian, które to informacje mo żna wykorzysta ć 
do ustalenia kryteriów bezpiecze ństwa dla nara żenia ludzi. Podkre śla się 
również konieczno ść uważnych obserwacji klinicznych zwierz ąt, aby 
uzyskać możliwie jak najwi ęcej informacji.
 
6. Cele bada ń w ramach niniejszej metody badawczej obejmuj ą: 
— określenie toksyczno ści przewlek łej badanej substancji chemicznej,  
— określenie organów docelowych,  
— scharakteryzowanie zale żności dawka-odpowied ź, 
— określenie poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę szkod­
liwych zmian (NOAEL), lub punktu wyj ścia dla ustalenia dawki 
wyznaczaj ącej (BMD),  
— oszacowanie skutków toksyczno ści przewlek łej przy poziomach nara ­ 
żenia ludzi,  
— dostarczenie danych na potrzeby zbadania hipotez dotycz ących sposobu 
działania (6).  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE  
7. Podczas oceny i oszacowania w łaściwości toksykologicznych badanej 
substancji chemicznej laboratorium badawcze powinno wzi ąć pod uwag ę 
wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji chemicznej 
przed rozpocz ęciem badania, aby opracowa ć taki projekt badania, który 
umożliwi zbadanie potencja łu wywo ływania toksyczno ści przewlek łej 
w sposób bardziej efektywny oraz zminimalizuje wykorzystanie zwierz ąt. 
Informacje, które b ędą pomocne w opracowywaniu projektu badania, obej ­
mują tożsamość, struktur ę chemiczn ą i właściwości fizykochemiczne 
badanej substancji chemicznej; wszelkie informacje na temat sposobu dzia ­ 
łania; wyniki wszelkich bada ń toksyczno ści in vitro  lub in vivo ; przewidy ­
wane zastosowania i potencjalne nara żenie ludzi; dost ępne dane 
dotyczące (Q)SAR oraz dane toksykologiczne dotycz ące strukturalnie powi ­ 
ązanych zwi ązków; dost ępne dane toksykokinetyczne (je śli dostępne, dane 
dotyczące kinetyki jednorazowego podania i podania powtarzanego) oraz 
dane pochodz ące z innych bada ń narażenia powtarzanego. Ocen ę toksycz­
ności przewlek łej należy przeprowadzi ć wyłącznie po uzyskaniu wst ępnych 
informacji na temat toksyczno ści na podstawie 28-dniowych lub 90-dnio ­
wych bada ń toksyczno ści wywo łanej powtarzanym dawkowaniem. 
W kontek ście ogólnej oceny potencjalnych niepo żądanych skutków dla 
zdrowia wywo ływanych przez dan ą badaną substancj ę chemiczn ą 
w badaniu toksyczno ści przewlek łej należy rozważyć podejście oparte na 
etapach (11) (12) (13) (14).  
8. Metody statystyczne najbardziej odpowiednie do analizy wyników, przy 
uwzględnieniu uk ładu doświadczalnego i celów badania, nale ży ustalić 
przed rozpocz ęciem badania. W śród kwestii, jakie nale ży rozważyć, znaj­
duje się pytanie, czy dane statystyczne powinny obejmowa ć korektę 
uwzględniającą zwierzęta, które prze żyły, oraz analiz ę w przypadku przed ­
wczesnego u śmiercenia jednej grupy lub wi ększej liczby grup. Wytyczne 
dotyczące odpowiednich analiz statystycznych i kluczowe odniesienia do 
przyjętych na poziomie mi ędzynarodowym metod statystycznych zawarto 
w wytycznych nr 116 (6), a tak że wytycznych nr 35 dotycz ących analizy 
i ewaluacji bada ń toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści (15).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Podczas przeprowadzania badania toksyczno ści przewlek łej należy 
w każdym przypadku kierowa ć się zasadami przewodnimi i czynnikami 
przedstawionymi w wytycznych OECD nr 19 dotycz ących rozpoznawania, 
oceny i wykorzystania objawów klinicznych jako humanitarnego punktu końcowego w odniesieniu do zwierz ąt wykorzystywanych w badaniu 
oceny bezpiecze ństwa (16), a zw łaszcza pkt 62 tego dokumentu. Punkt 
ten stanowi, że: „[w] badaniach z zastosowaniem powtarzanej dawki, je śli 
zwierzę wykazuje objawy kliniczne, które post ępują, prowadz ąc do dalszego 
pogorszenia jego stanu, nale ży podjąć uzasadnion ą decyzję, czy w sposób 
humanitarny u śmiercić takie zwierz ę. Taka decyzja powinna opiera ć się na 
rozważeniu warto ści informacji, jakie mo żna uzyska ć dzięki dalszemu utrzy ­
mywaniu takiego zwierz ęcia w ramach badania, i uwzgl ędniać ogólny stan 
takiego zwierz ęcia. Jeśli zapadnie decyzja o pozostawieniu takiego zwie ­
rzęcia w badaniu, cz ęstotliwość obserwacji nale ży w razie potrzeby zwi ęk­
szyć. Można także tymczasowo zaprzesta ć dawkowania, je śli nie wpłynie to 
w sposób niekorzystny na cel badania, a zmniejszy cierpienie lub stres odczuwany przez zwierz ę, lub też można zmniejszy ć podawan ą dawkę”.
 
10. Szczegó łowe wytyczne dotycz ące zasad doboru dawek w przypadku bada ń 
toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści, a także omówienie takich zasad, 
można znaleźć w wytycznych nr 116 (6) oraz w publikacjach Mi ędzynaro­
dowego Instytutu Nauk Biologicznych (ILSI) (17) (18). G łówna strategia 
doboru dawek zale ży od głównego celu lub celów badania (pkt 6). Podczas 
doboru odpowiednich poziomów dawek nale ży zachowa ć równowag ę 
między kontrol ą zagrożenia a okre śleniem reakcji na niskie dawki i ich 
istotnością. Ma to szczególne znaczenie w sytuacji, w której planuje si ę 
przeprowadzi ć łączone badanie toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści 
(rozdział B.33 niniejszego za łącznika) (pkt 11).  
11. Nale ży rozważyć przeprowadzenie łączonego badania toksyczno ści przewle ­
kłej i rakotwórczo ści (rozdzia ł B.33 niniejszego za łącznika) zamiast prze ­
prowadzania osobno badania toksyczno ści przewlek łej (niniejsza metoda 
badawcza B.30) i badania rakotwórczo ści (rozdzia ł B.32 niniejszego 
załącznika). W porównaniu z przeprowadzaniem dwóch osobnych bada ń 
łączone badanie zapewnia wi ększą efektywno ść pod wzgl ędem czasu 
i kosztów, a jednocze śnie nie obni ża jakości danych na etapie badania 
toksyczno ści przewlek łej ani na etapie badania rakotwórczo ści. Przy prze ­
prowadzaniu łączonego badania toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści 
(rozdział B.33 niniejszego za łącznika) nale ży jednak zwróci ć szczególn ą 
uwagę na zasady doboru dawek (pkt 9 i 20–25). Uznaje si ę także, że 
w przypadku pewnych ram regulacyjnych wymagane mo że być przeprowa ­
dzenie takich bada ń osobno.  
12. Definicje stosowane w kontek ście niniejszej metody badawczej mo żna 
znaleźć na końcu tego rozdzia łu oraz w wytycznych nr 116 (6).  
ZASADA BADANIA  
13. Badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę codziennie w dawkach stopniowa ­
nych kilku grupom zwierz ąt doświadczalnych zazwyczaj przez okres 12 
miesięcy, choć w zależności od wymogów regulacyjnych mo żna wybra ć 
także dłuższy lub krótszy czas trwania tego etapu badania (zob. pkt 33). 
Wybiera si ę wystarczaj ąco długi czas trwania badania, aby umo żliwić 
widoczne pojawienie si ę wszelkich skutków toksyczno ści kumulatywnej, 
jednocześnie unikaj ąc mogących wprowadzi ć w błąd skutków zmian wyni ­
kających z wieku. Odst ępstwa od 12-miesi ęcznego czasu trwania nara żenia 
należy uzasadni ć, zwłaszcza w przypadku krótszych okresów. Badan ą 
substancję chemiczn ą podaje si ę zazwyczaj drog ą pokarmow ą, choć 
w niektórych przypadkach w łaściwe może być badanie z zastosowaniem 
drogi inhalacyjnej lub dermalnej. Projekt badania mo że obejmowa ć także 
uśmiercanie w trakcie trwania do świadczenia, np. po up ływie 3 i 6 miesi ęcy, 
oraz włączenie do badania dodatkowych grup zwierz ąt w celu umo żliwienia 
takiego dzia łania (zob. pkt 19). Podczas okresu podawania danej substancji 
zwierzęta obserwuje si ę uważnie w celu wykrycia objawów toksyczno ści 
Zwierzęta, które padn ą lub zostan ą uśmiercone podczas badania, s ą 
poddawane sekcji zw łok, a zwierz ęta, które prze żyją, są po zako ńczeniu 
badania u śmiercane i poddawane sekcji zw łok. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 441
 
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
14. Niniejsza metoda badawcza obejmuje przede wszystkim ocen ę 
i oszacowanie toksyczno ści przewlek łej u gryzoni (zob. pkt 2), chocia ż 
uznaje si ę, że w ramach pewnych systemów regulacji wymagane mog ą 
być podobne badania na gatunkach innych ni ż gryzonie. Wybór gatunku 
należy uzasadni ć. Projekt badania i przeprowadzenie bada ń toksyczno ści 
przewlekłej z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie, je śli jest to 
wymagane, powinny opiera ć się na zasadach okre ślonych w niniejszej meto ­
dzie badawczej, a tak że na zasadach okre ślonych w rozdziale B.27 niniej ­
szego za łącznika, dotycz ącym 90-dniowego badania toksyczno ści pokar­
mowej wywo łanej powtarzanym dawkowaniem z wykorzystaniem gatunków 
innych ni ż gryzonie (5). Dodatkowe informacje na temat wyboru gatunku 
i szczepu przedstawiono w wytycznych nr 116 (6).  
15. Preferowanym gatunkiem gryzoni w ramach niniejszej metody badawczej 
jest szczur, mo żna jednak wykorzysta ć także inne gatunki, np. mysz. 
Szczury i myszy s ą jak dotąd preferowanymi zwierz ętami doświadczalnymi 
z uwagi na ich wzgl ędnie krótk ą długość życia, powszechne wykorzysty ­
wanie w badaniach farmakologicznych i toksykologicznych, podatno ść na 
powstawanie guzów, a tak że dostępność dostatecznie scharakteryzowanych 
szczepów. Z racji tych cech dost ępne są znaczne ilo ści informacji na temat 
ich fizjologii i patologii. Zaleca si ę wykorzystanie zdrowych, m łodych, 
dorosłych zwierz ąt pochodz ących ze szczepów powszechnie wykorzystywa ­
nych w laboratoriach. Badanie toksyczno ści przewlek łej należy przeprowa ­
dzić z wykorzystaniem zwierz ąt z tego samego szczepu i źródła, z którego 
pochodziły zwierzęta wykorzystane we wst ępnych badaniach toksyczno ści 
o krótszym czasie trwania. Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą być 
w ciąży. 
Warunki przetrzymywania i karmienia  
16. Zwierz ęta można przetrzymywa ć pojedynczo lub te ż w klatkach w ma łych 
grupach sk ładających się z osobników tej samej p łci; przetrzymywanie 
zwierząt pojedynczo nale ży rozważyć, wyłącznie jeśli jest to uzasadnione 
z naukowego punktu widzenia (19) (20) (21). Klatki nale ży rozmie ścić 
w taki sposób, aby zminimalizowa ć potencjalny wp ływ ich uk ładu. Tempe ­
ratura w pomieszczeniach dla zwierz ąt doświadczalnych powinna wynosi ć 
22 °C (± 3 °C). Chocia ż wilgotno ść względna powinna wynosi ć co najmniej 
30 % i po żądane jest, by poza czasem czyszczenia pomieszczenia nie prze ­
kraczała 70 %, nale ży dążyć do utrzymania jej na poziomie 50–60 %. 
Oświetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin 
ciemności. Do karmienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze laborato ­
ryjne z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej. Pasza powinna zaspo ­
kajać wszystkie potrzeby żywieniowe badanych gatunków, a obecna w niej 
zawartość pokarmowych substancji zanieczyszczaj ących, w tym mi ędzy 
innymi pozosta łości pestycydów, trwa łych zanieczyszcze ń organicznych, 
fitoestrogenów, metali ci ężkich i mikotoksyn, które mog ą wpłynąć na 
wynik badania, powinna by ć możliwie jak najni ższa. Okresowo nale ży 
generowa ć informacje analityczne na temat poziomów substancji zanie ­
czyszczaj ących w sk ładnikach od żywczych i pokarmowych, 
a przynajmniej na pocz ątku badania oraz w przypadku zmiany stosowanej 
partii. Takie informacje nale ży uwzględnić w sprawozdaniu ko ńcowym. 
Informacje analityczne na temat wody pitnej stosowanej w badaniu nale ży 
przedstawi ć w podobny sposób. Na wybór pokarmu mo że mieć wpływ 
potrzeba zapewnienia odpowiedniej mieszaniny badanej substancji chemicz ­
nej, a tak że potrzeba zaspokojenia potrzeb żywieniowych zwierz ąt, jeśli 
badaną substancj ę chemiczn ą podaje si ę drogą pokarmow ą. 
Przygotowanie zwierz ąt 
17. Nale ży wykorzysta ć zdrowe zwierz ęta aklimatyzowane do warunków labo ­
ratoryjnych przez co najmniej 7 dni oraz niepoddawane wcze śniej proce ­
durom do świadczalnym. W przypadku gryzoni dawkowanie substancji 
należy rozpocz ąć możliwie jak najszybciej po odsadzeniu i aklimatyzacji 
oraz najlepiej zanim zwierz ęta osiągną wiek 8 tygodni. Badane zwierz ęta 
należy scharakteryzowa ć z uwzgl ędnieniem ich gatunku, szczepu, źródła, 
płci, masy i wieku. W chwili rozpocz ęcia badania odchylenia masy dla 
obu płci wykorzystanych zwierz ąt powinny by ć minimalne i nie mo że 
przekracza ć ± 20 % średniej masy wszystkich zwierz ąt wykorzystanych  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 442
 
w ramach badania, osobno dla ka żdej płci. Należy losowo przydzieli ć zwie­
rzęta do grup kontrolnych i grup poddawanych dzia łaniu substancji badanej. 
Po randomizacji mi ędzy grupami nie powinno by ć znaczących różnic 
w średniej wadze osobników w obr ębie każdej płci. Jeśli odnotowano staty ­
stycznie istotne ró żnice, randomizacj ę należy powtórzy ć, jeśli jest to 
możliwe. Ka żdemu zwierz ęciu należy przydzieli ć niepowtarzalny numer 
identyfikacyjny i w sposób sta ły oznaczy ć je tym numerem poprzez jego 
wytatuowanie, wszczepienie implantu z chipem lub za pomoc ą innej odpo ­
wiedniej metody.  
PROCEDURA  
Liczba i p łeć zwierząt 
18. Nale ży wykorzysta ć zwierzęta obu płci. Należy wykorzysta ć wystarczaj ącą 
liczbę zwierząt, tak aby na koniec badania w ka żdej grupie dost ępnych by ło 
dostatecznie du żo zwierząt na potrzeby szczegó łowych szacunków z punktu 
widzenia biologicznego i statystycznego. W przypadku gryzoni zazwyczaj 
należy w odniesieniu do ka żdego poziomu dawkowania wykorzysta ć co 
najmniej 20 zwierz ąt każdej płci i z każdej grupy, natomiast w przypadku 
gatunków innych ni ż gryzonie zaleca si ę wykorzystanie co najmniej 4 
zwierząt każdej płci i z każdej grupy. W celu przeprowadzenia wszystkich 
wymaganych oznacze ń hematologicznych w przypadku bada ń 
z wykorzystaniem myszy mo że zaistnie ć konieczno ść dodania zwierz ąt do 
każdej z grup otrzymuj ących dawki.  
Założenia dotycz ące uśmiercania w trakcie trwania do świadczenia, grup 
satelitarnych i zwierz ąt wskaźnikowych  
19. W ramach badania mo żna założyć uśmiercanie zwierz ąt w trakcie trwania 
doświadczenia (co najmniej 10 zwierz ąt każdej płci i z każdej grupy), np. po 
upływie 6 miesi ęcy, w celu uzyskania informacji na temat progresji zmian 
toksykologicznych oraz informacji dotycz ących mechanizmu dzia łania, jeśli 
jest to uzasadnione z naukowego punktu widzenia. Je śli takie informacje s ą 
już dostępne dzięki poprzednim badaniom toksyczno ści wywołanej powta ­
rzanym dawkowaniem badanej substancji chemicznej, u śmiercanie w trakcie 
trwania do świadczenia mo że nie by ć uzasadnione z naukowego punktu 
widzenia. W celu monitorowania odwracalno ści zmian toksykologicznych 
wywołanych badan ą substancj ą chemiczn ą można uwzgl ędnić także grupy 
satelitarne. Wprowadzenie takich grup zazwyczaj b ędzie ograniczone do 
najwyższego poziomu dawki stosowanego w badaniu oraz grupy kontrolnej. 
W celu monitorowania w trakcie badania statusu choroby mo żna w razie 
konieczno ści uwzgl ędnić dodatkow ą grupę zwierząt wskaźnikowych 
(zazwyczaj 5 zwierz ąt każdej płci) (22). Je śli planuje si ę uśmiercanie 
w trakcie trwania do świadczenia lub w łączenie grup satelitarnych lub 
wskaźnikowych, liczb ę zwierząt przewidzian ą w projekcie badania nale ży 
zwiększyć o liczbę zwierząt przeznaczonych do u śmiercenia przed zako ń­
czeniem badania. Zwierz ęta te zazwyczaj poddaje si ę takim samym obser ­
wacjom, w tym obserwacjom dotycz ącym masy cia ła, spożycia pokarmu/ 
wody, pomiarom hematologicznym i pod k ątem biochemii klinicznej oraz 
pod kątem patologii, co zwierz ęta wykorzystane w ramach g łównego 
badania na etapie badania toksyczno ści przewlek łej, choć można założyć 
(w przypadku grup przewidzianych do u śmiercenia w trakcie trwania 
doświadczenia) ograniczenie takich pomiarów do konkretnych kluczowych 
wskaźników, takich jak badanie neurotoksyczno ści lub immunotoksycz ­
ności. 
Grupy otrzymuj ące dawki oraz dawkowanie  
20. Wytyczne dotycz ące wszystkich aspektów doboru dawek oraz zró żnico­
wania poziomu dawek zawarto w wytycznych nr 116 (6). Nale ży zasto­
sować co najmniej trzy poziomy dawek oraz ustanowi ć równoleg łą grupę 
kontrolną, poza przypadkiem, gdy prowadzone jest badanie graniczne (zob. 
pkt 27). Poziomy dawek b ędą zazwyczaj oparte na wynikach krótkotermi ­
nowych bada ń z powtarzanym dawkowaniem lub bada ń ustalających zakres 
dawkowania oraz nale ży uwzględnić w tym kontek ście wszelkie istniej ące 
dane toksykologiczne i toksykokinetyczne dost ępne w odniesieniu do 
badanej substancji chemicznej lub substancji powi ązanych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 443
 
21. O ile nie ogranicza tego fizykochemiczny charakter lub skutki biologiczne 
badanej substancji chemicznej, nale ży zwykle wybra ć najwyższy poziom 
dawki w celu okre ślenia głównych organów docelowych oraz skutków 
toksycznych, jednocze śnie unikaj ąc cierpienia, toksyczno ści ostrej, chorobo ­
wości lub śmierci. Uwzgl ędniając czynniki przedstawione w pkt 22 poni żej, 
należy wybrać najwyższy poziom dawki w celu uzyskania dowodów na 
toksyczno ść, potwierdzonych na przyk ład wolniejszym przybieraniem na 
wadze (o oko ło 10 %).  
22. W zale żności od celów badania (zob. pkt 6) mo żna wybra ć najwyższą 
dawkę niższą od dawki potwierdzaj ącej toksyczno ść, np. jeśli dawka powo ­
duje szkodliwe zmiany istotne dla badania, które maj ą jednak niewielki 
wpływ na długość życia czy mas ę ciała. Górna dawka nie powinna przekro ­
czyć 1 000 mg/kg masy cia ła dziennie (dawka graniczna, zob. pkt 27).  
23. Poziomy dawek i zró żnicowanie ich poziomów mo żna dobra ć tak, by 
określić odpowied ź zależną od dawki oraz NOAEL lub inny po żądany 
wynik badania, np. BMD (zob. pkt 25) przy najni ższym poziomie dawki. 
Przy stosowaniu ni ższych dawek nale ży rozważyć takie czynniki, jak: 
spodziewane nachylenie krzywej dawka-efekt, dawki, przy których mog ą 
pojawić się istotne zmiany w metabolizmie, lub charakter dzia łania toksycz ­
nego, przy którym oczekuje si ę wartości granicznej lub punktu wyj ścia dla 
ekstrapolacji dla niskiej dawki.  
24. Wybrane zró żnicowanie poziomów dawki b ędzie zale żeć od właściwości 
badanej substancji chemicznej i nie mo że zostać z góry okre ślone 
w niniejszej metodzie badawczej, jednak zastosowanie od podwójnych do poczwórnych odst ępów pomi ędzy kolejnym dawkowaniem cz ęsto zapewnia 
dobre wyniki badania dla ustalenia malej ących poziomów dawki, a dodanie 
czwartej grupy badanej jest cz ęsto rozwi ązaniem preferowanym 
w porównaniu ze stosowaniem bardzo du żych odstępów pomi ędzy kolejnym 
dawkowaniem (np. pomno żonych przez wspó łczynnik wi ększy niż 6–10). 
Zasadniczo nale ży unikać stosowania wspó łczynników wi ększych ni ż 10, 
a w przypadku ich zastosowania nale ży je uzasadni ć.
 
25. Jak opisano pokrótce w wytycznych OECD nr 116 (6), kwestie, jakie nale ży 
rozważyć przy doborze dawki, obejmuj ą: 
— znane lub podejrzewane nieliniowo ści lub punkty przegi ęcia krzywej 
dawka-efekt,  
— toksykokinetyk ę oraz zakresy dawkowania, przy których wyst ępuje lub 
nie występuje indukcja metaboliczna, nasycenie lub te ż nieliniowo ść 
między dawk ą zewnętrzną a dawką wewnętrzną, 
— prekursorowe zmiany patologiczne, markery skutku lub wska źniki dzia­ 
łania kluczowych podstawowych procesów biologicznych,  
— kluczowe (lub podejrzewane) aspekty sposobu dzia łania, takie jak 
dawki, przy których zaczyna pojawia ć się cytotoksyczno ść, zakłócone 
zostają poziomy hormonów, przestaj ą działać mechanizmy homeosta ­
tyczne itp.,  
— regiony krzywej dawka-efekt, gdzie konieczne s ą szczególnie solidne 
szacunki, np. w zakresie spodziewanej BMD lub podejrzewanej warto ści 
granicznej,  
— uwzgl ędnienie spodziewanych poziomów nara żenia ludzi.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. Grupa kontrolna powinna by ć grupą niepoddawan ą działaniu substancji 
badanej lub grup ą kontroln ą nośnika, jeśli do podawania badanej substancji 
chemicznej zastosowano no śnik. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu badanej 
substancji chemicznej zwierz ęta z grupy kontrolnej nale ży traktowa ć w taki 
sam sposób jak zwierz ęta z grup badanych. Je śli zastosowano no śnik, grupa 
kontrolna otrzymuje no śnik w najwy ższej objętości stosowanej w śród grup 
otrzymujących dawki. Je śli badaną substancj ę chemiczn ą podaje si ę wraz 
z pokarmem i je śli powoduje ona znacznie zmniejszone spo życie pokarmu 
z powodu jego obni żonych walorów smakowych, pomocna mo że być dodat­
kowa grupa kontrolna zwierz ąt otrzymuj ących pokarm w ilo ści spożywanej 
przez zwierz ęta z grupy badanej (pair-fed), która zapewni odpowiedniejsz ą 
kontrolę. 
27. Pełne badanie z zastosowaniem trzech poziomów dawek mo że zostać 
uznane za zb ędne, jeśli na podstawie informacji pochodz ących z bada ń 
wstępnych mo żliwe jest za łożenie, że badanie z zastosowaniem jednego 
poziomu dawki, równego co najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła dziennie, 
przeprowadzone z zastosowaniem procedur opisanych w odniesieniu do tego badania, nie spowoduje szkodliwych zmian, oraz je śli na podstawie 
danych dotycz ących innych strukturalnie powi ązanych zwi ązków nie prze ­
widuje si ę toksyczno ści. Można zastosowa ć limit 1 000 mg/kg masy cia ła 
dziennie, z wyj ątkiem sytuacji, gdy nara żenie ludzi wskazuje potrzeb ę zasto­
sowania wy ższego poziomu dawki.
 
Przygotowanie dawek i podanie badanej substancji chemicznej  
28. Badan ą substancj ę chemiczn ą zazwyczaj podaje si ę drogą pokarmow ą, wraz 
z pokarmem lub wod ą pitną, lub też za pomoc ą sondy. Dodatkowe infor ­
macje na temat dróg i metod podania przedstawiono w wytycznych nr 116 
(6). Droga i metoda podania zale żą od celu badania, fizykochemicznych 
właściwości badanej substancji chemicznej, jej biodost ępności oraz głównej 
drogi i metody nara żenia ludzi. Nale ży przedstawi ć uzasadnienie wybranej 
drogi i metody podania. W trosce o dobrostan zwierz ąt karmienie za 
pomocą sondy nale ży wybiera ć wyłącznie w przypadku tych substancji, 
dla których taka droga i metoda podania w sposób uzasadniony odzwier ­
ciedlają potencjalne nara żenie ludzi (np. produktów farmaceutycznych). 
Substancje wyst ępujące w pokarmie lub środowisku naturalnym, w tym 
pestycydy, podaje si ę zazwyczaj wraz z pokarmem lub wod ą pitną. 
W przypadku jednak niektórych scenariuszy, np. nara żenia zawodowego, 
podawanie substancji za pomoc ą innych dróg mo że być bardziej w łaściwe.  
29. W razie potrzeby badan ą substancj ę chemiczn ą rozpuszcza si ę lub sporz ądza 
się jej zawiesin ę w odpowiednim no śniku. W stosownych przypadkach 
należy wziąć pod uwag ę następujące cechy no śnika i innych dodatków: 
wpływ na wch łanianie, dystrybucj ę, metabolizm oraz zatrzymywanie 
badanej substancji chemicznej; wp ływ na chemiczne w łasności badanej 
substancji chemicznej, które mog ą zmieniać jej charakterystyk ę toksyczn ą; 
oraz wpływ na spo życie pokarmu lub wody lub te ż na stan od żywienia 
zwierząt. Zaleca si ę, w miarę możliwości, najpierw rozwa żyć zastosowanie 
wodnego roztworu/zawiesiny, nast ępnie roztworu/emulsji woda-olej (np. 
z zastosowaniem oleju kukurydzianego), a potem mo żliwego roztworu 
w innych no śnikach. W przypadku no śników innych ni ż woda charaktery ­
styka toksyczna no śnika powinna by ć znana. Dost ępne powinny by ć także 
informacje na temat stabilno ści badanej substancji chemicznej oraz jedno ­
rodności roztworów dawek lub pokarmu z dawkami (w stosownych przy ­
padkach) w warunkach podawania (np. pokarmu).  
30. W przypadku substancji podawanych w pokarmie lub wodzie pitnej wa żne 
jest dopilnowanie, by takie ilo ści badanej substancji chemicznej nie zak łó­
cały normalnego od żywiania ani bilansu wodnego organizmu. W przypadku 
długoterminowych bada ń toksyczno ści z zastosowaniem podawania dawek 
wraz z pokarmem st ężenie badanej substancji chemicznej w paszy nie 
powinno w normalnych warunkach przekracza ć górnej granicy 5 % ca łego 
pokarmu, aby unikn ąć nierównowagi żywieniowej. Przy podawaniu badanej 
substancji chemicznej wraz z pokarmem mo żna zastosowa ć stałe stężenie 
w pokarmie (mg/kg pokarmu lub ppm) lub te ż stały poziom dawki 
w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia (mg/kg masy cia ła), obliczany 
cotygodniowo. Nale ży określić, które rozwi ązanie zastosowano.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 445
 
31. Przy podawaniu substancji drog ą pokarmow ą zwierzętom podaje si ę dawki 
badanej substancji chemicznej codziennie (siedem dni w tygodniu), zazwy ­
czaj przez okres 12 miesi ęcy (zob. tak że pkt 33), chocia ż w zależności od 
wymogów regulacyjnych konieczny mo że być dłuższy okres podawania 
danej substancji. Zastosowanie innego schematu dawkowania, np. przez 
pięć dni w tygodniu, nale ży uzasadni ć. Przy podawaniu substancji drog ą 
dermalną zwierzęta zazwyczaj poddaje si ę działaniu badanej substancji 
chemicznej przez co najmniej 6 godzin dziennie, 7 dni w tygodniu, zgodnie z rozdzia łem B.9 niniejszego za łącznika (10), przez okres 12 miesi ęcy. 
Narażenie drog ą inhalacyjn ą stosuje si ę przez 6 godzin dziennie, 7 dni 
w tygodniu, ale mo żliwe jest zastosowanie nara żenia także przez 5 dni 
w tygodniu, je śli zostanie to uzasadnione. Okres nara żenia zazwyczaj 
wynosi 12 miesi ęcy. Jeśli gatunki gryzoni inne ni ż szczury poddaje si ę 
narażeniu wyłącznie poprzez nos, maksymalne okresy nara żenia można 
dostosowa ć tak, by zminimalizowa ć
 charakterystyczny dla danego gatunku 
stres. W przypadku stosowania okresu nara żenia krótszego ni ż 6 godzin 
dziennie nale ży przedstawi ć stosowne uzasadnienie. Zobacz równie ż 
rozdział B.8 niniejszego za łącznika (8).  
32. Jeśli badaną substancj ę chemiczn ą podaje si ę zwierzętom za pomoc ą sondy, 
należy dokonywa ć tego z u życiem sondy żołądkowej lub odpowiedniej 
kaniuli intubacyjnej ka żdego dnia o podobnych porach. Zazwyczaj podaje 
się pojedyncz ą dawkę raz dziennie, je śli jednak substancja jest na przyk ład 
substancją wykazuj ącą miejscowe dzia łanie drażniące, możliwe jest zacho ­
wanie dziennej mocy dawki poprzez podawanie jej jako dawki dzielonej 
(dwa razy dziennie). Maksymalna obj ętość cieczy, jak ą można podać jedno­
razowo, zale ży od wielko ści badanego zwierz ęcia. Objętość taka powinna 
być możliwie jak najni ższa i nie powinna w normalnych warunkach prze ­
kraczać 1 ml/100 g masy cia ła w przypadku gryzoni (22). Zmienno ść stoso­
wanej obj ętości należy zminimalizowa ć poprzez dostosowanie st ężenia, aby 
zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawek. Wyj ątkiem są 
substancję potencjalnie żrące lub wykazuj ące działanie drażniące, które 
należy rozcieńczyć w celu unikni ęcia miejscowych ostrych skutków. Nale ży 
unikać badania z u życiem stężeń, które mog ą mieć działanie żrące lub 
drażniące na przewód pokarmowy.  
Czas trwania badania  
33. Mimo że niniejsza metoda badawcza jest przede wszystkim zaprojektowana 
jako 12-miesi ęczne badanie toksyczno ści przewlek łej, w ramach projektu 
badania mo żna zaplanowa ć i zastosowa ć krótszy (wynosz ący np. 6 lub 9 
miesięcy) lub d łuższy (wynosz ący np. 18 miesi ęcy lub 24 miesi ące) czas 
trwania badania w zale żności od wymogów poszczególnych systemów regu ­
lacyjnych lub w przypadku specyficznych celów modeli mechanistycznych. Odstępstwa od 12-miesi ęcznego czasu trwania nara żenia nale ży uzasadni ć, 
zwłaszcza w przypadku krótszych okresów. Grupy satelitarne wprowadzone 
w celu monitorowania odwracalno ści zmian toksykologicznych wywo łanych 
przez badan ą substancj ę chemiczn ą należy utrzyma ć bez podawania danej 
substancji przez okres nie krótszy ni ż 4 tygodnie oraz nie d łuższy niż jedna 
trzecia ca łego okresu trwania badania po ustaniu nara żenia. Dalsze 
wytyczne, w tym dotycz ące sposobu uwzgl ędnienia zwierz ąt, które prze żyły 
badanie, przedstawiono w wytycznych nr 116 (6).
 
OBSERWACJE  
34. Wszystkie zwierz ęta należy sprawdzi ć pod k ątem chorobowo ści 
i upadkowo ści, zazwyczaj na pocz ątku i pod koniec ka żdego dnia, w łącznie 
z weekendami i dniami wolnymi od pracy. Ogólnych obserwacji klinicznych należy dokonywa ć co najmniej raz dziennie, najlepiej o tej samej porze lub 
porach ka żdego dnia, uwzgl ędniając szczytowy okres przewidywanych 
skutków po podaniu dawki w przypadku podawania substancji badanej za 
pomocą sondy.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 446
 
35. Przynajmniej raz przed pierwszym nara żeniem nale ży dokona ć szczegółowej 
obserwacji klinicznej wszystkich zwierz ąt (w celu umo żliwienia porówna ń 
dotyczących tych samych osobników), a tak że pod koniec pierwszego tygo ­
dnia badania, a po tym okresie – co miesi ąc. Protokó ł dotyczący obserwacji 
należy opracowa ć tak, by zminimalizowa ć odchylenia mi ędzy poszczegól ­
nymi obserwatorami i by by ły one niezale żne od badanej grupy. Obserwacji 
należy dokonywa ć poza klatk ą zwierzęcia, najlepiej w warunkach standar ­
dowych i za ka żdym razem o podobnych porach. Obserwacje nale ży 
starannie odnotowa ć, najlepiej za pomoc ą systemów punktacji wyra źnie 
określonych przez laboratorium badawcze. Nale ży dołożyć starań w celu 
dopilnowania, aby odchylenia w warunkach obserwacji by ły minimalne. 
Odnotowane objawy powinny obejmowa ć między innymi zmiany na skórze, 
sierści, oczach, b łonach śluzowych, wyst ąpienie wydzielin i wydalin oraz 
aktywność autonomicznej cz ęści układu nerwowego (np. łzawienie, piloe ­
rekcję, rozmiar źrenicy, nietypowy rytm oddychania). Nale ży odnotowa ć 
także zmiany w sposobie chodzenia, postawie i reakcji na dotyk, jak 
również obecność ruchów klonicznych lub tonicznych, zachowa ń stereoty­
powych (np. nadmierne czyszczenie si ę, powtarzaj ące się krążenie w kó łko) 
oraz dziwne zachowania (np. samookaleczanie si ę, chodzenie do ty łu) (24).  
36. Badanie oftalmologiczne, za pomoc ą oftalmoskopu lub innego odpowied ­
niego sprz ętu, należy przeprowadzi ć u wszystkich zwierz ąt przed pierwszym 
podaniem badanej substancji chemicznej. Badanie to nale ży przeprowadzi ć 
także wraz z zako ńczeniem badania, najlepiej u wszystkich zwierz ąt, a co 
najmniej w grupach otrzymuj ących wysokie dawki i w grupach kontrolnych. 
W przypadku wykrycia w oczach zmian zwi ązanych z poddawaniem 
zwierząt działaniu substancji badanej nale ży przebada ć wszystkie zwierz ęta. 
Jeśli wyniki analizy strukturalnej lub inne informacje wskazuj ą na toksycz ­
ność dla oczu, nale ży zwiększyć częstotliwość badania oczu.  
37. W przypadku substancji chemicznych, dla których poprzednie 28-dniowe 
lub 90-dniowe badania toksyczno ści wywołanej powtarzanym dawkowa ­
niem wykaza ły prawdopodobie ństwo wywo ływania dzia łania neurotoksycz ­
nego, przed rozpocz ęciem badania oraz co 3 miesi ące po rozpocz ęciu 
badania przez okres do 12 miesi ęcy, a także na zako ńczenie badania (je śli 
jego czas trwania jest d łuższy niż 12 miesi ęcy) można przeprowadzi ć ocenę 
reaktywno ści na różnego typu bod źce (24) (np. bod źce słuchowe, wizualne 
i proprioceptywne) (25) (26) (27), si ły uchwytu (28) oraz ocen ę aktywno ści 
motorycznej (29). Dalsze szczegó łowe informacje na temat procedur, jakie 
można zastosowa ć, podano w odpowiednich źródłach. Można jednak zasto ­
sować również procedury inne ni ż te podane w bibliografii.  
38. W przypadku substancji chemicznych, dla których poprzednie 28-dniowe 
lub 90-dniowe badania toksyczno ści wywołanej powtarzanym dawkowa ­
niem wykaza ły prawdopodobie ństwo wywo ływania dzia łania immunoto ­
ksycznego, dalsze badania tego punktu ko ńcowego mo żna przeprowadzi ć 
wraz z zako ńczeniem badania.  
Masa cia ła, spożycie pokarmu/wody i wydajno ść pokarmu  
39. Wszystkie zwierz ęta należy zważyć na pocz ątku rozpocz ęcia poddawania 
ich działaniu substancji badanej, a tak że co najmniej raz w tygodniu 
przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz w miesiącu. Pomiarów spo życia pokarmu i wydajno ści pokarmu nale ży 
dokonywa ć co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po 
tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu. Spożycie wody nale ży mierzyć 
co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu, jeśli substancj ę badaną podaje si ę w wodzie 
pitnej. Pomiary spo życia wody nale ży rozważyć także w przypadku bada ń, 
w których zachodz ą zmiany zwi ązane ze spo życiem wody.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 447
 
Hematologia i biochemia kliniczna  
40. W przypadku bada ń z wykorzystaniem gryzoni badania hematologiczne 
należy przeprowadza ć u co najmniej 10 samców i 10 samic w ka żdej grupie 
po upływie 3, 6 i 12 miesi ęcy, a także wraz z zako ńczeniem badania (je śli 
jego czas trwania jest d łuższy niż 12 miesi ęcy), wykorzystuj ąc w tym celu 
te same osobniki przez ca ły okres badania. W przypadku wykorzystania 
w badaniu myszy konieczne mo że być wprowadzenie zwierz ąt satelitarnych 
w celu przeprowadzenia wszystkich wymaganych oznacze ń hematologicz ­
nych (zob. pkt 18). W badaniach z wykorzystaniem gatunków innych ni ż 
gryzonie próbki nale ży pobiera ć od mniejszej liczby zwierz ąt (np. od 4 
zwierząt dla każdej płci i grupy w badaniach z wykorzystaniem psów) 
w trakcie badania oraz wraz z jego zako ńczeniem, tak jak opisano 
w odniesieniu do bada ń z wykorzystaniem gryzoni. Nie ma konieczno ści 
przeprowadzania pomiarów po up ływie 3 miesi ęcy – zarówno w przypadku 
gryzoni, jak i gatunków innych ni ż gryzonie – je śli w poprzednim 90- 
dniowym badaniu przeprowadzonym przy porównywalnych poziomach 
dawek nie odnotowano zmian parametrów hematologicznych. Próbki krwi należy pobrać z określonego miejsca, na przyk ład poprzez nak łucie serca lub 
z zatoki oczodo łowej tylnej, w znieczuleniu.
 
41. Nale ży zbadać następujące parametry (30): ca łkowitą i różnicową liczbę 
leukocytów, liczb ę czerwonych krwinek, liczb ę płytek krwi, st ężenie hemo ­
globiny, hematokryt (HCT), średnią objętość krwinki czerwonej (MCV), 
średnią masę hemoglobiny w krwince czerwonej (MCH), średnie stężenie 
hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC), czas protrombinowy oraz czas częściowej tromboplastyny po aktywacji. W stosownych przypadkach 
można zmierzy ć inne parametry hematologiczne, takie jak cia łka Heinza 
lub inne nietypowe parametry morfologii erytrocytów lub methemoglobiny, 
w zależności od toksyczno ści badanej substancji chemicznej. Zasadniczo 
należy przyjąć elastyczne podej ście, dostosowane do obserwowanych lub 
spodziewanych skutków danej badanej substancji chemicznej. Je śli badana 
substancja chemiczna ma wp ływ na uk ład krwiotwórczy, mo żna równie ż 
przeprowadzi ć badanie liczby retikulocytów i cytologi ę szpiku kostnego, 
choć nie trzeba przeprowadza ć takich bada ń rutynowo.
 
42. Oznaczenia parametrów biochemii klinicznej w celu zbadania g łównych 
skutków toksycznych w tkankach, a w szczególno ści skutków dla nerek 
i wątroby, nale ży wykona ć na próbkach krwi pobranych od co najmniej 
10 samców i 10 samic z ka żdej grupy w takich samych odst ępach czaso ­
wych jak w przypadku bada ń hematologicznych, wykorzystuj ąc w tym celu 
te same osobniki przez ca ły okres badania. W przypadku wykorzystania 
w badaniu myszy konieczne mo że być wprowadzenie zwierz ąt satelitarnych 
w celu przeprowadzenia wszystkich wymaganych oznacze ń parametrów 
biochemii klinicznej. W badaniach z wykorzystaniem gatunków innych niż gryzonie próbki nale ży pobiera ć od mniejszej liczby zwierz ąt (np. od 
4 zwierząt dla każdej płci i grupy w badaniach z wykorzystaniem psów) 
w trakcie badania oraz wraz z jego zako ńczeniem, tak jak opisano 
w odniesieniu do bada ń z wykorzystaniem gryzoni. Nie ma konieczno ści 
przeprowadzania pomiarów po up ływie 3 miesi ęcy, zarówno w przypadku 
gryzoni, jak i gatunków innych ni ż gryzonie, je śli w poprzednim 90- 
dniowym badaniu przeprowadzonym przy porównywalnych poziomach 
dawek nie odnotowano zmian parametrów biochemii klinicznej. Zalecane jest wstrzymanie podawania zwierz ętom pokarmu (z wyj ątkiem myszy) 
przez noc poprzedzaj ącą pobranie krwi. Nale ży zbadać następujące para­
metry (30): glukoza, mocznik (azot mocznikowy), kreatynina, bia łko całko­
wite, albumina, wap ń, sód, potas, cholesterol ca
łkowity, co najmniej dwa 
odpowiednie badania w celu oceny komórek w ątroby (aminotransferaza 
alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, dehydrogenaza glutaminia ­
nowa, kwasy żółciowe całkowite) (31), oraz co najmniej dwa odpowiednie 
badania w celu oceny w ątroby i dróg żółciowych (fosfataza alkaliczna, 
gamma-glutamylotranspeptydaza, 5’-nukleotydaza, bilirubina ca łkowita, 
kwasy żółciowe całkowite) (31). W stosownych przypadkach mo żna zbadać 
inne parametry biochemii klinicznej, takie jak: st ężenie trójglicerydów na 
czczo, poziom okre ślonych hormonów oraz poziom pseudocholinesterazy, 
w zależności od toksyczno ści badanej substancji chemicznej. Ogólnie rzecz 
biorąc, należy przyjąć elastyczne podej ście w zale żności od gatunku oraz 
obserwowanych lub spodziewanych skutków danej badanej substancji 
chemicznej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 448
 
43. Oznaczenia w ramach analizy moczu nale ży przeprowadzi ć u co najmniej 
10 samców i 10 samic z ka żdej grupy na próbkach pobranych w takich 
samych odst ępach czasu jak w przypadku hematologii i biochemii klinicz ­
nej. Nie ma konieczno ści przeprowadzania pomiarów po up ływie 3 
miesięcy, jeśli w poprzednim 90-dniowym badaniu przeprowadzonym 
przy porównywalnych poziomach dawek nie odnotowano zmian 
w analizie moczu. Zalecenie ekspertów dotycz ące badań klinicznych pod 
kątem patologii obejmuje nast ępujące parametry (30): wygl ąd, objętość, 
osmolalno ść lub ciężar właściwy, pH, bia łko całkowite i glukoza. Inne 
oznaczenia obejmuj ą ketony, urobilinogen, bilirubin ę i krew utajon ą. 
W stosownych przypadkach mo żna zastosowa ć badania dodatkowych para ­
metrów w celu rozszerzenia badania zaobserwowanych skutków.  
44. Ogólnie uznaje si ę, że podstawowe zmienne hematologiczne i biochemii 
klinicznej nale ży zbadać przed poddaniem zwierz ąt działaniu substancji 
badanej w przypadku bada ń z wykorzystaniem psów, jednak nie ma takiej 
potrzeby w przypadku bada ń z wykorzystaniem gryzoni (30). Je śli jednak 
historyczne dane podstawowe (zob. pkt 50) s ą nieodpowiednie, nale ży 
rozważyć wygenerowanie takich danych.  
Patologia  
Pełne rozpoznanie histopatologiczne  
45. Wszystkie zwierz ęta wykorzystane w badaniu nale ży zazwyczaj podda ć 
pełnemu, szczegó łowemu rozpoznaniu histopatologicznemu, które obejmuje 
staranne zbadanie zewn ętrznej powierzchni cia ła, wszystkich otworów, jamy 
czaszki, jamy klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawarto ści. Można 
jednak za łożyć (w grupach przewidzianych do u śmiercenia w trakcie trwania 
doświadczenia lub w grupach satelitarnych) ograniczenie pomiarów do 
poszczególnych kluczowych wska źników, takich jak badanie neurotoksycz ­
ności lub immunotoksyczno ści (zob. pkt 19). Takie zwierz ęta nie musz ą 
zostać poddane sekcji zw łok ani dalszym procedurom opisanym 
w poniższych punktach. Zwierz ęta wskaźnikowe mog ą w poszczególnych 
przypadkach wymaga ć sekcji zw łok, według uznania kierownika badania.  
46. Nale ży odnotowa ć masy organów wszystkich zwierz ąt, prócz tych wy łączo­
nych na mocy ostatniej cz ęści pkt 45. Nadnercza, mózg, naj ądrza, serce, 
nerki, wątrobę, jajniki, śledzionę, jądra, tarczyc ę (zważoną po utrwaleniu, 
z przytarczycami) oraz macic ę pobrane od wszystkich zwierz ąt (oprócz tych 
znalezionych w stanie agonalnym lub u śmierconych w trakcie trwania 
doświadczenia) nale ży w stosownych przypadkach okroi ć z wszelkich przy ­
legających tkanek i zmierzy ć ich masę mokrą możliwie jak najszybciej po 
sekcji w celu zapobiegni ęcia ich wyschni ęciu. W badaniu z wykorzystaniem 
myszy wa żenie nadnerczy jest opcjonalne.  
47. Nast ępujące tkanki nale ży zachowa ć w roztworze utrwalaj ącym najbardziej 
odpowiednim zarówno dla rodzaju tkanki, jak i planowanego pó źniejszego 
badania histopatologicznego (32) (tkanki podane w nawiasach kwadrato ­
wych są opcjonalne): 
wszystkie makroskopowe 
zmiany patologiczne serce trzustka żołądek (przed żołądek, 
żołądek gruczo łowy) 
nadnercze jelito kr ęte przytarczyca [z ęby] 
aorta jelito czcze nerw obwodowy j ądro 
mózg (w tym cz ęści kreso­
mózgowia, mó żdżku 
i rdzenia/mostu) nerka przysadka grasica 
jelito ślepe gruczo ł łzowy (oczodo ­ 
łowy) prostata tarczyca 
szyjka macicy w ątroba odbytnica [j ęzyk] ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
gruczoł koaguluj ący p łuco gruczo ł ślinowy tchawica 
okrężnica w ęzły chłonne (powierz ­
chowne i g łębokie) pęcherzyk nasienny p ęcherz moczowy 
dwunastnica gruczo ł mlekowy (obo ­
wiązkowo w przypadku 
samic oraz, je śli 
wyraźnie nadaje si ę do 
analizy, równie ż 
w przypadku samców) mięsień szkieletowy macica (w tym szyjka 
macicy) 
najądrze [górne drogi oddechowe, 
w tym nos, ma łżowiny 
nosowe oraz zatoki przy ­
nosowe] skóra [moczowód] 
oko (w tym siatkówka) prze łyk rdze ń kręgowy (na 
trzech odcinkach: szyj ­
nym, śródpiersiowym 
i lędźwiowym) [cewka moczowa] 
[kość udowa ze stawem] [opuszka w ęchowa] śledziona pochwa 
pęcherzyk żółciowy (w 
przypadku gatunków innych 
niż szczur) jajnik [mostek] wycinek szpiku kostnego lub 
świeży aspirat szpiku 
kostnego 
gruczoł przyoczny  
W przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży utrwalić 
oba organy. Wyniki bada ń klinicznych i innych testów mog ą wskazać na 
konieczno ść zbadania dodatkowych tkanek. Organy uznane w oparciu 
o znane w łaściwości badanej substancji chemicznej za prawdopodobne 
organy docelowe tak że należy zachowa ć. W przypadku bada ń 
z zastosowaniem dermalnej drogi podania nale ży utrwali ć organy zgodnie 
z listą określoną dla podania drog ą pokarmow ą, przy czym kluczowe jest 
pobranie i zachowanie próbek skóry z miejsca aplikacji. W przypadku bada ń 
z zastosowaniem inhalacyjnej drogi podania, uk ładając listę tkanek z dróg 
oddechowych do zachowania i zbadania, nale ży kierowa ć się zaleceniami 
zawartymi w rozdziale B.8 niniejszego za łącznika (8) i rozdziale B.29 
niniejszego za łącznika (9). W przypadku innych organów/tkanek (oraz 
oprócz okre ślonych utrwalonych tkanek z dróg oddechowych) nale ży zbadać 
organy zgodnie z list ą określoną dla podania drog ą pokarmow ą. 
Histopatologia  
48. Dost ępne są wytyczne dotycz ące najlepszych praktyk zwi ązanych 
z przeprowadzaniem toksykologicznych bada ń zmian patologicznych (32). 
Badaniu histopatologicznemu nale ży poddać co najmniej nast ępujące tkanki:  
— wszystkie tkanki zwierz ąt z grup otrzymuj ących wysokie dawki i z grup 
kontrolnych,  
— wszystkie tkanki zwierz ąt padłych lub u śmierconych podczas badania,  
— wszystkie tkanki wykazuj ące makroskopowe nieprawid łowości, 
— tkanki docelowe lub tkanki, które wykazuj ą zmiany spowodowane 
poddaniem zwierz ęcia działaniu substancji badanej w grupie otrzy ­
mującej wysokie dawki, pobrane od wszystkich zwierz ąt we wszystkich 
innych grupach otrzymuj ących dawki,  
— w przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży 
zbadać oba organy.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
49. W odniesieniu do wszystkich parametrów poddawanych oszacowaniu nale ży 
przedstawi ć dane dotycz ące każdego zwierz ęcia. Dodatkowo wszystkie dane 
należy zestawi ć w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do ka żdej 
badanej grupy liczb ę zwierząt na pocz ątku badania, liczb ę zwierząt padłych 
w trakcie trwania badania lub u śmierconych z przyczyn humanitarnych, 
wraz z okre śleniem czasu zgonu lub humanitarnego u śmiercenia, liczb ę 
zwierząt wykazuj ących objawy toksyczno ści, opis obserwowanych objawów 
toksyczno ści, w tym czas ich pojawienia si ę, czas trwania, stopie ń ostrości 
wszelkich skutków toksycznych, liczb ę zwierząt wykazuj ących zmiany pato ­
logiczne, typ takich zmian oraz procent zwierz ąt wykazuj ących każdy typ 
zmiany. W tabelach z zestawieniem danych nale ży oprócz klasyfikacji 
zmian patologicznych przedstawi ć średnie i standardowe odchylenia (dla 
danych z bada ń ciągłych) dotycz ące zwierz ąt wykazuj ących skutki 
toksyczne lub zmiany patologiczne.  
50. Historyczne dane kontrolne mog ą być cenne przy interpretacji wyników 
badania, np. je śli istnieją przesłanki, że dane uzyskane z równoczesnych 
kontroli s ą w sposób znacz ący niestandardowe w porównaniu 
z najnowszymi danymi dotycz ącymi zwierz ąt kontrolnych z tej samej 
placówki przeprowadzaj ącej badanie/badanej kolonii. Historyczne dane 
kontrolne, je śli poddaje si ę je oszacowaniu, powinno przedstawi ć to samo 
laboratorium i powinny si ę one odnosi ć do zwierz ąt w tym samym wieku i z 
tego samego szczepu. Dane takie powinny zosta ć wygenerowane w ci ągu 
pięciu lat przed rozpocz ęciem rozwa żanego badania.  
51. W stosownych przypadkach wyniki liczbowe nale ży poddawa ć oszacowaniu 
za pomoc ą właściwych i ogólnie przyj ętych metod statystycznych. Metody 
statystyczne i dane poddawane analizie nale ży wybrać w czasie przygoto ­
wywania projektu badania (pkt 8). Taki wybór powinien obejmowa ć w razie 
konieczno ści korektę uwzględniającą zwierzęta, które prze żyły. 
Sprawozdanie z badania  
52. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść i własności fizykochemiczne,  
— dane identyfikacyjne,  
— źródło substancji chemicznej,  
— numer partii,  
— świadectwo analizy chemicznej.  
Nośnik (w stosownych przypadkach)  
— uzasadnienie wyboru no śnika (jeżeli jest inny ni ż woda).  
Badane zwierz ęta 
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie takiego wyboru,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt na pocz ątku badania,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— źródło, warunki przetrzymywania, pokarm itp.,  
— masa cia ła poszczególnych zwierz ąt na pocz ątku badania.  
Warunki badania  
— uzasadnienie drogi podania i doboru dawek,  
— w stosownych przypadkach metody statystyczne zastosowane do analizy 
danych,  
— szczegó łowe informacje na temat postaci u żytkowej badanej substancji 
chemicznej/przygotowywania pokarmu,  
— dane analityczne dotycz ące osiąganego st ężenia, stabilno ści 
i jednorodno ści preparatu,  
— droga podania i szczegó łowe dane dotycz ące podawania badanej 
substancji chemicznej,  
— w przypadku bada ń inhalacyjnych informacje o tym, czy nara żenie 
odbywa si ę wyłącznie przez nos czy przez ca łe ciało, 
— dawki rzeczywiste (mg/kg masy cia ła/dzień) oraz w stosownych przy ­
padkach wska źnik konwersji st ężenia badanej substancji chemicznej 
w pokarmie/wodzie pitnej (mg/kg lub ppm) do dawki rzeczywistej,  
— szczegó łowe informacje o pokarmie i jako ści wody.  
Wyniki (nale ży przedstawi ć zestawienie danych w tabeli oraz dane dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt) 
— dane dotycz ące zwierz ąt, które prze żyły, 
— masa cia ła/zmiany masy cia ła, 
— dane dotycz ące spożycia pokarmu, wyliczenia wydajno ści pokarmu, je śli 
przeprowadzono, oraz w stosownych przypadkach dane dotycz ące 
spożycia wody,  
— dane dotycz ące efektu toksycznego wed ług płci i poziomu dawki, 
włączając objawy toksyczno ści, 
— rodzaj, wyst ępowanie (i ostro ść, jeśli poddano j ą ocenie) oraz czas 
trwania obserwowanych objawów klinicznych (tak odwracalnych, jak i nieodwracalnych),
 
— wyniki badania oftalmologicznego,  
— wyniki badania hematologicznego,  
— wyniki klinicznych bada ń biochemicznych,  
— wyniki analizy moczu,  
— wynik wszelkich bada ń neurotoksyczno ści lub immunotoksyczno ści, 
— masa cia ła w chwili zgonu,  
— masa organów (i w stosownych przypadkach ich wspó łczynniki),  
— wyniki sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników bada ń histopatologicznych 
związanych z poddawaniem zwierz ąt działaniu substancji badanej,  
— dane dotycz ące wchłaniania, je śli są dostępne. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
W stosownych przypadkach statystyczne opracowanie wyników  
Omówienie wyników, w tym:  
— zależność dawka-odpowied ź, 
— rozwa żenie wszelkich informacji na temat sposobu dzia łania,  
— omówienie wszelkich podej ść modelowych,  
— określenie BMD, NOAEL lub LOAEL,  
— historyczne dane kontrolne,  
— znaczenie dla ludzi.  
Wnioski  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rzym, 1995), wewn ętrzny doku ­
ment roboczy, Dyrekcja ds. Środowiska, OECD, Pary ż. 
(2) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
(3) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW i in. (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40, 145–191.  
(4) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.
 
(5) Rozdzia ł B.27 niniejszego za łącznika, Badanie toksyczno ści podprzewle ­
kłej drogą pokarmow ą – badania toksyczno ści drogą pokarmow ą na gatun ­
kach innych ni ż gryzonie metod ą powtarzanej 90-dniowej dawki.  
(6) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – wyd. drugie. Series on Testing and Assessment nr 116, dost ępne 
na publicznej stronie OECD po święconej wytycznym dotycz ącym bada ń: 
www.oecd.org/env/testguidelines.  
(7) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Pary ż.
 
(8) Rozdzia ł B.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść powtarzanej (28 dni) 
dawki (inhalacyjna).  
(9) Rozdzia ł B.29 niniejszego za łącznika. Badanie podprzewlek łej toksycz ­
ności inhalacyjnej – 90-dniowe badania inhalacyjne z wykorzystaniem 
gatunków gryzoni.  
(10) Rozdzia ł B.9 niniejszego za łącznika, Toksyczno ść powtarzanej (28 dni) 
dawki (dermalna).  
(11) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR i in. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Moderniza ­
tion of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
(12) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T i in. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
 
(13) Doe JE, Boobis AR, Blacker A i in. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 453
 
(14) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM i in. (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69–98.  
(15) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
nr 35 oraz Series on Pesticides nr 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paryż.
 
(16) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation, nr 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pary ż.
 
(17) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
(18) ILSI (Mi ędzynarodowy Instytut Nauk Biologicznych) (1997). Principles for 
the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (red.). ILSI Press, Waszyngton, D.C.
 
(19) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 
22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do 
celów naukowych (Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33).  
(20) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication nr 86-23. Waszyngton D.C., Departament Zdrowia i Opieki Spo łecznej Stanów Zjednoczonych.
 
(21) GV-SOLAS (Towarzystwo Nauk o Zwierz ętach Laboratoryjnych, Gesells ­
chaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
(22) GV-SOLAS (Towarzystwo Nauk o Zwierz ętach Laboratoryjnych, Gesells ­
chaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of labora ­
tory animals in various housing systems.  
(23) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. 2001. A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23.  
(24) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria 
Document nr 60.  
(25) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
(26) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
(27) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.  
(28) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and 
Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.  
(29) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. 
Teratol. 13: 599–609.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 454
 
(30) Weingand K, Brown G, Hall R i in. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
(31) EMEA, projekt dokumentu pt. „Non-clinical guideline on drug-induced 
hepatotoxicity” (nr ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(32) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK i in. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126–131.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 455
 
Dodatek 1  
DEFINICJA  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  BADANIE PRZEDURODZENIOWEJ TOKSYCZNO ŚCI 
ROZWOJOWEJ  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest kopi ą OECD TG 414 (2001).  
1.1. WPROWADZENIE  
Opisana metoda okre ślania toksyczno ści rozwojowej opracowana 
została w celu uzyskania ogólnych informacji dotycz ących wpływu 
przedurodzeniowej ekspozycji na badane zwierz ę ciężarne oraz na 
organizm rozwijaj ący się in utero ; może ona obejmowa ć zarówno 
skutki dla matki, jak równie ż śmierć, wady w budowie lub niepra ­
widłowości wzrostu p łodu. Badanie niedoborów funkcjonalnych, 
chociaż są one ważnym elementem rozwoju, nie stanowi integralnej 
części tej metody. Mog ą być badane w oddzielnym badaniu lub te ż 
jako dodatek do tego badania, przy wykorzystaniu metody badania neurotoksyczno ści rozwojowej. W celu uzyskania informacji 
o badaniu niedoborów funkcjonalnych i innych skutków postnatal ­
nych nale ży zapozna ć się z metodą badania toksyczno ści reprodukcji 
oraz badaniem neurotoksyczno ści rozwojowej jako metodami w łaści­
wymi.
 
W indywidualnych przypadkach niniejsza metoda badania mo że 
wymagać konkretnego dostosowania, uwzgl ędniającego konkretn ą 
wiedzę, np. o fizykochemicznych lub toksykologicznych w łas­
nościach badanej substancji. Dostosowania takie s ą dopuszczalne, 
jeżeli przekonuj ące dowody naukowe świadczą, że doprowadzi ona 
do badania przynosz ącego więcej informacji. W takim przypadku 
należy w sprawozdaniu z bada ń dokładnie udokumentowa ć wspom­
niane dowody naukowe.  
1.2. DEFINICJE  
Toksykologia rozwojowa:  badanie niekorzystnych skutków wywie ­
ranych na rozwijaj ący się organizm, które mog ą być wynikiem 
ekspozycji przed zap łodnieniem, podczas rozwoju przedurodzenio ­
wego lub po urodzeniu, do okresu osi ągnięcia dojrza łości płciowej. 
Główne przejawy toksyczno ści rozwojowej obejmuj ą: 1) śmierć 
organizmu; 2) nieprawid łowość strukturaln ą; 3) zmian ę we wzro ście; 
i 4) niedobór funkcjonalny. Toksykologia rozwojowa by ła wcześniej 
często nazywana teratologi ą. 
Niekorzystny skutek:  jakakolwiek maj ąca związek z poddaniem 
badaniu zmiana, w stosunku do danych bazowych, która zmniejsza zdolność organizmu do prze życia, rozmna żania lub przystosowania 
się do środowiska. W odniesieniu do najszerzej uj ętej toksykologii 
rozwojowej obejmuje on ka żdy skutek, który stanowi przeszkod ę dla 
normalnego rozwoju jaja p łodowego, przed i po urodzeniu.
 
Zmiana we wzro ście: zmiana w narz ądzie, masie cia ła lub wielko ści 
potomka.  
Nieprawid łowości (anomalie):  strukturalne nieprawid łowości 
w rozwoju, obejmuj ące zarówno wady rozwojowe jak 
i odchylenia (28).  
Wada rozwojowa/znaczna nieprawid łowość: zmiana strukturalna 
uznana za szkodliw ą dla zwierz ęcia (może być również letalna), 
która zazwyczaj wyst ępuje rzadko.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Odchylenie/nieznaczna nieprawid łowość: zmiana strukturalna 
uznana za ma ło szkodliw ą lub nieszkodliw ą dla zwierz ęcia; może 
być przejściowa i w populacji kontrolnej mo że występować 
względnie często. 
Jajo płodowe:  całość wytworów zap łodnionego jaja w ka żdym 
stadium rozwoju od zap łodnienia do urodzenia, wliczaj ąc w to 
błony pozazarodkowe, jak równie ż sam zarodek lub p łód. 
Zagnieżdżenie:  przyczepienie si ę blastocysty do nab łonka wyście­
lającego macic ę, obejmuj ące równie ż przenikni ęcie blastocysty 
poprzez nab łonek macicy i jej zag łębienie się w śluzówce macicy.  
Zarodek:  wczesne stadium rozwojowe jakiegokolwiek organizmu, 
szczególnie rozwijaj ący się produkt zap łodnienia jaja, po pojawieniu 
się długiej osi a ż do stanu, w którym widoczne s ą wszystkie g łówne 
struktury.  
Embriotoksyczno ść: szkodliwa dla normalnej budowy, rozwoju, 
wzrostu i/lub zdolno ści do życia zarodka.  
Płód: nienarodzone potomstwo w okresie postembrionalnym.  
Toksyczno ść dla płodu:  szkodliwa dla normalnej budowy, rozwoju, 
wzrostu i/lub zdolno ści do życia płodu. 
Poronienie:  przedwczesne wydalenie z macicy produktów zap łod­
nienia: zarodka lub p łodu niezdolnego do życia.  
Resorpcja:  jajo płodowe, które po zagnie żdżeniu się w macicy 
następnie obumar ło i zostało lub jest resorbowane.  
Wczesna resorpcja:  ślad zagnie żdżenia bez widocznego zarodka/ ­
płodu. 
Późna resorpcja:  martwy zarodek lub p łód z zewn ętrznymi zmia ­
nami zwyrodnieniowymi.  
NOAEL:  poziom dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę 
szkodliwych zmian oznacza najwy ższą dawkę lub poziom ekspozycji 
przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych zmian.  
1.3. SUBSTANCJA ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Substancja testowa podawana jest zwykle ci ężarnym samicom co 
najmniej od zagnie żdżenia do ostatniego dnia przed planowanym 
uśmierceniem, które powinno przypada ć jak najbli żej normalnej 
daty porodu bez ryzyka utraty danych wynikaj ących z wczesnego 
porodu. Omawiana metoda nie ma na celu badania jedynie okresu organogenezy (np. dni 5–15 u gryzonia i dni 6–18 u królika), ale 
również skutki wyst ępujące w okresie przedimplantacyjnym, 
w stosownych przypadkach, przez ca ły okres ci ąży do ostatniego 
dnia przed cesarskim ci ęciem. Na krótko przed cesarskim ci ęciem 
samice zostaj ą uśmiercone, zawarto ść macic zbadana, a p łody 
oceniane pod wzgl ędem widocznych zewn ętrznych nieprawid łowości 
i zmian w tkance mi ękkiej i kostnej.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. OPIS METODY BADA Ń 
1.5.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Zaleca się prowadzenie bada ń na najbardziej odpowiednim gatunku 
oraz wykorzystanie gatunków i szczepów laboratoryjnych 
powszechnie u żywanych w badaniach toksyczno ści przeudrodzenio ­
wej. Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, a spo śród 
z gatunków innych ni ż gryzonie – królik. Je żeli wykorzystuje si ę 
inny gatunek nale ży podać uzasadnienie.  
1.5.2.  Warunki przebywania i warunki żywieniowe  
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 22  o C (± 3  o ) dla gryzoni i 18  o C (± 3  o ) dla królików. 
Chociaż wilgotno ść względna powinna wynosi ć co najmniej 30 % 
i pożądane jest, żeby nie przekracza ła 70 % poza czasem czyszczenia 
pomieszczenia, celem powinno by ć utrzymywanie jej na poziomie 
50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin 
jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia mo żna stosowa ć konwencjo ­
nalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody 
pitnej.  
Procedury krycia przeprowadza si ę w klatkach nadaj ących się do 
tego celu. Chocia ż pożądane jest trzymanie zwierz ąt krytych 
w oddzielnych klatkach, dopuszczalne jest równie ż umieszczanie 
w klatkach w ma łych grupach.  
1.5.3.  Przygotowania  
Należy wykorzystywa ć zdrowe zwierz ęta aklimatyzowane do 
warunków laboratoryjnych co najmniej przez okres pi ęciu dni 
przed rozpocz ęciem testu, niepoddawane wcze śniej procedurom 
badawczym. Badane zwierz ęta należy scharakteryzowa ć ze względu 
na gatunek, szczep, źródło, płeć, wagę i/lub wiek. Na ile to prak ­
tycznie mo żliwe, zwierz ęta we wszystkich grupach badanych 
powinny by ć jednakowej masy cia ła i wieku. Do ka żdego poziomu 
dawek nale ży wykorzysta ć młode dojrza łe samice, które nie rodzi ły. 
Samice powinny by ć kryte samcami tego samego gatunku i szczepu, 
należy równie ż unikać krycia pomi ędzy rodze ństwem. U gryzoni 
dzień 0 danej ci ąży jest okre ślany w momencie wykrycia czopu 
nasienia i/lub spermy w pochwie; u królików dzie ń 0 określany 
jest zwykle w dniu kopulacji lub sztucznej inseminacji, je śli zasto­
sowano t ę technikę. Pokryte samice nale ży przydzieli ć w sposób 
losowy do grup kontrolnych i badanych. Klatki powinny by ć usta­
wione w taki sposób, żeby zminimalizowa ć możliwy wpływ poło­ 
żenia klatki. Zwierz ęta są identyfikowane jednoznacznie. Pokryte 
samice nale ży przydzieli ć w sposób losowy do grup kontrolnych 
i badanych, za ś jeżeli samice s ą pokrywane w seriach, zwierz ęta 
z każdej serii nale ży rozdzieli ć równomiernie pomi ędzy grupy. 
Podobnie samice zainseminowane przez tego samego samca powinny by ć rozdzielone równomiernie pomi ędzy grupy.
 
1.6. PROCEDURA  
1.6.1.  Liczba i p łeć zwierząt 
Każda grupa badana i kontrolna powinna sk ładać się 
z wystarczaj ącej liczby samic, aby znalaz ło się w nich oko ło 20 
samic z miejscami zagnie żdżenia, w czasie kiedy poddawane s ą 
sekcji. Grupy sk ładające się z mniej ni ż 16 zwierz ąt z miejscami 
zagnieżdżenia mog ą być niewłaściwe. Zgony matek nie zawsze 
powodują nieważność badania, pod warunkiem że nie przekraczaj ą 
ok. 10 %.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Przygotowanie dawek  
Jeżeli w celu usprawnienia dawkowania u żywa się nośnika lub 
innego dodatku, nale ży uwzględnić następujące charakterystyki: 
skutek wywierany na absorpcj ę, dystrybucj ę, metabolizm oraz na 
zatrzymywanie lub ekskrecj ę substancji testowej; skutki wywierane 
na chemiczne w łasności substancji testowej, które mog ą zmienić jej 
charakterystyk ę toksyczn ą; należy równie ż uwzględnić wpływ na 
pobieranie pokarmu lub wody, lub stan od żywienia zwierz ąt. Nośnik 
nie powinien wykazywa ć toksyczno ści rozwojowej ani wp ływać na 
reprodukcj ę. 
1.6.3.  Dawkowanie  
Zazwyczaj substancja testowa powinna by ć podawana codziennie od 
dnia zagnie żdżenia (np. w dniu 5 po kryciu) do dnia przed ci ęciem 
cesarskim. Je żeli badania wst ępne, jeśli są dostępne, nie wskazuj ą na 
dużą możliwość wystąpienia strat przedimplantacyjnych, podawanie 
można rozciągnąć na cały okres ci ąży, od dnia krycia do dnia 
poprzedzaj ącego planowane u śmiercenie. Jest rzecz ą powszechnie 
znaną, że niewłaściwe post ępowanie ze zwierz ętami lub stres 
podczas ci ąży może powodowa ć straty przedurodzeniowe. W celu 
zabezpieczenia si ę przed stratami przedurodzeniowymi, spowodowa ­
nymi przez czynniki niezwi ązane z podawaniem dawek, nale ży 
unikać niekoniecznego niepokojenia i przenoszenia ci ężarnych 
zwierząt, jak równie ż powodowania stresów przez czynniki 
zewnętrzne, takie jak np. ha łas. 
Należy użyć co najmniej trzech grup dawkowania i jednoczesn ą 
grupę kontroln ą. Zdrowe zwierz ęta są losowo przydzielane do 
grupy kontrolnej i badanej. Poziomy dawkowania powinny by ć zróż­
nicowane w celu osi ągnięcia stopniowania skutków toksycznych. 
Jeżeli charakter fizykochemiczny lub w łasności biologiczne 
substancji testowanej nie powoduj ą ograniczenia, najwy ższą dawkę 
należy dobrać w taki sposób, aby wywo łać pewną toksyczno ść 
rozwojow ą i/lub toksyczno ść względem matek (objawy kliniczne 
lub spadek masy cia ła, ale nie śmierć lub powa żne cierpienie). Co 
najmniej jedna dawka po średnia nie powinna dawa ć żadnych oznak 
toksyczno ści względem matek lub toksyczno ści rozwojowej. Nale ży 
zastosowa ć sekwencj ę coraz mniejszych dawek, aby zademonstrowa ć 
wszelkie reakcje zwi ązane z dawkowaniem i okre ślić poziom dawko ­
wania, przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych zmian (NOAEL). 
Dwa do czterech interwa łów dawkowania jest cz ęsto optymalne dla 
ustalenia malej ących poziomów dawki i dodanie czwartej grupy 
badanej jest cz ęsto bardziej po żądane niż stosowanie bardzo du żych 
interwałów dawek (np. wspó łczynnik wi ększy od 10) mi ędzy dawko ­
waniem. Chocia ż celem jest ustalenie NOAEL u matek, badania, 
które nie ustalaj ą tego poziom ą, mogą być również do przyj ęcia (1).  
Poziomy dawek nale ży dobiera ć z uwzględnieniem wszelkich istniej ­ 
ących danych o toksyczno ści, jak równie ż dodatkowych informacji 
dotyczących metabolizmu i toksykokinetyki. Tego rodzaju infor ­
macje mog ą również pomóc w wykazaniu odpowiedniego doboru 
reżimu dawkowania.  
Należy użyć równoczesnej grupy kontrolnej. Powinna to by ć grupa 
kontrolna poddawana pozorowanej terapii lub grupa kontrolna nośnika, jeżeli przy podawaniu substancji testowanej jest stosowany 
nośnik. Wszystkie grupy winny otrzymywa ć te same obj ętości 
substancji testowanej lub no śnika. Ze zwierz ętami grup(-y) kontro ­
lnych(-ej) powinno si ę obchodzi ć w sposób identyczny jak ze zwie ­
rzętami grupy badanej. Grupie kontrolnej no śnika nale ży podawa ć 
nośnik w najwi ększej stosowanej obj ętości (takiej jak w grupie 
badanej o najmniejszym poziomie dawki).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Badanie graniczne  
Jeżeli badanie przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 
1 000 mg/dzie ń/kg masy cia ła w podaniu doustnym, stosuj ący proce­
dury opisane dla tego badania, nie wywo łuje widocznych objawów 
zatrucia u zwierz ąt ciężarnych ani u ich potomstwa, i je żeli nie 
należałoby spodziewa ć się toksyczno ści na podstawie istniej ących 
danych (np. dotycz ących zwi ązków strukturalnie pokrewnych i/lub 
powiązanych metabolicznie), wtedy pe łne badanie przy zastosowaniu 
trzech poziomów dawkowania mo że być uznane za niepotrzebne. 
Przewidywana ekspozycja ludzi mo że wskaza ć na potrzeb ę zastoso­
wania w badaniu granicznym wi ększej dawki doustnej. 
W odniesieniu do innych dróg podawania, na przyk ład wziewnej 
lub stosowania na skór ę, własności fizyczne i chemiczne substancji 
testowanej mog ą często wskazywa ć i ogranicza ć najwyższy możliwy 
do osiągnięcia poziom ekspozycji (zastosowanie na skór ę, na przy ­
kład, nie powinno powodowa ć silnej toksyczno ści miejscowej).  
1.6.5.  Podawanie  
Testowana substancja lub no śnik podawane s ą zazwyczaj doustnie 
przez intubacj ę. Jeżeli zostanie zastosowana inna droga podawania, 
prowadzący badania powinien przedstawi ć uzasadnienie i racjonaln ą 
podstawę wyboru, mog ą być również konieczne odpowiednie mody ­
fikacje (2)(3)(4). Testowana substancja powinna by ć podawana 
każdego dnia o podobnym czasie.  
Dawka dla danego zwierz ęcia powinna zwykle opiera ć się na 
ostatnim okre śleniu jego masy cia ła. Należy jednak zachowa ć ostroż­
ność, kiedy dostosowuje si ę dawki w ostatnim trymestrze ci ąży. 
W doborze dawek nale ży wykorzysta ć dostępne dane aby zapobiec 
nadmiernej toksyczno ści względem matek. Je śli jednak zostanie 
zaobserwowana nadmierna toksyczno ść u matek poddanych terapii, 
zwierzęta te nale ży humanitarnie u śmiercić. Jeżeli kilka ci ężarnych 
zwierząt wykazuje oznaki nadmiernej toksyczno ści, należy rozważyć 
uśmiercenie zwierz ąt tej grupy dawkowania. Kiedy substancja poda ­
wana jest do żołądka, pożądane jest podawanie w jednorazowej 
dawce przy u życiu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej. 
Maksymalna obj ętość cieczy, która mo że być podana jednorazowo, 
zależy od wielko ści badanego zwierz ęcia. Objętość ta nie powinna 
przekracza ć 1 ml/100 g masy cia ła, oprócz roztworów wodnych, 
w przypadku których mo żna użyć 2 ml/100 g masy cia ła. 
W przypadku stosowania jako no śnika oleju kukurydzianego, obj ę­
tość nie powinna przekracza ć 0,4 ml/100 g masy cia ła. Zmienno ść 
objętości w teście powinna by ć zminimalizowana przez dostoso ­
wanie stężenia, tak aby zapewni ć stałą objętość dla wszystkich 
poziomów dawki.  
1.6.6.  Obserwacja matek  
Obserwacje kliniczne powinny by ć przeprowadzane i odnotowywane 
co najmniej raz dziennie, najlepiej ka żdego dnia w tym samym 
czasie, bior ąc pod uwag ę szczytowy okres przewidywanych 
objawów po dawkowaniu. Stan zdrowia zwierz ąt powinien by ć 
odnotowywany, pod k ątem śmiertelno ści, zachorowalno ści, 
odnośnych zmian zachowania i wszelkich objawów widocznej 
toksyczno ści. 
1.6.7.  Masa cia ła i spożycie pożywienia  
Zwierzęta należy zważyć w dniu 0 ci ąży lub nie pó źniej niż w dniu 
3 ciąży, jeżeli zwierz ęta kryte w znanym czasie dostarczane s ą przez 
hodowcę z zewn ątrz, następnie w pierwszym dniu dawkowania, 
potem co najmniej raz na trzy dni podczas okresu dawkowania 
oraz w dniu planowanego u śmiercenia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Spożycie pożywienia odnotowuje si ę w odstępach trzydniowych 
i należy to robić równocze śnie z ważeniem zwierz ąt. 
1.6.8.  Sekcja zw łok 
Samice u śmierca si ę na jeden dzie ń przed przewidywan ą datą 
porodu. Samice wykazuj ące objawy poronienia lub porodu przed ­
wczesnego przed dat ą planowanego u śmiercenia nale ży uśmiercić 
i poddać dokładnemu badaniu ogl ądowemu.  
W momencie u śmiercenia lub śmierci w okresie trwania badania 
matkę należy zbadać oglądowo w kierunku nieprawid łowości struk­
turalnych lub zmian patologicznych. W celu zminimalizowania b łędu 
systematycznego najlepiej jest, je żeli oceny matek podczas ci ęcia 
cesarskiego oraz nast ępcze analizy p łodu prowadzone s ą przez 
osoby nie świadome przynale żności samicy do grupy poddanej tera ­
pii. 
1.6.9.  Analiza zawarto ści macicy  
Bezpośrednio po u śmierceniu, lub tak szybko jak mo żliwe po 
śmierci, nale ży wyciąć macice i ustali ć ciężarność. Macice, które 
wyglądają na nieci ężarne nale ży poddać dalszemu badaniu (np. 
przy użyciu barwienia siarczkiem amonu w przypadku gryzoni, 
barwieniem Salewskiego lub inn ą odpowiedni ą metod ą 
w przypadku królików) w celu potwierdzenia ich nieci ężarnego 
statusu (5).  
Należy zważyć ciężarne macice wraz z szyjk ą. Nie uzyskuje si ę 
wielkości mas ci ężarnych macic zwierz ąt padłych w czasie badania.  
U zwierz ąt ciężarnych nale ży określić liczbę ciałek żółtych.  
Należy zbadać zawarto ść macicy pod k ątem liczby obumar łych 
zarodków oraz liczby p łodów zdolnych do życia. Nale ży określić 
stopień resorpcji w celu ustalenia wzgl ędnego czasu śmierci jaja 
płodowego (zob. sekcja 1.2).  
1.6.10.  Badanie p łodów  
Należy określić płeć i ciężar ciała każdego płodu. 
Każdy płód bada si ę w kierunku zmian zewn ętrznych (6).  
Płody należy zbadać pod kątem zmian w tkance mi ękkiej i kostnej 
(np. odchylenia, wady lub nieprawid łowości) (7)(8)(9)(10)(11)(12) 
(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24). Podzia ł zmian 
w płodach na kategorie jest po żądany, ale nie jest wymagany. Je żeli 
wprowadza si ę podział na kategorie, nale ży dokładnie zdefiniowa ć 
kryteria ka żdej kategorii. Szczególn ą uwagę należy zwrócić na drogi 
rodne, które nale ży zbadać pod kątem zmian rozwojowych.  
W przypadku gryzoni w przybli żeniu połowa każdego miotu 
powinna zosta ć wypreparowana i zbadana pod k ątem zmian 
w tkance kostnej. Pozosta ła część miotu powinna zosta ć wypreparo ­
wana i oceniona pod k ątem zmian w tkance mi ękkiej, 
z wykorzystaniem przyj ętej i właściwej metody ci ęcia skrawków 
seryjnych lub z zastosowaniem techniki precyzyjnej sekcji w ca łości. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 462
 
Dla zwierz ąt innych ni ż gryzonie, np. królików, nale ży zbadać 
wszystkie p łody pod k ątem zmian w tkance kostnej i mi ękkiej. 
Ciała tych p łodów oceniane s ą poprzez precyzyjn ą sekcję, pod 
kątem zmian w tkance mi ękkiej, które mo że równie ż obejmowa ć 
procedury oceny wewn ętrznej struktury serca (25). G łowy połowy 
zbadanych w ten sposób p łodów odcina si ę i poddaje procedurze 
oceny pod k ątem zmian w tkance mi ękkiej (wraz z oczami, 
mózgiem, przewodami nosowymi i j ęzykiem), stosuj ąc metody stan ­
dardowego skrawania seryjnego (26) lub innej metody o podobnej 
czułości. Ciała tych p łodów i pozosta łych płodów niebadanych 
należy przygotowa ć i zbadać pod kątem nieprawid łowości szkieleto ­
wych, stosuj ąc te same metody jak opisane dla gryzoni.  
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Dane nale ży podawa ć indywidualnie dla matek oraz ich potomstwa 
i podsumowa ć w formie tabeli wykazuj ącej, w odniesieniu do ka żdej 
grupy badanej i ka żdego pokolenia, liczb ę zwierząt na pocz ątku 
badania, liczb ę zwierząt padłych podczas badania lub u śmierconych 
ze względów humanitarnych, czas zgonu lub humanitarnego u śmier­
cenia zwierz ęcia, liczb ę ciężarnych samic, liczb ę zwierząt wykazuj ­ 
ących zaobserwowane oznaki toksyczno ści, z podaniem czasu ich 
pojawienia si ę, czasu trwania, ci ężkości wszelkich skutków toksycz ­
ności, rodzajów obserwacji zarodków/p łodów oraz wszelkich 
odnośnych danych miotów.  
Wyniki liczbowe nale ży ocenić właściwą metodą statystyczn ą, przyj­
mując miot jako jednostk ę w analizie danych. Nale ży zastosowa ć 
uznaną metodę statystyczn ą; wyboru metod statystycznych nale ży 
dokonać w ramach projektowania badania i uzasadni ć. 
W sprawozdaniu nale ży również umieścić dane dotycz ące zwierz ąt, 
które nie prze żyły do terminu planowanego u śmiercenia. 
W odpowiednich przypadkach dane te mog ą zostać włączone do 
średnich dla grup. W sprawozdaniu nale ży również zamieścić dane 
odnoszące się do zwierz ąt, które nie prze żyły do daty planowanego 
uśmiercenia. W stosownych przypadkach dane takie mog ą być 
uwzględniane w średnich dla grup. Znaczenie danych uzyskanych 
z takich zwierz ąt, a tym samym ich uwzgl ędnienie lub nieuwzgl ęd­
nienie w średniej (średnich), nale ży uzasadni ć i ocenić indywidualnie 
dla każdego przypadku.  
2.2. OCENA WYNIKÓW  
Wyniki badania przeudrodzeniowej toksyczno ści rozwojowej nale ży 
ocenić w odniesieniu do obserwowanych skutków. Ocena obejmuje 
następujące informacje:  
— wyniki bada ń matek, zarodków/p łodów, w tym ocena zwi ązku 
lub jego braku pomi ędzy ekspozycj ą zwierząt na badan ą 
substancję oraz częstość i ciężkość wszelkich zaobserwowanych 
skutków,  
— kryteria zastosowane do wyró żnienia kategorii nieprawid łowości 
zewnętrznych, nieprawid łowości tkanki mi ękkiej i nieprawid ło­
wości szkieletowych p łodu, jeśli zastosowano kategoryzacj ę, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— w stosownych przypadkach, wcze śniej uzyskane dane kontrolne 
wspomagaj ące interpretacj ę wyników badania,  
— liczby wykorzystane do obliczenia wszystkich danych procento ­
wych lub wska źników,  
— w stosownych przypadkach, odpowiedni ą analizę statystyczn ą 
obejmującą wystarczaj ące informacje dotycz ące metody analizy, 
tak aby niezale żny recenzent/statystyk móg ł dokonać powtórnej 
oceny i odtworzy ć analizę. 
W każdym badaniu, które wykaza ło brak jakiegokolwiek skutku 
toksycznego, nale ży rozwa żyć dalsze badania absorpcji 
i biologicznej dost ępności testowanej substancji.  
2.3. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Badanie przeudrodzeniowej toksyczno ści rozwojowej dostarcza 
informacji o skutkach powtarzanej w czasie ci ąży ekspozycji 
matek na dan ą substancj ę, jak równie ż o skutkach wywieranych na 
wewnątrzmaciczny rozwój ich potomstwa. Wyniki badania nale ży 
rozpatrywa ć w połączeniu z wynikami uzyskanymi w badaniach 
toksyczno ści podchronicznej, rozrodczej, badaniach toksokinetycz ­
nych i innych. Poniewa ż nacisk po łożony jest zarówno na ogóln ą 
toksyczno ść w kategoriach punktów ko ńcowych toksyczno ści 
względem matek, jak i toksyczno ści rozwojowej, wyniki bada ń 
pozwolą do pewnego stopnia rozró żnić skutki rozwojowe wyst ę­
pujące przy nieobecno ści toksyczno ści ogólnej, od wywo ływanych 
tylko na tych poziomach dawkowania, które s ą toksyczne równie ż 
dla matki (27).  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące szczegó łowe infor ­
macje:  
Substancja testowana:  
— forma fizyczna, oraz, w odpowiednich przypadkach, w łasności 
fizykochemiczne,  
— identyfikacj ę w tym numer CAS, je śli jest znany/ustalony,  
— czysto ść. 
Nośnik (jeśli był użyty):  
— uzasadnienie wyboru no śnika, jeśli jest inny ni ż woda.  
Zwierzęta badane:  
— użyty gatunek i szczep,  
— liczba i wiek zwierz ąt, 
— źródło, warunki środowiska, po żywienie itp.,  
— indywidualna masa cia ła zwierząt na pocz ątku badania.  
Warunki badania:  
— racjonalne uzasadnienie doboru poziomu dawek,  
— szczegó ły formulacji substancji badanej/przygotowywania po ży­
wienia osi ągnięte stężenie, stabilno ść i jednorodno ść preparatu,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— szczegó ły dotyczące podawania substancji testowej,  
— w stosownych przypadkach, przeliczenie st ężeń substancji 
testowej w po żywieniu/wodzie pitnej (ppm) na dawk ę rzeczy­
wistą mg/kg masy cia ła/dzień), 
— warunki środowiskowe,  
— szczegó ły jakości pożywienia i wody.  
Wyniki:  
Dane dotycz ące toksycznej reakcji matek w rozbiciu na poziomy 
dawkowania powinny obejmowa ć poniższe, ale nie powinny by ć 
do nich ograniczone:  
— liczba zwierz ąt na pocz ątku badania, zwierz ąt, które prze żyły, 
zwierząt ciężarnych, roni ących, liczba zwierz ąt rodzących przed ­
wcześnie, 
— data śmierci podczas do świadczenia lub informacja, że zwierzęta 
przeżyły do uśmiercenia,  
— dane uzyskane dla zwierz ąt, które nie prze żyły do planowanego 
uśmiercenia, nale ży umieścić w sprawozdaniu, ale bez uwzgl ęd­
niania w statystycznych porównaniach mi ędzy grupowych,  
— data obserwacji ka żdego nieprawid łowego objawu klinicznego 
i jego dalszego przebiegu,  
— masa cia ła, zmiana masy cia ła i masa ci ężarnej macicy, w tym, 
nieobowiązkowo, zmian ę masy cia ła skorygowanej wzgl ędem 
ciężaru ciężarnej macicy,  
— spożycie pokarmu, oraz w wody, w przypadkach gdy jest 
mierzone,  
— stwierdzenia sekcji, w tym mas ę ciężarnej macicy,  
— warto ści NOAEL w odniesieniu do skutków wzgl ędem matek 
i skutków rozwojowych powinny zosta ć zamieszczone 
w sprawozdaniu.  
Rozwojowe punkty ko ńcowe w podziale na poziomy dawek, dla 
miotów z zagnie żdżeniami, obejmuj ące: 
— liczbę ciałek żółtych,  
— liczbę zagnieżdżeń i procent żywych i martwych p łodów oraz 
resorpcji,  
— liczbę i procent strat przed- i poimplantacyjnych.  
Rozwojowe punkty ko ńcowe w podziale na poziomy dawek, dla 
miotów z żywymi płodami, obejmuj ące: 
— liczbę i procent żywego potomstwa,  
— proporcj ę płci, 
— masy cia ła płodów, najlepiej w podziale na p łci i łącznie dla obu 
płci, 
— wady rozwojowe zewn ętrzne, tkanki mi ękkiej i szkieletu, oraz 
inne odno śne zmiany,  
— w stosownych przypadkach, kryteria podzia łu na kategorie,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— całkowitą liczbę i procent p łodów i miotów z jakimikolwiek 
zmianami zewn ętrznymi, tkanki mi ękkiej lub zmianami szkiele ­
towymi, jak równie ż rodzaje i cz ęstości występowania indywi ­
dualnych nieprawid łowości i innych odno śnych zmian.  
Dyskusja wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Kavlock R.J. et al. (1996) A Simulation Study of the Influence 
of Study Design on the Estimation of Benchmark Doses for 
Developmental Toxicity.  Risk Analysis  16; 399–410.  
(2) Kimmel, C.A. and Francis, E.Z. (1990) Proceedings of the 
Workshop on the Acceptability and Interpretation of Dermal Developmental Toxicity Studies.  Fundamental and Applied 
Toxicology  14; 386–398.
 
(3) Wong, B.A., et al. (1997) Developing Specialized Inhalation 
Exposure Systems to Address Toxicological Problems.  CIIT 
Activities  17; 1–8.  
(4) US Environmental Protection Agency (1985) Subpart 
E-Specific Organ/Tissue Toxicity, 40 CFR 798.4350; Inhala ­
tion Developmental Toxicity Study.  
(5) Salewski, E. (1964) Faerbermethode zum Makroskopischen 
Nachweis von Implantations Stellen am Uterusder Ratte.  
Naunyn-Schmeidebergs Archiv fur Pharmakologie undExperi ­
mentelle Pathologie  247: 367.  
(6) Edwards, J.A. (1968) The external Development of the Rabbit 
and Rat Embryo.  In Advances in Teratology.  D.H.M. Woolam 
(ed.) Vol. 3. Academic Press, NY.  
(7) Inouye, M. (1976) Differential Staining of Cartilage and Bone 
in Fetal Mouse Skeleton by Alcian Blue and Alizarin Red S.  
Congenital Anomalies  16; 171–173.  
(8) Igarashi, E. et al. (1992) Frequency Of Spontaneous Axial 
Skeletal Variations Detected by the Double Staining Techni ­
quefor Ossified and Cartilaginous Skeleton in Rat Foetuses.  
Congenital Anomalies  32; 381–391.  
(9) Kimmel, C.A. et al. (1993) Skeletal Development Following 
Heat Exposure in the Rat.  Teratology  47; 229–242.  
(10) Marr, M.C. et al. (1988) Comparison of Single and Double 
Staining for Evaluation of Skeletal Development: The Effects 
of Ethylene Glycol (EG) in CD Rats.  Teratology  37; 476.  
(11) Barrow, M.V. and Taylor, W.J. (1969) A Rapid Method for 
Detecting Malformations in Rat Foetuses.  Journal of Morpho ­
logy 127:291–306.  
(12) Fritz, H. (1974) Prenatal Ossification in Rabbits ss Indicative 
of Foetal Maturity.  Teratology  11; 313–320.  
(13) Gibson, J.P. et al. (1966) Use of the Rabbit in Teratogenicity 
Studies.  Toxicology and Applied Pharmacology  9; 398–408.  
(14) Kimmel, C.A. and Wilson, J.G. (1973) Skeletal Deviation in 
Rats: Malformations or Variations?  Teratology  8; 309–316.  
(15) Marr, M.C. et al. (1992) Developmental Stages of the CD 
(Sprague-Dawley) Rat Skeleton after Maternal Exposure to 
Ethylene Glycol.  Teratology  46; 169–181.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 466
 
(16) Monie, I.W. et al. (1965) Dissection Procedures for Rat 
Foetuses Permitting Alizarin Red Staining of Skeleton and 
Histological Study of Viscera.  Supplement to Teratology 
Workshop Manual ; pp. 163–173.  
(17) Spark, C. and Dawson, A.B. (1928) The Order and Time of 
appearance of Centers of Ossification in the Fore and Hind 
Limbs of the Albino Rat, with Special Reference to the 
Possible Influence of the Sex Factor.  American Journal of 
Anatomy  41; 411–445.  
(18) Staples, R.E. and Schnell, V.L. (1964) Refinements in Rapid 
Clearing Technique in the KOH-Alizarin Red S Method for 
Fetal Bone.  Stain Technology  39; 61–63.  
(19) Strong, R.M. (1928) The Order Time and Rate of Ossification 
of the Albino Rat (Mus Norvegicus Albinus) Skeleton.  American Journal of Anatomy  36; 313–355.
 
(20) Stuckhardt, J.L. and Poppe, S.M. (1984) Fresh Visceral Exami ­
nation of Rat and Rabbit Foetuses Used in Teratogenicity 
Testing.  Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis  4; 
181–188.  
(21) Walker, D.G. and Wirtschafter, Z.T. (1957)  The Genesis of the 
Rat Skeleton.  Thomas, Springfield, JL. L 216/234 EN Official 
Journal of the European Union 16.6.2004.  
(22) Wilson, J.G. (1965) Embryological Considerations in Terato ­
logy. In  Teratology: Principles and Techniques,  
(23) Wilson J.G. and Warkany J. (eds). University of Chicago, 
Chicago, IL, pp 251–277. (23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. 
(eds). (1977)  Handbook of Teratology,  Vol. 4. Plenum, NY.  
(24) Varnagy, L. (1980) Use of Recent Fetal Bone Staining Tech ­
niques in the Evaluation of Pesticide Teratogenicity.  Acta Vet. 
Acad. Sci. Hung.  28; 233–239.  
(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in 
Mammalian Foetuses.  Teratology  9; 37–38.  
(26) Van Julsingha, E.B. and C.G. Bennett (1977) A Dissecting 
Procedure for the Detection of Anomalies in the Rabbit Foetal Head. In:  Methods in Prenatal Toxicology  Neubert, D., 
Merker, H.J. and Kwasigroch, T.E. (eds.). University of 
Chicago, Chicago, IL, pp. 126–144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register  
56; 63798–63826.  
(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental 
Abnormalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) 
Teratology 55; 249–292.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32.  BADANIA RAKOTWÓRCZO ŚCI 
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna z dotycz ącą badań wytyczn ą 
OECD nr 451 (2009). Pierwotny tekst TG 451 dotycz ącej badań rakotwór ­
czości przyjęto w 1981 r. Opracowanie niniejszej zmienionej metody 
badawczej B.32 uznano za konieczne w celu odzwierciedlenia ostatnich 
zmian w dziedzinie dobrostanu zwierz ąt i wymogów regulacyjnych (2) (3) 
(4) (5) (6). Aktualizacj ę niniejszej metody badawczej B.32 przeprowadzono 
równolegle z modyfikacjami rozdzia łu B.30 niniejszego za łącznika, dotycz ą­
cego bada ń toksyczno ści przewlek łej, oraz rozdzia łu B.33 niniejszego 
załącznika, dotycz ącego łączonych bada ń toksyczno ści przewlek łej/rako­
twórczości, w celu uzyskania dodatkowych informacji pochodz ących od 
zwierząt wykorzystywanych w badaniu oraz zapewnienia dalszych szczegó ­ 
łowych informacji na temat doboru dawek. Niniejsz ą metodę badawcz ą B.32 
opracowano w celu jej wykorzystywania w badaniach szerokiego zakresu chemikaliów, w tym pestycydów i chemikaliów przemys łowych. Nale ży 
zauważyć jednak, że niektóre dane szczegó łowe i wymogi mog ą różnić 
się w przypadku produktów farmaceutycznych (zob. wytyczne S1B 
dotycz
ące badania produktów farmaceutycznych pod k ątem rakotwórczo ści 
Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji (ICH)).  
2. Większość badań rakotwórczo ści przeprowadza si ę z wykorzystaniem 
gatunków gryzoni, w zwi ązku z czym niniejsza metoda badawcza przewi ­
dziana jest do stosowania przede wszystkim w badaniach z wykorzystaniem takich gatunków. W przypadku konieczno ści przeprowadzenia takich bada ń 
z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie nale ży zastosowa ć zasady 
i procedury okre ślone w niniejszej metodzie badawczej, wraz z zasadami 
i procedurami okre ślonymi w rozdziale B.27 niniejszego za łącznika, dotycz ­ 
ącym 90-dniowego badania toksyczno ści doustnej wywo łanej powtarzanym 
dawkowaniem z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie (6), przy 
wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji. Dalsze wytyczne s ą dostępne 
w wytycznych OECD nr 116 dotycz ących opracowywania 
i przeprowadzania bada ń toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści (7).
 
3. Trzy g łówne drogi podania stosowane w badaniach rakotwórczo ści to droga 
pokarmowa, dermalna i inhalacyjna. Wybór drogi podania zale ży od fizycz ­
nych i chemicznych w łaściwości substancji badanej oraz g łównej drogi 
narażenia ludzi. Dodatkowe informacje na temat wyboru drogi nara żenia 
przedstawiono w wytycznych nr 116 (7).  
4. W ramach niniejszej metody badawczej k ładzie się nacisk na nara żenie 
drogą pokarmow ą, która jest drog ą najczęściej stosowan ą w badaniach rako ­
twórczości. Przeprowadzenie bada ń rakotwórczo ści obejmuj ących nara żenie 
drogą dermaln ą lub inhalacyjn ą może być również konieczne do oceny 
ryzyka dla zdrowia ludzi lub wymagane w ramach pewnych systemów regulacji, obydwie te drogi nara żenia wymagaj ą jednak bada ń znacznie 
złożonych technicznie. Takie badania b ędą musiały zostać opracowane dla 
poszczególnych przypadków, jednak opisana w niniejszym rozdziale metoda 
badawcza maj ąca na celu ocen ę i oszacowanie rakotwórczo ści przy pokar ­
mowej drodze podania mo że stanowi ć podstaw ę dla protoko łu badania 
z zastosowaniem inhalacyjnej lub dermalnej drogi podania, 
z zastrze żeniem zalece ń dotyczących okresów poddawania dzia łaniu 
substancji, parametrów klinicznych, parametrów analizy patologicznej itp. Dostępne są wytyczne OECD dotycz ące podawania substancji badanych 
drogą
 dermaln ą (7) i drog ą inhalacyjn ą (7) (8). Podczas opracowywania 
badań uwzględniających dłuższy okres nara żenia drog ą inhalacyjn ą należy 
w szczególno ści wziąć pod uwag ę rozdział B.8 niniejszego za łącznika (9) 
oraz rozdzia ł B.29 niniejszego za łącznika (10), a tak że wytyczne OECD 
dotyczące badania ostrej toksyczno ści inhalacyjnej (8). W przypadku 
badań przeprowadzanych drog ą dermaln ą należy uwzględnić rozdział B.9 
niniejszego za łącznika (11).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Badanie rakotwórczo ści dostarcza informacji na temat potencjalnych 
zagrożeń dla zdrowia, których pojawienie si ę jest prawdopodobne 
w przypadku powtarzaj ącego się narażenia przez okres trwaj ący nawet 
przez całą długość życia wykorzystanego w badaniu gatunku. Badanie 
dostarczy informacji na temat skutków toksycznych substancji badanej, 
w tym na temat potencjalnej rakotwórczo ści, i może wskaza ć organy doce ­
lowe i mo żliwość akumulacji. Badanie mo że także dostarczy ć szacunko ­
wych informacji na temat poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian w kontek ście skutków toksycznych oraz, 
w przypadku niegenotoksycznych substancji rakotwórczych, w odniesieniu 
do reakcji guzów, które to informacje mo żna wykorzysta ć do ustalenia 
kryteriów bezpiecze ństwa dla nara żenia ludzi. Podkre śla się również 
konieczno ść uważnych obserwacji klinicznych zwierz ąt, aby uzyska ć 
możliwie jak najwi ęcej informacji.
 
6. Cele bada ń rakotwórczo ści w ramach niniejszej metody badawczej obej ­
mują: 
— określenie właściwości rakotwórczych substancji badanej, skutkuj ących 
zwiększonym wyst ępowaniem nowotworów, zwi ększonym odsetkiem 
nowotworów z łośliwych lub szybszym wyst ąpieniem nowotworów, 
w porównaniu z równoleg łą grupą kontroln ą, 
— określenie organu lub organów docelowych rakotwórczo ści, 
— określenie czasu, po którego up ływie pojawiaj ą się nowotwory,  
— scharakteryzowanie zale żności dawka-odpowied ź w odniesieniu do 
guzów,  
— określenie poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę szkod­
liwych zmian (NOAEL) lub punktu wyj ścia dla ustalenia dawki 
wyznaczaj ącej (BMD),  
— ekstrapolacja skutków rakotwórczych do poziomów nara żenia ludzi przy 
niskich dawkach,  
— pozyskanie danych do zbadania hipotez dotycz ących sposobu dzia łania 
(2) (7) (12) (13) (14) (15).  
WSTĘPNE ROZWA ŻANIA  
7. Podczas oceny i oszacowania potencjalnej rakotwórczo ści substancji badanej 
laboratorium badawcze powinno rozwa żyć wszystkie dost ępne informacje 
na temat substancji badanej przed rozpocz ęciem badania, w celu opraco ­
wania takiego projektu badania, który umo żliwi zbadanie potencjalnej rako ­
twórczości w sposób bardziej efektywny oraz zminimalizuje wykorzystanie 
zwierząt. Szczególnie istotne s ą informacje na temat sposobu dzia łania 
substancji, co do której podejrzewa si ę, że jest substancj ą rakotwórcz ą, 
oraz uwzgl ędnienie takiego sposobu dzia łania (2) (7) (12) (13) (14) (15), 
ponieważ optymalny projekt badania mo że różnić się w zależności od tego, 
czy substancja badana jest znan ą genotoksyczn ą substancj ą rakotwórcz ą, czy 
też substancj ą, co do której podejrzewa si ę działanie genotoksyczne 
i rakotwórcze. Dalsze wytyczne na temat kwestii dotycz ących sposobu dzia ­ 
łania można znaleźć w wytycznych nr 116 (7).  
8. Informacje, które b ędą pomocne w opracowywaniu projektu badania, obej ­
mują tożsamość, struktur ę chemiczn ą i właściwości fizykochemiczne 
substancji badanej; wyniki wszelkich bada ń toksyczno ści in vitro  lub in 
vivo, w tym bada ń genotoksyczno ści; spodziewane zastosowania 
i potencjalne nara żenie ludzi; dost ępne dane dotycz ące (Q)SAR, mutagen ­
ności/genotoksyczno ści, rakotwórczo ści oraz inne dane toksykologiczne 
dotyczące strukturalnie powi ązanych zwi ązków; dost ępne dane toksykokine ­
tyczne (je śli dostępne, dane dotycz ące kinetyki jednorazowego podania 
i podania powtórzonego) oraz dane pochodz ące z innych bada ń narażenia 
powtarzanego. Ocen ę rakotwórczo ści należy przeprowadzi ć wyłącznie po  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 469
 
uzyskaniu wst ępnych informacji na temat toksyczno ści na podstawie 28- 
dniowych lub 90-dniowych bada ń toksyczno ści wywo łanej podaniem 
powtórzonym. U żytecznych informacji mog ą dostarczy ć także krótkotermi ­
nowe badania dotycz ące inicjacji i promocji w kontek ście rakotwórczo ści. 
W kontek ście badania rakotwórczo ści należy rozważyć podejście oparte na 
etapach, w ramach ogólnej oceny potencjalnych niepo żądanych skutków dla 
zdrowia wywo ływanych przez dan ą substancj ę badaną (16) (17) (18) (19).  
9. Metody statystyczne najbardziej odpowiednie do analizy wyników, przy 
uwzględnieniu uk ładu doświadczalnego i celów badania, nale ży ustalić 
przed rozpocz ęciem badania. W śród kwestii, jakie nale ży rozważyć, znaj­
duje się pytanie, czy dane statystyczne powinny zawiera ć korektę uwzględ­
niającą zwierzęta, które prze żyły, analizę łącznego ryzyka wyst ąpienia guza 
w odniesieniu do okresu prze życia, analiz ę tego, jak szybko wyst ąpił guz, 
oraz analiz ę w przypadku przedwczesnego u śmiercenia jednej grupy lub 
większej liczby grup. Wytyczne dotycz ące odpowiednich analiz statystycz ­
nych i kluczowych odniesie ń do uznanych na świecie metod statystycznych 
zawarto w wytycznych nr 116 (7), a tak że wytycznych nr 35 dotycz ących 
analizy i ewaluacji bada ń toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści (20).  
10. Podczas przeprowadzania badania rakotwórczo ści należy w każdym przy ­
padku kierowa ć się głównymi zasadami i rozwa żaniami przedstawionymi 
w wytycznych OECD nr 19 dotycz ących rozpoznawania, oceny 
i stosowania objawów klinicznych jako humanitarnego punktu ko ńcowego 
w odniesieniu do zwierz ąt wykorzystywanych w badaniu oceny bezpiecze ń­
stwa (21), a zw łaszcza pkt 62 tego dokumentu. Punkt ten stanowi, że: „W 
badaniach z zastosowaniem powtarzanej dawki, je śli zwierz ę wykazuje 
objawy kliniczne, które post ępują, prowadz ąc do dalszego pogorszenia 
jego stanu, nale ży podjąć uzasadnion ą decyzję, czy w sposób humanitarny 
uśmiercić takie zwierz ę. Taka decyzja powinna opiera ć się na rozwa żeniu 
wartości informacji, jakie mo żna uzyska ć dzięki dalszemu utrzymywaniu 
takiego zwierz ęcia w ramach badania, i uwzgl ędniać ogólny stan takiego 
zwierzęcia. Jeśli zapadnie decyzja o pozostawieniu takiego zwierz ęcia 
w badaniu, cz ęstotliwość obserwacji nale ży w razie potrzeby zwi ększyć. 
Można także tymczasowo zaprzesta ć dawkowania, je śli nie wp łynie to 
w sposób niekorzystny na cel badania, a zmniejszy cierpienie lub stres 
odczuwany przez zwierz ę, lub też można zmniejszy ć podawan ą dawkę”. 
11. Szczegó łowe wytyczne dotycz ące zasad doboru dawek w przypadku bada ń 
toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści, a także omówienie takich zasad, 
można znaleźć w wytycznych nr 116 (7), oraz w publikacjach Mi ędzyna­
rodowego Instytutu Nauk Biologicznych (ILSI) (22) (23). G łówna strategia 
doboru dawek zale ży od głównego celu lub celów badania (pkt 6). Podczas 
doboru odpowiednich poziomów dawek nale ży zachowa ć równowag ę 
między kontrol ą zagrożenia a okre śleniem reakcji na niskie dawki i ich 
istotnością. Ma to szczególne znaczenie w sytuacji, w której planuje si ę 
przeprowadzi ć łączone badanie toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści 
(rozdział B.33 niniejszego za łącznika) (pkt 12).  
12. Nale ży rozważyć przeprowadzenie łączonego badania toksyczno ści przewle ­
kłej i rakotwórczo ści (rozdzia ł B.33 niniejszego za łącznika), zamiast prze ­
prowadzenia osobno badania toksyczno ści przewlek łej (rozdzia ł B.30 niniej ­
szego za łącznika) i badania rakotwórczo ści (niniejsza metoda badawcza 
B.32). W porównaniu z przeprowadzaniem dwóch osobnych bada ń łączone 
badanie zapewnia wi ększą efektywno ść pod wzgl ędem czasu i kosztów, 
a jednocze śnie nie obni ża jakości danych, czy to na etapie badania toksycz ­
ności przewlek łej, czy te ż na etapie badania rakotwórczo ści. Przy przepro ­
wadzaniu łączonego badania toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści (roz­
dział B.33 niniejszego za łącznika) nale ży jednak zwróci ć szczególn ą uwagę 
na zasady doboru dawek (pkt 11 i 22–25), a tak że uznaje si ę, że 
w przypadku pewnych ram regulacyjnych wymagane mo że być przeprowa ­
dzenie takich bada ń osobno.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. Definicje stosowane w kontek ście niniejszej metody badawczej mo żna 
znaleźć na końcu tego rozdzia łu oraz w wytycznych nr 116 (7).  
ZASADA BADANIA  
14. Substancj ę badaną podaje si ę codziennie w dawkach stopniowanych kilku 
grupom zwierz ąt badanych przez wi ększą część długości ich życia, zazwy ­
czaj drog ą pokarmow ą. Właściwe może być także badanie przy zastoso ­
waniu drogi inhalacyjnej lub dermalnej. Zwierz ęta obserwuje si ę uważnie 
w celu wykrycia objawów toksyczno ści i pojawienia si ę zmian nowotwo ­
rowych. Zwierz ęta, które zgin ą lub zostan ą uśmiercone podczas badania, s ą 
poddawane sekcji zw łok, a zwierz ęta, które prze żyją, są, po zako ńczeniu 
badania, u śmiercane i poddawane sekcji zw łok. 
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
15. Niniejsza metoda badawcza obejmuje przede wszystkim ocen ę 
i oszacowanie rakotwórczo ści u gryzoni (pkt 2). Wykorzystanie gatunków 
innych ni ż gryzonie mo żna rozważyć, jeśli dostępne dane wskazuj ą, że takie 
gatunki s ą bardziej odpowiednie w kontek ście określenia skutków dla 
zdrowia u ludzi. Wybór gatunku nale ży uzasadni ć. Preferowanym gatun ­
kiem gryzoni jest szczur, mo żna jednak wykorzysta ć także inne gatunki, 
np. mysz. Cho ć w przesz łości wykorzystanie myszy w badaniach rakotwór ­
czości mogło ogranicza ć użyteczność takich bada ń (24) (25) (26), w ramach 
niektórych obowi ązujących przepisów nadal wymaga si ę badania rakotwór ­
czości z wykorzystaniem myszy, o ile nie ustalono, że takie badanie nie jest 
konieczne z naukowego punktu widzenia. Szczury i myszy s ą jak dotąd 
preferowanymi modelami do świadczalnymi z uwagi na ich wzgl ędnie krótk ą 
długość życia, powszechne wykorzystywanie w badaniach farmakologicz ­
nych i toksykologicznych, podatno ść na powstawanie guzów, a tak że 
dostępność dostatecznie scharakteryzowanych szczepów. Z racji tych cech 
dostępne są znaczne ilo ści informacji na temat ich fizjologii i patologii. 
Dodatkowe informacje na temat wyboru gatunku i szczepu przedstawiono w wytycznych nr 116 (7).
 
16. Zaleca si ę wykorzystanie zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt pochodz ­ 
ących ze szczepów powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. 
Badanie rakotwórczo ści należy przeprowadzi ć najlepiej z wykorzystaniem 
zwierząt z tego samego szczepu i źródła, z którego pochodzi ły zwierzęta 
wykorzystane we wst ępnym badaniu lub wst ępnych badaniach toksyczno ści 
o krótszym czasie trwania, niemniej jednak, je śli wiadomo, że w przypadku 
zwierząt z danego szczepu i źródła pojawiaj ą się problemy z osi ągnięciem 
powszechnie przyj ętego kryterium prze życia w badaniach d ługoterminowych 
[zob. wytyczne nr 116 (7)], nale ży rozważyć wykorzystanie szczepu 
zwierząt, który charakteryzuje si ę akceptowalnym wska źnikiem prze życia 
w przypadku bada ń długoterminowych. Samice powinny by ć nieródkami 
i nie mog ą być w ciąży. 
Warunki przetrzymywania i karmienia  
17. Zwierz ęta można przetrzymywa ć pojedynczo lub w klatkach w ma łych 
grupach sk ładających się z osobników tej samej p łci; przetrzymywanie 
zwierząt pojedynczo nale ży rozważyć, wyłącznie jeśli jest to uzasadnione 
z naukowego punktu widzenia (27) (28) (29). Klatki nale ży rozmie ścić 
w taki sposób, aby zminimalizowa ć potencjalny wp ływ ich uk ładu. Tempe ­
ratura w pomieszczeniach badawczych, w których przetrzymuje si ę zwie­
rzęta, powinna wynosi ć 22 °C (± 3 °C). Chocia ż wilgotno ść względna 
powinna wynosi ć co najmniej 30 % i po żądane jest, by poza czasem czysz ­
czenia pomieszczenia nie przekracza ła 70 %, nale ży dążyć do utrzymania jej 
na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 
godzin światła, 12 godzin ciemno ści. Do żywienia mo żna stosowa ć konwen­
cjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 471
 
Pasza powinna spe łniać wszystkie wymogi zwi ązane z od żywianiem bada ­
nych gatunków, a obecna w niej zawarto ść pokarmowych substancji zanie ­
czyszczaj ących, w tym mi ędzy innymi pozosta łości pestycydów, trwa łych 
zanieczyszcze ń organicznych, fitoestrogenów, metali ci ężkich i mikotoksyn, 
które mog ą wpłynąć na wynik badania, powinna by ć możliwie jak najni ż­
sza. Okresowo nale ży generowa ć informacje analityczne na temat poziomów 
składników od żywczych i pokarmowych substancji zanieczyszczaj ących, 
a przynajmniej na pocz ątku badania oraz w przypadku zmiany stosowanej 
partii. Takie informacje nale ży uwzględnić w sprawozdaniu ko ńcowym. 
Informacje analityczne na temat wody pitnej stosowanej w badaniu nale ży 
przedstawi ć w podobny sposób. Na wybór pokarmu mo że mieć wpływ 
potrzeba zapewnienia odpowiedniej mieszaniny substancji badanej, a tak że 
potrzeba spe łnienia wymogów zwi ązanych z od żywianiem zwierz ąt, jeśli 
substancję badaną podaje si ę wraz z pokarmem.  
Przygotowanie zwierz ąt 
18. Nale ży wykorzysta ć zdrowe zwierz ęta aklimatyzowane do warunków labo ­
ratoryjnych przez okres co najmniej 7 dni, oraz niepoddawane wcze śniej 
procedurom badawczym. W przypadku gryzoni dawkowanie substancji zwierzętom nale ży rozpocz ąć możliwie jak najszybciej po odsadzeniu 
i aklimatyzacji, oraz najlepiej zanim zwierz ęta osiągną wiek 8 tygodni. 
Badane zwierz ęta należy scharakteryzowa ć ze wzgl ędu na ich gatunek, 
szczep, źródło, płeć, wagę i wiek. W chwili rozpocz ęcia badania odchylenia 
masy dla obu p łci wykorzystanych zwierz ąt powinny by ć minimalne i nie 
przekracza ć ± 20 % średniej masy wszystkich zwierz ąt wykorzystanych 
w ramach badania, osobno dla ka żdej płci. Należy losowo przydzieli ć zwie­
rzęta do grup kontrolnych i grup poddawanych dzia łaniu substancji badanej. 
Po randomizacji mi ędzy grupami nie powinno by ć znaczących różnic 
w średniej wadze osobników w odniesieniu do obu p łci. Jeśli odnotowano 
statystycznie istotne ró żnice, randomizacj ę należ
y powtórzy ć, jeśli jest to 
możliwe. Ka żdemu zwierz ęciu należy przydzieli ć niepowtarzalny numer 
identyfikacyjny i w sposób sta ły oznaczy ć je tym numerem poprzez jego 
wytatuowanie, wszczepienie implantu z chipem lub za pomoc ą innej odpo ­
wiedniej metody.  
PROCEDURA  
Liczba i p łeć zwierząt 
19. Nale ży wykorzysta ć zwierzęta obu płci. Należy wykorzysta ć wystarczaj ącą 
liczbę zwierząt, aby umo żliwić szczegółowe szacunki z punktu widzenia 
biologicznego i statystycznego. W zwi ązku z powy ższym każda grupa 
otrzymująca dawki oraz równoleg ła grupa kontrolna powinny liczy ć co 
najmniej 50 zwierz ąt każdej płci. W zale żności od celu badania mo żna 
zwiększyć moc statystyczn ą kluczowych szacunków poprzez zró żnicowane 
przydzielenie zwierz ąt nierównomiernie do grup otrzymuj ących różne 
dawki, przy czym w grupach otrzymuj ących niskie dawki powinno by ć 
więcej niż 50 zwierz ąt; np. w celu oszacowania rakotwórczo ści przy niskich 
dawkach. Nale ży jednak pami ętać, że umiarkowane zwi ększenie liczebno ści 
grupy oznacza wzgl ędnie niewielkie zwi ększenie mocy statystycznej bada ­
nia. Więcej informacji na temat projektu badania pod wzgl ędem staty ­
stycznym oraz doboru poziomów dawek w celu zmaksymalizowania mocy 
statystycznej zawarto w wytycznych nr 116 (7).  
Ustalenia dotycz ące uśmiercania w trakcie trwania do świadczenia oraz 
grup satelitarnych (wska źnikowych)  
20. W ramach badania mo żna założyć uśmiercanie zwierz ąt w trakcie trwania 
doświadczenia, np. po up ływie 12 miesi ęcy, w celu uzyskania informacji na 
temat progresji zmian nowotworowych oraz informacji dotycz ących mecha ­
nizmu dzia łania, jeśli jest to uzasadnione z naukowego punktu widzenia. 
Jeśli takie informacje s ą już dostępne dzięki poprzednim badaniom toksycz ­
ności dawki powtórzonej substancji badanej, u śmiercanie w trakcie trwania 
doświadczenia mo że nie być uzasadnione z naukowego punktu widzenia. 
Jeśli projekt badania przewiduje u śmiercanie w trakcie trwania do świadcze­
nia, liczba zwierz ąt w każdej grupie otrzymuj ącej dawki przeznaczona do 
uśmiercenia w trakcie trwania do świadczenia b ędzie wynosi ć zazwyczaj 10 
zwierząt każdej płci, zaś całkowitą liczbę zwierząt przewidzianych 
w projekcie badania nale ży zwiększyć o liczbę zwierząt przeznaczonych 
do uśmiercenia przed zako ńczeniem badania. W celu monitorowania 
w trakcie badania, w razie konieczno ści, statusu choroby, mo żna uwzględnić 
dodatkow ą grupę zwierząt wskaźnikowych (zazwyczaj 5 zwierz ąt każdej 
płci) (30). Dalsze wytyczne przedstawiono w wytycznych nr 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Grupy otrzymuj ące dawki oraz dawkowanie  
21. Wytyczne dotycz ące wszystkich aspektów doboru dawek oraz zró żnico­
wania poziomu dawek zawarto w wytycznych nr 116 (7). Nale ży zasto­
sować co najmniej trzy poziomy dawek oraz ustanowi ć równoleg łą grupę 
kontrolną. Poziomy dawek b ędą zazwyczaj oparte na wynikach krótkoter ­
minowych bada ń z powtarzanym dawkowaniem lub bada ń ustalających 
zakres dawkowania oraz nale ży uwzględnić w tym kontek ście wszelkie 
istniejące dane toksykologiczne i toksykokinetyczne dost ępne 
w odniesieniu do substancji badanej lub substancji powi ązanych.  
22. O ile nie ogranicza tego fizykochemiczny charakter biologicznych skutków 
działania substancji badanej, nale ży wybrać najwyższy poziom dawki w celu 
określenia głównych organów docelowych oraz skutków toksycznych, 
jednocześnie unikaj ąc cierpienia, toksyczno ści ostrej, chorobowo ści lub 
śmierci. Uwzgl ędniając czynniki przedstawione w pkt 23 poni żej, należy 
zazwyczaj wybra ć najwyższy poziom dawki w celu uzyskania dowodów 
na toksyczno ść, potwierdzonych, na przyk ład, wolniejszym przybieraniem 
na wadze (o oko ło 10 %). W zale żności od celów badania (zob. pkt 6) 
można wybra ć górną dawkę, niższą od dawki potwierdzaj ącej toksyczno ść, 
np. jeśli dawka powoduje niekorzystny skutek istotny dla badania, który ma 
jednak niewielki wp ływ na długość życia czy wag ę ciała. 
23. Poziomy dawek i zró żnicowanie ich poziomów mo żna dobra ć tak, by 
określić odpowied ź zależną od dawki oraz, w zale żności od sposobu dzia ­ 
łania substancji badanej, NOAEL lub inny po żądany wynik badania, np. 
BMD (zob. pkt 25) przy najni ższym poziomie dawki. Przy stosowaniu 
niższych dawek nale ży rozważyć takie czynniki, jak spodziewane nachy ­
lenie krzywej dawka-odpowied ź, dawki, przy których mog ą pojawić się 
istotne zmiany w metabolizmie, lub charakter dzia łania toksycznego, przy 
którym oczekuje si ę wartości granicznej lub punktu wyj ścia dla ekstrapolacji 
dla niskiej dawki.  
24. Wybrane zró żnicowanie poziomów dawki b ędzie zale żeć od właściwości 
substancji badanej i nie mo że zostać z góry okre ślone w metodzie badaw ­
czej, jednak zastosowanie dwóch do czterech odst ępów pomi ędzy kolejnym 
dawkowaniem cz ęsto zapewnia dobre wyniki badania dla ustalenia malej ­ 
ących poziomów dawki, a dodanie czwartej grupy badanej jest cz ęsto 
rozwiązaniem preferowanym w porównaniu ze stosowaniem bardzo du żych 
interwałów między dawkowaniem (np. wspó łczynnik wi ększy niż 6–10). 
Zasadniczo nale ży unikać stosowania wspó łczynników wi ększych ni ż 10, 
a w przypadku ich zastosowania nale ży je uzasadni ć. 
25. Jak omówiono to w wytycznych OECD nr 116 (7), kwestie, jakie nale ży 
rozważyć przy doborze dawki, obejmuj ą: 
— znane lub podejrzewane nieliniowo ści lub punkty przegi ęcia krzywej 
dawka-odpowied ź, 
— toksykokinetyk ę oraz zakresy dawkowania, przy których wyst ępuje lub 
nie występuje indukcja metaboliczna, nasycenie lub te ż nieliniowo ść 
między zewn ętrznymi a wewn ętrznymi dawkami,  
— zmiany prekursorowe, markery skutku, lub wska źniki działania kluczo ­
wych podstawowych procesów biologicznych,  
— kluczowe (lub podejrzewane) aspekty sposobu dzia łania, takie jak 
dawki, przy których zaczyna pojawia ć się cytotoksyczno ść, zakłócone 
zostają poziomy hormonów, przestaj ą działać mechanizmy homeosta ­
tyczne itp.,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— regiony krzywej dawka-odpowied ź, gdzie konieczne s ą szczególnie 
solidne szacunki, np. w zakresie spodziewanej BMD lub podejrzewanej 
wartości granicznej,  
— uwzgl ędnienie spodziewanych poziomów nara żenia ludzi.  
26. Grupa kontrolna powinna by ć grupą niepoddawan ą działaniu substancji 
badanej lub grup ą kontroln ą nośnika, jeśli do podawania substancji badanej 
zastosowano no śnik. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu substancji badanej, 
zwierzęta z grupy kontrolnej nale ży traktowa ć w sposób identyczny ze 
sposobem traktowania osobników z grup badanych. Je śli zastosowano 
nośnik, grupa kontrolna otrzymuje no śnik w najwy ższej objętości stoso­
wanej wśród grup otrzymuj ących dawki. Je śli substancj ę badaną podaje 
się wraz z pokarmem i je śli powoduje ona znacznie zmniejszone pobranie 
pokarmu z powodu jego obni żonych warto ści smakowych, pomocna mo że 
być dodatkowa grupa kontrolna zwierz ąt otrzymuj ących pokarm w ilo ści 
spożywanej przez zwierz ęta z grupy badanej (pair-fed), która zapewni odpo ­
wiedniejsz ą kontrolę. 
Przygotowanie dawek i podanie substancji badanej  
27. Substancj ę badaną zazwyczaj podaje si ę drogą pokarmow ą, wraz 
z pokarmem lub wod ą pitną, lub też za pomoc ą sondy. Dodatkowe infor ­
macje na temat dróg i metod podania przedstawiono w wytycznych nr 116 
(7). Droga i metoda podania zale żą od celu badania, fizykochemicznych 
właściwości substancji badanej, jej biodost ępności oraz g łównej drogi 
i metody nara żenia ludzi. Nale ży przedstawi ć uzasadnienie wybranej drogi 
i metody podania. W trosce o dobrostan zwierz ąt należy w normalnych 
warunkach wybra ć sondę żołądkową wyłącznie dla tych substancji, dla 
których taka droga i metoda podania w sposób uzasadniony odzwierciedlaj ą 
potencjalne nara żenie ludzi (np. produkty farmaceutyczne). Substancje 
występujące w pokarmie lub środowisku naturalnym, w tym pestycydy, 
podaje si ę zazwyczaj wraz z pokarmem lub wod ą pitną. W przypadku 
jednak niektórych scenariuszy, np. nara żenia zawodowego, podawanie 
substancji za pomoc ą innych dróg mo że być bardziej w łaściwe.  
28. W razie potrzeby substancj ę badaną rozpuszcza si ę lub sporz ądza się jej 
zawiesinę w odpowiednim no śniku. W stosownych przypadkach nale ży 
wziąć pod uwag ę następujące cechy no śnika i innych dodatków: wp ływ 
na wchłanianie, dystrybucj ę, metabolizm oraz zatrzymywanie substancji 
badanej; wp ływ na chemiczne w łasności substancji badanej, które mog ą 
zmienić jej charakterystyk ę toksyczn ą; oraz wp ływ na spo życie pokarmu 
lub wody, lub te ż na stan od żywienia zwierz ąt. Zaleca si ę, w miarę możli­
wości, najpierw rozwa żyć zastosowanie roztworu wodnego/zawiesiny, 
następnie roztworu/emulsji w oleju (np. z zastosowaniem oleju kukurydzia ­
nego), a potem mo żliwego roztworu w innych no śnikach. W przypadku 
nośników innych ni ż woda charakterystyka toksyczna no śnika powinna 
być znana. Dost ępne powinny by ć także informacje na temat stabilno ści 
substancji badanej oraz jednorodno ści roztworów dawek lub pokarmu 
z dawkami (w zale żności od sytuacji) w warunkach podawania (np. 
pokarm).  
29. W przypadku substancji podawanych w pokarmie lub wodzie pitnej wa żne 
jest dopilnowanie, by ilo ści substancji badanej nie zak łócały prawid łowej 
równowagi od żywiania lub spo życia wody. W przypadku d ługoterminowych 
badań toksyczno ści z zastosowaniem podawania dawek wraz z pokarmem 
stężenie substancji badanej w paszy nie powinno w normalnych warunkach 
przekracza ć górnego limitu 5 % ca łego pokarmu, aby unikn ąć zakłócenia 
równowagi od żywiania. Przy podawaniu substancji badanej wraz 
z pokarmem mo żna zastosowa ć stałe stężenie w pokarmie (mg/kg pokarmu 
lub ppm) lub te ż stały poziom dawki w odniesieniu do masy cia ła zwie­
rzęcia (mg/kg masy cia ła), obliczany cotygodniowo. Nale ży określić, które 
rozwiązanie zastosowano.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Przy podawaniu substancji drog ą pokarmow ą zwierzętom podaje si ę dawki 
substancji badanej codziennie (siedem dni w tygodniu), zazwyczaj przez 
okres 24 miesi ęcy w przypadku gryzoni (zob. tak że pkt 32). Zastosowanie 
innego systemu dawkowania, np. przez pi ęć dni w tygodniu, nale ży uzasad­
nić. Przy podawaniu substancji drog ą dermalną zwierzęta zazwyczaj poddaje 
się działaniu substancji badanej przez co najmniej 6 godzin dziennie, 7 dni 
w tygodniu, zgodnie z rozdzia łem B.9 niniejszego za łącznika (11), przez 
okres 24 miesi ęcy. Narażenie drog ą inhalacyjn ą stosuje si ę przez 6 godzin 
dziennie, 7 dni w tygodniu, ale mo żliwe jest zastosowanie nara żenia także 
przez 5 dni w tygodniu, je śli zostanie to uzasadnione. Okres nara żenia 
zazwyczaj wynosi 24 miesi ące. Jeśli gatunki gryzoni inne ni ż szczury 
poddaje si ę narażeniu wyłącznie poprzez nos, maksymalne okresy nara żenia 
można dostosowa ć tak, by zminimalizowa ć charakterystyczny dla danego 
gatunku stres. W przypadku stosowania okresu nara żenia krótszego ni ż 6 
godzin dziennie nale ży przedstawi ć stosowne uzasadnienie. Zob. równie ż 
rozdział B.8 niniejszego za łącznika (9).  
31. Jeśli substancj ę badaną podaje si ę zwierzętom za pomoc ą sondy, nale ży 
dokonywa ć tego z u życiem sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli 
intubacyjnej, ka żdego dnia o podobnych porach. Zazwyczaj podaje si ę poje­
dynczą dawkę raz dziennie; je śli jednak substancja jest, na przyk ład, 
substancją wykazuj ącą miejscowe dzia łanie drażniące, możliwe jest zacho ­
wanie dziennej mocy dawki poprzez podawanie jej jako dawki dzielonej (dwa razy dziennie). Maksymalna obj ętość cieczy, jak ą można podać jedno­
razowo, zale ży od wielko ści badanego zwierz ęcia. Objętość taka powinna 
być możliwie jak najni ższa i nie powinna w normalnych warunkach prze ­
kraczać 1 ml/100 g masy cia ła w przypadku gryzoni (31). Zmienno ść stoso­
wanej obj ętości należ
y zminimalizowa ć poprzez dostosowanie st ężenia, aby 
zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawek. Wyj ątkiem są 
substancję potencjalnie żrące lub wykazuj ące działanie drażniące, które 
należy rozcieńczyć w celu unikni ęcia miejscowych ostrych skutków. Nale ży 
unikać badania z u życiem stężeń, które mog ą być żrące lub wykazuj ące 
działanie drażniące dla przewodu pokarmowego.  
Czas trwania badania  
32. W przypadku gryzoni czas trwania badania b ędzie zazwyczaj wynosi ł 24 
miesiące, co stanowi wi ększą część standardowej d ługości życia zwierz ąt, 
które maj ą zostać wykorzystane w takim badaniu. Mo żna ustalić dłuższy lub 
krótszy czas trwania badania w zale żności od długości życia szczepu 
gatunku zwierz ąt wykorzystanego w badaniu, tak ą decyzję należy jednak 
uzasadnić. W przypadku pewnych szczepów myszy, np. szczepów AKR/J, 
C3H/J lub C57BL/6J, w łaściwszy mo że być czas trwania badania 
wynoszący 18 miesi ęcy. Poniżej znajduj ą się pewne wytyczne dotycz ące 
czasu trwania i zako ńczenia badania oraz prze życia; dalsze wytyczne, 
w tym rozwa żenia dotycz ące dopuszczalno ści rakotwórczo ści ujemnie powi ­ 
ązanej z prze życiem, przedstawiono w wytycznych OECD nr 116 dotycz ­ 
ących opracowywania i przeprowadzania bada ń toksyczno ści przewlek łej 
i rakotwórczo ści (7).  
— Zakończenie badania nale ży rozważyć, jeśli liczba osobników, które 
pozostały przy życiu w grupach otrzymuj ących niższe dawki lub grupie 
kontrolnej, spadnie poni żej 25 %.  
— Jeśli wyłącznie osobniki z grupy otrzymuj ącej wysokie dawki padn ą 
przedwcze śnie z powodu toksyczno ści, nie powinno to powodowa ć 
zakończenia badania.  
— Przeżycie osobników obu p łci należy rozważyć osobno.  
— Nie nale ży przedłużać badania, je śli dane dost ępne dzięki badaniu sta ły 
się niewystarczaj ące, aby umo żliwić oszacowanie wiarygodne pod 
względem statystycznym.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
OBSERWACJE  
33. Wszystkie zwierz ęta należy sprawdzi ć pod k ątem chorobowo ści 
i upadkowo ści, zazwyczaj na pocz ątku i pod koniec ka żdego dnia, w łącznie 
z weekendami i dniami wolnymi od pracy. Dodatkowo zwierz ęta należy 
sprawdza ć raz dziennie pod k ątem szczególnych objawów istotnych 
z toksykologicznego punktu widzenia, a w przypadku podawania substancji poprzez sond ę, uwzględniając okres szczytowego wyst ępowania spodziewa ­
nych skutków po podaniu dawki. Szczególn ą uwagę należy zwróci ć na 
rozwój guzów; nale ży odnotowa ć czas pojawienia si ę guza, jego po łożenie, 
wymiary, wygl ąd oraz progresj ę każdego wyra źnie widocznego lub wyczu ­
walnego guza.
 
Masa cia ła, spożycie pokarmu/wody i wydajno ść pokarmu  
34. Wszystkie zwierz ęta należy zważyć na pocz ątku rozpocz ęcia poddawania 
ich działaniu substancji badanej, a tak że co najmniej raz w tygodniu 
przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz 
w miesiącu. Pomiarów spo życia pokarmu i wydajno ści pokarmu nale ży 
dokonywa ć co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po 
tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu. Spożycie wody nale ży mierzyć 
co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – 
co najmniej raz w miesi ącu, jeśli substancj ę badaną podaje si ę wraz z wod ą 
pitną. Pomiary spo życia wody nale ży rozważyć także w przypadku bada ń, 
w których zasz ły zmiany zwi ązane ze spo życiem wody.  
Hematologia, biochemia kliniczna i inne pomiary  
35. W celu zmaksymalizowania informacji uzyskanych dzi ęki badaniu, 
zwłaszcza na temat kwestii zwi ązanych ze sposobem dzia łania, próbki 
krwi można podda ć analizie pod k ątem hematologii i biochemii klinicznej, 
według uznania kierownika badania. W łaściwe może być także przeprowa ­
dzenie analizy moczu. Dalsze wytyczne dotycz ące wartości pobrania takich 
próbek w ramach badania rakotwórczo ści przedstawiono w wytycznych 
nr 116 (7). Je śli uznano to za w łaściwe, pobranie próbek krwi na potrzeby 
oznaczenia hematologicznego i oznaczenia parametrów biochemii klinicznej, 
a także analizę moczu, mo żna przeprowadzi ć w ramach u śmiercania 
w trakcie trwania do świadczenia (pkt 20) oraz wraz z zako ńczeniem bada ­
nia, z wykorzystaniem co najmniej 10 zwierz ąt każdej płci i z każdej grupy. 
Próbki krwi nale ży pobrać z określonego miejsca, na przyk ład poprzez 
nakłucie serca lub z zatoki oczodo łowej tylnej, w znieczuleniu, oraz 
w stosownych przypadkach przechowywa ć we właściwych warunkach. Do 
zbadania mo żna przygotowa ć również rozmazy krwi, zw łaszcza je śli 
organem docelowym wydaje si ę szpik kostny, cho ć wartość takiego badania 
w celu oceny rakotwórczo ści/potencja łu onkogenicznego zosta ła zakwestio ­
nowana (32).  
PATOLOGIA  
Pełne rozpoznanie histopatologiczne  
36. Wszystkie zwierz ęta wykorzystane w badaniu, prócz zwierz ąt wskaźniko­
wych (zob. pkt 20) oraz innych zwierz ąt satelitarnych, nale ży poddać 
pełnemu, szczegó łowemu rozpoznaniu histopatologicznemu, które obejmuje 
staranne zbadanie zewn ętrznej powierzchni cia ła, wszystkich otworów, jamy 
czaszki, jamy klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawarto ści. Zwie­
rzęta wskaźnikowe i inne zwierz ęta satelitarne mog ą wymaga ć rozpoznania 
histopatologicznego w zale żności od poszczególnych przypadków, wed ług 
uznania kierownika badania. Masa organów nie jest zazwyczaj cz ęścią 
badania rakotwórczo ści, jako że w organach zachodz ą zmiany zwi ązane 
z wiekiem, a rozwój guzów na pó źniejszych etapach uniemo żliwia wyko ­
rzystanie takich danych. Takie dane mog ą mieć jednak kluczowe znaczenie 
dla oszacowania wagi dowodów, w szczególno ści w kontek ście kwestii 
związanych ze sposobem dzia łania. Jeśli stanowi ą one część badania sateli ­
tarnego, takie dane nale ży zgromadzi ć nie później niż rok po rozpocz ęciu 
badania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 476
 
37. Nast ępujące tkanki nale ży zachowa ć w roztworze utrwalaj ącym najbardziej 
odpowiednim zarówno dla rodzaju tkanki, jak i planowanego pó źniejszego 
badania histopatologicznego (33) (tkanki podane w nawiasach kwadrato ­
wych są opcjonalne): 
wszystkie wyra źne zmiany serce trzustka żołądek (przed żołądek, 
żołądek gruczo łowy) 
nadnercze jelito kr ęte przytarczyca [z ęby] 
aorta jelito czcze nerw obwodowy j ądro 
mózg (w tym cz ęści kreso­
mózgowia, mó żdżka 
i rdzenia/mostu) nerka przysadka grasica 
jelito ślepe gruczo ł łzowy prostata tarczyca 
szyjka macicy w ątroba odbytnica [j ęzyk] 
gruczoł koaguluj ący p łuco gruczo ł ślinowy tchawica 
okrężnica w ęzły chłonne (powierz ­
chowne i g łębokie) pęcherzyk nasienny p ęcherz moczowy 
dwunastnica gruczo ł mlekowy (obo ­
wiązkowo w przypadku 
samic oraz, je śli 
wyraźnie nadaje si ę do 
analizy, równie ż 
w przypadku samców) mięsień szkieletowy macica (w tym szyjka 
macicy) 
najądrze [górne drogi oddechowe, 
w tym nos, ma łżowiny 
nosowe oraz zatoki przy ­
nosowe] skóra [moczowód] 
oko (w tym siatkówka) prze łyk rdze ń kręgowy (na 
trzech odcinkach: szyj ­
nym, śródpiersiowym 
i lędźwiowym) [cewka moczowa] 
[kość udowa ze stawem] [opuszka w ęchowa] śledziona pochwa 
pęcherzyk żółciowy (w 
przypadku gatunków innych 
niż szczur) jajnik [mostek] odcinek szpiku kostnego lub 
świeżego aspiratu szpiku 
kostnego 
gruczoł przyoczny  
W przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży utrwalić 
obydwa organy. Wyniki bada ń klinicznych i innych bada ń mogą wskazać na 
konieczno ść zbadania dodatkowych tkanek. Organy uznane za prawdopo ­
dobne organy docelowe, w oparciu o znane w łaściwości substancji badanej, 
także należy zachowa ć. W przypadku bada ń z zastosowaniem dermalnej drogi 
podania nale ży utrwalić organy zgodnie z list ą określoną dla podania drog ą 
pokarmow ą, przy czym kluczowe jest pobranie i zachowanie próbek skóry 
z miejsca aplikacji. W przypadku bada ń z zastosowaniem inhalacyjnej drogi 
podania, uk ładając listę tkanek z dróg oddechowych do zachowania 
i zbadania, nale ży kierowa ć się zaleceniami zawartymi w rozdziale B.8 
i B.29 niniejszego za łącznika. W przypadku innych organów/tkanek (oraz 
w uzupełnieniu okre ślonych utrwalonych tkanek z dróg oddechowych) nale ży 
zbadać organy zgodnie z list ą określoną dla pokarmowej drogi podania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologia  
38. Dost ępne są wytyczne dotycz ące najlepszych praktyk zwi ązanych 
z przeprowadzaniem toksykologicznych bada ń zmian patologicznych (33). 
Należy zbadać co najmniej nast ępujące tkanki:  
— wszystkie tkanki zwierz ąt z grup otrzymuj ących wysokie dawki i z grup 
kontrolnych,  
— wszystkie tkanki zwierz ąt w stanie agonalnym lub u śmierconych 
podczas badania,  
— wszystkie tkanki wykazuj ące makroskopowe nieprawid łowości, w tym 
guzy,  
— w przypadku zaobserwowania w grupie otrzymuj ącej wysok ą dawkę 
histopatologicznych zmian zwi ązanych z poddawaniem zwierz ąt dzia­ 
łaniu substancji badanej nale ży zbadać takie same tkanki pochodz ące 
od wszystkich zwierz ąt ze wszystkich pozosta łych grup otrzymuj ących 
dawki,  
— w przypadku organów parzyastych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży 
zbadać obydwa organy.  
DANE ORAZ SPORZ ĄDZENIE SPRAWOZDANIA  
Dane  
39. Nale ży przedstawi ć dane dotycz ące każdego zwierz ęcia, w odniesieniu do 
wszystkich poddawanych oszacowaniu parametrów. Dodatkowo wszystkie 
dane nale ży zestawi ć w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do 
każdej badanej grupy liczb ę zwierząt na pocz ątku badania, liczb ę zwierząt, 
które zgin ęły w trakcie trwania badania lub które u śmiercono z przyczyn 
humanitarnych, wraz z okre śleniem czasu, w którym nast ąpiła śmierć lub 
humanitarne u śmiercenie, liczb ę zwierząt wykazuj ących objawy toksycz ­
ności, opis obserwowanych objawów toksyczno ści, w tym czas ich poja ­
wienia si ę, czas trwania, stopie ń ostrości wszelkich skutków toksycznych, 
liczbę zwierząt wykazuj ących zmiany, typ takich zmian oraz procent 
zwierząt wykazuj ących każdy typ zmiany. W tabelach z zestawieniem 
danych, oprócz klasyfikacji zmian, nale ży przedstawi ć średnie 
i odchylenia standardowe (dla danych z bada ń ciągłych) dotycz ące zwierz ąt 
wykazujących skutki toksyczne lub zmiany.  
40. Historyczne dane kontrolne mog ą być cenne przy interpretacji wyników 
badania, np. je śli istnieją przesłanki, że dane uzyskane z jednoczesnych 
kontroli s ą w sposób znacz ący niestandardowe w porównaniu 
z najnowszymi danymi dotycz ącymi zwierz ąt kontrolnych z tego samego 
obiektu/badanej kolonii. Historyczne dane kontrolne, je śli poddaje si ę je 
oszacowaniu, powinny przedstawi ć to samo laboratorium i powinny si ę 
odnosić do zwierz ąt w tym samym wieku i z tego samego szczepu, oraz 
powinny zosta ć wygenerowane w ci ągu pięciu lat przed rozpocz ęciem 
rozważanego badania.  
41. W stosownych przypadkach wyniki liczbowe nale ży poddawa ć oszacowaniu 
za pomoc ą właściwych i ogólnie przyj ętych metod statystycznych. Metody 
statystyczne i dane poddawane analizie nale ży wybrać w czasie przygoto ­
wywania projektu badania (pkt 9). Taki wybór powinien uwzgl ędniać, 
w razie potrzeby, korekt ę uwzględniającą zwierzęta, które prze żyły. 
Sprawozdanie z badania  
42. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść i własności fizykochemiczne,  
— dane dotycz ące tożsamości, ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— źródło substancji chemicznej,  
— numer partii,  
— świadectwo analizy chemicznej.  
Nośnik (w stosownych przypadkach)  
— uzasadnienie wyboru no śnika (jeżeli jest inny ni ż woda).  
Badane zwierz ęta 
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie takiego wyboru,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt na pocz ątku badaniu,  
— źródło, warunki przebywania, pokarm itp.,  
— masa cia ła poszczególnych zwierz ąt na pocz ątku badania.  
Warunki badania  
— uzasadnienie drogi podania i doboru dawek,  
— w stosownych przypadkach metody statystyczne zastosowane do analizy 
danych,  
— szczegó łowe informacje na temat postaci u żytkowej substancji badanej/ 
przygotowywania pokarmu,  
— dane analityczne dotycz ące osiąganego st ężenia, stabilno ści 
i jednorodno ści preparatu,  
— droga podania i szczegó łowe dane dotycz ące podawania substancji bada ­
nej, 
— w przypadku bada ń z inhalacyjn ą drogą podania informacje o tym, czy 
podanie odbywa si ę wyłącznie przez nos, czy przez ca łe ciało, 
— dawki rzeczywiste (mg/kg masy cia ła/dzień), wskaźnik konwersji 
stężenia substancji badanej w pokarmie/wodzie pitnej (mg/kg lub ppm) 
do dawki rzeczywistej, je śli ma to zastosowanie,  
— szczegó łowe informacje na temat jako ści pokarmu i wody.  
Wyniki (nale ży przedstawi ć zestawienie danych w tabeli oraz dane dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt) 
Wymogi ogólne  
— dane dotycz ące zwierz ąt, które prze żyły, 
— masa cia ła/zmiany masy cia ła, 
— dane dotycz ące spożycia pokarmu, wyliczenia wydajno ści pokarmu, je śli 
przeprowadzono, oraz dane dotycz ące spożycia wody, w stosownych 
przypadkach,  
— dane toksykokinetyczne, je śli dostępne, 
— oftalmoskopia (je śli takie dane s ą dostępne),  
— hematologia (je śli takie dane s ą dostępne),  
— biochemia kliniczna (je śli takie dane s ą dostępne). ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Ustalenia bada ń klinicznych  
— objawy toksyczno ści, 
— występowanie (i ostro ść, jeśli poddano j ą ocenie) wszelkich nieprawid ­ 
łowości, 
— rodzaj, ostro ść i czas trwania obserwowanych objawów klinicznych (tak 
odwracalnych, jak i nieodwracalnych).  
Dane dotycz ące sekcji zw łok 
— masa cia ła w chwili zgonu,  
— masa organów i ich wspó łczynniki, je śli takie dane s ą dostępne, 
— ustalenia z sekcji zw łok; występowanie i stopie ń ostrości nieprawid ło­
wości. 
Histopatologia  
— ustalenia histopatologiczne inne ni ż dotyczące nowotworów,  
— ustalenia histopatologiczne dotycz ące nowotworów,  
— korelacja mi ędzy objawami makroskopowymi i mikroskopowymi,  
— szczegó łowy opis wszystkich ustale ń histopatologicznych zwi ązanych 
z poddawaniem zwierz ąt działaniu substancji badanej, w tym klasyfi ­
kacja ostro ści skutków,  
— sprawozdanie z ewentualnej wzajemnej oceny preparatów.  
W stosownych przypadkach, statystyczne opracowanie wyników  
Omówienie wyników, w tym:  
— omówienie wszelkich podej ść modelowych,  
— zależność dawka-odpowied ź, 
— historyczne dane kontrolne,  
— rozwa żenie wszelkich informacji na temat sposobu dzia łania,  
— określenie BMD, NOAEL lub LOAEL,  
— znaczenie dla ludzi.  
Wnioski  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rzym, 1995), wewn ętrzny doku ­
ment roboczy, Dyrekcja ds. Środowiska, OECD, Pary ż. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency, Waszyngton, D.C.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW i in. (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 480
 
(6) Rozdzia ł B.27 niniejszego za łącznika. Badanie toksyczno ści podprzewle ­
kłej drogą pokarmow ą – badania toksyczno ści drogą pokarmow ą na gatun ­
kach innych ni ż gryzonie metod ą powtarzanej 90-dniowej dawki.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – Second edition. Series on Testing and Assessment No. 116, 
dostępne na publicznej stronie OECD po święconej wytycznych dotycz ­ 
ących bada ń, www.oecd.org/env/testguidelines.  
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Pary ż. 
(9) Rozdzia ł B.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść powtarzanej (28 dni) 
dawki (inhalacyjna).  
(10) Rozdzia ł B.29 niniejszego za łącznika. Badanie podprzewlek łej toksycz ­
ności inhalacyjnej – 90-dniowe badania inhalacyjne z wykorzystaniem 
gatunków gryzoni.  
(11) Rozdzia ł B.9 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść powtarzanej (28 dni) 
dawki (dermalna).  
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. Toxicol, 36: 
793–801.  
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, i Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589.
 
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56.
 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR i in. (2006). Agricultural 
Chemical Safety Assessment: A Multisector Approach to the Moderniza ­
tion of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T i in. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
 
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A i in. (2006). A Tiered Approach to 
Systemic Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 37–68.
 
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM i in. (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 69–98.  
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment 
nr 35 oraz Series on Pesticides nr 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, 
Paryż. 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment nr 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Pary ż. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection. Crit. Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
(23) ILSI (Mi ędzynarodowy Instytut Nauk Biologicznych) (1997). Principles for 
the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (red.). ILSI Press, Waszyngton, D.C.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN i Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1):214.  
(25) Usui T, Griffiths SA i Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. W: D’Arcy POF & Harron DWG (red.). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast. s. 279–284.
 
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203.
 
(27) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 
22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do 
celów naukowych (Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33).  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication nr 86-23. Waszyngton D.C., Departament 
Zdrowia i Opieki Spo łecznej Stanów Zjednoczonych.  
(29) GV-SOLAS (Towarzystwo Nauk o Zwierz ętach Laboratoryjnych, Gesells ­
chaft für Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Struc ­
ture of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 3-906255-04-2.
 
(30) GV-SOLAS (Towarzystwo Nauk o Zwierz ętach Laboratoryjnych, Gesells ­
chaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of labora ­
tory animals in various housing systems.  
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the 
administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23.  
(32) Weingand K, i in. (1996). Harmonisation of Animal Clinical Pathology 
Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & Appl. Toxicol. 29: 
198–201.  
(33) Crissman J, Goodman D, Hildebrandt P i in. (2004). Best Practices Guide ­
line: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 126–131.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Dodatek 1  
DEFINICJA  
Substancja badana:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana za pomoc ą 
niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  ŁĄCZONE BADANIA TOKSYCZNO ŚCI PRZEWLEK ŁEJ/RAKO ­
TWÓRCZO ŚCI 
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna z dotycz ącą badań wytyczn ą 
OECD nr 453 (2009). Pierwotny tekst TG 453 przyj ęto w 1981 r. Opraco ­
wanie niniejszej zmienionej metody badawczej B.33 uznano za konieczne w celu odzwierciedlenia ostatnich zmian w dziedzinie dobrostanu zwierz ąt 
i wymogów regulacyjnych (1) (2) (3) (4) (5). Aktualizacj ę niniejszej metody 
badawczej B.33 przeprowadzono równolegle z modyfikacjami rozdzia łu 
B.32 niniejszego za łącznika, dotycz ącego bada ń rakotwórczo ści, oraz 
rozdziału B.30 niniejszego za łącznika, dotycz ącego bada ń toksyczno ści 
przewlekłej, w celu uzyskania dodatkowych informacji na podstawie 
zwierząt wykorzystanych w badaniu oraz w celu zapewnienia dalszych 
szczegółowych informacji na temat doboru dawek. Niniejsz ą metodę 
badawczą opracowano w celu jej wykorzystywania w badaniach szerokiego 
zakresu chemikaliów, w tym pestycydów i chemikaliów przemys łowych. 
Należy zauważyć jednak, że niektóre dane szczegó łowe i wymogi mog ą 
różnić się w przypadku produktów farmaceutycznych [zob. wytyczne S1B 
dotyczące badania produktów farmaceutycznych pod k ątem rakotwórczo ści 
Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji (ICH)].
 
2. Większość badań toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści przeprowadza 
się z wykorzystaniem gatunków gryzoni, w zwi ązku z czym niniejsza 
metoda badawcza przewidziana jest do stosowania przede wszystkim w badaniach z wykorzystaniem takich gatunków. W przypadku koniecz ­
ności przeprowadzenia takich bada ń z wykorzystaniem gatunków innych 
niż gryzonie tak że można zastosowa ć zasady i procedury okre ślone 
w niniejszej metodzie badawczej, przy wprowadzeniu odpowiednich mody ­
fikacji, wraz z zasadami i procedurami okre ślonymi w rozdziale B.27 niniej ­
szego za łącznika, dotycz ącym 90-dniowego badania toksyczno ści pokar­
mowej wywo łanej powtarzanym dawkowaniem z wykorzystaniem gatunków 
innych ni ż gryzonie (6), zgodnie z wytycznymi OECD nr 116 dotycz ącymi 
opracowywania i przeprowadzania bada ń toksyczno ści przewlek łej 
i rakotwórczo ści (7).
 
3. Trzy g łówne drogi podania stosowane w badaniach toksyczno ści przewle ­
kłej/rakotwórczo ści to droga pokarmowa, dermalna i inhalacyjna. Wybór 
drogi podania zale ży od fizycznych i chemicznych w łaściwości substancji 
badanej oraz g łównej drogi nara żenia ludzi. Dodatkowe informacje na temat 
wyboru drogi nara żenia przedstawiono w wytycznych nr 116 (7).  
4. W ramach niniejszej metody badawczej k ładzie się nacisk na nara żenie 
drogą pokarmow ą, która jest drog ą najczęściej stosowan ą w badaniach 
toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści. Przeprowadzenie d ługotermino ­
wych bada ń obejmujących nara żenie drog ą dermalną lub inhalacyjn ą może 
być również konieczne do oceny ryzyka dla zdrowia ludzi lub wymagane 
w ramach pewnych systemów regulacji, obydwie te drogi nara żenia wyma ­
gają jednak bada ń znacznie z łożonych technicznie. Takie badania b ędą 
musiały zostać opracowane dla poszczególnych przypadków, jednak opisana 
w niniejszym rozdziale metoda badawcza maj ąca na celu ocen ę 
i oszacowanie toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści przy pokarmowej 
drodze podania mo że stanowi ć podstaw ę dla protoko łu badania 
z zastosowaniem inhalacyjnej lub dermalnej drogi podania, 
z zastrze żeniem zalece ń dotyczących okresów poddawania dzia łaniu 
substancji, parametrów klinicznych, parametrów analizy patologicznej itp. Dostępne są wytyczne OECD dotycz ące podawania substancji badanych 
drogą inhalacyjn ą (7) (8) i drog ą dermaln ą (7). Podczas opracowywania 
badań uwzględniających dłuższy okres nara żenia drog ą inhalacyjn ą należy 
w szczególno ści wziąć pod uwag ę rozdział B.8 niniejszego za łącznika (9) 
oraz rozdzia ł B.29 niniejszego za łącznika (10), a tak że wytyczne OECD 
dotyczące badania ostrej toksyczno ści inhalacyjnej (8). W przypadku 
badań przeprowadzanych drog ą dermaln ą należy uwzględnić rozdział B.9 
niniejszego za łącznika (11).
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Łączone badanie toksyczno ści przewlek łej/rakotwórczo ści dostarcza infor ­
macji na temat potencjalnych zagro żeń dla zdrowia, których pojawienie 
się jest prawdopodobne w przypadku nara żenia powtarzaj ącego się przez 
okres trwaj ący nawet przez ca łą długość życia wykorzystanego w badaniu 
gatunku. Badanie dostarczy informacji na temat skutków toksycznych 
substancji badanej, w tym na temat potencjalnej rakotwórczo ści, wskaże 
organy docelowe i mo żliwość akumulacji. Badanie mo że także dostarczy ć 
szacunkowych informacji na temat poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych zmian w kontek ście skutków toksycznych oraz, 
w przypadku niegenotoksycznych substancji rakotwórczych, w odniesieniu 
do reakcji guzów, które to informacje mo żna wykorzysta ć do ustalenia 
kryteriów bezpiecze ństwa dla nara żenia ludzi. Podkre śla się również 
konieczno ść uważnych obserwacji klinicznych zwierz ąt, aby uzyska ć 
możliwie jak najwi ęcej informacji.
 
6. Cele bada ń toksyczno ści przewlek łej/rakotwórczo ści w ramach niniejszej 
metody badawczej obejmuj ą: 
— określenie właściwości rakotwórczych substancji badanej, skutkuj ących 
zwiększonym wyst ępowaniem nowotworów, zwi ększonym odsetkiem 
nowotworów z łośliwych lub szybszym wyst ąpieniem nowotworów, 
w porównaniu z równoleg łymi grupami kontrolnymi,  
— określenie czasu, po którego up ływie pojawiaj ą się nowotwory,  
— określenie toksyczno ści przewlek łej substancji badanej,  
— określenie organu lub organów docelowych toksyczno ści przewlek łej 
i rakotwórczo ści, 
— scharakteryzowanie zale żności dawka-odpowied ź, 
— określenie poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę szkod­
liwych zmian (NOAEL) lub punktu wyj ścia dla ustalenia dawki 
wyznaczaj ącej (BMD),  
— ekstrapolacja skutków rakotwórczych do poziomów nara żenia ludzi przy 
niskich dawkach,  
— oszacowanie skutków toksyczno ści przewlek łej do poziomów nara żenia 
ludzi,  
— pozyskanie danych do zbadania hipotez dotycz ących sposobu dzia łania 
(2) (7) (12) (13) (14) (15).  
WSTĘPNE ROZWA ŻANIA  
7. Podczas oceny i oszacowania potencjalnej rakotwórczo ści i toksyczno ści 
przewlekłej substancji badanej laboratorium badawcze powinno rozwa żyć 
wszystkie dost ępne informacje na temat substancji badanej przed rozpocz ę­
ciem badania, w celu opracowania takiego projektu badania, który umo żliwi 
zbadanie toksykologicznych w łaściwości w sposób bardziej efektywny oraz 
zminimalizuje wykorzystanie zwierz ąt. Szczególnie istotne s ą informacje na 
temat sposobu dzia łania substancji, co do której podejrzewa si ę, że jest 
substancją rakotwórcz ą, oraz uwzgl ędnienie takiego sposobu dzia łania (2) 
(7) (12) (13) (14) (15), poniewa ż optymalny projekt badania mo że różnić się 
w zależności od tego, czy substancja badana jest znan ą genotoksyczn ą 
substancją rakotwórcz ą czy też substancj ą, co do której podejrzewa si ę 
działanie genotoksyczne i rakotwórcze. Dalsze wytyczne na temat kwestii 
dotyczących sposobu dzia łania można znaleźć w wytycznych nr 116 (7).  
8. Informacje, które b ędą pomocne w opracowywaniu projektu badania obej ­
mują tożsamość, struktur ę chemiczn ą i właściwości fizykochemiczne 
substancji badanej; wszelkie informacje na temat sposobu dzia łania; wyniki 
wszelkich bada ń toksyczno ści in vitro  lub in vivo , w tym bada ń genoto­
ksyczności; spodziewane zastosowania i potencjalne nara żenie ludzi; 
dostępne dane dotycz ące (Q)SAR, mutagenno ści/genotoksyczno ści, rako­
twórczości oraz inne dane toksykologiczne dotycz ące strukturalnie powi ąza­
nych zwi ązków; dost ępne dane toksykokinetyczne (je śli dostępne, dane  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
dotyczące kinetyki jednorazowego podania i podania powtórzonego) oraz 
dane pochodz ące z innych bada ń narażenia powtarzanego. Ocen ę toksycz­
ności przewlek łej/rakotwórczo ści należy przeprowadzi ć wyłącznie po uzys ­
kaniu wst ępnych informacji na temat toksyczno ści na podstawie 28-dnio ­
wych lub 90-dniowych bada ń toksyczno ści wywołanej powtarzanym dawko ­
waniem. U żytecznych informacji mog ą dostarczy ć także krótkoterminowe 
badania dotycz ące inicjacji i promocji w kontek ście rakotwórczo ści. 
W kontek ście badania rakotwórczo ści należy rozważyć podejście oparte 
na etapach, w ramach ogólnej oceny potencjalnych niepo żądanych skutków 
dla zdrowia wywo ływanych przez dan ą substancj ę badaną (16) (17) (18) 
(19).  
9. Metody statystyczne najbardziej odpowiednie do analizy wyników, przy 
uwzględnieniu projektu do świadczenia i celów badania, nale ży ustalić 
przed rozpocz ęciem badania. W śród kwestii, jakie nale ży rozważyć, znaj­
duje się pytanie, czy dane statystyczne powinny zawiera ć korektę uwzględ­
niającą zwierzęta, które prze żyły, analizę łącznego ryzyka wyst ąpienia guza 
w odniesieniu do okresu prze życia, analiz ę tego, jak szybko wyst ąpił guz, 
oraz analiz ę w przypadku przedwczesnego u śmiercenia jednej grupy lub 
większej liczby grup. Wytyczne dotycz ące odpowiednich analiz statystycz ­
nych i kluczowych odniesie ń do uznanych na świecie metod statystycznych 
zawarto w wytycznych nr 116 (7), a tak że wytycznych nr 35 dotycz ących 
analizy i ewaluacji bada ń toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści (20).  
10. Podczas przeprowadzania badania rakotwórczo ści należy w każdym przy ­
padku kierowa ć się głównymi zasadami i rozwa żaniami przedstawionymi 
w wytycznych OECD dotycz ących rozpoznawania, oceny i stosowania 
objawów klinicznych jako humanitarnego punktu ko ńcowego 
w odniesieniu do zwierz ąt wykorzystanych w badaniu oceny bezpiecze ństwa 
(21), a zw łaszcza w wytycznych zawartych w pkt 62 tego dokumentu. Punkt 
ten stanowi, że: „W badaniach z zastosowaniem powtarzanego dawkowania, 
jeśli zwierzę wykazuje objawy kliniczne, które post ępują, prowadz ąc do 
dalszego pogorszenia jego stanu, nale ży podjąć uzasadnion ą decyzję na 
temat tego, czy w sposób humanitarny u śmiercić takie zwierz ę. Taka decyzja 
powinna opiera ć się na rozwa żeniu warto ści informacji, jakie mo żna 
uzyskać dzięki dalszemu utrzymywaniu takiego zwierz ęcia w ramach 
badania i uwzgl ędniać ogólny stan takiego zwierz ęcia. Jeśli zapadnie 
decyzja o pozostawieniu takiego zwierz ęcia w badaniu, cz ęstotliwość obser­
wacji nale ży w razie potrzeby zwi ększyć. Można także tymczasowo 
zaprzesta ć dawkowania, je śli nie wp łynie to w sposób niekorzystny na cel 
badania, a zmniejszy cierpienie lub stres odczuwany przez zwierz ę, lub też 
można zmniejszy ć podawan ą dawkę”. 
11. Szczegó łowe wytyczne dotycz ące zasad doboru dawek w przypadku bada ń 
toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści, a także omówienie takich zasad, 
można znaleźć w wytycznych nr 116 (7), oraz w publikacjach Mi ędzyna­
rodowego Instytutu Nauk Biologicznych (ILSI) (22) (23). G łówna strategia 
doboru dawek zale ży od głównego celu lub celów badania (pkt 6). Podczas 
doboru odpowiednich poziomów dawek nale ży zachowa ć równowag ę 
między kontrol ą zagrożenia a okre śleniem reakcji na niskie dawki i ich 
istotnością. Ma to szczególne znaczenie w przypadku łączonego badania 
toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści. 
12. Nale ży rozważyć przeprowadzenie niniejszego łączonego badania toksycz ­
ności przewlek łej i rakotwórczo ści zamiast przeprowadzania osobno badania 
toksyczno ści przewlek łej (rozdzia ł B.30 niniejszego za łącznika) i badania 
rakotwórczo ści (rozdzia ł B.32 niniejszego za łącznika). W porównaniu 
z przeprowadzaniem dwóch osobnych bada ń łączone badanie zapewnia 
większą efektywno ść pod wzgl ędem czasu i kosztów, a jednocze śnie nie 
obniża jakości danych, czy to na etapie badania toksyczno ści przewlek łej, 
czy też na etapie badania rakotwórczo ści. Przy przeprowadzaniu łączonego 
badania toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści należy jednak zwróci ć 
szczególn ą uwagę na zasady doboru dawek (pkt 11 i 22–26), a tak że uznaje 
się, że w przypadku pewnych ram regulacyjnych wymagane mo że być prze­
prowadzenie takich bada ń osobno. Dalsze wytyczne dotycz ące projektu łączo­
nego badania toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści umożliwiającego 
osiągnięcie maksymalnej efektywno ści badania pod wzgl ędem ograniczenia 
liczby wykorzystanych zwierz ąt, a także poprzez usprawnienie ró żnych 
procedur do świadczalnych, mo żna znaleźć w wytycznych nr 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. Definicje stosowane w kontek ście niniejszej metody badawczej mo żna 
znaleźć na końcu tego rozdzia łu oraz w wytycznych nr 116 (7).  
ZASADA BADANIA  
14. Układ badania obejmuje dwa równoleg łe etapy – etap badania toksyczno ści 
przewlekłej i etap badania rakotwórczo ści (w celu uzyskania informacji na 
temat czasu trwania etapów zob. odpowiednio pkt 34 i 35). Substancj ę 
badaną podaje si ę zazwyczaj drog ą pokarmow ą, choć w niektórych przy ­
padkach w łaściwe może być badanie z zastosowaniem drogi inhalacyjnej 
lub dermalnej. Na etapie badania toksyczno ści przewlek łej substancj ę 
badaną podaje si ę codziennie w dawkach stopniowanych kilku grupom 
badanych zwierz ąt, przy czym ka żda grupa otrzymuje inny poziom dawki, 
zazwyczaj przez okres 12 miesi ęcy, choć w zależności od wymogów regu ­
lacyjnych mo żna wybra ć także dłuższy lub krótszy czas trwania tego etapu 
badania (zob. pkt 34). Czas trwania wybiera si ę w taki sposób, by badanie 
było dostatecznie d ługie, aby umo żliwić widoczne pojawienie si ę wszelkich 
skumulowanych skutków toksyczno ści, jednocze śnie unikaj ąc mogących 
wprowadzi ć w błąd skutków zmian wynikaj ących z wieku. Uk ład badania 
może obejmowa ć także uśmiercanie w trakcie trwania do świadczenia, np. po 
upływie 3 i 6 miesi ęcy, a także dodatkowe grupy zwierz ąt w celu umo żli­
wienia takiego dzia łania (zob. pkt 20). Na etapie badania rakotwórczo ści 
substancję badaną podaje si ę codziennie kilku grupom badanych zwierz ąt, 
przez większą część długości ich życia. Podczas obydwu etapów zwierz ęta 
obserwuje si ę uważnie w celu wykrycia objawów toksyczno ści i pojawienia 
się zmian nowotworowych. Zwierz ęta, które zgin ą lub zostan ą uśmiercone 
podczas badania, s ą poddawane sekcji zw łok, a zwierz ęta, które prze żyją, są, 
po zakończeniu badania, u śmiercane i poddawane sekcji zw łok. 
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
15. Niniejsza metoda badawcza obejmuje przede wszystkim ocen ę 
i oszacowanie toksyczno ści przewlek łej i rakotwórczo ści u gryzoni (pkt 
2). Wykorzystanie gatunków innych ni ż gryzonie mo żna rozwa żyć, jeśli 
dostępne dane wskazuj ą, że takie gatunki s ą bardziej odpowiednie 
w kontek ście określenia skutków dla zdrowia u ludzi. Wybór gatunku 
należy uzasadni ć. Preferowanym gatunkiem gryzoni jest szczur, mo żna 
jednak wykorzysta ć także inne gatunki, np. mysz. Cho ć w przesz łości 
wykorzystanie myszy w badaniach rakotwórczo ści mogło ogranicza ć 
użyteczność takich bada ń (24) (25) (26), w ramach niektórych obowi ązuj­ 
ących przepisów nadal wymaga si ę badania rakotwórczo ści 
z wykorzystaniem myszy, o ile nie ustalono, że takie badanie nie jest 
konieczne z naukowego punktu widzenia. Szczury i myszy s ą jak dotąd 
preferowanymi modelami do świadczalnymi z uwagi na ich wzgl ędnie krótk ą 
długość życia, powszechne wykorzystywanie w badaniach farmakologicz ­
nych i toksykologicznych, podatno ść na powstawanie guzów, a tak że 
dostępność dostatecznie scharakteryzowanych szczepów. Z racji tych cech 
dostępne są znaczne ilo ści informacji na temat ich fizjologii i patologii. 
Projekt i przeprowadzenie bada ń toksyczno ści przewlek łej/rakotwórczo ści 
z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie, je śli jest to wymagane, 
powinny opiera ć się na zasadach okre ślonych w niniejszej metodzie badaw ­
czej, a tak że na zasadach okre ślonych w rozdziale B.27 niniejszego 
załącznika, dotycz ącym 90-dniowego badania toksyczno ści pokarmowej 
wywołanej powtarzanym dawkowaniem z wykorzystaniem gatunków innych 
niż gryzonie (6). Dodatkowe informacje dotycz ące wyboru gatunku 
i szczepu przedstawiono w wytycznych nr 116 (7).  
16. Zaleca si ę wykorzystanie zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt pochodz ­ 
ących ze szczepów powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. 
Badanie toksyczno ści przewlek łej/rakotwórczo ści należy przeprowadzi ć 
z wykorzystaniem zwierz ąt z tego samego szczepu i źródła, z którego 
pochodziły zwierzęta wykorzystane we wst ępnym badaniu lub wst ępnych 
badaniach toksyczno ści o krótszym czasie trwania, niemniej jednak, je śli 
wiadomo, że w przypadku zwierz ąt z danego szczepu i źródła pojawiaj ą 
się problemy z osi ągnięciem powszechnie przyj ętego kryterium prze życia 
w badaniach d ługoterminowych [zob. wytyczne nr 116 (7)], nale ży 
rozważyć wykorzystanie szczepu zwierz ąt, który charakteryzuje si ę akcep­
towalnym wska źnikiem prze życia w przypadku bada ń długoterminowych. 
Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą być w ciąży. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Warunki przetrzymywania i karmienia  
17. Zwierz ęta można przetrzymywa ć pojedynczo lub te ż w klatkach w ma łych 
grupach sk ładających się z osobników tej samej p łci; przetrzymywanie 
zwierząt pojedynczo nale ży rozważyć, wyłącznie jeśli jest to uzasadnione 
z naukowego punktu widzenia (27) (28) (29). Klatki nale ży rozmie ścić 
w taki sposób, aby zminimalizowa ć potencjalny wp ływ ich uk ładu. Tempe ­
ratura w pomieszczeniach badawczych, w których przetrzymuje si ę zwie­
rzęta, powinna wynosi ć 22 °C (± 3 °C). Chocia ż wilgotno ść względna 
powinna wynosi ć co najmniej 30 % i po żądane jest, by poza czasem czysz ­
czenia pomieszczenia nie przekracza ła 70 %, nale ży dążyć do utrzymania jej 
na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 
godzin światła, 12 godzin ciemno ści. Do karmienia mo żna stosowa ć 
konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do 
wody pitnej. Pasza powinna spe łniać wszystkie wymogi zwi ązane 
z odżywianiem badanych gatunków, a obecna w niej zawarto ść pokarmo ­
wych substancji zanieczyszczaj ących, w tym mi ędzy innymi pozosta łości 
pestycydów, trwa łych zanieczyszcze ń organicznych, fitoestrogenów, metali 
ciężkich i mikotoksyn, które mog ą wpłynąć na wynik badania, powinna by ć 
możliwie jak najni ższa. Okresowo nale ży generowa ć informacje analityczne 
na temat poziomów sk ładników od żywczych i pokarmowych substancji 
zanieczyszczaj ących, a przynajmniej na pocz ątku badania oraz 
w przypadku zmiany stosowanej partii. Takie informacje nale ży uwzględnić 
w sprawozdaniu ko ńcowym. Informacje analityczne na temat wody pitnej 
stosowanej w badaniu nale ży przedstawi ć w podobny sposób. Na wybór 
pokarmu mo że mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej mieszaniny 
substancji badanej, a tak że potrzeba spe łnienia wymogów zwi ązanych 
z odżywianiem zwierz ąt, jeśli substancj ę badaną podaje si ę wraz 
z pokarmem.  
Przygotowanie zwierz ąt 
18. Nale ży wykorzysta ć zdrowe zwierz ęta aklimatyzowane do warunków labo ­
ratoryjnych przez okres co najmniej 7 dni oraz niepoddawane wcze śniej 
procedurom badawczym. W przypadku gryzoni dawkowanie substancji 
zwierzętom nale ży rozpocz ąć możliwie jak najszybciej po odsadzeniu 
i aklimatyzacji oraz najlepiej, zanim zwierz ęta osiągną wiek 8 tygodni. 
Badane zwierz ęta należy scharakteryzowa ć ze wzgl ędu na ich gatunek, 
szczep, źródło, płeć, wagę i wiek. W chwili rozpocz ęcia badania odchylenia 
masy dla obu p łci wykorzystanych zwierz ąt powinny by ć minimalne i nie 
przekracza ć ± 20 % średniej masy wszystkich zwierz ąt wykorzystanych 
w ramach badania, osobno dla ka żdej płci. Należy losowo przydzieli ć zwie­
rzęta do grup kontrolnych i grup poddawanych dzia łaniu substancji badanej. 
Po randomizacji mi ędzy grupami nie powinno by ć znaczących różnic 
w średniej wadze osobników, w odniesieniu do obu p łci. Jeśli odnotowano 
statystycznie istotne ró żnice, randomizacj ę należy powtórzy ć, jeśli jest to 
możliwe. Ka żdemu zwierz ęciu należy przydzieli ć niepowtarzalny numer 
identyfikacyjny i w sposób sta ły oznaczy ć je tym numerem poprzez jego 
wytatuowanie, wszczepienie implantu z chipem lub za pomoc ą innej odpo ­
wiedniej metody.  
PROCEDURA  
Liczba i p łeć zwierząt 
19. Nale ży wykorzysta ć zwierzęta obu płci. Należy wykorzysta ć wystarczaj ącą 
liczbę zwierząt, aby umo żliwić szczegółowe szacunki z punktu widzenia 
biologicznego i statystycznego. W zwi ązku z powy ższym w przypadku 
gryzoni ka żda grupa otrzymuj ąca dawki (jak okre ślono to w pkt 22) oraz 
równoleg ła grupa kontrolna przeznaczone do etapu badania rakotwórczo ści 
powinny liczy ć co najmniej 50 zwierz ąt każdej płci. W zale żności od celu 
badania mo żna zwiększyć moc statystyczn ą kluczowych szacunków poprzez 
zróżnicowane przydzielenie zwierz ąt nierównomiernie do grup otrzymuj ­ 
ących różne dawki, przy czym w grupach otrzymuj ących niskie dawki 
powinno by ć więcej niż 50 zwierz ąt; np. w celu oszacowania rakotwór ­
czości przy niskich dawkach. Nale ży jednak pami ętać, że umiarkowane 
zwiększenie liczebno ści grupy oznacza wzgl ędnie niewielkie zwi ększenie 
mocy statystycznej badania. W przypadku gryzoni ka żda grupa otrzymuj ąca 
dawki (jak okre ślono to w pkt 22) oraz równoleg ła grupa kontrolna prze ­
znaczone do etapu badania toksyczno ści przewlek łej powinny liczy ć co 
najmniej 10 zwierz ąt każdej płci. Należy zauważyć, że liczba ta jest ni ższa ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
niż liczba okre ślona dla badania toksyczno ści przewlek łej (rozdzia ł B.30 
niniejszego za łącznika). Przy interpretacji danych pochodz ących od zmniej ­
szonej liczby zwierz ąt w grupie na etapie badania toksyczno ści przewlek łej 
w ramach takiego łączonego badania mo żna jednak pos łużyć się danymi 
pochodzącymi od wi ększej liczby zwierz ąt przewidzianych w ramach etapu 
badania rakotwórczo ści. W przypadku bada ń z wykorzystaniem myszy na 
etapie badania toksyczno ści przewlek łej może zaistnie ć konieczno ść dodania 
zwierząt do każdej z grup otrzymuj ących dawki, w celu przeprowadzenia 
wszystkich wymaganych oznacze ń hematologicznych. Wi ęcej informacji na 
temat projektu badania pod wzgl ędem statystycznym oraz doboru poziomów 
dawek w celu zmaksymalizowania mocy statystycznej zawarto w wytycznych nr 116 (7).
 
Ustalenia dotycz ące uśmiercania w trakcie trwania do świadczenia oraz 
grup satelitarnych (wska źnikowych)  
20. W ramach badania mo żna założyć uśmiercanie zwierz ąt w trakcie trwania 
doświadczenia, np. po up ływie 6 miesi ęcy w przypadku etapu badania 
toksyczno ści przewlek łej, w celu uzyskania informacji na temat progresji 
zmian innych ni ż nowotworowe oraz informacji dotycz ących mechanizmu 
działania, jeśli jest to uzasadnione z naukowego punktu widzenia. Je śli takie 
informacje s ą już dostępne dzięki poprzednim badaniom toksyczno ści 
wywołanej powtarzanym dawkowaniem substancji badanej, u śmiercanie 
w trakcie trwania do świadczenia mo że nie by ć uzasadnione 
z naukowego punktu widzenia. Zwierz ęta wykorzystane na etapie badania 
toksyczno ści przewlek łej, który trwa zazwyczaj 12 miesi ęcy (pkt 34), 
dostarczaj ą danych dotycz ących uśmiercania w trakcie trwania do świad­
czenia przydatnych w kontek ście etapu badania rakotwórczo ści, dzięki 
czemu ogranicza si ę całkowitą liczbę wykorzystanych zwierz ąt. Na etapie 
badania toksyczno ści przewlek łej można uwzględnić także grupy satelitarne, 
w celu monitorowania odwracalno ści zmian toksykologicznych wywo łanych 
substancją badaną. Wprowadzenie takich grup mo żna ograniczy ć do najwy ż­
szego poziomu dawki stosowanego w badaniu oraz grupy kontrolnej. W celu monitorowania w trakcie badania, w razie konieczno ści, statusu 
choroby, mo żna uwzgl ędnić dodatkow ą grupę zwierząt wskaźnikowych 
(zazwyczaj 5 zwierz ąt każdej płci) (30). Dalsze wytyczne dotycz ące projektu 
badania uwzgl ędniającego uśmiercanie w trakcie trwania do świadczenia, 
zwierzęta satelitarne i wska źnikowe w celu zminimalizowania ca łkowitej 
liczby wykorzystanych zwierz ąt przedstawiono w wytycznych nr 116 (7).
 
21. Jeśli projekt badania przewiduje wykorzystanie zwierz ąt satelitarnych lub 
uśmiercanie w trakcie trwania do świadczenia, liczba zwierz ąt w każdej 
grupie otrzymuj ącej dawki przewidziana w tym celu b ędzie wynosi ć zazwy­
czaj 10 zwierz ąt każdej płci, zaś całkowitą liczbę zwierząt przewidzianych 
w układzie badania nale ży zwiększyć o liczbę zwierząt przeznaczonych do 
uśmiercenia przed zako ńczeniem badania. Zwierz ęta przewidziane do 
uśmiercenia w trakcie trwania do świadczenia lub zwierz ęta satelitarne 
zazwyczaj poddaje si ę takim samym obserwacjom, w tym obserwacjom 
dotyczącym masy cia ła, spożycia pokarmu/wody, pomiarom hematolo ­
gicznym i pod k ątem biochemii klinicznej oraz pod k ątem patologii, co 
zwierzęta wykorzystane w ramach g łównego badania na etapie badania 
toksyczno ści przewlek łej, choć można założyć (w przypadku grup przewi ­
dzianych do u śmiercenia w trakcie trwania do świadczenia) ograniczenie 
takich pomiarów do konkretnych kluczowych dzia łań, takich jak badanie 
neurotoksyczno ści lub immunotoksyczno ści. 
Grupy otrzymuj ące dawki oraz dawkowanie  
22. Wytyczne dotycz ące wszystkich aspektów doboru dawek oraz zró żnico­
wania poziomu dawek zawarto w wytycznych nr 116 (7). Nale ży zasto­
sować co najmniej trzy poziomy dawek oraz ustanowi ć równoleg łą grupę 
kontrolną, zarówno dla etapu badania toksyczno ści przewlek łej, jak i dla 
etapu badania rakotwórczo ści. Poziomy dawek b ędą zazwyczaj oparte na 
wynikach krótkoterminowych bada ń z powtarzanym dawkowaniem lub 
badań ustalających zakres dawkowania oraz nale ży uwzględnić w tym 
kontekście wszelkie istniej ące dane toksykologiczne i toksykokinetyczne 
dostępne w odniesieniu do substancji badanej lub substancji powi ązanych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. W przypadku etapu badania toksyczno ści przewlek łej pełne badanie 
z zastosowaniem trzech poziomów dawek mo że zostać uznane za zb ędne, 
jeśli możliwe jest za łożenie, że badanie z zastosowaniem jednego poziomu 
dawki, równego co najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła dziennie, nie spowo ­
duje szkodliwych skutków. Takie za łożenie powinno opiera ć się na infor ­
macjach pochodz ących z bada ń wstępnych oraz okre śleniu, że na podstawie 
danych dotycz ących innych strukturalnie powi ązanych zwi ązków nie prze ­
widuje si ę toksyczno ści. Można zastosowa ć limit 1 000 mg/kg masy cia ła 
dziennie, z wyj ątkiem sytuacji, gdy nara żenie ludzi wskazuje potrzeb ę zasto­
sowania wy ższego poziomu dawki.  
24. O ile nie ogranicza tego fizykochemiczny charakter biologicznych skutków 
działania substancji badanej, nale ży wybrać najwyższy poziom dawki w celu 
określenia głównych organów docelowych oraz skutków toksycznych, 
jednocześnie unikaj ąc cierpienia, toksyczno ści ostrej, chorobowo ści lub 
śmierci. Nale ży wybra ć najwyższy poziom dawki w celu uzyskania 
dowodów na toksyczno ść, potwierdzonych, na przyk ład, wolniejszym przy ­
bieraniem na wadze (o oko ło 10 %). W zale żności od celów badania (zob. 
pkt 6) mo żna jednak wybra ć górną dawkę niższą od dawki potwierdzaj ącej 
toksyczno ść, np. jeśli dawka powoduje niekorzystny skutek istotny dla 
badania, który ma jednak niewielki wp ływ na długość życia czy mas ę ciała. 
25. Poziomy dawek i zró żnicowanie ich poziomów mo żna dobra ć tak, by 
określić odpowied ź zależną od dawki oraz, w zale żności od sposobu dzia ­ 
łania substancji badanej, NOAEL lub inny po żądany wynik badania, np. 
BMD (zob. pkt 27). Przy stosowaniu ni ższych dawek nale ży rozważyć 
takie czynniki, jak spodziewane nachylenie krzywej dawka-odpowied ź, 
dawki, przy których mog ą pojawić się istotne zmiany w metabolizmie, 
lub charakter dzia łania toksycznego, przy którym oczekuje si ę wartości 
granicznej lub punktu wyj ścia dla ekstrapolacji dla niskiej dawki. Przy 
przeprowadzaniu łączonego badania rakotwórczo ści/toksyczno ści przewle ­
kłej głównym celem b ędzie uzyskanie informacji koniecznych do oceny 
ryzyka wyst ąpienia rakotwórczo ści, zaś informacje dotycz ące toksyczno ści 
przewlekłej będą zazwyczaj stanowi ć cel drugorz ędny. Nale ży o tym 
pamiętać przy doborze poziomów dawek oraz zró żnicowania poziomów 
dawek na potrzeby badania.  
26. Wybrane zró żnicowanie poziomów dawki b ędzie zależeć od celów badania 
i właściwości substancji badanej i nie mo że zostać z góry szczegó łowo 
określone w niniejszej metodzie badawczej, jednak zastosowanie dwóch 
do czterech odst ępów pomi ędzy kolejnym dawkowaniem cz ęsto zapewnia 
dobre wyniki badania dla ustalenia malej ących poziomów dawki, a dodanie 
czwartej grupy badanej jest cz ęsto rozwi ązaniem preferowanym 
w porównaniu ze stosowaniem bardzo du żych interwa łów między dawko ­
waniem (np. wspó łczynnik wi ększy niż 6-10). Zasadniczo nale ży unikać 
stosowania wspó łczynników wi ększych ni ż 10, a w przypadku ich zastoso ­
wania nale ży je uzasadni ć. 
27. Jak omówiono to w wytycznych OECD nr 116 (7), kwestie, jakie nale ży 
rozważyć przy doborze dawki, obejmuj ą: 
— znane lub podejrzewane nieliniowo ści lub punkty przegi ęcia krzywej 
dawka-odpowied ź, 
— toksykokinetyk ę oraz zakresy dawkowania, przy których wyst ępuje lub 
nie występuje indukcja metaboliczna, nasycenie lub te ż nieliniowo ść 
między zewn ętrznymi a wewn ętrznymi dawkami,  
— zmiany prekursorowe, markery skutku, lub wska źniki działania kluczo ­
wych podstawowych procesów biologicznych,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— kluczowe (lub podejrzewane) aspekty sposobu dzia łania, takie jak 
dawki, przy których zaczyna pojawia ć się cytotoksyczno ść, zakłócone 
zostają poziomy hormonów, przestaj ą działać mechanizmy homeosta ­
tyczne itp.,  
— regiony krzywej dawka-odpowied ź, gdzie konieczne s ą szczególnie 
solidne szacunki, np. w zakresie spodziewanej BMD lub podejrzewanej wartości granicznej,
 
— spodziewane poziomy nara żenia ludzi, zw łaszcza przy doborze dawek 
średnich i niskich.  
28. Grupa kontrolna powinna by ć grupą niepoddawan ą działaniu substancji 
badanej lub grup ą kontroln ą nośnika, jeśli do podawania substancji badanej 
zastosowano no śnik. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu substancji badanej, 
zwierzęta z grupy kontrolnej nale ży traktowa ć w sposób identyczny ze 
sposobem traktowania osobników z grup badanych. Je śli zastosowano 
nośnik, grupa kontrolna otrzymuje no śnik w najwy ższej objętości stoso­
wanej wśród grup otrzymuj ących dawki. Je śli substancj ę badaną podaje 
się wraz z pokarmem i je śli powoduje ona znacznie zmniejszone pobranie 
pokarmu z powodu jego obni żonych warto ści smakowych, pomocna mo że 
być dodatkowa grupa kontrolna zwierz ąt otrzymuj ących pokarm w ilo ści 
spożywanej przez zwierz ęta z grupy badanej (pair-fed), która zapewni odpo ­
wiedniejsz ą kontrolę. 
Przygotowanie dawek i podanie substancji badanej  
29. Substancj ę badaną zazwyczaj podaje si ę drogą pokarmow ą, wraz 
z pokarmem lub wod ą pitną, lub też za pomoc ą sondy. Dodatkowe infor ­
macje na temat dróg i metod podania przedstawiono w wytycznych nr 116 (7). Droga i metoda podania zale żą od celu badania, fizykochemicznych 
właściwości substancji badanej, jej biodost ępności oraz g łównej drogi 
i metody nara żenia ludzi. Nale ży przedstawi ć uzasadnienie wybranej drogi 
i metody podania. W trosce o dobrostan zwierz ąt należy w normalnych 
warunkach wybra ć sondę żołądkową wyłącznie dla tych substancji, dla 
których taka droga i metoda podania w sposób uzasadniony odzwierciedlaj ą 
potencjalne nara żenie ludzi (np. produkty farmaceutyczne). Substancje 
występujące w pokarmie lub środowisku naturalnym, w tym pestycydy, 
podaje si ę zazwyczaj wraz z pokarmem lub wod ą pitną. W przypadku 
jednak niektórych scenariuszy, np. nara żenia zawodowego, podawanie 
substancji za pomoc ą innych dróg mo że być bardziej w łaściwe.
 
30. W razie potrzeby substancj ę badaną rozpuszcza si ę lub sporz ądza się jej 
zawiesinę w odpowiednim no śniku. W stosownych przypadkach nale ży 
wziąć pod uwag ę następujące cechy no śnika i innych dodatków: wp ływ 
na wchłanianie, dystrybucj ę, metabolizm oraz zatrzymywanie substancji 
badanej; wp ływ na chemiczne w łasności substancji badanej, które mog ą 
zmienić jej charakterystyk ę toksyczn ą; oraz wp ływ na spo życie pokarmu 
lub wody, lub te ż na stan od żywienia zwierz ąt. Zaleca si ę, w miarę możli­
wości, najpierw rozwa żyć zastosowanie roztworu wodnego/zawiesiny, 
następnie roztworu/emulsji w oleju (np. z zastosowaniem oleju kukurydzia ­
nego), a potem mo żliwego roztworu w innych no śnikach. W przypadku 
nośników innych ni ż woda charakterystyka toksyczna no śnika powinna 
być znana. Dost ępne powinny by ć także informacje na temat stabilno ści 
substancji badanej oraz jednorodno ści roztworów dawek lub pokarmu 
z dawkami (w zale żności od sytuacji) w warunkach podawania (np. 
pokarm).  
31. W przypadku substancji podawanych w pokarmie lub wodzie pitnej wa żne 
jest dopilnowanie, by takie ilo ści substancji badanej nie zak łócały prawid­ 
łowej równowagi od żywiania lub spo życia wody. W przypadku d ługotermi­
nowych bada ń toksyczno ści z zastosowaniem podawania dawek wraz 
z pokarmem st ężenie substancji badanej w paszy nie powinno 
w normalnych warunkach przekracza ć górnego limitu 5 % ca łego pokarmu, 
aby unikn ąć zakłócenia równowagi od żywiania. Przy podawaniu substancji 
badanej wraz z pokarmem mo żna zastosowa ć stałe stężenie w pokarmie 
(mg/kg pokarmu lub ppm) lub te ż stały poziom dawki w odniesieniu do 
masy ciała zwierzęcia (mg/kg masy cia ła), obliczany cotygodniowo. Nale ży 
określić, które rozwi ązanie zastosowano.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Przy podawaniu substancji drog ą pokarmow ą zwierzętom podaje si ę dawki 
substancji badanej codziennie (siedem dni w tygodniu), przez okres 12 
miesięcy (etap badania toksyczno ści przewlek łej) lub 24 miesi ęcy (etap 
badania rakotwórczo ści), zob. tak że pkt 33 i 34. Zastosowanie innego systemu 
dawkowania, np. przez pi ęć dni w tygodniu, nale ży uzasadni ć. Przy poda ­
waniu substancji drog ą dermalną zwierzęta zazwyczaj poddaje si ę działaniu 
substancji badanej przez co najmniej 6 godzin dziennie, 7 dni w tygodniu, zgodnie z rozdzia łem B.9 niniejszego za łącznika (11), przez okres 12 
miesięcy (etap badania toksyczno ści przewlek łej) lub 24 miesi ęcy (etap 
badania rakotwórczo ści). Narażenie drog ą inhalacyjn ą stosuje si ę przez 6 
godzin dziennie, 7 dni w tygodniu, ale mo żliwe jest zastosowanie nara żenia 
także przez 5 dni w tygodniu, je śli zostanie to uzasadnione. Okres nara żenia 
zazwyczaj wynosi 12 miesi ęcy (etap badania toksyczno ści przewlek łej) lub 24 
miesiące (etap badania rakotwórczo ści). Jeśli gatunki gryzoni inne ni ż szczury 
poddaje si ę naraż
eniu wyłącznie poprzez nos, maksymalne okresy nara żenia 
można dostosowa ć tak, by zminimalizowa ć charakterystyczny dla danego 
gatunku stres. W przypadku stosowania okresu nara żenia krótszego ni ż 6 
godzin dziennie nale ży przedstawi ć stosowne uzasadnienie. Zob. równie ż 
rozdział B.8 niniejszego za łącznika (9).  
33. Jeśli substancj ę badaną podaje si ę zwierzętom za pomoc ą sondy, nale ży 
dokonywa ć tego z u życiem sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli 
intubacyjnej, ka żdego dnia o podobnych porach. Zazwyczaj podaje si ę poje­
dynczą dawkę raz dziennie, je śli jednak substancja jest, na przyk ład, 
substancją wykazuj ącą miejscowe dzia łanie drażniące, możliwe jest zacho ­
wanie dziennej mocy dawki poprzez podawanie jej jako dawki dzielonej 
(dwa razy dziennie). Maksymalna obj ętość cieczy, jak ą można podać jedno­
razowo, zale ży od wielko ści badanego zwierz ęcia. Objętość taka powinna 
być możliwie jak najni ższa i nie powinna w normalnych warunkach prze ­
kraczać 1 ml/100 g masy cia ła w przypadku gryzoni (31). Zmienno ść stoso­
wanej obj ętości należy zminimalizowa ć poprzez dostosowanie st ężenia, aby 
zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawek. Wyj ątkiem są 
substancję potencjalnie żrące lub wykazuj ące działanie drażniące, które 
należy rozcieńczyć w celu unikni ęcia miejscowych ostrych skutków. Nale ży 
unikać badania z u życiem stężeń, które mog ą być żrące lub wykazywa ć 
działanie drażniące dla przewodu pokarmowego.  
Czas trwania badania  
34. Okres dawkowania i czas trwania etapu badania toksyczno ści przewlek łej 
w ramach badania łączonego wynosz ą zazwyczaj 12 miesi ęcy, choć 
w ramach projektu badania mo żna zaplanowa ć i zastosowa ć krótszy 
(wynoszący np. 6 lub 9 miesi ęcy) lub d łuższy (wynosz ący np. 18 lub 24 
miesiące) czas trwania badania, w zale żności od wymogów poszczególnych 
systemów regulacyjnych lub w przypadku specyficznych celów zwi ązanych 
z mechanizmami. Odst ępstwa od 12-miesi ęcznego czasu trwania nara żenia 
należy uzasadni ć, zwłaszcza w przypadku krótszych okresów. Badanie na 
wszystkich grupach otrzymuj ących dawki przydzielonych do tego etapu 
zostanie zako ńczone w wyznaczonym czasie w celu oceny toksyczno ści 
przewlekłej oraz zmian patologicznych innych ni ż nowotworowe. Grupy 
satelitarne wprowadzone w celu monitorowania odwracalno ści zmian toksy ­
kologicznych wywo łanych przez substancj ę badaną należy utrzyma ć bez 
dawkowania przez okres nie krótszy ni ż 4 tygodnie oraz nie d łuższy niż 
jedna trzecia ca łego okresu trwania badania po ustaniu nara żenia.  
35. W przypadku gryzoni czas trwania etapu badania rakotwórczo ści w ramach 
badania łączonego b ędzie zazwyczaj wynosi ł 24 miesi ące, co stanowi 
większą część standardowej d ługości życia zwierz ąt, które maj ą zostać 
wykorzystane w takim badaniu. Mo żna ustalić dłuższy lub krótszy czas 
trwania badania w zale żności od długości życia szczepu gatunku zwierz ąt 
wykorzystanego w badaniu, tak ą decyzję należy jednak uzasadni ć. 
W przypadku pewnych szczepów myszy, np. szczepów AKR/J, C3H/J lub 
C57BL/6J, w łaściwszy mo że być czas trwania badania wynosz ący 18 
miesięcy. Poniżej znajduj ą się pewne wytyczne dotycz ące czasu trwania 
badania, zako ńczenia badania oraz prze życia; dalsze wytyczne, w tym 
rozważenia dotycz ące dopuszczalno ści rakotwórczo ści ujemnie zwi ązanej 
z przeżyciem, przedstawiono w wytycznych nr 116 (7):  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— zakończenie badania nale ży rozważyć, jeśli liczba osobników, które 
pozostały przy życiu w grupach otrzymuj ących niższe dawki lub grupie 
kontrolnej, spadnie poni żej 25 %,  
— jeśli wyłącznie osobniki z grupy otrzymuj ącej wysokie dawki padn ą 
przedwcze śnie z powodu toksyczno ści, nie powinno to powodowa ć 
zakończenia badania,  
— przeżycie osobników obu p łci należy rozważyć osobno,  
— nie nale ży przedłużać badania, je śli dane dost ępne dzięki badaniu sta ły 
się niewystarczaj ące, aby umo żliwić oszacowanie wiarygodne pod 
względem statystycznym.  
OBSERWACJE (ETAP BADANIA TOKSYCZNO ŚCI PRZEWLEK ŁEJ) 
36. Wszystkie zwierz ęta należy sprawdzi ć pod k ątem chorobowo ści 
i upadkowo ści, zazwyczaj na pocz ątku i pod koniec ka żdego dnia, w łącznie 
z weekendami i dniami wolnymi od pracy. Ogólnych obserwacji klinicznych 
należy dokonywa ć co najmniej raz dziennie, najlepiej o tej samej porze lub 
porach ka żdego dnia, uwzgl ędniając szczytowy okres przewidywanych 
skutków po podaniu dawki w przypadku podawania substancji badanej za 
pomocą sondy.  
37. Przynajmniej raz przed pierwszym nara żeniem nale ży dokona ć szczegółowej 
obserwacji klinicznej wszystkich zwierz ąt (w celu umo żliwienia porówna ń 
dotyczących tych samych osobników), a tak że pod koniec pierwszego tygo ­
dnia badania, a po tym okresie – co miesi ąc. Protokó ł dotyczący obserwacji 
należy opracowa ć tak, by zminimalizowa ć odchylenia mi ędzy poszczegól ­
nymi obserwatorami i by by ły one niezale żne od badanej grupy. Obserwacji 
należy dokonywa ć poza klatk ą zwierzęcia, najlepiej w warunkach standar ­
dowych i za ka żdym razem o podobnych porach. Obserwacje nale ży 
starannie odnotowa ć, najlepiej za pomoc ą systemów punktacji wyra źnie 
określonych przez laboratorium badawcze. Nale ży dołożyć starań w celu 
dopilnowania, aby odchylenia w warunkach obserwacji by ły minimalne. 
Odnotowane objawy powinny obejmowa ć, między innymi, zmiany 
w skórze, sier ści, oczach, b łonach śluzowych, wyst ąpienie wydzielin 
i wydalin oraz aktywno ść autonomicznego uk ładu nerwowego (np. łzawie­
nie, piloerekcj ę, rozmiar źrenicy, niestandardowe zmiany w sposobie oddy ­
chania). Nale ży odnotowa ć także zmiany w sposobie chodzenia, postawie 
i reakcji na dotyk, jak równie ż obecność ruchów klonicznych lub tonicz ­
nych, zachowa ń stereotypowych (np. nadmierne czyszczenie si ę, powta­
rzające się krążenie w kó łko) oraz dziwne zachowania (np. samookaleczanie 
się, chodzenie do ty łu) (32).  
38. Badanie oftalmologiczne, za pomoc ą oftalmoskopu lub innego odpowied ­
niego sprz ętu, należy przeprowadzi ć u wszystkich zwierz ąt przed pierwszym 
podaniem substancji badanej. Badanie to nale ży przeprowadzi ć także wraz 
z zakończeniem badania, najlepiej u wszystkich zwierz ąt, a co najmniej 
w grupach otrzymuj ących wysokie dawki i w grupach kontrolnych. 
W przypadku wykrycia zmian w oczach zwi ązanych z poddawaniem 
zwierząt działaniu substancji badanej nale ży przebada ć wszystkie zwierz ęta. 
Jeśli wyniki analizy strukturalnej lub inne informacje wskazuj ą na toksycz ­
ność dla oczu, nale ży zwiększyć częstotliwość badania oczu.  
39. W przypadku substancji chemicznych, dla których poprzednie 28-dniowe 
lub 90-dniowe badania toksyczno ści wywołanej powtarzanym dawkowa ­
niem wykaza ły prawdopodobie ństwo wywo ływania dzia łania neurotoksycz ­
nego i reaktywno ść na różnego typu bod źce (32) (np. bod źce słuchowe, 
wizualne i proprioceptywne) (33) (34) (35), przed rozpocz ęciem badania 
oraz co 3 miesi ące po rozpocz ęciu badania przez okres do 12 miesi ęcy, 
a także wraz z zako ńczeniem badania (je śli jego czas trwania jest d łuższy 
niż 12 miesi ęcy) można przeprowadzi ć ocenę siły uchwytu (36) oraz ocen ę 
aktywności motorycznej (37). Dalsze szczegó łowe informacje na temat 
procedur, jakie mo żna zastosowa ć, podano w odpowiednich odniesieniach. 
Można jednak tak że zastosowa ć również procedury inne ni ż te podane 
w odniesieniach.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 493
 
40. W przypadku substancji chemicznych, dla których poprzednie 28-dniowe 
lub 90-dniowe badania toksyczno ści wywołanej powtarzanym dawkowa ­
niem wykaza ły prawdopodobie ństwo wywo ływania dzia łania immunoto ­
ksycznego, dalsze badania tego parametru docelowego mo żna przeprowa ­
dzić wraz z zako ńczeniem badania.  
Masa cia ła, spożycie pokarmu/wody i wydajno ść pokarmu  
41. Wszystkie zwierz ęta należy zważyć na pocz ątku rozpocz ęcia poddawania 
ich działaniu substancji badanej, a tak że co najmniej raz w tygodniu 
przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz w miesiącu. Pomiarów spo życia pokarmu i wydajno ści pokarmu nale ży 
dokonywa ć co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po 
tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu. Spożycie wody nale ży mierzyć 
co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu, jeśli substancj ę badaną podaje si ę wraz z wod ą 
pitną. Pomiary spo życia wody nale ży rozważyć także w przypadku bada ń, 
w których zasz ły zmiany zwi ązane ze spo życiem wody.
 
Hematologia i biochemia kliniczna  
42. W przypadku bada ń z wykorzystaniem gryzoni badania hematologiczne 
należy przeprowadza ć u wszystkich badanych zwierz ąt (10 samców i 10 
samic w ka żdej grupie) po up ływie 3, 6 i 12 miesi ęcy, a tak że wraz 
z zakończeniem badania (je śli jego czas trwania jest d łuższy niż 12 miesi ę­
cy). W przypadku wykorzystania w badaniu myszy konieczne mo że być 
uwzględnienie zwierz ąt satelitarnych w celu przeprowadzenia wszystkich 
wymaganych oznacze ń hematologicznych (zob. pkt 19). W badaniach 
z wykorzystaniem gatunków innych ni ż gryzonie próbki nale ży pobiera ć 
od mniejszej liczby zwierz ąt (np. od 4 zwierz ąt dla każdej płci i grupy 
w badaniach z wykorzystaniem psów), w trakcie badania oraz wraz z jego zako ńczeniem, tak jak zosta ło to opisane w przypadku bada ń 
z wykorzystaniem gryzoni. Nie ma konieczno ści przeprowadzania pomiarów 
po upływie 3 miesi ęcy, zarówno w przypadku gryzoni, jak i gatunków 
innych ni ż gryzonie, je śli w poprzednim 90-dniowym badaniu przeprowa ­
dzonym przy porównywalnych poziomach dawek nie odnotowano zmian 
parametrów hematologicznych. Próbki krwi nale ży pobrać z określonego 
miejsca, na przyk ład poprzez nak łucie serca lub z zatoki oczodo łowej tylnej, 
w znieczuleniu.
 
43. Nale ży zbadać parametry z nast ępującej listy (38): ca łkowitą i różnicową 
liczbę leukocytów, liczb ę erytrocytów, liczb ę płytek krwi, st ężenie hemo ­
globiny, hematokryt (HCT), średnią objętość erytrocytów (MCV), średnią 
masę hemoglobiny w erytrocycie (MCH), średnie stężenie hemoglobiny 
w erytrocytach (MCHC), czas protrombinowy oraz czas cz ęściowej trombo ­
plastyny po aktywacji. Inne parametry hematologiczne, takie jak cia łka 
Heinza lub inne nietypowe parametry morfologii erytrocytów lub methemo ­
globiny, mog ą zostać zmierzone w stosownych przypadkach, w zale żności 
od toksyczno ści substancji badanej. Zasadniczo nale ży przyjąć elastyczne 
podejście, dostosowane do obserwowanych lub spodziewanych skutków 
działania danej substancji badanej. Je śli substancja badana ma wp ływ na 
układ krwiotwórczy, mo żna równie ż przeprowadzi ć badanie liczby retikulo ­
cytów i cytologi ę szpiku kostnego, cho ć takie badania nie musz ą być prze­
prowadzane w ramach bada ń rutynowych.  
44. Oznaczenia parametrów biochemii klinicznej w celu zbadania g łównych 
skutków toksycznych w tkankach, a w szczególno ści skutków dla nerek 
i wątroby, nale ży wykona ć na próbkach krwi pobranych od ka żdego zwie ­
rzęcia (10 samców i 10 samic z ka żdej grupy) w takich samych odst ępach 
czasowych jak w przypadku bada ń hematologicznych. W przypadku wyko ­
rzystania w badaniu myszy konieczne mo że być wprowadzenie zwierz ąt 
satelitarnych w celu przeprowadzenia wszystkich wymaganych oznacze ń ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
parametrów biochemii klinicznej. W badaniach z wykorzystaniem gatunków 
innych ni ż gryzonie próbki nale ży pobiera ć od mniejszej liczby zwierz ąt 
(np. od 4 zwierz ąt dla każdej płci i grupy w badaniach z wykorzystaniem 
psów), w trakcie badania oraz wraz z jego zako ńczeniem, tak jak zosta ło to 
opisane w przypadku bada ń z wykorzystaniem gryzoni. Nie ma koniecz ­
ności przeprowadzania pomiarów po up ływie 3 miesi ęcy, zarówno 
w przypadku gryzoni, jak i gatunków innych ni ż gryzonie, je śli 
w poprzednim 90-dniowym badaniu przeprowadzonym przy porównywal ­
nych poziomach dawek nie odnotowano zmian parametrów biochemii 
klinicznej. Zalecane jest wstrzymanie podawania zwierz ętom pokarmu (z 
wyjątkiem myszy) przez noc poprzedzaj ącą pobranie krwi (  1 ). Należy 
zbadać parametry z nast ępującej listy (38): glukoza, mocznik (azot moczni ­
kowy), kreatynina, bia łko całkowite, albumina, wap ń, sód, potas, cholesterol 
całkowity, co najmniej dwa odpowiednie badania w celu oceny komórek 
wątroby (aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, 
dehydrogenaza glutaminianowa, ca łkowite kwasy żółciowe) (39), oraz co 
najmniej dwa odpowiednie badania w celu oceny w ątroby i dróg żółciowych 
(fosfataza alkaliczna, gamma-glutamylotranspeptydaza, 5’-nukleotydaza, 
bilirubina ca łkowita, ca łkowite kwasy żółciowe) (39). Inne parametry 
biochemii klinicznej, takie jak st ężenie triglicerydów mierzone na czczo, 
poszczególne hormony oraz pseudocholinesteraza, mo żna zbada ć 
w stosownych przypadkach, w zale żności od toksyczno ści substancji bada ­
nej. Zasadniczo nale ży przyjąć elastyczne podej ście, dostosowane do obser ­
wowanych lub spodziewanych skutków dzia łania danej substancji badanej.  
45. Oznaczenia analizy moczu nale ży przeprowadzi ć u wszystkich zwierz ąt 
wykorzystanych w badaniu (10 samców i 10 samic z ka żdej grupy), na 
próbkach pobranych w takich samych odst ępach czasu jak w przypadku 
hematologii i biochemii klinicznej. Nie ma konieczno ści przeprowadzania 
pomiarów po up ływie 3 miesi ęcy, jeśli w poprzednim 90-dniowym badaniu 
przeprowadzonym przy porównywalnych poziomach dawek nie odnotowano 
zmian w analizie moczu. Zalecenie eksperta dotycz ące badań klinicznych 
pod kątem patologii obejmuje nast ępującą listę parametrów (38): wygl ąd, 
objętość, osmolalno ść lub masa w łaściwa, pH, ca łkowite bia łko i glukoza. 
Inne oznaczenia obejmuj ą ketony, urobilinogen, bilirubin ę i krew utajon ą. 
W stosownych przypadkach mo żna zastosowa ć badania dodatkowych para ­
metrów w celu rozszerzenia badania zaobserwowanych skutków.  
46. Ogólnie uznaje si ę, że podstawowe zmienne hematologiczne i biochemii 
klinicznej nale ży zbadać przed poddaniem zwierz ąt działaniu substancji 
badanej w przypadku bada ń z wykorzystaniem psów, jednak nie ma takiej 
potrzeby w przypadku bada ń z wykorzystaniem gryzoni (38). Je śli jednak 
historyczne dane podstawowe (zob. pkt 58) s ą nieodpowiednie, nale ży 
rozważyć wygenerowanie takich danych.  
PATOLOGIA  
Pełne rozpoznanie histopatologiczne  
47. Wszystkie zwierz ęta wykorzystane w badaniu nale ży zazwyczaj podda ć 
pełnemu, szczegó łowemu rozpoznaniu histopatologicznemu, które obejmuje 
staranne zbadanie zewn ętrznej powierzchni cia ła, wszystkich otworów, jamy 
czaszki, jamy klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawarto ści. Można 
jednak za łożyć (w grupach przewidzianych do u śmiercenia w trakcie trwania 
doświadczenia i w grupach satelitarnych) ograniczenie pomiarów do 
poszczególnych kluczowych dzia łań, takich jak badanie neurotoksyczno ści 
lub immunotoksyczno ści (zob. pkt 21). Takie zwierz ęta nie musz ą zostać 
poddane rozpoznaniu histopatologicznemu ani dalszym procedurom 
opisanym w poni ższych ust ępach. Zwierz ęta wskaźnikowe mog ą wymaga ć 
rozpoznania histopatologicznego w zale żności od poszczególnych przypad ­
ków, wed ług uznania kierownika badania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) W odniesieniu do niektórych pomiarów dotycz ących surowicy i osocza, w szczególno ści 
dla glukozy, zaleca si ę wstrzymanie podawania pokarmu przez noc. Zalecenie to wynika 
głównie z faktu, że zwiększona zmienno ść, którą nieuchronnie powoduje brak wstrzy ­
mania podawania pokarmu, cz ęsto maskuje bardziej subtelne skutki, co utrudnia inter ­
pretację wyników. Nale ży jednak zauwa żyć, że wstrzymanie podawania pokarmu przez 
noc może wpływać na ogólny metabolizm zwierz ąt, a w szczególno ści w badaniach 
żywieniowych mo że zakłócać dzienne nara żenie na dzia łanie substancji badanej. 
Wszystkie zwierz ęta powinny zosta ć poddane ocenie, b ędąc w tym samym stanie fizjo ­
logicznym, i dlatego szczegó łowe oceny lub oceny neurologiczne najlepiej zaplanowa ć 
na inny dzie ń niż dzień pobierania próbek na potrzeby zbadania parametrów biochemii 
klinicznej.
 48. Nale ży odnotowa ć masy organów wszystkich zwierz ąt, prócz tych wy łączo­
nych na mocy drugiej cz ęści pkt 47. Nadnercza, mózg, naj ądrza, serce, 
nerki, wątrobę, jajniki, śledzionę, jądra, tarczyc ę (zważoną po utrwaleniu, 
z przytarczycami) oraz macic ę pobrane od wszystkich zwierz ąt (oprócz tych 
w stanie agonalnym lub u śmierconych w czasie trwania badania) nale ży 
w stosownych przypadkach okroi ć z wszelkich przylegaj ących tkanek 
i zmierzy ć ich wagę mokrą możliwie jak najszybciej po sekcji w celu zapo ­
biegnięcia ich wyschni ęciu. 
49. Nast ępujące tkanki nale ży zachowa ć w roztworze utrwalaj ącym najbardziej 
odpowiednim zarówno dla rodzaju tkanki, jak i planowanego pó źniejszego 
badania histopatologicznego (40) (tkanki podane w nawiasach kwadrato ­
wych są opcjonalne): 
wszystkie wyra źne zmiany serce trzustka żołądek (przed żołądek, 
żołądek gruczo łowy) 
nadnercze jelito kr ęte przytarczyca [z ęby] 
aorta jelito czcze nerw obwodowy j ądro 
mózg (w tym cz ęści kreso­
mózgowia, mó żdżka 
i rdzenia/mostu) nerka przysadka grasica 
jelito ślepe gruczo ł łzowy prostata tarczyca 
szyjka macicy w ątroba odbytnica [j ęzyk] 
gruczoł koaguluj ący p łuco gruczo ł ślinowy tchawica 
okrężnica w ęzły chłonne (powierz ­
chowne i g łębokie) pęcherzyk nasienny p ęcherz moczowy 
dwunastnica gruczo ł mlekowy (obo ­
wiązkowo w przypadku 
samic oraz, je śli 
wyraźnie nadaje si ę do 
analizy, równie ż 
w przypadku samców) mięsień szkieletowy macica (w tym szyjka 
macicy) 
najądrze [górne drogi oddechowe, 
w tym nos, ma łżowiny 
nosowe oraz zatoki przy ­
nosowe] skóra [moczowód] 
oko (w tym siatkówka) prze łyk rdze ń kręgowy (na 
trzech odcinkach: szyj ­
nym, śródpiersiowym 
i lędźwiowym) [cewka moczowa] 
[kość udowa ze stawem] [opuszka w ęchowa] śledziona pochwa 
pęcherzyk żółciowy (w 
przypadku gatunków innych 
niż szczur) jajnik [mostek] odcinek szpiku kostnego lub 
świeżego aspiratu szpiku 
kostnego 
gruczoł przyoczny  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 496
 
W przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży utrwalić 
obydwa organy. Wyniki bada ń klinicznych i innych bada ń mogą wskazać na 
konieczno ść zbadania dodatkowych tkanek. Organy uznane za prawdopo ­
dobne organy docelowe, w oparciu o znane w łaściwości substancji badanej, 
także należy zachowa ć. W przypadku bada ń z zastosowaniem dermalnej 
drogi podania nale ży zbadać organy zgodnie z list ą określoną dla podania 
drogą pokarmow ą, przy czym kluczowe jest pobranie i zachowanie próbek 
skóry z miejsca aplikacji. W przypadku bada ń z zastosowaniem inhalacyjnej 
drogi podania, uk ładając listę tkanek z dróg oddechowych do zachowania 
i zbadania, nale ży kierowa ć się zaleceniami zawartymi w rozdziale B.8 
niniejszego za łącznika (9) i B.29 niniejszego za łącznika (10). 
W przypadku innych organów/tkanek (oraz w uzupe łnieniu okre ślonych 
utrwalonych tkanek z dróg oddechowych) nale ży zbadać organy zgodnie 
z listą określoną dla pokarmowej drogi podania.  
Histopatologia  
50. Dost ępne są wytyczne dotycz ące najlepszych praktyk zwi ązanych 
z przeprowadzaniem toksykologicznych bada ń zmian patologicznych (40). 
Należy zbadać pod kątem histopatologii co najmniej nast ępujące tkanki:  
— wszystkie tkanki zwierz ąt z grup otrzymuj ących wysokie dawki i z grup 
kontrolnych,  
— wszystkie tkanki zwierz ąt w stanie agonalnym lub u śmierconych 
podczas badania,  
— wszystkie tkanki wykazuj ące makroskopowe nieprawid łowości, 
— tkanki docelowe lub tkanki, które wykazuj ą zmiany spowodowane 
poddaniem zwierz ęcia działaniu substancji badanej w grupie otrzy ­
mującej wysokie dawki, pobrane od wszystkich zwierz ąt we wszystkich 
innych grupach otrzymuj ących dawki,  
— w przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży 
zbadać obydwa organy.  
OBSERWACJE (ETAP BADANIA RAKOTWÓRCZO ŚCI) 
51. Wszystkie zwierz ęta należy sprawdzi ć pod k ątem chorobowo ści 
i upadkowo ści, zazwyczaj na pocz ątku i pod koniec ka żdego dnia, w łącznie 
z weekendami i dniami wolnymi od pracy. Dodatkowo zwierz ęta należy 
sprawdza ć raz dziennie pod k ątem szczególnych objawów istotnych 
z toksykologicznego punktu widzenia. W przypadku bada ń 
z wykorzystaniem sondy zwierz ęta należy sprawdza ć w okresie 
bezpośrednio po dawkowaniu. Szczególn ą uwagę należy zwrócić na rozwój 
guzów; nale ży odnotowa ć czas pojawienia si ę guza, jego po łożenie, 
wymiary, wygl ąd oraz progresj ę każdego wyra źnie widocznego lub wyczu ­
walnego guza.  
52. Wszystkie zwierz ęta należy zważyć na pocz ątku rozpocz ęcia poddawania 
ich działaniu substancji badanej, a tak że co najmniej raz w tygodniu 
przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz w miesiącu. Pomiarów spo życia pokarmu i wydajno ści pokarmu nale ży 
dokonywa ć co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po 
tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu. Spożycie wody nale ży mierzyć 
co najmniej raz w tygodniu przez pierwsze 13 tygodni, a po tym okresie – co najmniej raz w miesi ącu, jeśli substancj ę badaną podaje si ę wraz z wod ą 
pitną. Pomiary spo życia wody nale ży rozważyć także w przypadku bada ń, 
w których zasz ły zmiany zwi ązane ze spo życiem wody.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Hematologia, biochemia kliniczna i inne pomiary  
53. W celu zmaksymalizowania informacji uzyskanych dzi ęki badaniu, 
zwłaszcza na temat kwestii zwi ązanych ze sposobem dzia łania, próbki 
krwi można podda ć analizie parametrów hematologii i biochemii klinicznej, 
według uznania kierownika badania. W łaściwe może być także przeprowa ­
dzenie analizy moczu. Informacji na temat tych parametrów dostarcz ą dane 
dotyczące zwierz ąt wykorzystanych na etapie badania toksyczno ści przewle ­
kłej, zazwyczaj dotycz ące okresu 12 miesi ęcy (pkt 34). Dalsze wytyczne 
dotyczące wartości pobrania takich próbek w ramach badania rakotwór ­
czości przedstawiono w wytycznych nr 116 (7). Je śli pobiera si ę próbki 
krwi, nale ży pobiera ć je pod koniec okresu badania, tu ż przed procedur ą 
uśmiercania zwierz ąt lub w jej trakcie. Próbki krwi nale ży pobrać 
z określonego miejsca, na przyk ład poprzez nak łucie serca lub z zatoki 
oczodołowej tylnej, w znieczuleniu. Do zbadania mo żna przygotowa ć 
również rozmazy krwi, zw łaszcza je śli organem docelowym wydaje si ę 
szpik kostny, cho ć wartość takiego badania rozmazów krwi na etapie 
badania rakotwórczo ści w celu oceny rakotwórczo ści/potencja łu onkogenicz ­
nego zosta ła zakwestionowana (38).  
PATOLOGIA  
Pełne rozpoznanie histopatologiczne  
54. Wszystkie zwierz ęta wykorzystane w badaniu, prócz zwierz ąt wskaźniko­
wych oraz innych zwierz ąt satelitarnych (zob. pkt 20), nale ży poddać 
pełnemu, szczegó łowemu rozpoznaniu histopatologicznemu, które obejmuje 
staranne zbadanie zewn ętrznej powierzchni cia ła, wszystkich otworów, jamy 
czaszki, jamy klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawarto ści. Zwie­
rzęta wskaźnikowe i inne zwierz ęta satelitarne mog ą wymaga ć rozpoznania 
histopatologicznego w zale żności od poszczególnych przypadków, wed ług 
uznania kierownika badania. Masa organów nie jest zazwyczaj cz ęścią 
badania rakotwórczo ści, jako że w organach zachodz ą zmiany zwi ązane 
z wiekiem, a rozwój guzów na pó źniejszych etapach uniemo żliwia wyko ­
rzystanie takich danych. Takie dane mog ą mieć jednak kluczowe znaczenie 
dla oszacowania wagi dowodów, w szczególno ści w kontek ście kwestii 
związanych ze sposobem dzia łania. Jeśli stanowi ą one część badania sateli ­
tarnego, takie dane nale ży zgromadzi ć nie później niż rok po rozpocz ęciu 
badania.  
55. Nast ępujące tkanki nale ży zachowa ć w roztworze utrwalaj ącym najbardziej 
odpowiednim zarówno dla rodzaju tkanki, jak i planowanego pó źniejszego 
badania histopatologicznego (40) (tkanki podane w nawiasach kwadrato ­
wych są opcjonalne): 
wszystkie wyra źne zmiany serce trzustka żołądek (przed żołądek, 
żołądek gruczo łowy) 
nadnercze jelito kr ęte przytarczyca [z ęby] 
aorta jelito czcze nerw obwodowy j ądro 
mózg (w tym cz ęści kreso­
mózgowia, mó żdżka 
i rdzenia/mostu) nerka przysadka grasica 
jelito ślepe gruczo ł łzowy prostata tarczyca 
szyjka macicy w ątroba odbytnica [j ęzyk] 
gruczoł koaguluj ący p łuco gruczo ł ślinowy tchawica 
okrężnica w ęzły chłonne (powierz ­
chowne i g łębokie) pęcherzyk nasienny p ęcherz moczowy  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
dwunastnica gruczo ł mlekowy (obo ­
wiązkowo w przypadku 
samic oraz, je śli 
wyraźnie nadaje si ę do 
analizy, równie ż 
w przypadku samców) mięsień szkieletowy macica (w tym szyjka 
macicy) 
najądrze [górne drogi oddechowe, 
w tym nos, ma łżowiny 
nosowe oraz zatoki przy ­
nosowe] skóra [moczowód] 
oko (w tym siatkówka) prze łyk rdze ń kręgowy (na 
trzech odcinkach: szyj ­
nym, śródpiersiowym 
i lędźwiowym) [cewka moczowa] 
[kość udowa ze stawem] [opuszka w ęchowa] śledziona pochwa 
pęcherzyk żółciowy (w 
przypadku gatunków innych niż szczur) jajnik [mostek] odcinek szpiku kostnego lub 
świeżego aspiratu szpiku 
kostnego 
gruczoł przyoczny
 
W przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży utrwalić 
obydwa organy. Wyniki bada ń klinicznych i inne ustalenia mog ą wskazać 
na konieczno ść zbadania dodatkowych tkanek. Organy uznane za prawdo ­
podobne organy docelowe, w oparciu o znane w łaściwości substancji bada ­
nej, także należy zachowa ć. W przypadku bada ń z zastosowaniem dermalnej 
drogi podania nale ży zbadać organy zgodnie z list ą określoną dla podania 
drogą pokarmow ą, przy czym konieczne jest pobranie i zachowanie próbek 
skóry z miejsca aplikacji. W przypadku bada ń z zastosowaniem inhalacyjnej 
drogi podania, uk ładając listę tkanek z dróg oddechowych do zachowania 
i zbadania, nale ży kierowa ć się zaleceniami zawartymi w rozdziale B.8 
niniejszego za łącznika (8) i B.29 niniejszego za łącznika (9). W przypadku 
innych organów/tkanek (oraz w uzupe łnieniu okre ślonych utrwalonych 
tkanek z dróg oddechowych) nale ży zbadać organy zgodnie z list ą określoną 
dla pokarmowej drogi podania.  
Histopatologia  
56. Dost ępne są wytyczne dotycz ące najlepszych praktyk zwi ązanych 
z przeprowadzaniem toksykologicznych bada ń zmian patologicznych (40). 
Należy zbadać co najmniej nast ępujące tkanki:  
— wszystkie tkanki zwierz ąt z grup otrzymuj ących wysokie dawki i z grup 
kontrolnych,  
— wszystkie tkanki zwierz ąt w stanie agonalnym lub u śmierconych 
podczas badania,  
— wszystkie tkanki wykazuj ące makroskopowe nieprawid łowości, w tym 
guzy,  
— w przypadku zaobserwowania w grupie otrzymuj ącej wysok ą dawkę 
histopatologicznych zmian zwi ązanych z poddawaniem zwierz ąt dzia­ 
łaniu substancji badanej, nale ży zbadać takie same tkanki pochodz ące 
od wszystkich zwierz ąt ze wszystkich pozosta łych grup otrzymuj ących 
dawki,  
— w przypadku organów parzystych, np. nerek lub nadnerczy, nale ży 
zbadać obydwa organy.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DANE ORAZ SPORZ ĄDZENIE SPRAWOZDANIA (RAKOTWÓR ­
CZOŚĆ I TOKSYCZNO ŚĆ PRZEWLEK ŁA) 
Dane  
57. Nale ży przedstawi ć dane dotycz ące każdego zwierz ęcia, w odniesieniu do 
wszystkich parametrów poddawanych oszacowaniu. Dodatkowo wszystkie dane nale ży zestawi ć w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do 
każdej badanej grupy liczb ę zwierząt na pocz ątku badania, liczb ę zwierząt, 
które pad ły w trakcie trwania badania lub które u śmiercono z przyczyn 
humanitarnych, wraz z okre śleniem czasu, w którym nast ąpiła śmierć lub 
humanitarne u śmiercenie, liczb ę zwierząt wykazuj ących objawy toksycz ­
ności, opis obserwowanych objawów toksyczno ści, w tym czas ich poja ­
wienia si ę, czas trwania, stopie ń ostrości wszelkich skutków toksycznych, 
liczbę zwierząt wykazuj ących zmiany, typ takich zmian oraz procent 
zwierząt wykazuj ących każdy typ zmiany. W tabelach z zestawieniem 
danych, oprócz klasyfikacji zmian, nale ży przedstawi ć średnie 
i odchylenia standardowe (dla danych z bada ń ciągłych) dotycz ące zwierz
ąt 
wykazujących skutki toksyczne lub zmiany.  
58. Historyczne dane kontrolne mog ą być cenne przy interpretacji wyników 
badania, np. je śli istnieją przesłanki, że dane uzyskane z jednoczesnych 
kontroli s ą w sposób znacz ący niestandardowe w porównaniu 
z najnowszymi danymi dotycz ącymi zwierz ąt kontrolnych z tego samego 
obiektu/badanej kolonii. Historyczne dane kontrolne, je śli poddaje si ę je 
oszacowaniu, powinny przedstawi ć to samo laboratorium i powinny si ę 
odnosić do zwierz ąt w tym samym wieku i z tego samego szczepu, oraz 
dane takie powinny zosta ć wygenerowane w ci ągu pięciu lat przed 
rozpoczęciem rozwa żanego badania.  
59. W stosownych przypadkach wyniki liczbowe nale ży poddawa ć oszacowaniu 
za pomoc ą właściwych i ogólnie przyj ętych metod statystycznych. Metody 
statystyczne i dane poddawane analizie nale ży wybrać w czasie przygoto ­
wywania uk ładu badania (pkt 9). Taki wybór powinien uwzgl ędniać w razie 
konieczno ści korektę uwzględniającą zwierzęta, które prze żyły. 
60. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść i własności fizykochemiczne,  
— dane identyfikacyjne,  
— źródło substancji chemicznej,  
— numer partii,  
— świadectwo analizy chemicznej.  
Nośnik (w stosownych przypadkach)  
— uzasadnienie wyboru no śnika (jeżeli jest inny ni ż woda).  
Badane zwierz ęta 
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie takiego wyboru,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt na pocz ątku badaniu,  
— źródło, warunki przebywania, pokarm itp.,  
— masa cia ła poszczególnych zwierz ąt na pocz ątku badania.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Warunki badania  
— uzasadnienie drogi podania i doboru dawek,  
— w stosownych przypadkach metody statystyczne zastosowane do analizy 
danych,  
— szczegó łowe informacje na temat postaci u żytkowej substancji badanej/ 
przygotowywania pokarmu,  
— dane analityczne dotycz ące osiąganego st ężenia, stabilno ści 
i jednorodno ści preparatu,  
— droga podania i szczegó łowe dane dotycz ące podawania substancji bada ­
nej, 
— w przypadku bada ń z inhalacyjn ą drogą podania informacje o tym, czy 
podanie odbywa si ę wyłącznie przez nos czy przez ca łe ciało, 
— dawki rzeczywiste (mg/kg masy cia ła/dzień), wskaźnik konwersji 
stężenia substancji badanej w pokarmie/wodzie pitnej (mg/kg lub ppm) 
do dawki rzeczywistej, je śli ma to zastosowanie,  
— szczegó łowe informacje o pokarmie i jako ści wody.  
Wyniki (nale ży przedstawi ć zestawienie danych w tabeli oraz dane dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt): 
Wymogi ogólne  
— dane dotycz ące zwierz ąt, które prze żyły, 
— masa cia ła/zmiany masy cia ła, 
— dane dotycz ące spożycia pokarmu, wyliczenia wydajno ści pokarmu, je śli 
przeprowadzono, oraz dane dotycz ące spożycia wody, je śli dostępne, 
— dane toksykokinetyczne, je śli dostępne, 
— oftalmoskopia (je śli takie dane s ą dostępne),  
— hematologia (je śli takie dane s ą dostępne),  
— biochemia kliniczna (je śli takie dane s ą dostępne).  
Ustalenia bada ń klinicznych  
— objawy toksyczno ści, 
— występowanie (i ostro ść, jeśli poddano j ą ocenie) wszelkich nieprawid ­ 
łowości, 
— rodzaj, ostro ść i czas trwania obserwowanych objawów klinicznych (tak 
odwracalnych, jak i nieodwracalnych).  
Dane dotycz ące sekcji zw łok 
— masa cia ła w chwili zgonu,  
— masa organów i ich wspó łczynniki, je śli takie dane s ą dostępne, 
— ustalenia z sekcji zw łok; występowanie i stopie ń ostrości nieprawid ło­
wości. 
Histopatologia  
— ustalenia histopatologiczne inne ni ż dotyczące nowotworów,  
— ustalenia histopatologiczne dotycz ące nowotworów,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— korelacja mi ędzy objawami makroskopowymi i mikroskopowymi,  
— szczegó łowy opis wszystkich ustale ń histopatologicznych zwi ązanych 
z poddawaniem zwierz ąt działaniu substancji badanej, w tym klasyfi ­
kacja ostro ści skutków,  
— sprawozdanie z ewentualnej wzajemnej oceny preparatów.  
W stosownych przypadkach, statystyczne opracowanie wyników  
Omówienie wyników, w tym:  
— omówienie wszelkich podej ść modelowych,  
— zależność dawka-odpowied ź, 
— historyczne dane kontrolne,  
— rozwa żenie wszelkich informacji na temat sposobu dzia łania,  
— określenie BMD, NOAEL lub LOAEL,  
— znaczenie dla ludzi.  
Wnioski  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rzym, 1995), wewn ętrzny doku ­
ment roboczy, Dyrekcja ds. Środowiska, OECD, Pary ż. 
(2) EPA (2005). Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Risk Assessment 
Forum U.S. Environmental Protection Agency Waszyngton, D.C.  
(3) Combes RD, Gaunt I, Balls M (2004). A Scientific and Animal Welfare 
Assessment of the OECD Health Effects Test Guidelines for the Safety 
Testing of Chemicals under the European Union REACH System. ATLA 32: 163–208.
 
(4) Barlow SM, Greig JB, Bridges JW i in. (2002). Hazard identification by 
methods of animal-based toxicology. Food. Chem. Toxicol. 40: 145–191.  
(5) Chhabra RS, Bucher JR, Wolfe M, Portier C (2003). Toxicity characteri ­
zation of environmental chemicals by the US National Toxicology 
Programme: an overview. Int. J. Hyg. Environ. Health 206: 437–445.  
(6) Rozdzia ł B.27 niniejszego za łącznika. Badanie toksyczno ści podprzewlek łej 
drogą pokarmow ą – badanie toksyczno ści drogą pokarmow ą na gatunkach 
innych ni ż gryzonie metod ą powtarzanej 90-dniowej dawki.  
(7) OECD (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
and 453 – wyd. drugie. Series on Testing and Assessment nr 116, dost ępne 
na publicznej stronie OECD po święconej wytycznym dotycz ącym bada ń: 
www.oecd.org/env/testguidelines.  
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, 
Paryż. 
(9) Rozdzia ł B.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść powtarzanej (28 dni) 
dawki (inhalacyjna).  
(10) Rozdzia ł B.29 niniejszego za łącznika. Badanie podprzewlek łej toksyczno ści 
inhalacyjnej – 90-dniowe badania inhalacyjne z wykorzystaniem gatunków 
gryzoni.  
(11) Rozdzia ł B.9 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść powtarzanej (28 dni) 
dawki (dermalna).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
(12) Boobis AR, Cohen SM, Dellarco V, McGregor D, Meek ME, Vickers C, 
Willcocks D, Farland W (2006). IPCS Framework for analyzing the Rele ­
vance of a Cancer Mode of Action for Humans. Crit. Rev. Toxicol, 36: 793–801.
 
(13) Cohen SM, Meek ME, Klaunig JE, Patton DE, Fenner-Crisp PA (2003). 
The human relevance of information on carcinogenic Modes of Action: An 
Overview. Crit. Rev. Toxicol. 33: 581–589.  
(14) Holsapple MP, Pitot HC, Cohen SN, Boobis AR, Klaunig JE, Pastoor T, 
Dellarco VL, Dragan YP (2006). Mode of Action in Relevance of Rodent Liver Tumors to Human Cancer Risk. Toxicol. Sci. 89: 51–56.
 
(15) Meek EM, Bucher JR, Cohen SM, Dellarco V, Hill RN, 
Lehman-McKemmon LD, Longfellow DG, Pastoor T, Seed J, Patton DE (2003). A Framework for Human Relevance analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit. Rev. Toxicol. 33: 591–653.
 
(16) Carmichael NG, Barton HA, Boobis AR i in. (2006). Agricultural Chemical 
Safety Assessment: A Multisector Approach to the Modernization of Human Safety Requirements. Critical Reviews in Toxicology 36: 1–7.
 
(17) Barton HA, Pastoor TP, Baetcke T i in. (2006). The Acquisition and 
Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and 
Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments. 
Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.  
(18) Doe JE, Boobis AR, Blacker A i in. (2006). A Tiered Approach to Systemic 
Toxicity Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical 
Reviews in Toxicology 36: 37–68.  
(19) Cooper RL, Lamb JS, Barlow SM i in. (2006). A Tiered Approach to Life 
Stages Testing for Agricultural Chemical Safety Assessment. Critical Reviews in Toxicology 36: 69–98.
 
(20) OECD (2002). Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Series on Testing and Assessment nr 35 oraz Series on Pesticides nr 14, ENV/JM/MONO(2002)19, OECD, Paryż.
 
(21) OECD (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation, Series on Testing and Assessment nr 19, ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OECD, Pary ż. 
(22) Rhomberg LR, Baetcke K, Blancato J, Bus J, Cohen S, Conolly R, Dixit R, 
Doe J, Ekelman K, Fenner-Crisp P, Harvey P, Hattis D, Jacobs A, 
Jacobson-Kram D, Lewandowski T, Liteplo R, Pelkonen O, Rice J, Somers D, Turturro A, West W, Olin S (2007). Issues in the Design and Inter ­
pretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
Approaches to Dose Selection Crit Rev. Toxicol. 37 (9): 729–837.
 
(23) ILSI (Mi ędzynarodowy Instytut Nauk Biologicznych) (1997). Principles for 
the Selection of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran JA (red.). ILSI Press, Waszyngton, D.C.
 
(24) Griffiths SA, Parkinson C, McAuslane JAN i Lumley CE (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
maceuticals. The Toxicologist 14(1): 214.  
(25) Usui T, Griffiths SA i Lumley CE (1996). The utility of the mouse for the 
assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals. W: D’Arcy 
POF & Harron DWG (red.). Proceedings of the Third International Confe ­
rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast, s. 279–284.  
(26) Carmichael NG, Enzmann H, Pate I, Waechter F (1997). The Significance 
of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the 
Agrochemical Industry. Environ Health Perspect. 105: 1196–1203.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 503
 
(27) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 
22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do 
celów naukowych (Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33).  
(28) National Research Council, 1985. Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication nr 86-23. Waszyngton D.C., Departament Zdrowia i Opieki Spo łecznej Stanów Zjednoczonych.
 
(29) GV-SOLAS (Towarzystwo Nauk o Zwierz ętach Laboratoryjnych, Gesells ­
chaft für Versuchstierkunde, grudzie ń 1989). Publication on the Planning 
and Structure of Animal Facilities for Institutes Performing Animal Expe ­
riments. ISBN 3-906255-06-9.  
(30) GV-SOLAS (Towarzystwo Nauk o Zwierz ętach Laboratoryjnych, Gesells ­
chaft für Versuchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of labora ­
tory animals in various housing systems.  
(31) Diehl K-H, Hull R, Morton D, Pfister R, Rabemampianina Y, Smith D, 
Vidal J-M, van de Vorstenbosch C. (2001). A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and 
volumes. Journal of Applied Toxicology 21: 15–23.
 
(32) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document nr 60.
 
(33) Tupper DE, Wallace RB (1980). Utility of the Neurologic Examination in 
Rats. Acta Neurobiol. Exp. 40: 999–1003.  
(34) Gad SC (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. 
J. Toxicol.Environ. Health 9: 691–704.  
(35) Moser VC, McDaniel KM, Phillips PM (1991). Rat Strain and Stock 
Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values 
and Effects of Amitraz. Toxicol. Appl. Pharmacol. 108: 267–283.  
(36) Meyer OA, Tilson HA, Byrd WC, Riley MT (1979). A Method for the 
RoutineAssessment of Fore- and Hind-limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol. 1: 233–236.
 
(37) Crofton KM, Howard JL, Moser VC, Gill MW, Reiter LW, Tilson HA, 
MacPhail RC (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Expe ­
riments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol. 13: 599–609.
 
(38) Weingand K, Brown G, Hall R i in. (1996). Harmonisation of Animal 
Clinical Pathology Testing in Toxicity and Safety Studies. Fundam. & 
Appl. Toxicol. 29: 198–201.  
(39) EMEA, projekt dokumentu pt. „Non-clinical guideline on drug-induced 
hepatotoxicity” (nr ref. EMEA/CHMP/SWP/a50115/2006).  
(40) Crissman JW, Goodman DG, Hildebrandt PK i in. (2004). Best Practices 
Guideline: Toxicological Histopathology. Toxicologic Pathology 32: 
126–131.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 504
 
Dodatek 1  
DEFINICJA  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  BADANIE TOKSYCZNO ŚCI REPRODUKCJI JEDNEGO 
POKOLENIA  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Substancja testowa podawana jest w stopniowanych dawkach kilku 
grupom samców i samic. Samcom nale ży podawa ć dawkę w okresie 
wzrostu i przez co najmniej jeden pe łny cykl spermatogenezy (oko ło 
56 dni u myszy i 70 dni u szczura), w celu wywo łania przez 
substancję testową wszelkich negatywnych skutków na spermatoge ­
nezie.  
Samice z pokolenia rodziców P powinny by ć poddane dawkowaniu 
przez co najmniej dwa pe łne cykle rujowe w celu wywo łania przez 
substancję testową wszelkich negatywnych skutków na cykl rajowy. 
Następnie zwierz ęta zostają pokryte. Substancja testowa jest poda ­
wana obu p łciom w okresie krycia a nast ępnie jedynie samicom 
w okresie ci ąży oraz przez okres ssania. W celu podania substancji 
przez drogi oddechowe, metoda b ędzie wymaga ć modyfikacji.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Brak.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.6.1. Przygotowania  
Przed rozpocz ęciem badania m łode zdrowe zwierz ęta są losowo 
przydzielane do grup badanych i kontrolnych. Zwierz ęta podlegaj ą 
warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów bada ­
nia, przez co najmniej 5 dni przed rozpocz ęciem badania. Zalecane 
jest podawanie substancji testowej w po żywieniu lub w wodzie 
pitnej. Akceptowane s ą również inne drogi podawania substancji 
testowej. Ta sama metoda podawania substancji testowej powinna być stosowana do wszystkich zwierz ąt w trakcie odpowiedniego 
okresu badania. W przypadku u życia jakiegokolwiek no śnika lub 
innych dodatków w celu usprawnienia dawkowania nale ży upewni ć 
się, iż nie powoduj ą żadnych skutków toksyczno ści.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
D a w k o w a n i e n a l e ż y p r z e p r o w a d z a ć s i e d e m d n i 
w t y g o d n i u .  
1.6.2. Zwierz ęta badane  
Wybór gatunków Po żądanymi gatunkami s ą szczur i mysz. Nale ży 
wykorzysta ć zdrowe zwierz ęta, które nie by ły wcześniej poddawane 
procedurom badawczym. Nie nale ży stosowa ć szczepów o niskiej 
płodności. Badane zwierz ęta należy scharakteryzowa ć ze wzgl ędu 
na gatunek, szczep, p łeć, wagę i/lub wiek.  
W celu odpowiedniego oszacowania p łodności, należy podda ć 
badaniu zarówno samice, jak i samce. Wszystkie zwierz ęta badane 
i kontrolne nale ży odstawi ć od ssania przed rozpocz ęciem dawko ­
wania.  
Liczba i p łeć 
Każda grupa do świadczalna i kontrolna powinna sk ładać się z takiej 
liczby zwierz ąt, aby znalaz ło się w nich oko ło 20 samic pod koniec 
ciąży. 
Celem jest wyprodukowanie odpowiedniej liczby ci ąż i potomstwa 
w celu zapewnienia znacz ącej oceny wp ływu substancji na p łodność, 
ciążę i zachowanie macierzy ńskie w pokoleniu zwierz ąt rodziców P i 
zwierząt ssących, wzrost i rozwój potomstwa F  1 w okresie od chwili 
poczęcia do zako ńczenia ssania.  
1 . 6 . 3 . W a r u n k i b a d a n i a  
Pożywienie i woda powinny by ć dostępne bez ogranicze ń. Tuż przed 
porodem ci ężarne samice powinny by ć umieszczone w klatkach 
porodowych lub matczynych zaopatrzonych w materia ł do zrobienia 
gniazda.  
1 . 6 . 3 . 1 . P o z i o m y d a w k o w a n i a  
Należy wykorzysta ć co najmniej trzy grupy badane i grup ę kontro­
lną. W przypadku u życia nośnika w podawaniu substancji testowej, 
grupie kontrolnej nale ży podać nośnik o najwy ższej wielko ści dawki. 
W przypadku gdy substancja testowa zmniejsza pobieranie lub wykorzystanie po żywienia, mo że być niezbędne dołączenie odpo ­
wiednio żywionej grupy kontrolnej. Je żeli dawka nie jest ograni ­
czona fizyczno-chemicznymi lub biologicznymi w łaściwościami 
substancji, najwy ższa wielko ść dawki powinna wywo ływać toksycz­
ność, ale nie śmiertelno ść w grupie zwierz ąt rodziców P. Średnia 
dawka powinna wywo ływać minimalne skutki toksyczno ści przypi­
sane dzia łaniu substancji testowej, a najni ższa dawka nie powinna 
wywoływać żadnych niekorzystnych skutków u rodziców lub potom ­
stwa. W przypadku substancji podawanej za pomoc ą dozownika lub 
w kapsułce dawka podawana ka ż
demu zwierz ęciu powinna by ć 
oparta na indywidualnej wadze cia ła zwierzęcia i dostosowywana 
raz w tygodniu z uwzgl ędnieniem zmian wagi cia ła zwierzęcia. 
Poziom dawkowania dla samic w okresie ci ąży może być oparty 
na wadze cia ła w dniu 0 lub 6 dniu ci ąży, w razie potrzeby.  
1 . 6 . 3 . 2 . T e s t g r a n i c z n y  
W przypadku substancji o niskiej toksyczno ści, jeżeli poziom dawki 
wynoszący, co najmniej 1 000 mg/kilogram nie powoduje żadnego 
szkodliwego wp ływu na zdolno ść reprodukcyjn ą, badania przy zasto ­
sowaniu innych poziomów dawek mog ą być uznane za niekonieczne. 
Jeżeli badania wst ępne przy wysokim poziomie dawki, z wyra źnymi 
dowodami toksyczno ści matki, nie wykazuj ą żadnego szkodliwego 
wpływu na p łodność, badania przy zastosowaniu innych poziomów 
dawek mog ą być uznane za niekonieczne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
1.6.3.3. Przeprowadzenie badania  
H a r m o n o g r a m y b a d a ń 
Codzienne stosowanie dawki u rodzicielskich samców P powinno 
rozpocząć się po przekroczeniu od pi ęciu do dziewi ęciu tygodni 
życia po zaprzestaniu ssania i aklimatyzacji przez okres co najmniej 
pięciu dni. W przypadku szczurów dawkowanie odbywa si ę przez 
okres 10 tygodni przed okresem krycia (w przypadku myszy – osiem tygodni). Samce nale ży uśmiercić i zbadać na końcu okresu krycia 
albo, alternatywnie, mog ą być zachowane, podaj ąc im pożywienie 
wykorzystywane w badaniu w celu ewentualnej produkcji drugiego 
miotu, a nast ępnie powinny by ć uśmiercone i zbadane w okresie 
poprzedzaj ącym zako ńczenie bada ń. W przypadku rodzicielskich 
samic P dawkowanie powinno rozpocz ąć się po co najmniej pi ęcio­
dniowym okresie aklimatyzacji i kontynuowane przez okres co 
najmniej dwóch tygodni przed rozpocz ęciem krycia. Codzienne 
dawkowanie rodzicielskich samic P powinno by ć kontynuowane 
przez trzytygodniowy okres krycia, ci ąży aż do czasu zaprzestania 
ssania potomstwa F
 1 . Należy rozważyć zmodyfikowanie zasad 
dawkowania przy uwzgl ędnieniu dost ępnych informacji na temat 
substancji testowej, w szczególno ści pobudzania przez ni ą metabo­
lizmu lub bioakumulacji.  
P r o c e d u r a k r y c i a  
W badaniach toksyczno ści reprodukcji mo żna zastosowa ć procedur ę 
krycia zarówno 1:1 (jeden samiec i jedna samica), jak i 1:2 (jeden samiec i dwie samice).
 
W oparciu o procedur ę krycia 1:1 jedn ą samicę należy umieścić 
z tym samym samcem a ż do momentu pojawienia si ę ciąży lub 
przez okres trzech tygodni. Ka żdego dnia rano, samice nale ży 
poddać badaniu na obecno ść spermy lub czopów nasienia 
w pochwie. Dzie ń 0 danej ci ąży jest okre ślany w chwili wykrycia 
spermy lub czopu nasienia w pochwie.  
Należy ustalić przyczyn ę wyraźnego braku p łodności w odniesieniu 
do par, które nie zainicjuj ą krycia.  
Powyższe może obejmowa ć takie procedury, jak ponowne, dodat ­
kowe krycie z reproduktorami matek, mikroskopowe badanie 
organów rozrodczych oraz badania cyklu rujowego i cyklu sperma ­
togenezy.  
W i e l k o ś ć m i o t u  
Zwierzęta poddawane dawkowaniu w okresie bada ń płodności są 
dopuszczane do miotu i wychowuj ą swoje potomstwo do chwili 
zaprzestania ssania bez normalizacji miotów.  
W przypadku dokonania normalizacji zaleca si ę następującą proce­
durę. Między 1 a 4 dniem po porodzie rozmiar ka żdego miotu mo że 
zostać dostosowany przez wyeliminowanie dodatkowych m łodych 
w miocie, na tyle na ile to mo żliwe, cztery samice i cztery samce 
na miot.  
W każdym przypadku gdy liczba m łodych samców lub samic unie ­
możliwia zachowanie czterech osobników danej p łci w każdym 
miocie, akceptowane jest cz ęściowe dostosowanie (np. pi ęć samców 
i trzy samice). Nie nale ży przeprowadza ć dostosowania 
w odniesieniu do miotów o liczbie osobników mniejszej ni ż osiem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
1 . 6 . 4 . O b s e r w a c j e  
Przez cały okres bada ń każde zwierz ę powinno by ć obserwowane co 
najmniej raz dziennie. Nale ży odnotowa ć zmiany w zachowaniu 
mające związek z badaniami, objawy trudnego lub d ługotrwałego 
porodu oraz wszelkie objawy toksyczno ści, włączając śmiertelno ść. 
W okresie poprzedzaj ącym krycie oraz w okresach krycia, spo życie 
żywności może być kontrolowane codziennie. Po porodzie oraz 
podczas okresu laktacji pomiary spo życia żywności (i pomiary 
spożycia wody, w przypadku gdy substancja testowa podawana 
jest w wodzie pitnej) nale ży sporządzać w tym samym dniu co 
ważenie miotu. Rodzicielskie samce i samice P nale ży ważyć 
w pierwszym dniu rozpocz ęcia dawkowania i nast ępnie 
w odstępach tygodniowych. Niniejsze uwagi nale ży odnotowa ć indy­
widualnie dla ka żdego doros łego zwierz ęcia. 
Czas trwania ci ąży należy oblicza ć, począwszy od dnia 0. Ka żdy 
miot nale ży zbadać, jeżeli możliwe, natychmiast po porodzie celem 
ustalenia liczby oraz p łci młodych, liczby martwo urodzonych, żywo 
urodzonych oraz obecno ść rażących nieprawid łowości. 
Martwe m łode oraz m łode uśmiercone w 4 dniu nale ży zachowa ć 
celem wykonania bada ń odnośnie do ewentualnych wad. Nale ży 
przeliczyć żywe młode i zwa żyć mioty nazajutrz po porodzie oraz 
w 4 i 7 dniu, a nast ępnie w odst ępach tygodniowych a ż do czasu 
zakończenia bada ń, gdzie zwierz ęta należy zbadać indywidualnie.  
Należy odnotowa ć obserwowalne nieprawid łowości fizyczne lub 
dotyczące zachowania u matek lub potomstwa.  
1.6.5. Patologia  
1 . 6 . 5 . 1 . S e k c j a z w ł o k 
W chwili u śmiercenia lub zgonu zwierz ęcia podczas badania zwie ­
rzęta pokolenia rodziców P powinny zosta ć poddane badaniom 
mikroskopowym w celu wykrycia wszelkich strukturalnych niepra ­
widłowości lub zmian patologicznych, ze zwróceniem szczególnej 
uwagi na organy systemu rozrodczego. Nale ży zbadać martwe lub 
konające młode w celu wykrycia uszkodze ń. 
1 . 6 . 5 . 1 . H i s t o p a t o l o g i a  
Jajniki, macica, szyjka macicy, pochwa, j ądra, najądrza, kanaliki 
nasienne, gruczo ł krokowy, gruczo ł opuszkowo-cewkowy, przysadka 
mózgowa i organ (organy) docelowe wszystkich zwierz ąt P należy 
zachować celem poddania badaniu mikroskopowemu. W przypadku 
gdy niniejsze organy nie zosta ły przebadane w trakcie innych bada ń 
z wykorzystaniem wielu poziomy dawek, nale ży przeprowadzi ć ich 
badanie u wszystkich zwierz ąt grupy najwy ższego dawkowania 
i kontrolnej, które pad ły w trakcie bada ń, w takim stopniu 
w jakim jest to mo żliwe.  
Organy takich zwierz ąt, wykazuj ące objawy nieprawid łowości, 
powinny zosta ć zbadane u wszystkich zwierz ąt P. W tych przypad ­
kach badanie mikroskopowe nale ży przeprowadzi ć na wszystkich 
tkankach wykazuj ących zmiany patologiczne. Jak sugerowano 
zgodnie z procedurami krycia, organy rozrodcze zwierz ąt podejrza ­
nych o brak p łodności mogą być poddane badaniu mikroskopo ­
wemu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. DANE  
Dane powinny zosta ć podsumowane w formie tabeli, wskazuj ącej 
liczbę zwierząt każdej badanej grupy na pocz ątku bada ń, liczbę 
płodnych samców, liczb ę ciężarnych samic, rodzaje zmian 
i procent zwierz ąt wykazuj ących każdy rodzaj zmian.  
Jeżeli możliwe, wyniki numeryczne powinny zosta ć oszacowane 
właściwą metodą statystyczn ą. Można zastosowa ć każdą uznaną 
metodę statystyczn ą. 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń zawiera, je żeli możliwe, nast ępujące informa ­
cje: 
— wykorzystany gatunek/szczep,  
— dane dotycz ące reakcji na toksyczno ść ze wzgl ędu na p łeć 
i dawkę, włączając płodność, ciążę i zdolno ść utrzymania si ę 
przy życiu,  
— czas zgonu podczas bada ń lub informacja o tym, czy zwierz ęta 
przetrwały do czasu planowanego u śmiercenia lub zako ńczenia 
badań, 
— tabela przedstawiaj ąca wagę każdego miotu, średnią wagę 
młodych i wag ę poszczególnych m łodych przy zako ńczeniu 
badań, 
— wpływ toksyczno ści lub innych skutków na reprodukcj ę, potom­
stwo i rozwój poporodowy,  
— dzień obserwacji ka żdego nietypowego objawu i pó źniejszego 
postępowania,  
— dane dotycz ące wagi cia ła dla zwierz ąt P, 
— wyniki bada ń sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników bada ń mikroskopowych,  
— statystyczne uj ęcie wyników, tam gdzie jest to stosowane,  
— analiza wyników,  
— interpretacja wyników.  
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
4. ODNIESIENIA  
Zob. Wprowadzenie ogólne cz ęść B. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  DWUPOKOLENIOWE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI REPRO ­
DUKCYJNEJ  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 416 (2001).  
1.1. WST ĘP 
Metoda badania toksyczno ści reprodukcji dwóch pokole ń opraco­
wana zosta ła w celu uzyskania ogólnych informacji dotycz ących 
skutków oddzia ływania substancji testowej na integralno ść 
i działanie męskich i żeńskich uk ładów rozrodczych, wliczaj ąc 
w to funkcj ę gruczołów rozrodczych, cykl rujowy, zachowanie kopu ­
lacyjne, zap łodnienie, ci ążę, poród, laktacj ę i zaprzestanie ssania, jak 
również wzrost i rozwój potomstwa. Badanie mo że również dostar­
czyć informacji dotycz ących skutków substancji testowej wywiera ­
nych na zachorowalno ść noworodków, śmiertelno ści oraz wst ępnych 
danych dotycz ących przedporodowej i poporodowej toksyczno ści 
rozwojowej, oraz s łużyć jako wskazówka do nast ępnych bada ń. 
Poza badaniem wzrostu i rozwoju pokolenia F  1 omawiana metoda 
badania ma na celu ocen ę integralno ści i dzia łania męskich 
i żeńskich układów rozrodczych, jak równie ż wzrostu i rozwoju 
pokolenia F  2 . W celu uzyskania dodatkowych informacji dotycz ­ 
ących toksyczno ści rozwojowej i niedoborów funkcjonalnych 
można albo w łączyć do niniejszego protoko łu dodatkowe segmenty 
badań, uwzględniające właściwe metody badania toksyczno ści 
rozwojowej i/lub neurotoksyczno ści rozwojowej, lub te ż można 
badać te punkty ko ńcowe w oddzielnych badaniach 
z wykorzystaniem w łaściwych metod.  
1.2 ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Substancja testowa podawana jest w stopniowanych dawkach kilku 
grupom samców i samic. Samcom z pokolenia rodziców P nale ży 
podawać dawkę w okresie wzrostu i przez co najmniej jeden pe łny 
cykl spermatogenezy (oko ło 56 dni u myszy i 70 dni u szczura) 
w celu wywo łania przez substancj ę testową wszelkich negatywnych 
skutków wywieranych na spermatogenez ę. Skutek wywierany na 
spermę określa się poprzez szereg parametrów spermy (np. morfo ­
logię i ruchliwo ść spermy) oraz w czasie preparowania tkanek 
i szczegó łowych bada ń histopatologicznych. Je śli dostępne są dane 
dotyczące spermatogenezy z wcze śniejszego badania powtarzanego 
dawkowania o wystarczaj ącym czasie trwania, np. badania 90-dnio ­
wego, nie ma potrzeby obejmowa ć oceną samców pokolenia P. 
Zaleca się jednak zachowanie próbek lub cyfrowych zapisów spermy 
pokolenia P, aby umo żliwić późniejszą ocenę. Samice z pokolenia 
rodziców P powinny by ć poddane dawkowaniu w okresie ich 
rozwoju i przez kilka kompletnych cyklów rujowych, w celu 
wykrycia wszelkich negatywnych skutków wywieranych przez substancję testową na normalny przebieg cyklu rujowego. Substancja 
testowa jest podawana zwierz ętom rodzicielskim (P) w okresie 
krycia, w okresie powsta łych ciąży oraz przez okres ssania ich 
potomstwa F
 1 . Po zaprzestaniu ssania, nale ży kontynuowa ć poda­
wanie substancji testowej potomstwu F  1 w okresie jego rozwoju 
do osiągnięcia doros łości, momentu kojarzenia w pary i produkcji 
potomstwa F  2 , do chwili zaprzestania ssania potomstwa F  2 . 
Obserwacje kliniczne i badania patologiczne s ą przeprowadzane na 
wszystkich zwierz ętach w kierunku oznak toksyczno ści, ze szcze ­
gólnym uwzgl ędnieniem skutków wywieranych na integralno ść 
i działanie układów rozrodczych samców i samic oraz na wzrost 
i rozwój potomstwa.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3 OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.3.1  Wybór gatunków zwierz ąt 
Szczur jest po żądanym gatunkiem zwierz ęcia do bada ń. Jeżeli zasto­
sowano inne gatunki, nale ży podać uzasadnienie, a metoda b ędzie 
wymagać odpowiednich modyfikacji. Nie nale ży stosowa ć szczepów 
o niskiej p łodności lub powszechnie znanej wysokiej cz ęstości 
występowania wad rozwojowych. W momencie rozpocz ęcia 
doświadczenia odchylenia mas cia ła wśród wykorzystywanych 
zwierząt powinny by ć jak najni ższe i nie powinny przekracza ć 
20 % średniej masy cia ła u każdej z płci. 
1.3.2  Warunki p rzeby w ani ą i warunki żywieniowe  
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 22  o C (± 3  o C). Chocia ż wilgotno ść względna powinna 
wynosić co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie przekracza ła 
70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno by ć 
utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć 
sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia 
można stosowa ć konwencjonalne pasze laboratoryjne 
z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej. Na wybór diety 
może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki 
substancji testowej przy podawaniu metod ą powyższą. 
Zwierzęta mogą być trzymane pojedynczo lub umieszczane 
w klatkach w ma łych grupach o tej samej p łci. Procedury krycia 
przeprowadza si ę w klatkach nadaj ących się do tego celu. Po stwier ­
dzeniu, że kopulacja nast ąpiła, pokryte samice powinny by ć umiesz­
czone po jednej w klatkach porodowych lub matczynych. Pokryte zwierzęta mogą być równie ż trzymane w ma łych grupach 
i oddzielane na jeden lub dwa dni przed porodem. Tu ż przed 
porodem nale ży zapewni ć pokrytym samicom w łaściwy i okre ślony 
materiał do zrobienia gniazda.
 
1.3.3.  Przygotowanie zwierz ąt 
Należy wykorzysta ć zdrowe m łode zwierz ęta, które by ły aklimaty ­
zowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni 
i które nie by ły wcześniej poddawane procedurom badawczym. 
Badane zwierz ęta należy scharakteryzowa ć ze względu na gatunek, 
szczep, źródło, płeć, wagę i/lub wiek. Nale ży określić stosunki 
pokrewieństwa w rodze ństwie wśród zwierz ąt w celu unikni ęcia 
krycia rodze ństwem. Nale ży losowo przydzieli ć zwierzęta do grup 
kontrolnych i badanych (zaleca si ę dalszy podzia ł według masy 
ciała). Klatki powinny by ć ustawione w taki sposób, żeby zminima ­
lizować możliwy wpływ położenia klatki. Ka żdemu zwierz ęciu 
powinno si ę nadać jednoznaczny numer identyfikacyjny. 
W pokoleniu P nale ży to zrobi ć przed rozpocz ęciem dawkowania. 
W pokoleniu F  1 należy to zrobi ć w momencie zako ńczenia ssania 
przez zwierz ęta wybrane do krycia. Nale ży prowadzi ć zapisy wska ­
zujące pochodzenie z miotu dla wszystkich wybranych zwierz ąt z 
pokolenia F  1 . Jeśli rozważa się indywidualne wa żenie młodych lub 
jakiekolwiek obserwacje funkcjonalne, zaleca si ę ponadto indywi ­
dualną identyfikacj ę młodych tak szybko po urodzeniu, jak to 
możliwe.  
W momencie rozpocz ęcia dawkowania zwierz ęta pokolenia rodzi ­
cielskiego (P) powinny by ć w wieku 5–9 tygodni. Na ile to prak ­
tycznie mo żliwe, zwierz ęta wszystkich grup badanych powinny by ć 
jednakowej masy cia ła i jednego wieku.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4 PROCEDURA  
1.4.1  Liczba i p łeć zwierząt 
Każda grupa badana i kontrolna powinna sk ładać się z takiej liczby 
zwierząt, aby znalaz ło się w nich oko ło 20 samic pod koniec ci ąży. 
Może nie być to możliwe w przypadku substancji powoduj ących 
niepożądane skutki zwi ązane z podawaniem (np. niep łodność, 
nadmiern ą toksyczno ść przy najwy ższym dawkowaniu). Celem jest 
wyprodukowanie odpowiedniej liczby ci ąż w celu zapewnienia 
znaczącej oceny ewentualnego wp ływu substancji na p łodność, 
ciążę i zachowanie macierzy ńskie w pokoleniu zwierz ąt rodziców 
P i ssących młodych, wzrost i rozwój potomstwa F  1 w okresie od 
chwili pocz ęcia do osi ągnięcia dojrza łości płciowej oraz na rozwój 
ich potomstwa (F  2 ) do zako ńczenia ssania. A zatem nieosi ągnięcie 
pożądanej liczby ci ężarnych zwierz ąt (tj. 20) nie musi oznacza ć 
konieczno ści uniewa żnienia badania i powinno by ć ocenione 
oddzielnie dla ka żdego przypadku.  
1.4.2  Przygotowanie dawek  
Zaleca si ę podawanie doustne (z po żywieniem, wod ą pitną lub 
dozownikiem), je żeli nie uznano za w łaściwą innej drogi podawania 
(np. naskórnej lub wziewnej).  
W przypadku gdy to konieczne, substancja testowa jest rozpuszczona 
lub ma posta ć zawiesiny w odpowiednim no śniku. Zaleca si ę, aby – 
jeżeli to mo żliwe – najpierw by ło rozważone użycie wodnego 
roztworu/zawiesiny, nast ępnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej 
kukurydziany), a potem mo żliwy roztwór w innym no śnikach. 
W przypadku no śników niewodnych musi by ć znana charakterystyka 
toksyczna no śnika. Powinna by ć określona trwa łość substancji 
testowej w no śniku.  
1.4.3.  Dawkowanie  
Należy wykorzysta ć co najmniej trzy poziomy dawki i równoczesn ą 
kontrolę. Jeżeli charakter fizykochemiczny lub skutki biologiczne 
substancji testowej nie powoduj ą ograniczenia, najwy ższą dawkę 
należy dobrać w taki sposób, aby wywo łać pewną toksyczno ść, ale 
nie śmierć lub powa żne cierpienie. W przypadku nieoczekiwanej 
śmiertelno ści, badanie ze śmiertelno ścią mniejszą niż ok. 10 % 
zwierząt rodzicielskich (P) b ędzie zazwyczaj do przyj ęcia. Nale ży 
zastosowa ć sekwencj ę coraz mniejszych dawek, aby zademonstrowa ć 
wszelkie reakcje zwi ązane z dawkowaniem i okre ślić poziom dawko ­
wania, przy którym nie obserwuje si ę niekorzystnych skutków 
(NOAEL). Dwa do czterech interwa łów dawkowania s ą często opty­
malne dla ustalenia malej ących poziomów dawki i dodanie czwartej 
grupy badanej jest cz ęsto bardziej po żądane niż stosowanie bardzo 
dużych interwa łów (np. wspó łczynnik wi ększy od 10) mi ędzy 
dawkowaniem. Dla bada ń, gdzie substancja testowa podawana jest 
w pożywieniu, interwa ł dawkowania nie powinien przekracza ć 
współczynnika 3. Poziomy dawkowania nale ży dobiera ć 
z uwzględnieniem wszelkich dost ępnych danych o toksyczno ści, 
szczególnie z bada ń powtarzanego dawkowania. Nale ży uwzględnić 
wszelkie dost ępne informacje o metabolizmie i kinetyce zwi ązku 
testowego lub odno śne materia ły. Informacje te pomog ą nadto 
w wykazaniu w łaściwego doboru re żimu dawkowania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 513
 
Grupa kontrolna powinna by ć grupą niepoddawan ą dawkowaniu lub 
grupą kontroln ą nośnika, jeśli nośnik zastosowano do podawania 
substancji testowej. Z wyj ątkiem poddawania dawkowaniu substancji 
testowej, zwierz ęta w grupie kontrolnej powinny by ć traktowane 
identycznie jak zwierz ęta będące przedmiotem badania. Je śli wyko­
rzystywany jest no śnik, grupa kontrolna otrzymuje no śnik 
w najwyższej stosowanej obj ętości. Jeżeli substancja testowa jest 
podawana z po żywieniem i powoduje obni żenie spożycia lub wyko ­
rzystania pokarmu, mo żna rozwa żyć konieczno ść użycia grupy 
kontrolnej karmionych par. Zamiast jednoczesnej grupy kontrolnej 
karmionych par mo żna, alternatywnie, wykorzysta ć badania kontro ­
lowane zaprojektowane w celu okre ślenia wp ływu obni żonej 
konsumpcji pokarmu na parametry reprodukcyjne.  
Należy uwzględnić następujące charakterystyki no śnika lub innych 
domieszek: skutek wywierany na absorpcj ę, dystrybucj ę, metabolizm 
oraz na zatrzymywanie lub ekskrecj ę substancji testowej; skutki 
wywierane na chemiczne w łasności substancji testowej, które mog ą 
zmienić jej charakterystyk ę toksyczn ą; należy równie ż uwzględnić 
wpływ na pobieranie pokarmu lub wody, lub stan od żywienia 
zwierząt. 
1.4.4.  Test graniczny  
Jeżeli badanie z podawaniem doustnym przy jednym poziomie dawki 
równym co najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła/dzień, lub równowa żny 
procent w po żywieniu lub wodzie pitnej (na podstawie ustalonej 
masy cia ła), w przypadku podawania w po żywieniu lub wodzie 
pitnej, stosuj ąc procedury opisane dla tego badania, nie wywo łuje 
widocznych objawów zatrucia ani u zwierz ąt rodzicielskich, ani u ich 
potomstwa, i je żeli nie nale żałoby spodziewa ć się toksyczno ści na 
podstawie danych dotycz ących substancji strukturalnie pokrewnych 
i/lub powi ązanych metabolicznie, wtedy pe łne badanie przy u życiu 
trzech poziomów dawki mo że nie być uznane za konieczne. Ten test 
graniczny stosuje si ę z wyj ątkiem przypadków, w których 
ekspozycja ludzi wskazuje na konieczno ść użycia wyższego poziomu 
dawki doustnej. W odniesieniu do innych dróg podawania, na przy ­
kład wziewnej lub stosowania na skór ę, własności fizyczne 
i chemiczne substancji testowej, jak np. rozpuszczalno ść, mogą 
często wskazywa ć i ogranicza ć najwyższy możliwy do osi ągnięcia 
poziom ekspozycji.  
1.4.5.  Podawanie  
Zwierzętom podaje si ę substancj ę testową przez siedem dni 
w tygodniu. Po żądane jest podawanie doustne (z pokarmem, wod ą 
pitną lub dozownikiem). Je śli zastosowano inn ą drogę podawania, 
należy podać uzasadnienie; mog ą też być konieczne w łaściwe mody ­
fikacje. Wszystkim zwierz ętom podaje si ę dawki t ą samą metodą 
w czasie odpowiedniego okresu do świadczalnego. Kiedy podaje si ę 
substancję dozownikiem, powinno si ę to wykonywa ć za pomoc ą 
zgłębnika do żołądka. Obj ętość cieczy, która mo że być podana 
jednorazowo nie powinna przekracza ć 1 ml/100 g masy cia ła (0,4 
ml/100 g masy cia ła jest maksymaln ą objętością przy stosowaniu 
oleju kukurydzianego), z wyj ątkiem roztworów wodnych mo żna 
użyć 2 ml/100 g masy cia ła. Z wyj ątkiem substancji dra żniących 
lub korozyjnych, które zazwyczaj wywo łują zaostrzone skutki, 
zmienność w testowej obj ętości powinna by ć zminimalizowana 
poprzez skorygowanie st ężenia, aby uzyska ć stałą objętość na 
wszystkich poziomach dawki. W badaniach z wykorzystaniem 
dozownika m łode otrzymuj ą substancj ę tylko drog ą pośrednią 
przez mleko, dopóki nie rozpocznie si ę dawkowanie bezpo średnie 
po zaprzestaniu ssania. W badaniach, gdzie podaje si ę substancj ę 
testową w pożywieniu lub wodzie pitnej, m łode otrzymuj ą substancj ę 
bezpośrednio, kiedy zaczynaj ą się samodzielnie od żywiać w ostatnim 
tygodniu okresu laktacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 514
 
W przypadku substancji podawanych w po żywieniu lub wodzie 
pitnej wa żne jest zapewnienie, aby wymagane ilo ści substancji 
testowej nie kolidowa ły z prawid łową równowag ą odżywiania lub 
wody. W przypadku gdy substancja testowa jest podawana w pożywieniu, mo że być stosowane sta łe stężenie żywieniowe 
(ppm) albo sta ły poziom dawki w odniesieniu do masy cia ła 
zwierząt; użyta opcja musi by ć wyszczególniona. W przypadku 
substancji podawanej przez dozownik, dawka powinna by ć poda­
wana każdego dnia o podobnej porze, i w razie konieczno ści mody­
fikowana co najmniej raz na tydzie ń, żeby utrzyma ć stały poziom 
dawki w odniesieniu do masy cia ła zwierzęcia. Kiedy podaje si ę 
dozownikiem dawk ę przeliczon ą na masę ciała, należy uwzględnić 
informacje dotycz ące dystrybucji łożyskowej.
 
1.4.6.  Harmonogramy bada ń 
Codzienne stosowanie dawki u rodzicielskich samców i samic (P) 
powinno rozpocz ąć się po przekroczeniu od 5–9 tygodni życia. 
Codzienne dawkowanie u samców i samic F  1 powinno rozpocz ąć 
się po zaprzestaniu ssania; nale ży pamiętać, że w przypadkach poda ­
wania substancji z po żywieniem lub wod ą pitną, bezpośrednia 
ekspozycja m łodych F  1 na substancj ę testową może nastąpić już 
w okresie laktacji. U obu p łci (P i F  1 ) dawkowanie powinno si ę 
odbywać przez co najmniej 10 tygodni przed okresem krycia. 
Dawkowanie nale ży kontynuowa ć u obu płci przez dwutygodniowy 
okres krycia. Samce nale ży humanitarnie u śmiercić, kiedy nie s ą już 
potrzebne do oceny wp ływu na rozrodczo ść. U rodzicielskich samic 
P dawkowanie powinno by ć kontynuowane przez okres ci ąży aż do 
czasu zaprzestania ssania potomstwa F  1 . Należy rozważyć zmodyfi­
kowanie zasad dawkowania przy uwzgl ędnieniu dost ępnych infor ­
macji na temat substancji testowej, w tym dost ępnych danych 
dotyczących toksyczno ści, pobudzania przez ni ą metabolizmu lub 
bioakumulacji. Dawka dla ka żdego zwierz ęcia powinna opiera ć się 
zazwyczaj na najbardziej aktualnym indywidualnym okre śleniu masy 
ciała. Należy jednak zachowa ć ostrożność, kiedy dostosowuje si ę 
dawki w ostatnim trymestrze ci ąży. 
Podawanie samcom i samicom P i F  1 trwa do ich u śmiercenia. 
Wszystkie doros łe samce i samice P i F  1 powinny zosta ć humani­
tarnie uśmiercone, kiedy nie s ą już potrzebne do oceny wp ływu na 
reprodukcj ę. Potomstwo F  1 nie wybrane do krycia i ca łe potomstwo 
F 2 powinno zosta ć humanitarnie u śmiercone po zaprzestaniu ssania.  
1.4.7.  Procedura krycia  
1.4.7.1.  Krycie w pokoleniu rodzicielskim (P)  
W celu ka żdego krycia jedn ą samicę umieszcza si ę z jednym 
samcem z tego samego poziomu dawkowania (krycie 1:1) do momentu kiedy nast ąpi kopulacja lub up łyną 2 tygodnie. Ka żdego 
dnia samice nale ży poddać badaniu na obecno ść spermy lub czopów 
nasienia w pochwie. Dzie ń 0 danej ci ąży jest okre ślany w chwili 
wykrycia spermy lub czopu nasienia w pochwie. Je śli kojarzenie 
w parze nie uda si ę, można rozwa żyć krycie samic samcami 
o dowiedzionej p łodności. W danych nale ży dokładnie zidentyfi ­
kować kojarzone pary. Nale ży unikać krycia pomi ędzy rodze ństwem.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 515
 
1.4.7.2.  Krycie w potomstwie F  1 
W celu otrzymania pokolenia F  2 , do krycia w potomstwie F  1 należy 
wybrać co najmniej jednego samca i jedn ą samicę, po zaprzestaniu 
ssania, z ka żdego miotu do krycia innymi m łodymi osobnikami 
z tego samego poziomu dawkowania, ale z innego miotu. Wybór 
młodych z ka żdego miotu powinien by ć losowy, je żeli nie zaobser ­
wowano znacz ących różnic w ci ężarze ciała pomiędzy młodymi 
w miocie. W przypadku zaobserwowania takich ró żnic należy 
wybrać młode najbardziej reprezentatywne dla ka żdego z miotów. 
W sposób pragmatyczny dokonuje si ę tego na podstawie ci ężaru 
ciała, ale wybór na podstawie wygl ądu może być właściwszy. 
Młode z pokolenia F  1 nie powinny by ć kryte zanim nie osi ągną 
pełnej dojrza łości płciowej.  
Należy ustalić przyczyny braku p łodności w odniesieniu do par, 
które nie maj ą potomstwa. Powy ższe może obejmowa ć takie proce ­
dury, jak dodatkowe mo żliwości krycia z samcami lub samicami 
o dowiedzionej p łodności, mikroskopowe badanie organów rozrod ­
czych oraz badania cyklu rujowego i cyklu spermatogenezy.  
1.4.7.3.  Drugie krycie  
W pewnych przypadkach, takich jak zwi ązane z terapi ą zmiany 
w wielko ści miotu lub zaobserwowanie niejednoznacznych skutków 
w pierwszym kryciu, zaleca si ę powtórne krycie zwierz ąt dorosłych 
P i F  1 w celu otrzymania drugiego miotu. Je śli uznano za konieczne 
uzyskanie drugiego miotu w którym ś z tych pokole ń, zwierzęta 
powinny by ć kryte po raz drugi po up ływie oko ło tygodnia od 
zaprzestania ssania przez ostatni miot.  
1.4.7.4.  Wielko ść miotu  
Zwierzęta są dopuszczane do miotów i wychowuj ą swoje potomstwo 
do chwili zaprzestania ssania. Normalizacja wielko ści miotu nie jest 
obowiązkowa. Kiedy dokonuje si ę normalizacji miotów, nale ży 
szczegółowo opisa ć zastosowan ą metodę. 
1.5. OBSERWACJE  
1.5.1.  Obserwacje kliniczne  
Ogólne obserwacje kliniczne prowadzone s ą każdego dnia, a w przy ­
padku dawkowania przez dozownik terminy podawania powinny uwzględniać szczytowy okres przewidywanych objawów po dawko ­
waniu. Nale ży odnotowa ć zmiany w zachowaniu, objawy trudnego 
lub długotrwałego porodu oraz wszelkie objawy toksyczno ści. 
Dodatkowe, bardziej szczegó łowe badanie ka żdego zwierz ęcia 
należy przeprowadzi ć co najmniej raz na tydzie ń, przy okazji 
ważenia zwierz ąt. Dwa razy dziennie, a podczas weekendów raz 
dziennie tam, gdzie to konieczne, wszystkie zwierz ęta są obserwo ­
wane pod k ątem zachorowalno ści i śmiertelno ści.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 516
 
1.5.2  Masa cia ła oraz konsumpcja po żywienia/wody przez zwierz ęta 
rodzicielskie  
Zwierzęta rodzicielskie (P i F  1 ) należy zważyć w pierwszym dniu 
dawkowania i nast ępnie co najmniej raz na tydzie ń. Rodzicielskie 
samice (P and F  1 ) należy ważyć co najmniej w dniu 0, 7, 14 i 20 lub 
21 ciąży, a podczas laktacji w tych samych dniach, w których 
ważone są mioty, oraz w dniu, w którym u śmierca si ę zwierzęta. 
Obserwacje te nale ży umieścić w sprawozdaniu oddzielnie dla 
każdego doros łego zwierz ęcia. W okresie przed kojarzeniem 
i podczas ci ąży, należy co najmniej raz w tygodniu mierzy ć konsum­
pcję pokarmu. Nale ży mierzy ć konsumpcj ę wody co najmniej raz 
w tygodniu, je żeli substancj ę testową podaje si ę w wodzie.  
1.5.3  Cykl rujowy  
Długość i normalny przebieg cyklu rujowego u samic P i F  1 
oceniane s ą poprzez rozmazy śluzówki pochwy przed kryciem 
i nieobowi ązkowo w okresie krycia, dopóki nie zostanie ustalone 
zaistnienie krycia. Przy uzyskiwaniu komórek pochwy/szyjki macicy należy uważać, żeby unikn ąć uszkodzenia śluzówki i, w nast ępstwie, 
wywołania ciąży rzekomej (1).
 
1.5.4  Parametry nasienia  
Przy uśmiercaniu wszystkich samców P i F  1 odnotowuje si ę masy 
jąder i najądrzy i po jednym z tych narz ądów zachowuje do badania 
histopatologicznego (zob. sekcja 1.5.7, 1.5.8.1). Z podgrupy co 
najmniej dziesi ęciu samców z ka żdej grupy samców P i F  1 , pozostałe 
jądra i naj ądrza nale ży użyć do liczenia, odpowiednio, spermatyd 
odpornych na homogenizacj ę i rezerw nasienia w ogonach naj ądrzy. 
Od tych samych samców nale ży zebrać nasienie z ogonów naj ądrzy 
lub kanalików nasiennych do badania ruchliwo ści i morfologii plem ­
ników. Je żeli zaobserwowano wyst ępowanie skutków zwi ązanych 
z terapią lub jeśli w innych badaniach dowiedziono mo żliwych 
skutków wzgl ędem spermatogenezy, ocena nasienia powinna zosta ć 
przeprowadzona u wszystkich samców ka żdej grupy dawkowania; 
w innych przypadkach liczenie mo żna ograniczy ć do samców P i 
F 1 grupy kontrolnej i grupy najwy ższego dawkowania.  
Należy określić całkowite liczby odpornych na homogenizacj ę sper­
matyd jądrowych i plemników z ogona naj ądrzy (2)(3). Rezerwy 
nasienia w ogonach naj ądrzy mo żna wyprowadzi ć ze stężenia 
i objętości nasienia w zawiesinie wykorzystywanej do wykonania 
ocen jako ściowych oraz liczby plemników uzyskanych przez 
następne zmielenie i/lub homogenizacj ę pozostałej tkanki ogona 
najądrza. Liczenia nale ży dokona ć u podgrupy samców ze wszyst ­
kich grup dawkowania bezpo średnio po u śmierceniu zwierz ąt, chyba 
że dokonano zapisów wideo lub cyfrowych, lub kiedy u śmiercone 
osobniki zostaj ą zamrożone i przeanalizowane pó źniej. W tych przy ­
padkach grupa kontrolna i grupa wysokiego poziomu dawkowania 
może zostać przeanalizowana najpierw. Je żeli nie zostan ą w nich 
stwierdzone skutki zwi ązane z terapi ą (np. wpływ na liczb ę plemni­
ków, ich ruchliwo ść, lub morfologi ę), nie ma potrzeby analizowania 
innych grup dawkowania. Kiedy w grupie najwy ższego dawkowania 
zostaną stwierdzone skutki zwi ązane z terapi ą, wtedy powinna 
również zostać oceniona grupa z ni ższym poziomem dawki.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 517
 
Ruchliwo ść plemników naj ądrza (lub kanalika nasiennego) powinna 
zostać oceniona lub zarejestrowana na ta śmie wideo bezpo średnio po 
uśmierceniu. Nasienie nale ży uzyskać z minimalnymi uszkodzeniami 
i rozcieńczone w celu przeprowadzenia analizy ruchliwo ści, stosując 
uznane metody (4). Udzia ł procentowy poruszaj ących się postępowo 
plemników powinien zosta ć oceniony subiektywnie lub obiektywnie. 
Kiedy dokonuje si ę wspomaganej komputerowo analizy ruchu (5) ­
(6)(7)(8)(9)(10), wyprowadzenie post ępowej ruchliwo ści opiera si ę 
na zdefiniowanych przez u żytkownika progach średniej pr ędkości 
wzdłuż drogi oraz wska źniku prosto ści lub liniowym. Je żeli próbki 
rejestrowane s ą na taśmie wideo (11) lub obrazy rejestruje si ę w inny 
sposób w czasie sekcji, wystarczy nast ępnie tylko analiza grup 
kontrolnych i wysokiego dawkowania samców P i F  1 , chyba że 
zostaną zaobserwowane skutki zwi ązane z terapi ą; w tym przypadku 
należy przeanalizowa ć również grupę niższego dawkowania. Je żeli 
nie ma obrazu wideo lub cyfrowego, wszystkie próbki ze wszystkich grup musz ą zostać przeanalizowane przy sekcji zw łok.
 
Należy dokona ć morfologicznej oceny próbki plemników z naj ądrzy 
(lub nasieniowodu). Plemniki (co najmniej 200 na próbk ę) należy 
badać w formie utrwalonych preparatów mokrych (12) 
i klasyfikowa ć jako prawid łowe lub nieprawid łowe. Przyk łady 
nieprawid łowości morfologicznych plemników obejmuj ą zrośnięcie, 
oddzielone lub zniekszta łcone główki i/lub wici. Oceny dokonuje si ę 
na wybranej podgrupie samców wszystkich grup dawkowania albo 
bezpośrednio po u śmierceniu zwierz ąt albo pó źniej, opieraj ąc się na 
zapisie wideo lub cyfrowym. Utrwalone rozmazy mog ą być również 
oglądane później. W tych przypadkach grupa kontrolna i grupa 
wysokiego poziomu dawkowania mo że zostać przeanalizowana 
najpierw. Je żeli nie zostan ą w nich stwierdzone skutki zwi ązane 
z terapią (np. wp ływ na morfologi ę plemników), nie ma potrzeby 
analizowania innych grup dawkowania. Kiedy w grupie najwy ższego 
dawkowania zostan ą stwierdzone skutki zwi ązane z terapi ą, wtedy 
należy również przeanalizowa ć grupy z ni ższym poziomem dawki.  
Jeżeli którykolwiek z powy ższych parametrów oceny nasienia by ł 
już wcześniej badany jako cz ęść systemowego badania toksykolo ­
gicznego trwaj ącego co najmniej 90 dni, badanie to nie musi by ć 
koniecznie powtarzane w badaniu dwupokoleniowym. Zaleca si ę 
jednak, aby próbki lub cyfrowe zapisy dotycz ące nasienia pokolenia 
P zostały zachowane do ewentualnej pó źniejszej oceny, je żeli zajdzie 
taka konieczno ść. 
1.5.5.  Młode 
Każdy miot nale ży zbadać tak szybko po urodzeniu jak to mo żliwe 
(dzień laktacji 0), w celu ustalenia liczby i p łci młodych, płodów 
urodzonych martwo, p łodów urodzonych żywo, oraz obecno ści 
poważnych nieprawid łowości. Pożądane jest zbadanie m łodych, 
które znaleziono martwe w dniu 0, pod k ątem możliwych wad 
i przyczyny zgonu, i zachowanie ich. Żywe młode należy policzy ć 
i zważyć pojedynczo w dniu urodzenia (dzie ń 0 laktacji) lub w dniu 
1, oraz w dniach regularnego wa żenia, np. w dniach 4, 7, 14 i 21 
laktacji. Nale ży odnotowa ć nieprawid łowości fizyczne lub 
w zachowaniu, zaobserwowane u matek lub m łodych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
Rozwój fizyczny m łodych powinien by ć odnotowany g łównie 
w postaci przyrostów masy cia ła. Inne parametry fizyczne (otwarcie 
uszu i oczu, wyrzynanie z ębów, wzrost sier ści) mogą dostarczy ć 
dodatkowych informacji, ale dane te najlepiej jest ocenia ć 
w kontek ście dojrzewania p łciowego (np. wiek i masa w dniu 
otwarcia pochwy lub wyró żnicowania podzia łu żołędzi-napletka) 
(13). Badania funkcjonalne (np. aktywno ści motorycznej, funkcji 
sensorycznej, ontogenezy odruchu) u m łodych pokolenia F  1 przed 
i po zaprzestaniu ssania, szczególnie te, które wi ążą się 
z dojrzewaniem p łciowym s ą zalecane, je żeli tego rodzaju stwier ­
dzenia nie zosta ły objęte innymi badaniami. U m łodych F  1 , które 
zaprzestały ssania, a s ą przeznaczone do krycia, nale ży określić wiek 
otwarcia pochwy i pojawienia si ę podziału żołędzi. Odleg łość 
między odbytem a otworem p łciowym nale ży mierzy ć w dniu 0 
po urodzeniu m łodych F  2 , jeżeli zmiany w proporcji p łci w grupie 
lub odchylenia w dojrzewaniu p łciowym wskazuj ą na taką koniecz­
ność. 
Można nie dokonywa ć obserwacji funkcjonalnych w grupach, które 
w inny sposób wykazuj ą wyraźne oznaki kliniczne niekorzystnych 
skutków (np. znacz ące spadki przyrostu masy itp.). Je żeli prowadzi 
się obserwacje funkcjonalne, nie nale ży ich dokonywa ć na młodych 
wybranych do krycia.  
1.5.6  Ogl ądowa sekcja zw łok 
W chwili u śmiercenia lub zgonu zwierz ęcia podczas badania, 
wszystkie zwierz ęta pokolenia rodziców (P i F  1 ), wszystkie m łode 
z nieprawid łowościami zewn ętrznymi lub objawami klinicznymi, jak 
również po jednym losowo wybranym m łodym/płci/miocie, powinny 
zostać poddane badaniom ogl ądowym w celu wykrycia wszelkich 
strukturalnych nieprawid łowości lub zmian patologicznych, ze zwró ­
ceniem szczególnej uwagi na organy uk ładu rozrodczego. M łode, 
które zosta ły humanitarnie u śmiercone w stanie chorobowym, oraz 
młode padłe, jeśli nie są zmacerowane, powinny zosta ć zbadane pod 
kątem ewentualnych wad i/lub przyczyny zgonu, i utrwalone.  
Macice samic, które rodzi ły pierwszy raz nale ży zbadać w sposób 
nie naruszaj ący możliwości przeprowadzenia oceny histopatolo ­
gicznej na obecno ść i liczbę zagnieżdżonych jaj.  
1.5.7.  Masy narz ądów 
Po uśmierceniu nale ży określić masę ciała oraz masy nast ępujących 
narządów wszystkich zwierz ąt rodzicielskich P i F  1 (narządy 
parzyste nale ży ważyć oddzielnie):  
— macica, jajniki,  
— jądra, najądrza (całe oraz ogony),  
— prostata,  
— pęcherzyki nasienne wraz z gruczo łami opuszkowo-cewkowymi 
i ich płynami oraz gruczo ł krokowy (jako jedna ca łość), 
— mózg, w ątroba, nerki, śledziona, przysadka, tarczyca, nadnercza 
i znane organy docelowe.  
Należy określić masy cia ła przy uśmierceniu tych m łodych F  1 i F 2 , 
które zosta ły wybrane do sekcji zw łok. Należy zważyć następujące 
narządy z jednego losowo wybranego m łodego/płci/miotu (zob. 
sekcja 1.5.6): mózg, śledziona i grasica.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Jeśli to możliwe, wyniki ogl ądowej sekcji zw łok i masy narz ądów 
powinny by ć oceniane w zestawieniu z innymi obserwacjami poczy ­
nionymi w innych badaniach powtarzanego dawkowania.  
1.5.8.  Histopatologia  
1.5.8.1.  Zwierz ęta rodzicielskie  
Należy utrwalić i przechowywa ć w odpowiednim środku nast ępujące 
narządy i tkanki zwierz ąt rodzicielskich (P i F  1 ) lub ich reprezenta ­
tywne próbki do badania histopatologicznego:  
— pochwa, macica z szyjk ą oraz jajniki (zachowane 
w odpowiednim utrwalaczu),  
— jedno j ądro (zachowane w utrwalaczu Bouina lub porównywal ­
nym), jedno naj ądrze, kanaliki nasienne, gruczo ł krokowy 
i gruczoł opuszkowo-cewkowy,  
— wcześniej okre ślony organ (organy) docelowe ze wszystkich 
zwierząt P i F  1 wybranych do kojarzenia.  
Należy wykona ć pełne badanie histopatologiczne wyliczonych 
powyżej utrwalonych narz ądów i tkanek u wszystkich zwierz ąt 
grupy wysokiego dawkowania i zwierz ąt kontrolnych P i F  1 wybra­
nych do kojarzenia. Badanie jajników zwierz ąt P nie jest obowi ąz­
kowe. W grupach najmniejszego i po średniego dawkowania nale ży 
również zbadać narządy wykazuj ące zmiany zwi ązane z terapi ą, by 
pomóc w wyja śnieniu NOAEL. Ponadto nale ży poddać ocenie histo ­
patologicznej organy rozrodcze zwierz ąt z grup najni ższego 
i pośredniego poziomu dawkowania, podejrzanych o obni żoną płod­
ność, tj. zwierz ąt, które nie kojarzy ły się, nie zosta ły zapłodnione, 
nie spłodziły, albo nie urodzi ły zdrowego potomstwa. Nale ży zbadać 
wszystkie du że zmiany, jak atrofia lub guzy.  
Należy przeprowadzi ć szczegółowe badania histopatologiczne j ąder 
(np. z wykorzystaniem utrwalacza Bouina, zatapiania w parafinie 
i skrawania poprzecznych skrawków o grubo ści 4–5 μm) w celu 
określenia związanych z terapi ą skutków, takich jak zatrzymane sper ­
matydy, braki komórek warstw zarodkowych lub ich typów, wielo ­
jądrowe komórki olbrzymie lub oddzielanie si ę komórek spermato ­
gennych w światło przewodu (14). Badanie nienaruszonego naj ądrza 
powinno obejmowa ć głowę, trzon i ogon, co mo żna osiągnąć przez 
ocenę przekroju poprzecznego. Badanie naj ądrza powinno obej ­
mować naciekanie leukocytami, zmiany w wyst ępowaniu poszcze ­
gólnych typów komórek, typy komórek odbiegaj ących od normy 
i fagocytoz ę plemników. W ocenie m ęskich narz ądów rozrodczych 
należy stosowa ć barwienie metod ą PAS i hematoksylin ą. 
Jajnik polaktacyjny powinien zawiera ć pęcherzyki rdzenne 
i pęcherzyki wzrastaj ące, jak równie ż duże ciałka żółte okresu lakta ­
cji. Badanie histopatologiczne powinno wykry ć jakościowe upo śle­
dzenie populacji p ęcherzyków rdzennych. U samic F  1 należy prze­
prowadzić ilościową ocenę pęcherzyków rdzennych; liczba zwierz ąt, 
wybór przekrojów jajnika i wielko ść próby przekrojów powinny 
mieć wielkości spełniające wymagania u żywanej procedury oceny 
statystycznej. Badanie powinno zawiera ć liczenie liczby p ęche­
rzyków rdzennych, któr ą dla potrzeb porównania jajników zwierz ąt 
badanych i kontrolnych mo żna połączyć z liczbą małych pęche­
rzyków wzrastaj ących (15)(16)(17)(18)(19).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Młode po zaprzestaniu ssania  
Tkanki i narz ądy docelowe ze znacznymi nieprawid łowościami ze 
wszystkich m łodych z zewn ętrznymi nieprawid łowościami lub ozna ­
kami klinicznymi, jak równie ż z jednego losowo wybranego 
młodego/płci/miotu z pokole ń F 1 i F 2 nieprzeznaczonego do krycia, 
należy utrwali ć i przechowa ć w odpowiednim środku, do bada ń 
histopatologicznych. Nale ży określić pełną histopatologiczn ą charak­
terystykę utrwalonej tkanki ze szczególnym uwzgl ędnieniem 
narządów rozrodczych.  
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Dane nale ży podawa ć indywidualnie i podsumowa ć w formie tabeli 
wykazującej, w odniesieniu do ka żdej grupy badanej i ka żdego 
pokolenia, liczb ę zwierząt na pocz ątku badania, liczb ę zwierząt, 
które znaleziono martwe podczas badania lub zwierz ąt uśmierconych 
ze względów humanitarnych, czas śmierci lub humanitarnego 
uśmiercenia, liczb ę zwierząt płodnych, liczb ę ciężarnych samic, 
liczbę zwierząt wykazuj ących zaobserwowane oznaki toksyczno ści, 
z podaniem czasu ich pojawienia si ę, w tym czasu trwania, ci ężkości 
wszelkich skutków toksyczno ści, rodzajów obserwacji zwierz ąt 
rodzicielskich i potomstwa, rodzajów zmian histopatologicznych 
oraz wszelkich odno śnych danych miotów.  
Wyniki liczbowe nale ży ocenić właściwą, uznaną metodą staty­
styczną; wyboru metod statystycznych nale ży dokona ć w ramach 
projektowania badania i uzasadni ć. Użytecznym w analizie mo że 
być model statystyczny zale żności reakcji od dawki. Sprawozdanie 
powinno zawiera ć wystarczaj ące informacje dotycz ące użytych 
metod analizy i oprogramowania komputerowego, tak aby niezale żny 
recenzent/statystyk móg ł dokonać powtórnej oceny i odtworzy ć 
analizę. 
2.2. OCENA WYNIKÓW  
Wyniki uzyskane w dwupokoleniowym badaniu toksyczno ści repro­
dukcyjnej nale ży ocenić w kategoriach zaobserwowanych skutków, 
w tym ustale ń z sekcji zw łok i bada ń mikroskopowych. Ocena obej ­
muje stwierdzenie zale żności – lub jej braku – pomi ędzy dawk ą 
substancji testowej a obecno ścią lub brakiem, cz ęstością 
i ciężkością nieprawid łowości, wliczaj ąc w to powa żne zmiany, 
wskazane organy docelowe, zmienion ą płodność, nieprawid łowości 
kliniczne, zmienione funkcje rozrodcze i funkcjonowanie miotów, 
zmiany masy cia ła, wpływ na śmiertelno ść i wszelkie inne skutki 
toksyczne.  
W ocenie wyników nale ży uwzględnić własności fizykochemiczne 
substancji testowej i (w miar ę dostępności) dane toksykokinetyczne. 
Prawidłowo przeprowadzone badanie toksyczno ści reprodukcyjnej 
powinno dostarczy ć zadowalaj ącą ocenę poziomu niepowoduj ącego 
skutków oraz da ć możliwość lepszego zrozumienia niekorzystnych 
skutków wywieranych na reprodukcj ę, poród, laktacj ę i rozwój 
pourodzeniowy, w tym wzrost i dojrzewanie p łciowe.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Dwupokoleniowy test toksyczno ści reprodukcyjnej dostarcza infor ­
macji o skutkach powtarzanej ekspozycji na substancj ę, podczas 
wszystkich faz cyklu rozrodczego. W szczególno ści badanie to 
dostarcza informacji o parametrach rozrodu, a tak że o rozwoju, 
wzroście, dojrzewaniu i prze żywaniu m łodych. Wyniki tego badania 
należy rozpatrywa ć w po łączeniu z wynikami uzyskanymi 
w badaniach toksyczno ści podchronicznej, przedurodzeniowej 
toksyczno ści rozwojowej i badaniach toksykokinetycznych i innych 
dostępnych badaniach. Wyniki tego badania mog ą być wykorzystane 
do oceny potrzeby dalszego badania substancji chemicznej. Ekstra ­
polacja wyników tego badania na cz łowieka jest uprawniona tylko 
w ograniczonym stopniu. Najlepszym sposobem ich wykorzystania jest dostarczanie informacji dotycz ącej poziomów niepowoduj ących 
skutków i dopuszczalnej ekspozycji ludzi (20)(21)(22)(23).
 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące szczegó łowe infor ­
macje:  
Substancja testowa:  
— cechy fizyczne, oraz, w odpowiednich przypadkach, w łasności 
fizykochemiczne,  
— dane identyfikacyjne,  
— czysto ść. 
Nośnik (w stosownych przypadkach):  
— uzasadnienie wyboru no śnika, jeśli jest inny ni ż woda.  
Zwierzęta badane:  
— użyty gatunek/szczep,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki środowiska, po żywienie, materia ł gniazdowy 
itp., 
— indywidualna masa cia ła zwierząt na pocz ątku badania.  
Warunki badania:  
— racjonalne uzasadnienie doboru poziomu dawek,  
— szczegó ły formy u żytkowej substancji testowej/przygotowywania 
pożywienia, osi ągnięte stężenia,  
— stabilno ść i jednorodno ść preparatu,  
— szczegó ły dotyczące podawania substancji testowej,  
— w stosownych przypadkach przeliczenie st ężeń substancji 
testowej w po żywieniu/wodzie pitnej (ppm) na dawk ę rzeczy­
wistą (mg/kg masy cia ła/dzień), 
— szczegó ły dotyczące jakości pożywienia i wody pitnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Wyniki:  
— konsumpcja pokarmu, konsumpcja wody (je żeli dane s ą dostęp­
ne), wydajno ść wykorzystania pokarmu (przyrost masy cia ła na 
gram zjadanego pokarmu), konsumpcja materia łu badanego 
u zwierząt P i F  1 , z wyjątkiem okresu wspólnego przebywania 
w klatce i ostatniej jednej trzeciej okresu laktacji;  
— dane dotycz ące absorpcji (je żeli są dostępne),  
— dane dotycz ące mas cia ła zwierząt P i F1 przeznaczonych do 
krycia,  
— dane dotycz ące mas miotów i m łodych,  
— masy cia ła w chwili u śmiercenia oraz bezwzgl ędne i wzgl ędne 
masy narz ądów u zwierz ąt rodzicielskich,  
— rodzaj, ci ężkość i czas trwania obserwowanych objawów klinicz ­
nych (tak odwracalnych jak i nieodwracalnych),  
— data śmierci podczas do świadczenia lub informacja, że zwierzęta 
przeżyły do uśmiercenia,  
— dane dotycz ące reakcji toksycznej w rozbiciu na p łeć i dawkę, 
w tym wska źniki krycia, p łodności, ciąż, urodzeń, żywotności 
oraz laktacji; sprawozdanie powinno podawa ć liczby wykorzys ­
tane do obliczania tych wska źników,  
— skutki toksyczne lub inne wywierane na reprodukcj ę, potomstwo, 
wzrost pourodzeniowy itp.,  
— stwierdzenia w czasie sekcji,  
— szczegó łowy opis stwierdze ń histopatologicznych,  
— liczba samic P i F  1 z normalnym cyklem oraz d ługość cyklu,  
— całkowita liczba plemników ogona naj ądrza, procent progre ­
sywnie przemieszczaj ących się plemników, procent morfolo ­
gicznie normalnych plemników oraz procenty plemników 
z każdą określoną nieprawid łowością, 
— czas do krycia, w tym liczba dni do momentu krycia,  
— długość trwania ci ąży, 
— liczba zagnie żdżonych płodów, cia łek żółtych, wielko ść miotu,  
— liczba m łodych urodzonych żywo i strat poimplantacyjnych,  
— liczba m łodych z widocznymi znacznymi nieprawid łowościami, 
liczba słabowitych m łodych w miocie, je żeli została określona, 
powinna zosta ć podana w sprawozdaniu,  
— dane o fizycznych punktach charakterystycznych u m łodych 
i inne dane na temat rozwoju pourodzeniowego; ocenione punkty 
charakterystyczne nale ży uzasadni ć, 
— w stosownych przypadkach, dane z obserwacji funkcjonalnych 
u młodych i doros łych, 
— w stosownych przypadkach, statystyczne opracowanie wyników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Dyskusja wyników.  
Wnioski, w tym warto ści NOAEL dla skutków u matek i potomstwa.  
4 BIBLIOGRAFIA  
(1) Sadleir, R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, In:  Reproduc ­
tion in Mammals:  I. Germ Cells and Fertilization, C.R. Auston 
and R. V. Short (eds.), Cambridge, New York.  
(2) Gray, L.E. et al., (1989). A Dose-Response Analysis of Metho ­
xychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and Function in the Rat.  Fundamental and Applied Toxicology  12: 
92–108.
 
(3) Robb, G.W. et al., (1978). Daily Sperm Production and Epidi ­
dymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats.  Journal of 
Reproduction and Fertility  54: 103–107.  
(4) Klinefelter, G.R. et al., (1991). The Method of Sperm Collec ­
tion Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat.  
Reproductive Toxicology  5: 39–44.  
(5) Seed, J. et al. (1996). Methods for Assessing Sperm Motility, 
Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report.  Reproductive Toxicology  10(3): 237– 244.
 
(6) Chapin, R.E. et al., (1992). Methods for Assessing Rat Sperm 
Motility.  Reproductive Toxicology  6:267–273.  
(7) Klinefelter, G.R. et al., (1992). Direct Effects of Ethane Dimet ­
hanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an In  
Vitro  Demonstration.  Journal of Andrology  13: 409–421.  
(8) Slott, V.L. et al., (1991). Rat Sperm Motility Analysis: Metho ­
dologic Considerations.  Reproductive Toxicology  5: 449–458.  
(9) Slott, V.L. and Perreault, S.D., (1993). Computer-Assisted 
Sperm Analysis of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility Analyzer. In:  Methods in Toxico ­
logy,  Part A., Academic, Orlando, Florida, pp. 319–333.
 
(10) Toth, G.P. et al. (1989). The Automated Analysis of Rat 
Sperm Motility Following Subchronic Epichlorhydrin Admi ­
nistration: Methodologic and Statistical Considerations. Journal of Andrology 10: 401–415.
 
(11) Working, P.K. and M. Hurtt, (1987). Computerized Videomic ­
rographic Analysis of Rat Sperm Motility. Journal of Andro ­
logy 8: 330–337.  
(12) Linder, R.E. et al., (1992). Endpoints of Spermatoxicity in the 
Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants. Reproductive Toxicology 6: 491–505.
 
(13) Korenbrot, C.C. et al., (1977). Preputial Separation as an 
External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biolo ­
gical Reproduction 17: 298–303.  
(14) Russell, L.D. et al., (1990). Histological and Histopathological 
Evaluation of the Testis, Cache River Press, Clearwater, 
Florida.  
(15) Heindel, J.J. and R.E. Chapin, (eds.) (1993). Part B. Female 
Reproductive Systems, Methods in Toxicology, Academic, 
Orlando, Florida.  
(16) Heindel, J.J. et al., (1989) Histological Assessment of Ovarian 
Follicle Number in Mice As a Screen of Ovarian Toxicity. In: 
Growth Factors and the Ovary, A.N. Hirshfield (ed.), Plenum, 
New York, pp. 421–426.  
(17) Manson, J.M. and Y.J. Kang, (1989). Test Methods for Asses ­
sing Female Reproductive and Developmental Toxicology. In: 
Principles and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), 
Raven, New York.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 524
 
(18) Smith, B.J. et al., (1991). Comparison of Random and Serial 
Sections in Assessment of Ovarian Toxicity. Reproductive 
Toxicology 5:379–383.  
(19) Heindel, J.J. (1999). Oocyte Quantitation and Ovarian Histo ­
logy. In: An Evaluation and Interpretation of Reproductive Endpoints for Human Health Risk Assessment, G. Daston,. 
and C.A. Kimmel, (eds.), ILSI Press, Washington, DC.
 
(20) Thomas, J. A. (1991). Toxic Responses of the Reproductive 
System. In: Casarett and Doull's Toxicology, M.O. Amdur, J. Doull, and C.D. Klaassen (eds.), Pergamon, New York.
 
(21) Zenick, H. and E.D. Clegg, (1989). Assessment of Male 
Reproductive Toxicity: A Risk Assessment Approach. In: Prin ­
ciples and Methods of Toxicology, A.W. Hayes (ed.), Raven Press, New York.
 
(22) Palmer, A.K. (1981). In: Developmental Toxicology, Kimmel, 
C.A. and J. Buelke-Sam (eds.), Raven Press, New York.  
(23) Palmer, A.K. (1978). In Handbook of Teratology, Vol. 4, J.G. 
Wilson and F.C. Fraser (eds.), Plenum Press, New York.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 525
 
B.36.  TOKSYKOKINETYKA  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna z dotycz ącą badań wytyczą 
OECD nr 417 (2010). Badania toksykokinetyki badanej substancji chemicznej prowadzone s ą w celu uzyskania odpowiednich informacji na 
temat wch łaniania, dystrybucji, biotransformacji (tj. metabolizmu) 
i wydalania tej substancji, a tak że aby pomóc w powi ązaniu stężenia lub 
dawki z obserwowan ą toksyczno ścią oraz w zrozumieniu mechanizmu 
toksyczno ści danej substancji. Toksykokinetyka mo że pomóc 
w zrozumieniu bada ń toksykologicznych poprzez wykazanie, że zwierzęta 
doświadczalne s ą systematycznie nara żane na dzia łanie badanej substancji 
chemicznej, oraz ujawnienie kr ążących grup funkcyjnych (macierzystej 
substancji chemicznej/metabolitów). Podstawowe parametry toksykokine ­
tyczne okre ślone na podstawie tych bada ń dostarcz ą również informacji 
na temat potencja łu akumulacji badanej substancji chemicznej w tkankach 
lub narządach oraz potencja łu indukcji biotransformacji w wyniku nara żenia 
na badaną substancj ę chemiczn ą.
 
2. Dane toksykokinetyczne mog ą pomóc w ocenie adekwatno ści i znaczenia 
danych dotycz ących toksyczno ści dla zwierz ąt na potrzeby ekstrapolacji na 
zagrożenie dla ludzi lub oceny ryzyka. Dodatkowo badania toksykokine ­
tyczne mog ą dostarczy ć przydatnych informacji dla celów okre ślenia 
poziomów dawkowania w badaniach toksyczno ści (kinetyka liniowa 
w porównaniu z kinetyk ą nieliniow ą), skutków drogi podania, biodost ęp­
ności oraz zagadnie ń związanych z projektem badania. Okre ślone typy 
danych toksykokinetycznych mo żna wykorzysta ć do opracowania fizjolo ­
gicznego modelu toksykokinetycznego (PBTK).  
3. Istniej ą ważne zastosowania dla danych dotycz ących metabolitów/toksyko ­
kinetyki, takie jak wskazywanie mo żliwej toksyczno ści i charakteru dzia ­ 
łania oraz ich zwi ązku z poziomem dawkowania i drog ą narażenia. Ponadto 
dane dotycz ące metabolizmu mog ą dostarczy ć informacji przydatnych do 
oceny toksykologicznego znaczenia nara żenia na egzogennnie wytwarzane 
metabolity badanej substancji chemicznej.  
4. Wystarczaj ące dane toksykokinetyczne pos łużą jako poparcie dalszej 
dopuszczalno ści i zastosowania ilo ściowych zale żności 
struktura-aktywno ść, podejścia przekrojowego lub podej ścia polegaj ącego 
na grupowaniu w ramach oceny bezpiecze ństwa chemikaliów. Dane kine ­
tyczne mo żna równie ż wykorzysta ć do oceny znaczenia toksykologicznego 
innych bada ń (np.  in vivo /in vitro ). 
5. Niniejsza metoda badawcza ma zastosowanie do podawania badanej 
substancji chemicznej drog ą pokarmow ą, chyba że wymienia si ę inną 
drogę podawania (zob. zw łaszcza pkt 74–78).  
WSTĘPNE ROZWA ŻANIA  
6. W systemach regulacji istniej ą różne wymogi i potrzeby zwi ązane 
z pomiarem punktów ko ńcowych i parametrów zwi ązanych 
z toksykokinetyk ą dla różnych klas substancji chemicznych (np. pestycy ­
dów, produktów biobójczych, chemikaliów przemys łowych). 
W przeciwie ństwie do wi ększości metod badawczych w niniejszej metodzie 
opisano badanie toksykokinetyczne, które obejmuje wiele pomiarów 
i punktów ko ńcowych. W przysz łości może dojść do opracowania kilku 
nowych metod badawczych lub wytycznych, aby opisa ć każdy punkt 
końcowy odr ębnie i w sposób bardziej szczegó łowy. W przypadku niniej ­
szej metody badawczej to, które badania lub oceny s ą przeprowadzane, jest 
określone zgodnie z wymogami lub potrzebami ka żdego systemu regulacji.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. Istnieje wiele bada ń, które mo żna przeprowadzi ć, aby oceni ć zachowanie 
toksykokinetyczne badanej substancji chemicznej dla celów regulacyjnych. 
Niemniej jednak w zale żności od okre ślonych potrzeb regulacyjnych lub 
sytuacji nie wszystkie z tych mo żliwych bada ń mogą być konieczne dla 
oceny badanej substancji chemicznej. Projekt bada ń toksykokionetycznych 
wymaga elastyczno ści i uwzgl ędnienia cech badanej substancji chemicznej 
będących przedmiotem zainteresowania. W niektórych przypadkach 
konieczne mo że być tylko rozpatrzenie okre ślonego zestawu pyta ń, aby 
uwzględnić zagrożenie i ryzyko zwi ązane z badan ą substancj ą chemiczn ą. 
W niektórych sytuacjach dane toksykokinetyczne mo żna zgromadzi ć 
w ramach oceny w innych badaniach toksykologicznych. W innych przy ­
padkach konieczne mog ą być dodatkowe lub bardziej rozleg łe badania 
toksykokinetyczne, zale żnie od potrzeb regulacyjnych lub je żeli w trakcje 
oceny badanej substancji chemicznej pojawi ą się nowe pytania.  
8. Przed przeprowadzeniem badania laboratorium badawcze powinno wzi ąć 
pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji 
chemicznej oraz jej istotnych metabolitów i analogów w celu poprawienia 
jakości badania oraz unikni ęcia niepotrzebnego wykorzystania zwierz ąt. 
Może to obejmowa ć dane pochodz ące z innych w łaściwych metod badaw ­
czych (bada ń in vivo , in vitro  lub ocen  in silico ). Właściwości fizykoche ­
miczne, takie jak: wspó łczynnik podzia łu oktanol/woda (wyra żony jako log 
P OW ), pKa, rozpuszczalno ść w wodzie, pr ężność pary, masa cz ąsteczkowa 
substancji chemicznej, mog ą być przydatne przy planowaniu badania 
i interpretacji wyników. Mo żna je ustali ć za pomoc ą odpowiednich metod 
opisanych w stosownych metodach badawczych.  
OGRANICZENIA  
9. Niniejsza metoda badawcza nie zosta ła opracowana do zastosowania 
w szczególnych okoliczno ściach, takich jak u zwierz ąt ciężarnych lub 
w okresie laktacji oraz u potomstwa, ani do oceny potencjalnych pozosta łości 
u zwierząt narażonych na dzia łanie substancji, od których lub z których 
pozyskuje si ę żywność. Dane uzyskane z badania B.36 mog ą jednak 
zapewnić podstawowe informacje na potrzeby zaprojektowania konkretnych 
badań do takich celów. Niniejsza metoda badawcza nie jest przeznaczona do 
badania nanomateria łów. Sprawozdanie ze wst ępnego przegl ądu wytycznych 
OECD dotycz ących bada ń w zakresie ich zastosowania do nanomateria łów 
wskazuje na to, że TG 417 (równowa żna niniejszej metodzie badawczej B.36) 
może nie mie ć zastosowania do nanomateria łów (1).  
DEFINICJE  
10. Definicje stosowane dla celów niniejszej metody badawczej przedstawiono 
w dodatku.  
TROSKA O DOBROSTAN ZWIERZ ĄT 
11. Wytyczne dotycz ące humanitarnego traktowania zwierz ąt są dostępne 
w wytycznej OECD (GD) nr 19 (2). Zaleca si ę, aby we wszystkich bada ­
niach  in vivo  i in vitro  opisanych w niniejszej metodzie badawczej korzysta ć 
z wytycznej OECD GD nr 19.  
OPIS METOD  
Badania pilota żowe 
12. Zaleca i poleca si ę korzystanie z bada ń pilotażowych na potrzeby wyboru 
parametrów do świadczalnych dla bada ń toksykokinetycznych (np. metabo ­
lizmu, bilansu masy, procedur analitycznych, zakresu dawkowania, wydy ­
chania CO  2 itd.). Opis niektórych z tych parametrów mo że nie wymaga ć 
użycia substancji chemicznych znakowanych izotopowo.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Wybór zwierz ąt 
Gatunek  
13. Gatunek zwierz ęcia (i szczep) wykorzystywany w badaniu toksykokine ­
tycznym powinien by ć taki sam jak gatunek wykorzystany w innych bada ­
niach toksykologicznych przeprowadzonych nad dan ą badaną substancj ą 
chemiczn ą. Zazwyczaj wykorzystywanym gatunkiem powinien by ć szczur, 
gdyż jest to gatunek szeroko wykorzystywany do bada ń toksykologicznych. 
Wykorzystanie innych lub dodatkowych gatunków mo że być uzasadnione, 
jeżeli kluczowe badania toksykologiczne wskazuj ą na oznaki znacznej 
toksyczno ści u tych gatunków lub je żeli wykazano, że ich toksyczno ść/to­
ksykokinetyka ma wi ększe znaczenie dla ludzi. Nale ży podać uzasadnienie 
wyboru gatunku i szczepu zwierz ąt. 
14. O ile nie wspomniano inaczej, w niniejszej metodzie badawczej szczura 
określa się gatunkiem badanym. W celu wykorzystania innych badanych 
gatunków konieczna mo że być modyfikacja pewnych aspektów tej metody.  
Wiek i szczep  
15. Zaleca si ę wykorzystanie zdrowych, m łodych, doros łych zwierz ąt (zazwy­
czaj w wieku 6–12 tygodni w chwili dawkowania; zob. te ż pkt 13 i 14). 
W przypadku wykorzystywania zwierz ąt innych ni ż młode doros łe osobniki 
należy podać uzasadnienie. Na pocz ątku badania wszystkie zwierz ęta 
powinny by ć w podobnym wieku. Odchylenie masy poszczególnych 
zwierząt nie powinno przekracza ć ± 20 % średniej masy badanej grupy. 
Najlepiej by łoby, gdyby wykorzystywany szczep by ł taki sam jak szczep 
wykorzystany do otrzymania bazy danych toksykologicznych dotycz ących 
badanej substancji chemicznej.  
Liczba i p łeć zwierząt 
16. Dla ka żdej zbadanej dawki nale ży wykorzysta ć przynajmniej cztery zwie ­
rzęta jednej p łci. Płeć wykorzystanych zwierz ąt należy uzasadni ć. Należy 
rozważyć wykorzystanie obu p łci (czterech samców i czterech samic), je żeli 
istnieją dowody potwierdzaj ące znaczne ró żnice w toksyczno ści związane 
z płcią. 
Warunki przetrzymywania i karmienia  
17. W okresie badania zwierz ęta na ogó ł należy przetrzymywa ć oddzielnie. 
Przetrzymywanie w grupach mo że być uzasadnione w szczególnych 
okoliczno ściach. Oświetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 h światła, 
12 h ciemno ści. Temperatura w pomieszczeniach dla zwierz ąt doświadczal­
nych powinna wynosi ć 22 °C (± 3 °C), a wzgl ędna wilgotno ść 30–70 %. 
Do karmienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze laboratoryjne 
z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.  
Badana substancja chemiczna  
18. Znakowana izotopowo badana substancja chemiczna z wykorzystaniem 
węgla 14 C powinna by ć stosowana we wszystkich aspektach badania 
związanych z bilansem masy i identyfikacj ą metabolitów; je żeli jednak 
można wykaza ć, że: 
— bilans masy i identyfikacj ę metabolitów mo żna odpowiednio oceni ć za 
pomocą badanej substancji chemicznej nieznakowanej izotopowo,  
— swoisto ść i czu łość analityczna metody stosowanej wraz 
z niepromieniotwórcz ą badaną substancj ą chemiczn ą są równe tym, 
które można uzyska ć przy użyciu badanej substancji chemicznej znako ­
wanej izotopowo, lub wy ższe, ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
wówczas nie trzeba stosowa ć znakowanej izotopowo badanej substancji 
chemicznej. Ponadto mo żna stosowa ć inne promieniotwórcze stabilne 
izotopy, w szczególno ści jeśli dany pierwiastek w ca łości lub cz ęściowo 
odpowiada za toksyczno ść badanej substancji chemicznej. Je żeli to możliwe, 
znakowanie izotopowe powinno znajdowa ć się w centralnej cz ęści 
cząsteczki, która jest metabolicznie stabilna (nie podlega wymianie, nie 
jest usuwana metabolicznie jako CO  2 i nie staje si ę częścią puli fragmentów 
jednowęglowych organizmu). Znakowanie wielu miejsc lub okre ślonych 
regionów cz ąsteczki mo że być niezbędne do śledzenia przebiegu metabo ­
lizmu badanej substancji chemicznej.  
19. Znakowane i nieznakowane izotopowo badane substancje chemiczne nale ży 
analizowa ć za pomoc ą odpowiednich metod, aby okre ślić czystość 
i tożsamość. Czystość radiochemiczna badanej promieniotwórczej substancji 
chemicznej powinna by ć możliwie najwy ższa z mo żliwych dla danej 
substancji (w idealnych warunkach powinna by ć wyższa niż 95 %). Nale ży 
dołożyć rozsądnych stara ń, aby zidentyfikowa ć zanieczyszczenia obecne na 
poziomie 2 % lub wy ższym. Nale ży podać czystość wraz z to żsamością 
i odsetkiem wszelkich zidentyfikowanych zanieczyszcze ń. 
W poszczególnych programach regulacji przewidziane mo że być zapew­
nienie dodatkowych wytycznych pomocnych w definiowaniu i specyfikacji badanych substancji chemicznych z łożonych z mieszanin, a tak że metod 
ustalania czysto ści.
 
Wybór dawki  
Badanie pilota żowe 
20. Zazwyczaj do badania pilota żowego wystarczy pojedyncza dawka doustna. 
Dawka ta powinna by ć nietoksyczna, lecz wystarczaj ąco wysoka, aby umo ż­
liwić identyfikacj ę metabolitów w wydalinach (i w stosownych przypadkach 
w osoczu), jak równie ż spełniać określony cel badania pilota żowego, 
o którym mowa w pkt 12 niniejszej metody badawczej.  
Badania g łówne  
21. W przypadku bada ń głównych preferowane s ą co najmniej dwie dawki, 
ponieważ informacje zebrane z przynajmniej dwóch grup otrzymuj ących 
dawki mog ą pomóc w okre śleniu dawek w innych badaniach toksyczno ści 
oraz pomóc w ocenie dawka-odpowied ź w ramach ju ż dostępnych bada ń 
toksyczno ści. 
22. W przypadku podawania dwóch dawek obie dawki powinny by ć wystar­
czająco wysokie, aby umo żliwić identyfikacj ę metabolitów w wydalinach (i 
w stosownych przypadkach w osoczu). Przy wyborze dawki nale ży 
uwzględnić informacje pochodz ące z dost ępnych danych dotycz ących 
toksyczno ści. Jeżeli informacje takie nie s ą dostępne (np. pochodz ące 
z badań toksyczno ści ostrej doustnej, w których odnotowano kliniczne 
oznaki toksyczno ści, lub z bada ń toksyczno ści wywo łanej powtarzanym 
dawkowaniem), mo żna rozwa żyć taką wartość wyższej dawki, która jest 
niższa od szacowanej warto ści LD  50 (droga doustna i droga dermalna) lub 
LC 50 (droga inhalacyjna) lub ni ższa od ni ższej warto ści szacowanego prze ­
działu toksyczno ści ostrej. Ni ższa dawka powinna stanowi ć pewien u łamek 
wyższej dawki.  
23. W przypadku badania wy łącznie jednego poziomu dawkowania najlepiej 
byłoby, gdyby dawka by ła wystarczaj ąco wysoka, aby umo żliwić identyfi­
kację metabolitów w wydalinach (i w stosownych przypadkach w osoczu), 
jednocześnie nie wywo łując widocznej toksyczno ści. Jeżeli drugiego 
poziomu dawkowania nie uwzgl ędniono, nale ży to uzasadni ć. 
24. Jeżeli istnieje potrzeba ustalenia skutków dawki dla procesów kinetycznych, 
dwie dawki mog ą być niewystarczaj ące i przynajmniej jedna dawka 
powinna by ć wystarczaj ąco duża, aby nasyci ć te procesy. Je żeli pole pod 
krzywą (AUC) st ężenia w osoczu w czasie mi ędzy dwiema dawkami wyko ­
rzystanymi w badaniu g łównym nie jest liniowe, jest to silna przes łanka, że 
gdzieś pomiędzy tymi dwoma poziomami dawkowania wyst ępuje nasycenie 
jednego procesu kinetycznego lub wi ększej ich liczby.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 529
 
25. W przypadku badanych substancji chemicznych o niskiej toksyczno ści 
należy zastosowa ć maksymaln ą dawkę 1 000 mg/kg masy cia ła (droga 
doustna i droga dermalna; podawanie drog ą inhalacyjn ą - zob. rozdzia ł 
B.2 niniejszego za łącznika; zazwyczaj dawka ta nie przekracza 2 mg/l). 
Okoliczno ści specyficzne dla danej substancji chemicznej mog ą wymaga ć 
zastosowania wi ększej dawki w zale żności od potrzeb regulacyjnych. Wybór 
dawki zawsze nale ży uzasadni ć. 
26. Toksykokinetyka pojedynczej dawki i dane dotycz ące dystrybucji 
w tkankach mog ą być wystarczaj ące do okre ślenia potencja łu akumulacji 
lub trwałości. W pewnych okoliczno ściach potrzebne jednak mo że być 
podanie powtarzane (i) aby w bardziej kompletny sposób zbada ć potencja ł 
akumulacji lub trwa łości bądź zmiany w toksykokinetyce (tj. na przyk ład 
w indukcji i inhibicji enzymatycznej); lub (ii) zgodnie z wymogami maj ą­
cego zastosowanie systemu regulacji. W badaniach z zastosowaniem powta ­
rzanego dawkowania w pewnych okoliczno ściach równie ż konieczne mo że 
być powtarzane podanie du żej dawki, chocia ż zazwyczaj wystarcza powta ­
rzane podanie ma łej dawki (zob. tak że pkt 57).  
Podawanie badanej substancji chemicznej  
27. Badan ą substancj ę chemiczn ą należy rozpuścić lub sporz ądzić jednorodn ą 
zawiesinę w tym samym no śniku, który wykorzystano w innych badaniach 
toksyczno ści doustnej dotycz ących podawania danej badanej substancji 
chemicznej za pomoc ą sondy, je żeli takie informacje na temat no śnika są 
dostępne. Nale ży przedstawi ć uzasadnienie wyboru no śnika. Wybór no śnika 
i objętość dawki nale ży uwzględnić w projekcie badania. Zwyczajow ą 
metodą podawania jest podawanie przez sond ę, jednak podawanie substancji 
w kapsu łkach żelatynowych lub zmieszanej z pokarmem mo że być 
w określonych sytuacji korzystniejsze (w obu przypadkach nale ży przed­
stawić uzasadnienie). Nale ży zapewni ć weryfikacj ę rzeczywistej dawki 
podanej ka żdemu zwierz ęciu. 
28. Maksymalna obj ętość cieczy, jak ą można podać jednorazowo za pomoc ą 
sondy, zale ży od wielko ści badanego zwierz ęcia, rodzaju no śnika oraz 
tego, czy przed podaniem badanej substancji chemicznej wstrzymuje si ę 
podawanie pokarmu. Nale ży przedstawi ć uzasadnienie podawania lub ogra ­
niczenia podawania pokarmu przed podaniem dawki. Zwykle obj ętość 
powinna by ć utrzymywana na mo żliwie niskim poziomie, jaki jest prak ­
tyczny dla no śników wodnych lub bezwodnych. Obj ętość dawki zazwyczaj 
nie powinna przekracza ć 10 ml/kg masy cia ła w przypadku gryzoni. Obj ę­
tość nośników stosowanych w przypadku bardziej lipofilnych badanych 
substancji chemicznych mo że rozpoczyna ć się od 4 ml/kg masy cia ła. 
W odniesieniu do powtarzanego dawkowania, gdzie codzienne wstrzymy ­
wanie podawania pokarmu by łoby niewskazane, nale ży rozważyć mniejszą 
objętość dawki (np. 2-4 ml/kg masy cia ła). W miar ę możliwości można 
rozważyć zastosowanie obj ętości dawki zgodnej z dawk ą badanej substancji 
chemicznej podawan ą drogą pokarmow ą przez sond ę w ramach innych 
badań. 
29. Podawanie do żylne badanej substancji chemicznej i pomiar tej substancji we 
krwi lub w wydalinach mo żna wykorzysta ć do ustalenia biodost ępności lub 
względnego wch łaniania po podaniu doustnym. W przypadku badania po 
podaniu do żylnym podaje si ę pojedyncz ą dawkę (zwykle odpowiadaj ącą 
mniejszej dawce podawanej drog ą doustną, lecz jej nieprzekraczaj ącej – 
zob. wybór dawki) badanej substancji chemicznej z zastosowaniem odpo ­
wiedniego no śnika. Materia ł ten należy podawa ć w odpowiedniej obj ętości 
(np. 1 ml/kg masy cia ła) w wybranym miejscu podania co najmniej czterem 
zwierzętom odpowiedniej p łci (jeśli jest to uzasadnione, mo żna wykorzysta ć 
obie płci, zob. pkt 16). W przypadku do żylnego podania badanej substancji 
chemicznej konieczne jest przygotowanie w pe łni rozpuszczonej dawki lub 
zawiesiny. No śnik dla podania do żylnego nie powinien zak łócać integral­
ności ani przep ływu krwi. Je śli badana substancja chemiczna podawana jest  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
we wlewie, szybko ść wlewu powinna by ć podana i ujednolicona pomi ędzy 
zwierzętami, pod warunkiem że stosowana jest pompa infuzyjna. Nale ży 
zastosowa ć znieczulenie w przypadku wprowadzania kaniuli do żyły szyjnej 
(w celu podania badanej substancji chemicznej lub pobrania krwi) lub je żeli 
do podania wykorzystuje si ę tętnicę udową. Należy rozważyć rodzaj znie ­
czulenia, poniewa ż może mieć on wpływ na toksykokinetyk ę. Przed poda ­
niem badanej substancji chemicznej wraz z no śnikiem zwierz ętom należy 
umożliwić odpowiedni ą regeneracj ę. 
30. W przypadku konkretnych badanych substancji chemicznych zastosowanie 
mogą mieć inne drogi podania, takie jak droga dermalna i inhalacyjna (zob. 
pkt 74-78), bior ąc pod uwag ę cechy fizykochemiczne tych substancji 
i spodziewane zastosowanie przez cz łowieka lub nara żenie ludzi.  
Pomiary  
Bilans masy  
31. Bilans masy okre śla się poprzez zsumowanie odsetka podanej (promienio ­
twórczej) dawki wydalonej w moczu, kale i wydychanym powietrzu oraz 
odsetka obecnego w tkankach, reszcie cia ła i materiale wyp łukanym z klatki 
(zob. pkt 46). Na ogó ł całkowity odzysk podanej badanej substancji 
chemicznej (promieniotwórczej) rz ędu > 90 % uwa ża się za wystarczaj ący. 
Wchłanianie  
32. Wstępne oszacowanie absorpcji mo żna uzyska ć poprzez wy łączenie odsetka 
dawki w przewodzie pokarmowym lub w kale z pomiaru bilansu masy. 
Obliczanie odsetka wch łaniania – zob. pkt 33. Badanie wydalin – zob. 
pkt 44–49. Je żeli dokładnego stopnia wch łaniania po podaniu dawki 
drogą doustną nie można określić na podstawie bada ń bilansu masy (np. 
jeżeli więcej niż 20 % podanej dawki wyst ępuje w kale), konieczne mog ą 
być dalsze badania. Badania te mog ą obejmowa ć albo 1) podanie badanej 
substancji chemicznej drog ą doustną i pomiar tej substancji w żółci; albo 2) 
podanie badanej substancji chemicznej drog ą doustną i dożylną oraz pomiar 
badanej substancji chemicznej netto w moczu, wydychanym powietrzu 
i ciele dla ka żdej z obu tych dróg podania. W obu projektach badania 
pomiar promieniotwórczo ści wykonuje si ę jako zast ępczą metodę swoistej 
analizy chemicznej badanej substancji chemicznej i metabolitów.  
33. W przypadku przeprowadzania badania wydalania z żółcią zazwyczaj 
stosuje się doustną drogę podawania. W badaniu tym wprowadza si ę kaniulę 
do przewodów żółciowych co najmniej czterech zwierz ąt odpowiedniej p łci 
(lub w uzasadnionych przypadkach obu p łci) i podaje pojedyncz ą dawkę 
badanej substancji chemicznej. Po podaniu tej substancji wydalanie promie ­
niotwórczo ści/badanej substancji chemicznej w żółci należy monitorowa ć 
tak długo, jak b ędzie to konieczne do oszacowania odsetka podanej dawki, 
która jest wydalana t ą drogą, co można wykorzysta ć do bezpo średniego 
obliczenia stopnia wch łaniania po podaniu doustnym w nast ępujący sposób:  
Wartość procentowa wch łaniania ¼ ðilość wżúłci þ moczu þ wydychanym powietrzu  
þ ciele bez zawarto ści przewodu pokarmowego Þ= 
podana ilo ść Ü 100 
34. W przypadku niektórych klas badanych substancji chemicznych mo że 
wystąpić bezpośrednie wydzielanie wch łoniętej dawki przez b łony jelitowe. 
W takiej sytuacji pomiaru % dawki w kale po doustnym podaniu dawki 
kaniulą wprowadzon ą w drogi żółciowe szczura nie uwa ża się za warto ść 
reprezentatywn ą dla niewch łoniętej dawki. Zaleca si ę, aby w przypadkach, 
w których s ądzi się, że zachodzi wydzielanie jelitowe, % wch łoniętej dawki 
opierał się na wchłanianiu obliczonym poprzez porównanie wydalania po 
podaniu dawki drog ą doustną i drogą dożylną (szczur nienaruszony lub 
z kaniulą wprowadzon ą w drogi żółciowe) (zob. pkt 35). Zaleca si ę również, 
aby w przypadku, gdy oznaczanie ilo ściowe wydzielania jelitowego uwa ża 
się za konieczne, mierzone by ły wydaliny u szczura z kaniul ą wprowadzon ą 
w drogi żółciowe po podaniu dawki drog ą dożylną. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 531
 
Biodostępność 
35. Biodost ępność można okre ślić na podstawie kinetyki osocza/krwi 
w odniesieniu do grup, które dan ą substancj ę otrzymuj ą drogą doustną 
i dożylną, jak opisano w pkt 50-52, poprzez specyficzn ą analizę chemiczn ą 
badanej substancji lub istotnych metabolitów, a tym samym nie wymaga to 
stosowania badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo. Biodostępność (F) badanej substancji chemicznej lub istotnych metabolitów 
można zatem obliczy ć w następujący sposób:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðdawka  IV=dawka  exp Þ 
gdzie AUC jest polem pod krzyw ą stężenia w osoczu w czasie, a exp jest 
doświadczaln ą drogą podania (doustn ą, dermaln ą lub inhalacyjn ą). 
36. Dla celów zastosowania w ocenie ryzyka skutków ogólnoustrojowych 
biodostępność składnika toksycznego jest na ogó ł preferowana nad odsetek 
wchłaniania, gdy porównuje si ę stężenia ogólnoustrojowe pochodz ące 
z badań na zwierz ętach z analogicznymi danymi z biomonitoringu uzyska ­
nymi z bada ń narażenia pracowników. Sytuacja mo że stać się bardziej 
złożona, jeżeli dawki znajduj ą się w zakresie nieliniowym, dlatego wa żne 
jest, aby w przesiewowych badaniach toksykokinetycznych dawki okre ślać 
w zakresie liniowym.  
Dystrybucja w tkankach  
37. Wiedza o dystrybucji badanej substancji chemicznej lub jej metabolitów 
w tkankach jest wa żna dla identyfikacji tkanek docelowych, a tak że dla 
zrozumienia podstawowych mechanizmów toksyczno ści oraz dla uzyskania 
informacji dotycz ących potencja łu akumulacji i trwa łości badanej substancji 
chemicznej i metabolitów. Odsetek ca łkowitej (promieniotwórczej) dawki 
w tkankach i w reszcie cia ła należy zbadać przynajmniej na zako ńczenie 
doświadczenia zwi ązanego z wydalaniem (tzn. zazwyczaj do 7 dni po 
podaniu dawki lub wcze śniej, w zale żności od zachowania badanej 
substancji chemicznej). W przypadku niewykrycia badanej substancji 
chemicznej w tkankach w chwili zako ńczenia badania (np. poniewa ż 
z powodu krótkiego okresu pó łtrwania badana substancja mog ła zostać 
usunięta przed zako ńczeniem badania) nale ży zachowa ć ostrożność, aby 
zapobiec b łędnej interpretacji danych. W tego typu sytuacji dystrybucj ę 
w tkankach nale ży zbadać w chwili, gdy st ężenie badanej substancji 
chemicznej (lub metabolitu) osi ąga odpowiednio szczytowe st ężenie 
w krwi/osoczu (T  max ) lub szczytowy poziom wydzielania z moczem (zob. 
pkt 38). Ponadto pobieranie tkanek w dodatkowych punktach czasowych może być konieczne dla okre ślenia dystrybucji badanej substancji 
chemicznej lub jej metabolitów w tkankach, ocenienia (w stosownych przy ­
padkach) zale żności od czasu, pomocniczo dla okre ślenia bilansu masy lub 
wymagane przez w łaściwy organ. Do tkanek, które nale ży pobrać, należą: 
wątroba, tłuszcz, przewód pokarmowy, nerka, śledziona, krew pe łna, reszta 
ciała, tkanki organu docelowego i wszelkie inne tkanki (np. tarczyca, eryt ­
rocyty, organy rozrodcze, skóra, oko (szczególnie u zwierz ąt zabarwionych)) 
mające potencjalne znaczenie przy toksykologicznej ocenie badanej 
substancji chemicznej. Nale ży rozwa żyć analizę dodatkowych tkanek 
w tych samych punktach czasowych, aby zmaksymalizowa ć wykorzystanie 
zwierząt, i w przypadku gdy toksyczno ść dla organu docelowego obserwuje 
się w badaniach toksyczno ści podprzewlek łej lub przewlek łej. Należy 
również podać stężenie rezydualne (promieniotwórczo ść) i wspó łczynniki 
podziału tkanki/osocze (krew).
 
38. Ocena dystrybucji w tkankach w dodatkowych punktach czasowych, takich 
jak moment szczytowego st ężenia w osoczu/krwi (np. T  max ) lub szczyto ­
wego poziomu wydzielania z moczem, uzyskana z odpowiednich bada ń 
kinetyki osocza/krwi lub wydalin, równie ż może być potrzebna lub wyma ­
gana przez w łaściwy organ. Informacje te mog ą być przydatne dla zrozu ­
mienia toksyczno ści oraz potencja łu akumulacji i trwa łości badanej 
substancji chemicznej i metabolitów. Nale ży podać uzasadnienie wyboru 
próbek; próbki do analizy na ogó ł powinny by ć takie same, jak okre ślone 
powyżej (zob. pkt 37).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 532
 
39. Oznaczanie ilo ściowe promieniotwórczo ści na potrzeby bada ń dystrybucji 
w tkankach mo żna przeprowadzi ć poprzez wyci ęcie organów, ich homoge ­
nizację, spalenie lub rozpuszczenie, a nast ępnie poddanie uwi ęzionych 
pozostałości analizie za pomoc ą scyntylacyjnego licznika cieczowego. 
Pewne techniki, obecnie znajduj ące się na różnych etapach rozwoju, np. 
ilościowa autoradiografia ca łego ciała i mikroskopowa autoradiografia 
receptorów, mog ą okazać się przydatne przy okre ślaniu dystrybucji badanej 
substancji chemicznej w organach lub tkankach (3) (4).  
40. W przypadku dróg nara żenia innych ni ż droga doustna nale ży pobrać 
i przeanalizowa ć określone tkanki, takie jak p łuca – w badaniach inhalacyj ­
nych lub skóra – w badaniach z zastosowaniem dermalnej drogi podania. Zob. pkt 74–78.
 
Metabolizm  
41. Wydaliny (i w stosownych przypadkach osocze) nale ży zbierać w celu 
identyfikacji i pomiaru ilo ściowego niezmienionej badanej substancji 
chemicznej i metabolitów zgodnie z opisem w pkt 44–49. Dopuszczalne jest łączenie wydalin, aby u łatwić identyfikacj ę metabolitu w danej grupie 
otrzymującej dawkę. Zalecane jest profilowanie metabolitów pochodz ących 
z każdego okresu. Je żeli uniemo żliwia to brak próbki lub promieniotwór ­
czość, dopuszczalne jest jednak łączenie moczu i ka łu z kilku punktów 
czasowych, lecz niedopuszczalne jest łączenie wydalin z grup ró żnej płci 
lub otrzymuj ących odmienne dawki. W celu zbadania moczu, ka łu, pozos­
tałości promieniotwórczo ści u zwierz ąt poddanych dzia łaniu substancji i w 
stosownych przypadkach żółci należy wykorzysta ć odpowiednie metody 
ilościowe i jako ściowe.
 
42. Nale ży dołożyć rozsądnych stara ń, aby zidentyfikowa ć wszystkie metabolity 
obecne na poziomie 5 % podanej dawki lub wy ższym oraz okre ślić układ 
metaboliczny badanej substancji chemicznej. Badan ą substancj ę chemiczn ą, 
którą scharakteryzowano w wydalinach jako stanowi ącą co najmniej 5 % 
podanej dawki, nale ży zidentyfikowa ć. Identyfikacja odnosi si ę do dokład­
nego strukturalnego okre ślenia składników. Zazwyczaj identyfikacji towa ­
rzyszy albo chromatografia równoleg ła metabolitu o znanych standardach 
z zastosowaniem dwóch odmiennych uk ładów, albo techniki umo żliwiające 
pozytywn ą identyfikacj ę strukturaln ą, takie jak spektrometria masowa, spek ­
troskopia magnetycznego rezonansu j ądrowego (NMR) itd. W przypadku 
chromatografii równoleg łej technik chromatograficznych wykorzystuj ących 
tę samą fazę stacjonarn ą przy dwóch ró żnych układach rozpuszczalników 
nie uważa się za odpowiedni ą weryfikacj ę tożsamości metabolitu za pomoc ą 
dwóch metod, poniewa ż metody te nie s ą niezależne. Identyfikacj ę poprzez 
chromatografi ę równoleg łą należy przeprowadzi ć z zastosowaniem dwóch 
odmiennych, niezale żnych analitycznie uk ładów, takich jak chromatografia 
cienkowarstwowa w normalnym i odwróconym uk ładzie faz (TLC) 
i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). O ile rozdzielanie chro ­
matograficzne charakteryzuje si ę wystarczaj ącą jakością, dodatkowe 
potwierdzenie za pomoc ą metod spektroskopowych nie jest potrzebne. 
Ewentualnie jednoznaczn ą identyfikacj ę można równie ż uzyskać, korzys­
tając z metod dostarczaj ących informacje strukturalne, takich jak: chromato ­
grafia cieczowa/spektometria masowa (LC-MS) lub chromatografia cieczo ­
wa/tandemowa spektometria masowa (LC-MS/MS), chromatografia gazowa/ 
spektometria masowa (GC-MS) oraz spektometria NMR.  
43. Jeżeli identyfikacja metabolitów obecnych na poziomie 5 % podanej dawki 
lub wyższym jest niemo żliwa, w sprawozdaniu ko ńcowym nale ży przed­
stawić uzasadnienie/wyja śnienie. Aby uzyska ć lepsze zrozumienie szlaku 
metabolicznego na potrzeby oceny zagro żenia lub ryzyka zwi ązanego 
z badaną substancj ą chemiczn ą, właściwa może być identyfikacja metabo ­
litów stanowi ących mniej ni ż 5 % podanej dawki. W miar ę możliwości 
należy podać potwierdzenie strukturalne. Mo że ono obejmowa ć profilowanie 
w osoczu, krwi lub innych tkankach.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 533
 
Wydalanie  
44. Szybko ść i stopień wydalania podanej dawki nale ży określić poprzez pomiar 
odsetka odzyskanej (promieniotwórczej) dawki z moczu, ka łu 
i wydychanego powietrza. Dane te pomog ą również w określeniu bilansu 
masy. Ilo ści badanej substancji chemicznej (promieniotwórczo ści) wydalonej 
w moczu, kale i wydychanym powietrzu nale ży określać w odpowiednich 
odstępach czasowych (zob. pkt 47–49). Do świadczenia z powtarzanym 
dawkowaniem nale ży odpowiednio zaprojektowa ć, aby umo żliwić zbieranie 
danych dotycz ących wydalin w celu zrealizowania celów opisanych w pkt 
26. Umożliwi to porównanie z do świadczeniami z pojedyncz ą dawką. 
45. Jeżeli badanie pilota żowe wykaza ło, że w wydychanym powietrzu nie jest 
wydalana istotna ilo ść badanej substancji chemicznej (promieniotwórczo ści) 
(zgodnie z pkt 49), wówczas w ostatecznym badaniu wydychane powietrze nie musi by ć gromadzone.
 
46. Każde zwierze nale ży umieścić w oddzielnej jednostce metabolicznej w celu 
zebrania wydalin (moczu, ka łu i wydychanego powietrza). Na koniec 
każdego okresu zbierania (zob. pkt 47–49) jednostk ę metaboliczn ą należy 
spłukać odpowiednim rozpuszczalnikiem (tzw. „materia ł wypłukany 
z klatki”), aby zapewni ć maksimum odzysku badanej substancji chemicznej 
(promieniotwórczo ści). Zbieranie wydalin nale ży zakończyć 7 dnia lub po 
odzyskaniu co najmniej 90 % podanej dawki, w zale żności od tego, co 
nastąpi wcześniej. 
47. Całkowitą ilość badanej substancji chemicznej (promieniotwórczo ści) 
w moczu nale ży określić dla przynajmniej dwóch punktów czasowych 
w pierwszym dniu zbierania, z czego jeden punkt powinien mie ć miejsce 
24 godziny po podaniu dawki, a nast ępnie każdego dnia a ż do zakończenia 
badania. Zach ęca się wybranie wi ęcej niż dwóch punktów zbierania moczu 
w pierwszym dniu (np. po 6, 12 i 24 godzinach). Nale ży przeanalizowa ć 
wyniki bada ń pilotażowych, aby uzyska ć informacje dotycz ące innych lub 
dodatkowych punktów czasowych w odniesieniu do zbierania moczu. Należy podać uzasadnienie harmonogramu zbierania.
 
48. Całkowitą ilość badanej substancji chemicznej (promieniotwórczo ści) w kale 
należy określać codziennie, pocz ąwszy od 24 godzin od podania dawki a ż 
do zakończenia badania, chyba że badania pilota żowe wskazuj ą na inne lub 
dodatkowe punkty czasowe w odniesieniu do zbierania ka łu. Należy podać 
uzasadnienie innego harmonogramu zbierania ka łu. 
49. Gromadzenie wydychanego CO  2 i innych lotnych materia łów można prze­
rwać w danym do świadczeniu badawczym, je żeli w wydychanym powietrzu 
wykryto mniej ni ż 1 % podanej dawki w okresie zbierania powietrza 
wynoszącym 24 godziny.  
Badania przebiegu w czasie  
Kinetyka osocza/krwi  
50. Celem tych bada ń jest uzyskanie szacunków dotycz ących podstawowych 
parametrów toksykokinetycznych [np. C  max , T max , okres pó łtrwania (t  1/2 ), 
pole pod krzyw ą] w odniesieniu do badanej substancji chemicznej. Badania 
te można przeprowadza ć w ramach jednej dawki lub – co bardziej prawdo ­
podobne – przy co najmniej dwóch dawkach. Dawk ę należy określić 
zgodnie z charakterem do świadczenia lub zagadnieniem, którego ono doty ­
czy. Dane dotycz ące kinetyki mog ą być potrzebne w odniesieniu do takich 
kwestii, jak biodost ępność badanej substancji chemicznej, lub dla celów 
wyjaśnienia skutków dawki dla klirensu (np. czy klirens jest nasycony 
w sposób zale żny od dawki).  
51. Na potrzeby tych bada ń w każdej grupie otrzymuj ącej dawk ę powinny 
znaleźć się co najmniej cztery zwierz ęta jednej p łci. Płeć wykorzystanych 
zwierząt należy uzasadni ć. Należy rozważyć wykorzystanie obu p łci (czte­
rech samców i czterech samic), je żeli istniej ą dowody potwierdzaj ące 
znaczne ró żnice w toksyczno ści związane z płcią. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 534
 
52. Po podaniu badanej substancji chemicznej (znakowanej izotopowo) nale ży 
pobrać próbki krwi od ka żdego zwierz ęcia w odpowiednich punktach czaso ­
wych za pomoc ą odpowiedniej metody pobierania próbek. Rozmiar i liczba 
próbek krwi, które mo żna uzyska ć od pojedynczego zwierz ęcia, mogą być 
ograniczone potencjalnymi skutkami powtarzanego pobierania próbek na 
zdrowie/fizjologi ę zwierzęcia lub czu łością metody analitycznej. Próbki 
należy poddać analizie w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia. W pewnych 
okoliczno ściach (np. przy charakterystyce metabolitu) konieczne mo że się 
okazać łączenie próbek pochodz ących od wi ęcej niż jednego zwierz ęcia. 
Próbki zbiorcze nale ży wyraźnie zidentyfikowa ć i poda ć wyjaśnienie 
łączenia próbek. W przypadku stosowania badanej substancji chemicznej 
znakowanej izotopowo w łaściwa może być analiza obecnej promieniotwór ­
czości ogółem. W takiej sytuacji promieniotwórczo ść ogółem należy prze­
analizowa ć w krwi pe łnej i osoczu lub w osoczu i krwinkach czerwonych, 
aby umożliwić obliczenie wspó łczynnika podzia łu krew/osocze. W innych 
okoliczno ściach konieczne mo że być bardziej szczegó łowe badanie wyma ­
gające identyfikacji zwi ązku macierzystego lub metabolitów b ądź oceny 
wiązań białkowych.  
Kinetyka innych tkanek  
53. Celem tych bada ń jest uzyskanie informacji na temat przebiegu w czasie, 
aby odpowiedzie ć na pytania zwi ązane z takimi kwestiami, jak: charakter 
działania toksycznego, bioakumulacja lub biotrwa łość, poprzez okre ślenie 
poziomów badanej substancji chemicznej w ró żnych tkankach. Wybór 
tkanek i liczba ocenianych punktów czasowych b ędą zależeć od kwestii, 
którą należy zbadać, i od bazy danych toksykologicznych dotycz ących 
badanej substancji chemicznej. W projekcie tych dodatkowych bada ń kine­
tyki tkanek nale ży uwzględnić informacje zgromadzone zgodnie z opisem 
zawartym w pkt 37–40. Badania te mog ą obejmowa ć dawkowanie jednora ­
zowe lub powtarzane. Nale ży przedstawi ć szczegółowe uzasadnienie zasto ­
sowanego podej ścia. 
54. Powody przeprowadzania bada ń kinetycznych innych tkanek mog ą obejmo­
wać: 
— dowody na wyd łużony okres pó łtrwania w krwi, co wskazuje na mo żli­
wość akumulacji badanej substancji chemicznej w ró żnych tkankach, lub  
— chęć sprawdzenia, czy w okre ślonych tkankach osi ągnięto poziom 
w stanie ustalonym (np. w badaniach z powtarzanym dawkowaniem, 
nawet jeżeli mogło dojść do widocznego osi ągnięcia poziomu st ężenia 
badanej substancji chemicznej we krwi w stanie ustalonym, mo że 
potrzebne by ć upewnienie si ę, że stan ustalony zosta ł osiągnięty równie ż 
w tkankach docelowych).  
55. W przypadku tego rodzaju bada ń przebiegu w czasie odpowiedni ą dawkę 
badanej substancji chemicznej nale ży podać drogą doustną co najmniej 
czterem zwierz ętom na dawk ę w ka żdym punkcie czasowym 
i monitorowa ć w wybranych tkankach przebieg dystrybucji w czasie. 
Można wykorzysta ć tylko jedn ą płeć, chyba że zaobserwowano toksyczno ść 
zależną od płci. To, czy analiza obejmie promieniotwórczo ść ogółem, czy 
substancję macierzyst ą lub metabolity, b ędzie też zależało od kwestii, której 
badanie dotyczy. Ocen ę dystrybucji w tkance nale ży przeprowadzi ć za 
pomocą odpowiednich technik.  
Indukcja/inhibicja enzymatyczna  
56. Badania dotycz ące możliwych skutków indukcji/inhibicji enzymatycznej lub 
biotransformacji badanej substancji chemicznej mog ą być konieczne w co 
najmniej jednym z nast ępujących przypadków:  
1) dostępne dowody wskazuj ą na zale żność pomiędzy biotransformacj ą 
badanej substancji chemicznej a zwi ększoną toksyczno ścią; 
2) dostępne dane dotycz ące toksyczno ści wskazuj ą na nieliniow ą zależność 
pomiędzy dawk ą a metabolizmem;  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) wyniki bada ń dotyczących identyfikacji metabolitów wskazuj ą na iden­
tyfikację potencjalnie toksycznego metabolitu, który móg ł zostać wytwo­
rzony poprzez ścieżkę enzymatyczn ą wywołaną przez badan ą substancj ę 
chemiczn ą; 
4) w odniesieniu do wyja śnienia skutków, co do których zak łada się, że są 
związane ze zjawiskiem indukcji enzymatycznej;  
5) jeżeli w profilu metabolicznym badanej substancji zaobserwowano 
zmiany istotne pod wzgl ędem toksykologicznym w ramach do świadczeń 
in vitro  lub in vivo  prowadzonych na innych gatunkach lub w innych 
warunkach, konieczne mo że być scharakteryzowanie zaanga żowanych 
enzymów (np. enzymy fazy I, takie jak izoenzymy uk ładu monooksy ­
genaz zale żnych od cytochromu P450, enzymy fazy II, takie jak izoen ­
zymy siarkotransferazy lub transferaza urydynodifosfoglukuronowa b ądź 
wszelkie inne istotne enzymy). Informacje te mo żna wykorzysta ć do 
oceny zasadno ści wykorzystania danego gatunku w ekstrapolacji gatun ­
kowej.  
57. Nale ży zastosowa ć odpowiednie protoko ły badania s łużące do oceny zmian 
w toksykokinetyce zwi ązanych z badan ą substancj ą chemiczn ą, poddane 
stosownej walidacji i uzasadnione. Przyk ładowy projekt badania obejmuje 
powtarzane podawanie badanej substancji chemicznej nieznakowanej izoto ­
powo, nast ępnie podanie w 14. dniu pojedynczej dawki znakowanej izoto ­
powo lub powtarzane podawanie badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo i pobieranie próbek w 1., 7. i 14. dniu w celu okre ślenia profilów 
metabolitów. Powtarzane podawanie badanej substancji chemicznej znako ­
wanej izotopowo mo że również dostarczy ć informacji na temat bioakumu ­
lacji (zob. pkt 26).
 
METODY UZUPE ŁNIAJĄCE 
58. Uzupe łniające rodzaje podej ścia wykraczaj ące poza do świadczenia  in vivo  
opisane w niniejszej metodzie badawczej mog ą dostarczy ć przydatnych 
informacji na temat wch łaniania, dystrybucji, metabolizmu i eliminacji 
badanej substancji chemicznej u niektórych gatunków.  
Wykorzystywanie informacji z bada ń in vitro  
59. W badaniach  in vitro  z zastosowaniem odpowiednich uk ładów badawczych 
można rozwa żyć kilka kwestii dotycz ących metabolizmu badanej substancji 
chemicznej. Do badania mo żliwych metabolitów mo żna wykorzystywa ć 
świeżo wyizolowane lub hodowane hepatocyty i frakcje subkomórkowe 
(np. mikrosomy i cytozol lub frakcj ę S9) wątroby. Metabolizm miejscowy 
w organie docelowym, np. w p łucu, może mieć znaczenie dla oceny ryzyka. 
Dla tych celów u żyteczne mog ą być mikrosomalne frakcje tkanek docelo ­
wych. Badania z mikrosomami mog ą być przydatne, je żeli chodzi 
o uwzględnienie potencjalnych ró żnic płci i etapu życia oraz scharakteryzo ­
wanie parametrów enzymatycznych (K  m i V  max ), które mog ą pomóc 
w ocenie zale żności metabolizmu od dawki w odniesieniu do poziomów 
narażenia. Ponadto mikrosomy mog ą być przydatne do identyfikowania 
konkretnych enzymów mikrosomalnych bior ących udzia ł w metabolizmie 
badanej substancji chemicznej, które mog ą być istotne w ekstrapolacji 
gatunkowej (zob. te ż pkt 56). Potencja ł indukcji biotransformacji mo żna 
również badać przy użyciu frakcji subkomórkowych w ątroby (np. mikro ­
somów i cytozolu) zwierz ąt wcześniej poddanych dzia łaniu danej badanej 
substancji chemicznej,  in vitro  poprzez badania indukcji w hepatocytach lub 
z wykorzystaniem okre ślonych linii komórkowych oddaj ących odpowiednie 
enzymy. W pewnych okoliczno ściach i w odpowiednich warunkach mo żna 
wziąć pod uwag ę użycie frakcji subkomórkowych pochodz ących z tkanek 
ludzkich w celu okre ślenia potencjalnych ró żnic między gatunkami pod 
względem biotransformacji. Te wyniki bada ń in vitro  mogą również być 
przydatne do opracowania modeli PBTK (5).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 536
 
60. Badania wch łaniania przez skór ę in vitro  mogą dostarczy ć dodatkowych 
informacji na potrzeby scharakteryzowania wch łaniania (6).  
61. Na potrzeby kwestii podobnych do tych, w których bada si ę mikrosomy 
wątroby, mo żna wykorzystywa ć pierwotne hodowle komórkowe z komórek 
wątroby i płaty świeżej tkanki. W niektórych przypadkach mo żna uzyska ć 
odpowied ź na konkretne pytania przy u życiu linii komórkowych 
o określonej ekspresji odpowiedniego enzymu lub modyfikowanych linii 
komórkowych. W pewnych sytuacjach przydatne mo że być przeanalizo ­
wanie za pomoc ą badań in vitro  zahamowania i indukowania okre ślonych 
izoenzymów cytochromu P450 (np. CYP1A1, 2E1, 1A2 i in.) lub enzymów fazy II przez zwi ązek macierzysty. Uzyskane informacje mog ą być 
użyteczne w odniesieniu do zwi ązków o podobnej strukturze.
 
Wykorzystywanie danych toksykokinetycznych z bada ń toksyczno ści 
jako informacji uzupe łniających  
62. Analiza próbek krwi, tkanek lub wydalin uzyskanych podczas przeprowa ­
dzania wszelkich innych bada ń toksyczno ści może dostarczy ć danych na 
temat biodost ępności, zmian st ężenia w osoczu w czasie (pole pod krzyw ą, 
C max ), potencja łu bioakumulacji, klirensu oraz zmian metabolizmu i kinetyki 
zależnych od p łci lub etapu życia.  
63. Rozwa żania dotycz ące projektu badania mo żna wykorzysta ć, aby odpowie ­
dzieć na pytania odnosz ące się do: nasycenia szlaków wch łaniania, biotran ­
sformacji lub wydalania przy wy ższych poziomach dawkowania; dzia łania 
nowych szlaków metabolicznych przy wi ększych dawkach oraz ograniczenia 
toksycznych metabolitów do wy ższych dawek.  
64. W innych rozwa żaniach zwi ązanych z ocen ą zagrożenia można uwzględniać 
takie kwestie, jak:  
— związana z wiekiem wra żliwość wynikająca z różnic w statusie bariery 
krew-mózg, zdolno ści metabolicznej nerek lub zdolno ściach detoksyka ­
cyjnych,  
— wrażliwość subpopulacji wynikaj ąca z różnic w zdolno ści do biotran ­
sformacji lub innych ró żnic toksykokinetycznych,  
— stopie ń narażenia płodu poprzez transfer przez łożyskowy substancji 
chemicznych lub noworodka poprzez laktacj ę. 
Korzystanie z modelowania toksykokinetycznego  
65. Modele toksykokinetyczne mog ą być przydatne do ró żnych aspektów oceny 
zagrożenia i ryzyka, na przyk ład do przewidzenia nara żenia ogólnoustrojo ­
wego i dawki w odniesieniu do tkanek wewn ętrznych. Ponadto mog ą 
zapewnić odpowiedzi na okre ślone pytania dotycz ące charakteru dzia łania. 
Modele te mog ą stanowić podstawę ekstrapolacji w odniesieniu do gatunku, 
dróg nara żenia i schematów dawkowania oraz podstaw ę oceny ryzyka dla 
ludzi. Dane przydatne do opracowania fizjologicznych modeli toksykokinetycznych (PBTK) dla badanej substancji chemicznej podawanej danemu gatunkowi obejmuj ą 1) wspó łczynniki podzia łu; 2) stałe bioche­
miczne i parametry fizjologiczne; 3) parametry wch łaniania dla poszczegól ­
nych dróg nara żenia; oraz 4) dane kinetyczne  in vivo  do oceny modelu [np. 
parametry klirensu dla odpowiednich (> 10 %) dróg wydalania, K
 m i V max 
dla metabolizmu]. Dane do świadczalne wykorzystane do opracowywania 
modelu nale ży wygenerowa ć za pomoc ą wiarygodnych naukowo metod, 
a wyniki modelu podda ć walidacji. Parametry specyficzne dla badanej 
substancji chemicznej i gatunku, takie jak: wspó łczynniki wch łaniania, 
podział krew-tkanka i sta łe metaboliczne, cz ęsto określa sie w celu 
ułatwienia opracowania modeli nieopartych na przedzia łach lub modeli 
fizjologicznych (7).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 537
 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
66. Zaleca si ę, aby sprawozdanie z badania zawiera ło spis tre ści. 
Treść sprawozdania  
67. Treść sprawozdania powinna obejmowa ć informacje uwzgl ędnione 
w niniejszej metodzie badawczej, które nale ży uporządkować w sekcje 
i punkty w nast ępujący sposób:  
Streszczenie  
68. Ta sekcja sprawozdania z badania powinna zawiera ć streszczenie projektu 
badania i opis zastosowanych metod. Nale ży w niej równie ż podkreślić 
kluczowe wyniki dotycz ące bilansu masy, charakteru i ilo ści metabolitów, 
pozostałości w tkankach, klirensu, potencja łu bioakumulacji, ró żnic związa­
nych z p łcią itd. Streszczenie nale ży przedstawi ć w sposób na tyle szcze ­
gółowy, aby umo żliwić ocenę wyników.  
Wprowadzenie  
69. Ta sekcja sprawozdania powinna obejmowa ć cele badania, jego uzasad ­
nienie i projekt, a tak że odpowiednie źródła i informacje wprowadzaj ące. 
Materiały i metody  
70. Ta sekcja sprawozdania powinna zawiera ć szczegółowy opis wszystkich 
istotnych informacji, w tym:  
a) Badana substancja chemiczna  
Ta podsekcja powinna zawiera ć identyfikacj ę badanej substancji 
chemicznej: nazw ę chemiczn ą, struktur ę molekularn ą, jakościowe 
i ilościowe oznaczenie jej sk ładu chemicznego, czysto ść chemiczn ą i w 
miarę możliwości rodzaj i ilo ści jakichkolwiek zanieczyszcze ń. Powinna 
również obejmowa ć informacje dotycz ące właściwości fizykochemicz ­
nych, w tym stanu skupienia, barwy, ca łkowitej rozpuszczalno ści lub 
współczynnika podzia łu, stabilno ści oraz w stosownych przypadkach 
działania żrącego. W stosownych przypadkach nale ży przedstawi ć infor­
macje na temat izomerów. Je żeli badana substancja chemiczna jest 
znakowana izotopowo, w tej podsekcji nale ży podać następujące infor­
macje: typ nuklidu promieniotwórczego, pozycj ę znacznika, aktywno ść 
właściwą i czystość radiochemiczn ą. 
Należy podać typ lub opis wszelkich no śników, rozpuszczalników, 
nośników zawiesin oraz emulgatorów lub innych materia łów wykorzy ­
stywanych do podawania badanej substancji chemicznej.  
b) Badane zwierz ęta 
Ta podsekcja powinna zawiera ć informacje na temat badanych zwierz ąt, 
w tym dotycz ące wyboru i uzasadnienia wyboru gatunku, szczepu 
i wieku w chwili rozpocz ęcia badania, p łci, jak równie ż masy cia ła, 
stanu zdrowia i hodowli.  
c) Metody  
Ta podsekcja powinna zawiera ć szczegó łowe informacje na temat 
projektu badania i zastosowanej metodyki. Powinna obejmowa ć opis:  
(1) w stosownych przypadkach – uzasadnienia wszelkich zmian drogi 
narażeniu i warunków nara żenia; ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
(2) uzasadnienia wyboru poziomów dawkowania;  
(3) w stosownych przypadkach – opis bada ń pilotażowych wykorzys ­
tanych w uk ładzie doświadczalnym dalszych bada ń. Należy przed­
stawić dane potwierdzaj ące badanie pilota żowe;  
(4) sposobu przygotowywania roztworów dawek oraz rodzaju rozpusz ­
czalnika lub no śnika, jeżeli został użyty; 
(5) liczby grup badanych i liczby zwierz ąt na grup ę; 
(6) poziomów dawkowania i obj ętości dawek (oraz aktywno ści 
właściwej dawki w przypadku zastosowania izotopów promienio ­
twórczych);  
(7) drogi i metody podawania;  
(8) częstotliwości dawkowania;  
(9) okresu wstrzymania podawania pokarmu (je żeli zastosowano);  
(10) promieniotwórczo ści na zwierz ę ogółem; 
(11) post ępowania ze zwierz ętami;  
(12) pobierania próbek i post ępowania z nimi;  
(13) metod analitycznych wykorzystanych w celu oddzielenia, pomiaru 
ilościowego i identyfikacji metabolitów;  
(14) granicy wykrywalno ści w odniesieniu do zastosowanych metod;  
(15) innych zastosowanych pomiarów i procedur do świadczalnych (w 
tym walidacji metod wykorzystanych do analizy metabolitów).  
d) Analiza statystyczna  
Jeżeli do analizy wyników badania zastosowano analiz ę statystyczn ą, 
wówczas sprawozdanie powinno zawiera ć wystarczaj ące informacje 
dotyczące użytych metod analizy i oprogramowania komputerowego, 
tak aby niezale żny recenzent/statystyk móg ł dokonać powtórnej oceny 
i odtworzy ć analizę. 
W przypadku bada ń z wykorzystaniem modeli uk ładów, takich jak fizjo ­
logiczny model toksykokinetyczny (PBTK), prezentacja modeli powinna 
obejmowa ć pełny opis modelu, aby umo żliwić jego niezale żną rekon­
strukcję i walidacj ę (zob. pkt 65 i dodatek: Definicje).  
Wyniki  
71. Wszystkie dane nale ży zestawi ć w formie tabeli z odpowiedni ą oceną staty­
styczną oraz opisa ć w tekście tej sekcji. Dane z pomiarów promieniotwór ­
czości należy streścić i przedstawi ć w formie odpowiedniej dla badania, 
zwykle w ekwiwalentach mikrogramów lub miligramów na mas ę próbki, 
chociaż można zastosowa ć także inne jednostki. Sekcja ta powinna zawiera ć 
ilustracje graficzne wyników, kopi ę reprezentatywnych danych chromatogra ­
ficznych i spektrometrycznych, nazwy/oznaczenie ilo ściowe metabolitów 
oraz proponowane szlaki metaboliczne, w tym struktur ę molekularn ą meta­
bolitów. Ponadto w stosownych przypadkach nale ży zawrze ć w tej sekcji 
następujące informacje:  
(1) ilość i procent odzysku promieniotwórczo ści w moczu, kale, wydy ­
chanym powietrzu oraz w p łynach pozosta łych po myciu klatek 
z moczu i ka łu. 
— w przypadku bada ń z zastosowaniem dermalnej drogi podania 
należy równie ż uwzględnić dane dotycz ące odzysku badanej 
substancji chemicznej ze skóry poddanej dzia łaniu substancji 
i płynów pozosta łych po przemywaniu skóry oraz rezydualnej 
promieniotwórczo ści w skórze, opisuj ąc przy tym urz ądzenie 
i jednostk ę metaboliczn ą, a także wyniki badania przemywania 
skóry. Dalsze omówienie – zob. pkt 74–77,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— w przypadku bada ń z zastosowaniem inhalacyjnej drogi podania 
należy równie ż uwzględnić dane dotycz ące odzysku badanej 
substancji chemicznej z p łuc i tkanek nosa (8). Dalsze omówienie 
– zob. pkt 78;  
(2) dystrybucj ę w tkankach, wyra żoną jako procent podanej dawki 
i stężenia (w ekwiwalentach mikrogramów na gram tkanki), oraz 
proporcje tkanki do krwi lub tkanki do osocza;  
(3) bilans materia łowy opracowany na podstawie ka żdego badania wi ążą­
cego się z testami tkanek cia ła i wydalin;  
(4) stężenie w osoczu i parametry toksykokinetyczne (biodost ępność, pole 
pod krzyw ą, C max , T max , klirens, okres pó łtrwania) po podaniu w łaściwą 
drogą (drogami) nara żenia;  
(5) szybko ść i stopie ń wchłaniania badanej substancji chemicznej po 
podaniu w łaściwą drogą (drogami) nara żenia;  
(6) ilości badanej substancji chemicznej i metabolitów (wyra żone jako 
procent podanej dawki) zebranych w wydalinach;  
(7) odniesienie do danych w za łączeniu, zawieraj ących dane dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt w odniesieniu do wszystkich punktów ko ńco­
wych pomiarów (np. dawkowanie, procent odzysku, st ężenia, parametry 
toksykokinetyczne itp.);  
(8) rysunek, na którym przedstawione s ą proponowane szlaki metaboliczne 
i struktura molekularna metabolitów.  
Omówienie i wnioski  
72. W tej sekcji autor lub autorzy powinni:  
(1) podać proponowany szlak metaboliczny na podstawie wyników meta ­
bolizmu i rozmieszczenia badanej substancji chemicznej;  
(2) omówi ć ewentualne ró żnice między gatunkami i p łciami pod wzgl ędem 
rozmieszczenia lub biotransformacji badanej substancji chemicznej;  
(3) zestawi ć w formie tabeli i omówi ć w stosownych przypadkach rodzaj 
i ilość metabolitów, klirens, potencja ł bioakumulacji oraz poziom pozos ­
tałości związku macierzystego lub metabolitów w tkankach, a tak że 
możliwe zmiany parametrów toksykokinetycznych uwarunkowane 
dawką; 
(4) włączyć do tej sekcji wszelkie istotne dane toksykokinetyczne uzyskane 
w trakcie prowadzenia bada ń toksyczno ści; 
(5) podać zwięzłą konkluzj ę, którą mogą potwierdza ć wyniki badania;  
(6) dodać sekcje (w razie potrzeby lub w stosownych przypadkach).  
73. Dodatkowe sekcje nale ży wykorzysta ć do zamieszczenia potwierdzaj ących 
danych bibliograficznych, tabel, rysunków, dodatków itp.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
ALTERNATYWNE DROGI NARA ŻENIA  
Droga dermalna  
Poddawanie dzia łaniu substancji drog ą dermalną 
74. Niniejsza sekcja zawiera szczegó łowe informacje na temat badania toksyko ­
kinetyki badanej substancji chemicznej podawanej drog ą dermaln ą. 
W odniesieniu do wch łaniania przez skór ę należy zapozna ć się 
z rozdzia łem B.44 niniejszego za łącznika [Absorpcja przez skór ę: metoda  
in vivo  (9)]. W przypadku innych punktów ko ńcowych, takich jak dystry ­
bucja i metabolizm, mo żna stosowa ć niniejszą metodę badawcz ą B.36. Przy 
poddawaniu dzia łaniu badanej substancji chemicznej drog ą dermalną należy 
zastosowa ć co najmniej jeden poziom dawkowania. Badana substancja 
chemiczna (np. czysty, rozcie ńczony lub zmieszany materia ł zawieraj ący 
badaną substancj ę chemiczn ą, który nak ładany jest na skór ę) powinna by ć 
taka sama (lub by ć realistycznym surogatem) jak substancja, na której dzia ­ 
łanie nara żeni mogą być ludzie lub inne potencjalne gatunki docelowe. 
Poziom (poziomy) dawkowania nale ży wybrać zgodnie z pkt 20–26 niniej ­
szej metody badawczej. Czynniki, które mo żna wziąć pod uwag ę przy 
doborze dawki na skór ę, obejmuj ą oczekiwane nara żenie ludzi lub dawki, 
przy których w innych badaniach toksyczno ści dermalnej zaobserwowano 
toksyczno ść. Dawka (dawki) na skór ę należy w razie potrzeby rozpu ścić 
w odpowiednim no śniku i aplikowa ć w ilości odpowiedniej do dostarczenia 
dawki. Tu ż przed badaniem nale ży wystrzyc sier ść na grzbietowej 
powierzchni tu łowia badanych zwierz ąt. Można zastosowa ć golenie, lecz 
należy je przeprowadzi ć około 24 godziny przed rozpocz ęciem badania. 
Podczas przycinania lub golenia sier ści należy uważać, aby nie uszkodzi ć 
skóry, gdy ż mogłoby to zmieni ć jej przepuszczalno ść. Na potrzeby zastoso ­
wania badanej substancji chemicznej nale ży usunąć sierść z ok. 10 % 
powierzchni cia ła. W przypadku substancji wysoce toksycznych mo żna je 
nanieść na powierzchni ę mniejszą niż ok. 10 %, jednak nale ży dążyć do 
tego, aby pokry ć jak najwi ększy obszar cienk ą i równomiern ą warstwą. We 
wszystkich grupach w badaniu nara żenia dermalnego nale ży wykorzysta ć 
taką samą powierzchni ę poddawania dzia łaniu substancji. Powierzchni ę, na 
którą dawkowana jest substancja, trzeba chroni ć odpowiedni ą dobrze 
umocowan ą osłoną. Zwierzęta powinny by ć trzymane oddzielnie.  
75. Nale ży przeprowadzi ć badanie przemywania skóry w celu oszacowania 
ilości aplikowanej dawki badanej substancji chemicznej, któr ą można 
usunąć ze skóry przez umycie łagodnym myd łem i wod ą powierzchni 
skóry poddanej dzia łaniu tej substancji. Badanie to mo że również pomóc 
w określeniu bilansu masy, gdy badana substancja chemiczna podawana jest 
drogą dermalną. Dla celów tego badania przemywania skóry nale ży dwóm 
zwierzętom poda ć pojedyncz ą dawkę badanej substancji chemicznej. 
Wyboru poziomu dawkowania dokonuje si ę zgodnie z pkt 23 niniejszej 
metody badawczej (zob. równie ż pkt 76, w którym omówiono czasu 
kontaktu ze skór ą). Ilości badanej substancji chemicznej odzyskane 
w płynach pozosta łych po przemywaniu nale ży określić, aby oszacowa ć 
skuteczno ść usuwania tej substancji poprzez mycie.  
76. Badan ą substancj ę chemiczn ą należy nałożyć na skórę i trzyma ć przez co 
najmniej 6 godzin, o ile nie uniemo żliwia tego dzia łanie żrące tej substancji. 
Po zdjęciu osłony obszar poddany dzia łaniu substancji nale ży umyć zgodnie 
z procedur ą określoną w badaniu przemywania skóry (zob. pkt 75). 
Zarówno os łonę, jak i p łyny pozosta łe po przemywaniu nale ży poddać 
analizie pod k ątem pozosta łości badanej substancji chemicznej. Na zako ń­
czenie badania ka żde zwierz ę należy humanitarnie u śmiercić zgodnie z (2) 
i usunąć skórę poddawan ą działaniu substancji. Odpowiedni wycinek tej 
skóry nale ży poddać analizie w celu okre ślenia pozosta łości badanej 
substancji chemicznej (promieniotwórczo ści). 
77. Dla celów toksykokinetycznej oceny produktów farmaceutycznych 
potrzebne mog ą być odmienne procedury, zgodne z odpowiednim systemem 
regulacji.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Droga inhalacyjna  
78. Nale ży zastosowa ć jedno st ężenie (lub w razie potrzeby wi ększą liczbę 
stężeń) badanej substancji chemicznej. St ężenie (stężenia) nale ży wybrać 
zgodnie z pkt 20–26 niniejszej metody badawczej. Zabiegi poddawania 
działaniu substancji drog ą inhalacyjn ą należy przeprowadza ć przy użyciu 
przyrządu z mask ą inhalacyjn ą umożliwiającą narażenie tylko przez nos 
lub tylko g łowy, aby zapobiec wch łanianiu substancji innymi drogami nara ­ 
żenia (8). Je żeli stosowane s ą inne warunki nara żenia inhalacyjnego, nale ży 
udokumentowa ć uzasadnienie zmiany procedury. Czas trwania nara żenia 
drogą inhalacyjn ą powinien by ć określony; typowe nara żenie trwa 4–6 h.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials nr 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, 
Paryż.
 
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use 
of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Pary ż.
 
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73–81.
 
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography. J. Pharmacological and Toxicological Methods 51: 
25–40.  
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d’Yvoire MB, 
Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. 
Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400–411.
 
(6) Rozdzia ł B.45 niniejszego za łącznika. Absorpcja przez skór ę: metoda  in 
vitro . 
(7) IPCS (2010). Characterization and application of 
Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS 
Harmonization Project Document nr 9. Genewa, Światowa Organizacja 
Zdrowia, Mi ędzynarodowy Program Bezpiecze ństwa Chemicznego.  
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, 
Series on Testing and Assessment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, 
OECD, Pary ż. 
(9) Rozdzia ł B.44 niniejszego za łącznika. Absorpcja przez skór ę: metoda  in 
vivo. 
(10) Barton HA, i in. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9–35.
 
(11) Gibaldi M i Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, wyd. drugie, Marcel 
Dekker, Inc., Nowy Jork.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Dodatek  
DEFINICJE  
Wchłanianie:  proces absorpcji chemikaliów w g łąb tkanek lub przez tkanki. 
Wchłanianie dotyczy zwi ązku macierzystego i wszystkich jego metabolitów. 
Nie mylić z „biodost ępnością”. 
Akumulacja (bioakumulacja):  wzrost ilo ści badanej substancji chemicznej 
w czasie w tkankach (zwykle tkankach t łuszczowych w nast ępstwie powtarza ­
nego nara żenia); jeśli ilość badanej substancji chemicznej wprowadzana do orga ­
nizmu jest wi ększa niż szybkość, z jaką jest wydalana, organizm gromadzi t ę 
substancję i może dojść do osiągnięcia toksycznego st ężenia badanej substancji 
chemicznej.  
ADME:  akronim „Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion” (ang. 
wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie).  
AUC:  (pole pod krzyw ą stężenia w osoczu w czasie): pole pod krzyw ą na 
wykresie st ężenia badanej substancji chemicznej w osoczu w czasie. Oznacza 
ono całkowitą ilość badanej substancji chemicznej wch łoniętą przez organizm we 
wcześniej określonym czasie. W warunkach liniowych AUC (od czasu zerowego 
do niesko ńczoności) jest proporcjonalne do ca łkowitej ilo ści badanej substancji 
chemicznej wch łoniętej przez organizm, niezale żnie od tempa wch łaniania.  
Autoradiografia:  (autoradiografia ca łego ciała): stosowana w celu jako ściowego 
lub ilościowego okre ślenia umiejscowienia w tkankach badanej promieniotwór ­
czej substancji chemicznej; w technice tej wykorzystuje si ę kliszę rentgenowsk ą 
lub - od niedawna – obrazowanie cyfrowe z u życiem fosforu w celu zwizuali ­
zowania radioaktywnie znakowanych cz ąsteczek lub fragmentów cz ąsteczek 
poprzez rejestrowanie promieniowania emitowanego w badanym obiekcie. W porównaniu z sekcj ą narządów ilościowa autoradiografia ca łego ciała może 
mieć pewne zalety dla oceny dystrybucji badanej substancji chemicznej oraz 
oceny ca łkowitego odzysku i rozk ładu materia łu promieniotwórczego 
w tkankach. Jedn ą z istotnych zalet jest na przyk ład to, że autoradiografia 
może być stosowana na zabarwionym modelu zwierz ęcym w celu ocenienia 
ewentualnego łączenia si ę badanej substancji chemicznej z melanin ą, która 
może wiązać się z pewnymi cz ąsteczkami. Mimo że technika ta mo że zapewni ć 
obejmujący całe ciało wygodny przegl ąd miejsc wi
ązania o du żej zdolno ści 
i niskim powinowactwie, mo że ona jednak by ć ograniczona pod wzgl ędem 
rozpoznawania swoistych miejsc docelowych, takich jak miejsca wi ązania recep ­
torów, gdzie wykrycie wymaga stosunkowo wysokiej rozdzielczo ści oraz wyso ­
kiej czułości. W przypadku korzystania z autoradiografii do świadczenia maj ące 
na celu okre ślenie bilansu masy podawanego zwi ązku należy przeprowadza ć jako 
odrębną grupę lub w ramach oddzielnego badania, pocz ąwszy od do świadczenia 
dotyczącego dystrybucji w tkankach, polegaj ącego na homogenizacji wszystkich 
wydalin (które mog ą również obejmowa ć wydychane powietrze) i ca łych ciał 
oraz poddaniu ich analizie za pomoc ą scyntylacyjnego licznika cieczowego.  
Wydalanie z żółcią: wydalanie z dróg żółciowych.  
Bioakumulacja:  zob. „akumulacja”.  
Biodostępność: ułamek podanej dawki, jaki dociera do kr ążenia ogólnego lub 
jest udost ępniany na miejscu aktywno ści fizjologicznej. Zazwyczaj biodost ępność 
badanej substancji chemicznej odnosi si ę do związku macierzystego, lecz mo że 
dotyczyć też jego metabolitu. Uwzgl ędnia się w jej ramach tylko jedn ą formę 
chemiczn ą. Uwaga : biodostępność i wchłanianie nie s ą tożsame. Ró żnica między 
np. wchłanianiem po podaniu doustnym (tj. obecno ścią w ścianie jelita i kr ążeniu 
wrotnym) a biodost ępnością (tj. obecno ścią w krwi w kr ążeniu ogólnym i w 
tkankach) mo że być spowodowana mi ędzy innymi rozk ładem chemicznym 
wskutek metabolizmu w ścianie jelita lub wyp ływu z powrotem do światła jelita 
lub pierwszym przej ściem przez w ątrobę (10). Biodost ępność składnika toksycz ­
nego (zwi ązku macierzystego lub metabolitu) jest krytycznym parametrem 
w ocenie ryzyka dla ludzi (ekstrapolacja dawki du żej do ma łej, ekstrapolacja 
drogi do drogi), s łużącym wyprowadzeniu warto ści wewn ętrznej 
z zewnętrznego NOAEL lub BMD (zastosowana dawka). W odniesieniu do 
skutków dla w ątroby po podaniu drog ą pokarmow ą wystarcza wch łanianie po 
podaniu doustnym, jednak dla ka żdego skutku innego ni ż występujący w miejscu 
wprowadzenia danej substancji to biodost ępność, nie wch łanianie, jest na ogó ł 
bardziej wiarygodnym parametrem na potrzeby dalszego zastosowania w ocenie 
ryzyka.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
Biotrwałość: zob. „trwa łość”. 
Biotransformacja:  (zwykle enzymatyczna) przemiana chemiczna badanej 
substancji chemicznej w inn ą substancj ę chemiczn ą zachodząca w ciele. Synonim 
„metabolizmu”.  
C max : maksymalne (szczytowe) st ężenie we krwi (osoczu/surowicy krwi) po 
podaniu lub maksymalne (szczytowe) wydalanie (z moczem lub ka łem) po poda ­
niu. 
Klirens:  ilościowa miara szybko ści, z jaką badana substancja chemiczna jest 
usuwana z krwi, osocza lub okre ślonej tkanki w jednostce czasu.  
Przedział: strukturalna lub biochemiczna cz ęść (lub jednostka) cia ła, tkanki lub 
komórki, która jest oddzielona od reszty.  
Ścieżki detoksykacji:  szereg etapów prowadz ących do eliminacji toksycznych 
chemikaliów z organizmu poprzez przemian ę metaboliczn ą lub wydalenie.  
Dystrybucja:  rozproszenie badanej substancji chemicznej i jej pochodnych 
w całym organizmie.  
Enzymy/izoenzymy:  białka, które katalizuj ą reakcje chemiczne. Izoenzymy s ą 
enzymami, które katalizuj ą podobne reakcje chemiczne, lecz ró żnią się sekwencj ą 
aminokwasów.  
Parametry enzymatyczne:  K m : stała Michaelisa oraz V  max : prędkość maksy­
malna.  
Wydalanie:  proces lub procesy, w drodze których podana badana substancja 
chemiczna lub jej metabolity s ą usuwane z organizmu  
Egzogennie:  wprowadzony spoza organizmu lub uk ładu lub wytworzony poza 
nimi.  
Ekstrapolacja:  wywodzenie jednej nieznanej warto ści lub wi ększej ich liczby 
w oparciu o to, co jest znane lub zosta ło zaobserwowane.  
Okres pó łtrwania (t  1/2 ): czas, jaki musi up łynąć, by stężenie badanej substancji 
chemicznej zmniejszy ło się o połowę w danym przedziale. Zazwyczaj odnosi si ę 
do stężenia w osoczu lub ilo ści badanej substancji chemicznej w ca łym organiz ­
mie. 
Indukcja/indukcja enzymatyczna:  synteza enzymów w odpowiedzi na bodziec 
środowiskowy lub cz ąsteczkę induktora.  
Liniowość/kinetyka liniowa:  proces jest liniowy pod wzgl ędem kinetyki, gdy 
wszystkie pr ędkości wnikania mi ędzy przedzia łami są proporcjonalne do obec ­
nych ilości lub st ężeń, tj. są pierwszego rz ędu. W zwi ązku z tym warto ści 
klirensu i dystrybucji s ą stałe, podobnie jak okresy pó łtrwania. Osi ągane stężenia 
są proporcjonalne do szybko ści dawkowania (nara żenia), a akumulacja jest 
łatwiejsza do przewidzenia. Liniowo ść/nieliniowo ść można ocenić przez porów ­
nanie odpowiednich parametrów, np. pola pod krzyw ą po różnych dawkach lub 
po narażeniu jednorazowym i powtarzanym. Brak zale żności od dawki mo że 
wskazywa ć na nasycenie enzymów bior ących udzia ł w metabolizmie danego 
związku chemicznego, zwi ększenie pola pod krzyw ą po powtarzanym nara żaniu 
w porównaniu z nara żeniem jednorazowym mo że świadczyć o zhamowaniu 
metabolizmu, a zmniejszenie pola pod krzyw ą może być oznaką indukcji meta ­
bolizmu [zob. równie ż (11)].  
Bilans masy:  rozliczanie badanej substancji chemicznej wchodz ącej do uk ładu 
i wychodz ącej z niego.  
Bilans materia łowy:  zob. „bilans masy”.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Mechanizm (charakter) toksyczno ści/mechanizm (charakter) dzia łania:  
mechanizm dzia łania odnosi si ę do konkretnych interakcji biochemicznych, 
przez które badana substancja chemiczna powoduje swój skutek. Charakter dzia ­ 
łania odnosi si ę do bardziej ogólnych szlaków prowadz ących do toksyczno ści 
badanej substancji chemicznej.  
Metabolizm:  synonim „biotransformacji”.  
Metabolity:  produkty metabolizmu lub procesów metabolicznych.  
Wchłanianie po podaniu doustnym:  procent dawki badanej substancji 
chemicznej wch łonięty z miejsca podania (tj. z przewodu pokarmowego). Ten 
krytyczny parametr mo żna wykorzysta ć, aby dowiedzie ć się, jaki ułamek podanej 
badanej substancji chemicznej dociera do żyły wrotnej, a pó źniej do w ątroby.  
Współczynnik podzia łu: znany tak że jako wspó łczynnik dystrybucji, jest miar ą 
różnicowej rozpuszczalno ści substancji chemicznej w dwóch rozpuszczalnikach.  
Szczytowe poziomy st ężenia we krwi (osoczu/surowicy krwi):  maksymalne 
(szczytowe) st ężenie we krwi (osoczu/surowicy krwi) po podaniu (zob. tak że 
„C max ”). 
Trwałość (biotrwa łość): długotrwała obecno ść substancji chemicznej (w uk ła­
dzie biologicznym) ze wzgl ędu na odporno ść na rozkład/eliminacj ę. 
Przekrój:  informacje na temat punktu ko ńcowego jednej substancji chemicznej 
lub większej ich liczby s ą wykorzystywane do przewidywania punktu ko ńco­
wego docelowej substancji chemicznej.  
Mikroskopowa autoradiografia receptorowa (lub mikroautoradiografia 
receptorowa):  technika ta mo że być wykorzystywania do badania interakcji 
ksenobiotyków z okre ślonymi miejscami tkanek lub populacjami komórek, jak 
na przyk ład w badaniach dotycz ących wiązania receptorów lub okre ślonego 
charakteru dzia łania, które mog ą wymagać wysokiej rozdzielczo ści oraz wysokiej 
czułości, jakie mog ą być niemożliwe do osi ągnięcia przy u życiu innych technik, 
takich jak autoradiografia ca łego ciała. 
Droga podania (doustna, do żylna, dermalna, inhalacyjna itp.):  odnosi si ę do 
sposobu wprowadzenia substancji chemicznych do cia ła (np. doustnie za pomoc ą 
sondy, doustnie z pokarmem, przez skór ę, przez drogi oddechowe, do żylnie itd.).  
Nasycenie:  stan, w którym co najmniej jeden z procesów kinetycznych 
(np. wch łanianie, metabolizm lub klirens) ma warto ść maksymaln ą (odczyt 
„nasycony”).  
Czułość: zdolność metody lub instrumentu do rozró żniania reakcji pomiarowych 
reprezentuj ących różne poziomy przedmiotowej zmiennej.  
Poziomy st ężenia we krwi (osoczu) w stanie ustalonym:  stan nierównowagi 
otwartego uk ładu, w którym wszystkie si ły działające na ten uk ład są dokładnie 
równoważone przez si ły przeciwstawne w taki sposób, że wszystkie jego 
elementy maj ą niezmienne st ężenie, mimo że substancja p łynie przez uk ład. 
Modelowanie uk ładów (fizjologiczny model toksykokinetyczny, model farma ­
kokinetyczny, farmakokinetycznymodel fizjologiczny, model biologiczny itp.):  abstrakcyjny model, w którym u żywa się języka matematycznego do 
opisu zachowania uk ładu.
 
Tkanka docelowa:  tkanka, w której przejawia si ę główne szkodliwe dzia łanie 
substancji toksycznej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja chemiczna lub miesza ­
nina badana za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  
Dystrybucja w tkankach:  odwracalny ruch badanej substancji chemicznej 
z jednego miejsca w ciele do drugiego. Dystrybucj ę w tkankach mo żna badać 
poprzez wyci ęcie organów, ich homogenizacj ę, spalenie i poddanie analizie za 
pomocą scyntylacyjnego licznika cieczowego b ądź też jakościową lub ilościową 
autoradiografi ę całego ciała. Pierwsza z tych metod jest przydatna do uzyskania 
stężenia i procentu odzysku z tkanek i reszty cia ła takich samych zwierz ąt, lecz 
może nie mie ć rozdzielczo ści pozwalaj ącej na zbadanie wszystkich tkanek, 
a całkowity odzysk mo że być mniejszy ni ż w warunkach idealnych (< 90 %). 
Zob. definicja drugiej metody powy żej. 
T max : czas do osi ągnięcia C  max . 
Toksykokinetyka (farmakokinetyka):  badanie wch łanianie, dystrybucji, meta ­
bolizmu i wydalania substancji chemicznych wzgl ędem czasu.  
Walidacja modeli:  proces oceny odpowiednio ści modelu do spójnego opisania 
dostępnych danych toksykokinetycznych. Modele mog ą być oceniane poprzez 
statystyczne i wizualne porównanie modelowych prognoz z warto ściami 
doświadczalnymi w stosunku do wspólnej zmiennej niezale żnej (np. czasu). 
Należy uzasadni ć zakres oceny w odniesieniu do zamierzonego zastosowania 
modelu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  OPÓ ŹNIONA NEUROTOKSYCZNO ŚĆ SUBSTANCJI FOSFO ­
ROORGANICZNYCH PO DU ŻEJ EKSPOZYCJI  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Przy ocenie i oszacowaniu skutków toksycznych substancji wa żne 
jest rozwa żenie potencja łu niektórych klas substancji do wywo ły­
wania okre ślonych typów neurotoksyczno ści, które mog ą nie być 
wykryte w innych badaniach toksyczno ści. Zaobserwowano, że 
niektóre substancje fosforoorganiczne powoduj ą opóźnioną neuroto­
ksyczność i powinny by ć wzięte pod uwag ę jako zwi ązki, które 
mogą być zaliczone do oszacowania.  
Testy sortuj ące in vitro  mogłyby być zastosowane, aby rozpozna ć te 
substancje, które mog ą powodowa ć opóźnioną polineuropati ę; 
jednakże negatywne wyniki bada ń in vitro  nie są dowodem, że 
substancja testowana nie jest substancj ą neurotoksyczn ą 
Zob. także Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Substancje fosforoorganiczne obejmuj ą nienaładowane estry fosforo ­
organiczne, tioestry i bezwodniki pochodnych organicznych kwasu fosforowego(V), kwasu fosfonowego i kwasów fosforoamidowych 
i ich tio-pochodnych lub inne substancje, które mog ą wywoływać 
opóźnioną neurotoksyczno ść obserwowan ą czasami w tej klasie 
substancji.
 
Opóźniona neurotoksyczno ść jest objawem powi ązanym z przed łu­ 
żonym zw łocznym pocz ątkiem ataksji, obwodow ą aksonopati ą 
w rdzeniu kr ęgowym i nerwach obwodowych, i zahamowaniem 
i starzeniem esterazy wywo łującej neuropati ę (NTE) w oboj ętnej 
tkance.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Substancja odniesienia mo że być testowana na pozytywnej grupie 
kontrolnej jako środek w celu wykazania, że w warunkach testu 
laboratoryjnego reakcja badanego gatunku nie zmieni ła się znacząco. 
Przykładem szeroko stosowanego środka neurotoksycznego jest orto ­
fosforan(V) tritoilu (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, nomenkla ­
tura CAS: kwas ortofosforowy(V), ester tris(2-metylofenylowy), znany jako fosforan trikrezylu.
 
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Substancja testowana jest podawana doustnie w pojedynczej dawce 
kurom domowym, które zosta ły zabezpieczone przed ostrymi skut ­
kami cholinergicznymi, gdzie w łaściwe. Zwierz ęta są obserwowane 
przez 21 dni pod k ątem anomalii behawioralnych, ataksji, i parali żu. 
Pomiary biochemiczne, w szczególno ści zahamowanie esterazy 
wywołującej neuropati ę (NTE), przeprowadza si ę na kurach losowo 
wybranych z ka żdej grupy, prawid łowo 24 i 48 godzin po dawko ­
waniu. Dwadzie ścia jeden dni po ekspozycji pozosta łe kury są zabi­
jane i przeprowadzane jest badanie histopatologiczne wybranych 
obojętnych tkanek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. OPIS METODY BADANIA  
1.5.1.  Przygotowania  
Zdrowe, m łode, doros łe kury, wolne od koliduj ących chorób wiru ­
sowych i leków oraz bez nieprawid łowości w sposobie chodzenia, 
powinny by ć losowo przydzielane do grupy badanej i kontrolnej oraz 
aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpocz ęciem badania.
 
Powinno si ę stosować klatki i zagrody wystarczaj ąco obszerne, aby 
umożliwić swobodne poruszanie si ę kur i niezak łóconą obserwacj ę 
sposobu chodzenia.  
Dawkowanie substancji testowanej powinno prawid łowo przebiega ć 
drogą doustną, stosując aplikowanie bezpo średnio do żołądka, 
w kapsu łkach żelatynowych lub metod ą porównywaln ą. Ciecze 
powinny by ć podawane nierozcie ńczone lub rozpuszczone 
w odpowiednim no śniku, takim jak olej kukurydziany; substancje 
stałe powinny by ć, w miar ę możliwości, rozpuszczone, poniewa ż 
duże dawki substancji sta łych w żelatynie mog ą nie być absorbo­
wane wydajnie. W przypadku no śników niewodnych powinna by ć 
znana charakterystyka toksyczna no śnika, a je żeli nie jest znana, 
powinna by ć określona przed testem.  
1.5.2.  Warunki testu  
1.5.2.1.  Zwierz ęta badane  
Zalecana jest m łoda, doros ła, kura domowa nioska ( Gallus gallus 
domesticus ), w wieku 8–12 miesi ęcy. Powinny by ć wykorzystane 
odmiany i rasy standardowej wielko ści, które prawid łowo powinny 
być wcześniej hodowane w warunkach umo żliwiających swobodne 
poruszanie si ę. 
1.5.2.2.  Liczba i p łeć 
Oprócz grupy badanej powinna by ć stosowana zarówno grupa 
kontrolna no śnika, jak i pozytywna grupa kontrolna. Grupa kontrolna 
nośnika powinna by ć traktowana w sposób identyczny, jak grupa 
badana z wyj ątkiem tego, że podawanie substancji testowanej jest 
pominięte. 
W każdej grupie ptaków nale ży wykorzysta ć wystarczaj ącą liczbę 
kur tak, aby co najmniej sze ść ptaków mo żna było zabić do celów 
oznaczenia biochemicznego (trzy w ka żdym z dwóch punktów 
czasowych) i sze ść mogło przeżyć okres 21-dniowej obserwacji do 
celów patologii.  
Pozytywna grupa kontrolna mo że być poddawana badaniu w tym 
samym czasie lub te ż może ona by ć ostatnią grupą kontroln ą 
w historii badania. Powinna sk ładać się z co najmniej sze ściu kur, 
poddawanych dzia łaniu znanego opó źnionego środka neurotoksycz ­
nego, trzy kury przeznaczone s ą do celów biochemii i trzy do celów 
patologii. Zalecane jest okresowe uaktualnianie przesz łych danych. 
W przypadku gdy jaki ś istotny element (np. rasa, żywienie, warunki 
przebywania) w przebiegu badania zosta ł zmieniony przez laborato ­
rium wykonuj ące, należy uzyskać nowe pozytywne dane kontrolne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Poziomy dawki  
Aby oszacowa ć poziom dawki, który ma by ć zastosowany 
w badaniu g łównym, nale ży przeprowadzi ć badanie wst ępne przy 
użyciu odpowiedniej liczby kur i grup poziomów dawki. Typowy 
i nieunikniony jest pewien poziom śmiertelno ści w badaniu wst ęp­
nym, w celu okre ślenia właściwej dawki do badania g łównego. 
Jednakże aby zapobiec śmierci z powodu ostrych skutków choliner ­
gicznych mo że być użyta atropina lub inny środek ochronny, 
o którym wiadomo, że nie koliduje z opó źnionymi reakcjami neuro ­
toksycznymi. Rozmaite metody badania mog ą być stosowane w celu 
oszacowania maksymalnej, niewywo łującej śmierci dawki substancji 
testowanej (zob. metoda B.l bis). Poprzednie dane dotycz ące kur lub 
inne dane toksykologiczne mog ą być pomocne przy doborze dawki.  
W głównym badaniu poziom dawki substancji testowanej powinien 
być możliwie najwy ższy, bior ąc pod uwag ę wyniki wst ępnego 
badania doboru dawki i górn ą dawkę graniczn ą wynoszącą 2 000 
mg/kg masy cia ła. Jakakolwiek śmiertelno ść, która mo że wystąpić, 
nie powinna zak łócić przeżycia 21 dni przez wystarczaj ącą liczbę 
zwierząt do celów biochemii (sze ść) i histologii (sze ść). Powinna 
być użyta atropina lub inny środek ochronny, o którym wiadomo, 
że nie koliduje z opó źnionymi reakcjami neurotoksycznymi, w celu 
zapobieżenia śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych.  
1.5.2.4.  Test graniczny  
Jeżeli test przy poziomie dawki wynosz ącym co najmniej 2 000 
mg/kg masy cia ła/dzień, z zastosowaniem procedury opisanej dla 
tego badania, nie powoduje widocznych objawów toksycznych 
i jeżeli nie nale żałoby spodziewa ć się toksyczno ści na podstawie 
danych, dotycz ących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy 
badanie z zastosowaniem wi ększej dawki mo że nie być konieczne. 
Ten test graniczny stosowany jest z wyj ątkiem przypadków, 
w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczno ść użycia 
wyższego poziomu dawki.  
1.5.2.5.  Okres obserwacji  
Okres obserwacji powinien wynosi ć 21 dni.  
1.5.3.  Procedura  
Po podaniu środka ochronnego, aby zapobiec śmierci z powodu 
ostrych skutków cholinergicznych, substancja testowana jest poda ­
wana w pojedynczej dawce.  
1.5.3.1. Ogólne obserwacje  
Obserwacje powinny rozpocz ąć się bezpośrednio po ekspozycji. 
Wszystkie kury powinny by ć starannie obserwowane kilka razy 
w ciągu pierwszych 2 dni i od tego czasu co najmniej raz dziennie 
przez okres 21 dni lub do zaplanowanego zabicia. Wszystkie oznaki toksyczno ści powinny by ć odnotowywane, w tym czas rozpocz ęcia, 
typ, ostro ść i czas trwania anomalii behawioralnych. Ataksja 
powinna by ć mierzona wed ług porządkowej skali klasyfikacyjnej, 
składającej się z co najmniej czterech poziomów, parali ż powinien 
być odnotowany. Co najmniej dwa razy w tygodniu wszystkie kury 
wybrane do celów patologii powinny by ć wyjmowane z klatek 
i poddawane okresowej wymuszonej aktywno ści motorycznej, takiej 
jak wspinanie si ę po drabinie, aby u łatwić obserwacj ę minimalnych 
skutków toksycznych. Zwierz ęta konające oraz zwierz ęta przeja ­
wiające ostre cierpienie i ból powinny by ć usuwane, gdy zostanie 
to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zw łok.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2. Masa cia ła 
Wszystkie kury powinny by ć ważone tuż przed podaniem substancji 
testowanej i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu.  
1.5.3.3. Biochemia  
Sześć losowo wybranych kur z grup badanych i z grupy kontroli 
nośnika, i trzy kury z pozytywnej grupy kontrolnej (je żeli grupa ta 
jest poddawana badaniu jednocze śnie) powinny by ć zabite w ci ągu 
kilku dni po dawkowaniu, mózg i l ędźwiowy rdze ń kręgowy powi ­
nien być przygotowany i poddany analizie aktywno ści zahamowania 
esterazy wywo łującej neuropati ę. Dodatkowo mo że być przydatne 
przygotowanie i poddanie tkanki nerwu kulszowego analizie aktyw ­
ności zahamowania esterazy wywo łującej neuropati ę. Prawidłowo, 
trzy ptaki grupy kontrolnej i ka żdej grupy badanej s ą zabijane po 
24 godzinach i trzy po 48 godzinach, podczas gdy trzy kury z 
pozytywnej grupy kontrolnej powinny by ć zabite po 24 godzinach. 
Jeżeli obserwacja klinicznych oznak zatrucia (cz ęsto może to być 
ocenione przez obserwacj ę czasu rozpocz ęcia oznak cholinergicz ­
nych) wskazuje, że środek toksyczny mo że być usuwany bardzo 
powoli, bardziej po żądane mo że być pobranie próbki tkanki od 
trzech ptaków, w ka żdym z dwóch terminów mi ędzy 24 a 72 
godziną po dawkowaniu.  
Analizy acetylocholinoesterazy (AChE) mog ą być również wyko­
nane na tych próbkach, je żeli uzna si ę to za w łaściwe. Jednak że 
może mieć miejsce spontaniczna reaktywacja AChE  in vivo,  co 
może prowadzi ć do zbyt niskiego oszacowania potencji substancji 
jako inhibitora AChE.  
1.5.3.4. Sekcja zw łok 
Sekcja zw łok wszystkich zwierz ąt (zabitych planowo i zabitych jako 
konające) powinna obejmowa ć obserwacj ę wyglądu mózgu i rdzenia 
kręgowego.  
1.5.3.5. Badanie histopatologiczne  
Obojętna tkanka zwierz ąt przeżywających okres obserwacji, nieu żyta 
w badaniach biochemicznych, powinna by ć poddana badaniu mikro ­
skopowemu. Tkanki powinny by ć przygotowane  in situ,  stosując 
techniki perfuzji. Odcinki powinny obejmowa ć móżdżek (środkowy 
– wzdłużny poziom), rdze ń przedłużony, rdze ń kręgowy i nerwy 
obwodowe. Odcinki rdzenia kr ęgowego powinny by ć pobrane 
z górnego segmentu karkowego, okolic środkowopiersiowych 
i lędźwiowo-krzy żowych. Powinny by ć pobrane odcinki z okolic 
obwodowych nerwu piszczelowego i jego odga łęzienia do mi ęśnia 
brzuchatego łydki oraz nerwu kulszowego. Odcinki powinny by ć 
zabarwione odpowiedni ą mieliną i barwnikami charakterystycznymi 
dla aksonów.  
2. DANE  
Negatywne wyniki w punktach ko ńcowych wybranych w tej meto ­
dzie (biochemia, histopatologia i obserwacja behawioralna) prawid ­ 
łowo nie wymaga łyby dalszego badania, dotycz ącego opó źnionej 
neurotoksyczno ści. Niejednoznaczne lub nieprzekonuj ące wyniki 
dla tych punktów ko ńcowych mog ą wymaga ć dalszej oceny.  
Powinny zosta ć dostarczone indywidualne zwierz ąt. Dodatkowo, 
wszystkie dane powinny by ć podsumowane w formie tabeli, przed ­
stawiając dla każdej grupy badanej liczb ę zwierząt na początku testu, 
liczbę zwierząt wykazuj ących zmiany patologiczne, skutki behawio ­
ralne i biochemiczne, typy i ostro ść tych zmian patologicznych lub 
skutków i procent zwierz ąt okazujących każdy typ i ostro ść zmiany 
patologicznej lub skutku.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Wyniki badania powinny by ć ocenione pod wzgl ędem częstotli­
wości, ostrości, i korelacji skutków behawioralnych, biochemicznych 
i histopatologicznych oraz jakichkolwiek innych obserwowanych w grupach badanych i kontrolnych.
 
Wyniki liczbowe powinny by ć ocenione z zastosowaniem odpowied ­
niej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody staty ­
styczne powinny by ć wybrane podczas planowania badania.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
SPRAWOZDANIE Z TESTU  
Sprawozdanie z testu obejmuje, je żeli możliwe, nast ępujące informa ­
cje: 
Zwierzęta badane:  
— wykorzystana rasa,  
— liczba i wiek zwierz ąt, 
— źródło, warunki przebywania zwierz ąt itp.,  
— indywidualna waga zwierz ąt na pocz ątku testu.  
Warunki testu:  
— szczegó ły dotyczące przygotowania substancji testowanej, trwa ­ 
łości i homogeniczno ści, w odpowiednich przypadkach,  
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— szczegó ły podawania substancji testowanej,  
— szczegó ły jakości pożywienia i wody,  
— racjonalna podstawa wyboru dawki,  
— parametry podawanych dawek, w tym dane szczegó łowe 
dotyczące nośnika, obj ętości i formy fizycznej podawanych 
substancji,  
— tożsamość i szczegó ły podawania jakiegokolwiek środka ochron ­
nego.  
Wyniki:  
— dane dotycz ące masy cia ła, 
— dane dotycz ące reakcji toksycznej wed ług grup, w tym śmiertel­
ność, 
— natura, ostro ść i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwra ­
calne czy nie),  
— szczegó łowy opis metod biochemicznych i wyników,  
— wyniki sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,  
— gdzie w łaściwe, statystyczna obróbka wyników.  
Rozpatrzenie wyników  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 418.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  OPÓ ŹNIONA NEUROTOKSYCZNO ŚĆ SUBSTANCJI FOSFO ­
ROORGANICZNYCH. 28-DNIOWE BADANIE WIELO ­
KROTNEJ DAWKI  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Przy ocenie i oszacowaniu skutków toksycznych substancji wa żne 
jest rozwa żenie potencja łu niektórych klas substancji do wywo ły­
wania okre ślonych typów neurotoksyczno ści, które mog ą nie być 
wykrywane podczas innych bada ń toksyczno ści. Zaobserwowano, 
że niektóre substancje fosforoorganiczne powoduj ą opóźnioną neuro­
toksyczno ść i powinny by ć wzięte pod uwag ę jako zwi ązki, które 
mogą być zaliczone do oszacowania.  
Testy sortuj ące in vitro  mogłyby być zastosowane w celu rozpoz ­
nania tych substancji, które mog ą powodowa ć opóźnioną polineuro ­
patię; jednakże negatywne wyniki bada ń in vitro  nie są dowodem na 
to, że substancja testowana nie jest substancj ą neurotoksyczn ą. 
Ten 28-dniowy test opó źnionej neurotoksyczno ści dostarcza informa ­
cji, dotycz ących możliwych zagro żeń zdrowia, które mog ą się poja­
wiać się pod wpływem wielokrotnych ekspozycji przez ograniczony 
okres czasu. Dostarczy on informacji dotycz ących reakcji na dawk ę 
i może zapewni ć oszacowanie poziomu braku obserwowanych 
niekorzystnych skutków, który mo że być przydatny przy ustalaniu 
kryteriów bezpiecze ństwa dla ekspozycji.  
Zob. także Wprowadzenie ogólne cz ęść B. 
1.2. DEFINICJE  
Substancje fosforoorganiczne  obejmują nienaładowane estry fosforo ­
organiczne, tioestry i bezwodniki pochodnych organicznych kwasu 
fosforowego(V), kwasu fosfonowego i kwasów fosforoamidowych i ich tio-pochodnych lub inne substancje, które mog ą wywoływać 
opóźnioną neurotoksyczno ść obserwowan ą czasami w tej klasie 
substancji.
 
Opóźniona neurotoksyczno ść jest objawem zwi ązanym z przed łu­ 
żonym zw łocznym pocz ątkiem ataksji, obwodow ą aksonopati ą 
w rdzeniu kr ęgowym i nerwach obwodowych, i zahamowaniem 
i starzeniem esterazy wywo łującej neuropati ę (NTE) w oboj ętnej 
tkance.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Dzienne dawki substancji testowanej s ą podawane domowym kurom 
doustnie przez 28 dni. Zwierz ęta są obserwowane co najmniej raz 
dziennie pod k ątem anomalii behawioralnych, ataksji i parali żu do 
14 dnia po ostatniej dawce. Przeprowadzane s ą pomiary bioche ­
miczne, w szczególno ści zahamowanie esterazy wywo łującej neuro ­
patię (NTE), na kurach losowo wybranych z ka żdej grupy, prawid ­ 
łowo 24 i 48 godzin po ostatniej dawce. Dwa tygodnie po ostatniej 
dawce pozosta łe kury s ą zabijane i przeprowadzane jest badanie 
histopatologiczne wybranych oboj ętnych tkanek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. OPIS METODY BADANIA  
1.4.1.  Przygotowania  
Zdrowe, m łode, doros łe kury, wolne od koliduj ących chorób wiru ­
sowych i leków oraz bez nieprawid łowości w sposobie chodzenia, 
powinny zosta ć losowo przydzielone do grupy badanej i kontrolnej 
oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpocz ęciem badania.
 
Powinny by ć stosowane klatki i zagrody wystarczaj ąco obszerne, 
aby umożliwić swobodne poruszanie si ę kur i niezak łóconą obser­
wację sposobu chodzenia.  
Dawkowanie doustne powinno by ć prowadzone ka żdego dnia, 7 dni 
w tygodniu, najlepiej stosuj ąc aplikowanie bezpo średnio do żołądka 
lub w kapsu łkach żelatynowych. Ciecze powinny by ć podawane 
nierozcieńczone lub rozpuszczone w odpowiednim no śniku, takim 
jak olej kukurydziany; substancje sta łe powinny by ć w miarę możli­
wości rozpuszczone, poniewa ż duże dawki substancji sta łych 
w kapsułkach żelatynowych mog ą nie być absorbowane wydajnie. 
W przypadku no śników niewodnych powinna by ć znana charaktery ­
styka toksyczna no śnika, a je żeli nie jest znana, powinna by ć 
określona przed testem.  
1.4.2.  Warunki testu  
1.4.2.1.  Badane zwierz ęta 
Zalecana jest m łoda, doros ła, domowa, kura nioska ( Gallus gallus 
domesticus ), w wieku 8–12 miesi ęcy. Wykorzystane powinny by ć 
odmiany i rasy standardowej wielko ści, które prawid łowo powinny 
być wcześniej hodowane w warunkach umo żliwiających swobodne 
poruszanie si ę. 
1.4.2.2.  Liczba i p łeć 
Zasadniczo, powinny by ć wykorzystane co najmniej trzy grupy 
badane i grupa kontrolna no śnika. Grupa kontrolna no śnika powinna 
być traktowana w sposób identyczny jak grupa badana z wyj ątkiem 
tego, że podawanie substancji testowanej jest pomini ęte. 
W każdej grupie ptaków nale ży wykorzysta ć wystarczaj ącą liczbę 
kur, tak aby co najmniej sze ść ptaków mo żna było zabić do celów 
oznaczeń biochemicznych (trzy w ka żdym z dwóch punktów czaso ­
wych) i aby po zako ńczeniu dzia łań badawczych sze ść kur mog ło 
przeżyć okres 14-dniowej obserwacji do celów patologii.  
1.4.2.3.  Poziomy dawki  
Poziomy dawki powinny by ć wybierane, bior ąc pod uwag ę trzy 
wyniki testu ostrej opó źnionej neurotoksyczno ści i jakiekolwiek 
inne istniej ące, osiągalne dane dotycz ące toksyczno ści i kinetyki 
testowanego zwi ązku. Powinien by ć wybrany najwy ższy poziom 
dawki w celu wywo łania objawów zatrucia, najlepiej opó źnionej 
neurotoksyczno ści, ale nie śmierci lub widocznego cierpienia. Od 
tego czasu powinna by ć dobrana malej ąca sekwencja poziomów 
dawki, w celu wykazania wszystkich reakcji powi ązanych 
z dawkowaniem i braku zaobserwowania niekorzystnych objawów 
przy najmniejszym poziomie dawki.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Test graniczny  
Jeżeli test przy poziomie dawki wynosz ącym co najmniej 1 000 
mg/kg masy cia ła/dzień, z zastosowaniem procedury opisanej dla 
tego badania, nie wywo łuje widocznych objawów toksycznych 
i jeżeli nie nale żałoby spodziewa ć się toksyczno ści na podstawie 
danych, dotycz ących substancji strukturalnie pokrewnych, to badanie 
z zastosowaniem wi ększej dawki mo że nie być konieczne. Ten test 
graniczny stosuje si ę z wyjątkiem przypadków, w których spodzie ­
wana ekspozycja ludzi wskazuje na konieczno ść użycia wyższego 
poziomu dawki.  
1.4.2.5.  Okres obserwacji  
Wszystkie zwierz ęta powinny by ć obserwowane co najmniej raz 
dziennie podczas okresu ekspozycji i 14 dni po nim, chyba że plano­
wana jest sekcja zw łok. 
1.4.3.  Procedura  
Substancja testowana jest dawkowana siedem dni w tygodniu przez 
okres 28 dni  
1.4.3.1.  Ogólne obserwacje  
Obserwacje powinny rozpocz ąć się bezpośrednio po rozpocz ęciu 
działań badawczych. Wszystkie kury powinny by ć starannie obser ­
wowane co najmniej raz dziennie w ka żdym z 28 dni terapii i przez 
14 dni po dawkowaniu lub do zaplanowanego zabicia. Wszystkie 
oznaki toksyczno ści powinny by ć odnotowane, w tym czas 
rozpoczęcia, typ, ostro ść i czas trwania. Obserwacje powinny 
uwzględniać anomalie behawioralne, ale nie powinny by ć do nich 
ograniczone. Ataksja powinna by ć mierzona na porz ądkowej skali 
klasyfikacyjnej sk ładającej się z co najmniej czterech poziomów, 
należy odnotowa ć paraliż. Co najmniej dwa razy w tygodniu kury 
powinny by ć wyjęte z klatek i poddane okresowej wymuszonej 
aktywności motorycznej, takiej jak wspinanie si ę po drabinie, 
w celu u łatwienia obserwacji minimalnych skutków toksycznych. 
Zwierzęta konające, przejawiaj ące ostre cierpienie i ból powinny 
być usuwane, gdy zostanie to zauwa żone, humanitarnie zabite 
i poddane sekcji zw łok. 
1.4.3.2.  Masa cia ła 
Wszystkie kury powinny by ć ważone tuż przed pierwszym podaniem 
substancji testowanej i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu.  
1.4.3.3.  Biochemia  
Sześć losowo wybranych kur z grup badanych i z grupy kontroli 
nośnika powinno zosta ć zabitych w ci ągu kilku dni od przyj ęcia 
ostatniej dawki. Mózg i l ędźwiowy rdze ń kręgowy powinien by ć 
przygotowany i poddany analizie aktywno ści zahamowania esterazy 
(NTE) wywo łującej neuropati ę. Dodatkowo mo że być przydatne 
przygotowanie i poddanie tkanki nerwu kulszowego analizie aktyw ­
ności zahamowania esterazy wywo łującej neuropati ę. Prawidłowo, 
trzy ptaki grupy kontrolnej i ka żdej grupy badanej s ą zabijane po 
24 godzinach i trzy po 48 godzinach od ostatniej dawki. Je żeli dane 
z badania ostrej toksyczno ści lub innych bada ń (np. toksykokinetycz ­
nych) wskazuj ą, że inne terminy zabijania po ko ńcowym dawko ­
waniu są bardziej po żądane niż podane, powinny by ć one zastoso ­
wane, a racjonalna podstawa udokumentowana.  
Analizy acetylocholinoesterazy (AChE) mog ą być również wyko­
nane na tych próbkach, je żeli jest to uznane za w łaściwe. Jednak że 
może mieć miejsce spontaniczna reaktywacja AChE  in vivo  i w 
efekcie prowadzi ć do zbyt niskiego oszacowania potencja łu 
substancji jako inhibitora AChE.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4.  Sekcja zw łok 
Sekcja zw łok wszystkich zwierz ąt (zabitych planowo i zabitych jako 
konające) powinna obejmowa ć obserwacj ę wyglądu mózgu i rdzenia 
kręgowego.  
1.4.3.5.  Badanie histopatologiczne  
Obojętna tkanka zwierz ąt przeżywających okres obserwacji, nie 
użyta w badaniach biochemicznych powinna by ć poddana badaniu 
mikroskopowemu. Tkanki powinny by ć przygotowane  in situ,  
stosując techniki perfuzji. Odcinki powinny obejmowa ć móżdżek 
(środkowy – wzd łużny poziom), rdze ń przedłużony, rdze ń kręgowy, 
i nerwy obwodowe. Odcinki rdzenia kr ęgowego powinny by ć 
pobrane z górnego segmentu karku, okolic środkowopiersiowych 
i lędźwiowo-krzy żowych. Powinny by ć pobrane odcinki z okolic 
obwodowych nerwu piszczelowego i jego odga łęzienia do mi ęśnia 
brzuchatego łydki oraz nerwu kulszowego. Odcinki powinny by ć 
zabarwione odpowiedni ą mieliną i barwnikami charakterystycznymi 
dla aksonów. Pocz ątkowo badanie mikroskopowe powinno by ć prze­
prowadzone na zakonserwowanych tkankach wszystkich zwierz ąt 
grupy kontrolnej i grupy wysokiej dawki. W przypadku gdy istniej ą 
dowody skutków w grupie wysokiej dawki, badanie mikroskopowe 
powinno by ć również przeprowadzone na kurach z grup niskiej 
i pośredniej dawki.  
2. DANE  
Negatywne wyniki w punktach ko ńcowych wybranych w tej meto ­
dzie (biochemia, histopatologia i obserwacja behawioralna) prawid ­ 
łowo nie wymaga łyby dalszego badania, dotycz ącego opó źnionej 
neurotoksyczno ści. Niejednoznaczne lub nieprzekonuj ące wyniki 
dla tych punktów ko ńcowych mog ą wymaga ć dalszej oceny.  
Powinny zosta ć dostarczone dane indywidualne zwierz ąt. Dodat­
kowo wszystkie dane powinny by ć podsumowane w formie tabeli, 
przedstawiaj ąc dla każdej grupy badanej liczb ę zwierząt na pocz ątku 
testu, liczb ę zwierząt wykazuj ących zmiany patologiczne, skutki 
behawioralne i biochemiczne, typy i ostro ść tych zmian patologicz ­
nych lub skutków oraz procent zwierz ąt okazujących każdy typ 
i ostrość zmiany patologicznej lub skutku.  
Wyniki badania powinny by ć ocenione pod wzgl ędem częstotli­
wości, ostrości, i korelacji skutków behawioralnych, biochemicznych 
i histopatologicznych oraz jakichkolwiek innych obserwowanych 
w każdej z grup badanych i kontrolnych.  
Wyniki liczbowe powinny by ć ocenione za pomoc ą odpowiedniej 
i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny by ć wybrane podczas planowania badania.
 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
SPRAWOZDANIE Z TESTU  
Sprawozdanie z testu obejmuje, je żeli możliwe, nast ępujące informa ­
cje: 
Zwierzęta badane:  
— wykorzystana rasa,  
— liczba i wiek zwierz ąt, 
— źródło, warunki, w których przebywaj ą zwierzęta itp.,  
— indywidualna waga zwierz ąt na pocz ątku testu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
Warunki testu:  
— szczegó ły dotyczące przygotowania substancji testowanej, trwa ­ 
łości i homogeniczno ści; w odpowiednich przypadkach,  
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— szczegó ły podawania substancji testowanej,  
— szczegó ły jakości pożywienia i wody,  
— racjonalna podstawa wyboru dawki,  
— parametry podawanych dawek, w tym szczegó ły dotycz ące 
nośnika, objętości i formy fizycznej podawanych materia łów, 
— racjonalna podstawa wyboru innych terminów oznaczenia 
biochemicznego, je żeli są one inne ni ż 24 i 48 h.  
Wyniki:  
— dane dotycz ące masy cia ła, 
— dane dotycz ące reakcji toksycznej wed ług grupy,  
— w tym śmiertelno ść, 
— natura, ostro ść i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwra ­
calne, czy nie),  
— szczegó łowy opis metod biochemicznych i wyników,  
— wyniki sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,  
— statystyczna obróbka wyników, gdzie jest to w łaściwe.  
Rozpatrzenie wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 419.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  TEST POREPERACYJNEJ SYNTEZY DNA Z KOMÓRKAMI 
WĄTROBY SSAKÓW  IN VIVO  
1. METODA  
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 486, testu poreperacyjnej 
syntezy DNA z komórkami w ątroby ssaków  in vivo  (1997).  
1.1. WPROWADZENIE  
Celem testu poreperacyjnej syntezy DNA z komórkami w ątroby 
ssaków  in vivo  (UDS) jest zidentyfikowanie substancji badanych, 
które wywo łują napraw ę DNA w komórkach w ątroby lub 
u zwierząt poddanych dzia łaniu substancji (1)(2)(3)(4).  
To badanie  in vivo  przewiduje metod ę wykrywania skutków genoto ­
ksycznych substancji chemicznej w w ątrobie. Zmierzony punkt 
końcowy jest wska źnikiem uszkodzenia DNA oraz dalszych napraw 
w komórkach w ątroby. Wątroba jest zazwyczaj g łównym miejscem, 
gdzie odbywa si ę przemiana materii wch łanianych zwi ązków. Jest 
zatem właściwym miejscem pomiarów uszkodzenia DNA  in vivo . 
Jeżeli istniej ą dowody na to, że substancja nie dotrze do tkanek 
docelowych, wykorzystanie tego badania nie jest w łaściwe.  
Punkt ko ńcowy testu poreperacyjnej syntezy DNA z komórkami 
wątroby ssaków  in vivo  mierzony jest przez oznaczenie poboru ozna ­
czonych nukleozydów w komórkach, które nie s ą poddawane 
syntezie bia łka (faza S). Najpowszechniej wykorzystywan ą techniką 
jest oznaczanie poboru wykorzystanej oznaczonej trytem tymidyny 
( 3 H-TdR) przez autoradiografi ę. Preferuje si ę wykorzystywanie 
wątroby szczurów do przeprowadzenia bada ń in vivo  UDS. Tkanki 
inne niż wątrobowe mog ą zostać wykorzystane, ale nie podlegaj ą 
one tej metodzie.  
Wykrycie reakcji UDS uzale żnione jest od ilo ści zasad DNA usuni ę­
tych i zast ąpionych w miejscu uszkodzenia. Z tego wzgl ędu badanie 
UDS ma szczególn ą wartość w odniesieniu do wykrywania wywo ­ 
łanych przez substancj ę napraw (20–30 zasad). Odwrotnie, „repe ­
racja krótkich fragmentów DNA” (jedna do trzech zasad) jest wykry ­
wana ze znacznie mniejsz ą czułością. Co więcej, zdarzenia muta ­
genne mog ą wynikać ze wzgl ędu na nienaprawienie, niew łaściwą 
naprawę, niewłaściwe zast ąpienie defektów DNA. Zakres reakcji 
UDS nie zawiera wskazania dok ładności procesu naprawy. Dodat ­
kowo mo żliwe jest, że mutagen reaguje z DNA, ale uszkodzenie 
DNA nie jest naprawione poprzez wycinek procesu naprawczego. 
Brak szczegó łowych informacji dotycz ących aktywno ści mutagennej 
dostarczonych przez badanie UDS jest wyrównywane przez potencja ł 
wrażliwości tego punktu ko ńcowego, poniewa ż jest on mierzony 
w całym genomie.  
Zob. także Ogólne wprowadzenie do cz ęści B.  
1.2. DEFINICJE  
Komórki w naprawie:  względna ilość ziarnisto ści jądrowych 
(NNG) wy ższa niż aktualna warto ść, która ma zosta ć uzasadniona 
w laboratorium, w którym przeprowadzane s ą badania.  
Względna ilość ziarnisto ści jądrowych (NNG):  miara ilo ściowa 
w odniesieniu do aktywno ści UDS komórek w testach autoradiogra ­
ficznych UDS, obliczona przez odejmowanie średniej ilo ści jąder 
cytoplazmowych w obszarach cytoplazmowych równowa żnych 
jądru (CG) od ilo ści ziarnisto ści jądrowych (NG): NNG = NG – 
CG. NNG oblicze ń dokonuje si ę dla poszczególnych komórek, 
a następnie łączy się dla komórek w ramach danej hodowli, 
w równoleg łych hodowlach itd.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Test poreperacyjnej syntezy DNA (UDS):  synteza reperacyjna 
DNA po wyci ęciu oraz usuni ęciu części DNA zawieraj ącej region 
uszkodzenia wywo łanego substancjami chemicznymi lub czynnikami 
fizycznymi.  
1.3. ZASAD METODY BADAWCZEJ  
Badanie UDS na komórkach w ątroby ssaków wskazuje syntez ę 
naprawcz ą DNA po wyci ęciu oraz usuni ęciu odcinka DNA zawie ­
rającego region uszkodzenia wywo łanego substancjami chemicznymi 
lub czynnikami fizycznymi. Badanie zazwyczaj opiera si ę na 
włączeniu  3 H-TdR do DNA komórek w ątroby, które posiadaj ą 
niską częstotliwość komórek w fazie S cyklu komórkowego. Pobór  
3 H-TdR zazwyczaj jest oznaczany przez auroradiografi ę, ze wzgl ędu 
na to, że ta technika nie jest tak podatna na zak łócenie przez 
komórki fazy S jak na przyk ład płynne podliczanie scyntalizacji.  
1.4. OPIS METODY  
1.4.1.  Preparaty  
1.4.1.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Powszechnie wykorzystywane s ą szczury, chocia ż każdy odpowiedni 
gatunek ssaków mo że zostać wykorzystany. Powszechnie wykorzy ­
stywane szczepy laboratoryjne m łodych, zdrowych dojrza łych 
zwierząt powinny zosta ć wykorzystane. W trakcie przeprowadzania 
badania, zmienno ść masy zwierz ąt powinno by ć minimalne oraz nie 
powinno przekracza ć ± 20 % średniej masy dla ka żdej z płci. 
1.4.1.2.  Warunki przetrzymywania oraz karmienia  
Ogólne warunki okre ślone w Ogólnym wprowadzeniu do cz ęści B są 
stosowane, chocia ż celem w odniesieniu do wilgotno ści powinien 
być poziom 50–60 %.  
1.4.1.3.  Przygotowanie zwierz ąt 
Zdrowe m łode doros łe osobniki zwierz ąt są losowo przypisane do 
grup kontrolnych oraz grup poddanych dzia łaniu substancji. Klatki 
powinny zosta ć przygotowane w sposób minimalizuj ący możliwe 
skutki negatywne wynikaj ące z umieszczenia w klatce. Zwierz ęta 
są identyfikowane oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryj ­
nych przynajmniej przez okres pi ęciu dni.  
1.4.1.4.  Substancja badana/przygotowanie  
Stała substancja badana powinna zosta ć rozpuszczona lub zawie ­
szona w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz 
rozcieńczona, jeżeli jest to odpowiednie przed dawkowaniem zwie ­
rzętom. Płynne substancje mog ą być dawkowane bezpo średnio lub 
rozcieńczane przed dawkowaniem. Powinny zosta ć wykorzystane 
świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotycz ące stabil­
ności wskazuj ą, iż dopuszczalne jest sk ładowanie substancji  
1.4.2.  Warunki badania  
1.4.2.1.  Rozpuszczalnik/no śnik 
Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien wywo ływać skutków toksycz ­
nych przy wykorzystanym poziomie dawek oraz w odniesieniu do 
niego nie powinno by ć spodziewane reagowanie chemiczne 
z substancj ą badaną. Jeśli inne ni ż dobrze znane rozpuszczalniki/ ­
nośniki są wykorzystywane, ich w łączenie do do świadczenia 
powinno by ć wsparte danymi wskazuj ącymi ich zgodno ść. Zaleca 
się, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści rozważone zosta ło 
wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/no śników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Kontrole  
Równoleg łe pozytywne oraz negatywne kontrole (rozpuszczalnik/ ­
nośnik) powinny zosta ć objęte każdą, niezależnie przeprowadzan ą 
częścią doświadczenia. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu substancji 
badanej, zwierz ęta w grupie kontrolnej powinny by ć poddawane 
działaniom w identyczny sposób, jak zwierz ęta w grupach 
poddanych dzia łaniu substancji.  
Pozytywnymi kontrolami powinny by ć substancje znane 
z wytwarzania UDS, je żeli są podawane przy poziomie poddania 
działaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje si ę, iż da 
wykrywalny wzrost powy żej tła. Pozytywne kontrole, potrzebuj ące 
aktywacji metabolicznej powinny by ć wykorzystywane, je żeli są 
podawane przy dawkach wywo łujących umiarkowane reakcje (4). 
Dawki mog ą zostać wybrane tak, aby skutki by ły jasne, ale aby 
nie ujawnia ły natychmiast badaj ącemu tożsamości zakodowanych 
szkiełek mikroskopowych. Przyk ładami pozytywnych substancji 
kontrolnych s ą: 
Okresy pobierania próbek Substancje Nr CAS Nr Einecs  
Wczesne okresy pobierania próbek 
(2–4 godzin) N-nitrozodimetyloamina 62-75-9 200-249-8 
Późne okresy pobierania próbek 
(12-16 godzin) N-2-fluorenyloacetamid (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Inne odpowiednie kontrolne substancje chemiczne mog ą zostać 
wykorzystane. Dopuszczalne jest, by pozytywne kontrole by ły poda­
wane drog ą inną niż substancja badana.  
1.5. PROCEDURA  
1.5.1.  Liczba oraz p łeć zwierząt 
Powinna zosta ć wykorzystana odpowiednia liczba zwierz ąt w celu 
uwzględnienia naturalnej biologicznej zmienno ści reakcji. Liczba 
zwierząt powinna przynajmniej stanowi ć trzy nadaj ące się do 
poddania analizie osobniki na grup ę. W przypadku gdy zosta ła zgro­
madzona znacz ąca baza danych, jedynie jedno zwierz ę lub dwa 
zwierzęta są wymagane w odniesieniu do równoleg łych negatyw ­
nych i pozytywnych grup kontrolnych.  
Jeżeli w trakcie badania istniej ą dostępne dane z bada ń dotyczących 
tego samego gatunku, wykorzystuj ąc tę samą drogę poddania dzia ­ 
łaniu substancji, które wskazuj ą, że nie istniej ą zasadnicze ró żnice 
w toksyczno ści między płciami, badanie jednej p łci będzie wystar ­
czające. W przypadku poddawania cz łowieka dzia łaniu substancji, 
badanie mo że być specyficzne co do p łci, tak jak na przyk ład 
w odniesieniu do niektórych środków farmaceutycznych, badanie 
powinno zosta ć przeprowadzone z udzia łem zwierz ąt odpowiedniej 
płci. 
1.5.2.  Harmonogram poddania dzia łaniu substancji  
Substancje badane s ą w ujęciu ogólnym podawane jako pojedynczy 
zabieg poddania dzia łaniu substancji.  
1.5.3.  Poziomy dawek  
Zazwyczaj wykorzystywane s ą przynajmniej dwa poziomy dawek. 
Najwyższa dawka jest okre ślona jako dawka wywo łująca oznaki 
toksyczno ści a wyższe poziomy dawek oparte na tym samym re żimie 
dawkowania mog łyby być zabójcze. Ogólnie ni ższa dawka powinna 
wynosić od 50 % do 25 % wysokiej dawki.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
Substancje o szczególnej aktywno ści biologicznej przy niskich nieto ­
ksycznych dawkach (takie jak hormony i mitogeny) mog ą stanowić 
wyjątek w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny by ć 
oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Je żeli przeprowa ­
dzane jest studium okre ślające zakres badania, powinno by ć ono 
przeprowadzone w tym samym laboratorium, wykorzystuj ąc ten 
sam reżim gatunku, szczepu, p łci oraz poddawania dzia łaniu substan ­
cji, który ma zosta ć wykorzystany w badaniu g łównym.  
Najwyższa dawka mo że być również określona jako dawka, która 
wywołuje pewne wskazania toksyczno ści w wątrobie (np. j ądrze pikno ­
tycznym).  
1.5.4.  Badanie ograniczone  
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek o przynajmniej 
2 000 mg/kg masy cia ła zastosowane w pojedynczym poddaniu dzia ­ 
łaniu substancji lub jako dwa zabiegi poddania dzia łaniu substancji 
tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych wyników toksycznych, oraz jeżeli nie podejrzewa si ę genotoksyczno ści w oparciu o dane 
dotyczące substancji powi ązanych strukturalnie, wówczas przepro ­
wadzenie pe łnego badania mo że nie być konieczne. Spodziewa si ę, 
iż poddanie cz łowieka dzia łaniu substancji mo że wykaza ć potrzebę 
wykorzystania wi ększej dawki w badaniu ograniczonym.
 
1.5.5.  Dawkowanie  
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zg łębnik żołądkowy 
lub odpowiedni ą rurkę intubacyjn ą. Inne drogi poddania dzia łaniu 
substancji mog ą być dopuszczalne w przypadku gdy ich wykorzystanie 
jest uzasadnione. Jednak że droga wewn ątrzotrzewnowa nie jest zalecana 
ze względu na to, że mogłaby podda ć wątrobę bezpośrednio dzia łaniu 
substancji badanej, co jest bardziej prawdopodobne ni ż w przypadku 
poddania dzia łaniu substancji przez krwiobieg. Maksymalna obj ętość 
płynu, jaka mo że być podana przez zg łębnik lub wstrzykni ęta jednora ­
zowo zale ży od wielko ści badanego zwierz ęcia. Objętość nie powinna 
przekracza ć 2 ml/100 g masy cia ła. Wykorzystanie obj ętości wyższych 
niż te musi by ć uzasadnione. Z wyj ątkiem podra żniających lub żrących 
substancji, które zazwyczaj ujawniaj ą zwiększone skutki o du żym stęże­
niu, zmienno ści w objętości substancji badanej powinny zosta ć zmini­
malizowane przez dostosowanie st ężenia w celu zapewnienia sta łej obję­
tości przy wszystkich poziomach dawek.  
1.5.6.  Przygotowanie komórek w ątroby  
Komórki w ątroby przygotowywane s ą z poddanych dzia łaniu substancji 
zwierząt zazwyczaj w 12–16 godzin po dawkowaniu. Dodatkowy 
wcześniejszy okres pobierania próbek (zazwyczaj 2–4 godzin po 
poddaniu dzia łaniu substancji) jest generalnie niezb ędny, chyba że 
istnieje jasna pozytywna reakcja przy 12–16 godzinach. Jednak że alter­
natywne okresy pobierania próbek mog ą być wykorzystane, je żeli są 
uzasadnione na podstawie danych toksykokinetycznych.  
Krótkookresowe hodowle komórek w ątrobowych ssaków s ą zazwy­
czaj ustanawiane przez przecedzanie w ątroby  in situ  z kolagenaz ą 
i pozwalaj ąc na przytwierdzenie świeżo dysocjowanych komórek 
wątroby do odpowiedniej powierzchni. Komórki w ątroby ze zwierz ąt 
kontroli negatywnych powinny posiada ć zdolność do życia (5) 
wynoszącą przynajmniej 50 %.  
1.5.7.  Oznaczanie UDS  
Świeżo oddzielone komórki w ątroby ssaków s ą inkubowane zazwyczaj 
w podłożu zawieraj ącym  3 H-TdR przez odpowiedni okres czasu, np. 3–8 
godzin. Na koniec okresu inkubacji pod łoże powinno zosta ć usunięte od 
komórek, które mog ą następnie być inkubowane w pod łożu zawieraj ­ 
ącym nadmiar nieoznaczonej tymidyny w celu zmniejszenia 
niewłączonej radioaktywno ści („zimny obieg”). Nast ępnie komórki s ą 
płukane, stabilizowane oraz suszone. W odniesieniu do okresów inku ­
bacji bardziej przed łużonych w czasie zimny obieg mo że nie być 
konieczny. Szkie łka mikroskopowe s ą zanurzane w emulsji autoradio ­
graficznej, poddawane dzia łaniu substancji w ciemno ści (np. przetrzy ­
mywane w lodówce przez 7–14 dni), wytwarzane, barwione, a srebrne 
ziarna są podliczane. Przygotowywane s ą dwa lub trzy szkie łka mikro­
skopowe dla ka żdego zwierz ęcia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Analiza  
Preparaty szkie łek mikroskopowych powinny zawiera ć wystarczaj ącą 
liczbę komórek o normalnej morfologii w celu umo żliwienia prze ­
prowadzenia maj ącej znaczenie oceny UDS. Preparaty s ą badane 
mikroskopowo pod k ątem oznak jawnej cytotoksyczno ści (np. 
pyknoza, zmniejszony poziom oznaczenia radioaktywno ści). 
Szkiełka mikroskopowe powinny by ć kodowane przed podliczeniem 
ziaren. Zazwyczaj 100 komórek jest ocenianych z ka żdego zwierz ę­
cia, z przynajmniej dwu szkie łek mikroskopowych; ocena mniejszej 
ilości niż 100 komórek/zwierz ę powinna zosta ć uzasadniona. Ilo ści 
ziaren nie s ą oceniane punktowo w odniesieniu do S-fazy j ądra, ale 
udział komórek S-fazy mo że zostać odnotowany.  
Ilość włączenia  3 H-TdR w j ądrze oraz cytoplazmy normalnych pod 
względem morfologii komórek, jak potwierdzono przez osadzanie si ę 
srebrnych ziaren, powinna by ć oznaczona odpowiedni ą metodą. 
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Powinny zosta ć dostarczone indywidualne szkie łka mikroskopowe 
oraz dane dotycz ące zwierz ęcia. dodatkowo wszystkie dane powinny 
zostać podsumowane w formie tabelarycznej. Wzgl ędna ilość ziar­
nistości jądrowych (NNG) powinna zosta ć obliczona dla ka żdej 
komórki, dla ka żdego zwierz ęcia oraz dla ka żdej dawki oraz czasu 
przez odj ęcie ilości CG od ilo ści ziarnisto ści jądrowych (NG). Je śli 
„komórki w naprawie” s ą podliczane, kryteria oznaczania „komórek 
w naprawie” powinny zosta ć uzasadnione oraz oparte na historycz ­
nych danych dotycz ących kontroli negatywnej lub danych dotycz ­ 
ących równoleg łej kontroli negatywnej. Wyniki liczbowe mog ą być 
ocenione z wykorzystaniem metod statystycznych. Je żeli są wyko­
rzystywane, badania statystyczne powinny zosta ć wybrane oraz 
uzasadnione przed przeprowadzeniem badania.  
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Przykłady kryteriów w odniesieniu do pozytywnych/negatywnych 
reakcji obejmuj ą: 
pozytywne (i) warto ści NNG powy żej istniej ącego progu, 
który jest uzasadniony na podstawie historycz ­
nych danych laboratoryjnych; lub 
(ii) warto ści NNG znacz ąco wy ższe 
w porównaniu z równoleg łą kontrolą; 
negatywne (i) warto ści NNG w zakresie poni żej historycz ­
nego progu kontrolnego; lub 
(ii) warto ści NNG nieznacznie wy ższe 
w porównaniu z równoleg łą kontrolą. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
Biologiczne znaczenie danych powinno zosta ć wzięte pod uwag ę, 
np. parametry takie jak: zmienno ść międzyzwierz ęca, relacja mi ędzy 
dawką, a reakcj ą oraz cytotoksyczno ść powinny zosta ć uwzględ­
nione. Metody statystyczne mog ą być wykorzystane jako metody 
pomocnicze w ocenie wyników badania. Jednak że znaczenie staty ­
styczne nie powinno by ć jedynym czynnikiem okre ślającym 
w odniesieniu do reakcji pozytywnej.  
Chociaż większość doświadczeń będzie dawa ło w jasny sposób 
pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw 
danych b ędzie uniemo żliwiał dokonanie ostatecznej oceny 
dotyczącej aktywno ści substancji badanej. Wyniki mog ą pozostać 
niejednoznaczne lub sporne niezale żnie od tego, ile razy do świad­
czenie by ło powtarzane.  
Wyniki pozytywne z testu UDS z komórkami w ątroby ssaków  in 
vivo wskazuj ą, że substancja badana wywo łuje uszkodzenia DNA 
w komórkach w ątroby ssaków  in vivo,  które mog ą zostać napra­
wione w drodze testu poreperacyjnej syntezy DNA  in vitro . Wyniki 
negatywne wskazuj ą, że w warunkach badawczych, badana 
substancja nie wywo łuje uszkodze ń DNA, które s ą wykrywane 
przez to badanie.  
Prawdopodobie ństwo, że substancja badana dociera do g łównego 
obiegu lub szczególnie do tkanki docelowej (np. toksyczno ść syste­
mowa) powinno zosta ć omówione.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji w rozpuszczalniku/ ­
nośniku, jeżeli jest znana.  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystane gatunki/szczepy,  
— liczba oraz wiek zwierz ąt, 
— źródło, warunki przetrzymywania, od żywianie itp.,  
— indywidualna masa cia ła zwierzęcia na pocz ątku badania, w tym 
zakres masy cia ła, średnie oraz stan dardowe odst ępstwa 
w odniesieniu do ka żdej z grup.  
Warunki badania:  
— pozytywne i negatywne no śnik/rozpuszczalnik kontrole,  
— dane dotycz ące studium okre ślającego zakres badania, je żeli 
zostało przeprowadzone,  
— racjonalne uzasadnienie wyboru poziomu dawek,  
— szczegó ły dotyczące preparatu substancji badanej,  
— szczegó ły dotyczące podawania substancji badanej,  
— szczegó ły dotyczące drogi podawania substancji badanej,  
— metody sprawdzania, czy dany czynnik badany dotar ł do ogól­
nego obiegu lub tkanki docelowej, je żeli ma zastosowanie,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— zmiana st ężenia substancji badanej w od żywianiu/wodzie pitnej 
(ppm) na rzeczywist ą dawkę (mg/kg masy cia ła/dzień), jeżeli ma 
zastosowanie,  
— szczegó ły dotyczące jakości wody oraz żywności, 
— szczegó łowy opis poddania dzia łaniu substancji oraz harmono ­
gramów pobierania próbek,  
— metody pomiaru toksyczno ści, 
— metoda przygotowania i hodowli komórek w ątroby,  
— wykorzystana technika autoradiograficzna,  
— liczba sporz ądzonych szkie łek mikroskopowych oraz liczba 
ocenionych komórek,  
— kryteria oceny,  
— kryteria uznawania badania za pozytywne, negatywne lub niejed ­
noznaczne.  
Wyniki:  
— poszczególne szkie łka mikroskopowe, zwierz ęta i grupy, średnie 
wartości ziarnisto ści jądrowych, ziarnisto ści cytoplazmowych 
oraz wzgl ędna ziarnisto ść jądrowa,  
— relacja miedzy dawk ą a reakcją, jeżeli jest dost ępna, 
— ocena statystyczna, je żeli istnieje,  
— oznaki toksyczno ści, 
— dane dotycz ące równoleg łych negatywnych (rozpuszczalnik/ ­
nośnik) oraz pozytywnych kontroli,  
— historyczne dane dotycz ące negatywnej (rozpuszczalnik/no śnik) 
oraz pozytywnej kontroli z zakresem, średnimi oraz standardo ­
wymi odchyleniami,  
— liczba „komórek w naprawie”, je żeli jest oznaczona,  
— liczba komórek S-fazy, je żeli jest oznaczona,  
— zdolno ść komórek do życia.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Ashby, J. Lefevre, P. A., Burlinson, B. and Penman, M. G. 
(1985), An Assessment of the  In vivo  Rat. Hepatocyte DNA 
Repair Assay, Mutation Res., 156, pp. 1–18.  
(2) Butterworth, B. E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., 
Mirsalis, J., Probst, G. and Williams, G. (19 8 7), A Protocol 
and Guide for the  In vivo  Rat Hepatocyte DNA Repair Assay, 
Mutation Res., 189, pp. 123–133.  
(3) Kennelly, J. C, Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P. A., Burlinson, 
B., Benford, D. J., Dean, S. W. and Mitchell, I. de G. (1993),  In 
vivo Rat Liver UDS Assay, in: Kirkland D. J. and Fox M., 
(eds),  Supplementary Mutagenicity TestS: UKEM Recommended 
Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutage ­
nicity Testing. Report. Part II revised,  Cambridge University 
Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, 
pp. 52–77.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S. W., Andrac, U., Brambilla. G., Burlinson, 
B., Doolittle, D. J., Furihata, C, Hertner, T., McQueen, C. A. 
and Mori, H. (19 9 3), Recommendations for the Performance of UDS Tests  In vitro  and In vivo, Mutation Res., 312, pp. 
263–285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl. 
C. (1993), Assessment of the Relation Between the Initial Viabi ­
lity and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepatocytes Used for the  In vivo/In vitro  DNA Repair Assay (UDS), Muta ­
tion Res., 291, pp. 21–27.
 
(6) Mirsalis, J. C, Tyson, C. K. and Butterworth, B. E. (1982), 
Detection of Genotoxic Carcinogens in the  In vivo/In vitro  
Hepalocyte DNA Repair Assay, Environ. Mutagen, 4, pp. 553–562.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  BADANIE NISZCZENIA SKÓRY METOD Ą IN VITRO : TEST 
PRZEZSKÓRNEGO OPORU ELEKTRYCZNEGO (TER)  
1. METODA  
Opisywana metoda badania jest zgodna z OECD TG 430 (2004).  
1.1. WST ĘP 
Zniszczenie skóry oznacza powstawanie nieodwracalnych uszkodze ń 
tkanek skórnych w wyniku kontaktu z substancj ą testową (jak zdefi ­
niowano w Globalnie Zharmonizowanym Systemie Klasyfikacji i Oznakowania Produktów Chemicznych (GHS))(1). Metoda ta umożliwia stosowanie procedury, w której ocena poziomu uszka ­
dzania skóry nie jest przeprowadzana na żywych zwierz ętach.
 
Do tej pory ocena zniszczenia skóry wi ązała się zwykle z u życiem 
zwierząt laboratoryjnych (2). Potrzeba wyeliminowania bólu 
i cierpienia zwierz ąt została uwzględniona w modyfikacji metody 
badania B.4, umo żliwiającej określenie zniszczenia skóry przy 
użyciu alternatywnych metod  in vitro , bez zadawania zwierz ętom 
bólu i cierpienia.  
Pierwszym krokiem w kierunku zdefiniowania alternatywnych 
testów, które mog łyby zosta ć zastosowane do celów regulacyjnych, 
było przeprowadzenie bada ń prewalidacyjnych (3). Nast ępnie prze ­
prowadzono formalne badania walidacyjne (6)(7)(8) oceny znisz ­
czenia skóry metodami  in vitro  (4)(5). Wyniki tych bada ń oraz 
inne publikacje sta ły się podstawą zalecenia, że do oceny niszczenia 
skóry  in vivo  można stosowa ć następujące testy (9)(10)(11): test 
modelu skóry ludzkiej (zob. metoda badania B.40 bis) oraz test przezskórnego oporu elektrycznego (niniejsza metoda).
 
Badania walidacyjne oraz opublikowane wyniki innych bada ń wska­
zują, że test przezskórnego oporu elektrycznego (TER)(12)(13) 
pozwala na wiarygodne rozró żnienie znanych substancji niszcz ących 
skórę i nieniszcz ących skóry (5)(9).  
Test przedstawiony w opisie tej metody umo żliwia identyfikacj ę 
związków i mieszanin chemicznych uszkadzaj ących skór ę. Ponadto 
w połączeniu z dowodami uzyskanymi na podstawie innych dost ęp­
nych informacji (np. pH, zwi ązek między struktur ą a aktywno ścią, 
dane dotycz ące człowieka i zwierz ąt) umożliwia identyfikacj ę 
związków i mieszanin, które nie niszcz ą skóry (1)(2)(11)(14). Nie 
dostarcza informacji o podra żnieniach skóry, nie umo żliwia także 
dzielenia substancji uszkadzaj ących na podkategorie, jak dopusz ­
czono w Globalnie Zharmonizowanym Systemie Klasyfikacji (GHS) (1).
 
Zaleca się, aby w celu pe łnej oceny miejscowego dzia łania na skór ę 
po pojedynczej ekspozycji post ępować zgodnie z sekwencyjn ą stra­
tegią przedstawion ą w dodatku do metody badania B.4 (2) i w 
Globalnie Zharmonizowanym Systemie (GHS) (1). Ta strategia testowa obejmuje przeprowadzenie testów  in vitro  zniszczenia 
skóry (jak przedstawiono w opisie metody) i podra żnienia skóry 
przed rozwa żaniem przeprowadzenia bada ń na żywych zwierz ętach.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINICJE  
Zniszczenie skóry  in vivo : oznacza spowodowanie nieodwracalnych 
uszkodzeń skóry: a mianowicie widocznej martwicy skóry 
w warstwie naskórka i skóry w łaściwej w wyniku kontaktu 
z substancj ą testową w okresie do 4 godzin. Typowymi objawami 
zniszczenia skóry s ą wrzody, krwawienie, krwawi ące strupy oraz, 
pod koniec 14-dniowego okresu obserwacji, odbarwienie skóry spowodowane zbieleniem, pojawianie si ę całkowitych łysin i blizn. 
W przypadku w ątpliwych uszkodze ń należy zastosowa ć metody 
histopatologiczne.
 
Przezskórny opór elektryczny (TER):  jest miar ą impedancji skóry, 
wartością oporu elektrycznego w kiloomach. Jest to prosta i pewna 
metoda ocena funkcjonowania bariery skórnej przez rejestrowanie 
przy użyciu mostka Wheatstone'a przechodzenia przez skór ę jonów.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Tabela 1  
Chemiczne substancje odniesienia  
Nazwa Nr EINECS Nr CAS  
1,2-diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Silne dzia łanie niszcz ące 
Kwas akrylowy 201-177-9 79-10-7 Silne dzia łanie niszcz ące 
2-tert. Butylofenol 201-807-2 88-18-6 Dzia łanie niszcz ące 
Wodorotlenek potasu (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Dzia łanie niszcz ące 
Kwas siarkowy (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Dzia łanie niszcz ące 
Kwas oktanowy (kwas kaprylowy) 204-677-5 124-07-02 Dzia łanie niszcz ące 
4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Brak dzia łania niszcz ącego 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Brak dzia łania niszcz ącego 
Bromek fenetylu 203-130-8 103-63-9 Brak dzia łania niszcz ącego 
Tetrachloroetylen 204-825-9 27-18-4 Brak dzia łania niszcz ącego 
Kwas izostearynowy 250-178-0 30399-84-9 Brak dzia łania niszcz ącego 
4-(metylotio)-benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Brak dzia łania niszcz ącego  
Większość z wymienionych zwi ązków chemicznych pochodzi 
z wykazu chemikaliów przygotowanego na potrzeby mi ędzynarodo ­
wego studium atestacyjnego ECVAM (4). Ich wybór opiera si ę na 
następujących kryteriach:  
(i) taka sama liczba substancji niszcz ących, jak i nieniszcz ących;  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
(ii) dostępne w handlu substancje nale żące do wi ększości stosow ­
nych klas zwi ązków chemicznych;  
(iii) uwzgl ędnienie zarówno silnie niszcz ących jak i s łabiej nisz ­
czących substancji, aby umo żliwić rozróżnianie na podstawie 
właściwości niszczących;  
(iv) wybór chemikaliów, które mog ą być poddawane obróbce 
w laboratorium nie stwarzaj ąc zagrożeń innych ni ż zniszczenie 
skóry.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Materiał testowy jest nak ładany na okres do 24 godzin na naskór ­
kową powierzchni ę krążków skórnych w dwucz ęściowym systemie 
testowym, w którym kr ążki pełnią funkcję przegrody mi ędzy dwoma 
częściami. Kr ążki skóry pobierane s ą od szczurów w wieku 28–30 
dni uśmiercanych w humanitarny sposób. Materia ły uznawane s ą za 
niszczące na podstawie ich zdolno ści do uszkadzania struktury 
warstwy rogowej i zaburzania funkcji izolacyjnej, co mierzone jest 
spadkiem TER poni żej poziomu progowego (12). W przypadku TER 
u szczurów przyj ęto wartość graniczn ą 5 kΩ; wartość tę ustalono na 
podstawie wielu danych dla szerokiego zakresu zwi ązków chemicz ­
nych, dla których znaczna wi ększość wartości było albo wyra źnie 
wyższych (cz ęsto >10 k Ω) albo znacznie ni ższych (cz ęsto < 3 k Ω) 
od tej warto ści (12). Generalnie materia ły, które w przypadku 
zwierząt nie niszcz ą skóry, tylko j ą podrażniają lub w ogóle jej 
nie podra żniają nie powoduj ą spadku TER poni żej tej warto ści 
graniczną. Co więcej, zastosowanie innych preparatów skóry lub 
innego sprz ętu może zmienić wartość graniczn ą, powoduj ąc koniecz ­
ność dalszej walidacji.  
Etap wiązania barwnika jest w łączony do procedury testowej maj ącej 
potwierdzi ć dodatnie wyniki TER, w tym warto ści w pobli żu 5 kΩ. 
Etap wiązania barwnika pozwala na stwierdzenie, czy wzrost prze ­
puszczalno ści jonów jest spowodowany fizycznym zniszczeniem 
warstwy rogowej. Wykazano, że metoda TER z wykorzystaniem 
skóry szczurów świadczy o potencjale niszcz ącym in vivo , 
badanym metod ą badania B.4 (2) u królików. Nale ży zauważyć, że 
test in vivo  na królikach jest w porównaniu z testem wycinka ludz ­
kiej skóry wysoce konserwatywny, je śli chodzi o potencja ł nisz­
czenia skóry (15).  
1.5. OPIS METODY BADANIA  
1.5.1.  Zwierz ęta 
Szczury s ą gatunkiem preferowanym, poniewa ż wcześniej wykazano 
wrażliwość ich skóry na substancje chemiczne (10). Wiek (w 
momencie pobierania skóry) i linia szczurów maj ą zasadnicze 
znaczenie, bowiem od tego zale ży, czy mieszki w łosowe s ą 
w stanie w stanie u śpienia poprzedzaj ącym fazę wzrostu w łosa 
u dorosłych osobników.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Włosy z grzbietu i boku cia ła młodych, oko ło 22-dniowych samców 
lub samic szczurów (pochodz ących od linii Wistar lub podobnych), 
są starannie usuwane ma ła pincetą. Następnie zwierz ęta są czysz­
czone przez staranne przetarcie, natomiast miejsca, z których usuwano w łosy, są pokrywane roztworem antybiotyku (zawieraj ­ 
ącym na przyk ład streptomycyn ę, penicylin ę, chloramfenikol 
i amfoterycyn ę w stężeniach zapewniaj ących zahamowanie rozwoju 
bakterii). Zwierz ęta są przemywane antybiotykiem powtórnie trze ­
ciego lub czwartego dnia po pierwszym przemyciu i s ą poddawane 
eksperymentowi w ci ągu trzech dni od drugiego przemycia, kiedy 
warstwa rogowa ulegnie regeneracji po usuwaniu w łosów.
 
1.5.2.  Przygotowanie kr ążków skóry  
Zwierzęta są zabijane w sposób humanitarny, kiedy maj ą 28–30 dni; 
wiek ma tu szczególne znaczenie. Z grzbietu i boków cia ła każdego 
zwierzęcia pobierana jest skóra, z której nast ępnie usuwa si ę 
starannie nadmiar t łuszczu podskórnego. Pobierane s ą krążki skóry 
o średnicy oko ło 20 mm. Przed u życiem krążków skóra mo że być 
przechowywana, je śli wykazano, że dane dla kontroli pozytywnej 
i negatywnej s ą równowa żne z danymi uzyskanymi przy u życiu 
świeżej skóry.  
Każdy krążek skóry jest umieszczany nad jednym z ko ńców rurki 
TFE (politetrafluoroetylenowej), przy czym trzeba dopilnowa ć, aby 
powierzchnia naskórkowa przylega ła do rurki. Na koniec rury nak ła­
dany jest gumowy pier ścień, który utrzymuje skór ę w odpowiedniej 
pozycji, a nadmiar tkanki jest odcinany. Wymiary rurki i pier ścienia 
pokazano na rysunku 2. Po łączenie mi ędzy rurką PTFE a gumowym 
pierścieniem jest nast ępnie starannie uszczelniane wazelin ą. Rurka 
jest następnie mocowana spr ężynowym zaciskiem wewn ątrz komory 
receptorowej zawieraj ącej roztwór MgSO  4 (154 mM) (rysunek 1). 
Krążek skóry powinien by ć całkowicie zanurzony w roztworze 
MgSO  4 . Z jednej skóry szczura mo żna otrzyma ć 10–15 kr ążków.  
Przed rozpocz ęciem testów dla ka żdej skóry zwierz ęcej mierzy si ę 
opór elektryczny dwóch kr ążków skórnych, co stanowi procedur ę 
kontroli jako ści. Aby reszta kr ążków mog ła zostać użyta do testów, 
wartości oporu dla obu kr ążków powinny by ć wyższe niż 10 kΩ. 
Jeśli wartość oporu jest mniejsza ni ż 10 kΩ, resztę krążków z tej 
skóry nale ży wyrzuci ć. 
1.5.3.  Nak ładanie substancji testowej i kontrolnej  
Aby zapewni ć odpowiedni ą jakość testu, w ka żdym badaniu nale ży 
równocze śnie stosowa ć kontrolę pozytywn ą i negatywn ą. Należy 
używać krążków ze skóry jednego zwierz ęcia. Jako substancji 
kontroli pozytywnej i negatywnej zaleca si ę używać odpowiednio 
10 M kwasu solnego i wody destylowanej.  
Płynne substancje testowe nak łada się równomiernie na powierzchni ę 
naskórkow ą wewnątrz rurki (150 μL). Aby mie ć pewność w czasie 
badania materia łów stałych, że pokryta jest ca ła powierzchnia, na 
krążek nakłada się równomiernie odpowiedni ą ilość materia łu 
stałego. Do substancji sta łej dodaje si ę wodę dejonizowan ą (150 
uL) i delikatnie potrz ąsa się rurką. W celu zapewnienia maksymal ­
nego kontaktu cz ąstek stałych ze skór ą może być konieczne albo ich 
podgrzanie do 30  o C, aby je stopi ć lub zmiękczyć, albo zmielenie, 
aby otrzyma ć granulat lub proszek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Dla każdej substancji testowej i kontrolnej stosuje si ę trzy krążki 
skóry. Substancje testowe nak łada się na 24 godziny przy tempera ­
turze 20–23  o C. Substancja testowa jest zmywana strumieniem wody 
wodociągowej o temperaturze 30  o C do momentu, a ż nie da si ę już 
usunąć więcej materia łu. 
1.5.4.  Pomiary TER  
Impedancja skóry jest mierzona jako TER za pomoc ą niskonapi ęcio­
wego mostka Wheatstone'a przy zastosowaniu pr ądu zmiennego (13). 
Ogólne dane techniczne mostka to napi ęcie robocze 1–3 V, pr ąd 
zmienny 50–100 Hz sinusoidalny lub prostok ątny i zakres pomiaru 
co najmniej 0,1–30 k Ω Mostek stosowany w badaniach walidacyj ­
nych mierzy indukcyjno ść, opór bierny pojemno ściowy i opór do 
wartości odpowiednio 2 000 H, 2 000 μF oraz 2  MΩ, przy częstot­
liwości 100 Hz lub 1 kHz i przy po łączeniach szeregowych lub 
równoleg łych. Do celów oceny poziomu niszczenia skóry TER 
dokonuje si ę pomiarów oporu przy cz ęstotliwości 100 Hz i przy 
zastosowaniu po łączeń szeregowych. Przed dokonaniem pomiaru 
oporu elektrycznego zmniejsza si ę napięcie skóry przez dodanie 
dostatecznej ilo ści 70 % etanolu, aby pokry ć naskórek. Po paru 
sekundach usuwa si ę etanol z rurki, a tkank ę uwadnia przez dodanie 
3 mL roztworu MgSO  4 (154 mM). W celu zmierzenia oporu kr ążka 
skóry w k Ω, po obu jego stronach s ą umieszczane elektrody mostka 
(rysunek 1). Wymiary elektrod i d ługość elektrod obna żonych 
poniżej zacisku szcz ękowego s ą pokazane na rysunku 2. W czasie 
pomiaru oporu zacisk przymocowany do wewn ętrznej elektrody 
opiera si ę na szczycie rurki PTFE, aby mie ć pewność, że 
w roztworze MgSO  4 zanurzony jest ci ągły odcinek elektrody. Elek ­
troda zewn ętrzna umieszczona jest wewn ątrz części receptorowej, na 
jej dnie. Nale ży utrzymywa ć stałą odległość między zaciskiem szcz ę­
kowym a dnem rurki PTFE (rysunek 2), poniewa ż odległość ma 
wpływ na otrzymywane warto ści oporu. W zwi ązku z tym odleg łość 
między wewn ętrzną elektrodą a krążkiem skóry powinna by ć stała 
i minimalna (1–2 mm).  
Jeśli zmierzona warto ść oporu jest wi ększa niż 20 kΩ, może to być 
spowodowane pozosta łościami substancji testowej pokrywaj ącej 
naskórkow ą powierzchni ę krążka skóry. Mo żna próbowa ć usunąć 
tę warstwę, na przyk ład zatykaj ąc rurkę palcem w r ękawiczce 
i potrząsając rurką przez oko ło 10 sekund; usuwa si ę roztwór 
MgSO  4 i powtarza pomiar oporu przy zastosowaniu nowej porcji 
MgSO  4 . 
Na otrzymane warto ści TER mog ą mieć wpływ charakterystyka 
i wymiary aparatu testowego oraz zastosowana procedura ekspery ­
mentalna. Na podstawie danych uzyskanych przy u życiu okre ślonej 
aparatury i procedury, przedstawionych w opisie tej metody, usta ­
lono 5 k Ω próg poziomu niszczenia skóry. Je śli warunki testu 
zostaną zmienione lub je śli stosuje si ę inną aparaturę, zastosowanie 
mogą znajdowa ć inne progi i warto ści kontrolne. Tak wi ęc 
konieczne jest dokonanie kalibracji metodyki i warto ści progów 
oporu przez zbadanie szeregu wzorców wybranych spo śród 
substancji chemicznych u żytych w badaniu walidacyjnym (4) (5) 
lub spośród związków chemicznych podobnych do badanych 
substancji. Zestaw odpowiednich substancji wzorcowych zamiesz ­
czono w tabeli 1.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Metody wi ązania barwników  
Działanie niektórych materia łów nieniszcz ących skóry mo że 
prowadzić do zmniejszenia oporu poni żej wartości granicznej 5 
kΩ, umożliwiając przechodzenie jonów przez warstw ę rogową i w 
ten sposób redukuj ąc opór elektryczny (5). Na przyk ład obojętne 
związki organiczne oraz zwi ązki powierzchniowo czynne (w tym 
detergenty, emulgatory i inne surfaktanty) mog ą usuwać ze skóry 
tłuszcz, powoduj ąc, że bariera skórna staje si ę bardziej przepusz ­
czalna dla jonów. Tak wi ęc, jeśli wartości TER substancji testowych 
są niższe niż lub zbliżone do 5 k Ω przy braku widocznego uszko ­
dzenia, nale ży dla tkanek kontrolnych i badanych przeprowadzi ć test 
przenikania barwnika, aby stwierdzi ć, czy uzyskane warto ści TER są 
wynikiem zwi ększonej przepuszczalno ści skóry czy jej uszkodzenia 
(3)(5). W tym drugim przypadku, je śli uszkodzona jest warstwa 
rogowa, barwnik sulforodamina B szybko przenika w g łąb skóry 
i zabarwia le żącą głębiej tkank ę. Ten szczególny barwnik nie 
wchodzi w reakcj ę z wieloma ró żnymi zwi ązkami chemicznymi 
i nie ma na niego wp ływu procedura ekstrakcji opisana poni żej. 
1.5.5.1.  Stosowanie barwnika sulforodaminy B i jego usuwanie  
Po pomiarze TER siarczan magnezu jest usuwany z rurki i skóra jest 
poddawana dok ładnym ogl ędzinom, aby sprawdzi ć, czy są na niej 
widoczne uszkodzenia. Je śli nie ma oczywistych du żych uszkodze ń, 
na naskórkow ą powierzchni ę każdego krążka skóry nak ładany jest na 
dwie godziny barwnik sulforodamina B (Acid Red 52; C.I. 45100; numer EINECS 222-529-8; numer CAS 3520-42-1), 150 uL 10 % (masa/obj.), rozpuszczony w wodzie destylowanej. Kr ążki skóry s ą 
następnie przemywane wod ą wodociągową w temperaturze nie 
wyższej od pokojowej przez oko ło 10 sekund, aby usun ąć wszelki 
zbędny/niezwi ązany barwnik. Ka żdy krążek skóry jest starannie 
usuwany z rurki PTFE i umieszczany w fiolce (np. 20 mL szklanej 
fiolce scyntylacyjnej) zawieraj ącej wodę dejonizowan ą (8 mL). 
Fiolki są delikatnie wstrz ąsane przez 5 minut, aby usun ąć cały 
nadmiar niezwi ązanego barwnika. Procedura p łukania jest powta ­
rzana, po czym kr ążki skóry s ą wyjmowane i umieszczane 
w fiolkach zawieraj ących 5 ml 30 % (masa/obj.) roztworu sodowego 
siarczanu dodecylu (SDS) w wodzie destylowanej i inkubowane przez noc w 60
 o C. 
Po inkubacji wszystkie kr ążki skóry s ą wyjmowane i usuwane, 
a pozosta ły roztwór jest wirowany przez 8 minut w temperaturze 
21 o C (względna siła odśrodkowa ~ 175 × g). Próbka o obj ętości 
1 mL supernatantu jest rozpuszczana w stosunku 1 do 5 (obj./obj) [tj. 1 mL + 4 mL] z 30 % (masa/obj.) SDS w wodzie destylowanej. 
Gęstość optyczną (OD) mierzy si ę przy 565 nm.
 
1.5.5.2.  Obliczanie zawarto ści barwnika  
Zawartość barwnika sulforodaminy B na kr ążek obliczana jest na 
podstawie warto ści OD (5) (wspó łczynnik molowy ekstynkcji sulfo ­
rodaminy B przy 565 nm = 8,7 × 10  4 ; ciężar cząsteczkowy = 580). 
Zawartość barwnika jest okre ślana dla wszystkich kr ążków skóry 
przy zastosowaniu odpowiedniej krzywej kalibracyjnej, a nast ępnie 
dla wszystkich powtórze ń liczona jest średnia.  
2. DANE  
Wartości oporu (k Ω) i średnie zawarto ści barwnika (ug/kr ążek) dla 
materiału testowego, jak równie ż dla kontroli pozytywnej 
i negatywnej, powinny by ć tam gdzie to w łaściwe przedstawione 
w formie tabelarycznej (poszczególne dane z prób i średnie ± S.D.), 
w tym dane dla powtórze ń/powtarzanych eksperymentów, średnie 
i poszczególne dane.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Średnie wyniki TER s ą uznawane, je śli w testuj ącym laboratorium 
wartości otrzymane w jednoczesnych próbach kontroli pozytywnej 
i negatywnej mieszcz ą się w zakresie dopuszczalnym dla metody. 
Dopuszczalne zakresy oporu dla metodyki i aparatury opisanych 
powyżej podano w poni ższej tabeli:  
Kontrola Substancja Zakres oporu 
(kΩ) 
Pozytywna 10 M kwas solny 0,5– 1,0 
Negatywna Woda destylowana 10–25  
Średnie wyniki wi ązania barwnika s ą akceptowane pod warunkiem, 
że wartości otrzymane w równoczesnych testach kontrolnych 
mieszczą się w przedzia łach akceptowanych dla metody. Sugero ­
wane dopuszczalne zakresy zawarto ści barwnika dla substancji 
kontrolnych dla metodyki i aparatury opisanych powy żej zamiesz ­
czono w poni ższej tabeli:  
Kontrola Substancja Zakres zawar ­
tości barwnika 
(μg/krążek) 
Pozytywna 10 M kwas solny 40–100 
Negatywna Woda destylowana 15–35  
Substancja testowa uznawana jest za nieniszcz ącą skóry:  
(i) jeśli średnia warto ść TER otrzymana dla substancji testowej jest 
większa niż 5 kΩ lub 
(ii) średnia warto ść TER jest ni ższa od lub równa 5  kΩ; i 
— krążek skóry nie wykazuje niew ątpliwych uszkodze ń, i 
— średnia zawarto ść barwnika na kr ążek jest znacznie ni ższa od 
średniej zawarto ści barwnika na kr ążek w równoczesnej 
kontroli pozytywnej z 10 M HC1.  
Substancja testowa uznawana jest za niszcz ącą skórę: 
(i) jeśli średnia warto ść TER jest ni ższa od lub równa 5 k Ω, 
a krążek skóry jest niew ątpliwie uszkodzony; lub  
(ii) średnia warto ść TER jest ni ższa od lub równa 5 k Ω; i 
— krążek skóry nie wykazuje niew ątpliwych uszkodze ń, ale 
— średnia zawarto ść barwnika na kr ążek jest wy ższa lub równa 
średniej zawarto ści barwnika na kr ążek w równoczesnej 
kontroli pozytywnej z 10 M HC1.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE DOTYCZ ĄCE BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancje testow ą i kontroln ą: 
— nazwy chemiczne, takie jak nazwa IUPAC lub CAS oraz numer 
CAS, jeśli jest znany,  
— czysto ść i skład substancji lub preparatu (w procentach masy) 
i właściwości fizyczne,  
— właściwości fizyko-chemiczne, takie jak stan skupienia, pH, 
stabilność, rozpuszczalno ść w wodzie stosownie do warunków 
przeprowadzania badania;  
— postępowanie z substancjami testowym/kontrolnymi przed 
rozpoczęciem bada ń, jeśli znajduje zastosowanie (np. podgrzewa ­
nie, mielenie),  
— stabilno ść, jeśli jest znana.  
Zwierzęta testowe:  
— linia i p łeć, 
— wiek zwierz ąt w momencie pobierania skóry,  
— źródło, warunki w pomieszczeniu, dieta itd.,  
— szczegó ły dotyczące przygotowania skóry.  
Warunki testu:  
— krzywe kalibracyjne dla aparatury testowej,  
— krzywe kalibracyjne dla parametrów testu wi ązania barwnika,  
— szczegó ły zastosowanej procedury testowej do pomiaru TER,  
— szczegó łowe informacje na temat procedury testowej stosowanej 
do oceny wi ązania barwnika; w stosownych przypadkach,  
— opis wszelkich modyfikacji procedur testowych,  
— opis zastosowanych kryteriów oceny.  
Wyniki:  
— tabele zawieraj ące dane z bada ń TER i testu wi ązania barwnika 
(jeśli to znajduje zastosowanie) dla poszczególnych zwierz ąt 
i poszczególnych próbek skóry,  
— opis wszelkich obserwowanych skutków.  
Dyskusja wyników.  
Wnioski  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for 
Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asses ­
sment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http :// ­
www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- 
mono(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal 
Irritation/Corrosion.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, 
M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219–255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic, in 
Vitro 12, 471–482.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G., and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxic, in Vitro 12, 483–524.  
(6) Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of 
Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicolo ­
gical Test Methods, 62pp.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, CA., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regu ­
latory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publi ­
cation No. 97-3981. National Institute of Environmental Health 
Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http:// ­
iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf  
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275–280.  
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM 
evaluation of EpiDerm  TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and 
the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxico ­
logical Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV7EHS, available upon request from 
the Secretariat  
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C. (1986). An  
in vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, 507–512.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J. (1992). The skin corrosivity test  in vitro:  results of an inter ­
laboratory trial. Toxic, in Vitro 6, 191–194.  
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren RD, 
Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M (1998). An Evaluation of 
the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. 
ATLA 26: 709–720.  
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845–852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C. (1988). An In 
Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7–17.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Rysunek 1  
Aparatura do testu TER skóry szczura
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Rysunek 2  
Wymiary rurek politetrafluoroetylenowej (PFTE) i receptorowej oraz stosowane 
elektrody
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Najważniejsze elementy urz ądzenia przedstawionego powy żej: 
— wewn ętrzna średnica rurki PTFE,  
— długość elektrod w stosunku do rurki PTFE i rurki receptorowej, 
dobrana tak, aby elektrody nie dotyka ły do krążka skóry i żeby 
standardowa d ługość elektrody styka ła się z roztworem MgSO  4 , 
— ilość roztworu MgSO  4 w rurce receptorowej powinna zapewnia ć 
wysokość słupa cieczy odpowiedni ą do jej poziomu w rurce 
PFTE, jak pokazano na rysunku 1,  
— krążek skóry powinien by ć wystarczaj ąco mocno przymocowany 
do rurki PFTE, tak aby opór elektryczny by ł rzeczywist ą miarą 
właściwości skóry.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40. BIS  BADANIE ZNISZCZENIA SKÓRY METOD Ą IN VITRO:  
BADANIE MODELU SKÓRY LUDZKIEJ  
1. METODA  
Opisywana metoda badania jest zgodna z OECD TG 431 (2004).  
1.1. WST ĘP 
Zniszczenie skóry oznacza powstawanie nieodwracalnych uszkodze ń 
tkanek skórnych w wyniku kontaktu z substancj ą testową (jak zdefi ­
niowano w Globalnie Zharmonizowanym Systemie Klasyfikacji i Oznakowania Produktów Chemicznych (GHS)) (1). Niniejsza 
metoda badania nie wymaga wykorzystywania żywych zwierz ąt ani 
tkanek zwierz ęcych do oceny stopnia niszczenia skóry.
 
Do tej pory ocena zniszczenia skóry wi ązała się zwykle z u życiem 
zwierząt laboratoryjnych (2). Potrzeba wyeliminowania bólu 
i cierpienia zwierz ąt została uwzględniona przy przegl ądzie metody 
badania B.4, umo żliwiającej określenie zniszczenia skóry przy 
użyciu alternatywnych metod  in vitro , bez zadawania zwierz ętom 
bólu i cierpienia.  
Pierwszym krokiem w kierunku okre ślenia alternatywnych bada ń, 
które mog łyby zosta ć zastosowane przy badaniu niszczenia skóry 
do celów regulacyjnych, by ło przeprowadzenie bada ń wstępnych 
(3). Następnie przeprowadzono formalne badania zatwierdzaj ące (6)­
(7)(8) oceny zniszczenia skóry metodami  in vitro  (4)(5). Wyniki tych 
badań oraz inne publikacje (9) sta ły się podstaw ą zalecenia, że do 
oceny stopnia niszczenia skóry  in vivo  można stosowa ć następujące 
badania (10)(11)12)(13): badanie modelu skóry ludzkiej (niniejsza 
metoda) oraz test przezskórnego oporu elektrycznego (zob. metoda 
badania B.40).  
Badania zatwierdzaj ące wykaza ły, że badania, w których u żywane są 
modele ludzkiej skóry (3)(4)(5)(9) pozwalaj ą na wiarygodne rozró ż­
nienie substancji niszcz ących skór ę i nieniszcz ących skóry. Protokó ł 
badania mo że także dostarczy ć wskazówek u łatwiających odró ż­
nienie substancji powa żnie niszcz ących od substancji mniej nisz ­
czących.  
Badanie przedstawione w opisie niniejszej metody umo żliwia iden ­
tyfikację związków i mieszanin chemicznych uszkadzaj ących skór ę. 
Ponadto w po łączeniu z dowodami uzyskanymi na podstawie innych 
dostępnych informacji (np. pH, zwi ązek między struktur ą 
a aktywno ścią, dane dotycz ące ludzi i zwierz ąt) umożliwia identyfi ­
kację związków i mieszanin, które nie niszcz ą skóry (1)(2)(13)(14). 
Zwykle nie dostarcza wystarczaj ących informacji o podra żnieniach 
skóry, nie umo żliwia tak że dzielenia substancji niszcz ących na 
podkategorie, jak na to pozwala Globalny Zharmonizowany System 
Klasyfikacji (GHS) (1).  
Zaleca si ę, aby w celu dokonania pe łnej oceny miejscowego dzia ­ 
łania na skór ę po pojedynczej ekspozycji post ępować zgodnie 
z sekwencyjn ą strategią przedstawion ą w dodatku do metody badania 
B.4 (2) i w Globalnie Zharmonizowanym Systemie (GHS) (1). Ta strategia badania obejmuje przeprowadzenie bada ń zniszczenia skóry 
(jak przedstawiono w opisie niniejszej metody) i podra żnienia skóry  
in vitro  przed rozwa żaniem przeprowadzenia bada ń na żywych zwie ­
rzętach.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. DEFINICJE  
Zniszczenie skóry  in vivo : oznacza spowodowanie nieodwracalnych 
uszkodzeń skóry: a mianowicie widocznej martwicy skóry 
w warstwie naskórka i skóry w łaściwej w wyniku kontaktu 
z substancj ą testową w okresie do 4 godzin. Typowymi objawami 
zniszczenia skóry s ą wrzody, krwawienie, krwawi ące strupy oraz, 
pod koniec 14-dniowego okresu obserwacji, odbarwienie skóry spowodowane zbieleniem, pojawianie si ę całkowitych łysin i blizn. 
W przypadku w ątpliwych uszkodze ń należy zastosowa ć metody 
histopatologiczne.
 
Żywotność komórek:  parametr okre ślający całkowitą aktywno ść 
populacji komórek (np. zdolno ść dehydrogenaz w mitochondriach 
komórek do obni żenia zawarto ści przyżyciowego barwnika MTT), 
który, w zale żności od pomiaru ko ńcowego i zastosowanego schematu 
badania odpowiada ca łkowitej liczbie i/lub żywotności komórek.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Tabela 1  
Chemiczne substancje odniesienia  
Nazwa Nr EINECS Nr CAS  
1,2-diaminopropan 201-155-9 78-90-0 Silne dzia łanie niszcz ące 
Kwas akrylowy 201-177-9 79-10-7 Silne dzia łanie niszcz ące 
2-tert. Butylofenol 201-807-2 88-18-6 Dzia łanie niszcz ące 
Wodorotlenek potasu (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Dzia łanie niszcz ące 
Kwas siarkowy (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Dzia łanie niszcz ące 
Kwas oktanowy (kwas kaprylowy) 204-677-5 124-07-02 Dzia łanie niszcz ące 
4-amino-1,2,4-triazol 209-533-5 584-13-4 Brak dzia łania niszcz ącego 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Brak dzia łania niszcz ącego 
Bromek fenetylu 203-130-8 103-63-9 Brak dzia łania niszcz ącego 
Tetrachloroetylen 204-825-9 27-18-4 Brak dzia łania niszcz ącego 
Kwas izostearynowy 250-178-0 30399-84-9 Brak dzia łania niszcz ącego 
4-(metylotio)-benzaldehyd 222-365-7 3446-89-7 Brak dzia łania niszcz ącego  
Większość z wymienionych chemikaliów pochodzi z wykazu chemi ­
kaliów przygotowanego na potrzeby mi ędzynarodowego badania 
zatwierdzaj ącego ECVAM (4). Ich wybór opiera si ę na następuj­ 
ących kryteriach:  
(i) równa liczba substancji niszcz ących i nieniszcz ących;  
(ii) dostępne w handlu substancje nale żące do wi ększości stosow ­
nych klas zwi ązków chemicznych;  
(iii) uwzgl ędnienie zarówno silnie niszcz ących, jak i s łabiej nisz ­
czących substancji, aby umo żliwić rozróżnianie na podstawie 
właściwości niszczących;  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
(iv) wybór chemikaliów, które mog ą być poddawane obróbce 
w laboratorium nie stwarzaj ąc zagrożeń innych ni ż zniszczenie 
skóry.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Materiał testowy jest nak ładany miejscowo na trójwymiarowy model 
ludzkiej skóry, sk ładający się co najmniej ze zrekonstruowanego 
naskórka z funkcjonaln ą warstwą rogową. Materia ły niszczące są 
określane na podstawie ich zdolno ści do zmniejszania żywotności 
komórek, okre ślanej na przyk ład przy zastosowaniu metody redukcji 
MTT (15), poni żej określonego poziomu w okre ślonym czasie 
ekspozycji. Zasada oceny modelu ludzkiej skóry opiera si ę na hipo­
tezie, że substancje niszcz ące są w stanie przenikn ąć przez warstw ę 
rogową na drodze dyfuzji lub w wyniku jej niszczenia i s ą cytoto­
ksyczne dla le żących głębiej warstw komórek.  
1.4.1.  Procedura  
1.4.1.1.  Modele skóry ludzkiej  
Modele ludzkiej skóry mog ą być konstruowane lub nabyte (np. 
modele EpiDerm™i EPISKIN™) (16)(17)(18)(19) lub opracowy ­
wane i tworzone w laboratorium przeprowadzaj ącym badania (20) ­
(21). Uznaje si ę, że zastosowanie ludzkiej skóry podlega mi ędzyna­
rodowym i krajowym zastrze żeniom i warunkom etycznym. Ka żdy 
nowy model powinien podlega ć zatwierdzeniu (przynajmniej 
w zakresie opisanym w 1.4.1.1.2). Modele ludzkiej skóry stosowane 
do tego testu musz ą być zgodne z nast ępującymi kryteriami:  
1.4.1.1.1. O g ó l n e w a r u n k i m o d e l u :  
Do tworzenia nab łonka nale ży użyć ludzkich keranocytów. Pod 
zachowuj ącą funkcje życiowe warstw ą rogową powinno znajdowa ć 
się kilka warstw żywych komórek nab łonkowych. Model skóry mo że 
także zawiera ć element warstwy podskórnej. Warstwa rogowa 
powinna by ć wielowarstwowa, o odpowiednim profilu lipidowym, 
niezbędnym do wytworzenia funkcjonalnej bariery, na tyle szczelnej, 
aby powstrzyma ć szybkie przenikanie markerów cytotoksycznych. 
Właściwości izolacyjne modelu powinny zapobiega ć przechodzeniu 
materiału przez warstw ę rogową do żywej tkanki. Przechodzenie 
substancji testowej przez warstw ę rogową prowadzi do niew łaści­
wego modelowania ekspozycji skóry. Model skóry nie powinien być skażony bakteriami (tak że mykoplazmami) ani grzybami.
 
1.4.1.1.2. F u n k c j o n a l n e w a r u n k i m o d e l u :  
Skala żywotności jest zwykle kwantyfikowana przy u życiu MTT lub 
innego przekszta łconego metabolicznie barwnika. W tych przypad ­
kach gęstość optyczna (OD) ekstrahowanego (rozpuszczonego) 
barwnika z tkanki kontroli negatywnej powinna by ć co najmniej 
20 razy wi ększa niż OD samego rozpuszczalnika do ekstrakcji (prze ­
gląd problematyki zamieszczono w (22)). W okresie ekspozycji 
testowej tkanka kontroli negatywnej powinna by ć stabilna 
w hodowli (umo żliwiać podobne pomiary żywotności). Warstwa 
rogowa powinna by ć wystarczaj ąco odporna, aby powstrzyma ć 
szybkie przenikanie niektórych cytotoksycznych markerów (np. 1 % Triron X-100). W łaściwość tę można ocenić na podstawie 
czasu ekspozycji, potrzebnego do zmniejszenia żywotności komórek 
o 50 % (ET50) (np. dla modeli EpiDerm™ i EPISKIN™ czas ten 
wynosi > 2 godzin). Tkanka powinna charakteryzowa ć się odtwa­
rzalnością w czasie i je śli to możliwe, między laboratoriami. Co 
więcej, powinna pozwala ć na przewidywanie w łaściwości nisz­
czących wzorcowych zwi ązków chemicznych (zob. tabela 1), przy 
stosowaniu wybranego protoko łu badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 580
 
1.4.1.2.  Nakładanie substancji testowej i kontrolnej  
W każdej procedurze (czasie ekspozycji), w tym w kontrolach, stoso ­
wane są dwa powtórzenia próbki tkanki. W przypadku p łynnych 
materiałów należy równomiernie rozprowadzi ć na skórze dostateczn ą 
ilość substancji testowej: nale ży użyć co najmniej 25 uL/cm  2 . 
W przypadku materia łów stałych należy nałożyć na skór ę dosta­
teczną ilość substancji testowej, zwil żonej wod ą dejonizowan ą lub 
destylowan ą, aby zapewni ć dobry kontakt ze skór ą. Tam, gdzie to 
właściwe, substancje sta łe przed zastosowaniem nale ży zmielić na 
proszek. Metoda nak ładania powinna by ć odpowiednia do substancji 
testowej (zob. pozycja bibliograficzna 5). Po zako ńczeniu okresu 
ekspozycji nale ży starannie zmy ć materiał testowy ze skóry odpo ­
wiednim buforem lub 0,9 % NaCl.  
Aby zapewni ć odpowiednie dzia łanie modelu, w ka żdym badaniu 
należy równocze śnie stosowa ć kontrolę pozytywn ą i negatywn ą. 
Jako substancji do kontroli pozytywnej zaleca si ę użycie kwasu 
octowego lodowatego lub 8N KOH. Zalecanymi substancjami w kontroli negatywnej s ą 0,9 % NaCl lub woda.
 
1.4.1.3.  Pomiary żywotności komórek  
Do pomiaru żywotności komórek mo żna stosowa ć wyłącznie spraw ­
dzone metody ilo ściowe. Co wi ęcej, miara żywotności musi by ć 
kompatybilna w u życiu z trójwymiarowym wytworem tkankowym. 
Wiązanie niespecyficznego barwnika nie mo że zaburza ć pomiaru 
żywotności. Dlatego barwniki wi ążące białka i barwniki, które nie 
ulegają przemianom metabolicznym (np. czerwie ń obojętna) są 
nieodpowiednie. Najcz ęściej stosowanym badaniem jest redukcja 
MTT (3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5 difenylo bromek tetrazolu: 
numer EINECS 206-069-5, numer CAS 298-93-1)), którego dok ład­
ność i powtarzalno ść wykazano (5), ale mo żna zastosowa ć także 
inne badania. Próbka skóry umieszczana jest na 3 godziny w roztworze MTT o odpowiednim st ężeniu (np. 0,3–1 mg/mL) 
przy odpowiedniej temperaturze inkubacji. Wytr ącony niebieski 
formazan jest nast ępnie ekstrahowany przy u życiu rozpuszczalnika 
(izopropanol), a st ężenie formazanu jest mierzone przez okre ślenie 
gęstości optycznej przy d ługości fali mi ędzy 540 a 595 nm.
 
Działanie chemiczne materia łu testowego na barwnik przy życiowy 
może przebiega ć podobnie jak w metabolizmie komórkowym, 
prowadząc do fałszywej oceny żywotności. Wykazano, że ma to 
miejsce, kiedy materia ł testowy nie zosta ł całkowicie usuni ęty ze 
skóry przez p łukanie (9). Je śli materia ł testowy oddzia łuje 
bezpośrednio na barwnik przy życiowy, nale ży zastosowa ć dodat­
kowe kontrole w celu wykrywania i korygowania zak łóceń pomiaru 
żywotności(9)(23).  
2. DANE  
Dla każdej tkanki nale ży przedstawi ć w formie tabelarycznej 
wartości gęstości optycznej i procentowe dane dotycz ące żywotności 
komórek dla materia łu testowego, kontroli pozytywnej i negatywnej, 
w tym w odpowiednich przypadkach dane z powtórze ń ekspery­
mentu, średnie oraz poszczególne pojedyncze warto ści. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Wartości OD otrzymane dla ka żdej próbki testowej mog ą być wyko­
rzystane do obliczenia procentowej żywotności w stosunku do kontroli 
negatywnej, dla której arbitralnie przyjmuje si ę 100 %. Warto ść 
graniczna dla procentowej żywotności komórek, wyznaczaj ąca granicę 
między materia łami testowymi niszcz ącymi skór ę i nieniszcz ącymi 
skóry (lub granice mi ędzy różnymi klasami niszczenia) lub statystyczne 
procedury stosowane do oceny wyników i identyfikacji materia łów nisz­
czących musz ą być jasno zdefiniowane i udokumentowane, przy czym 
należy wykazać, że są one odpowiednie. Generalnie, warto ści graniczne 
są ustalane w trakcie optymalizacji testu, sprawdzane w fazie prewali ­
dacyjnej i potwierdzane w badaniach walidacyjnych. Na przyk ład 
prognoza poziomu niszczenia w powi ązaniu z modelem EpiDerm™ 
wygląda następująco (9):  
Substancja testowa uznawana jest za niszcz ącą skórę: 
(i) jeśli żywotność po trzyminutowej ekspozycji jest mniejsza ni ż 
50 %; lub  
(ii) jeśli żywotność po trzyminutowej ekspozycji jest wi ększa niż lub 
równa 50 % a żywotność po godzinnej ekspozycji jest mniejsza 
niż 15 %.  
Substancja testowa uznawana jest za nieniszcz ącą skóry:  
(i) jeśli żywotność po trzyminutowej ekspozycji jest wi ększa niż lub 
równa 50 %, a żywotność po godzinnej ekspozycji jest wi ększa 
niż lub równa 15 %.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancja testowa i kontrolna:  
— nazwy chemiczne, takie jak nazwa IUPAC lub CAS oraz numer 
CAS, jeśli jest znany,  
— czysto ść i skład substancji lub preparatu (w procentach masy),  
— właściwości fizykochemiczne, takie jak stan skupienia, pH, 
stabilność, rozpuszczalno ść w wodzie stosownie do warunków 
przeprowadzania badania,  
— postępowanie z substancjami testowymi/kontrolnymi przed 
rozpoczęciem bada ń, w odpowiednich przypadkach (np. podgrze ­
wanie, mielenie),  
— stabilno ść, jeśli jest znana.  
Uzasadnienie dla zastosowanego modelu skóry i procedury.  
Warunki badania:  
— użyty system komórek,  
— informacje kalibracyjne dla urz ądzania mierz ącego żywotność 
komórek (np. spektrofotometru),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— pełne informacje uzasadniaj ące użycie okre ślonego modelu 
skóry, w tym jego zgodno ści z przyj ętymi normami,  
— szczegó ły zastosowanej procedury testowej,  
— zastosowane dawki testowe,  
— opis wszelkich modyfikacji w procedurze testowej,  
— odniesienia do istniej ących danych o modelu,  
— opis zastosowanych kryteriów oceny.  
Wyniki:  
— przedstawienie w formie tabeli danych dla poszczególnych 
próbek testowych,  
— opis innych obserwowanych skutków.  
Dyskusja wyników.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of 
Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing 
and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm- mono(2001)6.
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal 
Irritation/Corrosion.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. 
(1995). A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity 
testing. The report recommendations of ECVAM Workshop 6 ATLA 23,219–255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., 
Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for 
skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic. In Vitro 12, 471–482.
 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M. (1998). The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team  Toxic. In Vitro 12, 483–524.  
(6) OECD (1996). Final Report of the OECD Workshop on 
Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alter ­
native Toxicological Test Methods, 62pp.  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
Lovell, D.P., Reinhardt, CA., Repetto, G., Sladowski, D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. Test report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129–147.
 
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C, Spielmann, H., Uphill, P., 
Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C, Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G. (2000). The ECVAM prevalidation study on the use of EpiDerm for skin Corrosivity testing. ATLA 28, pp.371–401.
 
(10) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 
275–280.  
(11) ECVAM (2000). ECVAM News & Views. ATLA 28, 365–67.  
(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDerm™, EPISKIN™ (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance 
(TER) assay: In Vitro test methods for assessing 
dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publica ­
tion No. 02-4502. National Toxicology Program Intera ­
gency Center for the Evaluation of Alternative Toxico ­
logical Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(13) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st – 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., 
Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M (1998). An Evaluation of 
the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709–720.
 
(15) Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular 
growth and survival: application to proliferation and cytotoxi ­
city asssays. J.Immunol. Meth. 65, 55–63.  
(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
ner, M., 1994. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxic. In Vitro 8, 889–891.
 
(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
J., and Mommaas, M., 2000. Lipid and ultrastructural charac ­
terization of reconstructed skin models. International Journal of Pharmaceutics. 203, 211–225.
 
(18) Tinois E, Gaetani Q, Gayraud B, Dupont D, Rougier A, Poura ­
dier DX (1994). The Episkin model: Successful reconstruction 
of human epidermis in vitro. In In vitro Skin Toxicology. 
Edited by A Rougier, AM Goldberg and HI Maibach: 133–140.
 
(19) Tinois E, Tiollier J, Gaucherand M, Dumas H, Tardy M, 
Thivolet J (1991). In vitro and post -transplantation differen ­
tiation of human keratinocytes grown on the human type IV collagen film of a bilayered dermal substitute. Experimental Cell Research 193: 310–319.
 
(20) Parentau, N.L., Bilbo, P., Molte, C.J., Mason, V.S., and 
Rosenberg, H. (1992). The organotypic culture of human 
skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function. Cytotechnology 9, 163–171.
 
(21) Wilkins, L.M., Watson, S.R., Prosky, S.J., Meunier, S.F., 
Parentau, N.L. (1994). Development of a bilayered living 
skin construct for clinical applications. Biotechnology and 
Bioengineering 43/8, 747–756.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 584
 
(22) Marshall, N.J., Goodwin, C.J., Holt, S.J. (1995). A critical 
assessment of the use of microculture tetrazohum assays 
to measure cell growth and function. Growth Regulation 5, 69–84.
 
(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne', C, Elliot, G.R., Harbell, 
J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Rouget, R., and van de Sandt, 
J.J.M., and Botham, P.A. (2001). A prevalidation study on  in 
vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxic. InVItro 15, 57–93.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  BADANIE FOTOTOKSYCZNO ŚCI 3T3 NRU  IN VITRO  
1. METODA  
Opisywana metoda testowa jest zgodna z OECD TG 432 (2004).  
1.1. WST ĘP 
Fototoksyczno ść definiuje si ę jako toksyczny wp ływ substancji, na 
działanie której nara żony jest organizm, przy czym wp ływ ten jest 
spowodowany lub zwi ększony (widoczny przy niskim poziomie 
dawki) przez ekspozycj ę na światło albo indukowany przez na świet­
lanie skóry po systematycznym podawaniu substancji.  
Badanie  in vitro  fototoksyczno ści 3T3 NRU jest stosowany w celu 
określenia potencja łu fototoksycznego substancji testowej, induko ­
wanej przez zwi ązek chemiczny wzbudzony w wyniku ekspozycji 
na światło. Badanie s łuży do oceny fotocytotoksyczno ści, którą to 
ocenę przeprowadza si ę na podstawie wzgl ędnego zmniejszenia si ę 
żywotności komórek nara żonych na dzia łanie substancji w świetle 
w porównaniu z ciemno ścią. Istnieje du że prawdopodobie ństwo, że 
substancje identyfikowane w tym te ście po stosowaniu ogólnoustro ­
jowym i nak ładaniu na skór ę lub po stosowaniu miejscowym s ą 
fototoksyczne in vivo.  
Wiadome jest, że wiele rodzajów substancji chemicznych wywo łuje 
efekt fototoksyczny (1)(2)(3)(4). Ich wspóln ą cechą jest zdolno ść do 
absorbowania energii światła w zakresie widma odpowiadaj ącego 
widmu promieniowania s łonecznego. Zgodnie z pierwszym prawem 
fotochemii (prawo Grotthausa-Drapera) fotoreakcja wymaga absor ­
pcji dostatecznej liczby kwantów światła. Tak wi ęc przed przepro ­
wadzeniem testów biologicznych nale ży określić widmo absorbcyjne 
UV/vis substancji chemicznej wed ług wytycznych OECD w zakresie 
badań 101. Stwierdzono, że jeśli molowy wspó łczynnik ekstynkcji/ ­
absorpcji jest ni ższy niż 10 litrów xmo 1  -1 × cm  -l , to jest ma ło 
prawdopodobne, że związek jest fotoreaktywny. Takiego zwi ązku 
nie trzeba poddawa ć badaniu fototoksycznemu in vitro 3T3 NRU 
ani innemu testowi biologicznemu na wyst ępowanie efektu fototo ­
ksycznego. Zob. tak że załącznik I.  
Wiarygodno ść i znaczenie badania fototoksyczno ści 3T3 NRU  in 
vitro  zostały niedawno ocenione (6)(7)(8) (9). Wykazano, że badanie 
fototoksyczno ści 3T3 NRU  in vitro  dostarcza informacji o efektach 
ostrej fototoksyczno ści in vivo  u zwierz ąt i ludzi. Badanie nie jest 
opracowany po to, aby przewidywa ć inne niekorzystne skutki, do 
których mo że dojść w wyniku po łączonego dzia łania substancji 
chemicznych i światła, np. nie znajduje zastosowania w przypadku 
fotogenotoksyczno ści, fotoalergii i fotokarcynogenno ści, nie umo ż­
liwia także oceny nasilenia fototoksyczno ści. Ponadto badanie nie 
jest przeznaczone do badania po średnich mechanizmów fototoksycz ­
ności, działania metabolitów substancji testowej ani dzia łania 
mieszanin.  
Podczas gdy wykorzystanie reakcji metabolicznych jest ogólnym 
wymogiem przy ocenie poziomu genotoksyczno ści 
i karcynogenno ści dla wszystkich testów  in vitro , w przypadku foto ­
toksyczno ści jak dot ąd znaleziono tylko nieliczne przyk łady sytuacji, 
w których substancja zaczyna dzia łać jako fototoksyna  in vivo  lub in 
vitro  dopiero po przekszta łceniach metabolicznych. Tak wi ęc obecnie 
nie uważa się ani za konieczne, ani za naukowo uzasadnione, aby 
test był przeprowadzany w po łączeniu z systemem aktywacji meta ­
bolicznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINICJE  
Irradiancja:  intensywno ść światła ultrafioletowego (UV) lub 
widzialnego padaj ącego na powierzchni ę w W/m  2 lub W/cm  2 . 
Dawka światła: ilość (= natężenie × czas) promieniowania ultrafio ­
letowego (UV) lub widzialnego padaj ącego na powierzchni ę, wyra­ 
żona w dżulach (= W × s) na powierzchni ę, np. J/m  2 lub J/cm  2 . 
Zakresy d ługości fal UV:  CIE (Mi ędzynarodowa Komisja O świet­
leniowa) zaleca nast ępujące oznaczenia: UVA (315–400 nm), UVB 
(280–315 nm) i UVC (100–280 nm). Inne oznaczenia równie ż mogą 
być stosowane; podzia ł między UVB a UVA jest cz ęsto przeprowa ­
dzany przy 320 nm, a UVA mog ą być dzielone na UV-A1 i UV-A2, 
z granicą przy oko ło 340 nm.  
Żywotność komórek:  parametr okre ślający całkowitą aktywno ść 
populacji komórek (np. wychwyt barwnika prze życiowego Natural 
Red do lizosomów komórki) który, w zale żności od pomiaru ko ńco­
wego i zastosowanego schematu badania, koreluje z ca łkowitą liczbą 
i/lub żywotnością komórek.  
Względna żywotność komórek:  żywotność komórek wyra żona 
w stosunku do kontroli rozpuszczalnikowych (negatywnych), których 
próbki by ły pobierane przez ca łą procedur ę testową (+Irr lub -Irr), 
ale które nie by ły poddawane dzia łaniu substancji testowej.  
PIF (Photo Irritation Factor – wspó łczynnik fotopodra żnienia):  
współczynnik uzyskany przez porównanie dwóch tak samo efektyw ­
nych stężeń cytotoksycznych (IC50) testowanej substancji, otrzy ­
many przy braku (-Irr) i przy zastosowaniu (+Irr) niecytotoksycznej 
irradiacji UVA/vis.  
IC50: stężenie testowanej substancji, przy której żywotność komórek 
jest zmniejszona o 50 %.  
MPE (Mean Photo Effect – średni fotoefekt):  miara uzyskana 
z matematycznej analizy krzywych odpowiedzi na st ężenie, otrzy ­
mana przy braku (-Irr) i przy zastosowaniu (+Irr) niecytotoksycznej irradiacji UVA/vis.
 
Fototoksyczno ść: reakcja na toksyczno ść ostrą, pojawiaj ąca się po 
pierwszej ekspozycji skóry na niektóre substancje chemiczne, a następnie ekspozycji na światło lub reakcja, która jest wywo łana 
przez na świetlanie skóry po systematycznym, ogólnoustrojowym 
podawaniu substancji.
 
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Badanie fototoksyczno ści 3T3 NRU  in vitro  polega na porównaniu 
cytotoksyczno ści substancji przy zastosowaniu i przy braku 
ekspozycji na niecytotoksyczn ą dawkę symulowanego światła 
słonecznego. Cytotoksyczno ść w tym te ście jest wyra żona jako 
zależne od stężenia zmniejszanie wychwytu barwnika przy życiowego 
Neutral Red, mierzone 24 godziny po wprowadzeniu substancji 
chemicznej i irradiacji (10). NR jest s łabym barwnikiem kationo ­
wym, który łatwo przenika niedyfuzyjnie przez b łony komórkowe 
i zbiera si ę wewnątrz komórek, w lizosomach. Modyfikacje 
powierzchni delikatnej b łony lizosomów powoduj ą kruchość lizo­
somów i inne zmiany, które stopniowo staj ą się nieodwracalne. 
Zmiany takie, wywo łane przez dzia łanie ksenobiotyków, prowadz ą 
do zmniejszonego wychwytu i wi ązania NR. Mo żna więc wyróżnić 
w pełni żywotne, uszkodzone i martwe komórki, co stanowi 
podstawę testu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Komórki Balb/c 3T3 hoduje si ę przez 24 godziny w celu wytwo ­
rzenia monowarstw. Dwie p łytki z 96 studzienkami na substancj ę 
testową są przez 1 godz. wst ępnie inkubowane z substancj ą testową 
w ośmiu różnych stężeniach. Nast ępnie jedna z dwóch p łytek jest 
poddawana dzia łaniu najwy ższej niecytotoksycznej dawce irradiacji, 
podczas gdy druga p łytka trzymana jest w ciemno ści. Na obu p łyt­
kach pożywka jest badana nast ępnie wymieniana na po żywkę 
kontrolną i po nast ępnych 24 godzinach inkubacji okre śla się żywot­
ność komórek na podstawie wychwytu barwnika Neutral Red. 
Żywotność komórek wyra żana jest jako procent nie poddawanych 
działaniu substancji kontroli rozpuszczalnikowych i jest okre ślana 
dla każdego stężenia testowego. W celu okre ślenia potencja łu foto­
toksycznego porównuje si ę odpowiedzi na zmienne st ężenia 
w obecno ści i przy braku irradiacji, zwykle na poziomie IC50, tj. 
przy stężeniu zmniejszaj ącym żywotność do 50 % w stosunku do 
kontroli nie poddawanej dzia łaniu irradiacji.  
1.4. OPIS METODY BADANIA  
1.4.1.  Przygotowania  
1.4.1.1.  Komórki  
W badaniu walidacyjnym u żyta zosta ła ustalona linia fibroplastów 
mysich Balb/c 3T3, klon 31, z hodowli ameryka ńskiej American 
Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA, albo 
z hodowli europejskiej European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK i wobec tego zaleca si ę, aby 
pobierać materiał z odpowiednich banków komórek. Inne komórki 
lub linie komórek mog ą być użyte do tej samej procedury testowej 
jeśli warunki hodowli s ą dostosowane do specyficznych potrzeb 
komórek, ale nale ży wykaza ć równowa żność warunków.
 
Komórki powinny by ć regularnie sprawdzane pod k ątem braku 
skażenia mykoplazmami i u żywane tylko, je śli stwierdzono ca łko­
wity ich brak (11).  
Ważne jest, aby regularnie sprawdza ć wrażliwość komórek na UV, 
zgodnie z procedur ą kontroli jako ści przedstawion ą w opisie metody. 
Ponieważ wrażliwość komórek na UVA mo że wzrasta ć wraz z liczb ą 
pasaży, należy użyć komórek Balb/c 3T3 o mo żliwie jak najmniej ­
szej liczbie pasa ży, najlepiej poni żej stu. (Zob. cz ęść 1.4.2.2.2. 
i załącznik 2).  
1.4.1.2.  Pożywki i warunki hodowli kultury  
Przy rutynowych pasa żach komórek oraz w trakcie procedury 
testowej nale ży przestrzega ć odpowiednich warunków inkubacji 
i stosowa ć odpowiednie po żywki hodowlane, np. w przypadku 
komórek Balb/c 3T3 powinna to by ć pożywka DMEM (Dulbecco's 
Modified Eagle's Medium), z dodatkiem 10 % surowicy nowo urodzonych ciel ąt, 4 mM glutaminy, penicyliny (100IU), streptomy ­
cyny (100 μg/mL), inkubowana w wilgotnych warunkach w 37 C, 
5–7,5 % CO
 2 w zależności od bufora (zob.cz ęść 1.4.1.4 akapit 
drugi). Szczególne znaczenie ma, aby warunki hodowli komórek zapewnia ły cykl komórek, którego okres trwania odpowiada 
wcześniejszym cyklom u żywanych komórek lub linii komórek.
 
1.4.1.3.  Przygotowanie kultur  
Komórki z zamro żonych kultur macierzystych s ą wysiewane do 
pożywki hodowlanej przy odpowiednim zag ęszczeniu i nast ępnie – 
zanim zostan ą użyte w teście fototoksyczno ści 3T3 NRU  in vitro  – 
przynajmniej raz wysiane na hodowle wtórne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Komórki u żywane do badania fototoksyczno ści są wysiewane do 
pożywki hodowlanej w odpowiednim zag ęszczeniu, tak żeby nie 
dochodziło do przeg ęszczenia przed ko ńcem badania, to znaczy do 
momentu, kiedy po 48 godzinach od wysiewania komórek oceniana jest ich żywotność. W przypadku komórek Balb/c 3T3 hodowanych 
na 96-studzienkowych p łytkach zalecane zag ęszczenie wynosi 1 × 
10
 4 komórek na studzienk ę. 
W przypadku ka żdej substancji testowej komórki s ą wysiewane 
w taki sam sposób na dwie 96-studzienkowe p łytki, poddawane 
równocze śnie całej procedurze testowej w identycznych warunkach 
hodowli – z wyj ątkiem okresu, w którym jedna z p łytek jest na świet­
lana (+Irr), a druga trzymana w ciemno ści (-Irr).  
1.4.1.4.  Przygotowanie substancji testowej  
Substancje testowe musz ą być przygotowywane na świeżo, 
bezpośrednio przed u życiem, chyba że istniejące dane wskazuj ą na 
ich stabilno ść w czasie przechowywania. Zaleca si ę, aby wszelkie 
operacje z substancjami chemicznymi i wst ępna obróbka komórek 
były wykonywane w warunkach świetlnych, które nie spowoduj ą 
fotoaktywacji lub rozk ładu substancji testowej przed irradiacj ą. 
Substancje chemiczne powinny by ć rozpuszczane w buforowanych 
roztworach soli, np. w zrównowa żonym roztworze soli Earla (EBSS) 
lub innych fizjologicznie zrównowa żonych roztworach, które nie 
mogą zawierać składników bia łkowych, sk ładników absorbuj ących 
światło (np. barwnych wska źników pH i witamin), aby w czasie 
irradiacji nie dochodzi ło do interferencji. Poniewa ż w czasie irra ­
diacji komórki s ą trzymane przez oko ło 50 minut poza inkubatorem 
CO 2 , należy uważać, aby nie dosz ło do alkalizacji. Je śli stosowane 
są słabe bufory takie jak EBSS, mo żna to osiągnąć przez inkubacj ę 
komórek w obecno ści 7,5 % CO  2 . Jeśli komórki s ą inkubowane 
w obecno ści jedynie 5 % CO  2 , należy wybrać silniejszy bufor.  
Substancje testowe o ograniczonej rozpuszczalno ści w wodzie 
powinny by ć rozpuszczane w odpowiednim rozpuszczalniku. Je śli 
stosowany jest rozpuszczalnik, we wszystkich hodowlach musi on 
występować w tym samym st ężeniu, tj. zarówno w kontrolach nega ­
tywnych (rozpuszczalnikowych), jak i we wszystkich st ężeniach 
substancji testowej i nie mo że być przy tym st ężeniu toksyczny. 
Stężenia substancji chemicznej nale ży dobiera ć tak, aby nie dopu ścić 
do wytrącania się lub zmętnienia roztworów.  
Zalecanymi rozpuszczalnikami s ą sulfotlenek dimetylu (DMSO) 
i etanol (ETOH). Mo żna równie ż użyć innych rozpuszczalników 
o niskiej cytotoksyczno ści. Przed u życiem wszystkie rozpuszczalniki 
powinny by ć ocenione pod k ątem okre ślonych w łaściwości, np. 
reakcji z substancj ą testową, tłumienia efektu fototoksycznego, 
właściwości zmiatania wolnych rodników i/lub stabilno ści 
chemicznej w rozpuszczalniku.  
Jeśli nie ma to wp ływu na stabilno ść substancji testowej mo żna 
ułatwić rozpuszczanie stosuj ąc mieszanie wirowe i/lub podgrzewanie 
do odpowiedniej temperatury.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Warunki irradiacji  
1.4.1.5.1. Ź r ó d ł o ś w i a t ł a 
W badaniach fototoksyczno ści wybór odpowiedniego źródła światła 
ma podstawowe znaczenie. Światło UVA i w widzialnych cz ęściach 
widma wi ąże się zwykle z fototoksycznymi reakcjami  in vivo  (3)­
(12), natomiast UVB ma z nimi mniejszy zwi ązek, ale jest wysoce 
cytotoksyczny; cytotoksyczno ść wzrasta tysi ąckrotnie kiedy d ługość 
fali zmienia si ę z 313 do 280 nm (13). Kryteria wyboru odpowied ­
niego źródła światła muszą obejmowa ć wymóg, aby źródło światła 
emitowało długości fal absorbowanych przez substancj ę testową 
(widmo absorpcyjne) i żeby dawka światła (osiągalna 
w rozsądnym czasie ekspozycji) wystarcza ła do wykrycia znanych 
substancji fotocytotoksycznych. Co wi ęcej, zastosowane d ługości fal 
i dawki nie powinny by ć zbytnio szkodliwe dla systemu testowego, 
np. emisja ciep ła (promieniowanie podczerwone).  
Uważa się, że optymalnym rodzajem światła jest światło pochodz ące 
z symulatorów światła słonecznego. Rozk ład mocy irradiacji symu ­
latora światła słonecznego wyposa żonego w filtry powinien by ć zbli­ 
żony do widma światła dziennego podanego w (14). Jako symulatory 
światła słonecznego u żywane są zarówno łukowe lampy ksenonowe, 
jak i lampy (domieszkowane) rt ęciowo-metalowo-halogenkowe (15). 
Te ostatnie maj ą tę zaletę, że emitują mniej ciep ła i są tańsze, ale 
mniej doskonale ni ż lampy ksenonowe imituj ą światło słoneczne. 
Ponieważ wszystkie symulatory światła słonecznego emituj ą znaczne 
ilości UVB, powinny by ć wyposażone w odpowiednie filtry, aby 
zredukowa ć wysoce toksyczne promieniowanie UVB. Poniewa ż 
plastikowe materia ły stosowane przy hodowlach komórek zawieraj ą 
stabilizatory UV, widmo powinno by ć mierzone przez ten sam typ 
pokrywy p łytki z 96 studzienkami, jaki jest u żywany w te ście. 
Niezależnie od kroków podj ętych w celu os łabienia promieniowania 
w niektórych cz ęściach widma przez filtrowanie lub na skutek 
nieuniknionego oddzia ływania sprz ętu, widmo rejestrowane poni żej 
tych filtrów nie powinno odbiega ć od widma standardowego światła 
dziennego (14). Przyk ład rozkładu widma irradiancji wyposa żonego 
w filtry symulatora światła słonecznego stosowanego w badaniu 
walidacyjnym badania fotoksyczno ści 3T3 NRU  in vitro  podano 
w (8)(16). Zob. tak że załącznik 2 rysunek 1.  
1.4.1.5.2 D o z y m e t r i a  
Intensywno ść światła (irradiancja) powinna by ć regularnie spraw ­
dzana przy u życiu odpowiedniego, szerokopasmowego miernika 
UV przed ka żdym badaniem fototoksyczno ści. Intensywno ść 
powinna by ć mierzona przez tego samego typu pokryw ę płytki 
z 96 studzienkami co stosowana w badaniu. Miernik UV musi by ć 
wykalibrowany stosownie do źródła. Należy sprawdza ć sprawno ść 
miernika UV i w tym celu u żywać drugiego, wzorcowego licznika 
UV tego samego typu, zalecana jest identyczna kalibracja. 
W idealnym przypadku, w wi ększych odst ępach czasu, do pomiaru 
irradiancji spektralnej filtrowanego źródła światła i do sprawdzania 
szerokopasmowego miernika UV powinien by ć używany spektrora ­
diometr.  
Stwierdzono, że dawka 5 J/cm  2 (mierzona w zakresie UVA) nie jest 
toksyczna dla komórek Balb/c 3T3 i jest wystarczaj ąco silna, aby 
wzbudzić substancje chemiczne i spowodowa ć ich wejście w reakcje 
fotoksyczne (6)(17), np. żeby uzyska ć 5 J/cm  2 w ciągu 50 minut 
irradiancja zosta ła ustalona na 1,7 mW/cm  2 . Zob. za łacznik 2, 
rysunek 2. Je śli używa się innej linii komórek albo innego źródła 
światła, może być konieczne przeprowadzenie kalibracji dawki irra ­
diacji, tak aby zosta ł dobrany schemat dawek, który nie jest szkod ­
liwy dla komórek, a zarazem jest wystarczaj ący, aby spowodowa ć 
wzbudzenie standardowych fototoksyn. Czas ekspozycji na światło 
wyliczany jest w nast ępujący sposób:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ dawka irradiacjiðJ= cm  2 Þ Ü 1000 
irradiacja ðmW = cm  2 Þ Ü 60 1 J = 1 W sec  
1.4.2.  Warunki badania  
1.4.2.1.  Stężenia substancji testowej  
Zakresy st ężeń substancji chemicznej testowanej przy na świetleniu 
(+Irr) i bez światła (-Irr) powinny by ć odpowiednio okre ślone 
w eksperymentach s łużących wyznaczeniu zakresów dawki. Przy ­
datne mo że być przeprowadzenie pocz ątkowej oceny rozpuszczal ­
ności, a nast ępnie po 60 minutach (lub jakimkolwiek innym czasie, 
odpowiednim do schematu badania), jako że rozpuszczalno ść może 
znacznie si ę zmienia ć w czasie lub w trakcie ekspozycji. Aby 
uniknąć toksyczno ści, spowodowanej niew łaściwymi warunkami 
hodowli lub obecno ścią silnie kwa śnych lub zasadowych zwi ązków 
chemicznych, po dodaniu badanej substancji pH hodowli komórko ­
wych powinno mie ścić się w przedziale 6,5–7,8.  
Najwyższe stężenie substancji testowej powinno mie ścić się 
w granicach fizjologicznych, tzn. nale ży unikać stresu pH 
i osmotycznego. W zale żności od substancji testowej mo że być 
konieczne wzi ęcie pod uwag ę innych w łaściwości fizyko-chemicz ­
nych jako czynników ograniczaj ących najwy ższe stężenie testowe. 
W przypadku stosunkowo trudno rozpuszczalnych substancji, które nie są toksyczne przy st ężeniach do punktu nasycenia, nale ży 
testować najwyższe możliwe do osi ągnięcia stężenie. Generalnie, 
należy unikać wytrącania substancji testowej przy jakimkolwiek 
stężeniu testowym. Maksymalne st ężenie substancji testowej nie 
powinno przekracza ć 1 000 g/mL; osmolarno ść nie powinna przekra ­
czać 10 mmol. Nale ży użyć 8 stężeń substancji testowej przygoto ­
wanych zgodnie z post ępem geometrycznym, ze sta ł
ym wspó łczyn­
nikiem rozcie ńczania (zob. cz ęść 2.1 akapit drugi).  
Jeśli istnieją dane wskazuj ące (uzyskane w toku eksperymentu 
określającego zakres), że substancja testowa nie jest cytotoksyczna 
do stężenia granicznego w eksperymencie ciemnym (-Irr), ale jest 
wysoce cytotoksyczna w przypadku na świetlania (+Irr), zakresy 
stężeń wybranych dla eksperymentu (+Irr) mog ą się różnić od 
zakresu st ężeń dla (-Irr), je śli eksperyment ma spe łnić wymaganie 
odpowiedniej jako ści danych.  
1.4.2.2.  Kontrole  
1.4.2.2.1. W r a ż l i w o ś ć k o m ó r e k n a p r o m i e n i o w a n i e , u s t a ­
l a n i e d a n y c h h i s t o r y c z n y c h  
Komórki powinny by ć regularnie sprawdzane (mniej wi ęcej co piąty 
pasaż) pod kątem wrażliwości na źródło światła przez ocen ę ich 
żywotności po ekspozycji na rosn ące dawki światła. W ocenie nale ży 
zastosowa ć kilka dawek irradiacji, w tym dawki, które s ą znacznie 
większe od dawek u żytych w badaniu fototoksyczno ści 3T3 NRU. 
Dawki te naj łatwiej skwantyfikowa ć mierząc cześć UV widma 
emitowanego przez źródło światła. Komórki s ą wysiewane przy 
gęstości stosowanej w badaniu fototoksyczno ści 3T3 NRU  in vitro  
i naświetlane nast ępnego dnia. Nast ępnie, na podstawie wychwytu 
barwnika Neutral Red, okre ślana jest żywotność komórek. Nale ży 
wykazać, że ostateczna najwy ższa dawka nietoksyczna (np. 
w badaniu walidacyjnym: 5 J/cm  2 [UVA]) by ła wystarczaj ąca do 
prawidłowego sklasyfikowania wzorcowych substancji chemicznych 
(tabela 1).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. W r a ż l i w o ś ć n a p r o m i e n i o w a n i e , s p r a w d z e n i e 
b i e ż ą c e g o b a d a n i a :  
TBadanie spe łnia kryteria jako ściowe, je śli naświetlone 
kontrole negatywne/rozpuszczalnikowe wykazuj ą żywotność 
ponad 80 % w porównaniu z nie na świetlaną kontrol ą 
negatywn ą/rozpuszczalnikow ą. 
1.4.2.2.3 Ż y w o t n o ś ć k o n t r o l i r o z p u s z c z a l n i k o w y c h :  
Absolutna g ęstość optyczna (OD  540 NRU  ) barwnika Neutral Red 
wyekstrahowanego z kontroli rozpuszczalnikowych wskazuje, czy 1 × 104 komórek wysianych do ka żdej studzienki w ci ągu dwóch 
dni testu mno żyło się, podwajaj ąc liczebno ść w normalnym czasie. 
Badanie spe łnia kryteria akceptacji, je śli średnia OD
 540 NRU  kontroli 
nie poddanych dzia łaniu substancji wynosi > 0,4 (tj. oko ło 
dwadzieścia razy wi ęcej niż absorbancja rozpuszczalnika w tle).  
1.4.2.2.4. K o n t r o l a p o z y t y w n a :  
Równocze śnie z każdym badaniem  in vitro  fototoksyczno ści 3T3 
NRU powinna by ć testowana znana substancja fototoksyczna. Zaleca 
się chlorpromazyn ę (CPZ). W przypadku CPZ testowanej zgodnie ze 
standardow ą procedur ą, w teście fotoksyczno ści 3T3 NRU  in vitro , 
określono nast ępujące kryteria akceptacji: CPZ na świetlona (+Irr): 
IC 50 = 0,1 do 2,0 μg/ml, CPZ niena świetlona (-Irr): IC  50 = 7,0 do 
90,0 μg/mL. Wspó łczynnik fotopodra żnienia (PIF) powinien by ć 
> 6. Nale ży monitorowa ć zmiany w czasie parametrów kontroli 
pozytywnej.  
Zamiast chloropromazyny do równoczesnych kontroli pozytywnych 
można użyć związków fototoksycznych, odpowiednich dla klasy 
chemicznej lub charakterystyki rozpuszczalno ści ocenianego zwi ązku 
chemicznego.  
1.4.3  Procedura badania (6)(7)(8)(16)(17):  
1.4.3.1  Pierwszy dzie ń: 
Rozmieścić 100 μL pożywki hodowlanej w peryferyjnych studzien ­
kach 96-studzienkowej p łytki mikrotitracyjnej do hodowli tkanko ­
wych (= puste). W pozosta łych studzienkach rozmie ścić 100 μL 
zawiesiny komórek (l × 10  5 komórek/mL) w po żywce hodowlanej 
(= 1 × 10  4 komórek/studzienka). Dla ka żdej serii st ężeń danej 
substancji testowej oraz dla kontroli rozpuszczalnikowej i kontroli 
dodatniej nale ży przygotowa ć dwie płytki. 
Inkubowa ć komórki przez 24 godziny (zob. cz ęść 1.4.1.2), dopóki 
nie utworz ą na wpół jednolitej monowarstwy. Okres inkubacji umo ż­
liwia komórkom odzyskanie żywotności, przyleganie i wzrost 
wykładniczy.  
1.4.3.2  Drugi dzie ń: 
Po inkubacji zdekantowa ć pożywkę hodowlan ą z komórek i przemy ć 
je ostrożnie 150 μL roztworu buforowego u żytego do inkubacji. 
Dodać 100 μL buforu zawieraj ącego odpowiednie st ężenie substancji 
testowej lub rozpuszczalnika (kontrola rozpuszczalnikowa). Zasto ­
sować 8 różnych stężeń substancji testowej. Inkubowa ć komórki 
z substancj ą testową w ciemno ści przez 60 minut (zob. cz ęść 1.4.1.2 
i 1.4.1.4 akapit drugi).  
Z dwóch p łytek przygotowanych do ka żdej serii st ężeń substancji 
testowej i kontroli wybiera si ę jedną, zwykle losowo, do oznaczenia 
cytotoksyczno ści (-Irr) (tj. p łytka kontrolna) i jedn ą (płytka ekspery ­
mentalna) do oznaczenia fototoksyczno ści (+Irr).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
W celu przeprowadzenia ekspozycji +Irr na świetlać komórki 
w temperaturze pokojowej przez 50 minut przez pokryw ę 96- 
studzienkowej p łytki przy najwy ższej dawce promieniowania, które 
nie jest toksyczne (zob. tak że załącznik 2). Trzyma ć nienaświetlone 
płytki (-Irr) w temperaturze pokojowej w ciemno ści (= czas 
ekspozycji na światło). 
Zdekantowa ć roztwór testowy i ostro żnie przemy ć dwukrotnie 
150 μL buforowanym roztworem u żywanym do inkubacji, ale nie 
zawierającym materia łu testowego. Zamieni ć bufor na po żywkę 
hodowlan ą i inkubowa ć (zob. cz ęść 1.4.1.2) do nast ępnego dnia 
(godz. 18–22).  
1.4.3.3  Trzeci dzie ń: 
1.4.3.3.1 O c e n a m i k r o s k o p o w a  
Komórki powinny by ć sprawdzone pod k ątem wzrostu, morfologii 
oraz kompletno ści monowarstwy za pomoc ą kontrastowego mikro ­
skopu fazowego. Nale ży zanotowa ć zmiany w morfologii komórek 
i wpływ na wzrost komórek.  
1.4.3.3.2 B a d a n i e w y c h w y t u b a r w n i k a N e u t r a l R e d  
Przemyć komórki 150 μL podgrzanego buforu. Usun ąć roztwór do 
przemywania poprzez lekkie stukanie. Doda ć 100 μL nośnika, 
zawierającego 50 μg/mL barwnika Neutral Red (NR) (chlorowo ­
dorek 3-amino-7-dimetyloamino-2-metylofenazyny, numer EINECS 
209-035-8; numer CAS 553-24-2; C.I. 50040) oraz surowic ę (16) 
i przez 3 godz. inkubowa ć jak opisano w akapicie 1.4.1.2. Po inku ­
bacji usun ąć nośnik zawieraj ący NR i przemy ć komórki 150 μL 
buforu. Zdekantowa ć i usunąć nadmiar buforu przez ods ączenie 
lub odwirowanie.  
Dodać dokładnie 150 μL roztworu desorbuj ącego NR ( świeżo przy­
gotowanego, 49 cz ęści wody + 50 cz ęści etanolu + 1 cz ęść kwasu 
octowego).  
Wytrząsać delikatnie p łytkę do mikromiareczkowania w wytrz ąsarce 
do płytek przez 10 minut, dopóki NR nie zostanie wyekstrahowany 
z komórek i nie utworzy jednorodnego roztworu.  
Zmierzyć gęstość optyczną ekstraktu NR w spektrofotometrze przy 
540 nm, stosuj ąc próby puste jako odniesienie. Zapisa ć dane 
w elektronicznym pliku w odpowiednim formacie w celu dalszej 
analizy.  
2. DANE  
2.1. JAKO ŚĆ I ILOŚĆ DANYCH  
Dane testowe powinny umo żliwić wiarygodn ą analizę odpowiedzi na 
stężenia, otrzymanych w obecno ści i przy braku irradiacji i – je śli to 
możliwe – st ężenia testowanej substancji, przy którym żywotność 
komórek jest zredukowana do 50 % (IC  50 ). Jeśli stwierdzona zosta ła 
cytotoksyczno ść, zarówno zakres st ężenia, jak i punkty przeci ęcia 
z osią krzywych dla poszczególnych st ężeń powinny by ć ustalone 
w taki sposób, aby umo żliwić dopasowanie krzywej do danych 
eksperymentalnych.  
Zarówno w przypadku wyra źnie dodatnich, jak i wyra źnie ujemnych 
wyników (zob. cz ęść 2.3 akapit pierwszy) mo że wystarczy ć pier­
wotny eksperyment, poparty jednym lub kilku wst ępnymi testami 
określającymi zakres.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Wyniki niejednoznaczne, bliskie warto ści granicznych lub niejasne 
powinny zosta ć przed dalszym testowaniem wyja śnione (zob. tak że 
część 2.4 akapit drugi). W takim przypadku nale ży rozważyć mody­
fikację warunków eksperymentu. Do wyników eksperymentalnych, 
które mog ą być modyfikowane, zalicza si ę zakres st ężeń lub różnice 
między kolejnymi st ężeniami, czas wst ępnej inkubacji oraz czas 
ekspozycji na irradiacj ę. W przypadku substancji, które łatwo hydro ­
lizują może być właściwe zastosowanie krótszego czasu ekspozycji.  
2.2. OCENA WYNIKÓW  
Aby umo żliwić ocenę danych mo żna obliczy ć współczynnik foto ­
podrażnienia (PIF) lub średni efekt fotoelektryczny.  
Przy obliczaniu miar fotoksyczno ści (zob. ni żej) należy wyznaczy ć 
za pomoc ą odpowiedniej ci ągłej krzywej odpowiedzi na st ężenie 
(model) grup ę dyskretnych warto ści odpowiedzi na st ężenie. Dopa ­
sowywanie krzywej do danych zwykle odbywa si ę za pomoc ą 
metody regresji nieliniowej (18). Aby oceni ć wpływ zmienno ści 
danych na kszta łt dopasowanej krzywej, zaleca si ę zastosowa ć 
metodę bootstrap.  
Współczynnik fotopodra żnienia (PIF) jest obliczany wed ług nastę­
pującego wzoru:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Jeśli nie da si ę obliczyć IC50 w obecno ści lub przy braku światła, 
nie jest mo żliwe obliczenie PIF dla materia łu testowego. Średni efekt 
fotoelektryczny (MPE) wyznacza si ę na podstawie porównania 
całych krzywych odpowiedzi na st ężenie (19). Efekt ten definiowany 
jest jako średnia wa żona reprezentatywnego zbioru warto ści efektu 
fotoelektrycznego  
MPE ¼ Σ 
i ¼ 1 n 
w i PE c i 
Σ 
i ¼ 1 n 
w i 
Efekt fotoelektryczny PEc przy dowolnym st ężeniu C jest definio ­
wany jako iloczyn efektu odpowiedzi REc i efektu dawki DEc, tj. 
PEc = REc × DEc. Efekt odpowiedzi REc jest ró żnicą między 
odpowiedziami obserwowanymi przy braku światła i przy świetle, 
tj. REc = REc = Rc (-Irr) – Rc (+Irr). Efekt dawki oblicza si ę 
według wzoru:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
gdzie C* oznacza st ężenie równowa żne, tj. stężenie, przy którym 
odpowied ź +Irr jest taka sama jak odpowied ź -Irr przy st ężeniu C. 
Jeśli C* nie da si ę określić poniewa ż wartości odpowiedzi na 
krzywej + Irr s ą systematycznie wy ższe lub ni ższe niż RC (-Irr), 
efekt dawki jest przyjmowany za 1. Czynniki wa żące są wyznaczone 
przez najwy ższą wartość odpowiedzi, tj. Wi = MAX { R  i (+Irr), Ri 
(-Irr)}. Tabela st ężeń C i jest dobierana w taki sposób, że ta sama 
liczba punktów przypada na ka żdy z przedzia łów stężenia, okre ślo­
nych przez warto ści stężenia zastosowane w eksperymencie. Obli ­
czanie MPE ogranicza si ę do maksymalnej warto ści stężenia, przy 
której co najmniej jedna z dwóch krzywych wci ąż wykazuje warto ść 
odpowiedzi co najmniej 10 %. Je śli to maksymalne st ężenie jest 
wyższe niż najwyższe stężenie zastosowane w eksperymencie +Irr, 
pozostała część krzywej +Irr jest dopasowywana do warto ści odpo­
wiedzi „0”. Substancja jest klasyfikowana jako fototoksyczna, 
w zależności od tego, czy warto ść MPE jest wi ększa niż odpo­
wiednio wybrany punkt odci ęcia (MPEc = 0,15), czy nie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Pakiet programów do obliczania PIF i MPE mo żna uzyska ć na 
stronie internetowej OECD (20).  
2.3. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Na podstawie bada ń walidacyjnych (8) substancja testowa z PIF < 2 
lub MPE <0,1 oznacza: „brak fototoksyczno ści”. PIF > 2 i < 5 lub 
MPE > 0,1 i < 0,15 oznacza: „prawdopodobn ą fototoksyczno ść”; 
a PIF > 5 lub MPE > 0,15 oznacza: „fototoksyczno ść”. 
W każdym laboratorium zaczynaj ącym przeprowadza ć to badanie, 
przed przebadaniem substancji testowej pod k ątem fototoksyczno ści 
należy poddać testom materia ły wzorcowe wymienione w tabeli 
1. Wartości PIF lub MPE powinny by ć bliskie warto ści wymienio ­
nych w tabeli 1.  
Tabela 1  
Nazwa chemiczna Nr EINECS Nr CAS PIF MPE Pik absorpcji Rozpuszc ­
zalnik (  1 ) 
Amiodaron 
HCL 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27–0,54 242 nm 
300 nm 
(prog) etanol 
Chloroproma ­
zyna HCL 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33–0,63 309 nm etanol 
Norfloksacyna 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34–0,90 316 nm acetonitryle 
Antracen 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19–0,81 356 nm acetonitryle Protoporfiryna 
IX, Disodium 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54–0,74 402 nm etanol 
L-Histydyna [7006-35-1] brak PIF 0,05–0,10 211 nm woda 
Heksachlorofen 200-733-8 [70-30-4] 1,1—1,7 0,00–0,05 299 nm 
317nm 
(prog) etanol 
Siarczan 
sodowy laurylu 205-788-1 [151-21-3] 1,0—1,9 0,00–0,05 brak absor ­
pcji woda
 
( 1 ) Rozpuszczalnik u żywany do mierzenia absorpcji.  
2.4. INTERPRETACJA DANYCH  
Jeśli efekty fototoksyczne wyst ępują jedynie przy najwy ższych stęże­
niach testowych (zw łaszcza w przypadku substancji testowych 
rozpuszczalnych w wodzie), ocena zagro żenia może wymaga ć 
uwzględnienia innych czynników. Mog ą to by ć dane 
o wchłanianiu przez skór ę i akumulacji substancji w skórze i/lub 
dane pochodz ące z innych bada ń, np. bada ń in vitro  na skórze ludz ­
kiej lub zwierz ęcej lub na modelach skóry.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Jeśli wykazano brak fototoksyczno ści (+Irr i -Irr) i je śli słaba 
rozpuszczalno ść ogranicza ła wartość stężenia, jakie mog ło być 
poddane testom, to kompatybilno ść substancji testowej z testem 
może być kwestionowana. Nale ży wtedy przeprowadzi ć testy 
potwierdzaj ące przy u życiu np. innego modelu.  
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z przeprowadzonego badania musi zawiera ć co 
najmniej nast ępujące informacje:  
Substancja testowa:  
— dane identyfikacyjne, powszechnie stosowan ą nazwę ogólną oraz 
numer IUPAC i CAS, je śli są znane,  
— stan skupienia i czysto ść, 
— właściwości fizykochemiczne zwi ązane z tokiem bada ń, 
— widmo absorpcyjne UV/vis,  
— stabilno ść i fotostabilno ść, jeśli są znane.  
Rozpuszczalnik:  
— uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika,  
— rozpuszczalno ść substancji testowej w rozpuszczalniku,  
— procent rozpuszczalnika obecnego w po żywce testowej.  
Komórki:  
— typ i źródło komórek,  
— brak mykoplazm,  
— liczba pasa ży komórek, je śli znana.  
— Wrażliwość komórek na promieniowanie, okre ślona za pomoc ą 
sprzętu irradiacyjnego stosowanego w te ście fototoksyczno ści 
3T3 NRU  in vitro . 
Warunki badania (1);  inkubacja przed i po procedurze : 
— typ i sk ład pożywki hodowlanej,  
— warunki inkubacji (st ężenie CO  2 ; temperatura; wilgotno ść), 
— czas trwania inkubacj i (przed procedur ą testową, po procedurze 
testowej).  
Warunki testu (2);  poddawanie dzia łaniu substancji chemicznej : 
— uzasadnienie wyboru st ężeń substancji testowej stosowanych 
przy naświetlaniu i bez na świetlania,  
— w przypadku ograniczonej rozpuszczalno ści substancji testowej 
i braku cytotoksyczno ści: uzasadnienie dla najwy ższego testowa ­
nego stężenia,  
— typ i sk ład pożywki testowej (buforowany roztwór soli),  
— czas dzia łania substancji chemicznej.  
Warunki testu (3);  irradiacja:  
— uzasadnienie wyboru stosowanego źródła światła, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— producent i typ źródła światła i radiometru,  
— charakterystyka widmowa irradiancji źródła światła, 
— charakterystyka przepuszczalno ści i absorpcji stosowanego(-ych) 
filtra(-ów),  
— charakterystyka radiometru i szczegó ły jego kalibracji,  
— odległość źródła światła od systemu testowego,  
— irradiancja UVA przy tej odleg łości wyrażona w mW/cm  2 , 
— czas trwania ekspozycji na światło UV/vis,  
— dawka UVA (irradiancja x czas), wyra żona w J/cm  2 , 
— temperatura hodowli komórkowych w czasie na świetlania 
i równoczesnych hodowli komórkowych trzymanych w ciemno ści.
 
Warunki testu (4);  test żywotności Neutral Red : 
— skład pożywki testowej Neutral Red,  
— czas trwania inkubacji Neutral Red,  
— warunki inkubacji (st ężenie CO  2 , temperatura, wilgotno ść), 
— Warunki ekstrakcji Neutral Red (rozpuszczalnik do ekstrakcji, 
czas trwania),  
— długość fali użytej do spektrofotometrycznego odczytu g ęstości 
optycznej Neutral Red,  
— druga d ługość fali (wzorcowa), je śli stosowano,  
— zawarto ść próby ślepej spektrofotometru, je śli używano.  
Wyniki:  
— żywotność komórek otrzymywana przy ka żdym stężeniu 
substancji testowej, wyra żona w procentach żywotności średnich, 
równoczesnych kontroli rozpuszczalnikowych;  
— krzywe odpowiedzi na st ężenie (stężenie substancji testowej 
w stosunku do wzgl ędnej żywotności komórek) uzyskane 
w równoczesnych eksperymentach +Irr i -Irr;  
— analiza krzywych odpowiedzi na st ężenie: jeśli to możliwe, obli ­
czenie IC  50 (+Irr) i IC  50 (-Irr);  
— porównanie dwóch krzywych odpowiedzi na st ężenie otrzyma ­
nych w obecno ści i przy braku irradiacji, albo przez obliczenie 
współczynnika fotopodra żnienia (PIF) lub średniego fotoefektu 
(MPE);  
— kryteria akceptacji testu; równoczesna kontrola rozpuszczalni ­
kowa:  
— żywotność absolutna (g ęstość optyczna ekstraktu Neutral Red) 
komórek na świetlanych i niena świetlanych,  
— historyczne dane dotycz ące kontroli negatywnej 
i rozpuszczalnikowej; średnie i standardowe odchylenia,  
— kryteria akceptacji testu; równoczesna kontrola pozytywna,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— IC  50 (+Irr) i IC  50 (-Irr) oraz PIF/MPE substancji kontroli pozy ­
tywnej,  
— historyczne dane dotycz ące substancji kontroli pozytywnej: IC  50 
(+Irr) i IC  50 (-Irr) oraz PIF/MPE; średnie i standardowe odchy ­
lenia.  
Dyskusja o wynikach.  
Wnioski.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) Lovell W.W. (1993). A scheme for  in vitro  screening of 
substances for photoallergenic potential. Toxic. In Vitro 7: 
95–102.  
(2) Santamaria, L. and Prino, G. (1972). List of the photodynamic 
substances. In Research Progress in Organic, Biological and Medicinal Chemistry-Vol. 3 part 1. North Holland Publishing Co. Amsterdam. p XI–XXXV.
 
(3) Spielmann, H., Lovell, W.W., Hölzle, E., Johnson, B.E., 
Maurer, T., Miranda, M.A., Pape, W.J.W., Sapora, O., and Sladowski, D. (1994). The report and recommendations of 
ECVAM Workshop 2. ATLA, 22, 314–348.
 
(4) Spikes, J.D. (1989). Photosensitization. In „The science of 
Photobiology” Edited by K.C. Smith. Plenum Press, New 
York. 2nd edition, p 79-110.  
(5) OECD (1997) Environmental Health and Safety Publications, 
Series on Testing and Assessment No.7 „Guidance Document On Direct Phototransformation Of Chemicals In Water” Envi ­
ronment Directorate, OECD, Paris.
 
(6) Spielmann, H., Balls, M., Dóring, B., Holzhutter, H.G., 
Kalweit, S., Klecak, G., L'Eplattenier, H., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Moldenhauer. F. Moore. L., Pape, W., 
Pfannbecker, U., Potthast, J., De Silva, O., Steiling, W., and 
Willshaw, A. (1994). EEC/COLIPA project on  in vitro  photo­
toxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay. Toxic. In Vitro 8, 793–796.
 
(7) Anon (1998). Statement on the scientific validity of the 3T3 
NRU PT test (an  in vitro  test for phototoxicity), European 
Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 
3 November 1997, ATLA, 26,7–8.  
(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
vitch, G. De Silva, O., Holzhutter, H.G., Clothier, R., 
Desolle, P., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, W.W., Maurer, T., Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., 
Sladowski, D., Steiling, W., and Brantom, P. (1998). The 
international EU/COLIPA  In vitro  phototoxicity validation 
study: results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test. Toxic. In Vitro 12, 305–327.
 
(9) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test Guideline Proposal, Berlin, 30th-31th October 2001, Secretariat's Final Summary 
Report, 15
 th March 2002, OECD ENV/EHS, available upon 
request from the Secretariat.  
(10) Borenfreund, E., and Puerner, J.A. (1985). Toxicity determina ­
tion in vitro  by morphological alterations and neutral red 
absorption. Toxicology Lett., 24,119–124.  
(11) Hay, R.J. (1988) The seed stock concept and quality control 
for cell lines. Analytical Biochemistry 171, 225–237.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 598
 
(12) Lambert L.A, Warner W.G., and Kornhauser A. (1996) Animal 
models for phototoxicity testing. In „Dermatotoxicology”, 
edited by F.N. Marzulli and H.I. Maibach. Taylor & Francis, Washington DC. 5th Edition, p 515–530.
 
(13) Tyrrell R.M., Pidoux M (1987) Action spectra for human skin 
cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultra ­
violet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on 
epidermal keratinocytes. Cancer Res., 47, 1825–1829.  
(14) (1993). Photography – Processed photographic colour films 
and paper prints – Methods for measuring image stability.  
(15) Sunscreen Testing (UV.B) TECHNICALREPORT, CIE, Inter ­
national Commission on Illumnation, Publication No. 90, 
Vienna, 1993, ISBN 3900734275  
(16) ZEBET/ECVAM/COLIPA – Standard Operating Procedure: 
Final Version, 7 September, 1998. 18 pgs.  
(17) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., De Silva, 
O., Holzhutter, H.G., Gerberick, F., Liebsch, M., Lovell, 
W.W., and Pfannenbecker, U. (1998) A study on UV filter chemicals from Annex VII of the European  Union Directive 
76/768/EEC,  in the  in vitro  3T3 NRU phototoxicity test. 
ATLA 26, 679-708.
 
(18) Holzhütter, H.G., and Quedenau, J. (1995) Mathematical 
modeling of cellular responses to external signals. J. Biol. Systems 3, 127–138.
 
(19) Holzhütter, H.G. (1997). A general measure of  in vitro  photo­
toxicity derived from pairs of dose-response curves and its use 
for predicting the  in vivo  phototoxicity of chemicals. ATLA, 
25, 445–462.  
(20) http://www.oecd.org/document/55/0,2340,en_2649_34377_23 49687 
_l_l_l_l,00.html  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
ZAŁĄCZNIK 1  
Rola 3T3 NRU PT w sekwencyjnym podej ściu do testowania fototoksyczno ści substancji 
chemicznych
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
ZAŁĄCZNIK 2  
Rysunek 1  
Rozkład mocy widma symulatora światła słonecznego wyposa żonego w filtry
  
(zob. część 1.4.1.5 akapit drugi)  
Na rysunku 1 podano przyk ład dopuszczalnego rozk ładu widma irradiancji symulatora świata 
słonecznego wyposa żonego w filtr. Opracowano na podstawie źródła halogenkowego stosowanego 
w badaniach walidacyjnych 3T3 NRU PT (6)(8)(17). Pokazano efekt dwóch ró żnych filtrów oraz 
dodatkowy efekt filtracyjny pokrywy 96-studzienkowej p łytki do kultur komórkowych. Filtr H2 by ł 
stosowany wy łącznie w systemach testowych, które toleruj ą znaczną ilość UVB (model testu 
skórnego i test fotohemolizy krwinek czerwonych). W 3T3 NRU-PT stosowano filtr H1. Na rysunku wida ć, że dodatkowy efekt filtruj ący pokrywy p łytki wyst ępuje głównie w zakresie 
UVB, przy czym w widmie irradiacji wci ąż jest wystarczaj ąco dużo UVB, żeby wzbudza ć 
substancje normalnie absorbuj ące promieniowanie w zakresie UVB, jak Amiodaron (zob. tabela 1).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Rysunek 2  
Wrażliwość na irradiacj ę komórek Balb/c 3T3 (mierzona w zakresie UVA)  
Żywotność komórek ( % wychwytu Red Neutral w kontrolach ciemnych)
  
(zob. część 1.4.1.5.2 akapit drugi); 1.4.2.2.1, 1.4.2.2.2)  
Wrażliwość komórek Balb/c 3T3 na irradiacj ę przy stosowaniu symulatora światła słonecznego 
stosowanego w badaniach walidacyjnych testu toksyczno ści 3T3 NRU, mierzona w zakresie 
UVA. Na rysunku przedstawiono wyniki otrzymane w 7 ró żnych laboratoriach w badaniach przed ­
walidacyjnych (1). Dwie krzywe z otwartymi symbolami zosta ły uzyskane przy u życiu starych 
komórek (du ża liczba pasa ży), które musia ły zostać zastąpione nowymi zasobami komórek; krzywe 
z wytłuszczonymi symbolami przedstawiaj ą komórki z akceptowaln ą tolerancj ą na naświetlanie.  
Na podstawie tych danych ustalono najwy ższą niecytotoksyczn ą dawkę irradiacji 5 J/cm (pionowa 
linia przerywana). Pozioma linia przerywana pokazuje dodatkowo maksymalny akceptowalny efekt 
irradiacji, opisany w akapicie 1.4.2.2).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  DZIAŁANIE UCZULAJ ĄCE NA SKÓR Ę: BADANIE LOKALNYCH 
WĘZŁÓW CHŁONNYCH  
WSTĘP 
1. Wytyczne OECD w odniesieniu do badania chemikaliów i opracowane 
według nich metody bada ń UE są okresowo poddawane przegl ądowi 
w związku z post ępem naukowym, zmieniaj ącymi się potrzebami regula ­
cyjnymi oraz trosk ą o dobrostan zwierz ąt. Pierwotna metoda badania (TM) 
przy okre ślaniu dzia łania uczulaj ącego na skór ę u myszy – badanie lokal ­
nych węzłów chłonnych (LLNA); wytyczna OECD nr 429 dotycz ąca 
badań; rozdział B.42 niniejszego za łącznika) zosta ła przyjęta już wcześniej 
(1). Szczegó ły walidacji LLNA i przegl ąd powiązanej bibliografii opubli ­
kowano w (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Zaktualizowana metoda 
LLNA opiera si ę na ocenie do świadczeń i danych naukowych (12). Jest to 
druga TM opracowywana w celu oceny potencja łu działania uczulaj ącego 
na skórę przez chemikalia (substancje i mieszaniny) u zwierz ąt. Druga TM 
(tj. wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań; rozdział B.6 niniejszego 
załącznika) wykorzystuje badania na świnkach morskich, 
w szczególno ści test maksymalizacji na świnkach morskich oraz test 
Buehlera (13). LLNA jest korzystniejsza od metody B.6 i wytycznej 
OECD nr 406 (13) dotycz ącej bada ń w odniesieniu do dobrostanu 
zwierząt. Ta zaktualizowana LLNA TM obejmuje zestaw norm 
efektywno ści (PS) (dodatek 1), które mog ą być wykorzystywane do 
oceny statusu zatwierdzenia nowych lub zmodyfikowanych metod badania, 
które są funkcjonalnie i pod wzgl ędem mechanistycznym podobne do 
LLNA, zgodnie z zasadami okre ślonymi w wytycznych OECD nr 34 (14).  
2. LLNA bada faz ę indukcyjn ą uczulenia skóry i dostarcza danych ilo ścio­
wych odpowiednich dla dokonania oceny dawka-reakcja. Trzeba zauwa ­ 
żyć, że łagodne/umiarkowane czynniki uczulaj ące, które zalecane s ą jako 
odpowiednie pozytywne substancje kontrolne dla metod testów na świn­
kach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań) (13) są 
również właściwe do stosowania w LLNA (6) (8) (15). Ograniczone 
podejście LLNA (rLLNA), w którym mo żna by wykorzystywa ć do 
40 % mniej zwierz ąt, jest równie ż opisane jako opcja w tej TM (16) 
(17) (18). Metoda rLLNA mo że być wykorzystywana, je śli istnieje 
potrzeba regulacyjna, aby potwierdzi ć negatywne oczekiwania co do 
potencjału działania uczulaj ącego na skór ę, pod warunkiem przestrzegania 
wszystkich innych specyfikacji protoko łów LLNA, jak to opisano 
w niniejszej TM. Przewidywania negatywnego wyniku powinny opiera ć 
się na wszystkich dost ępnych informacjach, o których mowa w pkt 4. 
Przed zastosowaniem podej ścia rLLNA nale ży przedstawi ć jasne uzasad ­
nienie i naukowe przes łanki uzasadniaj ące jego stosowanie. Je żeli, wbrew 
oczekiwaniom, uzyskuje si ę w rLLNA pozytywny lub niejednoznaczny 
wynik, konieczne mog ą być dodatkowe badania w celu interpretacji lub 
wyjaśnienia nieprawid łowości. Metody rLLNA nie nale ży wykorzystywa ć 
do identyfikacji zagro żeń ze strony badanych substancji uczulaj ących 
skórę w przypadku, gdy potrzebne s ą informacje dotycz ące zależności 
dawka-reakcja w celach takich, jak dokonanie podzia łu na podkategorie 
na potrzeby rozporz ądzenia (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, 
oznakowania i pakowania substancji i mieszanin oraz Globalnie Zharmo ­
nizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów ONZ.  
DEFINICJE  
3. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 2.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
4. LLNA jest alternatywn ą metodą identyfikowania potencjalnych chemika ­
liów uczulaj ących skór ę. Nie oznacza to, że należy koniecznie we wszyst ­
kich przypadkach stosowa ć LLNA zamiast testu na świnkach morskich (tj. 
B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań) (13), a tylko, że badanie to 
ma tę samą wartość merytoryczn ą i może zostać zastosowane jako badanie 
alternatywne, którego pozytywne lub negatywne wyniki nie wymagaj ą już 
dalszego potwierdzenia Laboratorium badawcze powinno uwzgl ędnić 
wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji przed  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
rozpoczęciem bada ń. Informacje te powinny obejmowa ć tożsamość 
i budow ę chemiczn ą badanej substancji; jej w łaściwości 
fizyko-chemiczne; wyniki innych bada ń toksyczno ści in vitro  lub in vivo  
badanej substancji i dane toksykologiczne dotycz ące strukturalnie pokrew ­
nych substancji chemicznych. Informacje te nale ży uwzględnić w celu 
ustalenia, czy LLNA jest odpowiednia dla substancji (ze wzgl ędu na 
niezgodno ść ograniczonych rodzajów chemikaliów z LLNA – zob. 
pkt 5) oraz do pomocy przy doborze dawek.  
5. Będąc metodą in vivo , LLNA nie eliminuje wykorzystania zwierz ąt 
w określaniu alergicznego kontaktowego dzia łania uczulaj ącego. Daje 
jednak potencjalne mo żliwości obniżenia liczby zwierz ąt potrzebnych do 
tego celu. Co wi ęcej, LLNA oferuje znacznie bardziej udoskonalony 
sposób wykorzystywania zwierz ąt (mniej bólu i cierpienia) do badania 
alergicznego kontaktowego dzia łania uczulaj ącego. LLNA opiera si ę na 
obserwacji zjawisk immunologicznych zachodz ących podczas fazy induk ­
cyjnej uczulania. W odró żnieniu od testów na świnkach morskich (tj. B.6; 
wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań) (13), test LLNA nie wymaga 
wywoływania reakcji nadwra żliwości skóry poprzez prowokacj ę. Ponadto 
LLNA nie wymaga zastosowania adiuwanta, jak wymaga tego test maksy ­
malizacji na świnkach morskich (13). Tym samym LLNA zmniejsza ból 
i cierpienie zwierz ąt. Niezale żnie od przewagi LLNA nad metodami B.6 
i wytyczn ą OECD nr 406 dotycz ącą badań, należy przyzna ć, że istnieją 
pewne ograniczenia, które mog ą spowodowa ć konieczno ść wykorzystania 
B.6 lub wytycznej OECD nr 406 (13) dotycz ącej badań (np. fałszywe 
wyniki negatywne dla LLNA w przypadku niektórych metali, fa łszywe 
wyniki pozytywne w przypadku niektórych środków dra żniących skór ę 
[takich jak niektóre chemikalia powierzchniowo czynne] lub rozpuszczal ­
ność badanej substancji) (19) (20). Ponadto klasy chemiczne lub 
substancje zawieraj ące grupy funkcjonalne, co do których wykazano, że 
działają jako potencjalne czynniki zak łócające (21), mog ą wymagać użycia 
badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD dotycz ąca badań 
nr 406) (13). Co wi ęcej, na podstawie ograniczonej bazy danych walida ­
cyjnych, która sk ładała się głównie z form u żytkowych pestycydów, otrzy ­
manie pozytywnego wyniku dla tego rodzaju badanych substancji jest 
bardziej prawdopodobne w przypadku LLNA ni ż w przypadku testów 
na świnkach morskich (22). Jednak podczas badania form u żytkowych 
można rozwa żyć wykorzystanie podobnych substancji o znanych wyni ­
kach jako substancji referencyjnych w celu wykazania, że LLNA dzia ła 
prawidłowo (zob. pkt 16). Poza tymi przypadkami zidentyfikowanych 
ogranicze ń LLNA powinna by ć stosowana do badania wszelkich substan ­
cji, chyba że istnieją właściwości związane z tymi substancjami, które 
mogą zakłócać dokładność LLNA.  
ZASADA BADANIA  
6. Podstawow ą zasadą u podłoża LLNA jest fakt, i ż czynniki uczulaj ące 
wywołują pierwotn ą proliferacj ę limfocytów w w ęźle chłonnym odprowa ­
dzającym limf ę z miejsca przy łożenia badanej substancji. Ta proliferacja 
jest proporcjonalna do zastosowanej dawki oraz potencja łu zastosowanego 
alergenu i jest prostym środkiem uzyskania ilo ściowego pomiaru uczule ­
nia. Proliferacja jest mierzona przez porównanie średniej proliferacji 
w każdej badanej grupie do średniej proliferacji w grupie kontrolnej otrzy ­
mującej nośnik (VC). Okre śla się stosunek średniej proliferacji w ka żdej 
grupie poddanej dzia łaniu środka do średniej proliferacji w równoleg łej 
grupie VC, który jest nazywany wska źnikiem stymulacji (SI) i powinien 
wynosić ≥ 3 zanim substancja badana zostanie zaklasyfikowana jako 
potencjalny czynnik uczulaj ący skórę. Procedury opisane w niniejszym 
dokumencie s ą oparte na wykorzystaniu do pomiaru  in vivo  znakowania 
markerem promieniotwórczym zwi ększonej liczby komórek rozmna żaj­ 
ących się wegetatywnie w odprowadzaj ących usznych w ęzłach chłonnych. 
Można jednak zastosowa ć inne punkty ko ńcowe do oceny liczby rozmna ­ 
żających się komórek, pod warunkiem że wymogi PS s ą całkowicie spe ł­
nione (dodatek 1).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
OPIS BADANIA  
Dobór gatunków zwierz ąt 
7. Mysz jest gatunkiem preferowanym do tego badania. U żywa się młodych, 
dorosłych samic myszy szczepów CBA/Ca lub CBA/J, które nie rodzi ły 
i nie są ciężarne. Na pocz ątku doświadczenia samice powinny mie ć 8–12 
tygodni, a zró żnicowanie mas cia ła poszczególnych zwierz ąt powinno by ć 
minimalne i nie przekracza ć 20 % średniej masy cia ła. Można ewentualnie 
wykorzysta ć inne szczepy i samce, je żeli otrzymano wystarczaj ące 
dowody na to, że nie istniej ą znaczące specyficzne ró żnice w reakcji na 
LLNA w zale żności od szczepu i/lub p łci. 
Warunki w pomieszczeniach dla zwierz ąt i pożywienie  
8. Myszy powinny by ć trzymane w grupach (23), chyba że istnieją odpo­
wiednie naukowe przes łanki dla trzymania myszy pojedynczo. Tempera ­
tura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosi ć 22 ± 
3 °C. Chocia ż wilgotno ść względna powinna wynosi ć co najmniej 30 % 
i pożądane jest, żeby nie przekracza ła 70 % poza czasem czyszczenia 
pomieszczenia, celem powinno by ć utrzymywanie jej na poziomie 
50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 
12 godzin ciemno ści. Do żywienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze 
laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.  
Przygotowanie zwierz ąt 
9. Zwierz ęta wybierane s ą losowo i znakowane w sposób umo żliwiający indy­
widualną identyfikacj ę (ale nie przez jakiekolwiek znaki na uszach) 
i trzymane w klatkach przez co najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem 
dawkowania w celu umo żliwienia zaaklimatyzowania do warunków labora ­
toryjnych. Przed rozpocz ęciem podawania bada si ę wszystkie zwierz ęta 
w celu upewnienia si ę, że nie maj ą żadnych zauwa żalnych zmian skórnych.  
Przygotowanie roztworów dozuj ących  
10. Sta łe substancje powinny zosta ć rozpuszczone lub zawieszone 
w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz rozcie ńczone, 
jeżeli jest to odpowiednie, przed zastosowaniem na uchu myszy. Chemi ­
kalia płynne można zastosowa ć czyste lub rozcie ńczone przed dawkowa ­
niem. Chemikalia nierozpuszczalne, takie jak te najcz ęściej spotykane 
w wyrobach medycznych, nale ży poddać ekstrakcji w warunkach wyj ątko­
wych w odpowiednim rozpuszczalniku w celu wykrycia wszystkich mo żli­
wych do wyekstrahowania sk ładników do badania przed zastosowaniem na 
uchu myszy. Substancje badane nale ży przygotowywa ć codziennie, chyba 
że dane dotycz ące stabilno ści wykazuj ą dopuszczalno ść składowania.  
Sprawdzenie wiarygodno ści 
11. Pozytywne substancje kontrolne (PC) wykorzystuje si ę do wykazania 
właściwego dzia łania badania poprzez reakcj ę badanej substancji uczulaj ącej 
z odpowiedni ą i powtarzaln ą czułością, dla której wielko ść reakcji jest 
dobrze scharakteryzowana. W łączanie kolejnych PC jest zalecane, poniewa ż 
potwierdza si ę w ten sposób kompetencje laboratorium do skutecznego 
przeprowadzenia ka żdego badania i umo żliwia dokonanie oceny odtwarzal ­
ności i porównywalno ści wewnątrz- i międzylaboratoryjnej. Niektóre organy 
regulacyjne wymagaj ą PC dla ka żdego badania i w zwi ązku z tym u żyt­
kownicy s ą zachęcani do przeprowadzenia konsultacji z w łaściwymi orga ­
nami przed rozpocz ęciem LLNA. Odpowiednio zaleca si ę rutynowe wyko ­
rzystywanie równoleg łej PC, aby unikn ąć potrzeby dodatkowych bada ń na 
zwierzętach do spe łnienia tych wymaga ń, które mog ą powstać w związku ze 
stosowaniem okresowej PC (zob. pkt 12). PC powinna da ć w teście LLNA  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
odpowied ź pozytywn ą na poziom nara żenia na dzia łanie, przy którym ocze ­
kuje się wzrostu wska źnika stymulacji (SI) > 3 wi ęcej niż w grupie kontroli 
negatywnej (NC). Dawk ę PC należy dobrać w taki sposób, by nie powo ­
dować nadmiernego podra żnienia skóry lub ogólnoustrojowej toksyczno ści, 
a indukcja by ła powtarzalna, ale nie nadmierna (tj. SI > 20 by łyby zbyt 
wysokie). Preferowana PC to 25 % aldehydu cynamonowego heksylu (Che ­
mical Abstracts Service [CAS] nr 101-86-0) w acetonie: oliwie z oliwek (w proporcji obj ętościowej 4:1 v/v) i 5 % merkaptobenzotiazolu (CAS nr 149- 
30-4) w N,N,-dimetyloformamidzie (zob. dodatek 1, tabela 1). Mog ą zaist­
nieć okoliczno ści, w których mo żna użyć innych PC spe łniających powy ­ 
ższe kryteria, pod warunkiem że istnieje po temu odpowiednie uzasadnienie.
 
12. Pomimo że zaleca si ę włączenie równoleg łej grupy PC, mog ą zaistnieć 
sytuacje, w których okresowe badanie PC (tj. w odst ępach nie d łuższych 
niż 6 miesięcy) może okazać się wystarczaj ące w przypadku laboratoriów, 
które regularnie przeprowadzaj ą badanie LLNA (tj. przeprowadzaj ą 
badanie LLNA co najmniej raz na miesi ąc) i dysponuj ą wcześniejszymi 
danymi z pozytywnych kontroli, świadczącymi o tym, że laboratorium jest 
w stanie uzyskiwa ć odtwarzalne i dok ładne wyniki w pozytywnych 
kontrolach. Mo żna wykaza ć odpowiedni poziom bieg łości 
w wykonywaniu badania LLNA, uzyskuj ąc stałe pozytywne wyniki PC 
w co najmniej 10 niezale żnych badaniach przeprowadzonych w rozs ądnym 
terminie (tj. w okresie krótszym ni ż rok).  
13. Nale ży zawsze w łączać równoleg łą grupę PC, jeśli zachodzi proceduralna 
zmiana w LLNA (np. zmiana przeszkolonego personelu, zmiany 
w metodzie badania materia łów i/lub odczynników, zmiany w metodzie 
badania urz ądzenia, zmiana źródła zwierząt testowych), a przedmiotowe 
zmiany powinny by ć udokumentowane w laboratoryjnych sprawozdaniach. 
Należy zwrócić uwagę na wpływ tych zmian na odpowiednio ść ustalonych 
wcześniej danych przy okre ślaniu konieczno ści zgromadzenia nowej bazy 
danych, aby udokumentowa ć spójność wyników PC.  
14. Badacze powinni by ć świadomi, że decyzja o przeprowadzeniu badania 
PC na zasadzie okresowej zamiast równolegle wywiera wp ływ na odpo ­
wiedniość i akceptowalno ść negatywnych wyników bada ń uzyskanych bez 
równoleg łej PC w okresie pomi ędzy każdym okresowym badaniem PC. 
Na przyk ład, jeżeli w okresowych PC uzyskany zostaje wynik fa łszywie 
negatywny, negatywne wyniki substancji badanej uzyskane w okresie 
między ostatnim dopuszczalnym okresowym badaniem PC 
i niedopuszczalnym okresowym badaniem PC mog ą być kwestionowane. 
Należy dokładnie rozwa żyć tego rodzaju skutki przy podejmowaniu 
decyzji, czy nale ży włączyć równoleg łą PC, czy tylko przeprowadza ć 
PC na zasadzie okresowej. Nale ży również wziąć pod uwag ę możliwość 
wykorzystania mniejszej liczby zwierz ąt w ramach grupy równoleg łej PC, 
jeżeli jest to naukowo uzasadnione, oraz je żeli laboratorium mo że wyka­
zać, w oparciu o wcze śniej zgromadzone dane, że można wykorzysta ć 
mniejszą liczbę myszy (12).  
15. Chocia ż substancja kontroli pozytywnej powinna by ć testowana 
w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje konsekwentn ą reakcję (np. 
aceton: oliwa z oliwek; w proporcji obj ętościowej 4:1, v/v), mog ą jednak 
zaistnieć pewne sytuacje wynikaj ące z przepisów, w których przetesto ­
wanie w niestandardowym no śniku (o formulacji odpowiedniej klinicznie/ 
chemicznie) mo że być również konieczne (24). Je żeli równoleg ła PC jest 
badana w innym no śniku niż substancja badana, wówczas nale ży włączyć 
oddzielną VC w odniesieniu do równoleg łej PC.  
16. W przypadkach gdy ocenia si ę substancje badane konkretnej klasy 
chemicznej lub daj ące pewien zakres reakcji, substancje wzorcowe mog ą 
służyć także temu, aby wykaza ć, czy metoda badawcza jest odpowiednia 
dla dokonania oceny potencjalnego dzia łania uczulaj ącego na skór ę tego 
rodzaju badanych substancji. Odpowiednie substancje wzorcowe powinny 
posiadać następujące właściwości: 
— strukturalne i funkcjonalne podobie ństwo do klasy badanej substancji,  
— znane w łaściwości fizyczne i chemiczne,  
— dane potwierdzaj ące z LLNA,  
— dane potwierdzaj ące z innych modeli zwierz ęcych i/lub ludzkich.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
PROCEDURA BADANIA  
Liczba zwierz ąt i poziomy dawek  
17. W ka żdej grupie badanej powinny by ć użyte nie mniej ni ż cztery zwie ­
rzęta, z minimaln ą liczbą trzech st ężeń badanej substancji oraz negatywn ą 
grupą kontroln ą otrzymuj ącą jedynie no śnik badanej substancji 
i pozytywn ą grupą kontroln ą (równoleg łą lub najnowsz ą, zgodnie 
z podejściem laboratorium, bierze si ę pod uwag ę pkt 11–14). Nale ży 
rozważyć zbadanie wielu dawek PC, szczególnie gdy badanie PC jest 
prowadzone na zasadzie nieregularnej. Z wyj ątkiem zastosowania 
substancji badanej, ze zwierz ętami grup kontrolnych nale ży się obchodzi ć 
w sposób identyczny jak ze zwierz ętami grup badanych.  
18. Dobór dawek i wybór no śnika powinien by ć oparty na zaleceniach poda ­
nych w pozycjach (3) i (5) bibliografii. Kolejne dawki zazwyczaj wybiera 
się z odpowiedniego szeregu st ężeń, takich jak 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 
5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Do wyboru szeregu st ężeń należy dołączyć 
odpowiednie naukowe uzasadnienie. O ile s ą dostępne, należy uwzględnić 
wszystkie istniej ące informacje toksykologiczne (np. o ostrej toksyczno ści 
i o podra żnieniu skóry) oraz o strukturalnych i fizykochemicznych w łaści­
wościach badanej substancji (i/lub substancji zbli żonych pod wzgl ędem 
budowy) przy wyborze trzech kolejnych st ężeń, tak aby najwy ższe 
stężenie maksymalizowa ło narażenie, nie doprowadzaj ąc jednak do ogól ­
noustrojowej toksyczno ści i/lub nadmiernego miejscowego podra żnienia 
skóry (3) (25). W przypadku braku takich informacji mo że okazać się 
konieczne przeprowadzenie badania wst ępnego (zob. pkt 21–24)  
19. No śnik nie powinien zak łócać wyniku badania lub wp ływać na niego oraz 
powinien by ć wybrany na podstawie maksymalizowania rozpuszczalno ści 
w celu uzyskania najwy ższego osi ągalnego st ężenia, dając jednocze śnie 
możliwość uzyskania roztworu/zawiesiny nadaj ącej się do podania 
substancji badanej. Zalecanymi no śnikami są aceton: oliwa z oliwek (w 
proporcji obj ętościowej 4:1 v/v), N,N-dimetyloformamid, metylo-etylo- 
keton, glikol propylenowy i sulfotlenek dimetylowy (19), ale mog ą być 
użyte inne, je śli przedstawi si ę wystarczaj ące uzasadnienie naukowe. 
W niektórych sytuacjach mo że okazać się konieczne u życie, jako dodat ­
kowej kontroli, rozpuszczalnika odpowiedniego ze wzgl ędów klinicznych, 
lub postaci handlowej, w której badana substancja wprowadzana jest na 
rynek. Szczególn ą uwagę należy zwrócić na zapewnienie, aby hydrofilne 
substancje badane zosta ły włączone do systemu no śnika, który nawil ża 
skórę i nie sp ływa z niej natychmiast, przez w łączenie odpowiednich 
środków zwi ększających rozpuszczalno ść (np. 1 % Pluronic ® L92). 
A zatem nale ży unikać roztworów ca łkowicie wodnych.  
20. Przetwarzanie w ęzłów chłonnych z poszczególnych myszy umo żliwia 
ocenę zmienno ści pomiędzy zwierz ętami oraz statystyczne porównanie 
różnicy między substancj ą badaną i pomiarami grupy VC (zob. pkt 35). 
Ponadto dokonanie oceny mo żliwości obniżenia liczby myszy w grupie 
PC jest wykonalne wówczas, gdy gromadzone s ą dane dotycz ące poszcze ­
gólnych zwierz ąt (12). Co wi ęcej, niektóre organy regulacyjne wymagaj ą 
zbierania danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt. Niemniej jednak 
połączenie danych dotycz ących zwierz ąt może być uznane za mo żliwe do 
przyjęcia przez niektóre organy regulacyjne i w takich przypadkach u żyt­
kownicy mog ą mieć możliwość gromadzenia indywidualnych lub po łączo­
nych danych dotycz ących zwierz ąt. 
Badanie wst ępne 
21. W przypadku braku informacji pozwalaj ącej określić najwyższą dawkę, 
jaka ma zosta ć zbadana (zob. pkt 18), nale ży przeprowadzi ć badanie 
wstępne w celu okre ślenia właściwego poziomu dawki do badania 
w metodzie LLNA. Celem badania wst ępnego jest opracowanie wytycz ­
nych dotycz ących wyboru maksymalnej dawki, jak ą należy stosowa ć 
w głównym badaniu LLNA, w przypadku gdy nie dysponuje si ę informa­
cjami na temat st ężenia powoduj ącego toksyczno ść ogólnoustrojow ą (zob. 
pkt 24) i/lub nadmierne miejscowe podra żnienie skóry (zob. pkt 23). 
Maksymalny poziom badanej dawki powinien wynosi ć 100 % substancji 
badanej w przypadku cieczy lub maksymalne mo żliwe stężenie 
w przypadku cia ł stałych lub zawiesin.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 607
 
22. Badanie wst ępne przeprowadza si ę w warunkach identycznych do tych, 
w jakich przeprowadza si ę główne badanie LLNA, z tym że nie przepro ­
wadza się oceny proliferacji w ęzła chłonnego oraz mo żna wykorzysta ć 
mniejszą liczbę zwierząt w grupie badanej. Zaleca si ę jedno lub dwa 
zwierzęta w grupie badanej. Wszystkie myszy b ędą obserwowane 
codziennie pod k ątem jakichkolwiek klinicznych oznak toksyczno ści ogól­
noustrojowej lub miejscowego podra żnienia skóry w miejscu zastosowa ­
nia. Masy cia ła są rejestrowane przed badaniem i przed jego zako ńczeniem 
(dzień 6.). Obydwoje uszu ka żdej myszy bada si ę pod kątem wyst ąpienia 
rumienia i ocenia przy wykorzystaniu tabeli 1 (25). Pomiary grubo ści ucha 
są przeprowadzane przy wykorzystaniu grubo ściomierza (np. cyfrowych 
mikrometrów lub grubo ściomierzem Peacock Dial) w dniu 1. (przed poda ­
niem substancji), w dniu 3. (oko ło 48 godzin nast ępujących po podaniu 
pierwszej dawki) oraz w dniu 6. Ponadto w dniu 6. grubo ść ucha mo żna 
określić za pomoc ą kolczykownicy do pomiaru masy, co powinno by ć 
przeprowadzone po u śmierceniu zwierz ąt w humanitarny sposób. 
Nadmierne miejscowe podra żnienie skóry jest sygnalizowane wyst ąpie­
niem rumienia o wyniku ≥ 3 i/lub zwi ększeniem grubo ści ucha ≥ 25 % 
w dniu pomiaru (26) (27). Najwy ższa dawka wybrana do g łównego 
badania LLNA to nast ępna niższa dawka w szeregu st ężeń badania wst ęp­
nego (zob. pkt 18), która nie wywo łuje ogólnoustrojowej toksyczno ści 
i/lub nadmiernego miejscowego podra żnienia skóry.  
Tabela 1  
Ocena punktowa rumienia  
Objawy Wynik  
Brak rumienia 0 
Bardzo lekki rumie ń (prawie niewidoczny) 1 
Wyraźny rumień 2 
Rumień umiarkowany do mocnego 3 
Mocny rumie ń (czerwie ń przypominaj ąca barwę mięsa czer­
wonego) do form obrz ęku wykluczaj ących klasyfikacj ę 
rumienia 4 
23. Oprócz 25 % zwi ększenia grubo ści ucha (26) (27), do zidentyfikowania 
substancji dra żniących w metodzie LLNA wykorzystywano te ż staty­
stycznie istotne zwi ększenie grubo ści ucha u myszy badanych 
w porównaniu z myszami kontrolnymi (28) (29) (30) (31) (32) (33) 
(34). O ile jednak statystycznie znacz ące zwiększenie mo że wystąpić 
przy grubo ści ucha mniejszej ni ż 25 %, to nie uda ło się go powi ązać 
z nadmiernym podra żnieniem (30) (32) (33) (34).  
24. Nast ępujące obserwacje kliniczne mog ą wskazywa ć na toksyczno ść ogól­
noustrojow ą (35) (36), je śli są wykorzystywane jako cz ęść zintegrowanej 
oceny i w zwi ązku z tym mog ą określać maksymalne dawki do stosowania 
w LLNA: zmiany w funkcjach uk ładu nerwowego (np. piloerekcja, atak ­
sja, drżenia oraz konwulsje); zmiany w zachowaniu (na przyk ład agresja, 
zmiany w czyszczeniu, wyra źna zmiana w poziomie aktywno ści); zmiany 
w sposobie oddychania (np. zmiany w cz ęstotliwości i intensywno ści 
oddychania, takie jak duszno ść, dyszenie oraz rz ężenie), a tak że zmiany 
w konsumpcji żywności i wody. Ponadto w ocenie nale ży wziąć pod 
uwagę oznaki stanów zwi ększonej senno ści i/lub brak reakcji oraz 
wszelkie objawy kliniczne sygnalizuj ące coś więcej niż niewielki lub 
chwilowy ból i cierpienie, lub > 5 % spadek masy cia ła od dnia 1. do 
dnia 6. czy śmiertelno ść. Zwierzęta konające oraz zwierz ęta wykazuj ące 
oczywiste oznaki bólu czy oznaki ostrego i przewlek łego strachu powinny 
zostać uśmiercone w sposób humanitarny (37).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 608
 
Harmonogram do świadczalny g łównego badania  
25. Harmonogram do świadczalny badania jest nast ępujący: 
— Dzień 1: Indywidualnie okre ślić i odnotowa ć wagę każdego zwierz ęcia 
oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Stosuje si ę 25 μl właściwego 
roztworu lub samego no śnika, lub kontroli pozytywnej (równoleg łej 
lub najnowszej, na podstawie polityki laboratoryjnej, bierze si ę pod 
uwagę pkt 11–15), na cz ęść grzbietow ą każdego ucha.  
— Dzień 2 i 3:  Powtórzy ć procedurę stosowania przeprowadzon ą w dniu 1.  
— Dzień 4 i 5:  Bez podawania.  
— Dzień 6: Zanotowa ć masę każdego zwierz ęcia. Poda ć w iniekcji 250 
μl sterylnego roztworu chlorku sodu buforowanego fosforanami (PBS) 
zawierającego 20 μCi (7,4 × 10  5 Bq) (  3 H) -metylotymidyny znako ­
wanej trytem wszystkim zwierz ętom badanym i kontrolnym przez żyłę 
ogonową. Alternatywnie poda ć w iniekcji 250 μl sterylnego PBS 
zawierającego 2 μCi (7,4 × 10  4 Bq)  125 I-jododezoksyuridiny 
i 10  –5 M fluorodezoksyuridiny wszystkim myszom przez żyłę 
ogonową. Pięć godzin (5 h) pó źniej uśmiercić w sposób humanitarny 
zwierzęta. Wyci ąć uszne w ęzły chłonne z ka żdego ucha myszy 
i przetwarza ć razem w PBS dla ka żdego zwierz ęcia (traktowanie 
w ujęciu osobniczym); alternatywnie wyci ąć i zebrać węzły chłonne 
z każdego ucha w PBS z ka żdej grupy badanej (traktowanie zbiorcze 
w ujęciu grupowym). Informacje i schematy identyfikacji i rozbioru 
węzła chłonnego mo żna znaleźć w pozycji (12). Do celów dalszego 
monitorowania miejscowych reakcji skóry w badaniu g łównym, 
w protokole badania mo żna uwzgl ędnić dodatkowe parametry, takie 
jak punktacja rumienia ucha lub pomiar grubo ści ucha (zrobiony za 
pomocą grubościomierza lub za pomoc ą kolczykownicy do pomiaru 
masy w czasie sekcji).  
Przygotowanie zawiesiny komórek  
26. Zostaje przygotowana jedna wspólna porcja zawiesiny z komórek w ęzła 
chłonnego (LNC) usuni ętych obustronnie u pojedynczych zwierz ąt albo 
z połączonych grup badanych przez delikatne mechaniczne rozdzielenie 
agregatów na siateczce ze stali nierdzewnej o oczkach wielko ści 200 μm 
lub za pomoc ą innych mo żliwych do przyj ęcia technik s łużących 
tworzeniu jednokomórkowych zawiesin. Komórki w ęzłów chłonnych s ą 
przemywane dwukrotnie pozosta łym PBS, a DNA jest str ącane 5 % 
kwasem trichlorooctowym (TCA) w 4 oC przez 18 godzin (3). Peletki 
są albo zawieszane ponownie w 1 mL TCA i przenoszone do fiolek 
scyntylacyjnych zawieraj ących 10 mL p łynu scyntylacyjnego do policzenia  
3 H, lub te ż przenoszone bezpo średnio do fiolek do liczenia impulsów 
gamma, w celu liczenia impulsów  125 I. 
Określenie proliferacji komórek (wbudowanie zwi ązku promieniotwórczego)  
27. Wbudowanie  3 H-metylotymidyny mierzone jest przez liczenie impulsów 
β-scyntylacji jako liczba rozpadów na minut ę (DPM). Wbudowywanie  
125 I-jododezoksyuridiny mierzone jest jako impulsy  125 I i równie ż wyra­ 
żane jako DPM. W zale żności od zastosowanego podej ścia, wbudowanie 
wyrażane jest jako DPM/mysz (uj ęcie osobnicze) lub DPM/grupa badana 
(ujęcie zbiorcze).  
Ograniczone podej ście LLNA  
28. W pewnych sytuacjach, je śli zachodzi potrzeba regulacyjna, aby potwier ­
dzić negatywne oczekiwania co do potencja łu działania uczulaj ącego na 
skórę, można zastosowa ć fakultatywny protokó ł rLLNA (16) (17) (18) 
z wykorzystaniem mniejszej liczby zwierz ąt, pod warunkiem że są prze­
strzegane wszystkie inne specyfikacje protoko łu LLNA w tej TM. Przed 
zastosowaniem podej ścia rLLNA nale ży przedstawi ć jasne uzasadnienie 
i naukowe przes łanki uzasadniaj ące jego stosowanie. Je żeli uzyskuje si ę 
wynik pozytywny lub niejednoznaczny, mog ą się okazać konieczne dodat ­
kowe badania w celu interpretacji lub wyja śnienia nieprawid łowości. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 609
 
29. Zmniejszenie liczby grup badanych jest jedyn ą różnicą między protoko ­ 
łami badania metod LLNA i rLLNA i z tego powodu rLLNA nie dostarcza 
informacji na temat relacji mi ędzy dawk ą a reakcj ą. Dlatego te ż rLLNA 
nie należy stosowa ć w przypadku, gdy potrzebne s ą informacje na temat 
relacji mi ędzy dawk ą a reakcją. Podobnie jak w wielodawkowym LLNA, 
stężeniem substancji badanej ocenianym w rLLNA powinno by ć maksy­
malne stężenie, które nie wywo łuje widocznej ogólnoustrojowej toksycz ­
ności i/lub nadmiernego miejscowego podra żnienia skóry u myszy (zob. 
pkt 18).  
OBSERWACJE  
Obserwacje kliniczne  
30. Zwierz ęta poddaje si ę starannej obserwacji klinicznej raz dziennie pod 
kątem jakichkolwiek oznak klinicznych, czy to miejscowego podra żnienia 
w miejscu zastosowania czy te ż ogólnoustrojowej toksyczno ści. Wszystkie 
obserwacje kliniczne s ą systematycznie odnotowywane w postaci zapisów 
prowadzonych dla ka żdej myszy. Plany monitorowania powinny obej ­
mować kryteria umo żliwiające szybk ą identyfikacj ę tych myszy, które 
wykazują oznaki toksyczno ści ogólnoustrojowej, nadmiernego miej ­
scowego podra żnienia skóry lub żrącego dzia łania na skór ę, w celu euta ­
nazji (37).  
Masy cia ła 
31. Jak wskazano w pkt 25, indywidualne masy cia ła określane są na początku 
badania i przy planowanym humanitarnym u śmierceniu zwierz ąt. 
OBLICZANIE WYNIKÓW  
32. Wyniki dla ka żdej grupy badanej s ą wyrażane jako SI. Je żeli zastosowano 
ujęcie osobnicze, SI otrzymuje si ę przez podzielenie średniej warto ści 
DPM/mysz w obr ębie każdej grupy dawkowania badanej substancji 
i grupy pozytywnej kontroli przez średnią wartość DPM/zwierz ę dla 
grupy kontrolnej rozpuszczalnika/no śnika. Średnie SI dla grup VC wynosi 
zatem jeden. Przy zastosowaniu uj ęcia zbiorczego, SI otrzymuje si ę przez 
podzielenie zbiorczego wbudowania zwi ązku promieniotwórczego dla 
każdej grupy badanej przez wbudowanie w zbiorczej próbie grupy VC; 
to daje średnie SI.  
33. W procesie decyzyjnym wynik uznawany jest za pozytywny, je śli SI ≥ 3. 
Jednakże siła reakcji na dawk ę, znaczenie statystyczne i spójno ść reakcji 
rozpuszczalnik/no śnik i PC mog ą również być stosowane przy ustalaniu, 
czy wynik graniczny mo żna uznać za pozytywny (4) (5) (6).  
34. Jeżeli zachodzi potrzeba obja śnienia otrzymanych wyników, nale ży 
rozważyć różne własności badanej substancji, w tym rozwa żyć, czy jest 
strukturalnie pokrewna znanym czynnikom uczulaj ącym, czy powoduje 
nadmierne podra żnienie skóry u myszy, a tak że rozważyć charakter zaob ­
serwowanej relacji dawka-reakcja. Te i inne wzgl ędy omówione s ą szcze­
gółowo gdzie indziej (7).  
35. Gromadzenie danych dotycz ących radioaktywno ści na poziomie poszcze ­
gólnych myszy umo żliwi analiz ę statystyczn ą danych w odniesieniu do 
obecności i relacji dawka-reakcja. Ocena statystyczna mo że obejmowa ć 
ocenę relacji mi ędzy dawk ą a reakcją, jak równie ż odpowiednio dostoso ­
wane porównania badanych grup (np. grupa badana w parach w porównaniu do równoleg łej grupy kontrolnej otrzymuj ącej nośnik). 
Analizy statystyczne mog ą obejmowa ć np. regresj ę liniową lub badanie 
Williamsa w celu dokonania oceny tendencji w relacji mi ędzy dawk ą 
a reakcją oraz badanie Dunnetta w odniesieniu do porówna ń par. Przy 
wyborze w łaściwej metody analizy statystycznej danych prowadz ący 
badanie powinien zachowa ć świadomość możliwej nierówno ści wariancji 
lub innych powi ązanych problemów, które mog ą spowodowa ć koniecz­
ność transformacji danych lub przeprowadzenia nieparametrycznej analizy 
statystycznej. W ka żdym przypadku prowadz ący badanie musi liczy ć się 
z konieczno ścią
 przeprowadzenia oblicze ń SI i analiz statystycznych 
z wykorzystaniem pewnych punktów danych i bez nich (tzw. „warto ści 
odstające”). ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 610
 
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Dane  
36. Dane nale ży przedstawi ć w formie tabeli. Przy wykorzystaniu podej ścia 
w ujęciu osobniczym nale ży przedstawi ć wartości DMP dla poszczegól ­
nych zwierz ąt, średnią wartość DPM/zwierz ę w danej grupie, zwi ązana 
wartość błędu (np. SD, SEM), oraz średnie SI dla ka żdej grupy badanej 
porównywane z równoleg łą grupą VC. Przy wykorzystaniu uj ęcia zbior­
czego nale ży wskaza ć średnią/medianę DPM i średnie SI dla ka żdej grupy 
badanej porównane z równoleg łą grupą VC.  
Sprawozdanie z bada ń 
37. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Substancje: badana i kontrolna:  
— dane identyfikacyjne (np. numery CAS lub WE, je śli są dostępne); 
źródło: czystość; znane zanieczyszczenia; numer partii),  
— cechy fizyczne i w łasności fizykochemiczne (np. lotno ść, stabilno ść, 
rozpuszczalno ść), 
— jeżeli jest to mieszanina, sk ład i wzgl ędne udzia ły procentowe sk ład­
ników.  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— dane identyfikacyjne (czysto ść; stężenie, tam gdzie stosowne; wyko ­
rzystane obj ętości), 
— uzasadnienie wyboru no śnika.  
Zwierzęta badane:  
— źródło, z którego pochodz ą myszy szczepu CBA,  
— status mikrobiologiczny zwierz ąt, jeśli jest znany,  
— liczba i wiek zwierz ąt, 
— źródło pochodzenia zwierz ąt, warunki środowiska, pokarm itp.  
Warunki badania:  
— szczegó ły przygotowania i stosowania substancji badanej,  
— uzasadnienie doboru dawek ( łącznie z wynikami z badania wst ępnego, 
jeśli było przeprowadzane),  
— nośnik i użyte stężenia substancji testowej oraz ca łkowita ilo ść zasto­
sowanej substancji badanej,  
— szczegó ły dotycz ące jakości pożywienia i wody (w łączając w to 
rodzaj/źródło diety, źródło wody),  
— szczegó ły dotycz ące poddania dzia łaniu substancji oraz harmono ­
gramów pobierania próbek,  
— metody pomiaru toksyczno ści, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne lub negatywne,  
— szczegó ły dotyczące protoko łu odchyle ń i wyjaśnienie, w jaki sposób 
odchylenie ma wp ływ na planowanie bada ń i ich wynik.  
Sprawdzenie wiarygodno ści: 
— podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodno ści, 
w tym informacji o wykorzystanej substancji badanej, st ężeniach 
i nośniku,  
— równoleg łe i/lub wcze śniejsze pozytywne i negatywne dane kontroli 
laboratorium prowadz ącego badanie,  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— jeżeli nie w łączono równoleg łej grupy PC, data i sprawozdanie labo ­
ratoryjne z ostatniego okresowego PC i sprawozdanie wyszczegól ­
niające wcześniejsze dane dotycz ące PC dla danego laboratorium, 
uzasadniaj ące przyczyny dla których nie przeprowadzono PC równo ­
legle.  
Wyniki:  
— masa poszczególnych myszy na pocz ątku dawkowania i przy plano ­
wanym u śmierceniu; jak równie ż średnia i opis powi ązanego b łędu 
(np. SD, SEM) w odniesieniu do ka żdej grupy badanej,  
— przebieg czasowy pojawienia si ę i oznaki toksyczno ści, w tym podra ż­
nień skóry w miejscu podania, je śli takie wyst ąpiły, u każdego zwie ­
rzęcia, 
— tabelę indywidualnych (podej ście w ujęciu osobniczym) lub średnich/ 
mediana (uj ęcie zbiorcze) warto ści DPM oraz SI dla ka żdej grupy 
badanej,  
— średnią oraz opis powi ązanego b łędu (np. SD, SEM) dla warto ści 
DPM/mysz dla ka żdej grupy badanej i wyniki analizy warto ści odstaj­ 
ących dla ka żdej grupy badanej przy zastosowaniu podej ścia osobni ­
czego,  
— obliczone SI i odpowiedni ą miarę zmienno ści, uwzgl ędniającą zmien­
ność między zwierz ętami w obu grupach: substancji badanej 
i kontrolnej przy u życiu podej ścia osobniczego,  
— relacja dawka-reakcja,  
— analizy statystyczne, tam gdzie stosowne.  
Omówienie wyników:  
— krótki komentarz do wyników, analiza zale żności reakcji od dawki 
oraz w stosownych przypadkach, analizy statystyczne, z wnioskiem czy substancja testowa powinna by ć uznana za czynnik uczulaj ący 
skórę.
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Pary ż. Dostępny na stronie: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; 
collaborative studies and new directions: A commentary,  Food Chem. Toxi ­
col., 30, 165–169.  
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications,  Toxicol ., 93, 1–31.  
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise,  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563–79.
 
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation,  Food Chem. Toxicol ., 34, 999–1002.  
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin 
sensitisation tests,  Food Chem. Toxicol ., 34, 985–997.  
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests,  Food Chem. 
Toxicol ., 36, 327–33.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 612
 
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins,  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 258–273.
 
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency 
center for the evaluation of alternative toxicological methods,  Reg. Toxicol. 
Pharmacol , 34, 274–286.
 
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process,  Reg. Toxicol. Pharmacol , 34: 249–257.  
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na 
stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]  
(13) OECD (1992),  Skin Sensitisation . OECD Guideline for Testing of Chemi ­
cals No 406, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines]  
(14) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and 
Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde,  J. Appl. Toxicol ., 18, 281–284.
 
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, 
P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal require ­
ments?  Contact Dermatitis , 54, 181–185.
 
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay 
(rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research 
Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre 
for the Validation of Alternative Methods, Kwiecie ń 2007. Dost ępny na 
stronie: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525- 1.pdf]
 
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis 
Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
 
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method 
for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Com ­
pounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordi ­
nated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program 
Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny 
na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llna ­
rep.pdf]
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 613
 
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90–96.
 
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of 
the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other 
Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication 
Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Envi ­
ronmental Health Sciences, dost ępne na stronie: [http://iccvam.nie ­
hs.nih.gov/]  
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National 
Academies Press.  
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71–89.  
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 404, Pary ż, France. Dost ępny na stronie: http:// 
www.oecd.org/document/40/ 0,3343,en_2649_34377_37051368_ 1_1_1_1,00.html]
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.  
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions,  Toxi­
col. Appl. Pharmacol ., 153, 83–94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals,  Toxicol. Meth ., 8, 245–256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods,  Drug. Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and 
Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60–68.  
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract,  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028.  
(35) OECD (1987),  Acute Dermal Toxicity , OECD Guideline for Testing of 
Chemicals No 402, Pary ż, France. Dost ępny na stronie: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 614
 
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
Tox_workshop.htm]
 
(37) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph, 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, 
Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 615
 
Dodatek 1  
Normy efektywno ści do celów oceny proponowanych podobnych do LLNA 
lub zmodyfikowanych metod badania dzia łania uczulaj ącego na skór ę 
WSTĘP 
1. Normy efektywno ści służą przede wszystkim ustaleniu, w jaki sposób 
określić, czy nowe metody bada ń, zarówno zastrze żone (tj. chronione 
prawem autorskim czy znakiem towarowym, zarejestrowane), jak i niezastrze żone, są wystarczaj ąco dokładne i wiarygodne w odniesieniu 
do konkretnych celów badawczych. Te normy efektywno ści, opracowane 
na podstawie zatwierdzonych i zaakceptowanych metod badawczych, mog ą 
być wykorzystane do oceny wiarygodno ści i dokładności innych podobnych 
metod (nazywanych potocznie metodami „me-too”), które opieraj ą się na 
podobnych zasadach naukowych i mierz ą lub przewiduj ą te same skutki 
biologiczne lub toksyczne (14).
 
2. Przed przyj ęciem zmodyfikowanych metod (tj. proponowanych ewentual ­
nych usprawnie ń do zatwierdzonej metody bada ń) należy dokona ć oceny 
w celu okre ślenia wpływu proponowanych zmian na dzia łanie badania oraz 
zakres, w jakim zmiany takie maj ą wpływ na informacje dost ępne dla 
innych elementów procesu zatwierdzania. W zale żności od liczby 
i charakteru proponowanych zmian, wygenerowanych danych i towarzysz ącej tym zmianom dokumentacji, powinny one by ć poddawane 
takiemu samemu procesowi walidacji, jak opisano w odniesieniu do 
nowego badania, lub, w stosownych przypadkach, ograniczonej ocenie 
wiarygodno ści i istotno ści przy u życiu sprawdzonej normy efektywno ści 
(14).
 
3. Podobne lub zmodyfikowane metody zaproponowane w ramach tej TM 
należy poddać ocenie w celu okre ślenia ich wiarygodno ści i dokładności 
przy użyciu substancji chemicznych reprezentuj ących pełne spektrum ocen 
LLNA. W celu unikni ęcia nieuzasadnionego wykorzystywania zwierz ąt 
zaleca się, aby naukowcy opracowuj ący modele zasi ęgnęli opinii w łaści­
wych władz przed rozpocz ęciem badania walidacyjnego zgodnie z normami 
efektywno ści i wytycznymi zamieszczonymi w niniejszej TM.  
4. Niniejsze normy efektywno ści opieraj ą się na normach US-ICCVAM, 
EC-ECVAM oraz japo ńskiej zharmonizowanej normie efektywno ści 
JaCVAM (12), s łużących do oceny wiarygodno ści metod podobnych do 
LLNA lub zmodyfikowanych jej wersji. Norma efektywno ści składa się 
z zasadniczych elementów metody badania, zalecanych substancji odnie ­
sienia i norm dotycz ących dokładności i wiarygodno ści, które proponowana 
metoda powinna spe łniać lub przewy ższać. 
I. Istotne elementy metody badania  
5. W celu zagwarantowania, że zmodyfikowana wersja metody LLNA lub 
metoda podobna do niej jest pod wzgl ędem funkcjonalnym 
i mechanistycznym analogiczna do LLNA i mierzy ten sam biologiczny 
skutek, w protokole metody badania powinny zosta ć uwzględnione nast ę­
pujące elementy:  
— substancja badana powinna by ć stosowana miejscowo na obu uszach 
myszy,  
— proliferacja limfocytów powinna by ć mierzona w w ęzłach chłonnych 
odprowadzaj ących z miejsca stosowania badanej substancji,  
— proliferacja limfocytów powinna by ć mierzona w fazie indukcyjnej 
uczulenia skóry,  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— wybran ą dla badanej substancji najwy ższą dawką powinno by ć maksy­
malne stężenie, które nie wywo łuje ogólnoustrojowej toksyczno ści i/lub 
nadmiernego miejscowego podra żnienia skóry u myszy. Dla pozytywnej 
chemicznej substancji odniesienia, najwy ższa dawka powinna by ć co 
najmniej tak du ża, jak warto ści LLNA EC3 odpowiednich chemicznych 
substancji odniesienia (zob. tabela 1) bez wywo ływania ogólnoustro ­
jowej toksyczno ści i/lub nadmiernego miejscowego podra żnienia skóry 
u myszy,  
— powinna zosta ć włączona równoleg ła VC do ka żdego badania oraz, 
w stosownych przypadkach, powinny by ć również wykorzystane równo ­
ległe PC,  
— w grupie badanej powinny by ć wykorzystane co najmniej cztery zwie ­
rzęta, 
— można gromadzi ć indywidualne lub zbiorcze dane z bada ń na zwierz ę­
tach.  
Jeżeli którekolwiek z tych kryteriów nie jest spe łnione, wówczas dane 
normy efektywno ści nie mog ą być wykorzystywane do zatwierdzania 
podobnych lub zmodyfikowanych metod.  
II. Minimalny wykaz chemicznych substancji odniesienia  
6. W normach US-ICCVAM, EC-ECVAM oraz japo ńskiej zharmonizowanej 
normie efektywno ści JaCVAM (12) zidentyfikowano 18 podstawowych 
chemicznych substancji odniesienia, które nale ży wykorzystywa ć, i cztery 
nieobowiązkowe chemiczne substancje odniesienia (tj. substancje, które 
w LLNA: DA daj ą fałszywie dodatnie lub fa łszywie ujemne wyniki, je śli 
porównać je do wyników bada ń na ludziach i na świnkach morskich (B.6 
i wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań) (13), i z tego wzgl ędu umoż­
liwiają wykazanie, że dana metoda dzia ła równie dobrze jak LLNA lub j ą 
przewyższa), które w łączono do normy efektywno ści dotycz ącej LLNA. 
W celu zidentyfikowania tych substancji chemicznych pos łużono się nastę­
pującymi kryteriami:  
— wykaz chemicznych substancji odniesienia reprezentuje typy substancji 
zazwyczaj badane w odniesieniu do potencjalnego dzia łania uczulaj ą­
cego na skór ę i do zakresu reakcji, które LLNA jest w stanie mierzy ć 
lub przewidywa ć, 
— substancje maj ą ściśle określone chemiczne struktury,  
— udostępniono dla ka żdej substancji dane LLNA z bada ń na świnkach 
morskich (tj. B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań) (13) oraz, 
tam gdzie mo żliwe, dane z bada ń na ludziach, oraz  
— substancje by ły łatwo dost ępne z handlowego źródła. 
Zalecane chemiczne substancje odniesienia przedstawiono w tabeli 1. 
Badania przy u życiu proponowanych chemicznych substancji odniesienia 
powinny by ć oceniane w no śniku, z którym s ą wymienione w tabeli 1. 
W sytuacjach, w których wymieniona w wykazie substancja nie jest dostępna, można stosowa ć inne substancje spe łniające kryteria doboru, 
z odpowiednim uzasadnieniem.
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 617
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 618
 ▼M3 
Tabela 1  
Zalecane w normie efektywno ści LLNA chemiczne substancje odniesienia  
Numer Substancje chemiczne (  1 ) Nr CAS Forma No śnik (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x - 2,0x EC3 Rzeczywisty 
zakres EC3 LLNA 
wporównaniu 
z badaniami 
na świnkach 
morskich LLNA 
wporównaniu 
z badaniami 
na ludziach  
1 5-chloro-2-metylo-4-izotiazolino-3-on (CMI)/2- 
metylo-4-izotiazolino-3-on (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Ciecz DMF 0,009 1 0,0045–0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sta ła AOO 0,049 15 0,025–0,099 0,02–0,09 ­
4 +/+ +/+ 
3 4-fenylenodiamina 106-50-3 Sta ła AOO 0,11 6 0,055–0,22 0,07–0,16 +/+ +/+ 
4 Chlorek kobaltu 7646-79-9 Sta ła DMSO 0,6 2 0,3–1,2 0,4–0,8 +/+ +/+ 
5 Izoeugenol 97-54-1 Ciecz AOO 1,5 47 0,77–3,1 0,5–3,3 +/+ +/+ 6 2-merkaptobenzotiazol 149-30-4 Sta ła DMF 1,7 1 0,85–3,4 NC +/+ +/+ 
7 Cytral 5392-40-5 Ciecz AOO 9,2 6 4,6–18,3 5,1–13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Ciecz AOO 9,7 21 4,8–19,5 4,4–14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Ciecz AOO 10,1 11 5,05–20,2 4,9–15 +/+ +/+ 
10 Benzoesan fenylu 93-99-2 Sta ła AOO 13,6 3 6,8–27,2 1,2–20 +/+ +/+ 
11 Alkohol cynamonowy 104-54-1 Sta ła AOO 21 1 10,5–42 NC +/+ +/+ 
12 Imidazolidynylomocznik 39236-46-9 Sta ła DMF 24 1 12–48 NC +/+ +/+ 
13 Metakrylan metylu 80-62-6 Ciecz AOO 90 1 45–100 NC +/+ +/+ 14 Chlorobenzen 108-90-7 Ciecz AOO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 Alkohol izopropylowy 67-63-0 Ciecz AOO 50 1 NA NA –/– –/+
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 619
 ▼M3 
Numer Substancje chemiczne (  1 ) Nr CAS Forma No śnik (  2 ) EC3 % (  3 ) N (  4 ) 0,5x - 2,0x EC3 Rzeczywisty 
zakres EC3 LLNA 
wporównaniu 
z badaniami 
na świnkach 
morskich LLNA 
wporównaniu 
z badaniami 
na ludziach  
16 Kwas mlekowy 50-21-5 Ciecz DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Salicylan metylu 119-36-8 Ciecz AOO 20 9 NA NA –/– –/– 18 Kwas salicylowy 69-72-7 Sta ła AOO 25 1 NA NA –/– –/– 
Nieobowi ązkowe substancje, które maj ą wykazać poprawę wyników w odniesieniu do LLNA 
19 Sól sodowa siarczanu dodecylu 151-21-3 Sta ła DMF 8,1 5 4,05–16,2 1,5–17,1 +/– +/– 
20 Dimetakrylan glikolu etylenowego 97-90-5 Ciecz MEK 28 1 14–56 NC +/– +/+ 
21 Ksylen 1330-20-7 Ciecz AOO 95,8 1 47,9–100 NC +/ (**) +/– 
22 Chlorek niklu 7718-54-9 Sta ła DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Skróty: AOO = aceton: oliwa z oliwek (w proporcji obj ętościowej 4: 1 v/v); nr CAS = Numer w Chemical Abstracts Service = Serwisie Dokumentacji Chemicznej; DMF = N, N-dimetyloformamid; DMSO = sulfotlenek dimetylowy; 
DNCB = 2,4-chlorodinitrobenzen; EC 3 = szacowane st ężenie konieczne do wyprodukowania wska źnika stymulacji 3; GP = wynik testów na świnkach morskich (tj. B. 6 lub wytyczna OECD nr 406 dotycz ąca badań) (13); HCA = 
aldehyd cynamonowy heksylu; Liq = ciecz; LLNA = wynik badania lokalnych w ęzłów chłonnych na myszach (tj. B. 42 lub wytyczna OECD nr 429 dotycz ąca badań) (1); MEK = keton metylo-etylowy; ND = nie dotyczy, poniewa ż 
wskaźnik stymulacji < 3; NC = nieobliczone, poniewa ż dane zosta ły uzyskane z jednego badania; SOL = sta łe; veh = badany no śnik. 
(*) Przypuszcza si ę, że u ludzi nie wywo łuje uczulenia ze wzgl ędu na fakt, że nie stwierdzono oznak klinicznych testu skórnego, nie jest on uwzgl ędniony w te ście skórnym plasterkowym z zestawem alergenów, a tak że nie stwierdzono 
przypadków dzia łania uczulaj ącego na cz łowieka. 
(**) GP brak dost ępnych danych. 
( 1 ) Substancje nale ży przygotowywa ć codziennie, chyba że dane dotycz ące stabilno ści wykazuj ą dopuszczalno ść składowania. 
( 2 ) Ze wzgl ędu na potencjalny wp ływ różnych nośników na efektywno ść LLNA nale ży zastosowa ć zalecany dla ka żdej chemicznej substancji odniesienia no śnik (24) (32). 
( 3 ) Warto ść średnia, w przypadku gdy by ła dostępna więcej niż jedna warto ść EC3. W odniesieniu do negatywnych substancji (tj. o wska źniku stymulacji < 3) podano najwy ższe badane st ężenie. 
( 4 ) Liczba bada ń LLNA, z których dane zosta ły uzyskane. 
( 5 ) Dostępny w handlu jako Kathon CG (nr CAS 55965-84-9), mieszanina CMI I MI w proporcji 3:1. Odpowiednie st ężenia dla ka żdego składnika wahaj ą się między 1,1 % a 1.25 % (CMI) oraz 0,3 % a 0,45 % (MI). Sk ładniki 
nieaktywne to: sole magnezu (od 21,5 % do 24 %) i azotan miedzi (od 0,15 % do 0,17 %), natomiast pozosta ła postać użytkowa to 74 % – 77 % wody. Kathon CG jest łatwo dost ępny w firmach Sigma-Aldrich i Rohm and Haas 
(obecnie Dow Chemical Corporation).
 III. Zdefiniowane normy wiarygodno ści i dokładności 
7. Dok ładność podobnej lub zmodyfikowanej metody LLNA powinna by ć 
taka sama, jak okre ślona w normie efektywno ści LLNA, ocenionej przy 
użyciu 18 podstawowych chemicznych substancji odniesienia, jakie 
powinny by ć stosowane, lub j ą przewyższać. Zastosowanie nowej lub 
zmodyfikowanej metody powinno prowadzi ć do poprawnej klasyfikacji 
w oparciu o decyzj ę „tak/nie”. Jednak nowa lub zmodyfikowana metoda 
może nie zaklasyfikowa ć poprawnie wszystkich z podstawowych chemicz ­
nych substancji odniesienia, jakie powinny by ć stosowane. Je żeli na przy ­
kład jeden z czynników s łabo uczulaj ących zosta ł nieprawid łowo zaklasy ­
fikowany, uzasadnienie nieprawid łowej klasyfikacji i odpowiednie dodat ­
kowe dane (np. wyniki testów, na podstawie których prawid łowo zaklasy ­
fikowano inne substancje z fizycznymi, chemicznymi i uczulaj ącymi właści­
wościami podobnymi do tych posiadanych przez nieprawid łowo zaklasyfi ­
kowaną chemiczn ą substancj ę odniesienia) mog łoby być uznane za 
świadczące o równowa żnej efektywno ści. W takich okoliczno ściach status 
zatwierdzenia nowej lub zmodyfikowanej metody LLNA b ędzie oceniany 
na zasadzie jednostkowych przypadków.  
Odtwarzalno ść wewnątrzlaboratoryjna  
8. W celu okre ślenia odtwarzalno ści wewnątrzlaboratoryjnej nowa lub zmody ­
fikowana metoda LLNA powinna by ć oceniona przy wykorzystaniu 
substancji uczulaj ącej, która jest dobrze scharakteryzowana w LLNA. 
Z tego wzgl ędu normy efektywno ści LLNA opieraj ą się na zmienno ści 
wyników z powtórzonych bada ń aldehydu cynamonowego 
heksylu (HCA). Aby oceni ć wiarygodno ść wewnątrzlaboratoryjn ą, należy 
wyprowadzi ć oszacowane warto ści progowe st ężenia dla HCA cztery razy, 
w co najmniej jednotygodniowych odst ępach czasu. Potwierdzeniem 
dopuszczalnej wewn ątrzlaboratoryjnej odtwarzalno ści jest zdolno ść labora­
torium do uzyskania, w ka żdym badaniu HCA, oszacowanych warto ści 
progowych dla HCA mi ędzy 5 % i 20 %, tj. o zakresie 0,5–2,0 razy średnia 
EC3 okre ślona dla HCA (10 %) w LLNA (zob. tabela 1).  
Odtwarzalno ść międzylaboratoryjna  
9. Odtwarzalno ść międzylaboratoryjna nowej lub zmodyfikowanej metody 
LLNA powinna by ć oceniona przy u życiu dwóch substancji uczulaj ących, 
które są dobrze scharakteryzowane w LLNA. Normy efektywno ści LLNA 
opierają się na zmienno ści wyników z bada ń HCA i 2,4- 
chlorodinitrobenzenu (DNCB) w ró żnych laboratoriach. Oszacowane 
wartości progowe st ężenia powinny by ć ustalane niezale żnie, w wyniku 
pojedynczego badania przeprowadzonego przynajmniej w trzech ró żnych 
laboratoriach. Aby wykaza ć dopuszczaln ą odtwarzalno ść międzylaborato ­
ryjną, każde laboratorium powinno uzyska ć oszacowane warto ści progowe 
stężenia wielko ści od 5 % do 20 % dla HCA i od 0,025 % do 0,1 % dla 
DNCB, tj. o zakresie 0,5–2,0 razy średnia EC3 st ężeń określonych dla HCA 
(10 %) i DNCB (0,05 %), odpowiednio, w LLNA (zob. tabela 1).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 620
 
Dodatek 2  
Definicje  
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody 
badania a przyj ętymi warto ściami odniesienia. Jest to miara efektywno ści metody 
badania i jeden z aspektów jej istotno ści. Pojęcia tego cz ęsto używa się 
zamiennie z poj ęciem „zgodno ść” na oznaczenie odsetka prawid łowych wyników 
uzyskiwanych przy u życiu metody badania (14).  
Substancja wzorcowa:  uczulająca lub nieuczulaj ąca substancja wykorzystywana 
jako norma dla celów porównania z substancj ą badaną. Substancja wzorcowa 
powinna mie ć następujące cechy: (i) sta łe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobie ń­
stwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji; (iii) znane w łaści­
wości fizykochemiczne; (iv) dane potwierdzaj ące występowanie znanych skut ­
ków; oraz (v) znany potencja ł w zakresie po żądanych reakcji.  
Oszacowany próg st ężenia (ECt):  oszacowane st ężenie substancji badanej, 
niezbędne do wyprodukowania wska źnika stymulacji, który jest oznak ą pozy­
tywnej reakcji.  
Oszacowane st ężenie 3 (EC3):  oszacowane st ężenie substancji badanej, 
niezbędne do wyprodukowania wska źnika stymulacji o warto ści 3. 
Fałszywy wynik negatywny:  substancja badana w wyniku zastosowania metody 
badania oznaczona niew łaściwie jako negatywna lub nieaktywna, podczas gdy 
w rzeczywisto ści jest pozytywna lub aktywna.  
Fałszywy wynik pozytywny:  substancja badana w wyniku zastosowania metody 
badania oznaczona niew łaściwie jako pozytywna lub aktywna, podczas gdy 
w rzeczywisto ści jest negatywna lub nieaktywna.  
Zagrożenie:  możliwość wywierania negatywnego wp ływu na zdrowie lub środo­
wisko. Niekorzystny wp ływ przejawia si ę tylko wtedy, gdy istnieje wystarczaj ące 
narażenie.  
Odtwarzalno ść międzylaboratoryjna:  miernik zakresu, w jakim ró żne wykwalifi ­
kowane laboratoria, przy u życiu tego samego protoko łu i testując tę samą badaną 
substancję, mogą przynieść jakościowo i ilo ściowo podobne wyniki. Odtwarzal ­
ność międzylaboratoryjna jest okre ślana w procesach poprzedzaj ących walidacj ę 
i obejmuj ących walidacj ę i wskazuje, w jakim stopniu badanie mo żna 
z powodzeniem przekazywa ć między laboratoriami: nazywana jest równie ż 
odtwarzalno ścią międzylaboratoryjn ą (14).  
Odtwarzalno ść wewnątrzlaboratoryjna:  ustalenie stopnia, w jakim wykwalifiko ­
wani pracownicy w tym samym laboratorium mog ą z powodzeniem odtworzy ć 
wyniki, stosuj ąc szczegó łowy protokó ł w różnych momentach. Nazywana 
również odtwarzalno ścią laboratoryjn ą (14).  
Badanie me-too:  potoczne okre ślenie metody badania, która jest strukturalnie 
i funkcjonalnie podobna do zwalidowanych i zaakceptowanych zgodnie z referencyjn ą metodą badania. Taka metoda badania kwalifikowa łaby się do 
wykorzystania jako walidacja „doganiaj ąca”. Zamiennie wykorzystana 
z podobn ą metodą badania (14).
 
Wynik odstaj ący: wynik odstaj ący jest obserwacj ą, która znacznie ró żni się od 
innych warto ści w losowej próbce z populacji.  
Normy efektywno ści (PS):  normy oparte na zwalidowanej metodzie badania, 
zapewniaj ące podstaw ę do oceny porównywalno ści proponowanej metody bada ­
nia, która jest podobna do metody referencyjnej pod wzgl ędem mechanistycznym 
i funkcjonalnym. Uwzgl ędnia się: (i) istotne elementy metody badania; (ii) 
podstawowy wykaz chemicznych substancji odniesienia, wybranych spo śród 
substancji chemicznych wykorzystywanych w celu wykazania akceptowalnej efektywno ści zwalidowanej metody badania; oraz (iii) podobny poziom dok ład­
ności i wiarygodno ści, na podstawie wyników uzyskanych dla zatwierdzonej 
metody badania, który proponowana metoda badania powinna osi ągnąć przy 
ocenie z wykorzystaniem minimalnego wykazu chemicznych substancji odnie ­
sienia (14).
 
Zastrzeżona metoda badawcza:  metoda badania, której produkcja i dystrybucja 
jest ograniczona poprzez patenty, prawa autorskie, znaki towarowe itp.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Zapewnienie jako ści: proces zarz ądzania, w którym przestrzeganie norm 
i wymogów w zakresie bada ń laboratoryjnych, oraz procedur dotycz ących doku ­
mentacji i dok ładności przekazywania danych jest oceniane przez osoby nieza ­
leżne od tych, które przeprowadzaj ą badania.  
Chemiczne substancje odniesienia:  substancje chemiczne wybrane do wykorzys ­
tania w procesie walidacji, dla których reakcje w systemie bada ń referencyjnych  
in vitro , jak i  in vivo  lub odpowiednie dla bada ń gatunki s ą już znane. Te 
substancje powinny by ć reprezentatywne dla klas substancji chemicznych, 
w odniesieniu do których – zgodnie z oczekiwaniami – b ędzie stosowana dana 
metoda badawcza i powinny reprezentowa ć pełny zakres reakcji, jakich mo żna 
się spodziewa ć po substancjach chemicznych, w odniesieniu do których środek 
może być stosowany, od reakcji silnych przez s łabe aż do negatywnych. Ró żne 
zestawy chemicznych substancji odniesienia mog ą być wymagane na ró żnych 
etapach procesu zatwierdzania, a tak że w odniesieniu do ró żnych metod badaw ­
czych i zastosowa ń badania (14).  
Istotność: opis powi ązania badania z oczekiwanym skutkiem oraz czy jest ono 
znaczące i użyteczne dla konkretnego celu. Jest to zakres, w jakim badanie 
prawidłowo mierzy lub przewiduje biologiczny oczekiwany skutek. Istotno ść 
obejmuje uwzgl ędnienie dok ładności (zgodno ści) metody badania (14).  
Wiarygodno ść: miernik zakresu, w jakim metoda badania mo że zostać wykonana 
w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomi ędzy laboratoriami 
w dłuższym okresie czasu, w przypadku jej wykonywania przy u życiu tego 
samego protoko łu. Ocenia si ę ją poprzez obliczenie odtwarzalno ści wewnątrz- 
i międzylaboratoryjnej (14).  
Działanie uczulaj ące na skór ę: proces immunologiczny, do którego dochodzi 
w przypadku, gdy osobnik wra żliwy jest nara żony miejscowo na wywo łujący 
uczulenie chemiczny alergen, powoduj ący immunologiczn ą reakcję skórną, co 
może prowadzi ć do uczulania przez kontakt ze skór ą. 
Wskaźnik stymulacji (SI):  wartość obliczona dla oceny potencjalnego dzia łania 
uczulającego na skór ę przez substancj ę badaną, który wyra ża się stosunkiem 
proliferacji w grupach poddanych dzia łaniu środka do proliferacji 
w równoleg łej grupie kontrolnej no śnika.  
Substancja badana (okre ślana także jako badana substancja chemiczna):  każda 
substancja lub mieszanina, badana za pomoc ą niniejszej TM.  
Zwalidowana metoda badania:  metoda badania, w odniesieniu do której zako ń­
czono badania walidacyjne w celu okre ślenia jej istotno ści (w tym dok ładności) 
i wiarygodno ści w odniesieniu do konkretnego celu. Nale ży zauważyć, że zwali­
dowana metoda badania mo że nie wykazywa ć dostatecznej efektywno ści 
z punktu widzenia dok ładności i wiarygodno ści, aby mo żna było ją uznać za 
dopuszczaln ą w odniesieniu do danego celu (14).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  BADANIE NEUROTOKSYCZNO ŚCI U GRYZONI  
1. METODA  
Ta metoda badania jest odpowiednikiem TG 424 (1997).  
Ta metoda badania zosta ła zaprojektowana w celu uzyskania danych 
potrzebnych do potwierdzenia lub bli ższego scharakteryzowania 
potencjalnej neurotoksyczno ści związków chemicznych wzgl ędem 
dorosłych zwierz ąt. Można ją albo łączyć z istniej ącymi metodami 
testowania wielokrotnej dawki, albo wykorzystywa ć w odrębnym 
badaniu. W celu uzyskania pomocy w projektowaniu bada ń opartych 
na tej metodzie zaleca si ę zapoznanie si ę z dokumentem zawieraj ­ 
ącym wytyczne OECD dotycz ące strategii i metod badania neuroto ­
ksyczności (1). Jest to szczególnie wa żne, jeżeli rozwa ża się mody­
fikacje obserwacji i procedur badania zalecanych do rutynowego wykorzystania tej metody. Dokument zawieraj ący wytyczne przygo ­
towano w celu u łatwienia wyboru innych procedur testowych do 
wykorzystywania w konkretnych okoliczno ściach.
 
Ocena neurotoksyczno ści rozwojowej nie jest tematem omawianej 
metody.  
1.1. WPROWADZENIE  
W ocenie i ewaluacji charakterystyki toksycznej substancji chemicz ­
nych wa żne jest rozparzenie potencja łu wywoływania skutków 
neurotoksycznych. Ju ż metoda testowania ogólnoustrojowej toksycz ­
ności dawki wielokrotnej zawiera obserwacje, które mog ą być bada­
niami sortuj ącymi pod k ątem potencjalnej neurotoksyczno ści. 
Omawiana metoda testowa mo że być wykorzystana do zaprojekto ­
wania badania zmierzaj ącego do uzyskania bli ższej informacji lub 
potwierdzenia skutków neurotoksycznych obserwowanych w badaniach ogólnoustrojowej toksyczno ści dawki wielokrotnej. 
Jednakże rozpatrywanie potencjalnej neurotoksyczno ści pewnych 
klas związków chemicznych mo że wskazywa ć, że może być ona 
właściwiej oceniona za pomoc ą omawianej metody, bez wcze śnie­
jszego wskazania potencjalnej neurotoksyczno ści w badaniu ogól ­
noustrojowej toksyczno ści dawki wielokrotnej. Tego rodzaju ewen ­
tualne wskazania obejmuj ą na przyk ład:
 
— obserwacje oznak neurologicznych lub zmian neuropatologicz ­
nych w badaniach innych ni ż badania ogólnoustrojowej toksycz ­
ności dawki wielokrotnej, lub  
— strukturalna zale żność lub inne informacje wi ążące je ze znanymi 
substancjami neurotoksycznymi.  
Ponadto mog ą być jeszcze inne przypadki, kiedy wykorzystanie 
omawianej metody jest w łaściwe; w celu uzyskania dodatkowych 
szczegółów, zob. (1).  
Ta metoda zosta ła opracowana w taki sposób, że można ją dosto­
sować do konkretnych potrzeb potwierdzenia specyficznej neuroto ­
ksyczności histopatologicznej i behawioralnej zwi ązku chemicznego, 
jak równie ż charakteryzowania i ilo ściowego okre ślania reakcji 
neurotoksycznej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
W przesz łości utożsamiano neurotoksyczno ść z neuropati ą obej­
mującą zmiany neuropatologiczne lub dysfunkcje neurologiczne, 
takie jak napady, parali ż lub drżenie. Chocia ż neuropatia jest 
ważnym objawem klinicznym neurotoksyczno ści, w tej chwili 
wiadomo ju ż, że jest wiele innych oznak toksyczno ści względem 
układu nerwowego (np. utrata koordynacji motorycznej, niedobory 
czucia, dysfunkcje uczenia si ę i pamięci), które mog ą nie ujawnia ć 
się w badaniach neuropath i innych typach bada ń. 
Omawiana metoda badania neurotoksyczno ści zaprojektowana 
została w celu wykrywania g łównych skutków neurobehawioralnych 
i neuropatologicznych u doros łych gryzoni. Chocia ż skutki behawio ­
ralne, nawet przy braku zmian morfologicznych mog ą odzwier ­
ciedlać niekorzystny wp ływ na organizm, nie wszystkie zmiany 
behawioralne s ą specyficzne dla systemu nerwowego. A zatem 
wszelkie obserwowane zmiany nale ży interpretowa ć w powiązaniu 
z korelacyjnymi danymi histopatologicznymi, hematologicznymi lub 
biochemicznymi jak równie ż danymi dotycz ącymi innych rodzajów 
toksyczno ści ogólnoustrojowej. Testowanie potrzebne w tej metodzie 
do scharakteryzowania i ilo ściowego okre ślenia reakcji neuroto ­
ksycznych obejmuje specyficzne procedury histopatologiczne 
i behawioralne, które mog ą być dalej potwierdzone przez badania 
elektrofizjologiczne i/lub biochemiczne (1)(2)(3)(4).  
Czynniki neurotoksyczne mog ą oddziaływać na wiele celów 
w obrębie układu nerwowego i to za po średnictwem ró żnych mecha ­
nizmów. Poniewa ż nie ma jednego zestawu testów, który potrafi łby 
dokładni oceni ć potencja ł neurotoksyczny wszelkich substancji, 
może być konieczne wykorzystywanie innych testów  in vivo  lub in 
vitro  specyficznych wzgl ędem obserwowanego lub przewidywanego 
rodzaju neurotoksyczno ści. 
Niniejsza metoda badania mo że być równie ż wykorzystana 
w połączeniu z wytycznymi podanymi w dokumencie OECD dotycz ­ 
ącym strategii i metod badania neurotoksyczno ści (1) do zaprojekto ­
wania bada ń zmierzaj ących do bli ższego scharakteryzowania lub 
zwiększenia czu łości ilościowego okre ślania reakcji na dawk ę, albo 
lepszej oceny poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę 
niekorzystnych skutków lub potwierdzenia znanych, lub podejrzewa ­
nych zagro żeń związanych z danym zwi ązkiem chemicznym. Na 
przykład można zaprojektowa ć badania zmierzaj ące do zidentyfiko ­
wania i oceny mechanizmu(-ów) neurotoksycznych lub uzupe łnienia 
danych dost ępnych w ramach wykorzystania podstawowych 
procedur obserwacji neurobehawioralnych i neuropatologicznych. Badania takie nie musz ą dublowa ć danych, które mo żna by uzyska ć 
przez zastosowanie standardowych procedur zalecanych w niniejszej 
metodzie, je żeli takie dane s ąjuż dostępne albo nie zosta ły uznane za 
konieczne do interpretacji wyników tego badania.
 
Badanie neurotoksyczno ści, wykorzystywane odr ębnie albo 
w połączeniu z innymi, dostarcza informacji, które mog ą: 
— stwierdzi ć, czy testowany zwi ązek chemiczny wp łynął na układ 
nerwowy w sposób trwa ły czy odwracalny,  
— przyczyni ć się do scharakteryzowania zmian w uk ładzie 
nerwowym zwi ązanych z ekspozycj ą na związek chemiczny, 
oraz do zrozumienia mechanizmu le żącego u pod łoża jego 
oddziaływania,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— określić zależności reakcji od dawki i czasu, w celu ocenienia 
poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę niekorzyst ­
nych skutków (który mo żna wykorzysta ć do ustalenia kryteriów 
bezpiecze ństwa w odniesieniu do danego zwi ązku chemicznego).  
Omawiana metoda testowa wykorzystuje doustn ą drogę podawania 
testowanej substancji. Inne drogi podawania (np. naskórna lub 
wziewna) mog ą być właściwsze i mog ą wymaga ć modyfikacji zale ­
canych procedur. Wybór drogi podawania zale ży od profilu nara ­ 
żenia ludzi oraz dost ępnych informacji w zakresie toksykologii 
i kinetyki.  
1.2. DEFINICJE  
Niekorzystny skutek:  jakakolwiek maj ąca związek z terapi ą zmiana 
w stosunku do danych bazowych, która zmniejsza zdolno ść orga­
nizmu do prze życia, rozmna żania lub przystosowania si ę do środo­
wiska.  
Dawka:  jest ilością podawanej substancji testowej. Dawka wyra żana 
jest w jednostkach wagowych (g, mg) lub jako waga substancji testowej na jednostk ę masy badanego zwierz ęcia (np. mg/Kg), lub 
jako stałe stężenie pożywienia (ppm).
 
Dawkowanie:  jest terminem ogólnym obejmuj ącym dawk ę, częstot­
liwość i czas trwania dawkowania.  
Neurotoksyczno ść: jest niekorzystn ą zmianą struktury lub funkcji 
układu nerwowego wynikaj ącą z ekspozycji na czynnik chemiczny, 
biologiczny lub fizyczny.  
Czynnik neurotoksyczny:  to jakikolwiek czynnik chemiczny, biolo ­
giczny lub fizyczny o potencjale powodowania skutków neuroto ­
ksycznych.  
NOAEL:  jest skrótem oznaczaj ącym poziom, przy którym nie obser ­
wuje się niekorzystnych skutków i jest najwy ższą dawką lub 
poziomem ekspozycji, przy zastosowaniu którego nie obserwuje si ę 
niekorzystnych wyników terapii.  
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Testowany zwi ązek chemiczny podawany jest drog ą doustną, 
w postaci pewnego zakresu dawek, kilku grupom gryzoni laborato ­
ryjnych. Wymagane s ą zazwyczaj dawki wielokrotne, za ś reżim 
dawkowania mo że obejmowa ć 28 dni, podchronicznej (90 dni) lub 
chronicznej toksyczno ści (1 rok lub d łużej). Procedury opisane 
w niniejszej metodzie badawczej mog ą być również użyte 
w badaniu neurotoksyczno ści ostrej. Zwierz ęta bada si ę w celu 
wykrycia lub scharakteryzowania behawioralnych i/lub neurologicz ­
nych nieprawid łowości. Zakres zachowa ń, na które czynniki neuro ­
toksyczne mog ą wpływać, oceniany jest w ka żdym okresie obserwa ­
cji. Na koniec badania podgrup ę zwierząt każdej z płci poddaje si ę 
perfuzji  in situ,  a następnie preparuje i bada skrawki mózgu, rdzenia 
kręgowego i nerwów obwodowych.  
Jeżeli badanie przeprowadza si ę jako odr ębne badanie w celu sorto ­
wania pod k ątem neurotoksyczno ści lub scharakteryzowania efektów 
neurotoksycznych, zwierz ęta z każdej grupy, nieu żyte do perfuzji 
i następczego badania histopatologicznego (zob. tabela 1), mog ą 
zostać wykorzystane do konkretnych procedur neurobehawioralnych, 
neuropatologicznych i elektrofizjologicznych, które mog ą uzupełnić 
dana otrzymane w standardowych badaniach wymaganych 
w niniejszej metodzie (1). Tego rodzaju dodatkowe procedury 
mogą być szczególnie u żyteczne w przypadkach kiedy obserwacje 
empiryczne lub przewidywane skutki wskazuj ą na jakiś szczególny 
rodzaj lub docelowy organ dzia łania neurotoksycznego. Alternatyw ­
nie, pozosta łe zwierzęta mogą zostać wykorzystane do ocen, jakich 
wymaga metoda badania toksyczno ści dawki wielokrotnej u gryzoni.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 625
 
Jeżeli procedury powy ższej metody badania łączone są z objętymi 
innymi metodami, nale ży użyć wystarczaj ącej liczby zwierz ąt 
potrzebnej do osi ągnięcia celów obu bada ń. 
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.4.1.  Wybór gatunków zwierz ąt 
Szczur jest po żądanym gatunkiem zwierz ęcia do bada ń, chociaż 
można użyć innego gatunku gryzonia, z podaniem uzasadnienia. 
Należy prowadzi ć badania na m łodych doros łych, zdrowych osobni ­
kach powszechnie u żywanych szczepów laboratoryjnych. Samice 
powinny by ć nieciężarne i takie, które nie rodzi ły. Dawkowanie 
powinno si ę zazwyczaj zacz ąć najszybciej jak to mo żliwe po zako ń­
czeniu ssania, najlepiej nie pó źniej niż w wieku sze ściu tygodni, 
w każdym razie zanim zwierz ęta osiągną wiek dziewi ęciu tygodni. 
Jednakże jeżeli badanie łączone jest z innym badaniem, wymagania 
co do wieku mog ą wymaga ć zmodyfikowania. Na pocz ątku badania 
zmienność ciężaru zwierz ąt powinna by ć minimalna i nie przekra ­
czać ± 20 % średniego ci ężaru dla ka żdej płci. Kiedy przeprowadza 
się krótkotrwa łe badanie z zastosowaniem dawki wielokrotnej jako 
wstępne badanie do badania d ługoterminowego, w obu badaniach 
należy użyć zwierząt tego samego szczepu pochodz ących z tego 
samego źródła. 
1.4.2.  Warunki przebywania i warunki żywieniowe  
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 22  o C (± 3  o C). Chocia ż wilgotno ść względna powinna 
wynosić co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie przekracza ła 
70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno by ć 
utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć 
sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Nale ży zmini­
malizowa ć sporadyczne g łośne hałasy. Do żywienia mo żna stosowa ć 
konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do 
wody pitnej. Na wybór diety mo że mieć wpływ potrzeba zapew ­
nienia odpowiedniej domieszki substancji testowanej przy podawaniu 
metodą powyższą. Zwierzęta mogą być trzymane pojedynczo lub 
umieszczane w klatkach w ma łych grupach o tej samej p łci. 
1.4.3.  Przygotowanie zwierz ąt 
Zdrowe, m łode zwierz ęta są losowo przydzielane do grup badanych 
i kontrolnych. Klatki powinny by ć ustawione w taki sposób, żeby 
zminimalizowa ć możliwy wpływ położenia klatki. Zwierz ęta są iden­
tyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co 
najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem badania, żeby umożliwić akli­
matyzację do warunków laboratoryjnych.  
1.4.4.  Droga podawania i przygotowanie dawek  
Ta metoda dotyczy konkretnie podawania doustnego substancji testo ­
wej. Podawanie mo że odbywa ć się przez rurk ę, w pożywieniu, 
wodzie pitnej lub w kapsu łkach. Mo żna użyć innych dróg podawania 
(np. naskórnej lub wziewnej), ale mo że to wymaga ć modyfikacji 
zalecanych procedur. Wybór drogi podawania zale ży od profilu nara ­ 
żenia ludzi oraz dost ępnych informacji w zakresie toksykologii 
i kinetyki. Nale ży wskaza ć racjonalne uzasadnienie wyboru drogi 
podawania, jak równie ż wynikające z niego modyfikacje procedury 
tej metody testowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 626
 
W przypadku gdy to konieczne, substancja testowana jest rozpuszczona 
lub ma posta ć zawiesiny w odpowiednim no śniku. Zaleca si ę, aby – 
jeżeli to możliwe – najpierw by ło rozważone użycie wodnego roztworu/ ­
zawiesiny, nast ępnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej kukurydziany), 
a potem mo żliwy roztwór w innym no śniku. Musi by ć znana charaktery ­
styka toksyczna no śnika. Ponadto nale ży uwzględnić następujące 
charakterystyki no śnika lub innych domieszek: skutek wywierany na 
absorpcję, dystrybucj ę, metabolizm, oraz na zatrzymywanie lub 
ekskrecję substancji testowej; skutki wywierane na chemiczne w łasności 
substancji testowej, które mog ą zmienić jej charakterystyk ę toksyczn ą; 
należy również uwzględnić wpływ na pobieranie pokarmu lub wody, lub 
stan odżywienia zwierz ąt. 
1.5. PROCEDURY  
1.5.1.  Liczba i p łeć zwierząt 
Kiedy badanie prowadzone jest jako odr ębne, do oceny szczegó łowych 
obserwacji klinicznych nale ży użyć co najmniej 20 zwierz ąt (10 samców 
i 10 samic) w ka żdej z grup dawkowania i kontrolnej. Co najmniej pi ęć 
samców i pi ęć samic nale ży poddać perfuzji  in situ  i wykorzysta ć do 
szczegółowych bada ń neurohistopatologicznych na zako ńczenie bada ­
nia. W przypadkach kiedy obserwacje kliniczne pod k ątem oznak 
skutków neurotoksycznych prowadzone s ą tylko w odniesieniu do ogra ­
niczonej liczby zwierz ąt, należy rozważyć włączenie tych zwierz ąt do 
grupy wybranych do perfuzji. Je żeli badanie prowadzone jest 
w połączeniu z badaniem toksyczno ści dawki wielokrotnej, nale ży 
użyć odpowiedniej liczby zwierz ąt potrzebnej do osi ągnięcia celów 
obu badań. Minimalne liczby zwierz ąt dla różnych kombinacji bada ń 
podano w tabeli 1. Je żeli planowane jest u śmiercanie w czasie trwania 
badania lub rozwa ża się prowadzenie grup zwierz ąt zdrowiej ących 
w celu obserwacji odwracalno ści, utrzymywania si ę lub opóźnionych 
skutków toksycznych, lub rozwa ża się obserwacje uzupe łniające, 
wtedy nale ży zwiększyć liczbę zwierząt aby zapewni ć, że wystarczy 
ich do celów obserwacji i bada ń histopatologicznych.  
1.5.2.  Grupy badane i grupa kontrolna  
Zasadniczo, powinny by ć wykorzystane co najmniej trzy grupy 
badane i grupa kontrolna, jednak je żeli z oceny innych danych nale ­ 
żałoby oczekiwa ć braku objawów przy dawce 1 000 mg/kg masy 
ciała/dzień, może być przeprowadzony test graniczny. Je żeli nie są 
dostępne odpowiednie dane, mo że być wykonane badanie wyników 
zakresowych, pomagaj ące w okre śleniu dawek, które maj ą być użyte. 
Z wyjątkiem zastosowania substancji testowanej, ze zwierz ętami grupy 
kontrolnej powinno si ę obchodzi ć w sposób identyczny, jak z podmio ­
tami grupy badanej. Je żeli przy podawaniu substancji testowanej jest 
stosowany no śnik, grupa kontrolna powinna otrzyma ć największą 
użytą objętość nośnika. Z wyj ątkiem zastosowania substancji testowa ­
nej, ze zwierz ętami grup kontrolnych powinno si ę obchodzi ć 
w sposób identyczny, jak ze zwierz ętami grup badanych. Je żeli przy 
podawaniu substancji testowanej jest stosowany no śnik, grupa 
kontrolna powinna otrzyma ć największą użytą objętość nośnika.  
1.5.3.  Sprawdzenie niezawodno ści 
Laboratorium wykonuj ące badanie powinno przedstawi ć dane wyka ­
zujące jego zdolno ść do przeprowadzenia badania oraz czu łość 
używanych metod. Dane te powinny udowadnia ć zdolność do 
wykrywania i ilo ściowego okre ślania stosownych zmian 
w punktach ko ńcowych zalecanych do obserwacji, takich jak objawy 
autonomiczne, reaktywno ść czuciowa, si ła uchwytu i aktywno ść 
motoryczna. Informacje o zwi ązkach chemicznych, które powoduj ą 
różne rodzaje reakcji neurotoksycznych i mog ą zostać użyte jako 
substancje do kontroli pozytywnej mo żna znaleźć w pozycjach 
bibliograficznych (2)–(9). Mog ą zostać użyte wcze śniej uzyskane 
dane jeżeli istotne aspekty procedury pozostaj ą takie same. Zalecane 
jest okresowe uaktualnianie przesz łych danych. Nale ży uzyska ć 
nowe dane wykazuj ące zachowan ą czułość procedur w przypadku 
gdy jakiś istotny element w przebiegu badania lub procedurach 
został zmieniony przez laboratorium wykonuj ące. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 627
 
1.5.4  Wybór dawki  
Poziomy dawki powinny by ć wybierane poprzez wzi ęcie pod uwag ę 
jakichkolwiek istniej ących danych o toksyczno ści i danych kinetycz ­
nych osiągalnych dla substancji testowanej lub materia łów pokrew ­
nych. Powinien zosta ć wybrany najwy ższy poziom dawki, w celu 
wywołania skutków neurotoksycznych lub wyra źnych toksycznych 
skutków ogólnoustrojowych. Od tego czasu malej ąca sekwencja 
poziomów dawki powinna by ć dobierana w taki sposób, aby 
wykazać wszelkie reakcje powi ązane z dawkowaniem i brak obser ­
wowanych objawów niekorzystnych przy najmniejszym poziomie dawki (NOAEL). W zasadzie poziomy dawek powinny by ć tak 
dobrane, aby pierwotne skutki dzia łania toksycznego na uk ład 
nerwowy da ły się odróżnić od skutków odnosz ących się do toksycz ­
ności ogólnoustrojowej. Dwa do trzech interwa łów są często opty­
malne dla ustalenia malej ących poziomów dawki i dodanie czwartej 
grupy badanej jest cz ęsto bardziej po żądane niż stosowanie bardzo 
dużych interwa łów (np. wspó łczynnik wi ększy od 10) mi ędzy 
dawkowaniem. Tam, gdzie dost ępna jest racjonalna ocena ekspozycji 
ludzi, powinna by ć ona równie
ż wzięta pod uwag ę. 
1.5.5.  Test graniczny  
Jeżeli test przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1 000 
mg/kg masy cia ła/dzień, przy stosowaniu procedur opisanych dla tego 
badania, nie wywo łuje widocznych objawów neurotoksycznych i je żeli 
nie należałoby spodziewa ć się toksyczno ści na podstawie danych 
dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy pe łne badanie 
przy użyciu trzech poziomów dawki mo że nie być konieczne. Ten test 
graniczny stosuje si ę z wyjątkiem przypadków, w których ekspozycja 
ludzi może wskazać na konieczno ść zastosowania w te ście granicznym 
wyższego poziomu dawki doustnej. W odniesieniu do innych dróg 
podawania, na przyk ład wziewnej lub stosowania na skór ę, własności 
fizyczne substancji testowanej mog ą często wyznacza ć najwyższy 
możliwy do osi ągnięcia poziom ekspozycji. Dawka testu granicznego 
do przeprowadzenia badania doustnej toksyczno ści ostrej powinna 
wynosić co najmniej 2 000 mg/kg.  
1.5.6.  Podawanie dawek  
Zwierzętom podaje si ę dawki substancji testowej raz dziennie, przez 
siedem dni w tygodniu, przez okres co najmniej 28 dni; stosowanie 
podawania przez pi ęć dni lub przez krótszy okres ekspozycji 
wymaga uzasadnienia. Kiedy substancja testowana podawana jest wprost do żołądka, powinna by ć podawana w jednorazowej dawce 
przy użyciu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej. Maksy ­
malna obj ętość cieczy, która mo że być podana jednorazowo, zale ży 
od wielko ści badanych zwierz ąt. Objętość ta nie powinna przekra ­
czać 1 ml/100 g masy cia ła; jednak że w przypadku roztworów 
wodnych mo żna rozwa żyć użycie do 2 ml/100 g masy cia ła. Poza 
substancjami dra żniącymi i korozyjnymi, które normalnie ujawniaj ą 
zaostrzone objawy przy wy ższych stężeniach, zmienno ść objętości 
w teście powinna by ć zminimalizowana przez dostosowanie st ężenia, 
tak aby zapewni ć stałą objętość dla wszystkich poziomów dawki.
 
W przypadku substancji podawanych w po żywieniu lub wodzie 
pitnej wa żne jest zapewnienie, aby wymagane ilo ści substancji testo ­
wanej nie kolidowa ły z prawid łową równowag ą odżywiania lub 
wody. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana w pożywieniu, mo że być stosowane sta łe stężenie żywieniowe 
(ppm) albo sta ły poziom dawki w odniesieniu do masy cia ła 
zwierząt; użyta opcja musi by ć wyszczególniona. W przypadku 
substancji podawanej bezpo średnio do żołądka dawka powinna by ć 
podawana ka żdego dnia o podobnym czasie, i w razie konieczno ści 
modyfikowana, żeby utrzyma ć stały poziom dawki w odniesieniu do 
masy ciała zwierzęcia. W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki 
jest przeprowadzane jako badanie wst ępne do badania d ługotermino ­
wego, w obu badaniach powinna by ć stosowana podobna dieta. 
W badaniach toksyczno ści ostrej, je żeli pojedyncza dawka nie jest 
możliwa, mo że ona by ć podawana w mniejszych cz ęściach przez 
okres nieprzekraczaj ący 24 godzin.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 628
 
1.6. OBSERWACJE  
1.6.1.  Cz ęstotliwość obserwacji i bada ń 
W badaniach dawki wielokrotnej okres obserwacji obejmuje okres 
dawkowania, w badaniach toksyczno ści ostrej, nale ży przestrzega ć 
14-dniowego okresu poobserwacyjnego. U zwierz ąt w grupie sateli ­
tarnej, któr ą trzyma si ę bez ekspozycji w okresie po terapii, obser ­
wacje powinny obj ąć również i ten okres.  
Obserwacje nale ży prowadzi ć z wystarczaj ącą częstotliwością by 
zmaksymalizowa ć prawdopodobie ństwo wykrycia nieprawid łowości 
w zachowaniu i/lub nieprawid łowości neurologicznych. Obserwacje 
powinny by ć przeprowadzane najlepiej ka żdego dnia o tej samej 
porze, bior ąc pod uwag ę szczytowy okres przewidywanych objawów 
po dawkowaniu. Cz ęstotliwość obserwacji klinicznych 
i funkcjonalnych zestawiono w tabeli 2. Je żeli dane kinetyczne, 
lub inne dane pochodz ące z poprzednich bada ń wskazują na potrzeb ę 
wyznaczenia innych punktów czasowych, bada ń lub okresów poob ­
serwacyjnych, w celu otrzymania jak najwi ększej ilości informacji, 
można przyjąć odmienny harmonogram. Nale ży przedstawi ć racjo­
nalne powody zmian w harmonogramie.  
1.6.1.1.  Obserwacje ogólnego stanu zdrowia oraz zachorowalno ści/­ 
śmiertelno ści 
Należy uważnie obserwowa ć wszystkie zwierz ęta, co najmniej raz 
dziennie, pod k ątem ogólnego stanu zdrowia, jak równie ż co 
najmniej dwa razy dziennie, pod k ątem zachorowalno ści 
i śmiertelno ści. 
1.6.1.2.  Szczegó łowe obserwacje kliniczne  
Należy prowadzi ć szczegó łowe obserwacje kliniczne wszystkich 
zwierząt wybranych do tego celu (zob. tabela 1), jeden raz przed 
pierwszą ekspozycj ą (aby uwzgl ędnić porównanie w obr ębie 
podmiotów), i od tego czasu w ró żnych odst ępach czasu, 
w zależności od czasu trwania badania (zob. tabela 2). Szczegó łowe 
obserwacje kliniczne w satelitarnych grupach zdrowiej ących zwierz ąt 
powinny zosta ć przeprowadzone pod koniec okresu zdrowienia. 
Szczegółowe obserwacje kliniczne powinny by ć przeprowadzane 
na zewnątrz klatki macierzystej na znormalizowanej powierzchni. 
Powinny by ć one dok ładnie odnotowywane przy u życiu systemów 
punktowania zawieraj ących kryteria lub skale punktowe dla ka żdego 
pomiaru w obserwacjach. Kryteria zastosowanych skal powinny by ć 
wyraźnie zdefiniowane przez laboratorium testuj ące. Należy podjąć 
wysiłki, aby zagwarantowa ć, że zmiany warunków badania s ą mini­
malne (niepowi ązane systematycznie z terapi ą) oraz że obserwacje s ą 
przeprowadzane najlepiej przez obserwatorów nie świadomych 
rzeczywiście zastosowanej terapii.  
Zaleca si ę prowadzenie obserwacji w sposób ustrukturalizowany, 
w którym dok ładnie zdefiniowane kryteria (w tym definicja normal ­
nego „zakresu”) stosowane s ą systematycznie do ka żdego zwierz ęcia 
w każdym okresie obserwacji. Nale ży dostatecznie udokumentowa ć 
„normalny zakres”. Wszelkie zaobserwowane objawy powinny by ć 
odnotowywane. Gdzie to mo żliwe, nale ży również odnotowa ć wiel­
kość obserwowanych objawów. Obserwacje kliniczne powinny obej ­
mować, ale nie powinny by ć do nich ograniczone, zmiany w skórze, 
futrze, oczach, b łonach śluzowych, wyst ąpienie wydzielin i wydalin 
oraz aktywno ść wegetatywn ą (np. łzawienie, podniesienie sier ści, 
rozmiar źrenicy, niezwyk ła forma oddychania i/lub oddychanie 
przez jam ę ustną, wszelkie niezwyk łe oznaki oddawania moczu lub 
defekacji oraz odbarwiony mocz).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 629
 
Należy równie ż odnotowywa ć wszelkie niezwyk łe reakcje 
w odniesieniu do postawy, poziomu aktywno ści (np. podwy ższenie 
lub obniżenie poziomu eksploracji znormalizowanej powierzchni) 
i koordynacji ruchowej. Nale ży także odnotowywa ć zmiany 
w sposobie chodzenia (np. chód kaczkowaty, ataksja), postawie 
(np. wygi ęty grzbiet), i reakcji na dotyk, przenoszenie i inne bod źce 
ze środowiska, jak równie ż obecność ruchów drgawkowych lub 
kurczowych, konwulsji lub dr żenia, stereotypy (np. nadmierne czysz ­
czenie si ę, niezwyk łe ruchy g łową, powtarzaj ące się krążenie 
w kółko), lub dziwne zachowania (np. gryzienie lub nadmierne wyli ­
zywanie, samookaleczanie, chodzenie do ty łu, wydawanie d źwię­
ków) lub agresj ę. 
1.6.1.3.  Obserwacje funkcjonalne  
Podobnie jak szczegó łowe obserwacje kliniczne, obserwacje funk ­
cjonalne nale ży równie ż przeprowadzi ć raz przed ekspozycj ą 
i później, często, u wszystkich zwierz ąt wybranych w tym celu 
(zob. tabela 1). Cz ęstotliwość obserwacji funkcjonalnych zale ży 
również od czasu trwania badania (zob. tabela 2). Dodatkowo, 
oprócz obserwacji podanych w tabeli 2, nale ży również przeprowa ­
dzić obserwacje funkcjonalne satelitarnej grupy zwierz ąt zdrowiej ­ 
ących, jak najbli żej terminu ko ńcowego u śmiercenia. Badania funk ­
cjonalne powinny obejmowa ć reaktywno ść na bodźce różnego typu 
(np. słuchowe, wzrokowe i czucia g łębokiego (5)(6)(7)), ocen ę siły 
uchwytu (8) oraz ocen ę aktywno ści motorycznej (9). Aktywno ść 
motoryczn ą należy mierzy ć urządzeniem automatycznym umo żli­
wiającym wykrywanie zarówno wzrostu jak i spadku aktywno ści. 
Jeżeli zastosowano inny zdefiniowany system, powinien on doko ­
nywać pomiaru ilo ściowego, nale ży też wykazać jego niezawodno ść. 
Należy przetestowa ć każde urządzenie, aby zapewni ć niezawodno ść 
w czasie oraz spójno ść pomiędzy urządzeniami. Bli ższe szczegó ły 
procedur, które mo żna przeprowadza ć, podane s ą w odpowiednich 
pozycjach bibliografii. Je żeli brak jest danych (np. struktura-dzia ła­
nie, dane epidemiologiczne, inne badania toksykologiczne) wskazuj ­ 
ących potencjalne skutki neurotoksyczne, nale ży rozważyć włączenie 
bardziej specjalistycznych obserwacji funkcji sensorycznej, aktyw ­
ności motorycznej i modelu zachowania lub uczenia si ę i pamięci, 
w celu bardziej szczegó łowego zbadania tych potencjalnych skut ­
ków. Dalsze szczegó ły bardziej wyspecjalizowanych obserwacji 
i ich zastosowania s ą podane w (1).  
Wyjątkowo z obserwacji funkcjonalnych mog ą być wyłączone zwie ­
rzęta, które ujawniaj ą oznaki zatrucia w stopniu, który móg łby 
znacząco kolidowa ć z wykonaniem obserwacji funkcjonalnej. Nale ży 
podać uzasadnienie wy łączenia zwierz ąt z obserwacji funkcjonalnej.  
1.6.2.  Masa cia ła i spożycie pożywienia/wody  
W badaniach trwaj ących do 90 dni, wszystkie zwierz ęta powinny 
być ważone co najmniej raz w tygodniu. Pomiary spo życia poży­
wienia (i wody, je żeli substancja testowana podawana jest z wod ą 
pitną) powinny by ć wykonywane co najmniej raz na tydzie ń. 
W badaniach d ługoterminowych nale ży ważyć zwierzęta raz na 
tydzień przez pierwsze 13 tygodni, pó źniej zaś co najmniej raz na 
4 tygodnie. Nale ży dokonywa ć pomiarów spo życia pożywienia (i 
wody, jeżeli substancja testowana podawana jest w tym o środku) 
co najmniej raz na tydzie ń przez pierwsze 13 tygodni, a nast ępnie 
w około trzymiesi ęcznych odst ępach, jeżeli stan zdrowia lub zmiany 
wagi ciała wymusz ą stosowanie innej procedury.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 630
 
1.6.3.  Oftalmologia  
W przypadku bada ń trwających dłużej niż 28 dni badanie oftalmo ­
logiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprz ętu 
powinno zosta ć przeprowadzone przed podaniem substancji testowej 
oraz przed zako ńczeniem bada ń, najlepiej na wszystkich zwierz ętach, 
ale co najmniej na zwierz ętach grupy najwy ższego dawkowania 
i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach nale ży 
przebadać wszystkie zwierz ęta. W badaniach d ługoterminowych 
należy przeprowadzi ć badanie oftalmologiczne równie ż w 13 tygod ­
niu. Nie ma potrzeby przeprowadzania badania oftalmologicznego, jeżeli takie dane s ą już dostępne z innych bada ń o podobnym okresie 
trwania i przy podobnych poziomach dawek.
 
1.6.4.  Hematologia i biochemia kliniczna  
Kiedy badanie neurotoksyczno ści prowadzone jest w po łączeniu 
z badaniem ogólnoustrojowej toksyczno ści dawki wielokrotnej, 
należy przeprowadzi ć badania hematologiczne i oznaczenia 
w zakresie biochemii klinicznej wed ług zasad podanych 
w odpowiedniej metodzie badania toksyczno ści ogólnoustrojowej. 
Próbki nale ży pobiera ć w taki sposób, żeby zminimalizowa ć jakikol­
wiek potencjalny wp ływ na zachowania o pod łożu neurologicznym.  
1.6.5.  Histopatologia  
Należy zaplanowa ć badanie neuropatologiczne w celu uzupe łnienia 
i poszerzenia obserwacji poczynionych podczas fazy  in vivo  badania. 
Tkanki pobrane od co najmniej 5 zwierz ąt/płeć/grupę (zob. tabela 1 
i następny akapit) nale ży utrwalić in situ , stosując powszechnie przy ­
jęte techniki perfuzji i utrwalania (zob. poz. bibliograficzna (3), 
rozdział 5, i poz. bibliograficzna (4), rozdzia ł 50). Nale ży odnotowa ć 
widoczne ogl ądowo zmiany. Je żeli badanie jest przeprowadzane jako 
odrębne badanie sortuj ące pod kątem neurotoksyczno ści lub w celu 
scharakteryzowania skutków neurotoksycznych, mo żna wykorzysta ć 
pozostałe zwierzęta do konkretnych procedur neurobehawioralnych 
(10)(11), neuropatologicznych (10)(11)(12)(13), neurochemicznych (10)(11)(14)(15) lub elektrofizjologcznych (10)(11)(16)(17), którymi 
można uzupe łniać procedury i badania opisane powy żej; można też 
powiększyć o nie liczb ę zwierząt badanych histopatologicznie. Tego 
rodzaju dodatkowe procedury s ą szczególnie u żyteczne 
w przypadkach, kiedy obserwacje empiryczne lub przewidywane 
skutki wskazuj ą na jakiś szczególny rodzaj lub docelowy organ 
działania neurotoksycznego (2)(3). Alternatywnie, mo żna wyko ­
rzystać pozostałe zwierzęta równie ż do rutynowych bada ń histopato ­
logicznych, jakie opisano w metodzie bada ń dawki wielokrotnej.  
Wszystkie preparaty tkanek zatopione w parafinie nale ży poddać 
ogólnej procedurze barwienia, jak np. hematoksylin ą i eozyn ą 
(H&E), i zbada ć pod mikroskopem. Je żeli zaobserwuje si ę oznaki 
neuropatii obwodowej lub podejrzewa ich obecno ść, należy zbadać 
próbki tkanki nerwów obwodowych zatopione w tworzywie. Oznaki 
kliniczne mog ą również sugerowa ć dodatkowe lokalizacje do 
zbadania lub te ż zastosowanie specjalnych procedur barwienia. 
Wytyczne dotycz ące dodatkowych miejsc do zbadania mo żna 
znaleźć w (3)(4). Pomocne mog ą być także właściwe specjalne barw ­
niki ujawniaj ące konkretne rodzaje zmian patologicznych (18).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 631
 
Należy zbadać histologicznie reprezentatywne skrawki z centralnego 
i obwodowego uk ładu nerwowego (zob. poz. bibliograficzna (3), 
rozdział 5, i poz. bibliograficzna (4), rozdzia ł 50). Obszary badane 
powinny zwykle obejmowa ć: przodomózgowie, centraln ą część 
móżdżku, w tym przekrój przez hipokamp, śródmózgowie, mó żdżek, 
most, rdze ń przedłużony, oko z nerwem wzrokowym i siatkówk ą, 
rdzeń kręgowy na poziomie rozszerzenia szyjnego i l ędźwiowego, 
zwoje korzeni grzbietowych, w łókna korzeni brzusznych 
i grzbietowych, proksymalny nerw kulszowy, proksymalny nerw 
piszczelowy (w kolanie) oraz mi ęśniowe odga łęzienia nerwu pisz ­
czelowego. Skrawki z rdzenia kr ęgowego i nerwów obwodowych 
powinny obejmowa ć zarówno przekroje poprzeczne jak 
i wzdłużne. Należy uwzględnić unaczynienie uk ładu nerwowego. 
Należy równie ż zbadać próbkę mięśnia szkieletowego, szczególnie 
mięśnia łydki. Szczególn ą uwagę należy poświęcić tym okolicom, 
których struktury komórkowe i w łókna w centralnym i obwodowym 
układzie nerwowym znane s ą ze szczególnej podatno ści na dzia łanie 
czynników neurotoksycznych.  
W pozycjach bibliograficznych (3)(4) mo żna znaleźć wskazówki 
dotyczące zmian neuropatologicznych typowych dla zmian wynikaj ­ 
ących z ekspozycji na czynnik toksyczny. Zaleca si ę dokonywanie 
badań w etapach, w których skrawki z grupy wysokiego dawko ­
wania porównywane s ą najpierw ze skrawkami z grupy kontrolnej. 
Jeżeli nie zostan ą zaobserwowane żadne zmiany neuropatologiczne 
w próbach z tych grup, nie jest wymagana dalsza analiza. Je żeli 
zostaną zaobserwowane zmiany w grupie wysokiego dawkowania, 
próba ka żdej potencjalnie dotkni ętej tkanki z grup po średniego 
i niskiego dawkowania powinna zosta ć zakodowana i nast ępnie 
zbadana sekwencyjnie.  
Jeżeli w obserwacjach jako ściowych zostan ą zauważone dowody 
jakichkolwiek zmian neuropatologicznych, nale ży przeprowadzi ć 
badanie we wszystkich obszarach uk ładu nerwowego wykazuj ących 
te zmiany. Skrawki z potencjalnie dotkni ętych okolic, ze wszystkich 
grup dawkowania, nale ży zakodowa ć i badać losowo bez znajomo ści 
kodu. Nale ży odnotowa ć częstość i ciężkość każdej zmiany. Kiedy 
zostaną ocenione wszystkie grupy dawkowania, mo żna rozkodowa ć 
oznaczenia i przeprowadzi ć analizę statystyczn ą w celu oszacowania 
zależności reakcji od dawki. Nale ży opisać przykłady zmian 
o różnym stopniu ci ężkości. 
Zmiany neuropatologiczne powinny by ć oceniane w kontek ście 
obserwacji i pomiarów, jak równie ż innych danych 
z wcześniejszych lub jednocze śnie prowadzonych bada ń toksycz­
ności ogólnoustrojowej testowanej substancji.  
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Powinny zosta ć dostarczone dane indywidualne zwierz ąt. Dodat­
kowo wszystkie dane powinny by ć podsumowane w formie tabeli 
przedstawiaj ącej dla ka żdej grupy badanej lub kontrolnej liczb ę 
zwierząt na pocz ątku testu, liczb ę zwierząt, które znaleziono martwe 
podczas testu lub u śmiercono z powodów humanitarnych i czas 
każdej śmierci lub humanitarnego u śmiercenia, liczb ę zwierząt wyka­
zujących oznaki toksyczno ści, opis obserwowanych oznak zatrucia, 
w tym czas rozpocz ęcia, okres trwania, rodzaj i ci ężkość wszelkich 
skutków zatrucia, liczb ę zwierząt wykazuj ących zmiany patolo ­
giczne, typ zmian(-y).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 632
 
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Objawy stwierdzone w badaniu nale ży ocenić w kategoriach cz ęs­
tości występowania, ci ężkości i korelacji skutków neurobehawioral ­
nych i neuropatologicznych (równie ż neurochemicznych 
i elektrofizjologicznych, je żeli włączono dodatkowe badania) oraz 
wszelkich innych zaobserwowanych skutków niekorzystnych. W przypadkach, gdy jest to mo żliwe, wyniki liczbowe powinny 
być ocenione za pomoc ą odpowiedniej i ogólnie akceptowanej 
metody statystycznej. Metody statystyczne powinny by ć wybrane 
podczas planowania badania.
 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancja testowa:  
— cechy fizyczne (w tym izomeria, czysto ść i własności fizykoche ­
miczne),  
— dane identyfikacyjne.  
Nośnik (w stosownych przypadkach):  
— uzasadnienie wyboru no śnika.  
Zwierzęta badane:  
— wykorzystany gatunek/szczep,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki przebywania zwierz ąt, aklimatyzacja, dieta, itp.,  
— — indywidualne masy cia ła zwierząt na pocz ątku testu.  
Warunki testu:  
— szczegó ły dotyczące przygotowania formy u żytkowej substancji 
testowanej/po żywienia, osi ąganego st ężenia, trwa łości 
i homogeniczno ści preparatu,  
— wyszczególnienie podawanych dawek, obejmuj ące szczegó ły 
nośnika, objętości i cech fizycznych podawanego materia łu; 
— szczegó ły podawania substancji testowanej,  
— racjonalna podstawa wyboru poziomu dawki,  
— racjonalna podstawa wyboru drogi podawania i czasu trwania 
ekspozycji,  
— jeżeli ma zastosowanie, przeliczenie st ężenia substancji testo ­
wanej w po żywieniu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywist ą dawkę 
(mg/kg masy cia ła/dzień), 
— szczegó ły jakości pożywienia i wody.  
Procedury obserwacji i testów:  
— szczegó ły przydzielania zwierz ąt każdej grupy do podgrup 
poddawanych perfuzji,  
— szczegó ły systemów punktowych, zawieraj ące kryteria i skale 
punktowe dla ka żdego pomiaru w szczegó łowych obserwacjach 
klinicznych,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— szczegó ły obserwacji funkcjonalnych pod k ątem oceny reaktyw ­
ności na bod źce różnego typu (np. s łuchowe, wzrokowe i czucia 
głębokiego; oceny si ły uchwytu oraz oceny aktywno ści moto­
rycznej (wraz ze szczegó łami urządzeń automatycznych wykry ­
wających aktywno ść); oraz innych u żytych procedur,  
— szczegó ły badań oftalmologicznych oraz, w stosownych przypad ­
kach, bada ń hematologicznych oraz klinicznych prób bioche ­
micznych wraz z odpowiednimi warto ściami bazowymi,  
— szczegó ły konkretnych procedur neurobehawioralnych, neuropa ­
tologicznych, neurochemicznych i elektrofizj ologicznych.  
Wyniki:  
— masa cia ła/zmiany masy cia ła w tym masa cia ła w chwili u śmier­
cenia,  
— spożycie pokarmu i spo życie wody, w stosownych przypadkach,  
— dane dotycz ące reakcji toksycznej w rozbiciu na p łcie i poziomy 
dawek, w tym oznaki toksyczno ści lub śmiertelno ść, 
— charakter, ci ężkość i czas trwania (rozpocz ęcie i dalszy przebieg) 
obserwacji klinicznych (zarówno odwracanych jak i nieodwracalnych),
 
— szczegó łowy opis wszystkich wyników obserwacji funkcjonal ­
nych,  
— stwierdzenia sekcji zw łok, 
— szczegó łowy opis wszystkich stwierdze ń neurobehawioralnych, 
neuropatologicznych, i neurochemicznych, je śli takie s ą 
dostępne, 
— dane dotycz ące absorpcji i metabolizmu, w stosownych przypad ­
kach,  
— statystyczna obróbka wyników, w stosownych przypadkach,  
Dyskusja wyników:  
— informacje o reakcji na dawk ę, 
— związek jakichkolwiek skutków toksycznych z wnioskiem 
dotyczącym neurotoksycznego potencja łu badanego zwi ązku 
chemicznego,  
— poziom dawkowania, przy którym nie obserwuje si ę niekorzys ­
tnego skutku.  
Wnioski:  
— zachęca się do zamieszczenia konkretnego stwierdzenia dotycz ą­
cego ogólnej neurotoksyczno ści badanego zwi ązku chemicznego.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.  
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, 
OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.  
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
 
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 
999–1003.  
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Indust ­
rial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691–704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observa ­
tional Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. 
Appl. Pharmacol., 108, 267–283.  
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. 
(1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and 
Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxi ­
col., 1, 233–236.  
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
599–609.
 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. 
Marcel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689–695.  
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. 
(1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 
18, 343–352.  
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445–452.
 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368–378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Elec ­
trophysiological Techniques inNeurotoxicology. In: Nervous 
System Toxicology. Mitchell, CL. ed. Raven Press, New York, pp 299–335.
 
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxico ­
logy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams 
and Wilkins Co., Baltimore/London, pp. 726–742.  
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livings ­
tone. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabela 1  
Minimalne liczby zwierz ąt w grupach potrzebne w sytuacji, kiedy badanie neurotoksyczno ści przeprowadzane 
jest odrębnie lub w po łączeniu z innymi badaniami  
BADANIE NEUROTOKSYCZNO ŚCI PRZEPROWADZONE JAKO: 
Odrębne badanie Połączone z badaniem 
28-dniowym Połączone z badaniem 
90-dniowym Połączone z badaniem 
toksyczno ści 
chronicznej  
Całkowita liczba zwierz ąt 
na grupę 10 samców i 10 
samic 10 samców i 10 
samic 15 samców i 15 
samic 25 samców i 25 
samic 
Liczba zwierz ąt wybrana do 
obserwacji funkcjonalnych, w tym szczegó łowych 
obserwacji klinicznych 10 samców i 10 
samic 10 samców i 10 
samic 10 samców i 10 
samic 10 samców i 10 
samic 
Liczba zwierz ąt wybranych 
do perfuzji  in situ  
i neurohistopatologii 5 samców i 5 samic 5 samców i 5 samic 5 samców i 5 samic 5 samców i 5 samic 
Liczba zwierz ąt wybranych 
do badań dawki wielokrot ­
nej/obserwacji toksyczno ści 
podchronicznej/chronicznej, 
hematologii, biochemii 
klinicznej, histopatologii itp., jak wskazano to w odnośnych wytycznych 5 samców i 5 samic 10 samców † i 10 
samic † 20 samców † i 20 
samic † 
Dodatkowe obserwacje 
w stosownych przypadkach 5 samców i 5 samic
 
† Wliczaj ąc w to pi ęć zwierząt wybranych do obserwacji funkcjonalnych i szczegó łowych obserwacji klinicznych, stanowi ących 
część badania neurotoksyczno ści ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabela 2  
Częstotliwość obserwacji klinicznych i funkcjonalnych  
Rodzaj obserwacji Czas trwania badania 
Ostra 28-dniowe 90-dniowe Chroniczna  
U wszystkich 
zwierząt Ogólny stan 
zdrowotny codziennie codziennie codziennie codziennie 
Zachorowalno ść/ 
śmiertelno ść dwa razy 
dziennie dwa razy 
dziennie dwa razy 
dziennie dwa razy dziennie 
U zwierz ąt wybra­
nych do obserwacji funkcjonalnych Szczegółowe 
obserwacje kliniczne — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— w okresie 8 
godzin od 
dawkowania, w momencie oczekiwa ­
nego 
— maksymal ­
nego skutku w 7 i 14 
dniu po 
dawkowaniu — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— następnie raz 
na tydzie ń — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— raz w pierw ­
szym lub 
drugim tygodniu ekspozycji 
— następnie raz 
na miesiąc — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— raz na koniec 
pierwszego 
miesiąca 
ekspozycji 
— następnie raz 
na trzy 
miesiące 
Obserwacje 
funkcjonalne — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— w okresie 8 
godzin od dawkowania, w momencie 
oczekiwa ­
nego maksy ­
malnego skutku 
— w 7 i 14 
dniu po dawkowaniu skutku — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— w czwartym 
tygodniu terapii, najbliżej 
końca 
okresu ekspozycji jak to 
możliwe — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— raz w pierw ­
szym lub drugim tygodniu 
ekspozycji 
— następnie raz 
na miesiąc — przed 
pierwszą 
ekspozycj ą 
— raz, na koniec 
pierwszego miesiąca 
ekspozycji 
— następnie raz 
na trzy miesiące
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  ABSORPCJA PRZEZ SKÓR Ę: METODA  IN VIVO  
1. METODA  
Opisywana metoda badania jest zgodna z wytyczn ą OECD nr 427 
(2004).  
1.1. WPROWADZENIE  
Ekspozycja na wiele substancji chemicznych nast ępuje głównie przez 
skórę, natomiast wi ększość badań toksykologicznych na zwierz ętach 
laboratoryjnych skupia si ę na doustnej drodze podawania. Badanie  in 
vivo wchłaniania przez skór ę opisane w tej instrukcji dostarcza infor ­
macji niezb ędnych do ekstrapolowania wyników bada ń wchłaniania 
doustnego i wykorzystywania ich do sporz ądzania oceny bezpiecze ń­
stwa po ekspozycji przez skór ę. 
Zanim substancja dostanie si ę do układu krążenia, musi ona przej ść 
przez wiele warstw komórek skóry. W przypadku wi ększości 
substancji o szybko ści wchłaniania decyduje warstwa rogowa, sk ła­
dająca się z martwych komórek. Przepuszczalno ść skóry zale ży 
zarówno od lipofilno ści substancji chemicznej i grubo ści zewnętrznej 
warstwy naskórka, jak równie ż czynników takich, jak masa cz ąstecz­
kowa i st ężenie substancji. Ogólnie rzecz bior ąc, skóra szczurów 
i królików jest bardziej przepuszczalna ni ż skóra ludzka, natomiast 
przepuszczalno ść skóry świnek morskich i ma łp bardziej przypomina 
przepuszczalno ść skóry ludzkiej.  
Metody mierzenia wch łaniania przez skór ę można podzieli ć na dwie 
kategorie:  in vivo  i in vitro.  Metoda  in vivo  może dostarczy ć istot­
nych informacji o wch łanianiu przez skór ę u różnych gatunków 
laboratoryjnych. Metody  in vitro  zostały opracowane pó źniej. 
W metodach tych wykorzystuje si ę transport przez skór ę zwierzęcą 
lub ludzk ą, pełnej lub niepe łnej grubo ści, do zbiornika p łynu. 
Metodę in vitro  przedstawiono osobno w opisie innej metody 
badania (1). W celu doboru najw łaściwszej metody w danej sytuacji 
zaleca się skonsultowa ć wytyczn ą OECD na temat przeprowadzania 
badań wchłaniania przez skór ę (2), bowiem zawiera ona wi ęcej 
szczegółowych informacji na temat stosowalno ści obu metod.  
Opisywana poni żej metoda  in vivo  pozwala na okre ślenie stopnia 
przenikania substancji testowej przez skór ę do systemu. Technika 
ta jest powszechnie stosowana od wielu lat (3)(4)(5)(6)(7). Wpraw ­
dzie badania wch łaniania przez skór ę in vitro  mogą w wielu przy ­
padkach by ć odpowiednie, w niektórych sytuacjach potrzebnych 
danych dostarczy ć mogą jedynie badania  in vivo.  
Zalety metody  in vivo  polegają na tym, że stosując ją, wykorzystuje 
się nienaruszony fizjologicznie i metabolicznie system, u żywa się 
gatunków wspólnych dla wielu bada ń nad toksyczno ścią, zaś metoda 
po modyfikacji mo że być stosowana do bada ń na innych gatunkach. 
Wadami s ą konieczno ść użycia żywych zwierz ąt, potrzeba stoso ­
wania materia łów znakowanych promieniotwórczo w celu uzyskania 
wiarygodnych wyników, trudno ści z okre śleniem wczesnej fazy 
wchłaniania oraz ró żnice w przepuszczalno ści skóry preferowanych 
gatunków (szczur) i cz łowieka. Skóra zwierz ęca jest na ogó ł bardziej 
przepuszczalna i w zwi ązku z tym badania prowadzone z jej wyko ­
rzystaniem mog ą prowadzi ć do przeszacowania wch łaniania przez 
skórę u ludzi (6)(8)(9). Na żywych zwierz ętach nie nale ży testowa ć 
substancji żrących lub korozyjnych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. DEFINICJE  
Dawka niepoch łonięta: jest to dawka sp łukana z powierzchni skóry 
po ekspozycji i wszelkie substancje obecne w miejscach nieprzepusz ­
czalnych, w tym wszelkie substancje, o których wiadomo, że wypa­
rowały ze skóry w czasie ekspozycji.  
Dawka poch łonięta (in vivo) : obejmuje substancj ę obecną w moczu, 
materiale wyp łukanym z klatki, odchodach, wydychanym powietrzu 
(jeśli mierzono), krwi, tkankach (je śli pobierano) oraz innych 
częściach ciała po usuni ęciu skóry w miejscu na łożenia substancji.  
Dawka wch łanialna:  jest mas ą substancji obecnej na lub w skórze 
po zmyciu.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Substancja testowa, najlepiej znakowana izotopem promieniotwór ­
czym, nak ładana jest na wystrzy żoną skórę zwierz ęcia 
w odpowiedniej dawce lub dawkach, w takiej postaci, w jakiej jest 
normalnie u żywana. Aby zapobiec zjedzeniu przez zwierz ę preparatu 
testowego pozostaj ącego w kontakcie ze skór ą przez okre ślony czas, 
zabezpiecza si ę go odpowiednim opatrunkiem (nieokluzyjnym, 
semiokluzyjnym lub okluzyjnym). Pod koniec okresu ekspozycji 
opatrunek jest usuwany, a skóra czyszczona odpowiednim środkiem 
czyszczącym. Opatrunek i materia ły użyte do czyszczenia s ą zacho­
wane do analizy i zak ładany jest świeży opatrunek. Przed, w trakcie 
i po okresie ekspozycji zwierz ęta są umieszczane w oddzielnych 
klatkach metabolicznych. W tych okresach do celów analizy pobie ­
rane są wydaliny i wydychane powietrze. Pobieranie wydychanego 
powietrza nie jest konieczne, je śli istnieje dostatecznie du żo infor­
macji, że lotne metabolity promieniotwórcze powstaj ą w niewielkich 
ilościach lub nie tworz ą się wcale. Zwykle bada si ę kilka grup 
zwierząt, które poddaje si ę działaniu preparatu testowego. Jedna 
grupa jest zabijana po zako ńczeniu okresu ekspozycji. Inne grupy 
są zabijane pó źniej zgodnie z harmonogramem (2). Na koniec okresu 
pobierania próbek zabijane s ą pozostałe zwierzęta, pobierana jest 
krew do analizy, skóra w miejscu na łożenia substancji wycinana 
do analizy, a cia ło poddawane badaniu w poszukiwaniu niewydalo ­
nego materia łu. Próbki s ą badane w odpowiedni sposób i oznaczany 
jest poziom wch łaniania przez skór ę (6)(8)(9).  
1.4. OPIS METODY BADANIA  
1.4.1.  Dobór gatunków zwierz ąt 
Najczęściej wykorzystuje si ę do tego celu szczury, ale mo żna 
również użyć linii bezw łosych i gatunków, których intensywno ść 
wchłaniania przez skór ę jest podobna do tej u cz łowieka (3)(6)(7) ­
(8)(9). Nale ży użyć młodych, doros łych zwierz ąt jednej p łci (stan­
dardowo u żywa się samców) i linii powszechnie wykorzystywanych 
w laboratoriach. Na pocz ątku badań zróżnicowanie masy zwierz ąt 
nie powinno przekracza ć ± 20 % średniej masy. Na przyk ład odpo­
wiednie s ą samce szczurów o masie w zakresie 200–250 g, 
zwłaszcza o masie z górnej po łowy tego zakresu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Liczba oraz p łeć zwierząt 
Do każdego preparatu testowego i ka żdego zaplanowanego czasu 
zabijania nale ży użyć co najmniej czterech zwierz ąt jednej p łci. 
Każda grupa zwierz ąt jest zabijana po ró żnym czasie, na przyk ład 
na koniec okresu ekspozycji (zwykle po 6 lub 24 godzinach) 
i następnie po kolejnych okresach (np. 48 i 72 godzinach). Je śli są 
dostępne dane świadczące o istotnej ró żnicy między samcami 
i samicami w zakresie toksyczno ści skórnej, nale ży wybrać bardziej 
wrażliwą płeć. Jeśli brak takich danych, mo żna użyć zwierząt 
dowolnej p łci. 
1.4.3.  Warunki w pomieszczeniach dla zwierz ąt i pożywienie  
Temperatura w pomieszczeniu ze zwierz ętami doświadczalnymi 
powinna wynosi ć 22  o C (± 3  o C). Mimo że wilgotno ść względna 
powinna poza okresem sprz ątania pomieszczenia wynosi ć co 
najmniej 30 % i raczej poni żej 70 %, nale ży starać się ją utrzymać 
na poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 
12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. Stosowa ć można konwen ­
cjonalny pokarm laboratoryjny, który powinien by ć dostępny 
bez ogranicze ń, podobnie jak woda. W czasie bada ń, a najlepiej 
także w okresie aklimatyzacji, zwierz ęta są trzymane w osobnych 
klatkach metabolicznych. Nale ży zminimalizowa ć możliwość 
rozsypywania pokarmu lub rozlewania wody, poniewa ż może to 
mieć wpływ na wyniki.  
1.4.4.  Przygotowanie zwierz ąt 
Zwierzęta są indywidualnie znakowane w celu umo żliwienia identy ­
fikacji osobników i trzymane w swoich klatkach przez co najmniej 
pięć dni przed rozpocz ęciem bada ń w celu zapewnienia aklimatyzacji 
do warunków laboratoryjnych.  
Po okresie aklimatyzacji i oko ło 24 godziny przed zastosowaniem 
dawki na skórze ka żdego zwierz ęcia w rejonie barków i grzbietu 
zostanie wystrzy żona skóra. Przepuszczalno ść skóry uszkodzonej 
jest inna ni ż skóry nieuszkodzonej, nale ży więc uważać, aby nie 
zranić zwierzęcia. Po wystrzy żeniu skóry i oko ło 24 godziny przed 
nałożeniem substancji testowej na skór ę (zob. cz ęść 1.4.7) 
powierzchni ę skóry nale ży przetrze ć acetonem, aby usun ąć łój. 
Dodatkowe przemywanie myd łem i wod ą nie jest zalecane, poniewa ż 
wszelkie resztki myd ła mogą zwiększać wchłanianie substancji testo ­
wej. Aby umo żliwić przeprowadzenie wiarygodnych oblicze ń wchła­
niania w przeliczeniu na 1 cm  2 powierzchnia skóry, na któr ą nakła­
dana jest substancja musi by ć wystarczaj ąco duża, najlepiej co 
najmniej 10 cm  2 . Taką powierzchni ę można uzyska ć u szczurów 
o masie 200–250 g. Po przygotowaniu zwierz ęta są wkładane z 
powrotem do klatek metabolicznych.  
1.4.5.  Substancja testowa  
Substancja testowa jest substancj ą, której w łaściwości przenikania s ą 
poddawane badaniu. W idealnym przypadku substancja testowa powinna by ć znakowana izotopami promieniotwórczymi.
 
1.4.6.  Przygotowanie do badania  
Preparat substancji testowej (np. czysty, rozcie ńczony lub materia ł 
przygotowany wed ług receptury, zawieraj ący nakładaną na skór ę 
substancję) powinien by ć taki sam (lub by ć realistycznym suroga ­
tem) jak substancja, na której dzia łanie nara żani są ludzie lub inne 
gatunki docelowe. Ka żda różnica mi ędzy preparatem 
a wykorzystywan ą substancj ą musi by ć uzasadniona. W razie 
potrzeby badan ą substancj ę rozpuszcza si ę lub sporz ądza jej zawie ­
sinę w odpowiednim pod łożu. W przypadku pod łoża innego ni ż 
woda powinna by ć znana charakterystyka absorpcji oraz potencjalne 
interakcje z substancj ą testową. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 640
 
1.4.7.  Nak ładanie na skór ę 
Na powierzchni skóry wyznacza si ę miejsce nak ładania o okre ślonej 
powierzchni. Nast ępnie równomiernie nak łada się na to miejsce 
preparat testowy. Jego ilo ść powinna zwykle imitowa ć potencjaln ą 
ekspozycj ę u człowieka, zwykle 1–5 mg/cm  2 w przypadku substancji 
stałej i do 10 μl/cm  2 w przypadku p łynu. Zastosowanie jakiejkolwiek 
innej ilości powinno by ć uzasadnione oczekiwanymi warunkami 
użycia, celami badania lub fizycznymi w łaściwościami preparatu 
testowego. Po na łożeniu preparatu miejsce na łożenia musi by ć chro­
nione przed wylizywaniem przez zwierz ę. Przykład typowego 
urządzenia pokazano na rysunku 1. Zazwyczaj miejsce nak ładania 
powinno by ć chronione nieokluzyjnym opatrunkiem (np. przepusz ­
czalną nylonow ą gazą). W przypadku dawek nieograniczonych 
miejsce nak ładania powinno by ć przykryte opatrunkiem okluzyjnym. 
W przypadku gdy parowanie pó łlotnych substancji testowych 
zmniejsza wska źnik odzysku substancji testowej do niedopuszczal ­
nego poziomu (zob. tak że część 1.4.10 akapit pierwszy), konieczne 
jest zebranie wyparowanej substancji do filtra z w ęgla aktywowa ­
nego, pokrywaj ącego urządzenie do nak ładania (zob. rysunek 1). 
Ważne jest, żeby żadne urządzenie nie uszkadza ło skóry, nie absor ­
bowało substancji testowej, ani nie wchodzi ło z nią w reakcj ę. Zwie­
rzęta wkłada się z powrotem do klatek metabolicznych, w celu 
zebrania wydalin.  
1.4.8.  Czas trwania ekspozycji i pobieranie próbek  
Czas trwania ekspozycji jest czasem mi ędzy nałożeniem 
a usunięciem preparatu przez zmycie go ze skóry. Nale ży zastosowa ć 
odpowiedni czas ekspozycji (zwykle 6 lub 24 godziny), dostoso ­
wując go do czasu trwania ekspozycji u ludzi. Po okresie ekspozycji 
zwierzęta są trzymane w klatkach metabolicznych do czasu plano ­
wego uśmiercenia. Przez ca ły czas trwania badania zwierz ęta 
powinny by ć regularnie obserwowane pod k ątem oznak toksyczno ści 
lub anormalnych reakcji. Po zako ńczeniu okresu ekspozycji nale ży 
zaobserwowa ć, czy na skórze nara żonej na dzia łanie substancji nie 
wystąpią objawy podra żnienia.  
Klatki metaboliczne powinny pozwoli ć na oddzielne pobieranie 
moczu i ka łu przez ca ły czas badania. Powinny tak że umożliwiać 
pobieranie znakowanego w ęglem  14 C dwutlenku w ęgla oraz lotnych 
związków węgla 14 C, które nale ży poddać analizie, je śli pojawiaj ą 
się większe ilości (> 5 %). Dla ka żdej grupy i w trakcie ka żdego 
pobierania próbek nale ży osobno pobra ć mocz, ka ł i płyny, 
w których znalaz ła się badana substancja (np. dwutlenek w ęgla 
14 C i lotne zwi ązki 14 C). Jeśli jest wystarczaj ąco dużo danych 
świadczących, że tworzy si ę niewiele lotnych promieniotwórczych 
metabolitów lub nie tworz ą się one wcale, mo żna stosowa ć klatki 
otwarte.  
Wydaliny s ą zbierane podczas ekspozycji, do 24 godzin po pierw ­
szym kontakcie ze skór ą, następnie codziennie do ko ńca ekspery ­
mentu. Zazwyczaj wystarczaj ą trzy okresy pobierania wydalin, 
jednak zak ładane przeznaczenie preparatu testowego lub istniej ące 
dane kinetyczne mog ą wskazywa ć na potrzeb ę pobrania tego mate ­
riału w innych lub dodatkowych terminach.  
Na zakończenie okresu ekspozycji urz ądzenie zabezpieczaj ące jest 
zdejmowane z ka żdego zwierz ęcia i zatrzymywane do osobnej 
analizy. Skóra w miejscu poddania dzia łaniu substancji testowej 
powinna by ć u wszystkich zwierz ąt co najmniej trzykrotnie przemyta 
środkiem czyszcz ącym przy u życiu odpowiednich tamponów. Nale ży 
uważać, aby nie doprowadzi ć do skażenia innych cz ęści ciała. 
Środek czyszcz ący powinien by ć reprezentatywny dla środków 
stosowanych do zwyk łych czynno ści higienicznych, np. wodny 
roztwór myd ła. Na koniec nale ży wysuszy ć skórę. Wszystkie 
tampony i p łyny pozosta łe po przemywaniu musz ą być zachowane 
do analizy. Zwierz ętom tworz ącym grupy badane przez d łuższy 
okres nale ży przed w łożeniem ich z powrotem do klatek na łożyć 
świeży opatrunek, chroni ący miejsce poddane dzia łaniu substancji 
testowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 641
 
1.4.9.  Procedury ko ńcowe  
W każdej grupie zwierz ęta nale ży uśmiercić zgodnie 
z harmonogramem i pobra ć krew do bada ń. Urządzenie ochronne 
lub opatrunek nale ży zdjąć w celu poddania analizie. Z ka żdego 
zwierzęcia powinien zosta ć pobrany i poddany analizie fragment 
skóry z miejsca na łożenia substancji oraz podobny, ostrzy żony frag­
ment skóry, który nie by ł poddany dzia łaniu substancji. Skóra 
z miejsca poddanego dzia łaniu substancji testowej mo że zostać 
podzielona na frakcje, by oddzieli ć warstwę rogową od głębszej 
warstwy naskórka w celu uzyskania dok ładniejszych informacji na 
temat rozmieszczenia substancji testowej. Okre ślenie takiego odk ła­
dania się substancji w okresie po ekspozycji powinno dostarczy ć 
pewnych danych na temat losu wszystkich substancji testowych w warstwie rogowej. Aby u łatwić dzielenie skóry (po ostatnim 
myciu skóry i u śmierceniu zwierz ęcia), nale ży zdjąć opatrunek 
ochronny. Skóra z miejsca na łożenia substancji testowej, wraz z 
pierścieniem dooko ła, jest wycinana i rozpinana na p łytce. Przy 
zastosowaniu delikatnego nacisku na powierzchni
ę skóry przykleja 
się kawałek taśmy klejącej. Następnie odkleja si ę go wraz z cz ęścią 
warstwy rogowej. Kolejne paski ta śmy są naklejane, dopóki ta śma 
przestanie przywiera ć do powierzchni skóry po usuni ęciu całej 
warstwy rogowej. Wszystkie paski ta śmy pochodz ące od jednego 
zwierzęcia mogą być umieszczone razem w jednym pojemniku, do 
którego dodaje si ę środek trawi ący tkanki w celu rozpuszczenia 
fragmentów warstwy rogowej. Przed poddaniem reszty cia ła analizie 
mającej określić dawkę wchłoniętą przez organizm, mo żna pobrać 
wszelkie potencjalne tkanki docelowe. Cia ła poszczególnych osob ­
ników nale ży zachowa ć do analizy. Zwykle wystarcza analiza ca łko­
witej zawarto ści. Do odr ębnej analizy mo żna pobra ć określone 
organy (je śli tak zalecono w innych badaniach). Do wcze śniej zebra ­
nych próbek moczu nale ży dodać mocz obecny w p ęcherzu 
w momencie u śmiercania zwierz ęcia. Po zebraniu wydalin z klatek 
metabolicznych w zaplanowanym terminie u śmiercania zwierz ęcia 
całe klatki powinny zosta ć umyte odpowiednim rozpuszczalnikiem. 
Podobnie nale ży poddać analizie inne urz ądzenia, które mog ły ulec 
skażeniu.  
1.4.10.  Analiza  
We wszystkich badaniach nale ży osiągnąć odpowiedni ą wartość 
odzysku (tj. średnio 100 ± 10 % radioaktywno ści). Poziom odzysku 
poza tym przedzia łem powinien zosta ć uzasadniony. Wielko ść zasto­
sowanej dawki w ka żdej próbie powinna zosta ć przeanalizowana 
przy użyciu odpowiednio udokumentowanych procedur.  
Dla każdej procedury nak ładania dawki w opracowaniu staty ­
stycznym powinna si ę znaleźć miara wariancji dla powtórze ń. 
2. DANE  
W przypadku ka żdego zwierz ęcia w ka żdym okresie pobierania 
próbek dla testowanej substancji i/lub jej metabolitów nale ży prze­
prowadzić następujące pomiary. Poza danymi indywidualnymi 
należy podać średnie dla danych pogrupowanych wed ług czasów 
pobierania.  
— ilość związana z urz ądzeniami ochronnymi,  
— ilość, która mo że zostać usunięta ze skóry,  
— ilość substancji w/na skórze, której nie mo żna zmyć ze skóry,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— ilość w próbce krwi,  
— ilość w wydalinach i wydychanym powietrzu (je śli znajduje to 
zastosowanie),  
— ilość pozostająca w martwym ciele i wszelkich organach pobra ­
nych do oddzielnej analizy.  
Oznaczenie ilo ści substancji testowej i/lub metabolitów 
w wydalinach, wydychanym powietrzu, krwi i w martwym ciele umożliwi okre ślenie całkowitej ilo ści zaabsorbowanej w ka żdym 
punkcie czasowym. Mo żna równie ż dokona ć obliczenia ilo ści 
substancji chemicznej wch łanianej na 1 cm
 2 skóry poddanej dzia ­ 
łaniu substancji testowej.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć wymagania okre ślone 
w protokole, w tym uzasadnienie u żytego systemu testowego 
i powinien obejmowa ć, co następuje:  
Substancja testowa:  
— dane identyfikacyjne (np. numer CAS, je śli dostępny; źródło; 
czystość (czystość radiochemiczna); znane zanieczyszczenia; 
numer partii),  
— własności fizyczne, w łaściwości fizykochemiczne (np. pH, 
lotność, rozpuszczalno ść, stabilno ść, masa cz ąsteczkowa 
i log P  ow ). 
Preparat testowy:  
— forma i uzasadnienie u życia,  
— szczegó łowe dane o preparacie testowym, ilo ść zastosowanej 
substancji, uzyskane st ężenia, pod łoże, stabilno ść 
i homogeniczno ść. 
Zwierzę testowe:  
— wykorzystany gatunek/szczep,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło zwierząt, warunki przetrzymywania zwierz ąt, pokarm, itd.,  
— masa poszczególnych zwierz ąt na pocz ątku testu.  
Warunki badania:  
— szczegó łowe informacje na temat podawania preparatu testowego 
(miejsce nak ładania, metody pobierania próbek, okluzja/bez 
okluzji, obj ętość, ekstrakcja, wykrywanie),  
— szczegó łowe informacje o pokarmie i jako ści wody.  
Wyniki:  
— wszelkie oznaki toksyczno ści, 
— dane tabelaryczne dotycz ące wchłaniania (wyra żone jako tempo, 
ilość lub procent),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— sumaryczne warto ści odzysku w eksperymencie,  
— interpretacja wyników, porównanie z wszelkimi dost ępnymi 
danymi na temat wch łaniania przez skór ę związku testowego.  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. LITERATURA  
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption:  In vitro  Method.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for 
Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No. 20.  
(4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol.  8(5), 829–835.  
(5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
(6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and 
Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
 
(7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic 
Substances.  
(8) Bronaugh R.L., Wester RC, Bucks D., Maibach H.I. and 
Sarason R (1990)  In vivo  percutaneous absorption of fragrance 
ingredients in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. Toxic.  
28, 369–373.  
(9) Feldman R.J. and Maibach H.I. (1970) Absorption of some 
organic compounds through the skin in man.  J. Invest Dermatol.  
54, 399–404.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Rysunek 1  
Przykład konstrukcji typowego urz ądzenia stosowanego do wyznaczania 
i zabezpieczenia miejsca stosowania substancji na skórze w trakcie bada ń in 
vivo wchłaniania przez skór ę
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  ABSORPCJA PRZEZ SKÓR Ę: METODA  IN VITRO  
1. METODA  
Opisywana metoda badania jest zgodna z wytyczn ą OECD nr 428 
(2004).  
1.1. WPROWADZENIE  
Metoda ta zosta ła opracowana, aby dostarczy ć informacji na temat 
wchłaniania substancji testowej nak ładanej na wycinek skóry. Mo że 
być stosowana w po łączeniu z metod ą badania wch łaniania przez 
skórę in vivo  (1) lub oddzielnie. Zaleca si ę, aby przy opracowywaniu 
badań opartych na tej metodzie korzysta ć z wytycznej OECD 
dotyczącej badań wchłaniania przez skór ę (2). Wytyczna zosta ła 
opracowana, aby u łatwić wybór odpowiednich procedur  in vitro , 
nadających się do stosowania w okre ślonych okoliczno ściach, 
w celu zapewnienia wiarygodno ści wyników uzyskanych t ą metodą. 
Metody pomiaru wch łaniania przez skór ę oraz ilo ści substancji 
dostającej się do organizmu przez skór ę można podzieli ć na dwie 
kategorie:  in vivo  i in vitro.  Metody  in vivo  badania wch łaniania 
przez skór ę są dobrze opracowane i dostarczaj ą informacji 
o farmakokinetyce u wielu ró żnych gatunków. Informacje 
o metodzie  in vivo  przedstawiono osobno w opisie innej metody 
badania (1). Tak że metody  in vitro  są stosowane do pomiaru wch ła­
niania przez skór ę od wielu lat. Wprawdzie nie przeprowadzono 
formalnych bada ń walidacyjnych metod  in vitro  składających się 
na niniejsz ą metodę badania, jednak że specjali ści OECD zgodzili 
się w 1999 r., że istnieje wystarczaj ąco dużo udokumentowanych 
danych na poparcie metody  in vitro  (3). Więcej szczegó łowych infor ­
macji uzasadniaj ących to poparcie, w tym znaczn ą liczbę bezpośred­
nich porówna ń metod  in vitro  i in vivo,  zamieszczono w wytycznej 
(2). Istniej ą monografie, w których omówiono ten temat 
i przedstawiono szczegó łowy zakres stosowania metody  in vitro  (4)­
(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Metody  in vitro  umożliwiają pomiar 
rozprzestrzeniania si ę substancji chemicznych w g łąb skóry i na jej 
powierzchni, a nast ępnie do zbiornika p łynu. W badaniu u żywa się 
zarówno martwej skóry, s łużącej wyłącznie do pomiaru dyfuzji, jak 
i skóry świeżej, aktywnej metabolicznie, pozwalaj ącej na równo ­
czesne badanie dyfuzji i metabolizmu skóry. Takie metody znalaz ły 
zastosowanie przy porównywaniu przenikania zwi ązków chemicz ­
nych zawartych w ró żnych substancjach chemicznych w g łąb 
skóry i przez skór ę, mogą też umożliwić uzyskanie u żytecznych 
modeli oceny wch łaniania przezskórnego u ludzi.  
Stosowanie metody  in vitro  może być niemożliwe we wszystkich 
warunkach i w przypadku wszystkich kategorii zwi ązków chemicz ­
nych. Mo żna korzysta ć z metody badania  in vitro  do wstępnej oceny 
jakościowej przenikania przez skór ę. W niektórych przypadkach 
konieczne mo że być na dalszym etapie przeprowadzenie bada ń in 
vivo.  W celu dok ładniejszego poznania sytuacji, w których metoda  in 
vitro  byłaby odpowiednia, nale ży sięgnąć do wytycznej (2). Dodat ­
kowe szczegó łowe informacje przydatne przy podejmowaniu decyzji 
zamieszczono w (3).  
W opisie metody zawarto ogólne zasady pomiaru wch łaniania przez 
skórę i dopływu substancji testowej przy u życiu wycinka skóry. 
Możliwe jest u życie skóry wielu gatunków ssaków, w tym cz ło­
wieka. W łaściwości skóry zwi ązane z przepuszczalno ścią są zacho­
wywane po wyci ęciu jej fragmentu z organizmu, poniewa ż główną 
barierę przenikania stanowi martwa warstwa rogowa. Aktywny trans ­
port substancji chemicznych przez skór ę nie zosta ł stwierdzony. 
Wykazano, że skóra ma zdolno ść metabolizowania niektórych 
związków chemicznych podczas wch łaniania przezskórnego (6), 
jednak proces ten nie zmniejsza ilo ści rzeczywi ście wchłanianej 
dawki, cho ć może mieć wpływ na natur ę substancji dostaj ącej się 
do krwi.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINICJE  
Dawka niepoch łonięta: jest to dawka sp łukana z powierzchni skóry 
po ekspozycji i wszelkie substancje obecne w miejscach nieprzykry ­
tych, w tym wszelkie substancje, o których wiadomo, że wyparowa ły 
ze skóry w czasie ekspozycji.  
Dawka poch łonięta (in vitro) : masa substancji testowej docieraj ącej 
do płynu receptorowego lub uk ładu krążenia w okre ślonym czasie.  
Dawka wch łanialna  (in vitro) : jest mas ą substancji obecnej na lub 
w skórze po zmyciu.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Substancja testowa, która mo że być znakowana izotopem promienio ­
twórczym jest nak ładana na powierzchni ę próbki skóry oddzielaj ącej 
dwie części komory dyfuzyjnej. Substancja pozostaje na skórze 
w określonych warunkach, przez okre ślony czas, zanim zostanie 
usunięta w trakcie odpowiedniej procedury mycia. Próbki p łynu 
receptorowego s ą pobierane w odst ępach czasowych w trakcie 
całego badania i analizowane pod k ątem obecno ści substancji 
testowej i/lub metabolitów.  
W przypadku stosowania systemów aktywnych metabolicznie mo żna 
odpowiednimi metodami analizowa ć metabolity substancji testowej. 
Na koniec eksperymentu, w razie potrzeby, rozmieszczenie substancji testowej i jej metabolitów jest wyra żane ilościowo.
 
W odpowiednich warunkach przedstawionych w opisie tej metody 
oraz w wytycznej (2), absorpcja substancji testowej w okre ślonym 
czasie jest mierzona za pomoc ą analizy p łynu receptorowego 
i badanej skóry. Substancja testowa pozostaj ąca w skórze jest uzna ­
wana za zaabsorbowan ą, chyba że uda się wykazać, iż poziom absor ­
pcji można ustalić wyłącznie na podstawie warto ści płynu recepto ­
rowego. Analiza innych komponentów (materia ł spłukany ze skóry 
i pozostaj ący w obr ębie warstw skóry) umo żliwia dalsz ą ocenę 
danych, w tym ca łkowitego rozmieszczenia substancji testowej 
i odzysku wyra żonego w procentach.  
Aby wykaza ć sprawno ść i wiarygodno ść systemu testów 
w przeprowadzaj ącym je laboratorium, nale ży dysponowa ć wyni­
kami odnosz ącymi się do odpowiednich substancji wzorcowych, 
a wyniki te powinny by ć zgodne z publikacjami na temat wykorzy ­
stywanej metody. Wymóg ten mo żna spełnić przeprowadzaj ąc test 
przy użyciu odpowiedniej substancji wzorcowej (najlepiej 
o lipofilno ści zbliżonej do lipofilno ści substancji testowej) równo ­
cześnie przy u życiu substancji testowej albo dostarczaj ąc odpowied ­
nich danych historycznych dla ró żnych substancji wzorcowych 
o zróżnicowanej lipofilno ści (np. kofeina, kwas benzoesowy 
i testosteron).  
1.4. OPIS METODY BADANIA  
1.4.1.  Komora dyfuzyjna  
Komora dyfuzyjna sk łada się z dwóch cz ęści, donorowej 
i receptorowej, pomi ędzy którymi umieszczona jest skóra (przyk ład 
typowego uk ładu przedstawiono na rysunku 1). Komora powinna 
zapewnić szczelno ść wokół skóry, pozwala ć na łatwe pobieranie 
próbek i dobre mieszanie roztworu receptorowego pozostaj ącego 
w kontakcie ze spodni ą częścią skóry oraz sprawn ą regulację tempe­
ratury komory i jej zawarto ści. Dopuszczalny jest zarówno uk ład 
statyczny, jak i przep ływ przez komory dyfuzyjne. W czasie 
ekspozycji ograniczonej dawki substancji testowej cz ęści donorowe 
są zwykle otwarte. Jednak w przypadku stosowania nieograniczo ­
nych dawek lub przy pewnych scenariuszach stosowania dawek 
ograniczonych, cz ęści donorowe mog ą pozostawa ć zamknięte. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Płyn receptorowy  
Preferowane jest stosowanie p łynu receptorowego o fizjologicznej 
przewodno ści, można jednak stosowa ć również inne płyny, jeśli 
ich użycie jest uzasadnione. Nale ży dostarczy ć precyzyjnych danych 
o składzie płynu receptorowego. Nale ży zapewni ć odpowiedni ą 
rozpuszczalno ść substancji testowej w p łynie receptorowym, tak 
aby nie stanowi ł bariery absorpcji. Ponadto p łyn receptorowy nie 
powinien wp ływać na kompletno ść preparatu skóry. W systemach 
przepływowych szybko ść przepływu nie powinna hamowa ć dyfuzji 
substancji testowej do p łynu receptorowego. W systemie komory 
statycznej p łyn powinien by ć nieustannie mieszany, a próbki 
powinny by ć pobierane regularnie. Je śli przedmiotem bada ń jest 
metabolizm, p łyn receptorowy musi zapewni ć żywotność skóry 
przez cały czas trwania eksperymentu.  
1.4.3.  Preparaty skóry  
Można użyć skóry ludzkiej lub zwierz ęcej. Uznaje si ę, że zastoso ­
wanie ludzkiej skóry podlega mi ędzynarodowym zastrze żeniom 
i warunkom etycznym. Wprawdzie preferowana jest żywa skóra, 
można jednak u żyć również skóry martwej, pod warunkiem że 
można wykaza ć kompletno ść wycinka. Jako b łony do dyfuzji 
można użyć preparatu naskórka (wyizolowanego metodami enzyma ­
tycznymi, cieplnymi lub chemicznymi) lub p łata skóry niepe łnej 
grubości (zwykle o grubo ści 200–400 μm) przygotowanego za 
pomocą dermatomu. P łat skóry pe łnej grubo ści może być użyty, 
jednakże należy unikać zbyt du żej grubości (ca > 1 mm), chyba 
że ma on s łużyć do oznaczenia ilo ści substancji chemicznej 
w warstwach skóry. Wybór gatunku, miejsca anatomicznego 
i techniki preparacji musi by ć uzasadniony. Wymagane s ą odpo­
wiednie dane z co najmniej czterech powtórze ń na każdy preparat 
testowy.  
1.4.4.  Kompletno ść preparatu skóry  
Właściwe przygotowanie preparatu skóry ma zasadnicze znaczenie. 
Nieodpowiednie post ępowanie mo że spowodowa ć uszkodzenie 
warstwy rogowej, dlatego nale ży sprawdza ć kompletno ść przygoto ­
wanej próbki skóry. W przypadku badania metabolizmu skóry nale ży 
używać świeżo pobranych wycinków skóry przy zachowaniu warun ­
ków, o których wiadomo, że sprzyjaj ą zachowaniu aktywno ści meta­
bolicznej. Generalnie zaleca si ę użyć wycinka skóry w ci ągu 24 
godzin od jego pobrania, jednak dopuszczalny okres przechowy ­
wania mo że być różny, w zale żności od systemu enzymatycznego 
uczestnicz ącego w metabolizmie oraz od temperatury przechowy ­
wania (13). Je śli preparaty skórne by ły przed u życiem przechowy ­
wane, nale ży przedstawi ć dane dowodz ące, że funkcja bariery zosta ła 
zachowana.  
1.4.5.  Substancja testowa  
Substancja testowa jest substancj ą, której w łaściwości przenikania s ą 
poddawane badaniu. W idealnym przypadku substancja testowa powinna by ć znakowana izotopami promieniotwórczymi.
 
1.4.6.  Preparat testowy  
Preparat substancji testowej (np. czysty, rozcie ńczony lub materia ł 
przygotowany wed ług receptury, zawieraj ący substancj ę nakładaną 
na skórę) powinien by ć taki sam (lub by ć realistycznym surogatem) 
jak substancja, na dzia łanie której mog ą być narażeni ludzie lub inne 
gatunki docelowe. Ka żda różnica mi ędzy preparatem 
a wykorzystywan ą substancj ą musi by ć uzasadniona.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Stężenia i formy substancji testowych  
Zwykle stosuje si ę więcej niż jedno st ężenie substancji testowej, 
sięgające górnej granicy potencjalnych dawek, na które nara żany 
jest człowiek. Nale ży także rozważyć poddanie testom ró żnych typo ­
wych form substancji.  
1.4.8  Nak ładanie na skór ę 
W normalnych warunkach cz łowiek jest nara żany na dzia łanie ograni ­
czonych dawek substancji chemicznej. Z tego powodu nale ży nakładać 
testowaną substancj ę w sposób imituj ący ekspozycj ę, na jaką narażany 
jest człowiek. Zwykle nale ży stosowa ć 1–5 mg/cm  2 w przypadku 
substancji sta łej i do 10 μl/cm  2 w przypadku p łynów. Zastosowanie 
określonej ilości powinno by ć uzasadnione oczekiwanymi warunkami 
użycia, celami badania lub fizycznymi w łaściwościami preparatu testo ­
wego. Na przyk ład dawki nak ładane na skór ę mogą być nieograniczone 
tam gdzie nak ładane są duże objętości na jednostk ę powierzchni skóry.  
1.4.9.  Temperatura  
Temperatura wp ływa na dyfuzj ę bierną substancji chemicznych (i 
wobec tego na wch łanianie przez skór ę). Komora dyfuzyjna i skóra 
powinny mie ć stałą temperatur ę, zbliżoną do normalnej temperatury 
skóry: 32 ± 1  o C. Różne konstrukcje komory dyfuzyjnej wymagaj ą 
zastosowania ró żnej temperatury łaźni wodnych lub bloków grzew ­
czych, aby mie ć pewność, że receptor/skóra odpowiadaj ą normie fizjo ­
logicznej. Wilgotno ść powinna mie ścić się w przedziale 30–70 %.  
1.4.10.  Czas trwania ekspozycji i pobieranie próbek  
Ekspozycja skóry na preparat testowy mo że trwać przez ca ły czas 
trwania eksperymentu lub przez krótszy czas (np. w celu imitacji określonego rodzaju ekspozycji, na któr ą narażany jest cz łowiek). 
Nadmiar preparatu testowego nale ży zmyć ze skóry za pomoc ą 
odpowiedniego środka czyszcz ącego, a sp łukany materia ł zebrać 
w celu poddania go analizie. Procedura usuwania preparatu testo ­
wego zale ży od przewidywanych warunków stosowania i nale ży ją 
uzasadnić. W celu uzyskania odpowiedniej charakterystyki profilu 
absorpcji zwykle wymagany jest 24-godzinny okres pobierania 
próbek. Poniewa ż po okresie d łuższym niż 24 godziny stan skóry 
może zacząć się pogarsza ć, czas pobierania próbek nie powinien 
zazwyczaj przekracza ć 24 godzin. W przypadku substancji testowych 
szybko wnikaj ących w skór ę może to nie by ć konieczne, jednak 
w przypadku substancji testowych, które wnikaj ą powoli, mog ą 
być konieczne d łuższe okresy pobierania próbek. Cz ęstotliwość 
pobierania próbek p łynu receptorowego powinna umo żliwić 
graficzne przedstawienie profilu absorpcyjnego substancji testowej.  
1.4.11.  Procedury ko ńcowe  
Wszystkie elementy systemu testowego powinny by ć poddane analizie. 
Należy również oznaczyć wielkość odzysku. Obejmuje to cz ęść dono­
rową komory dyfuzyjnej, sp łukiwanie powierzchni skóry, preparat 
skórny oraz p łyn receptorowy/komor ę receptorow ą. W niektórych przy ­
padkach skóra mo że być frakcjonowana na powierzchni ę eksponowan ą 
i powierzchni ę pod kryz ą komory oraz na frakcje warstwy rogowej, 
naskórka i skóry w łaściwej, poddawane odr ębnym analizom.  
1.4.12.  Analiza  
We wszystkich badaniach nale ży osiągnąć odpowiedni poziom 
odzysku (celem powinna by ć średnia 100 ± 10 % promieniotwór ­
czości, wszelkie odchylenia nale ży uzasadni ć). Analizie przy u życiu 
odpowiedniej techniki powinna zosta ć poddana substancja testowa 
obecna w p łynie receptorowym, materiale zmytym z powierzchni 
skóry i wyp łukanym z aparatury.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. DANE  
Należy opisać wyniki analizy p łynu receptorowego, rozmieszczenie 
testowanej substancji chemicznej w systemie testowym oraz zmiany profilu absorpcji w czasie. Je śli ekspozycja polega na stosowaniu 
dawki ograniczonej, nale ży obliczy ć ilość substancji sp łukiwanej ze 
skóry, ilo ść związaną ze skórą (i w różnych warstwach skóry, je śli 
jest to przedmiotem analizy) oraz ilo ść substancji obecnej w p łynie 
receptorowym (wspó łczynnik oraz ilo ść lub procent stosowanej 
dawki). Czasami mo żliwe jest okre ślenie absorpcji przez skór ę 
przy wykorzystaniu wy łącznie danych o p łynie receptorowym. Je śli 
jednak w momencie zako ńczenia bada ń w skórze pozostaje 
substancja testowa, mo że być konieczne uwzgl ędnienie jej przy obli ­
czaniu ca łkowitej zaabsorbowanej ilo ści (zob. poz. bibliograficzna 
(3) pkt 66). W przypadku zastosowania do ekspozycji dawki nieograniczonej, dane mog ą pozwolić na obliczenie sta łej przenikal ­
ności (Kp). W ostatnim przypadku procent zaabsorbowanej 
substancji nie ma znaczenia.
 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć wymagania okre ślone 
w protokole, w tym uzasadnienie u życia systemu testowego, 
i powinno obejmowa ć, co następuje:  
Substancja testowa:  
— właściwości fizyczne i fizykochemiczne (przynajmniej masa 
cząsteczkowa i log P  ow ), czystość (czystość radiochemiczna),  
— informacje identyfikacyjne (np. nr partii),  
— rozpuszczalno ść w płynie receptorowym.  
Preparat testowy:  
— forma i uzasadnienie u życia,  
— homogeniczno ść. 
Warunki badania:  
— źródło i miejsce pobrania skóry, metod ę preparacji, warunki prze ­
chowywania przed u życiem, wszelkie wst ępne zabiegi (oczysz ­
czanie, traktowanie antybiotykami itd.), pomiary kompletno ści 
skóry, status metaboliczny, uzasadnienie u życia,  
— konstrukcj ę komory, sk ład płynu receptorowego, szybko ść prze­
pływu płynu receptorowego oraz czas i procedury pobierania 
próbek,  
— szczegó ły dotycz ące nak ładania preparatu testowego 
i kwantyfikacja stosowanej dawki,  
— czas trwania ekspozycji,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące usuwania preparatu testowego 
ze skóry, np. sp łukiwanie skóry,  
— szczegó łowe dane o skórze i wszelkich technikach frakcjono ­
wania użytych do podzia łu skóry,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— procedury mycia komory i sprz ętu, 
— metody pobierania próbek, techniki ekstrakcji, granice wykry ­
wania i walidacja metod analitycznych.  
Wyniki:  
— ogólna ilo ść substancji odzyskiwanej w toku eksperymentu 
(dawka zastosowana materia ł zmyty ze skóry + skóra + p łyn 
receptorowy + p łyn z płukania komory),  
— tabelaryczne zestawienie odzysków w poszczególnych cz ęściach 
komory,  
— profil absorpcji,  
— dane tabelaryczne dotycz ące wchłaniania (wyra żone jako tempo, 
ilość lub procent).  
Omówienie wyników.  
Wnioski.  
4. LITERATURA  
(1) Testing Method B.44. Skin Absorption:  In vivo  Method.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
 
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G. (1990). Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
(5) Bronaugh R.L. and Collier, S.W. (1991). Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications,  R.L. 
Bronaugh and H.I. Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237–241.
 
(6) Bronaugh R.L. and Maibach H.I. (1991).  In vitro Percutaneous 
Absorption: Principles, Fundamentals and Applications.  CRC 
Press, Boca Raton.  
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, 
ECETOC, Brussels.  
(8) Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F., Courtellemont P., 
Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W (1999). 
Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal Absorption 
and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191–205.
 
(9) Recommended Protocol for In  vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.  
(10) Howes D., Guy R., Hadgraft J., Heylings J.R.  et al.  (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
(11) Schaefer H. and Redelmeier T.E. (1996). Skin barrier: princi ­
ples of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
(12) Roberts M.S. and Walters K.A. (1998). Dermal absorption and 
toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
(13) Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. And Williams, F.M. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356–365.  
Rysunek 1  
Przykład typowej konstrukcji statycznej komory dyfuzyjnej do bada ń in vitro  
wchłaniania przezskórnego
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  DZIAŁANIE DRA ŻNIĄCE NA SKÓR Ę IN VITRO : BADANIE NA 
MODELU ZREKONSTRUOWANEGO LUDZKIEGO NASKÓRKA  
WSTĘP 
1. Dzia łanie drażniące na skór ę oznacza powodowanie odwracalnego uszko ­
dzenia skóry w wyniku na łożenia na skór ę substancji badanej na okres do 
4 godzin [zgodnie z definicj ą Globalnie Zharmonizowanego Systemu 
Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) Organizacji Narodów Zjednoczonych (ONZ) i z rozporz ądzeniem Parlamentu Europejskiego 
i Rady (WE) nr 1272/2008 z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfi ­
kacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin (1) (3)]. Niniejsza metoda badania (TM) obejmuje procedur ę in vitro , która mo że być wyko­
rzystywana do identyfikacji zagro żeń w przypadku chemikaliów (sub ­
stancje dra żniące i mieszaniny) zgodnie z GHS ONZ i UE CLP kategorii 
2 (1) (2) (3). W UE i w innych regionach, które nie przyj ęły fakultatywnej 
kategorii 3 GHS ONZ (lekko dra żniące), ta TM mo że być wykorzysty ­
wana równie ż w celu zidentyfikowania chemikaliów niezakwalifikowa ­
nych do żadnej kategorii, tj. w GHS ONZ i UE CLP okre ślonych mianem 
„brak kategorii” (1) (3). Niniejsza TM mo że być wykorzystywana do 
ustalenia dra żliwości substancji dla skóry na podstawie samodzielnego 
badania zast ępczego dla badania dzia łania drażniącego na skór ę metodą 
in vivo  w wielopoziomowej strategii bada ń (4 i rozdzia ł B.4 niniejszego 
załącznika).
 
2. Ocena dzia łania drażniącego na skór ę obejmowa ła na ogół wykorzystanie 
zwierząt laboratoryjnych (zob. wytyczna OECD nr 404 dotycz ąca badań; 
rozdział B.4 w niniejszym za łączniku] (4). Z uwagi na konieczno ść zapew­
nienia dobrostanu zwierz ąt zmodyfikowano w 2004 r. metod ę B.4, umo ż­
liwiając ustalenie dzia łania żrącego/drażniącego na skór ę dzięki zastoso ­
waniu strategii bada ń wielopoziomowych, przy u życiu zwalidowanych 
metod badania  in vitro  i ex vivo , co z kolei pozwoli ło na unikni ęcie 
zadawania bólu zwierz ętom i powodowania ich cierpienia. Trzy zwalido ­
wane metody badania  in vitro  zostały przyjęte w wytycznych OECD 
nr 430, 431 i 435 dotycz ących bada ń (5) (6) (7) i dwóch z nich jako 
rozdziały B.40 i B.40bis niniejszego za łącznika, które maj ą być stosowane 
do części dotycz ącej badań działania żrącego w ramach strategii bada ń 
wielopoziomowych B.4 lub wytycznej OECD nr 404 dotycz ącej badań (4). 
3. Niniejsza TM odnosi si ę do działania drażniącego na skór ę ludzką. Opiera 
się ona na wykorzystaniu modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka 
(RhE), które pod wzgl ędem ogólnej struktury (zastosowanie niezmienio ­
nych keratynocytów naskórka pochodzenia ludzkiego jako źródła komó­
rek, reprezentatywnej tkanki i cytoarchitektury) imituj ą ściśle bioche ­
miczne i fizjologiczne w łaściwości górnych warstw ludzkiej skóry, tj. 
naskórka. Niniejsza TM obejmuje równie ż zestaw norm 
efektywno ści (PS) (dodatek 2) do oceny podobnych i zmodyfikowanych 
metod badania z wykorzystaniem RhE opracowanych przez EC-ECVAM (8), zgodnie z zasadami wytycznych OECD nr 34 (9).
 
4. Istniej ą trzy zwalidowane metody, które s ą zgodne z niniejsz ą TM. Prze ­
prowadzono badania wst ępne, optymalizacyjne i walidacyjne metody  in 
vitro  (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20), 
z wykorzystaniem modelu RhE, dost ępnego w handlu pod nazw ą 
EpiSkin  TM (oznaczonego jako zwalidowana metoda referencyjna – 
VRM). Dwie inne dost ępne w handlu metody badania  in vitro  działania 
drażniącego na skór ę z wykorzystaniem RhE wykaza ły podobne wyniki do 
VRM zgodnie z walidacj ą opartą na normach efektywno ści (21), a s ą to 
metody EpiDerm  TM SIT (EPI-200) i SkinEthic  TM RHE (22).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Zanim b ędzie możliwe wykorzystanie proponowanej podobnej lub zmody ­
fikowanej metody badania  in vitro  z wykorzystaniem RhE innej ni ż VRM, 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) lub SkinEthic  TM RHE do celów regulacyjnych, 
należy ustalić jej wiarygodno ść, istotność (dokładność) i ograniczenia 
w zakresie dotycz ącym jej proponowanego stosowania, aby zapewni ć jej 
porównywalno ść ze zwalidowan ą metodą referencyjn ą, zgodnie z normami 
efektywno ści określonymi w niniejszej metodzie badania (dodatek 2). 
Ponadto zaleca si ę odniesienie si ę do dokumentu OECD zawieraj ącego 
wyjaśnienia dotycz ące badania  in vitro  działania drażniącego na skór ę 
zanim podobna lub zmodyfikowana metoda badania  in vitro  
z wykorzystaniem RhE zostanie opracowana, zwalidowana i przed łożona 
do przyjęcia (23).  
DEFINICJE  
6. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 1.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
7. Ograniczeniem TM, jak wykazano w badaniu walidacyjnym (16), jest fakt, 
że nie umo żliwia ona klasyfikacji substancji chemicznych do opcjonalnej 
kategorii 3 GHS ONZ (lekko dra żniące) (1). Przy zastosowaniu jej do 
częściowego zast ąpienia badania mog ą się okazać konieczne kolejne 
badanie  in vivo  do uzyskania pe łnego opisu potencjalnego dzia łania draż­
niącego na skór ę (4 i rozdzia ł B.4 niniejszego za łącznika). Uznaje si ę, że 
zastosowanie ludzkiej skóry podlega mi ędzynarodowym i krajowym 
zastrzeżeniom i warunkom etycznym.  
8. Niniejsza TM odnosi si ę do elementu badania  in vitro  działania drażnią­
cego na skór ę w wielopoziomowej strategii bada ń B.4 (wytyczna OECD 
nr 404 dotycz ąca badań) w odniesieniu do dzia łania żrącego/podra żniają­
cego dla skóry (4). Pomimo że niniejsza TM nie zapewnia wystarczaj ­ 
ących informacji na temat dzia łania żrącego na skór ę, należy zauważyć, że 
metoda B.40bis (wytyczna OECD nr 431 dotycz ąca badań) dotycząca 
działania żrącego na skór ę opiera si ę również na tym samym systemie 
badań z RhE, cho ć z wykorzystaniem innego protoko łu (rozdzia ł B.40 
bis). Niniejsza metoda opiera si ę na modelach RhE wykorzystuj ących 
ludzkie keratynocyty, które w zwi ązku z tym w badaniach  in vitro  pełnią 
rolę docelowego narz ądu u docelowego gatunku. Ponadto bezpo średnio 
obejmuje ona pierwszy etap kaskady zapalnej/mechanizmu dzia łania 
(uszkodzenia komórki i tkanki daj ące w wyniku miejscowy uraz), które 
występuje podczas podra żnienia skóry  in vivo . W ramach walidacji le żącej 
u podstaw niniejszej TM zbadano szerok ą gamę chemikaliów – 
a empiryczna baza danych bada ń walidacyjnych wynios ła ogółem 58 
chemikaliów (16) (18) (23). Ma to zastosowanie do substancji sta łych, 
płynnych, pó łstałych i wosków. P łyny mog ą być wodne lub niewodne; 
substancje sta łe mogą być rozpuszczalne w wodzie lub nie. W miar ę 
możliwości substancje sta łe powinny zosta ć wcześniej zmielone do postaci 
drobnoziarnistego proszku przed ich zastosowaniem; żadna inna obróbka 
wstępna próbki nie jest wymagana. Gazów i aerozoli nie oceniano jeszcze 
w badaniach walidacyjnych (24). Jest mo żliwe, że mogą one być badane 
z wykorzystaniem technologii RhE, obecna TM nie pozwala na badanie gazów i aerozoli. Nale ży równie ż zauważyć, że mocno zabarwione 
substancje chemiczne mog ą zakłócać pomiary żywotnoś
ci komórek 
i wymaga ć stosowania przystosowanych kontroli w celu korekty (zob. 
pkt 24–26).  
9. Pojedyncza seria oznacze ń, w skład której wchodz ą trzy replikaty tkanki, 
powinna wystarczy ć dla zbadania substancji chemicznej, je śli klasyfikacja 
jest jednoznaczna. Jednak że w przypadku w ątpliwych wyników, jak np. 
niezgodno ść powtarzalnych pomiarów i/lub średnia procentowa żywot­
ności równa 50 ± 5 %, nale ży rozważyć przeprowadzenie drugiej serii 
oznaczeń, jak równie ż trzeciej w przypadku niezgodno ści między wyni ­
kami dwóch pierwszych serii.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
ZASADA BADANIA  
10. Badana substancja chemiczna jest nanoszona miejscowo na trójwymiarowy 
model RhE sk ładający się z niezmienionych keratynocytów naskórka 
pochodzących od cz łowieka, które poddano hodowli w celu uzyskania 
wielowarstwowego, wysoce zró żnicowanego modelu ludzkiego naskórka. 
Model ten sk łada się ze zorganizowanych warstw: podstawnej, kolczystej 
i ziarnistej oraz z wielopoziomowej warstwy rogowej zawieraj ącej między­
komórkowe, blaszkowate warstwy lipidów przedstawiaj ących główne lipi ­
dowe struktury, analogiczne do stwierdzanych  in vivo . 
11. Sprowokowane chemicznie dzia łanie drażniące na skór ę, objawiaj ące się 
poprzez rumie ń i obrzęk, jest wynikiem kaskady wydarze ń zaczynaj ącej 
się od penetracji warstwy rogowej i uszkodzenia le żących głębiej warstw 
keratynocytów. Umieraj ące keratynocyty uwalniaj ą mediatory, rozpoczy ­
nające kaskad ę zapalną, która oddzia ływuje na komórki w skórze, 
w szczególno ści na komórki zr ębu i śródbłonka. To na skutek rozszerzenia 
i wzrostu przepuszczalno ści komórek śródbłonka mo żna zaobserwowa ć 
rumień i obrzęk (24). Metoda oparta na RhE dokonuje pomiaru pocz ątko­
wych zdarze ń w kaskadzie.  
12. Żywotność komórek w modelach RhE jest mierzona metod ą enzyma­
tycznej konwersji przy życiowego barwnika MTT [bromek 3-(4,5-dimety ­
lotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, b łękit tiazolilowy; numer CAS 
298-93-1, w niebiesk ą sól formazanu, któr ą oznacza si ę ilościowo po 
ekstrakcji z tkanek (25). Substancje dra żniące identyfikuje si ę na 
podstawie ich zdolno ści do zmniejszenia żywotności komórek poni żej 
określonych warto ści progowych (tj. ≤ 50 % dla substancji dra żniących 
kategorii 2 GHS ONZ/UE CLP). W zale żności od ram regulacyjnych, 
w których wyniki tej TM s ą wykorzystane, chemikalia, które prowadz ą 
do zachowania żywotności komórek powy żej określonego poziomu progo ­
wego, mo żna uznać za niedra żniące (tj. > 50 % – brak kategorii).  
WYKAZANIE EFEKTYWNO ŚCI 
13. Przed rozpocz ęciem rutynowego stosowania którejkolwiek z trzech 
zatwierdzonych metod, które s ą zgodne z niniejsz ą TM, laboratoria 
powinny wykaza ć jej efektywno ść techniczn ą z wykorzystaniem dziesi ęciu 
chemicznych substancji odniesienia wymienionych w tabeli 1. 
W odniesieniu do podobnych metod, opracowanych w ramach niniejszej 
TM, lub do zmodyfikowanych wersji którejkolwiek z trzech zatwierdzo ­
nych metod powinny by ć spełnione wymogi normy efektywno ści opisane 
w dodatku 2 dotycz ącym niniejszej TM, zanim dana metoda zostanie 
wykorzystana do bada ń regulacyjnych.  
14. W ramach wykazywania efektywno ści zaleca si ę, aby użytkownik spraw ­
dził właściwości bariery cechuj ące tkanki po ich otrzymaniu, zgodnie ze 
wskazaniami producenta modelu RhE. Jest to szczególnie wa żne, jeżeli 
tkanki są wysłane na du że odległości lub w d ługich okresach czasu. 
Gdy metoda zosta ła z powodzeniem wprowadzona oraz wykazano jej 
efektywno ść, weryfikacja taka nie b ędzie konieczna w ramach rutynowej 
procedury. Jednak w przypadku rutynowego zastosowania metody zaleca się, aby w dalszym ci ągu ocenia ć właściwości bariery w regularnych 
odstępach czasu.
 
Tabela 1  
Chemiczne substancje odniesienia  ( 1 ) 
Chemikalia Nr CAS Ocena  in vivo  ( 2 ) Stan fizyczny Kategoria 
w klasyfikacji GHS 
ONZ/UE CLP  
Kwas naftylooctowy 86-87-3 0 Cia ło stałe Brak kat. 
Izopropanol 67-63-0 0,3 Ciecz Brak kat.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Chemikalia Nr CAS Ocena  in vivo  ( 2 ) Stan fizyczny Kategoria 
w klasyfikacji GHS 
ONZ/UE CLP  
Stearynian metylu 112-61-8 1 Cia ło stałe Brak kat. 
Maślan heptylu 5870-93-9 1,7 Ciecz Brak kat. 
(nieobowiązkowa 
kat. 3 ) ( 3 ), ( 4 ) 
Salicylan heksylu 6259-76-3 2 Ciecz Brak kat. 
(nieobowiązkowa 
kat. 3 ) ( 3 ), ( 4 ) 
Aldehyd cyklamenu 103-95-7 2,3 Ciecz Kat. 2 
1-bromoheksan 111-25-1 2,7 Ciecz Kat. 2 Wodorotlenek potasu (5 % roztwór 
wodny) 1310-58-3 3 Ciecz Kat. 2 
1-metylo-3-fenylo-1-piperazyna 5271-27-2 3,3 Cia ło stałe Kat. 2 
Heptanal 111-71-7 3,4 Ciecz Kat. 2
 
( 1 ) Wymienione chemiczne substancje odniesienia stanowi ą podgrup ę chemicznych substancji odniesienia u żywanych w badaniach 
walidacyjnych. 
( 2 ) Ocena  in vivo  zgodnie z B.4 i wytycznymi OECD nr 404 dotycz ącymi bada ń (4). 
( 3 ) Zgodnie z niniejsz ą metodą badania opcjonalna kategoria 3 GHS ONZ (lekko dra żniące) (1) jest uznawana za brak kategorii. 
( 4 ) GHS ONZ opcjonalna kategoria 3 nie jest stosowana w ramach UE CLP.  
PROCEDURA  
15. Poni żej przedstawiono opis sk ładowych i procedur badania oceniaj ącego 
działanie drażniące na skór ę przy wykorzystaniu RhE. Nale ży odtworzy ć 
model RhE: mo że być on przygotowany w laboratorium lub uzyskany na 
rynku. S ą dostępne standardowe procedury operacyjne (SPO) dla 
EpiSkin  TM , EpiDerm  TM SIT (EPI-200) i SkinEthic RHE  TM (26) (27) 
(28). Badania nale ży wykonywa ć zgodnie z poni ższymi zaleceniami:  
Składowe metody badania RHE  
Warunki ogólne  
16. W celu odtworzenia naskórka nale ży użyć niezmienionych keratynocytów 
pochodzących od cz łowieka. Pod zachowuj ącą funkcje życiowe warstw ą 
rogową powinno znajdowa ć się kilka warstw żywych komórek naskórka 
(warstwa podstawna, warstwa kolczysta, warstwa ziarnista). Warstwa 
rogowa powinna by ć wielopoziomowa i powinna zawiera ć lipidy 
niezbędne do utworzenia czynno ściowej bariery na tyle wytrzyma łej, aby 
uniemożliwiała szybkie przenikanie cytotoksycznych markerów, np. soli 
sodowej siarczanu dodecylu (SDS) lub markera Triton X-100. Funkcj ę 
bariery nale ży wykaza ć i można ocenić albo poprzez ustalenie st ężenia, 
w którym marker zmniejsza żywotność tkanek o 50 % (IC  50 ) po ustalonym 
czasie nara żenia na dzia łanie, albo poprzez ustalenie czasu nara żenia na 
działanie potrzebnego do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % (ET  50 ) 
po zastosowaniu markera w okre ślonym, sta łym stężeniu. Właściwości 
izolacyjne modelu RhE powinny zapobiega ć przechodzeniu materia łu 
przez warstw ę rogową do żywej tkanki, gdy ż w innym razie modelowanie 
narażenia skóry mog łoby być niewłaściwe. Model RhE nie powinien by ć 
skażony bakteriami, wirusami, mykoplazmami ani grzybami.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 656
 
Warunki funkcjonalne  
Żywotność 
17. Prób ą stosowan ą dla ustalenia wielko ści żywotności jest próba MTT (25). 
Użytkownicy modelu RhE powinni zapewni ć, aby każda partia stosowa ­
nego modelu RhE spe łniała określone kryteria kontroli negatywnej (NC). 
Gęstość optyczna (OD) samego rozpuszczalnika do ekstrakcji powinna by ć 
wystarczaj ąco niska, tj. OD < 0,1. Zakres dopuszczalno ści (górna i dolna 
granica) kontroli negatywnej warto ści gęstości optycznej (w warunkach 
metody badania dzia łania drażniącego na skór ę) jest okre ślony przez 
producentów/dostawców modelu RhE, a zakresy akceptowalno ści dla 
trzech zatwierdzonych metod s ą podane w tabeli 2. Nale ży udokumen ­
tować stabilność w hodowli (uzyskiwanie podobnych wyników pomiarów 
żywotności) tkanki poddanej dzia łaniu NC w badanym okresie nara żenia.  
Tabela 2  
Zakresy dopuszczalno ści kontroli negatywnej warto ści gęstości optycznej (OD)  
Dolna granica dopuszczalno ści Górna granica dopuszczalno ści 
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Funkcja bariery  
18. Warstwa rogowa i wchodz ące w jej sk ład lipidy powinny by ć na tyle 
odporne, aby nie by ło możliwe szybkie przenikanie przez nie cytotoksycz ­
nych markerów, np. SDS lub markera Triton X-100, wed ług oceny na 
podstawie IC  50 lub ET  50 (tabela 3).  
Morfologia  
19. Badanie histologiczne modelu RhE nale ży przeprowadzi ć z wykazaniem 
istnienia struktury przypominaj ącej ludzki naskórek (w tym wielopozio ­
mowej warstwy rogowej).  
Odtwarzalno ść 
20. Wyniki pozytywnej kontroli substancji chemicznej (PC), oraz negatywne 
kontrole (NC) metody badania powinny wykazywa ć odtwarzalno ść 
w czasie.  
Kontrola jako ści (QC)  
21. Producent b ądź dostawca modelu RhE powinni zapewni ć i wykaza ć, że 
każda partia wykorzystywanego modelu RhE spe łnia określone kryteria 
zwolnienia do produkcji, spo śród których te dotycz ące żywotności (pkt 
17), funkcji bariery  (pkt 18) i  morfologii  (pkt 19) s ą najbardziej istotne. 
Dane te powinny by ć przekazane u żytkownikom metody, tak aby mogli 
oni uwzgl ędnić tę informacj ę w sprawozdaniu z badania. Zakres dopusz ­
czalności (górna i dolna granica) IC  50 lub ET  50 powinien zosta ć ustalony 
przez producenta/dostawc ę modelu skóry (lub badacza w przypadku stoso ­
wania modelu opracowanego wewn ętrznie). Do wiarygodnego przewidy ­
wania klasy podra żnienia mo żna przyjąć wyłącznie wyniki uzyskane 
z użyciem zakwalifikowanych tkanek. Przyk ładowe zakresy dopuszczal ­
ności dla trzech zatwierdzonych metod podano w tabeli 3.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Tabela 3  
Przykłady kryteriów zwolnienia serii na podstawie kontroli jako ści 
Dolna granica dopuszczalno ści Górna granica dopuszczalno ści 
EpiSkin  TM (SM) 
(poddawanie dzia łaniu SDS przez 
18 godzin) (26) IC 50 = 1,0 mg/ml IC  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(1 % Triton X-100)(27) ET 50 = 4,8 hr ET  50 = 8,7 hr 
SkinEthic  TM RHE 
(1 % Triton X-100)(28) ET 50 = 4,0 hr ET  50 = 9,0 hr  
Nakładanie substancji badanej i kontrolnej  
22. Nale ży użyć co najmniej trzy powtórzenia dla ka żdej substancji badanej 
i kontrolnej w ka żdej serii. W przypadku p łynnych i sta łych substancji 
należy nałożyć na skór ę dostateczn ą ilość substancji badanej, tak aby 
równomiernie pokrywa ła powierzchni ę skóry, unikaj ąc jednak nak ładania 
dawki nieograniczonej, tj. nale ży użyć co najmniej 25 μL/cm  2 lub 25 
mg/cm  2 . W przypadku cia ł stałych przed na łożeniem nale ży zwilżyć 
powierzchni ę naskórka wod ą dejonizowan ą lub destylowan ą w celu 
poprawy kontaktu mi ędzy badan ą substancj ą chemiczn ą i powierzchni ą 
naskórka. W miar ę możliwości substancje sta łe powinny by ć badane 
w postaci drobnoziarnistego proszku. Pod koniec okresu nara żenia na 
działanie substancj ę badaną należy ostrożnie zmyć z powierzchni skóry 
buforem wodnym lub 0,9 % NaCl. Zale żnie od tego, która z trzech 
zatwierdzonych metod z wykorzystaniem RhE jest stosowana, okres nara ­ 
żenia na dzia łanie może się wahać od 15 do 60 minut, a temperatura 
inkubacji mo że wynosi ć od 20 do 37 °C. Czas nara żenia na dzia łanie 
i temperatura s ą dobrane odpowiednio dla ka żdej z metod RhE 
i stanowi ą swoiste w łaściwości, różne dla ka żdej metody. Szczegó łowe 
informacje okre ślono w standardowych procedurach operacyjnych dotycz ­ 
ących omawianych metod (26) (27) (28).  
23. Równoleg łe NC i PC powinny by ć stosowane w ka żdej serii, aby wyka ­
zać, że żywotność (przy NC), funkcja bariery i ostateczna czu łość tkan­
kowa (przy PC) s ą zawarte w dopuszczalnym zakresie zdefiniowanym na 
podstawie danych historycznych. Proponowana PC to 5 % roztworu 
wodnego SDS. Zalecanymi substancjami stanowi ącymi NC s ą woda lub 
roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami (PBS).  
Pomiary żywotności komórek  
24. Najwa żniejszym elementem procedury badania jest to, że pomiarów 
żywotności nie wykonuje si ę natychmiast po nara żeniu na substancje 
badane, ale po dostatecznie d ługim okresie inkubacji tkanek przemytych 
po tej ekspozycji, w świeżym podłożu. Ten okres pozwala zarówno na 
ustąpienie słabych dzia łań cytotoksycznych, jak i na pojawienie si ę 
wyraźnych dzia łań cytotoksycznych. Faza optymalizacji badania (11) 
(12) (13) (14) (15) wykaza ła, że okres 42 godzin inkubacji tkanek po 
ekspozycji jest optymalny.  
25. Próba MTT jest uznan ą metodą ilościową, którą należy wykorzystywa ć do 
pomiarów żywotności komórek w ramach niniejszej TM. Mo żna ją 
stosować do bada ń z użyciem trójwymiarowego wytworu tkankowego. 
Próbkę tkanki umieszcza si ę w roztworze MTT o w łaściwym st ężeniu 
(np. 0,3–1 mg/mL) na 3 godziny. Wytr ącony niebieski produkt formaza ­
nowy ekstrahuje si ę następnie z tkanki przy u życiu rozpuszczalnika (np. 
izopropanol, kwa śny izopropanol) i mierzy si ę stężenie formazanu poprzez 
oznaczenie OD przy d ługości fali 570 nm, wykorzystuj ąc filtr w pa śmie 
maksimum ± 30 nm.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. Właściwości optyczne badanej substancji chemicznej lub jej dzia łanie 
chemiczne na MTT mog ą wpływać na prób ę, powoduj ąc zafałszowanie 
oceny żywotności (poniewa ż substancja badana mo że uniemo żliwiać lub 
odwracać oraz powodowa ć powstawanie barwy). Mo że tak się zdarzyć 
w przypadku nieca łkowitego usuni ęcia określonej substancji badanej 
z tkanki przez przemywanie lub gdy substancja ta przeniknie przez naskó ­
rek. Jeśli substancja badana oddzia łuje bezpo średnio na MTT (reduktor 
MTT), jest naturalnie barwna lub staje si ę barwna w trakcie oddzia ływania 
na tkank ę, należy zastosowa ć dodatkowe kontrole w celu wykrycia 
i skorygowania wp ływu substancji badanej na technik ę pomiaru żywot­
ności. Szczegó łowy opis korekty bezpo średniej redukcji MTT i zak łóceń 
przez barwniki jest dost ępny w standardowych procedurach operacyjnych 
dotyczących trzech zatwierdzonych metod (26) (27) (28).  
Kryteria dopuszczalno ści 
27. Dla ka żdej metody z zastosowaniem zwalidowanych serii RhE (zob. pkt 
21) tkanki poddane dzia łaniu NC powinny wykazywa ć OD odpowiedni ą 
do jakości tkanek poddanych wszystkim etapom wysy łki i odbioru oraz 
wszystkim procesom protoko łu badania. Warto ści OD kontroli nie 
powinny by ć niższe niż dolne granice zdefiniowane na podstawie danych 
historycznych. Podobnie tkanki poddane dzia łaniu PC, tj. 5 % roztworem 
wodnym SDS, powinny odzwierciedla ć ich zdolno ści do reagowania na 
drażniącą substancj ę chemiczn ą w warunkach TM (26) (27) (28). Nale ży 
zdefiniowa ć powiązane i właściwe miary zmienno ści pomiędzy replikatami 
tkanek (np. w przypadku stosowania odchyle ń standardowych (SD) 
powinny one mie ścić się w jednostronnym przedziale tolerancji 95 % 
obliczonym na podstawie danych historycznych; dla VRM SD < 18 %).  
Interpretacja wyników i model predykcyjny  
28. Warto ści OD uzyskane dla ka żdej substancji badanej mo żna wykorzysta ć 
do obliczenia procentowej żywotności znormalizowanej w odniesieniu do 
NC, której żywotność ustala si ę na 100 %. Nale ży wyraźnie zdefiniowa ć 
i udokumentowa ć wartość odcięcia procentowej żywotności komórek, 
odróżniającą drażniące substancje badane od niesklasyfikowanych 
substancji badanych, oraz procedury statystyczne stosowane do oceny 
wyników i identyfikacji substancji dra żniących; nale ży również udowod­
nić, że są one właściwe. Warto ści odcięcia do predykcji dzia łania drażnią­
cego są podane poni żej: 
— badana substancja chemiczna jest uwa żana za dra żniącą dla skóry 
zgodnie z klasyfikacj ą GHS ONZ/UE CLP kategorii 2, je śli żywotność 
tkanki po nara żeniu i nast ępującej po nim inkubacji jest mniejsza lub 
równa (≤) 50 %,  
— w zale żności od ram regulacyjnych, w których s ą wykorzystywane 
wyniki niniejszej TM, badan ą substancj ę można uznać za niewywie ­
rającą działania drażniącego na skór ę zgodnie z GHS ONZ/UE CLP 
„brak kategorii”, je śli żywotność tkanki po nara żeniu na dzia łanie 
i następującej po nim inkubacji jest wi ększa niż (>) 50 %.  
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Dane  
29. Dla ka żdej serii nale ży przedstawi ć w formie tabelarycznej, 
z uwzględnieniem w stosownych przypadkach danych z powtórze ń 
eksperymentu, dane z poszczególnych replikatów tkanek (np. dane 
dotyczące warto ści OD i obliczonej procentowej żywotności komórek 
dla każdej substancji badanej, łącznie z klasyfikacj ą). Ponadto nale ży 
zgłosić średnie ± odchylenie standardowe dla ka żdej serii. Powinny by ć 
przedstawione zaobserwowane interakcje z odczynnikiem MTT i z barw ­
nymi substancjami badanymi w odniesieniu do ka żdej substancji badanej.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Sprawozdanie z badania  
30. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badane i kontrolne substancje chemiczne:  
— nazwy chemiczne, np. nazwa i numer CAS, nazwa i numer WE, je żeli 
jest znany,  
— czysto ść i skład substancji (w procentach wagowych),  
— właściwości fizykochemiczne istotne dla prowadzenia badania (np. 
stan fizyczny, stabilno ść, lotność, pH i rozpuszczalno ść w wodzie, 
jeśli jest znana),  
— postępowanie z substancjami badanymi/kontrolnymi przed rozpocz ę­
ciem bada ń, w odpowiednich przypadkach (np. podgrzewanie, miele ­
nie), 
— warunki przechowywania.  
Uzasadnienie dla zastosowanego modelu RhE i protoko łu 
Warunki badania:  
— zastosowany system komórkowy,  
— pełne informacje podstawowe na temat stosowanego modelu RhE, 
z uwzględnieniem jego efektywno ści. Powinno to w szczególno ści 
obejmowa ć: 
(i) żywotność; 
(ii) funkcj ę bariery;  
(iii) morfologi ę; 
(iv) odtwarzalno ść i predykcyjno ść; 
(v) kontrole jako ści (QC) modelu,  
— szczegó ły zastosowanej procedury testowej,  
— zastosowane badane dawki, czas trwania nara żenia i okresu inkubacji 
po narażeniu,  
— opis wszelkich modyfikacji procedury badania,  
— odwo łanie do danych historycznych modelu. Powinno to mi ędzy 
innymi obejmowa ć: 
(i) dopuszczalno ść danych QC z odwo łaniem do danych dotycz ących 
serii historycznych;  
(ii) dopuszczalno ść wartości kontroli pozytywnych i negatywnych, 
z określeniem pozytywnych i negatywnych średnich oraz zakresów 
kontroli,  
— opis stosowanych kryteriów oceny, z uzasadnieniem wyboru punktu(- 
ów) odcięcia w modelu predykcyjnym,  
— odniesienie do kontroli historycznych danych.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Wyniki:  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących pojedynczych badanych 
substancji chemicznych dla ka żdej serii i ka żdego powtarzalnego 
pomiaru,  
— wskazanie prób kontroli u żywanych w odniesieniu do bezpo średnich 
reduktorów MTT i/lub substancji badanych, które w wyniku reakcji przechodz ą w barwny produkt,
 
— opis innych zaobserwowanych skutków.  
Omówienie wyników  
Wnioski  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania 
Chemikaliów (GHS), wydanie drugie zmienione, ONZ, Nowy Jork 
i Genewa 2009. Dost ępny na stronie: [http://www.unece.org/trans/danger/ 
publi/ghs/ghs_rev03/03files_e.html]  
(2) EC-ECVAM (2009), Statement on the „Performance under UN GHS of 
three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
Reference Chemicals and Defined Accuracy Values of the ECVAM skin irritation Performance Standards”, issued by the ECVAM Scientific Advi ­
sory Committee (ESAC30), 9 kwietnia 2009 r. Dost ępny na stronie: [http:// 
ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(3) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania 
i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006. Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1.  
(4) OECD (2004), Acute Dermal Irritation/Corrosion, OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(5) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER), OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testgui ­
delines]
 
(6) OECD (2004),  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test, OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431, OECD, Pary ż. Dstępny na 
strnie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2006),  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion, 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435, OECD, Pary ż. 
Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(8) EC-ECVAM (2009), Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
methods based on Reconstructed human Epidermis (RhE)? Dost ępny na 
stronie: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(9) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD, Pary ż. Dostępny 
na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(10) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, 
J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J. M. and Botham, P. (2001), A prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, Results and 
evaluation by the Management Team, Toxicol. in Vitro 15, 57–93.
 
(11) Portes, P., Grandidier, M.-H., Cohen, C. and Roguet, R. (2002), Refinement 
of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of 
chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study, Toxicol. in 
Vitro 16, 765–770.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 661
 
(12) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, 
B. and Spielmann, H. (2004), Optimisation of the EpiDerm test protocol for 
the upcoming ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests, 
ALTEX 21, 107–114.  
(13) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, 
D. and Spielmann, H. (2005), The EpiDerm test protocol for the upcoming 
ECVAM validation study on  in vitro  skin irritation tests – An assessment of 
the performance of the optimised test, ATLA 33, 351–367.  
(14) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. and Rubinsteen, G. 
(2005), The  in vitro  acute skin irritation of chemicals: optimisation of the 
EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation 
process, ATLA 33, 329–349.  
(15) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., 
Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, 
R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. and Worth, A. (2002), Follow-up to 
the ECVAM prevalidation study on  in vitro  tests for acute skin irritation, 
The European Centre for the Validation of Alternative Methods Skin Irri ­
tation Task Force report 2, ATLA 30, 109–129.  
(16) Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., 
Eskes, C., Roguet, R., Cotovio, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, 
P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007), The ECVAM 
international validation study on  in vitro  tests for acute skin irritation: 
Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test, ATLA 35, 559–601.
 
(17) Hoffmann, S. (2006), ECVAM skin irritation validation study phase II: 
Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1- α. 
Dostępny na stronie: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(18) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. and 
Zuang, V. (2007), The ECVAM international validation study on  in vitro  
tests for acute skin irritation: selection of test chemicals, ATLA 35, 
603–619.  
(19) Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Lelièvre, D., Roguet, R., 
Tinois-Tessonneaud, E. and Leclaire, J. (2007),  In vitro  acute skin irritancy 
of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy - 
Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, 14, 
351–358.  
(20) EC-ECVAM (2007), Statement on the validity of  in vitro  tests for skin 
irritation, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC26), 27 kwietnia 2007 r. Dost ępny na stronie: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(21) EC-ECVAM (2007), Performance Standards for applying human skin 
models to  in vitro  skin irritation testing. Dost ępny na stronie: [http://ec ­
vam.jrc.ec.europa.eu]  
(22) EC-ECVAM (2008), Statement on the scientific validity of  in vitro  tests for 
skin irritation testing, issued by the ECVAM Scientific Advisory Committee 
(ESAC29), 5 listopada 2008 r. Dost ępny na stronie: [http://ecvam.jrc.ec.eu ­
ropa.eu]  
(23) OECD (2010), Explanatory background document to the OECD draft Test 
Guideline on  in vitro  skin irritation testing. OECD Series on Testing and 
Assessment, No. 137, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: [http:// 
www.oecd.org/document/24/ 0,3746,en_2649_34377_47858904_ 1_1_1_1,00.html]
 
(24) Welss, T., Basketter, D.A. and Schröder, K.R. (2004),  In vitro  skin irrita ­
tion: fact and future. State of the art. review of mechanisms and models, 
Toxicol. in Vitro 18, 231–243.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 662
 
(25) Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for cellular growth and 
survival: application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. 
Methods 65, 55–63.  
(26) EpiSkin  TM SOP, Version 1.8 (luty 2009), ECVAM Skin Irritation Valida ­
tion Study: Validation of the EpiSkin  TM test method 15 min - 42 hours for 
the prediction of acute skin irritation of chemicals. Dost ępny na stronie: 
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(27) EpiDerm  TM SOP, Version 7.0 (poddany przegl ądowi w marcu 2009), 
Protocol for:  In vitro  EpiDerm  TM skin irritation test (EPI-200-SIT), For 
use with MatTek Corporation’s reconstructed human epidermal model EpiDerm (EPI-200). Dost ępny na stronie: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]
 
(28) SkinEthic  TM RHE SOP, Version 2.0 (luty 2009), SkinEthic skin irritation 
test-42bis test method for the prediction of acute skin irritation of chemi ­
cals: 42 minutes application + 42 hours post-incubation. Dost ępny na stro ­
nie: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu]  
(29) Harvell, J.D., Lamminstausta, K., and Maibach, H.I. (1995), Irritant contact 
dermatitis, In: Practical Contact Dermatitis, pp 7-18, (Ed. Guin J. D.). Mc 
Graw-Hill, Nowy Jork.  
(30) Dyrektywa Komisji 2001/59/WE z dnia 6 sierpnia 2001 r. dostosowuj ąca po 
raz dwudziesty ósmy do post ępu technicznego dyrektyw ę Rady 
67/548/EWG w sprawie zbli żenia przepisów ustawowych, wykonawczych 
i administracyjnych odnosz ących się do klasyfikacji, pakowania 
i etykietowania substancji niebezpiecznych, Dz.U. L 225 z 21.8.2001, s. 1.  
(31) Basketter, D.A., York, M., McFadden, J.P. and Robinson, M.K. (2004), 
Determination of skin irritation potential in the human 4-h patch test. 
Contact Dermatitis 51, 1–4.  
(32) Jirova, D., Liebsch, M., Basketter, D., Spiller, E., Kejlova, K., Bendova, H., 
Marriott, M. and Kandarova, H. (2007), Comparison of human skin irrita ­
tion and photo-irritation patch test data with cellular  in vitro  assays and 
animal  in vivo  data, ALTEX, 14, 359–365.  
(33) Jírová, D., Basketter, D., Liebsch, M., Bendová, H., Kejlová, K., Marriott, 
M. and Kandárová, H. (2010), Comparison of human skin irritation patch test data with  in vitro  skin irritation assays and animal data, Contact 
Dermatitis, 62, 109–116.
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Dodatek 1  
Definicje  
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody 
badania a przyj ętymi warto ściami odniesienia. Jest to miara efektywno ści metody 
badania i jeden z aspektów jej istotno ści. Pojęcia tego cz ęsto używa się 
zamiennie z poj ęciem „zgodno ść” na oznaczenie odsetka prawid łowych wyników 
uzyskiwanych przy u życiu metody badania (9).  
Żywotność komórek:  parametr okre ślający całkowitą aktywno ść populacji komó ­
rek, np. zdolno ść dehydrogenaz w mitochondriach komórek do obni żenia zawar ­
tości przyżyciowego barwnika MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5- 
difenylotetrazoliowy, b łękit tiazolilowy), który – w zale żności od mierzonego 
punktu ko ńcowego i zastosowanego schematu badania – odpowiada ca łkowitej 
liczbie i/lub żywotności żywych komórek.  
Zgodność: jest to miara efektywno ści metody badania w odniesieniu do metod 
badań, które daj ą wyniki kategoryczne i jest jednym z aspektów istotno ści. 
Określenie jest stosowane wymiennie z okre śleniem „dok ładność”; definiuje si ę 
jako odsetek wszystkich badanych substancji chemicznych, które s ą prawidłowo 
sklasyfikowane jako pozytywne lub negatywne. (9).  
ET 50 : może być oszacowane przez ustalenie czasu nara żenia na dzia łanie 
potrzebnego do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % po zastosowaniu 
substancji chemicznej pe łniącej rolę markera w okre ślonym, sta łym stężeniu, 
zob. równie ż IC 50 . 
UE CLP (rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania 
substancji i mieszanin):  wdraża w Unii Europejskiej (UE) system GHS ONZ 
służący do celów klasyfikacji i etykietowania chemikaliów (substancje 
i mieszaniny) (3).  
GHS (globalnie zharmonizowany system klasyfikacji i etykietowania chemikaliów 
Organizacji Narodów Zjednoczonych (ONZ)):  system proponuj ący klasyfikacj ę 
chemikaliów (substancji i mieszanin) wed ług znormalizowanych rodzajów 
i poziomów zagro żeń fizycznych, zdrowotnych i środowiskowych oraz uwzgl ęd­
niający odpowiednie elementy komunikacyjne, takie jak piktogramy, has ła 
ostrzegawcze, zwroty wskazuj ące rodzaj zagro żenia, zwroty wskazuj ące środki 
ostrożności i karty charakterystyki substancji i produktów niebezpiecznych, aby 
przekazać informacje na temat ich dzia łań niepożądanych w celu zapewnienia 
ochrony ludzi (w tym pracowników, robotników, przewo źników, konsumentów 
i ratowników) i środowiska (1).  
IC 50 : może być oszacowane poprzez oznaczanie st ężenia, w którym substancja 
chemiczna pe łniąca rolę markera powoduje zmniejszenie żywotności tkanek 
o 50 % (IC  50 ) po stałym czasie nara żenia na dzia łanie, zob. równie ż ET  50 . 
Dawka nieograniczona:  ilość substancji badanej nak ładana na skór ę, przekra ­
czająca ilość konieczn ą do całkowitego, jednolitego pokrycia jej powierzchni.  
Badanie me-too:  potoczne okre ślenie metody badania, która jest strukturalnie 
i funkcjonalnie podobna do zwalidowanych i zaakceptowanych zgodnie z referencyjn ą metodą badania. Taka metoda badania kwalifikowa łaby się do 
wykorzystania jako walidacja „doganiaj ąca”. Zamiennie wykorzystana 
z podobn ą metodą badania (9).
 
Normy efektywno ści (PS):  normy oparte na zwalidowanej metodzie badania, 
zapewniaj ące podstaw ę do oceny porównywalno ści proponowanej metody bada ­
nia, która jest podobna do metody referencyjnej pod wzgl ędem mechanistycznym 
i funkcjonalnym. Uwzgl ędnia się: (i) istotne elementy metody badania; (ii) 
podstawowy wykaz chemicznych substancji odniesienia, wybranych spo śród 
substancji chemicznych wykorzystywanych w celu wykazania akceptowalnej 
efektywno ści zwalidowanej metody badania; oraz (iii) podobny poziom dok ład­
ności i wiarygodno ści, na podstawie wyników uzyskanych dla zwalidowanej 
metody badania, który proponowana metoda badania powinna osi ągnąć przy 
ocenie z wykorzystaniem podstawowego wykazu chemicznych substancji odnie ­
sienia (9).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Chemiczne substancje odniesienia:  substancje chemiczne wybrane do wykorzys ­
tania w procesie walidacji, dla których reakcje w systemie bada ń referencyjnych  
in vitro  oraz  in vivo  lub odpowiednie dla bada ń gatunki s ą już znane. Te 
substancje powinny by ć reprezentatywne dla klas substancji chemicznych, 
w odniesieniu do których – zgodnie z oczekiwaniami – b ędzie stosowana dana 
metoda badawcza i powinny reprezentowa ć pełny zakres reakcji, jakich mo żna 
się spodziewa ć po substancjach chemicznych, w odniesieniu do których środek 
może być stosowany, od reakcji silnych przez s łabe aż do negatywnych. Ró żne 
zestawy chemicznych substancji odniesienia mog ą być wymagane na ró żnych 
etapach procesu zatwierdzania, a tak że w odniesieniu do ró żnych metod badaw ­
czych i zastosowa ń badania (9).  
Istotność: opis powi ązania badania z oczekiwanym skutkiem oraz czy jest ono 
znaczące i użyteczne dla konkretnego celu. Jest to zakres, w jakim badanie 
prawidłowo mierzy lub przewiduje biologiczny oczekiwany skutek. Istotno ść 
obejmuje uwzgl ędnienie dok ładności (zgodno ści) metody badania (9).  
Wiarygodno ść: miernik zakresu, w jakim metoda badania mo że zostać wykonana 
w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomi ędzy laboratoriami 
w dłuższym okresie czasu, w przypadku jej wykonywania przy u życiu tego 
samego protoko łu. Ocenia si ę ją poprzez obliczenie odtwarzalno ści wewnątrz- 
i międzylaboratoryjnej (9).  
Badanie zast ępcze:  badanie, które ma na celu zast ąpienie badania stosowanego 
rutynowo i zaakceptowanego do identyfikacji zagro żeń i/lub oceny ryzyka i w 
odniesieniu do którego ustalono, że zapewnia równowa żną lub lepsz ą ochronę 
zdrowia ludzi lub zwierz ąt lub środowiska, odpowiednio, w porównaniu 
z zaakceptowanym badaniem, we wszystkich mo żliwych warunkach badania 
i w odniesieniu do wszystkich mo żliwych chemikaliów (9).  
Czułość: odsetek wszystkich pozytywnych/aktywnych chemikaliów prawid łowo 
sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dok ładności metody badania, która 
daje wyniki kategoryczne, stanowi ąca parametr istotny dla oceny istotno ści 
metody badania (9).  
Działanie drażniące na skór ę: powodowanie odwracalnego uszkodzenia skóry 
w wyniku na łożenia na skór ę badanej substancji chemicznej na okres do 4 
godzin. Dzia łanie drażniące na skór ę jest powstaj ącą miejscowo, nieimmuno ­
genną reakcją, która pojawia si ę wkrótce po stymulacji (29). Jego g łówną 
cechą jest odwracalny proces obejmuj ący reakcje zapalne oraz wi ększość charak­
terystycznych objawów klinicznych podra żnienia (rumie ń, obrzęk, świąd i ból) 
związanych z procesem zapalnym.  
Swoistość: odsetek wszystkich negatywnych/nieczynnych badanych chemikaliów 
prawidłowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dok ładności metody 
badania, która daje wyniki kategoryczne, stanowi ąca parametr istotny dla 
oceny istotno ści metody badania (9).  
Wielopoziomowa strategia badania:  badanie, w którym zastosowano metody 
badania w sposób sekwencyjny; Decyzje dotycz ące wyboru metod badawczych 
na każdym kolejnym poziomie podejmowane s ą w oparciu o wyniki uzyskane 
w poprzednim poziomie bada ń (9). 
Substancja badana (okre ślana także jako badana substancja chemiczna):  każda 
substancja lub mieszanina, badana za pomoc ą niniejszej TM.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Dodatek 2  
Normy efektywno ści do celów oceny proponowanych podobnych do bada ń 
in vitro  z wykorzystaniem zrekonstruowanego ludzkeigo naskórka (RhE) lub 
zmodyfikowanych metod badania dzia łania uczulaj ącego na skór ę 
WSTĘP 
1. Normy efektywno ści (PS) służą przede wszystkim ustaleniu, w jaki sposób 
określić, czy nowe metody bada ń, zarówno zastrze żone (tj. chronione 
prawem autorskim czy znakiem towarowym, zarejestrowane), jak i niezastrze żone, są wystarczaj ąco dokładne i wiarygodne w odniesieniu 
do konkretnych celów badawczych. Te normy efektywno ści, opracowane 
na podstawie zwalidowanych i zaakceptowanych metod badawczych, mogą być wykorzystane do oceny wiarygodno ści i dokładności innych 
podobnych metod (nazywanych potocznie metodami „me-too”), które 
opierają się na podobnych zasadach naukowych i mierz ą lub przewiduj ą 
te same skutki biologiczne lub toksyczne (9).
 
2. Przed przyj ęciem zmodyfikowanych metod (tj. proponowanych ewentual ­
nych usprawnie ń do zatwierdzonej metody bada ń), należy dokona ć oceny 
w celu okre ślenia wpływu proponowanych zmian na dzia łanie badania oraz 
zakres, w jakim zmiany takie maj ą wpływ na informacje dost ępne dla 
innych elementów procesu walidacji. W zale żności od liczby i charakteru 
proponowanych zmian, wygenerowanych danych i towarzysz ącej tym 
zmianom dokumentacji, powinny one by ć poddawane takiemu samemu 
procesowi walidacji, jak opisano w odniesieniu do nowego badania, lub, w stosownych przypadkach, ograniczonej ocenie wiarygodno ści i istotno ści 
przy użyciu sprawdzonej normy efektywno ści (9).
 
3. Metody podobne (me-too) do którejkolwiek z trzech zwalidowanych 
metod [EpiSkin™ (zwalidowana metoda referencyjna – VRM), EpiDerm™ SIT (EPI-200) i SkinEthic™RHE] lub ich zmodyfikowane 
wersje zaproponowane do stosowania w ramach niniejszej TM nale ży 
poddać ocenie w celu okre ślenia ich wiarygodno ści i dok ładności 
z wykorzystaniem substancji chemicznych reprezentuj ących pełny zakres 
wskaźników podra żnienia wg Draize’a. W ocenie z u życiem 20 zalecanych 
w normach efektywno ści chemicznych substancji odniesienia (tabela 1) 
proponowane lub zmodyfikowane metody powinny mie ć wartości wiary­
godności i dokładności porównywalne do wykazywanych przez VRM 
(tabela 2) lub od nich lepsze (2) (16). Warto ści wiarygodno ści 
i dokładności, które nale ży osiągnąć, są określone w pkt 8–12 niniejszego 
dodatku. Zosta ły uwzględnione zarówno chemikalia niezaklasyfikowane 
(GHS ONZ/UE CLP brak kategorii), jak i zaklasyfikowane (GHS ONZ/UE CLP kategoria 2) (1), reprezentuj ące różne klasy substancji 
chemicznych, tak aby mo żna było porówna ć wiarygodno ść i dokładność 
(czułość, swoistość i ogólną dokładność) proponowanej metody do wiary
­
godności i dokładności VRM. Przed zastosowaniem metody badania do 
badań nowych substancji badanych nale ży określić jej wiarygodno ść, 
a także zdolno ść do prawid łowej identyfikacji substancji dra żniących 
należących do kategorii 2 GHS ONZ/UE CLP a tak że, w zale żności od 
ram regulacyjnych, na potrzeby których generowane s ą dane, jej zdolno ść 
do prawid łowej identyfikacji substancji niezaklasyfikowanych do żadnej 
kategorii w systemie UN GHS/UE CLP (brak kategorii).  
4. Niniejsze normy efektywno ści opieraj ą się na EC-ECVAM PS (8), zaktua ­
lizowanej odpowiednio wed ług systemów klasyfikacji i etykietowania 
GHS ONZ i UE CLP (1) (3). Pierwotnie PS zosta ły określone po zako ń­
czeniu badania walidacyjnego (21) i opracowane w oparciu o wspólnotowy system klasyfikacji ustanowiony w dyrektywie Komisji 2001/59/WE z dnia 6 sierpnia 2001 r. dostosowuj ącej po raz dwudziesty 
ósmy do post ępu technicznego dyrektyw ę Rady 67/548/EWG w sprawie 
zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych 
odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji 
niebezpiecznych (
 1 ). W zwi ązku z przyj ęciem systemu GHS ONZ do 
celów klasyfikacji i etykietowania w UE (UE CLP) (3), jakie mia ło ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) Dz.U. L 225 z 21.8.2001, s. 1.
 miejsce w okresie pomi ędzy zako ńczeniem badania walidacyjnego 
a ukończeniem niniejszej TM, normy efektywno ści zostały uaktualnione 
(8). W uaktualnionej wersji zawarto wiele zmian (i) w obj ętym normami 
efektywno ści zestawie chemicznych substancji odniesienia; oraz (ii) 
w określonych warto ściach wiarygodno ści i dokładności (2) (23).  
NORMY EFEKTYWNO ŚCI DLA METOD BADANIA  IN VITRO  DZIAŁANIA 
UCZULAJ ĄCEGO NA SKÓR Ę Z WYKORZYSTANIEM RhE  
5. Normy efektywno ści obejmuj ą trzy nast ępujące elementy (9):  
I) Istotne elementy metody badania  
II) Minimalny wykaz chemicznych substancji odniesienia  
III) Zdefiniowane warto ści wiarygodno ści i dokładności 
I) Istotne elementy metody badania  
6. Obejmuj ą one kluczowe strukturalne, funkcjonalne, i proceduralne 
elementy metody zwalidowanej, które powinny by ć zawarte w protokole 
metody proponowanej, podobnej do metody odniesienia pod wzgl ędem 
mechanistycznym i funkcjonalnym, lub zmodyfikowanej jej wersji. 
Elementy te obejmuj ą wyjątkowe cechy metody, krytyczne szczegó ły 
proceduralne oraz środki kontroli jako ści. Przestrzeganie zasadniczych 
elementów metody badania przyczyni si ę do zapewnienia, że podobna 
lub zmodyfikowana proponowana metoda opiera si ę na tej samej koncep ­
cji, co odpowiadaj ąca im VRM (9). Istotne elementy metody badania 
zostały szczegó łowo opisane w pkt 16–21 niniejszej TM, a badanie nale ży 
wykonywa ć zgodnie z zaleceniami zawartymi w:  
— warunkach ogólnych (pkt 16),  
— warunkach funkcjonalnych, które obejmuj ą: 
— żywotność (pkt 17),  
— funkcj ę bariery (pkt 18),  
— morfologi ę (pkt 19),  
— odtwarzalno ść (pkt 20), oraz  
— kontrol ę jakości (pkt 21).  
II) Minimalny wykaz chemicznych substancji odniesienia  
7. Chemiczne substancje odniesienia s ą wykorzystywane do okre ślenia, czy 
wiarygodno ść i dokładność proponowanej podobnej lub zmodyfikowanej 
metody, co do której udowodniono, że jest strukturalnie i funkcjonalnie 
wystarczaj ąco podobna do VRM, lub stanowi niewielk ą zmianę jednej 
z trzech zwalidowanych metod, s ą porównywalne do wiarygodno ści 
i dokładności VRM lub od nich lepsze (2) (8) (16) (23). 20 zalecanych 
chemicznych substancji odniesienia, które zosta ły wymienione w tabeli 1, 
obejmuje chemikalia reprezentuj ące różne klasy substancji chemicznych 
(tj. kategorie chemiczne opracowane na podstawie grup funkcjonalnych) 
i reprezentuj ą pełny zakres wska źników podra żnienia wg Draize’a (od 
niedrażniących po silnie dra żniące). Chemikalia zawarte w tym wykazie 
obejmują 10 chemikaliów nale żących do kategorii 2. systemu GHS 
ONZ/UE CLP i 10 chemikaliów niezaklasyfikowanych, z których 3 s ą 
nieobowiązkowymi chemikaliami z kategorii 3 systemu GHS ONZ. 
Zgodnie z niniejsz ą metodą badania opcjonalna kategoria 3 jest uznawana 
za brak kategorii. Chemikalia wymienione w tabeli 1 zosta ły wybrane 
spośród substancji chemicznych wykorzystanych w fazie optymalizacji 
badania, która nast ąpiła po etapie procedur poprzedzaj ących walidacj ę ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
i w badaniu walidacyjnym VRM, w odniesieniu do funkcjonalno ści 
chemicznej i stanu fizycznego (14) (18). Te chemiczne substancje odnie ­
sienia to minimalna liczba chemikaliów, które powinny by ć wykorzystane 
do oceny dok ładności i wiarygodno ści proponowanej podobnej lub 
zmodyfikowanej metody, nie powinny jednak by ć wykorzystywane przy 
opracowywaniu nowych metod. W sytuacjach, w których wymieniona 
w wykazie substancja chemiczna jest niedost ępna, można wykorzysta ć 
inne chemikalia, w stosunku do których dysponuje si ę odpowiednimi 
danymi referencyjnymi z bada ń in vivo , głównie spo śród substancji 
chemicznych wykorzystywanych w fazie optymalizacji badania, która 
następuje po etapie procedur poprzedzaj ących walidacj ę lub w badaniu 
walidacyjnym VRM. W razie potrzeby, aby dodatkowo oceni ć dokładność 
proponowanej metody badania, mo żna dodać do wykazu minimalnego 
substancji referencyjnych dodatkowe substancje reprezentuj ące inne klasy 
chemiczne, dla których s ą dostępne dostateczne dane referencyjne z bada ń 
in vivo . 
Tabela 1  
Minimalny wykaz chemicznych substancji odniesienia, w celu okre ślenia warto ści dokładności i wiarygodno ści 
dla podobnych lub zmodyfikowanych metod badania dzia łania drażniącego na skór ę z wykorzystaniem RhE  ( 1 ) 
Chemikalia Numer CAS Stan fizyczny Ocena  in vivo  Kat. VRM  in 
vitro  Kat. GHS ONZ/UE 
CLP in vivo  
1-bromo-4-chlorobutan 6940-78-9 Ciecz 0 Kat. 2 Brak kat. 
Ftalan dietylu 84-66-2 Ciecz 0 Brak kat. Brak kat. 
Kwas naftylooctowy 86-87-3 Cia ło stałe 0 Brak kat. Brak kat. 
Fenoksyoctan allilu 7493-74-5 Ciecz 0,3 Brak kat. Brak kat. 
Izopropanol 67-63-0 Ciecz 0,3 Brak kat. Brak kat. 
Aldehyd 4-metylo-tio- 
benzoesowy 3446-89-7 Ciecz 1 Kat. 2 Brak kat. 
Stearynian metylu 112-61-8 Cia ło stałe 1 Brak kat. Brak kat. 
Maślan heptylu 5870-93-9 Ciecz 1,7 Brak kat. Brak kat. 
Salicylan heksylu 6259-76-3 Ciecz 2 Brak kat. Brak kat. 
Aldehyd cynamonowy 104-55-2 Ciecz 2 Kat. 2 Brak kat. 
(nieobowiązkowa 
kat. 3 ) ( 3 ) 
1-decanol  ( 2 ) 112-30-1 Ciecz 2,3 Kat. 2 Kat. 2  
Aldehyd cyklamenu 103-95-7 Ciecz 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromoheksan 111-25-1 Ciecz 2,7 Kat. 2 Kat. 2 Chlorowodorek 2-chlorome ­
tylo -3,5-dimetylo-4-meto ­
ksypirydyny 86604-75-3 Cia ło stałe 2,7 Kat. 2 Kat. 2  
Disiarczek di-n-propylu  (
 2 ) 629-19-6 Ciecz 3 Brak kat. Kat. 2  
Wodorotlenek potasu (5 % 
roztwór wodny) 1310-58-3 Ciecz 3 Kat. 2 Kat. 2 
Benzenotiol, 5–(1,1-dimety ­
loetylo)-2-metylu 7340-90-1 Ciecz 3,3 Kat. 2 Kat. 2 
1-metylo-3-fenylo-1-pipera ­
zyna 5271-27-2 Cia ło stałe 3,3 Kat. 2 Kat. 2  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Chemikalia Numer CAS Stan fizyczny Ocena  in vivo  Kat. VRM  in 
vitro  Kat. GHS ONZ/UE 
CLP in vivo  
Heptanal 111-71-7 Ciecz 3,4 Kat. 2 Kat. 2 
Tetrachloroetylen 127-18-4 Ciecz 4 Kat. 2 Kat. 2  
( 1 ) Wybór chemikaliów opiera si ę na następujących kryteriach: (i) substancje chemiczne s ą dostępne na rynku; (ii) s ą reprezentatywne 
dla pełnego zakresu wska źników podra żnienia wg Draize’a (od niedra żniących po silnie dra żniące); (iii) maj ą określoną budowę 
chemiczn ą; (iv) są reprezentatywne dla funkcjonalno ści chemicznej wykorzystywanej w procesie walidacji; oraz (v) nie wykazuj ą 
wysoce toksycznych w łaściwości (np. nie s ą rakotwórcze ani toksyczne dla uk ładu rozrodczego) i nie wi ążą się z nadmiernymi 
kosztami usuwania pozosta łości. 
( 2 ) Chemikalia, które dzia łają drażniąco na skór ę u królika, ale w odniesieniu do których dost ępne są wiarygodne dowody na to, że nie 
wywołują podrażnienia skóry u ludzi (31) (32) (33). 
( 3 ) W systemie GHS ONZ, lecz nie w UE CLP  
III) Zdefiniowane warto ści wiarygodno ści i dokładności 
8. Aby okre ślić wiarygodno ść i istotno ść proponowanych podobnych lub 
zmodyfikowanych metod, które maj ą być przekazywane mi ędzy laborato ­
riami, nale ży zbadać wszystkie 20 chemicznych substancji odniesienia 
z tabeli 1 w co najmniej trzech laboratoriach. Jednak gdy proponowana 
metoda ma by ć stosowana w jednym laboratorium, wielolaboratoryjne 
badania nie b ędą konieczne do walidacji. Wa żne jednak, aby takie badania 
walidacyjne zosta ły niezale żnie ocenione przez uznane na poziomie 
międzynarodowym organy zatwierdzaj ące, zgodnie z mi ędzynarodowymi 
wytycznymi (9). W ka żdym laboratorium wszystkich 20 chemicznych 
substancji odniesienia powinno zosta ć zbadane w trzech niezale żnych 
seriach, wykonanych na tkankach pochodz ących z ró żnych partii 
i odpowiednio roz łożonych w czasie. Ka żda seria dla ka żdej uwzgl ęd­
nionej badanej substancji powinna sk ładać się z przynajmniej trzech 
równocze śnie badanych powtórze ń poddawania tkanek dzia łaniu badanej 
substancji, NC i PC.  
9. Warto ści wiarygodno ści i dokładności proponowanych metod nale ży obli­
czyć uwzględniając wszystkie cztery poni ższe kryteria i dbaj ąc, aby 
wartości dla wiarygodno ści i istotno ści obliczane by ły w okre ślony 
i spójny sposób:  
1. Jedynie dane z kompletnych sekwencji serii kwalifikuj ą się do obli­
czenia wewn ątrzlaboratoryjnej i mi ędzylaboratoryjnej zmienno ści 
i możliwości prognozowania (dok ładności) metody.  
2. Klasyfikacj ę końcową dla każdej chemicznej substancji odniesienia 
należy wyznaczy ć w każdym uczestnicz ącym laboratorium przy u życiu 
wartości średniej żywotności w różnych seriach kompletnej sekwencji 
serii.  
3. Jedynie dane uzyskane dla tych substancji chemicznych, dla których 
przeprowadzono kompletne sekwencje serii we wszystkich uczestnicz ­ 
ących laboratoriach kwalifikuj ą się do obliczania zmienno ści międzyla­
boratoryjnej metody.  
4. Warto ści dokładności należy obliczy ć na podstawie indywidualnych 
prognoz laboratoryjnych uzyskanych dla 20 chemicznych substancji 
odniesienia przez ró żne uczestnicz ące laboratoria.  
W tym kontek ście sekwencja serii  składa się z trzech niezale żnych serii 
przeprowadzonych przez jedno laboratorium dla jednej badanej substancji.  
Kompletna sekwencja serii  to sekwencja serii przeprowadzona przez 
jedno laboratorium dla jednej badanej substancji, w przypadku gdy 
wszystkie trzy serie s ą ważne. Oznacza to, że pojedyncza niewa żna seria 
unieważnia całą sekwencj ę składającą się z trzech serii.  
Odtwarzalno ść wewnątrzlaboratoryjna  
10. Ocena odtwarzalno ści wewnątrzlaboratoryjnej powinna wykazywa ć zgod­
ność klasyfikacji (GHS ONZ/UE CLP kategoria 2 i brak kategorii) uzys ­
kanej w ró żnych, niezale żnych seriach bada ń 20 chemicznych substancji 
odniesienia w pojedynczym laboratorium wi ększą lub równ ą (≥) 90 %.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 669
 
Odtwarzalno ść międzylaboratoryjna  
11. Ocena odtwarzalno ści międzylaboratoryjnej nie jest niezb ędna, jeśli propo­
nowana metoda badania ma by ć stosowana tylko w jednym laboratorium. 
Aby można było przenosi ć metody pomi ędzy laboratoriami, zgodno ść 
klasyfikacji (GHS ONZ/UE CLP kategoria 2 i brak kategorii) uzyskanej w różnych, niezale żnych seriach bada ń 20 chemicznych substancji odnie ­
sienia pomi ędzy, najkorzystniej, minimalnie trzema laboratoriami powinna 
być większa lub równa ( ≥) 80 %.
 
Możliwości prognozowania (dok ładność) 
12. Dok ładność (czułość, swoisto ść i ogólna dok ładność) proponowanej 
podobnej lub zmodyfikowanej metody powinna by ć porównywalna do 
tej uzyskiwanej w VRM lub lepsza, bior ąc pod uwag ę dodatkowe infor ­
macje odnosz ące się do istotno ści u gatunków odpowiednich do bada ń 
(tabela 2). Czu łość powinna wynosi ć co najmniej 80 % ( ≥) (2) (8) (23). 
Jednak do czu łości proponowanej metody  in vitro  stosuje si ę dalsze szcze ­
gólne ograniczenia: tylko dwie substancje chemiczne kategorii 2 stoso ­
wane do bada ń in vivo : 1-Dekanol i dwusiarczek di-n-propylu  mogą być 
nieprawid łowo zaklasyfikowane jako brak kategorii przez wi ęcej niż jedno 
uczestnicz ące laboratorium. Swoisto ść powinna wynosi ć co najmniej 70 % 
(≥) (2) (8) (23). Nie ma dalszych ogranicze ń w odniesieniu do swoisto ści 
proponowanej metody  in vitro , tj. każde uczestnicz ące laboratorium mo że 
nieprawid łowo zaklasyfikowa ć wszelkie substancje chemiczne okre ślane 
mianem „brak kategorii” wykorzystywane do bada ń in vivo , o ile osta ­
teczna swoisto ść metody badawczej mie ści się w dopuszczalnym zakresie. 
Ogólna dok ładność powinna wynosi ć co najmniej 75 % ( ≥) (2) (8) (23). 
Chociaż czułość VRM obliczona dla 20 chemicznych substancji odniesie ­
nia, wymienionych w tabeli 1 jest równa 90 %, okre śloną wartość mini­
malną czułości, wymagan ą, aby podobn ą lub zmodyfikowan ą metodę 
można było uznać za ważną, ustala si ę na 80 %, poniewa ż zarówno 
o 1-Dekanolu  (substancja chemiczna o warto ści granicznej), jak i o  
dwusiarczku di-n-propylu  (fałszywie negatywny w VRM) wiadomo, że 
nie powoduj ą podrażnień u ludzi (31) (32) (33), chocia ż zostały zidenty ­
fikowane jako dra żniące w badaniach na królikach. Z uwagi na fakt, że 
modele RhE bazuj ą na komórkach pochodzenia ludzkiego, mog ą one 
przewidzie ć uznanie tych chemikaliów za niewywieraj ące działania draż­
niącego (GHS ONZ/UE CLP brak kategorii).  
Tabela 2  
Przewidywane warto ści czułości, swoisto ści i dokładności ogólnej wymagane aby wszelkie 
podobne lub zmodyfikowane metody uzna ć za ważne. 
Czułość Swoisto ść Ogólna dok ładność 
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Kryteria dopuszczalno ści badania  
13. Mo żliwe jest, że jedno lub kilka bada ń odnoszących się do jednej lub 
kilku badanych substancji chemicznych nie spe łnia kryteriów akceptacji 
badania dla substancji badanej oraz kontrolnej lub jest nie do przyj ęcia 
z innych powodów. W celu uzupe łnienia brakuj ących danych dla ka żdej 
substancji badanej dopuszcza si ę maksymalnie dwa dodatkowe badania 
(„ponowne badanie”). Dok ładniej rzecz ujmuj ąc, poniewa ż w przypadku 
ponownego badania równie ż PC i NC musz ą być równolegle poddane 
badaniom, mo żna przeprowadzi ć maksymalnie dwie dodatkowe serie dla 
każdej badanej substancji.  
14. Jest mo żliwe, że nawet po ponownym przebadaniu nie uda si ę uzyskać 
minimalnej liczby trzech wa żnych serii wymaganych dla ka żdej badanej 
substancji w odniesieniu do ka żdej chemicznej substancji odniesienia 
w każdym uczestnicz ącym laboratorium, co skutkowa łoby niekompletnym 
zbiorem danych. W takich przypadkach, aby uzna ć zestawy danych za 
akceptowalne, powinny zosta ć spełnione nast ępujące trzy kryteria:  
1. W odniesieniu do wszystkich spo śród 20 chemicznych substancji 
odniesienia powinno si ę dysponowa ć co najmniej jedn ą kompletn ą 
sekwencją serii.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. W ka żdym z co najmniej trzech uczestnicz ących laboratoriów co 
najmniej 85 % sekwencji serii powinno by ć kompletnych (dla 20 
chemikaliów: tj. dopuszczalne s ą 3 niewa żne sekwencje serii 
w jednym laboratorium).  
3. Co najmniej 90 % wszystkich mo żliwych sekwencji serii z co najmniej 
trzech laboratoriów musi by ć kompletnych (w odniesieniu do 20 chemi ­
kaliów badanych w 3 laboratoriach oznacza to, że dopuszczalnych jest 
ogółem 6 niewa żnych sekwencji serii).;  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B. 47  METODA BADANIA ZM ĘTNIENIA I PRZEPUSZCZALNO ŚCI 
ROGÓWKI U BYD ŁA DO CELÓW IDENTYFIKACJI 
SUBSTANCJI ŻRĄCYCH I SILNIE DRA ŻNIĄCYCH DLA OCZU  
WPROWADZENIE  
01. Metoda badania zm ętnienia i przepuszczalno ści rogówki u byd ła (BCOP) 
jest metod ą badania  in vitro , którą można stosowa ć w niektórych okolicz ­
nościach i przy okre ślonych ograniczeniach w celu zaklasyfikowania 
substancji i mieszanin jako „ żrące i silnie dra żniące dla oczu” (1)(2)(3). 
Dla celów niniejszej metody badania substancje silnie dra żniące oznaczaj ą 
substancje, które wywo łują zmiany oczne utrzymuj ące się u królika przez co 
najmniej 21 dni od podania tych substancji. Chocia ż uważa się, że badanie 
BCOP nie mo że całkowicie zast ąpić badania  in vivo  na oku królika, zaleca 
się jego stosowanie w ramach strategii bada ń wielopoziomowych do celów 
klasyfikacji regulacyjnej i oznakowania w ramach okre ślonej dziedziny 
zastosowania (4)(5). Badane substancje i mieszaniny (6) mo żna zaklasyfi ­
kować jako żrące lub silnie dra żniące dla oczu bez przeprowadzania dodat ­
kowych bada ń na królikach. Substancj ę, która daje ujemny wynik 
w badaniu, nale ży zbadać na królikach za pomoc ą strategii bada ń sekwen­
cyjnych, zgodnie z wytycznymi OECD dotycz ącymi bada ń 405 (7) (rozdzia ł 
B. 5 niniejszego za łącznika).  
02. Niniejsza metoda badania ma na celu opisanie procedur stosowanych do 
oceny potencjalnego dzia łania żrącego lub silnie dra żniącego dla oczu 
badanej substancji, okre ślanego na podstawie jej zdolno ści do wywo ływania 
zmętnienia i zwi ększonej przepuszczalno ści w izolowanej rogówce bydl ęcej. 
Toksyczne oddzia ływanie na rogówk ę jest oceniane na podstawie: (i) 
zmniejszonej przepuszczalno ści światła (zmętnienie) oraz (ii) zwi ększonej 
przepuszczalno ści barwnika na bazie soli sodowej fluoresceiny (przepusz ­
czalność). Oceny zm ętnienia i przepuszczalno ści rogówki, wydane 
w następstwie ekspozycji rogówki na badan ą substancj ę, są łączone 
w jeden wska źnik podra żnienia  in vitro  (IVIS), który stosuje si ę do klasy ­
fikacji stopnia dzia łania drażniącego badanej substancji.  
03. Metod ę badania BCOP zastosowano równie ż do badania substancji dra żnią­
cych dla oczu wywo łujących zmiany, które ust ępują w ciągu 21 dni, oraz 
substancji niedra żniących. Dok ładność i wiarygodno ść metody badania 
BCOP w odniesieniu do substancji nale żących do tych kategorii nie zosta ła 
jednak formalnie oceniona.  
04. Definicje podano w dodatku 1.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
05. Niniejsza metoda badania opiera si ę na protokole metody badania BCOP 
Międzyagencyjnego Komitetu Koordynacyjnego ds. Uznawania Metod 
Alternatywnych (ICCVAM) (8), który opracowano na podstawie mi ędzyna­
rodowego badania walidacyjnego (4)(5)(9) przy udziale Europejskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) i Japo ńskiego 
Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (JaCVAM). Protokó ł opiera 
się na informacjach uzyskanych z instytutu bada ń in vitro  (In Vitro Scien ­
ces, IIVS) oraz na protokole 124 INVITTOX (10), który zosta ł zastosowany 
w sponsorowanym przez Wspólnot ę Europejsk ą badaniu prewalidacyjnym 
badania BCOP przeprowadzonym w latach 1997-1998. Podstaw ą dla 
obydwu powy ższych protoko łów była metodologia badania BCOP, 
o której po raz pierwszy wspomina Gautheron i in. (11).
 ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 672
 
06. Zidentyfikowane ograniczenia niniejszej metody badania opieraj ą się na 
wysokich odsetkach wyników fa łszywie dodatnich w przypadku alkoholi 
i ketonów oraz na wysokim odsetku wyników fa łszywie ujemnych 
w przypadku cia ł stałych, które obserwuje si ę w bazie danych walidacyj ­
nych (zob. pkt 44) (5). Je żeli z bazy danych wy łączy się powyższe klasy 
chemiczne i fizyczne, dok ładność badania BCOP w systemach klasyfikacji 
UE, EPA i GHS znacznie si ę poprawia (5). Ze wzgl ędu na cel niniejszego 
badania (tj. zidentyfikowanie wy łącznie substancji żrących/silnie dra żnią­
cych dla oczu) odsetek wyników fa łszywie ujemnych nie ma decyduj ącego 
znaczenia, poniewa ż substancje takie zostan ą następnie zbadane na króli ­
kach lub za pomoc ą innych odpowiednio zwalidowanych bada ń in vitro , 
w zależności od wymogów okre ślonych w przepisach, przy zastosowaniu 
strategii bada ń sekwencyjnych zgodnie z podej ściem opartym na analizie 
wagi dowodów. Ponadto obecna baza danych walidacyjnych nie pozwala na 
odpowiedni ą ocenę niektórych klas chemicznych lub produktowych (np. 
mieszanin). Osoby przeprowadzaj ące badanie mog ą jednak rozwa żyć zasto­
sowanie niniejszej metody badania w odniesieniu do wszystkich rodzajów 
badanego materia łu (w tym mieszanin), w przypadku którego wynik dodatni 
można zaakceptowa ć jako wskazuj ący na reakcj ę na działanie żrące lub 
silnie dra żniące dla oczu. Dodatnie wyniki uzyskane w przypadku alkoholi 
i ketonów nale ży jednak interpretowa ć z ostrożnością ze względu na ryzyko 
ich zawyżenia.  
07. Wszystkie procedury przeprowadzane z wykorzystaniem oczu bydl ęcych 
i rogówki bydl ęcej powinny przebiega ć zgodnie z regulaminami 
i procedurami post ępowania z materia łem pozyskanym od zwierz ąt, który 
obejmuje m.in. tkanki i p łyny tkankowe, obowi ązującymi w placówce prze ­
prowadzaj ącej badanie. Zaleca si ę przestrzeganie ogólnych środków ostro ż­
ności dla laboratoriów (12).  
08. Ograniczeniem niniejszej metody badania jest fakt, że chociaż uwzględnia 
się w niej niektóre skutki dla oczu oceniane przy zastosowaniu metody 
badania podra żnienia oczu królika i w pewnym zakresie stopie ń tych 
podrażnień, nie bierze si ę w niej pod uwag ę uszkodze ń spojówki 
i tęczówki. Ponadto, chocia ż w badaniu BCOP nie mo żna ocenić odwracal ­
ności zmian w rogówce samych w sobie, zaproponowano, na podstawie 
badań na oku królika, mo żliwość zastosowania oceny pocz ątkowego 
stadium uszkodzenia rogówki w celu rozró żnienia mi ędzy skutkami 
nieodwracalnymi i odwracalnymi (13). Badanie BCOP nie pozwala te ż na 
ocenę potencjalnej toksyczno ści systemowej zwi ązanej z ekspozycj ą oczu.  
09. Podejmowane s ą starania w celu dok ładniejszego scharakteryzowania przy ­
datności i ogranicze ń badania BCOP w odniesieniu do identyfikowania 
substancji o s łabym dzia łaniu drażniącym i substancji niedra żniących (zob. 
również pkt 45). U żytkowników zach ęca się również do przekazywania 
próbek lub danych organizacjom walidacyjnym w celu przeprowadzenia 
formalnej oceny mo żliwych przysz łych zastosowa ń metody badania 
BCOP, w tym do identyfikacji substancji o s łabym dzia łaniu drażniącym 
i substancji niedra żniących.  
10. W ka żdym laboratorium, które zaczyna przeprowadza ć to badanie, nale ży 
zastosowa ć chemikalia przeznaczone do oceny bieg łości wymienione 
w dodatku 2. Laboratorium mo że stosowa ć te chemikalia w celu wykazania 
swojej bieg łości technicznej w zakresie przeprowadzania badania metod ą 
BCOP przed przedstawieniem danych z badania BCOP do celów regula ­
cyjnej klasyfikacji zagro żeń. 
ZASADA BADANIA  
11. Metoda badania BCOP jest modelem organotypicznym, który zapewnia 
krótkotrwa łe zachowanie normalnych funkcji fizjologicznych 
i biochemicznych rogówki bydl ęcej in vitro . Uszkodzenia spowodowane 
badaną substancj ą ocenia si ę w ramach tej metody badania na podstawie 
ilościowych pomiarów zmian w zm ętnieniu i przepuszczalno ści rogówki 
przy pomocy odpowiednio miernika zm ętnienia oraz spektrofotometru 
światła widzialnego. Obydwa pomiary stosuje si ę do obliczenia wska źnika 
IVIS, na postawie którego przypisuje si ę kategorie klasyfikacji zagro żenia 
podrażnieniem  in vitro  w celu przewidzenia potencjalnego dzia łania draż­
niącego dla oczu  in vivo  badanej substancji (zob. kryteria decyzji).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 673
 
12. W metodzie badania BCOP stosuje si ę izolowan ą rogówkę z oczu byd ła 
pozyskan ą bezpośrednio po uboju. Zm ętnienie rogówki mierzy si ę ilościowo 
jako ilość światła przepuszczanego przez rogówk ę. Przepuszczalno ść mierzy 
się ilościowo jako ilo ść barwnika na bazie soli sodowej fluoresceiny, jaka 
przenika przez ca łą grubość rogówki i jest wykrywana w środku komory 
tylnej oka. Badane substancje aplikuje si ę na nabłonek przedni rogówki oraz 
do komory przedniej pojemnika na rogówk ę. Dodatek 3 zawiera opis 
i rysunek pojemnika na rogówk ę stosowanego w metodzie badania 
BCOP. Pojemniki na rogówk ę można nabyć na rynku lub zbudowa ć samo­
dzielnie.  
Pochodzenie i wiek oczu bydl ęcych oraz dobór gatunków zwierz ąt 
13. Bydło wysyłane do rze źni jest zazwyczaj poddawane ubojowi albo dla 
celów spo życia przez ludzi, albo dla innych celów komercyjnych. Rogówka 
stosowana w badaniu BCOP pochodzi wy łącznie od zdrowych zwierz ąt, 
które uznano za odpowiednie do wprowadzenia do łańcucha żywnościo­
wego człowieka. W zwi ązku z tym, że masa byd ła jest znacznie zró żnico­
wana w zale żności od rasy, wieku i p łci, nie ma zalecanej masy zwierz ęcia 
podczas uboju.  
14. Różnice w wymiarach rogówki mog ą pojawić się w przypadku, gdy stosuje 
się oczy pochodz ące od zwierz ąt w różnym wieku. Rogówki o średnicy 
poziomej > 30,5 mm i grubo ści środkowej cz ęści wynosz ącej ≥ 1 100 μm 
uzyskuje si ę zazwyczaj od byd ła w wieku powy żej ośmiu lat, natomiast 
rogówki o średnicy poziomej < 28,5 mm i grubo ści środkowej cz ęści 
wynoszącej < 900 μm uzyskuje si ę zazwyczaj od byd ła w wieku poni żej 
pięciu lat (14). W zwi ązku z powy ższym zazwyczaj nie stosuje si ę oczu 
pochodzących od byd ła w wieku powy żej 60 miesi ęcy. Zasadniczo nie 
stosuje si ę oczu pochodz ących od byd ła w wieku poni żej 12 miesi ęcy, 
ponieważ są one jeszcze w fazie rozwoju, przez co grubo ść i średnica 
rogówki s ą znacznie mniejsze ni ż w przypadku oczu doros łego bydła. Stoso­
wanie rogówek pochodz ących od m łodych zwierz ąt (tj. w wieku 6-12 
miesięcy) jest jednak dozwolone, poniewa ż wiążą się z tym pewne korzy ści, 
na przykład większa dost ępność, wąski przedzia ł wiekowy oraz mniejsze 
zagrożenie związane z potencjalnym nara żeniem pracowników na g ąbczastą 
encefalopati ę bydła (15). Ze wzgl ędu na to, że przydatne by łoby przepro ­
wadzenie dalszej oceny wp ływu rozmiaru lub grubo ści rogówki na stopie ń 
reakcji na substancje żrące lub dra żniące, zachęca się użytkowników do 
zgłaszania szacowanego wieku lub szacowanej masy zwierz ąt, od których 
pobrano rogówki stosowane w badaniu.  
Pobieranie oczu i transport do laboratorium  
15. Oczy pobieraj ą pracownicy rze źni. Aby zminimalizowa ć uszkodzenia 
mechaniczne i inne rodzaje uszkodze ń, enukleacj ę oczu nale ży przeprowa ­
dzać jak najszybciej po śmierci zwierz ęcia. Aby zapobiec ekspozycji oczu 
na potencjalnie dra żniące substancje, podczas op łukiwania g łowy zwierz ęcia 
pracownicy rze źni nie powinni u żywać detergentów.  
16. Oczy nale ży w całości zanurzy ć w roztworze HBSS w pojemniku 
o odpowiednich rozmiarach i przetransportowa ć do laboratorium w taki 
sposób, żeby zminimalizowa ć możliwość pogorszenia stanu oczu lub 
skażenia bakteriami. Poniewa ż oczy pobiera si ę w trakcie procesu uboju, 
mogą one być narażone na kontakt z krwi ą i innymi substancjami biolo ­
gicznymi, w tym z bakteriami i innymi mikroorganizmami. Wa żne jest 
zatem, aby zapewni ć zminimalizowanie ryzyka ska żenia (np. poprzez 
umieszczenie pojemnika zawieraj ącego oczy w lodzie, poprzez dodanie 
antybiotyków do roztworu HBSS u żywanego do przechowywania oczu 
podczas transportu [np. penicylina o st ężeniu 100 j.m./ml i streptomycyna 
o stężeniu 100 mg/ml]).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 674
 
17. Nale ży zminimalizowa ć odstęp czasu mi ędzy pobraniem oczu a u życiem 
rogówek w badaniu BCOP (zazwyczaj pobranie i u życie nast ępuje tego 
samego dnia) oraz wykaza ć, że nie wpłynie on negatywnie na wyniki bada ­
nia. Wyniki badania opieraj ą się na kryteriach doboru oczu, jak równie ż na 
reakcjach w ramach kontroli pozytywnej i negatywnej. Wszystkie oczy 
wykorzystane w badaniu powinny pochodzi ć z tej samej grupy oczu pobra ­
nych danego dnia.  
Kryteria doboru oczu stosowanych w badaniu BCOP  
18. Po dostarczeniu do laboratorium oczy s ą dokładnie badane pod k ątem wad, 
m.in. zwi ększonego zm ętnienia, zadrapa ń i neowaskularyzacji. Wy łącznie 
rogówki pochodz ące z oczu niewykazuj ących takich wad mog ą zostać 
wykorzystane w badaniu.  
19. Jako ść każdej rogówki jest równie ż oceniana w pó źniejszych etapach badania. 
Należy odrzucić te rogówki, których zm ętnienie po wst ępnym, jednogodzinnym 
okresie inkubacji przekracza siedem jednostek zm ętnienia (UWAGA: miernik 
zmętnienia nale ży poddać wzorcowaniu wed ług norm zm ętnienia, które stosuje 
się do ustalania jednostek zm ętnienia, zob. dodatek 3).  
20. Każda badana grupa (badana substancja, równoczesna kontrola negatywna 
i pozytywna) sk łada się z co najmniej trojga oczu. Trzy rogówki nale ży 
wykorzysta ć do kontroli negatywnej w badaniu BCOP. Poniewa ż wszystkie 
rogówki s ą wycinane z ca łej gałki ocznej i umieszczane w komorach rogów ­
kowych, istnieje mo żliwość powstania artefaktów wynikaj ących z obróbki 
w odniesieniu do warto ści zmętnienia i przepuszczalno ści poszczególnych 
rogówek (w łączając kontrol ę negatywn ą). Ponadto warto ści zmętnienia 
i przepuszczalno ści uzyskane z rogówek s łużących do kontroli negatywnej 
są stosowane w celu skorygowania warto ści zmętnienia i przepuszczalno ści 
rogówki uzyskanych w wyniku dzia łania badanej substancji i kontroli pozy ­
tywnej w obliczeniach wska źnika IVIS.  
PROCEDURA  
Przygotowanie oczu  
21. Rogówki niewykazuj ące nieprawid łowości wycina si ę wraz z 2-3 mm 
obwódką twardówki w celu u łatwienia dalszej obróbki. Dok łada się starań, 
aby unikn ąć uszkodzenia nab łonka przedniego i nab łonka tylnego rogówki. 
Izolowane rogówki umieszcza si ę w specjalnie zaprojektowanych pojemni ­
kach na rogówk ę, składających się z komory przedniej i tylnej, które stykaj ą 
się odpowiednio z nab łonkiem przednim i nab łonkiem tylnym rogówki. 
Obydwie komory s ą maksymalnie wype łniane wcze śniej podgrzan ą 
pożywką hodowlan ą Eagle’a (EMEM) (najpierw komora tylna) w celu 
zagwarantowania, że nie utworz ą się żadne pęcherzyki powietrza. Nast ępnie 
urządzenie utrzymuje si ę w temperaturze 32 ± 1 °C przez co najmniej 
godzinę w celu zrównowa żenia rogówek w po żywce i uzyskania ich 
normalnej aktywno ść metabolicznej w zakresie, w jakim jest to mo żliwe 
(temperatura na powierzchni rogówki  in vivo  wynosi w przybli żeniu 32 °C).  
22. Po okresie inkubacji do obydwu komór dodaje si ę świeżą, wcześniej 
podgrzaną pożywkę EMEM oraz pobiera si ę wyjściowe odczyty zm ętnienia 
dla każdej rogówki. Odrzuca si ę każdą rogówkę, która wykazuje makro ­
skopowe uszkodzenia tkanki (np. zadrapania, przebarwienia, neowaskulary ­
zacja) lub zm ętnienie > 7 jednostek zm ętnienia. Oblicza si ę średnie zm ęt­
nienie wszystkich inkubowanych rogówek. Co najmniej trzy rogówki o wartościach zm ętnienia zbli żonych do średniej warto ści dla wszystkich 
rogówek wybiera si ę jako rogówki do kontroli negatywnej (kontroli 
z zastosowaniem rozpuszczalnika). Pozosta łe rogówki trafiaj ą następnie do 
grupy badanej i grupy kontroli pozytywnej.
 ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 675
 
23. Ze wzgl ędu na to, że pojemno ść cieplna wody jest wy ższa od pojemno ści 
cieplnej powietrza, woda zapewnia stabilniejsze warunki temperatury dla 
inkubacji. Zaleca si ę zatem stosowanie k ąpieli wodnej w celu utrzymania 
pojemnika na rogówk ę i jego zawarto ści w temperaturze 32 ± 1 °C. 
Niemniej mo żna równie ż zastosowa ć inkubatory powietrzne, pod warun ­
kiem że podejmie si ę środki ostro żności w celu utrzymania stabilnej tempe ­
ratury (np. poprzez wcze śniejsze podgrzewanie pojemników i po żywek).  
Podanie substancji badanej  
24. Stosuje si ę dwa różne protoko ły zabiegu – jeden dla cieczy i substancji 
powierzchniowo czynnych (sta łych lub ciek łych), zaś drugi dla cia ł stałych 
niebędących substancjami powierzchniowo czynnymi.  
25. Ciecze bada si ę w stanie nierozcie ńczonym, natomiast substancje powierzch ­
niowo czynne bada si ę w stężeniu 10 % w/v w 0,9 % roztworze chlorku 
sodu, w wodzie destylowanej lub innym rozpuszczalniku, w odniesieniu do 
którego wykazano, że nie wp ływa negatywnie na uk ład badawczy. Cia ła 
półstałe, kremy i woski s ą zazwyczaj badane tak jak ciecze. Zastosowanie 
innych st ężeń należy odpowiednio uzasadni ć. Ekspozycja rogówek na dzia ­ 
łanie cieczy i substancji powierzchniowo czynnych trwa 10 minut. Zastoso ­
wanie innego czasu ekspozycji wymaga przedstawienia racjonalnego 
uzasadnienia naukowego.  
26. Ciała stałe niebędące substancjami powierzchniowo czynnymi bada si ę 
zazwyczaj tak jak roztwory i zawiesiny w st ężeniu 20 % w/v w 0,9 % 
roztworze chlorku sodu, w wodzie destylowanej lub innym rozpuszczalniku, 
w odniesieniu do którego wykazano, że nie wp ływa negatywnie na uk ład 
badawczy. W niektórych okoliczno ściach, po przedstawieniu odpowiedniego 
uzasadnienia naukowego, cia ła stałe również można badać w postaci nieroz ­
cieńczonej poprzez bezpo średnią aplikacj ę na powierzchni ę rogówki 
z zastosowaniem metody „otwartej komory” (zob. pkt 29). Ekspozycja rogówek na dzia łanie ciał stałych trwa cztery godziny, ale podobnie jak 
w przypadku cieczy i substancji powierzchniowo czynnych mo żliwe jest 
zastosowanie innego czasu ekspozycji, pod warunkiem przedstawienia 
właściwego uzasadnienia naukowego.
 
27. W zale żności od stanu skupienia i w łaściwości chemicznych (np. cia ła stałe, 
ciecze, ciecze lepkie oraz ciecze nielepkie) badanej substancji mo żna zasto­
sować różne metody badania. Najwa żniejsze jest, aby upewni ć się, że 
nabłonek przedni zosta ł pokryty badan ą substancj ą w odpowiedni sposób 
oraz że odpowiednio j ą usunięto w trakcie p łukania. Metod ę „zamkni ętej 
komory” stosuje si ę zwykle w przypadku cieczy nielepkich i cieczy lekko 
lepkich, natomiast metod ę „otwartej komory” stosuje si ę zwykle 
w przypadku cieczy cz ęściowo lepkich i lepkich oraz nierozcie ńczonych 
ciał stałych. 
28. W przypadku metody „zamkni ętej komory” badan ą substancj ę, w ilości 
wystarczaj ącej (750 μl) do pokrycia nab łonka przedniego rogówki, wpro ­
wadza się do komory przedniej przez otwory do dawkowania znajduj ące się 
w górnej cz ęści komory, które nast ępnie w trakcie ekspozycji uszczelnia si ę 
specjalnymi zatyczkami. Nale ży dopilnowa ć, aby czas ekspozycji ka żdej 
rogówki na dzia łanie badanej substancji by ł właściwy.  
29. W przypadku metody „otwartej komory” przed rozpocz ęciem badania 
z komory przedniej usuwa si ę pierścień zabezpieczaj ący okienko i szklane 
okienko. Substancja kontrolna lub badana (750 μl lub w ilo ści wystar ­
czającej do ca łkowitego pokrycia rogówki) jest aplikowana bezpo średnio 
na nabłonek przedni rogówki za pomoc ą mikropipety. Je żeli trudno jest 
zaaplikowa ć badaną substancj ę za pomoc ą pipety, wówczas mo żna taką 
substancję wprowadzi ć pod ciśnieniem do pipety t łokowej, aby u łatwić 
dawkowanie. Ko ńcówkę pipety t łokowej umieszcza si ę w końcówce 
dawkującej strzykawki w celu wprowadzenia substancji do ko ńcówki pipety 
tłokowej pod ci śnieniem. W miar ę naciskania t łoka strzykawki, t łok pipety 
podnosi si ę. Jeżeli w końcówce pipety pojawi ą się pęcherzyki powietrza, 
usuwa si ę badaną substancj ę i cały proces jest powtarzany, dopóki 
końcówka nie zostanie nape łniona bez p ęcherzyków powietrza. W miar ę 
konieczno ści można zastosowa ć normalną strzykawk ę (bez igły), poniewa ż 
umożliwia ona dok ładne zmierzenie ilo ści badanej substancji oraz u łatwia 
jej aplikacj ę na nabłonek przedni rogówki. Po podaniu substancji szklane 
okienko z powrotem umieszcza si ę w komorze przedniej, aby przywróci ć 
układ zamkni ęty. ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 676
 
Inkubacja po zako ńczeniu ekspozycji  
30. Po okresie ekspozycji usuwa si ę badaną substancj ę, substancj ę do kontroli 
negatywnej lub substancj ę do kontroli pozytywnej z komory przedniej, za ś 
nabłonek przedni przemywa si ę co najmniej trzy razy (lub dopóki nie znikn ą 
wszystkie widoczne ślady badanej substancji) przy u życiu pożywki EMEM 
(zawierającej czerwie ń fenolow ą). Do sp łukiwania stosuje si ę pożywkę 
zawierającą czerwień fenolową, poniewa ż na podstawie zmiany barwy czer ­
wieni fenolowej mo żna określić skuteczno ści spłukiwania substancji kwaso ­
wych lub zasadowych. Rogówki przemywa si ę więcej niż trzy razy, je żeli 
czerwień fenolowa ma w dalszym ci ągu zmienion ą barwę (żółtą lub fiole ­
tową) lub jeśli badana substancja jest w dalszym ci ągu widoczna. Po 
oczyszczeniu po żywki z badanej substancji rogówki op łukuje się po raz 
ostatni po żywką EMEM (bez czerwieni fenolowej). Po żywka EMEM (bez 
czerwieni fenolowej) jest u żywana do ostatniego op łukania, aby zapewni ć 
usunięcie czerwieni fenolowej z komory przedniej przed rozpocz ęciem 
pomiaru zm ętnienia. Nast ępnie ponownie wype łnia się komorę przednią 
świeżą pożywką EMEM bez czerwieni fenolowej.  
31. W przypadku cieczy lub substancji powierzchniowo czynnych rogówki s ą 
inkubowane przez kolejne dwie godziny w temperaturze 32 ± 1 °C. W niektórych sytuacjach potrzebny mo że być dłuższy czas dodatkowej 
ekspozycji; jego wprowadzenie nale ży rozważyć indywidualnie dla ka żdego 
przypadku. Rogówki wystawione na dzia łanie ciał stałych poddaje si ę 
dokładnemu p łukaniu po zako ńczeniu czterogodzinnej ekspozycji, ale nie 
wymagają one dodatkowej inkubacji.
 
32. Pod koniec okresu dodatkowej inkubacji w przypadku cieczy i substancji 
powierzchniowo czynnych oraz pod koniec czterogodzinnej ekspozycji w przypadku cia ł stałych niebędących substancjami powierzchniowo czyn ­
nymi dokonuje si ę pomiaru zm ętnienia i przepuszczalno ści każdej rogówki. 
Każdą rogówkę obserwuje si ę również wzrokowo i zapisuje si ę istotne 
obserwacje (np. łuszczenie si ę tkanki, pozosta łości badanej substancji, 
niejednolite zm ętnienie). Powy ższe obserwacje mog ą mieć istotne znaczenie, 
ponieważ mogą znaleźć odzwierciedlenie w zmienno ści odczytów miernika 
zmętnienia.
 
Substancje kontrolne  
33. Każde doświadczenie obejmuje równoczesn ą kontrolę negatywn ą lub 
kontrolę z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika i kontrol ę pozytywn ą. 
34. W przypadku badania cieczy o st ężeniu 100 % w metodzie badania BCOP 
uwzględnia się równoczesn ą kontrolę negatywn ą (np. 0,9 % roztwór chlorku 
sodu lub woda destylowana) w celu wykrycia niespecyficznych zmian 
w układzie badawczym i zapewnienia punktu odniesienia dla punktów 
końcowych badania. Kontrola negatywna gwarantuje równie ż, że warunki 
badania nie wywo łują niepożądanej reakcji w postaci podra żnienia.  
35. W przypadku badania cieczy rozcie ńczonej, substancji powierzchniowo 
czynnej lub cia ła stałego w metodzie badania BCOP uwzgl ędnia się równo­
czesną grupę kontroli z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika w celu 
wykrycia niespecyficznych zmian w uk ładzie badawczym i zapewnienia 
punktu odniesienia dla punktów ko ńcowych badania. Stosowa ć można 
jedynie rozpuszczalnik/no śnik, w odniesieniu do którego wykazano, że nie 
wpływa negatywnie na uk ład badawczy.  
36. W ka żdym doświadczeniu uwzgl ędnia się substancj ę o znanym dzia łaniu 
drażniącym dla oczu, s łużącą do przeprowadzenia równoczesnej kontroli 
pozytywnej w celu zweryfikowania, czy wywo łana została właściwa reakcja. 
Ponieważ w niniejszej metodzie badania stosuje si ę badanie BCOP w celu 
zidentyfikowania substancji żrących i silnie dra żniących, w idealnej sytuacji 
do kontroli pozytywnej powinna zosta ć użyta substancja referencyjna, która 
wywołuje silną reakcję w takiej metodzie badania. Aby jednak zapewni ć 
możliwość oceny zmienno ści reakcji w kontroli pozytywnej w czasie, 
podrażnienie nie powinno by ć nadmierne.  
37. Do celów kontroli pozytywnej w przypadku badanych cieczy mo żna zasto­
sować na przyk ład dimetyloformamid lub 1 % roztwór wodorotlenku sodu. 
Do celów kontroli pozytywnej w przypadku badanych cia ł stałych można 
zastosowa ć na przyk ład 20 % (waga w stosunku do obj ętości) imidazol 
w 0,9 % roztworze chlorku sodu.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 677
 
38. Substancje wzorcowe s ą przydatne do oceny potencjalnego dzia łania draż­
niącego dla oczu nieznanych chemikaliów z okre ślonej klasy chemicznej lub 
produktowej lub do oceny wzgl ędnego potencjalnego dzia łania drażniącego 
substancji dra żniącej dla oczu w okre ślonym zakresie reakcji w postaci 
podrażnienia.  
Pomiar punktów ko ńcowych  
39. Zmętnienie okre śla się na podstawie ilo ści światła przepuszczanego przez 
rogówkę. Zmętnienie rogówki mierzy si ę ilościowo przy pomocy miernika 
zmętnienia, w wyniku czego otrzymuje si ę wartości zmętnienia mierzone na 
skali ciągłej. 
40. Przepuszczalno ść określa się na podstawie ilo ści barwnika na bazie soli 
sodowej fluoresceiny, jaka przenika przez wszystkie warstwy rogówki (tj. przez nab łonek przedni na zewn ętrznej powierzchni rogówki po nab łonek 
tylny na wewn ętrznej powierzchni rogówki). Do komory przedniej pojem ­
nika na rogówk ę, która styka si ę z nabłonkiem przednim rogówki, dodaje 
się roztwór 1 ml soli sodowej fluoresceiny (odpowiednio 4 lub 5 mg/ml 
w przypadku badania cieczy i substancji powierzchniowo czynnych lub cia ł 
stałych nieb ędących substancjami powierzchniowo czynnymi), natomiast 
komorę tylną, która styka si ę z nabłonkiem tylnym rogówki, wype łnia się 
świeżą pożywką EMEM. Nast ępnie pojemnik inkubuje si ę w pozycji 
poziomej przez 90 ± 5 min w temperaturze 32 ± 1 °C. Ilo ść soli sodowej 
fluoresceiny, jaka przedostaje si ę do komory tylnej, jest mierzona ilo ściowo 
przy pomocy spektrofotometrii UV/VIS. Pomiary spektrofotometryczne przy 
długości fali 490 nm rejestruje si ę jako warto ści gęstości optycznej (OD
 490 ) 
lub absorbancji mierzone na skali ci ągłej. Warto ści przepuszczalno ści fluo­
resceiny okre śla się przy użyciu warto ści OD  490 otrzymanych w wyniku 
zastosowania spektrofotometru światła widzialnego, w którym stosuje si ę 
standardow ą 1 cm drog ę optyczną. 
41. Można ewentualnie zastosowa ć czytnik p łytek 96-do łkowych, pod warun ­
kiem że: (i) można ustalić zakres liniowy czytnika p łytek w celu okre ślenia 
wartości OD  490 fluoresceiny oraz (ii) odpowiednia liczba próbek fluores ­
ceiny zostanie u żyta w płytce 96-do łkowej, aby otrzyma ć wartości OD  490 
równoważne standardowej 1 cm drodze optycznej (konieczne mo że być 
całkowite wype łnienie do łków [zwykle 360 ml]).  
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Ocena danych  
42. Po skorygowaniu warto ści zmętnienia i średniej przepuszczalno ści (OD  490 ) 
względem warto ści zmętnienia i negatywnej kontroli przepuszczalno ści 
OD  490 tła, średnie warto ści zmętnienia i przepuszczalno ści OD  490 dla każdej 
badanej grupy nale ży połączyć w opracowany empirycznie wzór w celu 
obliczenia wska źnika podra żnienia  in vitro  (IVIS) w odniesieniu do ka żdej 
badanej grupy w nast ępujący sposób:  
IVIS = średnia warto ść zmętnienia + (15 × średnia warto ść przepuszczal ­
ności OD  490 ) 
Sina i in. (16) podaje, że powyższy wzór opracowano w trakcie bada ń 
wewnętrznych i mi ędzylaboratoryjnych. Dane otrzymane dla serii 36 
związków w badaniu mi ędzylaboratoryjnym poddano analizie wielowymia ­
rowej w celu wyznaczenia równania, które najlepiej opisuje zale żność 
między danymi  in vivo  a danymi  in vitro . Analizę przeprowadzili naukowcy 
w dwóch odr ębnych przedsi ębiorstwach, którzy otrzymali niemal że iden­
tyczne wzory.  
43. Warto ści zmętnienia i przepuszczalno ści równie ż należy oceniać niezależnie, 
aby stwierdzi ć, czy badana substancja wywo ływała działanie żrące lub silnie 
drażniące wyłącznie w jednym z dwóch punktów ko ńcowych (zob. kryteria 
decyzji).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Kryteria decyzji  
44. Substancj ę, w przypadku której wska źnik IVIS wynosi ≥ 55,1, okre śla się 
jako żrącą lub silnie dra żniącą. Zgodnie z pkt 1 je żeli badana substancja nie 
została zidentyfikowana jako żrąca lub silnie dra żniąca dla oczu, nale ży 
przeprowadzi ć dodatkowe badanie do celów klasyfikacji i oznakowania. 
Metoda badania BCOP wykazuje ogóln ą dokładność od 79 % (113/143) 
do 81 % (119/147), odsetek wyników fa łszywie dodatnich od 19 % (20/103) 
do 21 % (22/103), odsetek wyników fa łszywie ujemnych od 16 % (7/43) do 
25 % (10/40) w porównaniu do danych uzyskanych w wyniku metody badania  in vivo  na oku królika, sklasyfikowanych zgodnie z systemami 
klasyfikacji EPA (1), UE (2) lub GHS (3). Je żeli substancje nale żące do 
określonych klas chemicznych (tj. alkohole, ketony) lub fizycznych (tj. cia ła 
stałe) są wyłączone z bazy danych, dok ładność badania BCOP wg 
systemów klasyfikacji UE, EPA i GHS wynosi od 87 % (72/83) do 92 % 
(78/85), odsetek wyników fa łszywie dodatnich – od 12 % (7/58) do 16 % 
(9/56), a odsetek wyników fa łszywie ujemnych – od 0 % (0/27) do 12 % 
(3/26).
 
45. Nawet je żeli badana substancja nie zostanie zaklasyfikowana jako żrąca lub 
silnie dra żniąca dla oczu, dane z badania BCOP mog ą być przydatne, 
w połączeniu z danymi z badania  in vivo  na oku królika lub z innego 
odpowiednio zwalidowanego badania  in vitro , w celu dalszej oceny przy ­
datności i ogranicze ń metody badania BCOP w odniesieniu do identyfikacji 
substancji o s łabym dzia łaniu drażniącym i substancji niedra żniących (trwaj ą 
prace nad dokumentem zawieraj ącym wytyczne dotycz ące stosowania metod 
badania toksyczno ści dla oczu  in vitro ). 
Kryteria dopuszczalno ści badania  
46. Badanie uznaje si ę za dopuszczalne, je żeli kontrola pozytywna daje 
wskaźnik IVIS, który mie ści się w ramach dwóch standardowych odchyle ń 
od obecnej historycznej średniej, któr ą należy aktualizowa ć co najmniej co 
trzy miesi ące lub za ka żdym razem, gdy dopuszczalne badanie jest przepro ­
wadzane w laboratoriach, w których rzadko przeprowadza si ę badania (tj. 
rzadziej ni ż raz na miesi ąc). Warto ści zmętnienia i przepuszczalno ści otrzy­
mane w wyniku reakcji kontroli negatywnej lub kontroli z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika powinny by ć niższe od ustalonych górnych limitów 
wartości zmętnienia i przepuszczalno ści tła dla rogówek bydl ęcych 
poddanych odpowiedniej kontroli negatywnej lub kontroli z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika.
 
Sprawozdanie z badania  
47. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje, o ile s ą 
one istotne dla przebiegu badania:  
Substancje badane i kontrolne  
Nazwa chemiczna (nazwy chemiczne), np. nazwa strukturalna u żywana 
przez Chemical Abstracts Service (CAS), po której nast ępują inne nazwy, 
jeżeli są znane;  
Numer CAS, je żeli jest znany;  
Czystość i skład substancji lub mieszaniny (w procentach masy), w miar ę 
dostępności tych informacji;  
Właściwości fizykochemiczne istotne dla przebiegu badania, np. stan 
skupienia, lotno ść, pH, stabilno ść, klasa chemiczna, rozpuszczalno ść 
w wodzie;  
W stosownych przypadkach obróbka substancji badanych/kontrolnych przed 
badaniem (np. ogrzanie, rozdrobnienie);  
Stabilność, jeżeli jest znana.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informacje dotycz ące sponsora i placówki przeprowadzaj ącej badanie  
Nazwa i adres sponsora i placówki przeprowadzaj ącej badanie oraz dane 
kierownika bada ń; 
Identyfikacja źródła oczu (tj. zak ład, w którym je pobrano);  
Warunki przechowywania i transportu oczu (np. data i czas pobrania oczu, 
odstęp czasu mi ędzy pobraniem oczu a rozpocz ęciem badania, środek trans ­
portu i temperatura, wszelkie podane antybiotyki);  
W miarę dostępności szczegó łowe dane na temat zwierz ąt, od których 
pobrano oczy (np. wiek, p łeć, masa zwierz ęcia dawcy).  
Uzasadnienie zastosowanej metody badania i protoko łu 
Integralno ść metody badania  
Procedura zastosowana w celu zapewnienia integralno ści (tj. dok ładności 
i wiarygodno ści) metody badania w czasie (np. okresowe badanie substancji 
do oceny bieg łości, wykorzystanie historycznych danych z kontroli nega ­
tywnej i pozytywnej).  
Kryteria dotycz ące badania dopuszczalnego  
Dopuszczalny zakres równoczesnej kontroli pozytywnej i negatywnej na 
podstawie danych historycznych;  
W stosownych przypadkach dopuszczalny zakres równoczesnej kontroli 
odniesienia na podstawie danych historycznych.  
Warunki badania  
Opis zastosowanego uk ładu badawczego;  
Rodzaj zastosowanego pojemnika na rogówk ę; 
Informacje na temat wzorcowania urz ądzeń zastosowanych do pomiaru 
zmętnienia i przepuszczalno ści (np. miernik zm ętnienia i spektrofotometr);  
Informacje na temat zastosowanych rogówek bydl ęcych, w tym o świad­
czenia dotycz ące ich jako ści; 
Szczegółowe dane na temat zastosowanej procedury badania;  
Zastosowane st ężenie badanej substancji;  
Opis wszelkich modyfikacji procedury badania;  
Odniesienie do danych historycznych dotycz ących modelu (np. kontrole 
pozytywne i negatywne, substancje do oceny bieg łości, substancje wzorco ­
we); 
Opis stosowanych kryteriów oceny.  
Wyniki  
Tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących pojedynczych badanych 
próbek (np. warto ści zmętnienia i OD  490 oraz obliczony wska źnik IVIS 
dla badanej substancji i kontroli pozytywnej, negatywnej i odniesienia 
[jeżeli zosta ła uwzgl ędniona], przedstawione w tabelarycznej formie, 
w stosownych przypadkach z uwzgl ędnieniem danych z powtórze ń doświad­
czenia z replikatem oraz średnich ± odchylenie standardowe dla ka żdego 
doświadczenia);  
Opis innych zaobserwowanych skutków.  
Omówienie wyników  
Wnioski  
LITERATURA  
0(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
0(2) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania 
i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006. Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1.  
0(3) ONZ (2007). Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji 
i Oznakowania Chemikaliów (GHS), wydanie drugie zmienione, publi ­
kacje ONZ, Nowy Jork i Genewa 2007. Dost ępny na stronie internetowej:  
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
0(4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants. Dost ępne na stronie 
internetowej:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
0(5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of 
Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. Dostępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(6) Rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady 
z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania 
zezwoleń i stosowanych ogranicze ń w zakresie chemikaliów (REACH) 
i utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniaj ące dyrektyw ę 
1999/45/WE oraz uchylaj ące rozporz ądzenie Rady (EWG) nr 793/93 
i rozporz ądzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak równie ż dyrektyw ę 
Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE. Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1.
 
0(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Dost ępne na stronie interne ­
towej:  
[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37 051368_ 
1_1_1_1,00.html]  
0(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Proto ­
col. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. 
Dostępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Identifying 
Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. Publikacja NIH nr: 06-4512. Research Triangle 
Park: National Toxicology Program. Dost ępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]  
(10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permea ­
bility Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, W łochy: 
Europejskie Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
(11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine 
corneal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular irri ­
tancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
(12) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents 
in Healthcare Settings. Dost ępne na stronie internetowej:
 
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].  
(13) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(14) Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
(15) Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The 
Lancet 349: 636-641.  
(16) Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., 
Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irri ­
tation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam Appl Toxicol  
26:20-31.
 
(17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Dostępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_bcop.htm]  
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In 
Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irri ­
tants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Dost ępne na stronie 
internetowej:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody 
badania a przyj ętymi warto ściami odniesienia. Jest to miara efektywno ści metody 
badania i jeden z aspektów jej „istotno ści”. Pojęcia tego cz ęsto używa się 
zamiennie z poj ęciem „zgodno ść” na oznaczenie odsetka prawid łowych wyników 
uzyskiwanych przy u życiu metody badania.  
Substancja wzorcowa:  substancja u żywana jako wzorzec do porówna ń z badaną 
substancją. Substancja wzorcowa powinna mie ć następujące cechy: (i) sta łe 
i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobie ństwo strukturalne i funkcjonalne do badanej 
klasy substancji; (iii) znane w łaściwości fizyczne/chemiczne; (iv) dane potwier ­
dzające występowanie znanych skutków oraz (v) znany potencja ł w zakresie 
pożądanych reakcji.  
Rogówka:  przezroczysta warstwa w przedniej cz ęści gałki ocznej, która okrywa 
tęczówkę i źrenicę oraz wpuszcza światło do wnętrza oka.  
Zmętnienie rogówki:  pomiar stopnia zm ętnienia rogówki wskutek ekspozycji na 
badaną substancj ę. Zwiększone zm ętnienie rogówki wskazuje na jej uszkodzenie. 
Zmętnienie mo żna ocenić subiektywnie, jak w przypadku testu Draize’a wyko ­
nywanego na oku królika, lub obiektywnie przy u życiu odpowiedniego narz ę­
dzia, np. „miernika zm ętnienia”.  
Przepuszczalno ść rogówki:  ilościowy pomiar szkody wyrz ądzonej w nab łonku 
przednim rogówki poprzez okre ślenie, jaka ilo ść barwnika na bazie soli sodowej 
fluoresceiny przenika przez wszystkie warstwy rogówki.  
Kategoria I EPA:  działanie żrące (nieodwracalne uszkodzenie tkanki oka) lub 
zmiany rogówkowe lub podra żnienie rogówki utrzymuj ące się dłużej niż 21 dni (1).  
Kategoria R41 UE:  spowodowanie uszkodzenia tkanki w oku lub powa żne 
fizyczne pogorszenie widzenia w nast ępstwie na łożenia badanej substancji na 
przednią powierzchni ę oka, które nie jest ca łkowicie odwracalne w ci ągu 
21 dni od na łożenia (2).  
Odsetek wyników fa łszywie ujemnych:  odsetek wszystkich obecnych substancji 
fałszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badawczej jako 
nieobecne. Jest to jeden ze wska źników efektywno ści metody badania.  
Odsetek wyników fa łszywie dodatnich:  odsetek wszystkich nieobecnych 
substancji fa łszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badaw ­
czej jako obecne. Jest to jeden ze wska źników efektywno ści metody badania.  
GHS (Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania 
Chemikaliów):  system proponuj ący klasyfikacj ę chemikaliów (substancji 
i mieszanin) wed ług znormalizowanych rodzajów i poziomów zagro żeń fizycz­
nych, zdrowotnych i środowiskowych oraz omawiaj ący odpowiednie elementy 
komunikacyjne, takie jak piktogramy, has ła ostrzegawcze, zwroty wskazuj ące 
rodzaj zagro żenia, zwroty wskazuj ące środki ostro żności i karty charakterystyki 
substancji i produktów niebezpiecznych, aby przekaza ć informacje na temat ich 
działań niepożądanych w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, 
robotników, przewo źników, konsumentów i ratowników) i środowiska (3).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 683
 
Kategoria 1 GHS:  spowodowanie uszkodzenia tkanki w oku lub powa żne 
fizyczne pogorszenie widzenia w nast ępstwie na łożenia badanej substancji na 
przednią powierzchni ę oka, które nie jest ca łkowicie odwracalne w ci ągu 
21 dni od na łożenia (3).  
Zagrożenie:  nieodłączna właściwość czynnika lub sytuacja, która mo że poten­
cjalnie doprowadzi ć do negatywnych skutków w przypadku ekspozycji orga ­
nizmu, systemu lub (sub)populacji na taki czynnik.  
Wskaźnik podra żnienia  in vitro  (IVIS):  opracowany empirycznie wzór stoso ­
wany w badaniu zm ętnienia i przepuszczalno ści rogówki u byd ła (BCOP), 
zgodnie z którym średnie warto ści zmętnienia i przepuszczalno ści dla ka żdej 
badanej grupy s ą łączone w jeden wska źnik in vitro  dla każdej badanej grupy.  
IVIS = średnia warto ść zmętnienia + (15 x średnia warto ść przepuszczalno ści). 
Kontrola negatywna:  replikat niepoddany dzia łaniu badanej substancji, zawie ­
rający wszystkie sk ładniki uk ładu badawczego. Próbka ta jest przetwarzana 
razem z próbkami poddanymi dzia łaniu badanej substancji oraz z innymi 
próbkami kontrolnymi w celu okre ślenia, czy rozpuszczalnik wchodzi 
w reakcję z układem badawczym.  
Niedrażniące: substancje, które nie zosta ły zaklasyfikowane do kategorii I, II lub 
III EPA, kategorii R41 lub R36 UE lub kategorii 1, 2A lub 2B GHS jako drażniące dla oczu.
 
Żrące dla oczu:  a) substancja, która powoduje nieodwracalne uszkodzenie tkanki 
w oku; b) substancje, które zaklasyfikowano do kategorii 1 GHS, kategorii I EPA 
lub kategorii R41 UE jako dra żniące dla oczu (1)(2)(3).  
Drażniące dla oczu:  a) substancja, która powoduje odwracaln ą zmianę w oku 
w następstwie jej na łożenia na przedni ą powierzchni ę oka; b) substancje, które 
zaklasyfikowano do kategorii II lub III EPA, kategorii R36 UE lub kategorii 2A 
lub 2B GHS jako dra żniące dla oczu (1)(2)(3).  
Silnie dra żniące dla oczu:  a) substancja, która powoduje zmian ę w oku 
w następstwie jej zaaplikowania na przedni ą powierzchni ę oka, która nie ust ępuje 
w ciągu 21 dni od na łożenia lub powoduje powa żne fizyczne pogorszenie widze ­
nia; b) substancje, które zaklasyfikowano do kategorii I GHS, kategorii I EPA lub kategorii R41 UE jako dra żniące dla oczu (1)(2)(3).
 
Miernik zm ętnienia:  narzędzie stosowane do pomiaru stopnia „zm ętnienia 
rogówki” poprzez ilo ściową ocenę przepuszczalno ści światła przez rogówk ę. 
Typowe urz ądzenie posiada dwie komory, z których ka żda ma w łasne źródło 
światła i fotokomórk ę. W jednej z komór znajduje si ę badana rogówka, natomiast 
druga jest u żywana do wzorcowania i zerowania urz ądzenia. Światło z lampy 
halogenowej jest kierowane na fotokomórk ę przez komor ę kontroln ą (pustą 
komorę bez okien i p łynu), a nast ępnie porównywane ze światłem kierowanym 
na fotokomórk ę przez komor ę doświadczaln ą, w której znajduje si ę komora 
zawierająca rogówk ę. Porównuje si ę różnicę w przepuszczalno ści światła między 
fotokomórkami, a warto ść liczbowa zm ętnienia przedstawiana jest na wy świet­
laczu cyfrowym.  
Kontrola pozytywna:  replikat zawieraj ący wszystkie sk ładniki uk ładu badaw ­
czego, który zosta ł poddany dzia łaniu substancji, o której wiadomo, że wywoła 
reakcję dodatnią. Aby zapewni ć możliwość oceny zmienno ści reakcji w kontroli 
pozytywnej w czasie, podra żnienie nie powinno by ć nadmierne.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 684
 
Wiarygodno ść: miary zakresu, w jakim metoda badania mo że zostać wykonana 
w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomi ędzy laboratoriami 
w czasie, w przypadku jej wykonywania przy u życiu tego samego protoko łu. 
Ocenia si ę ją poprzez obliczenie odtwarzalno ści wewn ątrz- 
i międzylaboratoryjnej oraz powtarzalno ści wewnątrzlaboratoryjnej.  
Kontrola z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika:  próbka niepoddana dzia ­ 
łaniu badanej substancji, zawieraj ąca wszystkie sk ładniki uk ładu badawczego, 
w tym rozpuszczalnik lub no śnik, która jest przetwarzana razem z próbkami 
poddanymi dzia łaniu badanej substancji oraz z innymi próbkami kontrolnymi 
w celu okre ślenia wyj ściowej reakcji dla próbek poddanych dzia łaniu badanej 
substancji rozpuszczonej w tym samym rozpuszczalniku lub no śniku. Jeżeli 
równocze śnie przeprowadza si ę kontrolę negatywn ą, próbka ta wykazuje 
również, czy rozpuszczalnik lub no śnik wchodzi w reakcj ę z układem badaw ­
czym.  
Badanie wielopoziomowe:  stopniowa strategia badawcza, zgodnie z któr ą 
wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji s ą analizowane na 
każdym etapie w okre ślonym porz ądku z zastosowaniem procesu uwzgl ędniają­
cego wag ę dowodów w celu okre ślenia, czy dost ępna jest wystarczaj ąca ilość 
informacji do podj ęcia decyzji o klasyfikacji zagro żenia, przed przej ściem do 
następnego etapu. Je żeli na podstawie dost ępnych informacji mo żna przypisa ć 
badanej substancji potencja ł wywołania podra żnienia, dodatkowe badania nie s ą 
potrzebne. Je żeli na podstawie dost ępnych informacji nie mo żna przypisa ć 
badanej substancji potencja łu wywołania podra żnienia, przeprowadza si ę proce­
durę stopniowych bada ń sekwencyjnych na zwierz ętach do momentu, a ż będzie 
możliwe dokonanie jednoznacznej klasyfikacji.  
Zwalidowana metoda badania:  metoda badania, w odniesieniu do której zako ń­
czono badania walidacyjne w celu okre ślenia jej istotno ści (w tym dok ładności) 
i wiarygodno ści w odniesieniu do konkretnego celu. Nale ży zauważyć, że zwali­
dowana metoda badania mo że nie wykazywa ć dostatecznej efektywno ści 
z punktu widzenia istotno ści i wiarygodno ści, aby mo żna było ją uznać za 
dopuszczaln ą w odniesieniu do danego celu.  
Waga dowodów:  proces analizowania mocnych i s łabych stron ró żnych 
elementów informacji podczas formu łowania wniosku dotycz ącego potencjalnego 
zagrożenia stwarzanego przez dan ą substancj ę oraz w celu potwierdzenia takiego 
wniosku.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 685
 
Dodatek 2  
Substancje do oceny bieg łości w odniesieniu do metody badania BCOP  
Przed rozpocz ęciem rutynowego stosowania metody badania zgodnej z niniejsz ą 
metodą badania laboratoria mog ą podjąć się wykazania swojej bieg łości tech­
nicznej prawid łowo identyfikuj ąc klasyfikacj ę stopnia dzia łania żrącego 10 
substancji wskazanych w tabeli 1. Substancje te zosta ły wybrane w taki sposób, 
by reprezentowa ły zakres reakcji na miejscowe dzia łanie drażniące/żrące dla oczu 
oparty na wynikach badania  in vivo  na oku królika (TG 405) (np. kategorie 1, 2A, 
2B lub nieklasyfikowane ani nieoznakowane zgodnie z GHS ONZ) (3)(7). Bior ąc 
pod uwag ę zwalidowan ą użyteczność tych bada ń (tj. wyłącznie do identyfiko ­
wania substancji żrących/silnie dra żniących dla oczu), istniej ą jednak tylko dwa 
wykazujące efektywno ść wyniki bada ń dla potrzeb klasyfikacji (substancja żrąca/­
drażniąca lub substancja nie żrąca/niedrażniąca). Innymi kryteriami doboru by ły: 
dostępność handlowa substancji, wysoka jako ść dostępnych danych odniesienia 
z badań in vivo  oraz istnienie wysokiej jako ści danych dotycz ących dwóch metod  
in vitro , w odniesieniu do których przygotowuje si ę wytyczne dotycz ące badań. 
Z tego powodu substancje dra żniące wybrano z zalecanego przez Mi ędzyagen­
cyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) 
wykazu 122 substancji odniesienia do walidacji metod bada ń in vitro  toksyczno ści 
dla oczu (zob. dodatek H: Zalecane substancje odniesienia ICCVAM) (5). Dane referencyjne znale źć można w dokumentach przegl ądowych ICCVAM dla metody 
badania BCOP oraz badania na izolowanym oku kurzym (ICE) (17)(18).
 
Tabela 1  
Zalecane substancje do oceny bieg łości technicznej w odniesieniu do badania BCOP  
Substancja Nr CAS Klasa chemiczna (  1 ) Stan 
skupienia Klasyfikacja  in 
vivo ( 2 ) Klasyfikacja  in vitro  ( 3 ) 
Chlorek benzalko ­
nium (5 %) 8001-54-5 Zwi ązek oniowy Ciecz Kategoria 1 Substancja żrąca/Substancja 
silnie dra żniąca 
Chloroheksydyna 55-56-1 Amina, amidyna Cia ło stałe Kategoria 1 Substancja żrąca/Substancja 
silnie dra żniąca 
Kwas dibenzoilo- 
1-winowy 2743-38-6 Kwas karboksy ­
lowy, ester Ciało stałe Kategoria 1 Substancja żrąca/Substancja 
silnie dra żniąca 
Imidazol 288-32-4 Zwi ązek hetero ­
cykliczny Ciało stałe Kategoria 1 Substancja żrąca/Substancja 
silnie dra żniąca 
Kwas trichlorooc ­
towy (30 %) 76-03-9 Kwas karboksy ­
lowy Ciecz Kategoria 1 Substancja żrąca/Substancja 
silnie dra żniąca 
Chlorek 2,6-dich ­
lorobenzoilu 4659-45-4 Halogenek acylu Ciecz Kategoria 2A Substancja nie żrąca/Sub­
stancja o s łabym dzia łaniu 
drażniącym 
2-etylo-acetylo ­
octan metylu 609-14-3 Keton, ester Ciecz Kategoria 2B Substancja nie żrąca/Sub­
stancja o s łabym dzia łaniu 
drażniącym 
Azotan amonu 6484-52-2 Sól nieorga ­
niczna Ciało stałe Kategoria 2A Substancja nie żrąca/Sub­
stancja o s łabym dzia łaniu 
drażniącym ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Substancja Nr CAS Klasa chemiczna (  1 ) Stan 
skupienia Klasyfikacja  in 
vivo ( 2 ) Klasyfikacja  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Alkohol Ciecz Nieoznakowana Substancja nie żrąca/Sub­
stancja o s łabym dzia łaniu 
drażniącym 
n-heksan 110-54-3 W ęglowodór 
(acykliczny) Ciecz Nieoznakowana Substancja nie żrąca/Sub­
stancja o s łabym dzia łaniu 
drażniącym  
Skróty: Nr CAS = numer w Chemical Abstracts Service 
( 1 ) Klasy chemiczne przypisano do ka żdej badanej substancji z zastosowaniem standardowego schematu klasyfikacji w oparciu 
o system klasyfikacji Medical Subject Headings (MeSH) opracowany przez National Library of Medicine (Krajow ą Bibliotek ę 
Medyczną) (dostępny pod adresem http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) W oparciu o wyniki badania  in vivo  na oku królika (OECD TG 405) i z zastosowaniem GHS ONZ (3)(7). 
( 3 ) W oparciu o wyniki bada ń BCOP i ICE.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Dodatek 3  
POJEMNIK NA ROGÓWK Ę W BADANIU BCOP  
1. Pojemniki na rogówk ę stosowane w badaniu BCOP wykonane s ą z materia łu 
obojętnego (np. polipropylenu). Pojemnik sk łada się z dwóch po łówek (komory 
przedniej i tylnej) i ma dwie podobne do siebie komory wewn ętrzne w kszta łcie 
cylindrycznym. Ka żda komora mie ści 5 ml cieczy i ko ńczy się szklanym 
okienkiem, poprzez które mo żna dokona ć pomiaru zm ętnienia. Ka żda 
z komór wewn ętrznych ma 1,7 cm średnicy i 2,2 cm g łębokości (  1 ). Pierścień 
uszczelniaj ący typu „O” umieszczony na komorze tylnej ma zapobiega ć wycie­
kom. Rogówki umieszcza si ę stroną z nabłonkiem tylnym do do łu na 
pierścieniu tylnej komory, za ś komorę przednią umieszcza si ę na stronie 
z nabłonkiem przednim. Komory utrzymywane s ą w miejscu przez trzy 
śruby ze stali nierdzewnej umieszczone na zewn ętrznych kraw ędziach komór. 
Na końcu każdej komory znajduje si ę szklane okienko, które mo żna zdemon ­
tować w celu uzyskania łatwego dost ępu do rogówki. Pomi ędzy szklanym 
okienkiem a komor ą umieszczony jest równie ż pierścień uszczelniaj ący typu 
„O” zapobiegaj ący wyciekom. Dwa otwory na szczycie ka żdej komory umo ż­
liwiają wprowadzanie i usuwanie pod łoża i badanych zwi ązków. Otwory te s ą 
zamknięte gumowymi korkami w czasie badania i w okresie inkubacji.
  
Glosariusz:  
Glass disc: Kr ążek szklany  
PTFE-O-ring: Pier ścień uszczelniaj ący typu „O” z politetrafluoroetylenu  
Refill: Zasobnik  
Hanger: Wieszak  
Cap: Nak ładka  
Nut: Nakr ętka 
O-ring: Pier ścień uszczelniaj ący typu „O”  
Posterior compartment: Komora tylna  
Anterior compartment: Komora przednia  
Fixing screws: Śruby podtrzymuj ące ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Podane wymiary oparte s ą na wymiarach pojemników na rogówk ę stosowanych 
w przypadku krów w wieku od 12 do 60 miesi ęcy. W przypadku zwierz ąt w wieku 
6–12 miesi ęcy pojemnik powinien by ć tak zaprojektowany, aby komora mia ła pojemno ść 
4 ml, zaś każda z komór wewn ętrznych mia ła średnicę 1,5 cm oraz g łębokość 2,2 cm. 
W przypadku projektowania nowego pojemnika na rogówk ę należy pamiętać, że 
stosunek wielko ści eksponowanej powierzchni rogówki do pojemno ści komory powinien 
być taki sam jak w tradycyjnym pojemniku. Konieczne jest zapewnienie prawid łowego 
określenia warto ści przepuszczalno ści na potrzeby obliczenia IVIS przez zastosowanie 
proponowanego wzoru.
 MIERNIK ZM ĘTNIENIA  
2. Miernik zm ętnienia jest to urz ądzenie służące do pomiaru przepuszczal ­
ności światła. Światło z lampy halogenowej jest kierowane na fotokomórk ę 
przez komor ę kontroln ą (pustą komorę bez okien i p łynu), a nast ępnie 
porównywane ze światłem kierowanym na fotokomórk ę przez komor ę 
doświadczaln ą, w której znajduje si ę komora zawieraj ąca rogówk ę. Porów­
nuje się różnicę w przepuszczalno ści światła między fotokomórkami, 
a wartość liczbowa zm ętnienia przedstawiana jest na wy świetlaczu cyfro ­
wym. Ustala si ę jednostki zm ętnienia.  
3. Miernik zm ętnienia powinien dawa ć liniową odpowied ź złożoną 
z pojedynczych odczytów zm ętnienia obejmuj ących punkty odci ęcia stoso­
wane w ró żnych klasyfikacjach opisanych w modelu predykcyjnym (tj. do 
punktu odci ęcia wskazuj ącego na dzia łanie żrące/silnie dra żniące). W celu 
zapewnienia dok ładnych liniowych odczytów do 75-80 jednostek zm ęt­
nienia konieczne jest przeprowadzenia wzorcowania miernika przy u życiu 
kilku kalibratorów. Kalibratory (nieprzezroczyste arkusze poliestru) umiesz ­
czane są w komorze kalibracyjnej (komorze na rogówk ę przeznaczonej do 
umieszczenia kalibratorów) i odczytywane na mierniku zm ętnienia. Komora 
wzorcująca jest przeznaczona do umieszczenia kalibratorów w przybli żeniu 
w takiej samej odleg łości od źródła światła i fotokomórki, w jakiej zloka ­
lizowane b ędą rogówki podczas pomiaru zm ętnienia. Miernik zm ętnienia 
wzorcuje si ę najpierw na 0 jednostek zm ętnienia przy u życiu komory wzor ­
cującej bez kalibratora. Nast ępnie w komorze wzorcuj ącej umieszcza si ę 
pojedynczo ró żne kalibratory i dokonuje pomiaru zm ętnienia. Kalibratory 1, 
2 i 3 powinny dawa ć odczyty zm ętnienia równe ich ustalonym warto ściom 
odpowiednio 75, 150 i 225 jednostek zm ętnienia, ± 5 %.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B. 48  METODA BADANIA NA IZOLOWANYM OKU KURZYM DO 
CELÓW IDENTYFIKACJI SUBSTANCJI ŻRĄCYCH I SILNIE 
DRAŻNIĄCYCH DLA OCZU  
WPROWADZENIE  
01. Metoda badania na izolowanym oku kurzym (ICE) jest metod ą badania  in 
vitro , którą można stosowa ć w niektórych okoliczno ściach i przy okre ślo­
nych ograniczeniach w celu zaklasyfikowania substancji i mieszanin jako 
„żrące i silnie dra żniące dla oczu” (1)(2)(3). Dla celów niniejszej metody 
badania substancje silnie dra żniące oznaczaj ą substancje, które wywo łują 
zmiany oczne utrzymuj ące się u królika przez co najmniej 21 dni od 
podania tych substancji. Chocia ż uważa się, że badanie ICE nie mo że 
całkowicie zast ąpić badania  in vivo  na oku królika, zaleca si ę jego stoso ­
wanie w ramach strategii bada ń wielopoziomowych do celów klasyfikacji 
regulacyjnej i oznakowania w ramach okre ślonej dziedziny zastosowania 
(4)(5). Badane substancje i mieszaniny (6), które w tym badaniu daj ą wyniki 
dodatnie, mo żna zaklasyfikowa ć jako żrące lub silnie dra żniące dla oczu bez 
przeprowadzania dodatkowych bada ń na królikach. Substancj ę, która daje 
ujemny wynik w badaniu, nale ży zbadać na królikach za pomoc ą strategii 
badań sekwencyjnych, zgodnie z wytycznymi OECD dotycz ącymi bada ń 
405 (7) (rozdzia ł B. 5 niniejszego za łącznika).  
02. Niniejsza metoda badania ma na celu opisanie procedur stosowanych do 
oceny potencjalnego dzia łania żrącego lub silnie dra żniącego dla oczu 
badanej substancji, okre ślanego na podstawie jej potencja łu oddziaływania 
toksycznego na enukleowane oko kurze. Toksyczne oddzia ływanie na 
rogówkę mierzy si ę przy zastosowaniu (i) jako ściowej oceny zm ętnienia, 
(ii) jakościowej oceny uszkodzenia nab łonka przedniego poprzez zaapliko ­
wanie fluoresceiny na oko (zatrzymanie fluoresceiny), (iii) ilo ściowego 
pomiaru zwi ększonej grubo ści (obrzęku) oraz (iv) jako ściowej oceny makro ­
skopowych uszkodze ń morfologicznych powierzchni. Oceny zm ętnienia 
rogówki, obrz ęku i uszkodze ń po ekspozycji na badan ą substancj ę dokonuje 
się indywidualnie, a nast ępnie łączy się je w celu otrzymania Klasyfikacji 
Działania Drażniącego dla Oczu.  
03. Metod ę badania ICE stosuje si ę również do badania substancji dra żniących 
dla oczu wywo łujących zmiany, które ust ępują w ciągu 21 dni, oraz 
substancji niedra żniących. Dok ładność i wiarygodno ść metody badania 
ICE w odniesieniu do substancji w tych kategoriach nie zosta ła jednak 
formalnie oceniona.  
04. Definicje podano w dodatku 1.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
05. Niniejsza metoda badania opiera si ę na protokole metody badania ICE 
Międzyagencyjnego Komitetu Koordynacyjnego ds. Uznawania Metod 
Alternatywnych (ICCVAM) (8), który opracowano na podstawie mi ędzyna­
rodowego badania walidacyjnego (4)(5)(9), przy udziale Europejskiego 
Centrum Uznawania Metod Alternatywnych, Japo ńskiego Centrum Uzna ­
wania Metod Alternatywnych oraz Departamentu Jako ści Życia Dzia łu 
Toksykologii i Farmakologii Stosowanej TNO (Niderlandy). Protokó ł opiera 
się na informacjach uzyskanych z opublikowanych protoko łów oraz bie ż­ 
ących protoko łów stosowanych przez TNO (10)(11)(12)(13)(14).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
06. Zidentyfikowane ograniczenia niniejszej metody badania opieraj ą się na 
odsetku wyników fa łszywie dodatnich w przypadku alkoholi oraz odsetku 
wyników fa łszywie ujemnych w przypadku cia ł stałych i substancji 
powierzchniowo czynnych (zob. pkt 47) (4). Je żeli z bazy danych wy łączy 
się powyższe klasy chemiczne i fizyczne, dok ładność badania ICE 
w systemach klasyfikacji UE, EPA i GHS znacznie si ę poprawia (4). Ze 
względu na cel niniejszego badania (tj. zidentyfikowanie wy łącznie 
substancji żrących/silnie dra żniących dla oczu) odsetek wyników fa łszywie 
ujemnych nie ma decyduj ącego znaczenia, poniewa ż substancje takie 
zostaną następnie zbadane na królikach lub za pomoc ą innych odpowiednio 
zwalidowanych bada ń in vitro , w zależności od wymogów okre ślonych 
w przepisach, przy zastosowaniu strategii bada ń sekwencyjnych zgodnie 
z podejściem opartym na analizie wagi dowodów. Ponadto obecna baza 
danych walidacyjnych nie pozwala na odpowiedni ą ocenę niektórych klas 
chemicznych lub produktowych (np. mieszanin). Osoby przeprowadzaj ące 
badanie mog ą jednak rozwa żyć zastosowanie niniejszej metody badania 
w odniesieniu do wszystkich rodzajów materia łu (w tym mieszanin), 
w przypadku którego wynik dodatni mo żna zaakceptowa ć jako wskazuj ący 
na działanie żrące lub silnie dra żniące dla oczu. Dodatnie wyniki uzyskane 
w przypadku alkoholi nale ży jednak interpretowa ć z ostro żnością ze 
względu na ryzyko ich zawy żenia.  
07. Wszystkie procedury przeprowadzane z wykorzystaniem oczu kurzych 
powinny przebiega ć zgodnie z regulaminami i procedurami post ępowania 
z materia łem pozyskanym od ludzi lub zwierz ąt, który obejmuje m.in. 
tkanki i p łyny tkankowe, obowi ązującymi w placówce przeprowadzaj ącej 
badanie. Zaleca si ę przestrzeganie ogólnych środków ostro żności dla labo ­
ratoriów (15).  
08. Ograniczeniem niniejszej metody badania jest fakt, że chociaż uwzględnia 
się w niej niektóre skutki dla oczu oceniane przy zastosowaniu metody 
badania podra żnienia oczu królika i w pewnym zakresie stopie ń tych 
podrażnień, nie bierze si ę w niej pod uwag ę uszkodze ń spojówki 
i tęczówki. Ponadto, chocia ż w badaniu ICE nie mo żna ocenić odwracal ­
ności zmian w rogówce samych w sobie, zaproponowano, na podstawie 
badań oczu królika, mo żliwość zastosowania oceny pocz ątkowego stadium 
uszkodzenia rogówki w celu rozró żnienia mi ędzy skutkami nieodwracal ­
nymi i odwracalnymi (16). Badanie ICE nie pozwala te ż na ocenę poten­
cjalnej toksyczno ści systemowej zwi ązanej z ekspozycj ą oczu.  
09. Podejmowane s ą starania w celu dok ładniejszego scharakteryzowania przy ­
datności i ogranicze ń badania ICE w odniesieniu do identyfikowania 
substancji, które nie s ą silnie dra żniące, i substancji niedra żniących (zob. 
również pkt 48). U żytkowników zach ęca się również do przekazywania 
próbek lub danych organizacjom walidacyjnym w celu przeprowadzenia formalnej oceny mo żliwych przysz łych zastosowa ń metody badania ICE, 
w tym do identyfikacji substancji o s łabym dzia łaniu dra żniącym 
i substancji niedra żniących.
 
10. W ka żdym laboratorium zaczynaj ącym przeprowadzanie tego badania 
należy zastosowa ć chemikalia przeznaczone do oceny bieg łości wymienione 
w dodatku 2. Laboratorium mo że stosowa ć te chemikalia w celu wykazania 
swojej bieg łości technicznej w zakresie przeprowadzania badania metod ą 
ICE przed przedstawieniem danych z badania ICE do celów regulacyjnej klasyfikacji zagro żeń.
 
ZASADA BADANIA  
11. Metoda badania ICE jest modelem organotypicznym, który zapewnia krót ­
kotrwałe zachowanie oka kurzego  in vitro . Uszkodzenia spowodowane 
badaną substancj ą ocenia si ę w ramach tej metody badania na podstawie 
obrzęku i zmętnienia rogówki oraz zatrzymania fluoresceiny. Podczas gdy 
dwa ostatnie parametry wymagaj ą oceny jako ściowej, analiza obrz ęku 
rogówki stanowi ocen ę ilościową. Każdy pomiar przelicza si ę na wynik 
ilościowy stosowany do obliczania ogólnego wska źnika podra żnienia lub 
też przypisuje si ę mu kategori ę jakościową stosowan ą do przypisania kate ­
gorii w klasyfikacji  in vitro  działania żrącego i dra żniącego dla oczu. Ka żdy 
z tych wyników mo żna następnie zastosowa ć do przewidzenia potencjalnego 
działania żrącego lub dra żniącego dla oczu  in vivo  (zob. kryteria decyzji).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Pochodzenie i wiek oczu kurzych  
12. Oczy do niniejszego badania pobiera si ę tradycyjnie od kurcz ąt uzyskiwa ­
nych z rze źni, w której s ą one poddawane ubojowi na potrzeby spo życia 
przez ludzi, co eliminuje konieczno ść wykorzystywania zwierz ąt laborato ­
ryjnych. Stosuje si ę wyłącznie oczy zwierz ąt zdrowych, które uznano za 
odpowiednie do wprowadzenia do łańcucha żywnościowego cz łowieka.  
13. Chocia ż nie przeprowadzono badania z grup ą kontroln ą w celu oceny opty ­
malnego wieku kurcz ąt, wiek i masa kurcz ąt wykorzystywanych dotychczas 
do niniejszego badania odpowiadaj ą młodym kurcz ętom tradycyjnie prze ­
twarzanym przez rze źnie drobiu (tzn. ok. 7 tygodni, 1,5-2,5 kg).  
Pobieranie oczu i transport do laboratorium  
14. Głowy nale ży usunąć natychmiast po u śmierceniu kurcz ąt (najczęściej przy 
użyciu wstrz ąsu elektrycznego) i naci ęciu szyi w celu wywo łania krwawie ­
nia. Nale ży zapewni ć lokalne źródło kurcząt, zlokalizowane blisko labora ­
torium, tak by g łowy zwierz ąt mogły zostać przetransportowane z rze źni do 
laboratorium na tyle szybko, żeby zminimalizowa ć możliwość pogorszenia 
stanu oczu lub ska żenia bakteriami. Nale ży zminimalizowa ć odstęp czasu 
między pobraniem g łów kurcz ąt i użyciem oczu w badaniu ICE (zwykle do 
dwóch godzin) oraz wykaza ć, że nie wp łynie on negatywnie na wyniki 
badania. Wyniki badania opieraj ą się na kryteriach doboru oczu, jak równie ż 
na reakcjach w ramach kontroli pozytywnej i negatywnej. Wszystkie oczy 
wykorzystane w badaniu powinny pochodzi ć z tej samej grupy oczu pobra ­
nych danego dnia.  
15. Poniewa ż oczy wycina si ę w laboratorium, g łowy w stanie nienaruszonym 
są transportowane z rze źni w temperaturze otoczenia, w plastikowych 
pojemnikach nawil żanych r ęcznikami zmoczonymi w izotonicznym 
roztworze soli.  
Kryteria doboru oczu zastosowane w badaniu ICE  
16. Odrzuca si ę oczy wykazuj ące po enukleacji wysoki poziom wybarwienia 
fluorescein ą (tzn. > 0,5) lub zm ętnienia rogówki (tzn. > 0,5).  
17. Każda badana grupa oraz grupa równoczesnej kontroli pozytywnej sk łada 
się z co najmniej trojga oczu. Grupa kontroli negatywnej lub kontroli 
z zastosowaniem rozpuszczalnika (w przypadku stosowania rozpuszczalnika innego ni ż roztwór soli) sk łada się z co najmniej jednego oka.
 
PROCEDURA  
Przygotowanie oczu  
18. Powieki wycina si ę ostrożnie, tak aby nie uszkodzi ć rogówki. Szybkiej 
oceny, czy rogówka jest nienaruszona, dokonuje si ę poprzez wkroplenie 
2 % (w/v) soli sodowej fluoresceiny na powierzchni ę rogówki na kilka 
sekund, a nast ępnie przemycie rogówki izotonicznym roztworem soli. 
Oczy poddane dzia łaniu fluoresceiny bada si ę następnie przy u życiu mikro ­
skopu z lamp ą szczelinow ą w celu zagwarantowania, że rogówka nie jest 
uszkodzona (tzn. że wyniki zatrzymania fluoresceiny oraz zm ętnienia ≤ 0,5).  
19. Jeżeli oko nie jest uszkodzone, wycina si ę je całkowicie z czaszki, staraj ąc 
się nie uszkodzi ć rogówki. Ga łkę oczną wyciąga się z oczodo łu przytrzy ­
mując mocno migotk ę szczypczykami chirurgicznymi, za ś mięśnie oka 
odcina się przy użyciu zagi ętych tępo zakończonych no życzek. Nie mo żna 
dopuścić do powstania uszkodze ń rogówki poprzez wywieranie na ni ą 
nadmiernego nacisku (tj. stosowania urz ądzeń kompresyjnych).  
20. Po wyj ęciu gałki ocznej z oczodo łu należy pozostawi ć przyczepion ą 
widoczną część nerwu wzrokowego. Po wyj ęciu z oczodo łu oko umieszcza 
się na podk ładce chłonnej i odcina si ę migotkę i inne tkanki łączne. ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Poddane enukleacji oko umieszcza si ę w uchwycie ze stali nierdzewnej, 
przy rogówce ustawionej pionowo. Uchwyt przenosi si ę następnie do 
komory urz ądzenia do przep łukiwania (16). Uchwyty nale ży umieścić 
w urządzeniu do przep łukiwania w taki sposób, by na ca łą rogówkę kapał 
izotoniczny roztwór soli. Komory urz ądzenia do przep łukiwania powinny 
utrzymywa ć temperatur ę 32 ± 1,5 °C. Dodatek 3 zawiera schemat budowy 
typowego urz ądzenia do przep łukiwania i uchwytów na oczy, które mo żna 
nabyć na rynku lub zbudowa ć samodzielnie. Urz ądzenie mo żna tak zmody ­
fikować, aby spe łniało potrzeby konkretnego laboratorium (np. poprzez 
dostosowanie liczby oczu).  
22. Po umieszczeniu w urz ądzeniu do przep łukiwania oczy bada si ę ponownie 
przy użyciu mikroskopu z lamp ą szczelinow ą w celu sprawdzenia, czy nie 
zostały one uszkodzone podczas procedury wycinania. W tym momencie 
należy również zmierzyć grubość rogówki na jej wierzcho łku przy zastoso ­
waniu urz ądzenia do pomiaru g łębokości połączonego z mikroskopem 
z lampą szczelinow ą. Należy zastąpić oczy (i) o wyniku zatrzymania fluo ­
resceiny > 0,5; (ii) o zm ętnieniu rogówki > 0,5 lub (iii) nosz ące jakiekol ­
wiek ślady uszkodzenia. Oczy, które nie zosta ły odrzucone ze wzgl ędu na 
jedno z powy ższych kryteriów, nale ży odrzuci ć jeśli grubość ich rogówki 
różni się o ponad 10 % od średniej warto ści dla wszystkich oczu. U żyt­
kownicy powinni by ć świadomi, że mikroskopy z lampami szczelinowymi 
mogą dawać różne wyniki pomiaru grubo ści rogówki, je śli stosuje si ę różne 
ustawienia szczeliny. Szeroko ść szczeliny powinna wynosi ć 0,095 mm.  
23. Po zbadaniu i dopuszczeniu wszystkich oczu s ą one inkubowane przez ok. 
45 do 60 minut w celu zrównowa żenia ich z uk ładem badawczym przed 
dawkowaniem substancji. Po okresie inkubacji rejestruje si ę zerowy pomiar 
referencyjny grubo ści rogówki i jej zm ętnienia, który s łuży jako punkt 
odniesienia (tj. czas = 0). Wynik pomiaru fluoresceiny okre ślony 
w momencie wycinania stosuje si ę jako pomiar odniesienia dla tego punktu 
końcowego.  
Podanie substancji badanej  
24. Natychmiast po dokonaniu zerowych pomiarów referencyjnych oko (w 
pojemniku) wyjmuje si ę z urządzenia do przep łukiwania i ustawia 
w pozycji poziomej, a na rogówk ę aplikuje si ę badaną substancj ę. 
25. Substancje ciek łe bada si ę zwykle w stanie nierozcie ńczonym, mo żna je 
jednak w razie potrzeby rozcie ńczyć (np. w cz ęści badania). Preferowanym 
rozpuszczalnikiem w przypadku substancji rozcie ńczanych jest sól fizjolo ­
giczna. Mo żna jednak stosowa ć również alternatywne rozpuszczalniki 
w kontrolowanych warunkach badania, ale zasadno ść zastosowania rozpusz ­
czalników innych ni ż sól fizjologiczna nale ży udowodni ć. 
26. Badane substancje ciek łe aplikuje si ę na rogówk ę w taki sposób, by ca ła 
powierzchnia rogówki by ła równomiernie pokryta badan ą substancj ą; stan­
dardowa ilo ść wynosi 0,03 ml.  
27. Ciała stałe należy w miar ę możliwości jak najdok ładniej rozdrobni ć 
w moździerzu lub podobnym urz ądzeniu rozdrabniaj ącym. Proszek nale ży 
zaaplikowa ć na rogówk ę w taki sposób, by jej powierzchnia by ła równo­
miernie pokryta badan ą substancj ą; standardowa ilo ść wynosi 0,03 g.  
28. Badan ą substancj ę (ciecz lub cia ło stałe) pozostawia si ę przez 10 sekund, 
a następnie zmywa z oka izotonicznym roztworem soli (w ilo ści ok. 20 ml) 
w temperaturze otoczenia. Oko (w pojemniku) umieszcza si ę następnie 
ponownie w urz ądzeniu do przep łukiwania w pierwotnej pozycji pionowej.  
Substancje kontrolne  
29. Każde doświadczenie powinno obejmowa ć równoczesn ą kontrolę negatywn ą 
lub kontrol ę z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika i kontrol ę pozy­
tywną. ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. W przypadku badania cieczy o st ężeniu 100 % lub cia ł stałych w metodzie 
badania ICE jako równoczesn ą kontrolę negatywn ą stosuje si ę sól fizjolo ­
giczną w celu wykrycia niespecyficznych zmian w uk ładzie badawczym 
i zagwarantowania, że warunki badania nie wywo łują w niewłaściwy sposób 
reakcji w postaci podra żnienia.  
31. W przypadku badania cieczy rozcie ńczonych w metodzie badania 
uwzględnia się równoczesn ą kontrolę z zastosowaniem rozpuszczalnika/ ­
nośnika w celu wykrycia niespecyficznych zmian w uk ładzie badawczym 
i zagwarantowania, że warunki badania nie wywo łują w niewłaściwy sposób 
reakcji w postaci podra żnienia. Jak stwierdzono w pkt 25 mo żna stosowa ć 
jedynie rozpuszczalnik/no śnik, w odniesieniu do którego wykazano, że nie 
wpływa negatywnie na uk ład badawczy.  
32. W ka żdym doświadczeniu uwzgl ędnia się substancj ę o znanym dzia łaniu 
drażniącym dla oczu s łużącą do przeprowadzenia równoczesnej kontroli 
pozytywnej w celu zweryfikowania, czy wywo łana została właściwa reakcja. 
Ponieważ w niniejszej metodzie badania stosuje si ę badanie ICE w celu 
zidentyfikowania substancji żrących i silnie dra żniących, w idealnej sytuacji 
do kontroli pozytywnej powinna by ć użyta substancja referencyjna, która 
wywołuje silną reakcję w tej metodzie badania. Aby jednak zapewni ć możli­
wość oceny zmienno ści reakcji w kontroli pozytywnej w czasie, podra ż­
nienie nie powinno by ć nadmierne. Nale ży wyprodukowa ć wystarczaj ące 
dane  in vitro  do kontroli pozytywnej, aby mo żna było obliczy ć określony 
statystycznie dopuszczalny zakres kontroli pozytywnej. Je żeli dla konkretnej 
kontroli pozytywnej nie istniej ą odpowiednie dane historyczne z bada ń ICE, 
może zajść konieczno ść przeprowadzenia bada ń w celu dostarczenia tych 
informacji.  
33. Do celów kontroli pozytywnej w przypadku badanych cieczy mo żna zasto­
sować na przyk ład 10 % kwas octowy lub 5 % roztwór chlorku benzalko ­
nium, zaś do kontroli pozytywnej dla badanych cia ł stałych - na przyk ład 
wodorotlenek sodu lub imidazol.  
34. Substancje wzorcowe s ą przydatne do oceny potencjalnego dzia łania draż­
niącego dla oczu nieznanych chemikaliów z okre ślonej klasy chemicznej lub 
produktowej lub do oceny wzgl ędnego potencjalnego dzia łania drażniącego 
substancji dra żniącej dla oczu w okre ślonym zakresie reakcji w postaci 
podrażnienia.  
Pomiar punktów ko ńcowych  
35. Rogówki poddane dzia łaniu badanej substancji ocenia si ę przed podaniem 
tej substancji, a nast ępnie po 30, 75, 120, 180 i 240 minutach (± 5 minut) 
od płukania po podaniu substancji badanej. Te punkty czasowe zapewniaj ą 
odpowiedni ą liczbę pomiarów w trakcie czterogodzinnego okresu badania, 
pozostawiaj ąc jednocze śnie odpowiedni ą ilość czasu pomi ędzy pomiarami 
na dokonanie koniecznych obserwacji wszystkich oczu.  
36. Oceniane punkty ko ńcowe to zm ętnienie rogówki, obrz ęk, zatrzymanie fluo ­
resceiny i zmiany morfologiczne (np. w żery lub rozlu źnienie nab łonka 
przedniego). Wszystkie punkty ko ńcowe, z wyj ątkiem zatrzymania fluores ­
ceiny (które okre śla się wyłącznie przed poddaniem materia łu działaniu 
badanej substancji oraz 30 minut po nim), ustalane s ą we wszystkich 
wymienionych punktach czasowych.  
37. Zaleca si ę wykonanie fotografii celem udokumentowania zm ętnienia 
rogówki, zatrzymania fluoresceiny, zmian morfologicznych oraz histopato ­
logii, jeśli jest przeprowadzana.  
38. Zach ęca się użytkowników, by po ostatniej ocenie po czterech godzinach 
zachowali oczy w odpowiednim środku utrwalaj ącym (np. oboj ętnej bufo ­
rowanej formalinie) na potrzeby ewentualnego badania histopatologicznego.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Obrz ęk rogówki okre śla się na podstawie pomiaru grubo ści rogówki doko ­
nywanego przy u życiu pachymetru optycznego w mikroskopie z lamp ą 
szczelinow ą. Wartość tę wyraża się procentowo i oblicza si ę ją na podstawie 
pomiarów grubo ści rogówki wed ług poniższego wzoru: 
" 
grubo ść rogowki wczasie t  Ä grubo ść rogowki wczasie t  ¼ 0 
grubo ść rogowki wczasie ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Średnią wartość procentow ą obrzęku rogówki we wszystkich oczach 
poddanych badaniu oblicza si ę w oparciu o wszystkie punkty czasowe 
obserwacji. W oparciu o najwy ższy średni wynik obrz ęku rogówki zaobser ­
wowany w dowolnym punkcie czasowym podaje si ę ogólny wynik dla 
kategorii w odniesieniu do ka żdej badanej substancji.  
41. Zmętnienie rogówki oblicza si ę przy zastosowaniu najbardziej zm ętniałej 
powierzchni rogówki. Średnią wartość procentow ą zmętnienia rogówki we 
wszystkich oczach poddanych badaniu oblicza si ę w oparciu o wszystkie 
punkty czasowe obserwacji. W oparciu o najwy ższy średni wynik zm ęt­
nienia rogówki zaobserwowany w dowolnym punkcie czasowym podaje się ogólny wynik dla kategorii w odniesieniu do ka żdej badanej substancji 
(tabela 1).
 
Tabela 1  
Wyniki oceny zm ętnienia rogówki  
Wynik Obserwacja  
0 Brak zm ętnienia 
0,5 Nieznaczne zm ętnienie 
1 Obszary pojedyncze lub rozproszone; elementy t ęczówki są wyraźnie widoczne 
2 Obszar pó łprzezroczysty jest wyra źnie widoczny; elementy t ęczówki s ą nieco 
zamazane 
3 Powa żne zmętnienie rogówki; nie s ą widoczne żadne konkretne elementy 
tęczówki; bardzo trudno jest okre ślić wielkość źrenicy 
4 Ca łkowite zm ętnienie rogówki; t ęczówka jest niewidoczna  
42. Średni poziom zatrzymania fluoresceiny we wszystkich badanych oczach 
oblicza si ę wyłącznie w punkcie czasowym po 30 minutach; warto ść tę 
stosuje si ę do określenia ogólnego wyniku dla kategorii w odniesieniu do 
każdej badanej substancji (tabela 2).  
Tabela 2  
Wyniki zatrzymania fluoresceiny  
Wynik Obserwacja  
0 Brak zatrzymania fluoresceiny 
0,5 Nieznaczne wybarwienie pojedynczych komórek 
1 Wybarwienie pojedynczych komórek rozproszone na ca łym obszarze rogówki 
poddanym dzia łaniu substancji 
2 Ogniskowe lub łączące się zwarte wybarwienie pojedynczych komórek 
3 Łączące się duże obszary rogówki zatrzymuj ą fluorescein ę ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 695
 
43. Zmiany morfologiczne obejmuj ą „wżery” komórek nab łonka przedniego, 
„rozluźnienie” nab łonka przedniego, „stwardnienie” powierzchni rogówki 
oraz „przyleganie” badanej substancji do rogówki. Ustalenia te mog ą się 
różnić między sobą stopniem zaawansowania i mog ą występować jedno­
cześnie. Klasyfikacja tych ustale ń jest subiektywna i zale żna od interpretacji 
osoby badaj ącej. 
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Ocena danych  
44. Wyniki badania zm ętnienia rogówki, obrz ęku rogówki i zatrzymania fluo ­
resceiny nale ży ocenia ć osobno, tak aby wygenerowa ć klasę ICE dla 
każdego punktu ko ńcowego. Klasy ICE w odniesieniu do ka żdego punktu 
końcowego s ą następnie łączone w celu uzyskania Klasyfikacji Dzia łania 
Drażniącego dla Oczu dla ka żdej badanej substancji.  
Kryteria decyzji  
45. Po dokonaniu oceny ka żdego punktu ko ńcowego mo żna przypisa ć klasy 
ICE w oparciu o wcze śniej ustalony zakres. Interpretacji wyników grubo ści 
rogówki (tabela 3), zm ętnienia (tabela 4) i zatrzymania fluoresceiny (tabela 
5) z zastosowaniem czterech klas ICE dokonuje si ę na podstawie nast ępuj­ 
ących skal:  
Tabela 3  
Kryteria klasyfikacji ICE w odniesieniu do grubo ści rogówki  
Średni obrz ęk rogówki (%) (*) Klasa ICE  
0–5 I 
> 5–12 II 
> 12–18 (> 75 min po podaniu substancji) II 
> 12–18 ( ≤ 75 min po podaniu substancji) III 
> 18–26 III 
> 26–32 (> 75 min po podaniu substancji) III 
> 26–32 ( ≤ 75 min po podaniu substancji) IV 
> 32 IV  
(*) Wyniki dotycz ące obrzęku rogówki maj ą zastosowanie, wy łącznie jeżeli jej grubo ść mierzy si ę przy 
użyciu mikroskopu z lampa szczelinow ą Haag-Streit BP900 z urz ądzeniem pomiarowym nr I, przy 
ustawieniu szczeliny na 9½, co odpowiada 0,095 mm. U żytkownicy powinni by ć świadomi, że mikro­
skopy z lampami szczelinowymi mog ą dawać różne wyniki pomiaru grubo ści rogówki, je żeli stosuje si ę 
różne ustawienia szczeliny.  
Tabela 4  
Kryteria klasyfikacji ICE w odniesieniu do zm ętnienia  
Średni maksymalny wynik zm ętnienia (*) Klasa ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 
1,6-2,5 III 
2,6-4,0 IV  
(*) Zob. tabela 1.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Tabela 5  
Kryteria klasyfikacji ICE w odniesieniu do zatrzymania fluoresceiny  
Średni wynik zatrzymania fluoresceiny 30 minut po 
podaniu substancji (*) Klasa ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 
2,6-3,0 IV
 
(*) Zob. tabela 2.  
46. Ogóln ą klasyfikacj ę działania drażniącego  in vitro  badanej substancji ocenia 
się poprzez odczyt kategorii dzia łania dra żniącego odpowiadaj ącej 
połączeniu kategorii otrzymanych w odniesieniu do obrz ęku rogówki, zm ęt­
nienia rogówki i zatrzymania fluoresceiny oraz zastosowanie schematu przedstawionego w tabeli 6.
 
Tabela 6  
Ogólna klasyfikacja dzia łania drażniącego  in vitro  
Kategoria Po łączenie 3 punktów ko ńcowych  
Substancja o dzia łaniu żrącym / silnie dra ż­
niącym 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 
2 × IV, 1 × I (*) 
Zmętnienie rogówki ≥ 3 po 30 min (w przynaj ­
mniej 2 oczu) Zmętnienie rogówki = 4 po 30 min (w przynaj ­
mniej 2 oczu) 
Znaczne rozlu źnienie nab łonka przedniego 
(w przynajmniej 1 oku)
 
(*) Mniej prawdopodobne po łączenia.  
47. Zgodnie z tre ścią pkt 1, jeżeli badana substancja nie zosta ła zidentyfikowana 
jako żrąca lub silnie dra żniąca dla oczu, nale ży przeprowadzi ć dodatkowe 
badanie do celów klasyfikacji i oznakowania. Metoda badania ICE wyka ­
zuje ogóln ą dokładność od 83 % (120/144) do 87 % (134/154), odsetek 
wyników fa łszywie dodatnich od 6 % (7/122) do 8 % (9/116), odsetek 
wyników fa łszywie ujemnych od 41 % (13/32) do 50 % (15/30) 
w odniesieniu do identyfikacji substancji żrących i silnie dra żniących dla 
oczu w porównaniu do danych uzyskanych w wyniku metody badania  in 
vivo na oku królika, sklasyfikowanych zgodnie z systemami klasyfikacji 
EPA (1), UE (2) lub GHS (3). Je żeli substancje nale żące do okre ślonych 
klas chemicznych (tj. alkohole i substancje powierzchniowo czynne) lub fizycznych (tj. cia ła stałe) są wyłączone z bazy danych, dok ładność badania 
ICE wg systemów klasyfikacji UE, EPA i GHS wynosi od 91 % (75/82) do 
92 % (69/75), odsetek wyników fa łszywie dodatnich – od 5 % (4/73) do 
6 % (4/70), a odsetek wyników fa łszywie ujemnych – od 29 % (2/7) do 
33 % (3/9) (4).
 
48. Nawet je żeli badana substancja nie zostanie zaklasyfikowana jako żrąca lub 
silnie dra żniąca dla oczu, dane z badania ICE mog ą być przydatne, 
w połączeniu z danymi z badania  in vivo  na oku królika lub z innego 
odpowiednio zwalidowanego badania  in vitro , w celu dalszej oceny przy ­
datności i ogranicze ń metody badania ICE w odniesieniu do identyfikacji 
substancji o s łabym dzia łaniu drażniącym i substancji niedra żniących (trwaj ą 
prace nad dokumentem zawieraj ącym wytyczne dotycz ące stosowania metod 
badania toksyczno ści dla oczu  in vitro ). ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Kryteria dopuszczalno ści badania  
49. Badanie uznaje si ę za dopuszczalne, je żeli równoczesna kontrola negatywna 
/ kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika oraz równoczesna 
kontrola pozytywna daje wyniki w klasyfikacji dzia łania drażniącego 
mieszczące się odpowiednio w ramach klas substancji niedra żniących 
i silnie dra żniących/żrących.  
Sprawozdanie z badania  
50. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje, o ile s ą 
one istotne dla przebiegu badania:  
Substancje badane i kontrolne  
Nazwa chemiczna (nazwy chemiczne), np. nazwa strukturalna u żywana 
przez Chemical Abstracts Service (CAS), po której nast ępują inne nazwy, 
jeżeli są znane;  
Numer CAS, je żeli jest znany;  
Czystość i skład substancji lub mieszaniny (w procentach masy), w miar ę 
dostępności tych informacji;  
Właściwości fizykochemiczne istotne dla przebiegu badania, np. stan 
skupienia, lotno ść, pH, stabilno ść, klasa chemiczna, rozpuszczalno ść 
w wodzie;  
W stosownych przypadkach obróbka substancji badanych/kontrolnych przed 
badaniem (np. ogrzanie, rozdrobnienie);  
Stabilność, jeżeli jest znana.  
Informacje dotycz ące sponsora i placówki przeprowadzaj ącej badanie  
Nazwa i adres sponsora i placówki przeprowadzaj ącej badanie oraz dane 
kierownika bada ń; 
Identyfikacja źródła oczu (tj. zak ład, w którym je pobrano);  
Warunki przechowywania i transportu oczu (np. data i czas pobrania oczu, 
odstęp czasu mi ędzy pobraniem oczu a rozpocz ęciem badania);  
W miarę dostępności szczegó łowe dane na temat zwierz ąt, od których 
pobrano oczy (np. wiek, p łeć, masa zwierz ęcia dawcy).  
Uzasadnienie zastosowanej metody badania i protoko łu 
Integralno ść metody badania  
Procedura zastosowana w celu zapewnienia integralno ści (tj. dok ładności 
i wiarygodno ści) metody badania w czasie (np. okresowe badanie substancji 
do oceny bieg łości, wykorzystanie historycznych danych z kontroli nega ­
tywnej i pozytywnej).  
Kryteria dotycz ące badania dopuszczalnego  
W stosownych przypadkach akceptowalny zakres równoczesnej kontroli 
odniesienia na podstawie danych historycznych.  
Warunki badania  
Opis zastosowanego uk ładu badawczego;  
Zastosowany mikroskop z lamp ą szczelinow ą (np. model);  
Zastosowane ustawienia mikroskopu z lamp ą szczelinow ą; 
Informacje na temat zastosowanych oczu kurzych, w tym o świadczenia 
dotyczące ich jako ści; ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Szczegółowe dane na temat zastosowanej procedury badania;  
Zastosowane st ężenie badanej substancji;  
Opis wszelkich modyfikacji procedury badania;  
Odniesienie do danych historycznych dotycz ących modelu (np. kontrole 
pozytywne i negatywne, substancje do oceny bieg łości, substancje wzorco ­
we); 
Opis stosowanych kryteriów oceny.  
Wyniki  
Opis innych zaobserwowanych skutków;  
W razie potrzeby fotografie oka.  
Omówienie wyników  
Wnioski  
LITERATURA  
0(1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
0(2) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania 
i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006. Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1.  
0(3) Organizacja Narodów Zjednoczonych (ONZ) (2007). Globalnie Zhar ­
monizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), 
wydanie drugie zmienione, ONZ, Nowy Jork i Genewa 2007. Dostępne na stronie internetowej:
 
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]  
0(4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. Dostępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retro ­
spective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Dost ępne 
na stronie internetowej:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
0(6) Rozporz ądzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady 
z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ogranicze ń w zakresie chemikaliów (REACH) 
i utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniaj ące dyrektyw ę 
1999/45/WE oraz uchylaj ące rozporz ądzenie Rady (EWG) nr 793/93 
i rozporz ądzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak równie ż dyrektyw ę 
Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 
93/105/WE i 2000/21/WE. Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1.
 
0(7) OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Dost ępne na stronie inter ­
netowej:  
[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_ 
1_1_1_1,00.html]  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
0(8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Proto ­
col. W: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. Dostępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]  
0(9) ICCVAM. (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye 
Test Method. Publikacja NIH nr: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Dost ępne na stronie internetowej:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ ­
ocu_brd_ice.htm]  
(10) Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated 
eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize 
eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76.  
(11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Dostępne na stronie internetowej:  
[http://ecvam.jrc.it/index.htm].  
(12) Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
(13) Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): 
A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
(14) Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/ ­
prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.  
(15) Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Health ­
care Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guide ­
line for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious 
Agents in Healthcare Settings. Dost ępne na stronie internetowej:  
[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].  
(16) Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
(17) Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet.- Toxicol. - 19, 471-480.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
(18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Dost ępne na stronie internetowej:
 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm]  
(19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Dost ępne na stronie 
internetowej:  
[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop. 
htm] ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody 
badania a przyj ętymi warto ściami odniesienia. Jest to miara efektywno ści metody 
badania i jeden z aspektów jej „istotno ści”. Pojęcia tego cz ęsto używa się 
zamiennie z poj ęciem „zgodno ść” na oznaczenie odsetka prawid łowych wyników 
uzyskiwanych przy u życiu metody badania.  
Substancja wzorcowa:  substancja u żywana jako wzorzec do porówna ń z badaną 
substancją. Substancja wzorcowa powinna mie ć następujące cechy: (i) sta łe 
i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobie ństwo strukturalne i funkcjonalne do badanej 
klasy substancji; (iii) znane w łaściwości fizyczne/chemiczne; (iv) dane uzupe ł­
niające dotycz ące znanych skutków oraz (v) znan ą siłę działania w zakresie 
pożądanych reakcji.  
Rogówka:  przezroczysta warstwa w przedniej cz ęści gałki ocznej, która okrywa 
tęczówkę i źrenicę oraz wpuszcza światło do wnętrza oka.  
Zmętnienie rogówki:  pomiar stopnia zm ętnienia rogówki wskutek ekspozycji na 
badaną substancj ę. Zwiększone zm ętnienie rogówki wskazuje na jej uszkodzenie.  
Obrzęk rogówki:  obiektywny pomiar stopnia rozd ęcia rogówki w nast ępstwie 
ekspozycji na badan ą substancj ę w badaniu ICE. Obrz ęk rogówki wyra ża się 
procentowo i oblicza si ę go na podstawie wyj ściowych pomiarów grubo ści 
rogówki (sprzed podania substancji) i grubo ści mierzonej w równych odst ępach 
czasu po ekspozycji na badan ą substancj ę w badaniu ICE. Stopie ń obrzęku 
rogówki wskazuje na uszkodzenie rogówki.  
Kategoria I EPA:  działanie żrące (nieodwracalne uszkodzenie tkanki oka) 
lub zmiany rogówkowe lub podra żnienie rogówki utrzymuj ące się dłużej 
niż 21 dni (1).  
Kategoria R41 UE:  spowodowanie uszkodzenia tkanki w oku lub powa żne 
fizyczne pogorszenie widzenia w nast ępstwie na łożenia badanej substancji na 
przednią powierzchni ę oka, które nie jest ca łkowicie odwracalne w ci ągu 
21 dni od na łożenia (2).  
Odsetek wyników fa łszywie ujemnych:  odsetek wszystkich obecnych substancji 
fałszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badania jako 
nieobecne. Jest to jeden ze wska źników efektywno ści metody badania.  
Odsetek wyników fa łszywie dodatnich:  odsetek wszystkich nieobecnych 
substancji fa łszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badania 
jako obecne. Jest to jeden ze wska źników efektywno ści metody badania.  
Zatrzymanie fluoresceiny:  subiektywny pomiar ilo ści soli fluoresceiny zatrzy ­
manej w komórkach nab łonka przedniego rogówki w nast ępstwie ekspozycji na 
badaną substancj ę w badaniu ICE. Stopie ń zatrzymania fluoresceiny wskazuje na 
uszkodzenie nab łonka przedniego rogówki.  
GHS (Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania 
Chemikaliów):  system proponuj ący klasyfikacj ę chemikaliów (substancji 
i mieszanin) wed ług znormalizowanych rodzajów i poziomów zagro żeń fizycz­
nych, zdrowotnych i środowiskowych oraz omawiaj ący odpowiednie elementy 
komunikacyjne, takie jak piktogramy, has ła ostrzegawcze, zwroty wskazuj ące 
rodzaj zagro żenia, zwroty wskazuj ące środki ostro żności i karty charakterystyki 
substancji i produktów niebezpiecznych, aby przekaza ć informacje na temat ich 
działań niepożądanych w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, 
robotników, przewo źników, konsumentów i ratowników) i środowiska (3).  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
Kategoria 1 GHS:  spowodowanie uszkodzenia tkanki w oku lub powa żne 
fizyczne pogorszenie widzenia w nast ępstwie na łożenia badanej substancji na 
przednią powierzchni ę oka, które nie jest ca łkowicie odwracalne w ci ągu 
21 dni od na łożenia (3).  
Zagrożenie:  nieodłączna właściwość czynnika lub sytuacja, która mo że poten­
cjalnie doprowadzi ć do negatywnych skutków w przypadku ekspozycji orga ­
nizmu, systemu lub (sub)populacji na taki czynnik.  
Kontrola negatywna:  replikat niepoddany dzia łaniu badanej substancji, zawie ­
rający wszystkie sk ładniki uk ładu badawczego. Próbka ta jest przetwarzana 
razem z próbkami poddanymi dzia łaniu badanej substancji oraz z innymi 
próbkami kontrolnymi w celu okre ślenia, czy rozpuszczalnik wchodzi 
w reakcję z układem badawczym.  
Niedrażniące: substancje, które nie zosta ły zaklasyfikowane do kategorii I, II lub 
III EPA, kategorii R41 lub R36 UE lub kategorii 1, 2A lub 2B GHS jako drażniące dla oczu (1)(2)(3).
 
Żrące dla oczu:  a) substancja, która powoduje nieodwracalne uszkodzenie tkanki 
w oku; b) substancje, które zaklasyfikowano do kategorii 1 GHS, kategorii I EPA 
lub kategorii R41 UE jako dra żniące dla oczu (1)(2)(3).  
Drażniące dla oczu:  a) substancja, która powoduje odwracaln ą zmianę w oku 
w następstwie jej na łożenia na przedni ą powierzchni ę oka; b) substancje, które 
zaklasyfikowano do kategorii II lub III EPA, kategorii R36 UE lub kategorii 2A 
lub 2B GHS jako dra żniące dla oczu (1)(2)(3).  
Silnie dra żniące dla oczu:  a) substancja, która powoduje zmian ę w oku 
w następstwie jej na łożenia na przedni ą powierzchni ę oka, która nie ust ępuje 
w ciągu 21 dni od na łożenia lub powoduje powa żne fizyczne pogorszenie widze ­
nia; b) substancje, które zaklasyfikowano do kategorii I GHS, kategorii I EPA 
lub kategorii R41 UE jako dra żniące dla oczu (1)(2)(3).  
Kontrola pozytywna:  replikat zawieraj ący wszystkie sk ładniki uk ładu badaw ­
czego, który zosta ł poddany dzia łaniu substancji, o której wiadomo, że wywoła 
reakcję dodatnią. Aby zapewni ć możliwość oceny zmienno ści reakcji w kontroli 
pozytywnej w czasie, podra żnienie nie powinno by ć nadmierne.  
Wiarygodno ść: miary zakresu, w jakim metoda badania mo że zostać wykonana 
w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomi ędzy laboratoriami 
w czasie, w przypadku jej wykonywania przy u życiu tego samego protoko łu. 
Ocenia si ę ją poprzez obliczenie odtwarzalno ści wewn ątrz- 
i międzylaboratoryjnej oraz powtarzalno ści wewnątrzlaboratoryjnej.  
Mikroskop z lamp ą szczelinow ą: narzędzie używane do bezpo średniego 
badania oka w powi ększeniu pod mikroskopem dwuokularowym poprzez uzys ­
kanie prostego obrazu stereoskopowego. W metodzie badania ICE narz ędzie to 
stosuje si ę do oglądania przednich struktur oka kurzego, jak równie ż do obiek ­
tywnego pomiaru grubo ści rogówki za pomoc ą urządzenia do pomiaru grubo ści 
połączonego z mikroskopem.  
Kontrola z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika:  próbka niepoddana dzia ­ 
łaniu badanej substancji, zawieraj ąca wszystkie sk ładniki uk ładu badawczego, 
w tym rozpuszczalnik lub no śnik, która jest przetwarzana razem z próbkami 
poddanymi dzia łaniu badanej substancji oraz z innymi próbkami kontrolnymi 
w celu okre ślenia wyj ściowej reakcji dla próbek poddanych dzia łaniu badanej 
substancji rozpuszczonej w tym samym rozpuszczalniku lub no śniku. Jeżeli 
równocze śnie przeprowadza si ę kontrolę negatywn ą, próbka ta wykazuje 
również, czy rozpuszczalnik lub no śnik wchodzi w reakcj ę z układem badaw ­
czym.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Badanie wielopoziomowe:  stopniowa strategia badawcza, zgodnie z któr ą 
wszystkie istniej ące informacje na temat badanej substancji s ą analizowane na 
każdym etapie w okre ślonym porz ądku z zastosowaniem procesu uwzgl ędniają­
cego wag ę dowodów w celu okre ślenia, czy dost ępna jest wystarczaj ąca ilość 
informacji do podj ęcia decyzji o klasyfikacji zagro żenia, przed przej ściem do 
następnego etapu. Je żeli na podstawie dost ępnych informacji mo żna przypisa ć 
badanej substancji potencja ł wywołania podra żnienia, dodatkowe badania nie s ą 
potrzebne. Je żeli na podstawie dost ępnych informacji nie mo żna przypisa ć 
badanej substancji potencja łu wywołania podra żnienia, przeprowadza si ę proce­
durę stopniowych bada ń sekwencyjnych na zwierz ętach do momentu, a ż będzie 
możliwe dokonanie jednoznacznej klasyfikacji.  
Zwalidowana metoda badania:  metoda badania, w odniesieniu do której zako ń­
czono badania walidacyjne w celu okre ślenia jej istotno ści (w tym dok ładności) 
i wiarygodno ści w odniesieniu do konkretnego celu. Nale ży zauważyć, że zwali­
dowana metoda badania mo że nie wykazywa ć dostatecznej efektywno ści 
z punktu widzenia istotno ści i wiarygodno ści, aby mo żna było ją uznać za 
dopuszczaln ą w odniesieniu do danego celu.  
Waga dowodów:  proces analizowania mocnych i s łabych stron ró żnych 
elementów informacji podczas formu łowania wniosku dotycz ącego potencjalnego 
zagrożenia stwarzanego przez dan ą substancj ę oraz uzasadnienia takiego 
wniosku.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Dodatek 2  
CHEMIKALIA DO OCENY BIEG ŁOŚCI W ODNIESIENIU DO METODY 
BADANIA ICE  
Przed rozpocz ęciem rutynowego stosowania metody badania zgodnej z niniejsz ą 
metodą badania laboratoria mog ą podjąć się wykazania swojej bieg łości tech­
nicznej prawid łowo identyfikuj ąc klasyfikacj ę stopnia dzia łania żrącego 10 
substancji wskazanych w tabeli 1. Substancje te zosta ły wybrane w taki sposób, 
by reprezentowa ły zakres reakcji na miejscowe dzia łanie drażniące/żrące dla oczu 
oparty na wynikach badania  in vivo  na oku królika (TG 405) (np. kategorie 1, 
2A, 2B lub nieklasyfikowane ani nieoznakowane zgodnie z GHS ONZ) (3)(7). 
Biorąc pod uwag ę zwalidowan ą użyteczność tych bada ń (tj. wyłącznie do ziden ­
tyfikowania substancji żrących/silnie dra żniących dla oczu), istniej ą jednak tylko 
dwa wykazuj ące efektywno ść wyniki bada ń dla potrzeb klasyfikacji (substancja 
żrąca/drażniąca lub substancja nie żrąca/niedrażniąca). Innymi kryteriami doboru 
były: dostępność handlowa substancji, wysoka jako ść dostępnych danych refe ­
rencyjnych z bada ń in vivo  oraz istnienie wysokiej jako ści danych dotycz ących 
dwóch metod  in vitro , w odniesieniu do których przygotowuje si ę wytyczne 
dotyczące badań. Z tego powodu substancje dra żniące wybrano z zalecanego 
przez Mi ędzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod 
Alternatywnych (ICCVAM) wykazu 122 substancji referencyjnych do walidacji metod bada ń in vitro  toksyczno ści dla oczu (zob. dodatek H: Wykaz substancji 
referencyjnych zalecanych przez ICCVAM) (4). Dane referencyjne znale źć 
można w dokumentach przegl ądowych ICCVAM dla metod badania zm ętnienia 
i przepuszczalno ści rogówki u byd ła (BCOP) oraz badania ICE (18)(19).
 
Tabela 1  
Zalecane substancje do oceny bieg łości technicznej w odniesieniu do badania ICE  
Substancja chemiczna Nr CAS Substancja 
chemiczna (  1 ) Stan skupienia Klasyfikacja  in 
vivo ( 2 ) Klasyfikacja  in vitro  ( 3 ) 
Chlorek benzalko ­
nium (5 %) 8001-54-5 Zwi ązek 
oniowy Ciecz Kategoria 1 Substancja żrąca/ 
Substancja silnie 
drażniąca 
Chloroheksydyna 55-56-1 Amina, 
amidyna Ciało stałe Kategoria 1 Substancja żrąca/ 
Substancja silnie 
drażniąca 
Kwas dibenzoilo-1- 
winowy 2743-38-6 Kwas karbo ­
ksylowy, ester Ciało stałe Kategoria 1 Substancja żrąca/ 
Substancja silnie 
drażniąca 
Imidazol 288-32-4 Zwi ązek hete­
rocykliczny Ciało stałe Kategoria 1 Substancja żrąca/ 
Substancja silnie 
drażniąca 
Kwas trichlorooc ­
towy (30 %) 76-03-9 Kwas karbo ­
ksylowy Ciecz Kategoria 1 Substancja żrąca/ 
Substancja silnie 
drażniąca 
Chlorek 2,6-dichloro ­
benzoilu 4659-45-4 Halogenek 
acylu Ciecz Kategoria 2A Substancja nie żrąca/ 
Substancja o s łabym 
działaniu drażniącym 
2-etylo-acetylooctan 
metylu 609-14-3 Keton, ester Ciecz Kategoria 2B Substancja nie żrąca/ 
Substancja o s łabym 
działaniu drażniącym 
Azotan amonu 6484-52-2 Sól nieorga ­
niczna Ciało stałe Kategoria 2A Substancja nie żrąca/ 
Substancja o s łabym 
działaniu drażniącym ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Substancja chemiczna Nr CAS Substancja 
chemiczna (  1 ) Stan skupienia Klasyfikacja  in 
vivo ( 2 ) Klasyfikacja  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Alkohol Ciecz Nieoznakowana Substancja nie żrąca/ 
Substancja o s łabym 
działaniu drażniącym 
n_heksan 110-54-3 W ęglowodór 
(acykliczny) Ciecz Nieoznakowana Substancja nie żrąca/ 
Substancja o s łabym 
działaniu drażniącym  
Skróty: Nr CAS = numer w Chemical Abstracts Service 
( 1 ) Klasy chemiczne przypisano do ka żdej badanej substancji z zastosowaniem standardowego schematu klasyfikacji w oparciu 
o system klasyfikacji Medical Subject Headings (MeSH) opracowany przez National Library of Medicine (dost ępny pod 
adresem http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) W oparciu o wyniki badania  in vivo  na oku królika (OECD TG 405) i z zastosowaniem GHS ONZ (3)(7). 
( 3 ) W oparciu o wyniki bada ń BCOP i ICE.  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Dodatek 3  
Schematy budowy urz ądzenia do przep łukiwania i uchwytów na oczy 
stosowanych w badaniu ICE  
(Zob. Burton i in. (17), aby uzyska ć dodatkowe, ogólne opisy urz ądzenia do 
przepłukiwania i uchwytu na oko)
  ▼M2 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  BADANIE MIKROJ ĄDROWE  IN VITRO  W KOMÓRKACH 
SSAKÓW  
WSTĘP 
1. Badanie mikroj ądrowe  in vitro  (MNvit) jest badaniem genotoksyczno ści 
w celu wykrywania mikroj ądra (MN) w cytoplazmie komórek w interfazie. 
Mikrojądra mogą pochodzi ć odpowiednio z acentrycznych fragmentów 
chromosomów (tj. nieposiadaj ących centromera), lub z ca łych chromoso ­
mów, które nie s ą w stanie migrowa ć do biegunów w stadium anafazy 
podziału komórek. To badanie wykrywa klastogenne i aneugenne dzia łanie 
chemikaliów (substancji i mieszanin) (1) (2) w komórkach, w których doszło do podzia łu komórek podczas nara żenia na dzia łanie substancji 
badanej lub po nim. Niniejsza metoda badania (TM) dopuszcza stosowanie 
protokołów z inhibitorem polimeryzacji aktyny cytochalazyn ą B (cytoB) 
i bez niego. Dodanie cytoB przed ukierunkowan ą mitozą umożliwia 
określenie i selektywn ą analizę częstotliwości występowania mikroj ąder 
w komórkach, które uko ńczyły jedną mitozę, poniewa ż takie komórki s ą 
dwujądrowe (3) (4). Niniejsza TM pozwala równie ż na stosowanie proto ­
kołów bez zahamowania cytokinezy, pod warunkiem że istnieją dowody 
na to, że badana populacja komórek przesz ł
a mitozę. 
2. Oprócz badania MNvit wykorzystywanego do identyfikowania chemika ­
liów (substancji i mieszanin), które powoduj ą powstawanie mikroj ąder, 
informacji na temat mechanizmów uszkadzania chromosomu 
i formowania mikroj ąder mogą dostarczy ć również: zahamowanie cytoki ­
nezy, immunochemiczne oznakowanie kinetochorów lub hybrydyzacja z sondami centromerowymi/telomerowymi (fluorescencyjna hybrydyzacja  
in situ  (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). 
Procedury oznaczania i hybrydyzacji mog ą być wykorzystywane 
w przypadku, gdy nast ępuje wzrost procesu formowania mikroj ąder 
i badający zamierza ustali ć, czy ten wzrost jest skutkiem klastogennych 
lub aneugennych zdarze ń.
 
3. Mikroj ądra stanowi ą uszkodzenie, które zosta ło przekazane do komórek 
potomnych, podczas gdy aberracje chromosomowe znalezione w komórkach metafazy mog ą nie być przekazywane. Poniewa ż mikrojądra 
w komórkach w stadium interfazy mo żna stosunkowo obiektywnie oceni ć, 
pracownicy laboratorium musz ą tylko okre ślić, czy komórki si ę podzieliły 
i ile spośród komórek zawiera mikroj ądro. W rezultacie preparaty mog ą 
być ocenione wzgl ędnie szybko, a analizy mog ą być zautomatyzowane. 
Badanie staje si ę wydajniejsze, bo mo żna ocenia ć tysiące zamiast setek 
komórek poddanych dzia łaniu. Wreszcie, poniewa ż mikrojądra mog ą 
tworzyć się z chromosomów opó źnionych, istnieje mo żliwość wykrycia 
czynników wywo łujących aneuploidi ę, które trudno bada ć 
w konwencjonalnych badaniach aberracji chromosomalnych, np. wytyczna 
ODCE dotycz ąca badań nr 473 (rozdzia ł B.10 niniejszego za łącznika) 
(17). Jednak badanie MNvit nie pozwala na ró żnicowanie chemikaliów 
wywo
łujących poliploidalno ść od tych wywo łujących dzia łanie klasto ­
genne bez specjalnych technik, takich jak badanie FISH, opisane w pkt 2.  
4. Badanie MNvit jest metod ą in vitro , w której zazwyczaj wykorzystuje si ę 
hodowane komórki ludzkie lub gryzoni. Dostarcza ona kompleksowych 
podstaw do badania  in vitro  potencjalnego dzia łania powoduj ącego uszko ­
dzenia chromosomowe, poniewa ż można wykry ć zarówno aneugeny, jak 
i klastogeny.  
5. Badanie MNvit jest solidne i skuteczne w odniesieniu do ró żnych 
rodzajów komórek, oraz w obecno ści lub przy braku cytoB. Istnieje 
dużo danych na poparcie wa żności badania MNvit z wykorzystaniem 
różnych linii komórkowych gryzoni (CHO, V79, CHL/IU i L5178Y) 
i ludzkich limfocytów (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30), (31). Obejmuj ą one w szczególno ści międzynarodowe 
badania walidacyjne koordynowane przez Société Française de Toxico ­
logie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) i sprawozdania z International Workshop on Genotoxicity Testing (mi ędzynarodowych 
warsztatów z bada ń genotoksycznych) (4) (16). Dost ępne dane zosta ły 
również poddane ponownej ocenie w oparciu o analiz ę ciężaru dowodów 
w retrospektywnym badaniu walidacyjnym przez Europejskie Centrum
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 708
 
Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) Komisji Europejskiej 
i metoda badania zosta ła zatwierdzona jako naukowo uzasadniona przez 
naukowy komitet doradczy ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). Opisano wykorzystywanie ludzkich komórek z linii limfoblastoidów TK6 (35), komórek HepG2 (36) (37) i komórek zarodka chomika syryjskiego (38), 
pomimo że nie zosta ły one wykorzystane w badaniach walidacyjnych.
 
DEFINICJE  
6. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 1.  
UWAGI WST ĘPNE  
7. Badania przeprowadzane  in vitro  wymagaj ą zazwyczaj wykorzystania 
egzogenicznego źródła aktywacji metabolicznej, chyba że komórki s ą 
metabolicznie wydolne w odniesieniu do badanych substancji. Egzoge ­
niczny system aktywacji metabolicznej nie jest w stanie ca łkowicie na śla­
dować warunków  in vivo . Należy dołożyć wszelkich stara ń, aby unikn ąć 
warunków, które mog łyby prowadzi ć do zniekszta łconych pozytywnych 
wyników nieodzwierciedlaj ących wewn ętrznej mutagenno ści, a które 
mogą wynikać ze zmian w pH lub w st ężeniu osmolalnym lub by ć spowo­
dowane przez wysokie poziomy cytotoksyczno ści (39) (40) (41). Je śli 
badana substancja chemiczna powoduje zmian ę w pH pod łoża 
w momencie dodania, pH nale ży dostosowa ć, najlepiej za pomoc ą bufo­
rowania roztworu podstawowego w taki sposób, aby wszystkie obj ętości 
we wszystkich badanych st ężeniach oraz w odniesieniu do wszystkich 
kontroli pozostawa ły takie same.  
8. Dla celów analizy indukcji mikroj ąder istotne jest, aby mitoza mia ła 
miejsce zarówno w hodowlach komórkowych poddanych dzia łaniu 
substancji, jak i w niepoddanych temu dzia łaniu. Najpe łniejsze informacje 
w zakresie obliczania mikroj ąder można uzyska ć na podstawie bada ń 
komórek, które uko ńczyły jedną mitozę w trakcie poddawania dzia łaniu 
substancji badanej lub po nim.  
ZASADA BADANIA  
9. Hodowle komórek ludzi lub ssaków s ą poddawane dzia łaniu substancji 
badanej zarówno z egzogenicznym źródłem aktywacji metabolicznej, jak 
i bez niego, chyba że wykorzystuje si ę komórki o odpowiedniej zdolno ści 
metabolizowania. Stosowany równolegle rozpuszczalnik/no śnik (VC) 
i pozytywne substancje kontrolne (PC) s ą zawarte we wszystkich bada ­
niach.  
10. Komórki s ą hodowane w trakcie nara żenia na dzia łanie substancji badanej 
lub po nim przez okres, w którym uszkodzenia chromosomów lub wrze ­
ciona mog ą doprowadzi ć do tworzenia si ę mikrojąder w komórkach inter ­
fazy. Do indukcji aneuploidii substancja badana powinna zwykle by ć 
obecna w trakcie mitozy. Zebrane i zabarwione komórki interfazy s ą 
analizowane pod k ątem obecno ści mikroj ąder. W warunkach idealnych 
do powstania mikroj ąder powinno dochodzi ć jedynie w tych komórkach, 
które uko ńczyły mitozę podczas nara żenia na substancj ę badaną lub 
w okresie po nara żeniu, jeżeli jest stosowany. W hodowlach, które by ły 
poddane dzia łaniu substancji z blokerem cytokinezy mo żna to osi ągnąć 
poprzez liczenie jedynie komórek dwuj ądrowych. W przypadku braku 
blokera cytokinezy wa żne jest, aby wykaza ć, że w poddanych analizie 
komórkach prawdopodobnie dosz ło do podzia łu komórek podczas nara ­ 
żenia na dzia łanie substancji badanej lub po nim. Dla wszystkich proto ­
kołów ważne jest, aby wykaza ć, że proliferacja komórek mia ła miejsce 
zarówno w hodowlach kontrolnych, jak i w poddanych dzia łaniu substan ­
cji, a tak że należy oszacowa ć zakres cytotoksyczno ści wywołanej przez 
substancję lub cytostazy w hodowlach (lub w hodowlach równoleg łych), 
które są oceniane pod k ątem zawarto ści mikroj ąder. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 709
 
OPIS BADANIA  
Preparaty  
11. Mo żna wykorzystywa ć hodowane podstawowe limfocyty krwi obwodowej 
ludzi (5) (19) (42) (43) oraz komórki z szeregu linii komórkowych 
gryzoni, takich jak CHO, V79, CHL/IU i L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Stosowanie innych linii komórkowych i typów powinno by ć uzasadnione na podstawie ich wykazanej efektyw ­
ności w badaniu, zgodnie z kryteriami dopuszczalno ści opisanymi 
w odpowiednim rozdziale. Poniewa ż podstawowa cz ęstość występowania 
mikrojąder będzie miała wpływ na wra żliwość próby, zaleca si ę wykorzy ­
stywanie typów komórek, o niskiej, sta łej częstości powstawania mikro ­
jąder.
 
12. Limfocyty krwi obwodowej ludzi nale ży uzyskać od młodych (mi ędzy 18 
a 35 rokiem życia), zdrowych, niepal ących osób, które ostatnio nie by ły 
narażone, o ile wiadomo, na dzia łanie genotoksycznych substancji 
chemicznych lub na promieniowanie. Je żeli dla celów stosowania łączy 
się komórki pochodz ące od wi ększej liczby dawców ni ż jeden, nale ży 
określić liczbę dawców. Cz ęstość powstawania mikroj ąder wzrasta wraz 
z wiekiem i tendencja ta jest wyra źniejsza w przypadku kobiet ni ż 
mężczyzn (44), dlatego nale ży to uwzgl ędnić przy wyborze dawców 
komórek do łącznego poddawania dzia łaniu.  
Pożywki i warunki hodowli kultury  
13. W utrzymywaniu hodowli powinny by ć stosowane odpowiednie warunki 
podłoża hodowli oraz inkubacji (naczynia do hodowli, st ężenie CO  2 , 
temperatura oraz wilgotno ść). Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy 
powinny by ć rutynowo sprawdzane pod k ątem stabilno ści zmiennej liczby 
chromosomów oraz nieobecno ści zanieczyszczenia mykoplazm ą oraz nie 
powinny by ć wykorzystywane, je żeli są zanieczyszczone lub w przypadku, 
gdy liczba chromosomów uleg ła zmianie. Powinien by ć znany normalny 
czas cyklów komórkowych w warunkach hodowli stosowanej w laboratorium przeprowadzaj ącym badania. Je żeli stosowana jest metoda 
z blokerem cytokinezy wówczas st ężenie inhibitorów cytokinezy powinno 
być dostosowane do danego rodzaju komórek oraz nale ży wykaza ć, że jest 
ona w stanie wyprodukowa ć wystarczaj ącą liczbę komórek dwuj ądrowych 
dla celów oceny.
 
Przygotowanie hodowli  
14. Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy: Komórki s ą rozmnażane 
z hodowli podstawowej, siane na pod łożu hodowlanym w takiej g ęstości, 
aby hodowle nie zrasta ły się w warstwach, a hodowle w zawiesinie nie 
osiągały nadmiernego zag ęszczenia przed czasem pobierania, oraz inkubo ­
wane w temperaturze 37 °C.  
15. Limfocyty: Krew pe łną poddaną działaniu antykoagulantu (np. heparyny) 
lub oddzielone limfocyty hoduje si ę w obecno ści mitogenu np. 
fitohemoaglutyniny (PHA) przed nara żeniem na dzia łanie substancji 
badanej i cytoB.  
Aktywacja metaboliczna  
16. Zewn ątrzpochodny uk ład metabolizuj ący należy stosowa ć w przypadku, 
gdy stosuje si ę komórki o niew łaściwej wewn ątrzpochodnej pojemno ści 
metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzystywanym systemem jest 
uzupełniana wspó łczynnikiem frakcja pomitochondrialna (S9) przygoto ­
wana z w ątroby gryzoni otrzymuj ących czynniki pobudzaj ące enzymy 
takie jak Aroclor 1254 (45) (46) lub kombinacja fenobarbitonu oraz β- 
nafoflavonu (46) (47) (48) (49). To ostatnie po łączenie nie pozostaje 
w sprzeczno ści z Konwencj ą sztokholmsk ą w sprawie trwa łych zanie ­
czyszczeń organicznych (50) i rozporz ądzeniem (WE) nr 850/2004 dotycz ­ 
ącym trwa łych zanieczyszcze ń organicznych (66) i okaza ło się tak 
skuteczne jak Aroclor 1254 w wywo łaniu oksydaz wieloczynno ściowych 
(46) (47) (48) (49). Frakcja S9 jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach o zakresie 1–10 % (v/v) w ko ńcowym pod łożu badawczym. 
Warunki systemu aktywacji metabolicznej mog ą być uzależnione od klasy 
badanej substancji chemicznej i w niektórych przypadkach w łaściwe może 
okazać si
ę wykorzystanie wi ęcej niż jednego st ężenia S9.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 710
 
17. Genetycznie skonstruowane linie komórkowe oddaj ące szczególne dla 
ludzi lub gryzoni enzymy aktywuj ące mogą sprawić, że zewnątrzpochodny 
system aktywacji metabolicznej stanie si ę niepotrzebny i mog ą być stoso­
wane jako komórki badane. W takich przypadkach wybór wykorzystywa ­
nych linii komórkowych powinien by ć uzasadniony naukowo, np. poprzez 
istotność oksydaz wieloczynno ściowych dla metabolizmu substancji 
badanej (51) i ich zdolno ść do reagowania na znane klastogeny 
i aneugeny (zob. oddzielny rozdzia ł dotyczący kryteriów dopuszczalno ści). 
Należy uwzględnić fakt, że badana substancja mo że nie być metabolizo ­
wana przez wyra żoną oksydazę wieloczynno ściową; W takim przypadku 
negatywne wyniki nie wskazuj ą na to, że badana substancja nie mo że 
wywołać procesu powstawania mikroj ąder. 
Preparat substancji badanej  
18. Sta łe substancje chemiczne nale ży rozpuścić w odpowiednich rozpuszczal ­
nikach lub no śnikach oraz rozcie ńczyć, jeżeli jest to odpowiednie, zanim 
komórki zostan ą poddane dzia łaniu substancji badanej. P łynne substancje 
badane mog ą być dodawane bezpo średnio do uk ładu badawczego i/lub 
rozcieńczane przed poddaniem komórek dzia łaniu substancji badanej. 
Gazy lub lotne substancje chemiczne powinny by ć badane za pomoc ą 
odpowiednich modyfikacji standardowych protoko łów, takich jak 
poddawanie komórek dzia łaniu substancji badanej w szczelnie zamkni ę­
tych naczyniach (52) (53). Nale ży wykorzystywa ć świeże preparaty 
substancji badanej, chyba że dane dotycz ące stabilno ści wskazuj ą, iż 
dopuszczalne jest sk ładowanie substancji  
Warunki badania  
Rozpuszczalniki/no śniki 
19. Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien reagowa ć z substancj ą badaną, lub 
uniemożliwiać przeżywania komórek lub utrzymania dzia łania S9 przy 
wykorzystywanym st ężeniu. Jeśli są stosowane inne ni ż dobrze znane 
rozpuszczalniki/no śniki (np. woda, pod łoże hodowli komórkowych, sulfot ­
lenek dimetylu), ich stosowanie powinno by ć wsparte danymi wskazuj ­ 
ącymi ich zgodno ść z substancj ą badaną oraz brak ich toksyczno ści gene­
tycznej. Zaleca si ę, o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści 
rozważone zosta ło wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/no śników.  
Wykorzystanie cytoB jako blokera cytokinezy  
20. Jedn ą z najistotniejszych kwestii w wykonywaniu badania MNvit jest 
zapewnienie, że oceniane komórki zako ńczyły mitozę podczas poddania 
działaniu substancji badanej lub w okresie po poddaniu, je żeli jest stoso ­
wany. CytoB to czynnik, który by ł powszechnie stosowany do zahamo ­
wania cytokinezy, poniewa ż hamuje on polimeryzacj ę aktyny, a tym 
samym zapobiega oddzielaniu komórek potomnych po mitozie, doprowa ­
dzając do tworzenia komórek dwuj ądrowych (5) (54) (55). Z tego wzgl ędu 
liczenie mikroj ąder można ograniczy ć do komórek, które przesz ły mitozę 
w trakcie ich poddawania dzia łaniu substancji badanej lub po nim. Wp ływ 
substancji badanej na kinetyk ę proliferacji komórek mo że być mierzony 
jednocześnie. CytoB powinno by ć wykorzystywane jako bloker cytokinezy 
w przypadku, gdy s ą stosowane ludzkie limfocyty, poniewa ż czas cyklu 
komórkowego b ędzie różny dla ró żnych hodowli i ró żnych dawców oraz 
ze względu na to, że nie wszystkie limfocyty b ędą reagować na PHA. Inne 
metody zosta ły wykorzystane podczas badania linii komórkowych, aby 
ustalić, czy oceniane komórki si ę podzieli ły; zostały one omówione 
poniżej (zob. pkt 26).  
21. Laboratorium powinno okre ślić odpowiednie st ężenie cytoB dla ka żdego 
rodzaju komórek do osi ągnięcia optymalnej cz ęstości powstawania 
komórek dwuj ądrowych w hodowlach kontrolnych z wykorzystaniem 
rozpuszczalnika/no śnika. Odpowiednie st ężenie cytoB zwykle wynosi 
między 3 i 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Pomiar proliferacji komórek i cytotoksyczno ści oraz wybór st ężeń nara­ 
żenia 
22. Przy ustalaniu najwy ższego stężenia badanej substancji, które ma by ć 
badane, nale ży unikać stężeń, które mog ą dawać zniekszta łcone pozy ­
tywne wyniki, takich jak te, które powoduj ą nadmiern ą cytotoksyczno ść, 
opad w pod łożu hodowlanym i znaczne zmiany pH lub osmolalno ści (39) 
(40) (41).  
23. Dokonuje si ę pomiaru proliferacji komórek, aby upewni ć się, że komórki 
poddane dzia łaniu substancji przesz ły mitozę podczas badania oraz że 
poddawanie dzia łaniu substancji jest prowadzone na odpowiednim 
poziomie cytotoksyczno ści (zob. pkt 29). Cytotoksyczno ść powinna by ć 
oznaczana z aktywacj ą metaboliczn ą oraz bez niej w komórkach wymagaj ­ 
ących aktywacji metabolicznej, z wykorzystaniem wzgl ędnego wzrostu 
liczby komórek (RICC) lub wzgl ędnego podwojenia populacji (RPD) 
(zob. wzory w dodatku 2), chyba że wykorzystuje si ę cytoB. Gdy wyko ­
rzystuje si ę cytoB cytotoksyczno ść można określić, wykorzystuj ąc 
wskaźnik replikacji (RI) (zob. wzór w dodatku 2).  
24. Poddawanie dzia łaniu substancji badanej hodowli z cytoB i pomiar 
względnych cz ęstości występowania komórek jednoj ądrowych, dwuj ądro­
wych i wieloj ądrowych w hodowli sk ładają się na metod ę dokładnego 
ilościowego okre ślania wpływu na proliferacj ę komórek i dzia łanie cytoto ­
ksyczne lub cytostatyczne substancji badanej (5) oraz zapewnia, że liczone 
są jedynie komórki, w których dokona ł się podział podczas poddawania 
działaniu substancji badanej lub po nim.  
25. W badaniach z cytoB cytostatyczno ść/cytotoksyczno ść można określić 
ilościowo na podstawie wska źnika proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) 
(5) (26) (56) lub mo żna ją uzyskać z RI dla co najmniej 500 komórek na 
hodowlę (zob. wzory w dodatku 2). Gdy wykorzystuje si ę cytoB do oceny 
proliferacji komórek, nale ży określić CBPI lub RI na podstawie co 
najmniej 500 komórek na hodowl ę. Pomiary te, mi ędzy innymi, mo żna 
wykorzysta ć do oszacowania cytotoksyczno ści przez porównanie warto ści 
w hodowlach, które zosta ły poddane dzia łaniu substancji badanej oraz 
w hodowlach kontrolnych. Ocena innych markerów cytotoksyczno ści 
(np. zrastanie si ę, liczba komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz) 
może dostarczy ć użytecznych informacji.  
26. W badaniach bez cytoB nale ży wykaza ć, że w ocenianych komórkach 
w hodowli dokona ł się podział podczas poddawania dzia łaniu substancji 
badanej lub po nim, inaczej mo żna otrzyma ć fałszywie ujemne reakcje. 
Wśród metod, które zosta ły wykorzystane dla zapewnienia, że oceniane s ą 
komórki po podziale, mo żna wyliczy ć włączenie i pó źniejsze wykrywanie 
bromodeoksyurydyny (BrdU) w celu identyfikacji odtworzonych komórek 
(57), tworzenie si ę klonów, gdy komórki z trwa łych linii komórkowych s ą 
poddawane dzia łaniu i oceniane  in situ  na szkie łku mikroskopowym 
(wskaźnik proliferacji (PI)) (25) (26) (27) (28) lub pomiar wzgl ędnego 
podwojenia populacji (RPD) czy wzgl ędnego wzrostu liczby 
komórek (RICC) lub inne sprawdzone metody (16) (56) (58) (59) (zob. wzory w dodatku 2). Ocena innych markerów cytotoksyczno ści lub cytos ­
tazy (np. zrastanie si ę, liczba komórek, apoptoza, martwica, liczenie meta ­
faz) może dostarczy ć użytecznych informacji.
 
27. Co najmniej trzy nadaj ące się do analizy st ężenia badanej substancji 
powinny zosta ć poddane ocenie. Aby to osi ągnąć, konieczne mo że okazać 
się przeprowadzanie do świadczenia z wykorzystaniem wi ększej liczby 
stężeń o niewielkiej rozpi ętości pomiędzy nimi i przeanalizowanie powsta ­
wania mikroj ąder w tych st ężeniach, przy zapewnieniu odpowiedniego 
zakresu cytotoksyczno ści. Alternatywnym sposobem post ępowania jest 
wstępne zbadanie cytotoksyczno ści w celu ograniczenia zakresu ostatecz ­
nych bada ń. 
28. Najwy ższe stężenie powinno mie ć na celu spowodowanie 55 ± 5 % cyto ­
toksyczno ści. Wyższe poziomy mog ą powodowa ć uszkodzenie chromo ­
somu jako drugorz ędny skutek cytotoksyczno ści (60). W przypadku gdy 
pojawia si ę cytotoksyczno ść, wybrane st ężenia badanej substancji powinny 
obejmowa ć zakres od st ężenia powoduj ącego 55 ± 5 % cytotoksyczno ści 
do stężenia wywo łującego niewielk ą cytotoksyczno ść lub jej brak.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 712
 
29. Jeżeli nie wyst ępuje ani cytotoksyczno ść, ani opad, najwy ższe stężenie 
badanej substancji powinno odpowiada ć 0,01 M, 5 mg/mL lub 5 μl/mL, 
w zależności od tego, które ze st ężeń jest najni ższe. Stężenia wybrane do 
analizy powinny w zasadzie by ć rozdzielone o nie wi ęcej niż 10. 
W przypadku substancji badanych, które wykazuj ą gwałtowny wzrost 
krzywej st ężenie-reakcja, konieczne mo że okazać się zmniejszenie rozpi ę­
tości pomiędzy stężeniami substancji badanej, tak aby mo żliwa była 
również ocena hodowli o umiarkowanych i niskich zakresach toksycz ­
ności. 
30. Gdy czynnikiem ograniczaj ącym jest rozpuszczalno ść, maksymalnym 
stężeniem, je śli nie jest ono ograniczone przez cytotoksyczno ść, powinno 
być najniższe stężenie, przy którym widoczny jest minimalny opad 
w hodowlach, pod warunkiem że nie istniej ą żadne zak łócenia oceny. 
Oceny opadu nale ży dokona ć za pomoc ą metod takich, jak mikroskopia 
świetlna, obserwuj ąc opad, który utrzymuje si ę lub pojawia podczas 
hodowli (pod koniec poddawania dzia łaniu substancji badanej).  
Kontrole  
31. Równoleg łe kontrole pozytywne i kontrole z zastosowaniem rozpuszczal ­
nika/nośnika zarówno z aktywacj ą metaboliczn ą, jak i bez niej powinny 
zostać uwzględnione w ka żdym doświadczeniu.  
32. PC s ą potrzebne, aby wykaza ć zdolność komórek, a tak że protoko łu 
badań, do rozpoznawania klastogenów i aneugenów oraz aby potwierdzi ć 
zdolność metaboliczn ą preparatu S9. PC powinna wykorzystywa ć znane 
czynniki wywo łujące powstawanie mikroj ąder w stężeniach, od których 
oczekuje si ę wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu 
poza tło, i wykazywa ć czułość systemu. St ężenia pozytywnych kontroli 
powinny zosta ć wybrane tak, aby skutki by ły jasne, ale by badaj ącemu nie 
ujawniały bezpośrednio to żsamości zakodowanych szkie łek laboratoryj ­
nych.  
33. Klastogen, który wymaga aktywacji metabolicznej (np. cyklofosfamid; 
benzo[a]piren), powinien by ć wykorzystany, by wykaza ć zarówno wydol ­
ność metaboliczn ą, jak i zdolno ść systemu badania do wykrywania klas ­
togenów. Mo żna użyć innych PC, je śli jest to uzasadnione. Jako że 
niektóre wymagaj ące aktywacji metabolicznej PC mog ą działać bez egzo ­
genicznej aktywacji metabolicznej w pewnych warunkach poddawania 
działaniu substancji badanej lub w niektórych liniach komórkowych, 
potrzeba aktywacji metabolicznej i dzia łalnie preparatu S9 powinny zosta ć 
zbadane w wybranej linii komórkowej i w wybranych st ężeniach.  
34. W chwili obecnej nie s ą znane anaugeny wymagaj ące aktywacji metabo ­
licznej dla ich dzia łania genotoksycznego (16). Obecnie przyj ęte PC 
w odniesieniu do dzia łania aneugenicznego to, na przyk ład, kolchicyna 
i winblastyna. Inne substancje chemiczne mog ą być wykorzystane, o ile 
powodują powstawanie mikroj ąder wyłącznie lub przede wszystkim 
poprzez dzia łanie aneugeniczne. Aby unikn ąć konieczno ści stosowania 
dwóch PC (na klastogenno ść i aneugenno ść) bez aktywacji metabolicznej, 
kontrola aneugenno ści może służyć jako PC bez S9, a kontrola klastogen ­
ności może być stosowana do badania adekwatno ści stosowanego systemu 
aktywacji metabolicznej. PC zarówno na klastogenno ść, jak i aneugenno ść 
powinny by ć wykorzystywane w komórkach, które nie wymagaj ą stoso­
wania S9. Zalecane PC s ą zawarte w dodatku 3.  
35. Wykorzystanie PC powi ązanych z klas ą chemiczn ą może być brane pod 
uwagę, jeżeli są dostępne odpowiednie substancje chemiczne. Wszystkie 
PC powinny by ć właściwe dla rodzaju komórki oraz warunków aktywacji.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika powinny zosta ć 
włączone w ramach ka żdego okresu pobierania hodowli. Ponadto NC 
niepoddane dzia łaniu substancji badanej (brak rozpuszczalnika/no śnika) 
powinny by ć również wykorzystywane, chyba że istnieją opublikowane 
lub historyczne laboratoryjne dane dotycz ące kontroli wykazuj ące, że 
wybrany rozpuszczalnik w zastosowanych st ężeniach nie powoduje szkod ­
liwych skutków.  
PROCEDURA BADANIA  
Harmonogram poddawania dzia łaniu substancji  
37. Aby zmaksymalizowa ć prawdopodobie ństwo wykrycia aneugenu lub klas ­
togenu oddzia ływującego na okre ślonym etapie cyklu komórkowego, 
ważne jest, by wystarczaj ącą liczbę komórek podda ć działaniu substancji 
badanej na wszystkich etapach ich cykli komórkowych. Harmonogram 
poddawania dzia łaniu substancji linii komórkowych i hodowli komórek 
podstawowych ró żni się nieznacznie od harmonogramu stosowanego 
w odniesieniu do limfocytów, które wymagaj ą stymulacji mitogenicznej 
do rozpocz ęcia cyklu komórkowego i o których mowa w pkt 41–43 (16).  
38. Teoretyczne rozwa żania wraz z opublikowanymi danymi (18) wskazuj ą na 
to, że większość aneugenów i klastogenów wykrywa si ę na skutek 
poddawania dzia łaniu substancji przez krótki okres czasu, od 3 do 6 
godzin, w obecno ści S9 i przy jej braku, po czym usuwa si ę badaną 
substancję i pozostawia na okres wzrostu trwaj ący 1,5–2,0 cykli komór ­
kowych (6). Próbki komórek pobiera si ę w czasie równowa żnym zwyk łej 
(tj. takiej jak w momencie niepoddawania dzia łaniu substancji) d ługości 
cyklu komórkowego pomno żonej przez 1,5–2,0 po rozpocz ęciu lub na 
końcu poddawania dzia łaniu substancji (zob. tabela 1). Okres pobierania 
próbek i odzyskiwania mo że zostać przedłużony, jeżeli wiadomo lub 
podejrzewa si ę, że substancja badana ma wp ływ na szybko ść cyklu 
komórek (np. gdy bada si ę nuklozydowe substancje analogiczne).  
39. Ze wzgl ędu na potencjalne dzia łanie cytotoksyczne preparatu S9 na hodo ­
wane komórki ssaków, przed łużone nara żenie na dzia łanie substancji 
badanej o d ługości 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych stosuje si ę 
tylko w nieobecno ści S9. W przypadku przed łużonego poddawania dzia ­ 
łaniu substancji istniej ą możliwości poddawania komórek dzia łaniu 
substancji badanej w obecno ści cytoB lub bez cytoB. Z tych opcji 
można korzysta ć w sytuacjach, w których mo że istnieć niepewno ść co 
do możliwych reakcji mi ędzy substancj ą badaną a cytoB.  
40. Proponowane harmonogramy poddawania komórek dzia łaniu substancji 
przedstawiono w tabeli 1. Te ogólne harmonogramy poddawania dzia łaniu 
substancji mog ą ulec zmianie w zale żności od stabilno ści i reaktywno ści 
substancji badanej lub okre ślonych w łaściwości wzrostowych danych 
komórek. Poddawanie dzia łaniu substancji nale ży rozpocz ąć i zakończyć 
w momencie wyk ładniczego wzrostu komórek. Harmonogramy te przed ­
stawiono bardziej szczegó łowo poni żej w pkt 41–47.  
Tabela 1  
Czas poddawania komórek dzia łaniu substancji i czas pobierania hodowli w badaniu MNvit  
Limfocyty, komórki podstawowe i linie 
komórkowe poddane dzia łaniu cytoB + S9 Poddawa ć działaniu przez 3–6 godzin 
w obecno ści S9; 
usunąć S9 oraz pod łoże poddania dzia łaniu; 
dodać świeże podłoże i cytoB; 
pobierać 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych 
później. 
– S9 
Krótkie nara żenie na 
działanie Poddawać działaniu substancji przez 3–6 
godzin; 
usunąć podłoże poddawania dzia łaniu; 
dodać świeże podłoże i cytoB; 
pobierać 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych 
później. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 714
 
– S9 
Przedłużone nara ­ 
żenie na dzia łanie Wariant A:  Poddawa ć działaniu substancji 
przez 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych 
w obecno ści cytoB; 
pobierać pod koniec okresu nara żenia.  
Wariant B:  Poddawa ć działaniu substancji 
przez 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych; 
usunąć substancj ę badaną; 
dodać świeże podłoże i cytoB; 
pobierać 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych 
później. 
Linie komórkowe poddawane dzia łaniu substancji bez cytoB 
(identyczne z przedstawionymi powy żej harmonogramami poddawania dzia łaniu substancji, z tym wyj ątkiem, że nie 
zostało dodane cytoB)  
Limfocyty, komórki podstawowe i linie komórkowe poddane dzia łaniu cytoB  
41. Najbardziej skutecznym podej ściem w odniesieniu do limfocytów jest 
rozpoczęcie narażenia na dzia łanie substancji badanej na 44–48 godzin 
po stymulacji PHA, kiedy przestanie dochodzi ć do synchronizacji cykli 
(5). W badaniu pocz ątkowym komórki s ą poddawane dzia łaniu substancji 
badanej przez 3 do 6 godzin w obecno ści S9 i przy jej braku. Usuwa si ę 
podłoże poddania dzia łaniu i zast ępuje świeżym podłożem zawieraj ącym 
cytoB, a komórki s ą pobierane 1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych 
później. 
42. Jeżeli obydwa pocz ątkowe badania polegaj ące na krótkotrwa łym (3–6 
godzin) poddaniu dzia łaniu substancji s ą negatywne lub niejednoznaczne, 
stosuje si ę przedłużone narażenie na dzia łanie bez S9. Istniej ą dwie opcje 
poddawania dzia łaniu i obie s ą równie akceptowalne. Jednak że może 
okazać się bardziej stosowne stosowanie opcji A w odniesieniu do pobu ­
dzonych limfocytów, wówczas gdy wzrost wyk ładniczy mo że maleć w 96 
godzin po stymulacji. Ponadto hodowle komórek, które nie osi ągnęły 
stanu przeg ęszczenia w chwili ko ńcowego pobierania prób w wariancie B.  
— Wariant A : komórki s ą poddawane dzia łaniu substancji badanej przez 
1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych i pobierane po zako ńczeniu 
poddawania dzia łaniu.  
— Wariant B : komórki s ą poddawane dzia łaniu substancji badanej przez 
1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych. Pod łoże poddania dzia łaniu 
substancji jest usuwane i zast ępowane świeżym podłożem, a komórki 
są pobierane po przeprowadzeniu dodatkowych 1,5–2,0 zwyk łych 
cykli komórkowych.  
43. Komórki podstawowe i linie komórkowe nale ży poddawa ć działaniu 
w sposób podobny do limfocytów, z wyj ątkiem tego, że nie trzeba stymu ­
lować ich za pomoc ą PHA przez 44–48 godzin. Komórki inne ni ż limfo­
cyty powinny by ć narażone na dzia łanie w taki sposób, żeby pod koniec 
badania komórki nadal by ły w logarytmicznej fazie wzrostu.  
Linie komórkowe bez cytoB  
44. Komórki powinny by ć poddawane dzia łaniu substancji przez 3–6 godzin 
w obecno ści S9 i przy jej braku. Usuwa si ę podłoże poddania dzia łaniu 
i zastępuje świeżym podłożem, a komórki s ą pobierane 1,5–2,0 zwyk łych 
cykli komórkowych pó źniej. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Jeżeli obydwa pocz ątkowe badania polegaj ące na krótkotrwa łym (3–6 
godzin) poddaniu dzia łania substancji s ą negatywne lub niejednoznaczne, 
stosuje si ę przedłużone narażenie na dzia łanie (bez S9). Istniej ą dwie opcje 
poddawania dzia łaniu i obie s ą równie akceptowalne:  
— Wariant A : komórki s ą poddawane dzia łaniu substancji badanej przez 
1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych i pobierane po zako ńczeniu 
poddawania dzia łaniu.  
— Wariant B : komórki s ą poddawane dzia łaniu substancji badanej przez 
1,5–2,0 zwyk łych cykli komórkowych. Pod łoże poddania dzia łaniu 
substancji jest usuwane i zast ępowane świeżym podłożem, a komórki 
są pobierane po przeprowadzeniu dodatkowych 1,5 – 2,0 zwyk łych 
cykli komórkowych.  
46. W monowarstwach mog ą być obecne komórki mitotyczne (mo żna je 
rozpoznać po okr ągłym kszta łcie i fakcie, że oddzielaj ą się od 
powierzchni) pod koniec 3–6 godzin poddawania dzia łaniu substancji. 
Z uwagi na łatwość oddzielania si ę, komórki mitotyczne mog ą zostać 
utracone w momencie, gdy usuwane jest pod łoże zawieraj ące badan ą 
substancję. Należy zadbać o to, by zosta ły pobrane w momencie mycia 
hodowli i zwrócone do hodowli, aby unikn ąć w momencie pobierania 
utraty komórek, które s ą w trakcie mitozy i w których mo że dochodzi ć 
do powstawania mikroj ąder. 
Liczba hodowli  
47. Hodowle reprodukcyjne powinny by ć stosowane dla ka żdego stężenia 
substancji badanej oraz w odniesieniu do hodowli z wykorzystaniem rozpuszczalnika/no śnika oraz negatywnych hodowli kontrolnych. Gdy 
można wykaza ć minimalne zmiany mi ędzy hodowlami reprodukcyjnymi 
na podstawie historycznych danych laboratoryjnych, dopuszczalne jest 
wykorzystanie pojedynczych hodowli. Je żeli wykorzystywane s ą poje­
dyncze hodowle, zalecane jest zbadanie wi ększej liczby st ężeń.
 
Pobieranie komórek i przygotowywanie szkie łek mikroskopowych  
48. Ka żdą kulturę pobiera si ę oddzielnie i oddzielnie poddaje dzia łaniu 
substancji. Przygotowanie komórek mo że obejmowa ć hipotoniczne prze ­
twarzanie komórek, ale etap ten nie jest konieczny, je śli komórki rozpro ­
wadzono odpowiednio w inny sposób. Mo żna wykorzysta ć różne techniki 
do przygotowania szkie łka, pod warunkiem że uzyskuje si ę wysokiej 
jakości preparaty komórkowe do celów oceny. Cytoplazm ę komórek 
należy zachowa ć w celu umo żliwienia wykrycia mikroj ąder oraz (w meto ­
dzie z wykorzystaniem blokera cytokinezy) przeprowadzenia wiarygodnej identyfikacji komórek dwuj ądrowych.
 
49. Szkie łka można barwić przy użyciu różnych metod, takich jak Giemsa lub 
fluorescencyjne szczególne barwniki DNA (59). Wykorzystanie szczegól ­
nego barwnika DNA (np. oran ż akrydynowy (61) lub Hoechst 33258 plus 
pyronina-Y (62)) mo że wyeliminowa ć niektóre spo śród artefaktów zwi ąza­
nych z barwnikiem nienadaj ącym się do szczególnego szczepu DNA. 
W celu okre ślenia treści mikroj ądra (chromosom/fragment chromosomu) 
można zastosowa ć przeciwcia ła antykinetochorowe, FISH 
z wykorzystaniem pancentromerycznych sond DNA lub syntez ę in situ  
przy udziale startera ze starterami szczególnymi dla pancentromerów, 
wraz z odpowiednim barwieniem kontrastowym DNA, je żeli informacje 
dotyczące mechanizmu ich powstawania s ą przedmiotem zainteresowania 
(15) (16). Inne metody rozró żnienia mi ędzy klastogenami i aneugenami 
mogą być wykorzystane, o ile okaza ły się skuteczne.  
Analiza  
50. Wszystkie szkie łka mikroskopowe, w łącznie z tymi z rozpuszczalnikiem/ 
nośnikiem i tymi dotycz ącymi kontroli, powinny by ć niezależnie kodo­
wane przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Alternatywnie, 
kodowane próbki mog ą być analizowane przy pomocy zatwierdzonej auto ­
matycznej cytometrii przep ływowej lub analizy obrazowej.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 716
 
51. W hodowlach poddanych dzia łaniu cytoB cz ęstość powstawania mikro ­
jąder powinna by ć analizowana w co najmniej 2 000 komórek dwuj ądro­
wych przypadaj ących na st ężenie (co najmniej 1 000 komórek dwuj ądro­
wych na hodowl ę; dwie hodowle na st ężenie). Jeżeli wykorzystywane s ą 
pojedyncze hodowle, przynajmniej 2 000 komórek dwuj ądrowych przypa ­
dających na st ężenie powinno by ć oceniane z danej hodowli. Je żeli dostęp­
nych do celów oceny jest zasadniczo mniej ni ż 1 000 komórek dwuj ądro­
wych przypadaj ących na hodowl ę lub 2 000 w przypadku hodowli poje ­
dynczej na ka żde stężenie oraz je żeli nie wykryto znacznego wzrostu 
liczby mikroj ąder, nale ży powtórzy ć badanie, stosuj ąc więcej komórek 
lub mniej toksyczne st ężenia, w zale żności od tego, co bardziej w łaściwe. 
Należy zwróci ć uwagę, by nie ocenia ć komórek dwuj ądrowych 
o nieregularnych kszta łtach lub w przypadku, gdy dwa j ądra różnią się 
znacznie pod wzgl ędem wielko ści; nie nale ży równie ż mylić komórek 
dwujądrowych ze źle rozprowadzonymi komórkami wieloj ądrowymi. 
Komórki zawieraj ące więcej niż dwa jądra główne nie powinny by ć anali­
zowane pod k ątem zawarto ści mikrojąder, poniewa ż podstawowa cz ęstość 
powstawania mikroj ąder może być wyższa w tych komórkach (63) (64). 
Ocena komórek wieloj ądrowych jest dopuszczalna, je żeli wykazano, że 
substancja badana zak łóca działanie cytoB.  
52. W liniach komórkowych badanych bez poddawania dzia łaniu cytoB 
mikrojądra powinny by ć oceniane w przynajmniej 2 000 komórkach dla 
każdego stężenia (przynajmniej 1 000 komórek na hodowl ę; dwie hodowle 
na stężenie). W przypadku gdy jest stosowana tylko jedna hodowla na 
stężenie, przynajmniej 2 000 komórek powinno zosta ć ocenione z tej 
hodowli.  
53. Gdy jest stosowane cytoB, nale ży określić CBPI lub RI, aby oceni ć proli­
ferację komórek (zob. dodatek 2), u żywając co najmniej 500 komórek na 
hodowlę. Jeśli poddawanie dzia łaniu odbywa si ę przy nieobecno ści cytoB, 
konieczne jest uzyskanie dowodów, że oceniane komórki podleg ły proli­
feracji, jak omówiono w pkt 24–27.  
Kryteria dopuszczalno ści 
54. Laboratorium, w którym proponuje si ę wykonanie badania MNvit opisa ­
nego w niniejszej TM powinno wykaza ć, że jest w stanie w sposób wiary ­
godny i dok ładny wykrywa ć substancje chemiczne o znanym dzia łaniu 
aneugennym i klastogennym, z aktywacj ą metaboliczn ą i bez niej, jak 
również znane negatywne chemikalia, wykorzystuj ąc substancje chemiczne 
odniesienia wymienione w dodatku 3. Jako dowód zdolno ści do wyko ­
nania niniejszej TM prawid łowo laboratorium powinno przedstawi ć dane 
świadczące o tym, że komórki oceniane pod k ątem tworzenia mikroj ąder 
ukończyły jeden j ądrowy podzia ł, gdy badanie przeprowadza si ę bez 
użycia cytoB.  
55. Chemikalia wymienione w dodatku 3 s ą zalecane do stosowania jako 
chemiczne substancje odniesienia. Mo żna dodać zastępcze lub dodatkowe 
substancje chemiczne, je śli ich dzia łanie jest znane oraz je śli powoduj ą one 
powstawanie mikroj ąder za pomoc ą takich samych mechanizmów dzia łania, 
a także jeśli wykazano, że są odpowiednie dla chemikaliów, które b ędą 
badane przy wykorzystaniu procedury MNvit. Uzasadnienie mog łoby obej­
mować badanie walidacyjne z wykorzystaniem wielu ró żnorodnych 
substancji lub skoncentrowane na mniejszej ich liczbie na podstawie klasy 
chemicznej substancji badanej lub mechanizmu uszkadzania.  
56. Kontrole z wykorzystaniem rozpuszczalnika/no śnika i niepoddane dzia ­ 
łaniu hodowle powinny dawa ć w rezultacie odtwarzalnie nisk ą i stałą 
częstość powstawania mikroj ąder (zazwyczaj 5–25 mikroj ąder/1 000 
komórek dla rodzajów komórek okre ślonych w pkt 11). Inne rodzaje 
komórek mog ą mieć różne zakresy reakcji, które nale ży ustalić podczas 
walidowania ich dla celów wykorzystania w badaniu MNvit. Nale ży 
wykorzysta ć dane z kontroli negatywnych, z wykorzystaniem rozpuszczal ­
nika oraz kontroli pozytywnych w celu ustalenia historycznych zakresów 
kontroli. Warto ści te nale ży wykorzysta ć do ustalenia adekwatno ści 
równoczesnych NC/PC dla celów eksperymentu.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 717
 
57. Jeżeli proponuje si ę wprowadzenie nieznacznych zmian do badania (np. 
wykorzystanie automatycznych raczej ni ż ręcznych technik oceny, zasto ­
sowanie nowego rodzaju komórek), wówczas nale ży wykaza ć skuteczno ść 
zmiany, zanim zmieniony protokó ł zostanie uznany za mo żliwy do stoso ­
wania. Wykazanie skuteczno ści obejmuje udowodnienie, że można wykry ć 
główne mechanizmy uszkadzania chromosomów oraz zyski lub straty oraz 
że odpowiednie pozytywne i negatywne wyniki mo żna osiągnąć 
w odniesieniu do klasy danej substancji, lub wielu substancji, które mają być badane.
 
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Opracowanie wyników  
58. Jeżeli zastosowano technik ę z blokerem cytokinezy, do oceny mechanizmu 
indukcji mikroj ąder stosowane s ą jedynie komórki dwuj ądrowe 
z mikroj ądrami (niezale żnie od liczby mikroj ąder przypadaj ących na 
komórkę). Ocena liczby komórek z jednym, dwoma lub wi ększą liczbą 
mikrojąder może dostarczy ć użytecznych informacji, ale nie jest obowi ąz­
kowa.  
59. Nale ży określić równoczesne pomiary cytotoksyczno ści oraz/lub cytostazy 
w odniesieniu do wszystkich poddanych dzia łaniu substancji hodowli oraz 
hodowli kontrolnych z wykorzystaniem rozpuszczalnika/no śnika (58). 
Należy obliczy ć CBPI lub RI dla wszystkich poddanych dzia łaniu 
substancji hodowli oraz hodowli kontrolnych w charakterze pomiaru opóźnienia cyklu komórkowego, kiedy stosowana jest metoda 
z blokerem cytokinezy. W przypadku braku cytoB powinny by ć zastoso­
wane RPD lub RICC lub PI (zob. dodatek 2).
 
60. Nale ży dostarczy ć dane dotycz ące poszczególnych hodowli. Dodatkowo 
wszelkie dane powinny by ć podsumowane w formie tabelarycznej.  
61. Substancje chemiczne powoduj ące w badaniu MNvit powstawanie mikro ­
jąder mogą doprowadza ć do niego na skutek tego, że powoduj ą uszkodzenia 
chromosomów czy ich utrat ę lub na skutek po łączenia tych dwóch zjawisk. 
Dalsze analizy z wykorzystaniem przeciwcia ł anty-kinetochorowych, sond 
szczególnych dla centromerów  in situ  lub innych metod mog ą służyć do 
określania, czy mechanizm indukcji mikroj ąder jest spowodowany dzia ła­
niem klastogennym czy aneugennym.  
Ocena i interpretacja wyników  
62. Nie istnieje wymóg sprawdzania przez dodatkowe badanie wyra źnie pozy­
tywnych lub negatywnych reakcji. Niejednoznaczne wyniki mog ą być 
wyjaśniane w drodze analizy kolejnych 1 000 komórek z wszystkich 
hodowli, aby unikn ąć strat zwi ązanych z utrat ą anonimowo ści próby. 
Jeśli takie podej ście nie przes ądzi o wyniku, nale ży przeprowadzi ć dalsze 
badania. Modyfikacja parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu 
ocenionych warunków powinna zosta ć rozważona w dalszych do świad­
czeniach, je śli to stosowne. Parametry badawcze, które mog ą być zmody­
fikowane, obejmuj ą zakres st ężenia, terminy poddawania dzia łaniu 
substancji i pobierania komórek i/lub warunki aktywacji metabolicznej.  
63. Istniej ą liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak 
związany ze st ężeniem wzrost lub statystycznie istotny wzrost w liczbie 
komórek zawieraj ących mikroj ądra. Biologiczne znaczenie wyników 
powinno zosta ć wzięte pod uwag ę w pierwszej kolejno ści. Uwzgl ędnienie, 
czy zaobserwowane warto ści są w obrębie historycznych zakresów 
kontroli, czy te ż poza nimi mo że stanowi ć wskazówk ę przy ocenie biolo ­
gicznego znaczenia reakcji. Mo żna wykorzysta ć odpowiednie metody 
statystyczne jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (65). Jednak że wyniki bada ń statystycznych powinny by ć oceniane 
w odniesieniu do zale żności dawka-reakcja. Nale ży równie ż wziąć pod 
uwagę odtwarzalno ść oraz dane historyczne.
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 718
 
64. Chocia ż większość eksperymentów przyniesie wyra źnie pozytywne lub 
negatywne wyniki, w niektórych przypadkach uzyskane dane uniemo ż­
liwią dokonanie ostatecznego os ądu o dzia łaniu badanej substancji. Tego 
rodzaju niejednoznaczne lub sporne wyniki mo żna uzyskiwa ć niezależnie 
od tego, ile razy powtarza si ę doświadczenie.  
65. Wyniki pozytywne z badania MNvit wskazuj ą, że substancja badana 
wywołuje uszkodzenia chromosomów lub ich utrat ę w hodowlanych 
komórkach ssaków. Wyniki negatywne wskazuj ą, że w warunkach badaw ­
czych substancja badana nie wywo łuje uszkodze ń w chromosomach i/lub 
zysków lub strat chromosomów w hodowlanych komórkach ssaków.  
Sprawozdanie z badania  
66. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć co najmniej nast ępujące infor­
macje, o ile s ą one istotne dla przebiegu badania:  
Badana substancja chemiczna:  
— dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract Services 
oraz numer WE,  
— stan skupienia i czysto ść, 
— właściwości fizykochemiczne istotne dla przeprowadzenia badania,  
— reaktywno ść badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/no śniku 
lub w hodowli komórkowej mediów.  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika/no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść substancji badanej 
w rozpuszczalniku/no śniku.  
Komórki:  
— typ i źródło wykorzystywanych komórek,  
— odpowiednio ść wykorzystywanych komórek,  
— nieobecno ść mykoplazmy, je żeli ma zastosowanie,  
— informacja dotycz ąca długości cyklu komórkowego, czasu podwojenia 
lub indeksu proliferacji,  
— jeżeli stosuje si ę limfocyty, p łeć, wiek, liczb ę dawców krwi, je śli ma to 
zastosowanie,  
— jeżeli stosuje si ę limfocyty – informacja o tym, czy nara żona jest krew 
pełna czy wydzielone limfocyty,  
— liczba przej ść, jeżeli ma zastosowanie,  
— metoda utrzymania hodowli komórek, je żeli ma zastosowanie,  
— zmienna liczba chromosomów,  
— zwykła (kontrola ujemna) d ługość cyklu komórkowego.  
Warunki badania:  
— dane identyfikacyjne substancji blokuj ącej cytokinez ę (np. cytoB), o ile 
jest wykorzystywana i jej st ężenie oraz czas nara żenia komórek,  
— racjonalne uzasadnienie wyboru st ężeń oraz liczby hodowli, w tym np. 
dane dotycz ące cytotoksyczno ści oraz ogranicze ń rozpuszczalno ści, 
jeżeli są dostępne, 
— skład podłoża, stężenie CO  2 , jeżeli ma zastosowanie,  
— stężenia substancji badanej,  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— stężenia (i/lub obj ętość) nośnika oraz dodanej substancji badanej,  
— temperatura i czas inkubacji,  
— czas trwania poddania dzia łaniu substancji,  
— okres pobierania po poddaniu dzia łaniu,  
— gęstość komórki w czasie osadzania, je żeli właściwe,  
— rodzaj oraz sk ład systemu aktywacji metabolicznej, w tym kryteria 
dopuszczalno ści, 
— substancje chemiczne kontroli pozytywnych i kontrole negatywne,  
— metody przygotowania szkie łek mikroskopowych oraz stosowane tech ­
niki barwienia,  
— kryteria identyfikacji mikroj ąder, 
— liczba poddanych analizie komórek,  
— metody pomiaru cytotoksyczno ści, 
— wszelkie dodatkowe informacje dotycz ące cytotoksyczno ści, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne, negatywne lub niejedno ­
znaczne,  
— stosowana(-e) metoda (-y) analizy statystycznej,  
— metody, takie jak wykorzystanie przeciwcia ł kinetochorowych, stoso ­
wane w celu okre ślenia, czy mikroj ądra zawieraj ą całe lub rozdrob ­
nione chromosomy, je śli ma to zastosowanie.  
Wyniki:  
— zastosowany pomiar cytotoksyczno ści, np. CBPI lub RI w przypadku 
metody z wykorzystaniem blokera cytokinezy; RICC, RPD lub PI, gdy nie były wykorzystywane metody z wykorzystaniem blokera cytoki ­
nezy; inne uwagi w stosownych przypadkach, np. zrastanie si ę komó­
rek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz, cz ęstotliwość występowania 
komórek dwuj ądrowych,
 
— oznaki str ącania,  
— dane dotycz ące pH oraz osmolalno ści podłoża poddania dzia łaniu 
substancji, je żeli są określone,  
— definicja komórek dopuszczalnych do celów analizy,  
— dystrybucja jedno-, dwu- i wieloj ądrowych komórek, je żeli stosowana 
jest metoda z wykorzystaniem blokera cytokinezy,  
— liczba komórek z mikroj ądrami, podana oddzielnie dla ka żdej hodowli 
poddanej dzia łaniu substancji i hodowli kontrolnej, wraz z informacj ą, 
czy to z komórek jedno- czy dwuj ądrowych, w stosownych przypad ­
kach,  
— zależność stężenie-reakcja, o ile to mo żliwe,  
— dane dotycz ące substancji chemicznej stosowanej jako równoczesna 
negatywna (rozpuszczalnik/no śnik) oraz pozytywna kontrola (st ężenia 
i rozpuszczalniki,  
— historyczne dane dotycz ące substancji chemicznej stosowanej jako 
równoczesna negatywna (rozpuszczalnik/no śnik) oraz pozytywna 
kontrola, wraz z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyle ­
niami i przedzia łem ufności (np. 95 %),  
— analiza statystyczna; warto ści p, jeśli istnieją; 
Omówienie wyników  
Wnioski  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
BIBLIOGRAFIA  
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test.  
Mutation Res. , 392, 1–4.  
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the 
aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community 
aneuploidy project,  Mutation Res. , 287, 3–15.  
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in 
the micronucleus assay,  Cytobios. , 43, 233–246.  
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the  In Vitro  Micronucleus 
Assay Working Group,  Environ. Mol. Mutagen. , 35, 167–172.
 
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay,  Nature 
Protocols, 2  (5), 1084–1104.  
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus 
method in human lymphocytes: effect of  in-vivo  ageing and low dose 
X-irradiation,  Mutation Res. , 161, 193–198.  
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of 
aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody,  Environ. Mol. Mutagen. , 13, 34–43.
 
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and 
aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence  in- 
situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes,  Mutation Res. , 
234, 9–20.  
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), 
Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to  in situ  hybridization with 
biotinylated gamma satellite DNA,  Mutagenesis , 6, 297–302.
 
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluores ­
cence  in-situ  hybridisation for the detection of aneugens in 
cytokinesis-blocked mouse splenocytes,  Mutagenesis , 8, 329–334.  
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytoge ­
netic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds 
and micronucleus analysis by fluorescence  in situ  hybridization with 
a centromeric probe,  Mutation Res. , 319, 205–213.  
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chro ­
mosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by 
antikinetochore staining and  in situ  hybridization,  Mutagenesis , 8, 519–525.  
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyper ­
diploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes follo ­
wing exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor 
fluorescence  in situ  hybridization with DNA probes,  Mutation Res. , 322, 
9–20.  
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), 
Fluorescence  in situ  hybridisation (FISH) with chromosome-specific centro ­
meric probes: a sensitive method to detect aneuploidy,  Mutation Res. , 372, 
233–245.  
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of 
chromosome segregation by means of fluorescence  in situ  hybridization: 
application to cytokinesis-blocked human lymphocytes,  Mutation Res. , 
372, 211–219.  
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der 
Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the  in vitro  micronucleus 
assay working group.  Mutation Res. , 540, 153–163.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 721
 
(17) OECD (1997),  In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test , Test 
Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, 
Paryż. Dostępny na stronie: [www.oecd.org/env/testguidelines]  
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. 
and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on  in vitro  
micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study,  Mutation Res. , 607, 13–36.
 
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, 
R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test. II. 
Using human lymphocytes,  Mutation Res. , 607, 37–60.
 
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., 
Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, 
D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, III. Using CHO cells,  Mutation Res. , 607, 61–87.  
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Koba ­
yashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in 
vitro  micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells,  Mutation Res. , 607, 
88–124.
 
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., 
Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the  in vitro  micronucleus test, V. 
Using L5178Y cells,  Mutation Res. , 607, 125–152.
 
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data 
on in vitro  MNT and  in vitro  CA: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
187–208.  
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), 
Comparative evaluation of the  in vitro  micronucleus test and the  in vitro  
chromosome aberration test: industrial experience,  Mutation Res. , 392, 
45–59.  
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and 
Madle, S. (1998), Evaluation of the  in vitro  micronucleus test as an alter ­
native to the  in vitro  chromosomal aberration assay: position of the GUM 
Working Group on the  in vitro  micronucleus test. Gesellschaft fur 
Umwelt-Mutations-forschung,  Mutation Res. , 410, 81–116.  
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemi ­
cally induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three 
different test approaches,  Mutation Res.  439, 183–190.  
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. 
(1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 
cells to detect drug-induced photogenotoxicity,  Mutation Res.  445, 55–71.  
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., 
Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000),  In vitro  micronucleus assay with Chinese hamster V79 
cells - results of a collaborative study with  in situ  exposure to 26 chemical 
substances,  Mutation Res ., 468, 137–163.
 
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 517, 123–134.
 
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., 
Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and 
Sofuni, T. (1999), Validation study of the  in vitro  micronucleus test in 
a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU),  Mutagenesis , 14, 569–580.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 722
 
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International 
collaborative study on  in vitro  micronucleus test,  Mutation Res. , 607, 
1–152.  
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of 
Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on 
the scientific validity of the  in vitro  micronucleus test as an alternative to 
the in vitro  chromosome aberration assay for genotoxicity testing. 25. 
konferencja ESAC, 16-17 listopada, 2006 r., dost ępny na stronie: [http:// 
ecvam.jrc.it/index.htm]  
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer 
Review, Retrospective Validation of the  In Vitro  Micronucleus Test, 
Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, dost ępne na stronie: 
[http://ecvam.jrc.it/index.htm]  
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, 
van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of  
in vitro  Micronucleus Test (MNT),  Mutagenesis , 23, 271–283.  
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and 
Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid 
and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the  in vitro  micronucleus test,  
Mutation Res. , 347, 105–115.  
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and 
Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B  1 is genotoxic in human derived hepa ­
toma (HepG2) cells,  Mutagenesis , 17, 257–260.  
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., 
Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge,  Toxicol. , 198, 315–328.
 
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., 
Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian 
hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation 
assay for National Toxicology Program test chemicals,  Mutation Res. , 392, 
61–70.  
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., 
Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under 
extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9,  Mutation 
Res., 257, 147-205.
 
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity 
of low pH to various cultured mammalian cells,  Mutation Res. , 268, 
297–305.  
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced 
by low pH treatment conditions and increased ion concentrations,  Environ. 
Mutagen ., 8, 789–886.  
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in 
lymphocytes,  Mutation Res. , 147, 29–36.  
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood 
micronucleus method,  Mutation Res. , 392, 11–18.  
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., 
Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhale ­
vich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, 
M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, 
I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the 
frequency of micronuclei,  Environ. Mol. Mutagen.  37, 31–45.
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 723
 
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella 
mutagenicity test,  Mutation Res. , 113, 173–215.  
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential 
effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver,  J. Environ. Pathol. Toxicol. , 
4, 55–65.
 
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, 
G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254- induced S9 in  in-vitro  genotoxicity assays.  Mutagenesis , 7, 175–177.
 
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe 
substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Acti ­
vation Systems,  In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, 
R.M. (eds),  In Vitro  Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, 
North-Holland, pp. 85–88.  
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver 
S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison 
with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9,  
Environ. Mol. Mutagen. , 28, 51–59.  
(50) UNEP (2001 r.), Konwencja Sztokholmska w sprawie trwa łych zanieczysz ­
czeń organicznych, Program Narodów Zjednoczonych ds. Ochrony 
Środowiska (UNEP). Dost ępny na stronie: [http://www.pops.int/]  
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investi ­
gation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells,  Mutagenesis , 11, 
247–274.
 
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Muta ­
tion Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids,  In: Tice, R.R., Costa, 
D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. Nowy 
Jork, Plenum, pp. 91–103.  
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation 
of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay,  Environ. 
Mutagenesis  5, 795–801.
 
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: 
a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations,  Mutation Res. , 285, 35–44.
 
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the  
in vitro  micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol 
suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals 
with different mechanisms of action and different levels of activity,  Muta­
tion Res. , 521, 103–112.  
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., 
Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., 
Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the  in vitro  micronucleus assay working group”,  Mutation 
Res., 564, 97–100.
 
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear 
assay in lymphocytes,  Mutation Res. , 139, 61–65.  
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison 
of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the  in 
vitro  micronucleus test. I. Theoretical aspects,  Mutation Res. , 655, 1–3.  
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. 
(1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures,  Mutation Res. , 341, 
169–184.
 
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations  in vitro : 
Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the 
aberration assay, Environ. Molec.  Mutagenesis  35, 191–201.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 724
 
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of 
Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple 
Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y,  Mutation Res. , 120, 269–275.
 
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of 
acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test,  Mutation 
Res., 120, 241–247.  
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and 
Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria 
for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lympho ­
cyte cultures,  Mutation Res. , 534, 65–75.  
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003),  In vitro  micronucleus 
test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. 
Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork, NY, pp. 463–467.  
(66) Rozporz ądzenie (WE) nr 850/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 
29 kwietnia 2004 r. dotycz ące trwałych zanieczyszcze ń organicznych 
i zmieniaj ące dyrektyw ę 79/117/EWG, Dz.U. L 229 z 30.4.2004, s. 5.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Dodatek 1  
Definicje  
Aneugen:  każda substancja lub proces, który poprzez reakcj ę z elementami mito ­
tycznego i mejotycznego cyklu podzia łu komórek prowadzi do aneuploidii 
w komórkach lub organizmach.  
Aneuploidia:  wszelkie odchylenia od zwyk łej diploidalnej (lub haploidalnej) 
liczby chromosomów w pojedynczym chromosomie lub w wi ększej ich liczbie, 
ale nie w ca łym zestawie(-ach) chromosomów (poliploidalno ść). 
Apoptoza:  zaprogramowana śmierć komórki, na któr ą składa się szereg etapów 
prowadzących do rozpadu komórek w cz ąstki otoczone b łoną, które są następnie 
eliminowane przez fagocytoz ę lub wydalanie.  
Proliferacja komórek:  wzrost liczby komórek powsta ły w wyniku mitotycznego 
podziału komórek.  
Centromer:  region DNA chromosomu, w którym obydwie chromatydy si ę łączą 
i do którego s ą przyczepione obydwa kinetochory, jeden obok drugiego.  
Klastogen:  każda substancja lub proces, który powoduje strukturalne aberracje 
chromosomalne w populacjach komórek lub organizmów.  
Cytokineza:  proces podzia łu komórki nast ępujący bezpo średnio po mitozie, 
mający na celu utworzenie dwóch komórek potomnych, z których ka żda zawiera 
jedno jądro. 
Wskaźnik proliferacji blokera cytokinezy (CBPI):  odsetek komórek w trakcie 
drugiego podzia łu w populacji poddanej dzia łaniu substancji w stosunku do 
hodowli kontrolnej niepoddawanej dzia łaniu (zob. dodatek 2).  
Cytostaza:  hamowanie wzrostu komórek (zob. wzór w dodatku 2).  
Cytotoksyczno ść: szkodliwe skutki dla struktury lub funkcji komórek, ostatecznie 
powodujące śmierć komórki.  
Genotoksyczny:  termin ogólny, obejmuj ący wszystkie rodzaje uszkodze ń DNA 
lub chromosomu, w tym przerwy, przegrupowania adduktów, mutacje, aberracje chromosomowe i aneuploidi ę. Nie wszystkie rodzaje skutków genotoksycznych 
powodują mutacje lub sta łe uszkodzenia chromosomu.
 
Komórki w interfazie:  komórki nie w fazie mitozy.  
Kinetochor:  struktura zawieraj ąca białko na centromerze chromosomu, do której 
przyczepiaj ą się włókna wrzeciona kariokinetycznego w trakcie podzia łu 
komórki, umo żliwiając uporządkowane przemieszczanie si ę chromosomów 
potomnych do biegunów komórek potomnych.  
Mikrojądra: małe jądra, oddzielone oraz wyst ępujące dodatkowo w stosunku do 
jądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telofazy mitozy lub mejozy 
przez opó źnione fragmenty chromosomów lub ca łe chromosomy.  
Mitoza:  podział jądra komórkowego, na który zazwyczaj sk ładają się profaza, 
prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza.  
Indeks mitotyczny:  stosunek komórek w metafazie podzielony przez ca łkowitą 
liczbę komórek zaobserwowanych w populacji komórek; wskazanie stopnia proli ­
feracji komórek tej populacji.  
Mutagenny:  tworzy dziedziczne zmiany w sekwencji(-ach) pary zasad DNA 
w genach lub w strukturze chromosomów (aberracje chromosomowe).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Nondysjunkcja:  nierozdzielenie si ę pary chromatyd i brak odpowiedniego ich 
rozdziału do komórek potomnych, w wyniku czego powstaj ą komórki potomne 
z nieprawid łową liczbą chromosomów.  
Poliploidalno ść: liczbowe aberracje chromosomowe w komórkach lub organiz ­
mach, obejmuj ące cały zestaw(-y) chromosomów, a nie pojedyncze chromosomy 
(aneuploidia).  
Wskaźnik proliferacji (PI):  metoda pomiaru cytotoksyczno ści, kiedy nie stosuje 
się cytoB (zob. wzór w dodatku 2).  
Względny wzrost liczby komórek (RICC):  metoda pomiaru cytotoksyczno ści, 
kiedy nie stosuje si ę cytoB (zob. wzór w dodatku 2).  
Względne podwojenie populacji (RPD):  metoda pomiaru cytotoksyczno ści, kiedy 
nie stosuje si ę cytoB (zob. wzór w dodatku 2).  
Wskaźnik replikacji (RI):  odsetek zako ńczonych cykli podzia łu komórkowego 
w hodowli poddanej dzia łaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnej 
niepoddawanej dzia łaniu, podczas okresu nara żenia i odzysku (zob. wzór 
w dodatku 2).  
Substancja badana (okre ślana także jako badana substancja chemiczna):  każda 
substancja lub mieszanina, badana za pomoc ą niniejszej TM.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Dodatek 2  
Wzory do celów oceny cytotoksyczno ści 
1. Kiedy stosuje si ę cytoB  ocena cytotoksyczno ści powinna opiera ć się na 
wskaźniku proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) lub wska źniku replikacji (RI) 
(16) (58). CBPI okre śla średnią liczbę cykli komórkowych przypadaj ących na 
komórkę w okresie nara żenia na cytoB i mo że być wykorzystane do obliczenia 
proliferacji komórek. RI okre śla względną liczbę jąder w hodowlach poddawa ­
nych dzia łaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnych i mo że być wyko­
rzystane do obliczenia % cytostazy:  
% cytostazy = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
oraz 
T = hodowla poddana dzia łaniu substancji badanej  
C = nośnik kultury kontrolnej  
gdzie:  
CBPI ¼ ððliczba komúrek jednoj ądrowychÞ þ ð2 Ü liczba komúrek dwuj ądrowychÞ þ ð3 Ü liczba komúrek wieloj ądrowychÞÞ 
ðcałkowita liczba komúrek Þ 
Dlatego te ż wartość CBPI równa 1 (wszystkie komórki s ą jednojądrowe) jest 
równoważna 100 % cytostazy.  
Cytostaza = 100 – RI  
RI ¼ ððliczba komórek dwuj ądrowychÞ þ ð2 Ü liczba komórek wieloj ądrowychÞÞ ö ðcałkowita liczba komúrek Þ T 
ððliczba komórek dwuj ądrowychÞ þ ð2 Ü liczba komórek wieloj ądrowychÞÞ ö ðcałkowita liczba komúrek Þ C Ü 100 
T = hodowle poddawane dzia łaniu substancji  
C = hodowle kontrolne  
2. Tym samym warto ść RI równa 53 % oznacza, że w porównaniu do liczby 
komórek, które podzieli ły się i utworzy ły komórki dwu- i wieloj ądrowe 
w hodowli kontrolnej, jedynie 53 % tej liczby podzieli ło się w hodowli poddanej 
działaniu, czyli cytostaza wynosi 47 %.  
3. Kiedy nie stosuje si ę cytoB , zaleca si ę przeprowadzenie oceny cytotoksycz ­
ności w oparciu o wzgl ędny wzrost liczby komórek (RICC) lub wzgl ędne 
podwojenie populacji (RPD) (58), poniewa ż oba te wska źniki uwzgl ędniają 
odsetek populacji komórek, które si ę podzieliły. 
RICC ¼ ðwzrost liczbykomúrek whodowlach poddanych dzia łaniu substancji ðliczba końcowa –liczba pocz ątkowaÞÞ 
ðwzrost liczby komúrek whodowlach kontrolnych  ðliczba końcowa – liczba pocz ątkowaÞÞ Ü 100 
RPD ¼ ðliczba podwoje ń populacji whodowlach poddanych dzia łaniu substancjiÞ 
ðliczba podwoje ń populacji whodowlach kontrolnych Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
gdzie:  
Podwojenie populacji = [log (liczby komórek po poddaniu dzia łaniu ÷ 
początkowa liczba komórek)] ÷ log 2  
4. Dlatego te ż RICC lub RPD równe 53 % oznacza 47 % cytotoksyczno ści/ 
cytostazy.  
5. Stosuj ąc wskaźnik proliferacji (PI), mo żna dokona ć oceny cytotoksyczno ści 
poprzez liczenie klonów sk ładających się z 1 komórki (cl1), 2 komórek (cl2), 3 – 
4 komórek (cl4) i 5 do 8 komórek (cl8)  
PI ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. PI zosta ł wykorzystany jako cenny i wiarygodny parametr cytotoksyczno ści 
również w przypadku linii komórkowych hodowanych  in situ  w nieobecno ści 
cytoB (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Dodatek 3  
Chemiczne substancje odniesienia zalecane dla oceny efektywno ści ( 1 ) 
Kategoria Chemikalia Nr CAS Nr WE  
1. Klastogeny czynne bez aktywacji metabolicznej 
Arabinozyd cytozyny 147-94-4 205-705-9 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 
2. Klastogeny wymagaj ące aktywacji metabolicznej 
Benzo(a)piren 50-32-8 200-028-5 
Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugeny 
Kolchicyna 64-86-8 200-598-5 Winblastyna 143-67-9 205-606-0 
4. Substancje negatywne 
ftalan di(2-etyloheksylu) 117-81-7 204-211-0 
Kwas nalidyksowy 389-08-2 206-864-7 
Piren 129-00-0 204-927-3 Chlorek sodu 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Substancje chemiczne odniesienia s ą chemikaliami zalecanymi do stosowania. Zast ąpienie lub dodanie substancji chemicznych do 
wykazu chemicznych substancji odniesienia mo że nastąpić, jeśli wiadomo, że ich dzia łanie powoduje powstawanie mikroj ąder 
w wyniku takich samych mechanizmów dzia łania, i jeśli wykazano, że są odpowiednie dla chemikaliów, które b ędą badane przy 
wykorzystaniu procedury MNvit. W zale żności od celu, uzasadnienie mog łoby obejmowa ć badanie walidacyjne z wykorzystaniem 
wielu różnorodnych substancji lub skoncentrowane na mniejszej ich liczbie na podstawie klasy chemicznej substancji badanej lub 
mechanizmu uszkadzania.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  DZIA ŁANIE UCZULAJ ĄCE NA SKÓR Ę: BADANIE 
LOKALNYCH W ĘZŁÓW CHŁONNYCH DA  
WSTĘP 
1. Wytyczne OECD w odniesieniu do badania chemikaliów i metody bada ń 
UE są okresowo poddawane przegl ądowi w zwi ązku z post ępem nauko ­
wym, zmieniaj ącymi się potrzebami regulacyjnymi oraz trosk ą o dobrostan 
zwierząt. Pierwsza metoda badania (TM) (B.42) przy okre ślaniu dzia łania 
uczulającego na skór ę u myszy – badanie lokalnych w ęzłów chłonnych 
(LLNA; wytyczna OECD 429 dotycz ąca badań) została poddana prze ­
glądowi (1). Szczegó ły walidacji LLNA i przegl ąd powiązanej bibliografii 
opublikowano w (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). W LLNA radioizotopy 
tymidyny lub jodyny s ą stosowane do pomiaru proliferacji limfocytów i w 
związku z tym badanie ma ograniczone zastosowanie w przypadku, gdy 
nabycie, zastosowania lub usuwanie promieniotwórczo ści jest problema ­
tyczne. Badanie LLNA: DA (opracowane przez Daicel Chemical Indust ­
ries, Ltd.) jest niepromieniotwórczym wariantem badania LLNA, dzi ęki 
któremu, poprzez wykorzystanie bioluminescencji, udaje si ę dokonać 
pomiaru ilo ściowego zawarto ści adenozynotrifosforanu (ATP), s łużącego 
za wskaźnik proliferacji limfocytów. Badanie LLNA: DA zosta ło zatwier ­
dzone i poddane przegl ądowi oraz zalecone przez mi ędzynarodowy panel 
ds. wzajemnych przegl ądów jako przydatne do rozpoznawania chemika ­
liów uczulaj ących skór ę i jej nieuczulaj ących, z pewnymi zastrze żeniami 
(10) (11) (12) (13). Ta TM jest zaprojektowana dla celów oceny poten ­
cjału uczulenia skóry przez chemikalia (substancje i mieszaniny) 
u zwierząt. Rozdzia ł B.6 niniejszego za łącznika oraz wytyczna OECD 
dotycząca badań nr 406 wykorzystuj ą badania na świnkach morskich, 
w szczególno ści test maksymalizacji na śwince morskiej oraz test Buehlera 
(14). Metoda LLNA (rozdzia ł B.42 niniejszego za łącznika; wytyczna 
OECD dotycz ąca badań nr 429) oraz jej dwa niepromieniotwórcze 
warianty: LLNA: DA (rozdzia ł B.50 niniejszego za łącznika; wytyczna 
OECD dotycz ąca badań nr 442 A) oraz LLNA: BrdU-ELISA (rozdzia ł 
B.51 niniejszego za łącznika; wytyczna OECD dotycz ąca badań nr 442 
B) zapewniaj ą bardziej ograniczone i udoskonalone wykorzystanie 
zwierząt w porównaniu z badaniami na świnkach morskich opisanymi 
w B.6 i w wytycznej OECD dotycz ącej badań nr 406 (14).  
2. Podobnie jak metoda LLNA, LLNA: DA bada faz ę indukcyjn ą uczulenia 
skóry i dostarcza danych ilo ściowych odpowiednich dla dokonania oceny 
dawka-reakcja. Ponadto zdolno ść do wykrywania substancji dzia łających 
uczulająco na skór ę bez konieczno ści korzystania z izotopowego ozna ­
czania DNA eliminuje mo żliwość narażenia zawodowego na dzia łanie 
promieniotwórcze oraz kwestie zwi ązane z usuwaniem odpadów. To 
z kolei mo że pozwoli ć na zwiększone wykorzystanie myszy w celu 
wykrycia substancji dzia łających uczulaj ąco na skór ę, co może doprowa ­
dzić do dalszego ograniczenia stosowania świnek morskich do badania 
odporności na dzia łanie uczulaj ące na skór ę (tj. B6; wytyczna OECD 
dotycząca badań nr 406) (14).  
DEFINICJE  
3. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 1.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
4. LLNA: DA to zmodyfikowana metoda LLNA do wykrywania chemika ­
liów potencjalnie uczulaj ących skór ę, ze szczególnymi ograniczeniami. Nie 
oznacza to, że należy koniecznie we wszystkich przypadkach stosowa ć 
LLNA: DA zamiast LLNA lub bada ń na śwince morskiej (tj. B.6; 
wytyczna OECD dotycz ąca badań nr 406) (14), a tylko, że badanie to 
ma tę samą wartość merytoryczn ą i może zostać zastosowane jako badanie 
alternatywne, którego pozytywne lub negatywne wyniki nie wymagaj ą już 
dalszego potwierdzenia (10) (11). Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dost ępne informacje na temat badanej substancji 
przed rozpocz ęciem bada ń. Informacje te powinny obejmowa ć tożsamość 
i budowę chemiczn ą badanej substancji; jej w łaściwości fizyko-chemiczne; 
wyniki innych bada ń toksyczno ści in vitro  lub in vivo  badanej substancji
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
i dane toksykologiczne dotycz ące strukturalnie pokrewnych substancji 
chemicznych. Nale ży uwzględnić te informacje przy okre ślaniu, czy 
metoda LLNA: DA jest odpowiednia do badania danej substancji (z uwagi na niekompatybilno ść niektórych rodzajów chemikaliów z metod ą 
LLNA DA [zob. pkt 5] oraz przy wyborze dawki.
 
5. Będąc metodą in vivo , LLNA: DA nie eliminuje wykorzystania zwierz ąt 
w określaniu alergicznego kontaktowego dzia łania uczulaj ącego. Mo że ona 
jednak ograniczy ć stosowanie zwierz ąt do tego celu w porównaniu 
z badaniami na świnkach morskich (B.6; wytyczna OECD dotycz ąca 
badań nr 406) (14). Co wi ęcej, LLNA oferuje znacznie bardziej wyrafi ­
nowany sposób wykorzystywania zwierz ąt (mniej bólu i cierpienia) do 
badania alergicznego kontaktowego dzia łania uczulaj ącego, gdy ż 
w odróżnieniu od B.6 i wytycznej OECD dotycz ącej badań nr 406 metoda 
DA nie wymaga wywo ływania reakcji nadwra żliwości skóry poprzez 
prowokacj ę. Pomimo zalet LLNA: DA i jej przewagi nad B.6 
i wytyczn ą OECD dotycz ącą badań nr 406 (14), istniej ą pewne ograni ­
czenia, które mog ą spowodowa ć konieczno ść wykorzystania B.6 lub 
wytycznej OECD dotycz ącej badań nr 406 (np. badanie niektórych metali, 
fałszywe wyniki pozytywne w przypadku niektórych środków dra żniących 
skórę [takich jak niektóre substancje powierzchniowo czynne] (6) (1 oraz 
rozdział B.42 w niniejszym za łączniku), rozpuszczalno ść badanej substan ­
cji). Ponadto klasy chemiczne lub substancje zawieraj ące grupy funkcjo ­
nalne, co do których wykazano, że działają jako potencjalne czynniki 
zakłócające (16), mog ą wymaga ć użycia bada ń na świnkach morskich 
(tj. B.6; wytyczna OECD dotycz ącej badań nr 406 (14)). Zalecono stoso ­
wanie ogranicze ń wskazanych w LLNA (1 oraz rozdzia ł B.42 
w niniejszym za łączniku) równie ż w odniesieniu do LLNA: DA (10). 
Ponadto wykorzystanie LLNA: DA mo że okazać się nieodpowiednie 
w przypadku badania substancji, które wp ływają na poziom ATP (np. 
substancji dzia łających jako inhibitory ATP) lub tych, które wp ływają 
na pomiar mi ędzykomórkowego ATP (np. z uwagi na obecno ść enzymów 
rozkładających ATP, obecno ść międzykomórkowego ATP w w ęźle chłon­
nym). Oprócz tych zidentyfikowanych przypadków metoda LLNA: DA powinna by ć odpowiednia do badania wszelkich substancji, chyba że 
istnieją właściwoś
ci związane z tymi substancjami, które mog ą wpływać 
na dokładność badania LLNA: DA. Ponadto nale ży uwzględnić możliwość 
otrzymania pozytywnych wyników granicznych gdy warto ści wskaźnika 
stymulacji (SI) kszta łtują się pomiedzy 1,8 a 2,5 (zob. pkt 31–32). Opiera 
się to na bazie danych uzyskanej przy zatwierdzaniu 44 substancji 
z wykorzystaniem SI ≥ 1,8 (zob. pkt 6), gdzie za pomoc ą LLNA: DA 
poprawnie zidentyfikowano wszystkie 32 LLNA substancje uczulaj ące, 
lecz niew łaściwie oznaczono trzy z 12 LLNA substancji nieuczulaj ących 
o wartościach SI pomi ędzy 1,8 i 2,5 (tj. graniczne warto ści dodatnie) (10). 
Jednak w zwi ązku z tym, że ten sam zestaw danych by ł stosowany do 
ustalania warto ści SI i obliczania przewidywalnych w łaściwości badania, 
przytoczone wyniki mog ą być zawyżonym szacunkiem prawdziwych prze ­
widywalnych w łaściwości. 
ZASADA METODY BADANIA  
6. Podstawow ą zasadą u podłoża LLNA: DA jest fakt, że czynniki uczulaj ące 
wywołują proliferacj ę limfocytów w w ęźle chłonnym odprowadzaj ącym 
limfę z miejsca przy łożenia środka chemicznego. Ta proliferacja jest 
proporcjonalna do zastosowanej dawki oraz potencja łu zastosowanego 
alergenu i jest prostym środkiem uzyskania ilo ściowego pomiaru uczule ­
nia. Proliferacja jest mierzona przez porównanie średniej proliferacji 
w każdej badanej grupie do średniej proliferacji w grupie kontrolnej otrzy ­
mującej nośnik (VC). Okre śla się stosunek średniej proliferacji w ka żdej 
grupie poddanej dzia łaniu środka do średniej proliferacji w równoleg łej 
grupie VC, który jest nazywany wska źnikiem stymulacji (SI) i powinien 
wynosić ≥ 1,8 zanim substancja badana zostanie zaklasyfikowana jako  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 732
 
potencjalny czynnik uczulaj ący skórę. Procedury opisane w niniejszym 
dokumencie s ą oparte na wykorzystaniu pomiaru zawarto ści ATP na 
podstawie bioluminescencji (o której wiadomo, że jest zgodna z liczb ą 
żywych komórek) (17) do wykrycia zwi ększonej liczby rozmna żających 
się wegetatywnie komórek w odprowadzaj ących usznych w ęzłach chłon­
nych (18) (19). Metoda z wykorzystaniem bioluminescencji pos ługuje się 
enzymem lucyferazy do katalizowania zjawiska powstawania światła 
z ATP i lucyferyny zgodnie z nast ępującą reakcją: 
ATP + Luciferin  + O 2
 Oxyluciferin  + AMP  + PP  i + CO  2 
+ Light  
Natężenie emitowanego światła jest liniowo powi ązane ze st ężeniem ATP 
i mierzy si ę je za pomoc ą luminometra. Badanie z wykorzystaniem 
lucyferyny-lucyferazy jest czu łą metodą ilościowego pomiaru ATP wyko ­
rzystywan ą w szerokim wachlarzu zastosowa ń (20).  
OPIS BADANIA  
Dobór gatunków zwierz ąt 
7. Mysz jest gatunkiem preferowanym do tego badania. Badania walidacyjne 
dla LLNA: DA by ły przeprowadzane wy łącznie na szczepie CBA/J, który 
z tego wzgl ędu uznaje si ę za szczep preferowany (12) (13). Wykorzystuje 
się młode doros łe samice myszy, które s ą nieródkami i nie s ą w ciąży. Na 
początku doświadczenia samice powinny mie ć 8–12 tygodni, 
a zróżnicowanie mas cia ła poszczególnych zwierz ąt powinno by ć mini­
malne i nie przekracza ć 20 % średniej masy cia ła. Można ewentualnie 
wykorzysta ć inne szczepy i samce, je żeli dysponuje si ę danymi świadcz­ 
ącymi o tym, że nie istniej ą znaczące różnice w reakcji na LLNA: DA 
w zależności od szczepu i/lub p łci. 
Warunki w pomieszczeniach dla zwierz ąt i pożywienie  
8. Myszy powinny by ć trzymane w grupach (21), chyba że istnieją odpo­
wiednie naukowe przes łanki dla trzymania myszy pojedynczo. Tempera ­
tura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosi ć 22 ± 
3 °C. Chocia ż wilgotno ść względna powinna wynosi ć co najmniej 30 % 
i pożądane jest, żeby nie przekracza ła 70 % poza czasem czyszczenia 
pomieszczenia, celem powinno by ć utrzymywanie jej na poziomie 
50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 
12 godzin ciemno ści. Do żywienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze 
laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.  
Przygotowanie zwierz ąt 
9. Zwierz ęta wybierane s ą losowo i znakowane w sposób umo żliwiający 
indywidualn ą identyfikacj ę (ale nie przez jakiekolwiek znaki na uszach) 
i trzymane w klatkach przez co najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem 
dawkowania w celu umo żliwienia zaaklimatyzowania do warunków labo ­
ratoryjnych. Przed rozpocz ęciem podawania bada si ę wszystkie zwierz ęta 
w celu upewnienia si ę, że nie maj ą żadnych zauwa żalnych zmian skór ­
nych.  
Przygotowanie roztworów dozuj ących  
10. Sta łe substancje powinny zosta ć rozpuszczone lub zawieszone 
w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz rozcie ńczone, 
jeżeli jest to odpowiednie, przed zastosowaniem na uchu myszy. Chemi ­
kalia płynne można zastosowa ć czyste lub rozcie ńczone przed dawkowa ­
niem. Chemikalia nierozpuszczalne, takie jak te najcz ęściej spotykane 
w wyrobach medycznych, nale ży poddać ekstrakcji w wyj ątkowych 
warunkach w odpowiednim rozpuszczalniku w celu wykrycia wszystkich możliwych do wyekstrahowania sk ładników do badania przed zastosowa ­
niem na uchu myszy. Substancje badane nale ży przygotowywa ć codzien­
nie, chyba że dane dotycz ące stabilno ści wykazuj ą dopuszczalno ść skła­
dowania.
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 733
 
Sprawdzenie wiarygodno ści 
11. Pozytywne substancje kontrolne (PC) wykorzystuje si ę do wykazania 
właściwego dzia łania badania poprzez ich reakcj ę z odpowiedni ą 
i powtarzaln ą czułością na badan ą substancj ę uczulającą, dla której wiel ­
kość reakcji jest dobrze scharakteryzowana. W łączanie równoleg łej PC jest 
zalecane, poniewa ż potwierdza si ę w ten sposób kompetencje laboratorium 
do skutecznego przeprowadzenia ka żdego badania i umo żliwia dokonanie 
oceny odtwarzalno ści i porównywalno ści wewnątrz- i międzylaboratoryj ­
nej. Niektóre organy regulacyjne mog ą wymaga ć także PC dla ka żdego 
badania i w zwi ązku z tym zach ęca się użytkowników do konsultacji 
z właściwymi organami przed rozpocz ęciem LLNA: DA. Odpowiednio 
zaleca si ę rutynowe wykorzystywanie równoleg łej PC, aby unikn ąć 
potrzeby dodatkowych bada ń na zwierz ętach do spe łnienia tych wymaga ń, 
które mog ą powstać w związku ze stosowaniem okresowej PC (zob. pkt 
12). PC powinna da ć w teście LLNA: DA reakcj ę pozytywn ą na poziomie 
narażania, przy którym oczekuje si ę wzrostu wska źnika stymulacji (SI) ≥ 
1,8 większego ni ż w grupie kontroli negatywnej (NC). Dawk ę PC należy 
dobrać w taki sposób, by nie powodowa ć nadmiernego podra żnienia skóry 
lub ogólnoustrojowej toksyczno ści, a indukcja by ła powtarzalna, ale nie 
nadmierna (tj. SI > 10 by łyby uznane za zbyt wysokie). Preferowane PC 
to 25 % aldehyd cynamonowy heksylu (Chemical Abstracts Service [CAS] nr 101-86-0) i 25 % eugenol (numer CAS 97-53-0) w acetonie: oliwa 
z oliwek (w proporcji obj ętościowej 4:1 v/v). Mog ą zaistnieć okoliczno ści, 
w których mo żna użyć innych PC spe łniających powy ższe kryteria, pod 
warunkiem że istnieje po temu odpowiednie uzasadnienie.
 
12. Pomimo że zaleca si ę włączenie równoleg łej grupy PC, mog ą zaistnieć 
sytuacje, w których okresowe badanie PC (tj. w odst ępach nie d łuższych 
niż 6 miesięcy) może okazać się wystarczaj ące w przypadku laboratoriów, 
które regularnie przeprowadzaj ą badanie LLNA: DA (tj. przeprowadzaj ą 
badanie LLNA: DA co najmniej raz na miesi ąc) i dysponuj ą wcześnie­
jszymi danymi z pozytywnych kontroli, świadczącymi o tym, że labora­
torium jest w stanie uzyskiwa ć odtwarzalne i dok ładne wyniki 
w pozytywnych kontrolach. Mo żna wykaza ć odpowiedni poziom bieg łości 
w wykonywaniu badania LLNA: DA, uzyskuj ąc stałe pozytywne wyniki 
PC w co najmniej 10 niezale żnych badaniach przeprowadzonych 
w rozsądnym terminie (tj. w okresie krótszym ni ż rok).  
13. Nale ży zawsze w łączać równoleg łą grupę PC, jeśli zachodzi proceduralna 
zmiana w LLNA: DA (np. zmiana przeszkolonego personelu, zmiany 
w metodzie badania materia łów i/lub odczynników, zmiany w metodzie 
badania urz ądzenia, zmiana źródła badanych zwierz ąt), a przedmiotowe 
zmiany powinny by ć udokumentowane w laboratoryjnych sprawozdaniach. 
Należy zwrócić uwagę na wpływ tych zmian na odpowiednio ść ustalonych 
wcześniej danych przy okre ślaniu konieczno ści zgromadzenia nowej bazy 
danych, aby udokumentowa ć spójność wyników PC.  
14. Badacze powinni by ć świadomi, że decyzja o przeprowadzeniu badania 
PC na zasadzie okresowej zamiast równolegle wywiera wp ływ na odpo ­
wiedniość i akceptowalno ść negatywnych wyników bada ń uzyskanych bez 
równoleg łej PC w okresie pomi ędzy każdym okresowym badaniem PC. 
Na przyk ład, jeżeli w okresowych PC uzyskany zostaje wynik fa łszywie 
negatywny, negatywne wyniki substancji badanej uzyskane w okresie 
między ostatnim dopuszczalnym okresowym badaniem PC 
i niedopuszczalnym okresowym badaniem PC mog ą być kwestionowane. 
Należy dokładnie rozwa żyć tego rodzaju skutki przy podejmowaniu 
decyzji, czy nale ży włączyć równoleg łą PC, czy tylko przeprowadza ć 
PC na zasadzie okresowej. Nale ży również wziąć pod uwag ę możliwość 
wykorzystania mniejszej liczby zwierz ąt w ramach grupy równoleg łej PC, 
jeżeli jest to naukowo uzasadnione oraz je żeli laboratorium mo że wykaza ć, 
w oparciu o wcze śniej zgromadzone dane, że można wykorzysta ć mniejszą 
liczbę myszy (22).  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 734
 
15. Chocia ż substancja kontroli pozytywnej powinna by ć testowana 
w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje konsekwentn ą reakcję (np. 
aceton: oliwa z oliwek; w proporcji obj ętościowej 4:1, v/v), mog ą jednak 
zaistnieć pewne sytuacje wynikaj ące z przepisów, w których przetesto ­
wanie w niestandardowym no śniku (o formulacji odpowiedniej klinicznie/ 
chemicznie) mo że być również konieczne (23). Je żeli równoleg ła PC jest 
badana w innym no śniku niż substancja badana, wówczas nale ży włączyć 
oddzielną VC w odniesieniu do równoleg łej PC.  
16. W przypadkach, gdy ocenia si ę substancje badane konkretnej klasy 
chemicznej lub zakres reakcji, substancje wzorcowe mog ą być użyteczne, 
także aby wykaza ć, że metoda badawcza jest odpowiednia dla wykrywania 
potencjalnego dzia łania uczulaj ącego na skór ę przez tego rodzaju substan ­
cje. Odpowiednie substancje wzorcowe powinny posiada ć następujące 
właściwości: 
— strukturalne i funkcjonalne podobie ństwo do klasy badanej substancji,  
— znane w łaściwości fizyczne i chemiczne,  
— dane potwierdzaj ące z LLNA: DA,  
— dane potwierdzaj ące z innych modeli zwierz ęcych i/lub ludzkich.  
PROCEDURA BADANIA  
Liczba zwierz ąt i poziomy dawek  
17. W ka żdej grupie badanej powinny by ć wykorzystane nie mniej ni ż cztery 
zwierzęta, z minimaln ą liczbą trzech stężeń substancji badanej oraz równo ­
ległą grupą NC otrzymuj ącą jedynie no śnik substancji badanej i grup ą 
kontrolną PC (równoleg łą lub najnowsz ą, na podstawie polityki laborato ­
ryjnej, bior ąc pod uwag ę pkt 11–15). Nale ży rozważyć zbadanie wielu 
dawek PC, szczególnie gdy badanie PC jest prowadzone na zasadzie 
nieregularnej. Z wyj ątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierz ę­
tami grup kontrolnych nale ży się obchodzi ć w sposób identyczny jak ze 
zwierzętami grup badanych.  
18. Dobór dawek i wybór no śnika powinien by ć oparty na zaleceniach poda ­
nych w pozycjach (2) i (24) bibliografii. Kolejne dawki zazwyczaj wybiera 
się z odpowiedniego szeregu st ężeń takich, jak 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 
5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Do wyboru szeregu st ężeń należy dołączyć 
odpowiednie naukowe uzasadnienie. O ile s ą dostępne, należy uwzględnić 
wszystkie istniej ące informacje toksykologiczne (np. o ostrej toksyczno ści 
i o podra żnieniu skóry) oraz o strukturalnych i fizykochemicznych w łaści­
wościach badanej substancji (i/lub substancji zbli żonych pod wzgl ędem 
budowy) przy wyborze trzech kolejnych st ężeń, tak aby najwy ższe 
stężenie maksymalizowa ło narażenie, nie doprowadzaj ąc jednak do ogól ­
noustrojowej toksyczno ści i/lub nadmiernego miejscowego podra żnienia 
skóry (24) (25). W przypadku braku takich informacji mo że okazać się 
konieczne przeprowadzenie badania wst ępnego (zob. pkt 21–24)  
19. No śnik nie powinien zak łócać wyniku badania lub wp ływać na niego oraz 
powinien by ć wybrany na podstawie maksymalizowania rozpuszczalno ści 
w celu uzyskania najwy ższego osi ągalnego st ężenia, dając jednocze śnie 
możliwość uzyskania roztworu/zawiesiny nadaj ącej się do podania 
substancji badanej. Zalecanymi no śnikami są aceton: oliwa z oliwek (w 
proporcji obj ętościowej 4:1 v/v), N,N-dimetyloformamid, metylo etylo 
keton, glikol propylenowy i sulfotlenek dimetylowy (6), ale mog ą być 
użyte inne, je śli przedstawi si ę wystarczaj ące uzasadnienie naukowe. 
W niektórych sytuacjach mo że okazać się konieczne u życie, jako dodat ­
kowej kontroli, rozpuszczalnika odpowiedniego ze wzgl ędów klinicznych, 
lub postaci handlowej, w której badana substancja wprowadzana jest na 
rynek. Szczególn ą uwagę należy zwrócić na zapewnienie, aby substancje 
hydrofilne zosta ły włączone do systemu no śnika, który nawil ża skórę i nie 
spływa z niej natychmiast, przez w łączenie odpowiednich środków zwi ęk­
szających rozpuszczalno ść (np. 1 % Pluronic ® L92). A zatem nale ży 
unikać roztworów ca łkowicie wodnych.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 735
 
20. Przetwarzanie w ęzłów chłonnych z poszczególnych myszy umo żliwia 
ocenę zmienno ści pomiędzy zwierz ętami oraz statystyczne porównanie 
różnicy między substancj ą badaną i pomiarami grupy VC (zob. pkt 33). 
Ponadto dokonanie oceny mo żliwości obniżenia liczby myszy w grupie 
PC jest wykonalne jedynie wówczas, gdy gromadzone s ą dane dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt (22). Co wi ęcej, niektóre organy regulacyjne 
wymagają zbierania danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt. Regu­
larne gromadzenie danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt stanowi 
o dobrostanie zwierz ąt dzięki temu, że unika si ę powielania bada ń, do 
którego dochodzi łoby w przypadku, gdyby wyniki dotycz ące substancji 
badanej pierwotnie zebrane w jeden sposób (np. poprzez po łączenie 
danych dotycz ących zwierz ąt) miały zostać rozpatrzone w pó źniejszym 
terminie przez organy regulacyjne zgodnie z innymi wymogami (np. 
w ramach danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt). 
Badanie wst ępne 
21. W przypadku braku informacji pozwalaj ącej określić najwyższą dawkę, 
jaka ma zosta ć zbadana (zob. pkt 18), nale ży przeprowadzi ć badanie 
wstępne w celu okre ślenia właściwego poziomu dawki do badania 
w metodzie LLNA: DA. Celem badania wst ępnego jest opracowanie 
wytycznych dotycz ących wyboru maksymalnej dawki, jak ą należy 
stosować w głównym badaniu LLNA: DA, w przypadku gdy nie 
dysponuje si ę informacjami na temat st ężenia powoduj ącego toksyczno ść 
ogólnoustrojow ą (zob. pkt 24) i/lub nadmierne miejscowe podra żnienie 
skóry (zob. pkt 23). Maksymalny poziom badanej dawki powinien wynosić 100 % substancji badanej w przypadku cieczy lub maksymalne 
możliwe stężenie w przypadku cia ł stałych lub zawiesin.
 
22. Badanie wst ępne przeprowadza si ę w warunkach identycznych do tych, 
w jakich przeprowadza si ę główne badanie LLNA: DA, z tym że nie 
przeprowadza si ę oceny proliferacji w ęzła chłonnego oraz mo żna wyko­
rzystać mniejszą liczbę zwierząt w grupie badanej. Zaleca si ę jedno lub 
dwa zwierz ęta w grupie badanej. Wszystkie myszy b ędą obserwowane 
codziennie pod k ątem jakichkolwiek klinicznych oznak toksyczno ści ogól­
noustrojowej lub miejscowego podra żnienia skóry w miejscu zastosowa ­
nia. Masy cia ła są rejestrowane przed badaniem i przed jego zako ńczeniem 
(dzień 8.). Obydwoje uszu ka żdej myszy bada si ę pod kątem wyst ąpienia 
rumienia i ocenia przy wykorzystaniu tabeli 1 (25). Pomiary grubo ści ucha 
są przeprowadzane przy wykorzystaniu grubo ściomierza (np. cyfrowych 
mikrometrów lub grubo ściomierza Peacock Dial) w dniu 1. (przed poda ­
niem substancji), w dniu 3. (oko ło 48 godzin nast ępujących po podaniu 
pierwszej dawki) oraz w dniu 7. (24 godziny przed zako ńczeniem badania) 
i dniu 8. Ponadto w dniu 8. grubo ść ucha mo żna określić za pomoc ą 
kolczykownicy do pomiaru masy, co powinno by ć przeprowadzone po 
uśmierceniu zwierz ąt w humanitarny sposób. Nadmierne miejscowe 
podrażnienie skóry jest sygnalizowane przez rumie ń o wyniku ≥ 3 i/lub 
zwiększenie grubo ści ucha o ≥ 25 % w dniu pomiaru (26) (27). Najwy ższa 
dawka wybrana do g łównego badania LLNA: DA to nast ępna niższa 
dawka w szeregu st ężeń badania wst ępnego (zob. pkt 18), która nie wywo ­ 
łuje ogólnoustrojowej toksyczno ści i/lub nadmiernego miejscowego 
podrażnienia skóry.  
Tabela 1  
Ocena punktowa rumienia  
Objawy Wynik  
Brak rumienia 0 
Bardzo lekki rumie ń (prawie niewidoczny) 1 
Wyraźny rumień 2  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 736
 
Objawy Wynik  
Rumień umiarkowany do mocnego 3 
Mocny rumie ń (czerwie ń przypominaj ąca barwę mięsa czerwonego) do 
form obrz ęku wykluczaj ących klasyfikacj ę rumienia 4 
23. Oprócz 25 % zwi ększenia grubo ści ucha 26) (27), do zidentyfikowania 
substancji dra żniących w metodzie LLNA wykorzystywano te ż staty­
stycznie istotne zwi ększenie grubo ści ucha u myszy badanych 
w porównaniu z myszami kontrolnymi (28) (29) (30) (31) (32) (33) 
(34). O ile jednak statystycznie znacz ące zwiększenie mo że wystąpić 
przy grubo ści ucha mniejszej ni ż 25 %, to nie uda ło się go powi ązać 
z nadmiernym podra żnieniem (30) (31) (32) (33) (34).  
24. Następujące obserwacje kliniczne mog ą wskazywa ć na toksyczno ść ogólnou­
strojową (35), jeśli są wykorzystywane jako cz ęść zintegrowanej oceny i w 
związku z tym mog ą określać maksymalne dawki do stosowania w LLNA: 
DA: zmiany w funkcjach uk ładu nerwowego (np. piloerekcja, ataksja, dr że­
nia, oraz konwulsje); zmiany w zachowaniu (na przyk ład agresja, zmiany 
w czyszczeniu, wyra źna zmiana w poziomie aktywno ści); zmiany 
w sposobie oddychania (np. zmiany w cz ęstotliwości i intensywno ści oddy­
chania, takie jak duszno ść, dyszenie oraz rz ężenie), a tak że zmiany 
w konsumpcji żywności i wody. Ponadto w ocenie nale ży wziąć pod 
uwagę oznaki stanów zwi ększonej senno ści i/lub brak reakcji oraz wszelkie 
objawy kliniczne sygnalizuj ące coś więcej niż chwilowy ból i cierpienie, lub 
> 5 % spadek masy cia ła od dnia 1. do dnia 8. czy śmiertelno ść. Zwierzęta 
konające oraz zwierz ęta wykazuj ące objawy silnego bólu i zagro żenia należy 
humanitarnie u śmiercić (36).  
Harmonogram do świadczalny g łównego badania  
25. Harmonogram do świadczalny badania jest nast ępujący: 
— Dzień 1: Indywidualnie okre ślić i odnotowa ć wagę każdego zwierz ęcia 
oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Na łożyć 1 % roztworu wodnego 
dodecylo siarczanu sodu (SLS) na cz ęść grzbietow ą każdego ucha 
przy użyciu pędzla zanurzonego w roztworze SLS, tak aby ca ła 
grzbietowa cz ęść każdego ucha zosta ła pokryta za pomoc ą czterech 
do pięciu pociągnięć pędzla. Po godzinie od momentu podania SLS 
nakłada się 25 μl właściwego roztworu substancji badanej lub samego 
nośnika lub kontroli pozytywnej (równoleg łej lub najnowszej, na 
podstawie polityki laboratoryjnej, bior ąc pod uwag ę pkt 11–15), na 
część grzbietow ą każdego ucha.  
— Dni 2, 3 i 7: Powtórzy ć przeprowadzon ą w dniu 1. procedur ę wstęp­
nego poddania dzia łaniu 1 % wodnego roztworu SLS i na łożenia 
substancji badanej.  
— Dni 4, 5 i 6: Bez podawania.  
— Dzień 8: Zanotowa ć wagę każdego zwierz ęcia oraz wszelkie obser ­
wacje kliniczne. Oko ło 24 do 30 godzin po rozpocz ęciu stosowania 
w dniu 7. nale ży uśmiercić zwierzęta w sposób humanitarny. Wyci ąć 
uszne węzły chłonne z ka żdego ucha myszy i przetwarza ć oddzielnie 
w roztworze chlorku sodu buforowanym fosforanami (PBS) dla każdego zwierz ęcia. Informacje i schematy identyfikacji i rozbioru 
węzła chłonnego mo żna znaleźć w pozycji (22). Do celów dalszego 
monitorowania miejscowych reakcji skóry w badaniu g łównym, 
w protokole badania mo żna uwzgl ędnić dodatkowe parametry, takie 
jak punktacja rumienia ucha lub pomiar grubo ści ucha (zrobiony za 
pomocą grubościomierza lub za pomoc ą kolczykownicy do pomiaru 
masy w czasie sekcji).
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 737
 
Przygotowanie zawiesiny komórek  
26. Przygotowuje si ę jednokomórkow ą zawiesin ę z komórek w ęzła 
chłonnego (LNC) usuni ętych obustronnie dla ka żdego zwierz ęcia, przez 
umieszczenie w ęzłów chłonnych pomi ędzy dwoma szkie łkami mikrosko ­
powymi i zastosowanie lekkiego nacisku w celu rozdrobnienia w ęzłów. Po 
upewnieniu si ę, że tkanki zosta ły rozprowadzone cienk ą warstwą, należy 
rozdzielić oba szkie łka. Zawiesi ć tkanki z obu szkie łek w PBS, trzymaj ąc 
każde szkiełko pod k ątem nad szalk ą Petriego i p łucząc przy użyciu PBS 
i jednocze śnie zeskrobuj ąc tkankę ze szkie łka skrobakiem do komórek. 
Ponadto w ęzły chłonne u zwierz ąt z grupy kontroli negatywnej s ą niewiel­
kie, tak wi ęc ostrożne działanie ma istotne znaczenie dla unikni ęcia sztucz ­
nego wpływu na warto ści SI. Do p łukania szkie łek należy wykorzysta ć 
całkowitą objętość 1 mL PBS. Zawiesin ę LNC w szalce Petriego nale ży 
homogenizowa ć lekko za pomoc ą skrobaka do komórek. 20 μL alikwoty 
zawiesiny LNC zbiera si ę następnie za pomoc ą mikropipety, przy czym 
należy uważać aby nie zebra ć widocznej dla oka membrany, a nast ępnie 
miesza si ę z 1,98 mL PBS, tak aby otrzyma ć 2 mL próbki. Nast ępnie 
przygotowuje si ę drugą 2 mL próbk ę zgodnie z t ą samą procedur ą, tak aby 
przygotowane zosta ły dwie próbki dla ka żdego zwierz ęcia. 
Określenie proliferacji komórkowych (pomiar zawarto ści ATP limfocytów)  
27. Wzrost zawarto ści ATP w w ęzłach chłonnych jest mierzony za 
pomocą metody lucyferyny-lucyferazy z zastosowaniem zestawu do 
pomiaru ATP, który mierzy bioluminescencj ę w umownych jednostkach 
luminescencyjnych (RLU). Czas badania od momentu u śmiercenia 
zwierząt do pomiaru zawarto ści ATP dla ka żdego osobnika powinien 
być jednolity, w ci ągu około 30 minut, poniewa ż uważa się, że zawarto ść 
ATP stopniowo maleje wraz z up ływem czasu od momentu u śmiercenia 
zwierząt (12). Zatem seri ę procedur, poczynaj ąc od usuni ęcia usznych 
węzłów chłonnych a ż do pomiaru ATP, nale ży zakończyć w ciągu 20 
minut zgodnie z wcze śniej ustalonym harmonogramem, takim samym 
dla każdego zwierz ęcia. Pomiar luminescencji ATP nale ży przeprowadzi ć 
w każdej 2 mL próbce w taki sposób, aby w odniesieniu do ka żdego 
osobnika przeprowadzano łącznie dwa pomiary ATP. Ustala si ę wówczas 
średnią wartość luminescencji ATP i wykorzystuje j ą w późniejszych obli ­
czeniach (zob. pkt 30).  
OBSERWACJE  
Obserwacje kliniczne  
28. Zwierz ęta poddaje si ę starannej obserwacji klinicznej raz dziennie pod 
kątem jakichkolwiek oznak klinicznych, czy to miejscowego podra żnienia 
w miejscu zastosowania, czy te ż ogólnoustrojowej toksyczno ści. 
Wszystkie obserwacje kliniczne s ą systematycznie odnotowywane 
w postaci zapisów prowadzonych dla ka żdej myszy. Plany monitorowania 
powinny obejmowa ć kryteria umo żliwiające szybk ą identyfikacj ę tych 
myszy, które wykazuj ą oznaki toksyczno ści ogólnoustrojowej, nadmier ­
nego miejscowego podra żnienia skóry lub żrącego dzia łania na skór ę, 
w celu eutanazji (36).  
Masy cia ła 
29. Jak wskazano w pkt 25, indywidualne masy cia ła określane są na początku 
badania i przy planowanym humanitarnym u śmierceniu zwierz ąt. 
OBLICZANIE WYNIKÓW  
30. Wyniki dla ka żdej grupy badanej s ą wyrażane jako średni SI. SI otrzymuje 
się przez podzielenie średniej warto ści RLU/mysz w obr ębie każdej grupy 
dawkowania substancji badanej oraz grupy PC przez średnią RLU/mysz 
obliczoną dla grupy rozpuszczalnika/VC. Średnie SI dla grup VC wynosi 
zatem jeden.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 738
 
31. Proces decyzyjny uznaje wynik za pozytywny, gdy SI ≥ 1,8 (10). Jednak że 
siła reakcji na dawk ę, znaczenie statystyczne i spójno ść reakcji rozpusz ­
czalnik/no śnik i PC mog ą również być stosowane przy ustalaniu, czy 
wynik graniczny (tj. warto ść SI pomi ędzy 1,8 a 2,5) mo żna uznać za 
pozytywny (2) (3) (37).  
32. W przypadku granicznego wyniku pozytywnego o warto ści SI pomi ędzy 
1,8 i 2,5 u żytkownicy mog ą rozważyć dodatkowe informacje, takie jak 
relacja dawka-reakcja, oznaki toksyczno ści ogólnoustrojowej lub nadmier ­
nego podra żnienia oraz, w stosownych przypadkach, istotno ść statystyczna 
wraz z warto ściami SI w celu potwierdzenia, czy wyniki te s ą pozytywne 
(10). Nale ży również rozważyć różne własności substancji badanej, w tym 
rozważyć, czy jest ona strukturalnie pokrewna znanym czynnikom uczulaj ­ 
ącym, czy powoduje nadmierne podra żnienie skóry u myszy, oraz zaob ­
serwowany charakter relacji dawka-reakcja. Te i inne wzgl ędy omówione 
są szczegółowo gdzie indziej (4).  
33. Gromadzenie danych dotycz ących poszczególnych myszy umo żliwi 
analizę statystyczn ą danych w odniesieniu do obecno ści i relacji 
dawka-reakcja. Ocena statystyczna mo że obejmowa ć ocenę relacji mi ędzy 
dawką a reakcją, jak równie ż odpowiednio dostosowane porównania bada ­
nych grup (np. grup ę badaną w parach w porównaniu z równoleg łą grupą 
kontrolną otrzymuj ącą nośnik/rozpuszczalnik). Analizy statystyczne mog ą 
obejmowa ć np. regresj ę liniową lub badanie Williamsa w celu dokonania 
oceny tendencji w relacji mi ędzy dawk ą a reakcją oraz badanie Dunnetta 
w odniesieniu do porówna ń par. Przy wyborze w łaściwej metody analizy 
statystycznej danych prowadz ący badanie powinien zachowa ć świadomość 
możliwej nierówno ści wariancji lub innych powi ązanych problemów, które 
mogą spowodowa ć konieczno ść transformacji danych lub przeprowadzenia 
nieparametrycznej analizy statystycznej. W ka żdym przypadku 
prowadzący badanie musi liczy ć się z konieczno ścią przeprowadzenia 
obliczeń SI i analiz statystycznych z wykorzystaniem pewnych punktów 
danych i bez nich (tzw. „warto ści odstające”).  
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Dane  
34. Dane powinny by ć podsumowane w formie tabelarycznej pokazuj ącej 
wartości RLU odnosz ące się do poszczególnych zwierz ąt, średnie warto ści 
RLU/zwierz ę w danej grupie, zwi ązana warto ść błędu (np. SD, SEM), oraz 
średnie SI dla ka żdej grupy badanej porównywane z równoleg łą grupą 
kontrolną z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika.  
Sprawozdanie z bada ń 
35. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badane i kontrolne substancje chemiczne:  
— numery identyfikuj ące (np. CAS lub WE, je śli są dostępne); źródło: 
czystość; znane zanieczyszczenia; numer partii),  
— cechy fizyczne i w łasności fizykochemiczne (np. lotno ść, stabilno ść, 
rozpuszczalno ść), 
— jeżeli jest to mieszanina, sk ład i wzgl ędne udzia ły procentowe sk ład­
ników.  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— dane identyfikacyjne (czysto ść; stężenie, tam gdzie stosowne; wyko ­
rzystane obj ętości), 
— uzasadnienie wyboru no śnika. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Zwierzęta badane:  
— źródło, z którego pochodz ą myszy szczepu CBA,  
— status mikrobiologiczny zwierz ąt, jeśli jest znany,  
— liczba i wiek zwierz ąt, 
— źródło pochodzenia zwierz ąt, warunki środowiska, pokarm itp.  
Warunki badania:  
— źródło, numer partii i dane producenta dotycz ące zapewniania/kontroli 
jakości dla zestawu ATP,  
— szczegó ły przygotowania i stosowania substancji badanej,  
— uzasadnienie doboru dawek ( łącznie z wynikami z badania wst ępnego, 
jeśli było przeprowadzane),  
— nośnik i użyte stężenia substancji testowej oraz ca łkowita ilo ść zasto­
sowanej substancji badanej,  
— szczegó ły dotycz ące jakości pożywienia i wody (w łączając w to 
rodzaj/źródło diety, źródło wody),  
— szczegó ły dotycz ące poddania dzia łaniu substancji oraz harmono ­
gramów pobierania próbek,  
— metody pomiaru toksyczno ści, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne lub negatywne,  
— szczegó ły dotyczące protoko łu odchyle ń i wyjaśnienie, w jaki sposób 
odchylenie ma wp ływ na planowanie bada ń i ich wyniki.  
Sprawdzenie wiarygodno ści: 
— podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodno ści badań, 
w tym informacji o wykorzystanej substancji badanej, st ężeniach 
i nośniku,  
— dane dotycz ące równoleg łej lub wcze śniejszej kontroli pozytywnej 
i dotyczące równoleg łej negatywnej (rozpuszczalnik/no śnik) kontroli 
z laboratorium testuj ącego,  
— jeżeli nie w łączono równoleg łej grupy PC, data i sprawozdanie labo ­
ratoryjne z ostatniego okresowego PC i sprawozdanie wyszczegól ­
niające wcześniejsze dane dotycz ące PC dla danego laboratorium, 
uzasadniaj ące przyczyny dla których nie przeprowadzono PC równo ­
legle.  
Wyniki:  
— masa poszczególnych myszy na pocz ątku dawkowania i przy plano ­
wanym u śmierceniu; jak równie ż średnia i opis powi ązanego b łędu 
(np. SD, SEM) w odniesieniu do ka żdej grupy badanej,  
— przebieg czasowy pojawienia si ę i oznaki toksyczno ści, w tym podra ż­
nień skóry w miejscu podania, je śli takie wyst ąpiły, u każdego zwie ­
rzęcia, 
— godzina u śmiercenia i godzina pomiaru ATP dla ka żdego zwierz ęcia, 
— tabela warto ści RLU dla poszczególnych myszy i warto ści SI dla 
każdej grupy badanej,  
— średni oraz powi ązany okres b łędu (np. SD, SEM) dla RLU/mysz dla 
każdej grupy badanej i wyniki analizy obserwacji nietypowych dla 
każdej grupy badanej,  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— obliczone SI i w łaściwe pomiary zmienno ści, uwzgl ędniające zmien ­
ność pomiędzy zwierz ętami w odniesieniu do grup substancji badanej 
i grup kontrolnych,  
— relacja dawka-reakcja,  
— analizy statystyczne, tam gdzie stosowne.  
Omówienie wyników:  
— krótki komentarz do wyników, analiza zale żności reakcji od dawki 
oraz w stosownych przypadkach, analizy statystyczne, z wnioskiem, 
czy substancja testowa powinna by ć uznana za czynnik uczulaj ący 
skórę. 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (2010),  Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay , Test Guideline 
No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pary ż. Dostępny 
na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation.  Food Chem, Toxicol ., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests.  Food Chem, Toxicol ., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests.  Food Chem. 
Toxicol. , 36, 327–333.  
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins.  Toxicol ., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dost ępny na stronie: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol. 34 , 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol.  34, 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publi ­
cation No. 10-7551 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of 
Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: [http://iccvam.nie ­
hs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 741
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAP ­
RPRept2009.pdf].
 
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characteri ­
zation and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint. J. Pharmacol. Toxicol. Meth. , 58, 
1–10.
 
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, 
T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, 
T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph 
node assay based on adenosine triphosphate measurement.  J. Pharmacol. 
Toxicol. Meth. , 58, 11–26.
 
(14) OECD (1992),  Skin Sensitisation , Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), 
Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT).  Food Chem. Toxicol ., 46, 1896–1904.
 
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, 
A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing 
discordant sensitisation datasets: implications for REACH.  Reg. Toxicol. 
Pharmacol ., 55, 90–96.  
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of 
ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity.  J. 
Immunol. Meth ., 160, 81–88.  
(18) Ishizaka, A., Tono-oka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the 
proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP.  
J. Immunol. Meth ., 72, 127–132.  
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Deve ­
lopment of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacte ­
rial cell number from a mixed population.  Biomat. , 24, 27–34.  
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of 
biomass, enzymes, and metabolites.  Meth. Enzymol ., 305, 346–370.  
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Dost ępny na 
stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]
 
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH.  Toxicol ., 238, 71–89.  
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications.  Toxicol ., 93, 
13–31.  
(25) OECD (2002),  Acute Dermal Irritation/Corrosion , Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 742
 
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances.  Toxicologist , 96, 235.  
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
 
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice.  Drug. Chem. Toxicol ., 21, 195–206.
 
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions.  Toxi­
col. Appl. Pharmacol. , 153, 83–94.
 
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals.  Toxicol. Meth. , 8, 245–256.  
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods.  Drug Chem. Toxicol ., 22, 491–506.  
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round.  Toxicol ., 212, 
60–68.
 
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive?  Arch. Toxicol ., 79, 721–728.  
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract.  Environ. Health Perspect ., 115, 
1023–1028.  
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Dost ępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm]
 
(36) OECD (2000),  Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation , Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise.  J. 
Toxicol. Environ. Health , 53, 563–79.  
(38) OECD (2005),  Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment , Envi­
ronment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody 
badania a przyj ętymi warto ściami odniesienia. Jest to miara efektywno ści metody 
badania i jeden z aspektów jej istotno ści. Pojęcia tego cz ęsto używa się 
zamiennie z poj ęciem „zgodno ść” na oznaczenie odsetka prawid łowych wyników 
uzyskiwanych przy u życiu metody badania (38).  
Substancja wzorcowa:  uczulająca lub nieuczulajaca substancja wykorzystywana 
jako norma dla celów porównania z substancj ą badaną. Substancja wzorcowa 
powinna mie ć następujące cechy: (i) sta łe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobie ń­
stwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji; (iii) znane w łaści­
wości fizykochemiczne; (iv) dane potwierdzaj ące występowanie znanych skut ­
ków; oraz (v) znany potencja ł w zakresie po żądanych reakcji.  
Fałszywy wynik negatywny:  substancja, która w wyniku zastosowania metody 
badania zosta ła oznaczona niew łaściwie jako negatywna lub nieaktywna, podczas 
gdy w rzeczywisto ści jest pozytywna lub aktywna.  
Fałszywy wynik pozytywny:  substancja, która w wyniku zastosowania metody 
badania zosta ła oznaczona niew łaściwie jako pozytywna lub aktywna, podczas 
gdy w rzeczywisto ści jest negatywna lub nieaktywna.  
Zagrożenie:  możliwość wywierania negatywnego wp ływu na zdrowie lub środo­
wisko. Niekorzystny wp ływ przejawia si ę tylko wtedy, gdy istnieje wystarczaj ące 
narażenie.  
Odtwarzalno ść międzylaboratoryjna:  miernik zakresu, w jakim ró żne wykwalifi ­
kowane laboratoria, przy u życiu tego samego protoko łu i testując tę samą badaną 
substancję, mogą przynieść jakościowo i ilo ściowo podobne wyniki. Odtwarzal ­
ność międzylaboratoryjna jest okre ślana w procesach poprzedzaj ących walidacj ę 
i obejmuj ących walidacj ę i wskazuje, w jakim stopniu badanie mo żna 
z powodzeniem przekazywa ć między laboratoriami: nazywana jest równie ż 
odtwarzalno ścią międzylaboratoryjn ą (38).  
Odtwarzalno ść wewnątrzlaboratoryjna:  ustalenie stopnia, w jakim wykwalifiko ­
wani pracownicy w tym samym laboratorium mog ą z powodzeniem odtworzy ć 
wyniki, stosuj ąc szczegó łowy protokó ł w różnych momentach. Nazywana 
również odtwarzalno ścią laboratoryjn ą (38).  
Wynik oddstaj ący: wynik odstaj ący jest obserwacj ą, która znacznie ró żni się od 
innych warto ści w losowej próbce z populacji.  
Zapewnienie jako ści: proces zarz ądzania, w którym przestrzeganie norm 
i wymogów w zakresie bada ń laboratoryjnych, oraz procedur dotycz ących doku ­
mentacji i dok ładności przekazywania danych, jest oceniane przez osoby nieza ­
leżne od tych, które przeprowadzaj ą badania.  
Wiarygodno ść: miernik zakresu, w jakim metoda badania mo że zostać wykonana 
w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomi ędzy laboratoriami 
w dłuższym okresie czasu, w przypadku jej wykonywania przy u życiu tego 
samego protoko łu. Ocenia si ę ją poprzez obliczenie odtwarzalno ści wewnątrz- 
i międzylaboratoryjnej (38).  
Działanie uczulaj ące na skór ę: proces immunologiczny, do którego dochodzi 
w przypadku, gdy osobnik wra żliwy jest nara żony miejscowo na wywo łujący 
uczulenie chemiczny alergen, powoduj ący immunologiczn ą reakcję skórną, co 
może prowadzi ć do uczulania przez kontakt ze skór ą. 
Wskaźnik stymulacji (SI):  wartość obliczona dla oceny potencjalnego dzia łania 
uczulającego na skór ę przez substancj ę badaną, który wyra ża się stosunkiem 
proliferacji w grupach poddanych dzia łaniu środka do proliferacji 
w równoleg łej grupie kontrolnej no śnika.  
Substancja badana (okre ślana także jako badana substancja chemiczna):  każda 
substancja lub mieszanina, badana za pomoc ą niniejszej TM.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  DZIAŁANIE UCZULAJ ĄCE NA SKÓR Ę: BADANIE LOKALNYCH 
WĘZŁÓW CHŁONNYCH BRDU-ELISA  
WSTĘP 
1. Wytyczne OECD w odniesieniu do badania chemikaliów i metody bada ń 
UE są okresowo poddawane przegl ądowi w zwi ązku z post ępem nauko ­
wym, zmieniaj ącymi si ę potrzebami regulacyjnymi, oraz trosk ą 
o dobrostan zwierz ąt. Pierwsza metoda badania (TM) (B.42) przy 
określaniu dzia łania uczulaj ącego na skór ę u myszy – badanie lokalnych 
węzłów chłonnych (LLNA; wytyczna OECD dotycz ąca badań nr 429) 
została poddana przegl ądowi (1 i rozdzia ł B.42 niniejszego za łącznika). 
Szczegóły walidacji LLNA i przegl ąd powiązanej bibliografii opubliko ­
wano w (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). W LLNA radioizotopy tymidyny lub jodyny s ą stosowane do pomiaru proliferacji limfocytów i w zwi ązku 
z tym badanie ma ograniczone zastosowanie w przypadku, gdy nabycie, 
zastosowania lub usuwanie promieniotwórczo ści jest problematyczne. 
Badanie LLNA BrdU-ELISA [test immunoabsorpcji enzymozale żnej] jest 
niepromieniotwórcz ą modyfikacj ą metody LLNA TM, która wykorzystuje 
nieoznakowan ą izotopem promieniotwórczym 5-bromo-2-dezoksyurydyn ę 
(BrdU) (Chemical Abstracts Service [nr CAS 59-14-3) w formie systemu 
badawczego opartego na ELISA, do pomiaru proliferacji limfocytów. Badanie LLNA BrdU-ELISA zosta ło zatwierdzone i poddane przegl ądowi 
oraz zalecone przez mi ędzynarodowy panel ds. wzajemnych przegl ądów 
jako przydatne do rozpoznawania chemikaliów uczulaj ących skór ę oraz jej 
nieuczulaj ą
cych wraz z pewnymi ograniczeniami (10) (11) (12). Ta TM 
jest zaprojektowana dla celów oceny potencja łu uczulenia skóry przez 
chemikalia (substancje i mieszaniny) u zwierz ąt. Rozdzia ł B.6 niniejszego 
załącznika oraz wytyczna OECD dotycz ąca badań nr 406 wykorzystuj ą 
badania na świnkach morskich, w szczególno ści test maksymalizacji na 
śwince morskiej oraz test Buehlera (13). Metoda LLNA (rozdzia ł B.42 
niniejszego za łącznika; wytyczna OECD dotycz ąca badań nr 429) oraz 
jej dwa niepromieniotwórcze warianty: LLNA: BrdU-ELISA (rozdzia ł 
B.51 niniejszego za łącznika; wytyczna OECD dotycz ąca badań nr 442 
B) oraz LLNA: DA (rozdzia ł B.50 niniejszego za łącznika; wytyczna 
OECD dotycz ąca badań nr 442 A) zapewniaj ą bardziej ograniczone 
i udoskonalone wykorzystanie zwierz ąt w porównaniu do bada ń na świn­
kach morskich opisanych w B.6 i w wytycznej OECD dotycz ącej badań 
nr 406 (13).  
2. Podobnie jak LLNA, metoda LLNA: BrdU-ELISA bada faz ę indukcyjn ą 
uczulenia skóry i dostarcza danych ilo ściowych odpowiednich dla doko ­
nania oceny dawka-reakcja. Ponadto zdolno ść do wykrywania substancji 
działających uczulaj ąco na skór ę bez konieczno ści korzystania 
z izotopowego oznaczania DNA eliminuje mo żliwość narażenia zawodo ­
wego na dzia łanie promieniotwórcze oraz kwestie zwi ązane z usuwaniem 
odpadów. To z kolei mo że pozwoli ć na zwiększone wykorzystanie myszy 
w celu wykrycia substancji dzia łających uczulaj ąco na skór ę, co może 
doprowadzi ć do dalszego ograniczenia stosowania świnek morskich do 
badania odporno ści na dzia łanie uczulaj ące na skór ę (tj. B6; wytyczna 
OECD dotycz ąca badań nr 406) (13).  
DEFINICJE  
3. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 1.  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
4. Badanie LLNA BrdU-ELISA to zmieniona metoda LLNA umo żliwiająca 
identyfikacj ę potencjalnych chemikaliów uczulaj ących skór ę, 
z uwzględnieniem szczególnych ogranicze ń. Nie oznacza to, że we wszyst ­
kich przypadkach nale ży stosowa ć LLNA: BrdU-ELISA zamiast LLNA 
lub badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD dotycz ąca 
badań nr 406) (13), a tylko, że badanie to ma t ę samą wartość meryto­
ryczną i może zostać zastosowane jako badanie alternatywne, którego 
pozytywne lub negatywne wyniki nie wymagaj ą już dalszego potwier ­
dzenia (10) (11). Laboratorium badawcze powinno uwzgl ędnić wszystkie 
dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpocz ęciem 
badań. Informacje te powinny obejmowa ć tożsamość i budowę chemiczn ą ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
badanej substancji; jej w łaściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych 
badań toksyczno ści in vitro  lub in vivo  badanej substancji i dane toksy ­
kologiczne dotycz ące strukturalnie pokrewnych substancji chemicznych. 
Informacje te nale ży uwzgl ędnić w celu ustalenia, czy LLNA: 
BrdU-ELISA jest odpowiednia do badania danej substancji (z uwagi na 
niekompatybilno ść niektórych rodzajów chemikaliów z metod ą LLNA: 
BrdU-ELISA [zob. pkt 5]) oraz przy wyborze dawki.  
5. Badanie LLNA: BrdU-ELISA, b ędąc metodą in vivo , nie eliminuje wyko ­
rzystania zwierz ąt w określaniu alergicznego kontaktowego dzia łania uczu ­
lającego. Mo że ona jednak ograniczy ć stosowanie zwierz ąt do tego celu, 
w porównaniu z badaniami na świnkach morskich (B.6; wytyczna OECD 
dotycząca badań nr 406) (13). Co wi ęcej, LLNA: BrdU-ELISA oferuje 
znacznie bardziej wyrafinowany sposób wykorzystywania zwierz ąt do 
badania alergicznego kontaktowego dzia łania uczulaj ącego, poniewa ż 
w przeciwie ństwie do B.6 i wytycznej OECD dotycz ącej badania 
nr 406, LLNA: BrdU-ELISA nie wymaga wywo ływania reakcji nadwra ż­
liwości skóry poprzez prowokacj ę. Ponadto LLNA: BrdU-ELISA nie 
wymaga zastosowania adiuwanta, jak wymaga tego test maksymalizacji na świnkach morskich (rozdzia ł B.6 niniejszego za łącznika, 13). Tym 
samym LLNA: BrdU-ELISA zmniejsza cierpienie zwierz ąt. Niezale żnie 
od przewagi LLNA: BrdU-ELISA nad metodami B.6 i wytyczn ą OECD 
dotyczącą badań nr 406 (13), nale ży przyzna ć, że istnieją pewne ograni ­
czenia, które mog ą spowodowa ć konieczno ść wykorzystania B.6 lub 
wytycznej OECD dotycz ą
cej badań nr 406 (np. w przypadku badania 
niektórych metali, z uwagi na fa łszywe wyniki pozytywne w przypadku 
niektórych środków dra żniących skór ę [takich jak niektóre substancje 
powierzchniowo czynne] (6) (1, i rozdzia ł B.42 niniejszego za łącznika), 
lub rozpuszczalno ść badanej substancji). Ponadto klasy chemiczne lub 
substancje zawieraj ące grupy funkcjonalne, co do których wykazano, że 
działają jako potencjalne czynniki zak łócające (15), mog ą wymagać użycia 
badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD dotycz ącej badań 
nr 406 (13)). Zalecono stosowanie ogranicze ń wskazanych w LLNA (1 
oraz rozdzia ł B.42 w niniejszym za łączniku) równie ż w odniesieniu do 
LLNA: BrdU-ELISA (10). Poza tymi przypadkami zidentyfikowanych ogranicze ń, LLNA: BrdU-ELISA powinna by ć stosowana do badania 
wszelkich substancji, chyba że istnieją właściwości związane z tymi 
substancjami, które mog ą zakłócać dokładność LLNA: BrdU-ELISA. 
Ponadto nale ży uwzględnić możliwość
 otrzymania pozytywnych wyników 
granicznych, gdy warto ści wskaźnika stymulacji (SI) kszta łtują się 
pomiedzy 1,6 a 1,9 (zob. pkt 31–32). Opiera si ę to na bazie danych 
uzyskanej przy zatwierdzaniu 43 substancji z wykorzystaniem SI ≥ 1,6 
(zob. pkt 6), gdzie za pomoc ą LLNA: BrdU-ELISA poprawnie zidentyfi ­
kowano wszystkie 32 LLNA czynniki uczulaj ące, lecz niew łaściwie ozna ­
czono dwie z 11 LLNA substancji nieuczulaj ących o warto ściach SI 
pomiędzy 1,6 i 1,9 (tj. graniczne warto ści dodatnie) (10). Jednak 
w związku z tym, że ten sam zestaw danych by ł stosowany do ustalania 
wartości SI i obliczania przewidywalnych w łaściwości badania, przyto ­
czone wyniki mog ą być zawyżonym szacunkiem prawdziwych przewidy ­
walnych w łaściwości. 
ZASADA METODY BADANIA  
6. Podstawowa zasada le żąca u podstaw LLNA: BrdU-ELISA zak łada, że 
czynniki uczulaj ące wywo łują proliferacj ę limfocytów w w ęzłach chłon­
nych odprowadzaj ących limf ę z miejsca przy łożenia substancji badanej. Ta 
proliferacja jest proporcjonalna do zastosowanej dawki oraz potencja łu 
zastosowanego alergenu i jest prostym środkiem uzyskania ilo ściowego 
pomiaru uczulenia. Proliferacja jest mierzona przez porównanie średniej 
proliferacji w ka żdej badanej grupie do średniej proliferacji w grupie 
kontrolnej otrzymuj ącej nośnik (VC). Okre śla się stosunek średniej proli ­
feracji w ka żdej grupie poddanej dzia łaniu środka do średniej proliferacji 
w równoleg łej grupie VC, który jest nazywany wska źnikiem 
stymulacji (SI) i powinien wynosi ć ≥ 1,6, zanim substancja badana 
zostanie zaklasyfikowana jako potencjalny czynnik uczulaj ący skórę. 
Procedury opisane w niniejszym dokumencie s ą oparte na wykorzystaniu 
do pomiaru zawarto ści BrdU w celu wykrycia zwi ększonej liczby komórek  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 746
 
rozmnażających się wegetatywnie w odprowadzaj ących usznych w ęzłach 
chłonnych. BrdU jest substancj ą analogiczn ą do tymidyny i jest na 
podobnej zasadzie w łączana do DNA komórek rozmna żających się wege­
tatywnie. Pomiaru zjawiska w łączania BrdU dokonuje si ę metodą ELISA, 
która wykorzystuje przeciwcia ło specyficzne dla BrdU oznakowane 
również za pomoc ą peroksydazy. Gdy dodaje si ę podłoże, peroksydaza 
reaguje z nim i daje w wyniku barwiony produkt, kwantyfikowany w danej absorbancji przy zastosowaniu czytnika do p łytek ELISA.
 
OPIS BADANIA  
Dobór gatunków zwierz ąt 
7. Mysz jest gatunkiem preferowanym do tego badania. Badania walidacyjne 
dla LLNA: BrdU-ELISA by ły przeprowadzane wy łącznie na szczepie 
CBA/J, który z tego wzgl ędu uznaje si ę za szczep preferowany (10) 
(12). Wykorzystuje si ę młode doros łe samice myszy, które s ą nieródkami 
i nie są w ciąży. Na pocz ątku doświadczenia samice powinny mie ć 8–12 
tygodni, a zró żnicowanie mas cia ła poszczególnych zwierz ąt powinno by ć 
minimalne i nie przekracza ć 20 % średniej masy cia ła. Można ewentualnie 
wykorzysta ć inne szczepy i samce, je żeli dysponuje si ę danymi świadcz­ 
ącymi o tym, że nie istniej ą znaczące różnice w reakcji na LLNA: 
BrdU-ELISA.  
Warunki w pomieszczeniach dla zwierz ąt i pożywienie  
8. Myszy powinny by ć trzymane w grupach (16), chyba że istnieją odpo­
wiednie naukowe przes łanki dla trzymania myszy pojedynczo. Tempera ­
tura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosi ć 22 ± 
3 °C. Chocia ż wilgotno ść względna powinna wynosi ć co najmniej 30 % 
i pożądane jest, żeby nie przekracza ła 70 % poza czasem czyszczenia 
pomieszczenia, celem powinno by ć utrzymywanie jej na poziomie 
50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 
12 godzin ciemno ści. Do żywienia mo żna stosowa ć konwencjonalne pasze 
laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej.  
Przygotowanie zwierz ąt 
9. Zwierz ęta wybierane s ą losowo i znakowane w sposób umo żliwiający 
indywidualn ą identyfikacj ę (ale nie przez jakiekolwiek znaki na uszach) 
i trzymane w klatkach przez co najmniej pi ęć dni przed rozpocz ęciem 
dawkowania w celu umo żliwienia zaaklimatyzowania do warunków labo ­
ratoryjnych. Przed rozpocz ęciem podawania bada si ę wszystkie zwierz ęta 
w celu upewnienia si ę, że nie maj ą żadnych zauwa żalnych zmian skór ­
nych.  
Przygotowanie roztworów dozuj ących  
10. Sta łe substancje powinny zosta ć rozpuszczone lub zawieszone 
w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach oraz rozcie ńczone, 
jeżeli jest to odpowiednie, przed zastosowaniem na uchu myszy. Chemi ­
kalia płynne można zastosowa ć czyste lub rozcie ńczone przed dawkowa ­
niem. Chemikalia nierozpuszczalne, takie jak te najcz ęściej spotykane 
w wyrobach medycznych, nale ży podda ć przesadnej ekstrakcji 
w odpowiednim rozpuszczalniku w celu wykrycia wszystkich mo żliwych 
do wyekstrahowania sk ładników do badania przed zastosowaniem na uchu 
myszy. Substancje badane nale ży przygotowywa ć codziennie, chyba że 
dane dotycz ące stabilno ści wykazuj ą dopuszczalno ść składowania.  
Sprawdzenie wiarygodno ści 
11. Pozytywne substancje kontrolne (PC) wykorzystuje si ę do wykazania 
właściwego dzia łania badania poprzez reakcj ę badanej substancji uczu ­
lającej z odpowiedni ą i powtarzaln ą czułością, dla której wielko ść reakcji 
jest dobrze scharakteryzowana. W łączanie kolejnych PC jest zalecane, 
ponieważ potwierdza si ę w ten sposób kompetencje laboratorium do 
skutecznego przeprowadzenia ka żdego badania i umo żliwia dokonanie 
oceny odtwarzalno ści i porównywalno ści wewn ątrz- 
i międzylaboratoryjnej. Niektóre organy regulacyjne mog ą wymaga ć 
także PC dla ka żdego badania i w zwi ązku z tym zach ęca się użytkow­
ników do konsultacji z w łaściwymi organami przed rozpocz ęciem LLNA: 
BrdU-ELISA. Odpowiednio zaleca si ę rutynowe wykorzystywanie równo ­
ległej PC, aby unikn ąć potrzeby dodatkowych bada ń na zwierz ętach ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 747
 
do spełnienia tych wymaga ń, które mog ą powstać w związku ze stosowa ­
niem okresowej PC (zob. pkt 12). PC powinna dawa ć pozytywn ą reakcję 
na badanie LLNA: BrdU-ELISA przy takim poziomie nara żenia, przy 
którym oczekuje si ę wzrostu SI ≥ 1,6 w grupie kontroli 
negatywnej (NC). Dawk ę PC należy dobrać w taki sposób, by nie powo ­
dować nadmiernego podra żnienia skóry lub ogólnoustrojowej toksycz ­
ności, a indukcja by ła powtarzalna, ale nie nadmierna (tj. SI > 14 by łyby 
uznane za zbyt wysokie). Preferowane PC to 25 % aldehyd cynamonowy heksylu (nr CAS 101-86-0) i 25 % eugenol (nr CAS 97-53-0) w acetonie: 
oliwa z oliwek (w proporcji obj ętościowej 4:1 v/v). Mog ą zaistnieć 
okoliczno ści, w których mo żna użyć innych PC spe łniających powy ższe 
kryteria, pod warunkiem że istnieje po temu odpowiednie uzasadnienie.
 
12. Podczas gdy w łączenie równoleg łej grupy PC jest zalecane, mog ą zaistnieć 
sytuacje, w których badanie okresowe PC (tj. w odst ępach nie d łuższych 
niż 6 miesięcy) może okazać się wystarczaj ące w przypadku laboratoriów 
przeprowadzaj ących badanie LLNA: BrdU-ELISA regularnie (tj. przepro ­
wadzających badanie LLNA: BrdU-ELISA nie rzadziej ni ż raz na miesi ąc) 
i dysponuj ą wcześniejszymi danymi z pozytywnych kontroli, świadcz­ 
ącymi o tym, że laboratorium jest w stanie uzyskiwa ć odtwarzalne 
i dokładne wyniki w pozytywnych kontrolach. Mo żna wykaza ć odpo­
wiedni poziom bieg łości w wykonywaniu badania LLNA BrdU-ELISA, 
uzyskując stałe pozytywne wyniki PC w co najmniej 10 niezale żnych 
badaniach przeprowadzonych w rozs ądnym terminie (tj. w okresie krót ­
szym niż rok).  
13. Nale ży zawsze w łączać równoleg łą grupę PC, jeśli zachodzi proceduralna 
zmiana w LLNA: BrdU-ELISA (np. zmiana przeszkolonego personelu, 
zmiany w metodzie badania materia łów i/lub odczynników, zmiany 
w metodzie badania urz ądzenia, zmiana źródła zwierz ąt badanych), 
a przedmiotowe zmiany powinny by ć udokumentowane 
w laboratoryjnych sprawozdaniach. Nale ży zwróci ć uwagę na wpływ 
tych zmian na odpowiednio ść ustalonych wcze śniej danych przy 
określaniu konieczno ści zgromadzenia nowej bazy danych, aby udokumen ­
tować spójność wyników PC.  
14. Badacze powinni by ć świadomi, że decyzja o przeprowadzeniu badania 
PC na zasadzie okresowej zamiast równolegle wywiera wp ływ na odpo ­
wiedniość i akceptowalno ść negatywnych wyników bada ń uzyskanych bez 
równoleg łej PC w okresie pomi ędzy każdym okresowym badaniem PC. 
Na przyk ład, jeżeli w okresowych PC uzyskany zostaje wynik fa łszywie 
negatywny, negatywne wyniki substancji badanej uzyskane w okresie między ostatnim dopuszczalnym okresowym badaniem PC 
i niedopuszczalnym okresowym badaniem PC mog ą być kwestionowane. 
Należy dokładnie rozwa żyć tego rodzaju skutki przy podejmowaniu 
decyzji, czy nale ży włączyć równoleg łą PC, czy tylko przeprowadza ć 
PC na zasadzie okresowej. Nale ży również wziąć pod uwag ę możliwość 
wykorzystania mniejszej liczby zwierz ąt w ramach grupy równoleg łej PC, 
jeżeli jest to naukowo uzasadnione, oraz je żeli laboratorium mo że wyka­
zać, w oparciu o wcze śniej zgromadzone dane, że można wykorzysta ć 
mniejszą liczb
ę myszy (17).  
15. Chocia ż substancja kontroli pozytywnej powinna by ć testowana 
w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje konsekwentn ą reakcję (np. 
aceton: oliwa z oliwek; w proporcji obj ętościowej 4:1, v/v), mog ą jednak 
zaistnieć pewne sytuacje wynikaj ące z przepisów, w których przetesto ­
wanie w niestandardowym no śniku (o formulacji odpowiedniej klinicznie/ 
chemicznie) mo że być również konieczne (18). Je żeli równoleg ła PC jest 
badana w innym no śniku niż substancja badana, wówczas nale ży włączyć 
oddzielną VC w odniesieniu do równoleg łej PC.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 748
 
16. W przypadkach gdy ocenia si ę substancje badane konkretnej klasy 
chemicznej lub daj ące pewien zakres reakcji, substancje wzorcowe mog ą 
służyć także temu, aby wykaza ć, czy metoda badawcza jest odpowiednia 
dla dokonania oceny potencjalnego dzia łania uczulaj ącego na skór ę tego 
rodzaju badanych substancji. Odpowiednie substancje wzorcowe powinny 
posiadać następujące właściwości: 
— strukturalne i funkcjonalne podobie ństwo do klasy badanej substancji,  
— znane w łaściwości fizyczne i chemiczne,  
— dane potwierdzaj ące z LLNA: BrdU-ELISA,  
— dane potwierdzaj ące z innych modeli zwierz ęcych i/lub ludzkich.  
PROCEDURA BADANIA  
Liczba zwierz ąt i poziomy dawek  
17. W ka żdej grupie badanej powinny by ć wykorzystane nie mniej ni ż cztery 
zwierzęta, z minimaln ą liczbą trzech stężeń substancji badanej oraz równo ­
ległą grupą NC otrzymuj ącą jedynie no śnik substancji badanej i grup ą 
kontrolną PC (równoleg łą lub najnowsz ą, na podstawie polityki laborato ­
ryjnej, bior ąc pod uwag ę pkt 11–15). Nale ży rozważyć zbadanie wielu 
dawek PC, szczególnie gdy badanie PC jest przeprowadzane na zasadzie 
nieregularnej. Z wyj ątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierz ę­
tami grup kontrolnych nale ży się obchodzi ć w sposób identyczny jak ze 
zwierzętami grup badanych.  
18. Wybór dawek i no śnika powinien by ć oparty na zaleceniach podanych 
w pozycjach 2 i 19. Kolejne dawki zazwyczaj wybiera si ę 
z odpowiedniego szeregu st ężeń takich jak 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 
5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Do wyboru szeregu st ężeń należy dołączyć 
odpowiednie naukowe uzasadnienie. O ile s ą dostępne, należy uwzględnić 
wszystkie istniej ące informacje toksykologiczne (np. o ostrej toksyczno ści 
i o podra żnieniu skóry) oraz o strukturalnych i fizykochemicznych w łaści­
wościach badanej substancji (i/lub substancji zbli żonych pod wzgl ędem 
budowy) przy wyborze trzech kolejnych st ężeń, tak aby najwy ższe 
stężenie maksymalizowa ło narażenie, nie doprowadzaj ąc jednak do ogól ­
noustrojowej toksyczno ści i/lub nadmiernego miejscowego podra żnienia 
skóry (19) (20 i rozdzia ł B.4 niniejszego za łącznika). W przypadku 
braku takich informacji mo że okazać się konieczne przeprowadzenie 
badania wst ępnego (zob. pkt 21–24).  
19. No śnik nie powinien zak łócać wyniku badania lub wp ływać na niego oraz 
powinien by ć wybrany na podstawie maksymalizowania rozpuszczalno ści 
w celu uzyskania najwy ższego osi ągalnego st ężenia, dając jednocze śnie 
możliwość uzyskania roztworu/zawiesiny nadaj ącej się do podania 
substancji badanej. Zalecanymi no śnikami są aceton: oliwa z oliwek (w 
proporcji obj ętościowej 4:1 v/v), N,N-dimetyloformamid, metylo etylo 
keton, glikol propylenowy i sulfotlenek dimetylowy (6), ale mog ą być 
użyte inne, je śli przedstawi si ę wystarczaj ące uzasadnienie naukowe. 
W niektórych sytuacjach mo że okazać się konieczne u życie, jako dodat ­
kowej kontroli, rozpuszczalnika odpowiedniego ze wzgl ędów klinicznych, 
lub postaci handlowej, w której badana substancja wprowadzana jest na 
rynek. Szczególn ą uwagę należy zwrócić na zapewnienie, aby hydrofilne 
substancje badane zosta ły włączone do systemu no śnika, który nawil ża 
skórę i nie sp ływa z niej natychmiast, przez w łączenie odpowiednich 
środków zwi ększających rozpuszczalno ść (np. 1 % Pluronic ® L92). 
A zatem nale ży unikać roztworów ca łkowicie wodnych.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 749
 
20. Przetwarzanie w ęzłów chłonnych z poszczególnych myszy umo żliwia 
ocenę zmienno ści pomiędzy zwierz ętami oraz statystyczne porównanie 
różnicy między substancj ą badaną i pomiarami grupy VC (zob. pkt 33). 
Ponadto dokonanie oceny mo żliwości obniżenia liczby myszy w grupie 
PC jest wykonalne jedynie wówczas, gdy gromadzone s ą dane dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt (17). Co wi ęcej, niektóre organy regulacyjne 
wymagają zbierania danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt. Regu­
larne gromadzenie danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt stanowi 
o dobrostanie zwierz ąt dzięki temu, że unika si ę powielania bada ń, do 
którego dochodzi łoby w przypadku, gdyby wyniki dotycz ące substancji 
badanej pierwotnie zebrane w jeden sposób (np. poprzez po łączenie 
danych dotycz ących zwierz ąt) miały zostać rozpatrzone w pó źniejszym 
terminie przez organy regulacyjne zgodnie z innymi wymogami (np. 
w ramach danych dotycz ących poszczególnych zwierz ąt). 
Badanie wst ępne 
21. W przypadku braku informacji pozwalaj ącej określić najwyższą dawkę, 
jaka ma zosta ć zbadana (zob. pkt 18), nale ży przeprowadzi ć badanie 
wstępne w celu okre ślenia właściwego poziomu dawki do badania 
w metodzie LLNA: BrdU-ELISA. Celem badania wst ępnego jest uzys ­
kanie wytycznych na temat wyboru maksymalnej dawki, jaka mo że być 
stosowana w g łównym badaniu LLNA: BrdU-ELISA, w przypadku gdy 
nie dysponuje si ę informacjami na temat st ężenia powoduj ącego toksycz ­
ność ogólnoustrojow ą (zob. pkt 24) i/lub nadmierne miejscowe podra ż­
nienie skóry (zob. pkt 23). Maksymalny poziom badanej dawki powinien wynosić 100 % st ężenia substancji badanej w przypadku cieczy lub 
maksymalne mo żliwe stężenie w przypadku cia ł stałych lub zawiesin.
 
22. Badanie wst ępne przeprowadza si ę w warunkach identycznych do tych, 
w jakich przeprowadza si ę główne badanie LLNA: BrdU-ELISA, z tym że 
nie przeprowadza si ę oceny proliferacji w ęzła chłonnego oraz mo żna 
wykorzysta ć mniejszą liczbę zwierząt w grupie badanej. Zaleca si ę jedno 
lub dwa zwierz ęta w grupie badanej. Wszystkie myszy b ędą obserwowane 
codziennie pod k ątem jakichkolwiek klinicznych oznak toksyczno ści ogól­
noustrojowej lub miejscowego podra żnienia skóry w miejscu zastosowa ­
nia. Masy cia ła są rejestrowane przed badaniem i przed jego zako ńczeniem 
(dzień 6.). Obydwoje uszu ka żdej myszy bada si ę pod kątem wyst ąpienia 
rumienia i ocenia przy wykorzystaniu tabeli 1 (pkt 20 oraz rozdzia ł B.4 
niniejszego za łącznika). Pomiary grubo ści ucha s ą przeprowadzane przy 
wykorzystaniu grubo ściomierza (np. cyfrowych mikrometrów lub 
grubościomierzem Peacock Dial) w dniu 1. (przed podaniem substancji), 
w dniu 3. (oko ło 48 godzin nast ępujących po podaniu pierwszej dawki) 
oraz w dniu 6. Ponadto w dniu 6. grubo ść ucha mo żna określić za pomoc ą 
kolczykownicy do pomiaru masy, co powinno by ć przeprowadzone po 
uśmierceniu zwierz ąt w humanitarny sposób. Nadmierne miejscowe 
podrażnienie skóry jest sygnalizowane przez rumie ń o wyniku ≥ 3 i/lub 
zwiększenie grubo ści ucha o ≥ 25 % w dniu pomiaru (21) (22). Najwy ższa 
dawka wybrana do g łównego badania LLNA: BrdU-ELISA to nast ępna 
niższa dawka w szeregu st ężeń badania wst ępnego (zob. pkt 18), która nie 
wywołuje ogólnoustrojowej toksyczno ści i/lub nadmiernego miejscowego 
podrażnienia skóry.  
Tabela 1  
Ocena punktowa rumienia  
Objawy Wynik  
Brak rumienia 0 
Bardzo lekki rumie ń (prawie niewidoczny) 1 
Wyraźny rumień 2  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 750
 
Objawy Wynik  
Rumień umiarkowany do mocnego 3 
Mocny rumie ń (czerwie ń przypominaj ąca barwę mięsa czer­
wonego) do form obrz ęku wykluczaj ących klasyfikacj ę 
rumienia 4 
23. Oprócz 25 % zwi ększenia grubo ści ucha (21) (22), do zidentyfikowania 
substancji dra żniących w metodzie LLNA wykorzystywano te ż staty­
stycznie istotne zwi ększenie grubo ści ucha u myszy badanych 
w porównaniu do myszy kontrolnych (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28). 
O ile jednak statystycznie znacz ące zwiększenie mo że wystąpić przy 
grubości ucha mniejszej ni ż 25 %, to nie uda ło się go powi ązać 
z nadmiernym podra żnieniem (25) (26) (27) (28) (29).  
24. Nast ępujące obserwacje kliniczne mog ą wskazywa ć na toksyczno ść ogól­
noustrojow ą (30), jeśli są wykorzystywane jako cz ęść zintegrowanej oceny 
i w związku z tym mog ą określać maksymalne dawki do stosowania 
w LLNA: BrdU-ELISA: zmiany w funkcjach uk ładu nerwowego (np. 
piloerekcja, ataksja, dr żenia, oraz konwulsje); zmiany w zachowaniu (na 
przykład agresja, zmiany w czyszczeniu, wyra źna zmiana w poziomie 
aktywności); zmiany w sposobie oddychania (np. zmiany 
w częstotliwości i intensywno ści oddychania, takie jak duszno ść, dyszenie 
oraz rzężenie), a tak że zmiany w konsumpcji żywności i wody. Ponadto 
w ocenie nale ży wziąć pod uwag ę oznaki stanów zwi ększonej senno ści 
i/lub brak reakcji oraz wszelkie objawy kliniczne sygnalizuj ące coś więcej 
niż chwilowy ból i cierpienie, lub > 5 % spadek masy cia ła od dnia 1. do 
dnia 6. czy śmiertelno ść. Zwierzęta konające oraz zwierz ęta wykazuj ące 
objawy silnego bólu i zagro żenia należy humanitarnie u śmiercić (31).  
Harmonogram do świadczalny g łównego badania  
25. Harmonogram do świadczalny badania jest nast ępujący: 
— Dzień 1: Indywidualnie okre ślić i odnotowa ć wagę każdego zwierz ęcia 
oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Stosuje si ę 25 μl właściwego 
roztworu lub samego no śnika, lub kontroli pozytywnej (równoleg łej 
lub najnowszej, na podstawie polityki laboratoryjnej, bierze si ę pod 
uwagę pkt 11–15), na cz ęść grzbietow ą każdego ucha.  
— Dzień 2 i 3:  Powtórzy ć procedurę stosowania przeprowadzon ą w dniu 1.  
— Dzień 4: Bez podawania.  
— Dzień 5: Wstrzykn ąć 0,5 mL (5 mg/mysz) roztworu BrdU (10 mg/mL) 
wewnątrzotrzewnowo.  
— Dzień 6: Zanotowa ć wagę każdego zwierz ęcia oraz wszelkie obser ­
wacje kliniczne. W oko ło 24 godziny (24 h) po wstrzykni ęciu BrdU 
należy uśmiercić w sposób humanitarny zwierz ęta. Wyci ąć uszne 
węzły chłonne z ka żdego ucha myszy i przetwarza ć oddzielnie 
w roztworze chlorku sodu buforowanym fosforanami (PBS) dla każdego zwierz ęcia. Informacje i schematy identyfikacji i rozbioru 
węzła chłonnego mo żna znaleźć w pozycji (17). Do celów dalszego 
monitorowania miejscowych reakcji skóry w badaniu g łównym, 
w protokole badania mo żna uwzgl ędnić dodatkowe parametry, takie 
jak punktacja rumienia ucha lub pomiar grubo ści ucha (zrobiony za 
pomocą grubościomierza lub za pomoc ą kolczykownicy do pomiaru 
masy w czasie sekcji).
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 751
 
Przygotowanie zawiesiny komórek  
26. Zostaje przygotowana jedna wspólna porcja zawiesiny z komórek w ęzła 
chłonnego (LNC) usuni ętych obustronnie u ka żdej myszy przez delikatne 
mechaniczne rozdzielenie agregatów na siateczce ze stali nierdzewnej o oczkach wielko ści 200 μm lub za pomoc ą innych mo żliwych do przy ­
jęcia technik s łużących tworzeniu jednokomórkowych zawiesin (np. wyko ­
rzystując jednorazowe plastikowe t łuczki do zgniecenia w ęzłów chłon­
nych, a nast ępnie przesiewaj ąc je przez nylonow ą siatkę #70). Procedura 
przygotowania zawiesiny LNC ma zasadnicze znaczenie w tym badaniu, zatem ka żdy operator powinien ustanowi ć technikę z wyprzedzeniem. 
Ponadto w ęzły chłonne u zwierz ąt z grupy kontroli negatywnej s ą niewiel­
kie, tak wi ęc ostrożne działanie ma istotne znaczenie dla unikni ęcia sztucz ­
nego wpływu na warto ści SI. W ka żdym przypadku docelowa obj ętość 
zawiesiny LNC powinna zosta ć dostosowana do okre ślonej zoptymalizo ­
wanej obj ęto
ści (około 15 mL). Obj ętość zoptymalizowana opiera si ę na 
osiągnięciu średniej absorpcji w grupie NC w zakresie 0,1– 0,2.  
Określenie proliferacji komórkowych (pomiar zawarto ści BrdU w DNA 
limfocytów)  
27. BrdU mierzy si ę za pomoc ą ELISA przy u życiu zestawu dost ępnego 
w handlu (np. Roche Applied Science, Mannheim, Niemcy, 
nr w katalogu 11 647 229 001). Krótko rzecz ujmuj ąc, 100 μL zawiesiny 
LNC dodaje si ę do zagłębień w płaskodennej p łytce w trzech egzempla ­
rzach. Po utrwaleniu i denaturacji LNC dodaje si ę przeciwcia ło anty-BrdU 
do każdego zag łębienia i umo żliwia reakcj ę. Następnie przeciwcia ło 
anty-BrdU jest usuwane poprzez p łukanie, dodaje si ę roztwór pod łoża 
i umożliwia wytworzenie chromogenu. Nast ępnie mierzy si ę absorbancj ę 
przy 370 nm ze wzorcow ą długością fali 492 nm. We wszystkich przy ­
padkach nale ży zoptymalizowa ć warunki badania (zob. pkt 26).  
OBSERWACJE  
Obserwacje kliniczne  
28. Zwierz ęta poddaje si ę starannej obserwacji klinicznej raz dziennie pod 
kątem jakichkolwiek oznak klinicznych, czy to miejscowego podra żnienia 
w miejscu zastosowania, czy te ż ogólnoustrojowej toksyczno ści. 
Wszystkie obserwacje kliniczne s ą systematycznie odnotowywane 
w postaci zapisów prowadzonych dla ka żdej myszy. Plany monitorowania 
powinny obejmowa ć kryteria umo żliwiające szybk ą identyfikacj ę tych 
myszy, które wykazuj ą oznaki toksyczno ści ogólnoustrojowej, nadmier ­
nego miejscowego podra żnienia skóry lub żrącego dzia łania na skór ę, 
w celu eutanazji (31).  
Masy cia ła 
29. Jak wskazano w pkt 25, indywidualne masy cia ła określane są na początku 
badania i przy planowanym humanitarnym u śmierceniu zwierz ąt. 
OBLICZANIE WYNIKÓW  
30. Wyniki dla ka żdej grupy badanej s ą wyrażane jako średni SI. SI otrzymuje 
się, dzieląc średnią wartość wskaźnika proliferacyjnego BrdU w obr ębie 
każdej grupy substancji badanej i grupie PC przez średnią wartość 
wskaźnika proliferacyjnego BrdU w grupie badanej z zastosowaniem 
rozpuszczalnika/VC. Średnie SI dla grup VC wynosi zatem jeden.  
Wskaźnik proliferacyjny BrdU definiuje si ę jako:  
wskaźnik proliferacyjny BrdU = (ABS  em – ABS blank  em ) – (ABS  ref – 
ABS blank  ref ) 
gdzie; em = d ługość fali emisji; a ref = wzorcowa d ługości fali.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. W procesie decyzyjnym wynik uznawany jest za pozytywny, je śli SI ≥ 1,6 
(10). Jednak że siła reakcji na dawk ę, znaczenie statystyczne i spójno ść 
reakcji rozpuszczalnik/no śnik i PC mog ą również być stosowane przy 
ustalaniu, czy wynik graniczny (tj. warto ść SI pomi ędzy 1,6 a 1,9) 
można uznać za pozytywny (3) (6) (32).  
32. W przypadku granicznego wyniku pozytywnego o warto ści SI pomi ędzy 
1,6 i 1,9 u żytkownicy mog ą rozważyć dodatkowe informacje, takie jak 
relacja dawka-reakcja, oznaki toksyczno ści ogólnoustrojowej lub nadmier ­
nego podra żnienia oraz, w stosownych przypadkach, istotno ść statystyczna 
wraz z warto ściami SI w celu potwierdzenia, czy wyniki te s ą pozytywne 
(10). Nale ży również rozważyć różne własności substancji badanej, w tym 
rozważyć, czy jest ona strukturalnie pokrewna znanym czynnikom uczulaj ­ 
ącym, czy powoduje nadmierne podra żnienie skóry u myszy, oraz zaob ­
serwowany charakter relacji dawka-reakcja. Te i inne wzgl ędy omówione 
są szczegółowo gdzie indziej (4).  
33. Gromadzenie danych dotycz ących poszczególnych myszy umo żliwi 
analizę statystyczn ą danych w odniesieniu do obecno ści i relacji 
dawka-reakcja. Ocena statystyczna mo że obejmowa ć ocenę relacji mi ędzy 
dawką a reakcją, jak równie ż odpowiednio dostosowane porównania bada ­
nych grup (np. grup ę badaną w parach w porównaniu z równoleg łą grupą 
kontrolną otrzymuj ącą nośnik/rozpuszczalnik). Analizy statystyczne mog ą 
obejmowa ć np. regresj ę liniową lub badanie Williamsa w celu dokonania 
oceny tendencji w relacji mi ędzy dawk ą a reakcją oraz badanie Dunnetta 
w odniesieniu do porówna ń par. Przy wyborze w łaściwej metody analizy 
statystycznej danych prowadz ący badanie powinien zachowa ć świadomość 
możliwej nierówno ści wariancji lub innych powi ązanych problemów, które 
mogą spowodowa ć konieczno ść transformacji danych lub przeprowadzenia 
nieparametrycznej analizy statystycznej. W ka żdym przypadku 
prowadzący badanie musi liczy ć się z konieczno ścią przeprowadzenia 
obliczeń SI i analiz statystycznych z wykorzystaniem pewnych punktów 
danych i bez nich (tzw. „warto ści odstające”).  
DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Dane  
34. Dane powinny by ć podsumowane w formie tabelarycznej pokazuj ącej 
wartości wskaźnika proliferacyjnego BrdU odnosz ące się do poszczegól ­
nych zwierz ąt, średnie warto ści wskaźnika proliferacyjnego BrdU/zwierz ę 
w danej grupie, zwi ązana warto ść błędu (np. SD, SEM) oraz średnie SI dla 
każdej grupy badanej w porównaniu z równoleg łą grupą kontroln ą 
z zastosowaniem rozpuszczalnika/no śnika.  
Sprawozdanie z bada ń 
35. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badane i kontrolne substancje chemiczne:  
— numery identyfikuj ące (np. CAS lub WE, je śli są dostępne); źródło: 
czystość; znane zanieczyszczenia; numer partii),  
— cechy fizyczne i w łasności fizykochemiczne (np. lotno ść, stabilno ść, 
rozpuszczalno ść), 
— jeżeli jest to mieszanina, sk ład i wzgl ędne udzia ły procentowe sk ład­
ników.  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— dane identyfikacyjne (czysto ść; stężenie, tam gdzie stosowne; wyko ­
rzystane obj ętości), 
— uzasadnienie wyboru no śnika. ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Zwierzęta badane:  
— źródło, z którego pochodz ą myszy szczepu CBA,  
— status mikrobiologiczny zwierz ąt, jeśli jest znany,  
— liczba i wiek zwierz ąt, 
— źródło pochodzenia zwierz ąt, warunki środowiska, pokarm itp.  
Warunki badania:  
— źródła, numer partii i dane producenta dotycz ące zapewniania/kontroli 
jakości dla zestawu ELISA,  
— szczegó ły przygotowania i stosowania substancji badanej,  
— uzasadnienie doboru dawek ( łącznie z wynikami z badania wst ępnego, 
jeśli było przeprowadzane),  
— nośnik i użyte stężenia substancji testowej oraz ca łkowita ilo ść zasto­
sowanej substancji badanej,  
— szczegó ły dotycz ące jakości pożywienia i wody (w łączając w to 
rodzaj/źródło diety, źródło wody),  
— szczegó ły dotycz ące poddania dzia łaniu substancji oraz harmono ­
gramów pobierania próbek,  
— metody pomiaru toksyczno ści, 
— kryteria uznawania bada ń za pozytywne lub negatywne,  
— szczegó ły dotyczące protoko łu odchyle ń i wyjaśnienie, w jaki sposób 
odchylenie ma wp ływ na planowanie bada ń i ich wyniki.  
Sprawdzenie wiarygodno ści: 
— podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodno ści badań, 
w tym informacji o wykorzystanej substancji badanej, st ężeniach 
i nośniku,  
— dane dotycz ące równoleg łej lub wcze śniejszej kontroli pozytywnej 
i dotyczące równoleg łej negatywnej (rozpuszczalnik/no śnik) kontroli 
z laboratorium testuj ącego,  
— jeżeli nie w łączono równoleg łej grupy PC, data i sprawozdanie labo ­
ratoryjne z ostatniego okresowego PC i sprawozdanie wyszczegól ­
niające wcześniejsze dane dotycz ące PC dla danego laboratorium, 
uzasadniaj ące przyczyny dla których nie przeprowadzono PC równo ­
legle.  
Wyniki:  
— masa poszczególnych myszy na pocz ątku dawkowania i przy plano ­
wanym humanitarnym u śmierceniu; jak równie ż średnia i opis powi ­ 
ązanego błędu (np. SD, SEM) w odniesieniu do ka żdej grupy badanej,  
— przebieg czasowy pojawienia si ę i oznaki toksyczno ści, w tym podra ż­
nień skóry w miejscu podania, je śli takie wyst ąpiły, u każdego zwie ­
rzęcia, 
— tabelę wskaźników proliferacyjnych BrdU dla poszczególnych myszy 
i wartości SI dla ka żdej grupy badanej,  
— średni oraz powi ązany okres b łędu (np. SD, SEM) dla wska źnika 
proliferacyjnego BrdU//mysz dla ka żdej grupy badanej i wyniki 
analizy obserwacji nietypowych dla ka żdej grupy badanej,  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— obliczone SI i w łaściwe pomiary zmienno ści, uwzgl ędniające zmien ­
ność pomiędzy zwierz ętami w odniesieniu do grup substancji badanej 
i grup kontrolnych,  
— relacja dawka-reakcja,  
— analizy statystyczne, tam gdzie stosowne.  
Omówienie wyników:  
— krótki komentarz do wyników, analiza zale żności reakcji od dawki 
oraz w stosownych przypadkach, analizy statystyczne, z wnioskiem, 
czy substancja testowa powinna by ć uznana za czynnik uczulaj ący 
skórę. 
BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guide ­
line No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Pary ż. 
Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: 
status of validation. Food Chem. Toxicol., 34, 999–1002.  
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The 
local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 34, 985–997.
 
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for iden ­
tifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327–33.
 
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van 
Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising 
potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncerta ­
inty margins. Toxicol., 146, 49–59.
 
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for 
assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: 
The results of an independent peer review evaluation coordinated by the 
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publi ­
cation No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dost ępny na stronie: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
 
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, 
W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review 
panel. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 258–273.
 
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. 
(2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. 
Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 274–286.
 
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM 
evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review 
process. Reg. Toxicol. Pharmacol., 34(3), 249–257.  
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradio ­
active local lymph node assay: BrdU-ELISA Test Method Protocol (LLNA: BrdU-ELISA). NIH Publication No. 10-7552 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na 
stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-ELISA/ 
TMER.htm]
 ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 755
 
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: 
Updated validation status of new versions and applications of the murine 
local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: 
[http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAP ­
RPRept2009.pdf]
 
(12) Takeyoshi, M., Iida, K., Shiraishi, K. and Hoshuyama, S. (2005), Novel 
approach for classifying chemicals according to skin sensitising potency by non-radioisotopic modification of the local lymph node assay. J. Appl. Toxicol., 25, 129–134.
 
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for 
Testing of Chemicals, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(14) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., 
Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as 
assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig 
maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896–1904.
 
(15) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., 
Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. 
Pharmacol., 55, 90–96.
 
(16) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for 
the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
 
(17) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local 
Lymph Node Assay. NIH Publication Number 09-7357. Research Triangle 
Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na 
stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNA ­
PerfStds.pdf]  
(18) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and 
potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71–89.  
(19) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The 
local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 
13–31.  
(20) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, 
Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Pary ż. Dostępny na stronie: 
[http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(21) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), 
Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants 
and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.  
(22) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow 
Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft 
Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Insti ­
tute of Environmental Health Sciences. Dost ępny na stronie: [http://ic ­
cvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].  
(23) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact 
hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide 
in female B6C3F1 mice. Drug Chem. Toxicol., 21, 195–206.  
(24) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, 
H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxi ­
col. Appl. Pharmacol., 153, 83–94.
 
(25) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine 
local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy 
potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245–256.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 756
 
(26) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate 
compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and compa ­
rison of test methods. Drug. Chem. Toxicol., 22, 491–506.  
(27) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Love ­
ren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter- laboratory validation of alternative 
endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 
60–68.
 
(28) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too 
sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721–728.  
(29) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec D. (2007), Lack of evidence for 
contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 
1023–1028.  
(30) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing  In Vitro  
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. 
Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health 
Sciences. Dost ępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acute ­
tox/Tox_workshop.htm].  
(31) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
 
(32) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basket ­
ter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, 
K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medi ­
caments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ.l Health, 53, 563–79.
 
(33) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, 
Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Pary ż. Dostępny na stro ­
nie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody 
badania a przyj ętymi warto ściami odniesienia. Jest to miara efektywno ści metody 
badania i jeden z aspektów jej istotno ści. Pojęcia tego cz ęsto używa się 
zamiennie z poj ęciem „zgodno ść” na oznaczenie odsetka prawid łowych wyników 
uzyskiwanych przy u życiu metody badania (33).  
Substancja wzorcowa:  uczulająca lub nieuczulajaca substancja wykorzystywana 
jako norma dla celów porównania z substancj ą badaną. Substancja wzorcowa 
powinna mie ć następujące cechy: (i) sta łe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobie ń­
stwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji; (iii) znane w łaści­
wości fizyczne/chemiczne; (iv) dane uzupe łniające, dotycz ące znanych skutków; 
oraz (v) znan ą siłę działania w zakresie po żądanych reakcji.  
Fałszywy wynik negatywny:  substancja badana, która w wyniku zastosowania 
metody badania zosta ła oznaczona niew łaściwie jako negatywna lub nieaktywna, 
podczas gdy w rzeczywisto ści jest pozytywna lub aktywna (33).  
Fałszywy wynik pozytywny:  substancja badana, która w wyniku zastosowania 
metody badania zosta ła oznaczona niew łaściwie jako pozytywna lub aktywna, 
podczas gdy w rzeczywisto ści jest negatywna lub nieaktywna (33).  
Zagrożenie:  możliwość wywierania negatywnego wp ływu na zdrowie lub środo­
wisko. Niekorzystny wp ływ przejawia si ę tylko wtedy, gdy istnieje wystarczaj ące 
narażenie.  
Odtwarzalno ść międzylaboratoryjna:  miernik zakresu, w jakim ró żne wykwalifi ­
kowane laboratoria, przy u życiu tego samego protoko łu i testując tę samą badaną 
substancję, mogą przynieść jakościowo i ilo ściowo podobne wyniki. Odtwarzal ­
ność międzylaboratoryjna jest okre ślana w procesach poprzedzaj ących walidacj ę 
i obejmuj ących walidacj ę i wskazuje, w jakim stopniu badanie mo żna 
z powodzeniem przekazywa ć między laboratoriami: nazywana jest równie ż 
odtwarzalno ścią międzylaboratoryjn ą (33).  
Odtwarzalno ść wewnątrzlaboratoryjna:  ustalenie stopnia, w jakim wykwalifiko ­
wani pracownicy w tym samym laboratorium mog ą z powodzeniem odtworzy ć 
wyniki, stosuj ąc szczegó łowy protokó ł w różnych momentach. Nazywana 
również odtwarzalno ścią laboratoryjn ą (33).  
Wynik odstaj ący: wynik odstaj ący jest obserwacj ą, która znacznie ró żni się od 
innych warto ści w losowej próbce z populacji.  
Zapewnienie jako ści: proces zarz ądzania, w którym przestrzeganie norm 
i wymogów w zakresie bada ń laboratoryjnych oraz procedur dotycz ących doku ­
mentacji i dok ładności przekazywania danych jest oceniane przez osoby nieza ­
leżne od tych, które przeprowadzaj ą badania.  
Wiarygodno ść: miernik zakresu, w jakim metoda badania mo że zostać wykonana 
w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomi ędzy laboratoriami 
w dłuższym okresie czasu, w przypadku jej wykonywania przy u życiu tego 
samego protoko łu. Ocenia si ę ją poprzez obliczenie odtwarzalno ści wewnątrz- 
i międzylaboratoryjnej (33).  
Działanie uczulaj ące na skór ę: proces immunologiczny, do którego dochodzi 
w przypadku, gdy osobnik wra żliwy jest nara żony miejscowo na wywo łujący 
uczulenie chemiczny alergen, powoduj ący immunologiczn ą reakcję skórną, co 
może prowadzi ć do uczulania przez kontakt ze skór ą. 
Wskaźnik stymulacji (SI):  wartość obliczona dla oceny potencjalnego dzia łania 
uczulającego na skór ę przez substancj ę badaną, który wyra ża się stosunkiem 
proliferacji w grupach poddanych dzia łaniu środka do proliferacji 
w równoleg łej grupie kontrolnej no śnika.  
Substancja badana (okre ślana także jako badana substancja chemiczna):  każda 
substancja lub mieszanina, badana za pomoc ą niniejszej TM.  ▼M3 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  OSTRA TOKSYCZNO ŚĆ INHALACYJNA – METODA KLAS 
OSTREJ TOKSYCZNO ŚCI 
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna dotycz ącej badań wytycznej 
OECD nr 436 (2009). Dotycz ącą badań ostrej toksyczno ści inhalacyjnej 
wytyczną nr 403 przyj ęto po raz pierwszy w 1981 r., nast ępnie jednak 
wprowadzano do niej zmiany (zob. rozdzia ł B.2 niniejszego za łącznika 
(1)). Opracowanie metody klas ostrej toksyczno ści dla toksyczno ści inhala­
cyjnej (2) (3) (4) uznano za w łaściwe po przyj ęciu zmienionej metody klas 
ostrej toksyczno ści dla toksyczno ści doustnej (rozdzia ł B.1 tris niniejszego 
załącznika) (5). Retrospektywna ocena dzia łania badawczej metody klas 
ostrej toksyczno ści dla ostrej toksyczno ści inhalacyjnej wykaza ła, że metoda 
ta jest odpowiednia do zastosowania na potrzeby klasyfikacji i oznakowania 
(6). Badawcza metoda klas ostrej toksyczno ści dla toksyczno ści inhalacyjnej 
pozwoli na przeprowadzenie szeregu dzia łań z zastosowaniem okre ślonych 
stężeń docelowych w celu ustanowienia klasyfikacji toksyczno ści badanej 
substancji chemicznej. Jako kluczowy punkt ko ńcowy stosuje si ę śmiertel­
ność, jednak zwierz ęta doświadczające silnego bólu lub stresu, cierpi ące lub 
które nieuchronnie czeka zgon, nale ży w humanitarny sposób u śmiercić 
w celu zminimalizowania ich cierpienia. Wytyczne dotycz ące 
humanitarnego punktu ko ńcowego s ą dostępne w wytycznych OECD 
nr 19 (7).  
2. Wytyczne dotycz ące przeprowadzania i interpretacji wyników niniejszej 
metody badawczej mo żna znaleźć w dotycz ących badania ostrej toksycz ­
ności inhalacyjnej wytycznych nr 39 (GD 39) (8).  
3. Definicje zastosowane w kontek ście niniejszej metody badawczej przedsta ­
wiono w dodatku 1 oraz w GD 39 (8).  
4. Niniejsza metoda badawcza umo żliwia uzyskanie informacji na temat 
niebezpiecznych w łaściwości badanej substancji chemicznej oraz pozwala 
na jej ocen ę i klasyfikacj ę zgodnie z rozporz ądzeniem (WE) nr 1272/2008 
dotyczącym klasyfikacji substancji chemicznych powoduj ących ostr ą 
toksyczno ść (9). Jeśli wymagana jest estymacja punktowa warto ści LC  50 
lub analizy zale żności stężenie-odpowied ź, odpowiedni ą metodą badawcz ą, 
jaką należy zastosowa ć, jest metoda opisana w rozdziale B.2 niniejszego 
załącznika (1). Dalsze wytyczne dotycz ące wyboru metody badawczej 
można znale źć w GD 39 (8). Niniejsza metoda badawcza nie jest 
w szczególno ści przeznaczona do badania materia łów specjalnych, takich 
jak słabo rozpuszczalne materia ły izometryczne lub w łókniste czy te ż 
wytworzone nanomateria ły. 
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE  
5. Aby zminimalizowa ć wykorzystanie zwierz ąt, przed rozwa żeniem wyko ­
nania badania wed ług niniejszej metody badawczej laboratorium badawcze 
powinno wzi ąć pod uwag ę wszystkie dost ępne informacje na temat badanej 
substancji chemicznej, w tym wyniki istniej ących bada ń, dzięki którym 
można byłoby unikn ąć wykonywania dodatkowych bada ń. Informacje, 
które mog ą być pomocne w doborze najbardziej odpowiedniego gatunku, 
szczepu, p łci, sposobu nara żenia oraz odpowiednich st ężeń do badania obej ­
mują nazwę, struktur ę chemiczn ą i właściwości fizykochemiczne badanej 
substancji chemicznej; wyniki wszelkich bada ń toksyczno ści in vitro  lub 
in vivo ; spodziewane zastosowania i potencjalne nara żenie ludzi; dost ępne 
dane dotycz ące (Q)SAR oraz dane toksykologiczne na temat strukturalnie 
powiązanych zwi ązków. St ężeń, w przypadku których przewiduje si ę, że 
powodują silny ból i stres z powodu swojego dzia łania żrącego (  1 ) lub silnie 
drażniącego, nie nale ży badać za pomoc ą niniejszej metody badawczej [zob. 
GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) Do oceny dzia łania żrącego można wykorzysta ć ocenę specjalistyczn ą opartą na takich 
dowodach, jak: wyniki bada ń z udziałem ludzi lub zwierz ąt, istniejące dane ( in vitro ), np. 
rozdział B.40 (10), B.40 bis (11) niniejszego za łącznika lub wytyczna OECD TG 435 
(12), warto ści pH, informacje dotycz ące podobnych substancji chemicznych lub inne 
istotne dane.
 ZASADA BADANIA  
6. Zasada niniejszego badania polega na uzyskaniu wystarczaj ących informacji 
na temat ostrej toksyczno ści inhalacyjnej badanej substancji chemicznej za 
pomocą procedury sekwencyjnej podczas okresu nara żenia trwaj ącego 4 
godziny, w celu umo żliwienia jej klasyfikacji. Dla poszczególnych celów 
regulacyjnych mog ą obowiązywać inne czasy trwania nara żenia. Na ka żdym 
etapie badania z okre ślonym stężeniem bada si ę 3 zwierz ęta każdej płci. 
W zależności od upadkowo ści lub stanu agonalnego zwierz ąt do stwier ­
dzenia ostrej toksyczno ści badanej substancji chemicznej mog ą wystarczy ć 
2 etapy. Je śli udowodniono, że jedna z p łci jest bardziej podatna na dzia ­ 
łanie substancji, badanie mo żna kontynuowa ć z wykorzystaniem jedynie 
osobników takiej bardziej podatnej p łci. Wynik poprzedniego etapu okre śli 
działania w ramach kolejnego etapu, na przyk ład: 
a) dalsze badania nie s ą konieczne;  
b) badanie trzech zwierz ąt każdej płci; lub  
c) badanie z wykorzystaniem 6 zwierz ąt jedynie p łci bardziej podatnej na 
działanie substancji, tj. szacunki ni ższych warto ści granicznych klasy 
toksyczno ści należy oprzeć na badaniach z wykorzystaniem 6 zwierz ąt 
w każdej grupie otrzymuj ącej określone stężenie, niezale żnie od p łci 
takich zwierz ąt. 
7. Zwierz ęta w stanie agonalnym lub zwierz ęta wykazuj ące oczywiste oznaki 
bólu czy oznaki ostrego i przewlek łego stresu powinny zosta ć uśmiercone 
w humanitarny sposób i uwzgl ędnione w interpretacji wyników bada ń w ten 
sam sposób, co zwierz ęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania 
decyzji co do u śmiercenia zwierz ąt w stanie agonalnym lub cierpi ących 
silny ból oraz wytyczne dotycz ące rozpoznawania przewidywalnego lub 
nieuchronnie zbli żającego się zgonu zawarto w wytycznych OECD nr 19 
dotyczących humanitarnego punktu ko ńcowego (7).  
OPIS METODY  
Wybór gatunku zwierz ąt 
8. Nale ży wykorzysta ć zdrowe, m łode, doros łe zwierz ęta pochodz ące ze 
szczepów powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. Preferowanym gatunkiem jest szczur, a w przypadku wykorzystania innego gatunku nale ży 
podać uzasadnienie.
 
Przygotowanie zwierz ąt 
9. Samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą być w ciąży. W dniu nara żenia 
zwierzęta powinny by ć młodymi doros łymi osobnikami w wieku 8-12 
tygodni, a ich masa cia ła powinna mie ścić się w zakresie ± 20 % średniej 
masy dla ka żdej płci zwierz ąt w tym samym wieku poddanych uprzednio 
narażeniu. Zwierz ęta wybiera si ę losowo i oznacza w sposób umo żliwiający 
identyfikacj ę poszczególnych osobników. Zwierz ęta przetrzymuje si ę 
w klatkach przez co najmniej 5 dni przed rozpocz ęciem badania, aby umo ż­
liwić ich aklimatyzacj ę do warunków laboratoryjnych. Zwierz ęta powinny 
również być przyzwyczajane do przyrz ądów używanych w badaniu przez 
krótki okres przed rozpocz ęciem badania, poniewa ż zmniejszy to ich stres 
spowodowany wprowadzeniem do nowego środowiska.  
Hodowla zwierz ąt 
10. Temperatura w pomieszczeniach, w których przetrzymuje si ę zwierzęta 
doświadczalne, powinna wynosi ć 22 ± 3 °C. Najlepiej by łoby, gdyby 
wilgotność względna była utrzymywana w przedziale 30-70 %, chocia ż 
może to być niemożliwe w przypadku stosowania wody jako no śnika. 
Przed nara żeniem i po nim zwierz ęta na ogó ł należy trzymać w klatkach 
w grupach podzielonych wed ług płci i badanego st ężenia, lecz liczba 
zwierząt w klatce nie powinna przeszkadza ć w dokładnej obserwacji 
każdego zwierz ęcia, a tak że powinna umo żliwiać zminimalizowanie strat 
w zwierz ętach spowodowanych kanibalizmem i walkami. Je żeli zwierz ęta 
mają być poddane nara żeniu tylko przez nos, konieczne mo że być przyzwy ­
czajenie ich do rur unieruchamiaj ących. Rury unieruchamiaj ące nie powinny 
powodowa ć u zwierz ąt nadmiernego stresu fizycznego, termicznego ani  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
stresu zwi ązanego z unieruchomieniem. Unieruchomienie mo że wpłynąć na 
fizjologiczne punkty ko ńcowe, takie jak temperatura cia ła (hipertermia) lub 
minutowa pojemno ść oddechowa. Je żeli dostępne są dane ogólne, na 
podstawie których mo żna wykaza ć, że takie zmiany nie wyst ępują 
w znaczącym stopniu, uprzednia adaptacja do rur unieruchamiaj ących nie 
jest konieczna. Zwierz ęta, których ca ła powierzchnia cia ła jest nara żana na 
działanie aerozolu, w trakcie nara żenia powinny by ć trzymane oddzielnie, 
aby zapobiec filtrowaniu badanego aerozolu przez futro innych zwierz ąt 
w tej samej klatce. Mo żna stosowa ć konwencjonalne oraz certyfikowane 
pasze laboratoryjne, z wyj ątkiem okresów poddawania nara żeniu, podczas 
których stosuje si ę nieograniczony dost ęp do wody pitnej z miejscowej 
instalacji wodoci ągowej. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 12 
godzin światła, 12 godzin ciemno ści. 
Komory inhalacyjne  
11. Przy wyborze komory inhalacyjnej nale ży wziąć pod uwag ę charakter 
badanej substancji chemicznej i cel badania. Preferowan ą drogą narażenia 
jest narażenie tylko przez nos (poj ęcie to obejmuje nara żenie tylko g łowy, 
narażenie tylko przez nos lub nara żenie tylko pyska). Nara żenie tylko przez 
nos jest na ogó ł preferowane w badaniach aerozoli ciek łych lub sta łych oraz 
par, które mog ą skraplać się, tworząc aerozole. Nara żenie całego ciała może 
lepiej sprzyja ć osiągnięciu szczególnych celów badania, taki wybór nale ży 
jednak uzasadni ć w sprawozdaniu z badania. Aby zagwarantowa ć stabilność 
atmosfery przy zastosowaniu komory do poddawania nara żeniu całego ciała, 
całkowita obj ętość badanych zwierz ąt nie powinna przekracza ć 5 % obj ę­
tości komory. Zasady technik nara żenia tylko przez nos i przez 
powierzchni ę całego ciała oraz ich szczególne zalety i wady omówiono 
w GD 39 (8).  
WARUNKI NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE SUBSTANCJI  
Stosowanie st ężeń 
12. Zaleca si ę stosowanie sta łego okresu poddania nara żeniu trwaj ącego cztery 
godziny, z wyj ątkiem okresu wyrównywania st ężeń. W przypadku koniecz ­
ności spełnienia konkretnych wymogów mo żna zastosowa ć inne okresy 
trwania nara żenia, nale ży to jednak uzasadni ć w sprawozdaniu z badania 
[zob. GD 39 (8)]. Zwierz ęta poddane dzia łaniu aerozoli w komorach do 
poddawania nara żeniu całego ciała należy przetrzymywa ć pojedynczo, aby 
zapobiec po łykaniu badanej substancji chemicznej przy wylizywaniu innych 
zwierząt znajdujących się w tej samej klatce. W okresie nara żenia na dzia ­ 
łanie substancji nale ży wstrzyma ć podawanie paszy. Podczas ca łego okresu 
poddawania nara żeniu całego ciała można zapewni ć dostęp do wody.  
13. Zwierz ęta są poddawane nara żaniu na dzia łanie badanej substancji 
chemicznej w formie gazu, pary, aerozolu lub mieszaniny tych postaci. Stan fizyczny, który ma by ć przedmiotem badania, zale ży od właściwości 
fizykochemicznych badanej substancji chemicznej, wybranego st ężenia lub 
formy fizycznej, która najprawdopodobniej b ędzie wyst ępować podczas 
postępowania z badan ą substancj ą chemiczn ą i jej stosowania. Badane 
substancje chemiczne o charakterze higroskopijnym oraz reaktywne 
chemicznie nale ży badać w suchej atmosferze. Nale ży zachowa ć ostrożność, 
aby unikn ąć osiągnięcia stężenia wybuchowego.
 
Rozkład wielko ści cząstek 
14. W odniesieniu do wszystkich aerozoli oraz par, które mog ą skraplać się, 
tworząc aerozole, nale ży dokona ć klasyfikacji cz ąstek wed ług wielko ści. 
W celu umo żliwienia nara żenia na dzia łanie danej substancji wszystkich 
odpowiednich cz ęści dróg oddechowych zaleca si ę aerozole o średnicy aero ­
dynamicznej mediany rozk ładu masowego (MMAD) wynosz ącej od 1 do 
4 μm przy geometrycznym standardowym odchyleniu ( σ g ) równym od 1,5 
do 3,0 (8) (13) (14). Nale ży dołożyć uzasadnionych stara ń, aby spe łnić tę 
normę, jednak w razie niemo żności jej osi ągnięcia należy przedstawi ć 
specjalistyczn ą opinię. Przykładowo pary metali mog ą zawierać cząstki 
mniejsze ni ż przewiduje to norma, a cz ąstki naładowane, w łókna 
i materiały higroskopijne (których rozmiar zwi ększa się w wilgotnym środo­
wisku uk ładu oddechowego) mog ą tę normę przekracza ć. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Przygotowanie badanej substancji chemicznej w no śniku  
15. Do uzyskania odpowiedniego st ężenia i rozmiaru cz ąstek badanej substancji 
chemicznej w atmosferze mo żna zastosowa ć nośnik. Zasadniczo prefero ­
wanym no śnikiem powinna by ć woda. Materia ły stałe można podda ć 
obróbce mechanicznej w celu uzyskania wymaganego zró żnicowania wiel ­
kości cząstek, jednak nale ży zachowa ć ostrożność, aby badana substancja 
chemiczna nie uleg ła rozkładowi ani zmianom. W przypadkach, w których 
można przypuszcza ć, że w wyniku procesów mechanicznych zmieni ł się 
skład badanej substancji chemicznej (np. w skrajnych temperaturach 
powstających na skutek tarcia przy nadmiernie intensywnym mieleniu), 
należy go zweryfikowa ć metodami analitycznymi. Nale ży dołożyć odpo­
wiednich stara ń, aby unikn ąć zanieczyszczenia badanej substancji chemicz ­
nej. Nie ma potrzeby badania materia łów granulowanych niemaj ących 
charakteru sypkiego, które s ą celowo przygotowywane tak, aby nie ulega ły 
wdychaniu. Nale ży wykona ć próbę na ścieranie w celu wykazania, że przy 
wykorzystywaniu materia łu granulowanego nie powstaj ą cząstki respira ­
bilne. Jeżeli w wyniku próby na ścieranie powstan ą cząstki respirabilne, 
należy wykona ć badanie toksyczno ści inhalacyjnej.  
Zwierzęta kontrolne  
16. Wykorzystanie równoleg łej ujemnej (poddanej dzia łaniu powietrza) grupy 
kontrolnej nie jest konieczne. W przypadku wykorzystania no śnika innego 
niż woda w celu wytworzenia atmosfery na potrzeby badania nale ży użyć 
grupy kontrolnej no śnika tylko wtedy, gdy brak jest dost ępnych danych 
historycznych na temat toksyczno ści inhalacyjnej. Je żeli badanie toksycz ­
ności dla badanej substancji chemicznej zmieszanej z no śnikiem nie wyka że 
toksyczno ści, wynika z tego, że dany no śnik jest nietoksyczny w badanych 
stężeniach, a zatem nie ma potrzeby tworzenia grupy kontrolnej no śnika.  
MONITOROWANIE WARUNKÓW NARA ŻENIA NA DZIA ŁANIE 
SUBSTANCJI  
Przepływ powietrza w komorze  
17. Przep ływ powietrza przez komor ę należy starannie kontrolowa ć 
i monitorowa ć w sposób ciag ły, jak równie ż rejestrowa ć podczas nara żania 
na działanie substancji nie rzadziej ni ż co godzin ę. Monitorowanie st ężenia 
(lub stabilno ści) badanej substancji w atmosferze uzyskanej na potrzeby 
badania jest integralnym pomiarem wszystkich parametrów dynamicznych i umożliwia w sposób po średni kontrol ę wszystkich istotnych parametrów 
dynamicznych w zakresie wytwarzania atmosfery. Nale ży w szczególno ści 
uwzględnić kwestię zapobiegania ponownemu wdychaniu w komorach prze ­
znaczonych do nara żenia wyłącznie przez nos w przypadkach, gdy przep ływ 
powietrza przez uk ład podawania substancji jest nieodpowiedni do zapew ­
nienia dynamicznego przep ływu powietrza zawieraj ącego badan ą substancj ę 
chemiczn ą. Istnieją zalecane metody, które mo żna zastosowa ć do wykaza ­
nia, że w wybranych warunkach ponowne wdychanie nie zachodzi (8) (15). 
Stężenie tlenu powinno wynosi ć co najmniej 19 %, a st ężenie dwutlenku 
węgla nie powinno przekracza ć 1 %. Jeżeli istniej ą
 powody, by przypusz ­
czać, że norma ta nie mo że zostać osiągnięta, należy mierzyć stężenia tlenu 
i dwutlenku w ęgla. 
Temperatura i wilgotno ść względna w komorze  
18. W komorze nale ży utrzymywa ć temperatur ę na poziomie 22 ± 3 °C. Wilgot ­
ność względną w strefie oddychania zwierz ąt – zarówno dla nara żenia tylko 
przez nos, jak i dla nara żenia całego ciała – nale ży monitorowa ć 
i rejestrowa ć co najmniej trzykrotnie podczas okresów poddawania dzia łaniu 
substancji trwaj ących do 4 godzin, a podczas okresów krótszych – co 
godzinę. Należy utrzymywa ć wilgotno ść względną w przedziale 30–70 %, 
choć może to być nieosiągalne (np. przy badaniu mieszanin opartych na 
wodzie) lub niemo żliwe do zmierzenia w przypadku zak łócenia danej 
metody badawczej przez badan ą substancj ę chemiczn ą. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 762
 
Badana substancja chemiczna: st ężenie nominalne  
19. Tam, gdzie to mo żliwe, nale ży obliczy ć i zarejestrowa ć stężenie nominalne 
w komorze badawczej. St ężenie nominalne jest to masa wytworzonej 
badanej substancji chemicznej podzielona przez ca łkowitą objętość 
powietrza przepuszczonego przez system komory. St ężenie nominalne nie 
służy do charakteryzowania nara żenia zwierz ąt, lecz porównanie st ężenia 
nominalnego i st ężenia rzeczywistego umo żliwia okre ślenie w przybli żeniu 
efektywno ści wytwarzania substancji badanej w uk ładzie badawczym, a tym 
samym mo żna je wykorzysta ć do wykrywania problemów zwi ązanych 
z takim wytwarzaniem.  
Badana substancja chemiczna: st ężenie rzeczywiste  
20. Stężenie rzeczywiste jest to st ężenie badanej substancji chemicznej w strefie 
oddychania zwierz ąt w komorze inhalacyjnej. St ężenie rzeczywiste mo żna 
uzyskać za pomoc ą metod swoistych (np. bezpo średniego pobierania 
próbek, metod adsorpcji lub reakcji chemicznej, a nast ępnie charakterystyki 
analitycznej) lub metod nieswoistych, takich jak analiza grawimetryczna 
przy zastosowaniu filtra. Zastosowanie metody grawimetrycznej jest akcep ­
towalne tylko w przypadku aerozoli proszkowych zawieraj ących jeden 
składnik lub aerozoli cieczy o niskiej lotno ści i należy wtedy przed bada ­
niem wykona ć odpowiedni ą, swoistą dla badanej substancji chemicznej 
charakterystyk ę. Za pomoc ą metody grawimetrycznej mo żna równie ż 
określić stężenie wielosk ładnikowego aerozolu proszkowego. Do tego 
jednak konieczne s ą dane analityczne, za pomoc ą których mo żna wykaza ć, 
że skład materia łu znajduj ącego się w powietrzu jest podobny do sk ładu 
materiału wyjściowego. W razie braku takich informacji mo że być 
konieczna ponowna analiza badanej substancji chemicznej (najlepiej znaj ­
dującej się w powietrzu) w toku badania, w regularnych odst ępach czaso ­
wych. W przypadku środków w formie aerozoli, które mog ą ulec odparo ­
waniu lub sublimacji, nale ży wykaza ć, że stosując wybran ą metodę, zebrano 
wszystkie fazy. W sprawozdaniu z badania nale ży podać stężenia docelowe, 
nominalne i rzeczywiste, ale w analizach statystycznych do wyliczenia wartości stężeń śmiertelnych uwzgl ędnia się tylko stężenia rzeczywiste.
 
21. Jeżeli to mo żliwe, nale ży używać badanej substancji chemicznej 
pochodzącej z jednej partii, a badan ą próbkę należy przechowywa ć 
w warunkach zapewniaj ących jej czysto ść, jednorodno ść i stabilno ść. 
Przed rozpocz ęciem badania nale ży scharakteryzowa ć badaną substancj ę 
chemiczn ą, w tym okre ślić jej czysto ść oraz, o ile jest to wykonalne 
z technicznego punktu widzenia, nazw ę oraz ilo ści zidentyfikowanych 
domieszek i zanieczyszcze ń. Można to wykaza ć, między innymi, za pomoc ą 
następujących danych: czasu retencji i wzgl ędnej powierzchni sygna łu, masy 
cząsteczkowej uzyskanej w drodze spektrometrii masowej lub chromato ­
grafii gazowej b ądź innych oszacowa ń. Mimo że identyfikacja badanej 
próbki nie nale ży do obowi ązków laboratorium badawczego, rozs ądne 
może być potwierdzenie przez to laboratorium charakterystyki, któr ą przed­
stawił sponsor, przynajmniej w ograniczonym zakresie (np. co do koloru, 
cech fizycznych itp.).  
22. Podczas nara żenia nale ży utrzymywa ć możliwie niezmienn ą atmosfer ę 
i monitorowa ć ją stale lub co pewien czas, w zale żności od metody anali ­
tycznej. Je żeli stosuje si ę pobieranie próbek co pewien czas, podczas czte ­
rogodzinnego badania nale ży pobiera ć próbki powietrza w komorze nie 
rzadziej ni ż dwa razy podczas badania. Je żeli z powodu ograniczonej pr ęd­
kości przepływu powietrza lub niskich st ężeń jest to niemo żliwe, mo żna 
pobrać jedną próbkę na cały okres nara żenia. W razie wyst ąpienia znacz ­
nych fluktuacji pomi ędzy próbkami dla kolejnych badanych st ężeń należy 
pobrać cztery próbki na okres nara żenia. Warto ści stężeń w komorze dla 
poszczególnych próbek nie powinny odbiega ć od stężenia średniego 
w komorze o wi ęcej niż ± 10 % w przypadku gazów i par oraz o wi ęcej 
niż ± 20 % w przypadku aerozoli ciek łych lub sta łych. Nale ży obliczy ć 
i zapisać okres wyrównania st ężeń w komorze (t  95 ). Czas trwania nara żenia 
obejmuje czas wprowadzania badanej substancji chemicznej do komory przy 
uwzględnieniu czasu potrzebnego do osi ągnięcia t  95 . Wytyczne dotycz ące 
szacowania t  95 można znaleźć w GD 39 (8).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. W przypadku bardzo z łożonych mieszanin sk ładających się z par/gazów 
i aerozoli (np. w przypadku atmosfer spalania i badanych substancji 
chemicznych wydzielanych ze specjalnych produktów/urz ądzeń do zastoso ­
wania ko ńcowego) ka żda faza mo że zachowywa ć się inaczej w komorze 
inhalacyjnej, nale ży zatem wybra ć co najmniej jedn ą substancj ę wskaźni­
kową (analit) z ka żdej fazy (para/gaz i aerozol) – zazwyczaj jest to g łówna 
substancja czynna mieszaniny. Je żeli badana substancja chemiczna jest 
mieszanin ą, należy podać stężenie analityczne w odniesieniu do ca łej 
mieszaniny, a nie tylko substancji czynnej lub sk ładnika aktywnego (anali ­
tu). Dodatkowe informacje na temat st ężeń rzeczywistych mo żna znaleźć 
w GD 39 (8).  
Badana substancja chemiczna: rozk ład wielko ści cząstek 
24. Rozk ład wielko ści cząstek aerozoli nale ży określać co najmniej dwa razy 
podczas ka żdego czterogodzinnego okresu nara żenia za pomoc ą impaktora 
kaskadowego lub innego instrumentu, takiego jak aerodynamiczny spektro ­
metr pomiaru cz ąstek. Jeżeli można wykaza ć równowa żność wyników uzys ­
kanych za po średnictwem impaktora kaskadowego lub innego instrumentu, 
to ten inny instrument mo że być stosowany przez ca ły okres badania. 
W celu potwierdzenia sprawno ści zatrzymywania cz ąstek przez instrument 
główny nale ży równolegle do tego instrumentu stosowa ć drugie urz ądzenie, 
takie jak filtr grawimetryczny lub odpylacz/be łkotka. Stężenie masowe uzys ­
kane na podstawie analizy wielko ści cząstek powinno mie ścić się 
w rozsądnych granicach st ężenia masowego uzyskanego poprzez analiz ę 
filtrów [zob. GD 39 (8)]. Je śli można wykaza ć równowa żność 
w początkowej fazie badania, dalsze pomiary potwierdzaj ące można 
pominąć. Ze wzgl ędu na dobrostan zwierz ąt należy podjąć środki maj ące 
na celu zminimalizowanie ilo ści danych niejednoznacznych, które mog ą 
prowadzić do konieczno ści powtórzenia nara żenia. Klasyfikacj ę cząstek 
według wielko ści należy przeprowadzi ć w odniesieniu do par, je żeli istnieje 
jakakolwiek mo żliwość tworzenia si ę aerozolu wskutek kondensacji par lub 
jeśli cząstki są wykrywane w atmosferze parowej maj ącej potencja ł 
tworzenia faz mieszanych (zob. pkt 14).  
PROCEDURA  
Badanie g łówne  
25. W ka żdym etapie wykorzystuje si ę trzy zwierz ęta każdej płci lub sze ść 
zwierząt płci bardziej podatnej na dzia łanie substancji. Je śli gatunki gryzoni 
inne niż szczury poddaje si ę narażeniu tylko przez nos, maksymalne okresy 
narażenia można dostosowa ć, by zminimalizowa ć charakterystyczny dla 
danego gatunku stres. Poziom st ężenia do zastosowania w dawce 
wyjściowej wybiera si ę spośród jednego z czterech okre ślonych poziomów 
i taki wyj ściowy poziom st ężenia powinien by ć poziomem, co do którego 
istnieje najwi ększe prawdopodobie ństwo, że wywo ła on toksyczno ść 
u niektórych ze zwierz ąt narażanych. Plany badania w przypadku gazów, 
par i aerozoli (przedstawione w dodatkach 2–4) przedstawiaj ą badanie 
wartości granicznych dla kategorii z rozporz ądzenia CLP 1–4 (9) dla 
gazów (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (dodatek 2), dla par (0,5; 2; 10; 
20 mg/l/4h) (dodatek 3) i dla aerozoli (0,05; 0,5; 1; 5 mg/l/4h) (dodatek 4). Kategoria 5, której nie wdro żono rozporz ądzeniem (WE) nr 1272/2008 (9), 
dotyczy st ężeń powyżej odpowiednich st ężeń granicznych. Dla ka żdego 
stężenia wyjściowego stosuje si ę odpowiedni plan badania. W zale żności 
od liczby zwierz ąt uśmierconych z powodów humanitarnych lub zwierz ąt 
padłych, procedur ę badania przeprowadza si ę zgodnie ze wskazanymi strza ł­
kami aż do etapu, na którym mo żliwe jest dokonanie kategoryzacji.  
26. Odst ępy czasowe mi ędzy podawaniem dawek w ka żdej grupie poddawanej 
narażeniu okre śla się na podstawie czasu wyst ąpienia, d ługości trwania 
i cieżkości oznak toksyczno ści. Należy odwlec nara żenie zwierz ąt przy 
kolejnym poziomie st ężenia do momentu, gdy mo żna w sposób uzasadniony 
uznać, że uprzednio badane zwierz ęta przeżyły. Zaleca si ę przerwę długości 
trzech lub czterech dni mi ędzy nara żeniem z zastosowaniem kolejnych 
poziomów st ężenia, w celu umo żliwienia obserwacji opó źnionego dzia łania 
toksycznego. Taki odst ęp czasowy mo żna odpowiednio dostosowa ć, np. 
w przypadku niejednoznacznych reakcji.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Badanie graniczne  
27. Badanie graniczne stosuje si ę wtedy, gdy badana substancja chemiczna jest 
znana lub mo żna się spodziewa ć, że jest ona praktycznie nietoksyczna, tj. 
powoduje efekt toksyczny dopiero powy żej stężenia granicznego przewi ­
dzianego przepisami. Informacje na temat toksyczno ści badanej substancji 
chemicznej mo żna uzyska ć na podstawie wiedzy na temat podobnych 
zbadanych substancji lub podobnych mieszanin, z uwzgl ędnieniem nazwy 
i zawarto ści procentowej sk ładników, o których wiadomo, że mają 
znaczenie z punktu widzenia toksyczno ści. W sytuacji niewystarczaj ącej 
ilości lub braku informacji na temat toksyczno ści badanej substancji 
chemicznej lub w przypadku gdy oczekuje si ę, że taka substancja jest 
toksyczna, nale ży przeprowadzi ć badanie g łówne [dalsze wytyczne mo żna 
znaleźć w GD 39 (8)].  
28. W ramach normalnej procedury nara żeniu poddaje si ę trzy zwierz ęta każdej 
płci, lub sze ść zwierząt płci bardziej podatnej na dzia łanie substancji, przy 
stężeniach na poziomie odpowiednio 20 000 ppm w przypadku gazów, 20 
mg/l w przypadku pary i 5 mg/l w przypadku py łów/mgieł (jeśli jest to 
osiągalne), co stanowi badanie graniczne w ramach niniejszej metody 
badawczej. Przy badaniu aerozoli celem podstawowym powinno by ć osiąg­
nięcie cząstek o respirabilnych rozmiarach (np. średnica aerodynamiczna 
mediany rozk ładu masowego (MMAD) na poziomie 1-4 μm). Jest to 
możliwe w przypadku wi ększości badanych substancji chemicznych przy 
stężeniu 2 mg/l. Badanie aerozoli przy st ężeniu większym niż 2 mg/l nale ży 
przeprowadza ć tylko wtedy, je śli można osiągnąć rozmiar cz ąstek umo żli­
wiający ich wdychanie [zob. GD 39 (8)]. Zgodnie z GHS (16) w trosce 
o dobrostan zwierz ąt odradza si ę badania przy st ężeniu wyższym niż 
stężenie graniczne. Badanie w ramach kategorii GHS 5 (16), która nie 
jest wdra żana rozporz ądzeniem (WE) nr 1272/2008 (9), nale ży brać pod 
uwagę tylko w przypadku znacznego prawdopodobie ństwa, że wyniki takich 
badań przynios ą bezpośrednie korzy ści dla ochrony zdrowia ludzi, a w 
sprawozdaniu z badania nale ży podać uzasadnienie. W przypadku badanych 
substancji chemicznych, które mog ą spowodowa ć wybuch, nale ży dołożyć 
starań w celu unikni ęcia warunków sprzyjaj ących wybuchowi. Aby unikn ąć 
zbędnego wykorzystania zwierz ąt, należy przed badaniem granicznym prze ­
prowadzić test próbny bez udzia łu zwierz ąt w celu upewnienia si ę, że 
warunki w komorze do przeprowadzenia badania granicznego s ą możliwe 
do osiągnięcia. 
OBSERWACJE  
29. Zwierz ęta w trakcie okresu nara żenia nale ży często poddawa ć obserwacji 
klinicznej. Po nara żeniu nale ży prowadzi ć obserwacje kliniczne – w dniu 
narażenia co najmniej dwukrotnie, lub cz ęściej, jeśli wskazuje na to reakcja 
zwierząt na poddawanie dzia łaniu substancji, a po tym dniu co najmniej raz 
dziennie przez łącznie 14 dni. D ługość okresu obserwacji nie jest okre ślona, 
należy ją jednak ustali ć na podstawie charakteru i czasu wyst ąpienia 
objawów klinicznych oraz d ługości okresu zdrowienia. Czas, w jakim poja ­
wiają się i zanikaj ą oznaki toksyczno ści, jest istotny, szczególnie 
w przypadku tendencji do wyst ępowania opó źnionych oznak toksyczno ści. 
Wszystkie obserwacje s ą systematycznie zapisywane w ewidencji prowa ­
dzonej osobno dla ka żdego zwierz ęcia. Zwierz ęta, u których stwierdzono 
stan agonalny, oraz zwierz ęta wykazuj ące objawy silnego bólu lub stresu 
należy ze wzgl ędu na ich dobrostan u śmiercić w sposób humanitarny. Przy 
badaniu pod k ątem klinicznych oznak toksyczno ści należy zachowa ć ostroż­
ność, aby nie pomyli ć początkowego z łego wygl ądu i przej ściowych zmian 
oddechowych, b ędących skutkiem procedury nara żenia, ze skutkami zwi ąza­
nymi z poddawaniem zwierz ąt działaniu badanej substancji chemicznej. 
Należy przestrzega ć zasad i kryteriów streszczonych w wytycznych dotycz ­ 
ących humanitarnego punktu ko ńcowego (7). W przypadku u śmiercenia 
zwierząt z przyczyn humanitarnych lub stwierdzenia ich zgonu nale ży 
możliwie najdok ładniej zapisa ć czas zgonu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 765
 
30. Obserwacje zwierz ąt w klatkach powinny obejmowa ć zmiany skóry i sier ści, 
oczu i b łon śluzowych; jak równie ż zmiany w uk ładzie oddechowym 
i układzie krążenia, zmiany w autonomicznym i o środkowym uk ładzie 
nerwowym oraz zmiany w aktywno ści somatycznej i sposobie zachowania. 
O ile to mo żliwe, nale ży odnotowa ć rozróżnienie pomi ędzy skutkami miej ­
scowymi i ogólnoustrojowymi. Szczególn ą uwagę należy poświęcić obser­
wacjom dr żenia, konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki. 
Pomiar temperatury w odbycie mo że dostarczy ć dodatkowych dowodów 
potwierdzaj ących odruchowe spowolnienie oddechu lub hipo-/hipertermi ę 
w związku z poddawaniem dzia łaniu substancji lub przetrzymywaniem 
w zamkni ęciu. 
Masa cia ła 
31. Nale ży odnotowywa ć masy cia ła poszczególnych zwierz ąt: raz podczas 
okresu aklimatyzacji, w dniu nara żenia przed nara żeniem (dzie ń 0), oraz 
przynajmniej w dniach 1, 3 i 7 (a nast ępnie co tydzie ń), jak równie ż 
w momencie zgonu lub eutanazji, je śli nastąpi ona pó źniej niż w dniu 1. 
Masę ciała uznaje si ę za krytyczny wska źnik toksyczno ści, zatem zwierz ęta 
wykazujące stały spadek wagi na poziomie ≥ 20 %, w porównaniu 
z wartościami przed badaniem, nale ży ściśle monitorowa ć. Po zako ńczeniu 
okresu po nara żeniu zwierz ęta, które prze żyły, są ważone i humanitarnie 
uśmiercane.  
Patologia  
32. Wszystkie badane zwierz ęta, w tym te, które pad ły podczas bada ń lub 
zostały poddane eutanazji i wyeliminowane z bada ń ze wzgl ędu na ich 
dobrostan, nale ży poddać pełnemu rozpoznaniu histopatologicznemu. Je żeli 
sekcji zw łok nie mo żna przeprowadzi ć natychmiast po znalezieniu 
martwego zwierz ęcia, zwierz ę należy schłodzić (nie zamrozi ć) do tempera ­
tury wystarczaj ąco niskiej do zminimalizowania autolizy. Sekcj ę zwłok 
należy przeprowadzi ć możliwie szybko, zwykle w ci ągu jednego lub 
dwóch dni. W odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia należy odnotowa ć 
wszystkie makroskopowe zmiany patologiczne ze szczególnym uwzgl ędnie­
niem wszelkich zmian w drogach oddechowych.  
33. Można rozwa żyć przeprowadzenie dodatkowych, uprzednio zaprojektowa ­
nych testów w celu zwi ększenia warto ści interpretacyjnej badania, np. 
pomiaru masy p łuc u szczurów, które prze żyły, czy dostarczenia dowodów 
na podra żnienie poprzez badanie dróg oddechowych pod mikroskopem. 
Można równie ż objąć badaniem organy wykazuj ące wyraźne zmiany pato ­
logiczne u zwierz ąt, które prze żyły 24 lub wi ęcej godzin, oraz organy, co do 
których wiadomo lub mo żna oczekiwa ć, że narażenie miało na nie wp ływ. 
Z mikroskopowego badania ca łych dróg oddechowych mo żna uzyska ć 
użyteczne informacje na temat badanych substancji chemicznych, które 
reagują z wod ą, takich jak kwasy i badane substancje chemiczne 
o właściwościach higroskopijnych.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
34. Nale ży podać dane dotycz ące masy cia ła i wyników sekcji zw łok dotycz ące 
poszczególnych zwierz ąt. Dane z obserwacji klinicznych nale ży zestawi ć 
w postaci tabeli, przedstawiaj ąc w odniesieniu do ka żdej badanej grupy 
liczbę wykorzystanych zwierz ąt, liczbę zwierząt wykazuj ących specyficzne 
oznaki toksyczno ści, liczbę zwierząt padłych w trakcie trwania badania lub 
uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych 
zwierząt, opis skutków toksycznych oraz ich przebieg w czasie 
i odwracalno ść, a także wyniki sekcji zw łok. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Sprawozdanie z badania  
35. Sprawozdanie z badania powinno w stosownych przypadkach zawiera ć 
następujące informacje:  
Badane zwierz ęta i ich hodowla  
— opis warunków przetrzymywania w klatkach, w tym: liczba (lub zmiana 
liczby) zwierz ąt na klatk ę, ściółka, temperatura otoczenia i wilgotno ść 
względna, fotoperiod i okre ślenie diety,  
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie zastosowania gatunków 
innych ni ż szczur,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— metoda randomizacji,  
— szczegó łowe informacje na temat jako ści pożywienia i wody (w tym 
rodzaj/źródło diety oraz źródło wody),  
— opis wszelkich przygotowa ń przed badaniem, w tym diety, kwarantanny 
i leczenia chorób.  
Badana substancja chemiczna  
— cechy fizyczne, czysto ść oraz w stosownych przypadkach w łaściwości 
fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),  
— dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract 
Services (CAS), je żeli jest znany.  
Nośnik 
— uzasadnienie zastosowania no śnika oraz uzasadnienie wyboru no śnika 
(jeżeli jest inny ni ż woda),  
— dane historyczne lub równoleg łe wykazuj ące, że nośnik nie zak łóca 
wyniku badania.  
Komora inhalacyjna  
— szczegó łowy opis komory inhalacyjnej, w tym jej rozmiary i obj ętość, 
— źródło i opis wyposa żenia wykorzystywanego do celów nara żenia 
zwierząt, jak równie ż do wytwarzania atmosfery,  
— wyposa żenie do pomiaru temperatury, wilgotno ści, wielko ści cząstek 
i stężenia rzeczywistego,  
— źródło powietrza, metoda oczyszczania dostarczanego/pobieranego 
powietrza oraz system klimatyzacji,  
— metody kalibracji wyposa żenia w celu zapewnienia jednorodnej atmos ­
fery na potrzeby badania,  
— różnica ciśnienia (dodatnia lub ujemna),  
— porty nara żenia w komorze (nara żenie tylko przez nos); lokalizacja 
zwierząt w układzie (nara żenie całego ciała), 
— jednorodno ść/stabilność w czasie atmosfery na potrzeby badania,  
— lokalizacja czujników temperatury i wilgotno ści oraz pobieranie próbek 
powietrza w komorze,  
— natężenie przep ływu powietrza, nat ężenie przep ływu powietrza/port 
narażenia (nara żenie tylko przez nos) lub ładunek zwierz ąt/komorę 
(narażenie całego ciała), 
— informacje na temat wyposa żenia stosowanego do pomiaru zawarto ści 
tlenu i dwutlenku w ęgla, w stosownych przypadkach,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— czas potrzebny do wyrównania st ężeń w komorze inhalacyjnej (t  95 ), 
— liczba zmian obj ętości na godzin ę, 
— urządzenia pomiarowe (w stosownych przypadkach).  
Dane ekspozycji  
— uzasadnienie wyboru docelowego st ężenia w badaniu g łównym,  
— stężenia nominalne (ca łkowita masa badanej substancji chemicznej 
wprowadzonej do komory inhalacyjnej podzielona przez obj ętość 
powietrza przepuszczonego przez komor ę), 
— rzeczywiste st ężenia badanej substancji chemicznej w próbkach ze strefy 
oddychania zwierz ąt; w przypadku mieszanin, które tworz ą heteroge ­
niczne formy fizyczne (gazy, pary, aerozole), ka żdą substancj ę można 
analizowa ć oddzielnie,  
— wszystkie st ężenia substancji w powietrzu nale ży podawa ć 
w jednostkach masy (np. mg/l, mg/m  3 itp.), w nawiasie mo żna podać 
również jednostki obj ętości (np. ppm, ppb itp.),  
— rozkład wielko ści cząstek, średnica aerodynamiczna mediany rozk ładu 
masowego (MMAD) oraz geometryczne odchylenie standardowe ( σ g ), 
w tym metody ich obliczania. Nale ży odnotowa ć poszczególne analizy 
wielkości cząstek. 
Warunki badania  
— szczegó łowe informacje na temat przygotowania badanej substancji 
chemicznej, w tym szczegó ły dotyczące wszelkich procedur zastosowa ­
nych w celu zmniejszenia rozmiaru cz ąstek substancji sta łych lub przy ­
gotowania roztworów badanej substancji chemicznej. W przypadkach gdy procesy mechaniczne mog ły wpłynąć na zmian ę składu badanej 
substancji chemicznej, nale ży zamieścić wyniki analiz maj ących na 
celu weryfikacj ę składu badanej substancji chemicznej,
 
— opis (najlepiej wraz ze schematem) wyposa żenia wykorzystywanego do 
wytworzenia atmosfery na potrzeby badania i nara żania zwierz ąt na jej 
działanie,  
— szczegó łowe informacje na temat zastosowanej metody analizy 
chemicznej oraz walidacji metody (w tym wydajno ść odzysku badanej 
substancji chemicznej ze środka do pobierania próbek),  
— uzasadnienie wyboru badanych st ężeń. 
Wyniki  
— tabelaryczne zestawienie temperatury, wilgotno ści i przep ływu powietrza 
w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących nominalnego 
i rzeczywistego st ężenia w komorze,  
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących wielko ści cząstek, w tym 
danych dotycz ących gromadzenia próbek analitycznych, zró żnicowania 
wielkości cząstek oraz obliczenia średnicy aerodynamicznej mediany 
rozkładu masowego (MMAD) i σ g , 
— tabelaryczne zestawienie danych dotycz ących reakcji i poziomu st ężenia 
dla każdego zwierz ęcia (tj. zwierz ąt wykazuj ących oznaki toksyczno ści, 
w tym śmiertelno ść, rodzaj, ostro ść, czas pojawienia si ę i czas trwania 
objawów),  
— masy cia ła poszczególnych zwierz ąt zarejestrowane w trakcie badania, 
data i godzina zgonu, je śli nastąpił przed planow ą eutanazj ą; przebieg 
w czasie oznak toksyczno ści i informacje, czy by ły one odwracalne 
w przypadku ka żdego zwierz ęcia, ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— wyniki sekcji zw łok oraz bada ń histopatologicznych w odniesieniu do 
każdego zwierz ęcia, jeżeli są dostępne, 
— klasyfikacja kategorii wed ług rozporz ądzenia CLP oraz warto ść 
graniczna LC  50 . 
Omówienie i interpretacja wyników  
— szczególny nacisk nale ży położyć na opis metod zastosowanych w celu 
spełnienia kryteriów niniejszej metody badawczej, np. dotycz ących 
stężenia granicznego lub rozmiaru cz ąstek, 
— należy uwzględnić respirabilno ść cząstek w świetle wyników ogólnych, 
szczególnie je żeli nie mo żna było spełnić kryterium wielko ści cząstek, 
— w ogólnej ocenie badania nale ży uwzględnić spójność metod zastoso ­
wanych w celu okre ślenia nominalnego i rzeczywistego st ężenia oraz 
relacji mi ędzy stężeniem rzeczywistym a nominalnym,  
— należy uwzględnić prawdopodobn ą przyczyn ę zgonu i dominuj ący 
sposób dzia łania (ogólnoustrojowy w porównaniu z miejscowym),  
— należy przedstawi ć wyjaśnienie, je żeli zaistnia ła konieczno ść humanitar ­
nego uśmiercenia zwierz ąt wykazuj ących oznaki bólu lub objawy 
ostrego i przewlek łego stresu, zgodnie z kryteriami zawartymi 
w wytycznych OECD dotycz ących humanitarnego punktu ko ńcowego 
(7). 
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Rozdzia ł B.2 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść ostra (inhalacyjna).  
(2) Holzhütter H-G, Genschow E, Diener W i Schlede E (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxi ­
col. 77: 243–254.  
(3) Diener W, Kayser D i Schlede E (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class 
Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537–549.
 
(4) Diener W i Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to 
LD/LC  50 Tests. ALTEX 1: 129–134.  
(5) Rozdzia ł B.1 tris niniejszego za łącznika. Ostra toksyczno ść doustna – 
metoda klas ostrej toksyczno ści. 
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the 
Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation 
Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment nr 105, OECD, Pary ż. Tekst dost ępny pod adresem: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment nr 19.Tekst dost ępny pod adresem: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment nr 39, OECD, Pary ż. Tekst dost ępny pod adresem: [http:// 
www.oecd.org/env/testguidelines]  
(9) Rozporz ądzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 
z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin, zmieniaj ące i uchylaj ące dyrektywy 
67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniaj ące rozporz ądzenie (WE) 
nr 1907/2006 (Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1).
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
(10) Rozdzia ł B.40 niniejszego za łącznika. Badanie niszczenia skóry metod ą in 
vitro : test przezskórnego oporu elektrycznego (TER).  
(11) Rozdzia ł B.40 bis niniejszego za łącznika. Badanie zniszczenia skóry metod ą 
in vitro : badanie modelu skóry ludzkiej.  
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for testing of chemicals nr 435, OECD, Pary ż. Tekst 
dostępny pod adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]  
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2 
wydanie) Informa Healthcare, Nowy Jork.  
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, 
Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321–327.
 
(15) Pauluhn J i Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 
160–167  
(16) ONZ (2007), Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji 
i Oznakowania Chemikaliów (GHS) ONZ, ST/SG/AC.10/30, ONZ Nowy 
Jork i Genewa. Tekst dost ępny pod adresem: [http://www.unece.org/trans/ 
danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Dodatek 1  
DEFINICJA  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Dodatek 2  
Procedura, jak ą należy zastosowa ć przy ka żdym z wyj ściowych st ężeń 
w przypadku gazów (ppm/4h)  
Uwagi ogólne (  1 ) 
Dla każdego stężenia wyj ściowego odpowiednie plany bada ń zawarte 
w niniejszym dodatku przedstawiaj ą procedur ę, jaką należy zastosowa ć. 
Dodatek 2a:  Stężenie wyjściowe wynosi 100 ppm  
Dodatek 2b:  Stężenie wyjściowe wynosi 500 ppm  
Dodatek 2c:  Stężenie wyjściowe wynosi 2 500 ppm  
Dodatek 2d:  Stężenie wyjściowe wynosi 20 000 ppm  
W zależności od liczby zwierz ąt uśmierconych z powodów humanitarnych lub 
zwierząt padłych procedur ę badania przeprowadza si ę zgodnie ze wskazanymi 
strzałkami.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Poniższe tabele odnosz ą się do Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji 
i Oznakowania Chemikaliów (GHS). Jego odpowiednikiem na poziomie UE jest 
rozporządzenie (WE) nr 1272/2008. W przypadku ostrej toksyczno ści inhalacyjnej 
rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 (9) nie wdra ża kategorii 5.
 Dodatek 2a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Dodatek 2b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Dodatek 2c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Dodatek 2d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Dodatek 3  
Procedura, jak ą należy zastosowa ć przy ka żdym z wyj ściowych st ężeń 
w przypadku par (mg/l/4h)  
Uwagi ogólne (  1 ) 
Dla każdego stężenia wyj ściowego odpowiednie plany bada ń zawarte 
w niniejszym dodatku przedstawiaj ą procedur ę, jaką należy zastosowa ć. 
Dodatek 3a:  Stężenie wyjściowe wynosi 0,5 mg/l  
Dodatek 3b:  Stężenie wyjściowe wynosi 2,0 mg/l  
Dodatek 3c:  Stężenie wyjściowe wynosi 10 mg/l  
Dodatek 3d:  Stężenie wyjściowe wynosi 20 mg/l  
W zależności od liczby zwierz ąt uśmierconych z powodów humanitarnych lub 
zwierząt padłych procedur ę badania przeprowadza si ę zgodnie ze wskazanymi 
strzałkami.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Poniższe tabele odnosz ą się do Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji 
i Oznakowania Chemikaliów (GHS). Jego odpowiednikiem na poziomie UE jest 
rozporządzenie (WE) nr 1272/2008. W przypadku ostrej toksyczno ści inhalacyjnej 
rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 (9) nie wdra ża kategorii 5.
 Dodatek 3a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Dodatek 3b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Dodatek 3c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Dodatek 3d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Dodatek 4  
Procedura, jak ą należy zastosowa ć przy ka żdym z wyj ściowych st ężeń 
w przypadku aerozoli (mg/l/4h)  
Uwagi ogólne (  1 ) 
Dla każdego stężenia wyj ściowego odpowiednie plany bada ń zawarte 
w niniejszym dodatku przedstawiaj ą procedur ę, jaką należy zastosowa ć. 
Dodatek 4a:  Stężenie wyjściowe wynosi 0,05 mg/l  
Dodatek 4b:  Stężenie wyjściowe wynosi 0,5 mg/l  
Dodatek 4c:  Stężenie wyjściowe wynosi 1 mg/l  
Dodatek 4d:  Stężenie wyjściowe wynosi 5 mg/l  
W zależności od liczby zwierz ąt uśmierconych w sposób humanitarny lub mart ­
wych zwierz ąt procedura bada ń przebiega zgodnie z kierunkiem wyznaczanym 
przez strza łki. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Poniższe tabele odnosz ą się do Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji 
i Oznakowania Chemikaliów (GHS). Jego odpowiednikiem na poziomie UE jest 
rozporządzenie (WE) nr 1272/2008. W przypadku ostrej toksyczno ści inhalacyjnej 
rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 (9) nie wdra ża kategorii 5.
 Dodatek 4a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.05 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Dodatek 4b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Dodatek 4c  
Acute inhalation toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Dodatek 4d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  BADANIE NEUROTOKSYCZNO ŚCI ROZWOJOWEJ  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest zgodna z dotycz ącą badań wytyczną OECD 
nr 426 (2007 r.). W czerwcu 1995 r. w Kopenhadze grupa robocza OECD 
ds. toksyczno ści reprodukcyjnej i rozwojowej omawia ła potrzeb ę aktuali­
zacji istniej ących wytycznych OECD dotycz ących bada ń w zakresie 
toksyczno ści reprodukcyjnej i rozwojowej oraz opracowania nowych 
wytycznych w odniesieniu do punktów ko ńcowych, których jeszcze nie 
uwzględniono (1). Grupa robocza zaleci ła opracowanie dotycz ącej badań 
wytycznej w zakresie neurotoksyczno ści rozwojowej na podstawie 
wytycznej ameryka ńskiej Agencji Ochrony Środowiska, która zosta ła już 
poprawiona (2). W czerwcu 1996 r. w Kopenhadze odby ło się drugie spot ­
kanie konsultacyjne, którego celem by ło dostarczenie Sekretariatowi wska ­
zówek dotycz ących konspektu nowej dotycz ącej bada ń wytycznej 
w zakresie neurotoksyczno ści rozwojowej, w tym jej najbardziej istotnych 
elementów, np. szczegó łów dotycz ących doboru gatunków zwierz ąt, okresu 
dawkowania, okresu badania, punktów ko ńcowych podlegaj ących ocenie 
i kryteriów oceny wyników. Ameryka ńska wytyczna dotycz ąca oceny 
ryzyka neurotoksyczno ści została opublikowana w 1998 r. (3). Spotkanie 
konsultacyjne ekspertów OECD i warsztaty prowadzone przez Risk Science 
Institute przy ILSI odby ły się równolegle w pa ździerniku 2000 r., 
a spotkanie konsultacyjne ekspertów odby ło się w Tokio w 2005 r. Spot ­
kania te mia ły na celu omówienie kwestii naukowych i technicznych 
związanych z aktualnymi wytycznymi dotycz ącymi bada ń, a zalecenia, 
które były ich wynikiem (4)(5)(6)(7), uwzgl ędniono w opracowaniu przed ­
miotowej metody badawczej. Dodatkowe informacje dotycz ące procedury, 
interpretacji i terminologii stosowanej w przypadku tej metody badawczej 
można znaleźć w dokumencie zawieraj ącym wytyczne OECD nr 43 ‘Repro ­
ductive Toxicity Testing and Assessment’ (Badanie i ocena toksyczno ści 
reprodukcyjnej) (8) oraz nr 20 ‘Neurotoxicity Testing’ (Badanie neuroto ­
ksyczności) (9).  
USTALENIA WST ĘPNE  
2. Znany jest szereg substancji chemicznych, które prowadz ą do neurotoksycz ­
ności rozwojowej u ludzi i innych gatunków (10)(11)(12)(13). Okre ślenie 
potencjału wywo ływania neurotoksyczno ści rozwojowej mo że być 
niezbędne do oceny i zbadania toksycznych cech charakterystycznych 
substancji chemicznej. Badania neurotoksyczno ści rozwojowej maj ą na 
celu dostarczanie danych, w tym charakterystyki dawka-odpowied ź, dotycz­ 
ących potencjalnych skutków czynno ściowych i morfologicznych dla 
rozwijającego się układu nerwowego potomstwa, które mog ą powstać 
w wyniku nara żenia in utero  i we wczesnym stadium życia.  
3. Badanie neurotoksyczno ści rozwojowej mo żna prowadza ć jako oddzielne 
badanie w łączone do badania toksyczno ści reprodukcyjnej lub badania 
neurotoksyczno ści u doros łych osobników (np. metody badawcze B.34 
(14), B.35 (15), B.43 (16)), lub w powi ązaniu z badaniem przedurodze ­
niowej toksyczno ści rozwojowej (np. z metod ą badawcz ą B.31 (17)). Je żeli 
badanie neurotoksyczno ści rozwojowej jest w łączone do innego badania lub 
z nim powi ązane, konieczne jest zachowanie integralno ści obu rodzajów 
badań. Wszystkie badania powinny by ć zgodne z maj ącymi zastosowanie 
przepisami lub wytycznymi rz ądowymi i instytucjonalnymi, dotycz ącymi 
wykorzystywania zwierz ąt doświadczalnych w badaniach (np. 18).  
4. Laboratorium badawcze powinno uwzgl ędnić wszystkie dost ępne informacje 
na temat badanej substancji chemicznej przed przyst ąpieniem do badania. 
Informacje te powinny obejmowa ć tożsamość i struktur ę chemiczn ą substan­
cji, jej w łaściwości fizykochemiczne; wyniki wszystkich innych bada ń 
toksyczno ści in vitro  lub in vivo  przeprowadzonych na substancji, dane 
toksykologiczne substancji chemicznych zbli żonych pod wzgl ędem budowy 
oraz przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne dla przekonania wszystkich zainteresowanych stron, że badanie 
dotyczy ochrony zdrowia ludzi i jest pomocne w wyborze odpowiedniej 
dawki wyj ściowej.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
ZASADA BADANIA  
5. Badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę zwierzętom przez okres ci ąży 
i laktacji. Badania prowadzi si ę na matkach, aby oceni ć skutki dla samic 
w okresie ci ąży i laktacji oraz aby mie ć możliwość uzyskania informacji 
porównawczych (matki w porównaniu z potomstwem). Do oceny neuroto ­
ksyczności potomstwo dobiera si ę losowo z miotu. Ocena polega na obser ­
wacji maj ącej na celu wykrycie powa żnych anomalii neurologicznych 
i behawioralnych, w tym na ocenie rozwoju fizycznego, rozwoju zachowa ń, 
aktywności ruchowej, funkcji motoryczno-sensorycznych, uczenia si ę 
i pamięci, ocenie mas mózgów i ocenie neuropatologicznej w okresie 
rozwoju pourodzeniowego i doros łości. 
6. Jeżeli metod ę badawcz ą stosuje si ę jako odr ębne badanie, mo żna wyko­
rzystać dodatkowe, dost ępne zwierz ęta z każdej grupy w celu przeprowa ­
dzenia szczegó łowych procedur neurobehawioralnych, neuropatologicznych, 
neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, które mog ą uzupełnić dane 
otrzymane w badaniach zalecanych w ramach niniejszej metody 
(16)(19)(20)(21). Procedury uzupe łniające mogą być szczególnie u żyteczne 
w przypadkach, gdy obserwacje empiryczne, przewidywane skutki lub mechanizm/sposób dzia łania wskazuj ą na jakiś szczególny rodzaj neuroto ­
ksyczności. Te procedury uzupe łniające można stosowa ć zarówno 
w przypadku matek, jak i m łodych. Ponadto mo żna równie ż stosowa ć 
procedury  ex vivo  lub in vitro , o ile nie zmieni ą one integralno ści procedur  
in vivo .
 
PRZYGOTOWANIA DO BADANIA  
Wybór gatunków zwierz ąt 
7. Badania najlepiej jest przeprowadza ć na szczurach; w stosownych przypad ­
kach można wykorzysta ć inne gatunki. Nale ży jednak pami ętać, że liczba 
dni ciąży i liczba dni okresu postnatalnego okre ślone w tej metodzie s ą 
charakterystyczne dla powszechnie stosowanych szczepów szczurów i w 
związku z tym nale ży dobrać porównywalne liczby dni w przypadku wyko ­
rzystania innego gatunku lub nietypowego szczepu. Nale ży uzasadni ć wyko­
rzystanie innego gatunku na podstawie danych toksykologicznych, farmako ­
kinetycznych lub innych. Uzasadnienie powinno obejmowa ć dostępne, 
określone dla gatunku oceny neurobehawioralne i neuropatologiczne prze ­
prowadzone w okresie pourodzeniowym. Je żeli wcześniej miało miejsce 
badanie, które wzbudzi ło zaniepokojenie, nale ży uwzględnić gatunek/szczep, 
w odniesieniu do którego mia ło to miejsce. Ze wzgl ędu na zró żnicowane, 
związane z badaniami cechy ró żnych szczepów szczurów powinien istnie ć 
dowód, że wybrany do badania szczep charakteryzuje si ę odpowiedni ą płod­
nością i zdolno ścią reagowania. Nale ży udokumentowa ć wiarygodno ść 
i czułość innych gatunków pod wzgl ędem wykrywania neurotoksyczno ści 
rozwojowej.  
Warunki trzymania i żywienia  
8. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna 
wynosić 22 ± 3 °C. Chocia ż wilgotno ść względna powinna wynosi ć co 
najmniej 30 % i najlepiej by łoby, gdyby nie przekracza ła 70 % poza czasem 
czyszczenia pomieszczenia, docelowy poziom wilgotno ści powinien 
wynosić 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu dziennym 
12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. Możliwe jest równie ż odwrócenie 
cyklu światła przed kryciem i na okres trwania badania w celu przeprowa ­
dzenia oceny funkcjonalnych i behawioralnych punktów ko ńcowych w fazie 
nocy (przy o świetleniu czerwonym światłem), tj. w czasie, gdy zwierz ęta są 
zwykle aktywne (22). Wszelkie zmiany w cyklu dzie ń/noc powinny 
uwzględniać odpowiedni czas aklimatyzacji aby zwierz ęta mogły przysto ­
sować się do nowego cyklu. Do żywienia mo żna stosowa ć konwencjonalne 
pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody pitnej. Nale ży 
zgłosić rodzaj pokarmu i wod ę i przebada ć je pod k ątem zanieczyszcze ń. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Zwierz ęta mogą być trzymane pojedynczo lub umieszczane w klatkach 
w małych grupach o tej samej p łci. Procedury krycia powinny by ć przepro­
wadzane w klatkach nadaj ących się do tego celu. Po stwierdzeniu, że kopu­
lacja nast ąpiła, lub nie pó źniej niż w 15 dniu ci ąży, pokryte zwierz ęta 
powinny by ć umieszczone oddzielnie w klatkach porodowych lub matczy ­
nych. Klatki powinny by ć ustawione w taki sposób, żeby zminimalizowa ć 
możliwy wpływ położenia klatki. Tu ż przed porodem nale ży zapewni ć 
pokrytym samicom w łaściwe i okre ślone materia ły do budowy gniazda. 
Wiadomo powszechnie, że nieodpowiednie obchodzenie si ę ze zwierz ęciem 
lub stres w czasie ci ąży mogą pociągać za sobą niepożądane skutki, w tym 
straty przedurodzeniowe, wadliwy rozwój p łodu i wadliwy rozwój pouro ­
dzeniowy. W celu ochrony przed strat ą płodu spowodowan ą czynnikami 
niezwiązanymi z do świadczeniem nale ży ostrożnie postępować ze zwierz ę­
tami w czasie ci ąży i chroni ć je przed stresem wywo ływanym czynnikami 
zewnętrznymi, takimi jak nadmierny ha łas na zewn ątrz. 
Przygotowanie zwierz ąt 
10. Nale ży wykorzystywa ć zdrowe zwierz ęta zaaklimatyzowane do warunków 
laboratoryjnych i niepoddawane wcze śniej procedurom do świadczalnym, 
chyba że badanie zosta ło włączone do innego badania (zob. pkt 3). Nale ży 
sporządzić charakterystyk ę badanych zwierz ąt pod kątem gatunku, szczepu, 
źródła pochodzenia, p łci, wagi i wieku. Ka żdemu zwierz ęciu należy nadać 
niepowtarzalny numer identyfikacyjny i oznaczy ć je tym numerem. Na tyle, 
na ile to mo żliwe, we wszystkich badanych grupach zwierz ęta powinny 
mieć jednakow ą masę ciała i być w tym samym wieku oraz mie ścić się 
w zakresach typowych dla gatunku lub szczepu obj ętego badaniem. Do 
każdej dawki nale ży wykorzysta ć młode dojrza łe samice nieródki. Nie 
należy wykorzystywa ć rodzeństwa do krycia i nale ży dołożyć wszelki 
starań, aby to zapewni ć. Dzień 0 danej ci ąży jest dniem, w którym odno ­
towuje si ę czop pochwowy lub plemniki w pochwie. Po zakupie od 
dostawcy zap łodnionych w znanym czasie zwierz ąt należy dać im odpo ­
wiedni czas na aklimatyzacj ę (np. 2–3 dni). Pokryte samice nale ży przy­
dzielić w sposób losowy do grup kontrolnych i grup eksperymentalnych i, 
o ile to mo żliwe, rozdzieli ć je równomiernie mi ędzy grupy (np. zaleca si ę 
procedurę warstwowego doboru losowego w celu zapewnienia równomier ­
nego rozłożenia zwierz ąt między wszystkie grupy, np. na podstawie masy 
ciała). Samice inseminowane przez tego samego samca powinny by ć 
rozdzielone równomiernie mi ędzy grupy.  
PROCEDURA  
Liczba i p łeć zwierząt 
11. Każda grupa badana i kontrolna powinna sk ładać się z wystarczaj ącej liczby 
ciężarnych samic, które maj ą być poddane dzia łaniu badanej substancji 
chemicznej, aby uzyska ć odpowiedni ą liczbę potomstwa do oceny neuroto ­
ksyczności. W odniesieniu do ka żdego poziomu dawki zaleca si ę wykorzys ­
tanie łącznie 20 miotów. Dopuszcza si ę schematy dawkowania powtarza ­
nego i etapowego w odniesieniu do grupy, w przypadkach gdy udaje si ę 
uzyskać całkowitą liczbę miotów na grup ę i stosuje si ę odpowiednie modele 
statystyczne, na podstawie których okre śla się powtórzenia.  
12. W dniu 4. po urodzeniu lub przed nim (dzie ń porodu jest dniem 0) liczeb ­
ność każdego miotu powinna zosta ć dostosowana przez wyeliminowanie 
dodatkowych m łodych w miocie za pomoc ą doboru losowego, aby uzyska ć 
jednakow ą liczebno ść wszystkich miotów (23). Liczebno ść miotu nie 
powinna przekracza ć średniej liczebno ści miotu wykorzystanego szczepu 
gryzoni (8–12). Miot powinien si ę składać, w miar ę możliwości, z takiej 
samej liczby m łodych samców i samic. Selektywna eliminacja m łodych, np. 
oparta na masie cia ła, jest nieodpowiednia. Po dokonaniu standaryzacji 
miotów (eliminacji) i przed dalszymi badaniami funkcjonalnych punktów końcowych nale ży zidentyfikowa ć w sposób niepowtarzalny poszczególne 
młode, które wybrano do bada ń przedodsadzeniowych lub poodsadzenio ­
wych, za pomoc ą dowolnej odpowiedniej humanitarnej metody przezna ­
czonej do identyfikacji m łodych (np. 24).
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Wyznaczanie zwierz ąt do obserwacji funkcjonalnych i behawioralnych, 
ocen mas mózgów i ocen neuropatologicznych  
13. W opisywanej metodzie badawczej dopuszcza si ę różne podej ścia 
w odniesieniu do wyznaczania zwierz ąt, które s ą poddawane dzia łaniu in 
utero  i w okresie laktacji, do obserwacji funkcjonalnych i behawioralnych, 
oceny dojrza łości płciowej, pomiaru masy mózgu i oceny neuropatolo ­
gicznej (25). Indywidualnie w odniesieniu do ka żdego przypadku mo żna 
dodać inne badania funkcji neurobehawioralnej (np. zachowa ń społecznych), 
zmian neurochemicznych lub neuropatologicznych, dopóki nie b ędzie to 
zagrażać integralno ści pierwotnie wymaganych bada ń. 
14. Młode dobiera si ę z każdej grupy dawkowania i przydziela pod k ątem ocen 
punktów ko ńcowych w dniu 4. po urodzeniu lub pó źniej. Dobór m łodych 
należy przeprowadzi ć w taki sposób, aby, na ile to mo żliwe, obie p łcie 
z każdego miotu w ka żdej grupie dawkowania by ły reprezentowane we 
wszystkich badaniach w jednakowym stopniu. W celu zbadania aktywno ści 
ruchowej nale ży przeprowadzi ć badanie na tej samej parze m łodych, samca 
i samicy, na wszystkich etapach wiekowych przed odsadzeniem (zob. pkt 
35). Do celów wszystkich innych bada ń można przydzieli ć te same lub inne 
pary samców i samic do ró żnych bada ń behawioralnych. Mo że być wyma­
gane przydzielenie ró żnych młodych do bada ń funkcji poznawczych 
w okresie po odsadzeniu lub w okresie dojrza łości, aby nie dopu ścić do 
pomylenia z wp ływem wieku i wcze śniejszych szkole ń na te pomiary 
(26)(27). Przy odsadzaniu (dzie ń 21. po urodzeniu) mo żna humanitarnie 
uśmiercić młode, których nie wybrano do bada ń. Należy odnotowa ć 
wszelkie zmiany w przydzia łach młodych. Statystyczn ą jednostk ą miary 
powinien by ć miot (lub matka), a nie m łode. 
15. Istniej ą różne sposoby przydzielania m łodych do bada ń przedodsadzenio ­
wych i poodsadzeniowych, bada ń funkcji poznawczych, bada ń patologicz ­
nych itp. (zob. rys. 1 w odniesieniu do ogólnego schematu i dodatek 1 
w odniesieniu do przyk ładów przydzielania). Zalecana minimalna liczba 
zwierząt w każdej grupie dawkowania w odniesieniu do bada ń przedodsa ­
dzeniowych i poodsadzeniowych jest nast ępująca: 
obserwacje kliniczne i masa cia ła wszystkie zwierz ęta 
szczegółowe obserwacje kliniczne 20/p łeć (1/płeć/miot) 
masa mózgu (po utrwalaniu) mi ędzy dniem 
11. a 22. po urodzeniu 10/płeć (1/miot) 
masa mózgu (nieutrwalona) w dniu 70. po 
urodzeniu 10/płeć (1/miot) 
neuropatologia (zanurzenie lub utrwalenie 
perfuzyjne) mi ędzy dniem 11. a 22. po 
urodzeniu 10/płeć (1/miot) 
neuropatologia (utrwalenie perfuzyjne) 
w dniu 70. po urodzeniu 10/płeć (1/miot) 
dojrzałość płciowa 20/p łeć (1/płeć/miot) 
inne charakterystyczne punkty rozwojowe 
(opcjonalne) wszystkie zwierz ęta 
rozwój zachowa ń 20/p łeć (1/płeć/miot) 
aktywność ruchowa 20/p łeć (1/płeć/miot) 
funkcje motoryczno-sensoryczne 20/p łeć (1/płeć/miot) 
uczenie si ę i pamięć 10/p łeć ( a ) (1/miot)  
( a ) W zale żności od czu łości badań funkcji poznawczych nale ży rozważyć przepro­
wadzenie badania na du żo większej liczbie zwierz ąt, np. do 1 samca i 1 samicy na 
miot (w odniesieniu do przydzielania zwierz ąt zob. dodatek 1) (dalsze wytyczne 
dotyczące liczebno ści próby obj ęto dokumentem zawieraj ącym wytyczne OECD 
nr 43 (8)).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dawkowanie  
16. Nale ży zastosowa ć co najmniej trzy poziomy dawek i wprowadzi ć równo­
czesną grupę kontroln ą. Dawki powinny by ć zróżnicowane w celu osi ąg­
nięcia stopniowania efektów toksycznych. Je żeli charakter fizykochemiczny 
lub właściwości biologiczne substancji chemicznej nie powoduj ą ograni­
czenia dawki, najwy ższą dawkę należy dobrać w taki sposób, aby wywo łać 
pewną toksyczno ść matczyn ą (np. objawy kliniczne, obni żony przyrost 
masy cia ła (nie wi ęcej niż 10 %) lub oznaki toksyczno ści ograniczaj ącej 
wielkość dawki w organie docelowym). Z pewnymi wyj ątkami du żą 
dawkę można ograniczy ć do 1 000 mg/kg masy cia ła/dzień. Na przyk ład 
przewidywane nara żenie ludzi mo że wskaza ć na potrzeb ę zastosowania 
większej dawki. Ewentualnie nale ży przeprowadzi ć badania pilota żowe lub 
badania wst ępne mające na celu ustalenie zakresu, aby okre ślić największe 
dawkowanie, które mo żna zastosowa ć, a które wywo ła minimalny stopie ń 
toksyczno ści matczynej. Je żeli badana substancja chemiczna wykaza ła 
toksyczno ść rozwojow ą w standardowym badaniu toksyczno ści rozwojowej 
lub w badaniu pilota żowym, najwi ększa dawka powinna stanowi ć maksy­
malną dawkę niewywo łującą nadmiernej toksyczno ści u potomstwa ani 
zgonu  in utero  lub neonatalnego lub wad rozwojowych, co wystarcza, 
aby uniemo żliwić znaczącą ocenę neurotoksyczno ści. Najmniejsza dawka 
nie powinna wywo ływać żadnych oznak toksyczno ści matczynej ani 
rozwojowej, w tym neurotoksyczno ści. Należy dobrać malejącą sekwencj ę 
dawek w celu wykazania wszystkich zale żności dawka-odpowied ź 
i poziomów dawkowania, przy których nie obserwuje si ę szkodliwych 
zmian (NOAEL), lub dawki bliskie granicy wykrywalno ści, które pozwol ą 
określić dawkę wyznaczaj ącą. W odniesieniu do ustalenia malej ących dawek 
często jest optymalne wprowadzenie podwójnych do poczwórnych odst ę­
pów, a dodanie czwartej grupy dawkowania jest na ogó ł lepsze ni ż stoso­
wanie bardzo du żych odstępów (np. wspó łczynnik wi ększy od 10) mi ędzy 
dawkowaniami.  
17. Dawki nale ży dobiera ć, uwzględniając wszystkie istniej ące dane dotycz ące 
toksyczno ści oraz dodatkowe informacje na temat metabolizmu 
i toksykokinetyki badanej substancji chemicznej lub powi ązanych materia ­ 
łów. Informacje te mog ą również pomóc w wykazaniu stosowno ści sche­
matu dawkowania. Nale ży rozwa żyć bezpośrednie podawanie dawki 
młodym na podstawie informacji dotycz ących nara żenia i farmakokinetyki 
(28)(29). Przed przeprowadzeniem bada ń polegających na bezpo średnim 
dawkowaniu nale ży uważnie rozwa żyć ich zalety i ich wady (30).  
18. Równoleg ła grupa kontrolna powinna stanowi ć grupę kontroln ą poddaną 
terapii pozorowanej lubgrup ę kontroln ą nośnika, jeżeli przy podawaniu 
badanej substancji chemicznej stosowany jest no śnik. Wszystkim zwie ­
rzętom nale ży zwykle podawa ć taką samą ilość badanej substancji 
chemicznej lub no śnika obliczan ą na podstawie masy cia ła. Jeżeli w celu 
ułatwienia dawkowania u żywa się nośnika lub innego dodatku, nale ży 
uwzględnić następujące cechy charakterystyczne: wp ływ na wch łanianie, 
dystrybucj ę, metabolizm lub zatrzymywanie badanej substancji chemicznej; 
wpływ na w łaściwości chemiczne badanej substancji chemicznej, które 
mogą zmienić jej charakterystyk ę toksyczn ą; oraz wp ływ na przyjmowanie 
pokarmu lub wody, lub stan od żywienia zwierz ąt. Nośnik nie powinien 
wywoływać skutków, które mog łyby przeszkodzi ć w interpretacji wyników 
badania, ani nie powinien by ć toksyczny neurobehawioralnie, ani wp ływać 
na reprodukcj ę lub rozwój. W przypadku nowatorskich no śników oprócz 
grupy kontrolnej no śnika nale ży włączyć grupę kontroln ą poddaną terapii 
pozorowanej. Zwierz ęta w grupie kontrolnej (grupach kontrolnych) powinny 
być traktowane w dok ładnie taki sam sposób jak zwierz ęta w grupach 
badanych.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Podawanie dawek  
19. Badan ą substancj ę chemiczn ą lub nośnik należy podawa ć najbardziej odpo ­
wiednią drogą w odniesieniu do potencjalnego nara żenia u cz łowieka i na 
podstawie dost ępnych informacji dotycz ących metabolizmu i dystrybucji 
u badanych zwierz ąt. Drogą podawania b ędzie z regu ły droga pokarmowa 
(np. przez sond ę, z paszą, z wodą pitną), ale można wykorzysta ć inne drogi 
(np. naskórn ą lub wziewn ą) w zale żności od cech charakterystycznych 
i przewidywanych lub znanych dróg nara żenia u cz łowieka (dalsze 
wytyczne mo żna znaleźć w dokumencie zawieraj ącym wytyczne OECD 
nr 43 (8)). Nale ży uzasadni ć wybór drogi podawania. Badan ą substancj ę 
chemiczn ą należy podawa ć każdego dnia mniej wi ęcej o tej samej porze.  
20. Dawka podawana ka żdemu zwierz ęciu powinna zwykle zale żeć od bieżącej 
masy cia ła danego osobnika. Nale ży jednak zachowa ć ostrożność przy 
dostosowywaniu dawek w ostatnim trymestrze ci ąży. Jeżeli odnotuje si ę 
nadmiern ą toksyczno ść u matek obj ętych podawaniem, nale ży uśmiercić je 
w sposób humanitarny.  
21. Badan ą substancj ę chemiczn ą lub no śnik nale ży podawa ć pokrytym 
samicom co najmniej raz dziennie od momentu zagnie żdżenia (6. dzie ń 
ciąży) przez ca ły okres laktacji (dzie ń 21. po urodzeniu), w zwi ązku 
z czym m łode są poddawane nara żeniu na badan ą substancj ę chemiczn ą 
w okresie neurologicznego rozwoju przedurodzeniowego i pourodzeniowego. Wiek, w którym rozpoczyna si ę dawkowanie, oraz 
okres trwania i cz ęstotliwość dawkowania mo żna skorygowa ć, jeżeli istniej ą 
dowody na to, że taki schemat do świadczalny jest bardziej odpowiedni 
w odniesieniu do nara żenia u ludzi. Nale ży skorygowa ć okresy trwania 
dawkowania w odniesieniu do innych gatunków, aby zapewni ć narażenie 
w czasie wszystkich wczesnych okresów rozwoju mózgu (tj. równowa żnych 
rozwojowi mózgu cz łowieka w okresie przed urodzeniem i wczesnym 
okresie po urodzeniu). Dawkowanie mo żna rozpocz ąć na pocz ątku ciąży 
(0. dzień ciąży), ale nale ży uwzględnić
 możliwość, że badana substancja 
chemiczna spowoduje utrat ę zarodka przed zagnie żdżeniem. Rozpocz ęcie 
podawania w 6. dniu ci ąży wyeliminowa łoby to ryzyko, ale nie pozwoli łoby 
to zbadać stadiów rozwojowych mi ędzy 0. a 6. dniem ci ąży. W przypadku 
gdy laboratorium nabywa zwierz ęta kryte w znanym czasie, rozpocz ęcie 
dawkowania w 0. dniu ci ąży jest niepraktyczne, zatem 6. dzie ń ciąży 
byłby dobrym punktem wyj ściowym. Laboratorium badawcze powinno 
określić schemat dawkowania zgodnie z odpowiednimi informacjami 
dotyczącymi skutków badanej substancji chemicznej, wcze śniejszymi 
doświadczeniami i kwestiami logistycznymi; mo że on obejmowa ć przedłu­ 
żenie dawkowania w okresie po odsadzeniu. Dawkowanie nie powinno mie ć 
miejsca w dniu porodu w przypadku tych zwierz ąt, u których poród by ł 
niekompletny. Ogólnie rzecz bior ąc, zakłada się, że młode zostan ą poddane 
narażeniu przez mleko matki, nale ży jednak rozwa żyć bezpośrednie poda ­
wanie dawki m łodym w tych przypadkach, w których nie ma dowodów 
stałego narażenia potomstwa. Dowody sta łego narażenia można uzyska ć 
np. z informacji farmakokinetycznych, toksyczno ści dla potomstwa lub 
zmian w biomarkerach (28).  
OBSERWACJE  
Obserwacje matek  
22. Co najmniej raz dziennie nale ży przeprowadzi ć skrupulatn ą obserwacj ę 
wszystkich matek pod k ątem warunków dotycz ących ich zdrowia, w tym 
zachorowalno ści i śmiertelno ści. 
23. W czasie do świadczenia i obserwacji nale ży okresowo prowadzi ć bardziej 
szczegółowe obserwacje kliniczne (przynajmniej dwa razy w okresie dawko ­
wania w czasie ci ąży i dwa razy w okresie dawkowania w czasie laktacji), 
wykorzystuj ąc co najmniej dziesi ęć matek na ka żdą dawkę. Obserwacje 
zwierząt na zewn ątrz klatki macierzystej powinni przeprowadzi ć wyszkoleni 
technicy, którzy nie wiedz ą o podawaniu zwierz ętom substancji chemicz ­
nych, stosuj ąc standardowe procedury w celu ograniczenia do minimum 
stresu u zwierz ąt i stronniczo ści obserwatora oraz uzyskania maksymalnej 
wiarygodno ści kilku obserwatorów. Zaleca si ę, aby obserwacje w danym 
badaniu przeprowadza ł ten sam technik, je żeli istnieje taka mo żliwość. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Nale ży odnotowa ć wyst ępowanie obserwowanych objawów. 
W przypadkach, w których jest to mo żliwe, nale ży równie ż odnotowa ć 
skalę obserwowanych objawów. Obserwacje kliniczne powinny obejmowa ć 
między innymi zmiany w skórze, sier ści, oczach, b łonach śluzowych, 
wystąpienie wydzielin oraz aktywno ść autonomicznej cz ęści układu nerwo ­
wego(np. łzawienie, piloreksja, rozmiar źrenicy, zmieniony rytm oddychania 
lub oddychanie przez jam ę ustną i wszelkie nietypowe objawy zwi ązane 
z oddawaniem moczu lub wypró żnianiem).  
25. Nale ży również odnotowywa ć wszelkie nietypowe reakcje dotycz ące pozycji 
ciała, poziomu aktywno ści (np. obni żenie lub podwy ższenie poziomu 
eksploracji standardowej powierzchni) i koordynacji ruchowej. Nale ży 
także odnotowa ć zmiany w sposobie chodzenia (np. chód kaczkowaty, atak ­
sja), postawie (np. przygarbiony grzbiet) i reaktywno ści na kontakt, przeno ­
szenie i inne bod źce ze środowiska, jak równie ż obecność ruchów klonicz ­
nych lub tonicznych, konwulsji, dr żenia, stereotypii (np. nadmiernego czysz ­
czenia si ę, nietypowych ruchów g łową, powtarzanego kr ęcenia się), lub 
dziwnych zachowa ń (np. gryzienia lub nadmiernego wylizywania, samooka ­
leczania, chodzenia do ty łu, wydawania d źwięków) lub agresji.  
26. Nale ży odnotowa ć wszystkie oznaki toksyczno ści, w tym dzie ń ich 
wystąpienia, por ę dnia, stopie ń i okres trwania.  
27. W okresie dawkowania nale ży ważyć zwierzęta przynajmniej raz na tydzie ń 
przez cały okres trwania badania, w dniu porodu lub tu ż przed lub po nim 
i w dniu 21. po urodzeniu (odsadzenie). W przypadku bada ń 
z wykorzystaniem sondy nale ży ważyć matki przynajmniej dwa razy 
w tygodniu. Dawki powinny by ć korygowane w momencie okre ślania 
masy ciała każdego osobnika, stosownie do przypadku. Nale ży co tydzie ń 
mierzyć ilość przyjmowanego pokarmu, co najmniej w okresach ci ąży 
i laktacji. Ilo ść wypitej wody powinna by ć mierzona co najmniej raz 
w tygodniu, je żeli zwierz ę jest poddane nara żeniu za po średnictwem 
wody pitnej.  
Obserwacje potomstwa  
28. Co najmniej raz dziennie nale ży przeprowadzi ć skrupulatn ą obserwacj ę 
całego potomstwa pod k ątem oznak toksyczno ści i zachorowalno ści oraz 
śmiertelno ści. 
29. W okresach podawania substancji i obserwacji nale ży prowadzi ć bardziej 
szczegółowe obserwacje kliniczne potomstwa. Obserwacje potomstwa (przy ­
najmniej jednego m łodego/płeć/miot) powinni prowadzi ć wyszkoleni tech ­
nicy, którzy nie wiedz ą o podawaniu zwierz ętom substancji, stosuj ąc stan­
dardowe procedury w celu ograniczenia do minimum stronniczo ści oraz 
uzyskania maksymalnej wiarygodno ści kilku obserwatorów. Zaleca si ę, 
aby obserwacje przeprowadza ł ten sam technik, je żeli istnieje taka mo żli­
wość. Należy monitorowa ć co najmniej punkty ko ńcowe opisane w pkt 24 
i 25 stosownie do obserwowanego stadium rozwojowego.  
30. Nale ży odnotowa ć wszystkie oznaki toksyczno ści u potomstwa, w tym 
dzień ich pojawienia si ę, porę dnia, stopie ń i okres trwania.  
Fizyczne i rozwojowe punkty charakterystyczne  
31. Zmiany w charakterystycznych punktach rozwojowych w okresie przed 
odsadzeniem (np. rozwijanie si ę małżowiny ucha, otwieranie oczu, wyrzy ­
nanie się siekaczy) s ą ściśle związane z mas ą ciała (30)(31). Masa cia ła 
może być najlepszym wska źnikiem rozwoju fizycznego. W zwi ązku z tym 
zaleca się dokonywanie pomiarów charakterystycznych punktów rozwojo ­
wych jedynie wówczas, gdy wcze śniej pojawi ły się oznaki wskazuj ące, że te 
punkty ko ńcowe będą stanowić źródło dodatkowych informacji. Cz ęstotli­
wość przeprowadzania oceny tych parametrów przedstawiono w tabeli 1. 
W zależności od przewidywanych skutków i wyników pomiarów wst ępnych 
może być zalecane wprowadzenie dodatkowych punktów czasowych lub 
wykonanie pomiarów na innych stadiach rozwojowych.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 793
 
32. Do oceny rozwoju fizycznego zaleca si ę wykorzystywanie zwierz ąt 
w okresie po kopulacji, a nie w okresie po urodzeniu (33). Je żeli przepro ­
wadza się badanie na m łodych w dniu odsadzenia, zaleca si ę, aby badanie to 
zostało przeprowadzone przed faktycznym odsadzeniem w celu unikni ęcia 
efektu dezorientacji zwierz ąt spowodowanego stresem towarzysz ącym odsa ­
dzeniu. Ponadto wszelkie badania na m łodych w okresie po odsadzeniu nie 
powinny by ć prowadzone przez pierwsze dwa dni po odsadzeniu.  
Tabela 1  
Częstotliwość przeprowadzania oceny charakterystycznych punktów fizycznych 
i rozwojowych oraz funkcjonalnych/behawioralnych punktów ko ńcowych  ( a ) 
Okres rozwoju 
Punkty ko ńcowe Przed odsadzeniem (  b ) Dojrzewanie (  b ) Wczesna doros łość ( b ) 
Charakterystyczne punkty fizyczne i rozwojowe  
Masa cia ła 
i obserwacje kliniczne co tydzie ń ( c ) co najmniej raz na 
dwa tygodnie co najmniej raz na 
dwa tygodnie 
Masa mózgu dzie ń 22. po urodzeniu (  d ) na koniec badania 
Neuropatologia dzie ń 22. po urodzeniu (  d ) na koniec badania 
Dojrzewanie p łciowe — w stosownych przy ­
padkach — 
Inne charakterystyczne 
punkty rozwojowe (  e ) w stosownych przy ­
padkach — —  
Funkcjonalne/behawioralne punkty ko ńcowe  
Rozwój zachowa ń co najmniej dwa 
pomiary 
Aktywność ruchowa 
(w tym habituacja) 1–3 razy (  f ) — raz 
Funkcje motoryczno- 
sensoryczne — raz raz 
Uczenie si ę i pamięć — raz raz  
( a ) W powy ższej tabeli przedstawiono minimaln ą liczbę wykonywania pomiarów. W zale żności od prze ­
widywanych skutków i wyników pomiarów wst ępnych mo że być zalecane wprowadzenie dodatkowych 
punktów czasowych (np. stare zwierz ęta) lub wykonanie pomiarów na innych stadiach rozwojowych. 
( b ) Zaleca si ę, aby młode nie by ły poddawane badaniom przez pierwsze dwa dni po odsadzeniu (zob. pkt 
32). Zalecanym wiekiem do przeprowadzania bada ń na zwierz ętach w okresie dojrzewania jest: 
w odniesieniu do uczenia si ę i pamięci = dzie ń 25. ± 2 po urodzeniu; w odniesieniu do funkcji 
motoryczno-sensorycznych = dzie ń 25. ± 2 po urodzeniu. Zalecanym wiekiem do przeprowadzania 
badań na młodych doros łych jest dzie ń 60–70. po urodzeniu. 
( c ) W przypadku m łodych obj ętych bezpo średnim dawkowaniem nale ży co najmniej dwa razy w tygodniu 
dokonywa ć pomiarów mas cia ła w celu korygowania dawek w czasie gwa łtownego przyrostu masy 
ciała. 
( d ) W stosownych przypadkach masy mózgu i neuropatologi ę można ocenić trochę wcześniej (np. w dniu 
11 po urodzeniu) (zob. pkt 39). 
( e ) Oprócz masy cia ła należy zarejestrowa ć, w stosownych przypadkach, inne charakterystyczne punkty 
rozwojowe (np. otwieranie oczu) (zob. pkt 31). 
( f ) Zob. pkt 35.  
33. Nale ży policzy ć żywe młode i okre ślić ich płeć, np. dokonuj ąc kontroli 
wizualnej lub pomiaru odleg łości anogenitalnej (34)(35), a ka żde młode 
z miotu powinno by ć indywidualnie wa żone przy porodzie lub wkrótce 
po nim, co najmniej raz w tygodniu w okresie laktacji i co najmniej raz na dwa tygodnie po nim. Podczas dokonywania oceny dojrza łości płciowej 
należy określić wiek i mas ę ciała zwierzęcia w momencie otwarcia pochwy 
(36) lub oddzielenia napletka (37) co najmniej w odniesieniu do jednego 
samca i jednej samicy na miot.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 794
 
Rozwój zachowa ń 
34. Nale ży dokonywa ć pomiarów rozwoju wybranych zachowa ń u co najmniej 
jednego m łodego/płeć/miot w odpowiednim okresie wiekowym, przy czym 
to samo m łode jest wykorzystywane przez wszystkie dni badania do oceny 
wszystkich zachowa ń. Należy zachowa ć jednakowy odst ęp dni pomiarów 
w tym okresie, aby okre ślić normalne lub zwi ązane z do świadczeniem 
zmiany w rozwoju danego zachowania (38). Niektóre przyk łady zachowa ń, 
w odniesieniu do których mo żna ocenić ich rozwój, s ą następujące: odruch 
przyjmowania wyprostowanej postawy, ujemna geotaksja i aktywno ść 
ruchowa (38)(39)(40).  
Aktywno ść ruchowa  
35. Nale ży monitorowa ć aktywno ść ruchową (41)(42)(43)(44)(45) w okresie 
przed odsadzeniem i w wieku doros łym. W odniesieniu do bada ń 
w czasie odsadzania zob. pkt 32. Sesja badawcza powinna by ć na tyle 
długa, aby wykaza ć w jej trakcie habituacj ę grup kontrolnych nieobj ętych 
narażeniem. Wyra źnie zaleca si ę wykorzystanie aktywno ści ruchowej do 
oceny rozwoju zachowa ń. Jeżeli wykorzystuje si ę ją do badania rozwoju 
zachowań, we wszystkich sesjach badawczych prowadzonych przed odsa ­
dzeniem powinno si ę poddawa ć ocenie te same zwierz ęta. Badanie powinno 
odbywać się wystarczaj ąco często, aby oceni ć rozwój habituacji w trakcie 
danej sesji (44). W tym celu mog ą być wymagane trzy lub wi ęcej okresów 
czasu, obejmuj ące okres przed odsadzeniem i dzie ń odsadzenia (np. dni 13., 
17., 21. po urodzeniu). Badanie tych samych zwierz ąt lub zwierz ąt 
z jednego miotu powinno tak że mieć miejsce w odniesieniu do zwierz ąt 
dorosłych tuż przed zako ńczeniem badania (np. dzie ń 60–70. po urodzeniu). 
W razie potrzeby mo żna przeznaczy ć dodatkowe dni na badanie. Nale ży 
monitorowa ć aktywno ść ruchową za pomoc ą zautomatyzowanego sprz ętu 
do rejestrowania aktywno ści, który powinien by ć w stanie wykry ć zarówno 
wzrost, jak i obni żenie aktywno ści (tj. podstawowy poziom aktywno ści 
mierzony przez urz ądzenie nie powinien by ć tak niski, aby uniemo żliwić 
wykrycie obni żenia aktywno ści, ani tak wysoki, aby uniemo żliwić wykrycie 
jej wzrostu). Ka żde urządzenie powinno zosta ć przetestowane w ramach 
standardowych procedur, aby zapewni ć na ile to tylko mo żliwe niezawod ­
ność działania poszczególnych urz ądzeń w poszczególnych dniach. Na ile to 
możliwe eksperymentalne grupy powinny zosta ć przydzielone równomiernie 
do poszczególnych urz ądzeń. Każde zwierz ę należy badać indywidualnie. 
Należy równomiernie dostosowa ć grupy eksperymentalne do pór dnia bada ­
nia, aby unikn ąć zakłócenia wywo łanego dobowym rytmem aktywno ści 
biologicznej. Nale ży dołożyć starań, aby rozbie żności w warunkach badania 
były minimalne i niepowi ązane systematycznie z podawaniem. Do zmien ­
nych, które mog ą wpłynąć na wiele sk ładowych pomiaru zachowania, 
w tym aktywno ść ruchową, należą poziom d źwięku, rozmiar i kszta łt klatki 
do badań, temperatura, wilgotno ść względna, warunki świetlne, zapachy, 
stosowanie klatki macierzystej lub nowatorskiej klatki do bada ń 
i zakłócenia środowiskowe.  
Funkcje motoryczno-sensoryczne  
36. Nale ży szczegó łowo zbada ć funkcje motoryczno-sensoryczne co najmniej 
raz w okresie dojrzewania i raz na wczesnym etapie doros łości (np. dzie ń 
60–70. po urodzeniu). W odniesieniu do bada ń w czasie odsadzania zob. pkt 
32. Należy przeprowadzi ć ilość testów wystarczaj ącą do zapewnienia odpo ­
wiedniego ilo ściowego próbkowania modalno ści sensorycznych (np. soma ­
tosensorycznych, równowagi) i funkcji motorycznych (np. si ła, koordyna ­
cja). Niektóre przyk łady bada ń dotyczących funkcji motoryczno-sensorycz ­
nych obejmuj ą odruch prostowania si ę (46), odruch przyjmowania prawid ­ 
łowej pozycji (47)(48), habituacj ę do nagłych dźwięków (40)(49)(50)(51) 
(52)(53)(54) oraz potencja ły wywołane (55).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 795
 
Badania dotycz ące uczenia si ę i pamięci 
37. Po odsadzeniu (np. w dniu 25. ± 2 po urodzeniu) i w odniesieniu do 
młodych doros łych (dzie ń 60. po urodzeniu i starsze) nale ży przeprowadzi ć 
badanie asocjacyjnego uczenia si ę i pamięci. W odniesieniu do bada ń 
w czasie odsadzania zob. pkt 32. Na tych dwóch etapach rozwojowych można zastosowa ć to samo badanie lub ró żne badania. Dopuszcza si ę 
pewną elastyczno ść w wyborze badania (bada ń) w odniesieniu do uczenia 
się i pamięci u szczurów odsadzanych i doros łych. Badania musz ą być 
jednak skonstruowane w taki sposób, aby spe łniały dwa kryteria. Po pierw ­
sze, należy oceniać uczenie si ę jako zmian ę w szeregu powtarzanych prób 
lub sesji uczenia si ę lub, w badaniach sk ładających się z pojedynczej próby, 
w odniesieniu do warunku kontroluj ącego nieasocjacyjne skutki przyzwy ­
czajenia. Po drugie, oprócz podstawowego uczenia si ę (przyswajania) 
badania powinny obejmowa ć niektóre pomiary pami ęci (krótkotrwa łej lub 
długotrwałej), ale nie mo żna odnotowa ć tego pomiaru pami ęci, jeżeli brak 
jest pomiaru przyswajania uzyskanego w tym samym badaniu. Je żeli 
badania uczenia si ę i pamięci wykażą wpływ badanej substancji chemicznej, 
można rozwa żyć przeprowadzenie dodatkowych bada ń w celu wykluczenia 
alternatywnych interpretacji na podstawie zmian w zdolno ściach sensorycz ­
nych, motywacyjnych lub motorycznych. Poza powy ższymi dwoma kryte ­
riami zaleca si ę, aby wybór badania dotycz ącego uczenia si ę i pamięci był 
oparty na wykazanej w badaniu czu łości na klas ę badanej substancji 
chemicznej, je żeli informacj ę dotyczącą tej wra żliwości można znaleźć 
w literaturze. W przypadku braku takiej informacji przyk łady bada ń, które 
mogłyby zosta ć przeprowadzone, aby spe łnić powyższe kryteria, obejmuj ą: 
unikanie bierne (43)(56)(57), opó źnienie w orientacji przestrzennej 
w przypadku doros łych szczurów (58) i szczurów tu ż po urodzeniu (59), 
warunkowanie w ęchowe (43)(60), labirynt wodny Morrisa (61)(62)(63), 
labirynt Biela lub labirynt typu Cincinnati (64)(65), koncentrycznie ramienny labirynt (66), labirynt typu T (43) oraz nabycie i utrzymanie 
zachowań kontrolowanych zgodnie z planem (26)(67)(68). Dodatkowe 
badania opisano w literaturze dotycz ącej szczurów odsadzonych (26)(27) 
i dorosłych szczurów (19)(20).
 
Sekcja zw łok 
38. Po odsadzeniu potomstwa matki mo żna podda ć eutanazji.  
39. Ocena neuropatologiczna potomstwa zostanie przeprowadzona przy u życiu 
tkanek zwierz ąt uśmierconych w sposób humanitarny w dniu 22. po 
urodzeniu lub we wcze śniejszym punkcie czasowym mi ędzy dniem 11. 
a 22. po urodzeniu oraz na koniec badania. W przypadku potomstwa uśmierconego w dniu 22. po urodzeniu nale ży ocenić tkanki mózgu, a w 
przypadku zwierz ąt uśmierconych na koniec badania nale ży ocenić zarówno 
tkanki ośrodkowego uk ładu nerwowego, jak i tkanki obwodowego uk ładu 
nerwowego. Zwierz ęta uśmiercone w dniu 22. po urodzeniu lub wcze śniej 
mogą zostać utrwalone za pomoc ą zanurzenia lub perfuzji. Zwierz ęta 
uśmiercone na koniec badania nale ży utrwali ć za pomoc ą perfuzji. Na 
wszystkich etapach preparowania próbek tkanek, pocz ąwszy od procesu 
perfuzji zwierz ąt przez wycinanie próbek tkanki, przetwarzanie tkanki 
i barwienie preparatów, nale ży stosowa ć zrównowa żony schemat, tak aby 
każda seria zawiera ła reprezentatywne próbki z ka żdej grupy dawkowania. 
Dodatkowe wytyczne dotycz ące neuropatologii mo żna znale źć 
w dokumencie zawieraj ącym wytyczne OECD nr 20 (9), zob. równie ż 
(103).
 
Przetwarzanie próbek tkanki  
40. Θα πρέπει  να σημειώνονται  όλες οι μακροσκοπικές  ανωμαλίες  που είναι  
εμφανείς  κατά  τη νεκροψία . Τα λαμβανόμενα  δείγματα  ιστών  θα πρέπει  να 
αντιπροσωπεύουν  όλες τις σημαντικές  περιοχές  του νευρικού  συστήματος , 
να διατηρούνται  σε κατάλληλο  μέσο  μονιμοποίησης  και να υποβάλλονται  
σε επεξεργασία  σύμφωνα  με τυποποιημένα  δημοσιευμένα  ιστολογικά  
πρωτόκολλα  (69)(70)(71) (103). Ο εγκλεισμός  σε παραφίνη  είναι  αποδεκτός  
για τους ιστούς  του ΚΝΣ  και του ΠΝΣ , αλλά  ενδέχεται  να είναι  σκόπιμη  η ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 796
 
χρήση  οσμίου  μετά  τη μονιμοποίηση , σε συνδυασμό  με εγκλεισμό  σε εποξ­  
ειδική  ρητίνη , όταν  απαιτείται  υψηλότερος  βαθμός  ανάλυσης  (π.χ. για 
περιφερειακά  νεύρα , όταν  υπάρχουν  υπόνοιες  περιφερειακής  νευροπάθειας  
και/ή για τη μορφομετρική  ανάλυση  περιφερειακών  νεύρων . Οι εγκεφαλικοί  
ιστοί  που συλλέγονται  για μορφομετρική  ανάλυση  θα πρέπει  να εγκλείονται  
σε κατάλληλα  μέσα  σε όλα τα επίπεδα  δόσης  ταυτόχρονα , ώστε  να αποφ­  
εύγονται  τεχνικά  σφάλματα  λόγω  συρρίκνωσης  που μπορεί  να συνδέονται  
με παρατεταμένη  φύλαξη  σε μέσο  μονιμοποίησης  (6). 
Badanie neuropatologiczne  
41. Cele obserwacji jako ściowej są następujące: 
(i) identyfikacja obszarów w uk ładzie nerwowym wykazuj ących dowody 
zmian neuropatologicznych;  
(ii) identyfikacja rodzajów zmian neuropatologicznych wynikaj ących 
z narażenia na dzia łanie badanej substancji chemicznej; oraz  
(iii) okre ślenie zakresu dotkliwo ści zmian neuropatologicznych.  
Odpowiednio wyszkolony patolog powinien zbada ć mikroskopowo repre ­
zentatywne wycinki histologiczne próbek tkanek pod k ątem wyst ąpienia 
zmian neuropatologicznych. Wszystkim zmianom neuropatologicznym należy przypisa ć subiektywny stopie ń wskazuj ący dotkliwo ść. Barwniki 
hemotaksylina i eozyna mog ą być wystarczaj ące do przeprowadzenia 
oceny wycinków mózgu zwierz ąt uśmierconych w sposób humanitarny 
w dniu 22. po urodzeniu lub wcze śniej. W odniesieniu do wycinków tkanek 
ośrodkowego uk ładu nerwowego i obwodowego uk ładu nerwowego 
pochodzących od zwierz ąt uśmierconych na koniec badania zaleca si ę 
jednak barwnik mieliny (np. luxol fast blue/fiolet krezylowy) i barwnik 
srebrny (do barwienia metod ą Bielschowsky'ego lub Bodiana (srebrzenie)). 
Z zastrzeżeniem profesjonalnego os ądu patologa i rodzaju zaobserwowanych 
zmian mo żna uznać adekwatno ść innych barwników do identyfikowania 
i scharakteryzowania szczególnych rodzajów zmian (np. kwa śne białko 
włókienkowe (GFAP) lub histochemia lektyn do oceny zmian komórek 
glejowych lub mikroglejowych (72), fluorochrom Fluor-Jade do wykrywania martwicy (73)(74), lub barwniki srebrne, w szczególno ści w odniesieniu do 
chorób neurodegeneracyjnych (75)).
 
42. Nale ży przeprowadzi ć ocenę morfometryczn ą (ilościową), poniewa ż uzys­
kane z niej dane mog ą pomóc w wykrywaniu skutków zwi ązanych 
z podawaniem i s ą cenne w interpretowaniu zwi ązanych z podawaniem 
różnic w masie mózgu lub morfologii (76)(77). Nale ży pobrać próbki tkanki 
nerwowej i spreparowa ć je w celu umo żliwienia przeprowadzenia oceny 
morfometrycznej. Ocena morfometryczna mo że obejmowa ć np. pomiary 
liniowe lub powierzchniowe okre ślonych obszarów mózgu (78). Pomiary 
liniowe lub powierzchniowe wymagaj ą zastosowania homologicznych 
wycinków, które starannie wybrano na podstawie wiarygodnych, mikrosko ­
powych punktów charakterystycznych (6). Mo żna zastosowa ć stereologi ę 
w celu zidentyfikowania zwi ązanego z podawaniem wp ływu na parametry 
takie jak obj ętość lub liczba komórek w odniesieniu do okre ślonych 
obszarów neuroanatomicznych (79)(80)(81)(82)(83)(84).  
43. Nale ży zbadać mózgi pod k ątem wszelkich dowodów zmian neuropatolo ­
gicznych zwi ązanych z podawaniem i pobra ć odpowiednie próbki ze 
wszystkich g łównych obszarów mózgu (np. opuszków w ęchowych, kory 
mózgu, hipokampu, j ądra podstawnego, wzgórza, podwzgórza, śródmóz­
gowia (pokrywy śródmózgowia, nakrywki śródmózgowia i konarów 
mózgu), mostu, rdzenia przed łużonego, mó żdżka), aby zapewni ć dokładność 
badania. Wa żne jest, aby wycinki od wszystkich zwierz ąt zostały pobrane 
w tej samej p łaszczyźnie. W odniesieniu do zwierz ąt dorosłych uśmierco­
nych w sposób humanitarny na koniec badania nale ży pobrać próbki repre ­
zentatywnych wycinków rdzenia kr ęgowego i obwodowego uk ładu nerwo ­
wego. Obszary badane powinny obejmowa ć oko z nerwem wzrokowym 
i siatkówk ą, rdzeń kręgowy na poziomie opuchni ętych kręgów szyjnych 
i lędźwiowych, w łókno korzeni grzbietowych i brzusznych, proksymalny 
odcinek nerwu kulszowego, proksymalny odcinek nerwu piszczelowego (przy kolanie) i ga łęzie mięś
niowe nerwu piszczelowego. Skrawki rdzenia 
kręgowego i nerwów obwodowych powinny obejmowa ć przekroje 
poprzeczne i pod łużne. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 797
 
44. Oprócz zmian komórkowych (np. wakuolizacji neuronów, degeneracji, mart ­
wicy) i zmian tkanek (np. glejozy, nacieku leukocytów, torbieli) ocena 
neuropatologiczna powinna obejmowa ć badanie pod k ątem wska źników 
zaburzeń rozwojowych w uk ładzie nerwowym (6)(85)(86)(87)(88)(89). 
W tym wzgl ędzie wa żne jest odró żnienie skutków zwi ązanych 
z podawaniem od zwyk łych zjawisk zwi ązanych z rozwojem, o których 
wiadomo, że wystąpią w stadium rozwojowym odpowiadaj ącym czasowi 
uśmiercenia (90). Przyk łady znacznych zmian, które wskazuj ą na nieprawid ­ 
łowy rozwój, obejmuj ą między innymi:  
— zmiany wielko ści lub kszta łtu opuszek w ęchowych, mózgu lub 
móżdżka, 
— zmiany wzgl ędnej wielko ści różnych obszarów mózgu, w tym zmniej ­
szenia lub powi ększenia wielko ści obszarów wynikaj ące ze straty lub 
utrzymywania si ę zwykle przej ściowych populacji komórek b ądź rzutów 
neuronów (np. zewn ętrzne listki zarodkowe mó żdżka, ciało modzelowa ­
te), 
— zmiany w proliferacji, migracji i ró żnicowaniu, na które wskazuj ą 
obszary nadmiernej apoptozy lub martwicy, skupiska lub rozproszone populacje ektopowych, zdezorientowanych lub zdeformowanych neuronów lub zmian we wzgl ędnej wielko ści różnych warstw struktur 
korowych,
 
— zmiany w strukturach mielinacji, w tym ogólna redukcja wielko ści lub 
zmienione barwienie struktur mielinowych,  
— oznaki wodog łowia, w szczególno ści powiększenie komór, zw ężenie 
wodociągu mózgu i coraz cie ńsze półkule mózgu.  
Analiza zale żności dawka-odpowied ź w zmianach neuropatologicznych  
45. Do celów przeprowadzenia neuropatologicznej analizy jako ściowej 
i ilościowej zaleca si ę stosowanie nast ępujących procedur sekwencyjnych. 
Po pierwsze, wycinki z grupy otrzymuj ącej wysok ą dawkę porównuje si ę 
z wycinkami pozyskanymi z grupy kontrolnej. Je żeli u zwierz ęcia z grupy 
otrzymującej wysok ą dawkę nie wykryto żadnych zmian neuropatologicz ­
nych, dalsze analizy nie s ą wymagane. Je żeli w grupie otrzymuj ącej wysok ą 
dawkę występują zmiany neuropatologiczne, poddaje si ę badaniom zwie ­
rzęta z grupy otrzymuj ącej średnią dawkę i z grupy otrzymuj ącej niską 
dawkę. W przypadku gdy grupa otrzymuj ąca wysok ą dawkę zostaje wyeli ­
minowana ze wzgl ędu na śmierć lub inną zakłócającą toksyczno ść, należy 
zbadać grupy otrzymuj ące średnią i niską dawkę pod kątem zmian neuro ­
patologicznych. W przypadku wyst ąpienia jakiejkolwiek oznaki neuroto ­
ksyczności w grupach otrzymuj ących niższe dawki nale ży przeprowadzi ć 
w tych grupach badanie neuropatologiczne. Je żeli podczas badania jako ścio­
wego lub ilo ściowego wykryto jakiekolwiek zmiany neuropatologiczne 
związane z podawaniem, nale ży określić zależność tej zmiany od dawki 
oraz częstotliwość i stopień dotkliwo ści zmian patologicznych lub zmian 
morfometrycznych na podstawie oceny wszystkich zwierz ąt ze wszystkich 
grup dawkowania. Nale ży objąć tą oceną wszystkie obszary mózgu, 
w których wyst ępują jakiekolwiek oznaki zmian neuropatologicznych. 
W odniesieniu do ka żdego rodzaju zmiany patologicznej nale ży opisać 
cechy charakterystyczne stosowane przy okre ślaniu każdego stopnia dotkli ­
wości, wskazuj ąc na te cechy, które ró żnicują poszczególne stopnie. Nale ży 
odnotowa ć częstotliwość występowania ka żdego rodzaju zmiany i stopie ń 
jej dotkliwo ści oraz przeprowadzi ć analizę statystyczn ą w celu dokonania 
oceny charakteru zale żności dawka-odpowied ź. Zaleca si ę stosowanie zako ­
dowanych szkie łek laboratoryjnych (91).  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
46. Dane nale ży odnotowywa ć oddzielnie w formie zestawie ń tabelarycznych 
przedstawiaj ących w odniesieniu do ka żdej grupy badanej rodzaj zmiany 
i liczbę matek, liczb ę potomstwa w podziale na p łeć i liczbę miotów, 
u których wyst ąpił każdy rodzaj zmiany. Je żeli przeprowadzono 
bezpośrednie nara żenie potomstwa po urodzeniu, nale ży odnotowa ć drogę, 
czas trwania i okres nara żenia. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 798
 
Ocena i interpretacja wyników  
47. Badanie neurotoksyczno ści rozwojowej dostarczy informacji na temat 
wpływu powtarzanego nara żenia na substancj ę chemiczn ą podczas rozwoju  
in utero  i wczesnego rozwoju po urodzeniu. Poniewa ż szczególn ą uwagę 
przywiązuje się do punktów ko ńcowych toksyczno ści ogólnej 
i neurotoksyczno ści rozwojowej, wyniki badania pozwol ą na odró żnienie 
skutków neurorozwojowych wyst ępujących przy braku ogólnej toksyczno ści 
matczynej od wyst ępujących jedynie na poziomach, które s ą toksyczne 
również dla matki. Ze wzgl ędu na złożone wzajemne powi ązania między 
projektem badania, analiz ą statystyczn ą i biologicznym znaczeniem danych 
odpowiednia interpretacja danych dotycz ących neurotoksyczno ści 
rozwojowej b ędzie wymaga ła profesjonalnego os ądu (107)(109). Przy inter ­
pretowaniu wyników badania nale ży stosowa ć podejście wagi dowodów 
(20)(92)(93)(94). Nale ży omówi ć wzory wyników bada ń behawioralnych 
lub morfologicznych, je żeli wyst ępują, oraz dowody zale żności 
dawka-odpowied ź. W tej charakterystyce nale ży zawrze ć dane pochodz ące 
ze wszystkich bada ń powiązanych z ocen ą neurotoksyczno ści rozwojowej, 
w tym bada ń epidemiologicznych lub studiów przypadków u ludzi, i bada ń 
na zwierz ętach doświadczalnych (np. dane toksykokinetyczne, informacje 
dotyczące związku między struktur ą a działaniem, dane z innych bada ń 
toksyczno ści). Obejmuj ą one zwi ązek między dawkami badanej substancji 
chemicznej a obecno ścią lub brakiem, cz ęstotliwością występowania 
i zakresem ka żdego skutku neurotoksycznego w odniesieniu do ka żdej 
płci (20)(95).  
48. Ocena danych powinna obejmowa ć omówienie istotno ści biologicznej 
i statystycznej. Nale ży postrzega ć analizę statystyczn ą raczej jako narz ędzie, 
które nie determinuje interpretacji danych, a tylko wskazuje sposób. Brak 
istotności statystycznej nie powinien stanowi ć jedynego uzasadnienia dla 
stwierdzenia braku skutków zwi ązanych z podaniem, tak jak istotno ść staty­
styczna nie powinna stanowi ć jedynego uzasadnienia dla stwierdzenia 
skutków zwi ązanych z podaniem. Aby chroni ć przed ewentualnie fa łszywie 
ujemnymi wynikami i trudno ściami wi ążącymi si ę nieodłącznie 
z „przeprowadzaniem dowodu negatywnego”, nale ży omówi ć dostępne 
dane dotycz ące dodatniej i historycznej kontroli, zw łaszcza jeżeli nie wyst ę­
pują skutki zwi ązane z podaniem (102)(106). Nale ży omówić prawdopodo ­
bieństwo fałszywie dodatnich wyników w kontek ście całkowitej oceny 
statystycznej danych (96). Ocena powinna obejmowa ć związek, jeżeli taki 
występuje, mi ędzy obserwowanymi zmianami neuropatologicznymi 
i behawioralnymi.  
49. Nale ży przeanalizowa ć wszystkie wyniki, stosuj ąc modele statystyczne 
odpowiednie do schematu do świadczalnego (108). Nale ży uzasadni ć 
wybór analizy parametrycznej lub nieparametrycznej, uwzgl ędniając czyn­
niki takie jak charakter danych (przetworzone lub nieprzetworzone) i ich rozkład oraz wzgl ędną odporno ść wybranej analizy statystycznej. Wybór 
analizy statystycznej powinien by ć podyktowany celem i projektem badania, 
aby ograniczy ć do minimum b łędy typu I (fa łszywie dodatnie) i typu II 
(fałszywie ujemne) (96)(97)(104)(105). W badaniach rozwojowych, 
w których wykorzystuje si ę gatunki wielorodne i w których badaniom 
poddana jest wi ększa liczba m łodych z danego miotu, nale ży uwzględnić 
miot w modelu statystycznym, aby unikn ąć zbyt wielu b łędów typu 
I (98)(99)(100)(101). Statystyczn ą jednostk ą miary powinien by ć miot, 
a nie młode. Doświadczenia powinny by ć zaprojektowane w taki sposób, 
aby zwierz ęta z jednego miotu nie by ły traktowane jak oddzielne obiekty 
obserwacji. Nale ży kilkakrotnie przeprowadzi ć analizę każdego punktu 
końcowego mierzonego w tym samym podmiocie, stosuj ąc modele staty ­
styczne, które wyja śniają zale
żność tych pomiarów.  
Sprawozdanie z badania  
50. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna:  
— charakter fizyczny i, w stosownych przypadkach, w łaściwości 
fizykochemiczne,  
— dane identyfikacyjne, w tym źródło, ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— czysto ść preparatu i znane lub przewidywane zanieczyszczenia.  
Nośnik (w stosownych przypadkach):  
— uzasadnienie wyboru no śnika, jeżeli jest inny ni ż woda lub roztwór soli 
fizjologicznej.  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystany gatunek i szczep oraz uzasadnienie, je żeli wykorzystano 
inne zwierz ęta niż szczury,  
— dostawca badanych zwierz ąt, 
— liczba zwierz ąt, ich wiek na pocz ątku badań i ich płeć, 
— źródło pochodzenia, warunki trzymania, pasza, woda itp.,  
— masa cia ła każdego zwierz ęcia na pocz ątku badania.  
Warunki badania:  
— uzasadnienie w odniesieniu do wyboru poziomu dawki,  
— uzasadnienie w odniesieniu do drogi dawkowania i okresu dawkowania,  
— specyfikacje w zakresie podawanych dawek, w tym szczegó ły dotyczące 
nośnika, objętości i formy fizycznej podawanego materia łu, 
— szczegó ły dotyczące przygotowania formy u żytkowej badanej substancji 
chemicznej/przygotowania paszy, uzyskanego st ężenia, trwa łości 
i jednorodno ści preparatu,  
— metoda stosowana do niepowtarzalnej identyfikacji matek i potomstwa,  
— szczegó łowy opis procedur(-y) randomizacji stosowanych(-ej) do przy ­
dzielania matek do grup badanych, doboru m łodych do eliminacji 
i przydzielania m łodych do grup eksperymentalnych,  
— szczegó ły dotyczące podawania badanej substancji chemicznej,  
— w stosownych przypadkach przeliczenie st ężeń (ppm) badanej substancji 
chemicznej w paszy/wodzie pitnej lub roztworze do inhalacji na dawk ę 
faktyczną (mg/kg masy cia ła/dzień), 
— warunki środowiskowe,  
— szczegó ły dotyczące jakości pokarmu i wody (np. kranowa, destylowa ­
na), 
— daty rozpocz ęcia i zako ńczenia badania.  
Obserwacje i procedury badawcze:  
— szczegó łowy opis procedur stosowanych do standaryzacji obserwacji 
i procedur oraz definicji operacyjnych do celów punktowego oceniania 
obserwacji,  
— wykaz wszystkich procedur badawczych i uzasadnienie ich 
zastosowania,  
— szczegó ły dotycz ące zastosowanych procedur bada ń behawioralnych/ 
funkcjonalnych, patologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjolo ­
gicznych, w tym informacje i szczegó ły dotycz ące urządzeń 
automatycznych,  
— procedury kalibracji i zapewniania równowa żności urządzeń oraz bilan ­
sowanie grup eksperymentalnych w procedurach badawczych,  
— krótkie uzasadnienie wyja śniające wszelkie decyzje wi ążące się 
z profesjonalnym os ądem. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Wyniki (indywidualne i zbiorcze, w tym średnia i wariancja w stosownych 
przypadkach):  
— liczba zwierz ąt na pocz ątku badania i liczba zwierz ąt na końcu badania,  
— liczba zwierz ąt i miotów wykorzystanych do ka żdej metody badawczej,  
— numer identyfikacyjny ka żdego zwierz ęcia i miot, z którego pochodzi,  
— liczebno ść miotu i jego średnia wa żona przy urodzeniu w podziale na 
płeć, 
— masa cia ła i dane dotycz ące zmiany masy cia ła, w tym masa cia ła matek 
i potomstwa na koniec bada ń, 
— dane dotycz ące spożycia pokarmu oraz, w razie potrzeby, wypitej wody 
(np. jeżeli badana substancja chemiczna jest podawana z wod ą), 
— dane dotycz ące reakcji toksycznej wed ług płci i dawki, w tym objawy 
toksyczno ści lub śmiertelno ść, w stosownych przypadkach z podaniem 
czasu i przyczyny śmierci,  
— charakter szczegó łowych obserwacji klinicznych, ich dotkliwo ść, czas 
trwania, dzie ń rozpoczęcia, pora dnia i ich pó źniejszy przebieg,  
— wynik punktowy w odniesieniu do ka żdego charakterystycznego punktu 
rozwojowego (masy cia ła, dojrza łości płciowej i rozwoju zachowa ń) 
z każdego okresu obserwacji,  
— szczegó łowy opis wszystkich wyników bada ń behawioralnych, funkcjo ­
nalnych, neuropatologicznych, neurochemicznych, elektrofizjologicznych według płci, w tym wzrosty i spadki w porównaniu do grupy kontrolnej,
 
— wyniki sekcji zw łok, 
— masy mózgów,  
— wszelkie diagnozy postawione na podstawie objawów neurologicznych 
i zmian patologicznych, w tym pojawiaj ące się w sposób naturalny 
choroby lub warunki,  
— obrazy przyk ładowych wyników bada ń, 
— obrazy z urz ądzeń o małej mocy do oceny homologii wycinków zasto ­
sowanych do celów morfometrii,  
— dane dotycz ące wchłaniania i metabolizmu, w tym dane uzupe łniające 
z odrębnych bada ń toksykokinetycznych, je żeli są dostępne, 
— statystyczne opracowanie wyników, w tym modele statystyczne zastoso ­
wane w celu analizy danych, i wyniki, niezale żnie od tego, czy by ły 
istotne,  
— wykaz personelu badawczego, w tym odbyte szkolenia zawodowe.  
Omówienie wyników:  
— informacje dotycz ące zależności dawka-odpowied ź według płci i grupy,  
— związek wszelkich innych skutków toksycznych z wnioskiem dotycz ­ 
ącym neurotoksycznego potencja łu badanej substancji chemicznej 
według płci i grupy,  
— wpływ wszelkich informacji toksykokinetycznych na wnioski,  
— podobie ństwa skutków do jakichkolwiek znanych środków 
neurotoksycznych,  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— dane potwierdzaj ące wiarygodno ść i czułość metody badawczej (np. 
dodatnie i historyczne dane kontrolne),  
— związki, jeżeli wyst ępują, między skutkami neuropatologicznymi 
a czynnościowymi,  
— NOAEL lub dawka wyznaczaj ąca w odniesieniu do matek i potomstwa 
według płci i grupy.  
Wnioski:  
— omówienie ogólnej interpretacji danych na podstawie wyników, w tym 
wniosek dotycz ący tego, czy badana substancja chemiczna spowodowa ła 
neurotoksyczno ść rozwojow ą, i NOAEL.  
LITERATURA  
(1) OECD (1995), Draft Report of the OECD  Ad Hoc  Working Group on 
Reproduction and Developmental Toxicity, Kopenhaga, Dania, 13–14 czerwca 1995 r.
 
(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects 
Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. 
US EPA 712-C-98-239, Dost ępne na stronie: [http://www.epa.gov/ 
opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Se ­
ries/].  
(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 
630/R-95/001F. Dost ępne na stronie: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recor ­
display.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].  
(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., 
Weiss B., Mileson B. (2001), ‘Methods to identify and characterize deve ­
lopmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects’,  Environ. Health Perspect.  109, s. 79–91.
 
(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher J.E. Jr., 
Fisher J.W., Harry G.J., Li A.A., Makris S.L., Padilla S., Sultatos L.G., 
Mileson B.E. (2001), ‘Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations’,  Environ. Health Perspect . 109, s. 
101–111.
 
(6) Garman, R.H., Fix, A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Clau ­
dio, L., Ferenc, S. (2001), ‘Methods to identify and characterize develop ­
mental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropatholo ­
gy’, Environ. Health Perspect.  109, s. 93–100.  
(7) OECD (2003), Report of the OECD Expert Consultation Meeting on 
Developmental Neurotoxicity Testing, Waszyngton D.C., US, 
23–25 pa ździernika 2000 r.  
(8) OECD (2008), OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, 
OECD, Pary ż, lipiec 2008 r. Dost ępne na stronie: [http://search.oecd.org/ 
officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mo ­
no(2008)16&doclanguage=en].
 
(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series 
on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Pary ż, wrzesie ń 2003 r. 
Dostępne na stronie: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_ 
34377_1916054_1_1_1_1,00.html].
 
(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990), ‘Qualitative and quanti ­
tative comparability of human and animal developmental neurotoxicity’,  
Neurotoxicol. Teratol.  12, s. 173–292.  
(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000),  Experimental 
and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition , ISBN 0195084772, Oxford 
University Press, Nowy Jork.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 802
 
(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002), ‘Environmental 
factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits’,  Ment. 
Retard. Dev. Disabil. Res. Rev . 8, s. 188–197.  
(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998),  Handbook of Developmental Neuro ­
toxicology, 1st Edition , ISBN 0126488606, Academic Press, Nowy Jork.  
(14) Rozdzia ł B.34 niniejszego za łącznika: ‘Badanie toksyczno ści reprodukcji 
jednego pokolenia’.  
(15) Rozdzia ł B.35 niniejszego za łącznika: ‘Dwupokoleniowe badanie toksycz ­
ności reprodukcyjnej’.  
(16) Rozdzia ł B.43 niniejszego za łącznika: ‘Badanie neurotoksyczno ści 
u gryzoni’.  
(17) Rozdzia ł B.31 niniejszego za łącznika: ‘Badanie przedurodzeniowej 
toksyczno ści rozwojowej’.  
(18) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 
22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do 
celów naukowych. Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33.  
(19) WHO (1986),  Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity 
Associated with Exposure to Chemicals  (Environmental Health Criteria 
60), Albany, Nowy Jork: World Health Organization Publications Center, USA. Dost ępne na stronie: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ 
ehc060.htm].
 
(20) WHO (2001),  Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Princi ­
ples and Approaches  (Environmental Health Criteria 223), World Health 
Organization Publications, Genewa. Dost ępne na stronie: [http://www.in ­
tox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].  
(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995), Neurotoxicology: Approaches and 
Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, Nowy Jork.  
(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997), ‘Effects of neonatal naltrexone on 
neurological and somatic development in rats of both genders’,  Neuroto­
xicol. Teratol.  19, s. 499–509.  
(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997), ‘The rationale for culling of rodent 
litters’,  Fundam. Appl. Toxicol.  38, s. 2–6.  
(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977), ‘Foot tattoo of neonatal mice’,  Lab. 
Animal Sci.  27, s. 110–112.  
(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989), ‘Implementation of 
a primary screen for developmental neurotoxicity’,  Fundam. Appl. Toxicol.  
13, s. 118–136.  
(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979),  Ontogeny of Learning and Memory . 
ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.  
(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987),  
Perinatal Development: A Psychobiological Perspective , Academic Press, 
Orlando.  
(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003),  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research , ILSI Press, 
Waszyngton, DC.  
(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005), ‘Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group’,  Int. J. Toxicol . 24, s. 87–94.  
(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999), ‘Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment’,  Toxicol. Sci.  49, s. 1–4.  
(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: ‘Detection of Toxicity 
to Reproduction for Medical Products (S5 A)’. Mi ędzynarodowa konfe ­
rencja ds. harmonizacji wymaga ń technicznych dla rejestracji produktów 
leczniczych stosowanych u ludzi.  
(32) Lochry, E.A. (1987), ‘Concurrent use of behavioral/functional testing in 
existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical consi ­
derations’,  J. Am. Coll. Toxicol.  6, s. 433–439.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 803
 
(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998), ‘Using post ­
natal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments 
alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan’,  Neurotoxicol. Teratol.  20, s. 449–457.
 
(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999), ‘Interpreting the toxicologic significance of alterations in anoge ­
nital distance: potential for confounding effects of progeny body weights’,  
Reprod. Toxicol . 13, s. 383–390.  
(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, 
L. (2000), ‘Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat’,  
Toxicol. Sci.  58, s. 350–365.
 
(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., 
Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985), ‘Collaborative behavioral 
teratology study: Protocol design and testing procedure’,  Neurobehav. 
Toxicol. Teratol.  7, s. 579–586.  
(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977), ‘Preputial sepa ­
ration as an external sign of pubertal development in the male rat’,  Biol. 
Reprod.  17, s. 298–303.  
(38) Spear, L.P. (1990), ‘Neurobehavioral assessment during the early postnatal 
period’,  Neurotoxicol. Teratol.  12, s. 489–95.  
(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975), ‘Postnatal development of locomotion in 
the laboratory rat’,  Anim. Behav.  23, s. 896–920.  
(40) Adams, J. (1986), ‘Methods in Behavioral Teratology’, [w:]  Handbook of 
Behavioral Teratology , Riley, E.P., Vorhees, C.V. (red.) Plenum Press, 
Nowy Jork, s. 67–100.  
(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979), ‘Motor activity: A survey of methods 
with potential use in toxicity testing’,  Neurobehav. Toxicol.  1, s. 53–66.  
(42) Robbins, T.W. (1977), ‘A critique of the methods available for the measu ­
rement of spontaneous motor activity’, [w:]  Handbook of Psychopharma ­
cology , Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (red.) Plenum 
Press, Nowy Jork, s. 37–82.  
(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993), ‘Developmental neuro ­
toxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat’,  
Neurotoxicol. Teratol.  15, s. 117–129.  
(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985), ‘Development of loco ­
motor activity of rat pups in figure-eight mazes’,  Dev. Psychobiol.  18, s. 
247–260.  
(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., 
Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991), ‘Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessmen ­
ts’, Neurotoxicol. Teratol.  13, s. 599–609.
 
(46) Ross, J.F., Handley, D.E., Fix, A.S., Lawhorn, G.T., Carr, G.J. (1997), 
‘Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats’,  Neuro­
toxicol. Teratol.  19, 1997 r., s. 405–411.  
(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998), ‘A force plate system for 
measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals’,  
Physiol. Behav.  64, s. 661–669.  
(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977), ‘A simple, sensitive, and objective 
method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats’,  Toxicol. 
Appl. Pharmacol.  40, s. 589–591.  
(49) Davis, M. (1984), ‘The mammalian startle response’, [w:]  Neural Mecha ­
nisms of Startle Behavior , Eaton, R.C. (red.), Plenum Press, Nowy Jork, s. 
287–351.  
(50) Koch, M. (1999), ‘The neurobiology of startle’,  Prog. Neurobiol.  59, s. 
107–128.  
(51) Crofton, K.M. (1992), ‘Reflex modification and the assessment of sensory 
dysfunction’, [w:]  Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology , 
Tilson, H., Mitchell, C. (red.). Raven Press, Nowy Jork, s. 181–211.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 804
 
(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989), ‘Evaluation of sensory system function 
using reflex modification of the startle response’,  J. Am. Coll. Toxicol.  8, 
s. 199–211.  
(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994), ‘Solvent-induced ototo ­
xicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit’,  Hear. 
Res. 80, s. 25–30.  
(54) Ison, J.R. (1984), ‘Reflex modification as an objective test for sensory 
processing following toxicant exposure’,  Neurobehav. Toxicol. Teratol.  
6, s. 437–445.  
(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992), ‘Incorporating evoked 
potentials into neurotoxicity test schemes’, [w:]  Target Organ Toxicology 
Series: Neurotoxicity , Tilson, H., Mitchell, C., (red.), Raven Press, Nowy 
Jork. s. 125–145.  
(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990), ‘Learning and memory 
deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile’,  Toxicol. 
Appl. Pharmacol.  105, s. 321–332.  
(57) Bammer, G. (1982), ‘Pharmacological investigations of neurotransmitter 
involvement in passive avoidance responding: A review and some new 
results’,  Neurosci. Behav. Rev.  6, s. 247–296.  
(58) Bushnell, P.J. (1988), ‘Effects of delay, intertrial interval, delay behavior 
and trimethyltin on spatial delayed response in rats’,  Neurotoxicol. Teratol.  
10, s. 237–244.  
(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989), ‘Differential ontogeny of working 
memory and reference memory in the rat’,  Behav. Neurosci.  103, s. 
98–105.  
(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984), ‘Conditioning of aversion to an odor 
paired with peripheral shock in the developing rat’,  Develop. Psychobiol.  
17, s. 465–479.  
(61) Morris, R. (1984), ‘Developments of a water-maze procedure for studying 
spatial learning in the rat’,  J. Neurosci. Methods  11, s. 47–60.  
(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989), ‘The use of the Morris 
water maze in the study of memory and learning’,  Int. J. Neurosci.  48, 
s. 29–69.  
(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001), ‘Applications of the Morris water 
maze in the study of learning and memory’,  Brain Res. Rev.  36, s. 60–90.  
(64) Vorhees, C.V. (1987), ‘Maze learning in rats: A comparison of perfor ­
mance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin’,  Neurotoxicol. Teratol.  9, s. 235–241.
 
(65) Vorhees, C.V. (1997), ‘Methods for detecting long-term CNS dysfunction 
after prenatal exposure to neurotoxins’,  Drug Chem. Toxicol.  20, s. 
387–399.  
(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988), ‘Impaired Biel 
and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly’,  Neurotoxicol. Teratol.  10, s. 327–332.
 
(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983), ‘Delayed behavioral toxi ­
city of lead with increasing exposure concentration’,  Toxicol. Appl. Phar ­
macol.  71, s. 342–352.  
(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981), ‘Effects of age on long-term 
memory: Retention of fixed interval responding’,  J. Gerontol.  36, s. 
338–341.  
(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000), ‘Practical aspects of neuropathology: 
A technical guide for working with the nervous system’,  Toxicol. Pathol.  
28, s. 122–131.  
(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994),  Laboratory 
Methods in Histotechnology , American Registry of Pathology, Waszyng ­
ton, DC, s. 84–107.  
(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002),  Theory and Practice of Histological 
Techniques , 5th edition, Churchill Livingstone, Londyn.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 805
 
(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996), ‘Integrated 
evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, 
and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex’,  Toxicol. Pathol.  24, s. 
291–304.
 
(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000), ‘Fluoro-Jade B: A high affinity 
tracer for the localization of neuronal degeneration’,  Brain Res.  874, s. 
123–130.  
(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001), 
‘Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain’,  Exp. Toxic. Pathol.  53, 
s. 365–372.  
(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994), 
‘Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma’,  Neurotoxicol. Teratol.  16, s. 545–561.
 
(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, 
J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., 
Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a), 
‘Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives’,  Envi­
ron. Toxicol. Pharmacol.  19, s. 745–755.
 
(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, 
M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., 
O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gunder ­
sen, H.J. (2005b), ‘2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for develop ­
mental neurotoxicity’,  Reprod. Toxicol . 20, s. 417–432.
 
(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979), ‘Morphologic effects of interference 
with cell proliferation in the early fetal period’,  Neurobehav. Toxicol.  1, s. 
129–135.  
(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998),  Unbiased Stereology: 
Three-Dimensional Measurement in Microscopy , Springer-Verlag, Nowy 
Jork.  
(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998), ‘Stereology: 
A practical primer for neuropathology’, J . Neuropathol. Exp. Neurol.  57, 
s. 305–310.  
(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993), ‘Total 
numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an 
unbiased stereological method’,  Brain Res.  609, s. 262–268.  
(82) Schmitz, C. (1997), ‘Towards more readily comprehensible procedures in 
disector stereology’,  J. Neurocytol.  26, s. 707–710.  
(83) West, M.J. (1999), ‘Stereological methods for estimating the total number 
of neurons and synapses: Issues of precision and bias’,  Trends Neurosci.  
22, s. 51–61.  
(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005), ‘Design-based stereology in neuroscience’,  
Neuroscience  130, s. 813–831.  
(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994), ‘Patterns of 
growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the 
neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM)’,  Teratology  49, s. 113–121.  
(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995), ‘Glial responses to hypoxic/ 
ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum’,  Develop. Brain Res.  
84, s. 294–298.  
(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998), ‘Brain morphogenesis and develop ­
mental neurotoxicology’, [w:]  Handbook of Developmental Neurotoxico ­
logy, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (red.), Academic Press, Nowy Jork, s. 
3–41.  
(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, 
K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999), ‘Bloc ­
kade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the develo ­
ping brain’,  Science  283, s. 70–74.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 806
 
(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., 
Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, 
K., Olney, J.W. (2000), ‘Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome’,  Science  287, s. 1056–1060.
 
(90) Friede, R. L. (1989),  Developmental Neuropathology , wydanie drugie, 
Springer-Verlag, Berlin.  
(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992), ‘Comparison 
of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions’,  Toxicol. 
Let. 63, s. 127–133.  
(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996), ‘Setting exposure 
standards: a decision process’,  Environ. Health Perspect.  104, s. 401–405.  
(93) US EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment US EPA 
NCEA-F-0644 A.  
(94) US EPA (1996), Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, 
Federal Register 61(212): 56274-56322.  
(95) Du ńska Agencja Ochrony Środowiska (1995),  Neurotoxicology . Review of 
Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, 
O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.  
(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984), ‘Recommendations for 
appropriate statistical practice in toxicologic experiments’,  Neurotoxico ­
logy 5, s. 113–126.  
(97) Gad, S.C. (1989), ‘Principles of screening in toxicology with special 
emphasis on applications to Neurotoxicology’,  J. Am. Coll. Toxicol.  8, s. 
21–27.  
(98) Abby, H., Howard, E. (1973), ‘Statistical procedures in developmental 
studies on a species with multiple offspring’,  Dev. Psychobiol.  6, s. 
329–335.  
(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975), ‘Selection of the experimental unit in 
teratology studies’,  Teratology  12, s. 165–172.  
(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992), ‘Principles and pitfalls in the analysis of 
prenatal treatment effects in multiparous species’,  Neurotoxicol. Teratol.  
14, s. 221–228.  
(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. 
(1985), ‘Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach’,  
Neurobehav. Toxicol. Teratol.  7, s. 587–90.  
(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. 
(2004), ‘A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies’,  Neurotoxicol. Teratol.  26, s. 
345–352.
 
(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., oraz grupa 
robocza  ad hoc  STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006), 
‘A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in develop ­
mental neurotoxicity testing — for today’,  Toxicol. Pathol.  34, s. 296–313.  
(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992), ‘The use of repeated measures 
analysis in developmental toxicology studies’,  Neurotoxicol. Teratol. , 
14(3), s. 205–210.  
(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985), ‘Testing the statistical 
certainty of a response to increasing doses of a drug’,  Biometrics , 41, s. 
295–301.  
(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, 
S.P. (2008), ‘Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints’,  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4), s. 266–287.
 
(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. 
(2008), ‘Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute 
expert working group on neurodevelopmental endpoints’,  Neurotoxicology 
and Teratology , 30(4), s. 288–325.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, 
W. (2008), ‘Statistical issues and techniques appropriate for developmental 
neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints’,  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4), s. 326–348.
 
(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and 
Sobotka, T.J. (2008), ‘Identification and interpretation of developmental 
neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints’,  
Neurotoxicology and Teratology , 30(4), s. 349–381.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Rysunek 1  
Ogólny schemat bada ń w odniesieniu do bada ń behawioralnych/funkcjonalnych, oceny 
neuropatologicznej i mas mózgów. Poni ższy diagram jest oparty na opisach z pkt 13–15. 
Przykłady przydzielania zwierz ąt znajduj ą się w dodatku 1.
  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Dodatek 1  
1. Poni żej opisano i przedstawiono w formie tabeli przyk łady ewentualnych 
przydziałów. Przyk łady te maj ą na celu ukaza ć, że przydzia ł zwierząt obję­
tych badaniem do ró żnych modeli badania mo że przebiega ć na wiele sposo ­
bów.  
Przykład 1  
2. Do badania rozwoju zachowa ń w okresie przedodsadzeniowym wykorzys ­
tuje się grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samic ę na miot). 
Spośród tych zwierz ąt 10 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na 
miot) jest u śmiercanych w sposób humanitarny w dniu 22 po urodzeniu. Ich 
mózgi są usuwane, wa żone i przetwarzane do oceny histopatologicznej. 
Poza tym gromadzi si ę dane dotycz ące masy mózgu, stosuj ąc nieutrwalone 
mózgi pozosta łych 10 samców i 10 samic na dawk ę. 
3. Kolejn ą grupę 20 zwierz ąt/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samic ę na miot) 
wykorzystuje si ę do badań funkcjonalnych/behawioralnych w okresie pood ­
sadzeniowym (szczegó łowych obserwacji klinicznych, aktywno ści rucho­
wej, reakcji na nag ły dźwięk i badania funkcji poznawczej u zwierz ąt 
w okresie dojrzewania) i oceny wieku dojrzewania p łciowego. Spo śród 
tych osobników 10 zwierz ąt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na 
miot) zostaje znieczulonych i utrwalonych przez perfuzj ę na koniec badania 
(około dnia 70 po urodzeniu). Po dodatkowym utrwaleniu  in situ  usuwa si ę 
mózg i przetwarza si ę go w celu oceny neuropatologicznej.  
4. W badaniu funkcji poznawczej u m łodych doros łych (np. dzie ń 60–70 po 
urodzeniu) wykorzystuje si ę trzecią grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 
samca i 1 samic ę na miot). Spo śród tych osobników 10 zwierz ąt/płeć/dawkę 
(tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje u śmierconych na koniec badania, 
a ich mózgi s ą usuwane i wa żone. 
5. Pozosta łe 20 zwierz ąt/płeć/grupę zachowuje si ę do możliwych dodatkowych 
badań. 
Tabela 1  
Nr młodego (  a ) Liczba m łodych 
przydzielonych do 
badania Badanie 
m f  
1 5 20 m + 20 f Rozwój zachowa ń 
10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/ 
morfometria w dniu 22 po urodzeniu 
10 m + 10 f Masa mózgu w dniu 22 po 
urodzeniu 
2 6 20 m + 20 f Szczegó łowe obserwacje 
kliniczne 
20 m + 20 f Aktywno ść ruchowa 
20 m + 20 f Dojrza łość płciowa 
20 m + 20 f Funkcje 
motoryczno-sensoryczne 
20 m + 20 f Uczenie si ę i pamięć (dzień 25 
po urodzeniu) 
10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/ 
morfometria m łodego doros łego 
w dniu 70 po urodzeniu
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
Nr młodego (  a ) Liczba m łodych 
przydzielonych do 
badania Badanie 
m f  
3 7 20 m + 20 f Uczenie si ę i pami ęć (młode 
dorosłe) 
10 m + 10 f Masa mózgu m łodego doros łego 
w dniu 70 po urodzeniu 
4 8 — Zatrzymanie zwierz ąt w celu 
wymiany lub w celu dodatko ­
wych bada ń 
( a ) W tym przyk ładzie mioty zosta ły ograniczone do 4 samców (m) + 4 samic (f); 
młode samce oznaczono numerami od 1 do 4, a m łode samice od 5 do 8.  
Przykład 2  
6. Do badania rozwoju zachowa ń w okresie przedodsadzeniowym wykorzys ­
tuje się grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samic ę na miot). 
Spośród tych zwierz ąt 10 młodych/płeć/dawkę (1 samiec lub 1 samica na 
miot) jest u śmiercanych w sposób humanitarny w dniu 11 po urodzeniu. Ich 
mózgi są usuwane, wa żone i przetwarzane do oceny histopatologicznej.  
7. Inną grupę 20 zwierz ąt/płeć/dawkę (1 samiec i 1 samica na miot) wyko ­
rzystuje si ę do bada ń po odsadzeniu (szczegó łowych obserwacji klinicz ­
nych, aktywno ści ruchowej, oceny wieku dojrzewania p łciowego oraz 
funkcji motoryczno-sensorycznych). Spo śród tych osobników 10 zwierz ąt/ 
płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje znieczulonych 
i utrwalonych przez perfuzj ę na koniec badania (oko ło dnia 70 po urodze ­
niu). Po dodatkowym utrwaleniu  in situ  usuwa si ę mózg, wa ży się go 
i przetwarza w celu oceny neuropatologicznej.  
8. W badaniu funkcji poznawczej u osobników dojrzewaj ących i m łodych 
dorosłych wykorzystuje si ę 10 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca lub 1 
samicę na miot). Do celów bada ń funkcji poznawczej w dniu 23 po 
urodzeniu i u m łodych doros łych wykorzystuje si ę inne zwierz ęta. Na 
koniec badania 10 zwierz ąt/płeć/grupę objętych badaniem jako doros łe 
zostaje uśmierconych, a ich mózgi s ą usuwane i wa żone. 
9. Pozosta łe 20 zwierz ąt/płeć/grupę niewybranych do bada ń uśmierca si ę 
i utylizuje przy odsadzaniu.  
Tabela 2  
Nr młodego (  a ) Liczba m łodych przydzie ­
lonych do badania Badanie 
m f  
1 5 20 m + 20 f Rozwój zachowa ń 
10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/ 
morfometria w dniu 11 po 
urodzeniu 
2 6 20 m + 20 f Szczegó łowe obserwacje 
kliniczne 
20 m + 20 f Aktywno ść ruchowa 
20 m + 20 f Dojrza łość płciowa 
20 m + 20 f Funkcje 
motoryczno-sensoryczne 
10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/ 
morfometria m łodego doros łego 
w dniu 70 po urodzeniu  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
Nr młodego (  a ) 
Liczba m łodych przydzie ­
lonych do badania Badanie 
m f  
3 7 10 m + 10 f (  b ) Uczenie si ę i pamięć (dzień 23 
po urodzeniu) 
3 7 10 m + 10 f (  b ) Uczenie si ę i pami ęć (młode 
dorosłe) 
Masa mózgu m łodego doros łego 
4 8 — Zwierz ęta u śmiercone 
i zutylizowane w dniu 21 po 
urodzeniu  
( i ) W tym przyk ładzie mioty zosta ły ograniczone do 4 samców (m) + 4 samic (f); 
młode samce oznaczono numerami od 1 do 4, a m łode samice od 5 do 8. 
( j ) Do celów bada ń funkcji poznawczej w dniu 23 po urodzeniu i u m łodych doro ­
słych wykorzystuje si ę różne młode (np. parzyste/nieparzyste mioty z ca łkowitej 
liczby 20 miotów).  
Przykład 3  
10. Do celów pomiaru masy mózgu i oceny neuropatologicznej w dniu 11 po 
urodzeniu wykorzystuje si ę grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 
samicę na miot). Spo śród tych zwierz ąt 10 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 
samiec lub 1 samica na miot) zostaje u śmierconych w sposób humanitarny 
w dniu 11 po urodzeniu, a ich mózgi s ą usuwane, wa żone i przetwarzane do 
oceny histopatologicznej. Poza tym gromadzi si ę dane dotycz ące masy 
mózgu, stosuj ąc nieutrwalone mózgi pozosta łych 10 samców i 10 samic 
na dawkę. 
11. Kolejn ą grupę 20 zwierz ąt/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samic ę na miot) 
wykorzystuje si ę do celów badania rozwoju zachowa ń (aktywno ści rucho­
wej), bada ń w okresie po odsadzeniu (aktywno ści ruchowej i oceny wieku 
dojrzewania p łciowego) i badania funkcji poznawczej u osobników dojrze ­
wających.  
12. Nast ępną grupę 20 zwierz ąt/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samic ę na miot) 
wykorzystuje si ę do celów badania funkcji motoryczno-sensorycznych 
(reakcja na nag ły dźwięk) i szczegó łowych obserwacji klinicznych. Spo śród 
tych osobników 10 zwierz ąt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) 
zostaje znieczulonych i utrwalonych przez perfuzj ę na koniec badania 
(około dnia 70 po urodzeniu). Po dodatkowym utrwaleniu  in situ  usuwa 
się mózg, wa ży się go i przetwarza w celu oceny neuropatologicznej.  
13. Do badania funkcji poznawczej u m łodych doros łych wykorzystuje si ę inną 
grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samic ę na miot). Spo śród 
nich 10 zwierz ąt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje 
uśmierconych na koniec badania, a ich mózgi s ą usuwane i wa żone. 
Tabela 3  
Nr młodego (  a ) Liczba m łodych przydzie ­
lonych do badania Badanie 
m f  
1 5 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/ 
morfometria w dniu 11 po 
urodzeniu 
10 m + 10 f Masa mózgu w dniu 11 po 
urodzeniu 
2 6 20 m + 20 f Rozwój zachowa ń (aktywno ść 
ruchowa) 
20 m + 20 f Aktywno ść ruchowa 
20 m + 20 f Dojrzewanie p łciowe 
20 m + 20 f Uczenie si ę i pamięć (dzień 27 
po urodzeniu)  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
Nr młodego (  a ) Liczba m łodych przydzie ­
lonych do badania Badanie 
m f  
3 7 20 m + 20 f Reakcja na nag ły dźwięk (osob­
niki dojrzewaj ące i młode doro­
słe) 
20 m + 20 f Szczegó łowe obserwacje 
kliniczne 
10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/ 
morfometria m łodego doros łego 
w dniu 70 po urodzeniu 
4 8 20 m + 20 f Uczenie si ę i pami ęć (młode 
dorosłe) 
10 m + 10 f Masa mózgu m łodego doros łego 
( a ) W tym przyk ładzie mioty zosta ły ograniczone do 4 samców (m) + 4 samic (f); 
młode samce oznaczono numerami od 1 do 4, a m łode samice od 5 do 8.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Dodatek 2  
Definicje:  
Substancja chemiczna oznacza substancj ę lub mieszanin ę. 
Badana substancja chemiczna oznacza ka żdą substancj ę lub mieszanin ę badaną 
za pomoc ą opisywanej metody badawczej.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  TEST BIOLOGICZNY WZROSTU MACICY U GRYZONI: 
KRÓTKOTERMINOWE BADANIE PRZESIEWOWE 
WŁAŚCIWOŚCI ESTROGENNYCH  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest zgodna z dotycz ącą badań wytyczną OECD 
nr 440 (2007 r.). W 1998 r. OECD podj ęła działania o wysokim priorytecie, 
mające na celu zmian ę istniejących wytycznych i opracowanie nowych 
wytycznych na potrzeby bada ń przesiewowych i badania potencjalnych 
substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu hormonalnego (1). Jednym 
z elementów tych dzia łań było opracowanie wytycznych dotycz ących biolo ­
gicznego testu wzrostu macicy u gryzoni. Test biologiczny wzrostu macicy 
u gryzoni by ł następnie przedmiotem rozszerzonego programu walidacyj ­
nego, obejmuj ącego sporz ądzenie szczegó łowego dokumentu ramowego 
(2)(3) i przeprowadzenie obszernych wewn ątrz- i mi ędzylaboratoryjnych 
badań celem wykazania istotno ści i odtwarzalno ści testu biologicznego 
przy użyciu silnego estrogenu referencyjnego, s łabych agonistów recep ­
torów estrogenowych, silnego antagonisty receptorów estrogenowych oraz negatywnej chemicznej substancji odniesienia (4)(5)(6)(7)(8)(9). Przedmio ­
towa metoda badawcza B.54 zosta ła opracowana w oparciu 
o doświadczenia zdobyte w trakcie programu bada ń walidacyjnych 
i wyniki otrzymane za pomoc ą agonistów estrogennych w ramach tego 
programu.
 
2. Test biologiczny wzrostu macicy jest krótkoterminowym badaniem przesie ­
wowym, zapocz ątkowanym w latach 30. ubieg łego wieku (27)(28); po raz 
pierwszy zosta ł poddany standaryzacji w odniesieniu do bada ń przesiewo ­
wych przez komitet ekspertów w 1962 r. (32)(35). Test ten polega na 
zwiększeniu masy macicy lub reakcji polegaj ącej na zwi ększeniu masy 
macicy (w celu dokonania przegl ądu zob. pkt 29). Test pozwala dokona ć 
oceny zdolno ści substancji chemicznej do wywo ływania aktywno ści biolo­
gicznej zgodnej z aktywno ścią agonistów i antagonistów naturalnych estro ­
genów (np. estradiolu 17-beta), jednak jest znacznie rzadziej wykorzysty ­
wany do wykrywania antagonistów ni ż do wykrywania agonistów. Macica 
reaguje na estrogeny na dwa sposoby. Wst ępną reakcją jest wzrost masy 
w związku z imbibicj ą wody. Nast ępnie dochodzi do przyrostu masy 
w związku ze rozrostem tkanki (30). Reakcje macicy u szczurów i myszy 
są porównywalne pod wzgl ędem jako ściowym.  
3. Przedmiotowy test pe łni rolę badania przesiewowego  in vivo  i jego stoso ­
wanie nale ży postrzega ć w kontek ście ram koncepcyjnych OECD 
w zakresie bada ń i oceny substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu 
hormonalnego („OECD Conceptual Framework for the Testing and Asses ­
sment of Endocrine Disrupting Chemicals”) (dodatek 2). W powy ższych 
ramach koncepcyjnych test biologiczny wzrostu macicy przypisano do 
poziomu 3 jako test  in vivo  pozwalaj ący uzyska ć dane dotycz ące pojedyn ­
czego mechanizmu uk ładu hormonalnego, tj. estrogenno ści. 
4. Biologiczny test wzrostu macicy ma zosta ć włączony do zestawu bada ń in 
vitro  i in vivo  w celu identyfikacji substancji chemicznych, które mog ą 
wchodzić w interakcje z uk ładem hormonalnym, co ostatecznie doprowadzi 
do oceny ryzyka w odniesieniu do zdrowia ludzi i środowiska. 
W programie walidacyjnym OECD zastosowano zarówno silnych, jak 
i słabych agonistów estrogenu, aby oceni ć skuteczno ść testu pod wzgl ędem 
identyfikacji estrogennych substancji chemicznych (4)(5)(6)(7)(8). W ten sposób oprócz wykazania dobrej odtwarzalno ści wewn ątrz- 
i międzylaboratoryjnej doskonale wykazano tak że czułość procedury 
badawczej dla agonistów estrogenu.
 
5. Jeżeli chodzi o negatywne zwi ązki chemiczne, do programu walidacyjnego 
włączono zaledwie jedn ą „negatywn ą” chemiczn ą substancj ę odniesienia, 
w stosunku do której zg łoszono wynik negatywny w biologicznym te ście 
wzrostu macicy, jak równie ż w wiązaniu receptorowym  in vitro , ale 
oceniono dodatkowe dane z bada ń niepowi ązane z programem walida ­
cyjnym OECD, przedstawiaj ąc dalsze dowody na swoisto ść biologicznego 
testu wzrostu macicy w odniesieniu do bada ń przesiewowych agonistów 
estrogenu (16).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
6. Agoni ści i antagoni ści estrogenu dzia łają jako ligandy w stosunku do recep ­
torów estrogenowych a i b i mog ą, odpowiednio, aktywowa ć lub hamowa ć 
działanie transkrypcyjne receptorów. Mo że powodowa ć to niepo żądane 
zagrożenia dla zdrowia, w tym wp ływ na reprodukcj ę i rozwój. 
W związku z tym istnieje potrzeba dokonania oceny i zbadania substancji 
chemicznej jako potencjalnego agonisty lub antagonisty estrogenu. Powino ­
wactwo ligandu wobec receptora estrogenu lub aktywacja transkrypcji genów reporterowych  in vitro , mimo swojej warto ści informacyjnej, stanowi 
tylko jeden z szeregu determinantów potencjalnego zagro żenia. Pozosta łe 
determinanty mog ą obejmowa ć aktywacj ę i dezaktywacj ę metaboliczn ą 
w momencie dostania si ę do organizmu, dystrybucj ę do tkanek docelowych 
i klirens z organizmu, co najmniej cz ęściowo w zale żności od drogi poda ­
wania i badanej substancji chemicznej. Prowadzi to do konieczno ści prze­
prowadzenia bada ń in vivo  ewentualnego dzia łania substancji chemicznej 
w odpowiednich warunkach, chyba że odpowiednie informacje mo żna już 
wywnioskowa ć z właściwości danej substancji chemicznej w odniesieniu do 
wchł
aniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania. Reakcj ą tkanek macicy 
na stymulacj ę estrogenami jest nag ły i silny wzrost, w szczególno ści 
u gryzoni laboratoryjnych, w przypadku których cykl estrogenowy trwa około 4 dni. Gryzonie, a w szczególno ści szczury, wykorzystuje si ę także 
powszechnie w badaniach toksyczno ści do celów charakteryzowania zagro ­ 
żeń. W związku z tym macica gryzoni jest odpowiednim organem doce ­
lowym wykorzystywanym do celów bada ń przesiewowych  in vivo  dotycz­ 
ących agonistów i antagonistów estrogenu.
 
7. Przedmiotow ą metodę badawcz ą opracowano w oparciu o protoko ły wyko­
rzystywane w badaniu walidacyjnym OECD, które okaza ły się być wiary­
godne i powtarzalne w badaniach wewn ątrz- i międzylaboratoryjnych (5)(7). 
Obecnie dost ępne są dwie metody, a mianowicie wykorzystywanie doro ­
słych samic poddanych owariektomii (metoda badania doros łych osobników 
poddanych owariektomii) i wykorzystywanie niedojrza łych osobników 
niepoddanych owariektomii (metoda badania m łodych osobników). 
W przypadku obu metod, w ramach programu walidacyjnego OECD, wyka ­
zano porównywaln ą czułość i odtwarzalno ść. Metoda badania niedojrza łych 
osobników jest jednak w pewnym stopniu mniej szczegó łowa, poniewa ż 
posiadają one nienaruszon ą oś podwzgórze–przysadka–gonady (HPG), ale 
obejmuje szerszy zakres badania ni ż metoda badania zwierz ęcia poddanego 
owariektomii, poniewa ż zwierzę niedojrza łe może reagowa ć na substancje 
chemiczne, które wchodz ą w interakcje z osi ą podwzgórze–przysadka–go ­
nady, a nie tylko z receptorem estrogenu. W przypadku szczurów o ś 
podwzgórze–przysadka–gonady staje si ę funkcjonalna w wieku oko ło 15 
dni. Zanim to nast ąpi, nie mo żna przyspieszy ć momentu osi ągnięcia przez 
zwierzę dojrzałości płciowej, podaj ąc mu na przyk ład gonadoliberyn ę 
(GnRH). W momencie osi ągania przez samice dojrza łości płciowej, jeszcze 
przed otwarciem pochwy, u samicy wyst ąpi szereg cykli bezowulacyjnych, 
w wyniku których nie dojdzie do otwarcia pochwy lub owulacji, ale zajd ą 
pewne zmiany hormonalne. W przypadku gdy substancja chemiczna bezpośrednio lub po średnio stymuluje o ś podwzgórze–przysadka–gonady, 
następuje wczesne dojrzewanie, wczesna owulacja i przyspieszone otwarcie 
pochwy. Powoduj ą to nie tylko substancje chemiczne oddzia łujące na oś 
podwzgórze–przysadka–gonady, ale te ż niektóre pasze, zawieraj ące wyższe 
poziomy metabolizowalnej energii ni ż pozostałe, będą stymulowa ły wzrost 
i przyspiesza ły otwarcie pochwy, nie posiadaj ąc przy tym w łaściwości 
estrogennych. Takie substancje chemiczne nie wywo ływałyby reakcji 
wzrostu macicy u doros łych zwierz ąt poddanych owariektomii, poniewa ż 
w ich przypadku o ś podwzgórze–przysadka–gonady nie funkcjonuje.
 
8. Ze wzgl ędu na dobrostan zwierz ąt należy stosowa ć przede wszystkim tak ą 
metodę, która polega na wykorzystaniu niedojrza łych szczurów, unikaj ąc 
wykonywania na zwierz ętach wstępnych zabiegów chirurgicznych a tak że 
potencjalnego niewykorzystania tych zwierz ąt, które wykazuj ą oznaki 
wejścia w cykl estrogenowy (zob. pkt 30).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. Reakcja wzrostu macicy nie jest wy łącznie pochodzenia estrogennego, tj. 
reakcję tę mogą powodowa ć także substancje chemiczne inne ni ż agoniści 
lub antagoni ści estrogenów. Przyk ładowo podawanie stosunkowo wysokich 
dawek progesteronu, testosteronu lub ró żnych progestagenów syntetycznych 
może prowadzi ć do reakcji stymuluj ącej (30). Ka żda reakcja mo że być 
poddana analizie histologicznej, aby wykaza ć keratynizacj ę i rogowacenie 
pochwy (30). Niezale żnie od ewentualnej przyczyny reakcji uzyskanie 
dodatniego wyniku biologicznego testu wzrostu macicy powinno z regu ły 
prowadzić do dzia łań zmierzaj ących do dalszych wyja śnień. Dodatkowe 
dowody wskazuj ące na estrogenno ść mogą pochodzi ć z testów  in vitro , 
takich jak testy wi ązań receptora estrogenu i badania aktywacji transkrypcji, 
lub z innych testów  in vivo , takich jak test dojrza łości płciowej samic.  
10. Bior ąc pod uwag ę, że test biologiczny wzrostu macicy pe łni rolę badania 
przesiewowego  in vivo , przyjęte podej ście walidacyjne uwzgl ędniało 
zarówno dobrostan zwierz ąt, jak i wielopoziomow ą strategię badań. 
W tym celu g łówny nacisk k ładziono na rygorystyczn ą walidacj ę odtwa­
rzalności i czułości w odniesieniu do estrogenno ści stanowi ącej kluczow ą 
kwestię w odniesieniu do wielu substancji chemicznych, natomiast 
niewielką uwagę przywiązywano do kwestii dotycz ącej antyestrogenno ści 
testu. Zbadano tylko jeden antyestrogen o silnym dzia łaniu, poniewa ż liczba 
substancji chemicznych o wyra źnym profilu antyestrogennym (niezak łó­
conym przez aktywno ść estrogenow ą) jest bardzo ograniczona. 
W związku z tym przedmiotowa metoda badawcza przeznaczona jest dla 
protokołu estrogennego, natomiast protokó ł opisujący tryb testu dotycz ący 
antagonistów zawarto w wytycznych (37). Odtwarzalno ść i czułość testu na 
obecność substancji chemicznych charakteryzuj ących się wyłącznie dzia ła­
niem antyestrogennym zostanie doprecyzowana w dalszej kolejno ści, kiedy 
procedura badawcza b ędzie już przez jaki ś czas stosowana rutynowo 
i zidentyfikowana zostanie wi ększa liczba substancji chemicznych charak ­
teryzujących się takim dzia łaniem.  
11. Uznano, że wszelkie procedury z wykorzystaniem zwierz ąt będą zgodne 
z lokalnymi normami w zakresie opieki nad zwierz ętami; przedstawione 
poniżej opisy dotycz ące opieki nad zwierz ętami i ich traktowania stanowi ą 
minimalne standardy wykonywania bada ń i zostan ą zastąpione przez 
lokalne przepisy, takie jak dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 
2010/63/UE z dnia 22 wrze śnia 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wyko­
rzystywanych do celów naukowych (38). OECD zapewnia dalsze wytyczne dotyczące humanitarnego traktowania zwierz ąt (25).
 
12. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów, w których wykorzystuje si ę 
żywe zwierz ęta, niezwykle istotne jest dopilnowanie przed rozpocz ęciem 
testu, aby dane by ły faktycznie potrzebne. Przyk ładowo dwie sytuacje, 
w których dane takie mog ą być wymagane, to:  
— wysokie prawdopodobie ństwo nara żenia (poziom 1 ram koncepcyjnych, 
dodatek 2) lub prawdopodobie ństwo estrogenno ści (poziom 2) w celu 
zbadania, czy takie dzia łania mog ą wystąpić in vivo , 
— działania wskazuj ące na estrogenno ść na poziomie 4 lub 5 badania  in 
vivo w celu uzasadnienia, że działania te by ły związane z mechanizmem 
estrogennym, który nie móg łby zostać wyjaśniony za pomoc ą badania  
in vitro.  
13. Definicje stosowane w tej metodzie badawczej przedstawiono w dodatku 1.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
ZASADA BADANIA  
14. Test biologiczny wzrostu macicy w odniesieniu do swojej czu łości opiera 
się na systemie bada ń na zwierz ętach, u których o ś podwzgórze-przysadka- 
jajnik nie funkcjonuje, co prowadzi do niskich endogennych poziomów cyrkulacji estrogenu. Zapewni to nisk ą początkowa mas ę macicy 
i maksymalny zakres reakcji na podawane estrogeny. Nast ępujące dwa 
stany wra żliwości na estrogeny u samic gryzoni spe łniają ten wymóg:
 
(i) niedojrza łe samice po odsadzeniu i przed osi ągnięciem dojrza łości 
płciowej; oraz  
(ii) młode dojrza łe samice poddane owariektomii, u których zapewniono 
odpowiedni czas na regresj ę tkanek macicy.  
15. Badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę codziennie przez sond ę drogą 
doustną lub przez podskórne wstrzykni ęcie. Stopniowane dawki badanej 
substancji chemicznej podaje si ę co najmniej dwóm grupom badanych (w 
celu uzyskania wskazówek zob. pkt 33) zwierz ąt doświadczalnych, stosuj ąc 
taką samą dawkę w każdej grupie i okres podawania wynosz ący trzy 
kolejne dni w odniesieniu do metody badania osobników niedojrza łych 
oraz okres podawania wynosz ący co najmniej trzy kolejne dni 
w odniesieniu do metody badania doros łych osobników poddanych 
owariektomii. Zwierz ęta poddaje si ę sekcji po up ływie oko ło 24 godzin 
od podania ostatniej dawki. W przypadku agonistów estrogenu szacuje si ę 
średnią masę macicy badanych grup zwierz ąt w odniesieniu do grupy 
kontrolnej no śnika w celu wykrycia istotnych statystycznie wzrostów. Staty ­
stycznie istotny wzrost średniej masy macicy w grupie badanej wskazuje na 
dodatnią reakcję będącą wynikiem tego testu biologicznego.  
OPIS METODY BADAWCZEJ  
Wybór gatunków zwierz ąt 
16. Do bada ń wykorzystuje si ę powszechnie stosowane laboratoryjne szczepy 
gryzoni. Przyk ładowo podczas walidacji wykorzystano szczury szczepu 
Sprague-Dawley i Wistar. Nie nale ży wykorzystywa ć szczepów, 
w przypadku których stwierdzono lub podejrzewa si ę, że macice zwierz ąt 
mają mniejszą zdolność do wykazywania reakcji. Laboratorium powinno 
wykazać czułość wykorzystywanego szczepu zgodnie z opisem 
w punktach 26 i 27.  
17. Szczury i myszy wykorzystywano do celów biologicznego testu wzrostu 
macicy od lat 30. ubieg łego stulecia. Badania walidacyjne OECD przepro ­
wadzano jedynie u szczurów, opieraj ąc się na założeniu, że oba gatunki 
powinny by ć równowa żne, w zwi ązku z tym jeden gatunek powinien 
wystarczy ć do przeprowadzenia ogólno światowej walidacji dla oszcz ędzenia 
zasobów i zwierz ąt. Szczur jest gatunkiem preferowanym w przypadku 
większości badań toksyczno ści reprodukcyjnej i rozwojowej. Bior ąc pod 
uwagę, że istnieje obszerna historyczna baza danych dotycz ących myszy, 
przeprowadzono ograniczone uzupe łniające badanie walidacyjne na tym 
gatunku w celu rozszerzenia zakresu metody testu biologicznego wzrostu 
macicy w odniesieniu do gryzoni na myszy jako gatunek eksperymentalny (16). Zgodnie z pierwotnym zamiarem oszcz ędzania zasobów i zwierz ąt 
wybrano stosowanie podej ścia pomostowego polegaj ącego na wykorzysty ­
waniu ograniczonej liczby badanych substancji chemicznych, ograniczonej 
liczbie uczestnicz ących laboratoriów i nieprzeprowadzaniu bada ń kodowa­
nych próbek. Przedmiotowe pomostowe badanie walidacyjne wykaza ło 
w odniesieniu do biologicznego testu wzrostu macicy u m łodych dojrza łych 
myszy poddanych owariektomii, że dane otrzymane w przypadku szczurów 
i myszy odpowiadaj ą sobie nawzajem pod wzgl ędem jako ściowym 
i ilościowym. W przypadkach, w których wynik biologicznego testu 
wzrostu macicy mo że poprzedzi ć
 badanie d ługoterminowe, mo żliwe jest 
wykorzystanie w obu badaniach zwierz ąt tego samego szczepu 
i pochodz ących z tego samego źródła. Podejście pomostowe ograniczono 
do myszy poddanych owariektomii, a sprawozdanie nie zapewnia solidnego zbioru danych, aby dokona ć walidacji modelu bada ń niedojrza łych osobni ­
ków, w zwi ązku z czym model ten nie jest obj ęty zakresem bie żącej metody 
badawczej.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 818
 
18. W zwi ązku z tym w niektórych przypadkach dopuszcza si ę wykorzysty ­
wanie myszy zamiast szczurów. Nale ży uzasadni ć wykorzystanie tego 
gatunku w oparciu o kryteria toksykologiczne, farmakokinetyczne lub inne. W przypadku myszy mo że zajść konieczno ść modyfikacji protoko łu. 
Przykładowo spo życie pokarmu przez myszy okre ślane na podstawie masy 
ciała jest wy ższe niż u szczurów, w zwi ązku z czym zawarto ść fitoestro ­
genów w karmie podawanej myszom powinna by ć niższa niż w karmie 
podawanej szczurom (9)(20)(22).
 
Warunki trzymania i żywienia  
19. Wszystkie procedury powinny by ć zgodne z lokalnymi normami w zakresie 
opieki nad zwierz ętami w warunkach laboratoryjnych. Opisy dotycz ące 
opieki nad zwierz ętami i ich traktowania stanowi ą minimalne normy 
i zostaną zastąpione przez lokalne przepisy, takie jak dyrektywa Parlamentu 
Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 wrze śnia 2010 r. w sprawie 
ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do celów naukowych (38). Tempera ­
tura w pomieszczeniu ze zwierz ętami doświadczalnymi powinna wynosi ć 
22 °C (w przybli żeniu z tolerancj ą ± 3 °C). Wilgotno ść względna, poza 
okresem czyszczenia pomieszczenia, powinna wynosi ć co najmniej 30 % 
i nie przekracza ć 70 %. Wilgotno ść względną należy docelowo utrzymywa ć 
w granicach 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu 
dziennym 12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. 
20. Nale ży zapewni ć paszę laboratoryjn ą i wodę pitną ad libitum.  Młode 
dorosłe zwierz ęta mogą być trzymane pojedynczo lub umieszczane 
w klatkach w grupach o liczebno ści nieprzekraczaj ącej trzech zwierz ąt. 
Z uwagi na m łody wiek niedojrza łych zwierz ąt zaleca si ę trzymanie ich 
w grupach spo łecznych.  
21. Stwierdzono, że wysoka zawarto ść fitoestrogenów w paszach laboratoryj ­
nych zwiększa masę macicy u gryzoni w stopniu wystarczaj ącym, by zak łó­
cało to wyniki biologicznego testu wzrostu macicy (13)(14)(15). Wysokie 
poziomy fitoestrogenów i metabolizowalnej energii w paszach laboratoryj ­
nych mog ą powodowa ć także wczesne dojrzewanie p łciowe w przypadkach, 
w których wykorzystuje si ę zwierzęta niedojrza łe. Obecno ść fitoestrogenów 
wynika przede wszystkim z dodawania wyrobów z soi i lucerny do pasz laboratoryjnych, a do tego wykazano, że partie standardowych pasz labo ­
ratoryjnych ró żnią się między sobą pod wzgl ędem stężenia fitoestrogenów 
(23). Istotn ą zmienną jest masa cia ła, poniewa ż ilość spożywanego pokarmu 
ma związek z mas ą ciała. W zwi ązku z tym rzeczywista dawka spo żywa­
nych fitoestrogenów z tej samej paszy mo że różnić się między gatunkami 
i w zależności od wieku (9). W przypadku niedojrza ł
ych samic szczurów 
spożycie pokarmu okre ślane na podstawie masy cia ła może być prawie dwa 
razy większe niż w przypadku m łodych doros łych samic poddanych 
owariektomii. W przypadku m łodych doros łych samic myszy spo życie 
pokarmu okre ślane na podstawie masy cia ła może być prawie cztery razy 
większe niż w przypadku m łodych doros łych samic szczurów poddanych 
owariektomii.  
22. Wyniki biologicznego testu wzrostu macicy (9)(17)(18)(19) wykazuj ą 
jednak, że ograniczone ilo ści fitoestrogenów w paszy s ą dopuszczalne 
i nie powoduj ą obniżenia czułości testu biologicznego. Orientacyjnie zawar ­
tość fitoestrogenów nie powinna przekracza ć 350 μg odpowiedników genis ­
teiny/gram paszy laboratoryjnej w przypadku niedojrza łych samic szczurów 
szczepów Sprague Dawley i Wistar (6)(9). Takie pasze powinny tak że mieć 
zastosowanie w przypadku badania m łodych doros łych szczurów 
poddanych owariektomii, poniewa ż spożycie pokarmu w stosunku do 
masy cia ła jest ni ższe w przypadku m łodych doros łych zwierz ąt niż 
w przypadku zwierz ąt niedojrza łych. Jeżeli planuje si ę wykorzystanie 
myszy poddanych owariektomii lub szczurów o zwi ększonej wra żliwości 
na fitoestrogeny, nale ży rozważyć proporcjonalne obni żenie zawarto ści 
fitoestrogenów w paszy (20). Ponadto ró żnice w metabolizowalnej energii 
dostępnej w ró żnych paszach mog ą prowadzi ć do zmian czasowych 
w osiąganiu dojrza łości płciowej (21)(22).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 819
 
23. Przed przeprowadzeniem badania wymagany jest ostro żny wybór paszy 
niezawieraj ącej podwy ższonego poziomu fitoestrogenów (aby uzyska ć 
wytyczne zob. (6)(9)) lub metabolizowalnej energii, które mog ą zakłócić 
wyniki (15)(17)(19)(22)(36). Zapewnienie w łaściwej wydajno ści systemu 
badań wykorzystywanego przez laboratorium, zgodnie z punktem 26 i 27, 
jest istotnym elementem sprawdzaj ącym oba te czynniki. W ramach zabez ­
pieczenia zgodnie z dobr ą praktyką laboratoryjn ą (DPL) nale ży pobrać 
reprezentatywn ą próbkę spośród każdej serii paszy podawanej w trakcie 
badania w celu przeprowadzenia ewentualnej analizy zawarto ści fitoestro ­
genów (np. w przypadku wysokiej masy macicy osobników kontrolnych 
w stosunku do historycznych danych dotycz ących osobników kontrolnych 
lub w przypadku wyst ąpienia nieodpowiedniej reakcji na estrogen referen ­
cyjny, tj. etynyloestradiol 17-alfa). Nale ży przeprowadzi ć analizę podwielo ­
krotności próbek w trakcie badania lub po zamro żeniu w temperaturze – 
20 °C, bądź też w sposób pozwalaj ący na zapobie żenie rozk ładowi próbki 
przed poddaniem jej analizie.  
24. Niektóre materia ły ściółkowe mog ą zawiera ć naturalnie wyst ępujące 
chemiczne substancje estrogenowe lub antyestrogenowe (np. wiadomo, że 
kolba kukurydzy wp ływa na cykliczno ść u szczurów i wydaje si ę mieć 
działanie antyestrogenne). Wybrany materia ł ściółkowy powinien zawiera ć 
możliwie jak najni ższy poziom fitoestrogenów.  
Przygotowanie zwierz ąt 
25. Zwierz ęta doświadczalne niewykazuj ące żadnych oznak choroby lub wad 
fizycznych s ą losowo przydzielane do grup kontrolnych i grup badanych. 
Klatki powinny by ć ustawione w taki sposób, żeby zminimalizowa ć 
możliwy wpływ położenia klatki. Zwierz ęta należy identyfikowa ć pojedyn­
czo. Preferuje si ę, aby niedojrza łe zwierzęta trzymane by ły w klatkach 
z matkami lub matkami zast ępczymi do momentu odsadzenia podczas akli ­
matyzacji. Okres aklimatyzacji przed rozpocz ęciem badania powinien trwa ć 
około 5 dni w odniesieniu do m łodych doros łych zwierz ąt i zwierz ąt niedo­
jrzałych trzymanych z matkami lub matkami zast ępczymi. W przypadkach, 
w których niedojrza łe zwierzęta dostarczono jako m łode odsadzone bez 
matek, konieczne mo że być zastosowanie krótszego czasu trwania okresu 
aklimatyzacji, poniewa ż dawkowanie nale ży rozpocz ąć natychmiast po 
odsadzeniu (zob. pkt 29).  
PROCEDURA  
Weryfikacja bieg łości laboratorium  
26. W celu dokonania weryfikacji bieg łości laboratorium mo żna zastosowa ć 
następujące dwa warianty:  
— weryfikacj ę okresow ą, polegając na wst ępnym badaniu pocz ątkowym 
dodatniej kontroli (zob. punkt 27). Co najmniej raz na 6 miesi ęcy 
i za każdym razem, gdy wyka że się zmianę mogącą mieć wpływ na 
wydajność testu (np. w przypadku nowej postaci paszy, zmiany pracow ­
ników przeprowadzaj ących sekcje, zmiany szczepu zwierz ąt lub 
dostawcy itd.), zdolno ść reakcji systemu bada ń (modelu zwierz ęcego) 
powinna by ć weryfikowana przy u życiu odpowiedniej dawki (w oparciu 
o badanie pocz ątkowe dodatniej kontrolni omówione w pkt 27) estro ­
genu referencyjnego, tj. etynyloestradiolu 17-alfa (nr CAS 57-63- 
6) (EE),  
— zastosowanie równoleg łych kontroli poprzez w łączenie grupy, w której 
podano odpowiedni ą dawkę estrogenu referencyjnego w ka żdym teście. 
Jeżeli system nie wyka że oczekiwanej reakcji, nale ży zbadać warunki 
doświadczalne i w odpowiedni sposób je zmodyfikowa ć. Zaleca si ę, aby 
stosowana dawka estrogenu referencyjnego w przypadku obu wariantów 
wynosiła około ED70–80.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Początkowe badanie kontroli dodatniej  — zanim w laboratorium po raz 
pierwszy przeprowadzi si ę badanie w ramach tej metody badawczej, nale ży 
wykazać biegłość laboratorium poprzez zbadanie zdolno ści do reakcji 
modelu zwierz ęcego w drodze ustalenia reakcji na dawk ę estrogenu refe ­
rencyjnego: etynyloestradiolu 17-alfa (nr CAS 57-63-6) (EE), stosuj ąc co 
najmniej cztery dawki. Reakcja dotycz ąca masy macicy zostanie porównana 
z określonymi danymi historycznymi (zob. pozycja bibliografii nr (5)). 
W przypadku gdy powy ższe początkowe badanie kontroli dodatniej nie 
przyniesie oczekiwanych wyników, nale ży zbadać warunki do świadczalne 
i je zmodyfikowa ć. 
Liczba i stan zwierz ąt 
28. Każda badana i kontrolna grupa powinna zawiera ć co najmniej 6 zwierz ąt 
(zarówno w odniesieniu do protoko łu metody badania osobników niedojrza ­ 
łych, jak i doros łych osobników poddanych owariektomii).  
Wiek niedojrza łych zwierz ąt 
29. W przypadku biologicznego testu wzrostu macicy przeprowadzanego na 
niedojrzałych zwierz ętach nale ży dokładnie okre ślić dzień ich narodzin. 
Dawkowanie nale ży rozpocz ąć wystarczaj ąco wcześnie celem zapewnienia, 
by na zako ńczenie podawania badanej substancji chemicznej nie wyst ąpił 
jeszcze fizjologiczny wzrost endogennych estrogenów towarzysz ących 
dojrzałości płciowej. Istniej ą natomiast dowody wskazuj ące na fakt, że 
młode zwierz ęta mogą być mniej wra żliwe. W celu okre ślenia optymalnego 
wieku każde laboratorium powinno wzi ąć pod uwag ę swoje w łasne podsta ­
wowe dane dotycz ące dojrza łości. 
Jako ogólna wytyczna dawkowanie u szczurów mo żna rozpocz ąć natych­
miast po wczesnym odsadzeniu w dniu 18 po urodzeniu (przy czym dniem narodzin jest dzie ń 0). Preferowanym dniem zako ńczenia dawkowania 
u szczurów jest dzie ń 21 po urodzeniu, jednak w ka żdym przypadku 
dawkowanie nale ży zakończyć przed dniem 25 po urodzeniu, poniewa ż 
po przekroczeniu tego wieku o ś podwzgórze-przysadka-jajnik staje si ę funk­
cjonalna oraz mo że nastąpić wzrost poziomu endogennego estrogenu, a co 
za tym idzie wzrost podstawowych średnich mas macic i wzrost 
w grupowych odchyleniach standardowych (2)(3)(10)(11)(12).
 
Procedura wyci ęcia jajników  
30. W przypadku samic szczurów i myszy poddanych owariektomii (w grupie 
badanej i kontrolnej), owariektomia powinna by ć wykonana w 6–8 
tygodniu życia. W przypadku szczurów od momentu przeprowadzenia 
owariektomii do pierwszego dnia dawkowania powinno up łynąć co 
najmniej 14 dni, aby umo żliwić regres macicy do minimalnego, stabilnego 
poziomu podstawowego. W przypadku myszy od momentu przeprowa ­
dzenia owariektomii do pierwszego dnia dawkowania powinno up łynąć 
co najmniej 7 dni. Poniewa ż wystarczaj ą niewielkie ilo ści tkanki jajnikowej, 
aby wytwarza ć znaczne st ężenia estrogenów (3), przed ich wykorzystaniem 
należy poddać zwierzęta badaniu polegaj ącym na obserwacji komórek 
nabłonkowych pobieranych z pochwy przez co najmniej pi ęć kolejnych 
dni (np. w dniach 10–14 po przeprowadzeniu owariektomii w przypadku szczurów). Je żeli u zwierz ąt występują jakiekolwiek oznaki wej ścia w cykl 
owulacyjny, nie powinno si ę ich wykorzystywa ć do bada ń. Ponadto 
w trakcie sekcji nale ży zbadać pozostałości jajnikowe w celu uzyskania 
dowodów wskazuj ących na obecno ść tkanki jajnikowej. W przypadku 
wykrycia obecno ści tkanki jajnikowej zwierz ęcia nie nale ży uwzględniać 
w obliczeniach (3).
 
31. Zabieg owariektomii rozpoczyna si ę po odpowiednim znieczuleniu zwie ­
rzęcia i ułożeniu go w pozycji le żącej na brzuchu. Naci ęcie otwieraj ące 
grzbietowo-boczn ą ścianę brzucha powinno by ć wykonane na d ługości 
około 1 cm w środkowym punkcie mi ędzy doln ą granicą żeber 
a grzebieniem biodrowym oraz kilka milimetrów w kierunku poprzecznym do bocznej granicy mi ęśnia lędźwiowego. Nale ży usunąć jajnik z jamy 
brzusznej i przenie ść go do aseptycznego pojemnika. Jajnik nale ży odciąć 
na połączeniu jajowodu z trzonem macicy. Po stwierdzeniu, że nie 
wystąpiło znaczne krwawienie, nale ży zamkn ąć ścianę brzucha poprzez 
założenie szwu oraz zamkn ąć skórę klipsami lub u żyć odpowiedniego 
szwu. Punkty podwi ązania przedstawiono schematycznie na rys 1. Zgodnie 
z zaleceniem lekarza weterynarii posiadaj ącego doświadczenie w opiece nad 
gryzoniami nale ży zastosowa ć pooperacyjn ą analgezję. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 821
 
Masa cia ła 
32. W przypadku metody badania poddanych owariektomii osobników doro ­
słych masa cia ła i masa macicy nie s ą ze sobą skorelowane, poniewa ż na 
masę macicy wp ływ mają hormony, takie jak estrogeny, a nie czynniki 
wzrostowe reguluj ące masę ciała. Natomiast masa cia ła jest powi ązana 
z masą macicy w modelu badania niedojrza łych osobników w trakcie 
dojrzewania (34). Zatem na pocz ątku badania zró żnicowanie mas cia ła 
u zwierz ąt wykorzystywanych w tym badaniu, w przypadku modelu 
badania niedojrza łych osobników, powinno by ć jak najmniejsze i nie 
powinno przekracza ć ± 20 % średniej masy. Oznacza to, że liczebno ść 
miotu powinna by ć znormalizowana przez hodowc ę, aby potomstwo 
różnych matek by ło karmione mniej wi ęcej w takich samych ilo ściach. 
Zwierzęta należy przydzieli ć do grup (kontrolnych i badanych), stosuj ąc 
losowy rozk ład mas, aby średnia masa cia ła w każdej grupie nie ró żniła 
się statystycznie od średnich innych grup. Nale ży wziąć pod uwag ę 
konieczno ść unikania w miar ę możliwości umieszczania m łodych 
z jednego miotu w tej samej grupie badanej, bez potrzeby zwi ększania 
liczby miotów wykorzystywanych do celów badania.  
Dawkowanie  
33. W celu ustalenia, czy badana substancja chemiczna mo że mieć działanie 
estrogenne  in vivo,  zazwyczaj wystarcz ą dwie grupy dawkowania i jedna 
grupa kontrolna i takie rozwi ązanie jest w zwi ązku z tym preferowane ze 
względu na dobrostan zwierz ąt. Jeżeli celem jest uzyskanie krzywej 
dawka-efekt lub ekstrapolacja do mniejszych dawek, potrzebne s ą co 
najmniej 3 grupy dawkowania. Je żeli wymagane s ą informacje wykra ­
czające poza identyfikacj ę aktywno ści estrogennej (takie jak szacunki 
dotyczące aktywno ści), należy rozważyć zastosowanie innego schematu 
dawkowania. Z wyj ątkiem podawania badanej substancji chemicznej, zwie ­
rzęta w grupie kontrolnej nale ży traktowa ć w identyczny sposób jak zwie ­
rzęta w grupie badanej. Je żeli przy podawaniu badanej substancji 
chemicznej jest stosowany no śnik, grupa kontrolna powinna otrzyma ć 
taką samą ilość nośnika, jakiej u żywa się w przypadku badanych grup 
(lub najwi ększą objętość nośnika, jak ą użyto w przypadku badanych 
grup, jeżeli różni się ona między grupami).  
34. W przypadku biologicznego testu wzrostu macicy celem jest dokonanie 
wyboru dawek, które zapewniaj ą przeżycie zwierz ąt i które nie maj ą istot­
nego dzia łania toksycznego lub nie powoduj ą stresu u zwierz ąt po upływie 
trzech kolejnych dni podawania badanej substancji chemicznej w dawce 
nieprzekraczaj ącej 1 000 mg/kg/dzie ń. Wszystkie dawki nale ży proponowa ć 
i dobiera ć z uwzgl ędnieniem wszelkich istniej ących danych dotycz ących 
toksyczno ści i danych (toksyko)kinetycznych dost ępnych w odniesieniu 
do badanej substancji chemicznej lub powi ązanych materia łów. 
W przypadku najwy ższej dawki nale ży najpierw uwzgl ędnić medialn ą 
dawkę śmiertelną (LD50) lub dane dotycz ące ostrej toksyczno ści w celu 
uniknięcia śmierci, dotkliwego cierpienia i stresu zwierz ąt (24)(25)(26). 
Najwyższa dawka powinna odpowiada ć maksymalnej tolerowanej 
dawce (MTD); badanie przeprowadzone z zastosowaniem dawki, która 
wywołała dodatni ą reakcję wzrostu macicy, tak że byłoby dopuszczalne. 
W odniesieniu do bada ń przesiewowych zasadniczo dopuszczalne s ą duże 
odstępy pomiędzy kolejnym dawkowaniem (np. 0,5 jednostek logarytmicz ­
nych odpowiadaj ących progresji dawki w wysoko ści 3,2 lub nawet do 1 
jednostki logarytmicznej). W przypadku braku dost ępności odpowiednich 
danych mo żna przeprowadzi ć badanie ustalaj ące zakres dawkowania, aby 
wspomóc okre ślenie stosowanych dawek.  
35. Ewentualnie, je żeli aktywno ść estrogenn ą agonisty mo żna oszacowa ć na 
podstawie danych  in vitro  (lub  in silico ), dane te mo żna uwzgl ędnić przy 
doborze dawek. Przyk ładowo ilo ść badanej substancji chemicznej, która 
powodowa łaby reakcje wzrostu macicy równowa żne reakcji na agonist ę 
odniesienia (etynyloestradiol), szacuje si ę na podstawie jej wzgl ędnego 
oddziaływania  in vitro  na etynyloestradiol. Najwy ższą dawkę badania otrzy ­
mano by poprzez pomno żenie tej analogicznej dawki przez odpowiedni 
współczynnik, np. 10 lub 100.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 822
 
Uwagi dotycz ące ustalania zakresu dawkowania  
36. W razie potrzeby mo żna przeprowadzi ć badanie ustalaj ące zakres dawko ­
wania z wykorzystaniem kilku zwierz ąt. Pod tym wzgl ędem można zasto­
sować wytyczn ą OECD nr 19 (25), w której przedstawiono objawy 
kliniczne wskazuj ące na dzia łanie toksyczne lub stres u zwierz ąt. Jeżeli 
w ramach tego badania ustalaj ącego zakres dawkowania po trzech dniach 
podawania jest to wykonalne, macice mog ą zostać wycięte i zważone po 
upływie oko ło 24 godzin od ostatniej dawki. Dane te mog ą następnie zosta ć 
wykorzystane, aby wspomóc g łówny projekt badania (wybór dopuszczalnej 
dawki maksymalnej i dopuszczalnych ni ższych dawek oraz zalecenie liczby 
grup dawkowania).  
Podawanie dawek  
37. Badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę drogą doustną przez sond ę lub 
przez podskórne wstrzykni ęcie. Podczas dokonywania wyboru drogi poda ­
wania nale ży brać pod uwag ę względy dotycz ące dobrostanu zwierz ąt oraz 
aspekty toksykologiczne, takie jak zwi ązek z drog ą narażenia na substancj ę 
chemiczn ą u ludzi (np. drog ą doustną przez sond ę jako odpowiednik 
spożycia substancji, podskórne wstrzykni ęcie jako odpowiednik inhalacji 
lub wchłaniania przez skór ę), właściwości fizykochemiczne badanego mate ­
riału, a w szczególno ści istniej ące informacje toksykologiczne i dane 
dotyczące metabolizmu i kinetyki (np. konieczno ść unikania efektu pierw ­
szego przej ścia, zwiększona efektywno ść na skutek podania substancji 
określoną drogą). 
38. Zaleca si ę, o ile jest to mo żliwe, rozwa żenie użycia w pierwszej kolejno ści 
roztworu wodnego/zawiesiny wodnej. Poniewa ż jednak wi ększość ligandów 
estrogenów lub ich metabolicznych prekursorów najcz ęściej wykazuje w łaści­
wości hydrofobowe, powszechnie stosowanym podej ściem jest zastosowanie 
roztworu/zawiesiny w oleju (np. kukurydzianym, z orzechów arachidowych, sezamowym lub w oliwie z oliwek). Oleje te charakteryzuj ą się jednak 
różnymi warto ściami energetycznymi i zawarto ściami tłuszczu, w zwi ązku 
z czym no śnik może mieć wpływ na pobranie ca łkowitej metabolizowalnej 
energii (ME), potencjalnie zmieniaj ąc przez to mierzone punkty ko ńcowe, 
takie jak masa macicy, w szczególno ści w przypadku zastosowania metody 
badania niedojrza łych osobników (33). W zwi ązku z tym przed rozpocz ęciem 
badania ka żdy nośnik, który ma by ć użyty, powinien zosta ć przebadany na 
grupie kontrolnej bez no śników. Badane substancje chemiczne mo żna 
rozpuścić w minimalnej ilo ści 95-procentowego etanolu lub w innych odpo ­
wiednich rozpuszczalnikach i rozcie ńczy
ć w badanym no śniku do uzyskania 
końcowych roboczych st ężeń. Należy znać właściwości toksyczne rozpusz ­
czalnika i zbada ć je na oddzielnej grupie kontrolnej, w której zastosowano 
wyłącznie rozpuszczalnik. Je żeli badana substancja chemiczna zostanie 
uznana za stabiln ą, można zastosowa ć delikatne podgrzewanie i energiczne 
mechaniczne mieszanie w celu łatwiejszego rozpuszczenia badanej substancji 
chemicznej. Nale ży oznaczy ć stabilno ść badanej substancji chemicznej 
w nośniku. Jeżeli badana substancja chemiczna jest stabilna przez ca ły 
okres trwania badania, mo żna wtedy przygotowa ć jedną początkową podwie­
lokrotność badanej substancji chemicznej, a okre ślone rozcie ńczenia dawek 
można przygotowywa ć na bieżąco codziennie.  
39. Częstotliwość dawkowania b ędzie uzale żniona od wykorzystanego modelu 
(aby uzyska ć informacje na temat modelu niedojrza łych osobników, zob. 
pkt 29 i pkt 30, aby uzyska ć informacje na temat modelu osobników 
poddanych owariektomii). Niedojrza łym samicom szczurów podaje si ę 
badaną substancj ę chemiczn ą codziennie przez trzy kolejne dni. Trzydniowy 
okres podawania zaleca si ę także w przypadku samic szczurów poddanych 
owariektomii, ale dopuszcza si ę dłuższe okresy nara żenia, co mo że ułatwić 
wykrywanie substancji chemicznych charakteryzuj ących się słabą aktyw­
nością. W przypadku samic myszy poddanych owariektomii 3-dniowy 
okres podawania powinien by ć wystarczaj ący i przed łużenie tego okresu do 
siedmiu dni nie przyniesie żadnej istotnej korzy ści w przypadku silnych 
agonistów estrogenów, jednak że nie wykazano takiego zwi ązku 
w odniesieniu do s łabych estrogenów w badaniu walidacyjnym (16), zatem 
dawkowanie nale ży wydłużyć do 7 kolejnych dni w przypadku doros łych 
myszy poddanych owariektomii.Dawk ę należy podawa ć każdego dnia 
o takiej samej porze. W razie potrzeby dawki nale ży skorygowa ć, aby 
utrzymać stały poziom dawki w stosunku do masy cia ła zwierzęcia (np. 
jeden mg badanej substancji chemicznej na kilogram masy cia ła na dob ę). 
Biorąc pod uwag ę objętość stosowan ą w badaniu w stosunku do masy cia ła, 
należy ograniczy ć do minimum jej zmienno ść, dostosowuj ąc stężenie 
roztworu dozuj ącego w celu zapewnienia sta łej objętości w stosunku do 
masy ciała w odniesieniu do wszystkich dawek i do ka żdej drogi podawania.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 823
 
40. W przypadkach, w których badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę przez 
sondę, należy to robić, podając zwierzętom pojedyncz ą dawkę dobową przy 
użyciu sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksy ­
malna obj ętość płynu, jaką można podać jednorazowo, zale ży od wielko ści 
badanego zwierz ęcia. Nale ży przestrzega ć lokalnych wytycznych dotycz ­ 
ących opieki nad zwierz ętami, jednak przedmiotowa obj ętość nie powinna 
przekroczy ć 5 ml/kg masy cia ła, z wyj ątkiem roztworów wodnych, 
w przypadku których mo żna stosowa ć objętość wynosz ącą 10 ml/kg 
masy ciała. 
41. Jeżeli badana substancja chemiczna podawana jest drog ą wstrzykni ęcia 
podskórnego, nale ży to robi ć, stosując pojedyncz ą dawkę dobową. Dawki 
należy podawa ć w okolice łopatki na grzbiecie lub w okolice l ędźwi przy 
użyciu sterylnej ig ły (np. o rozmiarze 23 lub 25 G) lub strzykawki tuber ­
kulinowej. Golenie miejsca wstrzykni ęcia nie jest obowi ązkowe. Nale ży 
odnotowa ć wszelkie straty, wycieki w miejscu wstrzykni ęcia lub przypadki 
niepełnego podania dawki. Łączna objętość wstrzykiwana jednemu szczu ­
rowi w ci ągu doby nie powinna przekracza ć 5 ml/kg masy cia ła, rozdzie ­
lona na 2 miejsca wstrzykni ęcia, z wyj ątkiem roztworów wodnych, 
w przypadku których mo żna stosowa ć objętość wynosz ącą 10 ml/kg 
masy ciała. 
Obserwacje  
Obserwacje ogólne i kliniczne  
42. Ogólne obserwacje kliniczne nale ży przeprowadza ć przynajmniej raz dzien ­
nie, a w przypadku zaobserwowania oznak toksyczno ści ze zwi ększoną 
częstotliwością. Najlepiej jest prowadzi ć obserwacje o tych samych godzi ­
nach doby z uwzgl ędnieniem okresu oczekiwanych skutków szczytowych 
po dawkowaniu. Nale ży prowadzi ć obserwacje zwierz ąt pod kątem śmier­
telności, zachorowalno ści i ogólnych objawów klinicznych, takich jak 
zmiany w zachowaniu, skórze, sier ści, oczach, b łonach śluzowych, wyst ę­
powanie wydzielin i wydalin oraz aktywno ść autonomicznej cz ęści układu 
nerwowego (np. łzawienie, piloreksja, rozmiar źrenic, nietypowy rytm 
oddychania).  
Masa cia ła i spożycie pokarmu  
43. Wszystkie zwierz ęta należy codziennie wa żyć z dokładnością do 0,1 g, 
zaczynając tuż przed rozpocz ęciem dawkowania, tj. w momencie przydzie ­
lania zwierz ąt do grup. Nieobowi ązkowo mo żna mierzy ć ilości spożywa­
nego pokarmu przypadaj ące na każdą klatkę w trakcie okresu dawkowania, 
ważąc w tym celu karmniki. Wyniki dotycz ące spożycia pokarmu nale ży 
wyrażać w gramach na szczura na dob ę. 
Sekcja i pomiar masy macicy  
44. Szczury zostan ą uśmiercone w sposób humanitarny po up ływie 24 godzin 
od ostatniej dawki. Najlepiej jest dokonywa ć sekcji na losowo wybranych 
zwierzętach z grup w celu unikni ęcia progresji rosn ącej lub malej ącej 
w ramach grup dawkowania, co mog łoby nieznacznie wp łynąć na dane. 
Celem testu biologicznego jest dokonanie pomiaru masy zarówno mokrej, 
jak i osuszonej macicy. Mokra masa obejmuje macic ę i zawarto ść płynu 
w świetle macicy. Pomiaru suchej masy dokonuje si ę po wydobyciu 
i usunięciu płynu w świetle macicy.  
45. W przypadku niedojrza łych zwierz ąt przed przeprowadzeniem sekcji bada 
się pochwę pod kątem jej otwarcia. Sekcj ę rozpoczyna si ę od otwarcia 
ściany brzucha, zaczynaj ąc od spojenia łonowego. Nast ępie z grzbietowej 
ściany brzucha usuwa si ę róg macicy i jajniki, je żeli są obecne. P ęcherz 
moczowy i moczowody usuwane s ą z brzusznej i bocznej cz ęści macicy 
i pochwy. Nast ępnie odłącza się zrost w łóknisty mi ędzy odbytnic ą 
a pochwą do momentu, w którym mo żna zidentyfikowa ć miejsce z łączenia 
ujścia pochwy i skóry krocza. Macic ę i pochwę odłącza się od ciała poprzez 
wykonanie naci ęcia ściany pochwy tu ż nad miejscem z łączenia uj ścia ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 824
 
pochwy i skóry krocza, jak przedstawiono na rys 2. Macic ę należy odłączyć 
od ściany ciała, delikatnie przecinaj ąc krezki macicy w punkcie jej z łączenia 
wzdłuż całej długości grzbietowo-bocznej cz ęści każdego rogu macicy. Po 
usunięciu macicy z cia ła należy wystarczaj ąco szybko j ą zbadać, aby 
uniknąć osuszenia tkanek. Utrata wagi wynikaj ąca z osuszenia jest istot ­
niejsza w przypadku ma łych tkanek, takich jak tkanki macicy (23). Je żeli 
jajniki są obecne, usuwa si ę je przy jajowodzie, unikaj ąc wypłynięcia płynu 
ze światła rogu macicy. W przypadku gdy zwierz ęta poddano owariektomii, 
należy zbadać pozosta łości pod k ątem obecno ści tkanki jajnikowej. 
Nadmiar t łuszczu i tkanki łącznej nale ży usunąć. Pochwę usuwa si ę 
z macicy tu ż pod szyjk ą, tak aby pozostawi ć szyjkę wraz z trzonem macicy, 
jak przedstawiono na rys. 2.  
46. Każdą macicę należy umieścić w indywidualnie oznakowanym i zwa żonym 
pojemniku (np. w szalce Petriego lub szalce wagowej z tworzywa sztucz ­
nego), kontynuuj ąc działania zapobiegaj ące osuszeniu przed wa żeniem (np. 
w pojemniku mo żna umieścić bibułę filtracyjn ą delikatnie zwil żoną solą 
fizjologiczn ą). Macic ę z płynem w świetle macicy wa ży się 
z dokładnością do 0,1 mg (mokra masa macicy).  
47. Nast ępnie każdą macicę przetwarza si ę oddzielnie w celu usuni ęcia płynu. 
Oba rogi macicy nak łuwa się lub nacina pod łużnie. Macic ę umieszcza si ę 
na lekko zwil żonej bibule filtracyjnej (np. Whatman nr 3) i przyciska si ę 
drugim kawa łkiem lekko zwil żonej bibu ły filtracyjnej celem ca łkowitego 
usunięcia płynu. Macic ę bez zawarto ści płynu w świetle wa ży się 
z dokładnością do 0,1 mg (sucha masa macicy).  
48. Można wykorzysta ć masę macicy, jak ą ustalono na koniec badania, aby 
zapewnić, że nie zosta ł przekroczony odpowiedni wiek niedojrza łych nieba ­
danych szczurów, jednak że w tej kwestii decyduj ące znaczenie maj ą dane 
historyczne dotycz ące szczepu szczurów wykorzystanego przez laborato ­
rium (aby uzyska ć szczegóły na temat interpretacji wyników, zob. pkt 56).  
Badania nieobowi ązkowe  
49. Po zwa żeniu macic ę można utrwali ć w 10-procentowej oboj ętnej, zbuforo ­
wanej formalinie w celu przeprowadzenia badania histopatologicznego po zabarwieniu hematoksylin ą i eozyn ą. Należy w podobny sposób zbada ć 
pochwę (zob. pkt 9). Dodatkowo do celów porównania ilo ściowego 
można dokona ć pomiaru morfometrycznego nab łonka błony śluzowej 
macicy.
 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
50. Dane uzyskane w ramach badania powinny obejmowa ć: 
— liczbę zwierząt na pocz ątku badania,  
— liczbę i tożsamość zwierząt, które ponios ły śmierć podczas badania lub 
które uśmiercono z przyczyn humanitarnych, oraz dat ę i czas ka żdej 
śmierci lub ka żdego humanitarnego u śmiercenia,  
— liczbę i tożsamość zwierząt wykazuj ących oznaki toksyczno ści oraz opis 
zaobserwowanych oznak toksyczno ści wraz z czasem ich wyst ąpienia, 
czasem trwania i stopniem dotkliwo ści każdego efektu toksycznego, 
oraz 
— liczbę i tożsamość zwierząt wykazuj ących jakiekolwiek zmiany patolo ­
giczne oraz opis rodzaju tych zmian.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Nale ży rejestrowa ć dane dotycz ące masy cia ła, mokrej masy macicy 
i suchej masy macicy poszczególnych zwierz ąt. Należy przeprowadzi ć 
jednostronne analizy statystyczne agonistów, aby okre ślić, czy wynikiem 
podawania badanej substancji chemicznej by ł istotny statystycznie (p 
< 0,05) wzrost masy macicy. Nale ży wykona ć odpowiednie analizy staty ­
styczne, aby zbada ć zmiany zwi ązane z dawkowaniem w przypadku suchej 
i mokrej masy macicy. Przyk ładowo oceny danych mo żna dokona ć, 
stosując analizę kowariancji (ANCOVA) z wykorzystaniem masy cia ła 
w momencie przeprowadzania sekcji jako zmiennej towarzysz ącej. Przed 
dokonaniem analizy danych mo żna przeprowadzi ć logarytmiczn ą transfor­
mację stabilizuj ącą wariancj ę z wykorzystaniem danych dotycz ących macic. 
Test Dunnetta i Hsu jest odpowiedni do przeprowadzania porówna ń 
w parach z ka żdej grupy dawkowania z grupami kontrolnymi no śnika 
oraz do obliczania przedzia łów ufności. W celu wykrycia ewentualnych 
wartości odstających i dokonania oceny jednorodno ści wariancji mo żna 
zastosowa ć wykres pozosta łości regresji. Powy ższe procedury zastosowano 
w programie walidacyjnym OECD, wykorzystuj ąc wersję 8 programu 
PROC GLM w środowisku SAS ( Statistical Analysis System ) (SAS Insti ­
tute, Cary, Karolina Pó łnocna) (6)(7).  
52. Sprawozdanie ko ńcowe musi zawiera ć następujące informacje:  
Placówka badawcza:  
— szczegó ły dotyczące odpowiedzialnych pracowników i ich obowi ązków 
w zakresie bada ń, 
— dane z pocz ątkowego badania kontroli dodatniej i okresowe dane 
dotyczące dodatniej grupy kontrolnej (zob. pkt 26 i 27).  
Badana substancja chemiczna:  
— cechy charakterystyczne badanej substancji chemicznej,  
— właściwości fizyczne i w stosownych przypadkach w łaściwości 
fizykochemiczne,  
— metody i cz ęstotliwości przygotowywania rozcie ńczeń, 
— wszelkie dane dotycz ące stabilno ści, 
— wszelkie analizy roztworów dozuj ących.  
Nośnik: 
— charakterystyka badanego no śnika (charakter, dostawca i partia),  
— uzasadnienie wyboru no śnika (jeśli jest inny ni ż woda).  
Badane zwierz ęta: 
— gatunek i szczep oraz uzasadnienie ich wyboru,  
— dostawca i okre ślony obiekt dostawcy,  
— wiek zwierz ąt w momencie dostarczenia i dzie ń narodzin,  
— w przypadku niedojrza łych zwierz ąt informacje, czy zosta ły dostarczone 
z matką lub matk ą zastępczą, i data odsadzenia,  
— szczegó ły dotyczące procedur aklimatyzacji zwierz ąt, 
— liczba zwierz ąt w każdej klatce,  
— szczegó ły i metody dotycz ące identyfikacji pojedynczych zwierz ąt 
i grup zwierz ąt. 
Warunki testu:  
— szczegó ły dotyczące procesu randomizacji (tj. stosowanej metody),  
— uzasadnienie wyboru dawki,  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— szczegó ły dotyczące postaci badanej substancji chemicznej, osi ąganych 
przez nią stężeń, stabilno ści i jednorodno ści, 
— szczegó ły dotycz ące podawania badanej substancji chemicznej 
i uzasadnienie wyboru drogi nara żenia,  
— szczegó ły dotyczące paszy (nazwa, rodzaj, dostawca, zawarto ść i, jeżeli 
są znane, poziomy fitoestrgenów),  
— źródło wody (np. woda wodoci ągowa lub woda filtrowana) i sposób jej 
doprowadzenia (przewodami z du żego pojemnika, w butelkach itp.),  
— ściółka (nazwa, rodzaj, dostawca, sk ład), 
— rejestr warunków w klatce, okresów o świetlania, temperatury 
w pomieszczeniu i wilgotno ści, czyszczenia pomieszczenia,  
— szczegó łowy opis sekcji i procedur wa żenia macic,  
— opis procedur statystycznych.  
Wyniki:  
Poszczególne zwierz ęta: 
— wszystkie masy cia ła poszczególnych zwierz ąt uzyskane w ramach 
codziennego wa żenia (od momentu przydzielenia zwierz ąt do grup do 
sekcji) (z dok ładnością do 0,1 g),  
— wiek ka żdego zwierz ęcia (w dniach, licz ąc dzień narodzin jako dzie ń 0) 
w momencie rozpocz ęcia podawania badanej substancji chemicznej,  
— data i czas podania ka żdej dawki,  
— obliczona podana obj ętość i dawka oraz obserwacje dotycz ące wszel­
kich strat zwi ązanych z dawkowaniem w trakcie podawania lub po 
podaniu,  
— codzienny rejestr stanu zwierz ęcia, w tym istotne objawy i obserwacje,  
— podejrzewana przyczyna śmierci (w przypadku gdy w trakcie badania 
zwierzę padnie lub b ędzie w stanie agonalnym),  
— data i czas humanitarnego u śmiercenia wraz z odst ępem czasowym od 
ostatniego podania dawki,  
— mokra masa macicy (z dok ładnością do 0,1 mg) i wszelkie przypadki 
zaobserwowania utraty p łynu w świetle macicy w trakcie sekcji 
i przygotowa ń do ważenia,  
— sucha masa macicy (z dok ładnością do 0,1 mg).  
Każda grupa zwierz ąt: 
— średnie masy cia ła poszczególnych zwierz ąt uzyskane w ramach 
codziennego wa żenia (z dok ładnością do 0,1 g) i odchylenia standar ­
dowe (od momentu przydzielenia zwierz ąt do grup do sekcji),  
— średnie masy wilgotnych macic i średnie masy osuszonych macic (z 
dokładnością do 0,1 mg) oraz odchylenia standardowe,  
— dzienne spo życie pokarmu, je żeli było mierzone (obliczane w gramach 
spożytego pokarmu na zwierz ę), ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— wyniki statystycznych analiz porównuj ących zarówno masy wilgotnych, 
jak i osuszonych macic badanych grup w stosunku do tych samych 
pomiarów przeprowadzonych w grupach kontrolnych no śnika,  
— wyniki statystycznych analiz porównuj ących całkowitą masę ciała 
i przyrost masy cia ła badanych grup w stosunku do tych samych 
pomiarów przeprowadzonych w grupach kontrolnych no śnika.  
53. Podsumowanie istotnych orientacyjnych faktów dotycz ących metody 
badawczej  
Szczury Myszy  
Zwierzęta 
Szczep Powszechnie wykorzystywany szczep gryzoni do świadczalnych 
Liczba zwierz ąt Co najmniej 6 zwierz ąt w każdej grupie dawkowania 
Liczba grup Co najmniej 2 grupy badane (aby uzyska ć wskazówki zob. pkt 
33) i ujemna grupa kontrolna 
Aby uzyska ć wskazówki dotycz ące dodatnich grup kontrolnych 
zob. pkt 26 i 27  
Warunki trzymania i żywienia  
Temperatura 
w pomieszczeniu dla 
zwierząt (w °C) 22 °C ± 3 °C 
Wilgotno ść względna 50–60 %, ale nie mniej ni ż 30 % ani wi ęcej 70 % 
Dobowy cykl o świetlenia 12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści 
Pasza i woda pitna Ad libitum 
Utrzymywanie zwierz ąt Pojedynczo lub w grupach o liczebno ści nieprzekraczaj ącej 
trzech zwierz ąt (zaleca si ę trzymanie niedojrza łych zwierz ąt 
w grupach spo łecznych) 
Pasza i ściółka Zaleca si ę wykorzystywanie pasz i ściółki zawieraj ących niskie 
poziomy fitoestrogenów  
Protokół 
Metoda Niedojrza łe zwierz ęta nie 
poddane owariektomii (metoda 
preferowana). 
Metoda bada ń dorosłych samic 
poddanych owariektomii Dorosłe samice poddane 
owariektomii 
Wiek niedojrza łych 
zwierząt w momencie 
rozpoczęcia dawkowania Najwcześniej w dniu 18 po 
urodzeniu. Nale ży zakończyć 
dawkowanie przed dniem 25 po urodzeniu Nie dotyczy zakresu bie żącej 
metody badawczej 
Wiek zwierz ęcia 
w momencie poddania go owariektomii 6–8 tygodni życia 
Wiek zwierz ąt poddanych 
owariektomii w momencie 
rozpoczęcia dawkowania Między przeprowadzeniem 
owariektomii a pierwszym 
dniem podawania powinno upłynąć co najmniej 14 dni Między przeprowadzeniem 
owariektomii a pierwszym 
dniem podawania powinno upłynąć co najmniej 7 dni 
Masa ciała Zmienno ść masy cia ła powinna by ć możliwie jak najmniejsza 
i nie powinna przekracza ć ± 20 % średniej masy cia ła
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Szczury Myszy  
Dawkowanie  
Droga podawania Przez sond ę drogą doustną lub przez podskórne wstrzykni ęcie 
Częstotliwość podawania Jedna dawka dziennie 
Objętość dawki poda ­
wanej przez sond ę lub 
przez wstrzykni ęcie ≤ 5 ml/kg masy cia ła (lub maksymalnie 10 ml/kg masy cia ła 
w przypadku roztworów wodnych) (podawane w 2 miejsca 
wstrzykni ęcia w przypadku podskórnej drogi podawania) 
Czas trwania dawkowania 3 kolejne dni w przypadku 
modelu badania niedojrza łych 
zwierząt. 
Co najmniej 3 kolejne dni 
w przypadku modelu badania 
zwierząt poddanych owariek ­
tomii 7 kolejnych dni w przypadku 
modelu badania zwierz ąt 
poddanych owariektomii 
Czas sekcji Po up ływie oko ło 24 godzin od podania ostatniej dawki  
Wyniki  
Reakcja dodatnia Istotny statystycznie wzrost średniej masy macicy (mokrej lub 
suchej) 
Estrogen referencyjny Etynyloestradiol 17- α 
WYTYCZNE DOTYCZ ĄCE INTERPRETACJI I ZATWIERDZENIA 
WYNIKÓW  
54. Wynik badania estrogenno ści należy na ogó ł uznać za dodatni, je żeli ma 
miejsce istotny statystycznie wzrost masy macicy (p< 0,05) przy wysokiej dawce w stosunku do grupy kontrolnej, w której zastosowano rozpuszczal ­
nik. Wynik dodatni jest dodatkowo potwierdzany przez wykazanie wiary ­
godnego biologicznie zwi ązku między dawk ą a skalą reakcji, maj ąc na 
uwadze fakt, że nakładające się na siebie dzia łania estrogenne 
i antyestrogenne badanej substancji chemicznej mog ą mieć wpływ na 
kształt krzywej dawka-odpowied ź.
 
55. Nale ży zachowa ć szczególn ą ostrożność, aby nie przekroczy ć maksymalnej 
tolerowanej dawki w celu umo żliwienia wiarygodnej interpretacji danych. 
W związku z tym nale ży dokonywa ć starannej oceny spadku masy cia ła, 
objawów klinicznych i pozosta łych ustale ń. 
56. Masy macic uzyskane w grupie kontrolnej no śnika są istotnymi czynnikami 
mającymi wpływ na zatwierdzenie danych wynikaj ących z biologicznego 
testu wzrostu macicy. Wysokie warto ści uzyskane w grupie kontrolnej 
mogą zaburzy ć zdolność reakcji w te ście biologicznym oraz zdolno ść 
wykrywania bardzo s łabych agonistów estrogenu. Przegl ądy literatury 
i dane otrzymane w trakcie walidacji biologicznego testu wzrostu macicy 
wskazują na spontaniczne przypadki wyst ępowania wysokich średnich 
w grupach kontrolnych, w szczególno ści w przypadku niedojrza łych 
zwierząt (2)(3)(6)(9). Poniewa ż masa macicy u niedojrza łych szczurów 
zależy od wielu zmiennych, takich jak szczep lub masa cia ła, nie mo żna 
określić ostatecznej górnej granicy masy macicy. Dla orientacji, je żeli suche 
masy macic u niedojrza łych szczurów w grupie kontrolnej wynosz ą 40–45 
mg, wyniki nale ży uznać za podejrzane, a uzyskanie mas macic przekra ­
czających 45 mg mo że prowadzi ć do konieczno ści powtórzenia badania. 
Powyższe należy jednak rozpatrywa ć w odniesieniu do ka żdego przypadku 
indywidualnie (3)(6)(8). W przypadku przeprowadzania bada ń na doros łych 
szczurach niepe łna owariektomia mo że skutkowa ć obecnością pozostałości 
tkanki jajnikowej, która mo że produkowa ć endogenny estrogen i opó źniać 
regresję masy macicy.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. Suche masy macic grupy kontrolnej no śnika, wynosz ące mniej ni ż 0,09 % 
masy ciała w przypadku niedojrza łych samic szczurów i mniej ni ż 0,04 % 
w przypadku m łodych doros łych samic poddanych owariektomii, wydaj ą 
się dawać dopuszczalne wyniki [zob. tabela 31 (2)]. Je żeli masy macic 
w grupie kontrolnej przekrocz ą powyższe poziomy, nale ży skontrolowa ć 
szereg ró żnych czynników, takich jak wiek zwierz ąt, poprawno ść wyko­
nania owariektomii, poziom fitoestrogenów w paszy itd. oraz nale ży 
zachować ostrożność, wykorzystuj ąc ujemny wynik (brak oznak aktywno ści 
estrogennej) testu.  
58. Nale ży zachowa ć dane historyczne dotycz ące grup kontrolnych no śnika 
w laboratorium. W laboratorium nale ży również zachowa ć dane historyczne 
dotyczące reakcji na dodatnie estrogeny referencyjne, takie jak etynyloes ­
tradiol 17-a. W laboratoriach mo żna także badać reakcje na znanych 
słabych agonistów estrogenów. Wszystkie powy ższe dane mog ą być porów­
nywane z dost ępnymi danymi (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8), aby zapewni ć odpo­
wiednią czułość metod stosowanych w laboratorium.  
59. W trakcie badania walidacyjnego OECD w przypadku suchych mas macic 
wykazano mniejsz ą zmienno ść niż w przypadku mokrej masy macic (6)(7). 
Istotna reakcja w przypadku któregokolwiek z powy ższych pomiarów wska ­
zywałaby na dodatni wynik aktywno ści estrogennej badanej substancji 
chemicznej.  
60. Reakcja wzrostu macicy nie jest wy łącznie pochodzenia estrogennego, 
jednak dodatni wynik biologicznego testu wzrostu macicy nale ży ogólnie 
interpretowa ć jako dowód wskazuj ący na potencja ł estrogenowy  in vivo  
i test powinien zazwyczaj prowadzi ć do podj ęcia działań mających na 
celu uzyskanie dalszych wyja śnień (zob. pkt 9 i „ramy koncepcyjne 
OECD w zakresie bada ń i oceny substancji zaburzaj ących funkcjonowanie 
układu hormonalnego” zawarte w dodatku 2).  
Rysunek 1  
Schemat przedstawiaj ący chirurgiczne usuwanie jajników
  
Zabieg rozpoczyna si ę od otwarcia grzbietowo-bocznej ściany brzucha 
w środkowym punkcie mi ędzy doln ą granicą żeber a grzebieniem biod ­
rowym oraz wykonania naci ęcia o długości kilku milimetrów w poprzek 
do bocznej granicy mi ęśnia lędźwiowego. Nale ży zlokalizowa ć jajniki 
w jamie brzusznej zwierz ęcia. Nast ępnie w aseptycznych warunkach 
fizycznie usuwa si ę jajniki z jamy brzusznej, podwi ązując miejsce mi ędzy 
jajnikiem a macic ą, aby zatamowa ć krwawienie, i dokonuje si ę odłączenia 
jajnika przez naci ęcie nad miejscem podwi ązania w miejscu z łączenia jajo ­
wodu i ka żdego rogu macicy. Po potwierdzeniu, że krwawienie nie nasila 
się, należy zamknąć ścianę brzucha przez za łożenie szwu oraz zamkn ąć 
skórę np. za pomoc ą klipsa lub szwu. Zwierz ęta powinny odzyska ć przy­
tomność oraz powinien nast ąpić regres masy macicy przynajmniej 14 dni 
przed ich wykorzystaniem.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Rysunek 2  
Usunięcie i przygotowanie tkanek macicy w celu pomiaru masy
  
Zabieg rozpoczyna si ę od otwarcia ściany brzucha od spojenia łonowego. 
Następie z tylnej ściany brzucha usuwa si ę każdy jajnik, je żeli są obecne, oraz 
róg macicy. P ęcherz moczowy i moczowody usuwa si ę z brzusznej i bocznej 
części macicy i pochwy. Nast ępnie oddziela si ę zrost włóknisty mi ędzy odbytnic ą 
a pochwą do momentu, w którym mo żna zidentyfikowa ć miejsce z łączenia ujścia 
pochwy i skóry krocza. Macic ę i pochw ę odłącza się od ciała przez wykonanie 
nacięcia ściany pochwy tu ż nad miejscem z łączenia ze skór ą krocza, jak przed ­
stawiono na powy ższym rysunku. Macic ę należy odłączyć od ściany ciała przez 
delikatne przeci ęcie krezki macicy w punkcie jej łączenia wzd łuż całej długości 
grzbietowo-bocznej cz ęści każdego rogu macicy. Po usuni ęciu macicy z cia ła 
należy usunąć nadmiar t łuszczu i tkanki łącznej. Je żeli jajniki s ą obecne, 
usuwa si ę je przy jajowodzie, unikaj ąc wypłynięcia płynu ze światła rogu 
macicy. W przypadku gdy zwierz ęta poddano owariektomii, nale ży zbadać 
pozostałości pod k ątem obecno ści tkanki jajnikowej. Pochw ę usuwa si ę 
z macicy tu ż pod szyjk ą, tak aby pozostawi ć szyjkę wraz z trzonem macicy, 
jak przedstawiono na powy ższym rysunku. Nast ępnie można zważyć macicę. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Dodatek 1  
DEFINICJE:  
Antyestrogenno ść oznacza zdolno ść substancji chemicznej do hamowania estra ­
diolu 17-beta w organizmach ssaków.  
Substancja chemiczna  oznacza substancj ę lub mieszanin ę. 
Dzień narodzin  oznacza dzie ń 0 po urodzeniu.  
Dawkowanie  jest terminem ogólnym obejmuj ącym dawk ę, częstotliwość i czas 
trwania dawkowania.  
Dawka  jest ilością podawanej badanej substancji chemicznej. W odniesieniu do 
biologicznego testu wzrostu macicy dawka wyra żana jest w jednostkach wago ­
wych badanej substancji chemicznej na jednostk ę masy cia ła badanego zwie ­
rzęcia doświadczalnego na dzie ń (np. mg/kg masy cia ła/dobę). 
Maksymalna tolerowana dawka (MTD)  jest najwy ższą ilością substancji 
chemicznej, która po wprowadzeniu do organizmu nie powoduje śmierci bada ­
nych zwierz ąt doświadczalnych (oznaczana jako LD  0 ) (IUPAC, 1993 r.).  
Estrogenno ść oznacza zdolno ść substancji chemicznej do dzia łania jak estradiol 
17-beta w organizmach ssaków.  
Dzień X po urodzeniu  oznacza X-ty dzie ń życia po dniu narodzin.  
Czułość oznacza odsetek wszystkich dodatnich/aktywnych substancji chemicz ­
nych prawid łowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dok ładności metody 
badawczej, która daje wyniki kategoryczne i stanowi parametr istotny do celów 
oceny przydatno ści metody badawczej.  
Swoistość oznacza odsetek wszystkich ujemnych/aktywnych substancji chemicz ­
nych prawid łowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dok ładności metody 
badawczej, która daje wyniki kategoryczne i stanowi parametr istotny do celów 
oceny przydatno ści metody badawczej.  
Badana substancja chemiczna  oznacza ka żdą substancj ę lub mieszanin ę, 
badaną za pomoc ą opisywanej metody badawczej.  
Wzrost macicy  jest pojęciem używanym do okre ślania dodatniego wp ływu na 
rozwój tkanek macicy.  
Walidacja  oznacza proces naukowy opracowany do okre ślania wymogów opera ­
cyjnych i ogranicze ń metody badawczej oraz do wykazywania jej wiarygodno ści 
i przydatno ści dla konkretnego celu.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Dodatek 2
  
VMG mamm: zespó ł zarządzania walidacj ą ds. bada ń i oceny ssaków
 UWAGI DO POWY ŻSZYCH RAM:  
Uwaga 1:  Istnieje mo żliwość rozpoczynania i rezygnacji na wszystkich 
poziomach i zale ży to od charakteru istniej ącego zapotrzebowania 
na informacje do celów oceny zagro żenia i ryzyka.  
Uwaga 2:  Na poziomie 5 w badaniach z zakresu ekotoksykologii nale ży 
zawrzeć punkty ko ńcowe, wskazuj ące mechanizmy niepo żądanych 
skutków i potencjalne szkody dla populacji.  
Uwaga 3:  W przypadku gdy model multimodalny obejmuje kilka testów 
pojedynczych punktów ko ńcowych, przedmiotowy model zast ąpi 
stosowanie tych testów pojedynczych punktów ko ńcowych.  
Uwaga 4:  Ocena ka żdej substancji chemicznej powinna opiera ć się na indy­
widualnych przypadkach, z uwzgl ędnieniem wszystkich dost ęp­
nych informacji, maj ąc na uwadze rol ę poziomów powy ższych 
ram koncepcyjnych.  
Uwaga 5:  Obecnienie nale ży traktowa ć powyższych ram koncepcyjnych jako 
wytycznych obejmuj ących wszystkie kwestie. Poziomy 3, 4 i 5 
obejmują testy, które s ą dostępne lub w odniesieniu do których 
trwa proces walidacji. W odniesieniu do tej ostatniej kwestii testy te zosta ły tymczasowo w łączone. Po ich opracowaniu 
i przeprowadzeniu walidacji zostan ą oficjalnie dodane do ram 
koncepcyjnych.
 
Uwaga 6:  Nie nale ży uznawa ć, że poziom 5 zawiera wy łącznie badania 
ostateczne. Uznaje si ę, że badania uwzgl ędnione na tym poziomie 
przyczyniaj ą się do ogólnej oceny zagro żenia i ryzyka.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
LITERATURA  
(1) OECD (1998), ‘Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force’, 10–11 marca 
1998 r., ENV/MC/CHEM/RA(98)5.  
(2) OECD (2003), ‘Detailed Background Review of the Uterotrophic 
Bioassay: Summary of the Available Literature in Support of the Project of the OECD Task Force on Endocrine Disrupters Testing and Assessment (EDTA) to Standardise and Validate the Uterotrophic 
Bioassay’,  OECD Environmental Health and Safety Publication Series 
on Testing and Assessment  nr 38, ENV/JM/MONO(2003)1.
 
(3) Owens, J.W., Ashby, J., (2002), ‘Critical Review and Evaluation of the 
Uterotrophic Bioassay for the Identification of Possible Estrogen Agonists and Antagonists: In Support of the Validation of the OECD Uterotrophic 
Protocols for the Laboratory Rodent’,  Crit. Rev. Toxicol. 32 , s. 445–520.
 
(4) OECD (2006), ‘OECD Report of the Initial Work Towards the Validation 
of the Rodent Uterotrophic Assay — Phase 1’,  OECD Environmental 
Health and Safety Publication Series on Testing and Assessment  nr 65, 
ENV/JM/MONO(2006)33.  
(5) Kanno, J., Onyon, L., Haseman, J., Fenner-Crisp, P., Ashby, J., Owens, 
W., (2001), ‘The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay 
to screen compounds for in vivo estrogenic responses: Phase 1’  Environ 
Health Perspect 109 , s. 785–94.  
(6) OECD (2006), ‘OECD Report of the Validation of the Rodent Uterot ­
rophic Bioassay: Phase 2 — Testing of Potent and Weak Oestrogen Agonists by Multiple Laboratories’,  OECD Environmental Health and 
Safety Publication Series on Testing and Assessment  nr 66, ENV/JM/MO ­
NO(2006)34.
 
(7) Kanno, J., Onyon, L., Peddada, S., Ashby, J., Jacob, E., Owens, W., 
(2003), ‘The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dose Response Studies’,  Environ. Health Persp. 111 , s. 
1530–1549.
 
(8) Kanno, J., Onyon, L., Peddada, S., Ashby, J., Jacob, E., Owens, W., 
(2003), ‘The OECD program to validate the rat uterotrophic bioassay: 
Phase Two — Coded Single Dose Studies’,  Environ. Health Persp. 111 , 
s. 1550–1558..  
(9) Owens, W., Ashby, J., Odum, J., Onyon, L., (2003), ‘The OECD program 
to validate the rat uterotrophic bioassay: Phase Two — Dietary phytoe ­
strogen analyses’,  Environ. Health Persp. 111 , s. 1559–1567.  
(10) Ogasawara, Y., Okamoto, S., Kitamura, Y., Matsumoto, K., (1983), ‘Pro ­
liferative pattern of uterine cells from birth to adulthood in intact, neona ­
tally castrated, and/or adrenalectomized mice assayed by incorporation of 
[I 125 ]iododeoxyuridine’,  Endocrinology 113 , s. 582–587.  
(11) Branham, W.S., Sheehan, D.M, Zehr, D.R., Ridlon, E., Nelson, C.J., 
(1985), ‘The postnatal ontogeny of rat uterine glands and age-related effects of 17b-estradiol’,  Endocrinology 117 , s. 2229–2237.
 
(12) Schlumpf, M., Berger, L., Cotton, B., Conscience-Egli, M., Durrer, S., 
Fleischmann, I., Haller, V., Maerkel, K., Lichtensteiger, W., (2001), 
‘Estrogen active UV screens’,  SÖFW-J. 127 , s. 10–15.  
(13) Zarrow, M.X., Lazo-Wasem, E.A., Shoger, R.L., (1953), ‘Estrogenic acti ­
vity in a commercial animal ration’  Science 118 ,s. 650–651.  
(14) Drane, H.M., Patterson, D.S.P., Roberts, B.A., Saba, N., (1975), ‘The 
chance discovery of oestrogenic activity in laboratory rat cake’,  Fd. 
Cosmet. Toxicol. 13 , s. 425–427.  
(15) Boettger-Tong, H., Murphy, L., Chiappetta, C., Kirkland, J.L., Goodwin, 
B., Adlercreutz, H., Stancel, G.M., Makela, S., (1998), ‘A case of a laboratory animal feed with high estrogenic activity and its impact on  
in vivo  responses to exogenously administered estrogens’,  Environ. Health 
Perspec. 106 , s. 369–373.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 835
 
(16) OECD (2007), ‘Additional data supporting the Test Guideline on the 
Uterotrophic Bioassay in rodents’,  OECD Environmental Health and 
Safety Publication Series on Testing and Assessment  nr 67.  
(17) Degen, G.H., Janning, P., Diel, P., Bolt, H.M., (2002), ‘Estrogenic isof ­
lavones in rodent diets’,  Toxicol. Lett. 128 , s. 145–157.  
(18) Wade, M.G., Lee, A., McMahon, A., Cooke, G., Curran, I., (2003), ‘The 
influence of dietary isoflavone on the uterotrophic response in juvenile rats’,  Food Chem. Toxicol. 41 , s. 1517–1525.
 
(19) Yamasaki, K., Sawaki, M., Noda, S., Wada, T., Hara, T., Takatsuki M., 
(2002), ‘Immature uterotrophic assay of estrogenic compounds in rats 
given different phytoestrogen content diets and the ovarian changes in the immature rat uterotrophic of estrogenic compounds with ICI 182,780 or antide’,  Arch. Toxicol. 76 , s. 613–620.
 
(20) Thigpen, J.E., Haseman, J.K., Saunders, H.E., Setchell, K.D.R., Grant, 
M.F., Forsythe, D., (2003), ‘Dietary phytoestrogens accelerate the time 
of vaginal opening in immature CD-1 mice’,  Comp. Med. 53 , s. 477–485.  
(21) Ashby, J., Tinwell, H., Odum, J., Kimber, I., Brooks, A.N., Pate, I., Boyle, 
C.C., (2000), ‘Diet and the aetiology of temporal advances in human and rodent sexual development’,  J. Appl. Toxicol. 20 , s. 343–347.
 
(22) Thigpen, J.E., Lockear, J., Hasemanm, J., Saunders, H.E., Caviness, G., 
Grant, M.F., Forsythe, D.B., (2002), ‘Dietary factors affecting uterine 
weights of immature CD-1 mice used in uterotrophic bioassays’,  Cancer 
Detect. Prev. 26 , s. 381–393.  
(23) Thigpen, J.E., Li, L.-A., Richter, C.B., Lebetkin, E.H., Jameson, C.W., 
(1987), ‘The mouse bioassay for the detection of estrogenic activity in rodent diets: I. A standardized method for conducting the mouse bioassay’,  
Lab. Anim. Sci . 37, s. 596–601.
 
(24) OECD (2008), ‘Acute oral toxicity — up-and-down procedure’,  OECD 
Guideline for the testing of chemicals  nr 425.  
(25) OECD (2000), ‘Guidance Document on the Recognition, Assessment, and 
Use of Clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation’,  Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment  nr 19, ENV/JM/MONO(2000)7.
 
(26) OECD (2001), ‘Guidance document on acute oral toxicity’,  Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment  nr 24, 
ENV/JM/MONO(2001)4.  
(27) Bulbring, E. i Burn, J.H., (1935), ‘The estimation of oestrin and of male 
hormone in oily solution’,  J. Physiol. 85 , s. 320–333.  
(28) Dorfman, R.I., Gallagher, T.F. i Koch, F.C., (1936), ‘The nature of the 
estrogenic substance in human male urine and bull testis’,  Endocrinology 
19, s. 33– 41.  
(29) Reel, J.R., Lamb IV, J.C. i Neal, B.H., (1996), ‘Survey and assessment of 
mammalian estrogen biological assays for hazard characterization’,  
Fundam. Appl. Toxicol . 34, s. 288–305.  
(30) Jones, R.C. i Edgren, R.A., (1973), ‘The effects of various steroid on the 
vaginal histology in the rat’,  Fertil. Steril. 24 , 284–291.  
(31) OECD (1982), Organizacja Wspó łpracy Gospodarczej i Rozwoju — ‘Prin ­
ciples of Good Laboratory Practice’, ISBN 92-64-12367-9, Pary ż. 
(32) Dorfman, R.I., (1962), ‘Methods in Hormone Research, Vol. II, Part IV: 
Standard Methods Adopted by Official Organization’, Nowy Jork,  
Academic Press . 
(33) Thigpen, J.E.,  et al . (2004), ‘Selecting the appropriate rodent diet for 
endocrine disruptor research and testing studiem’,  ILAR J 45(4) , s. 
401–416.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 836
 
(34) Gray, L.E. i Ostby, J., (1998), ‘Effects of pesticides and toxic substances 
on behavioral and morphological reproductive development: endocrine 
versus non-endocrine mechanizm’,  Toxicol Ind Health. 14 (1–2) , s. 
159–184.  
(35) Booth, A.N., Bickoff, E.M. i Kohler, G.O., (1960), ‘Estrogen-like activity 
in vegetable oils and mill by-products’,  Science 131 , s. 1807–1808.  
(36) Kato, H., Iwata, T., Katsu, Y., Watanabe, H., Ohta, Y., Iguchi, T., (2004), 
‘Evaluation of estrogenic activity in diets for experimental animals using 
in vitro assai’,  J. Agric Food Chem. 52 , s. 1410–1414.  
(37) OECD (2007), ‘Guidance Document on the Uterotrophic Bioassay Proce ­
dure to Test for Antioestrogenicity. Series on Testing and Assessment’, 
nr 71.  
(38) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 
22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do 
celów naukowych (Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 837
 
B.55.  TEST BIOLOGICZNY HERSHBERGERA NA SZCZURACH: 
KRÓTKOTERMINOWE BADANIE PRZESIEWOWE 
WŁAŚCIWOŚCI (ANTY)ANDROGENNYCH  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest zgodna z dotycz ącą badań wytyczną OECD 
nr 441 (2009 r.). W 1998 r. OECD podj ęła działania o wysokim priorytecie, 
mające na celu zmian ę istniejących wytycznych i opracowanie nowych 
wytycznych na potrzeby bada ń przesiewowych i badania potencjalnych 
substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu hormonalnego (1). Jednym 
z elementów tych dzia łań było opracowanie wytycznych dotycz ących testu 
biologicznego Hershbergera na szczurach. Po kilkudziesi ęciu latach stoso ­
wania tego testu przez przemys ł farmaceutyczny zosta ł on po raz pierwszy 
znormalizowany w 1962 r. przez oficjalny komitet ekspertów jako narz ędzie 
przesiewowe w odniesieniu do androgennych substancji chemicznych (2). W latach 2001–2007 test biologiczny Hershbergera na szczurach zosta ł 
objęty intensywnym programem walidacyjnym, w ramach którego sporz ­ 
ądzono dokument przegl ądowy kontekstu (23), dokument zawieraj ący zesta­
wienie szczegó łowych metod (3), opracowano wytyczne dotycz ące sekcji 
(21) oraz prowadzono intensywne wewn ątrzlaboratoryjne 
i międzylaboratoryjne badania maj ące na celu pokazanie wiarygodno ści 
i odtwarzalno ści testu biologicznego. Wspomniane badania walidacyjne 
prowadzono na silnym androgenie referencyjnym (propionat testosteronu), 
dwóch silnych androgenach syntetycznych (octanie trenbolonu 
i metylotestosteronie), silnym antyandrogennym produkcie leczniczym (flu ­
tamidzie), silnym inhibitorze syntezy (finasterydzie) naturalnego androgenu (dihydrotestosteronu), kilku s łabo antyandrogennych pestycydach (linuronie, 
winklozolinie, procymidonie, p,p' DDE), inhibitorze 5-alfa-reduktazy (fina ­
sterydzie) i dwóch znanych negatywnych substancjach chemicznych (dinit ­
rofenolu i nonylofenolu) (4)(5)(6)(7)(8). Przedmiotowa metoda badawcza jest wynikiem wieloletniego do świadczenia zwi ązanego ze stosowaniem 
testu biologicznego i do
świadczenia zdobytego w trakcie programu bada ń 
walidacyjnych i jego wyników.  
2. Test biologiczny Hershbergera jest krótkoterminowym badaniem przesie ­
wowym  in vivo , w którym wykorzystuje si ę dodatkowe tkanki uk ładu 
rozrodczego u samca. Test zosta ł opracowany w latach 30. 
i zmodyfikowany w latach 40. ubieg łego stulecia w taki sposób, aby 
uwzględniał mięśnie reaguj ące na androgeny w uk ładzie rozrodczym 
samca (2)(9–15). W latach 60. ubieg łego stulecia oceniono ponad 700 
potencjalnych androgenów, wykorzystuj ąc w tym celu unormowan ą wersję 
protokołu (2)(14), a stosowanie testu zarówno w przypadku androgenów, 
jak i antyandrogenów uwa żano za metod ę standardow ą także w latach 60. 
(2)(15). Obecnie stosowany test biologiczny oparty jest na zmianach masy 
pięciu zależnych od androgenów tkanek u wykastrowanego samca szczura 
w okresie wczesnego dojrzewania. W ramach testu ocenia si ę zdolność 
substancji chemicznej do wywo łania aktywno ści biologicznej zgodnej 
z agonistami lub antagonistami androgenów lub inhibitorami 5-alfa-reduk ­
tazy. Do pi ęciu docelowych tkanek zale żnych od androgenów, które s ą 
objęte tym testem, nale żą: dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego, p ęcherzyk 
nasienny (plus p łyny i gruczo ły koaguluj ące), mięsień dźwigacz odbytu 
i mięsień opuszkowo-jamisty, parzyste gruczo ły Cowpera i żołądź. 
W przypadku wykastrowanego samca szczura w okresie wczesnego dojrze ­
wania te wszystkie pi ęć tkanek reaguje na androgeny przyrostem masy 
całkowitej. Je żeli te same tkanki stymuluje si ę w celu zwi ększenia masy 
przez podawanie silnego androgenu referencyjnego, wszystkie pi ęć tkanek 
reaguje na antyandrogeny utrat ą masy ca łkowitej. Pierwotnym modelem 
testu biologicznego Hershbergera by ł chirurgicznie wykastrowany samiec 
w okresie wczesnego dojrzewania, co zosta ło poddane walidacji w fazach 
1, 2 i 3 programu walidacyjnego Hershbergera.  
3. Test biologiczny Hershbergera pe łni rolę mechanistycznego badania prze ­
siewowego  in vivo  w zakresie agonistów androgenów, antagonistów andro ­
genów oraz inhibitorów 5-alfa-reduktazy i nale ży postrzega ć test 
w kontek ście „Ram koncepcyjnych OECD w zakresie bada ń i oceny 
substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu hormonalnego” (dodatek 
2). W tym dokumencie test biologiczny Hershbergera zosta ł umieszczony  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
na poziomie 3 jako test  in vivo  zapewniaj ący dane o pojedynczym mecha ­
nizmie hormonalnym, tj. (anty)androgenno ści. Test ma by ć włączony do 
zestawu testów  in vitro  i in vivo  mających na celu identyfikacj ę substancji 
chemicznych, które mog ą wchodzi ć w interakcj ę z układem hormonalnym, 
ostatecznie prowadz ąc do oceny zagro żenia i ryzyka dla zdrowia ludzkiego 
lub środowiska.  
4. Z uwagi na kwesti ę dobrostanu zwierz ąt w związku z procedur ą kastracji 
starano si ę, aby alternatywnym modelem do celów testu biologicznego 
Hershbergera zosta ł niekastrowany stymulowany samiec w okresie odsadze ­
niowym, aby unikn ąć etapu kastracji. Przeprowadzono walidacj ę metody 
badawczej stymulacji w okresie odsadzenia (24); jednak w trakcie bada ń 
walidacyjnych okaza ło się, że wersja testu biologicznego Hershbergera 
stosowanego w okresie odsadzenia nie pozwala w spójny sposób wykry ć 
skutków dzia łania słabych anty-androgenów na mas ę organów zale żnych od 
androgenów przy badanych dawkach. W zwi ązku z tym nie zosta ła ona 
ujęta w tej metodzie badawczej. Uznaj ąc jednak, że korzystanie z tej 
metody mo że przynie ść nie tylko korzy ści dla dobrostanu zwierz ąt, ale 
umożliwi także uzyskanie informacji dotycz ących innych rodzajów dzia łań, 
jest ona dost ępna w wytycznych OECD 115 (25).  
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
5. Agoni ści i antagoni ści androgenów dzia łają jako ligandy receptorów andro ­
genów oraz mog ą odpowiednio aktywowa ć lub hamowa ć transkrypcj ę 
genów kontrolowan ą przez receptory. Ponadto niektóre substancje 
chemiczne hamuj ą przekszta łcanie testosteronu w silniejszy androgen natu ­
ralny dihydrotestosteron w niektórych docelowych tkankach androgeno ­
wych (inhibitory 5-alfa-reduktazy). Takie substancje chemiczne mog ą 
powodowa ć niepożądane zagro żenia dla zdrowia, w tym wp ływ na repro ­
dukcję i rozwój. W zwi ązku z tym istnieje regulacyjna potrzeba szybkiego 
dokonywania oceny i badania substancji chemicznej jako potencjalnego 
agonisty lub antagonisty androgenu lub inhibitora 5-alfa-reduktazy. Powi ­
nowactwo ligandu w odniesieniu do receptora androgenu zmierzone przez wiązanie z receptorami lub aktywacj ę transkrypcji genów reporterowych  in 
vitro , chociaż ma charakter informacyjny, nie stanowi jedynej determinanty 
potencjalnego zagro żenia. Pozosta łe determinanty obejmuj ą aktywacj ę 
i dezaktywacj ę metaboliczn ą w momencie dostania si ę substancji do orga ­
nizmu, dystrybucj ę substancji chemicznych do tkanek docelowych i klirens 
tych substancji z organizmu. St ąd wynika potrzeba skontrolowania ewen ­
tualnego dzia łania substancji chemicznej  in vivo  w odpowiednich warun ­
kach i przy odpowiednim nara żeniu. Ocena  in vivo  ma nieco mniejsze 
znaczenie, je żeli znane s ą
 właściwości substancji chemicznej 
w odniesieniu do absorpcji, dystrybucji, metabolizmu i eliminacji. Tkanki 
zależne od androgenów reaguj ą na stymulacj ę androgenami szybkim 
i gwałtownym wzrostem, w szczególno ści w przypadku wykastrowanych 
samców szczurów w okresie wczesnego dojrzewania. Gryzonie, w szczególno ści szczury, wykorzystuje si ę także powszechnie 
w badaniach toksyczno ści do celów charakteryzowania zagro żeń. 
W związku z tym wersja testu, w której wykorzystuje si ę wykastrowane 
szczury w okresie wczesnego dojrzewania i pi ęć docelowych tkanek w tym 
teście, jest odpowiednia do celów bada ń przesiewowych  in vivo  pod kątem 
agonistów i antagonistów androgenów oraz inhibitorów 5-alfa-reduktazy.
 
6. Powy ższą metodę badawcz ą opracowano w oparciu o te protoko ły wyko­
rzystywane w badaniu walidacyjnym OECD, które okaza ły się wiarygodne 
i odtwarzalne w badaniach wewn ątrzlaboratoryjnych 
i międzylaboratoryjnych (4)(5)(6)(7)(8). W metodzie tej przedstawia si ę 
zarówno procedury dotycz ące androgenów, jak i antyandrogenów.  
7. Chocia ż różne laboratoria wprowadzi ły pewną zmianę w dawkach propio ­
natu testosteronu stosowanych w celu wykrycia antyandrogenów 
w programie walidacyjnym OECD w odniesieniu do testu biologicznym Hershbergera (0,2 w porównaniu do 0,4 mg/kg/dob ę, wstrzykni ęcie 
podskórne), ró żnica pod wzgl ędem zdolno ści wykrywania s łabego lub 
silnego dzia łania antyandrogennego mi ędzy tymi dwoma zmienionymi 
protokołami była niewielka. Jest jednak oczywiste, że dawka propionatu 
testosteronu nie powinna by ć zbyt wysoka, żeby blokowa ła wpływ słabych 
antagonistów receptora androgenowego, lub tak niska, żeby tkanki andro ­
genne wykazywa ły niewielk ą reakcję wzrostow ą nawet bez podania anty ­
androgenów.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. Reakcja wzrostowa poszczególnych tkanek zale żnych od androgenów nie 
jest wyłącznie pochodzenia androgennego, tj. masa okre ślonych tkanek 
może ulegać zmianom pod wp ływem substancji chemicznych innych ni ż 
agoniści androgenów. Reakcja wzrostowa ró żnych tkanek jednocze śnie 
świadczy jednak o mechanizmie bardziej ukierunkowanym na androgeny. 
Na przyk ład duże dawki silnych estrogenów mog ą powodowa ć zwiększanie 
masy pęcherzyka nasiennego; pozosta łe tkanki zale żne od androgenów 
uwzględnione w te ście nie reaguj ą jednak w taki sam sposób. Antyandro ­
genne substancje chemiczne mog ą działać jako antagoni ści receptora andro ­
genów lub jako inhibitory 5-alfa-reduktazy. Inhibitory 5-alfa-reduktazy maj ą 
zróżnicowane dzia łanie, poniewa ż przekszta łcenie w silniejszy w dzia łaniu 
dihydrotestosteron ró żni się w zależności od tkanki. Antyandrogeny, które 
blokują 5-alfa-reduktaz ę, takie jak finasteryd, oddzia łują w większym 
stopniu na dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego ni ż na inne tkanki 
w porównaniu do silnego antagonisty receptora androgenowego, jakim jest flutamid. Ta ró żnica w reakcjach tkanek mo że być wykorzystywana 
do odróżnienia trybów dzia łania receptora androgenowego i 5-alfa-reduk ­
tazy. Receptor androgenowy jest ponadto ewolucyjnie powi ązany 
z receptorem innych hormonów steroidowych i niektórych innych hormo ­
nów, jeżeli jest podawany w du żych, suprafizjologicznych dawkach, mo że 
wiązać i antagonizowa ć działanie wzrostowe propionatu testosteronu (13). 
Ponadto jest równie ż prawdopodobne, że zwiększony metabolizm steroidów 
i konsekwentne obni żanie poziomu testosteronu w surowicy mog łoby ogra­
niczyć wzrost tkanek zale żnych od androgenów. W zwi ązku z tym ka żdy 
wynik dodatni w te ście biologicznym Hershbergera nale ży zazwyczaj 
oceniać, stosując zasadę wagi dowodu, w tym testy  in vitro , takie jak 
testy wiążące receptor androgenowy i receptor estrogenowy oraz odpowia ­
dające im testy aktywacji transkrypcyjnej, lub inne testy  in vivo , które 
polegają na badaniu podobnych tkanek docelowych zale żnych od androge ­
nów, takie jak test m łodego samca w okresie dojrzewania, 15-dniowy test 
niekastrowanego samca lub 28-dniowe lub 90-dniowe badania toksyczno ści 
wywołanej powtarzanym dawkowaniem.
 
9. Doświadczenie wskazuje, że androgeny ksenobiotyczne wyst ępują rzadziej 
niż antyandrogeny ksenobiotyczne. Przewiduje si ę zatem, że test biolo ­
giczny Hershbergera b ędzie wykorzystywany najcz ęściej do badania prze ­
siewowego antyandrogenów. Procedura przeprowadzania testów na andro ­
geny mog łaby jednak by ć zalecania w odniesieniu do substancji steroido ­
wych lub sterydopodobnych, lub substancji, w przypadku których wska ­
zanie mo żliwego dzia łania androgennego zosta ło oparte na metodach 
poziomu 1 lub 2 ram koncepcyjnych (dodatek 2). Podobnie niepo żądane 
skutki zwi ązane z (anty)androgennymi profilami mo żna obserwowa ć 
w testach poziomu 5, co prowadzi do konieczno ści oceny, czy substancja 
chemiczna dzia ła na zasadzie hormonu.  
10. Uznano, że wszelkie procedury, w których wykorzystuje si ę zwierzęta, 
powinny by ć zgodne z lokalnymi normami w zakresie utrzymywania 
zwierząt; przedstawione poni żej opisy dotycz ące utrzymywania 
i traktowania zwierz ąt stanowi ą minimalne standardy wykonywania bada ń 
i zostaną zastąpione przez lokalne przepisy, takie jak dyrektywa Parlamentu 
Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 wrze śnia 2010 r. w sprawie 
ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do celów naukowych (26). OECD 
udziela dalszych wskazówek dotycz ących humanitarnego traktowania 
zwierząt (17).  
11. Podobnie jak w przypadku ka żdego testu biologicznego, w ramach którego 
wykorzystuje si ę zwierzęta doświadczalne, nale ży starannie przemy śleć 
konieczno ść przeprowadzenia tego badania. Zasadniczo mo żna wyróżnić 
dwa powody takiej decyzji:  
— wysokie prawdopodobie ństwo nara żenia (poziom 1 ram koncepcyjnych) 
lub wskazania w odniesieniu do (anty)androgenno ści w testach  in vitro  
(poziom 2) wspieraj ących badania dotycz ące tego, czy takie dzia łania 
mogą wystąpić in vivo , 
— działania zgodne z (anty)androgenno ścią na poziomie 4 lub 5 bada ń in 
vivo wspieraj ących badania szczegó łowego sposobu dzia łania, np. 
w celu okre ślenia, czy dzia łania były związane z mechanizmem 
(anty)androgennym.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. Definicje stosowane w tej metodzie badawczej przedstawiono w dodatku 1.  
ZASADA BADANIA  
13. Czu łość testu biologicznego Hershbergera zostaje osi ągnięta dzięki wyko­
rzystaniu samców z minimaln ą endogenn ą produkcj ą androgenów. Cel ten 
osiąga się dzięki wykorzystaniu wykastrowanych samców, pod warunkiem 
że zapewnia si ę odpowiedni czas po kastracji na powrót tkanek docelowych 
do minimalnej i jednakowej masy podstawowej. Zatem w przypadku bada ń 
przesiewowych prowadzonych pod k ątem potencjalnego dzia łania andro ­
gennego istniej ą niskie endogenne poziomy androgenów w krwioobiegu, 
oś podwzgórze-przysadka-gonady nie jest w stanie kompensowa ć za 
pośrednictwem mechanizmów sprz ężenia zwrotnego, zdolno ść tkanek do 
reakcji ulega maksymalnemu zwi ększeniu, a zmienno ść początkowej masy 
tkanek maleje do minimum. W przypadku bada ń przesiewowych pod k ątem 
potencjalnego dzia łania antyandrogennego mo żna uzyska ć bardziej spójny 
przyrost masy tkanek, je żeli tkanki stymuluje si ę androgenem referencyj ­
nym. W zwi ązku z powy ższym test biologiczny Hershbergera wymaga 
wyłącznie 6 zwierz ąt na grup ę dawkowania, natomiast w przypadku innych 
badań z niekastrowanymi samcami w okresie dojrzewania lub samcami 
dorosłymi zaleca si ę wykorzystywanie 15 samców na grup ę dawkowania.  
14. Kastracj ę samców szczurów w okresie wczesnego dojrzewania nale ży 
wykonać w sposób w łaściwy, stosuj ąc zatwierdzone znieczulenie 
i technikę aseptyczn ą. Należy podać środki przeciwbólowe w pierwszych 
kilku dniach po zabiegu w celu wyeliminowania dyskomfortu pozabiego ­
wego. Kastracja zwi ększa precyzj ę badania w zakresie wykrywania s łabych 
androgenów i antyandrogenów przez eliminowanie kompensacyjnych hormonalnych mechanizmów sprz ężenia zwrotnego obecnych 
u niekastrowanego zwierz ęcia, które mog ą osłabiać działanie podawanych 
androgenów i antyandrogenów, oraz przez eliminowanie du żej międzyosob­
niczej zmienno ści w poziomach testosteronu w surowicy. Kastracja ogra ­
nicza zatem liczb ę zwierząt wymaganych do bada ń przesiewowych 
w zakresie dzia łania tych hormonów.
 
15. W przypadku bada ń przesiewowych pod k ątem potencjalnego dzia łania 
androgennego badana substancja chemiczna podawana jest codziennie 
przez sond ę drogą doustną lub wstrzykni ęcie podskórne przez okres dzie ­
sięciu kolejnych dni. Badane substancje chemiczne podaje si ę przynajmniej 
dwóm badanym grupom zwierz ąt doświadczalnych, wykorzystuj ąc jedną 
dawkę na grupę. Zwierzęta poddaje si ę sekcji po up ływie oko ło 24 godzin 
od podania ostatniej dawki. Istotny statystycznie wzrost masy jednego lub 
większej liczby organów docelowych w grupie otrzymuj ącej badan ą 
substancję w stosunku do grupy kontrolnej no śnika wskazuje na dzia łanie 
androgenne badanej substancji chemicznej (zob. pkt 60). Androgeny, jak 
trenbolon, które nie mog ą ulec przemianie pod wp ływem 5-alfa-reduktazy, 
silniej oddzia łują na mięsień dźwigacz odbytu i mi ęsień opuszkowo-jamisty 
oraz na żołądź w porównaniu z propionatem testosteronu, jednak zwi ęk­
szony przyrost powinien pojawi ć się w przypadku wszystkich tkanek.  
16. W przypadku bada ń przesiewowych pod k ątem potencjalnego dzia łania 
antyandrogennego badan ą substancj ę chemiczn ą podaje si ę codziennie 
przez sond ę drogą doustną lub wstrzykni ęcie podskórne przez okres dzie ­
sięciu kolejnych dni wraz z codziennymi dawkami propionatu testosteronu 
(0,2 lub 0,4 mg/kg/dob ę) wstrzykiwanymi podskórnie. W programie wali ­
dacji stwierdzono, że możliwe jest podawanie propionatu testosteronu 
w dawce 0,2 lub 0,4 mg/kg/dob ę, poniewa ż obie dawki s ą skuteczne 
w wykrywaniu antyandrogenów i w zwi ązku z tym nale ży wybrać tylko 
jedną dawkę do stosowania w badaniu. Stopniowane dawki badanej 
substancji chemicznej podaje si ę przynajmniej trzem badanym grupom 
zwierząt doświadczalnych, wykorzystuj ąc jedną dawkę na grupę. Zwierzęta 
poddaje si ę sekcji po up ływie oko ło 24 godzin od podania ostatniej dawki. 
Istotny statystycznie spadek masy jednego lub wi ększej liczby organów 
docelowych w grupach, którym podawano badan ą substancj ę chemiczn ą 
i propionat testosteronu, w porównaniu z grup ą kontrolną, której podawano 
wyłącznie propionat testosteronu, wskazuje na ewentualne dodatnie anty ­
androgenne dzia łanie badanej substancji (zob. pkt 61).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
OPIS METODY BADAWCZEJ  
Wybór gatunków i szczepu  
17. Do testu biologicznego Hershbergera systematycznie wykorzystywano 
szczury od lat 30. ubieg łego stulecia. Chocia ż z biologicznego punktu 
widzenia zarówno u szczura, jak i myszy prawdopodobnie wyst ąpiłyby 
podobne reakcje, to jednak, opieraj ąc się na 70 latach do świadczenia 
z modelem szczura, w łaśnie to zwierz ę stanowi gatunek preferowany do 
celów testu biologicznego Hershbergera. Nale ży dodać, że skoro dane uzys ­
kane w te ście Hershbergera mog ą stanowić wstęp do długoterminowych 
badań międzypokoleniowych, umo żliwia to wykorzystanie zwierz ąt 
pochodzących z tego samego gatunku, szczepu i źródła w obu badaniach.  
18. W niniejszym protokole zezwala si ę laboratoriom na wybór do badania 
szczepu szczurów, który powinien zasadniczo by ć jednym z historycznie 
używanych przez uczestnicz ące laboratorium. Do bada ń wykorzystuje si ę 
powszechnie stosowane laboratoryjne szczepy szczurów; nie nale ży jednak 
wykorzystywa ć szczepów, które dojrzewaj ą znacznie pó źniej niż w 42. dniu 
życia, poniewa ż kastracja takich samców w 42. dniu życia mog łaby unie­
możliwić pomiar masy żołędzia, co mo żna wykona ć jedynie po oddzieleniu 
napletka od trzonu pr ącia. Nie nale ży zatem stosowa ć szczurów otrzyma ­
nych ze szczepu Fisher 344 z wyj ątkiem pojedynczych przypadków. 
Szczury szczepu Fisher 344 odznaczaj ą się innym czasem trwania etapów 
rozwoju p łciowego w porównaniu z innymi stosowanymi cz ęściej szcze ­
pami, jak szczepy Sprague Dawley lub Wistar (16). Je żeli wykorzystuje si ę 
jednak taki szczep, laboratorium powinno zapewni ć kastrację na nieco 
późniejszym etapie rozwoju i powinno by ć w stanie przedstawi ć czułość 
zastosowanego szczepu. Laboratorium powinno wyra źnie wskaza ć powody 
podjęcia decyzji o wyborze danego szczepu szczurów. W przypadku gdy 
badanie przesiewowe przeprowadza si ę jako badanie wst ępne poprzedzaj ące 
badanie toksyczno ści doustnej wywo łanej powtarzanym dawkowaniem, 
badanie reprodukcyjne i rozwojowe lub badanie d ługoterminowe, nale ży 
wykorzystywa ć zwierzęta z tego samego szczepu i źródła we wszystkich 
badaniach.  
Warunki trzymania i żywienia  
19. Wszystkie procedury powinny by ć zgodne ze wszystkimi lokalnymi 
normami opieki nad zwierz ętami laboratoryjnymi. Opisy dotycz ące opieki 
nad zwierz ętami i ich traktowania stanowi ą normy minimalne i zostan ą 
zastąpione przez bardziej rygorystyczne lokalne przepisy, takie jak dyrek ­
tywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 wrze śnia 
2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do celów nauko ­
wych (26). Temperatura w pomieszczeniu ze zwierz ętami doświadczalnymi 
powinna wynosi ć 22 °C (w przybli żeniu z tolerancj ą ± 3 °C). Wilgotno ść 
względna poza okresem czyszczenia pomieszczenia powinna wynosi ć co 
najmniej 30 % i nie przekracza ć 70 %. Wilgotno ść względną należy doce­
lowo utrzymywa ć w granicach 50–60 %. O świetlenie powinno by ć 
sztuczne, w cyklu dziennym 12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. 
20. Zaleca si ę trzymanie zwierz ąt w grupach, a nie w odosobnieniu, ze wzgl ędu 
na młody wiek zwierz ąt i fakt, że szczury s ą zwierzętami społecznymi. 
Trzymanie w klatce dwóch lub trzech zwierz ąt zapobiega ich st łoczeniu 
i wystąpieniu zwi ązanego z tym stresu, co mog łoby utrudnia ć kontrolę 
hormonaln ą rozwoju dodatkowej tkanki p łciowej. Klatki nale ży dokładnie 
czyścić, aby pozby ć się ewentualnych zanieczyszcze ń, i ustawia ć je w taki 
sposób, aby zminimalizowa ć możliwy wpływ położenia klatki. Klatki we 
właściwym rozmiarze (~2 000 centymetrów kwadratowych) b ędą zapo­
biegać zatłoczeniu.  
21. Każde zwierz ę należy indywidualnie oznakowa ć w celach identyfikacyjnych 
(np. znak na uszach lub marker), stosuj ąc w tym celu humanitarn ą metodę. 
Metodę identyfikacji nale ży odnotowa ć. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Nale ży zapewni ć paszę laboratoryjn ą i wodę pitną ad libitum.  Laboratoria 
wykonujące test biologiczny Hershbergera powinny u żywać paszy labora ­
toryjnej stosowanej zazwyczaj w ich pracy badawczej nad substancjami chemicznymi. W ramach badania walidacyjnego testu biologicznego nie zaobserwowano żadnych skutków ani zmienno ści, które mo żna powiązać 
z paszą. Stosowana pasza laboratoryjna zostanie odnotowana i jej próbk ę 
należy zachowa ć na potrzeby przysz łej analizy.
 
Kryteria wykonywania bada ń w przypadku masy narz ądów zale żnych 
od androgenów  
23. Podczas badania walidacyjnego nie znaleziono dowodów, że spadek masy 
ciała wpływa na wzrosty lub spadki wielko ści masy tkanek w odniesieniu 
do tkanek docelowych (tj. tych, które nale ży uwzględnić w niniejszym 
badaniu).  
24. Wśród różnych szczepów szczurów stosowanych z powodzeniem 
w programie walidacyjnym masy narz ądów zale żnych od androgenów s ą 
większe u ci ęższych szczepów szczurów ni ż u szczepów l żejszych. 
W związku z tym kryteria wykonywania testu biologicznego Hershbergera 
nie obejmuj ą bezwzgl ędnych przewidywanych mas organów w przypadku 
kontroli dodatnich i ujemnych.  
25. Poniewa ż współczynnik zmienno ści w odniesieniu do tkanki cechuje 
stosunek odwrotnie proporcjonalny do mocy testu statystycznego, kryteria 
wykonywania testu biologicznego Hershbergera oparte s ą na maksymalnych 
wartościach wspó łczynnika zmienno ści w przypadku ka żdej tkanki (tabela 
1). Wspó łczynniki zmienno ści wynikaj ą z badań walidacyjnych OECD. 
W przypadku ujemnych wyników laboratoria powinny zbada ć współczyn­
niki zmienno ści w grupie kontrolnej i grupie otrzymuj ącej wysok ą dawkę 
w celu stwierdzenia, czy przekroczono maksymalny wspó łczynnik zmien ­
ności w odniesieniu do kryteriów wykonywania.  
26. Nale ży powtórzy ć badanie w nast ępujących przypadkach: 1) gdy trzy lub 
większa liczba spo śród dziesi ęciu możliwych indywidualnych wspó łczyn­
ników zmienno ści w grupie kontrolnej i grupie otrzymuj ącej wysok ą dawkę 
przekraczaj ą maksymalne warto ści przewidziane dla bada ń pod kątem 
agonistów i antagonistów w tabeli 1 oraz 2) co najmniej dwie tkanki doce ­
lowe są marginalnie nieistotne, tj. warto ści r wynosz ą 0,05–0,10.  
Tabela 1  
Maksymalne dopuszczalne wspó łczynniki zmienno ści określone dla 
docelowych dodatkowych gruczo łów płciowych w przypadku modelu 
kastrowanego w badaniu walidacyjnym OECD  ( 1 ) 
Tkanka Działanie antyandro ­
genne Działanie androgenne  
Pęcherzyki nasienne 40 % 40 % 
Dobrzuszny p łat gruczo łu 
krokowego 40 % 45 % 
Mięsień dźwigacz odbytu 
i mięsień opuszkowo-jamisty 20 % 30 % 
Gruczoły Cowpera 35 % 55 % 
Żołądź 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Progowy wspó łczynnik zmienno ści w odniesieniu do danej tkanki okre ślono na 
podstawie wykresu warto ści współczynnika zmienno ści, uporządkowanych sekwencyjnie 
od najniższych do najwy ższych, jednolicie w odniesieniu do wszystkich eksperymentów 
w badaniu walidacyjnym przy u życiu konkretnego modelu (agonistycznego lub antago ­
nistycznego). Graniczny wspó łczynnik zmienno ści odczytano z punktu, w którym przy ­
rosty między następnymi najwy ższymi wspó łczynnikami zmienno ści w serii s ą znacznie 
większe niż kilka poprzedzaj ących wspó łczynników zmienno ści — warto ść graniczna. 
Należy zauważyć, że chociaż w ramach tej analizy zidentyfikowano wzgl ędnie wiary ­
godne warto ści graniczne w odniesieniu do modelu antagonistycznego testu, krzywe 
współczynnika zmienno ści dotycz ące testu agonistycznego wykaza ły bardziej jednolity 
wzrost, przez co wyznaczenie progowego wspó łczynnika zmienno ści tą metodą było 
poniekąd arbitralne.
 PROCEDURA  
Przestrzeganie przepisów i weryfikacja laboratorium  
27. W przeciwie ństwie do biologicznego testu wzrostu macicy (rozdzia ł B.54 
niniejszego za łącznika) przedstawienie kompetencji laboratorium przed 
rozpoczęciem bada ń nie jest konieczne do przeprowadzenia testu Hershber ­
gera, poniewa ż jednoczesne kontrole dodatnie (propionat testosteronu 
i flutamid) i kontrole ujemne s ą prowadzone jako integralna cz ęść badania.  
Liczba i stan zwierz ąt 
28. Każda grupa badana i grupa kontrolna powinna sk ładać się z co najmniej 6 
zwierząt. Ma to zastosowanie zarówno do protoko łów związanych 
z działaniem androgennym, jak i antyandrogennym.  
Kastracja  
29. Po odebraniu zwierz ąt należy przewidzie ć kilkudniowy wst ępny okres akli ­
matyzacji, aby zapewni ć zwierzętom dobry stan zdrowia i rozwój. Poniewa ż 
w przypadku zwierz ąt wykastrowanych przed 42. dniem życia (42. dniem 
po urodzeniu) mo że nie pojawia ć się oddzielenie napletka, zwierz ęta należy 
kastrować w 42. dniu po urodzeniu lub pó źniej, ale nie wcze śniej. Zwie ­
rzęta kastruje si ę w znieczuleniu przez naci ęcie w mosznie i usuni ęcie obu 
jąder i naj ądrza, a nast ępnie podwi ązanie naczy ń krwiono śnych 
i przewodów nasiennych. Po potwierdzeniu, że nie wyst ępuje krwawienie, 
należy zamknąć mosznę za pomoc ą szwu lub klipsu chirurgicznego. Zwie ­
rzętom należy podawa ć środki przeciwbólowe przez pierwszych kilka dni 
po zabiegu w celu z łagodzenia jakiegokolwiek dyskomfortu pozabiego ­
wego. Jeżeli kastrowane zwierz ęta nabywa si ę od dostawcy zwierz ąt, infor­
macje na temat wieku zwierz ąt i etapu dojrza łości płciowej powinny zosta ć 
dostarczone przez dostawc ę. 
Aklimatyzacja po kastracji  
30. Zwierz ęta powinny nadal aklimatyzowa ć się w warunkach laboratoryjnych 
w celu umo żliwienia regresu masy tkanek docelowych przez co najmniej 7 
dni po kastracji. Zwierz ęta należy obserwowa ć codziennie, a ka żde zwierz ę 
z oznakami choroby lub fizycznych anomalii nale ży wyłączać z badań. 
Poddawanie dzia łaniu substancji poprzez rozpocz ęcie dawkowania (w 
trakcie bada ń) można zatem rozpocz ąć się dopiero w 49. dniu po urodzeniu, 
ale nie pó źniej niż w 60. dniu po urodzeniu. Wiek w momencie przepro ­
wadzania sekcji nie powinien przekracza ć 70. dnia od urodzenia. Ta 
elastyczno ść umożliwia pracownikom laboratorium zaplanowanie prac 
eksperymentalnych w sposób efektywny.  
Masa cia ła i randomizacja grupy  
31. Różnice w indywidualnej masie cia ła są źródłem zmienno ści w masie 
tkanek zarówno w obr ębie grup zwierz ąt, jak i mi ędzy tymi grupami. 
Zwiększająca się zmienno ść masy tkanek skutkuje zwi ększonym wspó ł­
czynnikiem zmienno ści i zmniejszon ą statystyczn ą mocą testu (okre ślaną 
czasami jako czu łość testu). W zwi ązku z tym zró żnicowanie masy cia ła 
należy kontrolowa ć zarówno eksperymentalnie, jak i statystycznie.  
32. Kontrola eksperymentalna obejmuje tworzenie niewielkich zró żnicowań 
masy ciała w obrębie badanych grup i mi ędzy tymi grupami. Po pierwsze, 
należy unikać wykorzystywania niezwykle ma łych lub du żych zwierz ąt 
i nie włączać ich do badania kohortowego. W momencie rozpocz ęcia 
badań zróżnicowanie masy wykorzystywanych zwierz ąt nie powinno prze ­
kraczać ± 20 % średniej masy (np. 175 g ± 35 g w przypadku wykastro ­
wanych szczurów w okresie wczesnego dojrzewania). Po drugie, zwierz ęta 
należy przydzieli ć do grup (zarówno kontrolnych, jak i badanych) zgodnie 
z randomizowanym rozk ładem masy w taki sposób, aby średnia masa cia ła 
danej grupy nie odbiega ła statystycznie od pozosta łych grup. Nale ży odno­
tować procedur ę randomizacji blokowej.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 844
 
33. Poniewa ż toksyczno ść może powodowa ć zmniejszenie masy cia ła 
w obrębie grup badanych w stosunku do grupy kontrolnej, masa cia ła 
w pierwszym dniu podawania badanej substancji chemicznej mog łaby 
zostać wykorzystana jako statystyczna zmienna towarzysz ąca, a nie masa 
ciała ustalona przy sekcji.  
Dawkowanie  
34. W celu stwierdzenia, czy badana substancja chemiczna mo że mieć działanie 
androgenne  in vivo , zazwyczaj wystarczaj ą dwie grupy dawkowania badanej 
substancji chemicznej plus kontrola dodatnia i kontrola no śnika (ujemna) 
(zob. pkt 43), dlatego te ż taki projekt badania jest preferowany ze wzgl ędu 
dobrostan zwierz ąt. Jeżeli celem jest uzyskanie krzywej dawka-odpowied ź 
lub ekstrapolowanie do mniejszych dawek, potrzebne s ą co najmniej 3 
grupy dawkowania. Je żeli wymagane s ą informacje wykraczaj ące poza 
kwestię działania androgennego (takie jak oszacowanie si ły działania), 
należy rozważyć zastosowanie innego schematu dawkowania. W celu prze ­
prowadzenia badania w zakresie antyandrogenów badan ą substancj ę 
chemiczn ą podaje si ę razem z agonist ą androgenu referencyjnego. Nale ży 
wykorzysta ć co najmniej 3 grupy badane obj ęte różnymi dawkami badanej 
substancji chemicznej oraz kontrol ę dodatnią i ujemn ą (zob. pkt 44). 
Z wyjątkiem podawania badanej substancji chemicznej zwierz ęta w grupie 
kontrolnej nale ży traktowa ć w identyczny sposób jak zwierz ęta w grupie 
badanej. Je żeli przy podawaniu badanej substancji chemicznej u żywa się 
nośnika, grupa kontrolna powinna otrzyma ć największą objętość nośnika 
zastosowan ą w przypadku grupy badanej.  
35. Wszystkie dawki nale ży proponowa ć i dobiera ć z uwzgl ędnieniem wszel ­
kich istniej ących danych dotycz ących toksyczno ści i danych (toksyko)kine ­
tycznych dost ępnych w odniesieniu do substancji badanej lub materia łów 
pokrewnych. Stosuj ąc najwyższą dawkę, należy, po pierwsze, uwzgl ędnić 
LD 50 lub informacje dotycz ące ostrej toksyczno ści w celu unikni ęcia 
śmierci, powa żnego cierpienia lub stresu u zwierz ąt (17)(18)(19)(20), a w 
drugiej kolejno ści uwzględnić dostępne informacje dotycz ące dawek stoso ­
wanych w badaniach toksyczno ści podprzewlek łej i przewlek łej. Zasadniczo 
najwyższa dawka nie powinna powodowa ć spadku ostatecznej masy cia ła 
zwierząt większego ni ż 10 % masy grupy kontrolnej. Najwy ższa dawka 
powinna by ć 1) najwy ższą dawką, która zapewnia zwierz ętom prze życie 
i która nie wi ąże się ze znaczn ą toksyczno ścią lub stresem u zwierz ąt po 
10 kolejnych dniach podawania dawki wynosz ącej maksymalne 1000 
mg/kg/dob ę (zob. pkt 36) lub 2) dawk ą wywołującą działania (anty)andro ­
genne, w zale żności od tego, która z nich jest ni ższa. W ramach bada ń 
przesiewowych dopuszcza si ę duże odstępy pomiędzy kolejnym dawkowa ­
niem, np. pó ł jednostki logarytmicznej (odpowiadaj ących sekwencji dawko ­
wania równej 3,2) lub nawet jedn ą jednostk ę logarytmiczn ą. W przypadku 
braku dost ępności odpowiednich danych mo żna przeprowadzi ć badanie 
ustalające zakres dawkowania (zob. pkt 37), aby wspomóc okre ślenie 
dawek, które nale ży stosowa ć. 
Poziom dawki granicznej  
36. Jeżeli badanie przy dawce równej 1 000 mg/kg masy cia ła/dobę i dawce 
niższej z wykorzystaniem procedur opisanych w przypadku tego badania 
nie jest w stanie wywo łać istotnej statystycznie zmiany masy narz ądów 
rozrodczych, wówczas zastosowanie dodatkowych dawek mo żna uznać za 
zbędne. Dawka graniczna ma zastosowanie z wyj ątkiem przypadków, 
w których dane dotycz ące narażenia ludzi wskazuj ą na potrzeb ę zastoso­
wania wy ższej dawki.  
Uwagi dotycz ące ustalania zakresu dawkowania  
37. W razie potrzeby mo żna przeprowadzi ć wstępne badanie ustalaj ące zakres 
dawkowania, wykorzystuj ąc kilka zwierz ąt w celu doboru odpowiednich 
grup dawkowania [stosuj ąc metody badania ostrej toksyczno ści (rozdzia ł 
B.1 bis, B.1 ter niniejszego za łącznika (27), OECD TG 425 (19))]. 
Celem testu biologicznego Hershbergera jest dobór dawek, które zapewniaj ą 
zwierzętom przeżycie i które nie wi ążą się ze znaczn ą toksyczno ścią lub 
stresem u zwierz ąt po dziesi ęciu kolejnych dniach podawania substancji  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 845
 
chemicznej w wysoko ści równej dawce granicznej wynosz ącej 1 000 
mg/kg/dob ę, jak wskazano w pkt 35 i 36. W zwi ązku z tym mo żna 
skorzysta ć z dokumentu zawieraj ącego wytyczne OECD (17), w którym 
przedstawiono objawy kliniczne wskazuj ące na toksyczno ść lub stres 
u zwierząt. Jeżeli jest to wykonalne w ramach przedmiotowego badania 
ustalającego zakres dawkowania, po dziesi ęciu dniach podawania substancji 
tkanki docelowe mo żna wyciąć i zważyć po upływie oko ło 24 godzin od 
podania ostatniej dawki. Dane te mo żna następnie wykorzysta ć w celu 
ułatwienia doboru dawek w badaniu g łównym.  
Substancje chemiczne odniesienia i no śnik 
38. Agonist ą androgenu odniesienia powinien by ć propionat testosteronu, 
nr CAS 57-82-5. Dawkowanie propionatu testosteronu odniesienia mo że 
wynosić 0,2 mg/kg masy cia ła/dobę lub 0,4 mg/kg masy cia ła/dobę. Anta­
gonistą androgenu referencyjnego powinien by ć flutamid, nr CAS 1311-84- 
7. Dawka referencyjna flutamidu powinna wynosi ć 3 mg/kg masy cia ła/ 
dobę i powinna by ć podawana razem z dawk ą referencyjn ą propionatu 
testosteronu.  
39. Zaleca si ę, na ile to mo żliwe, rozwa żenie użycia w pierwszej kolejno ści 
roztworu wodnego/zawiesiny wodnej. Poniewa ż jednak wiele ligandów 
androgenów lub ich prekursorów metabolicznych wykazuje zazwyczaj 
właściwości hydrofobowe, najpowszechniejszym podej ściem jest u życie 
roztworu/zawiesiny w oleju (np. kukurydzianym, z orzechów arachidowych, oleju sezamowym lub w oliwie z oliwek). Badane substancje chemiczne można rozpuścić w minimalnej ilo ści etanolu 95 % lub w innych odpo ­
wiednich rozpuszczalnikach i rozcie ńczyć w badanym no śniku do uzyskania 
końcowych st ężeń roboczych. Nale ży znać właściwości toksyczne rozpusz ­
czalnika i zbada ć je w oddzielnej grupie kontrolnej rozpuszczalnika. Je żeli 
badana substancja chemiczna zostanie uznana za stabiln ą, można zasto­
sować delikatne podgrzewanie i energiczne mieszanie w celu łatwiejszego 
rozpuszczenia badanej substancji chemicznej. Nale ży oznaczy ć stabilność 
badanej substancji chemicznej w no śniku. Jeżeli badana substancja 
chemiczna jest stabilna w trakcie bada ń, wówczas mo żna przygotowa ć 
jedną począ
tkową podwielokrotno ść badanej substancji i przygotowywa ć 
codziennie okre ślone rozcie ńczenia dawek, zachowuj ąc ostrożność dla unik­
nięcia zanieczyszczenia i zepsucia si ę próbek.  
Podawanie dawek  
40. Propionat testosteronu nale ży podawa ć przez wstrzykni ęcie podskórne, 
a flutamid przez sond ę drogą doustną. 
41. Substancj ę chemiczn ą podaje si ę drogą doustną przez sond ę lub przez 
podskórne wstrzykni ęcie. Przy wyborze drogi podawania nale ży kierowa ć 
się dobrostanem zwierz ąt oraz uwzgl ędniać fizykochemiczne w łaściwości 
badanej substancji chemicznej. Ponadto przed rozpocz ęciem intensywnych, 
długoterminowych bada ń należy wziąć pod uwag ę aspekty toksykologiczne, 
takie jak zwi ązek z drog ą narażenia na dzia łanie substancji u ludzi (np. 
droga doustna przez sond ę jako odpowiednik spo życia substancji, 
podskórne wstrzykni ęcie jako odpowiednik inhalacji lub wch łaniania 
przez skór ę) oraz istniej ące informacje toksykologiczne i dane dotycz ące 
metabolizmu i kinetyki (np. konieczno ść unikania efektu pierwszego 
przejścia, zwiększona efektywno ść przez podanie substancji okre śloną 
drogą), jeżeli uzyska si ę dodanie wyniki na skutek wstrzykni ęcia. 
42. Zwierz ętom należy dawkowa ć substancje w taki sam sposób i w równych 
odstępach czasu przez dziesi ęć kolejnych dni w przybli żeniu w 24-godzin ­
nych odst ępach czasu. Nale ży codziennie dostosowywa ć wielkość dawki na 
podstawie towarzysz ących dawkowaniu codziennych pomiarów masy cia ła. 
Objętość dawki i czas podania nale ży odnotowywa ć każdego dnia, 
w którym nast ępuje nara żenie na dzia łanie substancji. Nale ży zachowa ć 
szczególn ą ostrożność, aby nie przekroczy ć dawki maksymalnej okre ślonej 
w pkt 35 w celu umo żliwienia wiarygodnej interpretacji danych. W zwi ązku 
z tym nale ży dokona ć gruntownej oceny spadku masy cia ła, objawów  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 846
 
klinicznych i innych ustale ń. Do podawania drog ą doustną należy użyć 
sondy do żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna 
objętość płynu, jaką można podać jednorazowo, zale ży od wielko ści bada­
nego zwierz ęcia. Nale ży przestrzega ć lokalnych wytycznych dotycz ących 
opieki nad zwierz ętami, jednak przedmiotowa obj ętość nie powinna prze ­
kroczyć 5 ml/kg masy cia ła, z wyj ątkiem roztworów wodnych, 
w przypadku których mo żna stosowa ć objętość wynosz ącą 10 ml/kg 
masy ciała. W przypadku wstrzykni ęć podskórnych dawki nale ży podawa ć 
w okolice łopatki na grzbiecie lub w okolice l ędźwi przy u życiu sterylnej 
igły (np. o rozmiarze 23 lub 25 G) lub strzykawki tuberkulinowej. Golenie 
miejsca wstrzykni ęcia nie jest obowi ązkowe. Nale ży odnotowa ć wszelkie 
straty, wycieki w miejscu wstrzykni ęcia lub przypadki niepe łnego podania 
dawki. Ca łkowita obj ętość wstrzykiwanej dawki przypadaj ąca na jednego 
szczura na dob ę nie powinna przekracza ć 0,5 ml/kg masy cia ła. 
Procedury szczegó łowe w odniesieniu do agonistów androgenu  
43. W przypadku badania w zakresie agonistów androgenów grupa no śnika 
stanowi kontrol ę ujemną, a grupa obj ęta podawaniem propionatu testoste ­
ronu stanowi kontrol ę dodatni ą. Aktywno ść biologiczn ą zgodną 
z agonistami androgenów bada si ę przez podawanie badanym grupom 
badanej substancji chemicznej w okre ślonych dawkach przez 10 kolejnych 
dni. Masy pi ęciu płciowych gruczo łów dodatkowych z grup badanej 
substancji chemicznej porównuje si ę z grupą nośnika w zakresie istotnych 
statystycznie przyrostów wagi.  
Procedury szczegó łowe w odniesieniu do antagonistów androgenu 
i inhibitorów 5-alfa-reduktazy  
44. W przypadku badania w zakresie antagonistów androgenu i inhibitorów 5- 
alfa-reduktazy grupa obj ęta podawaniem propionatu testosteronu stanowi 
kontrolę ujemną, a grupa, której podaje si ę jednocze śnie dawki referencyjne 
propionatu testosteronu i flutamidu, stanowi kontrol ę dodatnią. Aktywno ść 
biologiczn ą zgodną z antagonistami androgenu i inhibitorami 5-alfa-reduk ­
tazy bada si ę, podając dawkę referencyjn ą propionatu testosteronu i badanej 
substancji chemicznej przez 10 kolejnych dni. Masy pi ęciu płciowych 
gruczołów dodatkowych z grupy obj ętej podawaniem propionatu testoste ­
ronu i grupy badanej substancji chemicznej porównuje si ę pod wzgl ędem 
istotnych statystycznie spadków masy z grup ą odniesienia, która otrzymy ­
wała wyłącznie propionat testosteronu.  
OBSERWACJE  
Obserwacje kliniczne  
45. Ogólne obserwacje kliniczne nale ży przeprowadza ć przynajmniej raz dzien ­
nie, a przypadku zaobserwowania oznak toksyczno ści ze zwi ększoną częs­
totliwością. Najlepiej jest prowadzi ć obserwacje o tych samych godzinach 
doby z uwzgl ędnieniem okresu oczekiwanych skutków szczytowych po 
dawkowaniu. Nale ży przeprowadza ć obserwacje zwierz ąt pod kątem śmier­
telności, zachorowalno ści i ogólnych objawów klinicznych, takich jak 
zmiany w zachowaniu, skórze, sier ści, oczach, b łonach śluzowych, wyst ę­
powanie wydzielin i wydalin oraz aktywno ść autonomicznej cz ęści układu 
nerwowego (np. łzawienie, piloreksja, rozmiar źrenic, nietypowy rytm 
oddychania).  
46. Każde zwierz ę, które ponios ło śmierć, należy usunąć i zutylizowa ć bez 
dalszej analizy danych. Ka żdą śmierć zwierzęcia poprzedzaj ącą sekcję 
należy uwzględnić w dokumentacji dotycz ącej badania wraz z podaniem 
wszelkich widocznych przyczyn śmierci. Ka żde zwierz ę w stanie 
agonalnym nale ży uśmiercić w sposób humanitarny. Ka żde zwierz ę 
w stanie agonalnym i w konsekwencji poddane eutanazji nale ży uwzględnić 
w dokumentacji dotycz ącej badania wraz z podaniem widocznych przyczyn 
śmierci.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 847
 
Masa cia ła i spożycie pokarmu  
47. Wszystkie zwierz ęta należy codziennie wa żyć z dokładnością do 0,1 g, 
zaczynając tuż przed rozpocz ęciem dawkowania, tj. w momencie przydzie ­
lania zwierz ąt do grup. Opcjonalnie mo żna mierzy ć ilości spożywanego 
pokarmu przypadaj ące na ka żdą klatkę w trakcie okresu dawkowania, 
ważąc w tym celu karmniki. Wyniki dotycz ące spożycia pokarmu nale ży 
wyrażać w gramach na szczura na dob ę. 
Sekcja oraz pomiar masy tkanek i narz ądów 
48. Po oko ło 24 godzinach od ostatniego podania badanej substancji 
chemicznej szczury nale ży poddać eutanazji i wykrwawi ć zgodnie ze stan ­
dardowymi procedurami stosowanymi w laboratorium prowadz ącym, 
a następnie przeprowadzi ć sekcję. W sprawozdaniu sporz ądzonym przez 
laboratorium nale ży odnotowa ć metodę zastosowan ą do humanitarnego 
uśmiercenia.  
49. Najlepiej jest dokonywa ć sekcji na losowo wybranych zwierz ętach z grup 
w celu unikni ęcia progresji rosn ącej lub malej ącej w ramach grup dawko ­
wania, co mog łoby wpłynąć na dane. Wszelkie ustalenia dokonane 
w trakcie sekcji, tj. zmiany patologiczne/widoczne uszkodzenia nale ży 
odnotowa ć i zarejestrowa ć. 
50. Nale ży zważyć pięć tkanek zale żnych od androgenów (dobrzuszny p łat 
gruczołu krokowego, p ęcherzyk nasienny, mi ęsień-dźwigacz odbytu 
i mięsień opuszkowo-jamisty, gruczo ły Cowpera, żołądź). Tkanki te nale ży 
wyciąć, ostrożnie usunąć nadmiar przylegaj ącej tkanki i t łuszczu i okre ślić 
natychmiast ich mas ę w stanie świeżym (nieutrwalonym). Z ka żdą tkanką 
należy obchodzi ć się z zachowaniem szczególnej ostro żności, aby unikn ąć 
utraty płynów i osuszenia, co mo że być źródłem znacznych b łędów 
i zmienno ści w wyniku spadku odnotowanych mas. Szereg tkanek mo że 
być bardzo ma łych lub ich wyci ęcie może sprawia ć trudności, co stanie si ę 
przyczyną zmienno ści. W zwi ązku z tym wa żne jest, aby osoby przeprowa ­
dzające sekcję płciowych gruczo łów dodatkowych zapozna ły się ze stan­
dardowymi procedurami przeprowadzania sekcji tych tkanek. Podr ęcznik 
dotyczący standardowej procedury operacyjnej dost ępny jest na stronach 
internetowych OECD (21). Dok ładne przeszkolenie zgodnie 
z wytycznymi standardowej procedury operacyjnej zminimalizuje poten ­
cjalne źródło powstania zmienno ści w badaniu. Najlepiej by łoby, gdyby 
za sekcję danej tkanki odpowiada ł ten sam prosektor w celu wyelimino ­
wania różnic międzyosobniczych w trakcie przetwarzania tkanek. Je żeli nie 
jest to mo żliwe, nale ży przygotowa ć proces sekcji w taki sposób, aby ka żdy 
prosektor przeprowadza ł sekcję danej tkanki we wszystkich grupach bada ­
nych zamiast jednej osoby prowadz ącej sekcję wszystkich tkanek z grupy 
kontrolnej, a innej osoby odpowiedzialnej za grupy badane. Nale ży zważyć 
każdą pomocnicz ą tkankę płciową bez osuszania jej z dok ładnością do 0,1 
mg i odnotowa ć te pomiary w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia. 
51. Szereg tkanek mo że być bardzo ma łych lub ich sekcja mo że sprawia ć 
trudności, co stanie si ę przyczyn ą zmienno ści. Wcześniejsze badania wska ­
zały zakres wspó łczynników zmienno ści, który wydaje si ę różnić 
w zależności od bieg łości laboratorium. W kilku przypadkach w obr ębie 
konkretnego laboratorium zaobserwowano znaczne ró żnice w masie 
bezwzględnej tkanek takich jak dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego 
i gruczoły Cowpera.  
52. Pomiar masy w ątroby, obu nerek i obu nadnerczy jest nieobowi ązkowy. 
Należy jeszcze raz zaznaczy ć, że tkanki nale ży pozbawi ć przylegaj ącej 
powięzi i tłuszczu. W ątrobę należy zważyć i pomiar odnotowa ć 
z dokładnością do 0,1 g; obie nerki i nadnercza zwa żyć i pomiar odnotowa ć 
z dokładnością do 0,1 mg. W ątroba, nerki i nadnercza nie tylko pozostaj ą 
pod wp ływem androgenów; stanowi ą równie ż źródło przydatnych 
wskaźników toksyczno ści ogólnoustrojowej.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 848
 
53. Pomiar poziomu hormonu luteinizuj ącego w surowicy (LH), hormonu 
folikulotropowego (FSH) i testosteronu (T) jest nieobowi ązkowy. 
Określenie poziomów T w surowicy jest przydatne, je żeli badana substancja 
chemiczna wywo łuje metabolizm w ątrobowy testosteronu, zmniejszaj ąc tym 
samym jego poziom w surowicy. Bez danych dotycz ących T dzia łanie takie 
może okazać się działaniem wywo łanym za po średnictwem mechanizmu 
antyandrogennego. Na podstawie poziomów LH mo żna uzyska ć informacje 
o zdolności antyandrogenu nie tylko do pomniejszania masy organów, ale 
także do oddzia ływania na funkcj ę podwzgórza-przysadki, co w badaniach 
długoterminowych mo że wywołać nowotwory j ąder. FSH jest wa żnym 
hormonem w procesie spermatogenezy. Pomiar poziomu T4 i T3 w surowicy, na podstawie którego uzyskano by dodatkowe informacje dotyczące zdolno ści do zak łócania homeostazy hormonu tarczycy, równie ż 
jest nieobowi ązkowy. Je żeli pomiary poziomów hormonów maj ą zostać 
wykonane, szczury nale ży poddać znieczuleniu przed sekcj ą i pobra ć 
krew przez punkcj ę serca, a metod ę znieczulania nale ży wybra ć 
z zachowaniem ostro żności w taki sposób, aby nie oddzia ływała na pomiar 
hormonów. Nale ży odnotowa ć metodę przygotowania surowicy, źródło do 
badania radioimmunologicznego lub inny zestaw pomiarowy, procedury analityczne oraz wyniki. Poziomy LH nale ży odnotowa ć jako ng na ml 
surowicy, a poziomy T tak że należy odnotowywa ć jako ng na ml surowicy.
 
54. Sekcja tkanek jest opisywana w nast ępujący sposób wraz ze szczegó łowymi 
informacjami dotycz ącymi sekcji, do których do łączone są zdjęcia, publi ­
kowane jako materia ły uzupełniające w ramach programu walidacyjnego 
(21). Materia ł wideo dotycz ący sekcji jest równie ż dostępny na stronach 
internetowych korea ńskiej Agencji ds. Żywności i Leków (22).  
— Po ułożeniu zwierz ęcia powierzchni ą brzuszną zwrócon ą do góry nale ży 
ustalić, czy napletek pr ącia oddzieli ł się od żołędzia. Jeżeli tak, nale ży 
następnie zsun ąć napletek i usun ąć żołądź, zważyć (z dokładnością do 
0,1 mg) i odnotowa ć pomiar.  
— Rozci ąć skórę i ścianę brzucha, ods łaniając narządy wewn ętrzne. Jeżeli 
dokonuje si ę nieobowi ązkowego pomiaru masy narz ądów, nale ży 
usunąć i zważyć wątrobę z dokładnością do 0,1 g, usun ąć żołądek 
i jelita, usun ąć i zważyć obie nerki i oba nadnercza z dok ładnością 
do 0,1 mg. W wyniku sekcji ods łonięty zostaje p ęcherz i rozpoczyna 
się sekcja docelowych m ęskich płciowych gruczo łów dodatkowych.  
— W celu przeprowadzenia sekcji dobrzusznego p łata gruczo łu krokowego 
należy oddzieli ć pęcherz od warstwy mi ęśnia brzusznego, przecinaj ąc 
tkankę łączną wzdłuż linii środkowej. Przesun ąć pęcherz do przodu 
w kierunku p ęcherzyków nasiennych, ods łaniając lewy i prawy 
dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego (pokrytego warstw ą tłuszczu). 
Ostrożnie wycisn ąć tłuszcz z prawego i lewego p łata dobrzusznego 
gruczołu krokowego. Delikatnie odsun ąć prawy dobrzuszny p łat 
gruczołu krokowego od cewki moczowej i odci ąć go od cewki moczo ­
wej. Przytrzymuj ąc prawy dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego, deli ­
katnie odsun ąć lewy dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego od cewki 
moczowej i nast ępnie dokona ć jego wyci ęcia; zważyć z dokładnością 
do 0,1 mg i odnotowa ć pomiar.  
— W celu przeprowadzenia sekcji p ęcherzyków nasiennych i gruczo łów 
koagulujących przesun ąć pęcherz w kierunku ogona, odkrywaj ąc nasie­
niowód oraz prawy i lewy p łat pęcherzyków nasiennych i gruczo łów 
koagulujących. Nale ży zapobiec wyciekowi p łynu przez zaci śnięcie 
kleszczyków chirurgicznych u podstawy p ęcherzyków nasiennych 
i gruczo łów koaguluj ących w miejscu łączenia si ę nasieniowodu 
z cewką moczow ą. Ostrożnie wyciąć pęcherzyki nasienne i gruczo ły 
koagulujące, zacisn ąć kleszczyki chirurgiczne i usun ąć tłuszcz 
i przydatki, umie ścić w szalce do wa żenia, zdjąć kleszczyki, zwa żyć 
z dokładnością do 0,1 mg i odnotowa ć pomiar.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 849
 
— W celu przeprowadzenia sekcji mi ęśnia dźwigacza odbytu i mi ęśnia 
opuszkowo-jamistego nale ży odsłonić mięśnie i podstaw ę prącia. 
Mięśnie dźwigacze odbytu otaczaj ą okrężnicę, a przednie mi ęśnie dźwi­
gacza odbytu i mi ęśnie opuszkowo-jamiste po łączone są z opuszkami 
prącia. Nale ży usunąć skórę i przydatki z okolicy oko łoodbytowej 
rozciągającej się od podstawy pr ącia do przedniej kraw ędzi odbytu. 
Mięśnie opuszkowo-jamiste odcina si ę stopniowo od opuszka pr ącia 
i tkanek. Po rozci ęciu okrężnicy na dwie cz ęści można dokona ć sekcji 
i usunąć mięśnie dźwigacze odbytu i mi ęśnie opuszkowo-jamiste. 
Mięśnie dźwigacze odbytu i mi ęśnie opuszkowo-jamiste nale ży oczyścić 
z tłuszczu i przydatków, zwa żyć z dokładnością do 0,1 mg i odnotowa ć 
pomiar.  
— Po usuni ęciu mięśni dźwigaczy odbytu i mi ęśni opuszkowo-jamistych 
można dojrze ć okrągłe gruczo ły Cowpera lub gruczo ły 
opuszkowo-cewkowe u podstawy opuszków pr ącia, nieco bli żej 
grzbietu. Nale ży zachowa ć ostrożność przy wycinaniu, aby unikn ąć 
naruszenia cienkiej torebki i wycieku p łynu. Nale ży zważyć oba 
gruczoły Cowpera lub gruczo ły opuszkowo-cewkowe z dok ładnością 
do 0,1 mg i odnotowa ć pomiar.  
— Ponadto je żeli w trakcie sekcji i wycinania nast ąpi utrata p łynu 
z któregokolwiek gruczo łu, fakt ten nale ży odnotowa ć. 
55. Jeżeli ocena ka żdej substancji chemicznej wymaga sekcji wi ększej liczby 
zwierząt niż liczba, jak ą można wykona ć w ciągu jednego dnia, rozpocz ęcie 
badań można rozłożyć na dwa kolejne dni, co skutkuje roz łożeniem sekcji 
i związanych z tym prac na dwa dni. Je żeli nastąpi takie roz łożenie bada ń 
w czasie, nale ży wykorzysta ć połowę zwierząt z grupy badanej.  
56. Zwłoki zwierz ąt należy zutylizowa ć w odpowiedni sposób po przeprowa ­
dzeniu sekcji.  
SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Dane  
57. Dane nale ży zgłaszać indywidualnie (tj. masa cia ła, masa dodatkowych 
gruczołów płciowych, pomiary nieobowi ązkowe i inne reakcje oraz 
spostrzeżenia) i w odniesieniu do ka żdej grupy zwierz ąt (średnie 
i odchylenia standardowe wszystkich dokonanych pomiarów). Dane nale ży 
zestawić w formie tabeli. Dane powinny okre ślać liczbę zwierząt na 
początku badania, liczb ę zwierząt, które ponios ły śmierć podczas badania 
lub które wykaza ły oznaki toksyczno ści, opis zaobserwowanych oznak 
toksyczno ści, w tym czas ich pojawienia si ę, czas trwania i dotkliwo ść. 
58. W ko ńcowym sprawozdaniu nale ży uwzględnić następujące informacje:  
Placówka badawcza:  
— nazwa obiektu, lokalizacja,  
— kierownik bada ń i pozostali pracownicy oraz ich obowi ązki w trakcie 
badań, 
— daty rozpocz ęcia i zako ńczenia bada ń, tj. kolejno pierwszy dzie ń poda­
wania badanej substancji chemicznej i ostatni dzie ń sekcji.  
Badana substancja chemiczna:  
— źródło, numer partii/serii, nazwa, czysto ść, pełny adres dostawcy 
i charakterystyka badanych substancji chemicznych,  
— właściwości fizyczne i w stosownych przypadkach w łaściwości 
fizykochemiczne,  
— warunki przechowywania oraz metoda i cz ęstotliwość przygotowywania 
rozcieńczeń, 
— wszelkie dane dotycz ące stabilno ści, 
— wszelkie analizy dawkowanych roztworów/zawiesin.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Nośnik: 
— charakterystyka no śnika (nazwa, dostawca i numer partii),  
— uzasadnienie wyboru danego no śnika (jeżeli nośnikiem nie jest woda).  
Badane zwierz ęta i procedury hodowli zwierz ąt: 
— wykorzystany gatunek/szczep i uzasadnienie jego wyboru,  
— źródło lub dostawca zwierz ąt, w tym pe łne dane adresowe,  
— liczba i wiek dostarczonych zwierz ąt, 
— warunki trzymania (temperatura, o świetlenie itp.),  
— pasza (nazwa, rodzaj, dostawca, numer partii, sk ład i, o ile s ą znane, 
poziomy fitoestrogenów),  
— ściółka (nazwa, rodzaj, dostawca, sk ład), 
— warunki umieszczania zwierz ąt w klatkach i liczba zwierz ąt przypa­
dająca na jedn ą klatkę. 
Warunki testu:  
— wiek w momencie kastracji, czas trwania aklimatyzacji po kastracji,  
— indywidualne masy cia ła zwierząt na pocz ątku badania (z dok ładnością 
do 0,1 g),  
— proces randomizacji i zapis dotycz ący przydzielenia zwierz ąt do grupy 
nośnika, grupy odniesienia, grup badanej substancji chemicznej oraz 
klatek,  
— średnia i odchylenie standardowe mas cia ła w odniesieniu do ka żdej 
grupy w odniesieniu do ka żdego dnia wa żenia w trakcie bada ń, 
— uzasadnienie wyboru dawki,  
— droga podania badanej substancji chemicznej i uzasadnienie wyboru 
drogi nara żenia,  
— w przypadku stosowania testu dotycz ącego antyandrogenno ści, infor­
macje dotycz ące dawkowania propionatu testosteronu (dawka 
i objętość), 
— dawkowanie badanej substancji chemicznej (dawka i obj ętość), 
— czas dawkowania,  
— procedury dotycz ące sekcji, w tym sposoby wykrwawienia i środki 
znieczulenia,  
— jeżeli przeprowadza si ę analizę surowicy, nale ży przedstawi ć szczegóły 
zastosowanych metod. Na przyk ład jeżeli stosuje si ę RIA, nale ży przed­
stawić procedur ę RIA, źródło narzędzi używanych do RIA, daty 
wygaśnięcia przydatno ści narzędzi, procedur ę pomiaru scyntylacyjnego 
oraz standaryzacj ę. 
Wyniki:  
— codzienne obserwacje ka żdego zwierz ęcia w trakcie dawkowania, obej ­
mujące: 
— masę ciała (z dokładnością do 0,1 g),  
— objawy kliniczne (je żeli takie wyst ępują), 
— wszelkie pomiary lub uwagi w odniesieniu do spo życia pokarmu.  
— obserwacje w trakcie sekcji w odniesieniu do ka żdego zwierz ęcia, obej­
mujące: ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— datę sekcji,  
— grupę badaną, do której nale ży zwierzę, 
— numer identyfikacyjny zwierz ęcia, 
— prosektora,  
— porę dnia, kiedy wykonuje si ę sekcję i wycinanie,  
— wiek zwierz ęcia, 
— końcową masa cia ła przy sekcji, z wyszczególnieniem wszelkich istot ­
nych statystycznie wzrostów lub spadków,  
— kolejno ść wykrwawiania zwierz ęcia i wycinania w trakcie sekcji,  
— masy pi ęciu docelowych tkanek zale żnych od androgenów:  
— dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego (z dok ładnością do 0,1 mg),  
— pęcherzyki nasienne i gruczo ły koaguluj ące, w tym p łyny (oba, 
z dokładnością do 0,1 mg),  
— zespó ł mięśni dźwigaczy odbytu i mi ęśni opuszkowo-jamistych (z 
dokładnością do 0,1 mg),  
— gruczo ły Cowpera (waga obu gruczo łów natychmiast po sekcji, 
z dokładnością do 0,1 mg),  
— żołądź (waga natychmiast po sekcji, z dok ładnością do 0,1 mg),  
— masy tkanek z pomiarów nieobowi ązkowych, je żeli takie zosta ły 
wykonane:  
— wątroba (z dok ładnością do 0,1 g),  
— nerka (obie, z dok ładnością do 0,1 mg),  
— nadnercze (oba, z dok ładnością do 0,1 mg),  
— ogólne uwagi i spostrze żenia,  
— analiza poziomu hormonów w surowicy, je żeli taka zosta ła wykonana:  
— LH w surowicy (nieobowi ązkowe — ng na ml surowicy), oraz  
— poziom T w surowicy (nieobowi ązkowe — ng na ml surowicy),  
— ogólne uwagi i spostrze żenia.  
Zestawienie danych:  
Dane nale ży zestawi ć w formie tabeli obejmuj ącej wielko ść próby 
w odniesieniu do ka żdej grupy, średnią wartości, błąd standardowy średniej 
lub odchylenie standardowe. W tabelach nale ży uwzględnić masy cia ła 
zmierzone w trakcie sekcji, zmiany masy cia ła od rozpocz ęcia dawkowania 
aż do sekcji, masy docelowych p łciowych gruczo łów dodatkowych 
i wszelkie nieobowi ązkowe pomiary mas organów.  
Omówienie wyników  
Analiza wyników  
59. Nale ży dokona ć analizy statystycznej mas cia ła i organów zmierzonych 
w trakcie sekcji pod wzgl ędem właściwości takich jak homogeniczno ść 
wariancji z odpowiednimi przekszta łceniami danych w razie potrzeby. 
Grupy badane nale ży porówna ć z grupami kontrolnymi, korzystaj ąc 
z technik takich jak ANOVA, a nast ępnie porównanie w parach (np. jedno ­
stronny test Dunnetta) oraz kryterium ró żnicy statystycznej, na przyk ład p ≤ 
0,05. Nale ży zidentyfikowa ć grupy, które uzyskuj ą istotność statystyczn ą. 
Należy jednak unika ć „względnych” mas „organów” ze wzgl ędu na 
nieważne statystyczne za łożenia stanowi ące podstaw ę takich manipulacji 
danymi.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. W przypadku agonistów androgenów kontrol ę powinna stanowi ć grupa 
nośnika. Właściwości sposobu dzia łania badanej substancji chemicznej 
mogą doprowadzi ć do różnych reakcji wzgl ędnych mi ędzy tkankami, na 
przykład trenbolon, który nie mo że ulec przemianie pod wp ływem 5-alfa- 
reduktazy, ma bardziej widoczny wp ływ na mi ęsień dźwigacz odbytu 
i mięśnie opuszkowo-jamiste oraz żołądź niż propionat testosteronu. Istotny 
statystycznie wzrost (p ≤ 0,05) masy którychkolwiek dwóch lub wi ększej 
liczby spo śród pięciu docelowych tkanek zale żnych od androgenów 
(dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego, mi ęsień-dźwigacz odbytu i mi ęsień 
opuszkowo-jamisty, żołądź, gruczoły koaguluj ące oraz p ęcherzyki nasienne 
i gruczoły koaguluj ące) należy uznać za dodatni wynik dzia łania agonisty 
androgenu, przy czym pewien zwi ększony wzrost powinien cechowa ć 
wszystkie docelowe tkanki. Po łączoną ocenę wszystkich reakcji p łciowych 
gruczołów dodatkowych mo żna by uzyska ć, korzystaj ąc z odpowiedniej 
wielowymiarowej analizy danych. Mog łoby to poprawi ć jakość analizy, 
szczególnie w przypadkach, w których tylko pojedyncza tkanka odznacza się istotną statystycznie reakcj ą.
 
61. W przypadku antagonistów androgenu grup ę kontroln ą powinna stanowi ć 
grupa badana, której podano androgen referencyjny (wy łącznie propionat 
testosteronu). Charakterystyka dzia łania badanej substancji chemicznej 
może doprowadzi ć do różnych reakcji wzgl ędnych mi ędzy tkankami, na 
przykład inhibitory 5-alfa-reduktazy, jak finasteryd, maj ą bardziej widoczny 
wpływ na dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego ni ż na inne tkanki 
w porównaniu do silnych antagonistów receptora androgenowego, jak fluta ­
mid. Istotny statystycznie spadek (p ≤ 0,05) masy którychkolwiek dwóch 
lub większej liczby spo śród pięciu docelowych tkanek zale żnych od andro ­
genów (dobrzuszny p łat gruczo łu krokowego, mi ęsień-dźwigacz odbytu 
i mięsień opuszkowo-jamisty, żołądź, gruczoły koaguluj ące oraz p ęcherzyki 
nasienne i gruczo ły koaguluj ące) w stosunku do dawkowania samego 
propionatu testosteronu nale ży uznać za dodatni wynik dzia łania antago ­
nisty androgenu, przy czym pewien zwi ększony wzrost powinien cechowa ć 
wszystkie docelowe tkanki. Po łączoną ocenę wszystkich reakcji p łciowych 
gruczołów dodatkowych mo żna by uzyska ć, korzystaj ąc z odpowiedniej 
wielowymiarowej analizy danych. Mog łoby to poprawi ć jakość analizy, 
szczególnie w przypadkach, w których tylko pojedyncza tkanka odznacza 
się istotną statystycznie reakcj ą. 
62. Dane nale ży zestawi ć w formie tabeli, obejmuj ącej średnią, błąd standar ­
dowy średniej (odchylenie standardowe równie ż byłoby dopuszczalne) oraz 
wielkość próby w odniesieniu do ka żdej grupy. Nale ży również dołączyć 
poszczególne tabele z danymi. Nale ży przeanalizowa ć wartości indywi ­
dualne, średnią, błąd standardowy (odchylenie standardowe) i warto ści 
współczynnika zmienno ści dla danych kontroli w celu ustalenia, czy spe ł­
niają one dopuszczalne kryteria pod wzgl ędem spójno ści z przewidywanymi 
wartościami historycznymi. Wspó łczynniki zmienno ści, które przekraczaj ą 
wartości współczynnika zmienno ści przedstawione w tabeli 1 (zob. pkt 25 
i 26) w odniesieniu do ka żdej masy narz ądu powinny wskazywa ć, czy 
istnieją błędy w zapisie lub wprowadzaniu danych lub czy laboratorium 
osiągnęło już biegłość w przeprowadzaniu dok ładnej sekcji tkanek zale ż­
nych od androgenów i czy uzasadnione jest zalecanie dalszych szkole ń/ 
praktyki w tym zakresie. Zasadniczo wspó łczynniki zmienno ści (odchylenie 
standardowe podzielone przez średnią masę narządu) są odtwarzalne 
w ramach ró żnych bada ń prowadzonych przez ró żne laboratoria. Przedsta ­
wione dane powinny obejmowa ć co najmniej: dobrzuszny p łat gruczo łu 
krokowego, p ęcherzyk nasienny, mi ęsień dźwigacz odbytu i mi ęsień 
opuszkowo-jamisty, gruczo ły Cowpera, żołądź, wątrobę i masy cia ła oraz 
zmiany mas cia ła od pocz ątku dawkowania a ż do sekcji. Dane mo żna 
przedstawi ć także po skorygowaniu kowariancji w odniesieniu do masy 
ciała, jednak nie powinno to zast ępować przedstawienia danych nieskory ­
gowanych. Ponadto je żeli oddzielenie napletka nie wyst ąpiło w żadnej 
z grup, przypadek ten nale ży odnotowa ć i porówna ć statystycznie z grup ą 
kontrolną, stosując dokładny test Fishera.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Sprawdzaj ąc wprowadzone dane komputerowe z oryginalnymi arkuszami 
danych pod wzgl ędem dokładności, wartości masy narz ądów, które nie s ą 
biologicznie wiarygodne lub ró żnią się ponad trzema odchyleniami standar ­
dowymi od średniej w grupie badanej, nale ży dokładnie przeanalizowa ć 
i ewentualnie rozwa żyć konieczno ść odrzucenia ich, poniewa ż prawdopo ­
dobnie stanowi ą one błędy zapisu.  
64. Porównanie wyników bada ń z warto ściami wspó łczynnika zmienno ści 
OECD (w tabeli 1) cz ęsto jest wa żnym krokiem w kierunku interpretacji 
w zakresie wa żności wyników bada ń. Należy zachowa ć dane historyczne 
dotyczące grup kontrolnych no śnika w laboratorium. Dane historyczne 
dotyczące reakcji na pozytywne substancje chemiczne odniesienia, takie 
jak propionat testosteronu i flutamid, równie ż należy zachowa ć 
w laboratorium. Laboratoria mog ą także okresowo bada ć reakcję na dzia­ 
łanie znanych s łabych agonistów i antagonistów androgenów 
i przechowywa ć te dane. Dane te mo żna porówna ć z dostępnymi danymi 
OECD, aby zapewni ć statystyczn ą dokładność i moc metod stosowanych 
przez laboratorium.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Dodatek 1  
DEFINICJE:  
Androgenny  jest terminem stosowanym do okre ślenia dodatniego wp ływu na 
rozwój tkanek zale żnych od androgenów.  
Antyandrogenny  oznacza zdolno ść substancji chemicznej do t łumienia dzia łania 
propionatu testosteronu w organizmie ssaków.  
Substancja chemiczna  oznacza substancj ę lub mieszanin ę. 
Data urodzenia  oznacza dzie ń 0 po urodzeniu.  
Dawka  oznacza ilo ść podawanej badanej substancji chemicznej. Do celów testu 
biologicznego Hershbergera dawk ę wyraża się jako mas ę badanej substancji 
chemicznej na jednostkow ą masę ciała zwierzęcia na dob ę (np. mg/kg masy 
ciała/dobę). 
Dawkowanie  jest terminem ogólnym obejmuj ącym dawk ę, częstotliwość i czas 
trwania dawkowania.  
Agonalny  jest terminem stosowanym do okre ślenia zwierz ęcia w stanie śmierci, 
tj. zbliżającego się do momentu śmierci.  
Dzień X po urodzeniu  oznacza X-ty dzie ń życia od dnia urodzenia.  
Czułość oznacza potencja ł metody badawczej w zakresie poprawnego identyfi ­
kowania substancji chemicznych posiadaj ących badan ą właściwość. 
Swoistość oznacza potencja ł metody badawczej w zakresie poprawnego identy ­
fikowania substancji chemicznych nieposiadaj ących badanej w łaściwości. 
Badana substancja chemiczne  oznacza ka żdą substancj ę lub mieszanin ę badaną 
za pomoc ą opisywanej metody badawczej.  
Walidacja  oznacza proces naukowy opracowany w celu scharakteryzowania 
wymogów operacyjnych i ogranicze ń metody badawczej oraz w celu przedsta ­
wienia jej wiarygodno ści i znaczenia w odniesieniu do poszczególnego celu.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Dodatek 2
  
VMG mamm: zespó ł zarządzania walidacj ą ds. bada ń i oceny ssaków
 UWAGI DO POWY ŻSZYCH RAM  
Uwaga 1:  Istnieje mo żliwośćrozpoczynania i rezygnacji na wszystkich pozio ­
mach i zale ży to od charakteru istniej ącego zapotrzebowania na 
informacje do celów oceny zagro żenia i ryzyka.  
Uwaga 2:  Na poziomie 5 w badaniach z zakresu ekotoksykologii nale ży 
zawrzeć punkty ko ńcowe wskazuj ące mechanizmy niepo żądanych 
skutków i potencjalne szkody dla populacji.  
Uwaga 3:  W przypadku gdy model multimodalny obejmuje kilka testów poje ­
dynczych punktów ko ńcowych, przedmiotowy model zast ąpi stoso­
wanie tych testów pojedynczych punktów ko ńcowych.  
Uwaga 4:  Ocena ka żdej substancji chemicznej powinna opiera ć się na indy­
widualnych przypadkach, z uwzgl ędnieniem wszystkich dost ęp­
nych informacji, maj ąc na uwadze rol ę poziomów powy ższych 
ram koncepcyjnych.  
Uwaga 5:  Obecnie nie nale ży traktowa ć powyższych ram koncepcyjnych jako 
wytycznych obejmuj ących wszystkie kwestie. Poziomy 3, 4 i 5 
obejmują testy, które s ą dostępne lub w odniesieniu do których 
trwa proces walidacji. W odniesieniu do tej ostatniej kwestii testy 
te zosta ły tymczasowo w łączone. Po ich opracowaniu 
i przeprowadzeniu walidacji zostan ą oficjalnie dodane do ram 
koncepcyjnych.  
Uwaga 6:  Nie nale ży uznawa ć, że poziom 5 zawiera wy łącznie badania osta ­
teczne. Uznaje si ę, że badania uwzgl ędnione na tym poziomie 
przyczyniaj ą się do ogólnej oceny zagro żenia i ryzyka.  
LITERATURA  
(1) OECD (1998), ‘Report of the First Meeting of the OECD Endocrine 
Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force’, 10–11 marca 1998 r., ENV/MC/CHEM/RA(98)5.
 
(2) Dorfman, R.I. (1962),  Standard methods adopted by official organiza ­
tion,Academic Press, NY.  
(3) Gray, L.E. Jr, Furr, J. i Ostby, J.S. (2005), ‘Hershberger assay to inves ­
tigate the effects of endocrine disrupting compounds with androgenic and 
antiandrogenic activity in castrate-immature male rat.’ [w:]  Current Proto ­
cols in Toxicology  16.9.1–16.9.15. J. Wiley and Sons, Inc.  
(4) OECD (2006), ‘Final OECD report of the initial work towards the vali ­
dation of the rat Hershberger assay. Phase 1. Androgenic response to 
testosterone propionate and anti-androgenic effects of flutamide’,  Environ­
mental Health and Safety, Monograph Series on Testing and Assessment 
no. 62 . ENV/JM/MONO(2006)30.  
(5) OECD (2008), ‘Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
Bioassay: Phase 2: Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and a 5a-Reductase Inhibitor in Dose Response Studies by Multiple Labo ­
ratories’,  Environmental Health and Safety, Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 86 . ENV/JM/MONO(2008)3.
 
(6) OECD (2007), ‘Report of the Validation of the Rat Hershberger Assay: 
Phase 3: Coded Testing of Androgen Agonists, Androgen Antagonists and 
Negative Reference Chemicals by Multiple Laboratories. Surgical Castrate Model Protocol’,  Environmental Health and Safety, Monograph Series on 
Testing and Assessment No . 73, ENV/JM/MONO(2007)20.
 
(7) Owens, W., Zeiger, E., Walker, M., Ashby, J., Onyon, L., Gray, Jr, L.E. 
(2006), ‘The OECD programme to validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses. Phase 
1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol’,  Env. Health Persp.  114:1265–1269.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
(8) Owens, W., Gray, L.E., Zeiger, E., Walker, M., Yamasaki, K., Ashby, J., 
Jacob, E. (2007), ‘The OECD program to validate the rat Hershberger 
bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studiem’,  Environ Health Perspect.  
115(5):671–8.
 
(9) Korenchevsky, V. (1932), ‘The assay of testicular hormone preparations’,  
Biochem J  26:413–422.  
(10) Korenchevsky, V., Dennison, M., Schalit, R. (1932), ‘The response of 
castrated male rats to the injection of the testicular hormone’,  Biochem J  
26:1306–1314.  
(11) Eisenberg, E., Gordan, G.S. (1950), ‘The levator ani muscle of the rat as 
an index of myotrophic activity of steroidal hormones’,  J Pharmacol Exp 
Therap  99:38–44.  
(12) Eisenberg, E., Gordan, G.S., Elliott, H.W. (1949), ‘Testosterone and tissue 
respiration of the castrate male rat with a possible test for mytrophic activity’,  Endocrinology  45:113–119.
 
(13) Hershberger, L., Shipley, E., Meyer, R. (1953), ‘Myotrophic activity of 
19-nortestosterone and other steroids determined by modified levator ani 
muscle metod’,  Proc Soc Exp Biol Med  83:175–180.  
(14) Hilgar, A.G., Vollmer, E.P. (1964),  Endocrine bioassay data: Androgenic 
and myogenic , Washington DC: United States Public Health Service.  
(15) Dorfman, R.I. (1969). ‘Androgens and anabolic agents’, [w:]  Methods in 
Hormone Research, volume IIA,  (Dorfman, R.I., red.) New York: 
Academic Press, 151–220.  
(16) Massaro, E.J. (2002),  Handbook of Neurotoxicology, volume I.  New York: 
Humana Press, s. 38.  
(17) (OECD) (2000), ‘Guidance Document on the recognition, assessment and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation’,  Environmental Health and Safety Monograph Series on 
Testing and Assessment No. 19 . ENV/JM/MONO(2000)7.
 
(18) OECD (1982),  Organizacja Wspó łpracy Gospodarczej i Rozwoju  — Prin­
ciples of Good Laboratory Practice , ISBN 92-64-12367-9, Paris.  
(19) OECD (2008), ‘Acute oral toxicity — up-and-down procedure’,  OECD 
Guideline for the testing of chemicals No 425.  
(20) OECD (2001), ‘Guidance document on acute oral toxicity’,  Environmental 
Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24,  
ENV/JM/MONO(2001)4.  
(21) Materia ły uzupełniające do Owens i in. (2006), ‘The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol’,  Env. Health 
Persp.  114:1265–1269. Zob. sekcja II, wytyczne dotycz ące przeprowa ­
dzania sekcji zapewniane laboratoriom, dost ępne na stronie internetowej: 
http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf.
 
(22) Korea Food and Drug Administration. Referencyjny przewodnik wizualny 
dotyczący procedury testu Hershbergera zawieraj ący materia ł wideo na 
temat sekcji. Dost ępny na stronie internetowej: http://rndmoa.kfda.go.kr/ 
endocrine/reference/education_fr.html.  
(23) OECD (2008), ‘Background Review Document on the Rodent Hershberger 
Bioassay’,  Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing 
and Assessment No. 90,  ENV/JM/MONO(2008)17.  
(24) OECD (2008),  Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
Male Rat Version of the Hershberger Bioassay.  
(25) OECD (2009), ‘Guidance Document on the Weanling Hershberger 
Bioassay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic proper ­
ties’,  Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
(26) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 
22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierz ąt wykorzystywanych do 
celów naukowych (Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33).  
(27) Nast ępujące rozdzia ły niniejszego za łącznika:  
B.1 bis, toksyczno ść ostra pokarmowa — procedura z wykorzystaniem 
stałej dawki  
B.1 ter, toksyczno ść ostra pokarmowa — metoda klas ostrej toksyczno ści ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56.  ROZSZERZONE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI REPRODUK ­
CYJNEJ JEDNEGO POKOLENIA  
WPROWADZENIE  
1. Opisywana metoda badawcza jest zgodna z dotycz ącą badań wytyczn ą 
OECD nr 443 (2012 r.). Metoda ta opiera si ę na propozycji Mi ędzynaro­
dowego Instytutu Nauk Biologicznych (ILSI)-Instytutu Bada ń Środowi­
skowo-Zdrowotnych (HESI), Komitetu Technicznego ds. Oceny Bezpie ­
czeństwa Chemicznego w Rolnictwie (ACSA) dotycz ącej rozszerzonego 
badania toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia na etapie życia 
pokolenia F  1 , jak przedstawiono w publikacji Cooper i in., 2006 r. (1). 
W projekcie badania wprowadzono kilka ulepsze ń i wyja śnień, aby 
zapewnić elastyczno ść i podkre ślić znaczenie wykorzystania z istniej ącej 
wiedzy z jednoczesnym uwzgl ędnieniem obserwacji na żywych zwierz ętach 
w celu ukierunkowania i dostosowania bada ń. Przedmiotowa metoda 
badawcza zapewnia szczegó łowy opis prowadzenia rozszerzonego badania 
toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia. W ramach tej metody 
badawczej opisuje si ę trzy kohorty zwierz ąt z pokolenia F  1 : 
kohorta 1:  ocena reprodukcyjnych/rozwojowych punktów ko ńcowych; 
kohortę tę można rozszerzy ć na pokolenie F  2 , 
kohorta 2:  ocena potencjalnego wp ływu nara żenia na dzia łanie substancji 
chemicznych na rozwijaj ący się układ nerwowy,  
kohorta 3:  ocena potencjalnego wp ływu nara żenia na dzia łanie substancji 
chemicznych na rozwijaj ący się układ odporno ściowy.  
2. Decyzje dotycz ące tego, czy przeprowadzi ć ocenę drugiego pokolenia 
i pominąć kohortę neurotoksyczno ści rozwojowej lub kohort ę immunoto ­
ksyczności rozwojowej, powinny odzwierciedla ć stan istniej ącej wiedzy na 
temat substancji chemicznej podlegaj ącej ocenie, a tak że potrzeby ró żnych 
organów regulacyjnych. Celem omawianej metody badawczej jest przedsta ­
wienie szczegó łowych informacji o mo żliwych sposobach przeprowadzenia 
badania i wyja śnienie, w jaki sposób nale ży oceniać każdą kohortę. 
3. Procedura podejmowania decyzji dotycz ącej wewn ętrznego uruchamiania 
tworzenia drugiego pokolenia jest opisana w wytycznej OECD nr 117 (39) skierowanej do tych organów regulacyjnych, które stosuj ą wewnętrzne 
czynniki uruchamiaj ące.
 
USTALENIA WST ĘPNE I CELE  
4. Głównym celem rozszerzonego badania toksyczno ści reprodukcyjnej 
jednego pokolenia jest ocena poszczególnych etapów życia nieobj ętych 
innymi rodzajami bada ń toksyczno ści oraz zbadanie skutków, które mog ą 
pojawić się w wyniku nara żenia na dzia łanie substancji chemicznych 
w okresie przed- i pourodzeniowym. W przypadku reprodukcyjnych punktów ko ńcowych przewiduje si ę, że pierwszym krokiem jest wykorzys ­
tanie, w miar ę dostępności, informacji z bada ń toksyczno ści dawki powtó ­
rzonej (w tym bada ń przesiewowych toksyczno ści reprodukcyjnej, np. 
wytyczna OECD nr 422 (32)) lub z krótkoterminowych bada ń przesiewo ­
wych substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu hormonalnego (np. 
test wzrostu macicy — metoda badawcza B.54 (36) i test Hershbergera — 
metoda badawcza B.55 (37)) w celu wykrycia wp ływu na narz ądy 
rozrodcze samców i samic. Mo że to dotyczy ć spermatogenezy (histopato ­
logii jąder) w przypadku samców oraz cykli estrogenowych, liczby p ęche­
rzyków jajnikowych/dojrzewania oocytów oraz integralno ści jajników (his ­
topatologii) w przypadku samic. Rozszerzone badanie toksyczno ści repro­
dukcyjnej jednego pokolenia s łuży zatem jako badanie reprodukcyjnych 
punktów ko ńcowych, które wymagaj ą interakcji samców z samicami, 
samic z jajem p łodowym oraz samic z potomstwem i pokoleniem F
 1 aż 
do osiągnięcia dojrza łości płciowej (zob. wytycza OECD nr 151 dotycz ąca 
tej metody badawczej (40)).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. Przedmiotowa metoda badawcza ma zapewni ć ocenę przed- 
i pourodzeniowego wp ływu dzia łania substancji chemicznych na rozwój, 
a także dogłębną ocenę toksyczno ści ogólnoustrojowej u samic w okresie 
ciąży i laktacji oraz u m łodego i doros łego potomstwa. Oczekuje si ę, że 
szczegółowe badanie g łównych rozwojowych punktów ko ńcowych, takich 
jak żywotność potomstwa, zdrowie noworodków, stan rozwoju w momencie 
narodzin oraz rozwój fizyczny i funkcjonalny a ż do osiągnięcia doros łości, 
pozwoli zidentyfikowa ć konkretne organy docelowe u potomstwa. Ponadto 
badanie pozwoli uzyska ć lub potwierdzi ć informacje na temat wp ływu 
badanej substancji chemicznej na integralno ść i funkcjonowanie uk ładów 
rozrodczych doros łych samców i samic. Pod uwag ę brane s ą 
w szczególno ści, ale nie wy łącznie, nast ępujące parametry: czynno ść gonad, 
cykl estrogenowy, dojrzewanie plemników w naj ądrzach, zachowanie kopu ­
lacyjne, zap łodnienie, ci ąża, poród i laktacja. Ponadto informacje uzyskane 
z ocen neurotoksyczno ści rozwojowej i immunotoksyczno ści rozwojowej 
pozwolą scharakteryzowa ć potencjalne oddzia ływanie na te uk łady. Dane 
otrzymane z tych bada ń powinny umo żliwiać określenie poziomów dawko ­
wania, przy których nie obserwuje si ę szkodliwych zmian (poziomy 
NOAEL), najni ższych poziomów, przy których obserwuje si ę szkodliwe 
zmiany (LOAEL), lub dawek wyznaczaj ących dla ró żnych punktów ko ńco­
wych lub powinny zosta ć wykorzystane w celu scharakteryzowania 
skutków wykrytych w poprzednich badaniach toksyczno ści dawki powtó ­
rzonej lub s łużyć jako wskazówki dla kolejnych bada ń. 
6. Schemat protoko łu przedstawiono na rysunku 1. Badan ą substancj ę 
chemiczn ą podaje si ę w sposób ci ągły w dawkach stopniowanych kilku 
grupom dojrza łych płciowo samców i samic. Przedmiotowe pokolenie 
rodzicielskie (P) otrzymuje dawk ę przez ustalony okres poprzedzaj ący 
krycie (wybrany na podstawie dost ępnych informacji dla badanej substancji 
chemicznej; jednak przez co najmniej dwa tygodnie) oraz w trakcie dwuty ­
godniowego okresu krycia. Samcom z pokolenia P nadal podaje si ę 
substancję przynajmniej do momentu odsadzenia pokolenia F  1 . Należy im 
podawać substancj ę przez co najmniej 10 tygodni. Okres ten mo żna wydłu­ 
żyć, jeżeli zachodzi konieczno ść wyjaśnienia wp ływu na reprodukcj ę. 
Samicom z pokolenia P podaje si ę substancj ę również w trakcie ci ąży 
i laktacji a ż do zako ńczenia badania po odsadzeniu miotu (tj. przez 8–10 
tygodni). Potomstwo z pokolenia F  1 nadal otrzymuje badan ą substancj ę 
chemiczn ą od momentu odsadzenia do osi ągnięcia dorosłości. Jeżeli ocenie 
będzie poddane drugie pokolenie (zob. wytyczna OECD nr 117 (39)), 
potomstwo z pokolenia F  1 nadal będzie otrzymywa ło substancj ę aż do 
odsadzenia pokolenia F  2 lub do momentu zako ńczenia badania.  
7. Wszystkie zwierz ęta poddaje si ę obserwacjom klinicznym i badaniom pato ­
logicznym pod k ątem oznak toksyczno ści, ze szczególnym uwzgl ędnieniem 
integralno ści i funkcjonowania uk ładów rozrodczych samców i samic oraz 
zdrowia, wzrostu, rozwoju i funkcji rozrodczych potomstwa. Po odsadzeniu 
wybrane potomstwo przydziela si ę do specjalnych podgrup (kohorty 1–3, 
zob. pkt 33 i 34 oraz rys. 1) w celu prowadzenia dalszych bada ń, w tym 
dotyczących dojrza łości płciowej, integralno ści i funkcji narz ądów rozrod ­
czych oraz neurologicznych i behawioralnych punktów ko ńcowych, a tak że 
funkcji odporno ściowych.  
8. Przy prowadzeniu badania nale ży przestrzega ć zasad i ustale ń określonych 
w dokumencie zawieraj ącym wytyczne OECD nr 19 ‘Guidance Document 
on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpo ­
ints for experimental animals used in safety evaluations‘ (34) (Wytyczne dotyczące uznawania, oceny i wykorzystywania objawów klinicznych jako 
punktów humanitarnego zako ńczenia w odniesieniu do zwierz ąt doświad­
czalnych wykorzystywanych w ocenach bezpiecze ństwa).
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Kiedy dost ępna będzie wystarczaj ąca liczba bada ń umożliwiająca ustalenie 
wpływu tego nowego projektu badania, przedmiotowa metoda badawcza 
zostanie poddana przegl ądowi i w razie potrzeby poprawiona 
z uwzględnieniem zdobytych do świadczeń. 
Rysunek 1  
Schemat rozszerzonego badania toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia
  
OPIS METODY/PRZYGOTOWANIA DO BADANIA  
Zwierzęta 
Wybór gatunków zwierz ąt i szczepu  
10. Nale ży dokładnie rozwa żyć wybór gatunków do badania toksyczno ści 
reprodukcyjnej, uwzgl ędniając wszystkie dost ępne informacje. Ze wzgl ędu 
na zakres danych kontekstowych i porównywalno ść z badaniami toksycz ­
ności ogólnej gatunkiem preferowanym jest jednak zazwyczaj szczur i do 
tego gatunku odnosz ą się kryteria i zalecenia przedstawione 
w przedmiotowej metodzie badawczej. W przypadku wykorzystania innego 
gatunku nale ży przedstawi ć uzasadnienie i dokona ć odpowiednich modyfi ­
kacji w protokole. Nie nale ży wykorzystywa ć szczepów o niskiej p łodności 
i powszechnie znanej du żej częstości występowania samorzutnych wad 
rozwojowych.  
Wiek, masa cia ła i kryteria w łączenia do badania  
11. Nale ży wykorzystywa ć zdrowe zwierz ęta rodzicielskie, których wcze śniej 
nie poddawano procedurom badawczym. Nale ży objąć badaniem zarówno 
samce, jak i samice, przy czym samice powinny by ć nieródkami i nie mog ą 
być w ciąży. Zwierz ęta z pokolenia P powinny by ć dojrzałe płciowo, 
o podobnej masie (w obr ębie jednej p łci) w momencie rozpocz ęcia dawko ­
wania, w podobnym wieku (oko ło 90 dni) w momencie krycia oraz 
powinny by ć reprezentatywne dla danego gatunku i szczepu obj ętego bada ­
niem. Po dostarczeniu do laboratorium zwierz ęta należy poddać aklimaty ­
zacji przez co najmniej 5 dni. Zwierz ęta przydziela si ę losowo do grupy 
kontrolnej i grupy badanej w sposób, który zapewnia uzyskanie porówny ­
walnych średnich warto ści masy cia ła między grupami (tj. ± 20 % średniej).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Warunki trzymania i żywienia  
12. Temperatura w pomieszczeniu badawczym powinna wynosi ć 22 °C 
(± 3 °C). Wilgotno ść względna powinna by ć na poziomie 30–70 %, 
najlepiej w zakresie od 50 do 60 %. Cykl sztucznego o świetlenia nale ży 
ustawić na 12 godzin światła i 12 godzin ciemno ści. Można stosowa ć 
konwencjonalne pasze laboratoryjne, zapewniaj ąc nieograniczony dost ęp 
do wody pitnej. Nale ży zwrócić szczególn ą uwagę na zawarto ść fitoestro ­
genów w paszy, poniewa ż ich wysoki poziom w paszy mo że mieć wpływ 
na niektóre reprodukcyjne punkty ko ńcowe. Zaleca si ę standardowe pasze 
w otwartej formie u żytkowej, w których zmniejszono zawarto ść substancji 
estrogennych (2)(30). Na wybór paszy mo że mieć wpływ potrzeba zapew ­
nienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej w przypadku 
podawania jej w ramach opisywanej metody. Nale ży zweryfikowa ć skład, 
jednorodno ść i stabilno ść badanej substancji chemicznej w paszach. Pasz ę 
i wodę pitną należy regularnie bada ć na obecno ść zanieczyszcze ń. Próbki 
każdej partii paszy u żytej podczas badania nale ży przechowywa ć 
w odpowiednich warunkach (np. zamro żone w temperaturze – 20 °C) do 
momentu sporz ądzenia sprawozdania, na wypadek gdyby wyniki wymaga ły 
dalszej analizy sk ładników paszy.  
13. Zwierz ęta należy umieścić w klatkach w ma łych grupach osobników tej 
samej płci i nale żących do tej samej grupy badanej. Zwierz ęta można 
trzymać oddzielnie w celu unikni ęcia potencjalnych obra żeń (np. samce 
po okresie krycia). Procedury krycia nale ży przeprowadza ć w klatkach 
nadających się do tego celu. Po stwierdzeniu, że nastąpiła kopulacja, 
samice, które s ą prawdopodobnie zap łodnione, s ą umieszczane oddzielnie 
w klatkach porodowych lub matczynych, w których maj ą one dost ęp do 
właściwych i okre ślonych materia łów do budowy gniazda. Mioty trzyma si ę 
razem z matkami do odsadzenia. Zwierz ęta z pokolenia F  1 należy trzymać 
w małych grupach osobników tej samej p łci należących do tej samej grupy 
badanej od momentu odsadzenia a ż do zako ńczenia badania. Je żeli ma to 
uzasadnienie naukowe, zwierz ęta mogą być trzymane oddzielnie. Poziom 
zawartości fitoestrogenów w wybranym materiale ściółkowym powinien 
być minimalny.  
Liczba i identyfikacja zwierz ąt 
14. Zasadniczo ka żda grupa badana i grupa kontrolna powinna sk ładać się 
z wystarczaj ącej liczby kojarzonych par, aby otrzyma ć co najmniej 20 
zapłodnionych samic w ka żdej grupie dawkowania. Celem jest uzyskanie 
wystarczaj ącej liczby ci ąż, aby zapewni ć znaczącą ocenę potencjalnego 
wpływu substancji chemicznej na p łodność, ciążę i zachowania macierzy ń­
skie w pokoleniu P oraz wzrost i rozwój potomstwa z pokolenia F  1 od 
momentu pocz ęcia, aż do osiągnięcia dojrza łości. Jeżeli nie zostanie uzys ­
kana pożądana liczba zap łodnionych zwierz ąt, nie jest to równoznaczne 
z konieczno ścią unieważnienia badania i nale ży dokona ć indywidulanej 
oceny każdego przypadku, bior ąc pod uwag ę potencjalny zwi ązek przyczy ­
nowy z badan ą substancj ą chemiczn ą. 
15. Przed rozpocz ęciem dawkowania ka żdemu zwierz ęciu z pokolenia 
P przydziela si ę niepowtarzalny numer identyfikacyjny. Je żeli z danych 
historycznych zgromadzonych przez laboratorium wynika, że znaczna 
część samic mo że nie wykazywa ć regularnego (4- lub 5-dniowego) cyklu 
estrogenowego, wówczas zaleca si ę ocenę cykli estrogenowych przed 
rozpoczęciem dawkowania. Ewentualnie mo żna zwiększyć liczebno ść 
grupy, aby zapewni ć obecność w każdej grupie co najmniej 20 samic, 
które będą miały regularne (4- lub 5-dniowe) cykle estrogenowe 
w momencie rozpocz ęcia dawkowania. Ca łe potomstwo z pokolenia F  1 
identyfikuje si ę w sposób niepowtarzalny podczas pierwszego badania 
noworodków w dniu 0 lub 1 po urodzeniu. Przez ca ły okres trwania 
badania w odniesieniu do wszystkich zwierz ąt z pokolenia F  1 oraz, 
w stosownych przypadkach, z pokolenia F  2 należy prowadzi ć rejestr danych 
wskazujących na miot pochodzenia.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Badana substancja chemiczna  
Dostępne informacje na temat badanej substancji chemicznej  
16. Przegl ąd istniejących informacji jest istotny przy podejmowaniu decyzji 
w sprawie drogi podawania, wyboru no śnika, wyboru gatunku zwierz ąt, 
wyboru dawkowania i potencjalnych modyfikacji schematu dawkowania. 
Dlatego te ż, planując rozszerzone badanie toksyczno ści reprodukcyjnej 
jednego pokolenia, nale ży uwzględnić wszystkie dost ępne istotne infor ­
macje na temat badanej substancji chemicznej, tj. w łaściwości fizykoche ­
miczne, w łaściwości toksykokinetyczne (w tym dotycz ące metabolizmu 
charakterystycznego dla danego gatunku), w łaściwości toksykodynamiczne, 
zależności struktura-aktywno ść, procesy metaboliczne  in vitro , wyniki 
poprzednich bada ń toksyczno ści i istotne informacje na temat analogów 
strukturalnych. Wst ępne informacje na temat wch łaniania, dystrybucji, 
metabolizmu i wydalania (ADME) oraz bioakumulacji mo żna uzyska ć na 
podstawie struktury chemicznej, danych fizykochemicznych, stopnia wiązania z bia łkami osocza lub bada ń toksykokinetycznych, natomiast 
wyniki bada ń toksyczno ści są źródłem dodatkowych informacji, np. dotycz ­ 
ących poziomu NOAEL, metabolizmu lub indukcji metabolizmu.
 
Uwzględnienie danych toksykokinetycznych  
17. Chocia ż nie jest to wymagane, dane toksykokinetyczne uzyskane 
z przeprowadzonych wcze śniej bada ń służących wyznaczeniu zakresu 
dawki lub innych bada ń są niezwykle przydatne przy planowaniu projektu 
badania, wyborze dawki i interpretacji wyników. Szczególnie u żyteczne s ą 
dane, które: 1) weryfikuj ą narażenie rozwijaj ących się płodów i m łodych na 
działanie badanej substancji chemicznej (lub odpowiednich metabolitów); 2) 
zapewniaj ą szacunek dozymetrii wewn ętrznej; oraz 3) zapewniaj ą ocenę 
potencjalnego zale żnego od dawki nasycenia procesów kinetycznych. 
Należy równie ż uwzględnić dodatkowe dane toksykokinetyczne, je żeli są 
dostępne, takie jak profile metabolitów, przebieg st ężenia w czasie itp. 
Uzupełniające dane toksykokinetyczne mo żna równie ż gromadzi ć 
w trakcie g łównego badania, pod warunkiem że nie koliduje to 
z gromadzeniem i interpretacj ą punktów ko ńcowych badania g łównego.  
Zgodnie z ogóln ą wytyczn ą w trakcie planowania rozszerzonego badania 
toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia przydatny by łby nastę­
pujący zestaw danych toksykokinetycznych:  
— późny etap ci ąży (np. dzie ń 20 ciąży) — krew matki i krew p łodu, 
— środkowy etap laktacji (dzie ń 10 po urodzeniu) — krew matki, krew 
młodego lub mleko,  
— wczesny okres po odsadzeniu (np. dzie ń 28 po urodzeniu) — próbki 
krwi młodych po odsadzeniu.  
Określając konkretne anality (np. pierwotn ą substancj ę chemiczn ą lub meta ­
bolity) i schemat pobierania próbek, nale ży zachowa ć elastyczno ść. Na 
przykład liczba i czas pobierania próbek w danym dniu pobierania b ędą 
uzależnione od drogi nara żenia i wcze śniejszej wiedzy na temat w łaściwości 
toksykokinetycznych u zwierz ąt nieciężarnych. W przypadku bada ń, 
w których substancja badana podawana jest z pasz ą, wystarczaj ące jest 
pobieranie próbek jednokrotnie o tej samej porze ka żdego dnia podawania 
substancji, podczas gdy dawkowanie przez sond ę może wymaga ć dodatko­
wych pobra ń próbek w celu uzyskania lepszego szacunku zakresu 
wewnętrznych dawek. Nie jest jednak konieczne uzyskanie pe łnego prze ­
biegu stężenia w czasie w żadnym z dni pobierania. W razie potrzeby krew 
można łączyć według płci w ramach miotów do celów analiz p łodów 
i noworodków.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Droga podawania  
18. Przy wyborze drogi podania nale ży uwzgl ędnić drogę lub drogi 
w największym stopniu powi ązane z nara żeniem ludzi. Mimo że protokó ł 
opracowano z my ślą o podawaniu badanej substancji chemicznej z pasz ą, 
można go zmodyfikowa ć w celu podawania substancji inn ą drogą (z wodą 
pitną, przez sond ę, drogą wziewną, drogą naskórną) w zależności od cech 
charakterystycznych substancji i wymaganych informacji.  
Wybór no śnika 
19. W razie potrzeby badan ą substancj ę chemiczn ą rozpuszcza si ę lub przygo ­
towuje jako zawiesin ę w odpowiednim no śniku. Zaleca si ę, aby w miar ę 
możliwości przede wszystkim bra ć pod uwag ę zastosowanie roztworu/za ­
wiesiny w wodzie, a dopiero w dalszej kolejno ści roztworu/zawiesiny 
substancji w oleju (np. oleju kukurydzianym). W przypadku no śników 
innych ni ż woda właściwości toksyczne tego no śnika powinny by ć znane. 
Należy unikać stosowania no śników charakteryzuj ących się potencjaln ą 
swoistą toksyczno ścią (np. aceton, sulfotlenek dimetylu). Nale ży oznaczy ć 
stabilność badanej substancji chemicznej w no śniku. Jeżeli w celu 
ułatwienia dawkowania u żywa się nośnika lub innego dodatku, nale ży 
uwzględnić następujące cechy charakterystyczne: wp ływ na wch łanianie, 
dystrybucj ę, metabolizm lub zatrzymywanie badanej substancji chemicznej; 
wpływ na właściwości chemiczne badanej substancji chemicznej, co mo że 
zmienić jej charakterystyk ę toksyczn ą; oraz wp ływ na przyjmowanie 
pokarmu lub wody lub stan od żywienia zwierz ąt. 
Wybór dawki  
20. Zasadniczo w ramach badania nale ży podać co najmniej trzy dawki 
i zapewni ć równoczesn ą kontrolę. Przy wyborze odpowiednich poziomów 
dawek badacz powinien uwzgl ędnić wszystkie dost ępne informacje, w tym 
informacje dotycz ące dawkowania z poprzednich bada ń, dane toksykokine ­
tyczne uzyskane w badaniach zwierz ąt ciężarnych lub nieci ężarnych, zakres 
przenoszenia w trakcie laktacji i szacunki dotycz ące narażenia ludzi. Je żeli 
dostępne są dane toksykokinetyczne, które wskazuj ą na zależne od dawki 
nasycenie procesów toksykokinetycznych, nale ży zachowa ć ostrożność 
w celu unikni ęcia wysokich dawek, które wyra źnie wskazuj ą na nasycenie, 
oczywiście pod warunkiem że oczekuje si ę narażenia ludzi na poziomie 
znacznie ni ższym od punktu nasycenia. W takich przypadkach najwy ższa 
dawka powinna odpowiada ć punktowi przegi ęcia lub nieco przewy ższać ten 
punkt w odniesieniu do przej ścia na nielinearne zachowanie 
toksykokinetyczne.  
21. W przypadku braku istotnych danych toksykokinetycznych dawki nale ży 
ustalać w oparciu o efekty toksyczne, chyba że są one ograniczone fizyko ­
chemicznymi w łaściwościami badanej substancji chemicznej. Je żeli dawki 
określono na podstawie toksyczno ści, należy wybrać najwyższą dawkę 
w celu wywo łania pewnej toksyczno ści ogólnoustrojowej, ale nie śmierci 
ani powa żnego cierpienia zwierz ąt. 
22. Nale ży dobrać malejącą sekwencj ę dawek w celu wykazania wszelkich 
zależności dawka-odpowied ź i ustalenia poziomów NOAEL lub dawek 
bliskich granicy wykrywalno ści, które pozwoli łyby określić dawkę wyzna­
czającą dla najbardziej wra żliwych punktów ko ńcowych. Aby unikn ąć 
dużych odst ępów w podawaniu dawek mi ędzy poziomami NOAEL 
i LOAEL, optymalne s ą często podwójne lub poczwórne odst ępy. Dodanie 
czwartej grupy badanej jest cz ęsto bardziej zalecane ni ż stosowanie bardzo 
dużych odstępów (np. wspó łczynnik wi ększy od 10) mi ędzy dawkami.  
23. Z wyj ątkiem poddawania dzia łaniu badanej substancji chemicznej zwierz ęta 
w grupie kontrolnej traktuje si ę w identyczny sposób jak zwierz ęta w grupie 
badanej. Grupa ta powinna stanowi ć grupę, której substancja nie jest poda ­
wana, lub grup ę kontroln ą poddaną terapii pozorowanej b ądź grupę 
kontrolną nośnika, jeżeli przy podawaniu badanej substancji chemicznej 
stosowany jest no śnik. Jeżeli w badaniu u żywa się nośnika, grupa kontrolna 
powinna otrzyma ć największą zastosowan ą objętość nośnika. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Badanie graniczne  
24. Jeżeli badania toksyczno ści dawki powtórzonej nie daj ą objawów toksycz ­
ności przy dawce co najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła/dobę lub jeżeli nie 
przewiduje si ę objawów toksyczno ści na podstawie danych dotycz ących 
substancji chemicznych powi ązanych strukturalnie lub metabolicznie, wska ­
zujących na podobie ństwo w w łaściwościach metabolicznych  in vivo /in 
vitro,  badanie obejmuj ące kilka dawek mo że nie być konieczne. W takich 
przypadkach rozszerzone badanie toksyczno ści reprodukcyjnej jednego 
pokolenia mo żna przeprowadzi ć z wykorzystaniem grupy kontrolnej 
i pojedynczej dawki wynosz ącej co najmniej 1 000 mg/kg masy cia ła/dobę. 
Gdyby jednak przy tej dawce granicznej uzyskano dowody na toksyczno ść 
rozrodczą lub rozwojow ą, wymagane by łoby przeprowadzenie dalszych 
badań przy niższych dawkach w celu zidentyfikowania poziomu NOAEL. 
Czynniki zwi ązane z badaniem granicznym maj ą zastosowanie wy łącznie 
wówczas, gdy nara żenie ludzi nie wskazuje na konieczno ść zastosowania 
wyższej dawki.  
PROCEDURY  
Narażenie potomstwa  
25. Nara żenie na dzia łanie substancji w paszy jest preferowan ą metodą poda­
wania. Je żeli prowadzi si ę badania z wykorzystaniem sondy, nale ży pamię­
tać, że młode zwykle b ędą otrzymywa ły badaną substancj ę chemiczn ą tylko 
pośrednio przez mleko do momentu, a ż rozpocznie si ę dawkowanie 
bezpośrednie po odsadzeniu. W badaniach, w których substancje podaje 
się z paszą lub wod ą pitną, młode dodatkowo b ędą otrzymywa ły badaną 
substancję chemiczn ą bezpośrednio, gdy rozpoczn ą samodzielne od żywianie 
się w ostatnim tygodniu okresu laktacji. Nale ży rozwa żyć zmiany 
w projekcie badania, je żeli wydzielanie badanej substancji chemicznej 
w mleku jest niewielkie oraz w przypadku braku dowodu na ci ągłe nara­ 
żenie potomstwa na dzia łanie substancji. W takich przypadkach nale ży 
rozważyć bezpośrednie podawanie m łodym dawki w okresie laktacji na 
podstawie dost ępnych informacji toksykokinetycznych, toksyczno ści potom­
stwa lub zmian w biomarkerach (3)(4). Przed przeprowadzeniem bada ń 
polegających na bezpo średnim podawaniu dawek m łodym pozostaj ącym 
pod opiek ą matki nale ży starannie rozwa żyć korzyści i wady takiego 
rozwiązania (5).  
Schemat dawkowania i podawanie dawek  
26. Niektóre informacje na temat cyklów estrogenowych, histopatologii 
męskiego i żeńskiego uk ładu rozrodczego oraz analizy plemników 
w jądrach/najądrzach mo żna uzyska ć z wcześniejszych bada ń toksyczno ści 
dawki powtórzonej trwaj ących przez odpowiedni czas. Czas trwania poda ­
wania substancji w okresie poprzedzaj ącym krycie w ramach rozszerzonego 
badania toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia ma zatem na celu 
wykrycie wp ływu na zmiany funkcjonalne, które mog ą wpływać na zacho ­
wania kopulacyjne i zap łodnienie. Podawanie w okresie poprzedzaj ącym 
krycie powinno by ć na tyle d ługie, aby osi ągnąć stałe warunki nara żenia 
u samców i samic z pokolenia P. W wi ększości przypadków dwutygod ­
niowe podawanie substancji w okresie poprzedzaj ącym krycie uwa ża się za 
wystarczaj ące dla obu p łci. W przypadku samic taki okres obejmuje 3–4 
pełne cykle estrogenowe i powinien by ć wystarczaj ący, aby wykry ć 
wszelkie niepo żądane skutki dla cykliczno ści. W przypadku samców 
okres taki odpowiada czasowi, jaki jest wymagany do transportu dojrzewaj ­ 
ących plemników przez naj ądrza, i powinien pozwoli ć na wykrycie oddzia ­ 
ływania na plemniki po opuszczeniu j ąder (w trakcie ko ńcowych etapów 
spermiacji i dojrzewania plemników w naj ądrzach) podczas krycia. 
W momencie zako ńczenia badania, gdy planowana jest histopatologia 
jąder i naj ądrzy oraz analiza parametrów plemników, samce z pokolenia 
P i F  1 będą poddane dzia łaniu substancji przez co najmniej jeden pe łny cykl 
spermatogeniczny ((6)(7)(8)(9) i wytyczna OECD nr 151 (40)).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Scenariusze nara żenia na substancje w okresie poprzedzaj ącym krycie, 
dotyczące samców, mog łyby zosta ć dostosowane, gdyby toksyczno ść 
w odniesieniu do j ąder (upośledzenie spermatogenezy) lub wp ływ na inte ­
gralność plemników i ich funkcjonowanie zosta ły wyraźnie zidentyfikowane 
w trakcie wcze śniejszych bada ń. Podobnie w przypadku samic znany 
wpływ badanej substancji chemicznej na cykl estrogenowy, a co za tym 
idzie na receptywno ść seksualn ą, może uzasadni ć odmienne scenariusze 
narażenia na dzia łanie substancji w okresie poprzedzaj ącym krycie. 
W szczególnych przypadkach dopuszczalne mo że być rozpoczęcie poda­
wania substancji samicom z pokolenia P dopiero po uzyskaniu rozmazu 
zawierającego plemniki (zob. wytyczna OECD nr 151 (40)).  
28. Po ustaleniu okresu dawkowania w okresie poprzedzaj ącym krycie badan ą 
substancję chemiczn ą należy podawa ć zwierzętom stale przez 7 dni 
w tygodniu a ż do sekcji. Substancj ę należy podawa ć wszystkim zwierz ętom 
przy użyciu tej samej metody. Dawkowanie nale ży kontynuowa ć 
w dwutygodniowym okresie krycia oraz, w przypadku samic z pokolenia 
P, przez ca ły okres ci ąży i laktacji a ż do dnia zako ńczenia badania po 
odsadzeniu. Samcom nale ży podawa ć substancj ę w taki sam sposób a ż 
do zakończenia badania w momencie odsadzenia zwierz ąt z pokolenia F  1 . 
W przypadku sekcji pierwsze ństwo powinny mie ć samice, które nale ży 
poddać sekcji w tym samym/podobnym dniu laktacji. Sekcj ę samców 
można rozłożyć na większą liczbę dni w zale żności od mo żliwości labora­
torium. Bezpo średnie podawanie dawki samcom i samicom z pokolenia F  1 
powinno rozpocz ąć się w momencie odsadzenia i powinno trwa ć aż do 
zaplanowanej sekcji, w zale żności od przydzia łu do danej kohorty, chyba 
że dawkowanie rozpocz ęło się już w okresie laktacji.  
29. W przypadku substancji chemicznych podawanych z pasz ą lub wod ą pitną 
należy dopilnowa ć, aby ilości podawanej badanej substancji chemicznej nie 
zakłócały zwykłego odżywiania lub równowagi wodnej. Je żeli badana 
substancja chemiczna podawana jest z pasz ą, można zastosowa ć stałe 
stężenie w paszy (ppm) lub sta łą dawkę w odniesieniu do masy cia ła 
zwierzęcia; należy określić wybrany wariant.  
30. W przypadku podawania badanej substancji chemicznej przez sond ę ilość 
podawanego jednorazowo p łynu nie powinna zazwyczaj przekracza ć 1 
ml/100 g masy cia ła (0,4 ml/100 g masy cia ła stanowi maksymaln ą ilość 
w przypadku oleju, np. oleju kukurydzianego). Z wyj ątkiem substancji 
chemicznych o dzia łaniu drażniącym lub żrącym, które zwykle nasila si ę 
w wyższych stężeniach, nale ży minimalizowa ć zmienno ść objętości badanej 
substancji dzi ęki korygowaniu st ężenia w celu zapewnienia sta łej objętości 
przy wszystkich dawkach. Substancj ę należy podawa ć o podobnej porze 
każdego dnia. Dawk ę podawan ą każdemu zwierz ęciu należy zwykle 
określać na podstawie ostatniego pomiaru indywidualnej masy cia ła 
i dostosowywa ć co najmniej raz w tygodniu w przypadku doros łych 
samców i doros łych nieci ężarnych samic oraz co dwa dni w przypadku 
ciężarnych samic i zwierz ąt z pokolenia F  1 , jeżeli dawkę podaje si ę przed 
odsadzeniem i przez 2 tygodnie po odsadzeniu. Je żeli dane toksykokine ­
tyczne wskazuj ą na niskie przenikanie badanej substancji chemicznej przez 
łożysko, dawka podawana przez sond ę w ostatnim tygodniu ci ąży może 
wymagać dostosowania w celu unikni ęcia podania matce nadmiernie 
toksycznej dawki. W dniu porodu samicom nie nale ży podawa ć substancji 
przez sond ę ani żadną inną drogą podania wymagaj ącą opieki nad zwie ­
rzęciem; pomini ęcie podania badanej substancji chemicznej w tym dniu jest 
preferowane w celu unikni ęcia zakłócenia procesu porodu.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Krycie  
31. Każdą samicę z pokolenia P nale ży umieścić z jednym, losowo wybranym 
i niespokrewnionym z ni ą samcem z tej samej grupy dawkowania (koja ­
rzenie 1:1) a ż do momentu zaobserwowania, że nastąpiła kopulacja, lub na 
okres 2 tygodni. Je żeli liczba samców jest niewystarczaj ąca, na przyk ład na 
skutek śmierci samców przed kojarzeniem, wówczas mo żna kojarzy ć samca 
lub samce, które ju ż pokryły jedną samicę (1:1), z kolejn ą samicą lub 
kolejnymi samicami, tak aby wszystkie samice zosta ły skojarzone. Dzie ń 
0 ciąży określa się jako dzie ń, w którym potwierdzono wyst ąpienie krycia 
(wykrycie w pochwie czopu nasienia lub plemników). Po zaobserwowaniu, 
że nastąpiła kopulacja, zwierz ęta należy jak najszybciej rozdzieli ć. Jeżeli po 
upływie 2 tygodni krycie nie nast ąpi, zwierz ęta należy rozdzieli ć bez 
kolejnej mo żliwości krycia. W danych nale ży dokładnie zidentyfikowa ć 
kojarzone pary.  
Liczebno ść miotu  
32. W dniu 4 po urodzeniu liczebno ść każdego miotu mo żna dostosowa ć przez 
wyeliminowanie dodatkowych m łodych za pomoc ą doboru losowego, aby 
uzyskać, w miar ę możliwości, liczebno ść jednego miotu wynosz ącą pięć 
samców i pi ęć samic. Selektywna eliminacja m łodych, np. oparta na 
masie cia ła, jest nieodpowiednia. Ilekro ć liczba m łodych samców lub 
samic uniemo żliwia uzyskanie pi ęciu osobników ka żdej płci na miot, 
dopuszczalne jest cz ęściowe dostosowanie (na przyk ład sześć samców 
i cztery samice).  
Dobór m łodych do bada ń w okresie poodsadzeniowym (zob. rys. 1)  
33. W momencie odsadzenia (oko ło dnia 21 po urodzeniu) spo śród młodych 
z wszystkich dost ępnych miotów wybiera si ę do 20 zwierz ąt na grup ę 
dawkowania i grup ę kontroln ą w celu prowadzenia dalszych bada ń 
i utrzymuje a ż do osiągnięcia dojrza łości płciowej (chyba że wymagane 
są wcześniejsze badania). M łode dobiera si ę losowo, z wyj ątkiem 
ewidentnie s łabowitych osobników (zwierz ęta o masie cia ła o ponad dwa 
odchylenia standardowe ni ższej od średniej masy cia ła młodego w danym 
miocie), których nie nale ży włączać do badania, poniewa ż jest mało praw­
dopodobne, że będą one reprezentatywne dla grupy badanej.  
W dniu 21 po urodzeniu wybrane m łode z pokolenia F  1 przydziela si ę 
losowo do jednej z trzech kohort zwierz ąt w następujący sposób:  
kohorta 1 (1A i 1B) = badanie toksyczno ści reprodukcyjnej/rozwojowej,  
kohorta 2 (2A i 2B) = badanie neurotoksyczno ści rozwojowej,  
kohorta 3 = badanie immunotoksyczno ści rozwojowej.  
Kohorta 1A: jeden samiec i jedna samica/miot/grup ę (20/płeć/grupę): dobór 
priorytetowy do celów podstawowej oceny wp ływu na uk łady rozrodcze 
i oceny toksyczno ści ogólnej.  
Kohorta 1B: jeden samiec i jedna samica/miot/grup ę (20/płeć/grupę): dobór 
priorytetowy do celów oceny uzupe łniającej zdolno ści reprodukcyjnej 
u zwierząt z pokolenia F  1 w okresie krycia, w momencie poddawania 
ocenie (zob. wytyczna OECD nr 117 (39)) oraz do celów uzyskania dodat ­
kowych danych histopatologicznych w przypadkach substancji potencjalnie 
zaburzających funkcjonowanie uk ładu rozrodczego lub hormonalnego, lub 
gdy wyniki z kohorty 1A s ą niejednoznaczne.  
Kohorta 2A: łącznie 20 m łodych na grup ę (10 samców i 10 samic na grup ę; 
jeden samiec lub jedna samica na miot) przydzielonych do bada ń neurobe­
hawioralnych, a nast ępnie poddanych ocenie neurohistopatologicznej jako 
osobniki doros łe. 
Kohorta 2B: łącznie 20 m łodych na grup ę (10 samców i 10 samic na grup ę; 
jeden samiec lub jedna samica na miot) przydzielonych do oceny neurohis ­
topatologicznej w momencie odsadzenia (dzie ń 21 po urodzeniu lub dzie ń 
22 po urodzeniu). W przypadku niewystarczaj ącej liczby zwierz ąt preferuje 
się przydzielenie zwierz ąt do kohorty 2A.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Kohorta 3: łącznie 20 m łodych na grup ę (10 samców i 10 samic na grup ę; 
jedno na miot, w miar ę możliwości). Wymagane mog ą być dodatkowe 
młode z grupy kontrolnej jako zwierz ęta kontrolne dodatnie w te ście reakcji 
przeciwcia ł zależnej od limfocytów T w dniu 56 ± 3 po urodzeniu.  
34. Gdyby liczba m łodych w miocie okaza ła się niewystarczaj ąca, aby zape łnić 
wszystkie kohorty, pierwsze ństwo przys ługuje kohorcie 1, poniewa ż można 
ją rozszerzy ć w celu utworzenia pokolenia F  2 . W przypadku szczególnych 
wątpliwości, np. je żeli podejrzewa si ę, że substancja chemiczna jest 
substancją o działaniu neurotoksycznym, immunotoksycznym lub zabu ­
rzającą funkcjonowanie uk ładu rozrodczego, do ka żdej z kohort mo żna 
przydzieli ć dodatkowe m łode. Takie m łode można wykorzysta ć do bada ń 
w różnych punktach czasowych lub do oceny uzupe łniających punktów 
końcowych. M łode nieprzydzielone do kohort zostan ą poddane biochemii 
klinicznej (pkt 55) i pe łnemu rozpoznaniu histopatologicznemu (pkt 68).  
Drugie krycie zwierz ąt z pokolenia P  
35. W przypadku zwierz ąt z pokolenia P zwykle nie zaleca si ę drugiego krycia, 
ponieważ odbywałoby się ono kosztem utraty wa żnych informacji na temat 
liczby obszarów zagnie żdżenia (i w zwi ązku z tym danych dotycz ących 
straty poimplementacyjnej i oko łoporodowej, b ędących wska źnikami mo żli­
wego potencja łu teratogennego) w odniesieniu do pierwszego miotu. 
Z punktu widzenia konieczno ści weryfikacji lub wyja śnienia wp ływu na 
samice poddane dzia łaniu substancji odpowiedniejsze by łoby rozszerzenie 
badania w taki sposób, aby obejmowa ło ono krycie pokolenia F  1 . Drugie 
krycie samców z pokolenia P z samicami niepoddanymi dzia łaniu substancji 
zawsze stanowi jednak rozwi ązanie pozwalaj ące wyjaśnić niejednoznaczne 
wyniki lub mo że służyć do dalszej charakterystyki wp ływu na p łodność 
zaobserwowanego w pierwszym kryciu.  
OBSERWACJE NA ŻYWYCH ZWIERZ ĘTACH  
Obserwacje kliniczne  
36. Ogóln ą obserwacj ę kliniczną zwierząt z pokolenia P i wybranych zwierz ąt 
z pokolenia F  1 przeprowadza si ę raz dziennie. W przypadku dawkowania 
przez sond ę obserwacje kliniczne nale ży przeprowadza ć przed rozpocz ę­
ciem i po zako ńczeniu dawkowania (w celu wykrycia mo żliwych oznak 
toksyczno ści związanych z najwy ższym stężeniem w osoczu). Rejestruje 
się mające związek z badaniem zmiany w zachowaniu, objawy trudnego 
lub długotrwałego porodu oraz wszelkie oznaki toksyczno ści. Dwa razy 
dziennie, a w weekend raz dziennie, obserwuje si ę wszystkie zwierz ęta 
pod kątem ostrej toksyczno ści, zachorowalno ści i śmiertelno ści. 
37. Ponadto co tydzie ń przeprowadza si ę bardziej szczegó łowe badanie wszyst ­
kich zwierz ąt z pokole ń P i F  1 (po odsadzeniu) i najlepiej by łoby je prze ­
prowadza ć przy okazji wa żenia zwierz ęcia, co zminimalizowa łoby jego 
stres związany z tymi dzia łaniami. Nale ży starannie prowadzi ć obserwacje 
i rejestrowa ć ich wyniki za pomoc ą systemu punktowego okre ślonego przez 
dane laboratorium badawcze. Nale ży dołożyć starań, aby ró żnice 
w warunkach badania by ły minimalne. Odnotowane objawy powinny obej ­
mować między innymi zmiany w skórze, sier ści, oczach, b łonach śluzo­
wych, wyst ąpienie wydzielin i wydalin oraz aktywno ść autonomicznej 
części układu nerwowego (np. łzawienie, piloreksja, rozmiar źrenicy, zmie ­
niony rytm oddychania). Nale ży także rejestrowa ć zmiany w sposobie 
chodzenia, postawie, reakcji na kontakt, a tak że obecność ruchów klonicz ­
nych lub tonicznych, stereotypii (np. nadmiernego czyszczenia si ę, powta­
rzanego kr ęcenia się) lub dziwnych zachowa ń (np. samookaleczania, 
chodzenia do ty łu). ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 869
 
Masa cia ła i spożycie pokarmu/wody  
38. Osobniki z pokolenia P wa ży się w pierwszym dniu dawkowania, a potem 
co najmniej raz w tygodniu. Ponadto samice z pokolenia P wa ży się 
w okresie laktacji w tych samych dniach, w których odbywa si ę ważenie 
młodych z ich miotów (zob. pkt 44). Wszystkie zwierz ęta z pokolenia F  1 
waży się osobno przy odsadzeniu (dzie ń 21 po urodzeniu), a potem co 
najmniej raz w tygodniu. Mas ę ciała rejestruje si ę także w dniu, 
w którym zwierz ęta osiągną dojrzałość płciową (dzień pełnego oddzielenia 
napletka lub otwarcia pochwy). Wszystkie zwierz ęta waży się przy uśmier­
ceniu.  
39. W trakcie badania spo życie pokarmu i wody (w przypadku podawania 
badanej substancji chemicznej w wodzie pitnej) rejestruje si ę co najmniej 
raz w tygodniu w tych samych dniach, w których dokonuje si ę pomiaru 
masy cia ła zwierz ąt (z wy łączeniem okresu wspólnego przebywania 
w klatce). Spo życie pokarmu przez osobniki z pokolenia F  1 z każdej klatki 
rejestruje si ę co tydzie ń, począwszy od doboru zwierz ąt do poszczególnych 
kohort.  
Cykle estrogenowe  
40. Wst ępne informacje na temat wp ływu badanej substancji chemicznej na 
cykl estrogenowy mog ą być już dostępne z poprzednich bada ń toksyczno ści 
dawki powtórzonej i mo żna je wykorzysta ć przy opracowywaniu protoko łu 
dla badanej substancji chemicznej w odniesieniu do rozszerzonego badania toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia. Zazwyczaj ocena cyklicz ­
ności estrogenowej (za pomoc ą cytologii pochwy) rozpoczyna si ę na 
początku okresu podawania substancji i trwa do uzyskania potwierdzenia, 
że nastąpiło krycie, lub do zako ńczenia dwutygodniowego okresu krycia. 
Jeżeli samice zosta ły zbadane pod k ątem zwyk łych cykli estrogenowych 
przed podaniem substancji, wówczas przydatne jest kontynuowanie pobie ­
rania wymazów po rozpocz ęciu badania, ale je żeli istnieje obawa 
o wystąpienie niespecyficznych skutków na pocz ątku podawania substancji 
(takich jak pocz ątkowy znaczny spadek spo życia pokarmu), wówczas 
można dać zwierzętom czas do dwóch tygodni na przystosowanie si ę do 
podawania przed rozpocz ęciem dwutygodniowego okresu pobierania 
wymazów poprzedzaj ącego kojarzenie. Je żeli okres podawania substancji 
samicom zosta ł przedłużony w ten sposób (tj. do czterotygodniowego 
okresu podawania substancji przed okresem krycia), wówczas nale ży 
rozważyć nabycie m łodszych osobników i wyd łużenie okresu podawania 
substancji samcom przed kojarzeniem. Pobieraj ąc komórki 
z pochwy/szyjki, nale ży dołożyć wszelkich stara ń, aby unikn ąć uszkodzenia 
błony śluzowej i, w nast ępstwie, wywo łania ciąży rzekomej (10)(11).  
41. Wymazy z pochwy pochodz ące od wszystkich samic z pokolenia F  1 
w kohorcie 1A nale ży badać codziennie od momentu otwarcia pochwy a ż 
do zarejestrowania pierwszego wymazu zawieraj ącego komórki zrogowa ­
ciałe w celu okre ślenia odst ępu czasowego mi ędzy tymi dwoma zdarze ­
niami. Nale ży równie ż monitorowa ć cykle estrogenowe u wszystkich 
samic z pokolenia F  1 w kohorcie 1A przez okres dwóch tygodni, 
począwszy od oko ło dnia 75 po urodzeniu. Ponadto, w przypadku koniecz ­
ności krycia osobników z pokolenia F  1 , cytologi ę pochwy samic z kohorty 
1B wykonuje si ę od momentu kojarzenia a ż do uzyskania potwierdzenia, że 
nastąpiło krycie.  
Krycie i ci ąża 
42. Oprócz standardowych punktów ko ńcowych (np. masa cia ła, spożycie 
pokarmu, obserwacje kliniczne obejmuj ące kontrole śmiertelno ści/zachoro ­
walności) rejestruje si ę daty kojarzenia, dat ę inseminacji i dat ę porodu oraz 
oblicza si ę przerwę w kopulacji (od momentu kojarzenia do inseminacji) 
i okres ci ąży (od momentu inseminacji do porodu). W czasie przewidywa ­
nego porodu nale ży uważnie zbada ć samice z pokolenia P pod k ątem 
jakichkolwiek objawów dystocji. Nale ży rejestrowa ć wszelkie nietypowe 
zachowania zwi ązane z budow ą gniazda i opiek ą. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 870
 
43. Dzie ń, w którym nast ępuje poród, jest jednocze śnie dniem 0 laktacji dla 
matki i dniem 0 po urodzeniu dla potomstwa. Ewentualnie podstaw ą 
wszystkich porówna ń może być również czas po kopulacji, aby unikn ąć 
pomylenia danych dotycz ących rozwoju pourodzeniowego, które s ą spowo­
dowane ró żnicami w czasie trwania ci ąży, należy jednak równie ż zareje­
strować czas zwi ązany z porodem. Jest to niezwykle wa żne w przypadku, 
gdy badana substancja chemiczna wywiera wp ływ na czas trwania ci ąży. 
Parametry potomstwa  
44. Każdy miot nale ży zbadać po porodzie tak szybko, jak to mo żliwe (w dniu 
0 po urodzeniu lub w dniu 1), aby ustali ć liczbę młodych i ich p łeć, martwe 
urodzenia, żywe urodzenia i obecno ść wyraźnych anomalii (widoczne 
z zewnątrz nieprawid łowości, w tym rozszczep podniebienia, krwotok 
podskórny, nietypowy kolor skóry lub nietypowa tekstura skóry, obecno ść 
pępowiny, brak mleka w żołądku, obecno ść suchych wydzielin). Ponadto 
pierwsze badanie kliniczne noworodków powinna obejmowa ć ocenę 
jakościową temperatury cia ła, stanu ich aktywno ści i reakcji na kontakt. 
Młode, które zmar ły w dniu 0 po urodzeniu lub pó źniej, powinny zosta ć 
zbadane pod k ątem możliwych wad i przyczyny śmierci. Żywe młode są 
liczone i wa żone oddzielnie w dniu 0 lub 1 po urodzeniu, a nast ępnie 
regularnie, np. co najmniej w dniach 4, 7, 14 i 21 po urodzeniu. Badania kliniczne, stosowne do wieku zwierz ąt, należy powtarza ć przy wa żeniu 
zwierząt lub częś
ciej, jeżeli przy urodzeniu poczyniono szczególne ustalenia 
dla danego przypadku. Odnotowane objawy mog ą między innymi obej ­
mować nieprawid łowości zewnętrze, zmiany w skórze, sier ści, oczach, 
błonach śluzowych, wyst ąpienie wydzielin i wydalin oraz aktywno ść auto­
nomicznej cz ęści układu nerwowego. Nale ży także zarejestrowa ć zmiany 
w sposobie chodzenia, postawie, reakcji na kontakt oraz obecno ść ruchów 
klonicznych lub tonicznych, stereotypii lub dziwnych zachowa ń. 
45. Pomiar odleg łości anogenitalnej u ka żdego młodego nale ży przeprowadzi ć 
co najmniej raz mi ędzy dniem 0 a dniem 4 po urodzeniu. W dniu pomiaru 
odległości anogenitalnej nale ży dokona ć pomiaru masy cia ła młodego, 
a odległość anogenitaln ą należy znormalizowa ć w odniesieniu do pomiaru 
wielkości młodego, najlepiej jako pierwiastek kwadratowy z masy cia ła 
(12). W dniu 12 lub 13 po urodzeniu nale ży skontrolowa ć obecność 
brodawek sutkowych/otoczek brodawek sutkowych u m łodych samców.  
46. Wszystkie wybrane osobniki z pokolenia F  1 bada się codziennie pod k ątem 
oddzielenia napletka u samców lub otwarcia pochwy u samic, rozpoczy ­
nając przed przewidywanym dniem wyst ąpienia tych punktów ko ńcowych, 
tak aby wykry ć przypadki wcze śniejszego osi ągnięcia dojrza łości płciowej. 
Należy odnotowa ć wszelkie nieprawid łowości narządów układu rozrod ­
czego, takie jak trwa ła przegroda pochwy, spodziectwo lub żołądź rozszcze ­
piona. Dojrza łość płciową osobników z pokolenia F  1 porównuje si ę 
z rozwojem fizycznym, okre ślając wiek i mas ę ciała w momencie oddzie ­
lenia napletka u samców lub otwarcia pochwy u samic (13).  
Ocena potencjalnej neurotoksyczno ści rozwojowej (kohorty 2A i 2B)  
47. Do oceny neurotoksyczno ści należy wykorzysta ć 10 samców i 10 samic 
spośród zwierz ąt z kohorty 2A oraz 10 samców i 10 samic spo śród zwierz ąt 
z kohorty 2B z ka żdej grupy badanej (w odniesieniu do ka żdej kohorty: 1 
samiec i 1 samica na miot; wszystkie mioty s ą reprezentowane przez co 
najmniej jedno m łode; dobór losowy). Zwierz ęta z kohorty 2A nale ży 
poddać ocenie reakcji na nag ły dźwięk, zestawowi bada ń 
funkcjonalno-obserwacyjnych, ocenie aktywno ści ruchowej (zob. pkt 
48–50) i ocenie neuropatologicznej (zob. pkt 74–75). Nale ży dołożyć ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 871
 
starań, aby ró żnice we wszystkich warunkach badania by ły minimalne 
i niepowi ązane systematycznie z podawaniem. Do zmiennych, które mog ą 
wpłynąć na zachowanie, nale żą: poziom d źwięku (np. przerywany ha łas), 
temperatura, wilgotno ść, oświetlenie, zapachy, pora dnia i zak łócenia środo­
wiskowe. Wyniki testów neurotoksyczno ści należy interpretowa ć 
w odniesieniu do odpowiednich historycznych zakresów referncyjnych 
kontroli. Zwierz ęta z kohorty 2B nale ży wykorzysta ć do oceny neuropato ­
logicznej w dniu 21 lub 22 po urodzeniu (zob. pkt 74–75).  
48. W dniu 24 po urodzeniu (± 1 dzie ń) należy przeprowadzi ć badanie reakcji 
na nagły dźwięk, wykorzystuj ąc zwierzęta z kohorty 2A. Dzie ń badania 
powinien by ć równomiernie podzielony mi ędzy grupy badane i grupy 
kontrolne. Ka żda sesja sk łada się z 50 prób. Przy przeprowadzaniu badania 
reakcji na nag ły dźwięk należy ustalić średnią amplitud ę reakcji dla ka żdego 
bloku obejmuj ącego 10 prób (5 bloków po 10 prób), przy czym warunki 
badania optymalizuje si ę, aby uzyska ć habituacj ę w trakcie jednej sesji. 
Opisywane procedury powinny by ć spójne z metod ą badawcz ą B.53 (35).  
49. W odpowiednim czasie mi ędzy dniem 63 a 75 po urodzeniu zwierz ęta 
z kohorty 2A poddaje si ę zestawowi bada ń funkcjonalno-obserwacyjnych 
i automatycznemu badaniu aktywno ści ruchowej. Procedury te powinny by ć 
spójne z metodami badawczymi B.43 (33) i B.53 (35). Zestaw bada ń 
funkcjonalno-obserwacyjnych obejmuje dog łębny opis wygl ądu zewnętrz­
nego podmiotu, jego zachowa ń i integralno ści funkcjonalnej. Ocen ę taką 
uzyskuje si ę przez obserwacje zwierz ąt w klatkach macierzystych, obser ­
wacje zwierz ąt po przeniesieniu na znormalizowan ą powierzchni ę do obser ­
wacji (otwart ą przestrze ń), gdzie zwierz ęta mogą się swobodnie porusza ć, 
i przez badania manipulacyjne. Badania powinno si ę przeprowadza ć 
w kolejno ści od najmniej do najbardziej interaktywnych. Wykaz pomiarów 
przedstawiono w dodatku 1. Obserwacje wszystkich zwierz ąt powinni 
prowadzić wyszkoleni obserwatorzy, którzy nie maj ą wiedzy na temat 
tego, czy zwierz ętom podawana jest substancja, i którzy stosuj ą standar­
dowe procedury w celu ograniczenia do minimum zmienno ści między 
obserwatorami. Zaleca si ę, aby w miar ę możliwości ten sam obserwator 
przeprowadza ł oceny zwierz ąt w ramach danego badania. Je żeli nie jest 
to możliwe, wymagane jest udowodnienie wiarygodno ści ocen mi ędzy 
obserwatorami. W odniesieniu do ka żdego parametru z zestawu bada ń beha­
wioralnych nale ży stosowa ć wyraźnie okre ślone zakresy operacyjne 
i kryteria przyznawania punktów. W miar ę możliwości należy opracowa ć 
obiektywne pomiary ilo ściowe w odniesieniu do obserwowanych punktów 
końcowych, które obejmuj ą klasyfikacj ę subiektywn ą. Każde zwierz ę jest 
badane oddzielnie pod k ątem aktywno ści ruchowej. Sesja badawcza 
powinna by ć na tyle d ługa, aby wykaza ć w jej trakcie habituacj ę grup 
kontrolnych. Nale ży monitorowa ć aktywno ść ruchową za pomoc ą automa­
tycznego sprz ętu do rejestrowania aktywno ści, który powinien by ć w stanie 
wykryć zarówno wzrost, jak i obni żenie aktywno ści (tj. podstawowy 
poziom aktywno ści mierzony przez urz ądzenie nie powinien by ć tak niski, 
aby uniemo żliwić wykrycie obni żenia aktywno ści, ani tak wysoki, aby 
uniemożliwić wykrycie jej wzrostu). Ka żde urządzenie powinno zosta ć 
przetestowane w ramach standardowych procedur, aby zapewni ć na ile to 
tylko mo żliwe niezawodno ść działania poszczególnych urz ądzeń 
w poszczególnych dniach. Na ile to mo żliwe grupy badane powinny zosta ć 
przydzielone równomiernie do poszczególnych urz ądzeń. Należy równo­
miernie dostosowa ć grupy badane do pór badania, aby unikn ąć zakłócenia 
wywołanego oko łodobowym rytmem aktywno ści biologicznej.  
50. Jeżeli istniej ące informacje wskazuj ą na potrzeb ę przeprowadzenia innych 
badań funkcjonalnych (np. sensorycznych, spo łecznych, poznawczych), 
należy je włączyć do badań, nie naruszaj ąc integralno ści pozosta łych ocen 
przeprowadzanych w ramach badania. Je żeli badania te przeprowadza si ę na 
tych samych zwierz ętach, które wykorzystano do badania reakcji na nag ły 
dźwięk, zestawu bada ń funkcjonalno-obserwacyjnych i bada ń aktywno ści 
ruchowej, wówczas nale ży zaplanowa ć różne badania, aby zminimalizowa ć 
ryzyko naruszenia integralno ści tych bada ń. Procedury uzupe łniające mogą 
być szczególnie u żyteczne w przypadkach, gdy obserwacje empiryczne, 
przewidywane skutki lub mechanizm/sposób dzia łania wskazuj ą na jakiś 
szczególny rodzaj neurotoksyczno ści. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 872
 
Ocena potencjalnej immunotoksyczno ści rozwojowej (kohorta 3)  
51. W dniu 56 po urodzeniu (± 3 dni) 10 samców i 10 samic spo śród zwierz ąt 
z kohorty 3 z ka żdej grupy badanej (1 samiec lub 1 samica na miot; 
wszystkie mioty reprezentuje co najmniej jedno m łode; dobór losowy) 
należy poddać testowi reakcji przeciwcia ł zależnej od limfocytów T, tj. 
reakcji pierwszorz ędowych przeciwcia ł IgM na antygen zale żny od limfo ­
cytów T, np. erytrocyty owcy (SRBC) lub hemocyjanina ślimaka 
morskiego (KLH), zgodnie z aktualnymi procedurami badawczymi dotycz ­ 
ącymi immunotoksyczno ści (14)(15). Reakcj ę można ocenić, licząc swoiste 
komórki tworz ące łysinki w śledzionie lub ustalaj ąc miano przeciwcia ł IgM 
swoistych dla SRBC lub KLH w surowicy za pomoc ą testu ELISA 
w szczytowym momencie reakcji. Reakcje zwykle osi ągają moment szczy ­
towy w czwartym (w przypadku reakcji komórek tworz ących łysinki) lub 
piątym (w przypadku testu ELISA) dniu po immunizacji drog ą dożylną. 
Jeżeli reakcj ę przeciwcia ła pierwszorz ędowego bada si ę, licząc komórki 
tworzące łysinki, dopuszcza si ę ocenę podgrup zwierz ąt w odrębne dni, 
pod warunkiem że: immunizacja i u śmiercanie podgrupy przebiegaj ą 
w wyznaczonym czasie, dzi ęki czemu komórki tworz ące łysinki są liczone 
w szczytowym momencie reakcji; że podgrupy sk ładają się z równej liczby 
samców i samic z potomstwa ze wszystkich grup dawkowania, w tym grup kontrolnych; oraz że podgrupy ocenia si ę w mniej wi ęcej tym samym wieku 
pourodzeniowym.Poddawanie dzia łaniu badanej substancji chemicznej 
będzie kontynuowane a ż do dnia poprzedzaj ącego pobranie śledzion na 
potrzeby badania reakcji komórek tworz ących łysinki lub surowicy do 
testu ELISA.
 
Ocena uzupe łniająca potencjalnej toksyczno ści reprodukcyjnej (kohorta 
1B) 
52. Zwierz ęta z kohorty 1B mog ą być dalej obj ęte podawaniem po dniu 90 po 
urodzeniu i hodowane w celu uzyskania pokolenia F  2 , jeżeli jest to 
konieczne. Samce i samice z tej samej grupy dawkowania powinny by ć 
trzymane razem (ale nale ży unikać kojarzenia rodze ństwa) przez okres do 
dwóch tygodni, który nale ży rozpocz ąć najwcześniej w dniu 90 po urodze ­
niu, ale nie pó źniej niż w dniu 120 po urodzeniu. Procedury powinny by ć 
podobne do tych dotycz ących zwierz ąt z pokolenia P. Na podstawie wagi 
dowodów wystarczaj ące może być jednak u śmiercenie miotów w dniu 4 po 
urodzeniu, zamiast ich hodowania do odsadzenia lub d łużej. 
OBSERWACJE NA KONIEC BADANIA  
Biochemia kliniczna/hematologia  
53. Nale ży monitorowa ć skutki ogólnoustrojowe u zwierz ąt z pokolenia P. 
Próbki krwi pobiera si ę na czczo z okre ślonego miejsca od dziesi ęciu 
losowo dobranych samców i samic z pokolenia P na grup ę dawkowania 
na koniec badania, przechowuje si ę w odpowiednich warunkach i poddaje 
częściowej lub ca łkowitej hematologii, biochemii klinicznej, testowi na T4 
i TSH lub innym badaniom sugerowanym przez znany profil skutków badanej substancji chemicznej (zob. dokument zawieraj ący wytyczne 
OECD nr 151 (40)). Nale ży zbadać następujące parametry hematologiczne: 
hematokryt, st ężenie hemoglobiny, liczb ę erytrocytów, liczb ę leukocytów 
i różnicowanie leukocytów, liczb ę płytek krwi i czas krzepni ęcia krwi/po ­
tencjał krzepliwo ści. Badania osocza lub surowicy powinny obejmowa ć: 
cukier, cholesterol ca łkowity, mocznik, kreatynin ę, białko całkowite, albu ­
minę i co najmniej dwa enzymy wskazuj ące na stan komórek w ątroby 
(takie jak aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginianowa, fosfataza alkaliczna, gamma-glutamylotranspeptydaza i dehydrogenaza sorbitolu). Pomiary dodatkowych enzymów i kwasów żółciowych mog ą 
w pewnych okoliczno ściach dostarczy ć przydatnych informacji. Ponadto 
można pobrać krew od wszystkich zwierz ąt i przechowywa ć ją
 do możliwej 
analizy w pó źniejszym terminie, aby pomóc rozwia ć wątpliwości 
w przypadku uzyskania niejednoznacznych wyników lub wygenerowa ć 
dane dotycz ące narażenia wewn ętrznego. Je żeli nie planuje si ę drugiego 
krycia zwierz ąt z pokolenia P, pobiera si ę próbki krwi tu ż przed procedur ą ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 873
lub w ramach zaplanowanego u śmiercenia. W przypadku zachowania 
zwierząt próbki krwi nale ży pobrać kilka dni przed drugim kryciem 
zwierząt. O ile istniej ące dane pochodz ące z bada ń toksykologicznych 
dawki powtórzonej nie wskazuj ą, że badana substancja chemiczna nie ma 
wpływu na parametr, przed u śmierceniem nale ży przeprowadzi ć badanie 
moczu oraz oceni ć następujące parametry: wygl ąd zewnętrzny, obj ętość, 
osmolalno ść lub mas ę właściwą, pH, bia łko, cukier, krew i krwinki, 
szczątki komórek. Mocz mo żna także pobiera ć w celu monitorowania 
wydalania badanej substancji chemicznej lub jej metabolitów.  
54. Skutki ogólnoustrojowe nale ży równie ż monitorowa ć u zwierz ąt 
z pokolenia F  1. Próbki krwi pobiera si ę na czczo z okre ślonego miejsca 
od dziesi ęciu losowo dobranych samców i samic z kohorty 1A na grup ę 
dawkowania na koniec bada ń, przechowuje si ę w odpowiednich warunkach 
i poddaje standardowej biochemii klinicznej, w tym ocenie poziomów suro ­
wicy w odniesieniu do hormonów tarczycy (T4 i TSH), hematologii (liczba 
leukocytów i ró żnicowanie leukocytów oraz liczba erytrocytów) oraz 
badaniu moczu.  
55. W dniu 4 po urodzeniu m łode nieprzydzielone do żadnej kohorty obejmuje 
się pełnym rozpoznaniem histopatologicznym oraz rozwa ża się pomiar 
stężeń hormonu tarczycy (T4) w surowicy. W razie potrzeby krew nowo ­
rodków (w dniu 4 po urodzeniu) mo żna łączyć według miotów na potrzeby 
analizy biochemicznej/hormonu tarczycy. Krew pobiera si ę także do celów 
analizy T4 i TSH od osobników odsadzanych obj ętych pełnym rozpozna ­
niem histopatologicznym w dniu 22 po urodzeniu (m łode z pokolenia F  1 , 
których nie dobrano do kohort).  
Parametry plemników  
56. Parametry plemników nale ży mierzyć u wszystkich samców z pokolenia P, 
chyba że istnieją dane wykazuj ące, że parametry plemników nie uleg ły 
zmianom w trakcie 90-dniowego badania. Badanie parametrów plemników 
należy przeprowadzi ć u wszystkich samców z kohorty 1A.  
57. Na koniec badania rejestruje si ę masy jąder i najądrzy wszystkich samców 
z pokoleń P i F  1 (z kohorty 1A). Zachowuje si ę przynajmniej jedno j ądro 
i jedno naj ądrze do badania histopatologicznego. Pozosta łe najądrza wyko ­
rzystuje si ę do oznaczenia liczby zapasów plemników w ogonie naj ądrzy 
(16)(17). Ponadto pobiera si ę plemniki z ogona naj ądrzy (lub nasieniowodu) 
za pomoc ą metod, które minimalizuj ą szkody w odniesieniu do oceny 
ruchliwości plemników i ich morfologii (18).  
58. Ruchliwo ść plemników mo żna ocenia ć natychmiast po u śmierceniu albo 
można ją zarejestrowa ć do dalszej analizy. Udzia ł procentowy poruszaj ­ 
ących się postępowo plemników powinien zosta ć oceniony subiektywnie 
albo obiektywnie za pomoc ą wspomaganej komputerowo analizy ruchu 
(19)(20)(21)(22)(23)(24). Do celów oceny morfologii plemników nale ży 
zbadać próbkę plemników pochodz ących z naj ądrza (lub nasieniowodu) 
w formie utrwalonych lub mokrych preparatów (25) i co najmniej 200 plemników na próbk ę należy sklasyfikowa ć jako prawid łowe (zarówno 
główka, jak i wstawka/cz ęść główna wici wydaj ą się prawidłowe) lub 
nieprawid łowe. Przyk łady nieprawid łowości morfologicznych plemników 
obejmują zrośnięcie, oddzielone g łówki i zniekszta łcone główki lub wici 
(26). Zniekszta łcone lub du że główki plemników mog ą wskazywa ć na 
nieprawid ł
owości w spermiacji.  
59. Jeżeli próbki plemników zosta ły zamrożone, wymazy utrwalone, a obrazy 
na potrzeby analizy ruchliwo ści plemników zarejestrowane w trakcie sekcji 
(27), późniejsze analizy mo żna ograniczy ć do grupy kontrolnej i samców 
otrzymujących wysok ą dawkę. Jeżeli jednak odnotowuje si ę skutki 
związane z podawaniem, nale ży ocenić również grupy otrzymuj ące niższe 
dawki.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 874
 
Pełne rozpoznanie histopatologiczne  
60. W momencie u śmiercenia lub przedwczesnej śmierci wszystkie zwierz ęta 
z pokoleń P i F  1 poddaje si ę sekcji i badaniu makroskopowemu pod k ątem 
jakichkolwiek nieprawid łowości strukturalnych lub zmian patologicznych. 
Szczególn ą uwagę należy zwrócić na organy uk ładu rozrodczego. M łode, 
które uśmiercono w sposób humanitarny, gdy by ły w stanie agonalnym, 
i martwe m łode należy zarejestrowa ć oraz, jeżeli nie zosta ły zmacerowane, 
zbadać je pod k ątem możliwych wad lub przyczyny śmierci, a nast ępnie 
zachować. 
61. W dniu przeprowadzania sekcji bada si ę wymazy z pochwy pochodz ące od 
dorosłych samic z pokole ń P i F  1 w celu okre ślenia stadium cyklu estro ­
genowego i umo żliwienia korelacji z histopatologi ą narządów rozrodczych. 
Macice wszystkich samic z pokolenia P (i samic z pokolenia F  1 
w stosownych przypadkach) bada si ę na obecno ść i liczbę zagnieżdżonych 
płodów w sposób, który nie zaburza oceny histopatologicznej.  
Masa narz ądów i konserwacja tkanek — doros łe zwierzęta z pokolenia 
P i F  1 
62. W momencie u śmiercenia okre śla się masy cia ła i mokre masy narz ądów 
wymienionych poni żej pochodz ące od wszystkich zwierz ąt z pokolenia P i 
od wszystkich doros łych z pokolenia F  1 z odpowiednich kohort (jak 
określono poni żej) możliwie najszybciej po sekcji, aby unikn ąć wysuszenia. 
Następnie nale ży zakonserwowa ć te narządy w odpowiednich warunkach. 
O ile nie okre ślono inaczej, narz ądy parzyste nale ży ważyć oddzielnie lub 
razem zgodnie z typow ą praktyką stosowan ą przez dane laboratorium:  
— macica (razem z jajowodami i szyjk ą macicy), jajniki,  
— jądra, najądrza (całe i ogon naj ądrzy w przypadku próbek stosowanych 
do liczenia plemników),  
— gruczo ł krokowy (po łączone cz ęści grzbietowo-boczne i brzuszne). 
Odcinając gruczoł krokowy, nale ży zachowa ć ostrożność, aby unikn ąć 
przebicia p ęcherzyków nasiennych wype łnionych p łynem. W przypadku 
wpływu podawania substancji na ca łkowitą masę gruczołu krokowego 
należy ostrożnie przeprowadzi ć sekcję segmentów grzbietowo-bocznych 
i brzusznych po utrwaleniu i zwa żyć je oddzielnie,  
— pęcherzyki nasienne z gruczo łami koaguluj ącymi i ich p łynami (jako 
całość), 
— mózg, w ątroba, nerki, serce, śledziona, grasica, przysadka, tarczyca (po 
utrwaleniu), nadnercze i znane narz ądy docelowe lub tkanki.  
63. Oprócz wymienionych powy żej narządów nale ży zakonserwowa ć 
w odpowiednich warunkach próbki nerwów obwodowych, mi ęśni, rdzenia 
kręgowego, oka i nerwu wzrokowego, przewodu pokarmowego, p ęcherza 
moczowego, p łuca, tchawicy (wraz z do łączonymi tarczyc ą 
i przytarczycami), szpiku kostnego, nasieniowodu (samce), gruczo łu mleko­
wego (samce i samice) i pochwy.  
64. Wszystkie narz ądy zwierz ąt z kohorty 1A s ą ważone i konserwowane na 
potrzeby histopatologii.  
65. W celu zbadania powsta łych przedurodzeniowych i pourodzeniowych 
skutków immunotoksycznych 10 samców i 10 samic spo śród zwierz ąt 
z kohorty 1A z ka żdej grupy badanej (1 samiec lub 1 samica na miot; 
wszystkie mioty s ą reprezentowane przez co najmniej 1 m łode; dobór 
losowy) b ędą objęte następującymi procedurami na koniec badania:  
— ważenie węzłów chłonnych zwi ązanych i niezwi ązanych z drog ą nara­ 
żenia (oprócz wa żenia nadnerczy, grasicy i śledziony ju ż przeprowadzo ­
nego u wszystkich zwierz ąt z kohorty 1A),  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— analiza subpopulacji limfocytów śledziony (CD4+ oraz CD8+ limfo ­
cytów T, limfocytów B oraz i komórek NK) przy wykorzystaniu 
połowy śledziony, a druga po łowa jest konserwowana w celu oceny 
histopatologicznej.  
Analiza subpopulacji limfocytów śledziony u zwierz ąt nieuodpornionych (z 
kohorty 1A) pozwoli ustali ć, czy nara żenie jest zwi ązane z przesuni ęciem 
w immunologicznej dystrybucji w stanie równowagi grasicozale żnych 
limfocytów pomocniczych (CD4+) lub cytotoksycznych (CD8+) lub 
komórek NK (szybka reakcja na komórki nowotworowe i patogeny).  
66. U zwierz ąt z kohorty 1B nale ży zważyć następujące narządy, 
a odpowiadaj ące im tkanki przetworzy ć na bloczek:  
— pochw ę (niezważoną), 
— macic ę z szyjką, 
— jajniki,  
— jądra (co najmniej jedno),  
— najądrza,  
— pęcherzyki nasienne z gruczo łami koaguluj ącymi,  
— gruczo ł krokowy,  
— przysadk ę, 
— zidentyfikowane narz ądy docelowe.  
Histopatologii kohorty 1B dokonuje si ę, jeżeli wyniki bada ń przeprowadzo ­
nych na osobnikach z kohorty 1A s ą niejednoznaczne lub w przypadkach, 
gdy podejrzewa si ę występowanie substancji zaburzaj ących funkcjonowanie 
układu rozrodczego lub hormonalnego.  
67. Kohorty 2A i 2B: badanie neurotoksyczno ści rozwojowej (dzie ń 21 lub 22 
po urodzeniu i doros łe potomstwo). Zwierz ęta z kohorty 2A s ą uśmiercane 
po przeprowadzeniu bada ń behawioralnych, przy czym rejestruje si ę masę 
mózgu i przeprowadza pe łną neurohistopatologi ę do celów oceny neuroto ­
ksyczności. Zwierz ęta z kohorty 2B s ą uśmiercane w dniu 21 lub 22 po 
urodzeniu, przy czym rejestruje si ę masę ich mózgu i przeprowadza badanie 
mikroskopowe mózgu do celów oceny neurotoksyczno ści. Utrwalenie 
perfuzyjne jest wymagane w odniesieniu do zwierz ąt z kohorty 2A 
i opcjonalne w odniesieniu do zwierz ąt z kohorty 2B, jak okre ślono 
w metodzie badawczej B.53 (35).  
Masa narz ądów i konserwacja tkanek — odsadzone zwierz ęta 
z pokolenia F  1 
68. Młode niedobrane do kohort, w tym s łabowite m łode, są uśmiercane po 
odsadzeniu w dniu 22 po urodzeniu, chyba że wyniki wskazuj ą na potrzeb ę 
prowadzenia dalszych bada ń na żywych zwierz ętach. Uśmiercone m łode 
podlegają pełnemu rozpoznaniu histopatologicznemu, w tym ocenie 
narządów rozrodczych, jak opisano w pkt 62 i 63. Nale ży zważyć mózg, 
śledzionę i grasicę maksymalnie 10 m łodych ka żdej płci z każdej grupy 
z możliwie najwi ększej liczby miotów oraz zachowa ć je w odpowiednich 
warunkach. Ponadto mo żna zakonserwowa ć tkanki gruczo łu mlekowego 
tych m łodych samców i samic do celów dalszej analizy 
mikroskopowej (  1 ) (zob. dokument zawieraj ący wytyczne OECD nr 151 
(40)). Nale ży zachowa ć części wykazuj ące powa żne nieprawid łowości 
oraz tkanki docelowe do mo żliwego badania histologicznego.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 876  
( 1 ) Badania wykaza ły, że gruczo ł mlekowy, zw łaszcza na wczesnym stadium rozwoju, 
stanowi wra żliwy punkt ko ńcowy dzia łania estrogenów. Zaleca si ę, aby w opisywanej 
metodzie uwzgl ędnić punkty ko ńcowe obejmuj ące gruczo ły mlekowe m łodych obu p łci 
przy walidacji.
 Histopatologia — zwierz ęta z pokolenia P  
69. Pełną histopatologi ę narządów wymienionych w pkt 62 i 63 przeprowadza 
się w odniesieniu do wszystkich zwierz ąt z pokolenia P otrzymuj ących 
wysoką dawkę i tworz ących grup ę kontroln ą. Należy równie ż zbadać 
narządy wykazuj ące zmiany zwi ązane z podawaniem substancji 
u wszystkich zwierz ąt z grup przyjmuj ących niższą dawkę, aby pomóc 
w wyznaczeniu poziomu NOAEL. Ponadto nale ży objąć oceną histopatolo ­
giczną narządy rozrodcze wszystkich zwierz ąt, u których podejrzewa si ę 
obniżoną płodność, np. tych, u których nie dosz ło do krycia, nie zosta ły 
zapłodnione, nie sp łodziły albo nie urodzi ły zdrowego potomstwa lub 
w przypadku których cykliczno ść estrogenowa lub liczba, ruchliwo ść lub 
morfologia plemników uleg ły zmianom, jak równie ż wszystkie powa żne 
zmiany patologiczne.  
Histopatologia — zwierz ęta z pokolenia F  1 
Zwierzęta z kohorty 1  
70. Pełną histopatologi ę narządów wymienionych w pkt 62 i 63 przeprowadza 
się w odniesieniu do wszystkich doros łych osobników z kohorty 1A otrzy ­
mujących wysok ą dawkę i tych tworz ących grup ę kontroln ą. Wszystkie 
mioty powinny by ć reprezentowane przez co najmniej jedno m łode na 
płeć. Należy również zbadać narządy i tkanki wykazuj ące zmiany zwi ązane 
z podawaniem oraz wszystkie powa żne zmiany patologiczne u wszystkich 
zwierząt z grup otrzymuj ących niższe dawki, aby pomóc w wyznaczeniu 
poziomu NOAEL. Do celów oceny powsta łych przedurodzeniowych 
i pourodzeniowych skutków dla narz ądów limfoidalnych oprócz oceny 
histopatologicznej grasicy, śledziony i nadnerczy, która zosta ła już przepro­
wadzona u wszystkich zwierz ąt z kohorty 1A, nale ży także przeprowadzi ć 
ocenę histopatologiczn ą pobranych w ęzłów chłonnych i szpiku kostnego od 
10 samców i 10 samic z kohorty 1A.  
71. Tkanki uk ładu rozrodczego i hormonalnego od wszystkich zwierz ąt 
z kohorty 1B przetworzone na bloczek, jak opisano w pkt 66, nale ży zbadać 
do celów histopatologii w przypadku, gdy podejrzewa si ę występowanie 
substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu rozrodczego lub hormonal ­
nego. Zwierz ęta z kohorty 1B tak że powinny zosta ć poddane badaniu histo ­
logicznemu, je żeli wyniki tego badania przeprowadzonego na zwierz ętach 
z kohorty 1A s ą niejednoznaczne.  
72. Jajniki doros łych samic powinny zawiera ć pęcherzyki jajnikowe pierwotne 
i wzrastaj ące oraz cia łka żółte; w zwi ązku z tym badanie histopatologiczne 
powinno mie ć na celu sporz ądzenie oceny ilo ściowej pęcherzyków jajniko ­
wych pierwotnych i ma łych pęcherzyków jajnikowych wzrastaj ących oraz 
ciałek żółtych u samic z pokolenia F  1 ; liczba zwierz ąt, wybór wycinka 
jajnika oraz wielko ść próbki wycinka powinny by ć statystycznie odpo ­
wiednie do zastosowanej procedury oceny. Oznaczenie liczby p ęcherzyków 
można najpierw przeprowadzi ć na zwierz ętach z grupy kontrolnej i grupy 
otrzymującej wysok ą dawkę, a w przypadku wykrycia niepo żądanych 
skutków w tej drugiej grupie nale ży zbadać zwierzęta z grupy otrzymuj ącej 
niższe dawki. Badanie powinno obejmowa ć oznaczenie liczby p ęcherzyków 
jajnikowych pierwotnych, które mo żna łączyć z małymi pęcherzykami 
wzrastającymi, w celu porównania jajników zwierz ąt z grupy badanej 
i zwierząt z grupy kontrolnej (zob. dokument zawieraj ący wytyczne 
OECD nr 151 (40)). Ocen ę ciałek żółtych należy przeprowadza ć równolegle 
z badaniem cykliczno ści estrogenowej, tak aby w ocenie mo żna było 
uwzględnić fazę cyklu. Jajowód, macic ę i pochw ę bada się pod kątem 
odpowiedniego rozwoju dla danego narz ądu. 
73. Na samcach z pokolenia F  1 przeprowadza si ę szczegółowe badania histo ­
patologiczne j ąder w celu zidentyfikowania wp ływu podawania substancji 
na różnicowanie si ę i rozwój j ąder oraz na spermatogenez ę (38). W miar ę 
możliwości należy zbadać wycinki sieci j ądra. Głowę, trzon i ogon naj ądrzy 
oraz nasieniowody bada si ę pod kątem odpowiedniego rozwoju dla danego 
narządu oraz pod k ątem parametrów wymaganych w odniesieniu do 
samców z pokolenia P.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 877
 
Zwierzęta z kohorty 2  
74. Neurohistopatologi ę przeprowadza si ę według płci u wszystkich zwierz ąt 
z kohorty 2A nale żących do grupy otrzymuj ącej wysok ą dawkę oraz do 
grupy kontrolnej po zako ńczeniu badania neurobehawioralnego (po dniu 75 
po urodzeniu, ale nie pó źniej niż w dniu 90 po urodzeniu). Histopatologi ę 
mózgu wykonuje si ę według płci u wszystkich zwierz ąt z kohorty 2B 
należących do grupy otrzymuj ącej wysok ą dawkę oraz do grupy kontrolnej 
w dniu 21 lub 22 po urodzeniu. Nale ży również zbadać narządy lub tkanki, 
które wykazuj ą zmiany zwi ązane z podawaniem, u zwierz ąt z grup przyj ­
mujących niższą dawkę, aby pomóc w wyznaczeniu poziomu NOAEL. 
W przypadku zwierz ąt z kohorty 2A i 2B przeprowadza si ę badanie licz ­
nych wycinków z mózgu, aby umo żliwić zbadanie opuszków w ęchowych, 
kory mózgu, hipokampu, j ądra podstawnego, wzgórza, podwzgórza, śród­
mózgowia (pokrywy śródmózgowia, nakrywki śródmózgowia i konarów 
mózgu), pnia mózgu i mó żdżka. Tylko u zwierz ąt z kohorty 2A bada si ę 
oczy (siatkówk ę i nerw wzrokowy) oraz próbki nerwu obwodowego, mi ęśni 
i rdzenia kr ęgowego. Wszystkie procedury neurohistologiczne powinny by ć 
spójne z metod ą badawcz ą B.53 (35).  
75. Oceny morfometryczne (ilo ściowe) nale ży przeprowadza ć na reprezentatyw ­
nych obszarach mózgu (wycinki homologiczne starannie dobrane na podstawie wiarygodnych mikroskopowych punktów orientacyjnych) i mogą one obejmowa ć pomiary liniowe lub powierzchniowe okre ślonych 
obszarów mózgu. Nale ży pobrać co najmniej trzy kolejne wycinki 
z każdego punktu orientacyjnego (poziomu) w celu dobrania najbardziej 
homologicznego i reprezentatywnego dla okre ślonego obszaru mózgu 
wycinka na potrzeby oceny. Neuropatolog powinien stwierdzi ć, czy wycinki 
przygotowane do pomiaru s ą homologiczne z innymi w zbiorze stano ­
wiącym próbk ę i w zwi ązku z tym odpowiednie do w łączenia, poniewa ż 
w szczególno ści pomiary liniowe mog ą się zmienia ć na stosunkowo 
niewielkim dystansie (28). Nie nale ży używać wycinków niehomologicz ­
nych. Chocia ż celem jest pobranie próbki od wszystkich zwierz ąt zarezer­
wowanych do tego celu (10/p łeć/dawkę), mniejsza liczebno ść również może 
być odpowiednia. Próbki pobrane od mniej ni ż 6 zwierz ąt/płeć/dawkę 
z reguły nie będą jednak uznawane za wystarczaj
ące do celów opisywanej 
metody badawczej. Mo żna zastosowa ć stereologi ę w celu zidentyfikowania 
wpływu podawanej substancji na takie parametry jak obj ętość lub liczba 
komórek w odniesieniu do okre ślonych obszarów neuroanatomicznych. Na 
wszystkich etapach preparowania próbek tkanek, pocz ąwszy od utrwalania 
tkanek przez sekcj ę próbek tkanek, przetwarzanie tkanki i barwienie prepa ­
ratów, nale ży stosowa ć zrównowa żony schemat, tak aby ka żda seria zwie ­
rała reprezentatywne próbki z ka żdej grupy dawkowania. Je żeli ma zosta ć 
przeprowadzona analiza morfometryczna lub stereologiczna, tkank ę 
mózgową należy zanurzy ć w odpowiednim roztworze w odniesieniu do 
wszystkich poziomów dawkowania w tym samym czasie w celu unikni ęcia 
zmniejszania si ę artefaktów, co mo że być związane z przed łużonym prze ­
trzymywaniem w utrwalaczu.  
SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane  
76. Dane dostarcza si ę oddzielnie i w podstaci podsumowania w formie zesta ­
wień tabelarycznych. W stosownych przypadkach w odniesieniu do ka żdej 
grupy badanej i ka żdego pokolenia nale ży przedstawi ć następujące dane: 
liczbę zwierząt na pocz ątku badania, liczb ę zwierząt, które pad ły podczas 
badania lub które u śmiercono z przyczyn humanitarnych, czas śmierci lub 
uśmiercenia z przyczyn humanitarnych, liczb ę płodnych zwierz ąt, liczbę 
ciężarnych samic, liczb ę samic, które urodzi ły miot, oraz liczb ę zwierząt, 
które wykazuj ą oznaki toksyczno ści. Należy równie ż dostarczy ć opis 
toksyczno ści, w tym dzie ń wystąpienia, okres trwania i dotkliwo ść. 
77. Wyniki numeryczne powinny zosta ć oszacowane z zastosowaniem 
właściwej i zatwierdzonej metody statystycznej. Metody statystyczne 
powinny zosta ć wybrane jako cz ęść projektu badania i powinny odpo ­
wiednio uwzgl ędniać dane nienormalne (np. dane o liczbie), dane cenzuro ­
wane (np. ograniczony czas obserwacji), zale żność (np. wp ływ na miot  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
i powtarzane pomiary) oraz nierówne wariancje. Uogólnione mieszane 
modele liniowe i modele oparte na zale żności dawka-odpowied ź obejmują 
szeroki wybór narz ędzi analitycznych, które mog ą być odpowiednie dla 
danych uzyskanych w ramach omawianej metody badawczej. Sprawozdanie powinno zawiera ć wystarczaj ące informacje na temat metody analizy 
i zastosowanego programu komputerowego, tak aby niezale żny recenzent/ 
statystyk móg ł dokonać oceny/powtórnej oceny analizy.
 
Ocena wyników  
78. Wyniki nale ży ocenić w odniesieniu do obserwowanych skutków, w tym 
wyników sekcji i bada ń mikroskopowych. Ocena obejmuje zale żność lub 
brak zale żności między dawk ą a obecno ścią, częstością występowania 
i dotkliwo ścią nieprawid łowości, w tym powa żnych zmian patologicznych. 
Należy równie ż ocenić narządy docelowe, p łodność, nieprawid łowości 
kliniczne, zmienione funkcje rozrodcze i wyniki w odniesieniu do miotów, 
zmiany masy cia ła, śmiertelno ść i wszelkie inne skutki toksyczne 
i rozwojowe. Szczególn ą uwagę należy zwróci ć na zmiany zale żne od 
płci. Przy ocenie wyników bada ń należy uwzględnić właściwości fizyko­
chemiczne badanej substancji chemicznej oraz, je żeli są dostępne, dane 
toksykokinetyczne, w tym przenikanie przez łożysko i wydzielanie do 
mleka.  
Sprawozdanie z badania  
79. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje uzyskane 
w ramach niniejszego badania prowadzonego na zwierz ętach z pokole ń P, 
F 1 oraz F  2 (w stosownych przypadkach):  
Badana substancja chemiczna:  
— wszystkie dost ępne istotne informacje na temat substancji chemicznej, 
właściwości toksykokinetycznych i toksykodynamicznych badanej 
substancji chemicznej,  
— dane identyfikacyjne,  
— czysto ść. 
Nośnik (w stosownych przypadkach):  
— uzasadnienie wyboru no śnika, jeżeli jest inny ni ż woda.  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystany gatunek/szczep,  
— liczba zwierz ąt, ich wiek i ich p łeć, 
— źródło pochodzenia, warunki trzymania, pasza, materia ły do budowy 
gniazda itp.,  
— masa cia ła każdego zwierz ęcia na pocz ątku badania,  
— dane dotycz ące wymazu z pochwy w odniesieniu do samic z pokolenia 
P przed rozpocz ęciem podawania (je żeli dane zgromadzono w tym 
czasie),  
— dane dotycz ące kojarzenia u pokolenia P, wskazuj ące na samca 
i samicę, których wybrano do krycia, oraz czy dosz ło do krycia,  
— dane dotycz ące miotu pochodzenia w odniesieniu do doros łych zwierz ąt 
z pokolenia F  1 . 
Warunki badania:  
— uzasadnienie wyboru poziomu dawki,  
— szczegó ły dotyczące przygotowania formy u żytkowej badanej substancji 
chemicznej/przygotowania paszy, uzyskanych st ężeń, ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— trwałość i jednorodno ść preparatu w no śniku lub substancji no śnikowej 
(np. paszy, wody pitnej), w krwi lub mleku w warunkach u żytkowania 
i przechowywania mi ędzy poszczególnymi dawkowaniami,  
— szczegó ły dotyczące podawania badanej substancji chemicznej,  
— w stosownych przypadkach przeliczenie st ężeń (ppm) badanej substancji 
chemicznej w paszy/wodzie pitnej na uzyskan ą dawkę (mg/kg masy 
ciała/dobę), 
— szczegó ły dotyczące jakości pokarmu i wody (w tym sk ładników paszy, 
jeżeli dostępne),  
— szczegó łowy opis procedur randomizacji stosowanych do doboru 
młodych do eliminacji i przydzielania m łodych do grup badanych,  
— warunki środowiskowe,  
— wykaz personelu badawczego, w tym odbyte szkolenia zawodowe.  
Wyniki (podsumowanie wszystkich danych i dane indywidualne wed ług płci 
i dawki):  
— spożycie pokarmu, spo życie wody, je żeli odnośne dane s ą dostępne, 
wydajność pokarmu (przyrost masy cia ła na gram spo żywanego 
pokarmu, z wyj ątkiem okresów wspólnego przebywania w klatce 
i laktacji) oraz spo życie badanej substancji chemicznej (w przypadku 
podawania z pasz ą/woda pitn ą) w odniesieniu do zwierz ąt z pokole ń P i 
F 1 , 
— dane dotycz ące wchłaniania (je żeli są dostępne),  
— dane dotycz ące masy cia ła zwierząt z pokolenia P,  
— dane dotycz ące masy cia ła wybranych zwierz ąt z pokolenia F  1 
w okresie po odsadzeniu,  
— czas śmierci, je żeli zwierz ę padło w trakcie badania, lub informacja, że 
zwierzęta przeżyły do uśmiercenia,  
— charakter, dotkliwo ść i czas trwania obserwacji klinicznych (odwracalne 
czy nie),  
— dane pochodz ące z hematologii, badania moczu i chemii klinicznej, 
w tym dotycz ące TSH i T4,  
— analiza fenotypowa limfocytów śledziony (limfocytów T, limfocytów 
B i komórek NK),  
— komórkowo ść szpiku kostnego,  
— dane dotycz ące reakcji na toksyczno ść, 
— liczba samic z pokole ń P i F  1 , u których wyst ępuje normalny lub 
nienormalny cykl estrogenowy i czas trwania cyklu,  
— czas do krycia (odst ęp przed kopulacj ą, liczba dni mi ędzy kojarzeniem 
a kryciem),  
— skutki toksyczne lub inne dla rozrodczo ści, w tym liczba i odsetek 
zwierząt, które przesz ły przez krycie, ci ążę, poród i laktacj ę, liczba 
i odsetek samców, które zap łodniły samice, oraz samic z objawami 
dystocji/d ługotrwałego lub trudnego porodu,  
— czas trwania ci ąży oraz, je żeli odnośne dane s ą dostępne, porodu,  
— liczba zagnie żdżeń, liczebno ść miotu i odsetek samców w śród młodych,  
— liczba i odsetek strat pozagnie żdżeniowych, żywych urodze ń i martwych 
urodzeń, ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— dane dotycz ące masy miotu i masy m łodych (samców, samic i łącznie), 
liczba słabowitych m łodych, je żeli ją określono,  
— liczba m łodych z wyra źnie widocznymi nieprawid łowościami,  
— skutki toksyczne lub inne dla potomstwa, rozwoju pourodzeniowego, 
żywotności itp.,  
— dane dotycz ące fizycznych punktów orientacyjnych u m łodych i inne 
dane dotycz ące rozwoju pourodzeniowego,  
— dane dotycz ące dojrzewania p łciowego zwierz ąt z pokolenia F  1 , 
— w stosownych przypadkach dane dotycz ące obserwacji funkcjonalnych 
młodych i doros łych, 
— dane dotycz ące masy cia ła w momencie u śmiercania oraz bezwzgl ędnej 
i względnej masy narz ądu w odniesieniu do zwierz ąt z pokolenia P i 
dorosłych z pokolenia F  1 , 
— wyniki sekcji,  
— szczegó łowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,  
— całkowita liczba plemników w ogonie naj ądrza, odsetek poruszaj ących 
się postępowo plemników, odsetek morfologicznie normalnych plem ­
ników oraz odsetek plemników z ka żdą określoną nieprawid łowością 
w odniesieniu do samców z pokole ń P i F  1 , 
— w stosownych przypadkach liczba i stadia dojrzewania p ęcherzyków 
jajnikowych znajduj ących się w jajnikach samic z pokole ń P i F  1 , 
— oznaczenie liczby cia łek żółtych w jajnikach samic z pokolenia F  1 , 
— w stosownych przypadkach statystyczne opracowanie wyników.  
Parametry kohorty 2:  
— szczegó łowy opis procedur stosowanych do standaryzacji obserwacji 
i procedur oraz definicji operacyjnych do celów punktowego oceniania 
obserwacji,  
— wykaz wszystkich zastosowanych procedur badawczych i uzasadnienie 
ich zastosowania,  
— szczegó ły dotyczące zastosowanych procedur behawioralnych/funkcjo ­
nalnych, neuropatologicznych i morfometrycznych, w tym informacje i szczegó ły dotyczące urządzeń automatycznych,
 
— procedury kalibracji i zapewniania równowa żności urządzeń oraz bilan ­
sowanie grup badanych w procedurach badawczych,  
— krótkie uzasadnienie wyja śniające wszelkie decyzje wi ążące się z opinią 
eksperta,  
— szczegó łowy opis wszystkich wyników behawioralnych/funkcjonalnych, 
neuropatologicznych i morfometrycznych wed ług płci i grupy dawko ­
wania, w tym wzrosty i spadki w porównaniu do grupy kontrolnej,  
— masa mózgu,  
— wszelkie diagnozy postawione na podstawie objawów neurologicznych 
i zmian patologicznych, w tym pojawiaj ące się w sposób naturalny 
choroby lub schorzenia,  
— obrazy przyk ładowych wyników bada ń, 
— obrazy z urz ądzeń o małej mocy do oceny homologii wycinków zasto ­
sowanych do celów morfometrii,  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— statystyczne opracowanie wyników, w tym modele statystyczne zasto ­
sowane w celu analizy danych i wyników, niezale żnie od tego, czy by ły 
one istotne,  
— związek wszelkich innych skutków toksycznych z wnioskiem dotycz ­ 
ącym potencja łu neurotoksycznego badanej substancji chemicznej 
według płci i grupy dawkowania,  
— wpływ wszelkich informacji toksykokinetycznych na wnioski,  
— dane potwierdzaj ące wiarygodno ść i czułość metody badawczej (tj. dane 
dotyczące dodatnich i historycznych kontroli),  
— związki, jeżeli wyst ępują, między skutkami neuropatologicznymi 
a czynnościowymi,  
— NOAEL lub dawka wyznaczaj ąca w odniesieniu do matek i potomstwa 
według płci i grupy dawkowania,  
— dyskusja na temat ogólnej interpretacji danych na podstawie wyników, 
w tym wniosek dotycz ący tego, czy substancja chemiczna spowodowa ła 
neurotoksyczno ść rozwojow ą i NOAEL.  
Parametry kohorty 3:  
— miana przeciwcia ł IgM w surowicy (sensytyzacja na SRBC lub KLH) 
lub jednostki komórek tworz ących łysinki w śledzionie (sensytyzacja na 
SRBC),  
— działanie metody reakcji przeciwcia ł zależnej od limfocytów T powinno 
zostać potwierdzone w ramach procesu optymalizacji przez laborato ­
rium, które wykonuje test po raz pierwszy, a nast ępnie powinno by ć 
potwierdzane okresowo przez wszystkie laboratoria (np. corocznie),  
— omówienie ogólnej interpretacji danych na podstawie wyników, w tym 
wniosek dotycz ący tego, czy substancja chemiczna spowodowa ła immu­
notoksyczno ść rozwojow ą i NOAEL.  
Omówienie wyników  
Wnioski, w tym warto ści NOAEL w odniesieniu do skutków dla rodziców 
i potomstwa  
Należy równie ż przekaza ć wszystkie informacje, których nie uzyskano 
w trakcie badania, a które s ą przydatne do celów interpretacji wyników 
(np. podobie ństwa skutków do tych wywo ływanych przez jakiekolwiek 
znane środki neurotoksyczne).  
Interpretacja wyników  
80. Rozszerzone badanie toksyczno ści reprodukcyjnej jednego pokolenia 
dostarczy informacji na temat wp ływu powtarzanego nara żenia na 
substancję chemiczn ą podczas wszystkich faz cyklu rozrodczego, 
w zależności od potrzeb. W szczególno ści badanie dostarczy informacji 
na temat uk ładu rozrodczego oraz rozwoju, wzrostu, prze życia 
i funkcjonalnych punktów ko ńcowych w odniesieniu do potomstwa 
w wieku do 90 dnia po urodzeniu.  
81. W interpretacji wyników badania nale ży uwzględniać wszystkie dost ępne 
informacje dotycz ące substancji chemicznej, w tym w łaściwości fizykoche ­
miczne, toksykokinetyczne i toksykodynamiczne, dost ępne odpowiednie 
informacje na temat analogów strukturalnych oraz wyniki przeprowadzo ­
nych wcze śniej bada ń toksyczno ści z użyciem badanej substancji 
chemicznej (np. ostra toksyczno ść, toksyczno ść po powtarzanym podawa ­
niu, badania mechanistyczne i badania oceniaj ące, czy wyst ępują istotne 
różnice jako ściowe i ilo ściowe mi ędzy gatunkami pod wzgl ędem właści­
wości metabolicznych  in vivo /in vitro ). Pełne rozpoznanie histopatologiczne 
i wyniki pomiarów masy narz ądów należy oceniać w kontek ście obserwacji 
poczynionych podczas innych bada ń powtarzanego dawkowania, je żeli jest 
to wykonalne. Mo żna uznać, że obniżony wzrost potomstwa ma zwi ązek 
z wpływem badanej substancji chemicznej na sk ład mleka (29).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Kohorta 2 (neurotoksyczno ść rozwojowa)  
82. Wyniki neurobehawioralne i neuropatologiczne nale ży interpretowa ć 
w kontek ście wszystkich ustale ń, stosując podejście wagi dowodów 
i wiedzę specjalistyczn ą. Należy omówić wzory wyników bada ń behawio ­
ralnych lub morfologicznych, je żeli występują, oraz dowody zale żności 
dawka-odpowied ź. W tej charakterystyce nale ży zawrze ć ocenę neuroto­
ksyczności rozwojowej, w tym badania epidemiologiczne u ludzi lub studia 
przypadków, i badania na zwierz ętach doświadczalnych (np. dane toksyko ­
kinetyczne, informacje dotycz ące związku między struktur ą a działaniem, 
dane z innych bada ń toksyczno ści). Ocena danych powinna obejmowa ć 
omówienie istotno ści biologicznej i statystycznej. Ocena powinna obej ­
mować związek, jeżeli taki wyst ępuje, między obserwowanymi zmianami 
neuropatologicznymi i behawioralnymi. W odniesieniu do wytycznych dotyczących interpretowania wyników neurotoksyczno ści rozwojowej 
należy zapozna ć się
 z metod ą badawcz ą B.53 (35) oraz publikacj ą Tyl 
i in., 2008 (31).  
Kohorta 3 (immunotoksyczno ść rozwojowa)  
83. Supresj ę lub wzmocnienie funkcji uk ładu odporno ściowego stwierdzone 
w reakcji przeciwcia ł zależnej od limfocytów T nale ży ocenia ć 
w kontek ście wszystkich poczynionych obserwacji. Znaczenie wyników 
reakcji przeciwcia ł zależnej od limfocytów T mog ą potwierdza ć inne 
oddziaływania na wska źniki związane z odporno ścią (np. komórkowo ść 
szpiku kostnego, masa i histopatologia tkanek limfoidalnych, rozk ład 
podzbioru limfocytów). Skutki ustalone w ramach reakcji przeciwcia ł 
zależnej od limfocytów T mog ą mieć mniejsze znaczenie w przypadku 
innych toksyczno ści obserwowanych przy ni ższym stężeniu nara żenia.  
84. Przy interpretowaniu wyników dotycz ących rozrodczo ści 
i neurotoksyczno ści pomocny mo że być dokument zawieraj ący wytyczne 
OECD nr 43 (26).  
LITERATURA  
(1) Cooper, R.L., J.C. Lamb, S.M. Barlow, K. Bentley, A.M. Brady, N. Doerr, 
D.L. Eisenbrandt, P.A. Fenner-Crisp, R.N. Hines, L.F.H. Irvine, C.A. Kimmel, H. Koeter, A.A. Li, S.L. Makris, L.P. Sheets, G.J.A. Speijers and K.E. Whitby (2006), ‘A Tiered Approach to Life Stages Testing for 
Agricultural Chemical Safety Assessment’,  Critical Reviews in Toxicology , 
36, 69–98.
 
(2) Thigpen, J.E., K.D.R. Setchell, K.B. Ahlmark, J. Locklear, T. Spahr, G.F. 
Leviness, M.F. Goelz, J.K. Haseman, R.R. Newbold, and D.B. Forsythe (1999), ‘Phytoestrogen Content of Purified Open and Closed Formula 
Laboratory Animal Diets’,  Lab. Anim. Sci. , 49, 530–536.
 
(3) Zoetis, T., Walls, I. (2003),  Principles and Practices for Direct Dosing of 
Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research , ILSI Press, 
Waszyngton DC.  
(4) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005), ‘Direct dosing of preweaning 
rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI 
expert working group’,  Int. J. Toxicol. , 24: 87–94.  
(5) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999), ‘Stimulating research to 
improve the scientific basis of risk assessment’,  Toxicol. Sci. , 49: 1–4.  
(6) Ulbrich, B. and A.K. Palmer (1995), ‘Detection of Effects on Male Repro ­
duction — a Literature Survey’,  Journal of the American College of Toxi ­
cologists , 14, 293–327.  
(7) Mangelsdorf, I., J. Buschmann and B. Orthen (2003), ‘Some Aspects 
Relating to the Evaluation of the Effects of Chemicals on Male Fertility’,  
Regulatory Toxicology and Pharmacology , 37, 356–369.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 883
 
(8) Sakai, T., M. Takahashi, K. Mitsumori, K. Yasuhara, K. Kawashima, H. 
Mayahara and Y. Ohno (2000). ‘Collaborative work to evaluate toxicity on 
male reproductive organs by repeated dose studies in rats — overview of the studies’,  Journal of Toxicological Sciences , 25, 1–21.
 
(9) Creasy, D.M. (2003), ‘Evaluation of Testicular Toxicology: A Synopsis 
and Discussion of the Recommendations Proposed by the Society of Toxi ­
cologic Pathology’,  Birth Defects Research , część B, 68, 408–415.  
(10) Goldman, J.M., A.S. Murr, A.R. Buckalew, J.M. Ferrell and R.L. Cooper 
(2007), ‘The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology 
and its Utility in Toxicological Studies’,  Birth Defects Research , część B, 
80 (2), 84–97.  
(11) Sadleir, R.M.F.S. (1979), ‘Cycles and Seasons’, [w:] C.R. Auston and 
R.V. Short (red.),  Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertili ­
zation , Cambridge, Nowy Jork.  
(12) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. 
(1999), ‘Interpreting the toxicologic significance of alterations in anoge ­
nital distance: potential for confounding effects of progeny body weights’,  
Reprod. Toxicol. , 13: 383–390.  
(13) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977), ‘Preputial sepa ­
ration as an external sign of pubertal development in the male rat’,  Biolo­
gical Reproduction , 17, 298–303.  
(14) Ladics, G.S. (2007), ‘Use of SRBC Antibody Responses for Immunotoxi ­
city Testing’,  Methods , 41, 9–19.  
(15) Gore, E.R., J. Gower, E. Kurali, J.L. Sui, J. Bynum, D. Ennulat and D.J. 
Herzyk (2004), ‘Primary Antibody Response to Keyhole Limpet Hemo ­
cyanin in Rat as a Model for Immunotoxicity Evaluation’,  Toxicology , 
197, 23–35.  
(16) Gray, L.E., J. Ostby, J. Ferrell, G. Rehnberg, R. Linder, R. Cooper, J. 
Goldman, V. Slott and J. Laskey (1989), ‘A Dose-Response Analysis of Methoxychlor-Induced Alterations of Reproductive Development and 
Function in the Rat’,  Fundamental and Applied Toxicology , 12, 92–108.
 
(17) Robb, G.W., R.P. Amann and G.J. Killian (1978), ‘Daily Sperm Produc ­
tion and Epididymal Sperm Reserves of Pubertal and Adult Rats’,  Journal 
of Reproduction and Fertility ,54, 103–107.  
(18) Klinefelter, G.R., L.E. Jr Gray and J.D. Suarez (1991), ‘The Method of 
Sperm Collection Significantly Influences Sperm Motion Parameters Follo ­
wing Ethane Dimethanesulfonate Administration in the Rat’.  Reproductive 
Toxicology ,5, 39–44.  
(19) Seed, J., R.E. Chapin, E.D. Clegg., L.A. Dostal, R.H. Foote, M.E. Hurtt, 
G.R. Klinefelter, S.L. Makris, S.D. Perreault, S. Schrader, D. Seyler, R. 
Sprando, K.A. Treinen, D.N. Veeramachaneni and L.D. Wise (1996), 
‘Methods for Assessing Sperm Motility, Morphology, and Counts in the Rat, Rabbit, and Dog: a Consensus Report’,  Reproductive Toxicology , 10, 
237–244.
 
(20) Chapin, R.E., R.S. Filler, D. Gulati, J.J. Heindel, D.F. Katz, C.A. Mebus, 
F. Obasaju, S.D. Perreault, S.R. Russell and S. Schrader (1992), ‘Methods for Assessing Rat Sperm Motility’,  Reproductive Toxicology , 6, 267–273.
 
(21) Klinefelter, G.R., N.L. Roberts and J.D. Suarez (1992), ‘Direct Effects of 
Ethane Dimethanesulphonate on Epididymal Function in Adult Rats: an  In 
Vitro  Demonstration’,  Journal of Andrology , 13, 409–421.  
(22) Slott, V.L., J.D. Suarez and S.D. Perreault (1991), ‘Rat Sperm Motility 
Analysis: Methodologic Considerations’,  Reproductive Toxicology , 5, 
449–458.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 884
 
(23) Slott, V.L., and S.D. Perreault (1993), ‘Computer-Assisted Sperm Analysis 
of Rodent Epididymal Sperm Motility Using the Hamilton-Thorn Motility 
Analyzer’,  Methods in Toxicology, Cz ęść A, Academic, Orlando, Floryda. 
s. 319–333.  
(24) Toth, G.P., J.A. Stober, E.J. Read, H. Zenick and M.K. Smith (1989), ‘The 
Automated Analysis of Rat Sperm Motility Following Subchronic Epich ­
lorhydrin Administration: Methodologic and Statistical Considerations’,  
Journal of Andrology , 10, 401–415.  
(25) Linder, R.E., L.F. Strader, V.L. Slott and J.D. Suarez (1992), ‘Endpoints 
of Spermatoxicity in the Rat After Short Duration Exposures to Fourteen Reproductive Toxicants’,  Reproductive Toxicology , 6, 491–505.
 
(26) OECD (2008),  Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity 
Testing and Assessment , Series on Testing and Assessment, No. 43, ENV/ 
JM/MONO(2008)16, OECD, Pary ż. 
(27) Working, P.K., M. Hurtt (1987), ‘Computerized Videomicrographic 
Analysis of Rat Sperm Motility’,  Journal of Andrology , 8, 330–337.  
(28) Bolin, B., R. Garman, K. Jensen, G. Krinke, B. Stuart, and an ad Hoc 
Working Group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee (2006), ‘A ‘Best Practices’ Approach to Neuropathologic Assessment in 
Developmental Neurotoxicity Testing — for Today’,  Toxicological Patho ­
logy, 34, 296–313.
 
(29) Stütz, N., B. Bongiovanni, M. Rassetto, A. Ferri, A.M. Evangelista de 
Duffard, and R. Duffard (2006), ‘Detection of 2,4-dichlorophenoxyacetic 
Acid in Rat Milk of Dams Exposed During Lactation and Milk Analysis of 
their Major Components’,  Food Chemicals Toxicology , 44, 8–16.  
(30) Thigpen, JE, K.D.R. Setchell, J.K. Haseman, H.E. Saunders, G.F. Cavi ­
ness, G.E. Kissling, M.G. Grant and D.B. Forsythe (2007), ‘Variations in 
Phytoestrogen Content between Different Mill Dates of the Same Diet Produces Significant Differences in the Time of Vaginal Opening in CD-1 Mice and F344 Rats but not in CD Sprague Dawley Rats’,  Envi­
ronmental health perspectives,  115(12), 1717–1726.
 
(31) Tyl, R.W., K. Crofton, A. Moretto, V. Moser, L.P. Sheets and T.J. 
Sobotka (2008), ‘Identification and Interpretation of Developmental 
Neurotoxicity Effects: a Report from the ILSI Research Foundation/Risk 
Science Institute Expert Working Group on Neurodevelopmental Endpoin ­
ts’, Neurotoxicology and Teratology , 30: 349–381.  
(32) OECD (1996),  Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Repro ­
duction/Developmental Toxicity Screening Test , OECD Guideline for 
Testing of Chemicals, No. 422, OECD, Pary ż. 
(33) Rozdzia ł B.43 niniejszego za łącznika: ‘Badanie neurotoksyczno ści 
u gryzoni’.  
(34) OECD (2000),  Guidance Document on the recognition, assessment, and 
use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations , Series on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/ 
MONO(2000)7, OECD, Pary ż.
 
(35) Rozdzia ł B.53 niniejszego za łącznika: ‘Badanie neurotoksyczno ści 
rozwojowej’.  
(36) Rozdzia ł B.54 niniejszego za łącznika: ‘Test biologiczny wzrostu macicy 
u gryzoni: krótkoterminowe badanie przesiewowe w łaściwości estrogenny ­
ch’. 
(37) Rozdzia ł B.55 niniejszego za łącznika: ‘Test biologiczny Hershbergera na 
szczurach: krótkoterminowe badanie przesiewowe w łaściwości (anty)an ­
drogennych’.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
(38) OECD (2009),  Guidance Document for Histologic Evalution of Endocrine 
and Reproductive Test in Rodents , Series on Testing and Assessment, No. 
106, OECD, Pary ż. 
(39) OECD (2011),  Guidance Document on the Current Implementation of 
Internal Triggers in the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study in the United States and Canada , Series on Testing and Assessment, 
No. 117, ENV/JM/MONO(2011)21, OECD, Pary ż.
 
(40) OECD (2013),  Guidance Document supporting TG 443: Extended One 
Generation Reproductive Toxicity Study , Series on Testing and Asses ­
sment, No. 151, OECD, Pary ż. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 886
 
Dodatek 1  
Pomiary i obserwacje uwzgl ędnione w zestawie bada ń funkcjonalno-obserwacyjnych (kohorta 
2A) 
Klatka macierzysta i otwarta prze ­
strzeń Manipulacyjne Fizjologiczne  
Postawa Łatwość usuwania Temperatura 
Mimowolne ruchy kloniczne 
i toniczne Łatwość obchodzenia si ę Masa cia ła 
Zamknięcie powiek Tonus Reakcja źrenicy 
Piloerksja Reakcja na podej ście Rozmiar źrenicy 
Ślinienie Reakcja na dotyk 
Łzawienie Reakcja s łuchowa 
Wydawanie odg łosów Reakcja na szczypanie ogona 
Stawanie na tylnych ko ńczynach Reakcja przyjmowania 
prawidłowej postawy 
Nieprawid łowości w chodzie Odleg łość między kończy­
nami tylnymi przy l ądowaniu 
Pobudzenie Si ła uchwytu ko ńczyn przed ­
nich 
Stereotypia Si ła uchwytu ko ńczyn 
tylnych 
Dziwne zachowania Plamy 
Nieprawid łowości w oddychaniu
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Dodatek 2  
DEFINICJE:  
Substancja chemiczna:  oznacza substancj ę lub mieszanin ę. 
Badana substancja chemiczna:  oznacza ka żdą substancj ę lub mieszanin ę 
badaną za pomoc ą opisywanej metody badawczej.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  TEST STEROIDOGENEZY H295R  
WPROWADZENIE  
1. Opisywana metoda badawcza jest zgodna z dotycz ącą badań wytyczn ą 
OECD nr 456 (2011 r.). W 1998 r. OECD podj ęła działania o wysokim 
priorytecie, maj ące na celu zmian ę istniejących wytycznych i opracowanie 
nowych wytycznych na potrzeby bada ń przesiewowych i badania potencjal ­
nych substancji zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu hormonalnego. Ramy 
koncepcyjne OECD z 2002 r. w zakresie bada ń i oceny substancji chemicz ­
nych zaburzaj ących funkcjonowanie uk ładu hormonalnego (Conceptual 
Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals) obejmują pięć poziomów, z których ka żdy odpowiada innemu poziomowi 
złożoności biologicznej (1). W opisanym w niniejszej metodzie badawczej 
teście steroidogenezy H295R  in vitro  (H295R) wykorzystuje si ę linię ludz­
kich komórek raka nadnercza (komórki NCI-H295R) i stanowi on „test  in 
vitro  pozwalaj ący na uzyskanie danych mechanistycznych” poziomu 2, do 
celów bada ń przesiewowych i ustalania substancji priorytetowych. Opraco ­
wanie i standaryzacja powy ższego testu jako badania przesiewowego 
chemicznego wp ływu na steroidogenez ę, w szczególno ści na produkcj ę 
17β-estradiolu (E2) i testosteronu (T), odbywa ły się w wielu etapach. 
Test H295R by ł optymalizowany i poddawany walidacji (2)(3)(4)(5).
 
2. Test steroidogenezy H295R ma na celu wykrywanie substancji chemicz ­
nych, które maj ą wpływ na produkcj ę E2 i T. Test H295R ma identyfi ­
kować ksenobiotyki, których dzia łanie ukierunkowane jest na sk ładniki 
endogenne sk ładające się na międzykomórkowy szlak biochemiczny 
rozpoczynaj ący się sekwencj ą reakcji od cholesterolu po produkcj ę E2 
lub T. Test H295R nie ma na celu identyfikacji substancji chemicznych, które wp ływają na steroidogenez ę, z uwagi na jego oddzia ływanie na o ś 
podwzgórze–przysadka–gonady (HPG). Celem opisywanego testu jest uzys ­
kanie odpowiedzi TAK/NIE w odniesieniu do zdolno ści danej substancji 
chemicznej do wywo ływania lub hamowania produkcji T i E2; jednak 
w niektórych przypadkach mo żna uzyska ć wyniki ilo ściowe (zob. pkt 53 
i 54). Wyniki testu wyra ża się jako wzgl ędne zmiany w produkcji 
hormonów w porównaniu z kontrol ą rozpuszczalnika (KR). Celem tego 
testu nie jest dostarczenie okre ślonych informacji mechanistycznych dotycz ­ 
ących interakcji badanej substancji chemicznej z uk ładem hormonalnym. 
Aby zidentyfikowa ć wpływ na okre ślone enzymy i hormony po średnie, 
takie jak progesteron, przeprowadzono badania z wykorzystaniem danej linii komórkowej (2).
 
3. Definicje i skróty stosowane w opisywanej metodzie badawczej s ą opisane 
w dodatku. Szczegó łowy protokó ł zawieraj ący wskazówki dotycz ące 
sposobu przygotowywania roztworów, hodowania komórek 
i przeprowadzania ró żnych aspektów testu przedstawiono w dodatkach 
I–III do dokumentu OECD ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production’ (Mi ędzylaboratoryjna walidacja testu steroidogenezy H295R 
mająca na celu identyfikacj ę modulatorów wytwarzania testosteronu 
i estradiolu) (4).
 
ZAŁOŻENIA WST ĘPNE I OGRANICZENIA  
4. W biosyntezie sze ściu sterydowych hormonów p łciowych udzia ł bierze pi ęć 
różnych enzymów katalizuj ących sze ść różnych reakcji. Enzymatyczna 
konwersja cholesterolu do pregnenolonu za pomoc ą enzymu rozszczepiaj ą­
cego łańcuch boczny cholesterolu (CYP11 A) z rodziny enzymów cyto ­
chromu P450 (CYP) stanowi pocz ątkowy etap serii reakcji biochemicznych, 
które prowadz ą do syntezy sterydowych produktów ko ńcowych. 
W zależności od kolejno ści następnych dwóch reakcji nast ępuje podzia ł 
szlaku steroidogenezy na dwa szlaki, szlak Δ 5 -hydroksysteroidowy i szlak 
Δ 4 -ketosteroidowy, które łączą się w produkcji androstenedionu (rys. 1).  
5. Konwersja androstenedionu do testosteronu (T) zachodzi za pomoc ą dehyd­
rogenazy 17 β-hydroksysteroidowej (17 β-HSD). Testosteron jest zarówno 
hormonem po średnim, jak i produktem ko ńcowym. U samców T mo żna 
przekszta łcić w dihydrotestosteron (DHT) w wyniku dzia łania 5-α- 
red.uktazy, która znajduje si ę w błonach komórkowych, otoczce j ądrowej 
i siateczce śródplazmatycznej tkanek, na które ukierunkowane jest dzia łanie 
androgenów, takich jak prostata i p ęcherzyki nasienne. DHT jest znacznie 
silniejszy jako androgen ni ż T i jest równie ż uważany za hormon ko ńcowy. 
W teście H295R nie mierzy si ę poziomu dihydrotestosteronu (zob. pkt 10).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 889
 
6. Enzymem w przebiegu steroidogenezy, który umo żliwia konwersj ę andro­
genowych substancji chemicznych w estrogenowe substancje chemiczne jest 
aromataza (CYP19). Aromataza przekszta łca testosteron (T) w 17 β-estradiol 
(E2), a androstenedion w estron. E2 i T uwa ża się za końcowe hormony 
szlaku steroidogenezy.  
7. Specyfika dzia łania liazów CYP17 ró żni się w odniesieniu do substratów 
pośrednich mi ędzy gatunkami. U ludzi enzym ten faworyzuje substraty 
szlaku Δ 5 -hydroksysteroidowego (pregnenolon), natomiast u szczurów 
faworyzowane s ą substraty w szlaku Δ 4 -ketosteroidowym (progesteron) 
(19). Takie ró żnice w dzia łaniu liazów CYP17 mog ą wyjaśniać niektóre 
różnice w reakcji na substancje chemiczne mi ędzy gatunkami, które skut ­
kują zmianą steroidogenezy  in vivo  (6). Wykazano, że komórki H295 
najwierniej odzwierciedlaj ą ekspresj ę enzymów kory nadnerczy oraz 
schemat produkcji sterydów u ludzi doros łych (20), ale znane s ą 
z ekspresji enzymów zarówno w szlaku Δ 5 -hydroksysteroidowym, jak i w 
szlaku Δ 4 -ketosteroidowym syntezy androgenu (7)(11)(13)(15).  
Rysunek 1  
Przebieg steroidogenezy w komórkach H295R
  
Uwaga:  
Enzymy oznaczono kursyw ą, hormony oznaczono wyt łuszczeniem, za ś 
strzałki wskazuj ą kierunek syntezy. Szare t ło wskazuje na szlaki/produkty 
kortykosterydowe. W okr ągłej ramce umieszczono szlaki/produkty sterydo ­
wych hormonów p łciowych. CYP = cytochrom P450; HSD = dehydroge ­
naza hydroksysteroidowa; DHEA = dehydroepiandrosteron.  
8. Linia ludzkich komórek raka nadnercza H295R stanowi u żyteczny model  in 
vitro  do celów badania wp ływu na syntez ę hormonów sterydowych 
(2)(7)(8)(9)(10). W linii komórek H295R zachodzi ekspresja genów koduj ­ 
ących dla wszystkich przedstawionych powy żej enzymów kluczowych dla 
steroidogenezy (11)(15) (rys. 1). Jest to unikalna w łaściwość, poniewa ż 
ekspresja tych genów  in vivo  jest uzale żniona od tkanek i stadium rozwojo ­
wego i zazwyczaj żadna pojedyncza tkanka ani pojedyncze stadium 
rozwojowe nie pozwala na ekspresj ę wszystkich genów bior ących udzia ł 
w steroidogenezie (2). Komórki H295R wykazuj ą właściwości fizjologiczne 
strefowo niezró żnicowanych komórek nadnercza ludzkiego p łodu (11). 
Komórki te stanowi ą wyjątkowy system  in vitro , z uwagi na fakt, że posia­
dają one zdolno ść produkowania wszystkich hormonów sterydowych wyst ę­
pujących w korze nadnerczy i gonadach u doros łych ludzi, pozwalaj ąc na ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 890
 
badanie wp ływu na syntez ę kortykosterydów i produkcj ę sterydowych 
hormonów p łciowych, takich jak androgeny i estrogeny, mimo że test ten 
uzyskał walidację wyłącznie w odniesieniu do wykrywania T i E2. Zmiany 
zarejestrowane przez system testowy w postaci zmian w produkcji T i E2 mogą być wynikiem szeregu ró żnych interakcji badanych substancji 
chemicznych o funkcjach zwi ązanych ze steroidogenez ą, które wyra żają 
komórki H295R. Mog ą one obejmowa ć modulacj ę ekspresji, syntezy lub 
działania enzymów bior ących udzia ł w produkcji, transformacji lub elimi ­
nacji hormonów sterydowych (12)(13)(14). Zahamowanie produkcji 
hormonów mo że być wynikiem bezpo średniego konkurencyjnego wi ązania 
z enzymem w szlaku, wp ływu na wspó łczynniki, takie jak NADPH (fosfo ­
ranu dinukleotydu nikotynamido-adeninowego) i cAMP (cykliczny adeno ­
zynomonofosforan) lub zwi ększenia metabolizmu sterydów lub supresji 
ekspresji genów niektórych enzymów w szlaku steroidogenezy. Podczas 
gdy zahamowanie mo że być funkcją zarówno bezpo średnich, jak 
i pośrednich procesów sk ładających się na produkcj ę hormonów, indukcja 
ma zazwyczaj charakter po średni na przyk ład poprzez oddzia ływanie na 
wspó
łczynniki takie jak NADPH i cAMP (podobnie jak w przypadku 
forskoliny), ograniczanie metabolizmu sterydów (13) i zwi ększanie 
ekspresji genów steroidogenezy.  
9. Test H295R ma liczne zalety:  
— pozwala na wykrywanie zarówno zwi ększenia, jak i zmniejszenia 
produkcji T i E2,  
— umożliwia bezpo średnią ocenę potencjalnego wp ływu substancji 
chemicznej na żywotność/cytotoksyczno ść komórek. Jest to istotna 
cecha, poniewa ż pozwala na odró żnienie skutków b ędących wynikiem 
cytotoksyczno ści od skutków, które wynikaj ą z bezpośredniej interakcji 
substancji chemicznych ze szlakami steroidogenezy, co nie jest mo żliwe 
w przypadku systemów eksplantów tkanek, które sk ładają się z licznych 
rodzajów komórek charakteryzuj ących się różnymi czu łościami 
i funkcjami,  
— nie wymaga wykorzystywania zwierz ąt, 
— linia komórek H295R jest dost ępna na rynku.  
10. Główne ograniczenia tego testu s ą następujące: 
— zdolno ść metaboliczna testu nie jest znana, ale najprawdopodobniej jest 
dosyć ograniczona; w zwi ązku z tym substancje chemiczne, które 
wymagają aktywacji metabolicznej, zostan ą prawdopodobnie pomini ęte 
w tym te ście;, 
— poniewa ż komórki H295R uzyskuje si ę z tkanki nadnercza, zawieraj ą 
one enzymy zdolne do produkowania gluko- i mineralokortykoidów 
oraz hormonów p łciowych, w zwi ązku z czym oddzia ływanie na 
produkcję gluko- i mineralokortykoidów mo że mieć wpływ na obser ­
wowane w ramach tego testu poziomy T i E2,  
— w teście tym nie dokonuje si ę pomiaru poziomu DHT i w zwi ązku 
z tym nie oczekuje si ę, że zostaną wykryte substancje chemiczne 
hamujące 5-α-reduktaz ę; w takim przypadku mo żna zastosowa ć test 
Hershbergera (16),  
— w teście H295R nie zostan ą wykryte substancje chemiczne zak łócające 
steroidogenez ę poprzez oddzia ływanie na o ś podwzgórze–przysadka– ­
gonady (HPG), poniewa ż można to zbada ć wyłącznie na zwierz ętach 
nienaruszonych.  
ZASADA BADANIA  
11. Opisywany test ma na celu wykrywanie substancji chemicznych, które maj ą 
wpływ na produkcj ę T i E2. T jest równie ż produktem po średnim na szlaku 
prowadzącym do produkcji E2. W omawianym te ście można wykry ć 
substancje chemiczne, które zazwyczaj hamuj ą lub wywo łują działanie 
enzymów szlaku steroidogenezy.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Omawiany test przeprowadza si ę zazwyczaj w normalnych warunkach 
kultury komórkowej na p łytkach 24-do łkowych. Ewentualnie dopuszcza 
się stosowanie innych rozmiarów p łytek do przeprowadzania testu; warunki 
posiewu i warunki do świadczalne nale ży odpowiednio dostosowywa ć, aby 
zachować zgodność z kryteriami wykonania testu.  
13. Po zako ńczeniu 24-godzinnego okresu aklimatyzacji w p łytkach wielodo ł­
kowych komórki poddaje 48-godzinnemu okresowi nara żenia na siedem 
stężeń badanej substancji chemicznej co najmniej trzykrotnie. Rozpusz ­
czalnik oraz znany inhibitor produkcji hormonów i czynnik wywo łujący 
produkcję hormonów w sta łym stężeniu stosuje si ę jako kontrole ujemn ą 
i dodatni ą. Po zako ńczeniu okresu nara żenia z ka żdego dołka usuwa si ę 
podłoże. Natychmiast po usuni ęciu podłoża bada si ę żywotność komórek 
w każdym dołku. Stężenia hormonów w pod łożu można mierzy ć, stosując 
szereg różnych metod, w tym za pomoc ą dostępnych na rynku zestawów do 
pomiaru hormonów lub technik instrumentalnych, takich jak chromatografia cieczowa po łączona ze spektrometri ą masową (LC-MS). Dane wyra ża się 
jako krotno ść zmiany w stosunku do kontroli rozpuszczalnika i najni ż
szego 
stężenia, przy którym obserwuje si ę zmiany (LOEC). Je żeli wynik testu jest 
ujemny, najwy ższe zbadane st ężenie rejestruje si ę jako najwy ższe stężenie, 
przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych zmian (NOEC). Wnioski 
dotyczące zdolno ści substancji chemicznej do oddzia ływania na steroidoge ­
nezę należy formułować na podstawie co najmniej dwóch niezale żnych 
prób badawczych. Pierwsza próba badawcza mo że pełnić rolę próby 
służącej ustaleniu zakresu, po którym w razie potrzeby dostosowuje si ę 
stężenia dla prób 2 i 3, je żeli wyst ąpią problemy zwi ązane 
z rozpuszczalno ścią lub cytotoksyczno ścią lub jeżeli wydaje si ę, że aktyw­
ność danej substancji chemicznej znajduje si ę na poziomie granicznej 
wartości zakresu badanych st ężeń. 
PROCEDURA HODOWLI  
Linia komórkowa  
14. Komórki NCI-H295R s ą dostępne komercyjnie z ameryka ńskiego zbioru 
typów kultur (ATCC) po podpisaniu porozumienia o transferze materiału (MTA) (
 1 ). 
Wprowadzenie  
15. W zwi ązku ze zmianami zdolno ści komórek do produkcji E2 wraz 
z wiekiem i wzrostem liczby pasa ży (2), komórki nale ży hodowa ć zgodnie 
z określonym protoko łem, zanim zostan ą wykorzystane, i nale ży odnotowa ć 
liczbę pasaży od momentu rozmro żenia komórek oraz numer pasa żu, przy 
którym komórki zosta ły zamrożone i umieszone w zbiorniku z ciek łym 
azotem. Pierwsza warto ść oznacza faktyczn ą liczbę pasaży komórek, 
podczas gdy druga warto ść oznacza numer pasa żu, przy którym komórki 
zostały zamrożone i umieszczone w zbiorniku. Przyk ładowo komórki, które 
zostały zamrożone po pi ątym pasażu i rozmro żone, a nast ępnie trzykrotnie 
podzielone (4 pasa że, licząc świeżo rozmro żone komórki jako pasa ż 1), po 
ponownym umieszczeniu w hodowli zosta łyby oznaczone jako pasa ż 4.5. 
Przykładowy schemat numerowania przedstawiono w dodatku I do spra ­
wozdania z walidacji (4).  
16. Podłoże wyjściowe stosuje si ę jako podstaw ę podłoża wzbogaconego 
i podłoża do zamra żania. Pod łoże wzbogacone jest niezb ędnym składnikiem 
do hodowli komórek. Pod łoże do zamra żania jest specjalnie opracowane, 
aby umożliwić zamrażanie komórek bez skutków ubocznych do celów ich 
długoterminowego przechowywania. Przed zastosowaniem nale ży przepro ­
wadzić analizę Nu-serum (lub porównywalnego serum o równowa żnych 
właściwościach, w przypadku którego wykazano, że dostarcza danych spe ł­
niających wymogi w zakresie przeprowadzania testu i kontroli jako ści), 
które jest sk ładnikiem pod łoża wzbogaconego, pod k ątem wyjściowych 
stężeń T i E2. Sposób przygotowania tych roztworów opisano w dodatku 
II do sprawozdania z walidacji (4).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 892  
( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Po zainicjowaniu kultury komórkowej H295R z oryginalnej partii ATCC 
komórki nale ży hodowa ć przez pi ęć pasaży (tj. komórki dzieli si ę cztero­
krotnie). Komórki pasa żu piątego są następnie zamra żane w ciek łym azocie 
do celów przechowywania. Przed zamro żeniem komórek dokonuje si ę 
analizy próbki komórek poprzedniego pasa żu czwartego na p łytce kontroli 
jakości (zob. pkt 36 i 37), aby zweryfikowa ć, czy podstawowa produkcja 
hormonów i reakcja na substancje chemiczne kontroli dodatniej spe łniają 
wymogi w zakresie kontroli jako ści testu zgodnie z tabel ą 5. 
18. Komórki H295R nale ży hodowa ć, zamrozi ć i przechowywa ć w ciekłym 
azocie, aby mie ć pewność, że komórki z odpowiedniego pasa żu/w odpo ­
wiednim wieku s ą zawsze dost ępne do hodowli i u żytku. Maksymalna 
liczba pasa ży po wybraniu nowej (  1 ) lub zamro żonej (  2 ) partii komórek do 
kultury komórkowej, która jest dopuszczalna w przypadku testu H295R, nie 
powinna przekracza ć 10. Przyk ładowo w przypadku kultur komórek 
pochodzących z partii zamro żonych przy pasa żu 5 dopuszczalne by łyby 
pasaże z przedzia łu 4.5–10.5. W przypadku komórek uzyskanych z tych 
zamrożonych partii nale ży przestrzega ć procedury opisanej w pkt 19. 
Komórki te nale ży hodowa ć przez co najmniej cztery (4) dodatkowe pasa że 
(pasaż 4.5), zanim zostan ą wykorzystane do testów.  
Uzyskiwanie komórek z zamro żonego zapasu  
19. Procedur ę uzyskiwania komórek z zamro żonego zapasu nale ży stosowa ć 
w przypadku, gdy now ą partię komórek wyjmuje si ę z ciekłego azotu do 
celów hodowli i testów. Szczegó ły dotyczące tej procedury przedstawiono 
w dodatku III do sprawozdania z walidacji (4). Komórki wyjmuje si ę 
z ciekłego azotu, natychmiast si ę je rozmra ża, umieszcza w pod łożu wzbo­
gaconym w probówce wirówkowej, odwirowuje w temperaturze pokojowej, 
ponownie zawiesza w pod łożu wzbogaconym, a nast ępnie umieszcza si ę je 
w kolbie do kultur komórkowych. Nast ępnego dnia nale ży zmienić podłoże. 
Komórki H295R hoduje si ę w inkubatorze w temperaturze 37 °C 
w warunkach, w których zawarto ść CO  2 w powietrzu wynosi 5 %, 
a podłoże zmienia si ę na nowe 2–3 razy w tygodniu. W momencie osi ąg­
nięcia przez komórki konfluencji na poziomie 85–90 %, nale ży je podzieli ć. 
Podział komórek jest konieczny, aby zapewni ć zdrowie i wzrost komórek 
oraz aby utrzyma ć komórki do celów przeprowadzania testów biologicz ­
nych. Komórki p łucze się trzykrotnie w roztworze chlorku sodu buforo ­
wanym fosforanami (PBS bez zawarto ści Ca  2+ Mg 2+ ) i wydostaje si ę je 
z kolby do kultur komórkowych, dodaj ąc odpowiedni enzym powoduj ący 
oddzielenie, np. trypsyn ę, w PBS (bez zawarto ści Ca  2+ Mg 2+ ). Natychmiast 
po oddzieleniu si ę komórek od kolby do kultur komórkowych nale ży 
zatrzymać działanie enzymu poprzez dodanie pod łoża wzbogaconego 
w stosunku 3-krotno ści objętości zastosowanej do podania enzymu. 
Komórki umieszcza si ę w probówce wirówkowej, odwirowuje si ę je 
w temperaturze pokojowej, usuwa si ę supernatant i dokonuje si ę ponow­
nego zawieszenia osadu komórek w pod łożu wzbogaconym. Odpowiedni ą 
ilość roztworu z komórkami umieszcza si ę w nowej kolbie do kultur 
komórkowych. Ilo ść roztworu z komórkami nale ży dostosowa ć tak, aby 
komórki osi ągnęły stan konfluencji w ci ągu 5–7 dni. Zalecany wska źnik 
subhodowli wynosi 1:3–1:4. P łytkę należy ostrożnie oznakowa ć. Komórki 
można teraz wykorzysta ć do celów testu, a ich nadmiar nale ży zamrozi ć 
w ciekłym azocie w sposób opisany w pkt 20.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) „Nowa partia” odnosi si ę do świeżej partii komórek otrzymanych ze zbioru kultur typu 
amerykańskiego. 
( 2 ) „Zamro żona partia” odnosi si ę do komórek, które zosta ły uprzednio wyhodowane, 
a następnie zamro żone w laboratorium, innych ni ż komórki ze zbioru kultur typu amery ­
kańskiego.
 Zamrażanie komórek H295R (przygotowywanie komórek do przecho ­
wywania w ciek łym azocie)  
20. W celu przygotowania komórek H295R do zamro żenia nale ży stosowa ć 
procedurę opisaną powyżej w odniesieniu do podzia łu komórek a ż do 
etapu ponownego zawieszania osadu komórek na dnie probówki wirówko ­
wej. Na tym etapie osad komórek ponownie zawiesza si ę w podłożu do 
zamrażania. Roztwór przenosi si ę do odpowiednio oznakowanej fiolki krio ­
genicznej i zamra ża w temperaturze -80 °C na 24 godziny, a nast ępnie 
fiolkę kriogeniczn ą umieszcza si ę w ciekłym azocie do celów przechowy ­
wania. Szczegó ły dotyczące tej procedury przedstawiono w dodatku III do 
sprawozdania z walidacji (4).  
Posiew i wst ępna inkubacja tkanek do celów badania  
21. Potrzebna liczba p łytek 24-do łkowych, przygotowanych zgodnie z opisem 
w pkt 19, b ędzie uzale żniona od liczby badanych substancji chemicznych 
i konfluencji komórek w naczyniach z kulturami. Zgodnie z zasad ą ogólną 
jedna kolba do kultur komórkowych (75 cm  2 ) zawieraj ąca komórki w stanie 
konfluencji na poziomie 80–90 % zapewni wystarczaj ącą liczbę komórek 
dla 1–1,5 p łytki (24-do łkowej) o g ęstości docelowej wynosz ącej 
200 000–300 000 komórek na ml pod łoża, co skutkuje uzyskaniem 
w dołkach konfluencji na poziomie 50–60 % po up ływie 24 godzin (rys. 
2). Stanowi to zazwyczaj optymalny poziom g ęstości komórek do produkcji 
hormonów w te ście. W przypadku wy ższych gęstości schematy produkcji 
T i E2 ulegaj ą zmianie. Przed przeprowadzeniem testu po raz pierwszy 
zaleca się zbadanie ró żnych gęstości posiewu mi ędzy 200 000 a 300 000 
komórek na ml oraz wybranie g ęstości skutkuj ącej konfluencj ą na poziomie 
50–60 % w do łku po up ływie 24 godzin do celów dalszych do świadczeń. 
Rysunek 2  
Mikrofotografia komórek H295R o zag ęszczeniu na poziomie 50 % na p łytce 24-do łkowej 
zawierającej kultur ę komórkow ą wykonana w 24 godzinie na kra ńcu (A) i w środkowej 
części (B) do łka
 
22. Podłoże usuwa si ę z kolby do kultur komórkowych za pomoc ą pipety, 
a komórki p łucze się 3-krotnie za pomoc ą sterylnego PBS (niezawieraj ą­
cego Ca  2+ Mg 2+ ). Dodaje si ę roztwór enzymu (w PBS) w celu oddzielenia 
komórek od kolby do kultur komórkowych. Po up ływie odpowiedniego 
czasu na oddzielenie si ę komórek nale ży zatrzyma ć działanie enzymu 
poprzez dodanie pod łoża wzbogaconego w stosunku 3-krotno ści objętości 
zastosowanej do podania enzymu. Komórki umieszcza si ę w probówce  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 894
 
wirówkowej, odwirowuje si ę je w temperaturze pokojowej, usuwa si ę 
supernatant i dokonuje si ę ponownego zawieszenia osadu komórek 
w podłożu wzbogaconym. G ęstość komórek oblicza si ę za pomoc ą np. 
hemocytometru lub narz ędzia do liczenia komórek. Roztwór z komórkami 
należy rozcieńczyć do uzyskania oczekiwanej g ęstości posiewu i dok ładnie 
wymiesza ć, aby zapewni ć jednorodn ą gęstość komórek. Nale ży dokona ć 
posiewu komórek, stosuj ąc 1 ml roztworu z komórkami na do łek oraz 
oznakowa ć płytki i do łki. Posiane p łytki inkubuje si ę przez 24 godziny 
w temperaturze 37 °C w warunkach, w których zawarto ść CO  2 
w powietrzu wynosi poni żej 5 %, aby umo żliwić komórkom osadzenie 
się w dołkach.  
WYMOGI W ZAKRESIE KONTROLI JAKO ŚCI 
23. Niezwykle istotne jest dostarczenie dok ładnych obj ętości roztworów 
i próbek do do łków podczas dawkowania, poniewa ż objętości te decyduj ą 
o stężeniach wykorzystywanych w obliczeniach wyników testu.  
24. Przed zainicjowaniem kultury komórkowej i rozpocz ęciem wszelkich 
dalszych bada ń każde laboratorium powinno wykaza ć czułość swojego 
systemu pomiaru hormonów (pkt 29–31).  
25. Jeżeli planuje si ę zastosowanie testów pomiaru hormonów na podstawie 
przeciwcia ł, badane substancje chemiczne nale ży poddać analizie pod 
kątem ich potencja łu do zak łócania systemu pomiaru wykorzystywanego 
do ilościowego okre ślenia T i E2, jak opisano w pkt 32, przed rozpocz ę­
ciem testów.  
26. Zaleca si ę stosowanie sulfotlenku dimetylu (DMSO) jako rozpuszczalnika 
do celów testu. Je żeli wykorzystuje si ę alternatywny rozpuszczalnik, nale ży 
określić: 
— rozpuszczalno ść badanej substancji chemicznej, forskoliny i prochlorazu 
w rozpuszczalniku, oraz  
— cytotoksyczno ść jako funkcj ę stężenia rozpuszczalnika.  
Zaleca si ę, aby maksymalne dopuszczalne st ężenie rozpuszczalnika nie 
przekracza ło 10-krotnej warto ści rozcieńczenia najmniej cytotoksycznego 
stężenia rozpuszczalnika.  
27. Przed przeprowadzeniem bada ń po raz pierwszy laboratorium powinno 
wykonać doświadczenie kwalifikuj ące, mające na celu wykazanie, że labo­
ratorium posiada zdolno ść do utrzymania i uzyskania odpowiedniej kultury 
komórkowej i warunków do świadczalnych wymaganych do celów bada ń 
substancji chemicznych, jak opisano w pkt 33–35.  
28. Rozpoczynaj ąc badania z wykorzystaniem nowej partii, nale ży przeprowa ­
dzić analizę płytki kontrolnej przed zastosowaniem nowej partii komórek do 
oceny efektywno ści komórek, jak opisano w pkt 36 i 37.  
Sprawno ść systemu pomiaru hormonów  
Czułość, dokładność, precyzja i reaktywno ść krzyżowa metody wraz 
z przykładową matrycą 
29. Każde laboratorium mo że stosowa ć dowolny system pomiaru hormonów do 
celów analizy produkcji T i E2 przez komórki H295R, pod warunkiem że 
spełnia on wymogi w zakresie sprawno ści, w tym wymogi dotycz ące 
granicy oznaczalno ści (LOQ). Nominalnie granice te wynosz ą 100 pg/ml 
dla T i 10 pg/ml dla E2 i opieraj ą się na podstawowych poziomach 
hormonów zaobserwowanych podczas bada ń walidacyjnych. Wy ższe lub 
niższe poziomy mog ą być jednak odpowiednie w zale żności od podstawo ­
wych poziomów hormonów, jakie uzyskano w laboratorium przeprowadzaj ­ 
ącym badania. Przed rozpocz ęciem analizy p łytki kontroli jako ści i prób 
badawczych laboratorium powinno wykaza ć, że za pomoc ą planowanego  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 895
 
test hormonów mo żna dokonywa ć pomiaru st ężeń hormonów w pod łożu 
wzbogaconym z wystarczaj ącą dokładnością i precyzj ą, tak aby spe łnić 
kryteria w zakresie kontroli jako ści określone w tabelach 1 i 5, poprzez 
dokonanie analizy pod łoża wzbogaconego uzupe łnionego o substancj ę do 
wewnętrznej kontrolni hormonów. Pod łoże wzbogacone nale ży uzupełnić 
o co najmniej trzy st ężenia każdego hormonu (np. 100, 500 i 2 500 
pg/ml T; 10, 50 i 250 pg/ml E2; lub mo żna użyć najniższych mo żliwych 
stężeń na podstawie granic wykrywalno ści wybranego systemu pomiaru 
hormonów w odniesieniu do najni ższych uzupe łniających stężeń T i E2), 
a następnie podda ć analizie. Zmierzone st ężenia hormonów 
z nieekstrahowanych próbek powinny wynosi ć około 30 % st ężeń nominal­
nych, a zmienno ść między pomiarami kontrpróbek z tej samej próbki nie 
powinna przekracza ć 25 % (aby uzyska ć dodatkowe kryteria w zakresie 
kontroli jako ści, zob. tak że tabela 8). Je żeli powyższe kryteria w zakresie 
kontroli jako ści zostaną spełnione, przyjmuje si ę, że wybrany test pomiaru 
hormonów jest wystarczaj ąco dokładny i precyzyjny i nie wchodzi 
w reakcj ę krzyżową ze składnikami pod łoża (przyk ładowa matryca) 
w taki sposób, że można byłoby oczekiwa ć istotnego wp ływu na wynik 
testu. W zwi ązku z tym nie wymaga si ę ekstrakcji próbek przed dokona ­
niem pomiaru hormonów.  
30. Jeżeli kryteria w zakresie kontroli jako ści przedstawione w tabelach 1 i 8 
nie zostan ą spełnione, mo że nastąpić istotny wp ływ na matryc ę i wówczas 
należy przeprowadzi ć doświadczenie z ekstrahowanym pod łożem uzupe ł­
nionym. Przyk ład procedury ekstrakcji przedstawiono w dodatku II do 
sprawozdania z walidacji (4). Pomiary st ężeń hormonów 
w ekstrahowanych próbkach nale ży przeprowadzi ć trzykrotnie (  1 ). Jeżeli 
można wykaza ć, że po dokonaniu ekstrakcji sk ładniki pod łoża nie zakłócają 
metody wykrywania hormonów zgodnie z kryteriami w zakresie kontroli jakości, wszelkie dalsze do świadczenia nale ży przeprowadza ć przy użyciu 
ekstrahowanych próbek. Je żeli po dokonaniu ekstrakcji kryteria kontroli 
jakości nie mog ą zostać spełnione, stosowany system pomiaru hormonów 
nie jest odpowiedni do testu steroidogenezy H295R i nale ży wykorzysta ć 
inną metodę wykrywania hormonów.
 
Krzywa wzorcowa  
31. Stężenia hormonów w kontroli rozpuszczalnika (KR) powinny mie ścić się 
w zakresie liniowym krzywej wzorcowej. Po żądane jest, aby warto ści KR 
znalazły się w pobliżu środkowej cz ęści zakresu liniowego, dzi ęki czemu 
możliwy będzie pomiar wywo łania i zahamowania syntezy hormonów. 
Należy odpowiednio wybra ć rozcieńczenia pod łoża (lub ekstraktów), które 
mają zostać zmierzone. Zale żność liniową należy określić przy zastoso ­
waniu odpowiedniego podej ścia statystycznego.  
Badanie interferencji chemicznej  
32. W przypadku gdy do pomiaru hormonów maj ą zostać zastosowane testy 
oparte na przeciwcia łach, takie jak testy immunoenzymatyczne (ELISA) 
i metody radioimmunologiczne (RIA), ka żdą substancj ę chemiczn ą należy 
zbadać pod kątem potencjalnej interferencji z systemem pomiaru hormo ­
nów, który ma zosta ć wykorzystany, przed rozpocz ęciem faktycznego 
badania substancji chemicznych (dodatek III do sprawozdania z walidacji (4)), poniewa ż niektóre substancje chemiczne mog ą zakłócać wspomniane 
badania (17). W przypadku wyst ąpienia interferencji na poziomie ≥ 20 % 
podstawowej produkcji hormonów w odniesieniu do T lub E2, jak określono na podstawie analizy hormonów, nale ży przeprowadzi ć badanie
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Uwaga:  Jeżeli ekstrakcja jest wymagana, dokonuje si ę trzech kontrpomiarów 
w odniesieniu do ka żdego ekstraktu. Ka żda próbka zostanie poddana ekstrakcji tylko raz.
 interferencji chemicznej dla testu hormonów (jak opisano w sekcji 5.0 
dodatku III do sprawozdania z walidacji (4)) w odniesieniu do wszystkich 
rozcieńczeń roztworów wyj ściowych substancji chemicznych w celu ziden ­
tyfikowania progu dawki, przy której wyst ępuje istotna interferencja ( ≥ 20 
%). Jeżeli interferencja nie przekracza 30 %, wyniki mo żna skorygowa ć 
o wartość tej interferencji. Je żeli interferencja przekracza 30 %, otrzymane 
dane są nieważne i należy odrzuci ć dane dotycz ące odnośnych stężeń. Jeżeli 
istotna interferencja badanej substancji chemicznej z systemem pomiaru hormonów wyst ąpi w przypadku wi ęcej niż jednego niecytotoksycznego 
stężenia, nale ży zastosowa ć inny system pomiaru hormonów. W celu unik ­
nięcia interferencji wynikaj ącej z zanieczyszczania substancji chemicznych 
zaleca się dokonywanie ekstrakcji hormonów z pod łoża za pomoc ą odpo­
wiedniego rozpuszczalnika; mo żliwe metody przedstawiono 
w sprawozdaniu z walidacji (4).
 
Tabela 1  
Kryteria sprawno ści w odniesieniu do systemów pomiaru hormonów  
Parametr Kryterium  
Czułość metody pomiaru Granica oznaczalno ści (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  r ) 
Efektywno ść ekstrakcji hormonów 
(jedynie w przypadku, gdy ekstrakcja jest konieczna) Średnie wska źniki odzysku (na 
podstawie trzykrotnych pomiarów) w odniesieniu do dodanych ilo ści 
hormonów nie powinny odbiega ć 
o więcej niż 30 % od ilo ści, która 
została dodana. 
Interferencja chemiczna (jedynie 
w przypadku systemów opartych na przeciwcia łach) Nie powinna nast ąpić istotna 
(≥ 30 % podstawowej produkcji 
odpowiedniego hormonu) reakcja 
krzyżowa z żadnym hormonem 
produkowanym przez komórki (
 s ) ( t ) 
( r ) Uwaga:  Granice pomiaru metody ustalono na podstawie podstawowych warto ści 
dotyczących produkcji hormonów przedstawionych w tabeli 5 i zale żą one od 
wyników. Je żeli możliwe jest otrzymanie wi ększej podstawowej produkcji hormo ­
nów, granica mo że być wyższa. 
( s ) Niektóre przeciwcia ła T i E2 mog ą wchodzi ć w reakcj ę krzyżową odpowiednio 
z androstenedionem i estronem przy wy ższej zawarto ści procentowej. W takich 
przypadkach dok ładne okre ślenie wp ływu na 17 β-hydroksysteroid nie jest 
możliwe. Uzyskane dane mog ą jednak w dalszym ci ągu stanowi ć źródło przydat ­
nych informacji na temat ogólnego wp ływu na produkcj ę estrogenu lub andro ­
genu. W takich przypadkach dane nale ży wyrazi ć jako reakcje androgenowe/ 
estrogenowe, a nie reakcje 17 β-estradiolowe i testosteronowe. 
( t ) Obejmuj ą one: cholesterol, pregnenolon, progesteron, 11-deoksykortykosteron, 
kortykosteron, aldosteron, 17 α-pregnenolon, 17 α-progesteron, deoksykortyzol, 
kortyzol, dehydroepiandrosteron, androstenedion i estron.  
Badanie bieg łości laboratorium  
33. Przed rozpocz ęciem badania nieznanych substancji chemicznych laborato ­
rium powinno wykaza ć zdolność do uzyskania i utrzymywania odpowied ­
niej kultury komórkowej i odpowiednich warunków bada ń, wymaganych do 
skutecznego przeprowadzenia testu, wykonuj ąc badanie bieg łości laborato ­
rium. Poniewa ż wynik testu bezpo średnio zale ży od pracowników labora ­
torium przeprowadzaj ących test, procedury te nale ży częściowo powtarza ć, 
jeżeli nastąpi zmiana personelu laboratorium.  
34. Takie badanie bieg łości zostanie przeprowadzone w takich samych warun ­
kach jak warunki wymienione w pkt 38–40, poprzez nara żenie komórek na 
7 zwiększanych st ężeń substancji o silnym, umiarkowanym i s łabym dzia ­ 
łaniu wywo łującym i hamuj ącym oraz substancji kontroli ujemnej (zob. 
tabela 2). Badane substancje chemiczne obejmuj ą w szczególno ści forsko­
linę o silnym dzia łaniu wywo łującym (nr CAS 66575-29-9); prochloraz  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
o silnym dzia łaniu hamuj ącym (nr CAS 67747-09-5); atrazyn ę 
o umiarkowanym dzia łaniu wywo łującym (nr CAS 1912-24-9); aminoglu ­
tetymid o umiarkowanym dzia łaniu hamuj ącym (nr CAS 125-84-8); 
bisfenol A o s łabym dzia łaniu wywo łującym (produkcja E2) i s łabym dzia ­ 
łaniu hamuj ącym (produkcja T) (nr CAS 80-05-7); oraz ludzk ą gonadotro ­
pinę kosmówkow ą (hCG) do kontroli ujemnej (nr CAS 9002-61-3), jak 
przedstawiono w tabeli 2. Dla wszystkich substancji chemicznych stosuje się oddzielne p łytki zgodnie ze schematem przedstawionym w tabeli 6. 
Jedną płytkę kontroli jako ści (pkt 36–37, tabela 4) nale ży dołączyć do 
każdej próby dziennej w odniesieniu do substancji chemicznych przezna ­
czonych do oceny bieg łości.
 
Tabela 2  
Substancje chemiczne przeznaczone do oceny bieg łości i stężeń 
narażenia  
Substancja chemiczna prze ­
znaczona do oceny bieg łości Badane st ężenia [μM] 
Prochloraz 0 (  a ); 0,01; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10 
Forskolina 0 (  a ); 0,03; 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30 
Atrazyna 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
Aminoglutetymid 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
Bisfenol A 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100 
hCG 0 (  a ); 0,03; 0,1; 1; 3; 10; 30; 100  
( a ) Kontrola (0) rozpuszczalnika (DMSO), 1 μl DMSO/do łek 
Podczas badania bieg łości laboratorium poddanie komórek H295R dzia łaniu 
substancji chemicznych przeznaczonych do oceny bieg łości należy przepro ­
wadzać przy użyciu płytek 24-do łkowych. Dawkowanie w odniesieniu do 
wszystkich dawek badanych substancji chemicznych wyra ża się w μM. 
Należy podawa ć dawki w DMSO o st ężeniu 0,1 % v/v na do łek. Wszystkie 
badane st ężenia należy badać z zastosowaniem trzech do łków dla ka żdego 
poziomu st ężenia (tabela 6). W odniesieniu do ka żdej substancji chemicznej 
stosuje si ę oddzielne p łytki. Jedn ą płytkę kontroli jako ści dołącza się do 
każdej próby dziennej.  
35. Analiz ę żywotności komórek i analiz ę hormonów nale ży przeprowadza ć 
zgodnie z opisem zawartym w pkt 42–46. Warto ść progową (najniższe 
stężenie, przy którym obserwuje si ę zmiany, LOEC) i decyzj ę dotyczącą 
klasyfikacji nale ży odnotowa ć i porówna ć z wartościami przedstawionymi 
w tabeli 3. Dane uznaje si ę za dopuszczalne, je żeli spełniają wymogi 
w zakresie LOEC i klasyfikacji decyzji przedstawione w tabeli 3.  
Tabela 3  
Wartości progowe (LOEC) i klasyfikacje decyzji w odniesieniu do substancji 
chemicznych przeznaczonych do oceny bieg łości 
Nr CAS LOEC [μM] Klasyfikacja decyzji 
T E2 T E2  
Prochloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (zahamowa ­
nie) + (zahamowa ­
nie) 
Forskolina 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (indukcja) + (indukcja) 
Atrazyna 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (indukcja) + (indukcja) 
Aminoglute ­
tymid 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (zahamowanie) + (zahamowa ­
nie) ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
Nr CAS LOEC [μM] Klasyfikacja decyzji 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (zahamowanie) + (indukcja) 
hCG 9002-61-3 Nie 
dotyczy Nie 
dotyczy ujemna ujemna  
( a ) +, dodatniaNie dotyczy: nie dotyczy, poniewa ż nie oczekuje si ę wystąpienia zmian po nara żeniu na 
niecytotoksyczne st ężenia substancji kontroli ujemnej.  
Płytka kontroli jako ści 
36. Płytkę kontroli jako ści (QC) stosuje si ę w celu zweryfikowania efektyw ­
ności komórek H295R w standardowych warunkach hodowli oraz utwo ­
rzenia historycznej bazy danych st ężeń hormonów w kontrolach rozpusz ­
czalnika, kontrolach dodatnich i ujemnych, jak równie ż innych pomiarów 
kontroli jako ści w czasie:  
— efektywno ść komórek H295R nale ży oceniać, stosując płytkę kontroli 
jakości dla każdej nowej partii ATCC lub po wykorzystaniu uprzednio 
zamrożonego zapasu komórek po raz pierwszy, chyba że przeprowa ­
dzono badanie bieg łości laboratorium (pkt 32–34) przy u życiu tej partii 
komórek,  
— płytka kontroli jako ści pozwala na kompleksow ą ocenę warunków testu 
(np. żywotności komórek, kontroli rozpuszczalnika, kontroli ujemnych 
i dodatnich oraz zmienno ści w obrębie testów i mi ędzy testami) podczas 
badania substancji chemicznych i powinna stanowi ć część każdej próby 
badawczej.  
37. Badanie w zakresie kontroli jako ści przeprowadza si ę przy użyciu płytki 24- 
dołkowej i zgodnie z tymi samymi procedurami dotycz ącymi inkubacji, 
dawkowania, żywotności/cytotoksyczno ści komórek, ekstrakcji hormonów 
i analizy hormonów, które opisano w pkt 38–46 w odniesieniu do badania 
substancji chemicznych. P łytka kontroli jako ści zawiera próby ślepe, 
kontrole rozpuszczalnika oraz dwa st ężenia znanej substancji indukcyjnej 
(forskolin ę, 1, 10 μM) i inhibitora (prochloraz, 0,1, 1 μM) syntezy E2 i T. 
Ponadto w wybranych do łkach stosuje si ę MeOH jako kontrol ę dodatnią 
w teście żywotności/cytotoksyczno ści. Szczegó łowy opis uk ładu płytki 
przedstawiono w tabeli 4. Kryteria, które nale ży spełnić w odniesieniu do 
płytki kontroli jako ści, wymieniono w tabeli 5. Zarówno w przypadku 
dołków kontroli rozpuszczalnika, jak i do łków próby ślepej nale ży spełnić 
wymogi dotycz ące minimalnej podstawowej produkcji hormonów 
w odniesieniu do T i E2.  
Tabela 4  
Układ płytki kontroli jako ści do celów badania efektywno ści nienara żonych komórek 
H295R i komórek nara żonych na dzia łanie znanych inhibitorów (PRO = prochloraz) 
i stymulatorów (FOR = forskolina) produkcji E2 i T. Po zako ńczeniu nara żenia 
i usunięciu podłoża do wszystkich do łków zawieraj ących MeOH dodany zostanie 70- 
procentowy roztwór metanolu, s łużący jako kontrola dodatnia dla cyctotoksyczno ści 
(zob. test cytotoksyczno ści w dodatku III do sprawozdania z walidacji (4))  
1 2 3 4 5 6  
A Próba 
ślepa (  a ) Próba 
ślepa (  a ) Próba 
ślepa (  a ) Próba 
ślepa (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Próba 
ślepa (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Próba ślepa (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) Komórki w do łkach próby ślepej otrzymuj ą jedynie pod łoże (tj. nie otrzymuj ą rozpuszczalnika). 
( b ) Metanol (MeOH) zostanie dodany  po zakończeniu nara żenia i usuni ęciu podłoża z tych do łków. 
( c ) DMSO kontrola rozpuszczalnika (1 μl/dołek). 
Tabela 5  
Kryteria efektywno ści w odniesieniu do p łytki kontroli jako ści 
T E2  
Podstawowa produkcja 
hormonów w kontroli 
rozpuszczalnika ≥ 5-krotno ść granicy 
oznaczalno ści ≥ 2,5-krotno ść granicy 
oznaczalno ści 
Indukcja (10 μM forsko ­
liny) ≥ 1,5-krotno ść 
kontroli rozpuszczal ­
nika ≥ 7,5-krotno ść kontroli 
rozpuszczalnika 
Zahamowanie (1 μM 
prochlorazu) ≤ 0,5-krotno ść 
kontroli rozpuszczal ­
nika ≤ 0,5-krotno ść kontroli 
rozpuszczalnika  
PROCEDURA NARA ŻENIA NA SUBSTANCJE CHEMICZNE  
38. Komórki preinkubowane usuwa si ę z inkubatora (pkt 21) i sprawdza si ę je 
pod mikroskopem, aby upewni ć się, że są one w dobrym stanie ( łączenie, 
morfologia), zanim rozpocznie si ę dawkowanie.  
39. Komórki umieszcza si ę w szafce zapewniaj ącej bezpiecze ństwo biologiczne, 
a następnie usuwa si ę podłoże wzbogacone i zast ępuje się je nowym 
podłożem wzbogaconym (1 ml/do łek). Do celów tej metody preferowanym 
rozpuszczalnikiem jest DMSO. Je żeli istniej ą jednak wzgl ędy przema ­
wiające za zastosowaniem innych rozpuszczalników, nale ży przedstawi ć 
uzasadnienie naukowe. Komórki nara ża się na działanie badanej substancji 
chemicznej poprzez dodanie 1 μl odpowiedniego roztworu podstawowego 
w DMSO (zob. dodatek II do sprawozdania z walidacji (4)) na 1 ml podłoża wzbogaconego (obj ętość dołka). Dzięki temu uzyskuje si ę stężenie 
końcowe w do łkach na poziomie 0,1 % DMSO. Aby zapewni ć odpo­
wiednie mieszanie, zaleca si ę zasadniczo zmieszanie odpowiedniego 
roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej w DMSO z podłożem wzbogaconym celem uzyskania po żądanego st ężenia końco­
wego dla ka żdej dawki oraz dodanie mieszaniny do ka żdego dołka natych ­
miast po usuni ęciu starego pod łoża. W przypadku zastosowania tego 
wariantu nale ży zachowa ć jednakowe st ężenie DMSO (0,1 %) we wszyst ­
kich dołkach. Do łki zawieraj ące dwa najwi ększe stężenia ocenia si ę wzro­
kowo przy u życiu mikroskopu stereoskopowego pod k ątem tworzenia si ę 
osadów lub zm ętnienia, które stanowi ą wskaźniki niepe łnego rozpuszczenia 
się badanej substancji chemicznej. W przypadku zaobserwowania takich 
zjawisk (zm ętnienia, tworzenia si ę osadów) badaniu poddaje si ę także 
dołki zawieraj ące kolejne ni ższe stężenia (itd.), a st ężenia, które nie prze ­
kształciły się w pełni w roztwór, nale ży wyłączyć z dalszej oceny i analizy. 
Płytkę ponownie umieszcza si ę na 48 godzin w inkubatorze w temperaturze 
37 °C w warunkach, w których zawarto ść CO  2 w powietrzu wynosi 5 %. 
Układ płytki zawieraj ącej badan ą substancj ę chemiczn ą przedstawiono 
w tabeli 6. Roztwory podstawowe 1–7 przedstawiaj ą rozmieszczenie rosn ­ 
ących dawek badanej substancji chemicznej.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Tabela 6  
Schemat dawkowania przy poddawaniu komórek H295R dzia łaniu badanej substancji 
chemicznej na p łytce 24-do łkowej  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Roztwór 
podsta­
wowy 4 Roztwór 
podsta­
wowy 4 Roztwór 
podstawowy 
4 
B Roztwór 
podstawowy 1 Roztwór 
podstawowy 1 Roztwór 
podstawowy 1 Roztwór 
podsta­
wowy 5 Roztwór 
podsta­
wowy 5 Roztwór 
podstawowy 5 
C Roztwór 
podstawowy 2 Roztwór 
podstawowy 2 Roztwór 
podstawowy 2 Roztwór 
podsta­
wowy 6 Roztwór 
podsta­
wowy 6 Roztwór 
podstawowy 6 
D Roztwór 
podstawowy 
3 Roztwór 
podstawowy 
3 Roztwór 
podstawowy 
3 Roztwór 
podsta­
wowy 7 Roztwór 
podsta­
wowy 7 Roztwór 
podstawowy 
7
 
40. Po up ływie 48 godzin p łytki poddane dzia łaniu substancji chemicznych 
wyjmuje si ę z inkubatora i sprawdza si ę każdy dołek pod mikroskopem 
pod kątem stanu komórek ( łączenie, morfologia, poziom konfluencji) 
i oznak cytotoksyczno ści. Podłoże z każdego dołka dzieli si ę na dwie 
równe cz ęści (po oko ło 490 μl) i umieszcza si ę w dwóch oddzielnych, 
odpowiednio oznakowanych fiolkach (tj. jeden alikwot jako zapasowa 
próbka dla ka żdego dołka). Aby zapobiec wysychaniu komórek, pod łoże 
usuwa si ę stopniowo, wyjmuj ąc za każdym razem jeden rz ąd lub jedn ą 
kolumnę, i zastępuje podłożem służącym do testu żywotności/cytotoksycz ­
ności komórek. Je żeli nie planuje si ę natychmiastowego pomiaru żywot­
ności/cytotoksyczno ści komórek, do ka żdego dołka należy dodać 200 μl 
PBS zawieraj ącego Ca  2+ i Mg  2+ . Podłoża zamraża się w temperaturze – 
80 °C aż do dalszego przetwarzania celem dokonania analizy st ężeń 
hormonów (zob. pkt 44–46). Podczas gdy T i E2 w pod łożu przechowy ­
wanym w temperaturze – 80 °C s ą ogólnie stabilne przez co najmniej 3 
miesiące, stabilno ść hormonów w trakcie przechowywania nale ży dokumen ­
tować w obrębie każdego laboratorium.  
41. Natychmiast po usuni ęciu podłoża należy dokona ć oznaczenia żywotności/ 
cytotoksyczno ści komórek dla ka żdej płytki poddawanej dzia łaniu 
substancji chemicznej.  
Oznaczanie żywotności komórek  
42. W celu okre ślenia potencjalnego wp ływu badanej substancji chemicznej na 
żywotność komórek mo żna wykorzysta ć dowolny test żywotności/cytoto­
ksyczności komórek. Dany test powinien umo żliwić uzyskanie prawdziwej 
miary warto ści procentowej żywotnych komórek obecnych w do łku lub 
powinien pozwoli ć na wykazanie, że jest bezpo średnio porównywalny do 
(funkcji liniowej) testu Live/Dead® (zob. dodatek III do sprawozdania z walidacji (4)). Test cytotoksyczno ści MTT [bromku 3-(4,5-dimetylotia ­
zol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego] (18) stanowi alternatywny test, 
w przypadku którego wykazano równie skuteczne dzia łanie. Ocena żywot­
ności komórek przy zastosowaniu powy ższych metod stanowi wzgl ędny 
pomiar, który niekoniecznie wskazuje na obecno ść liniowych zale żności 
z bezwzgl ędną liczbą komórek w do łku. W zwi ązku z tym badacz powinien 
przeprowadzi ć równoleg łą, subiektywn ą ocenę wzrokow ą każdego dołka 
oraz wykona ć cyfrowe zdj ęcia kontroli rozpuszczalnika i dwóch najwy ż­
szych stężeń
 niecytotoksycznych i umie ścić je w archiwum, aby umo żliwić 
późniejszą ocenę faktycznej g ęstości komórek, je żeli będzie to wymagane. 
Jeżeli poprzez ocen ę wzrokow ą lub po wykazaniu w drodze testu żywot­
ności/cytotoksyczno ści komórek, wydaje si ę, że następuje wzrost liczby 
komórek, nale ży dokona ć weryfikacji tego pozornego wzrostu. Je żeli wzrost 
liczby komórek zostanie potwierdzony, nale ży odnotowa ć to 
w sprawozdaniu z badania. Żywotność komórek b ędzie wyra żona 
w stosunku do średniej reakcji kontroli rozpuszczalnika, uznanych za 
komórki w 100 % żywotne i oblicza si ę ją w sposób odpowiedni dla 
stosowanej metody testu żywotności/cytotoksyczno ści. W przypadku testu 
cytotoksyczno ści MTT, mo żna zastosowa ć następujący wzór:  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% żywotnych komórek =  (reakcja w do łku – średnia reakcja w do łkach, 
w których podawano MeOH [= 100 % martwych] – ( średnia reakcja 
w dołkach zawieraj ących kontrole rozpuszczalnika – średnia reakcja 
w dołkach, w których podawano MeOH [= 100 % martwych]  
43. Danych pochodz ących z do łków o żywotności poniżej 80 % w stosunku do 
średniej żywotności w kontrolach rozpuszczalnika (= 100 % żywotności) 
nie należy uwzględniać w ostatecznej analizie danych. Zahamowanie steroi ­
dogenezy wyst ępujące w przypadku oko ło 20-procentowej cytotoksyczno ści 
należy oceniać w sposób ostro żny, aby mie ć pewność, że cytotoksyczno ść 
nie była przyczyn ą zahamowania.  
Analiza hormonów  
44. W ka żdym laboratorium mo żna stosowa ć dowolny system pomiaru 
hormonów do celów analizy T i E2. Zapasowe alikwoty pod łoża z każdej 
grupy badanej mog ą zostać wykorzystane do sporz ądzenia rozcie ńczeń, aby 
sprowadzi ć stężenie do liniowej cz ęści krzywej wzorcowej. Jak opisano 
w pkt 29, ka żde laboratorium powinno wykaza ć zgodność stosowanego 
systemu pomiaru hormonów (np. ELISA, RIA, LC-MS, LC-MS/MS) z kryteriami kontroli jako ści poprzez dokonanie analizy pod łoża wzboga ­
conego uzupe łnionego o substancj ę do wewn ętrznej kontrolni hormonów 
przed przeprowadzeniem prób kontroli jako ści lub testów substancji 
chemicznych. W celu zapewnienia, że składniki systemu bada ń nie zakłó­
cają pomiaru hormonów, mo że zajść potrzeba ekstrakcji hormonów 
z podłoży przed dokonaniem ich pomiaru (w celu uzyskania informacji 
dotyczących warunków, w których ekstrakcja jest lub nie jest wymaga, 
zob. pkt 30). Zaleca si ę przeprowadzenie ekstrakcji zgodnie 
z procedurami przedstawionymi w dodatku III do sprawozdania z walidacji (4).
 
45. Jeżeli do pomiaru hormonów wykorzystuje si ę dostępny na rynku zestaw do 
przeprowadzania bada ń, analizy hormonów nale ży dokonywa ć, stosując się 
do instrukcji do łączonych przez producenta zestawu do przeprowadzania 
badań. Większość producentów stosuje swoiste procedury, zgodnie 
z którymi nale ży przeprowadza ć analizy. Rozcie ńczenia próbek nale ży 
dostosowa ć w taki sposób, aby oczekiwane st ężenia hormonów dla kontroli 
rozpuszczalnika mie ściły się w środkowej cz ęści liniowego zakresu krzywej 
wzorcowej dla pojedynczego testu (dodatek III do sprawozdania z walidacji 
(4)). Warto ści znajduj ące się poza liniowym zakresem krzywej wzorcowej 
należy odrzuci ć. 
46. Ostateczne st ężenia hormonów oblicza si ę w następujący sposób:  
Przykład: 
ekstrahowane: 450 μl podłoża 
odtworzone w: 250 μl buforu testowy 
rozcieńczenie w te ście: 1:10 (aby próbka mie ściła się w zakresie 
liniowym krzywej wzorcowej) 
stężenie hormonów w te ście: 150 pg/ml (po dostosowaniu do st ężenia 
na ml testowanej próbki) 
odzysk: 89 % ostateczne st ężenie hormonów = (st ężenie hormonów (na ml) ÷ odzysk) 
(współczynnik rozcie ńczenia) 
ostateczne st ężenie hormonów = (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Dobór badanych st ężeń 
47. W ramach testu nale ży przeprowadzi ć co najmniej dwie niezale żne próby. 
Jeżeli wcześniejsze dane, takie jak informacje dotycz ące granic rozpusz ­
czalności lub cytotoksyczno ści, nie stanowi ą podstawy doboru badanych 
stężeń, zaleca si ę rozmieszczenie badanych st ężeń do celów próby wst ępnej 
w podzia łce logarytmicznej log  10 z maksymalnym st ężeniem w wysoko ści 
10 –3 M. Jeżeli substancja chemiczna jest rozpuszczalna i nie wykazuje 
właściwości cytotoksycznych przy żadnym badanym st ężeniu, a wynik 
pierwszej próby w ramach testu by ł ujemny, nale ży to potwierdzi ć, prze­
prowadzaj ąc jeszcze jedn ą próbę w takich samych warunkach, w jakich 
przeprowadzono pierwsz ą próbę (tabela 7). Je żeli wyniki pierwszej próby 
są niejednoznaczne  (tj. zmiana krotno ści jest istotna statystycznie 
w przypadku kontroli rozpuszczalnika przy wy łącznie jednym st ężeniu) 
lub dodatnia (tj. zmiana krotno ści przy dwóch lub wi ększej liczbie s ąsiaduj­ 
ących stężeń jest istotna statystycznie), nale ży powtórzy ć badanie, jak wska ­
zano w tabeli 7, poprzez dostosowanie wybranych badanych st ężeń. Badane 
stężenia w próbie drugiej i trzeciej (w razie potrzeby) nale ży dostosowa ć na 
podstawie wyników próby wst ępnej, ograniczaj ąc stężenia, które wywo łały 
działanie, przy zastosowaniu zakresu st ężeń w wysoko ści 1/2-log (np. je żeli 
wynikiem pierwotnej próby obejmuj ącej 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1000 
μM były indukcje przy warto ściach 1 i 10 μM, w drugiej próbie nale ży 
użyć badanych st ężeń w wysoko ści 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 100 μM), chyba 
że konieczne b ędzie zastosowanie ni ższych stężeń, aby osi ągnąć LOEC. 
W ostatnim przypadku w drugiej próbie nale ży użyć co najmniej pi ęciu 
stężeń poniżej najniższego stężenia badanego w pierwszej próbie, stosuj ąc 
zakres skal ę logarytmiczn ą 1/2-log. Je żeli druga próba nie potwierdzi 
wyników uzyskanej w pierwszej próbie (tj. nie nast ąpi istotno ść staty­
styczna przy wcze śniej badanych st ężeniach, które osi ągnęły wynik dodatni 
± 1 przyrost st ężenia), nale ży przeprowadzi ć trzecie do świadczenie 
z zastosowaniem pierwotnych warunków badania. Niejednoznaczne wyniki 
uzyskane w pierwszej próbie uznaje si ę za ujemne, je żeli zaobserwowany 
wpływ może zostać potwierdzony w którejkolwiek z kolejnych dwóch prób. 
Niejednoznaczne wyniki uznaje si ę za dodatnie reakcje (dodatni wp ływ), 
jeżeli reakcje te mog ą zostać potwierdzone w co najmniej jeszcze jednej 
próbie i mieszcz ą się w zakresie ± 1 przyrost st ężenia (aby uzyska ć infor­
macje dotycz ące procedury interpretacji danych zob. pkt 55).  
Tabela 7  
Matryca decyzji w odniesieniu do mo żliwych scenariuszy wyników  
Próba 1 Próba 2 Próba 3 Decyzja 
Scenariusz Decyzja Scenariusz Decyzja Scenariusz Wynik 
dodatni Wynik 
ujemny  
Wynik ujemny Potwierdzi ć ( a ) Wynik ujemny Zatrzyma ć X 
Wynik ujemny Potwierdzi ć ( a ) Wynik dodatni Dostosowa ć ( b ) Wynik 
ujemny X 
Wynik niejedno ­
znaczny (  c ) Dostosowa ć ( b ) Wynik ujemny Potwierdzi ć ( a ) Wynik 
ujemny X 
Wynik niejedno ­
znaczny (  c ) Dostosowa ć ( b ) Wynik ujemny Potwierdzi ć ( a ) Wynik 
dodatni X 
Wynik niejedno ­
znaczny (  c ) Dostosowa ć ( b ) Wynik dodatni X 
Wynik dodatni Dostosowa ć ( b ) Wynik ujemny Potwierdzi ć ( a ) Wynik 
dodatni X ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Próba 1 Próba 2 Próba 3 Decyzja 
Scenariusz Decyzja Scenariusz Decyzja Scenariusz Wynik 
dodatni Wynik 
ujemny  
Wynik ujemny Potwierdzi ć ( a ) Wynik dodatni Dostosowa ć ( b ) Wynik 
dodatni X 
Wynik ujemny Dostosowa ć ( b ) Wynik dodatni Zatrzyma ć X  
( a ) Należy potwierdzi ć poprzedni ą próbę, stosując ten sam schemat bada ń. 
( b ) Należy powtórzy ć test, stosuj ąc rozkład stężeń w skali logarytmicznej 1/2-log (ograniczanie st ężenia, które w poprzednim 
badaniu da ło wynik ró żniący się w znacznym stopniu). 
( c ) Zmiana krotno ści przy jednym st ężeniu jest istotnie statystycznie ró żna od KR.  
Kontrola jako ści płytki do bada ń 
48. Poza spe łnieniem kryteriów maj ących zastosowanie do p łytki kontroli 
jakości, należy spełnić również inne kryteria jako ści, przedstawione 
w tabeli 8, które dotycz ą dopuszczalnej zmienno ści między odtwarzanymi 
dołkami, odtwarzanych eksperymentów, liniowo ści i czułości systemów 
pomiaru hormonów, zmienno ści między odtwarzanymi pomiarami 
hormonów w tej samej próbce oraz odzysk wzbogace ń hormonami wyra ­ 
żony w procentach po ekstrakcji pod łoża (w stosownych przypadkach; aby 
uzyskać szczegółowe informacje na temat wymogów w zakresie ekstrakcji 
zob. pkt 30). Dane powinny zawiera ć się w dopuszczalnych zakresach 
zdefiniowanych w odniesieniu do ka żdego parametru, aby mo żna je było 
uwzględnić w dalszej ocenie. Je żeli kryteria te nie zostan ą spełnione, 
w arkuszu kalkulacyjnym nale ży odnotowa ć, że kryteria kontroli jako ści 
nie zostały spełnione w odniesieniu do danej próbki oraz że należy dokona ć 
ponownej analizy tej próbki lub usun ąć ją ze zbioru danych.  
Tabela 8  
Dopuszczalne zakresy lub dopuszczalna zmienno ść (%) w odniesieniu do parametrów 
płytki do bada ń w teście komórek H295R  
(LOQ: granica oznaczalno ści systemu pomiaru hormonów. CV: wspó łczynnik zmienno ści; 
KR: kontrola rozpuszczalnika; DPM: liczba rozpadów na minut ę) 
Porównanie T E2  
Podstawowa produkcja 
hormonów w kontrolach 
rozpuszczalnika Krotność wyższa niż LOQ ≥ 5-ciokrotna ≥ 2,5-krotna 
Badanie nara żenia — 
w ramach wspó łczynnika 
zmienności p łytki 
w odniesieniu do kontroli 
rozpuszczalnika (odtwa ­
rzane dołki) Stężenia bezwzgl ędne ≤ 30 % ≤ 30 % 
Badanie nara żenia — 
między wspó łczynnikiem 
zmienności p łytki 
w odniesieniu do kontroli 
rozpuszczalnika (odtwa ­
rzane doświadczenia) Zmiana krotno ści ≤ 30 % ≤ 30 % 
System pomiaru 
hormonów — czu łość Wykrywalny krotny 
spadek w stosunku do 
kontroli rozpuszczalnika ≥ 5-krotna ≥ 2,5-krotna 
System pomiaru 
hormonów — powtórzony pomiar wspó łczynnika 
zmienności w odniesieniu 
do kontroli 
rozpuszczalnika (
 a ) Stężenia bezwzgl ędne ≤ 25 % ≤ 25 % 
Ekstrakcja pod łoża — 
odzysk standardu wewnętrznego 3H (w 
razie potrzeby) Liczba rozpadów na 
minutę ≥ 65 % nominalnie
 
( a ) Odnosi si ę do powtrzanych pomiarów tej samej próbki.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANALIZA DANYCH I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Analiza danych  
49. Aby dokona ć oceny wzgl ędnego wzrostu/spadku chemicznie zmienionej 
produkcji hormonów, wyniki nale ży znormalizowa ć do średniej warto ści 
KR każdej płytki do bada ń, a wyniki wyrazi ć jako zmiany wzgl ędem 
kontroli rozpuszczalnika w ka żdej badanej p łytce. Wszystkie dane nale ży 
wyrażać jako średnia ± 1 odchylenie standardowe (SD).  
50. W analizie danych nale ży uwzględnić jedynie dane dotycz ące hormonów 
z dołków, w których cytotoksyczno ść nie przekroczy ła poziomu 20 %. 
Względne zmiany nale ży oblicza ć w następujący sposób:  
Względna zmiana =  (stężenie hormonów w ka żdym dołku) ÷ (średnie 
stężenie hormonów we wszystkich do łkach kontroli rozpuszczalnika).  
51. Jeżeli poprzez kontrol ę wzrokow ą dołka lub po wykazaniu w drodze testu 
żywotności/cytotoksyczno ści komórek opisanego w pkt 42 wydaje si ę, że 
następuje wzrost liczby komórek, nale ży dokona ć weryfikacji tego pozor ­
nego wzrostu. Je żeli wzrost liczby komórek zostanie potwierdzony, nale ży 
odnotowa ć to w sprawozdaniu z badania.  
52. Przed przeprowadzeniem analizy statystycznej nale ży dokona ć oceny 
założeń dotyczących normalno ści i jednorodno ści zmienno ści. Oceny 
normalno ści należy dokonywa ć, stosując standardowe wykresy prawdopo ­
dobieństwa lub inn ą właściwą metodę statystyczn ą (np. test Shapiro-Wilka). 
Jeżeli dane (zmiany krotno ści) nie posiadaj ą rozkładu normalnego, nale ży 
dokonać próby transformacji danych, aby zbli żyć je do rozk ładu normal ­
nego. Jeżeli dane posiadaj ą rozkład normalny lub rozk ład zbliżony do 
normlanego, nale ży dokona ć analizy ró żnic między grupami st ężeń 
substancji chemicznych i KR, stosuj ąc test parametryczny (np. test Dunnet ­
ta), w którym  stężenie jest zmienn ą niezależną, a reakcja  (zmiana krotno ści) 
jest zmienn ą zależną. Jeżeli dane nie posiadaj ą rozkładu normalnego nale ży 
zastosowa ć odpowiedni test nieparametryczny (np. test Kruskala-Wallisa, 
test sum rang Steele'a). Ró żnice uznaje si ę za istotne przy warto ści p ≤ 
0,05.  Statystycznych ocen dokonuje si ę w oparciu o średnie warto ści 
dotyczące każdego dołka, które stanowi ą niezależne elementy danych. 
Oczekuje si ę, że z uwagi na znaczne przedzia ły między dawkami podczas 
pierwszej próby (skala logarytmiczna log  10 ), w wielu przypadkach nie 
będzie mo żliwe okre ślenie wyra źnych zwi ązków st ężenie-reakcja, 
w przypadku których dwie najwi ększe dawki znajd ą się w liniowej cz ęści 
krzywej sigmoidalnej. W zwi ązku z tym, dokonuj ąc pierwszej próby lub 
przy zastosowaniu wszelkich innych zbiorów danych, w przypadku których ten warunek zaistnieje (np. w przypadku, w którym nie mo żna oszacowa ć 
maksymalnego poziomu skuteczno ści), stosuje si ę statystyk ę stałych zmien ­
nych typu I, jak opisano powy żej.
 
53. Jeżeli w liniowej cz ęści krzywej znajduje si ę większa liczba elementów 
danych ni ż dwa i w przypadku, gdy mo żna obliczy ć maksymalne poziomy 
skuteczno ści, czego oczekuje si ę w odniesieniu do niektórych z drugich 
prób przeprowadzanych przy zastosowaniu pó łlogarytmicznej skali prze ­
działu stężeń ekspozycjnych, do obliczenia skutecznych st ężeń (np.EC50 
i EC20) nale ży wykorzysta ć model probitowy, logitowy lub inny w łaściwy 
model regresji.  
54. Wyniki nale ży przedstawi ć w formie graficznej (wykresu s łupkowego 
przedstawiaj ącego średnią +/– 1 odchylenie standardowe) i w formie tabeli 
(zawierającej LOEC/NOEC, kierunek dzia łania i siłę maksymalnej reakcji, 
będącej częścią porcji danych dawka-odpowied ź) (przykład przedstawiono 
na rys. 3). Ocen ę danych uznaje si ę za ważną, wyłącznie jeżeli dokonano 
jej na podstawie co najmniej dwóch niezale żnie przeprowadzonych prób. 
Uznaje si ę, że badanie lub próba s ą niezależne, jeżeli zostały przeprowa ­
dzone w ró żnych terminach z zastosowaniem nowego zestawu roztworów 
i kontroli. Zakres st ężeń, jakiego u żyto w próbach 2 i 3 (w razie potrzeby), 
może zostać dostosowany na podstawie wyników próby 1, aby lepiej zdefi ­
niować zakres reakcji na dawk ę zawieraj ący LOEC (zob. pkt 47).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 905
 
Rysunek 3  
Przykład przedstawienia i oceny danych otrzymanych w trakcie testu H295R w postaci 
wykresu i tabeli  
(Gwiazdk ą oznaczono istotne statystycznie ró żnice zaobserwowane w kontroli 
rozpuszczalnika (KR) ( p < 0,05 ). LOEC: najni ższe stężenie, przy którym obserwuje si ę zmiany; 
maksymalna zmiana: najwy ższa siła reakcji zaobserwowana przy jakimkolwiek st ężeniu w stosunku 
do średniej reakcji KR (= 1))
  
Substancja chemiczna LOEC Maksymalna zmiana  
Forskolina 0,01 0,15-krotno ść 
Letrozol 0,001 29-krotno ść 
Procedura interpretacji danych  
55. Uznaje si ę, że badana substancja chemiczna daje reakcj ę dodatnią, jeżeli 
krotność indukcji statystycznie ró żni się (p ≤ 0,05) od kontroli rozpusz ­
czalnika w dwóch s ąsiadujących stężeniach w co najmniej dwóch niezale ż­
nych próbach (tabela 7). Uznaje si ę, że badana substancja chemiczna daje 
reakcją ujemną po przeprowadzeniu dwóch ujemnych prób lub 
w przypadku trzech prób obejmuj ących dwie próby ujemne i jedn ą niejed­
noznaczn ą lub dodatni ą próbę. Jeżeli dane uzyskane podczas trzech nieza ­
leżnych bada ń nie spe łniają kryteriów decyzji wymienione w tabeli 7, 
wyniki bada ń nie nadaj ą się do wykorzystania. Wyniki uzyskane przy 
stężeniach wykraczaj ących poza granice rozpuszczalno ści lub przy st ęże­
niach cytotoksycznych nie powinny by ć uwzględniane w interpretacji wyni ­
ków.  
Sprawozdanie z badania  
56. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Placówka badawcza:  
— nazwa placówki i lokalizacja,  
— dane kierownika bada ń i pozosta łych pracowników oraz opis ich 
obowiązków w zakresie bada ń, 
— daty rozpocz ęcia i zako ńczenia bada ń. ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Badana substancja chemiczna, odczynniki i substancje kontrolne:  
— tożsamość (nazwa/nr CAS w stosownych przypadkach), źródło, numer 
partii/serii, czysto ść, dostawca, w łaściwości badanej substancji chemicz ­
nej, odczynników i substancji kontrolnych,  
— cechy fizyczne i stosowne w łaściwości fizykochemiczne badanej 
substancji chemicznej,  
— opis warunków przechowywania oraz metody i cz ęstotliwości przygo ­
towywania badanych substancji chemicznych, odczynników i substancji 
kontrolnych,  
— stabilno ść badanej substancji chemicznej.  
Komórki:  
— źródło i rodzaj komórek,  
— liczbę pasaży komórek (identyfikator pasa żu komórek) u żywanych 
w badaniu,  
— opis procedur stosowanych do utrzymywania kultur komórkowych.  
Wymogi przed rozpocz ęciem bada ń (w stosownych przypadkach):  
— opis i wyniki badania interferencji chemicznego testu hormonów,  
— opis i wyniki pomiarów efektywno ści ekstrakcji hormonów,  
— krzyw ą wzorcow ą i krzywą kalibracyjn ą dla wszystkich przeprowadza ­
nych testów analitycznych,  
— granice oznaczalno ści wybranych testów analitycznych.  
Warunki bada ń: 
— skład podłoży, 
— stężenie badanej substancji chemicznej,  
— gęstość komórek (szacowane lub mierzone st ężenia komórek w 24 i 48 
godzinie),  
— rozpuszczalno ść badanej substancji chemicznej (granica rozpuszczal ­
ności, jeżeli została określona),  
— czas inkubacji i warunki inkubacji.  
Wyniki bada ń: 
— nieprzetworzone dane w odniesieniu do ka żdego do łka kontroli 
i badanych substancji chemicznych — ka żdy powtórzony pomiar 
w postaci danych pierwotnych uzyskanych za pomoc ą narzędzi do 
pomiaru produkcji hormonów (np. g ęstości optycznej, jednostek fluo ­
rescencji, liczby rozk ładów na minut ę itd.),  
— walidacj ę normalno ści lub uzasadnienie transformacji danych,  
— średnie poziomy reakcji +/- 1 odchylenie standardowe w odniesieniu do 
każdego dołka, w którym dokonuje si ę pomiaru,  
— dane dotycz ące cytotoksyczno ści (badane st ężenia, które spowodowa ły 
cytotoksyczno ść), 
— potwierdzenie, że spełniono kryteria kontroli jako ści, ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— względna zmiana w stosunku do kontroli rozpuszczalnika skorygowana 
o cytotoksyczno ść, 
— wykres s łupkowy przedstawiaj ący względne zmiany (zmiany krotno ści) 
przy każdym stężeniu, odchylenie standardowe oraz istotno ść staty­
styczna, co omówiono w pkt 49–54.  
Interpretacja danych:  
— należy zastosowa ć procedur ę interpretacji danych do wyników i omówi ć 
ustalenia.  
Omówienie ustale ń: 
— czy wyniki badania wskazuj ą na jakiekolwiek mo żliwości, że na dane 
na temat T/E2 mog ły wpłynąć pośrednie oddzia ływania na szlak gluko- 
i minaralokortykoidowy?  
Wnioski  
LITERATURA  
(1) OECD (2002), ‘OECD Conceptual Framework for the Testing and Asses ­
sment of Endocrine Disrupting Chemicals’ w dodatku 2 do rozdzia łu B.54 
niniejszego za łącznika.  
(2) Hecker, M., Newsted, J.L., Murphy, M.B., Higley, E.B., Jones, P.D., Wu, 
R. and Giesy, J.P. (2006), ‘Human adrenocarcinoma (H295R) cells for 
rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone production’,  Toxicol. Appl. Pharmacol.,  217, s. 114-124.
 
(3) Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
Laskey, J., Buckalew, A., Grund, S., Nakai, M., Timm, G., and Giesy, J. 
P. (2007), ‘The OECD validation program of the H295R steroidgenesis assay for the identification of in vitro inhibitors or inducers of testosterone and estradiol production, Phase 2: inter laboratory pre-validation studies’,  
Env. Sci. Pollut. Res ., 14, s. 23 — 30.
 
(4) OECD (2010), ‘Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis 
Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production’,  
OECD Series of Testing and Assessment No. 132 , ENV/JM/MO ­
NO(2010)31, Pary ż, dostępny na stronie internetowej: [http://www.oecd. 
org/document/30/0,3746,en_2649_34377_ 1916638_1_1_1_1,00.html].  
(5) OECD (2010), ‘Peer Review Report of the H295R Cell-Based Assay for 
Steroidogenesis’,  OECD Series of Testing and Assessment No. 133 , ENV/ 
JM/MONO(2010)32, Pary ż, dostęp na stronie internetowej: [http://www. 
oecd.org/document/30/0,3746,en_2649_34377_1916638_1_1_1_1,00.html].  
(6) Battelle (2005), ‘Detailed Review Paper on Steroidogenesis’, dost ępny na 
stronie internetowej: http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogene ­
sis_drp_final_3_29_05.pdf].  
(7) Hilscherova, K., Jones, P. D., Gracia, T., Newsted, J. L., Zhang, X., 
Sanderson, J. T., Yu, R. M. K., Wu, R. S. S. and Giesy, J. P. (2004), ‘Assessment of the Effects of Chemicals on the Expression of Ten Steroi ­
dogenic Genes in the H295R Cell Line Using Real-Time PCR’,  Toxicol. 
Sci., 81, s. 78–89.
 
(8) Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. and Van den Berg, M. 
(2002), ‘Induction and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in H295R human adrenocortical carcinoma cells’,  
Toxicol. Appl. Pharmacol.,  182, s 44–54.
 
(9) Breen, M.S., Breen, M., Terasaki, N., Yamazaki, M. and Conolly, R.B. 
(2010), ‘Computational model of steroidogenesis in human H295R cells to 
predict biochemical response to endocrine-active chemicals: Model deve ­
lopment for metyrapone’,  Environ. Health Perspect.,  118, s. 265–272.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 908
 
(10) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
‘Assessment of chemical effects on aromatase activity using the H295R 
cell Line’,  Environ. Sci. Poll. Res.,  17, s. 1137–1148.  
(11) Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), ‘Establishment and characterization of a human adrenocor ­
tical carcinoma cell line that expresses Multiple pathways of steroid 
biosynthesis’,  Cancer Res.,  50, s. 5488–5496.
 
(12) He, Y.H., Wiseman, S.B., Zhang, X.W., Hecker, M., Jones, P.D., El-Din, 
M.G., Martin, J.W. and Giesy, J.P. (2010), ‘Ozonation attenuates the steroidogenic disruptive effects of sediment free oil sands process water in the H295R cell line’,  Chemosphere,  80, s. 578–584.
 
(13) Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. 
and Giesy, J.P. (2005), ‘Quantitative RT-PCR methods for evaluating toxicant-induced effects on steroidogenesis using the H295R cell Line’,  
Environ. Sci. Technol.,  39, s. 2777–2785.
 
(14) Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
‘Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 
and T production using the H295R cell Line’,  Environ. Sci. Pol. Res.,  17, 
s. 1137–1148.  
(15) Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), ‘Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids’,  J. Clin. 
Endocrinol. Metab.,  77, s. 731–737.
 
(16) Rozdzia ł B.55 niniejszego za łącznika: ‘Test biologiczny Hershbergera na 
szczurach: krótkoterminowe badanie przesiewowe w łaściwości (anty)an ­
drogennych’.  
(17) Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), ‘Interference by 2,3-dimercapto-1- 
propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay’,  J. Lab. Clin. Med.,  
2, s. 222–231.  
(18) Mosmann, T. (1983), ‘Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays’,  J. Immunol. Methods.,  
65, s. 55–63.  
(19) Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). ‘Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs of these two species’,  Biochemistry . 38, s. 1598–1606.
 
(20) Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
‘Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal 
gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro’,  J. Appl. Toxicol ., 26, s. 
484–492.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Dodatek  
DEFINICJE:  
Konfluencja  odnosi si ę do stopnia pokrycia lub rozrostu, na jaki pozwala si ę 
komórkom w pod łożu. 
Substancja chemiczna  oznacza substancj ę lub mieszanin ę. 
CV odnosi si ę do wspó łczynnika zmienno ści i oznacza stosunek odchylenia 
standardowego rozk ładu do jego średniej arytmetycznej.  
CYP  oznacza monooksygenazy cytochromu P450, rodzin ę genów i enzymów 
z nich produkowanych, które uczestnicz ą w katalizie szeregu ró żnych reakcji 
biochemicznych, w tym w syntezie i metabolizmie hormonów sterydowych.  
DPM  oznacza liczb ę rozpadów na minut ę. Jest to liczba atomów w danej ilo ści 
materiału radioaktywnego, która uleg ła rozpadowi w ci ągu jednej minuty.  
E2 to 17β-estradiol, najwa żniejszy estrogen w uk ładach u ssaków.  
Komórki  H295R  są ludzkimi komórkami raka nadnercza, które posiadaj ą właści­
wości fizjologiczne strefowo niezró żnicowanych komórek nadnercza ludzkiego 
płodu i które wydzielaj ą wszystkie enzymy szlaku steroidogenezy. Mo żna je 
otrzymać z ameryka ńskiego zbioru typów kultur (ATCC).  
Podłoże do zamra żania używane jest do zamra żania i przechowywania zamro ­ 
żonych komórek. Pod łoże to zawiera pod łoże wyjściowe oraz BD NuSerum 
i sulfotlenek dimetylu.  
Zakres liniowy  oznacza zakres w ramach krzywej wzorcowej w odniesieniu do 
systemu do pomiaru hormonów, w którym wyniki s ą proporcjonalne do st ężenia 
analitu obecnego w próbce.  
LOQ  oznacza granic ę oznaczalno ści i stanowi najni ższą ilość substancji 
chemicznej, jak ą można odróżnić od braku tej substancji (warto ść ślepej próby) 
przy okre ślonej granicy ufno ści. Do celów omawianej metody granic ę oznaczal ­
ności zazwyczaj definiuje producent systemów bada ń, jeżeli nie jest ona 
określona w inny sposób.  
LOEC  oznacza najni ższe stężenie, przy którym obserwuje si ę zmiany, czyli 
najniższe stężenie, przy którym reakcja w te ście jest statystycznie ró żna 
w porównaniu z kontrol ą rozpuszczalnika.  
NOEC  oznacza najwy ższe stężenie, przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych 
zmian, czyli najwy ższe badane st ężenie, jeżeli test nie daje reakcji dodatniej.  
Pasaż oznacza ilo ść podziałów komórek po inicjacji kultury z zamro żonego 
zapasu. Wst ępnemu pasa żowi, który przeprowadzono z zamro żonego zapasu, 
przypisuje si ę wartość jeden (1). Komórki, które zosta ły podzielone jednokrotnie, 
oznacza si ę jako pasa ż 2 itd.  
PBS oznacza roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami metod ą Dulbecco.  
Kontrola jako ści, oznaczana skrótem QC, odnosi si ę do pomiarów niezb ędnych 
do zapewnienia wa żności danych.  
Płytka kontroli jako ści jest płytką 24-dołkową zawieraj ącą dwa st ężenia 
substancji kontroli dodatniej i ujemnej do celów monitorowania efektywno ści 
nowej partii komórek lub do celów zapewniania kontroli dodatniej na potrzeby 
testu podczas badania substancji chemicznych.  
Próba  jest niezale żnym badaniem, w którym wykorzystuje si ę nowy zestaw 
roztworów i kontroli.  
Podłoże wyjściowe  stanowi podstaw ę do przygotowania innych odczynników. 
Podłoże to zawiera mieszanin ę pożywki Dulbecco's zmodyfikowanego pod łoża 
Eagle'a i pod łoża odżywczego Hama F-12 w stosunku 1:1 w 15 mM bufora 
HEPES, niezawieraj ącego czerwieni fenolowej ani wodorow ęglanu sodu. Wodo ­
rowęglan sodu dodaje si ę jako bufor, zob. dodatek II do sprawozdania z walidacji 
(4). 
Podłoże wzbogacone  zawiera pod łoże wyjściowe oraz BD Nu-Serum 
i najwyższej jako ści mieszanin ę ITS+, zob. dodatek II do sprawozdania 
z walidacji (4).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Steroidogeneza  jest syntetycznym szlakiem prowadz ącym od cholesterolu do 
różnych hormonów sterydowych. Niektóre pó łprodukty na szlaku syntezy stery ­
dów, takie jak progesteron i testosteron, same w sobie s ą ważnymi hormonami, 
ale odgrywaj ą również rolę prekursorów dla hormonów powstaj ących na 
dalszych etapach szlaku syntezy.  
T oznacza testosteron, jeden z dwóch najwa żniejszych androgenów w uk ładach 
ssaków.  
Badana substancja chemiczna  oznacza ka żdą substancj ę lub mieszanin ę badaną 
za pomoc ą opisywanej metody badawczej.  
Płytka do bada ń jest płytką, na której komórki H295R poddawane s ą działaniu 
badanych substancji chemicznych. P łytki do bada ń zawieraj ą kontrolę rozpusz­
czalnika i badan ą substancj ę chemiczne w siedmiu poziomach st ężenia po trzy 
płytki dla ka żdego stężenia.  
Trypsyna 1X  jest rozcie ńczonym roztworem trypsyny, enzymu nale żącego do 
proteaz serynowych wytwarzanych przez trzustk ę, stosowanym do oddzielania 
komórek od p łytki do hodowli komórek, zob. dodatek III do sprawozdania 
z walidacji (4).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  BADANIE MUTACJI GENOWEJ KOMÓREK SOMATYCZNYCH 
I GERMINALNYCH U GRYZONI TRANSGENICZNYCH  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest zgodna z dotycz ącą badań wytyczną OECD 
nr 488 (2013 r.). W Unii Europejskiej dost ępne są metody badawcze dla 
prowadzenia szerokiego zakresu bada ń mutacji  in vitro , za pomoc ą których 
można wykry ć mutacje chromosomowe lub genowe. Istniej ą metody 
badawcze w odniesieniu do punktów ko ńcowych  in vivo  (tj. aberracja chro ­
mosomowa i nieregularna synteza DNA). Za pomoc ą tych metod nie mierzy 
się jednak mutacji genowych. Badania mutacji u gryzoni transgenicznych 
spełniają zapotrzebowanie na praktyczne i powszechnie dost ępne badania  in 
vivo w kierunku mutacji genowych.  
2. Badania mutacji u gryzoni transgenicznych zosta ły poddane szczegó łowej 
analizie (24)(33). Badania te przeprowadza si ę na szczurach i myszach 
transgenicznych, które posiadaj ą wiele kopii zintegrowanych 
w chromosomie wahad łowych wektorów fagowych lub plazmidowych. 
Transgeny zawieraj ą geny reporterowe w celu wykrycia ró żnych rodzajów 
mutacji wywo łanych  in vivo  przez badane substancje chemiczne.  
3. Mutacje zachodz ące u gryzonia ocenia si ę punktowo, odzyskuj ąc transgen 
i analizuj ąc fenotyp genu reporterowego u gospodarza bakteryjnego bez 
genu reporterowego. Za pomoc ą badań mutacji u gryzoni transgenicznych 
mierzy si ę mutacje wywo łane w genetycznie neutralnych genach pozyski ­
wanych praktycznie z dowolnej tkanki gryzonia. Dzi ęki przedmiotowym 
badaniom pokonuje si ę zatem wiele istniej ących ogranicze ń związanych 
z badaniem mutacji genowej  in vivo  genów endogennych (np. ograniczona 
liczba tkanek nadaj ących się do analizy, dodatnia/ujemna selekcja 
względem mutacji).  
4. Z wagi dowodów wynika, że transgeny reaguj ą na mutageny podobnie jak 
geny endogenne, szczególnie je żeli chodzi o wykrywanie substytucji par 
zasad, mutacji zwi ązanych ze zmian ą fazy odczytu, a tak że niewielkich 
delecji i insercji (24).  
5. W ramach mi ędzynarodowych warsztatów z bada ń genotoksycznych (Inter ­
national Workshops on Genotoxicity Testing) zatwierdzono w łączenie 
badań mutacji genowych u gryzoni transgenicznych w kierunku wykrycia 
mutacji genowych  in vivo , a także zalecono protokó ł ich wdro żenia 
(15)(29). Opisywana metoda badawcza opiera si ę na wyżej wspomnianych 
zaleceniach. Dalsz ą analizę uzasadniaj ącą stosowanie protoko łu przedsta ­
wiono w (16).  
6. Oczekuje si ę, że w przysz łości będzie możliwe łączenie badania mutacji 
genowych u gryzoni transgenicznych z badaniem toksyczno ści dawki 
powtórzonej (rozdzia ł B.7 niniejszego za łącznika). Potrzebne s ą jednak 
dane, aby mie ć pewność, że czułość badania mutacji genowych u gryzoni 
transgenicznych nie jest zak łócona przez krótszy jednodniowy okres czasu 
między zako ńczeniem podawania i czasem pobierania próbek, co ma 
miejsce w badaniu toksyczno ści dawki powtórzonej, w porównaniu z 3- 
dniowym okresem w badaniach mutacji genowych u gryzoni transgenicz ­
nych. Niezb ędne są również dane wskazuj ące, że zastosowanie szczepu 
gryzoni transgenicznych zamiast tradycyjnych szczepów gryzoni nie b ędzie 
miało negatywnego wp ływu na efektywno ść badania toksyczno ści dawki 
powtórzonej. Przedmiotowa metoda badawcza zastanie zaktualizowania 
w momencie, w którym dost ępne będą wyżej wskazane dane.  
7. Definicje kluczowych terminów podano w dodatku.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
USTALENIA WST ĘPNE  
8. Badania mutacji genowej u gryzoni transgenicznych, w odniesieniu do 
których dost ępne są wystarczaj ące dane na poparcie ich zastosowanie 
w opisywanej metodzie badawczej, to: myszy z wprowadzonym bakterio ­
fagiem zawieraj ącym gen  lacZ  (Muta™Mouse); mysz z plazmidem zawie ­
rającym gen  lacZ ; myszy i szczury  gpt delta ( gpt i Spi  – ); myszy i szczury 
z wprowadzonym genem  lacI  (Big Blue®), wykonywane w warunkach 
standardowych. Ponadto do oceny mutacji w modelach Big Blue® i Muta™Mouse mo żna stosowa ć badanie selekcji dodatniej  cII. Mutagenez ę 
w modelach gryzoni transgenicznych zazwyczaj ocenia si ę jako częstość 
występowania mutacji; w razie potrzeby dodatkowe informacje mo żna 
jednak uzyska ć, dokonuj ąc analizy molekularnej mutacji (zob. pkt 24).
 
9. Takie badania mutacji genowej  in vivo  u gryzoni maj ą szczególne znaczenie 
w odniesieniu do oceny zagro żenia mutagennego, poniewa ż reakcje uzys ­
kane w badaniu zale żą od metabolizmu  in vivo , farmakokinetyki, procesów 
naprawy DNA, oraz awaryjnego mechanzmu syntezy DNA, chocia ż mogą 
one różnić się od siebie w zale żności od gatunku, tkanek oraz rodzajów 
uszkodzenia DNA. Badanie  in vivo  w kierunku mutacji genowych jest 
również użyteczne w odniesieniu do dalszych bada ń skutków mutagennych 
wykrytych w systemie  in vitro  oraz do dalszych dzia łań w związku 
z wynikami bada ń z wykorzystaniem innych punktów ko ńcowych 
w badaniu  in vivo  (24). Oprócz zwi ązku przyczynowego 
z wywoływaniem nowotworów mutacja genowa stanowi istotny punkt 
końcowy przy przewidywaniu nienowotworowych chorób powsta łych 
wskutek mutacji w tkankach somatycznych (12)(13) oraz chorób przekazy ­
wanych w linii germinalnej.  
10. Przeprowadzenie badania mutacji genowej u gryzoni transgenicznych nie 
jest właściwe, jeżeli istniej ą dowody, że badana substancja chemiczna, lub 
istotny metabolit, nie dotrze do badanych tkanek.  
ZASADA BADANIA  
11. W badaniach opisanych w pkt 8 gen docelowy jest pochodzenia bakteryj ­
nego lub bakteriofagowego, a odzyskanie z genomowego DNA gryzonia 
polega na wprowadzeniu transgenu do wahad łowego wektora fagowego lub 
plazmidowego λ. Procedura obejmuje ekstrakcj ę genomowego DNA 
z badanej tkanki gryzonia, przetworzenie  in vitro  genomowego DNA (tj. 
pakowanie wektorów λ lub ligacja i elektroporacja plazmidów w celu 
odzyskania wektora wahad łowego), a nast ępnie wykrycie mutacji 
u gospodarzy bakteryjnych w odpowiednich warunkach. W badaniu stosuje się transgeny neutralne, które łatwo odzyska ć z większości tkanek.
 
12. Podstawowe do świadczenie z zakresu mutacji genowej u gryzoni trans ­
genicznych polega na podawaniu gryzoniowi substancji chemicznej przez 
określony czas. Substancje chemiczne mo żna podawa ć każdą odpowiedni ą 
drogą, w tym poprzez implantacj ę (np. badanie wyrobów medycznych). 
Łączny okres podawania dawki zwierz ęciu jest zwany okresem podawania. 
Po podaniu nast ępuje zazwyczaj okres poprzedzaj ący uśmiercenie, podczas 
którego nie podaje si ę substancji chemicznej, a nienaprawione uszkodzenia 
DNA zostaj ą utrwalone w postaci stabilnych mutacji. W literaturze okres 
ten występuje pod ró żnymi nazwami, tj. czasu manifestacji, czasu utrwa ­
lenia lub czasu ekspresji; okres ten ko ńczy się pobraniem próbek (15)(29). 
Po uśmierceniu zwierz ęcia genomowe DNA zostaje wyizolowane z badanej 
tkanki lub tkanek i oczyszczone.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Dane dotycz ące pojedynczej tkanki ka żdego zwierz ęcia z wielu pakietów/ 
ligacji są zazwyczaj zagregowane, a cz ęstość występowania mutacji zazwy ­
czaj ocenia si ę, stosując łącznie 10  5 –10  8 jednostek tworz ących łysinki lub 
jednostek tworz ących koloni ę. Stosując metodę selekcji dodatniej, ca łkowitą 
liczbę jednostek tworz ących łysinki okre śla się za pomoc ą oddzielnego 
zestawu p łytek z pod łożem nieselektywnym.  
14. Opracowano metody selekcji dodatniej, aby u łatwić wykrywanie mutacji 
zarówno w genie  gpt [mysz i szczur  gpt delta, fenotyp  gpt  – (20)(22)(28)], 
jak i genie  lacZ  [Muta™Mouse lub mysz z plazmidem zawieraj ącym gen  
lacZ (3)(10)(11)(30)]. Natomiast mutacje genu  lacI u zwierz ąt Big Blue® s ą 
wykrywane metod ą nieselektywn ą, za pomoc ą której mutacje identyfikuje 
się dzięki tworzeniu zabarwionych (na niebiesko) łysinek. Metod ę selekcji 
dodatniej stosuje si ę również do wykrywania mutacji punktowych powstaj ­ 
ących w genie  cII wahadłowego wektora bakteriofaga λ [mysz lub szczur 
Big Blue® oraz Muta™Mouse (17)] oraz delecji w genach λ red i gam  
[selekcja Spi  – u myszy i szczura  gpt delta (21)(22)(28)]. Cz ęstość wystę­
powania mutacji oblicza si ę, dzieląc liczbę łysinek/plazmidów zawieraj ­ 
ących mutacje w transgenie przez ca łkowitą liczbę łysinek/plazmidów uzys ­
kanych z tej samej próbki DNA. W badaniach mutacji genowej u gryzoni 
transgenicznych zg łaszanym parametrem jest cz ęstość występowania muta ­
cji. Ponadto cz ęstość występowania mutacji mo żna określać jako frakcj ę 
komórek, w których zachodz ą niezależne mutacje. Wykonanie tego obli ­
czenia wymaga korekty o ekspansj ę klonalną w drodze sekwencjonowania 
pod kątem uzyskanych mutacji (24).  
15. Mutacje zliczane w badaniach mutacji punktowej genów  lacI, lacZ, cII  i gpt 
obejmują głównie substytucje par zasad, mutacje spowodowane zmianami 
fazy odczytu oraz niewielkie insercje/delecje. Wzgl ędny udzia ł tych 
rodzajów mutacji w śród mutacji spontanicznych przypomina mutacje obser ­
wowane w przypadku genu endogennego  Hprt . Duże delecje wykrywa si ę 
wyłącznie stosuj ąc selekcj ę Spi  – oraz badanie przy u życiu plazmidów 
zawierających gen  lacZ  (24). Badanymi mutacjami s ą mutacje  in vivo  
powstające u myszy lub szczura. Mutacje w badaniach  in vitro  i ex vivo,  
które mog ą powstawa ć podczas uzyskiwania fagów/plazmidów, replikacji 
lub naprawy, wyst ępują stosunkowo rzadko, a w niektórych systemach 
można je wyra źnie zidentyfikowa ć lub wykluczy ć za pomoc ą systemu 
gospodarza bakteryjnego/selekcji dodatniej.  
OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przygotowania  
Wybór gatunków zwierz ąt 
16. Obecnie dost ępne są liczne modele wykrywania mutacji genowej u myszy 
transgenicznych, które to systemy s ą powszechniej stosowane ni ż modele 
szczurów transgenicznych. Je żeli szczur jest zdecydowanie bardziej odpo ­
wiednim modelem ni ż mysz (np. w badaniu mechanizmu karcynogenezy 
dla guzów obserwowanych jedynie u szczurów; do celów korelacji 
z badaniem toksyczno ści u szczurów; lub je żeli wiadomo, że metabolizm 
u szczurów jest bardziej reprezentatywny dla metabolizmu u ludzi), nale ży 
rozważyć wykorzystanie modeli szczurów transgenicznych.  
Warunki trzymania i żywienia  
17. Temperatura w pomieszczeniu ze zwierz ętami doświadczalnymi powinna 
wynosić 22 °C (± 3 °C). Chocia ż wilgotno ść względna powinna wynosi ć 
co najmniej 30 % i po żądane jest, żeby nie przekracza ła 70 % poza czasem 
czyszczenia pomieszczenia, celem powinno by ć utrzymywanie jej na 
poziomie 50–60 %. O świetlenie powinno by ć sztuczne, w cyklu dziennym 
12 godzin światła, 12 godzin ciemno ści. Do żywienia mo żna stosowa ć ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 914
 
konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dost ępem do wody 
pitnej. Wybór paszy mo że zależeć od potrzeby zapewnienia odpowiedniej 
domieszki badanej substancji chemicznej przy podawaniu jej t ą drogą. 
Zwierzęta należy trzymać w małych grupach (nie wi ęcej niż pięć zwierząt) 
tej samej p łci, jeżeli nie oczekuje si ę agresywnego zachowania. Je żeli ma to 
naukowe uzasadnienie, zwierz ęta mogą być trzymane oddzielnie.  
Przygotowanie zwierz ąt 
18. Zdrowe, m łode, dojrza łe płciowo doros łe zwierzęta (w wieku 8–12 tygodni 
na początku badania) s ą losowo przydzielane do grup kontrolnych 
i badanych. Zwierz ęta są identyfikowane jednoznacznie. Zwierz ęta są akli­
matyzowane do warunków laboratoryjnych co najmniej przez pi ęć dni. 
Klatki powinny by ć ustawione w taki sposób, żeby zminimalizowa ć 
możliwy wpływ położenia klatki. W momencie rozpocz ęcia badania ró żnice 
w masie cia ła zwierząt powinny by ć minimalne oraz nie powinny przekra ­
czać ± 20 % średniej masy dla ka żdej płci. 
Przygotowanie dawek  
19. Stałe badane substancje chemiczne powinny zosta ć rozpuszczone lub zawie ­
szone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub no śnikach lub domieszane do 
paszy lub wody pitnej przed podaniem dawki zwierz ętom. Płynne badane 
substancje chemiczne mog ą być dawkowane bezpo średnio lub mog ą zostać 
rozcieńczone przed dawkowaniem. W przypadku inhalacji badane 
substancje chemiczne mo żna podawa ć w postaci gazu, pary lub sta łych/ 
ciekłych aerozoli, w zale żności od ich w łaściwości fizyczno-chemicznych. 
Powinny zosta ć wykorzystane świeże preparaty badanej substancji chemicz ­
nej, chyba że dane dotycz ące stabilno ści wykazuj ą dopuszczalno ść składo­
wania.  
Warunki badawcze  
Rozpuszczalnik/no śnik 
20. Rozpuszczalnik/no śnik nie powinien wywo ływać skutków toksycznych przy 
wykorzystywanych obj ętościach dawki oraz nie powinien reagowa ć 
chemicznie z badan ą substancj ą chemiczn ą. Jeśli inne ni ż dobrze znane 
rozpuszczalniki/no śniki są wykorzystywane, ich w łączenie do badania 
powinno by ć poparte danymi wskazuj ącymi ich zgodno ść. Zaleca si ę, 
o ile to mo żliwe, aby w pierwszej kolejno ści rozważone zosta ło wykorzys ­
tanie wodnych rozpuszczalników/no śników.  
Kontrole dodatnie  
21. Na ogó ł należy prowadzi ć równoleg łą grupę zwierząt na potrzeby kontrolni 
dodatniej. W przypadku laboratoriów, które wykaza ły kompetencje (zob. 
pkt 23) i które regularnie wykonuj ą przedmiotowe badania, do ka żdego 
badania mo żna jednak w łączyć DNA zwierz ąt stanowi ących wcze śniejszą 
kontrolę dodatnią, aby potwierdzi ć sukces metody. Takie DNA pochodz ące 
z wcześniejszych do świadczeń należy uzyskać od tego samego gatunku oraz 
z tej samej badanej tkanki i odpowiednio przechowywa ć (zob. pkt 36). 
Prowadząc równoleg łą kontrolę dodatnią, nie trzeba stosowa ć tej samej 
drogi podawania, co w przypadku grupy badanej substancji chemicznej. Musi być jednak wiadomo, że kontrole dodatnie wywo łują mutacje w co 
najmniej jednej badanej tkance w odniesieniu do grupy badanej substancji 
chemicznej. Dawki substancji chemicznych na potrzeby kontroli dodatnich należy dobiera ć tak, aby dawa ły słabe lub umiarkowane efekty, które umo ż­
liwiają krytyczn ą ocenę efektywno ści i czuł
ości badania. W tabeli 1 przed ­
stawiono przyk ładowe substancje stosowane do kontroli dodatnich 
i niektóre ich tkanki docelowe.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 915
 
Tabela 1  
Przykładowe substancje na potrzeby kontroli dodatnich i niektóre ich tkanki docelowe  
Substancje chemiczne na 
potrzeby kontroli dodatnich 
i nr CAS Nazwa EINECS i nr EINECS W łaściwości Docelowa tkanka, w której ma doj ść do 
mutacji 
Szczur Mysz  
N-etylo-N-nitrozomocznik 
[Nr CAS 759-73-9] N-etylo-N-nitrozo ­
mocznik 
[212-072-2] Mutagen 
o dzia łaniu 
bezpośrednim Wątroba, 
płuco Szpik kostny, okr ęż­
nica, nab łonek 
okrężnicy, jelito, 
wątroba, p łuco, 
śledziona, nerka, 
komórki ziarniste 
jajników, m ęskie 
komórki germinalne 
Karbaminian etylu (ure ­
tan) 
[Nr CAS 51-79-6] Uretan 
[200-123-1] Mutagen, wymaga 
metabolizmu, jednak daje 
jedynie s łabe 
efekty Szpik kostny, prze ­
dżołądek, jelito cien ­
kie, wątroba, płuco, 
śledziona 
2,4-diaminotoluen 
[nr CAS 95-80-7] 4-metylo-m-fenylenodia ­
mina 
[202-453-1] Mutagen, wymaga 
metabolizmu, dodatni równie ż 
w badaniu Spi
 – Wątroba W ątroba 
Benzo[a]piren 
[nr CAS 50-32-8] Benzo[def]chryzen 
[200-028-5] Mutagen, wymaga 
metabolizmu Wątroba, 
sieć Szpik kostny, pier ś, 
okrężnica, przed żoł­ 
ądek, żołądek 
gruczołowy, serce, 
wątroba, p łuco, 
męskie komórki 
germinalne  
Kontrole ujemne  
22. Ujemne kontrole, poddane dzia łaniu samego rozpuszczalnika lub no śnika, 
a poza tym traktowane w ten sam sposób co grupy poddane dzia łaniu 
substancji, powinny zosta ć uwzględnione w ka żdym pobieraniu próbek. 
Jeżeli nie istniej ą historyczne lub opublikowane dane wykazuj ące, że 
wybrany rozpuszczalnik/no śnik nie wywo łuje żadnych szkodliwych lub 
mutagennych skutków, grupy kontrolne niepoddane dzia łaniu substancji 
powinny zosta ć również uwzględnione w ka żdym okresie pobierania próbek 
w celu ustalenia dopuszczalno ści grupy kontrolnej no śnika.  
Weryfikacja bieg łości laboratorium  
23. Kompetencje w zakresie przedmiotowych bada ń ustala się, wykazuj ąc zdol­
ność do odtworzenia oczekiwanych wyników z opublikowanych danych 
(24) dla: 1) cz ęstości występowania mutacji przy zastosowaniu substancji 
chemicznych jako kontroli dodatnich (w tym reakcje s łabe), takich jak te 
wymienione w tabeli 1, substancji innych ni ż mutageny oraz grup kontro ­
lnych no śnika; oraz 2) odzyskania transgenu z genomowego DNA (np. 
wydajność pakowania).  
Sekwencjonowanie mutacji  
24. W przypadku zastosowa ń normatywnych sekwencjonowanie DNA mutacji 
nie jest wymagane, szczególnie w przypadku uzyskania wyra źnego wyniku 
dodatniego lub ujemnego. Dane sekwencjonowania mog ą jednak by ć przy­
datne, jeżeli odnotowuje si ę duże zróżnicowanie indywidualne. W takich 
przypadkach mo żna zastosowa ć sekwencjonowanie w celu wykluczenia 
możliwości wystąpienia kumulacji (ang. jackpots) lub klonowania  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 916
 
poprzez identyfikacj ę odsetka unikalnych mutacji w okre ślonej tkance. 
Sekwencjonowanie oko ło 10 mutacji na tkank ę na zwierz ę powinno wystar ­
czyć do prostego okre ślenia, czy mutacje klonalne wp ływają na częstość 
występowania mutacji. Wysekwencjonowanie a ż 25 mutacji mo że być 
niezbędne do dokonania matematycznej korekty cz ęstości występowania 
mutacji pod k ątem klonalno ści. Sekwencjonowania mutacji mo żna równie ż 
rozważyć w przypadku wykrycia niewielkich wzrostów cz ęstości występo­
wania mutacji (tj. warto ści nieco przewy ższających warto ści uzyskane 
w grupie kontrolnej niepoddanej dzia łaniu substancji). Ró żnice 
w spektrum mutacji mi ędzy hodowlami zmutowanych komórek zwierz ąt 
poddanych dzia łaniu substancji i zwierz ąt niepoddanych dzia łaniu substancji 
mogą potwierdza ć skutki mutagenne (29). Ponadto spektra mutacji mog ą 
być przydatne przy formu łowaniu hipotez mechanistycznych. Je żeli sekwen ­
cjonowanie ma zosta ć uwzględnione w protokole badania, nale ży zachowa ć 
szczególn ą uwagę przy tworzeniu projektu takich bada ń, w szczególno ści 
w odniesieniu do liczby zmutowanych komórek podczas sekwencjonowania jednej próbki, aby uzyska ć odpowiedni ą moc zgodnie z zastosowanym 
modelem statystycznym (zob. pkt 43).
 
PROCEDURA  
Liczba i p łeć zwierząt 
25. Nale ży wcześniej ustali ć całkowitą liczbę zwierząt w grupie tak, aby by ła 
wystarczaj ąca do uzyskania statystycznej mocy testu niezb ędnej do 
wykrycia co najmniej podwojenia cz ęstości występowania mutacji. Grupa 
powinna sk ładać się z co najmniej pi ęciu zwierz ąt. Jeżeli jednak moc testu 
jest niewystarczaj ąca, należy odpowiednio zwi ększyć liczbę zwierząt. 
Zasadniczo nale ży wykorzystywa ć samce zwierz ąt. Może zdarzyć się, że 
badania samych samic by łoby uzasadnione, przyk ładowo w przypadku 
testowania leków dla ludzi przeznaczonych dla kobiet lub badania metabo ­
lizmu kobiet. Je żeli zachodz ą znaczne ró żnice między płciami pod 
względem toksyczno ści lub metabolizmu, nale ży wykorzysta ć zarówno 
samce, jak i samice.  
Okres podawania  
26. Na podstawie obserwacji, zgodnie z którymi z ka żdym poddawaniem dzia ­ 
łaniu substancji zachodzi akumulacja mutacji, niezb ędny jest schemat 
powtarzanego dawkowania, obejmuj ący podawanie substancji badanej 
codziennie przez okres 28 dni. Powszechnie uznaje si ę to za dopuszczalne 
zarówno pod wzgl ędem uzyskania wystarczaj ącej akumulacji mutacji 
wywołanych słabymi mutagenami, jak i pod wzgl ędem uzyskania czasu 
ekspozycji odpowiedniego do wykrycia mutacji w narz ądach, których proli ­
feracja tkanek zachodzi powoli. W przypadku niektórych ocen odpowiednie może być zastosowanie alternatywnych schematów podawania substancji, 
które nale ży naukowo uzasadni ć w protokole. Poddawanie dzia łaniu 
substancji nie powinno trwa ć krócej ni ż czas wymagany do ca łkowitego 
indukowania wszystkich odpowiednich enzymów metabolicznych. Poddawanie dzia łaniu substancji przez krótszy czas mo że wymaga ć zasto­
sowania wielokrotnego pobierania próbek, odpowiedniego dla narz ądów 
o różnym tempie proliferacji tkanek. W ka żdym przypadku, uzasadniaj ąc 
protokół, należy przestawi ć wszystkie dost ępne informacje (np. dotycz ące 
toksyczno ści ogólnej lub metabolizmu i farmakokinetyki), szczególnie 
w przypadku odej ścia od powy ższych standardowych zalece ń. Czas 
poddawania dzia łaniu substancji d łuższy niż 8 tygodni nale ży dok
ładnie 
wyjaśnić i uzasadni ć, poniewa ż może to równie ż powodowa ć wyraźny 
wzrost cz ęstości występowania mutacji w drodze ekspansji klonalnej (29), 
chociaż może zwiększyć czułość badania.  
Poziomy dawek  
27. Poziomy dawek powinny opiera ć się na wynikach badania s łużącego 
wyznaczeniu zakresów dawki, w ramach którego dokonuje si ę pomiaru 
ogólnej toksyczno ści, przeprowadzonego t ą samą drogą ekspozycji, lub na 
wynikach wcze śniej istniej ących bada ń toksyczno ści podostrej. Do wyzna ­
czenia zakresów dawki mo żna wykorzysta ć zwierzęta nietransgeniczne 
należące do tego samego szczepu gryzoni. W ramach g łównego badania,  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 917
 
w celu uzyskania informacji dotycz ących zale żności dawka-odpowied ź, 
całkowite badanie powinno obejmowa ć kontrolę ujemną (zob. pkt 22) 
i co najmniej trzy poziomy dawek podawanych w odpowiednich odst ępach, 
z wyjątkiem przypadków zastosowania dawki granicznej (zob. pkt 28). 
Najwyższą dawką powinna by ć najwyższa tolerowana dawka. Najwy ższa 
tolerowana dawka jest okre ślona jako dawka wywo łująca oznaki toksycz ­
ności, przy czym oczekuje si ę, że wyższe poziomy dawek oparte na tym 
samym schemacie dawkowania mog łyby być śmiertelne. Substancje 
chemiczne o szczególnej aktywno ści biologicznej przy niskich nietoksycz ­
nych dawkach (takie jak hormony i mitogeny) oraz substancje chemiczne 
wykazujące intensywne w łaściwości toksykologiczne mog ą stanowi ć 
wyjątek w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny by ć 
oceniane odr ębnie dla ka żdego przypadku. Poziomy dawek powinny 
objąć zakres od maksymalnej do niskiej toksyczno ści lub do jej braku.  
Badanie graniczne  
28. Jeżeli badania s łużące wyznaczeniu zakresów dawki lub istniej ące dane 
dotyczące pokrewnych szczepów gryzoni wskazuj ą, że schemat dawko ­
wania dla co najmniej dawki granicznej (zob. poni żej) nie daje obserwo ­
walnych efektów toksycznych oraz je żeli nie podejrzewa si ę genotoksycz ­
ności w oparciu o dane dotycz ące substancji chemicznych powi ązanych 
strukturalnie, wówczas przeprowadzenie pe łnego badania z zastosowaniem 
trzech poziomów dawek mo że nie by ć konieczne. W przypadku okresu 
podawania wynosz ącego 28 dni (tj. 28 dni poddawania dzia łaniu substancji) 
dawka graniczna wynosi 1 000 mg/kg masy cia ła/dobę. W przypadku 
okresów podawania wynosz ących nie wi ęcej niż 14 dni, dawka graniczna 
wynosi 2 000 mg/kg masy cia ła/dobę (schematy dawkowania inne ni ż 28 
dni poddawania dzia łaniu substancji nale ży naukowo uzasadni ć 
w protokole; zob. pkt 26).  
Podawanie dawek  
29. Badana substancja chemiczna jest zazwyczaj podawana przez sond ę przy 
użyciu sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Zasadni ­
czo, opracowuj ąc badanie, nale ży rozważyć przewidywan ą drogę narażenia 
ludzi. Dlatego te ż możliwe jest dopuszczenie innych dróg nara żenia (takich 
jak podawanie w wodzie pitnej, podawanie podskórne, do żylne, miejscowe, 
inhalacja, podawanie dotrztchawiczne, podawanie w paszy lub implantacja), 
jeżeli można to uzasadni ć. Nie zaleca si ę stosowania wstrzykni ęcia doot­
rzewnowego, poniewa ż z fizjologicznego punktu widzenia nie jest to droga 
narażenia ludzi. Maksymalna obj ętość płynu, jaka mo że być podana przez 
sondę lub wstrzykni ęta jednorazowo, zale ży od wielko ści badanego zwie ­
rzęcia. Objętość nie powinna przekracza ć 2 ml/100 g masy cia ła. Wyko­
rzystanie obj ętości wyższych niż podane musi by ć uzasadnione. Poza dra ż­
niącymi i żrącymi substancjami chemicznymi, które zwykle daj ą zaostrzone 
objawy przy wy ższych stężeniach, zmienno ść objętości w badaniu powinna 
być zminimalizowana przez dostosowanie st ężenia, aby zapewni ć stałą obję­
tość przy wszystkich poziomach dawki.  
Czas pobierania próbek  
Komórki somatyczne  
30. Czas pobierania próbek stanowi kluczow ą zmienną, poniewa ż ustala się go 
na podstawie okresu potrzebnego do utrwalenia mutacji. Okres ten zale ży 
od tkanki i wydaje si ę związany z czasem odnowy populacji komórek, przy 
czym szpik kostny i jelito reaguj ą szybko, a w ątroba znacznie wolniej. 
Odpowiedni kompromis w odniesieniu do pomiaru cz ęstości występowania 
mutacji zarówno w tkankach o szybkiej proliferacji, jak i w tkankach 
o wolnej proliferacji to 28 kolejnych dni poddawania dzia łaniu substancji 
(jak wskazano w pkt 26) oraz pobieranie próbek w trzy dni po ostatnim podaniu, chocia ż w tych warunkach mo że nie dojść do maksymalnej cz ęs­
tości występowania mutacji w tkankach o wolnej proliferacji. Je żeli tkanki 
o wolnej proliferacji maj ą szczególne znaczenie, odpowiedniejsze mo że być 
zastosowanie pó źniejszego czasu pobierania próbek wynosz ącego 28 dni po 
okresie podawania wynosz ącym 28 dni (16)(29). W takich przypadkach 
zamiast czasu pobierania próbek w 3 dniu po okresie podawania zastoso ­
wano by pó źniejszy czas pobierania próbek, który wymaga łby naukowego 
uzasadnienia.
 ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 918
 
Komórki germinalne  
31. Testy na gryzoniach transgenicznych s ą odpowiednie do badania indukcji 
mutacji genowej w m ęskich komórkach germinalnych (7)(8)(27), 
w przypadku których wyra źnie określono czas i kinetyk ę spermatogenezy 
(27). Ma ła liczba komórek jajowych dost ępnych do analizy, nawet po 
superowulacji, oraz brak syntezy DNA w oocycie wykluczaj ą określenie 
mutacji w żeńskich komórkach germinalnych z zastosowaniem bada ń na 
zwierzętach transgenicznych (31).  
32. Wyboru momentów pobierania próbek dla m ęskich komórek germinalnych 
dokonuje si ę w taki sposób, aby pobra ć próbki szeregu rodzajów komórek 
poddanych nara żeniu w ca łym procesie rozwoju komórki germinalnej oraz 
tak, aby na docelowym etapie pobierania próbek nara żenie było wystar­
czające. Czas potrzebny na rozwój komórek germinalnych ze spermatogo ­
niów do postaci dojrza łych plemników docieraj ących do nasieniowodu/ 
ogonów naj ądrzy wynosi ~ 49 dni dla myszy (36) oraz ~ 70 dni dla 
szczurów (34)(35). Po 28-dniowym okresie nara żenia, a nast ępnie 3- 
dniowym okresie pobierania próbek zakumulowane plemniki pobrane z nasieniowodu/ogonów naj ądrzy (7)(8) stanowi ą populacj ę komórek 
poddanych nara żeniu w przybli żeniu w drugiej po łowie spermatogenezy, 
w tym na etapie mejotycznym i postmejotycznym, lecz nie na etapie sper ­
matogonium lub komórki macierzystej. Aby w odpowiedni sposób pobra ć 
próbki komórek znajduj ących się w nasieniowodzie/ogonach naj ądrzy, które 
w okresie nara żenia były spermatogoniami, nale ży dodatkowo pobra ć 
próbki po up ływie co najmniej 7 tygodni (myszy) lub 10 tygodni (szczury) 
od zakończenia poddawania dzia łaniu substancji.
 
33. Komórki uzyskane z cewek nasiennych po okresie 28 + 3 dni stanowi ą 
populację mieszaną, obejmuj ącą wszystkie etapy rozwoju komórek germi ­
nalnych (7)(8). Pobieranie próbek tych komórek w celu wykrycia mutacji genowych nie zapewnia tak dok ładnej oceny etapów, na których dosz ło do 
indukowania mutacji komórek germinalnych, jak ą można uzyska ć, pobie­
rając próbki plemników z nasieniowodu/ogonów naj ądrzy (poniewa ż próbki 
pobierane z cewek zawieraj ą szereg rodzajów komórek germinalnych 
i dochodzi do ska żenia przedmiotowej populacji komórek niektórymi 
komórkami somatycznymi). Pobranie próbek komórek z cewek nasiennych 
oprócz pobrania próbek plemników z nasieniowodu/ogonów naj ądrzy 
zgodnie ze schematem pobierania próbek 28 + 3 dni zagwarantowa łoby 
jednak, że w skład pobranych komórek wchodzi łyby komórki poddane 
narażeniu na wi ększości etapów rozwoju komórki germinalnej, co mo że 
być przydane do wykrywania mutagenów komórek germinalnych.
 
Obserwacje  
34. Ogólne obserwacje kliniczne powinny by ć przeprowadzane co najmniej raz 
dziennie, najlepiej ka żdego dnia o tej samej porze, bior ąc pod uwag ę szczy­
towy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Stan zdrowia 
zwierząt powinien by ć odnotowywany. Co najmniej dwa razy dziennie 
wszystkie zwierz ęta powinny by ć obserwowane pod k ątem zachorowalno ści 
i śmiertelno ści. Wszystkie zwierz ęta powinny by ć ważone co najmniej raz 
w tygodniu oraz przed u śmierceniem. Pomiary spo życia paszy powinny by ć 
dokonywane przynajmniej co tydzie ń. Jeżeli badana substancja chemiczna 
jest podawana w wodzie pitnej, spo życie wody musi by ć także mierzone 
przy każdej zmianie wody i przynajmniej cotygodniowo. Zwierz ęta wyka­
zujące oznaki nadmiernej toksyczno ści nieprowadz ące do śmierci nale ży 
poddać eutanazji przed zako ńczeniem badania (23).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 919
 
Pobieranie tkanek  
35. Nale ży wyraźnie określić podstawy pobrania tkanek. Poniewa ż praktycznie 
każdą tkankę można podda ć badaniu pod k ątek indukowania mutacji, 
wybór tkanek, które zostan ą pobrane, powinien by ć uwarunkowany przy ­
czyną przeprowadzania badania oraz wszelkimi istniej ącymi danymi dotycz ­ 
ących badanej substancji chemicznej w zakresie mutagenno ści, rakotwór ­
czości lub toksyczno ści. Do istotnych czynników, które nale ży rozważyć, 
należy drogę podania (w oparciu o prawdopodobn ą drogę lub drogi nara ­ 
żenia ludzi), przewidywana dystrybucja w tkankach oraz ewentualny 
mechanizm dzia łania. W przypadku braku informacji ogólnych nale ży 
pobrać szereg tkanek somatycznych, które przypuszczalnie s ą istotne. 
Tkanki te powinny obejmowa ć tkanki szybko proliferuj ące, tkanki wolno 
proliferuj ące i tkanki w miejscu kontaktu. Ponadto nale ży pobrać 
i przechowywa ć plemniki z nasieniowodu/ogonów naj ądrzy oraz 
rozwijające się komórki germinalne z cewek nasiennych (zgodnie 
z opisem zawartym w pkt 32 i 33) na wypadek konieczno ści przeprowa ­
dzenia w przysz łości analizy mutagenno ści komórek germinalnych. Nale ży 
uzyskać masy narz ądów, a w przypadku du żych narządów od wszystkich 
zwierząt należy je pobra ć ten sam obszar.  
Przechowywanie tkanek i DNA  
36. Tkanki (lub homogenaty tkanek) nale ży przechowywa ć w temperaturze 
–70 °C lub ni ższej i wykorzysta ć w celu izolacji DNA w ci ągu 5 lat. 
Wyizolowane DNA przechowywane sch łodzone w temperaturze 4 °C we 
właściwym buforze nale ży najlepiej wykorzysta ć do analizy mutacji 
w przeciągu 1 roku.  
Wybór tkanek do analizy mutacji  
37. Wyboru tkanek nale ży dokonywa ć, uwzględniając takie kwestie jak: 1) 
droga podania lub miejsce pierwszego kontaktu (np. żołądek gruczo łowy 
przy podaniu drog ą pokarmow ą, płuco przy podaniu przez inhalacj ę lub 
skóra przy podaniu miejscowym); oraz 2) parametry farmakokinetyczne 
odnotowane w ogólnych badaniach toksyczno ści, wskazuj ące rozmieszcze ­
nie, zatrzymanie lub akumulacj ę w tkankach, lub narz ądy docelowe pod 
kątem toksyczno ści. W przypadku prowadzenia bada ń uzupełniających 
badania rakotwórczo ści należy rozważyć docelowe tkanki pod k ątem rako­
twórczości. Tkanki do analizy nale ży tak dobiera ć, aby zmaksymalizowa ć 
wykrycie substancji chemicznych b ędących mutagenami dzia łającymi 
bezpośrednio w badaniu  in vitro , charakteryzuj ących się szybkim metabo ­
lizmem, du żą reaktywno ścią i słabą absorpcj ą, lub substancji chemicznych, 
w odniesieniu do których tkank ę docelow ą określa się na podstawie drogi 
podania (6).  
38. W przypadku braku informacji ogólnych i uwzgl ędniając miejsce kontaktu 
wynikające z drogi podania, ocenie w kierunku mutagenno ści należy 
poddać wątrobę i co najmniej jedn ą tkankę ulegającą szybkiemu podzia łowi 
(np. żołądek gruczo łowy, szpik kostny). W wi ększości przypadków powy ­ 
ższe wymogi mo żna spełnić, przeprowadzaj ąc analizę dwóch starannie 
dobranych tkanek, jednak w niektórych przypadkach konieczne by łoby 
zastosowanie co najmniej trzech tkanek. Je żeli istniej ą powody szczegól ­
nych obaw w odniesieniu do skutków dla komórek germinalnych, w tym 
dodatnich wyników w komórkach somatycznych, nale ży zbadać tkanki 
zawierające komórki germinalne pod k ątem mutacji.  
Metody pomiaru  
39. Dost ępne są standardowe metody laboratoryjne lub opublikowane metody 
wykrywania mutacji dla zalecanych modeli transgenicznych: bakteriofag 
lambda i plazmid zawieraj ące gen  lacZ  (30); mysz z wprowadzonym 
genem  lacI  (2)(18); mysz  gpt delta (22); szczur  gpt delta (28);  cII (17). 
Zmiany nale ży uzasadni ć i odpowiednio udokumentowa ć. Dane dotycz ące 
wielu reakcji pakowania mo żna zagregowa ć i wykorzysta ć do osiągnięcia 
odpowiedniej liczby łysinek lub kolonii. Konieczno ść zastosowania du żej 
liczby reakcji pakowania w celu osi ągnięcia odpowiedniej liczby łysinek  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 920
 
może jednak wskazywa ć na niską jakość DNA. W takich przypadkach, 
rozważając dane, nale ży zachowa ć ostrożność, poniewa ż mogą być one 
niewiarygodne. Optymalna ca łkowita liczba łysinek lub kolonii przypa ­
dająca na próbk ę DNA zale ży od statystycznego prawdopodobie ństwa 
wykrycia wystarczaj ącej liczby mutacji przy danej cz ęstości występowania 
mutacji spontanicznych. Zasadniczo przy cz ęstości występowania mutacji 
spontanicznych rz ędu 3 × 10  –5 minimalna wymagana liczba łysinek wynosi 
125 000–300 000 (15). W przypadku badania Big Blue®  lacI  ważne jest, 
aby wykaza ć, że cały zakres zabarwionych fenotypów mutacji mo żna 
wykryć, wprowadzaj ąc odpowiednie kontrole barwienia równolegle do 
każdego testu p łytkowego. Tkanki i ich próbki (pozycje) nale ży przetwo ­
rzyć i przeanalizowa ć, stosując projekt blokowy, w którym pozycje z grupy 
kontrolnej no śnika/rozpuszczalnika, grupy kontroli dodatniej (je żeli ją zasto­
sowano) lub kontroli dodatniej DNA (w stosownych przypadkach) oraz 
wszystkich grup poddanych dzia łaniu substancji s ą przetwarzane łącznie.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Opracowanie wyników  
40. Dane dotycz ące poszczególnych zwierz ąt powinny zosta ć przedstawione 
w formie tabelarycznej. Jednostk ą doświadczaln ą jest zwierz ę. 
W sprawozdaniu nale ży uwzględnić łączną liczbę jednostek tworz ących 
łysinki (pfu) lub jednostek tworz ących koloni ę (cfu), liczb ę mutacji 
i częstość występowania mutacji w odniesieniu do ka żdej tkanki ka żdego 
zwierzęcia. Jeżeli istnieje wiele reakcji pakowania/izolacji, nale ży odno­
tować liczbę reakcji przypadaj ącą na próbk ę DNA. Chocia ż należy 
zachować dane dotycz ące poszczególnych reakcji, odnotowa ć należy 
jedynie łączną liczbę pfu lub cfu. Nale ży zgłosić dane dotycz ące toksycz ­
ności i objawów klinicznych, jak wskazano w pkt 34. Wszelkie wyniki 
sekwencjonowania nale ży przedstawia ć dla każdej przeanalizowanej mutacji 
i należy przedstawi ć wynikłe obliczenia cz ęstości występowania mutacji dla 
każdego zwierz ęcia i dla ka żdej tkanki.  
Ocena statystyczna i interpretacja wyników  
41. Istniej ą liczne kryteria oznaczania wyników dodatnich, takie jak zwi ązany 
z dawką wzrost cz ęstości występowania mutacji lub wyra źny wzrost cz ęs­
tości występowania mutacji w grupie pojedynczej dawki w porównaniu do 
grupy kontrolnej rozpuszczalnika/no śnika. Aby uzyska ć wystarczaj ące dane 
do analizy zale żności dawka-odpowied ź, należy przeanalizowa ć co najmniej 
trzy poddane dzia łaniu substancji grupy dawkowania. Chocia ż biologiczne 
znaczenie wyników powinno zosta ć wzięte pod uwag ę w pierwszej kolej ­
ności, można wykorzysta ć odpowiednie metody statystyczne jako metody 
pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (4)(14)(15)(25)(26). Jedno ­
stką doświadczaln ą w zastosowanych badaniach statystycznych powinno 
być zwierzę. 
42. Badana substancja chemiczna, w odniesieniu do której wyniki nie spe łniają 
powyższych kryteriów, uwa żana jest za niemutagenn ą w opisywanym bada ­
niu. W przypadku biologicznego znaczenia wyników ujemnych nale ży 
potwierdzi ć narażenie tkanki.  
43. W przypadku analiz sekwencjonowania DNA dost ępnych jest wiele metod 
statystycznych jako metod pomocniczych w interpretacji wyników (1)(5)(9)(19).
 
44. Uwzgl ędnienie, czy zaobserwowane warto ści są w obrębie historycznych 
zakresów kontroli, czy te ż poza nimi, mo że stanowi ć wskazówk ę przy 
ocenie biologicznego znaczenia reakcji (32).  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Sprawozdanie z badania  
45. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna:  
— dane identyfikacyjne i numer CAS, je żeli jest znany,  
— źródło, numer partii, je żeli jest dost ępny, 
— cechy fizyczne i czysto ść, 
— właściwości fizyko-chemiczne stosownie do warunków przeprowadzania 
badania,  
— stabilno ść badanej substancji chemicznej, je żeli jest znana.  
Rozpuszczalnik/no śnik: 
— uzasadnienie wyboru no śnika,  
— rozpuszczalno ść oraz stabilno ść badanej substancji chemicznej 
w rozpuszczalniku/no śniku,  
— przygotowanie postaci u żytkowych paszy, wody pitnej i inhalacji,  
— analityczne okre ślenie postaci u żytkowych (np. stabilno ść, homogenicz ­
ność, stężenia nominalne).  
Badane zwierz ęta: 
— wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie ich wyboru,  
— liczba, wiek i p łeć zwierząt, 
— źródło, warunki przebywania, pasza itp.,  
— masa poszczególnych zwierz ęcia na pocz ątku badania, łącznie 
z zakresem mas cia ła, średnimi oraz standardowymi odchyleniami dla 
każdej grupy.  
Warunki badania:  
— dane dotycz ące dodatnich i ujemnych (rozpuszczalnik/no śnik) kontroli,  
— dane z badania ustalania zakresu,  
— uzasadnienie w odniesieniu do wyboru poziomu dawki,  
— szczegó ły dotyczące preparatów badanej substancji chemicznej,  
— szczegó ły dotyczące podawania badanej substancji chemicznej,  
— racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,  
— metody pomiaru toksyczno ści u zwierz ąt, w tym dost ępne badania histo ­
patologiczne lub hematologiczne oraz cz ęstotliwość przeprowadzania 
obserwacji zwierz ąt i pomiaru masy cia ła, 
— metody sprawdzania, czy badana substancja chemiczna dotar ła do tkanki 
docelowej lub do krwiobiegu w przypadku otrzymania wyników 
ujemnych,  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— dawka faktyczna (mg/kg masy cia ła/dzień) obliczona w oparciu 
o stężenie badanej substancji chemicznej w paszy/wodzie pitnej (ppm) 
i spożycia, w stosownych przypadkach,  
— szczegó ły dotyczące jakości pożywienia i wody,  
— szczegó łowy opis harmonogramów poddawania dzia łaniu substancji 
oraz pobierania próbek,  
— metody eutanazji,  
— procedury izolowania i konserwacji tkanek,  
— metody izolacji genomowego DNA gryzoni, odzyskanie transgenu 
z genomowego DNA oraz przenoszenia transgenicznego DNA do 
gospodarza bakteryjnego,  
— źródło i numery partii wszystkich komórek, zestawów i odczynników 
(w stosownych przypadkach),  
— metody oznaczania liczby mutacji,  
— metody molekularnej analizy mutacji i zastosowanie ich przy dokony ­
waniu korekcji o klonalno ść lub obliczaniu cz ęstości występowania 
mutacji, w stosownych przypadkach.  
Wyniki:  
— stan zwierz ąt przed badaniem i podczas ca łego okresu badania, w tym 
oznaki toksyczno ści, 
— masa cia ła i narządów w chwili u śmiercenia,  
— w odniesieniu do ka żdej tkanki/ka żdego zwierz ęcia liczba badanych 
mutacji, liczba łysinek lub kolonii, cz ęstotliwość występowania mutacji,  
— dla ka żdej grupy tkanek/zwierz ąt, liczba reakcji pakowania dla próbki 
DNA, łączna liczba mutacji, średnia cz ęstość występowania mutacji, 
odchylenie standardowe,  
— zależność dawka-odpowied ź, w miarę możliwości, 
— w odniesieniu do ka żdej tkanki/ka żdego zwierz ęcia liczba niezale żnych 
mutacji i średnia cz ęstość występowania mutacji w przypadku przepro ­
wadzenia molekularnej analizy mutacji,  
— dane dotycz ące równolegle prowadzonej i historycznej kontroli ujemnej 
z uwzględnieniem zakresów, średnich i odchyle ń standardowych,  
— dane dotycz ące jednoczesnej kontroli dodatniej (lub niejednoczesnych 
kontroli dodatnich DNA),  
— oznaczenia analityczne, je żeli jest dost ępne (np. st ężenia DNA zastoso ­
wane w pakowaniu, dane z sekwencjonowania DNA),  
— zastosowane analizy i metody statystyczne.  
Omówienie wyników  
Wnioski  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
LITERATURA  
(1) Adams,  W.T. i T.R.  Skopek  (1987 r.), ‘Statistical  Test  for the Comparison 
of Samples from Mutational Spectra’,  J. Mol. Biol ., 194: 391-396.  
(2) Bielas, J.H. (2002 r.), ‘A more Efficient Big Blue® Protocol Improves 
Transgene Rescue and Accuracy in an Adduct and Mutation Measure ­
ment’,  Mutation Res. , 518: 107–112.  
(3) Boerrigter, M.E., M.E. Dollé, H.-J. Martus, J.A. Gossen i J. Vijg (1995 r.), 
‘Plasmid-based Transgenic Mouse Model for Studying  in vivo  Mutations’,  
Nature , 377(6550): 657–659  
(4) Carr, G.J. i N.J. Gorelick (1995 r.), ‘Statistical Design and Analysis of 
Mutation Studies in Transgenic Mice’,  Environ. Mol. Mutagen , 25(3): 
246–255.  
(5) Carr, G.J. i N.J. Gorelick (1996 r.), ‘Mutational Spectra in Transgenic 
Animal Research: Data Analysis and Study Design Based upon the Mutant or Mutation Frequency’,  Environ. Mol. Mutagen,  28: 405–413.
 
(6) Dean, S.W., T.M. Brooks, B. Burlinson, J. Mirsalis, B. Myhr, L. Recio 
i V. Thybaud (1999 r.), ‘Transgenic Mouse Mutation Assay Systems can 
Play an important Role in Regulatory Mutagenicity Testing  in vivo  for the 
Detection of Site-of-contact Mutagens’,  Mutagenesis , 14(1): 141–151.  
(7) Douglas, G.R., J. Jiao, J.D. Gingerich, J.A. Gossen i L.M. Soper(1995 r.), 
‘Temporal and Molecular Characteristics of Mutations Induced by Ethyl ­
nitrosourea in Germ Cells Isolated from Seminiferous Tubules and in Spermatozoa of  lacZ  Transgenic Mice’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 92: 
7485–7489.
 
(8) Douglas, G.R., J.D. Gingerich, L.M. Soper i J. Jiao (1997 r.), ‘Toward an 
Understanding of the Use of Transgenic Mice for the Detection of Gene Mutations in Germ Cells’,  Mutation Res. , 388(2-3): 197–212.
 
(9) Dunson, D.B. i K.R. Tindall (2000 r.), ‘Bayesian Analysis of Mutational 
Spectra’,  Genetics , 156: 1411–1418.  
(10) Gossen, J.A., W.J. de Leeuw, C.H. Tan, E.C. Zwarthoff, F. Berends, P.H. 
Lohman, D.L. Knook id J. Vijg(1989 r.), ‘Efficient Rescue of Integrated Shuttle Vectors from Transgenic Mice: a Model for Studying Mutations  in 
vivo’, Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86(20): 7971–7975.
 
(11) Gossen, J.A. i J. Vijg (1993 r.), ‘A Selective System for lacZ-Phage using 
a Galactose-sensitive  E. coli  Host’,  Biotechniques , 14(3): 326, 330.  
(12) Erikson, R.P. (2003 r.), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer’,  Mutation Res. , 543: 125–136.  
(13) Erikson, R.P. (2010 r.), ‘Somatic Gene Mutation and Human Disease other 
than Cancer: an Update’,  Mutation Res. , 705: 96–106.  
(14) Fung, K.Y., G.R. Douglas i D. Krewski (1998 r.), ‘Statistical Analysis of  
lacZ Mutant Frequency Data from Muta™Mouse Mutagenicity Assays’,  
Mutagenesis , 13(3): 249–255.  
(15) Heddle, J.A., S. Dean, T. Nohmi, M. Boerrigter, D. Casciano, G.R. Doug ­
las, B.W. Glickman, N.J. Gorelick, J.C. Mirsalis, H.-J Martus, T.R. Skopek, V. Thybaud, K.R.Tindall i N. Yajima (2000 r.), ‘In vivo Trans ­
genic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Mutagen ., 35: 253-259.
 
(16) Heddle, J.A., H.-J. Martus i G.R. Douglas (2003 r.), ‘Treatment and 
Sampling Protocols for Transgenic Mutation Assays’,  Environ. Mol. Muta ­
gen., 41: 1-6.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 924
 
(17) Jakubczak, J.L., G. Merlino, J.E. French, W.J. Muller, B. Paul, S. Adhya 
i S. Garges (1996 r.), ‘Analysis of Genetic Instability during Mammary 
Tumor Progression using a novel Selection-based Assay for  in vivo  Muta­
tions in a Bacteriophage λ Transgene Target’,  Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 
93(17): 9073–9078.  
(18) Kohler, S.W., G.S. Provost, P.L. Kretz, A. Fieck, J.A. Sorge i J.M. Short 
(1990 r.), ‘The Use of Transgenic Mice for Short-term, in vivo Mutage ­
nicity Testing’, Genet. Anal. Tech. Appl., 7(8): 212–218.  
(19) Lewis P.D., B. Manshian, M.N. Routledge, G.B. Scott id P.A. Burns 
(2008 r.), ‘Comparison of Induced and Cancer-associated Mutational 
Spectra using Multivariate Data Analysis’, Carcinogenesis, 29(4): 
772–778.  
(20) Nohmi, T., M. Katoh, H. Suzuki, M. Matsui, M. Yamada, M. Watanabe, 
M. Suzuki, N. Horiya, O. Ueda, T. Shibuya, H. Ikeda i T. Sofuni (1996 r.), ‘A new Transgenic Mouse Mutagenesis Test System using Spi — and 6-thioguanine Selections’, Environ. Mol. Mutagen., 28(4): 465–470.
 
(21) Nohmi, T., M. Suzuki, K. Masumura, M. Yamada, K. Matsui, O. Ueda, H. 
Suzuki, M. Katoh, H. Ikeda i T. Sofuni (1999 r.), ‘Spi  – Selection: an 
Efficient Method to Detect γ-ray-induced Deletions in Transgenic Mice’,  
Environ. Mol. Mutagen ., 34(1): 9–15.  
(22) Nohmi, T., T. Suzuki i K.I. Masumura (2000 r.), ‘Recent Advances in the 
Protocols of Transgenic Mouse Mutation Assays’,  Mutation Res. , 
455(1–2): 191–215.  
(23) OECD (2000 r.), Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Series on Testing and Assessment, No 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Pary ż.
 
(24) OECD (2009), Detailed Review Paper on Transgenic Rodent Mutation 
Assays, Series on Testing and Assessment, No 103, ENV/JM/MO ­
NO(2009)7, OECD, Pary ż. 
(25) Piegorsch, W.W., B.H. Margolin, M.D. Shelby, A. Johnson, J.E. French, 
R.W. Tennant i K.R. Tindall (1995 r.), ‘Study Design and Sample Sizes 
for a lacI Transgenic Mouse Mutation Assay’, Environ. Mol. Mutagen., 
25(3): 231–245.  
(26) Piegorsch, W.W., A.C. Lockhart, G.J. Carr, B.H. Margolin, T. Brooks, ... 
G.R. Douglas, U.M. Liegibel, T. Suzuki, V. Thybaud, J.H. van Delft i N.J. Gorelick (1997 r.), ‘Sources of Variability in Data from a Positive Selec ­
tion lacZ Transgenic Mouse Mutation Assay: an Interlaboratory Study’, 
Mutation. Res., 388(2–3): 249–289.
 
(27) Singer, T.M., I.B. Lambert, A. Williams, G.R. Douglas i C.L. Yauk (2006 
r.), ‘Detection of Induced Male Germline Mutation: Correlations and 
Comparisons between Traditional Germline Mutation Assays, Transgenic 
Rodent Assays and Expanded Simple Tandem Repeat Instability Assays’, Mutation. Res., 598: 164-193.
 
(28) Toyoda-Hokaiwado, N., T. Inoue, K. Masumura, H. Hayashi, Y. Kawa ­
mura, Y. Kurata, M. Takamune, M. Yamada, H. Sanada, T. Umemura, A. Nishikawa i T. Nohmi (2010 r.), ‘Integration of in vivo Genotoxicity and 
Short-term Carcinogenicity Assays using F344 gpt delta Transgenic Rats: 
in vivo Mutagenicity of 2,4-diaminotoluene and 2,6-diaminotoluene Struc ­
tural Isomers’, Toxicol. Sci., 114(1): 71–78.
 
(29) Thybaud, V., S. Dean, T. Nohmi, J. de Boer, G.R. Douglas, B.W. Glic ­
kman, N.J. Gorelick, J.A. Heddle, R.H. Heflich, I. Lambert, H.-J. Martus, J.C. Mirsalis, T. Suzuki i N. Yajima (2003 r.), ‘ In vivo  Transgenic Muta ­
tion Assays’,  Mutation Res ., 540: 141–151.
 
(30) Vijg, J. i G.R. Douglas (1996 r.), ‘Bacteriophage λ and Plasmid  lacZ  
Transgenic Mice for studying Mutations  in vivo ’ in: G. Pfeifer (ed.),  
Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations, Part II,  
Plenum Press, New York, NY, USA, s. 391–410.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 925
 
(31) Yauk, C.L., J.D. Gingerich, L. Soper, A. MacMahon, W.G. Foster i G.R. 
Douglas (2005 r.), ‘A  lacZ  Transgenic Mouse Assay for the Detection of 
Mutations in Follicular Granulosa Cells’,  Mutation Res ., 578(1-2): 
117–123.  
(32) Hayashi, M., K. Dearfield, P. Kasper, D. Lovell, H.-J. Martus, V. Thybaud 
(2011 r.), ‘Compilation and Use of Genetic Toxicity Historical Control Data’, Mutation Res., doi:10.1016/j.mrgentox.2010.09.007.
 
(33) OECD (2011),  Retrospective Performance Assessment of OECD Test 
Guideline on Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation 
Assays , Series on Testing and Assessment, No 145, ENV/JM/MO ­
NO(2011)20, OECD, Pary ż. 
(34) Clermont, Y. (1972 r.), ‘Kinetics of spermatogenesis in mammals semini ­
ferous epithelium cycle and spermatogonial renewal’. Physiol. Rev. 52: 
198–236.  
(35) Robaire, B., Hinton, B.T., i Oregbin-Crist, M.-C. (2006), ‘The Epididy ­
mis’, w Neil, J.D., Pfaff, D.W., Chalis, J.R.G., de Kretser, D.M., Richards, 
J.S., i P. M, Wassarman (red.), Physiology of Reproduction, Elsevier, the Netherlands, s. 1071–1148.
 
(36) Russell, L.B. (2004 r.), ‘Effects of male germ-cell stage on the frequency, 
nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse’, 
Genetica, 122: 25–36.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 926
 
Dodatek  
DEFINICJE:  
Okres podawania:  całkowity okres podawania dawek zwierz ęciu. 
Substytucja par zasad:  mutacja powoduj ąca podstawienie pojedynczej zasady 
azotowej nukleotydów DNA przez inn ą zasadę azotową nukleotydów DNA.  
Kapsyd:  płaszcz bia łkowy otaczaj ący wirion.  
Substancja chemiczna:  substancja lub mieszanina.  
Ekspansja klonalna:  tworzenie wielu komórek z pojedynczej (zmutowanej) 
komórki.  
Jednostka tworz ąca koloni ę (cfu):  miara liczby żywotnych bakterii.  
Konkatamer:  długa, ciągła biomoleku ła zbudowana z wielu jednakowych 
odcinków po łączonych ze sob ą na zasadzie  głowa-ogon . 
Region cos:  12-nukleotydowy odcinek jednoniciowego DNA po łożony na obu 
końcach dwuniciowego genomu bakteriofagu lambda.  
Delecja:  mutacja powoduj ąca utratę jednego nukleotydu lub wielu (nast ępuj­ 
ących po kolei) nukleotydów w genomie.  
Elektroporacja:  zastosowanie impulsów elektrycznych w celu zwi ększenia prze ­
puszczalno ści błon komórkowych.  
Gen endogenny:  gen natywny genomu.  
Zmienno ść ponad dwumianowa:  zmienno ść w powtórzonych szacunkach 
odsetka populacji przewy ższająca zmienno ść, której oczekiwano by, je żeli dana 
populacja ma rozk ład dwumianowy.  
Mutacja spowodowana zmian ą fazy odczytu:  mutacja genetyczna spowodo ­
wana dodaniem lub usuni ęciem liczby nukleotydów niepodzielnej przez trzy 
w sekwencji nukleodytów koduj ącej białko/peptyd.  
Insercja:  dodanie co najmniej jednej pary zasad azotowych nukleotydów do 
sekwencji DNA.  
Kumulacja (ang.  jackpot ): duża liczba mutacji powsta łych w drodze ekspansji 
klonalnej z pojedynczej mutacji.  
Duże delecje:  delecje zachodz ące w DNA wi ęcej niż kilka kilopar zasad (które 
są skutecznie wykrywane w badaniach selekcji Spi  – i plazmidu z genem lacZ).  
Ligacja:  łącznie kowalencyjne dwóch ko ńców cząsteczek DNA z zastosowaniem 
ligazy DNA.  
Mitogen:  substancja chemiczna stymuluj ąca komórk ę do rozpocz ęcia podzia łu 
komórki, wywo łująca mitozę (tj. podzia ł komórki).  
Gen neutralny:  gen, na który nie maj ą wpływu ani pozytywne ani negatywne 
oddziaływania selektywne.  
Pakowanie:  synteza zaka źnych cząsteczek fagowych z preparatu kapsydu faga 
i białek końcowych i konkatameru cz ąsteczek DNA faga. Powszechnie stoso ­
wane do pakowania DNA sklonowanego na wektor lambda (odizolowany przez 
regiony cos) do zaka źnych cząsteczek lambda.  
Wydajno ść pakowania:  wydajno ść, z którą spakowane bakteriofagi s ą odzyski­
wane w bakterii b ędącej gospodarzem.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Jednostka tworz ąca łysinki (pfu):  miary liczby żywotnych bakteriofagów.  
Mutacja punktowa:  ogólne poj ęcie oznaczaj ące mutacj ę mającą wpływ na ma łą 
sekwencję DNA, w tym ma łe insercje, delecje i substytucje par zasad.  
Selekcja dodatnia:  metoda umo żliwiająca przetrwanie jedynie mutacji.  
Gen reporterowy:  gen, którego produkt modyfikacji genowej jest łatwy do 
wykrycia.  
Czas pobierania próbek:  koniec okresu przed u śmierceniem, podczas którego 
nie podaje si ę substancji chemicznej, a uszkodzenia DNA zostaj ą utrwalone 
w postaci stabilnych mutacji.  
Wektor wahad łowy:  wektor zbudowany tak, aby móg ł się namnażać w dwóch 
różnych gatunkach gospodarzy; zatem DNA wstawione do wektora wahad łowego 
można badać lub można nim manipulowa ć w dwóch ró żnych rodzajach komórek 
lub w dwóch ró żnych organizmach.  
Badana substancja chemiczna:  oznacza ka żdą substancj ę lub mieszanin ę 
badaną za pomoc ą opisywanej metody badawczej.  
Transgeniczny:  należący do organizmu, którego genom zosta ł zmieniony 
w wyniku przeniesienia genu lub genów z innego gatunku; zwi ązany z takim 
organizmem lub b ędący takim organizmem.  ▼M5 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
CZĘŚĆ  C: METODY USTALANIA EKOTOKSYCZNO ŚCI 
SPIS TRE ŚCI 
C.1. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA DLA RYB 
C.2. BADANIE NAG ŁEGO UNIERUCHOMIENIA  DAPHNIA  SP. 
C.3. BADANIE INHIBICJI WZROSTU S ŁODKOWODNYCH 
GLONÓW I CYJANOBAKTERII 
C.4. OZNACZENIE BIODEGRADOWALNO ŚCI 
CZĘŚĆ I. ROZWA ŻANIA OGÓLNE 
CZĘŚĆ II. BADANIE DOC METOD Ą „DIE-AWAY” (Metoda C.4-A) 
CZĘŚĆ III. ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIEWOWE OECD 
(Metoda C.4-B) 
CZĘŚĆ IV. BADANIE WYDZIELANIA CO  2 (Metoda C.4-C) 
CZĘŚĆ V. BADANIE RESPIROMETRII MANOMETRYCZNEJ (Metoda 
C.4.D) 
CZĘŚĆ VI. BADANIE „ZAMKNI ĘTEJ BUTLI” (Metoda C.4-E) 
CZĘŚĆ VII. BADANIE M.I.T.I. (Metoda C.4-F) 
C.5. DEGRADACJA – ZAPOTRZEBOWANIE BIOCHEMICZNE 
NA TLEN 
C.6. DEGRADACJA – ZAPOTRZEBOWANIE CHEMICZNE NA 
TLEN 
C.7. ROZK ŁAD – ROZK ŁAD ABIOTYCZNY: HYDROLIZA JAKO 
FUNKCJA PH 
C.8. TOKSYCZNO ŚĆ DŻDŻOWNIC 
C.9. BIODEGRADACJA – BADANIE ZAHN-WELLENS 
C.10. SYMULACYJNE BADANIE W WARUNKACH TLENOWYCH 
W OCZYSZCZALNIACH ŚCIEKÓW: C.10-A: ZESTAWY 
OSADU CZYNNEGO - C.10-B: BIOFILMY 
C.11. BIODEGRADACJA – BADANIE HAMOWANIA ODDY ­
CHANIA AKTYWOWANYCH SZLAMÓW 
C12. BIODEGRADACJA – ZMODYFIKOWANE BADANIE SCAS C.13. BIOKONCENTRACJA: BADANIE RYB W WARUNKACH 
PRZEPŁYWU 
C14. BADANIE ROZWOJU M ŁODYCH RYB 
C.15. RYBY, KRÓTKOTERMINOWE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI 
NA EMBRIONIE I NARYBKU 
C.16. PSZCZO ŁY MIODNE – BADANIE TOKSYCZNO ŚCI OSTREJ 
DROGĄ POKARMOW Ą 
C.17. PSZCZO ŁY MIODNE – BADANIE KONTAKTOWEJ 
TOKSYCZNO ŚCI OSTREJ 
C.18. ADSORPCJA/DESORPCJA PRZY U ŻYCIU METODY 
RÓWNOWAGI OKRESOWEJ
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. OSZACOWANIE WSPÓ ŁCZYNNIKA ADSORPCJI (K  oc ) NA 
GLEBIE IW OSADZIE ŚCIEKOWYM PRZY ZASTOSO ­
WANIU WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII 
CIECZOWEJ (HPLC) 
C.20. BADANIE ROZRODCZO ŚCI DAPHNIA  MAGNA 
C.21. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIA PRZEMIAN 
AZOTU 
C.22. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN 
WĘGLA 
C.23. PRZEMIANY W GLEBIE W WARUNKACH NATLENIENIA 
I BEZTLENOWYCH 
C.24. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W UK ŁADACH 
OSADÓW WODNYCH 
C.25. MINERALIZACJA TLENOWA W WODZIE POWIERZCH ­
NIOWEJ — SYMULACYJNE BADANIE BIODEGRADACJI 
C.26. BADANIE INHIBICJI WZROSTU GATUNKU  LEMNA  
▼M4 
C.27. BADANIE TOKSYCZNO ŚCI W UK ŁADZIE OSAD-WODA 
NA OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGA ­
CONEGO OSADU 
C.28. BADANIE TOKSYCZNO ŚCI W UK ŁADZIE OSAD-WODA 
NA OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGA ­
CONEJ WODY 
C.29. SZYBKA BIODEGRADOWALNO ŚĆ – CO  2 W SZCZELNIE 
ZAMKNI ĘTYCH NACZYNIACH (Badanie fazy gazowej nad 
roztworem) 
C.30. BIOACCUMULATION IN TERRESTRIAL OLIGOCHAETES  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. TOKSYCZNO ŚĆ OSTRA DLA RYB  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Celem niniejszego badania jest ustalenie ostrej toksyczno ści śmier­
telnej substancji dla ryb w wodach s łodkich. Po żądane jest posiada ­
nie, w mo żliwym zakresie, informacji na temat rozpuszczalno ści 
w wodzie, ci śnienia pary, stabilno ści chemicznej, sta łych dysocjacji 
i rozkładu biologicznego substancji badanej, co pomo że w wybraniu 
najwłaściwszej metody badania (statycznej, pó łstatycznej lub prze ­
pływowej), tak aby zapewni ć zadowalaj ące, stałe stężenia substancji 
badanej w czasie wykonywania badania.  
Przy planowaniu i interpretacji wyników badania nale ży także wziąć 
pod uwag ę dodatkowe informacje (np. wzór strukturalny, stopie ń 
czystości, charakter i zawarto ść procentowa istotnych zanieczysz ­
czeń, obecność i ilość substancji pomocniczych oraz wspó łczynnik 
podziału n-oktanol/woda).  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Toksyczno ść ostra to rozpoznawalne dzia łanie niepo żądane na orga ­
nizm w ci ągu krótkiego okresu ekspozycji (rz ędu dni) na substancj ę. 
W niniejszym badaniu toksyczno ść ostrą wyraża się jako median ę 
stężenia śmiertelnego (LC), tj. st ężenie w wodzie, które powoduje 
śmierć 50 % badanego stada ryb podczas okresu sta łej ekspozycji, 
który musi zosta ć podany.  
Wszystkie st ężenia substancji badanej podano jako waga na obj ętość 
(miligramy na litr). Mog ą być również wyrażone jako stosunek wagi 
do wagi (mg/kg  -1 ). 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Substancj ę odniesienia mo żna zbadać w celu zademonstrowania, że 
w warunkach laboratoryjnego badania, reakcja badanych gatunków nie zmieni ła się znacząco.
 
Dla niniejszego badania nie wyszczególniono żadnych substancji 
odniesienia.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Badanie graniczne mo żna przeprowadzi ć przy 100 mg na litr w celu 
zademonstrowania że LC  50 jest większy niż to stężenie.  
Ryby są poddawane ekspozycji na substancje badan ą dodaną do 
wody w danym zakresie st ężeń na okres 96 godzin. Odnotowuje 
się liczby zgonów w odst ępach co najmniej 24-godzinnych 
i oblicza si ę stężenia uśmiercające 50 % ryb (LC  50 ) w każdym 
momencie obserwacji, o ile to mo żliwe.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Kryteria jako ściowe nale ży odnieść do badania granicznego, jak 
również do pełnej metody badania.  
Śmiertelno ść w grupach kontrolnych nie mo że przekracza ć 10 % 
(lub jednej ryby, o ile stosuje si ę mniej ni ż 10) na koniec badania.  
Stężenie rozpuszczonego tlenu musi by ć wyższa niż 60 % warto ści 
nasycenia powietrzem przez ca ły czas.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
Stężenia substancji badanej powinny by ć utrzymywane do 80 % 
wstępnych stężeń poprzez czas trwania badania.  
Dla substancji łatwo rozpuszczalnych w pod łożu badanym roztwory 
podatne na stabilno ść, to jest te które nie wykazuj ą żadnego znacz ­
nego stopnia ulatniania, rozk ładu, hydrolizy lub absorpcji, 
początkowe st ężenie uwa żane jest za równowa żne nominalnemu 
stężeniu. Nale ży przedstawi ć dowody, że utrzymano st ężenia poprzez 
całe badanie i spe łniono kryteria jako ściowe.  
Dla substancji, które s ą: 
(i) słabo rozpuszczalne w pod łożu badawczym; lub  
(ii) zdolne do tworzenia stabilnych emulsji lub zawiesin; lub  
(iii) niestabilne w roztworach wodnych,  
początkowe st ężenie musi by ć pobrane jako zmierzone st ężenie 
w roztworze (lub, je śli to technicznie niemo żliwe, zmieszone 
w słupie wody) na pocz ątku badania. St ężenie nale ży oznaczy ć po 
okresie równowagi, lecz przed wprowadzeniem badanych ryb.  
W każdym z tych przypadków, musz ą być prowadzone dalsze 
pomiary w czasie trwania badania dla potwierdzenia rzeczywistych 
stężeń ekspozycji lub spe łnienia kryteriów jako ściowych.  
pH nie mo że się zmieniać więcej niż o jedną jednostk ę. 
1.6. OPIS METODY BADANIA  
Można zastosowa ć trzy rodzaje procedury:  
Badanie statyczne:  
Badanie toksyczno ści, w którym nie zachodzi przep ływ badanego 
roztworu. (Roztwory pozostaj ą bez zmian w trakcie ca łego badania).  
Badanie pó łstatyczne:  
Badanie bez przep ływu roztworu, jednak z regularnymi odnowie ­
niami roztworów badanych z tej samej serii po wyd łużonych odst ę­
pach czasu (np. co 24 godziny).  
Badanie przep ływowe:  
Badanie toksyczno ści, w którym wod ę stale się odnawia w komorach 
badawczych, przy czym badany zwi ązek chemiczny jest transporto ­
wany z wod ą wykorzystywan ą do odnowy pod łoża badawczego.  
1.6.1.  Odczynniki  
1.6.1.1.  Roztwory substancji badanych  
Przygotowuje si ę roztwory podstawowe o wymaganej mocy przez 
rozpuszczenie substancji w wodzie dejonizowanej lub w wodzie przygotowanej wed ług opisu w ppkt 1.6.1.2.
 
Wybrane st ężenia badane przygotowuje si ę przez rozcie ńczanie 
roztworu podstawowego. W przypadku badania wysokich st ężeń 
substancję można rozpuścić bezpośrednio w wodzie do rozcie ńczania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Substancje zwykle nale ży badać tylko do granicy rozpuszczalno ści. 
Dla niektórych substancji (na przyk ład dla substancji posiadaj ących 
niską rozpuszczalno ść w wodzie lub o wy ższym P  ow lub tych tworz ­ 
ących raczej stabilne zawiesiny ni ż roztwory rzeczywiste w wodzie) 
jest dopuszczalne st ężenie badania powy żej granicy rozpuszczalno ści 
celem zapewnienia, że uzyskano maksymalne st ężenie 
rozpuszczenia/stabilno ści. Jest wa żne jednak że, żeby to st ężenie 
w żaden sposób nie zak łócało systemu badania (np. warstwa 
substancji na powierzchni wody zapobiegaj ąca utlenianiu wody itp.).  
Stosuje si ę ultradźwiękowe rozpraszanie, rozpuszczalniki organiczne, 
emulsyfikatory lub dyspergatory jako środki do przygotowania 
roztworów podstawowych substancji o niskiej rozpuszczalno ści lub 
w celu u łatwienia rozproszenia tych substancji w pod łożu badaw­
czym. Je żeli stosuje si ę takie substancje pomocnicze, wszystkie 
badane st ężenia musz ą zawierać tę samą ilość substancji pomocni ­
czej oraz dodatkowa grupa kontrolna ryb powinna by ć poddana 
ekspozycji przy tym samym st ężeniu substancji pomocniczej, które 
użyto w badanych seriach. St ężenie takich substancji nale ży zmini­
malizowa ć, lecz w żadnym przypadku nie mo że przekracza ć 100 mg 
na litr w pod łożu badawczym.  
Badanie nale ży przeprowadzi ć bez regulacji pH. Je żeli istniej ą 
oznaki zaznaczonej zmiany pH, doradza si ę powtórzenie badania 
z odpowiednim dostosowaniem jego warto ści i przedstawienie uzys ­
kanych wtedy wyników. W takim przypadku warto ść pH roztworu 
podstawowego nale ży doprowadzi ć do pH wody do rozcie ńczenia, 
chyba że istnieją powody, dla których nie nale ży tego robi ć. HCl 
i NaOH s ą zalecane w tym celu. Regulacj ę pH należy przeprowadzi ć 
w taki sposób, aby nie zmieni ć w istotnym stopniu st ężenia 
substancji badanej w roztworze podstawowym. W przypadku 
gdyby zasz ła reakcja chemiczna lub dosz ło do fizycznego wytr ącania 
się osadu badanego zwi ązku z powodu ustawiania pH, nale ży podać 
ten fakt.  
1.6.1.2.  Woda hodowlana i woda do rozcie ńczania  
Można zastosowa ć wodę do picia z sieci wodoci ągowej (niezanie ­
czyszczon ą przez chlor, metale ci ężkie lub inne substancje 
w niebezpiecznym st ężeniu), dobrej jako ści wodę zwykłą lub wod ę 
odtworzon ą (zob. woda o ca łkowitej twardo ści pomiędzy 10 
i 250 mg na litr (jako CaC0  3 ) i o pH 6,0–8,5 jest zalecana.  
1.6.2.  Przyrz ąd 
Wszystkie elementy przyrz ądu muszą być wykonane z materia łu 
obojętnego chemicznie:  
— automatyczny uk ład rozcieńczający (do badania przep ływowego),  
— miernik tlenu,  
— wyposa żenia do oznaczania twardo ści wody,  
— odpowiednie urz ądzenia do regulacji temperatury,  
— miernik pH.  
1.6.3.  Badane ryby  
Ryby powinny by ć zdrowe i wolne od jakichkolwiek widocznych 
wad rozwojowych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
Stosowane gatunki nale ży wybrać na podstawie kryteriów praktycz ­
nych, takich jak sta ła dostępność w ciągu roku, łatwość utrzymania, 
dogodność badania, wzgl ędna wrażliwość na substancje chemiczne 
i wszystkie czynniki ekonomiczne, bilogiczne lub środowiskowe 
mające posiadaj ące jakiekolwiek znaczenie. Przy doborze gatunków 
ryb musi zrodzi ć się również przemyślenie potrzeby porównywal ­
ności uzyskanych danych do istniej ących uznanych danych mi ędzy­
narodowych (pozycja 1).  
Wykaz zalecanych gatunków ryb do przeprowadzenia niniejszego 
badania podano w dodatku 2; najlepszymi gatunkami s ą pstrąg 
tęczowy i danio pr ęgowany.  
1.6.3.1.  Hodowla  
Najkorzystniej, aby stosowane w badaniu ryby pochodzi ły z poje­
dynczego stada o podobnej d ługości i wieku. Nale ży je hodowa ć 
przez co najmniej 12 dni w nast ępujących warunkach:  
napełnienie:  
właściwe dla systemu (recyrkulacyjnego lub przep ływowego) 
i gatunku ryb,  
woda:  
zob. 1.6.1.2,  
światło: 
12–16 godzin na świetlenia dziennie,  
stężenie rozpuszczonego tlenu:  
co najmniej 80 % warto ści nasycenia powietrzem,  
karmienie:  
trzy razy tygodniowo lub codziennie przerwa ć 24 godzin przed 
rozpoczęciem badania.  
1.6.3.2.  Śmiertelno ść 
Po 48-godzinnym okresie przyzwyczajania odnotowuje si ę śmiertel­
ność i stosuje nast ępujące kryteria:  
— większa niż 10 % populacji w ci ągu siedmiu dni:  
odrzucić całe stado,  
— pomiędzy 5 i 10 % populacji:  
okres hodowli kontynuuje si ę przez nast ępnych siedem dni.  
Jeżeli nie stwierdzi si ę dodatkowych zgonów, stado mo żna zaak­
ceptować; w przeciwnym razie nale ży je odrzuci ć, 
— poniżej 5 % populacji:  
stado mo żna zaakceptowa ć. 
1.6.4.  Adaptacja  
Wszystkie ryby musz ą pozostawa ć w kontakcie z wod ą o jakości 
i temperaturze odpowiadaj ącej wodzie wykorzystywanej w badaniu 
przez co najmniej siedem dni przed ich zastosowaniem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Procedura badania  
Badanie ostateczne mo żna poprzedzi ć przeprowadzeniem badania 
służącego wyznaczeniu zakresu st ężeń, aby uzyska ć informacje na 
temat zakresu st ężeń, który zostanie wykorzystany w zasadniczym 
badaniu.  
Dodatkowo do badanych serii przeprowadza si ę również badanie 
jednej grupy kontrolnej bez badanej substancji i, je śli stosowne, 
jednej grupy kontrolnej dla substancji pomocniczej.  
Zależnie od w łaściwości fizycznych i chemicznych badanego 
związku należy wybrać badanie statyczne, pó łstatyczne lub przep ły­
wowe, tak aby zapewni ć spełnienie kryteriów jako ściowych.  
Ryby poddaje si ę ekspozycji na substancj ę w sposób opisany poni ­ 
żej: 
— czas trwania: 96 godzin,  
— liczba zwierz ąt: co najmniej 7 na st ężenie,  
— zbiorniki: o odpowiedniej pojemno ści w relacji do zalecanego 
napełnienia,  
— napełnienie: zaleca si ę maksymalne nape łnienie 1 g na litr 
w przypadku bada ń statycznych i pó łstatycznych; w przypadku 
systemów przep ływowych mo żna zaakceptowa ć większe nape ł­
nienie,  
— stężenie badania: co najmniej pi ęć stężeń różniących się stałym 
czynnikiem nieprzekraczaj ącym 2,2 i tak dalece jak to mo żliwe, 
rozpiętości zakresu śmiertelno ści od 0 do 100 %,  
— woda: zob. 1.6.1.2,  
— oświetlenie: 12 do 16 godzin dziennie,  
— temperatura: w łaściwa dla gatunków (dodatek 2), jednak utrzy ­
mana w granicach ± 1  o C w przypadku ka żdego z bada ń, 
— stężenie rozpuszczonego tlenu: nie mniej ni ż 60 % warto ści 
nasycenia powietrzem w wybranej temperaturze,  
— karmienie: żadne.  
Ryby kontroluje si ę po upływie pierwszych 2 do 4 godzin, 
a następnie w odst ępach co najmniej 24-godzinnych. Uwa ża się 
je za martwe, gdy dotkni ęcie nasady ogona nie prowadzi do reakcji 
i nie wida ć ruchów oddechowych. Martwe ryby usuwa si ę podczas 
obserwacji i odnotowuje liczb ę zgonów. Dokumentuje si ę wszelkie 
widoczne nieprawid łowości (np. utrat ę równowagi, zmiany 
zachowania podczas p ływania, zmiany czynno ści oddechowej, 
pigmentacji itp.).  
Należy wykonywa ć codzienne pomiary pH, rozpuszczonego tlenu 
i temperatury.  
Badanie graniczne  
Stosując procedury opisane w niniejszej metodzie badania, przepro ­
wadza się badanie graniczne przy st ężeniu 100 mg na litr w celu 
pokazania że LC  50 jest większy niż dla danego st ężenia.  
Jeżeli natura badanej substancji jest taka, że nie mo żna uzyska ć 
stężenia 100 mg na litr w wodzie, badanie graniczne nale ży prze­
prowadzić w stężeniu równym rozpuszczalno ści substancji (lub 
w maksymalnym st ężeniu tworz ącym stabiln ą zawiesin ę) w użytym 
podłożu (zob. tak że ppkt 1.6.1.1.).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
Badanie graniczne nale ży przeprowadzi ć stosując 7–10 ryb, wraz 
z tą samą liczbą w kontroli(-ach). (Teoria rozk ładu dwumianowego 
pokazuje, że gdy stosuje si ę 10 ryb o śmiertelno ści równej zeru, to 
jest 99,9 % pewno ści, że LC  50 jest większy niż stężenie użyte 
w badaniu granicznym. Dla 7, 8 lub 9 ryb brak śmiertelno ści daje 
co najmniej 99 % pewno ści, że LC  50 jest większy niż użyte stęże­
nie). 
Jeżeli występuje śmiertelno ść, należy przeprowadzi ć pełne badanie. 
Jeżeli obserwowane s ą działania subletalne, powinny by ć zapisy­
wane.  
2. DANE I OCENA  
Dla każdego okresu czasu, gdzie zapisywano obserwacje (24, 48, 72 
i 96 godzin), nale ży wykreślić procent śmiertelno ści dla ka żdego 
zalecanego okresu czasu ekspozycji w stosunku do st ężenia na 
papierze logarytm- prawdopodobie ństwo.  
Jeżeli to mo żliwe, dla ka żdego czasu obserwacji, nale ży oszacowa ć 
LC 50 i granice ufno ści (p = 0,05), stosuj ąc standartowe procedury; 
wartości te nale ży zaokrąglić do jedno ści, lub najwy żej do dwóch 
znaczących cyfr (przyk łady zaokr ąglania: 170 dla 173,5; 0,13 dla 
0,127; 1,2 dla 1,21).  
W przypadkach gdy k ąt nachylenia krzywej zale żności stężenia od 
odpowiedzi procentowej jest zbyt stromy, aby by ło możliwe obli ­
czenie LC  50 , wystarczy graficzna ocena szacunkowa tej warto ści. 
W przypadku gdy kolejne dwa st ężenia w stosunku 2,2 daj ą jedynie 
umieralno ść 0 i 100 %, wystarczaj ą one do wskazania zakresu, 
w którym znajduje si ę LC  50 . 
W razie zaobserwowania, że nie da si ę utrzyma ć stabilności lub 
jednorodno ści substancji badanej, nale ży to zgłosić i wziąć pod 
uwagę przy interpretacji wyników.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Sprawozdanie z bada ń zawiera w miar ę możliwości następujące 
informacje:  
— informacje na temat u żytych do badania ryb (nazwa naukowa, 
szczep, dostawca, wszelkie wcze śniejsze kontakty z innymi 
substancjami, rozmiary i liczba wykorzystana w przypadku 
każdego badanego st ężenia),  
— źródło wody do rozcie ńczenia i jej najwa żniejsze parametry 
chemiczne (pH, twardo ść, temperatura),  
— w przypadku substancji o niskiej rozpuszczalno ści w wodzie, 
metoda przygotowania roztworu podstawowego i badanego,  
— stężenie wszelkich substancji pomocniczych,  
— wykaz zastosowanych st ężeń i wszelkie dost ępne informacje na 
temat stabilno ści w danych st ężeniach badanego zwi ązku 
chemicznego w roztworze badanym,  
— jeśli przeprowadzono analizy chemiczne, zastosowane metody 
i uzyskane wyniki,  
— wyniki badania granicznego, je śli przeprowadzono,  
— uzasadnienie wyboru i szczegó łowe dane na temat zastosowanej 
procedury badania (np. badanie statyczne, pó łstatyczne, szybko ść 
dawkowania, szybko ść przepływu, czy stosowano napowietrza ­
nie, nape łnienie rybami itp.),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— opis urz ądzeń, 
— reżim oświetlenia,  
— stężenia rozpuszczonego tlenu, warto ści pH i temperatury 
roztworów badanych co 24 godziny,  
— dowody spe łnienia kryteriów jako ściowych,  
— tabelę pokazuj ącą śmiertelno ść skumulowan ą przy ka żdym 
stężeniu i dla roztworów kontrolnych (oraz kontrolnych 
z substancj ą pomocnicz ą, jeśli wymagane) przy ka żdym 
z zalecanych czasów obserwacji,  
— wykres zale żności stężenia od odpowiedzi procentowej pod 
koniec badania,  
— jeżeli możliwe, warto ści LC  50 w każdym z zalecanych czasów 
obserwacji (o granicach ufno ści 95 %),  
— procedury statystyczne wykorzystywane do ustalania warto ści 
LC 50 , 
— uzyskane wyniki je żeli zastosowano substancje odniesienia,  
— najwy ższe stężenie badane niepowoduj ące zgonów w czasie 
trwania badania,  
— najniższe stężenie badane powoduj ące 100 % zgonów w czasie 
trwania badania.  
4. LITERATURA  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the 
Council C(81) 30 final and updates.  
(2) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Brachydanio rerio  – Static and Flow Through methods – NFT 
90-303 June 1985.  
(3) AFNOR – Determination of the acute toxicity of a substance to  
Salmo gairdneri  – Static and Flow -Through methods – NFT 
90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/l,/2 and/3 – Water Quality – Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan –  Teleostei, Cyprinidae).  
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: 
Flow-through method.  
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden – Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und 
L (15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 – Water – Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata,  1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.
 
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, fourteen edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Okotoxikologie, Grund ­
lagen fur die okotoxikologische Bewertung von Umweltchemi ­
kalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J. T and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
(16) Finney, D. J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. 
Bioassay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 
3, 793–821.  
(18) Sprague, J. B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, vol. 4, 3–32.
 
(19) Stephan, C. E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F. I. Mayer and 
J. L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, ASTM STP 634, 1977, 65–84.
 
(20) Stephan, C. E., Busch, K. A., Smith, R., Burke, J. and 
Andrews, R. W A computer program for calculating an LC
 50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Dodatek 1  
Woda po regeneracji  
Przykład właściwej wody rozcie ńczającej 
Wszystkie zwi ązki chemiczne musz ą być czystości analitycznej.  
Woda powinna by ć wodą destylowan ą dobrej jako ści, lub wod ą dejonizowan ą 
o przewodnictwie elektrycznym poni żej 5 μS/cm  -1 . 
Przyrząd do destylacji wody nie mo że zawiera ć jakichkolwiek cz ęści miedzia ­
nych.  
Roztwory podstawowe  
CaCl  2 . 2H20 (diwodny chlorek wapnia): 
Rozpuścić, dopełnić wodą do jednego litra. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H20 (heptawodny siarczan magnezu): 
Rozpuścić, dopełnić wodą do jednego litra. 4,93 g 
NaHC0  3 (wodorow ęglan sodu): 
Rozpuścić, dopełnić wodą do jednego litra. 2,59 g 
KCl (chlorek potasu): 
Rozpuścić, dopełnić wodą do jednego litra. 0,23 g  
Regenerowana woda do rozcie ńczania  
Zmieszać po 25 ml ka żdego z czterech roztworów podstawowych i uzupe łnić 
wodą do 1 litra.  
Napowietrza ć, aż stężenie rozpuszczonego tlenu osi ągnie warto ść nasycenia 
powietrzem.  
Wartość pH powinna wynosi ć 7,8 ± 0,2.  
W razie potrzeby nale ży wyregulowa ć pH przy u życiu NaOH (wodorotlenku 
sodowego) lub HCl (kwasu solnego).  
Tak przygotowan ą wodę do rozcie ńczania odstawia si ę na około 12 godzin, przy 
czym nie nale ży jej dalej napowietrza ć. 
Suma zawarto ści jonów Ca i Mg w tym roztworze wynosi 2,5 mmola na litr. 
Stosunek jonów Ca:Mg wynosi 4:1 i jonów Na:K wynosi 10:1. Ca łkowita zasa ­
dowość niniejszego roztworu jest 8 mmol na litr.  
Wszelkie odchylenia w przygotowaniu wody do rozcie ńczania nie mog ą zmie­
niać jej składu ani w łaściwości. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Dodatek 2  
Gatunki ryb zalecane do przeprowadzania bada ń 
Zalecane gatunki Zalecany zakres 
temperatur (  o C) Zalecana 
całkowita długość 
badanych 
zwierząt (cm)  
Brachydanio rerio(Teleostei, Cyprinidae) 
(Hamilton-Buchanan) Danio pr ęgowany  20 do 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas(Teleostei, Cyprinidae) 
(Rafinesque)  20 do 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio(Teleostei, Cyprinidae) 
(Linneaus 1758) Karp zwyk ły 20 do 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes(Teleostei, Poeciliidae) 
Cyprinodontidae (Tomminck and Schiegel 1850) Ryzowka  20 do 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) 
(Peters 1859) Gupik  20 do 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chidae) (Rafinesque Linneaus 1758) Oko ń 
błękitnoskrzeli  20 do 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Pstr ąg tęczowy  12 do 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae) (Lin ­
neaus 1758) Jaz  20 do 24 6,0 ± 2,0
 
Zbiór  
Wymienione poni żej ryby są łatwe w hodowli i szeroko dost ępne w ciągu całego 
roku. Nadaj ą się one do hodowli i rozmna żania albo w gospodarstwach rybnych, 
albo w laboratoriach, w warunkach chroni ących je od chorób i paso żytów. Ryby 
te dostępne są w wielu miejscach na świecie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Dodatek 3  
Przykład stężenia: procent śmiertelno ści 
Przykład oznaczenia LC  50 z użyciem papieru log-probit (logarytm-prawdopodobie ństwo)
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. BADANIE NAG ŁEGO UNIERUCHOMIENIA  DAPHNIA  SP. 
1. METODA  
Opisywana metoda badania nag łego unieruchomienia jest zgodna 
z OECD TG 202 (2004).  
1.1. WST ĘP 
Metoda ta jest stosowana w badaniu ostrej toksyczno ści oceniaj ącym 
toksyczno ść w odniesieniu do rozwielitek. Istniej ące metody badania 
były stosowane w mo żliwym zakresie (1)(2)(3).  
1.2. DEFINICJE  
W ramach tej metody stosowane s ą następujące definicje:  
EC 50 : jest stężeniem, które wed ług szacunków powoduje unierucho ­
mienie 50 % rozwielitek w podanym okresie ekspozycji. Je śli stoso­
wana jest inna definicja, nale ży to zgłosić, podając jednocze śnie 
odniesienie do niej.  
Unieruchomienie:  te zwierz ęta, które nie s ą w stanie p ływać 
w ciągu 15 sekund po łagodnym potrz ąśnięciu naczyniem do bada ­
nia, są uznawane za unieruchomione (nawet je śli nadal mog ą poru­
szać czułkami).  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Młode rozwielitki w wieku poni żej 24 godzin na pocz ątku badania 
są przez 48 godzin poddawane dzia łaniu badanej substancji 
o zróżnicowanym st ężeniu. Unieruchomienie jest rejestrowane po 
24 oraz po 48 godzinach i porównywane z warto ściami kontrolnymi. 
Wyniki s ą analizowane w celu obliczenia EC  50 po 48 godz. (defi ­
nicje zamieszczono w cz ęści 1.2). Nie jest konieczna ocena EC  50 po 
24 godz.  
1.4. INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI  
Rozpuszczalno ść w wodzie i ci śnienie pary badanej substancji 
powinny by ć znane, jak równie ż powinna by ć dostępna niezawodna 
metoda okre ślania ilościowego substancji w roztworach testowych 
o udokumentowanej wydajno ści i granicy okre ślenia. Pomocnymi 
informacjami s ą m.in. wzór strukturalny, czysto ść substancji, stabil ­
ność w wodzie lub pod wp ływem światła, P  ow i wyniki badania 
podatności na rozk ład biologiczny (zob. metoda C.4).  
Uwaga:  Instrukcje dotycz ące badanych substancji, których w łaści­
wości fizykochemiczne utrudniaj ą ich przebadanie, zamieszczono 
w (4).  
1.5. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Można przeprowadzi ć badanie EC  50 substancji odniesienia w celu 
sprawdzenia, czy warunki s ą właściwe. Zaleca si ę użycie do tego 
celu substancji toksycznych stosowanych w mi ędzynarodowych 
próbach pier ścieniowych (1)(5) (  1 ). Badania z substancj ą odniesienia 
należy przeprowadza ć co miesi ąc, a co najmniej dwa razy do roku.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) Wyniki tych wewn ętrznych bada ń laboratoryjnych i technicznego sprostowania 
w sprawie ISO 6341 daj ą EC  50 po 24 h dichromianu potasu (K  2 Cr 2 O 7 ) w przedziale 
0,6–1,7 mg/l.
 1.6. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Przy uznawaniu wa żności badania stosuje si ę następujące kryteria:  
— w kontrolach, tak że w kontroli wykorzystuj ącej czynnik rozcie ń­
czający, zostało unieruchomionych nie wi ęcej niż 10 % rozwie ­
litek,  
— stężenie rozpuszczonego tlenu w naczyniach kontrolnych 
i naczyniach do badania powinno wynosi ć na końcu badania 
> 3 mg/l.  
Uwaga:  W przypadku pierwszego kryterium unieruchomienie lub 
inne oznaki choroby lub stresu, na przyk ład odbarwienie, nietypowe 
zachowanie, takie jak utkni ęcie przy powierzchni, powinno wyka ­
zywać nie więcej niż 10 % kontrolnych rozwielitek.  
1.7. OPIS METODY BADANIA  
1.7.1.  Przyrz ądy 
Naczynia do badania i inne elementy wyposa żenia mające kontakt 
z roztworami testowymi powinny by ć w całości wykonane ze szk ła 
lub innych chemicznie oboj ętnych materia łów. Naczyniami do 
badania b ędą zwykle szklane probówki lub zlewki; nale ży je czyścić 
przed każdym użyciem, stosuj ąc standardowe procedury laborato ­
ryjne. Naczynia do badania powinny by ć luźno przykryte, aby 
zmniejszy ć utratę wody na skutek parowania i unikn ąć dostawania 
się kurzu do roztworu. Substancje lotne powinny by ć badane 
w całkowicie wype łnionych i zamkni ętych naczyniach, wystar ­
czająco dużych, aby nie dopu ścić do ograniczania ilo ści lub nadmier ­
nego spadku poziomu tlenu (zob. cz ęść 1.6 i 1.8.3 ust ęp pierwszy).  
Dodatkowo nale ży używać niektórych lub wszystkich 
z następujących urządzeń: tlenomierz (z mikroelektrod ą lub innym 
odpowiednim wyposa żeniem do mierzenia poziomu tlenu 
w próbkach o niskiej zawarto ści tlenu); pehametr; odpowiedni aparat 
do kontroli temperatury; Sprz ęt do okre ślania całkowitego w ęgla 
organicznego (TOC); sprz ęt do oznaczania chemicznego zapotrzebo ­
wania tlenu (ChZT), sprz ęt do oznaczania twardo ści itd.  
1.7.2.  Badane organizmy  
Zalecanym gatunkiem jest  Daphnia magna  Straus, ale do badania 
można użyć także innych, nadaj ących się do tego celu gatunków (np.  
Daphnia pulex ). Zwierz ęta powinny by ć w wieku ni ższym niż 24 
godziny na pocz ątku badania i aby zmniejszy ć zróżnicowanie, zaleca 
się, aby nie by ło to potomstwo pierwszego pokolenia. Powinny one 
pochodzić ze zdrowej populacji (tj. nie wykazywa ć oznak stresu, 
takich jak wysoka śmiertelno ść, obecność samców i obecno ść jaj 
przetrwalnikowych, opó źnienia w produkcji pierwszego pokolenia, 
obecność odbarwionych zwierz ąt itd.). Wszystkie organizmy 
używane do okre ślonego badania powinny pochodzi ć z hodowli 
założonych z tej samej populacji rozwielitek. Hodowane zwierz ęta 
muszą być trzymane w warunkach hodowli ( światło, temperatura, 
pożywka) podobnych do warunków stosowanych pó źniej 
w badaniu. Je śli pożywka w hodowli rozwielitek w badaniu ró żni 
się od pożywki w rutynowych hodowlach, w łaściwym post ępowa­
niem jest wprowadzenie okresu aklimatyzacji przed badaniem. Z tego powodu pokolenie rodzicielskie rozwielitek powinno by ć 
trzymane w wodzie do rozcie ńczania w temperaturze do badania 
przez co najmniej 48 godzin przed rozpocz ęciem badania.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Woda hodowlana i woda do rozcie ńczania  
Woda naturalna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenero ­
wana lub odchlorowana mog ą być użyte jako woda do hodowli 
rozwielitek i woda do rozcie ńczania substancji, je śli rozwielitki prze ­ 
żyją w niej w czasie hodowli, aklimatyzacji i badania, nie wykazuj ąc 
oznak stresu. Jako wod ę do badania mo żna stosowa ć każdy rodzaj 
wody, której charakterystyka zgodna jest z charakterystyk ą 
chemiczn ą wody nadaj ącej się do rozcie ńczania, jak opisano 
w załączniku 1. W czasie trwania badania jej jako ść nie powinna 
się zmieniać. Woda regenerowana mo że być przygotowana przed 
dodanie do wody dejonizowanej lub destylowanej okre ślonych ilo ści 
odczynników o czysto ści odpowiedniej do analizy. Przyk łady wody 
regenerowanej podano w (1) i (6) oraz w za łączniku 2. Nale ży 
pamiętać, że w przypadku badania substancji zawieraj ącej metale 
należy unikać pożywek zawieraj ących czynniki chelatuj ące, takie 
jak M4 i M7 opisane w za łączniku 2. Warto ść pH powinna utrzy ­
mywać się w przedziale 6–9. Dla  Daphnia magna  zalecana twardo ść 
powinna wynosi ć między 140 a 250 mg/l (CaCO  3 ), dla innych 
gatunków  Daphnia  może być stosowana woda o mniejszej twar ­
dości. Woda do rozcie ńczania mo że być przed użyciem do badania 
napowietrzona, tak aby tlen rozpuszczony osi ągnął stan nasycenia.  
Jeśli stosowana jest woda naturalna, jej parametry jako ści powinny 
być sprawdzane co najmniej dwa razy do roku lub zawsze, kiedy 
istnieje podejrzenie, że mogły one znacznie si ę zmienić (zob. 
poprzedni ust ęp i załącznik 1). Nale ży także sprawdza ć zawartość 
metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Je śli używana jest 
woda odchlorowana, po żądane jest przeprowadzanie codziennej 
analizy zawarto ści chloru. Je śli woda do rozcie ńczania pochodzi 
z wód powierzchniowych lub gruntowych, nale ży dokona ć pomiaru 
przewodno ści i zawarto ści całkowitego w ęgla organicznego (TOC) 
lub chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT).  
1.7.4.  Roztwory testowe  
Roztwory testowe o wybranych st ężeniach są zwykle przygotowy ­
wane przez rozcie ńczenie roztworu podstawowego. Roztwory 
podstawowe nale ży przygotowywa ć, rozpuszczaj ąc badan ą 
substancję w wodzie do rozcie ńczania. Je śli to tylko mo żliwe, nale ży 
unikać stosowania rozpuszczalników, emulgatorów czy środków 
dysperguj ących. W niektórych przypadkach takie zwi ązki mogą 
być jednak potrzebne do przygotowania roztworu podstawowego 
o odpowiednim st ężeniu. Informacje na temat odpowiednich 
rozpuszczalników, emulgatorów i środków dysperguj ących podano 
w (4). W żadnym przypadku substancja badana w roztworach testo ­
wych nie powinna przekracza ć granicy rozpuszczalno ści w wodzie 
do rozcie ńczania.  
Badanie powinno by ć przeprowadzone bez regulacji pH. Je śli pH nie 
utrzymuje si ę w przedziale 6–9, mo żna przeprowadzi ć drugie 
badanie przed dodaniem badanej substancji, dostosowuj ąc pH 
roztworu podstawowego do pH wody do rozcie ńczania. Dostoso ­
wanie pH powinno zosta ć przeprowadzone w taki sposób, żeby 
stężenie roztworu podstawowego nie zosta ło istotnie zmienione 
i nie zosta ła spowodowana żadna reakcja chemiczna lub wytr ącenie 
badanej substancji. Zaleca si ę stosowanie HCl i NaOH.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. PROCEDURA  
1.8.1.  Warunki ekspozycji  
1.8.1.1.  Grupy badane i kontrolne  
Naczynia do badania s ą napełniane odpowiednimi obj ętościami 
wody do rozcie ńczania i roztworami badanych substancji. Stosunek 
powietrza do wody w naczyniu powinien by ć identyczny w grupie 
kontrolnej i badanej. Rozwielitki s ą następnie umieszczane 
w naczyniach do badania. Dla ka żdego badanego st ężenia 
i kontroli nale ży użyć co najmniej 20 zwierz ąt podzielonych na 
cztery grupy po pi ęć zwierząt w każdej. Na ka żde zwierz ę powinno 
przypadać co najmniej 2 ml roztworu badanego (tj. roztwór 
o objętości 10 ml dla pi ęciu rozwielitek na naczynie do badania). 
Badanie mo że być przeprowadzane przy zastosowaniu odnawiania 
semistatycznego lub przep ływu przez system, je śli badana substancja 
nie jest stabilna.  
Oprócz w łaściwych serii kontrolnych nale ży przeprowadzi ć jedną 
serię kontroln ą wody do rozcie ńczania i, je śli jest to w łaściwe, 
jedną serię kontroln ą zawieraj ącą czynnik rozpuszczaj ący. 
1.8.1.2.  Badane st ężenia 
Jeśli nie ma danych o toksyczno ści badanej substancji, mo żna prze­
prowadzić badanie zakresu, pozwalaj ące określić zakres st ężeń stoso­
wanych w ostatecznych badaniach. W tym celu rozwielitki 
umieszcza si ę w szeregu roztworów o znacznie ró żniących się od 
siebie stężeniach badanej substancji. Dzia łaniu każdego ze st ężeń 
przez 48 godzin lub mniej powinno by ć poddanych pi ęć rozwielitek, 
żadne powtórzenia nie s ą konieczne. Okres ekspozycji mo że być 
krótszy (np. 24 godzin lub mniej), je śli dane odpowiednie do 
celów badania okre ślającego zakres st ężeń można uzyska ć 
w krótszym okresie.  
Należy zastosowa ć co najmniej pi ęć stężeń. Powinny one tworzy ć 
szereg geometryczny, najlepiej o stosunku st ężeń nieprzekraczaj ącym 
2,2. Jeśli zastosowano mniej ni ż pięć stężeń, należy przedstawi ć 
uzasadnienie. Najlepiej je śli najwyższe badane st ężenie powoduje 
stuprocentowe unieruchomienie, a najni ższe badane st ężenie nie 
powoduje widocznych skutków.  
1.8.1.3.  Warunki inkubacji  
Temperatura powinna mie ścić się w przedziale 18–22  o C i w żadnym 
badaniu nie powinna zmienia ć się o więcej niż ± 1  o C. Zaleca si ę 
cykl 16 godzin o świetlenia, 8 godzin ciemno ści. Całkowita ciemno ść 
również jest dopuszczalna, zw łaszcza w przypadku badanych 
substancji niestabilnych w świetle.  
W czasie badania nie nale ży doprowadza ć powietrza do naczy ń do 
badania. Badanie powinno by ć przeprowadzone bez regulacji pH. 
W czasie badania rozwielitki nie powinny by ć karmione.  
1.8.1.4.  Czas trwania  
Czas trwania badania wynosi 48 godzin.  
1.8.2.  Obserwacje  
W każdym naczyniu do badania nale ży sprawdza ć obecność unieru­
chomionych rozwielitek po 24 i 48 godzinach od rozpocz ęcia 
badania (definicje zamieszczono w cz ęści 1.2). Poza unieruchomie ­
niem nale ży odnotowa ć wszelkie odchylenia od normy 
w zachowaniu lub wygl ądzie. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Pomiary analityczne  
Zawartość tlenu rozpuszczonego i pH mierzy si ę na początku i na 
końcu badania w kontroli(-ach) i w roztworze badanej substancji 
o najwi ększym st ężeniu. St ężenie tlenu rozpuszczonego 
w roztworach kontrolnych powinno spe łniać kryterium wa żności 
(zob. część 1.6). W normalnych warunkach pH nie powinno si ę 
różnić w poszczególnych badaniach o wi ęcej niż 1,5 jednostki. 
Pomiary temperatury przeprowadza si ę zwykle w naczyniach kontro ­
lnych i w ich otaczaj ącym powietrzu. Temperatur ę najlepiej mierzy ć 
stale w czasie trwania badania lub przynajmniej na pocz ątku i na 
końcu badania.  
Stężenie badanej substancji powinno by ć mierzone przynajmniej 
w roztworach badanych o najwy ższym i o najni ższym stężeniu, na 
początku i na ko ńcu badania (4). Zaleca si ę, aby wyniki opiera ły się 
na mierzonych st ężeniach. Je śli jednak istniej ą dane wskazuj ące, że 
stężenie badanej substancji jest skutecznie utrzymywane w granicach 
± 20 % warto ści nominalnej lub zmierzonej warto ści początkowej 
przez cały czas trwania badania, to wyniki mog ą opierać się na 
wartości nominalnej lub zmierzonej warto ści początkowej.  
1.9. BADANIE GRANICZNE  
Stosując procedury opisane w niniejszej metodzie, mo żna przepro ­
wadzić badanie graniczne przy st ężeniu 100 mg/l badanej substancji 
lub w stężeniu do granicy rozpuszczalno ści w środku stosowanym 
w badaniu (zale żnie od tego, która warto ść jest niższa) w celu wyka ­
zania, że EC  50 jest większe niż dane stężenie. Badanie graniczne 
powinno by ć przeprowadzone przy u życiu 20 rozwielitek (najlepiej 
podzielonych na cztery grupy po pi ęć osobników) i tej samej liczby 
zwierząt w kontroli. Je śli nastąpi unieruchomienie, nale ży przepro ­
wadzić pełne badanie. Nale ży zanotowa ć wszystkie odchylenia od 
normy w zachowaniu.  
2. DANE  
Dane powinny by ć podsumowane w formie tabelarycznej, dla ka żdej 
grupy badanej i kontrolnej przy ka żdej obserwacji nale ży podać 
liczbę użytych rozwielitek i unieruchomienie. Procent osobników 
unieruchomionych po 24 i 48 godzinach jest przedstawiany 
w funkcji st ężenia badania. Dane s ą analizowane przy u życiu właści­
wych metod statystycznych (np. analiza probitowa itd.) w celu obliczenia nachylenia krzywych i EC
 50 przy 95 % poziomie ufno ści 
(p = 0,05) (7)(8).  
W przypadku gdy standardowe metody obliczania EC  50 nie mają 
zastosowania do otrzymanych danych, do oszacowania EC  50 należy 
zastosowa ć najwyższe stężenie niepowoduj ące unieruchomienia 
i najniższe stężenie powoduj ące 100 % unieruchomienia (warto ść 
tę oblicza si ę jako średnią geometryczn ą tych dwóch st ężeń). 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące dane:  
Badana substancja:  
— cechy fizyczne i istotne w łaściwości fizykochemiczne,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— chemiczne dane identyfikacyjne, w tym czysto ść. 
Badany gatunek:  
— źródło i gatunek  Daphnia , dostawca (je śli znany) i zastosowane 
warunki hodowli (w tym źródło, rodzaj i ilo ść pożywienia, cz ęs­
totliwość karmienia).  
Warunki badania:  
— opis naczy ń do badania: typ naczy ń, objętość roztworu, liczba 
rozwielitek w naczyniu do badania, liczba naczy ń do badania 
(powtórze ń) dla każdego stężenia,  
— metody przygotowania roztworu podstawowego i badanych 
roztworów, w tym zastosowanie wszelkich rozpuszczalników lub środków dysperguj ących,
 
— szczegó łowe informacje o wodzie do rozcie ńczania: źródło 
i właściwości wody (pH, twardo ść, stosunek Ca/Mg, stosunek 
Na/K, zasadowo ść, przewodno ść itd.); sk ład regenerowanej 
wody, jeśli taka jest stosowana,  
— warunki inkubacji: temperatura, nat ężenie i cykliczno ść oświetle­
nia, rozpuszczony tlen, pH itd.  
Wyniki:  
— liczba i procent rozwielitek, które by ły unieruchomione lub 
wykazywa ły jakiekolwiek objawy niekorzystnego dzia łania 
substancji (w tym zachowanie odbiegaj ące od normy) 
w roztworach kontrolnych i badanych przy okazji ka żdej obser ­
wacji, oraz opis charakteru obserwowanych zmian,  
— wyniki i dane badania przeprowadzonego z substancja odniesie ­
nia, jeśli takie dane s ą dostępne, 
— nominalne st ężenia badania i wynik wszystkich analiz s łużących 
określeniu stężenia badanej substancji w naczyniach do badania; 
należy również przedstawi ć informacje o wydajno ści stosowanej 
metody oraz dok ładności oznaczania,  
— wyniki wszystkich pomiarów parametrów fizykochemicznych 
temperatury, pH i zawarto ści rozpuszczonego tlenu przeprowa ­
dzonych w czasie badania,  
— EC  50 po 48 godzinach dla unieruchomienia wraz z przedzia łami 
ufności i wykresy dopasowanego modelu u żytego do oblicze ń, 
nachylenia krzywych odpowiedzi na dawk ę i ich błąd standar ­
dowy; procedury statystyczne u żyte do okre ślenia EC  50 (dane dla 
unieruchomienia po 24 godzinach powinny tak że być przedsta ­
wione, je żeli były rejestrowane),  
— wyjaśnienie wszelkich odst ępstw od metody badania oraz 
określenie czy te odst ępstwa mia ły wpływ na wyniki bada ń. 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality – Determination of the inhibi ­
tion of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, Crus ­
tacea) – Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines – Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. Nr. 23. Paris 2000.
 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study 
of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  Daph­
nia. 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211:  
Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 1998.  
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. 
Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 – American Society 
for Testing and Materials. Pp. 65–84.  
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3  rd 
ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
ZAŁĄCZNIK 1  
NIEKTÓRE W ŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNE NADAJ ĄCEJ SI Ę DO 
BADAŃ WODY DO ROZCIE ŃCZANIA  
Substancja St ężenie 
Pył zawieszony < 20 mg/l 
Całkowity w ęgiel organiczny < 2 mg/l 
Amoniak niezjonizowany < 1 μg/l 
Chlor resztkowy < 10 μg/l 
Pestycydy fosforoorganiczne razem < 50 ng/l Pestycydy grupy w ęglowodorów chlorowanych razem plus 
polichlorowane bifenyle < 50 ng/l 
Całkowity chlor organiczny < 25 ng/1
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
ZAŁĄCZNIK 2  
PRZYKŁADY WŁAŚCIWEJ REGENEROWANEJ WODY DO BADANIA  
Woda do badania ISO (1)  
Roztwory podstawowe (pojedyncza substancja) W celu przygotowania 
zregenerowanej wody doda ć 
następujące objętości 
roztworów podstawowych do 1 
litra wody (*) Substancja Ilość dodawana do 1 litra 
wody (*)  
Chlorek wapnia 
CaCl  2 , 2H  2 O 11,76 g 25 ml 
Siarczan magnezu 
MgSO  4 , 7H  2 O 4,93 g 25 ml 
Wodorow ęglan sodu 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Chlorek potasu 
KC1 0,23 g 25 ml  
(*) Woda o odpowiedniej czysto ści, np. dejonizowana, destylowana lub poddana osmozie 
odwróconej, najlepiej maj ąca przewodno ść nieprzekraczaj ącą 10 μS.cm  -1 . 
Pożywki Elendta M7 i M4  
Aklimatyzacja do po żywek Elendta M4 i M7  
W niektórych laboratoriach napotkano trudno ści przy przenoszeniu rozwielitek 
do pożywek M4 i M7. Osi ągnięto jednak pewne pomy ślne wyniki, stosuj ąc 
aklimatyzacj ę stopniow ą, tzn. przenosz ąc rozwielitki z w łasnej pożywki do 
30 % roztworu, nast ępnie do 60 %, a pó źniej 100 % roztworu Elendta. 
Konieczne mo że być stosowanie okresu aklimatyzacji nawet przez miesi ąc. 
Przygotowanie  
Pierwiastki śladowe  
Najpierw przygotowuje si ę osobne roztwory podstawowe (I) poszczególnych 
pierwiastków śladowych w wodzie o odpowiedniej czysto ści, np. dejonizowanej, 
destylowanej lub poddanej osmozie odwróconej. Z poszczególnych roztworów podstawowych (I) przygotowywany jest drugi, pojedynczy, roztwór podstawowy 
(II), który zawiera wszystkie elementy śladowe (roztwór łączony), tj.:
 
Roztwor podstawowy 
(pojedyncza substancja) Ilość dodana do wody 
(mg/l) Stężenie (odnosz ące się 
do pożywki M4) W celu przygotowania kombinowanego roztworu 
II dodaċ następujące ilości roztworu 
podstawowego I do wody (ml/1) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000-krotne 1,0 0,25 
MnCl  2 .4H  2 O 7 210 20 000-krotne 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000-krotne 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Roztwor podstawowy 
(pojedyncza substancja) Ilość dodana do wody 
(mg/l) Stężenie (odnosz ące się 
do pożywki M4) W celu przygotowania kombinowanego roztworu 
II dodaċ następujące ilości roztworu 
podstawowego I do wody (ml/1) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000-krotne 1,0 0,25 
SrCl  2 .6H  2 O 3 040 20 000-krotne 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000-krotne 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 1 230 20 000-krotne 1,0 0,25 
CuCl  2 .2H  2 O 335 20 000-krotne 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000-krotne 1,0 1,0 
CoCl  2 .6H  2 O 200 20 000-krotne 1,0 1,0 
KI 65 20 000-krotne 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000-krotne 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000-krotne 1,0 1,0 
Na 2 EDTA.2H  2 O 5 000 2 000-krotne — — 
FeS0  4 .7H  2 O 1 991 2 000-krotne — — 
Zarowno roztwor Na 2 EDTA jak i FeSO  4 są przygotowywane oddzielnie, zlevane 
razem i niezw łocznie umieszczane w autoklawie. 
Daje to: 
roztwor 21 Fe-EDT 1 000-krotne 20,0 5,0  
Pożywki M4 i M7  
Pożywki M4 i M7 s ą przygotowywane przy u życiu roztworu podstawowego II, 
makroskładników i witamin w nast ępujący sposób:  
Ilość dodana do wody 
(mg/l) Stężenie (odnosz ące się 
do pożywki M4) Ilość roztworu p odstawowego II dodanego w celu 
otrzymania po żywkki (ml/1) 
M4 M7  
Roztwor podstawowy II 
(połączone pierwiastki 
śladowe) 20-krotne 50 50 
Roztwory podstawowe 
makroskładników (poje ­
dyncza substancja) 
CaCl  2 · 2H  2 O 293 800 1 000-krotne 1,0 1,0 
MgS0  4 · 7H  2 O 246 600 2 000-krotne 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000-krotne 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000-krotne 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000-krotne 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000-krotne 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000-krotne 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000-krotne 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Ilość dodana do wody 
(mg/l) Stężenie (odnosz ące się 
do pożywki M4) Ilość roztworu p odstawowego II dodanego w celu 
otrzymania po żywkki (ml/1) 
M4 M7  
Łączony roztwór podsta ­
wowy witamin — 10 000-krotne 0,1 0,1 
Łączony roztwor podstawowy witamin przygotowuje si ę przez dodanie 3 witamin 
do 1 litra wody, jak przedstawiono poni żej. 
Hydrochlorek tiaminy 750 10 000-krotne 
Cyjanokobalami na (B  12 ) 10 10 000-krotne 
Biotyna 7,5 10 000-krotne  
Roztwór podstawowy z łożony z witamin jest przechowywany zamro żony 
w niewielkich alikwotach. Witaminy s ą dodawane do po żywki na krótko przed 
użyciem.  
UWAGA: Aby unikn ąć wytrącania się soli w czasie przygotowywania 
kompletnych po żywek, doda ć alikwoty roztworów podstawowych 
do około 500–800 ml dejonizowanej wody, a nast ępnie uzupe łnić 
do 1 litra.  
UWAGA: Informacje o pierwszej publikacji na temat po żywki M4 mo żna 
znaleźć w pracy Elendt B.P. (1990). Selenium deficiency in Crusta ­
cea; an ultrastructual approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. BADANIE INHIBICJI WZROSTU S ŁODKOWODNYCH 
GLONÓW I CYJANOBAKTERII  
1. METODA  
Niniejsza metoda odpowiada OECD TG 201 (2006) (1).  
1.1. WST ĘP 
Metody badawcze s ą okresowo przegl ądane i aktualizowane 
w świetle post ępu naukowego. Metoda badawcza C.3 wymaga ła 
korekty, tak by obj ąć dodatkowe gatunki i spe łnić wymagania 
w zakresie oceny zagro żenia oraz klasyfikacji substancji chemicz ­
nych. Korekty dokonano na podstawie szerokich do świadczeń prak­
tycznych, post ępu naukowego w dziedzinie bada ń nad toksyczno ścią 
glonów oraz rozleg łego zastosowania regulacyjnego, które nast ąpiło 
od czasu pierwotnego przyj ęcia. 
1.2. DEFINICJE  
Do celów niniejszej metody u żyto następujących definicji i skrótów:  
Biomasa : jest to ci ężar suchej materii żywej obecnej w populacji, 
wyrażony na obj ętość; np. mg glonów/litr badanego roztworu. 
Zwykle „biomas ę” określa się w postaci masy, lecz w niniejszym 
badaniu s łowo to użyte jest w odniesieniu do masy przypadaj ącej na 
objętość. Ponadto w niniejszym badaniu zwykle mierzy si ę również 
surogaty biomasy, takie jak liczba komórek, fluorescencja, itp. i przez to okre ślenie „biomasa” odnosi si ę także do tych surogato ­
wych miar.
 
Współczynnik zmienno ści: jest bezwymiarow ą miarą zmienno ści 
parametru, okre śloną jako stosunek odchylenia standardowego do 
średniej. Mo że on równie ż być wyrażony jako warto ść procentowa. 
Średni wspó łczynnik zmienno ści średniej w łaściwej szybko ści 
wzrostu w replikatowych kulturach kontrolnych nale ży obliczy ć 
w następujący sposób:  
1. Obliczy ć % CV (wspó łczynnik zmienno ści) średniej w łaściwej 
szybkości wzrostu z szybko ści wzrostu dla odno śnego replikatu.  
2. Obliczy ć wartość średnią ze wszystkich warto ści obliczonych 
w punkcie 1, otrzymuj ąc średni wspó łczynnik zmienno ści 
właściwej szybko ści wzrostu dla poszczególnych dni/odcinków 
w replikatowych kulturach kontrolnych.  
EC x : jest stężeniem substancji testowej rozpuszczonej w po żywce, 
powodującym zmniejszenie wzrostu badanego organizmu o x % (np. 
50 %) w danym okresie ekspozycji (który nale ży wyraźnie podać, 
jeśli odbiega od pe łnego lub normalnego czasu trwania badania). 
Aby w sposób jednoznaczny oznaczy ć wartość EC otrzyman ą 
z szybkości wzrostu lub z uzysku, u żywa się symboli, odpowiednio, 
„E r C” i „E  y C”. 
Pożywka wzrostowa : jest to kompletne syntetyczne pod łoże hodow­
lane, w którym wzrastaj ą glony, gdy s ą wystawione na dzia łanie 
substancji testowej. Substancja testowa zwykle jest rozpuszczona w pożywce.
 
Szybkość wzrostu  (średnia w łaściwa szybko ść wzrostu ): jest to 
logarytmiczny wzrost biomasy w ci ągu okresu ekspozycji.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Najmniejszy obserwowany poziom st ężenia (LOEC) : jest to 
najniższe badane st ężenie, przy którym zostaje zaobserwowane, że 
substancja ma statystycznie istotny redukuj ący wpływ na wzrost 
(przy p < 0,05) w porównaniu do kultury kontrolnej, w danym okresie ekspozycji. Jednak że wszystkie badane st ężenia powy żej 
LOEC musz ą mieć szkodliwy wp ływ równy lub wi ększy niż te, 
które są obserwowane przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mog ą 
być spełnione, nale ży podać pełne wyjaśnienie, w jaki sposób LOEC 
(a stąd NOEC) zosta ło wybrane.
 
Nieobserwowany wp ływ stężenia (NOEC) : jest to st ężenie 
bezpośrednio poni żej LOEC.  
Zmienna odpowiedzi : jest to zmienna dla oszacowania toksyczno ści 
uzyskana z dowolnych zmierzonych parametrów opisuj ących 
biomasę za pomoc ą różnych metod obliczania. W przypadku niniej ­
szej metody szybko ści wzrostu i uzysk s ą zmiennymi odpowiedzi 
uzyskanymi z pomiaru biomasy bezpo średnio lub pomiaru dowol ­
nego ze wspomnianych surogatów.  
Właściwa szybko ść wzrostu : jest to zmienna odpowiedzi okre ślona 
jako iloraz ró żnicy logarytmów naturalnych parametru obserwacji (w 
niniejszej metodzie badawczej — biomasy) przez odpowiedni okres.  
Uzysk : jest to warto ść zmiennej pomiarowej na ko ńcu okresu 
ekspozycji minus warto ść zmiennej pomiarowej na pocz ątku okresu 
ekspozycji, wyra żająca przyrost biomasy w ci ągu badania.  
1.3. STOSOWALNO ŚĆ BADANIA  
Niniejszą metodę badawczą najłatwiej stosuje si ę do substancji rozpusz ­
czalnych w wodzie, które — w warunkach badania — prawdopodobnie pozostaną w wodzie. Dla badania substancji lotnych, silnie adsorbuj ­ 
ących, zabarwionych lub maj ących nisk ą rozpuszczalno ść w wodzie, 
bądź substancji, które mog ą wpływać na dostępność składników pokar ­
mowych lub minera łów w pożywce, mog ą być wymagane pewne mody ­
fikacje opisywanej procedury (np. uk ład zamkni ęty, specjalne przygoto ­
wanie naczy ń testowych). Wskazówki dotycz ące niektórych stosownych 
modyfikacji podano w (2), (3) i (4).
 
1.4. ZASADA BADANIA  
Celem niniejszego badania jest okre ślenie wpływu danej substancji 
na wzrost s łodkowodnych mikroglonów i/lub cyjanobakterii. 
Wykładniczo wzrastaj ące badane organizmy wystawia si ę na dzia­ 
łanie substancji testowej w hodowlach statycznych na okres 
wynoszący zwykle 72 godziny. Pomimo stosunkowo krótkiego 
czasu trwania badania, skutki mo żna ocenić na przestrzeni kilku 
pokoleń. 
Odpowied ź układu polega na ograniczeniu wzrostu w szeregu kultur 
glonów (badanych jednostek) wystawionych na dzia łanie różnych 
stężeń substancji testowej. Odpowied ź ocenia si ę w funkcji st ężenia 
w stosunku do średniego wzrostu replikatu, kultur kontrolnych 
niepoddawanych ekspozycji. Dla pe łnego wyra żenia odpowiedzi 
układu na toksyczne oddzia ływania (optymalnej czu łości), kulturom 
umożliwia się nieograniczony wyk ładniczy wzrost w dostatecznych 
warunkach od żywczych i przy sta łym świetle przez wystarczaj ący 
czas, aby zmierzy ć zmniejszenie w łaściwej szybko ści wzrostu.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
Wzrost i inhibicj ę wzrostu okre śla się ilościowo poprzez pomiary 
biomasy glonów w funkcji czasu. Biomas ę glonów okre śla się 
jako ciężar masy suchej przypadaj ący na obj ętość, np. mg glonów/ ­
litr roztworu testowego. Jednak że ciężar masy suchej jest trudny do 
zmierzenia i dlatego u żywa się parametrów zast ępczych. Spo śród 
tych surogatów najcz ęściej używa się liczby komórek. Do innych 
zastępczych parametrów nale ży objętość komórek, fluorescencja, 
gęstość optyczna itp. Nale ży znać współczynnik przeliczenia 
pomiędzy mierzonym parametrem zast ępczym a biomas ą. 
Punktem ko ńcowym badania jest inhibicja wzrostu wyra żona jako 
logarytmiczny przyrost biomasy ( średnia w łaściwa szybko ść 
wzrostu) w ci ągu okresu ekspozycji. Ze średnich w łaściwych szyb ­
kości wzrostu zarejestrowanych w serii roztworów testowych 
wyznacza si ę stężenie powoduj ące inhibicj ę wzrostu o okre ślone 
x % (np. 50 %) i wyra ża się jako E  r C x (np. E  r C 50 ). 
Do celów stosowania tej metody w ramach unijnego prawodawstwa, 
z powodów opisanych w pkt 2.2 poni żej, obliczanie wyników 
powinno opiera ć się na średniej w łaściwej szybko ści wzrostu. Dodat ­
kową zmienną odpowiedzi u żytą w niniejszej metodzie badawczej 
jest uzysk, który mo że być wymagany do spe łnienia okre ślonych 
wymogów regulacyjnych w niektórych krajach. Jest on okre ślony 
jako biomasa na ko ńcu okresu ekspozycji minus biomasa na 
początku okresu ekspozycji. Z uzysku zarejestrowanego w serii 
roztworów testowych oblicza si ę stężenie powoduj ące inhibicj ę 
uzysku o okre ślone x % (np. 50 %) i wyra ża się jako E  y C x (np. 
E y C 50 ). 
Ponadto, mo żna statystycznie wyznaczy ć najmniejszy obserwowany 
poziom st ężenia (LOEC) oraz nieobserwowany wp ływ stężenia 
(NOEC).  
1.5. INFORMACJE O SUBSTANCJI TESTOWEJ  
Informacje o substancji testowej, które mog ą być przydatne przy 
ustalaniu warunków badania, obejmuj ą wzór strukturalny, czysto ść, 
trwałość w warunkach badania, w łasności pochłaniania światła, pKa 
oraz wyniki bada ń przemiany, w tym podatno ści na rozk ład biolo­
giczny w wodzie.  
Należy znać rozpuszczalno ść w wodzie, wspó łczynnik podzia łu 
oktanol/woda (P  ow ) oraz ci śnienie pary substancji testowej 
i powinna by ć dostępna potwierdzona metoda kwantyfikacji 
substancji w roztworach testowych z podan ą wydajno ścią odzysku 
i granicą wykrywalno ści. 
1.6. SUBSTANCJA ODNIESIENIA  
Jako sposób sprawdzenia procedury badania, mo żna zbadać substan­
cję(-e) odniesienia, tak ą jak 3,5-dichlorofenol stosowany 
w międzynarodowej próbie pier ścieniowej (4). Jako substancji odnie ­
sienia dla zielenic mo żna równie ż użyć dwuchromianu potasowego. 
Pożądane jest zbadanie substancji odniesienia co najmniej dwa razy 
w roku.  
1.7. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ło ważne muszą być spełnione nast ępujące kryteria 
wykonania:  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— Biomasa w kulturach kontrolnych powinna wzrosn ąć wykład­
niczo o czynnik wynosz ący co najmniej 16 w ci ągu 72-godzin ­
nego okresu badania. Odpowiada to w łaściwej szybko ści 
wzrostu wynosz ącej 0,92 dzie ń –1 . Dla najcz ęściej używanych 
gatunków, szybko ść wzrostu jest zazwyczaj znacznie wy ższa 
(zob. dodatek 1). Kryterium to mo że nie by ć spełnione, gdy 
użyty jest gatunek, który wzrasta wolniej ni ż wymienione 
w dodatku 1. W takim przypadku okres badania mo żna przedłu­ 
żyć, tak aby uzyska ć co najmniej 16-krotny wzrost w kulturach 
kontrolnych, przy czym wzrost musi by ć wykładniczy w ci ągu 
całego okresu badania. Okres badania mo żna skróci ć do co 
najmniej 48 godz., aby utrzyma ć nieograniczony wyk ładniczy 
wzrost w ci ągu badania, o ile osi ągnięta zostanie krotno ść 
wynosząca minimum 16.  
— Średni wspó łczynnik zmienno ści dla w łaściwych szybko ści 
wzrostu wed ług poszczególnych odcinków (dni 0–1, 1–2 i 2–3, 
dla 72-godzinnych bada ń) w kulturach kontrolnych (zob. sekcja 
1.2 pod has łem „wspó łczynnik zmienno ści”) nie mo że przekra ­
czać 35 %. Obliczanie w łaściwej szybko ści wzrostu wed ług 
poszczególnych odcinków podano w akapicie drugim sekcji 
2.2.1. Kryterium to stosuje si ę do średniej warto ści współczyn­
ników zmienno ści obliczonej dla replikatowych kultur kontro ­
lnych.  
— Wspó łczynnik zmienno ści średnich w łaściwych szybko ści 
wzrostu w ci ągu całego okresu badania w replikatowych kultu ­
rach kontrolnych nie mo że przekroczy ć 7 % w badaniach 
z udziałem Pseudokirchneriella subcapitata  i Desmodesmus 
subspicatus . Dla innych, rzadziej badanych gatunków, warto ść 
ta nie powinna przekracza ć 10 %.  
1.8. OPIS METODY  
1.8.1.  Aparatura  
Użyte do badania naczynia oraz inne urz ądzenia, które b ędą się 
stykać z roztworami testowymi, powinny by ć wykonane w ca łości 
ze szkła lub innego chemicznie oboj ętnego materia łu. Sprzęt należy 
gruntownie umy ć w celu zapewnienia, że jakiekolwiek zanieczysz ­
czenia organiczne lub nieorganicznie nie b ędą zakłócać wzrostu 
glonów ani sk ładu roztworów testowych.  
Naczyniami u żywanymi do badania s ą zwykle kolby szklane 
o wymiarach pozwalaj ących na uzyskanie dostatecznej obj ętości 
kultur do pomiarów podczas badania oraz nale żyte przenikanie 
masy CO  2 z atmosfery (zob. akapit drugi w sekcji 1.8.9). Nale ży 
zwrócić uwagę, że objętość cieczy musi by ć wystarczaj ąca dla ozna ­
czeń analitycznych (zob. akapit pi ąty w sekcji 1.8.11).  
Ponadto wymagane b ędą niektóre lub wszystkie spo śród następuj­ 
ących urządzeń: 
— Urządzenia do hodowli kultur: zalecana jest kabina lub komora, 
w której wybrana temperatura inkubacji mo że być utrzymywana 
w granicach ± 2 °C.  
— Przyrz ądy do pomiaru światła: należy zwróci ć uwagę, że na 
mierzoną wartość będzie mieć wpływ metoda pomiaru nat ężenia 
światła, w szczególno ści typ receptora (kolektora). Pomiary 
należy wykonywa ć najlepiej przy u życiu receptora sferycznego 
(4 π) (który reaguje na bezpo średnie i odbite światło ze wszyst ­
kich kątów powy żej i poniżej płaszczyzny pomiaru) lub receptora 
2 π (który reaguje na światło ze wszystkich k ątów powy żej 
płaszczyzny pomiaru).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Aparatura do okre ślania biomasy glonów. Liczb ę komórek, która 
jest najcz ęściej stosowanym parametrem zast ępczym dla biomasy 
glonów, mo żna wyznaczy ć za pomoc ą elektronicznego licznika 
cząstek, mikroskopu z komor ą do liczenia oraz cytometru prze ­
pływowego. Inne surogaty biomasy mo żna mierzy ć przy pomocy 
cytometru, fluorymetru, spektrofotometru lub kolorymetru. 
Pomocny w obliczeniu jest wspó łczynnik przeliczeniowy 
wiążący liczbę komórek z ci ężarem masy suchej. Aby zapewni ć 
użyteczne pomiary przy niskich st ężeniach biomasy, gdy u żywa 
się spektrofotometru, mo że być niezbędne użycie kuwet 
o długości ścieżki światła co najmniej 4 cm.  
1.8.2.  Badane organizmy  
Można użyć kilku gatunków nieprzy łączonych mikroglonów 
i cyjanobakterii. Wykazano, że gdy stosuje si ę procedur ę badania 
określoną w niniejszej metodzie badawczej, to odpowiednie s ą 
szczepy wymienione w dodatku 1.  
Jeżeli użyte są inne gatunki, to nale ży podać szczep i/lub pochodze ­
nie. Nale ży potwierdzi ć, że można utrzyma ć wykładniczy wzrost 
wybranych do badania glonów w ci ągu całego okresu badania 
w panujących warunkach.  
1.8.3.  Po żywka wzrostowa  
Zaleca się dwie alternatywne po żywki wzrostowe, po żywkę OECD 
i pożywkę AAP. Sk łady tych po żywek przedstawiono w dodatku 
2. Należy zwróci ć uwagę, że wartość pH i zdolno ść buforująca 
(regulowanie wzrostu pH) tych dwu po żywek są różne. Dlatego 
wyniki bada ń mogą być różne, w zale żności od użytej pożywki, 
zwłaszcza gdy badane s ą substancje jonizuj ące się. 
Do niektórych celów, np. gdy bada si ę metale i czynniki chelatuj ące 
lub gdy wykonuje si ę badanie przy ró żnych warto ściach pH, mo że 
być konieczna modyfikacja po żywki wzrostowej. U życie zmodyfiko ­
wanej po żywki nale ży szczegó łowo opisa ć i uzasadni ć (3)(4).  
1.8.4.  Stężenie pocz ątkowej biomasy  
Początkowa biomasa w badanych kulturach musi by ć taka sama 
i dostatecznie ma ła, aby umo żliwić wykładniczy wzrost w ci ągu 
całego okresu inkubacji bez ryzyka wyczerpania sk ładnika pokarmo ­
wego. Pocz ątkowa biomasa nie mo że przekracza ć 0,5 mg/l 
w przeliczeniu na mas ę suchą. Zalecane s ą następujące początkowe 
skupienia komórek:  
Pseudokirchneriella subcapitata:  5 × 10  3 –10  4 komórek/ml  
Desmodesmus subspicatus  2–5 × 10  3 komórek/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 komórek/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 komórek/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 –10  5 komórek/ml  
1.8.5.  Stężenia substancji testowej  
Zakres st ężenia, w którym mog ą wystąpić wpływy, można wyzna ­
czyć na podstawie wyników prób okre ślania zakresu. Dla ko ńco­
wego definitywnego badania nale ży wybrać co najmniej pi ęć stężeń 
uporządkowanych w szereg geometryczny o wspó łczynniku nieprze ­
kraczającym 3,2. Dla substancji wykazuj ących płaską krzywą odpo­
wiedzi st ężenia może być uzasadniony wi ększy wspó łczynnik. 
Szereg st ężeń powinien najlepiej obejmowa ć zakres powoduj ący 
inhibicję szybkości wzrostu glonów o 5–75 %.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Replikaty i próby kontrolne  
Plan badania powinien obejmowa ć trzy replikaty przy ka żdym 
stężeniu testowym. Je żeli wyznaczenie NOEC nie jest wymagane, 
to plan badania mo żna zmieni ć, zwiększając liczbę stężeń 
i zmniejszaj ąc liczbę replikatów przypadaj ących na st ężenie. Liczba 
replikatów kontrolnych musi wynosi ć co najmniej trzy, a najlepiej 
powinna by ć dwukrotnie wi ększa od liczby replikatów u żytych dla 
każdego stężenia testowego.  
Do analitycznych oznacze ń stężeń substancji testowej mo żna sporz­ 
ądzić oddzielny zestaw roztworów testowych (zob. akapit czwarty 
i szósty w sekcji 1.8.11).  
Gdy do rozpuszczenia substancji testowej u żyty jest rozpuszczalnik, 
to w planie badania nale ży ująć dodatkowe próby kontrolne zawie ­
rające rozpuszczalnik o tym samym st ężeniu, co w badanych kultu ­
rach.  
1.8.7.  Przygotowanie kultury inokulum  
W celu przystosowania badanych glonów do warunków badania oraz 
zapewnienia, że znajduj ą się one w fazie wyk ładniczego wzrostu, 
gdy są użyte do inokulacji roztworów testowych, kultur ę inokulum 
w pożywce próbnej przygotowuje si ę 2–4 dni przez rozpocz ęciem 
badania. Biomas ę glonów nale ży skorygowa ć w celu umo żliwienia, 
aby w kulturze inokulum panowa ł wzrost wyk ładniczy do czasu 
rozpoczęcia badania. Kultur ę inokulum inkubuje si ę w tym samych 
warunkach, co kultury próbne. Nale ży zmierzy ć przyrost biomasy 
w kulturze inokulum, aby zapewni ć, że wzrost zawiera si ę 
w normalnym zakresie dla badanego szczepu w warunkach hodo ­
wania kultury. Przyk ład procedury dotycz ącej hodowania kultury 
glonów opisano w dodatku 3. Aby unikn ąć synchronicznego 
podziału komórek podczas badania, mo że być wymagany drugi 
krok reprodukowania kultury inokulum.  
1.8.8.  Sporz ądzenie roztworów testowych  
Wszystkie roztwory testowe musz ą zawierać takie same st ężenia 
pożywki wzrostowej i pocz ątkowej biomasy badanych glonów. 
Roztwory testowe o wybranych st ężeniach zwykle sporz ądza się 
przez zmieszanie roztworu podstawowego substancji testowej z pożywką wzrostow ą i kulturą inokulacyjn ą. Roztworzy podstawowe 
zwykle sporz ądza się rozpuszczaj ąc substancj ę testową w pożywce.
 
Jako nośników służących do dodania substancji o ma łej rozpusz ­
czalności w wodzie do po żywki mo żna użyć rozpuszczalników, 
np. acetonu, alkoholu t-butylowego i dwumetyloformamidu (2)(3). Stężenie rozpuszczalnika nie powinno przekracza ć 100 μl/l i takie 
samo stężenie rozpuszczalnika nale ży dodać do wszystkich kultur 
(wraz z kontrolnymi) w badanej serii.
 
1.8.9.  Inkubacja  
Przykryć naczynia badawcze korkami przepuszczaj ącymi powietrze. 
Naczynia wstrz ąsa się i umieszcza w aparacie do hodowli kultur. 
Podczas badania niezb ędne jest utrzymanie glonów w zawiesinie 
i umożliwienie wnikania CO  2 . W tym celu nale ży stosowa ć ciągłe 
wstrząsanie lub mieszanie. Kultury nale ży utrzymywa ć w przedziale 
temperatury 21–24 °C, regulowanej w granicach ± 2 °C. Dla gatunków innych ni ż wymienione w dodatku 1, np. gatunków tropi ­
kalnych, odpowiednie mog ą być wyższe temperatury, pod warun ­
kiem że spełnione będą kryteria wa żności. Kolby zaleca si ę umieścić 
losowo i codziennie zmienia ć ich położenie w inkubatorze.
 ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
pH pożywki kontrolnej nie powinno wzrosn ąć w trakcie badania 
o więcej niż 1,5 jednostek. W przypadku metali i zwi ązków, które 
częściowo jonizuj ą się przy pH w pobli żu pH badania mo że być 
konieczne ograniczenie dryftu pH, aby otrzyma ć odtwarzalne oraz 
dobrze okre ślone wyniki. Dryft < 0,5 jednostek pH jest technicznie 
możliwy i mo że być osiągnięty przez zapewnienie nale żytej szyb ­
kości wnikania masy CO  2 z otaczaj ącego powietrza do roztworu 
testowego, np. przez zwi ększanie szybko ści wstrząsania. Inn ą możli­
wością jest zmniejszenie zapotrzebowania na CO  2 przez zmniej ­
szenie pocz ątkowej biomasy lub skrócenie czasu trwania badania.  
Powierzchnia, na której nast ępuje inkubacja kultur, powinna otrzy ­
mywać ciągłe, równomierne o świetlenie np. typu „ch łodnego światła 
białego” lub „ światła dziennego”. Szczepy glonów i cyjanobakterii 
różnią się pod wzgl ędem swojego zapotrzebowania na światło. Natę­ 
żenie światła należy dobrać w taki sposób, aby odpowiada ło ono orga ­
nizmowi wybranemu do badania. Dla zalecanych gatunków zielonych 
glonów nat ężenie światła na poziomie roztworów testowych wybiera si ę 
z zakresu 60–120 μE·m  –2 ·s –1 , mierząc w skutecznym dla fotosyntezy 
przedziale d ługości fali 400–700 nm przy u życiu odpowiedniego recep ­
tora. Niektóre gatunki, w szczególno ści Anabaena flos-aquae , rosną 
dobrze przy mniejszych nat ężeniach światła, a przy wy ższych mog ą 
ulec uszkodzeniu. Dla takich gatunków nale ży wybrać średnie nat ężenie 
światła w zakresie 40–60 μE·m  –2 ·s –1 . (Dla przyrz ądów do pomiaru 
światła wykalibrowanych w luksach, zalecanemu nat ężeniu światła 
60–120 μE·m  –2 ·s –1 odpowiada w przybli żeniu równowa żny zakres 
4440–8880 luksów dla ch łodnego światła białego). Nat ężenie światła 
nie powinno waha ć się bardziej ni ż ± 15 % od średniego nat ężenia 
światła na powierzchni inkubacji.  
1.8.10.  Czas trwania badania  
Badanie zwykle trwa 72 godzin. Jednak że, można zastosowa ć 
krótsze lub d łuższe czasy trwania badania, pod warunkiem że 
mogą być spełnione kryteria wa żności podane w sekcji 1.7.  
1.8.11.  Pomiary i oznaczenia analityczne  
Biomasę glonów w ka żdej kolbie okre śla się co najmniej raz 
dziennie podczas okresu badania. Je żeli pomiary dokonywane s ą 
na małych objętościach pobranych z roztworu testowego za pomoc ą 
pipety, to nie nale ży wprowadza ć ich z powrotem do roztworu.  
Pomiar biomasy wykonuje si ę poprzez r ęczne zliczanie komórek 
przy pomocy mikroskopu lub elektronicznego licznika cz ąstek 
(określając liczbę komórek lub bioobj ętość). Można zastosowa ć 
alternatywne techniki, np. cytometri ę przepływową, fluorescencj ę 
chlorofilu  in vitro  lub in vivo  (6) (7) lub g ęstość optyczną, pod 
warunkiem że można wykaza ć zadowalaj ącą korelacj ę z biomas ą 
w całym zakresie biomasy wyst ępującym w badaniu.  
pH roztworów mierzy si ę na początku i na ko ńcu badania.  
Jeśli dostępna jest procedura analityczna dla oznaczania badanej 
substancji w zastosowanym zakresie st ężenia, roztwory testowe 
należy analizowa ć celem sprawdzenia pocz ątkowych st ężeń 
i utrzymania st ężeń ekspozycji podczas badania.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
W przypadku gdy jest prawdopodobne, że stężenie będą w trakcie 
badania odbiega ć od nominalnych warto ści o mniej ni ż 20 %, mo że 
być wystarczaj ąca analiza st ężenia substancji testowej na pocz ątku 
i końcu badania niskiego i wysokiego st ężenia testowego oraz 
stężenia około spodziewanego EC  50 . Gdy natomiast jest ma ło praw­
dopodobne, że stężenia pozostan ą w granicach 80–120 % nominalnej 
wartości, to zaleca si ę analizę wszystkich st ężeń testowych na 
początku i końcu badania. Dla substancji lotnych, nietrwa łych lub 
silnie adsorbuj ących zaleca si ę dodatkowe pobieranie próbek do 
analizy w odst ępach 24-godzinnych w ci ągu okresu ekspozycji, 
aby lepiej okre ślić stratę substancji testowej. Dla tych substancji 
potrzebne b ędą dodatkowe replikaty. We wszystkich przypadkach 
oznaczenie st ężeń substancji testowej musi by ć wykonywane tylko 
na jednym naczyniu z replikatem przy ka żdym stężeniu testowym 
(lub na zawarto ściach naczy ń połączonych wed ług replikatu).  
Pożywkę testową sporządzoną specjalnie do analizy st ężeń 
ekspozycji podczas badania nale ży potraktowa ć identycznie, jak 
pożywki użyte do badania, tzn. nale ży je zaszczepi ć glonami 
i inkubowa ć w identycznych warunkach. Je żeli wymagana jest 
analiza st ężenia rozpuszczonej substancji testowej, to mo że być 
konieczne oddzielenie glonów od po żywki. Oddzielenia nale ży 
dokonać najlepiej przez odwirowanie przy ma łej sile grawitacji, 
wystarczaj ącej do osadzenia si ę glonów.  
Jeśli istnieją dowody, że stężenie substancji testowej zosta ło zado­
walająco utrzymane w granicach ± 20 % nominalnego lub zmierzo ­
nego pocz ątkowego st ężenia w ci ągu całego badania, to analiz ę 
wyników mo żna oprze ć na nominalnych lub zmierzonych 
wartościach pocz ątkowych. Je śli odchylenie od nominalnego lub 
zmierzonego pocz ątkowego st ężenia jest wi ększe niż ± 20 %, to 
analizę wyników nale ży oprzeć na średnim geometrycznym st ężeniu 
w ciągu ekspozycji lub na modelach opisuj ących spadek st ężenia 
substancji testowej (3)(8).  
Badanie inhibicji wzrostu glonów odbywa si ę w bardziej dyna ­
micznym uk ładzie próbnym ni ż większość innych krótkookresowych 
badań toksyczno ści wodnej. W rezultacie rzeczywiste st ężenia 
ekspozycji mog ą być trudne do okre ślenia, zwłaszcza dla substancji 
adsorbujących badanych w niskich st ężeniach. W takich przypadkach 
zniknięcie substancji z roztworu przez adsorpcj ę do rosnącej masy 
glonów nie oznacza, że jest ona utracona z badanego uk ładu. 
Podczas analizowania wyniku badania nale ży sprawdzi ć, czy zmniej ­
szeniu st ężenia substancji testowej w trakcie badania towarzyszy 
zmniejszenie inhibicji wzrostu. Je żeli tak si ę dzieje, to mo żna 
rozważyć zastosowanie odpowiedniego modelu opisuj ącego spadek 
stężenia substancji testowej (8). Je żeli nie, to odpowiednim mo że 
być oparcie analizy wyników na pocz ątkowych (nominalnych lub 
zmierzonych) st ężeniach.  
1.8.12.  Inne obserwacje  
Należy przeprowadzi ć obserwacje mikroskopowe w celu sprawdze ­
nia, czy wygl ąd kultury inokulacyjnej jest normalny i zdrowy oraz 
zaobserwowania ewentualnego anormalnego wygl ądu glonów (który 
może być spowodowany ekspozycj ą na substancj ę testową) na końcu 
badania.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Badanie graniczne  
W pewnych okoliczno ściach, np. gdy wst ępne badanie wskazuje, że 
substancja testowa nie ma toksycznych skutków w st ężeniach do 
100 mg·l  –1 lub do jej granicznej rozpuszczalno ści w po żywce 
testowej (zale żnie od tego, co jest ni ższe), można przeprowadzi ć 
badanie graniczne polegaj ące na porównaniu odpowiedzi grupy 
kontrolnej i jednej grupy poddawanej zabiegowi (o st ężeniu 
100 mg·l  –1 lub równym granicznej rozpuszczalno ści). Bardzo zale ­
cane jest, aby by ło to poparte analiz ą stężenia ekspozycji. Do 
badania granicznego stosuj ą się wszystkie poprzednio opisane 
warunki badania i kryteria wa żności, poza tym że liczba replikatów 
poddawanych zabiegowi powinna wynosi ć co najmniej sze ść. 
Zmienne odpowiedzi w grupie poddawanemu zabiegowi i w grupie kontrolnej mo żna analizowa ć przy użyciu testu statystycznego do 
porównania średnich, np. testu t Studenta. Je żeli wariancje obydwu 
grup są nierówne, to nale ży wykona ć test t skorygowany dla nierów ­
nych wariancji.
 
1.8.14.  Modyfikacja w odniesieniu do mocno zabarwionych substancji  
Napromienienie (intensywno ść światła) powinno by ć bliskie najwy ż­
szych warto ści zakresu przewidzianego w tej metodzie badania: 
120μE m-2 s-1 lub wy ższe. 
Drogę strumienia światła należy skrócić poprzez ograniczenie obj ę­
tości roztworów testowych (zakres od 5 do 25 ml).  
Należy zapewni ć częste poruszanie (np. poprzez umiarkowane 
potrząsanie), tak by glony by ły często wystawione na intensywne 
napromienienie na powierzchni kultury.  
2. DANE  
2.1. WYKRE ŚLENIE KRZYWYCH WZROSTU  
Biomasa w naczyniach badawczych mo że być wyrażona 
w jednostkach surogatowego parametru u żytego do pomiaru (np. 
liczby komórek, fluorescencji).  
Należy zestawi ć w postaci tabelarycznej oszacowane st ężenie 
biomasy w kulturach testowych i w kulturach kontrolnych wraz ze 
stężeniami badanego materia łu i czasami pomiaru zarejestrowanymi 
z dokładnością co najmniej do pe łnych godzin, aby sporz ądzić 
wykresy krzywych wzrostu. Na tym pierwszym etapie mog ą być 
przydatne skale zarówno logarytmiczne, jak liniowe, lecz skale loga ­
rytmiczne s ą obowiązkowe i na ogó ł dają lepszą reprezentacj ę 
zmienności przebiegu wzrostu podczas okresu badania. Nale ży 
zwrócić uwagę, że nachylenie linii (tangens k ąta nachylenia) oznacza 
właściwą szybkość wzrostu.  
Przy pomocy wykresów nale ży zbadać, czy kultury kontrolne wzras ­
tają wykładniczo ze spodziewan ą szybkością w ciągu całego badania. 
Należy krytycznie zbada ć wszystkie punkty danych oraz wygl ąd 
wykresów i sprawdzi ć dane pierwotne i procedury pod k ątem możli­
wych błędów. Sprawdzi ć w szczególno ści wszelkie punkty danych, 
które wydaj ą się odchylać o błąd systematyczny. Je żeli jest oczy ­
wiste, że można stwierdzi ć i/lub uzna ć za wysoce prawdopodobne 
błędy proceduralne, to okre ślony punkt danych oznacza si ę jako 
wartość oddaloną i nie ujmuje si ę w późniejszej analizie statystycz ­
nej. (Zerowe st ężenie glonów w jednym z dwóch lub trzech naczy ­
niach replikatów mo że oznacza ć, że naczynie to nie zosta ło 
poprawnie zaszczepione lub zosta ło niewłaściwie wyczyszczone). 
Powody odrzucenia punktu danych jako warto ści oddalonej nale ży 
wyraźnie podać w sprawozdaniu z badania. Akceptowanymi powo ­
dami są jedynie (rzadkie) b łędy proceduralne, a nie tylko niedosta ­
teczna dok ładność. Procedury statystyczne dotycz ące identyfikacji 
wartości oddalonych maj ą ograniczone zastosowanie do zagadnienia 
tego typu i nie mog ą zastąpić specjalistycznej opinii. Warto ści odda­
lone (zaznaczone jako takie) nale ży najlepiej zachowa ć wśród 
punktów danych przedstawionych w pó źniejszej graficznej lub tabe ­
larycznej prezentacji danych.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. ZMIENNE ODPOWIEDZI  
Celem badania jest okre ślenie wp ływów substancji testowej na 
wzrost glonów. Niniejsza metoda badawcza opisuje dwie zmienne odpowiedzi, gdy ż państwa członkowskie maj ą różne preferencje 
i potrzeby regulacyjne. Aby wyniki badania by ły możliwe do przy ­
jęcia we wszystkich pa ństwach cz łonkowskich, skutki nale ży oceniać 
używając obydwu opisanych poni żej zmiennych odpowiedzi a) i b).
 
a) Średnia w łaściwa szybko ść wzrostu: t ę zmienną odpowiedzi 
oblicza si ę na podstawie logarytmicznego przyrostu biomasy 
w ciągu okresu badania, wyra żonego na dzie ń. 
b) Uzysk: t ą zmienną odpowiedzi jest biomasa na ko ńcu badania 
minus pocz ątkowa biomasa.  
Do celów stosowania tej metody w ramach unijnego prawodawstwa, 
z powodów opisanych poni żej, obliczanie wyników powinno opiera ć 
się na średniej w łaściwej szybko ści wzrostu. Nale ży zwrócić uwagę, 
że wartości toksyczno ści obliczone przy u życiu tych dwu zmiennych 
odpowiedzi nie s ą porównywalne i ró żnica musi by ć rozpoznana, 
gdy używa się wyników badania. Je żeli zachowane s ą warunki 
badania okre ślone w niniejszej metodzie badawczej, to warto ści 
EC x oparte o średnią właściwą szybkość wzrostu (E  r C x ) zwykle 
bywają wyższe od warto ści opartych o uzysk (E  y C x ), ze wzgl ędu 
na podstaw ę matematyczn ą odnośnych podej ść. Nie nale ży tego 
interpretowa ć jako różnicę czułości pomiędzy dwiema zmiennymi 
odpowiedzi, lecz jedynie że wartości te są matematycznie ró żne. 
Pojęcie średniej w łaściwej szybko ści wzrostu oparte jest o ogólny 
wykładniczy przebieg wzrostu glonów w nieograniczonych kultu ­
rach, gdzie toksyczno ść jest szacowana na podstawie wp ływów na 
szybkość wzrostu, nie b ędąc zależną od bezwzgl ędnego poziomu 
właściwej szybko ści wzrostu kultury kontrolnej, nachylenia krzywej 
stężenie–odpowied ź lub czasu trwania badania. Natomiast wyniki 
oparte o zmienn ą odpowiedzi w postaci uzysku s ą zależne od 
wszystkich tych pozosta łych zmiennych. E  y C x jest zależne od 
właściwej szybko ści wzrostu gatunków glonów u żytych w ka żdym 
badaniu oraz od maksymalnej w łaściwej szybko ści wzrostu, która 
może być różna dla ró żnych gatunków, a nawet dla ró żnych 
szczepów glonów. Tej zmiennej odpowiedzi nie powinno si ę używać 
do porównywania czu łości na czynniki toksyczne pomi ędzy gatun ­
kami glonów lub nawet ró żnymi ich szczepami. Cho ć do szacowania 
toksyczno ści naukowo preferowane jest pos ługiwanie si ę średnią 
właściwą szybkością wzrostu, to oszacowania toksyczno ści na 
podstawie uzysku s ą również ujęte w niniejszej metodzie badawczej, 
aby uczyni ć zadość obecnym wymogom regulacyjnym istniej ącym 
w niektórych krajach.  
2.2.1.  Średnia szybko ść wzrostu  
Średnią właściwą szybkość wzrostu dla konkretnego okresu oblicza 
się jako logarytmiczny przyrost biomasy z równania dla ka żdego 
pojedynczego naczynia kultur kontrolnych i poddawanych zabie ­
gowi:  
μ i-j ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i (dzień –1 ) 
gdzie:  
μ i–j : jest średnią właściwą szybkością wzrostu od czasu  i do j, 
X i : jest biomas ą o czasie  i, 
X j : jest biomas ą o czasie  j. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Dla każdej grupy poddawanej zabiegowi i grupy kontrolnej nale ży 
obliczyć średnią wartość szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami 
wariancji.  
Obliczyć średnią właściwą szybkość wzrostu w ci ągu całego czasu 
trwania badania (zwykle dni 0–3), jako pocz ątkową wartość 
używając nominalnie zaszczepion ą biomasę, zamiast zmierzonej 
początkowej warto ści, poniewa ż w ten sposób zwykle uzyskuje si ę 
większą dokładność. Jeżeli urządzenie używane do pomiaru biomasy 
pozwala na dostatecznie dok ładne okre ślenie ma łej biomasy 
inokulum (np. cytometr przep ływowy), to mo żna użyć zmierzonego 
początkowego st ężenia biomasy. Oceni ć również szybkość wzrostu 
dla poszczególnych odcinków, obliczon ą jako właściwe szybko ści 
wzrostu dla ka żdego dnia w trakcie badania (dni 0–1, 1–2 i 2–3) 
oraz zbada ć, czy szybko ść wzrostu w kulturze kontrolnej pozostaje 
stała (zob. kryteria walidacji, sekcja 1.7). Znacz ąco niższa właściwa 
szybkość wzrostu w pierwszym dniu od ogólnej średniej w łaściwej 
szybkości wzrostu mo że oznacza ć fazę zwłoki. Podczas gdy faz ę 
zwłoki można zminimalizowa ć i praktycznie wyeliminowa ć 
w kulturach kontrolnych przez odpowiednie rozmno żenie kultury 
pierwotnej, to faza zw łoki w kulturach poddanych ekspozycji mo że 
oznaczać regeneracj ę po pocz ątkowym stresie toksycznym lub 
zmniejszon ą ekspozycj ę wskutek straty substancji testowej (w tym 
jej sorpcji na biomasie glonów) po pocz ątkowej ekspozycji. St ąd, 
można określić szybkość wzrostu dla poszczególnych odcinków, 
aby oceni ć skutki substancji testowej wyst ępujące w ciągu okresu 
ekspozycji. Istotne ró żnice pomi ędzy szybko ścią wzrostu dla 
poszczególnych odcinków a średnią szybkością wzrostu oznaczaj ą 
odchylenie od sta łego wykładniczego wzrostu i uzasadniaj ą dokładne 
zbadanie krzywych wzrostu.  
Należy obliczy ć procentow ą inhibicję szybkości wzrostu dla ka żdego 
replikatu poddawanego zabiegowi, wed ług następującego równania:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100  
gdzie:  
%I r : procentowa inhibicja średniej w łaściwej szybko ści wzrostu,  
μ C : warto ść średnia średniej w łaściwej szybko ści wzrostu ( μ) 
w grupie kontrolnej,  
μ T : średnia właściwa szybko ść wzrostu dla replikatu poddawa ­
nego zabiegowi.  
Gdy do sporz ądzenia roztworów testowych u żyte są rozpuszczalniki, 
w obliczeniu procentowej inhibicji nale ży użyć grup kontrolnych 
z rozpuszczalnikiem zamiast grup kontrolnych bez rozpuszczalnika.  
2.2.2.  Uzysk  
Uzysk oblicza si ę jako biomas ę na końcu badania minus biomasa na 
początku badania dla ka żdego pojedynczego naczynia z replikatami 
kontrolnymi i replikatami poddawanymi zabiegowi. Dla ka żdego 
stężenia testowego i grupy kontrolnej nale ży obliczy ć średnią 
wartość uzysku wraz z oszacowaniami wariancji. Dla ka żdego repli ­
katu poddawanemu zabiegowi mo żna obliczy ć procentow ą inhibicję 
uzysku (%I  y ) w następujący sposób:  
%I y ¼ ðY C – Y T Þ 
Y C Ü 100  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
gdzie:  
% I  y : procentowa inhibicja uzysku,  
Y C : średnia warto ść uzysku w grupie kontrolnej,  
Y T : warto ść uzysku dla replikatu poddawanemu zabiegowi.  
2.3. WYKRE ŚLENIE KRZYWEJ ODPOWIEDZI ST ĘŻENIOWEJ  
Należy wykre ślić procent inhibicji w zale żności od logarytmu 
stężenia substancji testowej i dok ładnie zbada ć wykres, pomijaj ąc 
każdy punkt danych, który zosta ł potraktowany jako warto ść odda­
lona w pierwszej fazie. Nale ży dopasowa ć linię gładką pomiędzy 
punktami danych na oko lub za pomoc ą komputerowej interpolacji, 
aby uzyska ć pierwsze wra żenie zależności odpowiedzi st ężeniowej, 
a następnie kontynuowa ć z zastosowaniem bardziej szczegó łowej 
metody, najlepiej komputerowej metody statystycznej. 
W zależności od zamierzonego wykorzystania danych, jako ści 
(dokładności) i ilości danych, jak równie ż dostępności narzędzi do 
analizy danych, mo żna postanowi ć (co niekiedy jest nale życie 
uzasadnione), aby przerwa ć analizę danych na tym etapie i po prostu 
odczytać główne wielko ści EC  50 i EC  10 (oraz/lub EC  20 ) 
z dopasowanej na oko krzywej (zob. równie ż poniżej — sekcja 
dotycząca skutków stymulacyjnych). Do wa żnych powodów nieza ­
stosowania metody statystycznej mog ą należeć następujące: 
— Dane nie s ą odpowiednie do tego, aby metody komputerowe 
przyniosły wyniki bardziej wiarygodne od uzyskanych na 
podstawie specjalistycznej oceny — w takich sytuacjach, 
niektóre programy komputerowe mog ą nawet nie dostarczy ć 
wiarygodnego rozwi ązania (iteracje mog ą nie osiągnąć zbież­
ności, itp.).  
— Odpowiedzi stymulacyjnego wzrostu nie mog ą być 
w zadowalaj ący sposób poddane obróbce przy u życiu dostępnych 
programów komputerowych (zob. poni żej). 
2.4. PROCEDURY STATYSTYCZNE  
Celem jest uzyskanie ilo ściowej zale żności stężenie–odpowied ź za 
pomocą analizy regresji. Mo żliwe jest zastosowanie wa żonej regresji 
liniowej po przeprowadzeniu linearyzuj ącej transformacji danych 
odpowiedzi — na przyk ład do jednostek probit lub logit albo 
Weibulla (9), lecz preferowane s ą procedury regresji nieliniowej, 
które lepiej znosz ą nieuniknione nieregularno ści danych 
i odchylenia od g ładkich rozk ładów. Przy zbli żaniu się do zerowej 
lub do ca łkowitej inhibicji, nieregularno ści takie mog ą zostać 
powiększone przez transformacj ę, zakłócając analizę (9). Nale ży 
zwrócić uwagę, że standardowe metody analizy przy u życiu trans ­
format probit, logit lub Weibulla s ą przeznaczone do stosowania do 
danych kwantalowych (np. śmiertelno ści lub prze żywalności) 
i muszą zostać zmodyfikowane z dostosowaniem do danych szyb ­
kości wzrostu lub biomasy. Szczegó łowe procedury wyznaczania 
wartości EC  x na podstawie ci ągłych danych mo żna znaleźć w (10), 
(11) i (12). Zastosowanie analizy regresji nieliniowej jest dalej 
opisane szczegó łowo w dodatku 4.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Dla każdej zmiennej odpowiedzi, która ma by ć analizowana nale ży 
użyć zależności stężenie–odpowied ź do obliczenia oszacowa ń punk­
towych warto ści EC  x . Gdy to mo żliwe, dla ka żdego oszacowania 
należy określić granice ufno ści 95 %. Dok ładność dopasowania 
danych odpowiedzi do modelu regresji nale ży ocenić graficznie lub 
statystycznie. Analiz ę regresji nale ży przeprowadzi ć używając odpo­
wiedzi indywidualnych replikatów, a nie średnich z grup poddawa ­
nych zabiegowi. Je śli jednak dopasowanie krzywej nieliniowej jest 
trudne lub nie udaje si ę z powodu zbyt du żego rozrzutu danych, to 
problem mo żna ominąć wykonuj ąc regresję na średnich z grup, jako 
praktyczny sposób ograniczenia wp ływu podejrzewanych warto ści 
oddalonych. Wybranie tej opcji nale ży zaznaczy ć w sprawozdaniu 
z badania jako odst ępstwo od normalnej procedury wynik łe stąd, że 
dopasowania krzywej przy pomocy indywidualnych replikatów nie 
dały dobrego rezultatu.  
Oszacowania EC  50 i granice ufno ści można równie ż otrzymać przy 
użyciu interpolacji liniowej z ładowaniem pocz ątkowym (13), je żeli 
dostępne modele/metody regresji s ą nieodpowiednie do danych.  
W celu oszacowania LOEC, a st ąd NOEC, oraz wp ływów substancji 
testowej na szybko ść wzrostu, konieczne jest porównanie średnich 
z grup poddawanych zabiegowi przy u życiu technik analizy 
wariancji (ANOVA). Średnią dla każdego stężenia należy następnie 
porównać ze średnią kontroln ą przy użyciu odpowiedniej metody 
wielokrotnego porównania lub testu trendu. Przydatny mo że być 
test Dunnetta lub Williamsa (14)(15)(16)(17)(18). Nale ży ocenić, 
czy przyj ęte w ANOVA za łożenie homogeniczno ści wariancji pozos ­
taje w mocy. Ocen ę tę można przeprowadzi ć graficznie lub za 
pomocą formalnego testu (18). Odpowiednimi do tego celu testami 
są testy Levene’a lub Bartletta. Niespe łnienie za łożenia 
o homogeniczno ści wariancji mo żna niekiedy skorygowa ć za 
pomocą logarytmicznego przekszta łcenia danych. Je żeli heteroge ­
niczność wariancji jest skrajnie du ża i nie mo że być skorygowana 
przez transformacj ę, to należy rozważyć analizę za pomoc ą metod 
takich, jak testy trendu stopniowego obni żania Jonkheere’a. Dodat ­
kowe wskazówki dotycz ące wyznaczania NOEC mo żna znaleźć 
w (12).  
Rozwój naukowy, jaki ostatnio nast ąpił, doprowadzi ł do zalecenia 
zarzucenia poj ęcia NOEC i zast ąpienia go regresj ą opartą 
o oszacowania punktowe EC  x . Dla niniejszego badania glonów nie 
ustalono odpowiedniej warto ści x. Odpowiednim wydaje si ę prze­
dział 10–20 % (w zale żności od wybranej zmiennej odpowiedzi), 
a najlepiej nale ży podać zarówno EC  10 , jak i EC  20 . 
2.5. STYMULACJA WZROSTU  
Niekiedy obserwuje si ę stymulacj ę wzrostu (ujemna inhibicja) przy 
niskich st ężeniach. Mo że to wynika ć z hormezy („toksycznej stymu ­
lacji”) lub z dodania stymuluj ących czynników wzrostu z badanym 
materiałem do użytej minimalnej po żywki. Nale ży zwrócić uwagę, 
że dodanie nieorganicznych sk ładników od żywczych nie powinno 
mieć żadnego bezpo średniego wp ływu, poniewa ż badana po żywka 
powinna zachowa ć nadmiar sk ładników od żywczych w ci ągu całego 
badania. Stymulacj ę niskodawkow ą można zwykle pomin ąć 
w obliczeniach EC  50 , chyba że jest skrajna. Jednak że, jeśli jest 
ona skrajna lub ma by ć obliczona warto ść EC  x dla małego x, to 
mogą być wymagane specjalne procedury. Nale ży unikać usuwania 
odpowiedzi stymulacyjnych z analizy danych, je śli to mo żliwe 
i jeżeli dostępne oprogramowania do dopasowywania krzywych nie 
może przyjąć drobnej stymulacji, to mo żna posłużyć się interpolacj ą 
liniową z ładowaniem pocz ątkowym (19).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. NIETOKSYCZNE HAMOWANIE WZROSTU  
Materiały badane poch łaniające światło mogą przyczynia ć się do 
redukcji szybko ści wzrostu, poniewa ż zacienienie zmniejsza ilo ść 
dostępnego światła. Takie fizyczne typy oddzia ływań należy 
oddzielić od oddzia ływań toksycznych przez zmodyfikowanie 
warunków badania i poda ć je odrębnie w sprawozdaniu. Wskazówki 
można znaleźć w (2) i (3).  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancja testowa:  
— fizyczny charakter i stosowne w łasności fizykochemiczne, w tym 
graniczna rozpuszczalno ść w wodzie,  
— dane identyfikacyjne substancji chemicznej, w tym czysto ść. 
Badane gatunki:  
— szczep, dostawca lub źródło oraz zastosowane warunki kultury.  
Warunki badania:  
— data rozpocz ęcia badania i czas jego trwania,  
— opis planu badania: naczynia badawcze, obj ętości kultur, g ęstość 
biomasy na pocz ątku badania,  
— skład pożywki,  
— stężenia testowe i replikaty (np. liczba replikatów, liczba st ężeń 
testowych oraz zastosowany post ęp geometryczny),  
— opis sporz ądzania roztworów testowych, w tym u życia rozpusz ­
czalników, itp.,  
— aparatura do hodowli kultur,  
— natężenie i jako ść światła (źródło, jednorodno ść), 
— temperatura,  
— stężenia testowe: nominalne st ężenia testowe oraz wszelkie 
wyniki analiz okre ślania st ężenia substancji testowej 
w naczyniach badawczych. Nale ży podać sprawno ść odzyskow ą 
metody oraz granic ę kwantyfikacji w zestawie badawczym,  
— wszelkie odst ępstwa od niniejszej metody badawczej,  
— metoda okre ślania biomasy oraz dowody korelacji pomi ędzy 
mierzonym parametrem a ci ężarem masy suchej.  
Wyniki:  
— warto ści pH na pocz ątku i na ko ńcu badania przy wszystkich 
zabiegach,  
— biomasa dla ka żdej kolby w ka żdym punkcie pomiarowym oraz 
metoda pomiaru biomasy,  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— krzywe wzrostu (wykres zale żności biomasy od czasu),  
— obliczone zmienne odpowiedzi dla ka żdego replikatu poddawa ­
nemu zabiegowi, wraz z warto ściami średnimi 
i współczynnikami zmienno ści dla replikatów,  
— graficzne przedstawienie zale żności stężenie/skutek,  
— oszacowania toksyczno ści dla zmiennych odpowiedzi, np. EC  50 , 
EC 10 , EC  20 oraz zwi ązane z nimi przedzia ły ufności. 
W przypadku obliczenia — LOEC i NOEC oraz metody staty ­
styczne u żyte do ich wyznaczenia,  
— jeżeli zastosowana zosta ła ANOVA — wielko ść skutku, który 
można wykry ć (np. najmniejsza znacz ąca różnica),  
— wszelka stymulacja wzrostu stwierdzona w którejkolwiek próbie,  
— wszelkie zaobserwowane skutki, np. morfologiczne zmiany 
glonów,  
— omówienie wyników, w tym ewentualny wp ływ na wynik 
badania wynikaj ący z odstępstw od niniejszej metody badawczej.  
4. LITERATURA  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test.  
(2) ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhi ­
bition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, 
metals and waster water. ISO/DIS 14442.  
(3) OECD 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing 
of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health 
and Safety Publications. Series on Testing and Assessment, 
no. 23.  
(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667–16.  
(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. ISO 
8692.  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in vitro 
fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2525–2531.
 
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22,5 (1977), pp. 919–925.
 
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073–2079.
 
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological 
Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. 
Sci. Technol. 19, 713–718.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11: 1485–1494.
 
(12) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096–1121.
 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482–491.  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics 27: 103–117.  
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510–531.  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93–96.
 ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Dodatek 1  
Szczepy wykazane jako odpowiednie do badania  
Zielenice  
— Pseudokirchneriella subcapitata , (poprzednio znana pod nazw ą Selenastrum 
capricornutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (poprzednio znana pod nazw ą Scenedesmus 
subspicatus ) 86.81 SAG  
Okrzemki  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cyjanobakterie  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Źródła szczepów  
Zalecane szczepy s ą dostępne w postaci kultur jednoalgowych z nast ępujących 
kolekcji (w kolejno ści alfabetycznej):  
ATCC: American Type Culture Collection (Ameryka ńska kolekcja typokul ­
turowa)  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110–2209  
USA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa (Kolekcja kulturowa 
glonów i pierwotniaków)  
Institute of Freshwater Ecology (Instytut Wód S łodkich),  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
ZJEDNOCZONE KRÓLESTWO  
SAG: Collection of Algal Cultures (Kolekcja kultur glonów)  
Inst. Plant Physiology (Instytut Fizjologii Ro ślin) 
University of Göttingen (Uniwersytet w Getyndze)  
Nicholausberger Weg 18  
D-3400 Göttingen  
NIEMCY  
UTEX Culture Collection of Algae (Kulturowa kolekcja glonów)  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology (Sekcja Biologii 
Molekularnej, Komórkowej i Rozwojowej)  
School of Biological Sciences (Wydzia ł Nauk Biologicznych)  
the University of Texas at Austin (Uniwersytet Teksa ński w Austin)  
Austin, Texas 78712  
USA ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Wygląd i charakterystyka zalecanych gatunków  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Wygląd Zakrzywione, 
skręcone 
pojedyncze komórki Owalne, prze ­
ważnie poje­
dyncze komórki Pałeczki Łańcuchy 
owalnych 
komórek Pałeczki 
Rozmiar (L × W) μm 8–14 × 2–3 7–15 × 3–12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Objętość komórki ( μm
 3 /komórkę) 40–60 (  1 ) 60–80 (  1 ) 40–50 (  1 ) 30–40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Ciężar masy suchej (mg/komórk ę) 2–3 × 10  –8 3–4 × 10  –8 3–4 × 10  –8 1–2 × 10  –8 2–3 × 10  –9 
Szybkość wzrostu (  3 ) (dzień –1 ) 1,5–1,7 1,2–1,5 1,4 1,1–1,4 2,0–2,4  
( 1 ) Zmierzono za pomoc ą elektronicznego licznika cz ąstek. 
( 2 ) Obliczono na podstawie rozmiaru. 
( 3 ) Najczęściej obserwowana szybko ść wzrostu w po żywce OECD przy nat ężeniu światła ok. 70 μE·m  –2 ·s –1 i w temp. 21 °C.  
Szczególne zalecenia dotycz ące hodowli kultur i post ępowania z zalecanymi 
gatunkami próbnymi  
Pseudokirchneriella subcapitata  i Desmodesmus subspicatus  
Te zielenice s ą na ogół łatwe do utrzymania w ró żnych pożywkach do hodowli 
kultur. Informacje dotycz ące odpowiednich po żywek dost ępne są od kolekcji 
kultur. Komórki s ą zazwyczaj odosobnione i pomiary g ęstości komórek mo żna 
łatwo wykona ć przy użyciu elektronicznego licznika cz ąstek lub mikroskopu.  
Anabaena flos-aquae  
Do hodowania kultury podstawowej mo żna używać różnych pożywek. Szcze ­
gólnie wa żne jest niedopuszczenie, aby podczas odnawiania kultura seryjna nie 
przekroczy ła logarytmicznej fazy wzrostu, gdy ż powrót do normy w tym 
momencie jest trudny.  
Anabaena flos-aquae  tworzy skupiska wchodz ących w siebie nawzajem łańcu­
chów komórek. Rozmiar tych skupisk mo że zmienia ć się w zależności od 
warunków hodowania kultury. Mo że być konieczne rozbicie tych skupisk, gdy 
do określania biomasy stosuje si ę liczenie mikroskopowe lub elektroniczny 
licznik cz ąstek. 
Do rozbicia łańcuchów w celu zmniejszenia zmienno ści zliczania mo żna zasto­
sować nadźwiękawianie. Nad źwiękawianie d łuższe niż wymagane do rozbicia 
łańcuchów na krótsze odcinki mo że zniszczy ć komórki. Nat ężenie i czas trwania 
nadźwiękawiania musz ą być identyczne dla ka żdego zabiegu.  
Aby pozwoli ć skompensowa ć zmienno ść, należy zliczyć na hemocytometrze 
dostateczn ą ilość pól (co najmniej 400 komórek). Poprawi to rzetelno ść mikro­
skopowych oznacze ń gęstości. 
Do wyznaczenia ca łkowitej obj ętości komórek Anabaena mo żna użyć elektro­
nicznego licznika cz ąstek, po uprzednim rozbiciu łańcuchów komórek za pomoc ą 
ostrożnego nadźwiękawiania. Nale ży wyregulowa ć energię nadźwiękawiania, aby 
uniknąć rozerwania komórek.  
Należy użyć mieszadła wirowego lub podobnej odpowiedniej metody dla zapew ­
nienia, że zawiesina glonów u żyta do zaszczepienia naczy ń badawczych jest 
dobrze wymieszana i jednorodna.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Naczynia badawcze nale ży ustawić na orbitalnym lub posuwno-zwrotnym stole 
wibracyjnym przy oko ło 150 obrotach na minut ę. Alternatywnie, aby zmniejszy ć 
tendencję Anabaena do tworzenia skupisk, mo żna stosowa ć przerywane miesza ­
nie. Jeżeli występuje tworzenie si ę skupisk, nale ży dołożyć starań, aby uzyska ć 
reprezentatywne próbki do pomiarów biomasy. Aby rozbi ć skupiska glonów, 
przed pobraniem próbek mo że być konieczne energiczne mieszanie.  
Synechococcus leopoliensis  
Do hodowania kultury podstawowej mo żna używać różnorodnych po żywek 
wzrostowych. Informacje o odpowiednich po żywkach s ą dostępne od kolekcji 
kultur.  
Synechococcus leopoliensis  rośnie w postaci odosobnionych komórek w kszta łcie 
pałeczek. Komórki s ą bardzo ma łe, co komplikuje stosowanie zliczania mikro ­
skopowego do pomiarów biomasy. Przydatne s ą tu elektroniczne liczniki cz ąstek 
z wyposa żeniem do liczenia cz ąstek o rozmiarach do oko ło 1 μm. Można 
również stosować pomiary fluorometryczne  in vitro . 
Navicula pelliculosa  
Do hodowania kultury podstawowej mo żna używać różnorodnych po żywek 
wzrostowych. Informacje o odpowiednich po żywkach s ą dostępne od kolekcji 
kultur. Nale ży zwrócić uwagę, że w pożywce wymagany jest krzemian.  
Navicula pelliculosa  w pewnych warunkach wzrostu mo że tworzy ć skupiska. 
Z uwagi na wytwarzanie lipidów komórki glonów wykazuj ą niekiedy tendencj ę 
do zbierania si ę w warstewce powierzchniowej. W takich warunkach, podczas 
pobierania podpróbek do oznaczania biomasy nale ży podjąć szczególne środki, 
aby uzyska ć reprezentatywne próbki. Mo że być potrzebne energiczne mieszanie, 
np. przy u życiu mieszad ła wirowego.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Dodatek 2  
Pożywki wzrostowe  
Można używać jednej z nast ępujących dwu po żywek wzrostowych:  
Pożywka OECD: Oryginalna po żywka OECD TG 201, równie ż zgodna z ISO 
8692  
Pożywka AAP (EPA USA), równie ż zgodna z ASTM.  
Sporządzając te pożywki, nale ży użyć substancji chemicznych o czysto ści do 
analizy oraz wody dejonizowanej.  
Skład pożywki AAP (EPA USA) oraz po żywki OECD TG 201  
Składnik EPA OECD 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 ·2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) Stosunek molowy EDTA do żelaza przekracza nieco jeden. Zapobiega to wytr ąceniu się żelaza, 
a jednocze śnie zminimalizowana jest chelatacja jonów metali ci ężkich. 
W badaniu z u życiem okrzemka  Navicula pelliculosa , obydwie po żywki nale ży 
uzupełnić Na  2 SiO  3 ·9H  2 O, aby uzyska ć stężenie 1,4 mg Si/l.  
pH pożywki uzyskuje si ę przy równowadze pomi ędzy układem węglanowym 
pożywki a ci śnieniem cz ąstkowym CO  2 w powietrzu atmosferycznym. Przybli ­ 
żona zależność pomiędzy pH w temp. 25 °C a st ężeniem molowym wodorow ęg­
lanu jest nast ępująca: 
PH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Przy 15 mg NaHCO  3 , pH  eq = 7,5 (ameryka ńska pożywka EPA), a przy 50 mg 
NaHCO  3 /l, pH  eq = 8,1 (po żywka OECD).  
Skład pierwiastkowy po żywek  
Pierwiastek EPA OECD 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Sporządzenie po żywki OECD  
Składnik odżywczy St ężenie w roztworze podstawowym 
Roztwór podstawowy 1: makrosk ładniki 
odżywcze  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Roztwór podstawowy 2: żelazo 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l  –1 
100 mg·l  –1 
Roztwór podstawowy 3: pierwiastki śladowe  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Roztwór podstawowy 4: wodorow ęglan 
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Roztwory podstawowe nale ży wysterylizowa ć przez filtracj ę przeponow ą (średnia 
średnica poru 0,2 μm) lub przez obróbk ę w autoklawie (120 °C, 15 min). 
Roztwory nale ży przechowywa ć w ciemno ści w temperaturze 4 °C.  
Roztworów 2 i 4 nie poddawa ć obróbce w autoklawie, lecz wysterylizowa ć je 
przez filtracj ę przeponow ą. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Sporządzić pożywkę wzrostow ą dodając odpowiedni ą objętość roztworów 
podstawowych 1–4 do wody:  
Dodać do 500 ml sterylizowanej wody:  
— 10 ml roztworu podstawowego 1,  
— 1 ml roztworu podstawowego 2,  
— 1 ml roztworu podstawowego 3,  
— 1 ml roztworu podstawowego 4.  
Uzupełnić wodą sterylizowan ą do 1 000 ml.  
Odczekać należyty czas na utworzenie si ę równowagi pomi ędzy pożywką a CO  2 , 
jeśli potrzeba, stosuj ąc barbota ż sterylnym filtrowanym powietrzem przez kilka 
godzin.  
Sporządzenie po żywki AAP  
A1.1. Doda ć 1 ml ka żdego roztworu podstawowego wymienionego 
w A1.2.1–A1.2.7 do oko ło 900 ml wody dejonizowanej lub destylo ­
wanej, a nast ępnie rozcie ńczyć do 1 l.  
A1.2. Roztwory podstawowe makrosk ładników od żywczych sporz ądza się, 
rozpuszczaj ąc poniższe składniki w 500 ml wody dejonizowanej lub 
destylowanej. Reagenty A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 oraz A1.2.4 mo żna 
połączyć w jeden roztwór podstawowy.  
A1.2.1.  NaNO  3 —12,750 g.  
A1.2.2.  MgCL  2 · 6H 2 O—6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O—2,205 g.  
A1.2.4.  Roztwór podstawowy mikrosk ładników od żywczych —(zob. A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O—7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 —0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 —7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O—Zob. uwaga A1.1.  
UWAGA A1.1 — U żyć tylko do badanych gatunków okrzemków. 
Można dodać bezpośrednio (202,4 mg) lub za pomoc ą roztworu 
podstawowego, aby otrzyma ć końcowe stężenie w po żywce wynosz ące 
20 mg/l Si.  
A1.3. Roztwór podstawowy mikrosk ładników od żywczych sporz ądza się, 
rozpuszczaj ąc poniższe składniki w 500 ml wody dejonizowanej lub 
destylowanej:  
A1.3.1.  H  3 BO 3 —92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O—207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 —1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O—79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O—0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O—3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O—0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O—150,000 mg.  
[(Etylenodwunitrylo)czterooctan dwusodowy].  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O—0,005 mg. Zob. uwaga A1.2.  
UWAGA A1.2 — U żyć tylko w po żywce dla kultur podstawowych 
gatunków okrzemków.  
A1.4. Wyregulowa ć pH do 7,5 ± 0,1 za pomoc ą 0,1 N lub 1,0  N NaOH 
lub HCl.  
A1.5. Przefiltrowa ć pożywkę do sterylnego pojemnika przez filtr przeponowy 
0,22 μm, jeżeli ma by ć użyty licznik cz ąstek, lub filtr 0,45 μm, jeśli nie 
ma być użyty licznik cz ąstek. 
A1.6. Po żywkę należy przechowywa ć w ciemno ści w temperaturze oko ło 
4 °C do czasu u życia. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Dodatek 3  
Przykład procedury hodowania kultur glonów  
Ogólne spostrze żenia 
Celem hodowania kultur w oparciu o poni ższą procedur ę jest otrzymanie kultur 
glonów do bada ń toksyczno ści. 
Należy użyć odpowiednich metod dla zapewnienia, że kultury glonów nie b ędą 
zakażone bakteriami. Po żądane mog ą być kultury akseniczne, lecz musz ą zostać 
utworzone i u żyte kultury jednoalgowe.  
Wszystkie operacje nale ży przeprowadza ć w warunkach sterylnych, aby unikn ąć 
zanieczyszczenia bakteriami i innymi glonami.  
Sprzęt i materia ły 
Zob. w podsekcji „Aparatura” sekcji „Metoda badawcza”.  
Procedury otrzymywania kultur glonów  
Sporządzenie roztworów sk ładników od żywczych (po żywek):  
Wszystkie od żywcze sole po żywki przygotowuje si ę w postaci st ężonych 
roztworów podstawowych i przechowuje si ę w ciemnym i zimnym miejscu. 
Roztwory te sterylizuje si ę poprzez filtracj ę lub obróbk ę w autoklawie.  
Pożywkę sporządza się, dodając odpowiedni ą ilość roztworu podstawowego do 
sterylizowanej wody destylowanej, uwa żając, aby nie nast ąpiło zakażenie. Do 
odżywki w postaci sta łej dodaje si ę 0,8 procentu agaru.  
Kultura podstawowa:  
Kultury podstawowe s ą to niedu że kultury glonów, które przenosi si ę regularnie 
do świeżej pożywki, tak aby pe łniła ona rolę początkowego materia łu próbnego. 
Jeżeli kultury nie s ą regularnie u żywane, to tworz ą smużki na nachylonych 
rurkach agaru. Nale ży przenie ść je do świeżej pożywki co najmniej raz na 
dwa miesi ące. 
Kultury podstawowe hoduje si ę w kolbach sto żkowych zawieraj ących odpo ­
wiednią pożywkę (o objętości około 100 ml). Gdy glony s ą inkubowane 
w temperaturze 20 °C przy ci ągłym oświetleniu, to wymagane jest cotygodniowe 
przenoszenie.  
Podczas przenoszenia, pewn ą ilość „starej” kultury przenosi si ę przy pomocy 
sterylnych pipet do kolby ze świeżą pożywką, tak aby w przypadku gatunków 
szybko rosn ących pocz ątkowe stężenie było około 100 razy mniejsze ni ż w starej 
kulturze.  
Szybkość wzrostu gatunków mo żna wyznaczy ć z krzywej wzrostu. Je śli jest ona 
znana, to mo żliwe jest oszacowanie g ęstości, przy której kultur ę należy przenie ść 
do nowego medium. Musi to zosta ć wykonane, zanim kultura osi ągnie fazę 
śmierci.  
Kultura pierwotna:  
Kultura pierwotna s łuży do dostarczenia pewnej ilo ści glonów, odpowiedniej do 
zaszczepienia kultur przeznaczonych do badania. Kultura pierwotna jest inkubo ­
wana w warunkach badania i zostaje u żyta w chwili, gdy nadal wyk ładniczo 
wzrasta, zwykle po okresie inkubacji wynosz ącym 2 do 4 dni. Gdy kultury 
algowe zawieraj ą zdeformowane lub anormalne komórki, to nale ży je odrzuci ć. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Dodatek 4  
Analiza danych za pomoc ą regresji nieliniowej  
Zasady ogólne  
Odpowied ź w badaniach glonów i badaniach wzrostu innych mikroorganizmów 
— wzrost biomasy jest z natury zmienn ą ciągłą lub metryczn ą — szybko ścią 
procesu, je śli użyta jest szybko ść wzrostu oraz jej ca łką po czasie, je śli wybrana 
jest biomasa. Obydwie zmienne odniesione s ą do odpowiedniej średniej odpo ­
wiedzi replikatowych nieeksponowanych grup kontrolnych wykazuj ących maksy ­
malną odpowied ź dla narzuconych warunków — ze światłem i temperatur ą jako 
głównymi decyduj ącymi czynnikami w badaniu glonów. Uk ład jest roz łożony 
lub jednorodny i biomas ę można rozpatrywa ć jako kontinuum, nie bior ąc pod 
uwagę indywidualnych komórek. Rozk ład wariancji typu odpowiedzi dla takiego 
układu wiąże się wyłącznie z czynnikami do świadczalnymi (zwykle opisywa ­
nymi przez logarytmiczno-normalne lub normalne rozk łady błędu). Stanowi to 
przeciwie ństwo dla typowych odpowiedzi biooznaczania z danymi kwintalo ­
wymi, dla których cz ęsto przyjmuje si ę, że dominuj ącą składową wariancji jest 
tolerancja indywidualnych organizmów (zazwyczaj o rozk ładzie dwumianowym). 
Odpowiedziami kontrolnymi jest tu poziom zerowy lub t ła. 
W nieskomplikowanej sytuacji, znormalizowana lub wzgl ędna odpowied ź, r, 
maleje monotonicznie od 1 (zerowe hamowanie) do 0 (100-procentowe hamo ­
wanie). Nale ży zwrócić uwagę, że wszystkie odpowiedzi maj ą związany z sob ą 
błąd i że pozorne ujemne inhibicje mo żna obliczy ć jedynie jako wynik b łędu 
przypadkowego.  
Analiza regresji  
Modele  
Celem analizy regresji jest ilo ściowe opisanie krzywej st ężenie-odpowied ź 
w postaci matematycznej funkcji regresji Y = f (C) lub cz ęściej F (Z), gdzie 
Z = log C. Zastosowana jako odwrotno ść C = f  –1 (Y), pozwala ona na obliczenie 
wielkości EC  x , w tym EC  50 , EC  10 i EC  20 oraz ich 95 % granic ufno ści. Wyka­
zano, że kilka prostych matematycznych postaci funkcyjnych z powodzeniem 
opisuje zale żności stężenie-odpowied ź uzyskiwane w badaniach inhibicji wzrostu 
glonów. Do funkcji tych nale ży, na przyk ład, równanie logarytmiczne, niesymet ­
ryczne równanie Weibula oraz funkcja rozk ładu logarytmiczno-normalnego, 
z których wszystkie s ą krzywymi sigmoidalnymi d ążącymi asymptotycznie do 
jedności dla C → 0 oraz do zera dla C → nieskończoności. 
Ostatnio zaproponowan ą alternatyw ą dla modeli asymptotycznych jest zastoso ­
wanie modeli opartych na ci ągłych funkcjach progowych (np. modelu Koymana 
„dla inhibicji wzrostu populacji”, Kooijman i inni, 1996). Model ten zak łada brak 
efektów przy st ężeniach poni żej pewnego progu, EC0+, który oszacowywany jest 
przez ekstrapolacj ę zależności odpowied ź-stężenie z wyznaczeniem przeci ęcia 
z osią stężeń przy użyciu prostej funkcji ci ągłej, która nie jest ró żniczkowalna 
w punkcie pocz ątkowym.  
Należy zwrócić uwagę, że analiza ta mo że być prostą minimalizacj ą sum kwad ­
ratów resztkowych (zak ładając stałą wariancj ę) lub kwadratów wa żonych, je żeli 
ma być skompensowana heterogeniczno ść wariancji.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Procedura  
Procedurę można przedstawi ć następująco: wybra ć odpowiednie równanie funk ­
cyjne, Y = f (C), i dopasowa ć je do danych za pomoc ą regresji nieliniowej. 
Najlepiej nale ży wykorzysta ć wyniki pomiarów z ka żdej indywidualnej kolby, 
zamiast średnich warto ści replikatów, aby uzyska ć możliwie jak najwi ęcej infor­
macji z danych. Je śli natomiast wariancja jest du ża, to praktyczne do świadczenie 
sugeruje, i ż średnie warto ści replikatów mog ą okazać się solidniejsz ą estymacj ą 
matematyczn ą, mniej ulegaj ącą wpływowi systematycznych b łędów w danych, 
niż w przypadku zachowania ka żdego indywidualnego punktu danych.  
Należy wykreślić dopasowan ą krzywą i nanieść zmierzone dane i zbada ć, czy 
dopasowanie krzywej jest odpowiednie. Szczególnie przydatnym narz ędziem 
o tego celu mo że być analiza reszt. Je żeli wybrana zale żność funkcyjna do 
dopasowania odpowiedzi st ężenia nie opisuje dobrze ca łej krzywej lub istotnej 
jej części, takiej jak odpowied ź przy niskich st ężeniach, to nale ży wybrać inną 
możliwość dopasowania krzywej — np. krzyw ą niesymetryczn ą, taką jak funkcja 
Weibula, zamiast symetrycznej. Ujemne inhibicje mog ą stanowić problem, na 
przykład z funkcj ą rozkładu logarytmiczno-normalnego, równie ż wymagaj ąc 
alternatywnej funkcji regresji. Nie jest zalecane, aby takim ujemnych warto ściom 
przypisywa ć zerową lub małą dodatnią wartość, poniewa ż zniekszta łca to rozk ład 
błędów. Odpowiednim mo że być wykonanie oddzielnych dopasowa ń krzywej na 
częściach krzywej, takich jak cz ęść o małej inhibicji, aby oszacowa ć wielkości 
EC low x . Obliczy ć z dopasowanego równania (za pomoc ą „odwrotnej estymacji”, 
C = f  –1 (Y) oszacowania punktów charakterystycznych EC  x i podać, jako mini ­
mum, oszacowanie EC  50 oraz jedno lub dwa oszacowania EC  low x  . Doświad­
czenie uzyskane z praktycznych bada ń wykazało, że dokładność badania glonów 
zwykle pozwala na do ść dokładne oszacowanie na 10 % poziomie inhibicji, 
jeżeli istnieje dostateczna ilo ść punktów danych — o ile, jako czynnik wik łający, 
nie występuje stymulacja przy niskich st ężeniach. Dok ładność oszacowania EC  20 
jest często znacznie lepsza ni ż EC  10 , poniewa ż EC  20 zazwyczaj le ży na 
w przybli żeniu liniowej cz ęści środkowej krzywej odpowiedzi st ężeniowej. 
Niekiedy EC  10 może być trudne do interpretacji z powodu stymulacji wzrostu. 
Tak więc, choć EC  10 zwykle da si ę uzyskać z dostateczn ą dokładnością, to 
również zaleca si ę, aby w sprawozdaniu zawsze podawa ć EC  20 . 
Współczynniki wa żenia 
Doświadczalna wariancja nie jest na ogó ł stała i zwykle zawiera sk ładową 
proporcjonaln ą, korzystnie jest zatem rutynowo przeprowadza ć regresję ważoną. 
Do takiej analizy przyjmuje si ę zazwyczaj wspó łczynniki wa żenia odwrotnie 
proporcjonalne do wariancji:  
W i = 1/Var(r  i ) 
Wiele programów regresyjnych pozwala wykonywa ć opcję analizy regresji 
ważonej ze wspó łczynnikami wa żenia podanymi w tabeli. Dogodnie jest znor ­
malizowa ć współczynniki wa żenia przez pomno żenie ich przez n/ Σ w i (n jest 
liczbą punktów danych), tak aby ich suma równa ła się jedności. 
Normalizowanie odpowiedzi  
Normalizowanie przez średnią odpowied ź kontroln ą stwarza pewne zasadnicze 
problemy i prowadzi do do ść skomplikowanej struktury wariancji. Dziel ąc odpo­
wiedzi przez średnią odpowied ź kontroln ą w celu uzyskania procentu inhibicji, 
wprowadza si ę dodatkowy b łąd spowodowany b łędem średniej kontrolnej. O ile 
błąd ten nie jest pomijalnie ma ły, współczynniki wa żenia w regresji i granice 
ufności należy skorygowa ć pod wzgl ędem kowariancji za pomoc ą odpowiedzi 
kontrolnej (17). Nale ży zwrócić uwagę, że ważna jest wysoka dok ładność osza­
cowanej średniej odpowiedzi kontrolnej, aby zminimalizowa ć ogólną wariancj ę 
dla względnej odpowiedzi. Wariancja ta jest nast ępująca: ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
dolny indeks i odnosi si ę do poziomu st ężenia i a indeks dolny 0 do odpowiedzi 
kontrolnych)  
Y i = Względna odpowied ź = r  i /r 0 = 1 – I = f (C  i ) 
z wariancj ą: 
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) ∂ (∂Y i / ∂ r i ) 2 ·Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
a poniewa ż 
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 i (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
mając dane o rozk ładzie normalnym oraz m  i i m  0 replikatów:  
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
całkowita wariancja wzgl ędnej odpowiedzi, Y  i , staje się zatem:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
Błąd średniej kontrolnej jest odwrotnie proporcjonalny do pierwiastka kwadrato ­
wego z liczby u średnionych replikatów kontrolnych i niekiedy mo że być uzasad­
nione ujęcie danych historycznych i w ten sposób znaczne zmniejszenie b łędu. 
Alternatywna procedura polega nie na normalizowaniu danych i dopasowaniu bezwzględnych odpowiedzi, w tym danych odpowiedzi kontrolnych, lecz wpro ­
wadzeniu, jako dodatkowego parametru, warto ści odpowiedzi kontrolnej, która 
będzie dopasowana za pomoc ą regresji nieliniowej. Przy zwykle 2-paramet ­
rowym równaniu regresji metoda ta stwarza konieczno ść dopasowania 3 para ­
metrów, a przez to wymaga wi ęcej punktów danych ni ż nieliniowa regresja 
danych, które s ą znormalizowane przy pomocy zadanej odpowiedzi kontrolnej.
 
Odwrotne przedzia ły ufności 
Obliczanie przedzia łów ufności regresji nieliniowej za pomoc ą odwrotnej esty ­
macji jest do ść złożone i nie jest dost ępne jako opcja standardowa w zwyk łych 
pakietach statystycznych programów komputerowych. Mo żna otrzyma ć przybli­ 
żone granice ufno ści za pomoc ą standardowych programów regresji nieliniowej 
z reparametryzacj ą (Bruce i Versteeg, 1992), co polega na przepisaniu równania 
matematycznego z żądanymi oszacowaniami punktowymi, np. EC  10 i EC  50 , jako 
parametrami, które maj ą być oszacowane. (We źmy funkcj ę I = f (α, β, stężenie) 
i wykorzystajmy definicyjne zale żności f (α, β, EC  10 ) = 0,1 i f ( α, β, EC  50 ) = 0,5, 
aby w miejsce f ( α, β, stężenie) podstawi ć równowa żną funkcję g (EC  10 , EC  50 , 
stężenie)).  
Bardziej bezpo średnie obliczenie (Andersen i inni, 1998) przeprowadza si ę, 
zachowuj ąc pierwotne równanie i stosuj ąc rozwini ęcie w szereg Taylora wokó ł 
średnich r  i i r 0 . 
Ostatnio popularne sta ły się „metody ładowania pocz ątkowego” („boot strap 
methods”). Metody takie wykorzystuj ą zmierzone dane oraz cz ęste powtórne 
próbkowanie kierowane generatorem liczb losowych do szacowania empirycz ­
nego rozk ładu wariancji.  
Literatura  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625–1632.  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485–1494.  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. 
Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405–420.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. OZNACZENIE BIODEGRADOWALNO ŚCI 
CZĘŚĆ I. ROZWA ŻANIA OGÓLNE  
I.1. WPROWADZENIE  
Opisano sze ść metod pozwalaj ących na sortowanie substancji 
chemicznych w celu biodegradowalno ści w aerobowych wodnych 
podłożach: 
a) rozpuszczalny w ęgiel organiczny (DOC) metoda „Die-Away” 
(metoda C.4-A);  
b) zmodyfikowane badanie przesiewowe OECD – DOC metoda 
„Die-Away” (metoda C.4-B);  
c) wydzielanie ditlenku w ęgla (CO  2 ) (Zmodyfikowane badanie 
Sturma) (metoda C.4-C);  
d) respirometria manometryczna (metoda C.4-D);  
e) zamkni ętej butli (metoda C.4-E);  
f) MITI (Ministerstwo Handlu Mi ędzynarodowego i Przemys łu – 
Japonia) (Metoda C.4-F).  
Zwykłe i ogólne rozwa żania do wszystkich sze ściu badań podano 
w części I metody. Punkty specyficzne dla poszczególnych metod 
podano w cz ęściach II–VII. Dodatki zawieraj ą definicje, wzory 
i materiał wiodący. 
Ćwiczenie porównawcze mi ędzynarodowego laboratorium OECD, 
przeprowadzone w 1988 r., pokaza ły ze metody daj ą zgodne wyniki. 
Jednakże w zale żności od fizycznych charakterystyk badanych 
substancji jedna lub inne metody s ą zalecane.  
I.2. WYBÓR ODPOWIEDNIEJ METODY  
W celu wybrania najbardziej odpowiedniej metody podstawowe jest 
posiadanie informacji na temat rozpuszczalno ści chemicznej, pr ęż­
ności pary i charakterystyk adsorpcji. Powinna by ć znana struktura 
chemiczna i wzór w celu obliczenia teoretycznych warto ści i/lub 
sprawdzenia warto ści pomierzonych parametrów, na przyk ład 
ThOD, ThCO  2 , DOC, TÓC, COD (zob. za łącznik I i II).  
Badania substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie w co 
najmniej 100 mg/l mog ą być oszacowane wszystkimi metodami, 
pod warunkiem że są one nielotne i nieabsorbuj ące. Dla tych 
substancji chemicznych, które s ą słabo rozpuszczalne w wodzie, 
lotne lub adsorbuj ące, odpowiednie metody wskazano w tabeli 
1. Sposób w który substancje chemiczne s łabo rozpuszczalne 
w wodzie mo żna przygotowa ć opisano w za łączniku III. Średnio 
lotne substancje chemiczne mog ą być badane metod ą DOC (metoda 
„Die-Away”), je żeli jest wystarczaj ąca przestrze ń na gaz 
w naczyniach pomiarowych (które powinny by ć odpowiednio zakor ­
kowane). W tym przypadku nale ży ustawić kontrolę abiotyczn ą, by 
nie pozwoli ć na jakiekolwiek straty fizyczne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Tabela 1  
Stosowalno ść metod badania  
Badanie Metoda analityczna Odpowiednio ść dla substancji, które s ą: 
Słabo 
rozpuszczalne lotne adsorbuj ące 
DOC Die-Away Rozpuszczalny w ęgiel 
organiczny — — +/- 
Zmod. OECD Die-Away Rozpuszczalny w ęgiel 
organiczny — — +/- 
Wydzielanie CO  2 Respirometria: wydzielanie 
CO 2 + — + 
Respirometria manomet ­
ryczna Respirometria manomet ­
ryczna: zu życie tlenu + +/- + 
Zamkniętej butla Respirometria: rozpusz ­
czony tlen +/- + + 
MITI Respirometria: zu życie 
tlenu + +/- +  
Wymagane s ą informacje na temat czysto ści lub wzgl ędnych 
stosunków g łównych sk ładników badanego materia łu w celu inter ­
pretacji uzyskanych wyników, szczególnie gdy wyniki s ą niskie lub 
marginalne.  
Informacje na temat toksyczno ści badanej substancji w stosunku do 
bakterii (za łącznik IV) s ą bardzo u żyteczne dla wyboru odpowied ­
nich stężeń badania i mog ą być podstawowe dla prawid łowej inter ­
pretacji niskich warto ści biodegradacji.  
I.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
W celu sprawdzenia procedury chemiczne substancje odniesienia 
spełniające kryteria łatwej biodegradowalno ści są badane przez 
umieszczenie w odpowiedniej kolbie równolegle do zwyk łego prze­
biegu badania.  
Odpowiednimi substancjami chemicznymi s ą anilina ( świeżo desty­
lowana), octan sodu i benzoesan sodu. Te chemiczne substancje odniesienia ca łkowicie degraduj ą się w tych metodach, nawet gdy 
nie dodano przezornie inokulum.
 
Zasugerowano, że należy szukać chemicznej substancji odniesienia, 
która by by ła łatwo biodegradowalna, lecz wymaga łaby dodania 
inokulum. Zaproponowano wodoroftalan potasu lecz potrzeba uzyskać więcej dowodów dla tej substancji przed jej zaakceptowa ­
niem jako substancji odniesienia.
 
W badaniach respirometrycznych, zwi ązki zawieraj ące azot oddzia ­ 
ływują na pobieranie tlenu z powodu procesu nitryfikacji (zob. 
załączniki II i V).  
I.4. ZASADA METOD BADA Ń 
Roztwór lub zawiesin ę substancji badanej na pod łożu mineralnym 
jest zaszczepiany i inkubowany w warunkach aerobowych 
w ciemno ści lub rozproszonym świetle. Ilo ść DOC w roztworze 
badanym powinna by ć utrzymywana tak ma ła jak to mo żliwe 
w porównaniu z ilo ścią DOC spodziewanej w substancji badanej. 
Wykonuje si ę poprawk ę na aktywno ść endogeniczn ą inokulum 
przez prowadzenie równoleg łych bada ń ślepych z inokulum, ale 
bez substancji badanej, chocia ż endogeniczna aktywno ść komórek 
w obecno ści substancji nie tak samo dok ładnie odpowiada tej 
w kontroli endogenicznej. Substancja odniesienia jest równolegle 
badana w celu sprawdzenia operacji procedury.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Ogólnie bior ąc, degradacja jest wykonywana przez oznaczanie para ­
metrów takich jak DOC, tworzenie CO  2 i pobrany tlen, wykonywane 
są pomiary w dostatecznie cz ęstych odst ępach czasu pozwalaj ących 
na identyfikacj ę początku i końca biodegradacji. Przy zastosowaniu 
automatycznych respirometrów pomiar staje si ę ciągły. DOC jest 
czasem mierzony dodatkowo do innych parametrów, lecz jest to 
zwykle wykonywane tylko na pocz ątku i końcu badania. Stosuje 
się także specyficzn ą analiz ę chemiczn ą do oceny 
pierwotnej degradacji substancji badanej i do oznaczenia st ężenia 
wszystkich utworzonych substancji po średnich (obligatoryjne 
w badaniu MITI).  
Zwykle badanie biegnie przez 28 dni. Badanie jednak że można 
zakończyć przed up ływem 28 dni, to jest wtedy kiedy krzywa biode ­
gradacji osi ąga plateau dla co najmniej 3 oznacze ń. Badania mo żna 
także wydłużyć ponad 28 dni, je żeli krzywa pokazuje, że biodegra ­
dacja rozpocz ęła się natomiast nie osi ągnięto plateau 28 dnia.  
I.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
I.5.1.  Odtwarzalno ść 
Z powodu istoty biodegradacji oraz stosowania mieszanych populacji 
bakteryjnych oznaczenia przeprowadza ć co najmniej zdublowane.  
Ze zwyk łego doświadczenia wynika, i ż im większe jest st ężenie 
drobnoustrojów wst ępnie dodanych do pod łoża badawczego, tym 
mniejsze b ędą zmiany mi ędzy replikami. Badanie obr ączkowe 
również pokazuje, że mogą występować duże zmiany mi ędzy wyni ­
kami uzyskanymi przez ro żne laboratoria, lecz zwykle uzyskuje si ę 
dobrą zgodność przy zastosowaniu łatwo degradowalnych zwi ązków.  
I.5.2.  Wa żność badania  
Badanie uznaje si ę za ważne, jeżeli różnica ekstremów warto ści 
replikowanych zdj ętych z plateau badanej substancji pod koniec 
badania lub pod koniec badania 10-dniowego „okiennego” jest na 
koniec badania, odpowiednio, mniejsza od 20 %, oraz je żeli 
procentowa degradacja substancji odniesienia osi ągnęła poziom 
łatwej biodegradacji przez 14 dni. Je żeli jeden z tych warunków 
nie jest spe łniony badanie nale ży powtórzy ć. Z powodu ostro ści 
tych metod niskie warto ści niekoniecznie oznaczaj ą, że substancja 
badana nie jest biodegradowalna w warunkach środowiskowych, lecz 
wskazuje, że konieczne jest wi ęcej wysiłków do ustalenia biodegra ­
dowalności. 
Jeżeli w badaniu toksyczno ści, zawieraj ącym zarówno substancj ę 
badaną, jak i chemiczn ą substancj ę odniesienia, zachodzi mniej ni ż 
35 % degradacji (w oparciu o DOC) lub mniej ni ż 25 % (w oparciu 
o ThOD lub ThCO  2 ) w ciągu 14 dni, badan ą substancj ę można 
ocenić jako inhibitor (zob. tak że załącznik IV). Nale ży powtórzy ć 
serie bada ń, jeżeli możliwe jest u życie niższego stężenia badanej 
substancji i/lub wy ższego stężenia inokulum, lecz nie wi ększego 
niż 30 mg cia ła stałego/litr.  
I.6. PROCEDURY OGÓLNE I PRZYGOTOWANIA  
Ogólne warunki stosowane w badaniach podsumowano w tabeli 
2. Przyrz ąd oraz inne warunki eksperymentalne specyficznie 
właściwe dla poszczególnych bada ń opisano dalej, pod nag łówkami 
dla danego badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Tabela 2  
Warunki badania  
Badanie DOC (metoda 
„Die-Away”) CO 2 
wydzielanie Respirometria 
manometryczna Zmodyfiko ­
wane OECD 
badanie 
przesiewowe Zamknięta 
butla MITT (I)  
Stężenie 
badanej substancji jako 
mg/l 100 V 2–10 100 
mg DOC/l 10–40 10–20 10–40 
mg ThOD/1 50–100 5–10 
Stężenie 
inokulum 
(komórek/l, 
przybliżone) ≤ 30 mg/1 SS 
lub ≤ 100 ml wycieku/l 
(10
 7 – 10  8 ) 0,5 ml 
wtórny 
wyciek/1 
(10 5 ) < 5 ml 
wycieku/1 
(10 4 –10  6 ) 30 mg/1 SS 
(10 7 -10 8 ) 
Stężenie pier­
wiastków w podłożu 
mineralnym 
(w mg/1) 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 
Fe 0,05 - 0,1 V 0,05 - 0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 korzystnie 7,0 Temperatura 22 ± 2
 o C 25 ± I  o C 
DOC = rozpuszczony w ęgiel organiczny ThOD = teoretyczne 
zapotrzebowanie tlenu SS = zawieszone cia ła 
stałe
 
I.6.1.  Woda rozcie ńczająca 
Stosuje si ę dejonizowan ą lub destylowan ą wodę, wolne od inhibuj ­ 
ących stężeń substancji toksycznych (np. jonów Cu  ++ ). Musi 
zawierać nie więcej niż 10 % zawarto ści węgla organicznego wpro ­
wadzanego w badanym materiale. Konieczna jest woda do bada ń 
o wysokiej czysto ści w celu eliminacji wysokich warto ści dla śłepej 
próby. Zanieczyszczenia mog ą pochodzi ć z naturalnych zanieczysz ­
czeń wody, ale równie ż z żywic jonowymiennych oraz lizowanych 
materiałów bakteryjnych i glonów. Dla ka żdej serii bada ń stosuje si ę 
tylko jedn ą partię wody, sprawdzon ą uprzednio analiz ą DOC. Takie 
sprawdzenie nie jest konieczne dla badania „zamkni ętej butli”, lecz 
zapotrzebowanie wody na tlen musi by ć niskie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Roztwory podstawowe sk ładników mineralnych  
Do sporz ądzenia roztworów badanych sporz ądzane są roztwory 
podstawowe o odpowiednich st ężeniach sk ładników mineralnych. 
Następujące roztwory podstawowe s ą używane (o ró żnych wspó ł­
czynnikach rozcie ńczenia) dla metod DOC „Die-Away” zmodyfiko ­
wanego badania przesiewowego OECD, wydzielanie CO  2 , respiro­
metrii manometrycznej i badania „zamkni ętej butli”.  
Współczynniki rozcie ńczenia oraz, dla badania MITI, w łaściwie 
przygotowane pod łoża mineralne podano pod nag łówkami w łaści­
wych bada ń. 
Roztwory podstawowe:  
Przygotowa ć następujące roztwory podstawowe, stosuj ąc odczynniki 
czystości analitycznej. 
a) Diwodoroortofosforan monopotasu, KH  2 PO 4 8,50 g 
Monowodoroortofosforan dipotasu, K  2 HPO  4 21,75 g 
Diwodny monowodoroortofosforan disodium 
Na 2 HPO  4 . 2 H  2 O 33,40 g 
Chlorek amonu, NH  4 CI 0,50 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. Warto ść 
pH roztworu powinna by ć 7,4. 
b) Chlorek wapnia, bezwodny, CaCl  2 27,50 g 
lub chlorek wapnia diwodny, CaCl  2 , 2 H  2 O 36,40 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. 
c) Heptawodny siarczan magnezu, MgSO  4 . 7 H  2 O 22,50 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. 
d) Heksawodny chlorek żelaza (III), FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra.  
Uwaga: aby nie przygotowywa ć niniejszego roztworu bezpo średnio 
przed użyciem, doda ć kroplę stężonego kwasu solnego lub 0,4 grama 
soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na litr.  
I.6.3.  Roztwory podstawowe substancji chemicznych  
Przykładowo rozpu ścić 1–10 g odpowiednio badanej substancji 
chemicznej lub chemicznej substancji odniesienia w wodzie dejoni ­
zowanej i dope łnić do 1 litra, gdy rozpuszczalno ść przekracza 1 g/l. 
Z drugiej strony, przygotowa ć roztwory podstawowe w pod łożu 
mineralnym lub doda ć substancje chemiczn ą bezpośrednio do 
podłoża mineralnego. Post ępowanie ze s łabo rozpuszczalnymi 
substancjami chemicznymi – zob. za łącznik III, ale w badaniu 
MITI (metoda C.4-F) nie stosuje si ę ani rozpuszczalników, ani 
środków emulsyfikuj ących.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Materia ł inokulacyjny  
Inokulum mo że pochodzi ć z różnych źródeł: aktywowany osad, 
ścieki kanalizacyjne (niechlorowane), wody powierzchniowe 
i gleby lub ich mieszaniny. Dla bada ń DOC „Die-Away”, wydzie ­
lania CO  2 i respirometrii manometrycznej, je żeli stosowany jest akty ­
wowany osad, powinien by ć pobrany z oczyszczalni ścieków 
i urządzeń skali laboratoryjnej przyjmuj ących głównie ścieki 
domowe. Materia ł inokulacyjny z innych źródeł, okazał się dawać 
bardziej rozproszone wyniki. Dla zmodyfikowanego badania przesie ­
wowego OECD i badania zamkni ętej butli potrzebne jest bardziej 
rozcieńczone inokulum bez k łaczków osadu i zalecanym źródłem 
jest ściek drugiego stopnia oczyszczalnia ścieków domowych lub 
urządzeń skali laboratoryjnej. Dla badania MITI inokulum jest otrzy ­
mywane z mieszanych źródeł i opisane jest pod nag łówkiem tego 
specyficznego badania.  
I.6.4.1.  Inokulum z aktywowanych osadów  
Zebrać świeżo pobraną próbkę aktywowanego osadu z komor ą napo­
wietrzania oczyszczalni ścieków lub urz ądzenia skali laboratoryjnej 
przerabiaj ącego głównie ścieki domowe. Odrzuci ć duże cząstki, 
jeżeli konieczne poprzez filtracje przez siatk ę o drobnym oczku 
i utrzymywa ć napowietrzanie.  
Alternatywnie, zsedymentowa ć lub odwirowa ć (np. 1 100 rpm, 
10 min) po usuni ęciu wszystkich du żych cząstek. Odrzuci ć nadsącz. 
Można przemy ć osad w pod łożu mineralnym. Zawiesi ć stężony osad 
w podłożu mineralnym dla uzyskania st ężenia 3–5 g zawiesiny cia ł 
stałych/l i napowietrza ć do wymaganego momentu.  
Osad powinien by ć pobrany z prawid łowo dzia łającej konwencjo ­
nalnej oczyszczalni ścieków. Je żeli pobrano osad z oczyszczalni 
o wysokiej szybko ści oczyszczania lub podejrzewa si ę zawartość 
inhibitorów, nale ży go przemy ć. Zsedymentowa ć lub odwirowa ć 
ponownie zawieszony osad po energicznym mieszaniu, odrzuci ć 
nadsącz i ponownie zawiesi ć umyty osad w dalszej obj ętości podłoża 
mineralnego. Powtarza ć tę procedur ę do czasu, gdy uzna si ę, iż jest 
wolny od nadmiaru substratów lub inhibitorów.  
Po zakończeniu ponownego zawieszenia, lub niepoddany obróbce 
osad, odstawi ć ich próbk ę do momentu jej u życia do ustalenia suchej 
masy ciał stałych w zawiesinie.  
Dalszą alternatyw ą jest homogenizacja aktywowanego osadu (3–5 
g zawiesiny cia ł stałych/l). Rozdrobni ć osad w mechanicznym 
rozdrabniaczu przy średniej szybko ści przez 2 minuty. Zsedymen ­
tować rozdrobniony osad przez 30 minut lub d łużej, gdy trzeba, 
i zdekantowa ć ciecz do u życia jako inokulum przy szybko ści 10 ml/l 
podłoża mineralnego.  
I.6.4.2.  Inne źródła inokulum  
Można je uzyska ć ze ścieków drugiego stopnia oczyszczalni ścieków 
lub urządzeń skali laboratoryjnej przyjmuj ących głównie ścieki 
domowe. Zebra ć świeżą próbkę i utrzymywa ć napowietrzan ą 
w czasie transportu. Pozwoli ć osadzić się przez 1 godzin ę lub prze ­
filtrować przez grub ą bibułę filtracyjn ą i zatrzyma ć zdekantowany 
wyciek lub je śli wymagane przefiltrowa ć z napowietrzaniem. Do 
100 ml tego typu inokulum mo że być użyte na litr pod łoża. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
Następnym źródłem inokulum s ą wody powierzchniowe. W tym 
przypadku zebra ć próbkę z odpowiedniej wody powierzchniowej, 
np. rzeki, jeziora i utrzymywa ć w napowietrzeniu przez wymagany 
czas. Jeżeli konieczne, zat ężyć inokulum przez filtracj ę lub odwiro ­
wanie.  
I.6.5.  Wst ępne sezonowanie inokulum  
Materiał inokulacyjny mo że być wstępnie sezonowany do warunków 
eksperymentalnych, lecz niewst ępnie adoptowany do badanej 
substancji. Wst ępne sezonowanie sk łada się z napowietrzania akty ­
wowanego osadu w pod łożu mineralnym lub ścieku drugiego stop ­
nia, przez 5–7 dni w temperaturze badania. Wst ępne sezonowanie 
poprawia czasem precyzje metod badania przez zmniejszenie 
wartości dla ślepej próby. Uwa żane jest za niekonieczne wst ępne 
sezonowanie inokulum dla metody MITI.  
I.6.6.  Kontrole abiotyczne  
Gdy wymagane, sprawdzi ć możliwą abiotyczn ą degradacj ę badanej 
substancji przez oznaczenie usuni ętego DOC, pobieranie tlenu lub 
wydzielania ditlenku w ęgla w sterylnych kontrolach niezawieraj ­ 
ących inokulum. Sterylizowa ć za pomoc ą filtracji przez membran ę 
(0,2–0,45 mikrona) lub przez dodanie odpowiedniej toksycznej substancji o odpowiednim st ężeniu. Jeżeli stosuje si ę filtracje 
membranow ą, pobrać próbki aseptycznie dla utrzymania sterylno ści. 
Chociaż absorpcj ę badanej substancji wykluczono z góry, badania, 
które mierz ą biodegradacj ę jako usuwanie DOC, szczególnie dla 
inokulum aktywowanego osadu, powinny zawiera ć kontrole abio ­
tyczne, zaszczepione i intoksykowane.
 
I.6.7.  Liczba kolb  
Liczba kolb w typowym badaniu jest opisana pod nag łówkiem 
każdego badania.  
Stosuje si ę następujące typy kolb:  
— zawiesina badana: zawieraj ących substancj ę badaną i inokulum,  
— ślepa próba inokulum: zawieraj ące tylko inokulum,  
— kontrola procedury: zawieraj ących substancje odniesienia 
i inokulum,  
— kontrola sterylno ści abiotycznej: sterylne, zawieraj ących 
substancję badaną (zob. I.6.6),  
— kontrola adsorpcji: zawieraj ących substancj ę badaną inokulum 
i środek sterylizuj ący, 
— kontrola toksyczno ści: zawieraj ących substancj ę badaną 
substancje odniesienia i inokulum.  
Obowiązkowe jest, by oznaczenia w zawiesinie badanej i w ślepej 
próbie inokulum by ły wykonywane równolegle. Wskazane jest 
wykonywanie oznacze ń w innych kolbach równie ż w oznaczeniach 
równoleg łych. 
To jednak że nie zawsze jest mo żliwe. Upewni ć się, że pobrano 
wystarczaj ącą ilość próbek lub odczytów do oceny procentowego 
usunięcia DOC w 10-dniowym badaniu „okiennym”.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. DANE I OCENA  
W obliczeniu D  t zastosowano procent degradacji, średnie warto ści 
zdublowanych pomiarów parametrów w obu badanych naczyniach i w ślepej próbie inokulum. Wzory s ą przedstawione w sekcjach 
poniżej właściwych bada ń. Przebieg degradacji jest zobrazowany 
graficznie i badanie 10-dniowe „okno” jest wskazane. Nale ży obli­
czyć i przedstawi ć w sprawozdaniu usuni ęcie procentowe uzyskane 
na koniec 10-dniowego „okna” i warto ść w plateau, lub pod koniec 
badania, w zale żności od tego, co jest odpowiednie.
 
W badaniach respirometrycznych zwi ązki zawieraj ące azot mog ą 
wpływać na pobieranie tlenu z powodu nitryfikacji (zob. za łączniki 
II i V).  
I.7.1.  Degradacja zmierzona za pomoc ą oznaczenia DOC  
Procentow ą degradacj ę D t przy każdym czasie pobierania próbki 
należy obliczy ć oddzielnie dla kolb zawieraj ących substancj ę badaną, 
stosując średnie warto ści zdublowanych pomiarów DOC w celu 
oszacowania wa żności badania (zob. I.5.2). Oblicza si ę to, stosuj ąc 
następujące równanie:  
D t ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Î 
Ü 100  
gdzie:  
D t = % degradacji w czasie t,  
C 0 = średnie pocz ątkowe st ężenie DOC w zaszczepionym 
podłożu kultury zawieraj ącym substancj ę badaną (mg 
DOC/l),  
C t = średnie stężenie DOC w zaszczepionym pod łożu kultury 
zawierającym substancj ę badaną w czasie t (mg DOC/l),  
C bo = średnie pocz ątkowe st ężenie DOC w zaszczepionym 
podłoże mineralnym ślepej próby (mg DOC/l),  
C bt = średnie st ężenie DOC w zaszczepionym pod łożu mine­
ralnym ślepej próby w czasie t (mg DOC/l).  
Wszystkie st ężenia są mierzone eksperymentalnie.  
I.7.2.  Degradacja mierzona w poj ęciu właściwej analizy  
Gdy dost ępne są dane z w łaściwej analizy, mo żna obliczy ć pier­
wotną biodegradacj ę z: 
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
gdzie:  
D t = % degradacji w czasie t, zwykle 28 dni,  
S a = ilość pozosta łości substancji badanej w zaszczepionym 
podłożu na koniec badania (mg),  
S b = ilość pozostałości substancji badanej w badaniu ślepej próby 
woda/pod łoże, do którego dodano tylko substancj ę badaną 
(mg).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Abiotyczna degradacja  
Gdy stosuje si ę kontrolę sterylną abiotyczn ą, obliczyć procentow ą 
abiotyczn ą degradacj ę stosując 
% abiotic degradation  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
gdzie:  
C s(o) = DOC st ężenie w sterylnej kontroli w dniu 0,  
C s(t) = DOC st ężenie w sterylnej kontroli w dniu t.  
I.8. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
W miarę możliwości sprawozdanie z bada ń zawiera nast ępujące 
elementy:  
— badana i chemiczne substancje odniesienia, i ich czysto ść, 
— warunki badania,  
— inokulum: natura i miejsce próbkowania(- ń), stężenie i wszystkie 
operacje przygotowania wst ępnego,  
— proporcja i charakter odpadu przemys łowego obecnego w ścieku, 
jeśli znany,  
— czas trwania badania i temperatura,  
— w przypadku s łabo rozpuszczalnych badanych substancji, zasto ­
sowane operacje,  
— zastosowana metoda badania; dla ka żdej zmiany procedury 
należy podać przyczyny uzasadnione naukowo i uzasadnienie,  
— arkusz danych,  
— wszystkie obserwowane zjawiska inhibicji,  
— wszystkie obserwowane abiotyczne degradacje,  
— dane w łaściwej analizy chemicznej, je śli dostępne, 
— dane analityczne etapów po średnich, je śli dostępne, 
— wykres procentowy degradacji w stosunku do czasu dla 
substancji badanych i odniesienia; fazy opó źnienia, fazy degra ­
dacji, 10-dniowe „okno” oraz nachylenie wykresu nale ży 
wyraźnie wskaza ć (załącznik I). Je żeli badanie odpowiada ło 
kryteriom wa żności, można użyć do wykresu średni 
procent degradacji w kolbach zawieraj ących substancje badan ą, 
— procentowe usuni ęcie po 10-dniowym „oknie” i w plateau lub na 
koniec badania.  
CZĘŚĆ II. BADANIE DOC METOD Ą „DIE-AWAY”  (Metoda 
C.4-A)  
II.1. ZASADA METODY  
Zmierzon ą objętość zaszczepionego pod łoża mineralnego, zawieraj ą­
cego znane st ężenie substancji badanej (10–40 mg DOC/l), jako 
pojedyncze nominalne źródło węgla organicznego napowietrza si ę 
w ciemno ści lub w rozproszonym świetle w 22 ± 2  o C. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Postępującą degradacj ę określa się analizą DOC w cz ęstych prze ­
działach czasowych przez 28 dni. Stopie ń biodegradacji jest obli ­
czany przez wyra żenie stężenia usuni ętego DOC (skorygowanego 
do tego ze ślepej próby inokulum w kontroli) jako procent st ężenia 
obecnego pocz ątkowo. Stopie ń pierwotnej biodegradacji mo że być 
także obliczony z dodatkowych analiz chemicznych wykonanych na 
początku i pod koniec inkubacji.  
II.2. OPIS METODY  
II.2.1.  Przyrz ąd 
a) Kolby sto żkowe, np. 250 ml do 2 1, w zale żności od obj ętości 
wymaganej dla analizy DOC.  
b) Wytrz ąsarka do akomodacji kolb sto żkowych – albo 
z automatyczn ą kontrolą temperatury, albo u żywaną w stałej 
temperaturze pokojowej, oraz wystarczaj ąca moc dla utrzymania 
aerobowych warunków we wszystkich kolbach.  
c) Przyrz ąd filtracyjny z odpowiednimi membranami.  
d) Analizator DOC.  
e) Przyrz ąd dla oznaczania rozpuszczonego tlenu.  
f) Wirówka.  
II.2.2.  Przygotowanie pod łoża mineralnego  
W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.  
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcie ńczającej, dodać 
1 ml roztworu (b) do (d) i dope łnić do 1 l wod ą rozcieńczającą. 
II.2.3.  Przygotowanie wst ępne inokulum  
Inokulum mo że być otrzymane z ró żnych źródeł: aktywowanego 
osadu, ścieków kanalizacyjnych, wód powierzchniowych, gleb lub 
z mieszaniny tu wymienionych.  
Zob. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 i I.6.5.  
II.2.4.  Przygotowanie kolb  
Jako przyk ład wprowadzi ć porcje 800 ml pod łoża mineralnego do 2 
1 kolb sto żkowych i doda ć wystarczaj ące objętości roztworów 
podstawowych substancji badanej i odniesienia do oddzielnych kolb dla uzyskania st ężenia równowa żnika chemicznego do 
10–40 mg DOC/l. Sprawdzi ć wartość pH i ustawi ć, gdy konieczne, 
do 7,4. Przygotowa ć materia ł inokulacyjny w kolbach 
z aktywowanym osadem lub innym źródłem inokuli (zob. I.6.4) do 
uzyskania st ężenia końcowego wi ększego ni ż 30 mg zawiesiny cia ł 
stałych/litr. Przygotowa ć także kontrole inokulum w pod łożu mine­
ralnym, lecz bez badanej substancji i chemicznej substancji odnie ­
sienia.
 
Jeśli wymagane, u żyć jedno naczynie dla sprawdzenia mo żliwych 
działań inhibicyjnych substancji badanej przez inokulacj ę roztworu 
zawierającego w pod łożu mineralnym, porównywalne st ężenia 
substancji tak badanej, jak i chemicznej substancji odniesienia.  
Także, jeżeli jest to wymagane, ustawi ć następną sterylną kolbę dla 
sprawdzenia, czy badana substancja degraduje si ę abiotycznie, 
używając niezaszczepiony roztwór substancji chemicznej (zob. I.6.6).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Dodatkowo, je żeli podejrzewa si ę, że badana substancja zostanie 
zaabsorbowana znacz ąco w szkle, osadzie itp., wykona ć wstępną 
ocenę prawdopodobnego wzrostu absorpcji, a zatem przydatno ści 
badania dla substancji chemicznej (zob. tabela 1). Nastawi ć kolby 
zawierające substancj ę badaną, inokulum i środek sterylizuj ący. 
Dopełnić objętość we wszystkich kolbach do 11 pod łożem mine­
ralnym i po wymieszaniu pobra ć próbkę z każdej kolby do ozna ­
czenia pocz ątkowego st ężenia DOC (zob. za łącznik II.4). Przykry ć 
otwory kolb np. aluminiow ą folią, w taki sposób by umo żliwić 
swobodną wymianę powietrza mi ędzy kolbą i otaczaj ącą atmosfer ą. 
Następnie włożyć naczynia do wytrz ąsarki celem rozpocz ęcia bada­
nia. 
II.2.5.  Liczba kolb w typowym przebiegu  
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana  
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum  
Kolba 5: Kontrola procedury  
Zalecane oraz gdy konieczne:  
Kolba 6: Kontrola sterylno ści abiotycznej  
Kolba 7: Kontrola adsorpcji  
Kolba 8: Kontrola toksyczno ści 
Zob. także I.6.7.  
II.2.6.  Przeprowadzenie badania  
Poprzez ca łe badanie oznacza ć stężenia DOC w ka żdej kolbie dupli ­
katu w znanych odst ępach czasu, wystarczaj ąco często, by mo żna 
było oznaczy ć 10-dniowe „okno” i usuni ęcie procentowe na koniec 
10-dniowego „okna”. Pobra ć tylko minimaln ą objętość zawiesiny 
badanej konieczn ą dla każdego oznaczenia.  
Przed pobieraniem próbek zmniejszy ć straty parowania z kolb przez 
dodanie wody rozcie ńczającej (I.6.1) w wymaganej ilo ści, jeśli 
konieczne. Zamiesza ć energicznie pod łoże kultury przed pobraniem 
próbki i upewni ć się, że materia ł przylegaj ący do ścianek naczynia 
jest rozpuszczony lub zawieszony, przed pobieraniem próbek. Prze ­
filtrować przez filtr membranowy lub odwirowa ć (zob. za łącznik 
II.4) natychmiast po pobraniu próbek. Analizowa ć odfiltrowane lub 
odwirowane próbki tego samego dnia, w innym razie przechowa ć 
w 2–4  o C przez maksimum 48 godzin, lub w ni ższej temperaturze - 
18 o C przez czas d łuższy. 
II.3. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
II.3.1.  Obróbka wyników  
Obliczyć procentow ą degradacj ę w czasie t, jak podano w I.7.1 
(oznaczanie DOC), i – do wyboru – wed ług I.7.2 (w łaściwa analiza).  
Zapisać wszystkie wyniki na do łączonych arkuszach danych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Wa żność wyników  
Zob. I.5.2.  
II.3.3.  Sporz ądzanie sprawozdania  
Zob. I.8.  
II.4. ARKUSZ DANYCH  
Przykład arkusza danych podano poni żej. 
BADANIE DOC METOD Ą „DIE-AWAY”  
1. LABORATORIUM  
2. DATA ROZPOCZ ĘCIA BADANIA  
3. SUBSTANCJA BADANA  
Nazwa:  
Stężenie roztworu podstawowego: … mg/l jako substancja 
chemiczna.  
Początkowe stężenie w pod łożu, t  0 : … mg/l jako substancja 
chemiczna.  
4. INOKULUM  
Źródło: 
Poddano traktowaniu:  
Wstępne sezonowanie, je śli wykonano:  
Stężenie zawiesiny cia ł stałych w mieszaninie reakcyjnej: … 
mg/l 
5. OZNACZENIA W ĘGLA  
Analizator w ęgla: 
Kolba nr DOC po n dniach (mg/1) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Badana substancja 
chemiczna plus ino-kulum 
1 a
 1 
a 2 
a, średnia 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, średnia 
C b(t) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
Kolba nr DOC po n dniach (mg/1) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Ślepa próba 
inoku-lum bez badanej substancji 3 C
 1 
C 2 
c, średnia C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, średnia 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH  
Kolba nr % degradacja po n dniach 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Srednia (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 i D 2 nie należy uśredniać jeśli znacznie si ę różnią. 
Uwaga:  podobne arkusze mo żna użyć dla chemicznej substancji 
odniesienia i kontroli toksyczno ści. 
7. KONTROLA ABIOTYCZNA  (do wyboru)  
Czas (dni) 
0 t  
DOC cone, (mg/l) kontrola sterylno ści C s(o) C s(t) 
% abiotyczna degradacja  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. WŁAŚCIWA ANALIZA CHEMICZNA  (do wyboru)  
ilość pozostałości badanej 
substancji na koniec badania 
(mg/l) % pierwotnej degradacji  
Kontrola sterylno ści S  b ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
ilość pozostałości badanej 
substancji na koniec badania 
(mg/l) % pierwotnej degradacji  
Zaszczepione pod łoże badawcze S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
CZĘŚĆ III.  ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIE ­
WOWE OECD  (Metoda C.4-B)  
III. 1. ZASADA METODY  
Zmierzon ą objętość podłoża mineralnego zawieraj ące znane st ężenie 
substancji badanej (10–40 mg DOC/litr) jako nominalne pojedyncze źródło węgla organicznego, zaszczepiono za pomoc ą 0,5 ml wycieku 
na litr pod łoża. Mieszanin ę napowietrza si ę w ciemno ści lub 
w rozproszonym świetle w 22 ± 2
 o C. 
Postępującą degradacj ę określa się analizą DOC w cz ęstych prze ­
działach czasowych przez 28 dni. Stopie ń biodegradacji jest obli ­
czany przez wyra żenie stężenia usuni ętego DOC (skorygowanego 
do tego ze ślepej próby inokulum w kontroli) jako procent st ężenia 
obecnego pocz ątkowo. Stopie ń pierwotnej biodegradacji mo że być 
także obliczony z dodatkowych analiz chemicznych wykonanych na 
początku i pod koniec inkubacji.  
III.2. OPIS METODY  
III.2.1. Przyrz ąd 
a) Kolby sto żkowe, np. 250 ml do 2 1, w zale żności od obj ętości 
wymaganej dla analizy DOC.  
b) Wytrz ąsarka do akomodacji kolb sto żkowych – albo 
z automatyczn ą kontrolą temperatury, albo u żywaną w stałej 
temperaturze pokojowej, oraz wystarczaj ąca moc dla utrzymania 
aerobowych warunków we wszystkich kolbach.  
c) Przyrz ąd filtracyjny z odpowiednimi membranami.  
d) Analizator DOC.  
e) Przyrz ąd dla oznaczania rozpuszczonego tlenu.  
f) Wirówka.  
III.2.2.  Przygotowanie pod łoża mineralnego  
W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.  
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 80 ml wody rozcie ńczającej, doda ć 
1 ml roztworu (b) do (d) i dope łnić do 1 litra wod ą rozcieńczającą. 
Niniejsza metoda wykorzystuje tylko 0,5 ml wycieku/litr jako 
inokulum i dlatego pod łoże może wymaga ć wzmocnienia śladowymi 
pierwiastkami i czynnikami wzrostu. Wykonuje si ę to przez dodanie 
1 ml każdego z nast ępujących roztworów, na litr ko ńcowego pod łoża: ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Roztwór pierwiastków śladowych: 
Siarczan manganu tetrawodny MnSO  4 . 4 H  2 O 39,9 mg 
Kwas borowy, H  3 BO 3 57,2 mg 
Siarczan cynku heptawodny ZnSO  4 . 7 H  2 O 42,8 mg 
Heptamolibdenian amonu (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Fe-chelata (FeCl  3 kwasu etylenodiaminotetraocto ­
wego) 100,0 mg 
Rozpuścić w i dope łnić do 1 000 ml wod ą rozcień­
czającą 
Roztwór witaminowy: Ekstrakt dro żdży 15,0 mg
 
Rozpuścić ekstrakt dro żdży w 100 ml wody. Sterylizowa ć przez 
przepuszczenie przez membran ę 0,2 mikrona, lub przygotowa ć na 
świeżo. 
III.2.3.  Przygotowanie wst ępne inokulum  
Inokulum mo że być otrzymane ze ścieków drugiego stopnia oczysz ­
czalni ścieków lub urz ądzeń skali laboratoryjnej przyjmuj ących 
głownie ścieki domowe (zob. I.6.4.2 i I.6.5).  
Stosuje si ę 0,5 ml na litr pod łoża mineralnego.  
III.2.4.  Przygotowanie kolb  
Jako przyk ład wprowadzi ć porcje 800 ml pod łoża mineralnego do 2- 
litrowych kolb sto żkowych i doda ć wystarczaj ące objętości 
roztworów podstawowych substancji badanej i odniesienia do 
oddzielnych kolb dla uzyskania st ężenia równowa żnika chemicznego 
do 10–40 mg DOC/l. Sprawdzi ć wartość pH i ustawi ć, gdy 
konieczne, do 7,4. Zaszczepi ć kolby wyciekiem ściekowym 0,5 ml/ ­
litr (zob. I.6.4.2). Przygotowa ć także kontrole inokulum w pod łożu 
mineralnym, lecz bez badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia.
 
Jeśli wymagane, u żyć jedno naczynie dla sprawdzenia mo żliwych 
działań inhibicyjnych substancji badanej przez inokulacj ę roztworu 
zawierającego w pod łożu mineralnym, porównywalne st ężenia 
substancji tak badanej, jak i chemicznej substancji odniesienia.  
Także, jeżeli jest to wymagane, ustawi ć następną sterylną kolbę dla 
sprawdzenia, czy badana substancja degraduje si ę abiotycznie, 
używając niezaszczepiony roztwór substancji chemicznej (zob. I.6.6).  
Dodatkowo, je żeli podejrzewa si ę, że badana substancja zostanie 
zaabsorbowana znacz ąco w szkle, osadzie itp., wykona ć wstępną 
ocenę prawdopodobnego wzrostu absorpcji, a zatem przydatno ści 
badania dla substancji chemicznej (zob. tabela 1). Nastawi ć kolby 
zawierające substancj ę badaną, inokulum i środek sterylizuj ący. 
Dopełnić objętość we wszystkich kolbach do 1 litra pod łożem mine­
ralnym i po wymieszaniu pobra ć próbkę z każdej kolby do oznaczenia 
początkowego st ężenia DOC (zob. za łącznik II.4). Przykry ć otwory 
kolb np. aluminiow ą folią, w taki sposób by umo żliwić swobodn ą 
wymianę powietrza mi ędzy kolbą i otaczaj ącą atmosfer ą. Następnie 
włożyć naczynia do wytrz ąsarki celem rozpocz ęcia badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Liczba kolb w typowym przebiegu  
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana  
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum  
Kolba 5: Kontrola procedury  
i zalecane oraz gdy konieczne:  
Kolba 6: Kontrola sterylno ści abiotycznej  
Kolba 7: Kontrola adsorpcji  
Kolba 8: Kontrola toksyczno ści 
Zob. także I.6.7.  
III.2.6.  Przeprowadzenie badania  
Poprzez ca łe badanie oznacza ć stężenia DOC w ka żdej kolbie dupli ­
katu w znanych odst ępach czasu, wystarczaj ąco często, by mo żna 
było oznaczy ć 10-dniowe „okno” i usuni ęcie procentowe na koniec 
10-dniowego „okna”. Pobra ć tylko minimaln ą objętość zawiesiny 
badanej konieczna dla ka żdego oznaczenia.  
Przed pobieraniem próbek zmniejszy ć straty parowania z kolb przez 
dodanie wody rozcie ńczającej (I.6.1) w wymaganej ilo ści, jeśli 
konieczne. Zamiesza ć energicznie pod łoże kultury przed pobraniem 
próbki i upewni ć się że materia ł przylegaj ący do ścianek naczynia 
jest rozpuszczony lub zawieszony, przed pobieraniem próbek. Prze ­
filtrować przez filtr membranowy lub odwirowa ć (zob. za łącznik 
II.4) natychmiast po pobraniu próbek. Analizowa ć odfiltrowane lub 
odwirowane próbki tego samego dnia, w innym razie przechowa ć 
w 2–4  o C przez maksimum 48 godzin, lub w ni ższej temperaturze - 
18 o C przez czas d łuższy. 
III.3. DANE AND SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
III.3.1.  Obróbka wyników  
Obliczyć procentow ą degradacj ę w czasie t, jak podano w I.7.1 
(oznaczanie DOC), i – do wyboru – pod I.7.2. (w łaściwa analiza).  
Zapisać wszystkie wyniki na do łączonych arkuszach danych.  
III.3.2. Wa żność wyników  
Zob. I.5.2.  
III.3.3. Sporz ądzanie sprawozdania  
Zob. I.8.  
III.4. ARKUSZ DANYCH  
Przykład arkusza danych podano poni żej. 
ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIEWOWE OECD  
1. LABORATORIUM  
2. DATA ROZPOCZ ĘCIA BADANIA  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. SUBSTANCJA BADANA  
Nazwa:  
Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr jako substancja 
chemiczna  
Początkowe stężenie w pod łożu, t  o : … mg/litr jako substancja 
chemiczna  
4. INOKULUM  
Źródło: 
Poddano traktowaniu:  
Wstępne sezonowanie, je śli wykonano:  
Stężenie zawiesiny cia ł stałych w mieszaninie reakcyjnej: mg/l  
5. OZNACZENIA W ĘGLA  
Analizator wegla:  
Kolba nr DOC po n dniach (mg/1) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Badana substancja 
chemiczna plus inokulum 
1 a
 1 
a 2 
a, średnia 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, średnia 
C b(t) 
Ślepa próba 
inokulum bez 
badanej substancji 3 C 1 
C 2 
c, średnia C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, średnia 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH  
Kolba nr % degradacja po n dniach 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
Kolba nr % degradacja po n dniach 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Srednia (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 i D 2 nie mogą być uśrednian, je żeli znacznie si ę różnią. 
Uwaga:  podobne arkusze mo żna stosowa ć dla chemicznej substancji 
odniesienia i kontroli toksyczno ści. 
7. KONTROLA ABIOTYCZNA  (do wyboru)  
Czas (dni) 
0 t  
DOC cone, (mg/l) kontrola sterylno ści C s(o) C s(t) 
% abiotyczna degradacja  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100  
8. WŁAŚCIWA ANALIZA CHEMICZNA  (do wyboru)  
ilość pozostałości badanej 
substancji na koniec badania 
(mg/1) % pierwotnej degradacji  
Kontrola sterylno ści S  b 
Zaszczepione pod łoże badawcze S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
CZĘŚĆ IV. BADANIE WYDZIELANIA CO  2 (Metoda C.4-C)  
IV.1. ZASADA METODY  
Zmierzona obj ętość zaszczepionego pod łoża mineralnego, zawieraj ą­
cego znane st ężenie badanej substancji (10–20 mg DOG lub TOC/l) 
jako nominalne pojedyncze źródło węgla organicznego, jest napowiet ­
rzana przez przepuszczanie powietrza wolnego od ditlenku w ęgla 
z kontrolowan ą szybkością w ciemno ści lub rozproszonym świetle. 
Degradacja jest prowadzona przez 28 dni przez oznaczanie wytwarza ­
nego ditlenku w ęgla, który jest poch łaniany w wodorotlenku 
sodowym lub barowym i mierzony za pomoc ą miareczkowania pozos ­
tałego wodorotlenku lub jako nieorganiczny w ęgiel. Ilość ditlenku 
węgla wydzielonego z badanej substancji (skorygowana dla tej uzys ­
kanej ze ślepej próby inokulum) jest wyra żana jako procent ThCO  2 . 
Stopień biodegradacji mo żna także obliczy ć z dodatkowej analizy 
DOG wykonanej na pocz ątku i końcu inkubacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. OPIS METODY  
IV.2.1.  Przyrz ąd 
a) Kolby, 2–5 litra, ka żda zaopatrzona w rurk ę napowietrzaj ącą 
sięgającą blisko dna naczynia i w wylot.  
b) Mieszad ła magnetyczne przy ocenie s łabo rozpuszczalnych 
substancji chemicznych.  
c) Butle absorpcji gazu.  
d) Urządzenia do kontroli i pomiaru przep ływu powietrza.  
e) Przyrz ąd do przemywania ditlenku w ęgla, dla przygotowania 
powietrza wolnego od ditlenku w ęgla; alternatywnie mieszanina 
tlenu i azotu wolnych od ditlenku w ęgla z butli gazowych, 
używane w prawid łowej proporcji (20 % O  2 : 80 % N  2 ). 
f) Przyrz ąd do oznaczania ditlenku w ęgla – albo miareczkowaniem, 
albo jedn ą z postaci analizatora w ęgla nieorganicznego.  
g) Urządzenie filtracji membranowej (do wyboru).  
h) Analizator DOG (do wyboru).  
IV.2.2.  Przygotowanie pod łoża mineralnego  
W celu przygotowania roztworów podstawowych zob. I.6.2.  
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcie ńczającej, dodać 
1 ml roztworu (b) do (d) i dope łnić do 1 l wod ą rozcieńczającą. 
IV.2.3.  Przygotowanie wst ępne inokulum  
Inokulum mo żna otrzyma ć z różnych źródeł: aktywowany osad; 
ścieki kanalizacyjne; wody powierzchniowe; gleby lub 
z mieszaniny tu wymienionych.  
Zob. I.6.4., I.6.4.1, I.6.4.2 i I.6.5.  
IV.2.4.  Przygotowanie kolb  
Przykładowo wskazano nast ępujące objętości i wagi dla 5-litrowych 
kolb zawieraj ących 3 litry zawiesiny. Je żeli używa się mniejszych 
objętości, należy je odpowiednio zmodyfikowa ć, ale należy zapewni ć 
że utworzony ditlenek w ęgla zostanie zmierzony dok ładnie.  
Do każdej 5-litrowej kolby doda ć 2 400 ml pod łoża mineralnego. 
Dodać odpowiedni ą objętość przygotowanego aktywowanego osadu 
(zob. I.6.4.1 i I.6.5) dla otrzymania st ężenia zawiesiny cia ł stałych 
niewiększego ni ż 30 mg/l w ko ńcowej 3-litrowej zaszczepionej 
mieszaninie. Alternatywnie, rozcie ńczyć wpierw przygotowany 
osad do uzyskania zawiesiny 500–1 000 mg/l w pod łożu mineralnym 
przed dodaniem podwielokrotno ści do zawarto ści 5-litrowej kolby, 
dla uzyskania st ężenia 30 mg/l; zapewnia to wi ększą dokładność. 
Można użyć innych źródeł inokulum (zob. I.6.4.2).  
Napowietrza ć te zaszczepione mieszaniny powietrzem wolnym od 
ditlenku w ęgla przez noc celem przep łukania systemu z ditlenku 
węgla. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Dodać badany materia ł oraz substancje odniesienia oddzielnie, jako 
znaną objętość roztworów podstawowych, do replikowanych kolb 
dla uzyskania st ężeń wnoszących udzia ł przez dodane substancje 
chemiczne, 10 do 20 mg DOC lub TOC/l; pozostawi ć kilka kolb 
bez dodawania substancji chemicznych jako kontrole inokulum. 
Dodać badane s łabo rozpuszczalne substancje bezpo średnio do 
kolb na podstawie masy lub obj ętości lub post ępować jak opisano 
w załączniku III.  
Jeżeli wymagane, u żyć jedną kolbę do sprawdzenia mo żliwego dzia ­ 
łania inhibicyjnego badanej substancji przez dodanie zarówno 
badanej jak i substancji odniesienia, w tych samych st ężeniach jak 
obecne w innych kolbach.  
Także, jeżeli wymagane, u żyć sterylnej kolby do sprawdzenia czy 
badana substancja jest degradowana abiotycznie przez u życie nieza ­
szczepionego roztworu substancji chemicznej (zob. I.6.6). Steryli ­
zować przez dodanie substancji toksycznej o odpowiednim st ężeniu.  
Dopełnić objętości zawiesin we wszystkich kolbach do 3l dodaj ąc 
podłoże mineralne uprzednio napowietrzone powietrzem wolnym od 
CO 2 . Alternatywnie, mo żna pobra ć próbki do analizy DOC (zob. 
załącznik II.4) i/lub w łaściwej analizy. Pod łączyć butle absorpcyjne 
do wylotów powietrza kolb.  
Jeżeli używany jest wodorotlenek baru, po łączyć trzy butle absor ­
pcyjne, ka żda zawieraj ąca 100 ml 0,0125 M roztworu wodorotlenku 
baru, w seriach do kazdej 5-litrowej kolby. Roztwór musi by ć wolny 
od wytrąconych siarczanów oraz w ęglanów i jego st ężenie musi by ć 
oznaczone bezpo średnio przed u życiem. Je żeli używa się wodoro­
tlenek sodu, pod łączyć dwie pu łapki, druga dzia ła jako kontrola 
pokazania, że cały ditlenek w ęgla zosta ł zaabsorbowany 
w pierwszej. Butle absorpcyjne wyposa żone w zamkni ęcia typu 
kroplówkowego s ą odpowiednie. Doda ć 200 ml 0,05 
M wodorotlenku sodu do ka żdej butli, która jest odpowiednia do 
zaabsorbowania ca łkowitej ilo ści ditlenku w ęgla wydzielonego po 
całkowitej degradacji badanej substancji. Roztwory wodorotlenku 
sodu, nawet świeżo przygotowane, mog ą zawierać ślady węglanów; 
jest to korygowane przez odj ęcie węglanów ze ślepej próby.  
IV.2.5.  Liczba kolb w typowym przebiegu  
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana  
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum  
Kolba 5: Kontrola procedury  
oraz zalecane i gdy konieczne:  
Kolba 6: Kontrola sterylno ści abiotycznej  
Kolba 7: Kontrola toksyczno ści 
Kolba 8: Kontrola toksyczno ści 
Zob. także I.6.7.  
IV.2.6.  Przeprowadzenie badania  
Rozpocząć badanie przez wpuszczenie p ęcherzyków powietrza 
wolnego od ditlenku w ęgla przez zawiesiny z szybko ścią 30–100 ml/ ­
min. Pobiera ć próbki absorbenta ditlenku w ęgla okresowo do analiz 
na zawarto ść CO  2 . W trakcie pierwszych dziesi ęciu dni zalecane jest, 
by analizy by ły wykonywane co drugi lub trzeci dzie ń, a następnie 
co piąty, aż do 28 dnia, tak by okres 10-dniowego okna by ł ziden­
tyfikowany.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
W dniu 28 pobra ć próbki (do wyboru) do analizy DOC i/lub 
właściwej analizy, pomierzy ć pH zawiesin i doda ć 1 ml stężonego 
kwasu solnego do ka żdej kolby; napowietrza ć przez noc do wyp ę­
dzenia ditlenku w ęgla obecnego w badanych zawiesinach. Dnia 29 
wykonać analizę wydzielonego ditlenku w ęgla. 
W dniu pomiaru CO  2 rozłączyć absorber wodorotlenku baru 
najbliższy kolby i zmiareczkowa ć roztwór wodorotlenku za pomoc ą 
HCl 0,05 M, stosuj ąc fenoloftalein ę jako wska źnik. Przesun ąć pozos­
tałe absorbery o jedno miejsce bli żej kolby i umie ścić nowy absorber 
zawierający 100 ml świeżego 0,0125 M wodorotlenku baru na 
dalszym ko ńcu serii. Wykona ć miareczkowania wed ług potrzeby, 
na przykład gdy podstawowe str ącenie jest widoczne w pierwszej 
pułapce i przed str ąceniem w drugim, lub co najmniej co tydzie ń. 
Alternatywnie, z NaOH jako absorbentem, pobra ć strzykawk ą małą 
próbkę (w zale żności od charakterystyki stosowanego analizatora 
węgla) roztworu wodorotlenku sodu z absorbera najbli ższego kolbie. 
Wstrzykn ąć próbkę do części IC analizatora w ęgla do bezpo średniej 
analizy wydzielonego ditlenku w ęgla. 
Analizowa ć zawartość drugiej pu łapki tylko na koniec badania dla 
skorygowania przenoszenia ditlenku w ęgla. 
IV.3. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
IV.3.1.  Obróbka wyników  
Ilość CO  2 zatrzymana w absorberze przy miareczkowaniu jest dana 
przez:  
mg CO  2 = (100 × C  B 0,5 × V × C  A ) × 44  
gdzie:  
V = obj ętość HCl u żytego do miareczkowania 100 ml 
w absorberze (ml),  
C B = stężenie roztworu wodorotlenku baru (M),  
C A = stężenie roztworu kwasu solnego (M),  
jeśli C  B wynosi 0,0125 M i C  A jest 0,05 M, miareczkowanie 100 ml 
wodorotlenku baru daje 50 ml, a waga CO  2 jest dana przez:  
0; 05 
2 × 44 × ml HCI miareczkuj ącego = 1,1 × ml HCI  
Zatem w tym przypadku dla przeliczenia obj ętości HCl miareczkuj ą­
cego na wytworzone miligramy CO  2 , współczynnik wynosi 1,1.  
Obliczyć wagi wytworzonego CO  2 z samego inokulum oraz 
z inokulum plus badana substancja u żywając odnośne warto ści 
miareczkowania, a ró żnica jest wag ą CO  2 wytworzonego przez 
samą badaną substancj ę. 
Przykładowo, je żeli samo inokulum daje zmiareczkowane 48 ml oraz 
inokulum plus badana substancja daje 45 ml,  
CO 2 z inokulum = 1,1 × (50 – 48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 z inokulum plus badana substancja = 1,1 × (50 – 45) = 5,5 mg  
Zatem waga CO  2 wytworzonego z badanej substancji wynosi 
3,3 mg.  
Procentowa biodegradacja jest obliczana z:  
% degradacja ¼ mg CO  2 wytworz Ü 100 
ThCO  2 Ü mg dodanej substancji badanej  
lub, 
% degradacja ¼ mg CO  2 wytworzory Ü 100 
mg TOC dodanego w badaniu  Ü 3; 67 
3,67 istniej ący współczynnik konwersji (44/12) w ęgla do ditlenku 
węgla. 
Uzyskać procentow ą degradacj ę po każdym przedziale czasu przez 
dodanie stosunków procentowych warto ści ThCO  2 obliczonych dla 
każdego z dni, do czasu w jakim zmierzono.  
Dla absorberów z wodorotlenkiem sodu, obliczy ć ilość wytworzo ­
nego ditlenku w ęgla, wyra żając jako IC (mg), przez pomno żenie 
stężenia IC w absorbencie przez obj ętość absorbenta.  
Obliczyć procentow ą degradacj ę z: 
% of ThCO  2 ¼ mg IC z badanej kolby  Ä mg IC ze ślepej prúby 
MG TOC dodanego jako substancja badana  Ü 100 
Obliczyć usunięcie DOC (do wyboru) jak opisano pod I.7. Zapisa ć te 
i wszystkie inne wyniki na przygotowanych arkuszach danych.  
IV.3.2.  Ważność wyników  
Zawartość IC zawiesiny badanej substancja w pod łożu mineralnym 
na początku badania musi by ć mniejsza ni ż 5 % warto ści TC, 
a całkowite wydzielanie CO  2 w ślepej próbie z inokulum na ko ńcu 
badania nie powinna zwykle przekracza ć 40 mg/l pod łoża. Jeżeli 
uzyskuje si ę wartości wyższe niż 70 mg CO  2 /litr, dane i technika 
eksperymentalna musz ą być krytycznie przebadane.  
Zob. także I.5.2.  
IV.3.3.  Sporz ądzanie sprawozdania  
Zob. I.8.  
IV.4. ARKUSZ DANYCH  
Przykład arkusza danych podano poni żej. 
BADANIE WYDZIELANIA DITLENKU W ĘGLA  
1. LABORATORIUM  
2. DATA ROZPOCZ ĘCIA BADANIA  
3. SUBSTANCJA BADANA  
Nazwa:  
Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr jako substancja 
chemiczna  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Wstępne stężenie. w pod łożu: … mg/litr jako substancja 
chemiczna  
Całkowity C dodany do kolby: … mg C  
ThCO  2 : mg CO  2 
4. INOKULUM  
Źródło: 
Poddano traktowaniu:  
Przygotowanie wst ępne, o ile stosowano:  
Stężenie zawiesiny cia ł stałych w mieszaninie reakcyjnej: mg/litr  
5. WYTWARZANIE DITLENKU W ĘGLA I DEGRADO ­
WALNO ŚĆ 
Metoda: Ba(OH)/NaOH/inne  
Czas 
(dzień) CO 2 utworzonego 
w badaniu 
(mg) CO 2 utworzonego 
w ślepej próbie 
(mg) CO 2 utworzony 
zbiorczo (mg) 
(badanie minus średnia 
ślepej próby) ThCO  2 
zbiorczo  CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 średnia 3 
4 średnia 1 2 1 2 średnia  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Uwaga: podobne arkusze mog ą być używane dla chemicznej 
substancji odniesienia i kontroli toksyczno ści 
6. ANALIZA W ĘGLA  (do wyboru)  
Analizator w ęgla: 
Czas (dzie ń) Ślepa próba mg/l Badana substancja chemiczna mg/l  
0 C  b(o) C 0 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) lub w ko ńcu inkubacju  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% DOC usuni ętego ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
1 Ä C t Ä C bðoÞ Î 
Ü 100  
7. DEGRADACJA ABIOTYCZNA  (do wyboru)  
% abiotycznej degradacji =  CO  2 Ä CO  2 utworzonego w kolbie  ðstarliteÞpo 28 dniach ðmgÞ 
ThCO  2 ðmgÞ Ü 100 
CZĘŚĆ V.  BADANIE RESPIROMETRII MANOMET ­
RYCZNEJ  (Metoda C.4-D)  
V.1. ZASADA METODY  
Zmierzona obj ętość zaszczepionego pod łoża mineralnego, zawieraj ą­
cego znane st ężenie badanej substancji (100 mg/litr substancji bada ­
nej, dająca co najmniej 50–100 mg ThOD/litr) jako nominalnego 
pojedynczego źródła węgla organicznego, jest mieszana 
w zamkni ętej kolbie w sta łej temperaturze (± 1  o C lub bli żej) do 
28 dnia w łącznie. Zu życie tlenu jest oznaczane albo przez pomiary 
ilości tlenu (wytwarzanego elektrolitycznie) wymaganego do utrzy ­
mania sta łej objętości gazu w kolbie respirometru, lub przez zmian ę 
w objętości lub ci śnieniu (lub w kombinacji dwóch) w aparacie. 
Wydzielany ditlenek w ęgla jest absorbowany w roztworze wodoro ­
tlenku potasu lub w innym odpowiednim absorbencie. Ilo ść tlenu 
pobrana przez badan ą substancj ę (skorygowana o pobór w ślepej 
próbie z inokulum, biegn ącej równolegle) jest wyra żana jako 
stosunek procentowy ThOD lub COD. Alternatywnie, pierwotna biodegradacja mo że być także obliczona z dodatkowych w łaściwych 
analiz wykonanych na pocz ątku i ko ńcu inkubacji, i ostatecznie 
przez analiz ę DOC.
 
V.2. OPIS METODY  
V.2.1.  Przyrz ąd 
a) odpowiedni respirometr;  
b) regulator temperatury, utrzymuj ący ± 1  o C lub lepsz ą; 
c) urządzenie do filtracji membranowej (do wyboru);  
d) analizator w ęgla (do wyboru).  
V.2.2.  Przygotowanie pod łoża mineralnego  
W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.  
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcie ńczającej, dodać 
1 ml roztworu (b) do (d) i dope łnić do 1 litra wod ą rozcieńczającą. 
V.2.3.  Przygotowanie i przygotowanie wst ępne inokulum  
Inokulum mo że być uzyskane z ró żnych źródeł: aktywowany osad; 
ścieki kanalizacyjne; wody powierzchniowe i gleby lub mieszanina 
wymienionych.  
Zob. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. i I.6.5.  
V.2.4.  Przygotowanie kolb  
Przygotowa ć roztwory badane oraz chemicznej substancji odniesie ­
nia, w oddzielnych partiach, w pod łożu mineralnym równowa żnym 
stężeniu, zwykle 100 mg substancji chemicznej/litr (daj ący co 
najmniej 50–100 mg ThOD/litr), stosuj ąc roztwory podstawowe.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Obliczyć ThOD na podstawie tworzenia si ę soli amonowych, poza 
spodziewan ą nitryfikacj ą, dla której nale ży oprzeć obliczenia na 
tworzeniu si ę azotanów (zob. za łącznik II.2.)  
Oznaczyć wartości pH i je śli konieczne, ustawi ć na 7,4 ± 0,2.  
Substancje s łabo rozpuszczalne nale ży dodawa ć na dalszym etapie 
(zob. poni żej). 
Jeżeli ma by ć ustalona toksyczno ść badanej substancji, przygotowa ć 
dalszy roztwór z pod łoża mineralnego zawieraj ącego zarówno 
substancję badaną jak i chemiczn ą substancj ę odniesienia o tych 
samych st ężeniach co w poszczególnych roztworach.  
Jeżeli wymagany jest pomiar fizyko-chemicznego poboru tlenu, 
przygotowa ć roztwór badanej substancji zwykle 100 mg ThOD/litr 
który zosta ł sterylizowany dodatkiem odpowiedniej toksycznej 
substancji (zob. I.6.6).  
Wprowadzi ć konieczne obj ętości roztworów badanej substancji 
i chemicznej substancji odniesienia, odpowiednio, w co najmniej 
zdublowanych kolbach. Doda ć do następnych kolb tylko pod łoże 
mineralne (dla kontroli inokulum) i, je śli wymagane, zmieszane 
roztwory substancja badana/substancja odniesienia i roztwór sterylny.  
Jeśli badana substancja chemiczna jest s łabo rozpuszczalna, doda ć ją 
bezpośrednio na niniejszym etapie na podstawie wagi lub obj ętości 
lub postępować jak opisano w dodatku III. Doda ć wodorotlenek 
potasu, tabletki wapna sodowanego lub innego absorbenta do zbior ­
ników absorbera CO  2 . 
V.2.5.  Liczba kolb w typowym przebiegu  
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana  
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum  
Kolba 5: Kontrola procedury  
Zalecane i gdy konieczne:  
Kolba 6: Kontrola sterylna  
Kolba 7: Kontrola toksyczno ści 
Kolba 8: Kontrola toksyczno ści 
Zob. także I.6.7.  
V.2.6.  Przeprowadzenie badania  
Pozwolić na uzyskanie przez naczynia żądanej temperatury 
i zaszczepi ć odpowiednie naczynia przygotowanym aktywowanym 
osadem lub innym źródłem inokulum by otrzyma ć stężenie zawie ­
siny ciał stałych niewi ększe niż 30 mg/litr. Zestawi ć wyposażenie, 
włączyć mieszanie i sprawdzi ć szczelno ść, rozpocz ąć pomiar pobie ­
rania tlenu. Zwykle niewymagana jest dalsza uwaga inna ni ż zbie­
ranie koniecznych danych i wykonywanie codziennych sprawdze ń 
czy jest utrzymywane s ą właściwa temperatura i stosowne mieszanie.  
Obliczyć pobieranie tlenu z odczytów zbieranych w regularnych 
i częstych przedzia łach czasowych, stosuj ąc metody podane przez 
producenta wyposa żenia. Pod koniec inkubacji, zwykle 28-dniowej, 
zmierzyć pH zawarto ści kolb, szczególnie je śli pobieranie tlenu jest 
niższe lub wi ększe niż ThODNH  4 (dla związków zawieraj ących 
azot).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Jeżeli wymagane, pobra ć próbki z kolb respiratora, pocz ątkowej 
i końcowej, do analizy DOC lub w łaściwej chemicznej 
(zob. załącznik II.4). Przy pocz ątkowym pobieraniu upewni ć się, 
że objętość zawiesiny badanej pozostaj ącej w kolbie jest znana. 
Gdy tlen zostanie pobrany przez substancj ę badaną zawieraj ącą 
azot, oznaczy ć wzrost st ężenia azotynów oraz azotanów przez 
okres 28 dni i obliczy ć poprawk ę dla tlenu zu żytego przez nitryfi ­
kację (załącznik V).  
V.3. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
V.3.1.  Obróbka wyników  
Podzielić pobór tlenu (mg) przez badan ą substancj ę po danym czasie 
(skorygowa ć o tę ze ślepej kontroli inokulum po tym samym czasie) 
przez wag ę użytej badanej substancji. Da to BOD wyra żone jako mg 
tlenu/mg badanej substancji, czyli  
BOD ¼ ðmg O  2 pobúr przez badan ą substancje Ä mg O  2 pobrane w ślepej prúbieÞ 
ðmg badanej substancji w kolbie Þ 
= mg O  2 na mg badanej substancji.  
obliczyć procentow ą biodegradacje albo z:  
% biodegradacja ¼ % ThOD ¼ BODðmg O  2=mg subst : badanejÞ 
ThODðmg O  2 subst badanejÞ Ü 100 
lub postaci  
% COD ¼ BODðmg O  2=mg subst badanejÞ 
CODðmg O  2 subst badanejÞ Ü 100 
Należy zauważyć że te dwie metody niekoniecznie musz ą dawać te 
same warto ści; korzystniejsze jest u życie pierwszej metody.  
Dla badanych substancji zawieraj ących azot stosuje si ę odpowiednie 
ThOD (NH  4 lub N0  3 ) zgodnie z tym co jest znane lub oczekiwane 
o zajściu nitryfikacji (za łącznik II.2). Je żeli nitryfikacja zachodzi, 
lecz nie jest ca łkowita, obliczy ć poprawk ę dla tlenu zu żytego przez 
nitryfikacj ę ze zmian w st ężeniu azotynów i azotanów (za łącznik V).  
Gdy wykonano alternatywne oznaczenia w ęgla organicznego i/lub 
właściwej substancji chemicznej, obliczy ć procentow ą degradacj ę, 
jak opisano pod I.7.  
Zapisać wszystkie wyniki na do łączonych arkuszach danych.  
V.3.2.  Wa żność wyników  
Pobieranie tlenu w ślepej próbie z inokulum jest zwykle 20–30 mg 
O 2 /litr i powinno by ć niewiększe niż 60 mg/litr w ci ągu 28 dni. 
Wartości wyższe od 60 mg/litr wymagaj ą krytycznego sprawdzenia 
danych i technik eksperymentalnych. Je żeli warto ść pH jest poza 
zakresem 6–8,5, a zu życie tlenu przez badan ą substancj ę jest 
mniejsze ni ż 60 %, nale ży powtórzy ć badanie z ni ższym stężeniem 
badanej substancji.  
Zob. także 1.5.2.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Sporz ądzanie sprawozdania  
Zob. 1.8.  
V.4. ARKUSZ DANYCH  
Przykład arkusza danych podano poni żej. 
BADANIE RESPIROMETRII MANOMETRYCZNEJ  
1. LABORATORIUM  
2. DATA ROZPOCZ ĘCIA BADANIA  
3. SUBSTANCJA BADANA  
Nazwa:  
Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr  
Początkowe stężenie w pod łożu, C : … mg/litr  
Objętość w kolbie do bada ń (V): ml  
ThOD lub COD: mg O  2 /mg substancji badanej (NH  4 , N0  3 ) 
4. INOKULUM  
Źródło: 
Poddano traktowaniu:  
Wstępne sezonowanie, o ile wykonano:  
Stężenie zawiesiny cia ł stałych w mieszaninie reakcyjnej: … 
mg/l 
5. POBÓR TLENU: BIODEGRADOWALNO ŚĆ 
Czas (dni) 
0 7 14 21 28  
O 2 pobór (mg) 
badana 
substancja 1 
2 
a, średnia 
O 2 pobór (mg) 3 
4 
b, średnia 
skorygowane 
BOD (mg) (a 1 - b m ) 
(a 2 - b m ) 
BOD na mg 
badanej 
substancji ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Czas (dni) 
0 7 14 21 28  
% degradacja  
BOD 
ThOD Ü 100  D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
średnia (*)  
V = objętość podłoża w kolbie do bada ń 
(*) D  1 i D 2 nie należy uśredniać jeśli się znacząco różnią. 
Uwaga: Podobne arkusze u żywać można do chemicznej substancji 
odniesienia i kontroli toksyczno ści 
6. POPRAWKA DLA NITRYFIKACJI  (zob. załącznik V)  
Dzien 0 28 Roznica  
(i) Ste żenie azotanów (mg N/litr) (N) 
(ii) równowa żnik tlenu (4,57 × N × V) (mg) — — 
(iii) Ste żenie azotynów (mg N/litr) (N) 
(iv) równowa żnik tlenu (3,43 × N × V) (mg) — — 
(ii + iv) Ca łkowity równowa żnik tlenu — —  
7. ANALIZA W ĘGLA  (alternatywna)  
Analizator w ęgla: 
Czas (dzie ń) Ślepa proba mg/litr Badana substancja chemiczna mg/litr  
0 (C  blo ) (C  0 ) 
28 (*) (C  blt ) (C  t ) 
(*) lub w ko ńcu inkubacji  
% DOC usuni ętego ¼ Í 
1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Î 
Ü 100  
8. WŁASCIWA CHEMICZNA  (alternatywna)  
S b = stężenie w fizyko-chemicznej (sterylnej) kontroli 
w 28 dniu  
S a = stężenie w zaszczepionej kolbie w 28 dniu  
% biodegradacji ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. DEGRADACJA ABIOTYCZNA  (alternatywna)  
a = zużycie tlenu w sterylnej kolbie po 28 dniach, (mg)  
zużycie tlenu na mg badanej substancji =  a 
C o V ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(zob. sekcje 1 i 3)  
% abiotyczna degradacja =  a Ü 100 
C o V Ü ThOD  
CZĘŚĆ VI.  BADANIE „ZAMKNI ĘTEJ BUTLI”  (Metoda 
C.4-E)  
VI. 1. ZASADA METODY BADANIA  
Roztwór badanej substancji w pod łożu mineralnym, zwykle 2–5 mg/ ­
litr, jest zaszczepiany relatywnie ma łą liczbą drobnoustrojów ze 
zmieszanej populacji i trzymany w ca łkowicie pe łnej, zamkni ętej 
butli w ciemno ści w stałej temperaturze. Degradacja jest oznaczana 
przez analiz ę rozpuszczonego tlenu przez okres czasu 28 dni. Ilo ść 
tlenu pobrana przez badan ą substancj ę, skorygowany o pobór 
w równoleg łej ślepej próbie z inokulum, jest wyra żona jako stosunek 
procentowy ThOD lub COD.  
VI.2. OPIS METODY  
VI.2.1.  Przyrz ąd 
a) Butle BOD, ze szklanymi korkami, np. 250–300 ml.  
b) Łaźnia wodna lub inkubator, dla trzymania butli w sta łej tempe­
raturze (± 1  o C lub lepiej) przy wy łączonym świetle.  
c) Duże szklane butle (2–5 litrów) dla przygotowania pod łoża 
i napełniania butli BOD.  
d) Elektroda tlenowa i miernik, lub wyposa żenie oraz odczynniki 
dla miareczkowania Winklera.  
VI.2.2.  Przygotowanie pod łoża mineralnego  
W celu przygotowania roztworów podstawowych zob. 1.6.2.  
Zmieszać 1 (jeden) ml roztworu (a) z (d) i dope łnić do 1 litra wod ą 
rozcieńczającą. 
VI.2.3.  Przygotowanie inokulum  
Inokulum jest zwykle uzyskiwane ze ścieku drugiego stopnia oczysz ­
czalni ścieków lub urz ądzenia skali laboratoryjnej przyjmuj ącego 
głównie ścieki domowe. Alternatywnym źródłem inokulum s ą 
wody powierzchniowe. Zwykle u żywa się od jednej kropli (0,05 
ml) do 5 ml filtratu na litr pod łoża; konieczne mog ą być próby 
dla znalezienia optymalnej obj ętości danego wycieku (zob. I.6.4.2 
i I.6.5).  
VI.2.4.  Przygotowanie kolb  
Silnie napowietrzy ć podłoże mineralne na co najmniej 20 min. Prze ­
prowadzić każdą serię badań z podłożem mineralnym pochodz ącym 
z tej samej partii. Ogólnie, pod łoże jest gotowe do u życia po 
odstaniu 20 h, w temperaturze badania. Oznaczy ć stężenie rozpusz ­
czonego tlenu do celów kontrolnych; warto ść powinna wynosi ć 
około 9 mg/litr w 20  o C. Prowadzi ć wszystkie przenoszenia 
i operacje nape łniania nasyconym pod łożem wolnym od p ęcherzy­
ków, na przyk ład poprzez u życie syfonów.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Przygotowa ć równoleg łe grupy butli BOD dla oznacze ń badanej 
i chemicznej substancji odniesienia w równoczesnych seriach 
doświadczalnych. Zestawi ć wystarczaj ącą liczbę butli BOD, 
włączając ślepe próby inokulum, wykona ć co najmniej zdublowane 
pomiary zu życia tlenu w po żądanych odst ępach badawczych, na 
przykład po 0, 7, 14, 21 i 28 dniach. Dla zapewnienia zdolno ści 
identyfikacji 10-dniowego okna wymagana jest wi ększa ilość butli.  
Dodać całkowicie napowietrzone pod łoże mineralne do du żych butli, 
tak by by ły wypełnione w oko ło jednej trzeciej. Nast ępnie doda ć 
wystarczaj ącą ilość roztworu podstawowego badanej substancji 
i chemicznej substancji odniesienia do oddzielnych du żych butli 
tak by ko ńcowe stężenie substancji chemicznej zwykle by ło 
niewiększe niż 10 mg/litr. Nie dodawa ć substancji chemicznej do 
podłoża kontrolnego ślepej próby zawartego w nast ępnej dużej butli.  
W celu zapewnienia, że aktywno ść inokulum nie jest ograniczona, 
stężenie rozpuszczonego tlenu nie mo że być poniżej 0,5 mg/litr 
w butli BOD. To ogranicza st ężenie badanej substancji do oko ło 
2 mg/litr. Jednak że dla słabo rozpuszczalnych zwi ązków i tych 
o niskim ThOD mo żna użyć 5–10 mg/litr. W kilku przypadkach 
jest zalecane przeprowadzenie równoleg łych serii bada ń badanej 
substancji o dwu ró żnych stężeniach na przyk ład, 2 i 5 mg/litr. 
Zwykle oblicza si ę ThOD na podstawie tworzenia si ę soli amono ­
wych, lecz je żeli oczekiwana lub znana jest fakt, że może zajść 
nitryfikacja, oblicza si ę go na podstawie tworzenia azotanu (ThOD ­
NO  3 : zob. załącznik II.2). Jednak że jeśli nitryfikacja nie jest ca łko­
wita, ale zasz ła, należy skorygowa ć zmiany w st ężeniu azotynu 
i azotanu, oznaczone analitycznie (zob. za łącznik V).  
Jeżeli jest do zbadania toksyczno ść badanej substancji (w przypadku, 
na przykład, gdy znaleziono wcze śniejsze warto ści niskiej biodegra ­
dowalności), jest konieczna inna seria butli.  
Przygotowa ć inna du żą butlę do pomieszczenia napowietrzonego 
podłoża mineralnego (do oko ło jednej trzeciej jej obj ętości) plus 
badana substancja i chemiczna substancja odniesienia o ko ńcowych 
stężeniach zwykle takich samych jak w tych z innych du żych butli.  
Zaszczepi ć roztwory w du żych butlach ściekiem drugiego stopnia 
(jedną kroplą (0,05 ml), lub do 5 ml/litr)) lub z innego źródła, na 
przykład wody rzecznej (zob. I.6.4.2). Na koniec dope łnić roztwory 
do objętości napowietrzonym pod łożem mineralnym stosuj ąc wąż 
wpuszczony na dno butli dla uzyskania odpowiedniego mieszania.  
VI.2.5.  Liczba kolb w typowym przebiegu  
W typowym przebiegu stosuje si ę następujące butle:  
— co najmniej 10 zawieraj ących badan ą substancj ę i inokulum 
(zawiesina badana),  
— co najmniej 10 zawieraj ących tylko inokulum ( ślepa próba 
z inokulum),  
— co najmniej 10 zawieraj ących chemiczna substancja odniesienia 
i inokulum (procedura kontroli),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— i, gdy konieczne, 6 butli zawieraj ących badan ą substancj ę, 
chemiczn ą substancj ę odniesienia i inokulum (kontrola toksycz ­
ności). Jednak że dla zapewnienia zdolno ści identyfikacji 10-dnio ­
wego okna konieczna mo że być około dwukrotnie wi ększa ilość 
butli.  
VI.2.6. Przeprowadzenie badania  
Rozdzieli ć przygotowany roztwór niezw łocznie do odpowiednich 
grup butli BOD za pomoc ą węża z dolnej ćwiartki (nie z dna) do 
odpowiednio du żych butli, tak aby wszystkie butle BOD zosta ły 
całkowicie nape łnione. Postuka ć delikatnie, by usun ąć wszystkie 
pęcherzyki powietrza. Analizowa ć butle o zerowym czasie 
niezwłocznie na zawarto ść rozpuszczonego tlenu metod ą Winkler 
lub elektrodowo. Zawarto ść butli mo że być zabezpieczona dla 
późniejszej analizy metod ą Winklera przez dodanie siarczanu 
manganu (II) i wodorotlenku sodu (pierwszy odczynnik Winklera). Przechowywa ć w starannie zamkni ętych, zawieraj ących zwi ązany 
tlen jako br ązowy uwodniony tlenek manganu (III), w ciemno ści 
w temperaturze 10–20
 o C przez nie d łużej niż 24 godziny przed 
wykonaniem pozosta łych kroków metody Winklera. Zakorkowa ć 
pozostałe replikowane butle, upewniaj ąc się, że nie zawieraj ą pęche­
rzyków powietrza, i inkubowa ć w 20  o C w ciemno ści. Każdej serii 
musi towarzyszy ć całkowita seria równoleg ła z zaszczepionymi 
podłożami ślepej próby. Wyj ąć co najmniej zdublowane butle 
wszystkich serii w celu analizy rozpuszczonego tlenu w odst ępach 
czasu (co najmniej cotygodniowo) przez 28 dni inkubacji.  
Cotygodniowe pobieranie próbek powinno umo żliwić ocenę 
stosunku procentowego usuni ęcia w 14-dniowym oknie, przy czym 
pobieranie próbek co 3–4 dni powinno umo żliwić identyfikacj ę 10- 
dniowego okna, wymaganego oko ło podwójnie co wi ększość butli.  
Dla substancji badanych zawieraj ących azot nale ży wykona ć korekty 
poboru tlenu przez ka żdą zachodzącą nitryfikacj ę. By to wykona ć, 
użyć metody O  2 -elektrody dla oznaczania st ężenia rozpuszczonego 
tlenu i nast ępnie pobra ć próbkę z butli BOD do analizy na azotyny 
i azotany. Ze wzrostu st ężenia azotynów i azotanów, obliczy ć użyty 
tlen (zob. za łącznik V).  
VI. 3. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
VI.3.1.  Obróbka wyników  
Wpierw obliczy ć BOD użyte po ka żdym okresie czasu przez odej ­
mowanie zubo żenia tlenu (mg/litr) ślepej próby z inokulum od tej 
wykazanej przez badan ą substancj ę. Podzieli ć to poprawione zubo ­ 
żenie przez st ężenie(mg/litr) badanej substancji, aby uzyska ć 
właściwe BOD jako mg tlenu na mg badanej substancji. Obliczy ć 
procentow ą biodegradowalno ść przez podzielenie w łaściwego BOD 
przez właściwe ThOD (obliczonego zgodnie z za łącznikiem II.2) lub 
COD (oznaczonego przez analiz ę, zob. załącznik II.3), zatem:  
BOD ¼ ðmg O  2 pobranego przez badan ą substancj ę Ä mg O  2 pobranego w ślepej prúbieÞ 
ðmg badanej substancji w kolbie Þ ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg O  2 /mg badana substancja  
% degradacji =  BOD ðmg O  2=mg badanej substancji Þ 
ThODðmg O  2=mg badanej substancji Þ Ü 100 
lub 
% degradation ¼ BOD ðmg O  2=mg badanej substancji Þ 
CODðmg O  2=mg badanej substancji Þ Ü 100 
Należy zauważyć, że te dwie metody niekoniecznie daj ą te same 
wartości; korzystne jest u życie pierwszej metody.  
Dla badanych substancji zawieraj ących azot u żyć odpowiednie 
ThOD (NH  4 lub N0  3 ) zgodnie z tym, co jest znane lub oczekiwane 
o występowaniu nitryfikacji (za łącznik II.2). Je żeli nitryfikacja 
zachodzi lecz nie jest ca łkowita, obliczy ć poprawk ę dla tlenu zu ży­
tego przez nitryfikacj ę ze zmiany w st ężeniu azotynów i azotanów 
(załącznik V).  
VI.3.2.  Ważność wyników  
Zubożenie tlenu w ślepej próbie z inokulum nie powinno przekra ­
czać 1,5 mg rozpuszczonego tlenu/litr po 28 dniach. Wy ższe 
wartości wymagaj ą prześledzenia techniki eksperymentalnej. Resz ­
tkowe stężenie tlenu w badanych butlach nie powinno nigdy spa ść 
poniżej 0,5 mg/litr. Takie niskie poziomy tlenu s ą ważne, gdy stoso ­
wana metoda oznaczania rozpuszczonego tlenu jest zdolna do dokładnego pomiaru takich poziomów.
 
Zob. także I.5.2.  
VI.3.3.  Sporz ądzanie sprawozdania  
Zob. I.8.  
VI.4. ARKUSZ DANYCH  
Przykład arkusza danych podano poni żej. 
BADANIE METOD Ą „ZAMKNI ĘTEJ BUTLI”  
1. LABORATORIUM  
2. DATA ROZPOCZ ĘCIA BADANIA  
3. SUBSTANCJA BADANA  
Nazwa:  
Stężenie roztworu podstawowego: … mg/litr  
Początkowe stężenie w butli: … mg/litr  
ThOD lub COD: … mg O  2 /mg substancji badanej  
4. INOKULUM  
Źródło: 
Poddano traktowaniu:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Przygotowanie wst ępne, o ile stosowano:  
Stężenie w mieszaninie reakcyjnej: … mg/litr  
5. OZNACZANIE DO  
Metoda: Winklera/elektrodowa  
Analizy kolb  
Czas inkubacji (d) DO mg/l) 
0 n  1 n 2 
Ślepa próba -(bez 
substancji chemicznej 1 C  1 
2 C  2 
Średnia 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Badana substancja 
chemiczna 1 a  1 
2 a  2 
Średnia 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
Uwaga: Podobny arkusz mo że być stosowany dla substancji odnie ­
sienia i kontroli toksyczno ści. 
6. POPRAWKA DLA NITRYFIKACJI  (zob. załącznik V)  
Czas inkubacji (d) 0 n  1 n 2 n 3 
(i) St ężenie azotanu (mg N/litr) 
(ii) Zmiana w st ężeniu azotanu (mg N/litr) — 
(iii) Równowa żnik tlenu (mg/litr) — 
(iv) St ężenie azotynu (mg N/litr) 
(v) Zmiana w st ężeniu azotynu (mg N/litr) — 
(vi) Równowa żnik tlenu (mg/litr) — 
(iii + vi) Ca łkowity równowa żnik tlenu (mg/litr) —  
7. ZUBO ŻENIE DO: % DEGRADACJA  
Zubożenie po n dniach (mg/litr) 
n 1 n 2 n 3 
KOLBA 1: (m  to - m  tx ) – (m  bo – m  bx ) 
KOLBA 2: (m  to - m  tx ) – (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Zubożenie po n dniach (mg/litr) 
n 1 n 2 n 3 
KOLBA 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
stężenie badane Ü ThOD substancji chemicznej 
KOLBA 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ Ü 100 
stężenie badane Ü ThOD substancji chemicznej 
% D średnia (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Nie bra ć średniej je żeli jest znacz ąca różnica pomi ędzy replikami.  
m to = wartość w badanej kolbie w czasie 0  
m tx = wartość w badanej kolbie w czasie x  
m bo = średnia warto ść ślepej próby w czasie 0  
m bx = średnia warto ść ślepej próby w czasie x  
Zastosowa ć także poprawk ę dla nitryfikacji z (iii + vi) w sekcji 6.  
8. ZUBO ŻENIA DO W ŚLEPYCH PRÓBACH  
Zużycie tlenu przez ślepą próbę: (m  bo – m  b28 ) mg/litr. 
Niniejsze zu życie jest istotne dla wa żności naukowej badania. 
Powinno by ć mniejsze ni ż 1,5 mg/litr.  
CZĘŚĆ VII.  BADANIE M.I.T.I.  (Metoda C.4-F)  
VII.1. ZASADA METODY  
Pobieranie tlenu trakcie mieszania roztworu lub zawiesiny badanej 
substancji w pod łożu mineralnym, zaszczepionego specjalnie hodo ­
wanymi, nieadoptowanymi drobnoustrojami, jest mierzone automa ­
tycznie w ci ągu okresu 28 dni w zaciemnionym, zamkni ętym respi ­
rometrze w 25 ± 1  o C. Wydzielany ditlenek w ęgla jest absorbowany 
przez wapno sodowane. Biodegradowalno ść jest wyra żana jako 
procent pobieranego tlenu (skorygowany dla poboru w ślepej próbie) 
poboru teoretycznego (ThOD). Procent pierwotnej biodegradowal ­
ności jest równie ż obliczany z dodatkowej w łaściwej analizy 
chemicznej wykonywanej na pocz ątku i pod koniec inkubacji oraz, 
alternatywnie, przez analiz ę DOC.  
VII.2. OPIS METODY  
VII.2.1.  Przyrz ąd 
a) Automatyczny elektrolityczny miernik BOD respirometr zwykle 
wyposażony w 6 butli, ka żda 300 ml i zaopatrzony w kubki na 
substancję absorbuj ącą CO  2 . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Stała temperatura pokojowa i/lub łaźnia wodna 25  o C ± 1  o C lub 
lepszej.  
c) Zespół filtracji membranowej (alternatywny).  
d) Analizator w ęgla (alternatywny).  
VII.2.2.  Przygotowanie pod łoża mineralnego  
Przygotowa ć następujące roztwory podstawowe, stosuj ąc odczynniki 
czystości analitycznej i wod ę (I.6.1.): 
a) Diwodoroortofosforan potasu, KH  2 P0 4 8,50 g 
monowodoroortofosforan dipotasu, K  2 HP0  4 21,75 g 
monowodoroortofosforan disodu, dodekawodny 
Na 2 HP0  4 12 H  2 0 44,60 g 
chlorek amonu, NH  4 Cl 1,70 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. 
Wartośc pH roztworu powinna wynosi ć 7,2. 
b) Siarczan magnezu, heptawodny MgSO  4 7 H  2 0 22,50 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. 
c) Chlorek wapnia bezwodny, CaCl  2 27,50 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. 
d) Chlorek żelaza (III), heksawodny FeCl  3 6 H  2 0 27,50 g 
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra.  
Pobrać 3 ml każdego roztworu (a), (b), (c) i (d) i dope łnić do 1 litra.  
VII.2.3.  Przygotowanie inokulum  
Zebrać świeże próbki z nie wi ęcej niż dziesięciu miejsc, g łównie 
z obszarów, gdzie stosowana i unieszkodliwiana jest du ża rozmaito ść 
substancji chemicznych. Z takich miejsc, jak oczyszczalnie ścieków, 
oczyszczalnie ścieków wodnych przemys łowych, rzek, jezior, mórz, 
zebrać 1 litrowe próbki osadu, gleby powierzchniowej, wody itp. 
i dokładnie wymiesza ć. Po usuni ęciu ciał znajdujących się na 
powierzchni i odstawieniu ustawi ć pH nads ączu na 7 ± 1 za pomoc ą 
wodorotlenku sodu lub kwasu fosforowego.  
Użyć odpowiedni ą objętość odfiltrowanego nads ączu nape łnienia 
zbiornika, s łużącego do nape łniania i wylewania aktywowanego 
osadu, i napowietrza ć roztwór oko ło 23 1/2 godziny. Trzydzie ści 
minut po wstrzymaniu napowietrzania odrzuci ć około jednej trzeciej 
całej objętości nadsączu i doda ć równą objętość roztworu (pH 7) 
zawierającego po 0,1 % glukozy, peptonu i ortofosforanu potasu 
w celu zsedymentowania materia łu i rozpocz ąć ponowne napowiet ­
rzanie. Powtarza ć niniejsz ą procedur ę raz dziennie. Zbiornik 
z osadem nale ży obsługiwać zgodnie z dobr ą praktyką: ciecz musi 
być klarowna, temperatur ę należy utrzymywa ć w 25 ± 2  o C, pH 
powinno wynosi ć 7 ± 1, osad nale ży prawid łowo osadza ć, należy 
utrzymywa ć wystarczaj ące napowietrzanie mieszaniny aerobowej 
przez cały czas, powinny by ć obecne pierwotniaki a aktywno ść 
osadu nale ży badać względem substancji odniesienia co najmniej 
raz na trzy miesi ące. Nie u żywać osadu jako inokulum, przed 
upływem co najmniej miesi ąca jego utrzymywania i po okresie d łuż­
szym od czterech miesi ęcy. Następnie pobiera ć próbki z co najmniej 
10 miejsc w regularnych odst ępach czasu, raz na trzy miesi ące. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
W celu utrzymania świeżego i starego osadu w tej samej aktywno ści 
zmieszać odfiltrowany nads ącz aktywowanego bie żąco używanego 
osadu z równ ą objętością odfiltrowanego nads ączu z mieszaniny 
zebranej z dziesi ęciu źródeł i prowadzi ć kulturę połączonej cieczy, 
jak powy żej. Pobrać osad do u życia jako inokulum 18–24 godzin po 
zasileniu zbiornika.  
VII.2.4.  Przygotowanie kolb  
Przygotowa ć następujące sześć kolb:  
Nr 1: badana substancja w wodzie rozcie ńczającej w 100 mg/l  
Nr 2, 3 i 4: badana substancja w pod łożu mineralnym w 100 mg/l  
Nr 5: chemiczna substancja odniesienia (np. anilina) w pod łożu 
mineralnym w 100 mg/l  
Nr 6: tylko pod łoże mineralne  
Dodać słabo rozpuszczaln ą badaną substancj ę bezpośrednio na 
podstawie wagi lub obj ętości lub post ępować jak opisano 
w załączniku III, poza przypadkiem, gdy nie nale ży używać ani 
rozpuszczalników, ani środków emulsyfikuj ących. Doda ć absorbent 
CO 2 do wszystkich kolb w przygotowanych specjalnych kubkach. 
Ustawić pH w kolbach nr 2, 3 i 4 na 7,0.  
VII.2.5.  Przeprowadzenie badania  
Zaszczepi ć kolby nr 2, 3 i 4 (zawiesina badana), nr 5 (kontrola 
aktywności) i nr 6 (inokulum ślepa próba) ma łą objętością inokulum, 
by uzyska ć stężenie 30 mg/l zawiesiny cia ł stałych. Niedodawane 
jest inokulum do kolby nr 1, która s łuży jako kontrola abiotyczna. 
Zestawić wyposażenie, sprawdzi ć szczelno ść, włączyć mieszad ła, 
i rozpocz ąć pomiar pobierania tlenu w warunkach ciemno ści. 
Codziennie sprawdza ć temperatur ę, mieszad ła i rejestrator kulomet ­
rycznego pobierania tlenu, notowa ć wszystkie zmiany w kolorze 
zawartości kolb. Bezpo średnio odczytywa ć pobieranie tlenu 
w sześciu kolbach odpowiedni ą metod ą, na przyk ład 
z sześciopunktowego rejestratora drukuj ącego krzywe BOD. Na 
koniec inkubacji, zwykle 28 dni, zmierzy ć pH zawarto ści kolb 
i oznaczy ć stężenie pozosta łości badanej substancji i wszystkich 
pośrednich, a w przypadku substancji rozpuszczalnych w wodzie, 
stężenie DOC (za łącznik II.4). Zwróci ć szczególn ą uwagę 
w przypadku lotnych substancji chemicznych. Je żeli przewidywana 
jest nitryfikacja, oznaczy ć jeżeli możliwe, stężenie azotynów 
i azotanów.  
VII. 3. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
VII.3.1.  Obróbka wyników  
Podzielić ilość pobranego tlenu (mg) przez badan ą substancj ę po 
danym czasie (skorygowa ć o warto ść pobraną w ślepej próbie 
kontroli inokulum po tym samym czasie), przez wag ę użytej badanej 
substancji. Daje to BOD wyra żone jako mg tlenu/mg badana 
substancja, czyli:  
BOD ¼ ðmg O  2 probranego przez badan ą substancj ę Ä mg O  2 probranego w ślepej prúbieÞ 
ðmg badanej substancji w kolbie Þ 
= mg 0  2 /mg badana substancja.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Procentowa biodegradacja jest zatem otrzymywana z:  
% biodegradacji ¼ % ThOD ¼ BOD ðmg O  2=mg substancjiÞ 
ThOD ðmg O  2=mg substancjiÞ Ü 100 
Dla mieszanin obliczy ć ThOD z analizy sk ładników jak dla pojedyn ­
czych zwi ązków. U żyć odpowiednie ThOD (ThOD  NH4 lub 
ThOD  N03 ) w zależności, czy nitryfikacja jest obecna czy uko ńczona 
(załącznik II.2). Je żeli jednak że nitryfikacja zachodzi, ale nie jest 
całkowita, wykona ć poprawk ę dla tlenu zu żytego w nitryfikacji, 
wyliczonego ze zmian st ężeń azotynów i azotanów (za łącznik V).  
Obliczyć procentow ą pierwotna biodegradacj ę ze straty w łaściwej 
macierzystej substancji chemicznej (zob. 1.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Jeżeli zaszła strata badanej substancji w kolbie nr 1 mierz ącej fizyko- 
chemiczne usuni ęcie, zarejestrowa ć to i u żyć stężenia badanej 
substancji (S  b ) po 28 dniach w tej kolbie dla obliczenia procentowej 
biodegradacji.  
Jeżeli wykonano oznaczenia DOC (alternatywne), obliczy ć osta­
teczną procentow ą biodegradacj ę z: 
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î  
Ü 100 %  
jak opisano w pkt 1.7.1. Je śli nie wyst ąpiła strata DOC w kolbie 
nr 1, mierz ącej fizyko-chemiczne usuni ęcie, użyć stężenia DOC 
w niniejsze kolbie do obliczenia procentowej biodegradacji.  
Zapisać wszystkie wyniki na do łączonych arkuszach danych.  
VII.3.2.  Ważność wyników  
Pobieranie tlenu w ślepej próbie z inokulum jest zwykle 20–30 mg 
O 2 /l i powinno by ć nie większe niż 60 mg/l w ci ągu 28 dni. 
Wartości wyższe od 60 mg/l wymagaj ą krytycznego sprawdzenia 
danych i technik eksperymentalnych. Je żeli warto ść pH jest poza 
zakresem 6–8,5, a zu życie tlenu przez badan ą substancj ę jest 
mniejsze ni ż 60 %, nale ży powtórzy ć badanie z ni ższym stężeniem 
badanej substancji.  
Zob. także I.5.2.  
Jeżeli procentowa degradacja aniliny obliczona ze zu życia tlenu nie 
przekracza 40 % po 7 dniach i 65 % po 14 dniach, badanie uwa żane 
jest za niewa żne. 
VII.3.3.  Sporz ądzanie sprawozdania  
Zob.: I.8.  
VII.4. ARKUSZ DANYCH  
Przykład arkusza danych podano poni żej. 
BADANIE MITI (I)  
1. LABORATORIUM  
2. DATA ROZPOCZ ĘCIA BADANIA  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. SUBSTANCJA BADANA  
Nazwa:  
Stężenie roztworu podstawowego: … mg/l jako substancja 
chemiczna  
Początkowe stężenie w pod łożu, C  O : … mg/l jako substancja 
chemiczna  
Objętość mieszaniny reakcyjnej, V: … ml  
ThOD: … mg O  2 /l 
4. INOKULUM  
Miejsca pobierania osadu kanalizacyjnego: 
1) … 6) … 
2) … 7) … 
3) … 8) … 4) … 9) … 
5) … 10) …
 
Stężenie zawiesiny cia ł stałych w aktywowanym osadzie po 
sezonowaniu z syntetycznym ściekiem = ... mg/l  
Objętość aktywowanego osad na litr ko ńcowego pod łoża = 
... ml  
Stężenie osad ko ńcowym pod łożu = ... mg/l  
5. POBÓR TLENU: BIODEGRADOWALNO ŚĆ 
Typ używanego respirometru:  
Czas (dni) 
0 7 14 21 28  
O 2 pobrany (mg) 
badana substancja a 1 
a 2 
a 3 
O 2 pobrany (mg) 
ślepa proba b 
Poprawka pobra ­
nego O  2 (mg) (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
BOD na mg 
badanej substancji  ða Ä bÞ 
C o V Kolba 1 
Kolba 2 Kolba 3 
% degradacja
 
BOD 
ThOD Ü 100  1 
2 
3 
srednia (*)  
(*) Nie u średniać przy znacznych ró żnicach pomi ędzy replikami.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
Uwaga: podobny arkusz mo żna używać dla substancji odniesienia.  
6. ANALIZA W ĘGLA  (alternatywna)  
Analizator w ęgla: 
Kolba DOC 
% DOC usuni ęte Średnia 
zmierzone skorygowane  
Woda + substancja badana a — — 
Osad + substancja badana b  1 b 1 -c 
Osad + substancja badana b  2 b 2 -c 
Osad + substancja badana b  3 b 3 -c 
Ślepa próba kontrolna c — — —  
DOC % usuni ęty = a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100  
7. WŁAŚCIWE CHEMICZNE DANE ANALITYCZNE  
Pozostałość badanej substancji na 
koniec badania % degradacja  
ślepa próba z wod ą S  b 
zaszczepione pod łoze S a1 
S a2 
S a3 
% degradacja ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100  
Obliczyć % degradacji odpowiednio dla kolby a  l i a 3 
8. UWAGI  
Należy dołączyć, gdy dost ępna, krzyw ą BOD w zale żności od 
czasu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
ZAŁĄCZNIK I  
SKRÓTY I DEFINICJE  
DO: Rozpuszczony tlen (mg/l) jest st ężeniem tlenu rozpuszczonego 
w wodnej próbce.  
BOD: Zapotrzebowanie biochemiczne na tlen (g) jest ilo ścią tlenu zu żytego 
przez drobnoustroje metabolizuj ące badany zwi ązek; także wyrażane 
jako gramy pobieranego tlenu na gramy badanego zwi ązku (zob. 
metoda C.5).  
COD: Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (g) jest ilo ścią tlenu zu żytego 
w czasie trwania utleniania badanego zwi ązku gorącym zakwaszonym 
dichromianem; dostarcza pomiaru ilo ści obecnych utlenialnych cia ł; 
także wyrażane jako gramy tlenu zu żytego na gramy badanego zwi ązku 
(zob. metoda C.6).  
DOC: Rozpuszczalny w ęgiel organiczny jest to w ęgiel organiczny obecny 
w roztworze, lub ten przechodz ący przez filtr 0,45 mikrona lub pozos ­
taje w nads ączu po odwirowaniu przy 40 000 m/s  2 (± 4 000 g) dla 
15 min.  
ThOD: Teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (mg) jest ca łkowitą ilością tlenu 
wymagan ą do całkowitego chemicznego utlenienia; jest obliczane ze 
wzoru cz ąsteczkowego (zob. za łącznik II.2) i jest tak że wyrażane jako 
mg wymaganego tlenu na mg badanego zwi ązku. 
ThCO  2 : Teoretyczny ditlenek w ęgla (mg) jest ilo ścią ditlenku w ęgla obliczon ą 
jako wytworzon ą ze znanej lub zmierzonej zawarto ści węgla związku 
badanego, przy pe łnej mineralizacji; tak że wyrażany jako ilo ść mg 
ditlenku w ęgla wydzielanego na mg badanego zwi ązku. 
TOC: Ca łkowity w ęgiel organiczny próbki jest sum ą węgla organicznego 
w roztworze i w zawiesinie.  
IC: W ęgiel nieorganiczny.  
TC: Ca łkowity w ęgiel, jest sum ą węgla organicznego i nieorganicznego 
obecną w próbce.  
Pierwotna biodegradacja:  
jest zmian ą w chemicznej strukturze substancji, spowodowan ą działaniem biolo ­
gicznym, powoduj ącą utratę specyficznych w łaściwości tej substancji.  
Ostateczna biodegradacja (aerobowa):  
jest uzyskanym poziomem degradacji, gdy badany zwi ązek zostaje ca łkowicie 
rozłożony przez drobnoustroje, objawiaj ący się wytwarzaniem ditlenku w ęgla, 
wody, soli mineralnych i nowych mikrobowych sk ładowych komórkowych (bio ­
masy).  
Łatwo biodegradowalne:  
umowna klasyfikacja substancji chemicznych przechodz ących pewne specyficzne 
badania przesiewowe na ostateczn ą biodegradowalno ść; te badania s ą tak zaost ­
rzone, że można stwierdzi ć, że takie zwi ązki ulegn ą szybko i ca łkowicie biode ­
gradacji w środowiskach wodnych w warunkach aerobowych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Pierwotnie biodegradowalny:  
klasyfikacja substancji chemicznych dla których istniej ą niedwuznaczne dowody 
biodegradacji (pierwotnej lub ostatecznej) we wszystkich naukowo uznanych badaniach biodegradowalno ści.
 
Podatność na obróbk ę: 
jest uległością związków do usuwania w czasie trwania biologicznej obróbki 
ścieków bez zak łócania zwyk łego działania procesów przetwarzania. Ogólnie 
łatwo biodegradowalne zwi ązki są podatne na obróbk ę, lecz nie wszystkie 
o pierwotnej biodegradowalno ści. Abiotyczne procesy mog ą także powodowa ć 
działanie.  
Czas opó źnienia:  
jest czasem od inokulacji, w badaniu „die-away”, do momentu a ż 
procent degradacji wzro śnie co najmniej 10 %. Czas opó źnienia jest cz ęsto 
bardzo zmienny i s łabo odtwarzalny:  
Czas degradacji:  
jest czasem od ko ńca czasu opó źnienia do czasu uzyskania 90 % maksymalnego 
poziomu degradacji.  
10- dniowe okno:  
jest 10 dniami bezpo średnio nast ępującymi po osi ągnięciu 10 % degradacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
ZAŁĄCZNIK II  
OBLICZENIE I OZNACZENIE ODPOWIEDNICH PARAMETRÓW 
PODSUMOWUJ ĄCYCH  
W zależności od wybranej metody, mog ą być wymagane pewne parametry 
podsumowuj ące. Następująca sekcja opisuje wyprowadzenie tych warto ści. 
Użycie tych parametrów jest opisane w poszczególnych metodach.  
1. Zawarto ść węgla 
Zawartość węgla jest obliczana ze znanego sk ładu pierwiastkowego lub 
oznaczana poprzez analiz ę pierwiastkow ą substancji badanej.  
2. Teoretyczne zapotrzebowanie tlenu (ThOD)  
Teoretyczne zapotrzebowanie tlenu (ThOD) mo że być obliczone, je żeli 
znany jest sk ład pierwiastkowy lub jest wyznaczony przez analiz ę elemen­
tarną. Dla zwi ązku: 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s 
lub z nitryfikacj ą, 
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
bez nitryfikacji,  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
MW  mg/mg  
3. Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (COD)  
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (COD) jest oznaczane zgodnie 
z metodą C.6.  
4. Rozpuszczalny w ęgiel organiczny (DOC)  
Rozpuszczalny w ęgiel organiczny (DOC) jest wed ług definicji w ęglem 
organicznym wszystkich substancji chemicznych i mieszanin w wodzie przechodz ących przez filtr 0,45 mikrona.
 
Próbki z naczy ń badawczych s ą pobierane i niezw łocznie filtrowane 
w aparacie filtracyjnym, stosuj ąc odpowiedni filtr membranowy. Pierwsze 
20 ml (mo żna zmniejszy ć ilość, stosując mniejsze filtry) filtratu jest odrzu ­
cane. Obj ętości 10–20 ml lub mniej, je żeli wstrzykuje si ę (objętość zależy 
od ilości wymaganej dla analizatora w ęgla), są poddawane analizie na 
węgiel. Stężenie DOC jest oznaczane za pomoc ą analizatora w ęgla orga­
nicznego zdolnego do dok ładnych pomiarów st ężenia węgla równowa żnego 
lub niższego niż 10 % pocz ątkowego st ężenia DOC u żytego w badaniu.  
Odfiltrowane próbki, które nie mog ą być analizowane tego samego dnia, 
można zabezpieczy ć przez przechowanie w lodówce w 2–4  o C przez 48 
godz. lub ni ższej - 18  o C przez d łuższy czas.  
Uwagi;  
Filtry membranowe  są często impregnowane środkami powierzchniowo ­
czynnymi w celu hydrofilizacji. Zatem filtr mo że zawiera ć do kilku mg 
rozpuszczalnego w ęgla organicznego, który b ędzie zakłócał oznaczenia 
biodegradowalno ści. Usuwa si ę związki powierzchniowoczynne i inne 
rozpuszczalne zwi ązki organiczne z filtrów przez gotowanie ich 
w wodzie dejonizowanej przez trzy okresy czasu po jednej godzinie ka żdy. 
Filtry nast ępnie można przechowywa ć w wodzie przez tydzie ń. Jeżeli 
wkłady filtrów jednorazowych s ą używane, ka żda partia musi by ć spraw­
dzona dla potwierdzenia ze nie zawiera rozpuszczalnego w ęgla organicz ­
nego.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
W zależności od rodzaju filtra membranowego badana substancja mo że być 
zatrzymywana przez adsorpcj ę. Jest zatem godne polecenia upewnienie si ę 
czy badana substancja nie jest zatrzymywana przez filtr.  
Odwirowanie  w 40 000 m/sec  2 (4 000 g) przez 15 min mo żna stosowa ć do 
zróżnicowania TOC wzgl ędem DOC zamiast filtracji. Metoda nie jest 
pewna przy pocz ątkowym st ężeniu < 10 mg DOC/l poniewa ż, albo nie 
wszystkie bakterie s ą usuwane, albo w ęgiel jako sk ładnik plazmy bakte ­
ryjnej jest ponownie rozpuszczany.  
BIBLIOGRAFIA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.
 
— Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38409 Teil 41 – Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, 
Abwasser- und Schlammunter-suchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngrö βen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstof ­
fbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschu β Wasserwesen (NAW) in DIN 
Deutsches Institut fur Normung e.V.
 
— Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compo ­
unds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
ZAŁĄCZNIK III  
OCENA BIODEGRADOWALNO ŚCI SŁABO ROZPUSZCZALNYCH 
SUBSTANCJI  
W badaniach biodegradowalno ści słabo rozpuszczalnych substancji nale ży 
zwrócić szczególn ą uwagę na następujące aspekty.  
Podczas gdy jednorodne ciecze rzadko stwarzaj ą problemy z pobieraniem ich 
próbek, dla materia łów w postaci cia ł stałych, zalecana jest ich homogenizacja 
odpowiednimi metodami, aby zapobiec b łędom z powodu ich niejednorodno ści. 
Należy zwrócić szczególn ą uwagę, gdy wymagane s ą reprezentatywne próbki 
kilkumiligramowe z mieszanin substancji chemicznych o du żej zawarto ści zanie­
czyszczeń. 
W czasie bada ń można stosowa ć różne formy mieszania. Nale ży zwrócić uwagę 
by używać dostatecznego mieszania tylko do utrzymania substancji chemicznej 
w postaci zawiesiny, w celu zapobie żenia przegrzaniu, nadmiernemu pienieniu 
i nadmiernym si łom poprzecznym.  
Można stosowa ć emulsyfikator daj ący stabiln ą zawiesin ę substancji chemicznej. 
Nie może być on toksyczny dla bakterii i ulega ć biodegradacji lub powodowa ć 
pienienie w warunkach badania.  
Do rozpuszczalników stosuje si ę takie same kryteria jak do emulsyfikatorów.  
Nie jest zalecane u żywanie sta łych nośników przy badaniu sta łych substancji ale 
mogą być one odpowiednie dla substancji oleistych.  
Gdy stosowane s ą pomocnicze substancje, takie jak emulsyfikatory, rozpuszczal ­
niki oraz no śniki, nale ży przeprowadzi ć ślepą próbę z substancj ą pomocnicz ą. 
Każde z trzech bada ń respirometrycznych CO  2 , BOD, MITI mo żna użyć 
w badaniach biodegradowalno ści związków słabo rozpuszczalnych.  
BIOBLIGRAFIA  
— de Morsier, A. et al., Biodegradacja tests for s łabo rozpuszczalne compounds. 
Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.  
— Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
ZAŁĄCZNIK IV  
OCENA BIODEGRADOWALNO ŚCI SUBSTANCJI CHEMICZNEJ 
PODEJRZEWANEJ O DZIA ŁANIE TOKSYCZNE DLA INOKULUM  
Jeżeli substancja chemiczna podlegaj ąca badaniu na łatwość biodegradowalno ści 
okazuje sie by ć niebiodegradowaln ą, zalecana jest nast ępująca procedura, je śli 
pożądana jest ró żnica pomi ędzy inhibicj ą a obojętnością (Reynolds et al., 1987).  
Do badań biodegradacji i toksyczno ści należy użyć podobnych lub identycznych 
inokulum.  
Do oceny toksyczno ści substancji chemicznych w badaniach łatwości biodegra ­
dacji wydaje si ę odpowiednie zastosowanie jednego z, lub po łączonych bada ń: 
inhibicji szybko ści respiracji aktywowanego osadu (Dir 88/302/EEC), BOD i/lub 
inhibicji wzrostu.  
Aby zapobiec inhibicji z powodu toksyczno ści, sugeruje si ę, aby stężenia 
substancji badanej, stosowane w badaniach łatwości biodegradowalno ści, były 
mniejsze ni ż 1/10 warto ści EC  50 (lub mniejsze ni ż wartości EC  20 ) otrzymywa ­
nych w badaniach toksyczno ści. Związki o warto ści EC  50 większej niż 300 mg/l 
nie wywieraj ą prawdopodobnie dzia łania toksycznego w badaniach łatwości 
biodegradacji.  
Wartości EC  50 mniejsze ni ż 20 mg/l prawdopodobnie stwarzaj ą poważne 
problemy w nast ępnych badaniach. Nale ży zastosowa ć niskie st ężenia badania, 
powodującego konieczno ść użycia surowego i czu łego badania „zamkni ętej butli” 
lub użycia znacznika  14 C. Alternatywnie sezonowane inokulum pozwala u żyć 
wyższego stężenia substancji badanej. W ostatnim przypadku gubi si ę jednak 
kryterium w łaściwe badaniu łatwości biodegradacji.  
BIOBLIGRAFIA  
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
ZAŁĄCZNIK V  
KOREKCJA POBORU TLENU Z POWODU ZAK ŁÓCENIA PRZEZ 
NITRYFIKACJ Ę 
Błędy z powodu nieuwzgl ędniania nitryfikacji w ocenie pobieranie tlenu 
w biodegradowalno ści substancji badanych niezawieraj ących azotu s ą marginalne 
(nie większe niż 5 %), nawet je żeli utlenianie azotu amonowego w pod łożu 
zachodzi inaczej ni ż pomiędzy substancj ą badaną i naczyniami ślepej próby. 
Jednakże zawarty w badanych substancjach azot powoduje powstanie powa żnych 
błędów.  
Jeżeli zaszła nitryfikacja lecz nie jest ca łkowita, obserwowane pobieranie tlenu 
przez mieszanin ę reakcyjn ą musi by ć skorygowane o ilo ść tlenu zu żytego przy 
utlenieniu amoniaku do azotynów i azotanów; je żeli zmiany w st ężeniu, w czasie 
trwania inkubacji, azotynów i azotanów s ą określone następującymi równaniami: 
2 NH4Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HCl + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
ogólnie: 2 NH
 4 Cl + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HC1+ 2 H  2 O (3)  
Według równania (1) pobór tlenu przez 28 g azotu zawartego w chlorku amonu 
(NH4Cl) utlenianego do azotynu wyniesie 96 g, daj ąc wskaźnik 3,43 (96/28). 
W ten sam sposób z równania (3) pobór tlenu przez 28 g azotu utlenionego do azotanu wynosi 28 g, daj ąc wskaźnik 4,57 (128/28).
 
Ponieważ reakcje zachodz ą sekwencyjnie, zosta ły przeprowadzone przez ró żne 
szczepy bakterii, jest mo żliwy wzrost lub spadek st ężenia azotynów; w ostatnim 
przypadku utworzy si ę równowa żne stężenie azotanów, Zatem tlen zu żyty 
w utworzeniu azotanu jest 4,57 mno żony przez wzrost w st ężeniu azotanu, 
podczas gdy tlen po łączony z utworzeniem azotynu jest 3,43 pomno żony przez 
wzrost w st ężeniu azotynu lub ze spadkiem w jego st ężeniu strata tlenu jest - 
3,43 pomno żona przez spadek w st ężeniu.  
Oznacza to: 
O 2 zużytego w tworzeniu azotanu = 4,57 x wzrost w st ężeniu 
azotanu (4) 
i 
O 2 zużytego w tworzeniu azotynu = 3,43 x wzrost w st ężeniu 
azotynu (5) 
i 
Strata O  2 w zaniku azotynu = - 3,43 x spadek w st ężeniu 
azotanu (6) 
Tak więc 
Pobór O  2 z powodu nitryfikacji = ± 3,43 x zmiana st ężenia 
azotynu + 4,57 x wzrost st ężenia azotanu. (7) 
I dlatego 
Pobór O  2 z powodu utleniania C = ca łkowity obserwowany 
pobór – pobór z powodu nitryfikacji (8) 
Alternatywnie, je żeli tylko ca łkowity utleniony azot jest oznaczony, pobieranie 
tlenu z powodu nitryfikacji, mo że być wzięte, w pierwszym przybli żeniu, 4,57 
x wzrost w utlenionym azocie.  
Wartość poprawki zu życia tlenu z powodu utleniania w ęgla jest nast ępnie porów ­
nywana z ThOD NH  3 , jak wyliczono w za łączniku II.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. DEGRADACJA – ZAPOTRZEBOWANIE BIOCHEMICZNE NA 
TLEN  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Celem metody jest pomiar zapotrzebowania biochemicznego na tlen 
(BOD) substancji organicznych w stanie ciek łym lub sta łym. 
Dane wypracowane w niniejszym badaniu odnosz ą się do związków 
rozpuszczalnych w wodzie, jednak że związki lotne oraz te o niskiej 
rozpuszczalno ści w wodzie, mog ą być również, przynajmniej 
z zasady badane.  
Metoda jest stosowana tylko do tych badanych materia łów organicz ­
nych, które nie s ą inhibitorami w stosunku do bakterii w st ężeniach 
używanych w badaniu. Je żeli badany materia ł nie jest rozpuszczalny 
w stężeniu badania, nale ży użyć specjalnych środków, takich jak 
użycie ultrad źwięków, dla uzyskania dobrej zawiesiny badanego 
materiału. 
Informacje na temat toksyczno ści substancji chemicznej s ą użyteczne 
do interpretacji niskich wyników i do wyboru odpowiednich st ężeń 
badań. 
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI  
BOD jest zdefiniowane jako masa rozpuszczonego tlenu po żądana 
przez właściwą objętość roztworu substancji dla procesu utleniania 
biochemicznego w opisanych warunkach.  
Wyniki s ą wyrażane jako gramy BOD na gram badanej substancji.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Pożądane jest u życie odpowiednich substancji odniesienia dla spraw ­
dzenia aktywno ści inokulum.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Wstępnie oznaczona ilo ść substancji, rozpuszczona lub zawieszona 
w dobrze napowietrzanym odpowiednim pod łożu, jest zaszczepiana 
drobnoustrojami i inkubowana w sta łej zdefiniowanej temperaturze 
otoczenia w ciemno ści. 
BOD jest oznaczane przez ró żnicę w zawarto ści rozpuszczonego 
tlenu na pocz ątku i na ko ńcu badania. Czas trwania badania wynosi 
co najmniej 5 dni i nie wi ęcej niż 28 dni.  
Ślepa próba musi by ć oznaczona w równoleg łym badaniu niezawie ­
rającym badanej substancji.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Oznaczenie BOD nie mo że być uważane jako maj ące ważność 
naukową oznaczenie biodegradowalno ści substancji, a jedynie jako 
badanie przesiewowe (sortuj ące). 
1.6. OPIS METODY BADANIA  
Wstępny roztwór lub zawiesina substancji jest przygotowywana aby 
uzyskac st ężenie BOD odpowiednie dla zastosowanej metody. 
Następnie BOD jest oznaczane stosuj ąc jedną z odpowiednich naro ­
dowo i mi ędzynarodowo standaryzowanych metod.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. DANE I OCENA  
BOD zawarte w wst ępnym roztworze jest obliczane zgodnie 
z wybran ą znormalizowana metod ą i przeliczane na gramy BOD 
na gram badanej substancji.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Metoda stosowana musi by ć ustalona.  
Zapotrzebowanie biochemiczne na tlen nale ży uśrednić z co najmniej 
trzech wa żnych pomiarów.  
Wszystkie informacje i uwagi odno śnie interpretacji wyników musza 
być przedstawione w sprawozdaniu, szczególnie w odniesieniu do 
zanieczyszcze ń, postaci fizycznej, dzia łania toksycznego 
i właściwości związanych z budow ą substancj ą które powoduj ą 
wpływ na wyniki.  
Musi być wykazane w sprawozdaniu u życie dodatków hamuj ących 
biologiczna nitryfikacj ę. 
4. LITERATURA  
Wykaz standaryzowanych metod, dla przyk ładu: 
NF T 90-103: Determination biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, 
London.  
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after 
n days.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. DEGRADACJA – ZAPOTRZEBOWANIE CHEMICZNE NA 
TLEN  
1. METODA  
1.1. WPROWADZENIE  
Celem metody jest pomiar zapotrzebowania chemicznego na tlen 
(COD) substancji organicznych w stanie ciek łym lub sta łym 
w standardowy arbitralny sposób, w ustalonych warunkach labora ­
toryjnych.  
Informacje na temat wzoru chemicznego s ą użyteczne dla prowa ­
dzenia tego badania oraz interpretacji uzyskanych wyników (np. 
sole halogenowe, sole żelazowe zwi ązków organicznych, zwi ązki 
chloroorganiczne).  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen jest zmierzon ą utlenialno ścią 
substancji, wyra żoną jako równowa żna ilość tlenu odczynnika utle ­
niającego zużytego przez substancje w ustalonych warunkach labo ­
ratoryjnych.  
Wynik jest wyra żany w gramach COD na gram badanej substancji.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Nie ma konieczno ści stosowania substancji odniesienia za ka żdym 
razem, gdy przeprowadzane s ą badania nowej substancji. Powinny 
one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajno ści 
metody i pozwoli ć na porównanie wyników z innymi metodami.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Wstępnie oznaczona ilo ść substancji, rozpuszczonej lub zawieszonej 
w wodzie, jest utleniana przez dichromian potasu w st ężonym 
kwasie siarkowym z siarczanem srebra jako katalizatorem, pod chłodnicą zwrotną przez dwie godziny. Pozosta łość dichromiany 
jest oznaczana miareczkowo mianowanym roztworem siarczanu żela­
zoamonowego.
 
W przypadku substancji zawieraj ących chlor, dodaje si ę siarczanu 
rtęci (  1 ) celem zmniejszenia zak łócenia przez chlorki.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCI 
Z powodu arbitralnego sposobu oznaczenia, COD jest „wska źnikiem 
utlenialno ści” i jako taki u żywany jest jako praktyczna metoda 
pomiaru zwi ązków organicznych.  
Chlorki zak łócają to badanie; redukuj ące środki nieorganiczne lub 
utleniające mogą także powodowa ć zakłócenia w oznaczaniu COD.  
Niektóre zwi ązki cykliczne i wiele substancji lotnych (np. ni ższe 
kwasy tłuszczowe) nie s ą w pełni utleniane w niniejszym badaniu.  
1.6. OPIS METODY BADANIA  
Wstępny roztwór lub zawiesina substancji jest tak przygotowywana 
by uzyska ć COD pomi ędzy 250 i 600 mg na litr.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Po użyciu roztwory zawieraj ące sole rt ęci należy unieszkodliwi ć, by zapobiec przenie ­
sieniu rtęci do środowiska naturalnego.
 Uwagi:  
W przypadku s łabo rozpuszczalnych i niedaj ących się zdyspergowa ć 
substancji nale ży ilość drobno sproszkowanej substancji, odpowia ­
dającej około 5 mg COD, odwa żyć i umieścić w aparacie do świad­
czalnym wraz z wod ą. 
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (COD) jest cz ęsto i szczególnie 
w przypadku s łaborozpuszczalnych substancji oznaczane korzystnie 
w odmianach metody, to jest w zamkni ętym systemie 
z ciśnieniowym ekwalizerem (H. Kelkenberg, 1975). W niniejszej 
modyfikacji zwi ązki, które tylko z trudno ścią można oznaczy ć 
metodą konwencjonaln ą – na przyk ład kwas octowy – s ą często z 
powodzeniem oznaczane. Metoda tak że zawodzi, jak w przypadku 
pirydyny. Je żeli stężenie dichromianu potasu, jak opisano w pozycji 
bibliograficznej (1), wzro śnie do 0,25 N (0,0416 M), bezpo średnia 
doważka 5–10 mg substancji u łatwia oznaczenie COD, co jest zasad ­
nicze dla s łabo rozpuszczalnych w wodzie substancji (poz. lit. (2)).  
Z drugiej strony, COD jest oznaczane, wykorzystuj ąc wszystkie 
odpowiednie krajowe i mi ędzynarodowe standaryzowane metody.  
2. DANE I OCENA  
COD zawarte w kolbie do świadczalnej jest obliczane, stosuj ąc 
wybrane znormalizowane metody i przeliczane na gramy COD na 
gram badanej substancji.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
Zastosowana metoda odniesienia musi by ć ustalona.  
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen musi by ć średnią co najmniej 
z trzech pomiarów. Wszystkie informacje i uwagi odno śnie interpre ­
tacji wyników musza by ć przedstawione w sprawozdaniu, szcze ­
gólnie w odniesieniu do zanieczyszcze ń, postaci fizycznej, 
i właściwości związanych z budow ą substancji, które powoduj ą 
wpływ na wyniki.  
W sprawozdaniu nale ży przedstawi ć również fakt użycia siarczanu 
rtęci dla zminimalizowania zak łóceń pochodz ących od chlorków.  
4. LITERATURA  
(1) Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, 
vol. 8, 146.  
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble 
compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.  
Wykaz standaryzowanych metod, dla przyk ładu: 
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen 
demand.  
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NFT 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen 
demand (COD) within the range above 15 mg per litr.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. ROZK ŁAD – ROZK ŁAD ABIOTYCZNY: HYDROLIZA JAKO 
FUNKCJA PH  
1. METODA  
Niniejsza metoda badania jest równowa żna metodzie OECD TG 111 
(2004).  
1.1. WST ĘP 
Związki chemiczne mog ą przedostawa ć się do wód powierzchnio ­
wych takimi drogami, jak: bezpo średnie stosowanie, rozpylenie poza 
teren upraw, odp ływ, odprowadzanie wód powierzchniowych, 
usuwanie odpadów, ścieki przemys łowe, komunalne lub rolnicze 
oraz opady atmosferyczne. Zwi ązki te mog ą ulegać przemianom 
w tych wodach w procesach chemicznych (np. hydroliza, utlenianie), 
fotochemicznych i/lub mikrobiologicznych. Niniejsze wytyczne 
opisują metodę badania laboratoryjnego maj ącą ocenić abiotyczne 
przemiany hydrolityczne zwi ązków chemicznych w uk ładach 
wodnych, przy warto ściach pH normalnie wyst ępujących 
w środowisku naturalnym (pH = 4–9) i oparte s ą na istniej ących 
wytycznych (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).  
Próby wykonuje si ę dla określenia: (i) szybko ści hydrolizy substancji 
badanej w funkcji pH; oraz (ii) to żsamości lub charakteru oraz szyb ­
kości powstawania i zaniku produktów hydrolizy, na dzia łanie 
których organizmy mog ą być narażone. Badania takie mog ą być 
wymagane dla zwi ązków chemicznych, które s ą bezpośrednio stoso ­
wane w wodzie albo które prawdopodobnie mog ą się przedostawa ć 
do środowiska innymi drogami, które opisano powy żej. 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Zob. załącznik 2.  
1.3. ZAKRES STOSOWANIA METODY  
Metoda ta dotyczy ogólnie substancji chemicznych (znaczonych lub 
nieznaczonych), dla których istnieje metoda analityczna maj ąca 
wystarczaj ącą dokładność i czułość. Ma ona zastosowanie dla 
związków o niskiej lotno ści oraz nielotnych, o wystarczaj ącej 
rozpuszczalno ści w wodzie. Badania nie nale ży przeprowadza ć dla 
związków chemicznych, które wykazuj ą wysoką lotność ze środo­
wiska wodnego (np. fumiganty, rozpuszczalniki organiczne) i tym 
samym nie mo żna ich utrzyma ć w roztworze w warunkach tego 
badania. Badanie mo że być trudne do wykonania dla substancji 
o minimalnej rozpuszczalno ści w wodzie (8).  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Sterylne wodne roztwory buforowe o ró żnych warto ściach pH (pH = 
4, 7 i 9) poddaje si ę działaniu substancji badanej oraz inkubacji 
w ciemno ści w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (w 
stałych temperaturach). Po odpowiednich okresach czasu roztwory 
buforowe analizuje si ę na obecno ść substancji badanej i produktów 
hydrolizy. W przypadku substancji znaczonej (np.  14 C) bilans 
masowy mo że być łatwiejszy do ustalenia.  
Niniejszą metodę badania okre śla się jako „podej ście poziomowe”, 
które pokazano oraz wyja śniono w za łączniku 1. Ka żdy „poziom” 
jest uruchamiany przez wyniki poprzedniego „poziomu”.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMACJA O SUBSTANCJI BADANEJ  
Do pomiaru szybko ści hydrolizy mo żna użyć substancji nieznaczo ­
nych albo znaczonych. Materia ł znaczony jest zasadniczo prefero ­
wany przy badaniu przebiegu hydrolizy oraz przy ustalaniu bilansu 
masowego; jednak w przypadkach szczególnych znaczenie nie musi 
być absolutnie konieczne. Zaleca si ę znaczenie przy pomocy  14 C, ale 
przydatne mo że być również użycie innych izotopów, takich jak  13 C, 
15 N, 3 H. O ile to b ędzie możliwe, znacznik powinien by ć umiesz­
czony w najtrwalszej cz ęści cząsteczki. Na przyk ład, jeśli substancja 
badana zawiera jeden pier ścień, wymagane jest znaczenie 
w pierścieniu; je śli substancja badana zawiera dwa lub wi ększą 
liczbę pierścieni, potrzebne mog ą być osobne badania dla ustalenia 
losu każdego zaznaczonego pier ścienia i dla uzyskania odpowiednich 
informacji na temat powstawania produktów hydrolizy. Czysto ść 
substancji badanej powinna wynosi ć co najmniej 95 %.  
Przed wykonaniem testu hydrolizy nale ży zebrać następujące infor­
macje na temat substancji badanej:  
a) rozpuszczalno ść w wodzie (metoda badania A.6);  
b) rozpuszczalno ść w rozpuszczalnikach organicznych;  
c) prężność par (metoda badania A.4) i/lub sta ła w równaniu 
Henry'ego;  
d) współczynnik podzia łu n-oktanol/woda (metoda badania A.8);  
e) stała dysocjacji (pK  a ) (Wytyczna OECD 112) (9);  
f) szybko ść fototransformacji bezpo średniej i po średniej w wodzie, 
w przypadkach, których to dotyczy.  
Dostępne powinny by ć metody analityczne dla oznaczania ilo ścio­
wego substancji badanej oraz, je śli jest to wa żne, dla identyfikacji 
i oznaczania ilo ściowego produktów hydrolizy w roztworach 
wodnych (zob. tak że sekcja 1.7.2).  
1.6. SUBSTANCJE WZORCOWE  
W miarę możliwości przy identyfikacji i ocenie ilo ściowej 
produktów hydrolizy metodami spektroskopowymi i chromatogra ­
ficznymi albo innymi odpowiednio czu łymi metodami nale ży 
korzystać z substancji wzorcowych.  
1.7. KRYTERIA JAKO ŚCI 
1.7.1.  Odzysk  
Analiza co najmniej dwóch roztworów buforowych albo ich 
ekstraktów natychmiast po dodaniu substancji badanej daje pierwsz ą 
wskazówk ę na temat powtarzalno ści metody analitycznej oraz jedno ­
rodności procedury aplikacyjnej dla substancji badanej. Stopnie 
odzysku dla kolejnych etapów eksperymentów uzyskuje si ę 
z odpowiednich bilansów masowych (je śli używa się materiału 
znaczonego). Stopnie te powinny si ę mieścić w zakresie od 90 % 
do 110 % dla zwi ązków chemicznych znaczonych i nieznaczonych 
(7). W przypadku gdy uzyskanie tego zakresu jest technicznie 
trudne, odzysk wynosz ący 70 % dla zwi ązków nieznaczonych jest 
do przyjęcia, ale nale ży podać uzasadnienie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Powtarzalno ść i czułość metody analitycznej  
Powtarzalno ść metody analitycznej albo metod analitycznych wyko ­
rzystywanych do oceny ilo ściowej substancji badanej i produktów 
hydrolizy mo żna sprawdzi ć za pomoc ą powielanych analiz tych 
samych roztworów buforowych (lub ich ekstraktów) w pó źniejszym 
okresie, po zebraniu wystarczaj ących ilości produktów hydrolizy dla 
oceny ilo ściowej.  
Metoda analityczna powinna by ć wystarczaj ąco czuła, aby mo żna 
było ocenić ilościowo stężenia substancji badanych na poziomie 
10 % lub mniej st ężenia pierwotnego. Je śli ma to zastosowanie, 
metody analityczne powinny tak że być wystarczaj ąco czułe, aby 
można było oznaczy ć ilościowo dowolny produkt hydrolizy stano ­
wiący 10 % lub wi ęcej stężenia zastosowanego (w dowolnym 
momencie podczas badania), do 25 % lub mniej jego najwy ższego 
stężenia.  
1.7.3.  Przedzia ły ufności dla danych kinetycznych hydrolizy  
Przedziały ufności należy obliczy ć i podać dla wszystkich wspó ł­
czynników regresji, sta łych szybko ści, okresów po łowicznego zaniku 
oraz wszelkich innych parametrów kinetycznych (np. DT50).  
1.8. OPIS METODY BADANIA  
1.8.1.  Aparatura i wyposa żenie 
Badania nale ży wykonywa ć w pojemnikach szklanych (np. 
w probówkach lub niewielkich kolbkach), w ciemno ści i w warun ­
kach sterylnych, je śli jest to konieczne, chyba że informacje wst ępne 
(takie jak wspó łczynnik podzia łu n-oktanol/woda) wskazuj ą, że 
substancja badana mo że przywiera ć do szkła. W takich przypadkach 
może zaistnie ć potrzeba rozwa żenia użycia materia łów alternatyw ­
nych (takich jak teflon). By ć może także uda się zmniejszy ć problem 
przylegania do szk ła przy pomocy jednej z poni ższych metod:  
— określenie masy substancji badanej i produktów hydrolizy zaad ­
sorbowanych do naczynia testowego,  
— użycie łaźni ultradźwiękowej,  
— zapewnienie mycia rozpuszczalnikiem ca łego sprzętu szklanego 
dla każdego odst ępu pobierania próbek,  
— używanie produktów preparowanych,  
— używanie zwi ększonej ilo ści współrozpuszczalnika dla wprowa ­
dzania substancji badanej do uk ładu; jeśli używa się współroz­
puszczalnika, powinien to by ć taki materia ł, który nie powoduje 
hydrolizy substancji badanej.  
Dla inkubacji ró żnych roztworów badanych zwykle potrzebne s ą 
wstrząsarki z łaźnią wodną o kontrolowanej temperaturze albo inku ­
batory z termostatyczn ą kontrolą temperatury.  
Potrzebne jest standardowe wyposa żenie laboratorium, obejmuj ące 
w szczególno ści: 
— pH-metr,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— przyrz ądy analityczne, takie jak wyposa żenie GC, HPLC i TLC, 
włącznie z odpowiednimi systemami detekcji dla analizy 
substancji znaczonych radioaktywnie i nieznaczonych, albo odwrócona metoda rozcie ńczeń izotopowych,
 
— przyrz ądy dla potrzeb identyfikacji (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR itp.),  
— cieczowy licznik scyntylacyjny,  
— rozdzielacze dla ekstrakcji ciecz-ciecz,  
— aparatura do zat ężania roztworów i ekstraktów (np. wyparka 
rotacyjna),  
— urządzenie do kontroli temperatury (np. łaźnia wodna).  
Odczynniki chemiczne obejmuj ące na przyk ład: 
— rozpuszczalniki organiczne, cz.d.a., takie jak heksan, dichloro ­
metan itp.,  
— ciecz scyntylacyjna,  
— roztwory buforowe (szczegó ły – zob. sekcja 1.8.3).  
Cały sprzęt szklany, wod ę o czysto ści odczynnikowej oraz roztwory 
buforowe u żywane w testach hydrolizy nale ży poddać sterylizacji.  
1.8.2.  Wprowadzanie substancji badanej  
Substancja badana powinna by ć wprowadzana jako roztwór wodny 
do różnych roztworów buforowych (zob. za łącznik 3). Je śli jest to 
konieczne dla odpowiedniego rozpuszczenia, dopuszcza si ę użycie 
niewielkich ilo ści rozpuszczalników mieszaj ących się z wodą (takich 
jak acetonitryl, aceton, etanol) dla wprowadzenia i rozprowadzenia substancji badanej, jednak ilo ść ta normalnie nie powinna przekra ­
czać 1 % obj. W przypadku je śli rozważa się użycie wyższych stężeń 
rozpuszczalników (np. w przypadku s łabo rozpuszczalnych 
substancji badanych), jest to dopuszczalne jedynie je śli można wyka­
zać, że rozpuszczalnik nie wywiera wp ływu na hydroliz ę substancji 
badanych.
 
Nie zaleca si ę rutynowego stosowania produktu preparowanego, 
gdyż nie można wykluczy ć, że składniki preparatu mog ą wpływać 
na proces hydrolizy. Jednak dla substancji badanych s łabo rozpusz ­
czalnych w wodzie albo dla substancji przywieraj ących do szk ła 
(zob. sekcja 1.8.1) u życie materia łu preparowanego mo że być odpo­
wiednią alternatyw ą. 
Należy stosowa ć jedno st ężenie substancji badanej i nie powinno 
ono przekracza ć 0,01 M albo po łowy stężenia w stanie nasycenia 
(zob. załącznik 1).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Roztwory buforowe  
Badanie hydrolizy nale ży wykonywa ć przy warto ściach pH wynosz ­ 
ących 4, 7 oraz 9. W tym celu nale ży przygotowa ć roztwory bufo ­
rowe, używając chemikaliów cz.d.a. oraz wody. Pewne przydatne 
układy buforowe przedstawiono w za łączniku 3. Nale ży podkreślić, 
że stosowany uk ład buforowy mo że wpływać na szybko ść hydrolizy, 
i tam gdzie taki wp ływ jest obserwowany nale ży użyć alternatyw ­
nego układu buforowego (  1 ). 
Wartość pH dla ka żdego roztworu buforowego nale ży sprawdza ć 
wykalibrowanym pH-metrem z dok ładnością do co najmniej 0,1 
jednostki w wymaganej temperaturze.  
1.8.4.  Warunki badania  
1.8.4.1.  Temperatura badania  
Badania dotycz ące hydrolizy nale ży prowadzi ć w stałych temperatu ­
rach. Dla potrzeb ekstrapolacji wa żne jest utrzymywanie temperatury 
z dokładnością co najmniej do + 0,5  o C. 
Test wstępny (poziom 1) nale ży wykona ć w temperaturze 50  o C, jeśli 
hydrolityczne zachowanie si ę substancji badanej jest nieznane. Testy 
kinetyczne na wy ższych poziomach nale ży prowadzi ć w minimum 
trzech temperaturach (w łącznie z testem w 50  o C), chyba że substancja 
badana oka że się odporna na hydroliz ę w teście początkowym. Sugero ­
wany zakres temperatur to 10–70  o C (korzystnie z przyj ęciem co 
najmniej jednej temperatury poni żej 25  o C), co obejmuje temperatur ę 
podawaną w sprawozdaniu z bada ń, wynoszącą 25 o C, oraz wi ększość 
temperatur spotykanych w warunkach polowych.  
1.8.4.2.  Światło i tlen  
Wszystkie badania hydrolizy nale ży prowadzi ć przy użyciu odpo ­
wiedniej metody, aby unikn ąć wpływów fotolitycznych. Nale ży 
podjąć wszelkie stosowne środki, aby unikn ąć obecności tlenu (np. 
barbotując przez ciecz hel, azot albo argon, w ci ągu 5 minut, przed 
przygotowaniem roztworu).  
1.8.4.3.  Czas trwania testu  
Test wstępny powinien trwa ć 5 dni, natomiast testy na wy ższych 
poziomach nale ży kontynuowa ć, aż hydrolizie ulegnie 90 % 
substancji badanej albo przez okres 30 dni, zale żnie od tego, co 
nastąpi wcześniej. 
1.8.5.  Wykonanie badania  
1.8.5.1.  Test wst ępny (poziom 1)  
Test wstępny wykonuje si ę w temperaturze 50 ± 0,5  o C i przy pH = 
4,0, 7,0 oraz 9,0. Je śli po 5 dniach obserwuje si ę hydroliz ę na 
poziomie mniejszym ni ż 10 % (t0,5 25  o C > 1 rok), substancj ę 
badaną uznaje si ę za trwałą hydrolitycznie i normalnie nie s ą wyma­
gane żadne dodatkowe testy. Je śli o substancji wiadomo, że nie jest 
ona trwa ła w temperaturach wyst ępujących w środowisku 
naturalnym (  2 ), test wst ępny nie jest wymagany. Metoda analityczna 
musi być wystarczaj ąco dokładna i czu ła, aby wykrywa ła spadek 
wynoszący 10 % st ężenia pocz ątkowego.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey i Mill zalecaj ą używanie buforów boran owych lub octanowych zamiast fosfo ­
ranowych (11). 
( 2 ) Informacje takie mog ą pochodzi ć z innych źródeł, takich jak dane dotycz ące hydrolizy 
dla strukturalnie podobnych zwi ązków – z literatury albo ze wst ępnych pó łilościowych 
testów hydrolizy dla substancji badanej, wykonanych na wcze śniejszym etapie.
 1.8.5.2.  Hydroliza substancji nietrwa łych (poziom 2)  
Test na wy ższym poziomie (test zaawansowany) nale ży wykonywa ć 
przy warto ściach pH, dla których stwierdzono w te ście wstępnym, że 
substancja badana jest nietrwa ła. Roztwory substancji badanej 
w buforach nale ży termostatowa ć w wybranych temperaturach. 
Przy testach na kinetyk ę pierwszego rz ędu każdy roztwór reakcyjny 
należy analizowa ć w odstępach czasu, które zapewniaj ą co najmniej 
sześć równomiernie rozmieszczonych punktów pomiarowych, 
zwykle pomi ędzy 10 % a 90 % hydrolizy substancji badanej. Nale ży 
pobierać pojedyncze próbki dla analiz powtórnych (co najmniej po 
dwie próbki pobierane do osobnych zbiorniczków reakcyjnych) 
i przeanalizowa ć ich zawarto ść dla każdego z co najmniej sze ściu 
okresów czasu (dla co najmniej dwunastu punktów zawieraj ących 
dane). Pobieranie za ka żdym razem jednej du żej próbki roztworu 
badanego, z której pobiera si ę mniejsze ilo ści dla analiz powtórnych, 
uznaje si ę za niew łaściwe, gdy ż procedura taka nie pozwala na 
analizę zmienno ści danych i mo że prowadzi ć do problemów 
z zanieczyszczaniem roztworu badanego. Na koniec badania na wyższym poziomie (to znaczy przy 90 % hydrolizy albo po 30 
dniach) nale ży wykonywa ć testy potwierdzaj
ące sterylno ść. Jeśli 
jednak nie obserwuje si ę rozkładu (to znaczy transformacji), prze ­
prowadzenie testów na sterylno ść nie uważa się za konieczne.  
1.8.5.3.  Identyfikacj a produktów hydrolizy (poziom 3)  
Wszelkie g łówne produkty hydrolizy, a co najmniej te, które repre ­
zentują > 10 % zastosowanej dawki, powinny zosta ć zidentyfiko ­
wane przy pomocy odpowiednich metod analitycznych.  
1.8.5.4.  Testy opcjonalne  
Dla hydrolitycznie nietrwa łej substancji badanej wymagane mog ą 
być dodatkowe testy przy warto ściach pH innych ni ż 4, 7 oraz 
9. Na przyk ład dla potrzeb fizjologicznych, potrzebny mo że być 
test w warunkach bardziej kwa śnych (np. pH = 1,2) i w jednej 
temperaturze maj ącej znaczenie fizjologiczne (37  o C). 
2. DANE  
Ilości substancji badanej i produktów hydrolizy, je śli takie istniej ą, 
należy podawa ć w % zastosowanego st ężenia pocz ątkowego oraz, 
tam gdzie ma to zastosowanie, w mg/l, dla ka żdego punktu (czasu) 
poboru próbek, dla ka żdej warto ści pH oraz dla ka żdej temperatury. 
Dodatkowo, je śli użyto znaczonej substancji badanej, nale ży podać 
bilans masowy w procentach zastosowanego st ężenia pocz ątkowego.  
Należy przygotowa ć prezentacj ę graficzn ą logarytmicznie przetwo ­
rzonych danych dla st ężeń substancji badanej w funkcji czasu. 
Wszelkie g łówne produkty hydrolizy, a przynajmniej te stanowi ące 
> 10 % u żytej dawki, powinny zosta ć zidentyfikowane, a ich prze ­
tworzone logarytmicznie st ężenia powinny by ć również wykreślone 
w ten sam sposób, co substancja macierzysta, aby pokaza ć szybkości 
ich powstawania i zaniku.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Dokładniejsze oznaczenie okresów po łowicznego zaniku lub 
wartości DT  50 powinno si ę uzyskać stosując obliczenia na bazie 
odpowiedniego modelu kinetycznego. Okresy po łowicznego zaniku 
i/lub warto ści DT  50 (włącznie z granicami przedzia łu ufności) należy 
podawać dla każdej warto ści pH oraz warto ści temperatury, wraz 
z opisem u żytego modelu, rz ędu kinetyki oraz wspó łczynnika deter ­
minacji (r  2 ). Jeśli jest to w łaściwe, obliczenia nale ży także stosowa ć 
dla produktów hydrolizy.  
W przypadku bada ń szybkości wykonywanych w ró żnych tempera ­
turach sta łe szybkości pseudo pierwszego rz ądu dla hydrolizy (kobs) 
należy przedstawi ć jako funkcj ę temperatury. Obliczenie powinno 
być oparte zarówno na rozdzieleniu warto ści kobs na sta łe szybkości 
dla hydrolizy katalizowanej kwasem, hydrolizy neutralnej i hydrolizy 
katalizowanej zasad ą (odpowiednio kH, kneutral i k0H), jak i na 
równaniu Arrheniusa:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutral þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i ¼ H;neutral ;OH A i e ÄB i=T 
gdzie A  i i B i są stałymi regresji, odpowiednio z punktu przeci ęcia się 
osią rzędnych i z nachylenia, dla najlepiej pasuj ących linii wygene ­
rowanych z przeprowadzenia regresji liniowej ln k  i w funkcji 
odwrotno ści temperatury absolutnej w Kelvinach (T). Przy pomocy 
zależności Arrheniusa dla hydrolizy katalizowanej kwasem, hydro ­
lizy neutralnej i hydrolizy katalizowanej zasad ą można wyliczy ć 
stałe szybkości pseudo pierwszego rz ędu, a tym samym okresy po ło­
wicznego zaniku, dla innych temperatur, w których bezpo średnie 
doświadczalne oznaczenie sta łej szybko ści nie jest praktycznie 
możliwe (10).  
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Większość reakcji hydrolizy przebiega zgodnie z kinetyk ą reakcji 
pozornie pierwszego rz ędu i dlatego okresy po łowicznego zaniku 
są niezależne od stężenia (zob. równanie 4 w za łączniku 2). Pozwala 
to zwykle na stosowanie wyników laboratoryjnych oznaczonych dla 
10 -2 do 10  -3 M do warunków wyst ępujących w środowisku natu ­
ralnym (< 10  -6 M) (10). Mabey i Mill (11) przedstawili kilka przy ­
kładów dobrej zgodno ści pomiędzy szybko ściami hydrolizy zmierzo ­
nymi w wodzie czystej i w wodach naturalnych dla ró żnorodnych 
związków chemicznych, pod warunkiem że mierzy si ę zarówno pH, 
jak i temperatur ę. 
3. OPRACOWANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi obejmowa ć co najmniej nast ępujące 
informacje:  
Substancja badana:  
— nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór struk ­
turalny (z pokazaniem miejsca znaczenia, kiedy u żywa się mate­
riału znaczonego radioaktywnie) oraz stosowne w łasności fizyko­
chemiczne (zob. sekcja 1.5),  
— czysto ść (zanieczyszczenia) substancji badanej,  
— czysto ść oznaczenia znaczonego zwi ązku chemicznego oraz 
aktywność molowa (je śli dotyczy),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— roztwory buforowe,  
— daty i szczegó ły dotyczące przygotowania,  
— użyte bufory i rodzaje wody,  
— molowo ść i pH roztworów buforowych.  
Warunki badania:  
— daty wykonania bada ń, 
— ilość zastosowanej substancji badanej,  
— metoda i rozpuszczalniki (rodzaj i ilo ść) użyte dla zastosowania 
substancji badanej,  
— objętość inkubowanych buforowanych roztworów substancji 
badanej,  
— opis uk ładu użytego do inkubacji,  
— pH i temperatura w trakcie badania,  
— czasy pobierania próbek,  
— metoda/metody ekstrakcji,  
— metody oceny ilo ściowej i identyfikacji substancji badanej oraz 
produktów jej hydrolizy w roztworach buforowych,  
— liczba powtórze ń. 
Wyniki:  
— powtarzalno ść i czułość użytych metod analitycznych,  
— stopnie odzysku (warto ści procentowe dla wa żności badania 
podano w sekcji 1.7.1),  
— dane dla powtórze ń i wartości średnie w formie tabeli,  
— bilans masowy w trakcie i na koniec bada ń (jeśli użyta została 
znaczona substancja badana),  
— wyniki testu wst ępnego,  
— omówienie i interpretacja wyników,  
— wszelkie oryginalne dane i liczby.  
Poniższe informacje s ą wymagane jedynie kiedy oznacza si ę szyb­
kość hydrolizy:  
— wykresy st ężeń w funkcji czasu dla substancji badanej i, 
w stosownych przypadkach, dla produktów hydrolizy przy ka żdej 
wartości pH oraz temperatury,  
— tabele wyników z równania Arrheniusa dla temperatury 20  o C/25  
o C, z podaniem pH, sta łej szybko ści [h  -1 lub dzień -1 ], okresu 
połowicznego zaniku albo DT  50 , temperatur [  o C], włącznie 
z granicami dla przedzia łu ufności i wspó łczynnikami korelacji 
(r 2 ) albo porównywalnymi informacjami,  
— proponowany przebieg (cykl przemian w trakcie) hydrolizy.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guide ­
line for Testing of Chemicals Nr. 111 [OECD (1981).  
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796,3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC 
amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: 
Fate and Behaviour in the Environment.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prufung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser 
(October 1980).  
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed 
[SETAC (1995).  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Asses ­
sment Nr.23 [OECD (2000).
 
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994 – 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals [OECD (1993).  
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral 
presentation at the 14
 th Annual Meeting of the Society of 
Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
 
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref Data 7, 383–415.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
ZAŁĄCZNIK 1  
Wielopoziomowy schemat badania hydrolizy
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
ZAŁĄCZNIK 2  
Definicje i jednostki  
W każdym przypadku nale ży stosowa ć międzynarodowy uk ład jednostek 
miar (SI).  
Substancja badana:  dowolna substancja, niezale żnie od tego, czy jest to 
związek macierzysty, czy odpowiednie produkty transformacji.  
Produkty transformacji:  wszystkie substancje powstaj ące w biotycznych lub 
abiotycznych reakcjach transformacji substancji badanej.  
Produkty hydrolizy:  wszystkie substancje powstaj ące w reakcjach transformacji 
hydrolitycznej substancji badanej.  
Hydroliza  dotyczy reakcji substancji badanej RX z wod ą, z wymian ą grupy X na 
grupę OH w centrum reakcyjnym: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
Szybkość, z jaką stężenie RX spada w tym uproszczonym procesie, podaje si ę 
równaniem 
szybkość = k [H  2 O] [RX] reakcja drugiego rz ędu 
albo 
szybkość = k [RX] reakcja pierwszego rz ędu 
zależnie od etapu decyduj ącego o szybko ści. Poniewa ż woda jest obecna 
w dużym nadmiarze w stosunku do substancji badanej, ten typ reakcji zwykle 
opisuje si ę jako reakcj ę pseudopierwszego rz ędu, w której obserwowan ą stałą 
reakcji podaje zale żność 
k obs = k [H  2 O] [2]  
i można ją wyznaczy ć z wyrażenia (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
gdzie:  
t = czas,  
a C  o , C t = stężenia RX dla czasu wynosz ącego 0 oraz t.  
Wymiar dla tej sta łej to (jednostka czasu)  -1 , a okres po łowicznego zaniku dla 
reakcji (czas, po którym przereaguje 50 % RX) podaje równanie  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Okres po łowicznego zaniku:  (t 0,5 ) to czas potrzebny dla osi ągnięcia 50 % 
hydrolizy substancji badanej, kiedy reakcj ę można opisać kinetyką pierwszego 
rzędu; zależy on od st ężenia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Jeśli wykres danych w skali logarytmicznej jako funkcji czasu nie jest lini ą prostą (co 
równa się szybkości reakcji pierwszego rz ędu), wówczas nie mo żna wykorzystywa ć 
równania [3] do okre ślania stałej szybko ści hydrolizy dla substancji badanej.
 DT 50 (Disappearance Time 50 = czas zaniku 50):  to czas, po którym st ężenie 
substancji badanej zmniejsza si ę o 50 %; jest on ró żny od okresu po łowicznego 
zaniku t  0,5 , kiedy reakcja nie stosuje si ę do kinetyki pierwszego rz ędu. 
Ocena k w innej temperaturze  
Kiedy znane s ą stałe szybkości reakcji w dwóch temperaturach, sta łe szybkości 
w innych temperaturach mo żna wyprowadzi ć z równania Arrheniusa:  
k ¼ A Ü e Ä E 
R Ü T lub ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Wykres ln k w funkcji l/T jest lini ą prostą o nachyleniu -E/R  
gdzie:  
k = sta ła szybkości, mierzona w ró żnych temperaturach,  
E = energia aktywacji (kJ/mol),  
T = temperatura absolutna (K),  
R = sta ła gazowa (8,314 J/mol.K).  
Energię aktywacji wyliczono za pomoc ą analizy regresyjnej albo nast ępującego 
równania:  
E ¼ R Ü ln k 2 Ä ln k 1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
w którym: T  2 >T 1 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
ZAŁĄCZNIK 3  
Układy buforowe  
A. CLARK i LUBS:  
Mieszaniny buforowe wed ług CLARKA i LUBSA  (*) 
Skład pH  
0,2 N HC1 + 0,2 N KC1 przy 20  o C 
47,5 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 1,0 
32,25 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 1,2 
20,75 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 1,4 
13,15 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 1,6 
8,3 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 1,8 
5,3 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 2,0 
3,35 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcie ńczyć do 100 ml 2,2  
0,1 M kwasny ftalan potasu + 0,1 N HC1 przy 20  o C 
46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 2,2 
39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 2,8 
20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 3,0 
14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 3,4 
5,97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 3,6 
2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 3,8  
0,1 M kwa śny ftalan potasu + 0,1 N HCl przy 20  o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 4,0 
3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 4,6 
17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 4,8  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Warto ści pH podane w tych tabelach zosta ły obliczone na podstawie pomiarów potencja łu, przy wykorzys ­
taniu standardowych równa ń Sórensena (1909). Odpowiadaj ące im warto ści pH są o 0,04 jednostki wy ższe od 
wartości podanych w tabeli.
 Skład pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 5,2 
35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 5,4 
39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 5,6 
43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 5,8 
45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwa śnego ftalanu do 100 ml 6,0  
Mieszaniny buforowe wed ług CLARKA i LUBSA (ci ąg dalszy) 
0,1 M fosforan monopotasu + 0,1 N NaOH przy 20  o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 mll 6,0 
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 m 6,4 
17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 7,2 39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 7,4 42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 7,6 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 B0 3 w 0,1 M KC1 + 0,1 N NaOH przy 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 8,2 8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 8,6 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF i VLEESCHHOUWER:  
Bufory cytrynianowe wed ług KOLTHOFFA i VLEESCHHOUWERA  (*) 
Sklad pH  
0,1 M cytrynian monopotasu i 0,1 N HC1 przy 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml cytrynianu do 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HCl+50 ml cytrynianu do 100 ml 2,4 
36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml 2,6 
30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HCl+50 ml cytrynianu do 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml 3,6  
0,1 M cytrynian monopotasu i 0,1 N HCl przy 18  o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 4,4 
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml 6,0  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Doda ć niewielkie kryszta łki tymolu lub podobnej substancji aby zapobiec rozwojowi 
pleśni.
 C. SÖRENSEN:  
Mieszaniny boranowe wed ług SÓRENSENA  
Skład Sörensen 
18 o C Valbum, pH przy 
ml boraksu ml HCl/NaO H 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M boraksu + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 
9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M boraksu + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Mieszaniny fosforanowe wed ług SÖRENSENA  
Skład pH  
0,0667 M fosforan monopotasu + 0,0667 M fosforan disodu przy 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOKSYCZNO ŚĆ DŻDŻOWNIC  
BADANIE SZTUCZNEJ GLEBY  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
W tym badaniu laboratoryjnym substancja testowa dodawana jest do 
sztucznej gleby, w której umieszcza si ę dżdżownice na okres 14 dni. 
Po zakończeniu tego okresu (i opcjonalnie po siedmiu dniach) 
badane s ą skutki śmiertelno ści dżdżownic wywo łane przez 
substancję testową. Badanie dostarcza metody na wzgl ędnie krótko ­
terminowe badanie skutków substancji chemicznej na d żdżownice 
pobieranej przez skór ę i układ pokarmowy.  
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKA  
LC 50 : Stężenie substancji testowej ocenione jako powoduj ące śmierć 
u 50 % badanych zwierz ąt w okresie przeprowadzania badania.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Substancja odniesienia u żywana jest okresowo jako środek pozwa ­
lający określić, iż czułość systemu badawczego nie uleg ła znacznej 
zmianie.  
Analityczny stopie ń chloroacetamidu zalecany jest jako substancja 
odniesienia.  
1.4. ZASADA BADANIA  
Ziemia stanowi zmienn ą pożywkę, dlatego te ż do tego badania 
wykorzystywana jest starannie okre ślona sztuczna gleba. Doros łe 
dżdżownice z gatunku  Eisenia foetida  (zob. uwaga w dodatku) utrzy ­
mywane s ą w ściśle określonej sztucznej glebie poddawanej dzia ­ 
łaniu różnych stężeń substancji testowej. Zawarto ść zbiorników 
rozłożona jest na tacach przez okres 14 dni (i opcjonalnie przez 
siedmiu dniach) po rozpocz ęciu badania oraz zliczane s ą osobniki 
pozostałe przy życiu po ekspozycji na dzia łanie każdej wielko ści 
stężenia substancji testowej.  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Badanie zaprojektowano w taki sposób, aby by ło jak najbardziej 
odtwarzalne w odniesieniu do badanego substrata i organizmu. 
Śmiertelno ść w grupach kontrolnych nie mo że przekracza ć 10 % 
po zakończeniu badania, w przeciwnym razie badanie uwa ża się za 
nieważne. 
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.6.1.  Materia ły 
1.6.1.1. S u b s t r a t t e s t o w y  
Zdefiniowana sztuczna gleba u żywana jest jako podstawowy substrat 
testowy.  
a) Podstawowy substrat (procenty w przeliczeniu na such ą masę) 
— 10 % torf sfagnowy (o mo żliwie jak najbardziej zbli żonym 
pH 5,5–6,0 bez widocznych pozosta łości roślinnych 
i drobnomielony).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % gliny laolinitowej, najlepiej z ponad 50 % zawarto ścią 
kaolinitu.  
— Około 69 % przemys łowego piasku kwarcowego (przewaga 
piasku drobnoziarnistego z ponad 50 % zawarto ścią cząste­
czek o wielko ści 0,05–0,2 mm). W przypadku gdy substancja 
nie rozrzedza si ę w wodzie w sposób wystarczaj ący, 10 
g badanego substrata nale ży zachowa ć z danego zbiornika 
w celu pó źniejszego zmieszania z substancja testow ą. 
— Dodaje si ę około 1 % węglanu wapnia (CaCO  3 ), sproszkowa ­
nego, chemicznie czystego w celu uzyskania pH do 6,0 ± 0,5.  
b) Substrat testowy  
Substrat testowy zawiera substrat podstawowy, substancj ę testową 
i dejonizowan ą wodę. 
Zawartość wody wynosi oko ło 25–42 % suchej masy substrata 
podstawowego. Zawarto ść wody w substracie, ustalana jest przez 
osuszanie próbki do sta łej masy przy 105  o C. Kluczowym kryte ­
rium jest nawil żanie sztucznej gleby do takiego momentu, aby nie 
powstały wody stoj ące. Należy zachowa ć ostrożność podczas 
mieszania w celu równomiernego roz łożenia substancji testowej 
i substrata. Sposób wprowadzenia substancji testowej do substrata 
należy opisać. 
c) Substrat kontrolny  
Substrat kontrolny zawiera substrat podstawowy i wod ę. 
W przypadku wprowadzenia dodatkowego czynnika, dodatkowy 
substrat kontrolny powinien zawiera ć tę samą ilość dodatkowego 
czynnika.  
1.6.1.2. Z b i o r n i k i t e s t o w e  
Szklane zbiorniki o pojemno ści około jednego litra (odpowiednio 
przykryte plastikowymi pokrywkami, naczynia lub folie z tworzywa sztucznego z otworami wentylacyjnymi) wype łnione 
pewną ilością nawilżonego lub kontrolnego substrata, równowarto ść 
500 g suchej masy substrata.
 
1.6.2.  Warunki badania  
Zbiorniki nale ży przechowywa ć w klimatyzowanych komorach 
w temperaturze 20 ± 2  o C w stałym oświetleniu. Nat ężenie oświet­
lenia powinno wynosi ć 400–800 luksów.  
Okres badania wynosi 14 dni, ale śmiertelno ść można fakultatywnie 
ocenić na siedem dni po rozpocz ęciu badania.  
1.6.3.  Procedura badania  
S t ę ż e n i a s u b s t a n c j i t e s t o w e j  
Stężenia substancji testowej wyra żone są jako waga substancji na 
suchą masę substrata podstawowego (mg/kg).  
T e s t u s t a l a n i a z a k r e s u s t ę ż e ń 
Wielkość stężeń powoduj ąca śmiertelno ść 0–100 % mo żna ustalić 
przez test ustalania zakresu st ężeń w celu przekazania informacji 
o zakresie st ężeń wykorzystywanym w ostatecznym badaniu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
Substancj ę należy zbadać przy nast ępujących wielko ściach stężeń: 
1 000; 100; 10; 1; 0,1 mg substancji/kilogram badanego substrata 
(sucha masa).  
W przypadku przeprowadzenia w pe łni badania ostatecznego jedna 
grupa badana na dan ą wielkość stężenia i jedna grupa kontrolna 
niepoddana dzia łaniu substancji, ka żda zawieraj ąca 10 dżdżownic, 
powinna by ć wystarczaj ąca w celu wykonania testu ustalania zakresu 
stężeń. 
B a d a n i e o s t a t e c z n e  
Wyniki testu ustalania zakresu st ężeń wykorzystywane s ą w celu 
wybrania co najmniej pi ęciu wielko ści stężeń uszeregowanych 
geometrycznie, obejmuj ących zakres 0–100 % śmiertelno ści 
i różniących się stałym czynnikiem nie przekraczaj ącym 1,8.  
Badania wykorzystuj ące te serie st ężeń powinny umo żliwić ustalenie 
wartości LC  50 oraz jej granic pewno ści najdok ładniej jak to mo żliwe.  
W badaniu ostatecznym nale ży użyć co najmniej cztery grupy 
badane przy danej wielko ści stężenia i cztery grupy kontrolne niepo ­
ddane dzia łaniu substancji, ka żda zawieraj ąca 10 dżdżownic. Wyniki 
takich replikuj ących grup podawane s ą jako średnia i odchylenie 
standardowe.  
W przypadku gdy dwa równoleg łe stężenia o wielko ści 1,8, powo ­
dują 0 % i 100 % śmiertelno ści, takie dwie warto ści są wystarczaj ące 
do oznaczenia zakresu, w którym obni ża się LC  50 . 
M i e s z a n i n a p o d s t a w o w e g o s u b s t r a t a t e s t o w e g o 
i s u b s t a n c j i t e s t o w e j .  
Badany substrat, je żeli możliwe, nie powinien zawiera ć dodatkowych 
czynników innych ni ż woda. Bezpo średnio przed rozpocz ęciem 
badania, zawiesina substancji testowej lub substancja testowa rozrze ­
dzona w dejonizowanej wodzie lub innym rozpuszczalniku jest mieszana z podstawowym substratem testowym, lub równomiernie nad nim rozpylana za pomoc ą drobnego spryskiwacza chromatogra ­
ficznego lub podobnego.
 
Jeżeli substancja testowa nie jest rozpuszczalna w wodzie, mo że być 
rozpuszczona w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, 
w możliwie jak najmniejszej ilo ści (np. heksan, aceton lub chloro ­
form).  
Jedynie czynniki łatwo ulatniaj ące się mogą być użyte w celu 
rozpuszczenia, rozrzedzenia lub zemulgowania substancji testowej. 
Badany substrat nale ży wietrzy ć przed użyciem. Nale ży uzupełniać 
ilość wyparowanej wody. Grupa kontrolna powinna zawiera ć tę samą 
ilość każdego dodawanego czynnika.  
Jeżeli substancja testowa jest nierozpuszczalna, nierozrzedzalna lub 
nie emulguje w rozpuszczalnikach organicznych, nale ży zmiesza ć 10 
g drobnoziarnistego piasku kwarcowego oraz tak ą ilość substancji 
testowej, jaka wymagana jest przy 500 g suchej masy sztucznej 
gleby z 490 g suchej masy badanego substrata.  
W odniesieniu do ka żdej badanej grupy, nale ży umieścić ilość nawil­ 
żonego badanego substrata równ ą 500 g suchej masy w ka żdym 
szklanym zbiorniku wraz z 10 d żdżownicami, które przebywa ły 
przez okres 24 godzin w podobnych warunkach tj. w warunkach nawilżonego substrata podstawowego, a nast ępnie zosta ły szybko 
umyte, a nadwy żka wody zosta ła wchłonięta w bibu łę filtracyjn ą 
przed użyciem.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Zbiorniki przykrywa si ę perforowanymi plastikowymi pokrywkami, 
naczyniami lub foli ą w celu zapobie żenia wysychaniu substrata 
i utrzymuje si ę je w warunkach badania przez okres l4 dni.  
Oszacowania nale ży dokona ć 14 dni (opcjonalnie po siedmiu dniach) 
po rozpocz ęciu badania. Substrat rozk ładany jest na szklanej p łytce 
lub płytce wykonanej ze stali nierdzewnej. Nale ży przeprowadzi ć 
badanie d żdżownic oraz ustali ć liczbę osobników pozosta łych przy 
życiu. Dżdżownice uwa ża się za martwe, je żeli nie reaguj ą na deli­
katne bod źce mechaniczne oddzia łujące z przodu organizmu osob ­
nika.  
W przypadku gdy badanie przeprowadzane jest po siedmiu dniach, 
zbiornik ponownie nape łniany jest substratem testowym, a osobniki 
pozostałe przy życiu są przenoszone na powierzchni ę z tym samym 
substratem testowym.  
1.6.4.  Badane organizmy  
Organizmy poddane badaniu powinny by ć osobnikami doros łymi 
Eisenia foetida  (zob. uwagi w Dodatku) (w wieku dwóch miesi ęcy 
życia z ukszta łtowanym siode łkiem) o wadze nawil żonego cia ła 
300–600 mg (metody uprawy, zob. dodatek).  
2. DANE  
2.1. OBRÓBKA I ANALIZA WYNIKÓW  
Stężenia testowej substancji odnotowywane s ą w odniesieniu do 
procentowej ilo ści martwych d żdżownic.  
Jeżeli dane s ą zadowalaj ące, należy ustalić wartość LC  50 oraz limity 
pewności (p = 0,05) wykorzystuj ąc standardowe metody (Litchfield 
i Wilcoxon, 1949, metoda równowa żna). LC  50 należy podać jako 
miligram substancji testowej na kilogram badanego substrata (sucha masa).
 
W przypadkach gdy nachylenie krzywej st ężenia jest zbyt strome 
aby umożliwić obliczenie LC  50 , wystarczaj ące jest graficzne oszaco ­
wanie tej warto ści. 
W przypadku gdy dwie kolejne wielko ści stężenia o wska źniku 
w wysoko ści 1,8 powoduj ą jedynie śmiertelno ść 0 % i 100 %, te 
dwie warto ści są wystarczaj ące do oznaczenia granicy, przy której 
obniża się LC  50 . 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— stwierdzenie, że badanie zosta ło przeprowadzone zgodnie 
z wyżej wymienionymi kryteriami jako ści, 
— przeprowadzone badanie (badanie zakresu wielko ści stężeń i/lub 
badanie ostateczne),  
— dokładny opis warunków badania lub stwierdzenie, że badanie 
zostało przeprowadzone zgodnie z metod ą; wszelkie odst ępstwa 
od procedury metody nale ży odnotowa ć, 
— dokładny opis procedury mieszania substancji testowej z podsta ­
wowym substratem testowym,  
— informacja o badanych organizmach (gatunki, wiek, średnia oraz 
rozpiętość wagi, warunki hodowli i utrzymywania, dostawca),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— metoda u żywana w celu ustalenia LC  50 , 
— wyniki badania łącznie ze wszelkimi wykorzystanymi danymi,  
— opis obserwowanych objawów i zmian w zachowaniu badanych 
organizmów,  
— śmiertelno ść w grupach kontrolnych.  
— LC  50 lub najwy ższa wielko ść stężenia testowego nie powoduj ąca 
śmiertelno ści oraz najni ższa wielko ść stężenia powoduj ąca 
100 %, śmiertelno ści na 14 dni (oraz fakultatywnie siedem dni) 
po rozpocz ęciu badania,  
— wykre ślanie krzywej/st ężenia w odniesieniu do powodowanej 
reakcji,  
— wyniki otrzymane po zastosowaniu substancji odniesienia, oraz 
czy zosta ły połączone z obecnym badaniem, czy na podstawie 
wcześniejszej kontroli jako ści. 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Pary ż, 1981,  Wytyczne Badania  201, ostateczna decyzja 
Rady C(81) 30.  
(2) Edwards, C. A. i Lofty, J. R., 1977,  Biologia D żdżownic,  
Chapman i Hall, Londyn, str. 331.  
(3) Bouche, M. B., 1972,  Lombriciens de France, Ecologie et 
Systétmatique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 
str. 671.  
(4) Litchfield, J. T. i Wilcoxon, F., Uproszczona metoda oceny 
badań skutków dawkowania.  J. Pharm. Exp. Therap.,  tom 96, 
1949, str. 99.  
(5) Komisja Wspólnot Europejskich,  Rozwój standardowej metody 
laboratoryjnej odno śnie oceny wp ływu toksyczno ści substancji 
chemicznych na d żdżownice , Sprawozdanie 8714 EUR EN, 
1983.  
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrensvorschlag „Toxizitat ­
stest am Regenwurm  Eisenia foetida  in kunstlichem Boden”, 
in: Rudolph/Boje,  Okotoxikologie,  ecomed, Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Dodatek  
Hodowla i utrzymywanie d żdżownic przed rozpocz ęciem badania  
W celu za łożenia hodowli zwierz ąt należy umieścić 30–50 doros łych dżdżownic 
w zbiorniku hodowlanym zawieraj ącym świeży substrat i usun ąć po okresie 14 
dni. Zwierz ęta te można wykorzysta ć do hodowli kolejnych grup. D żdżownice 
wylężone z kokonów wykorzystuje si ę do badania po osi ągnięciu dojrza łości 
(zgodnie z zalecanymi warunkami po okresie dwóch do trzech miesi ęcy). 
Warunki utrzymywania i hodowli  
Komora klimatyczna: temperatura 20 ± 2  o C najlepiej sta łym oświetleniem ze 
(natężenie 400–800 luksów).  
Zbiorniki hodowlane: odpowiednio p łytkie zbiorniki o pojemno ści 10–20 1.  
Substrat:  Eisenia foetida  może być hodowana w ró żnych ekskre ­
mentach zwierz ęcych. Zaleca si ę użycie mieszaniny 
o składzie 50 % torfu i 50 % krowiego lub ko ńskiego 
obornika jako po żywki hodowlanej. Po żywka powinna 
zawierać wartość pH w wysoko ści około 6–7 (regulo ­
wanej węglanem wapnia) oraz nisk ą przewodno ść elek­
tryczną (mniej ni ż 6 mmhos lub 0,5 % st ężenia soli).  
Substrat nale ży odpowiednio nawil żać, ale niezbyt obfi ­
cie. 
Oprócz wy żej wspomnianej metody, mo żna zastosowa ć 
inne odpowiednie procedury.  
Uwaga : Eisenia foetida  występuje w dwóch rasach, które niektórzy systematycy 
podzielili na dwa gatunki (Bouche, 1972). Gatunki te s ą podobne pod wzgl ędem 
morfologicznym, ale jeden,  Eisenia foetida foetida , posiada typowo poprzeczne 
paskowanie lub przedzia ły na segmentach, a drugi,  Eisenia foetida andrei , 
takiego paskowania nie posiada, b ędąc jednocze śnie różnobarwnego czerwona ­
wego koloru. Je żeli jest to mo żliwe, nale ży użyć Eisenia foetida andrei.  Można 
użyć inne gatunki, je żeli dostępna jest metodologia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIODEGRADACJA  
BADANIE ZAHN-WELLENS  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Celem metody jest ocena wp ływu całkowitej biodegradacji rozpusz ­
czalnych w wodzie, nielotnych substancji organicznych w przypadku ich ekspozycji na stosunkowo wysokie st ężenia drobnoustrojów 
w badaniu statycznym.
 
Może mieć miejsce fizyczna i chemiczna adsorpcja zawieszonych 
substancji sta łych, co nale ży wziąć pod uwag ę przy interpretacji 
wyników (zob. 3.2).  
Substancje przeznaczone do badania wykorzystuje si ę w stężeniach 
odpowiadaj ących warto ściom DOC w przedziale 50–400 mg/litr lub 
wartościom COD w przedziale 100–1 000 mg/litr (DOC = 
rozwiązany węgiel organiczny; COD = chemiczne zapotrzebowanie 
tlenu). Te wzgl ędnie wysokie st ężenia posiadaj ą zaletę wiarygod ­
ności analitycznej. Zwi ązki o właściwościach toksycznych mog ą 
opóźnić lub zahamowa ć proces degradacji.  
W niniejszej metodzie pomiar st ężenia rozwi ązanego w ęgla orga­
nicznego lub chemicznego zapotrzebowania tlenu wykorzystywany jest w celu okre ślenia całkowitej biodegradacji substancji testowej.
 
Równoczesne u życie szczególnej metody analitycznej mo że umoż­
liwić ocenę podstawowej biodegradacji substancji (zanik pierwotnej 
budowy chemicznej).  
Metodę stosuje si ę jedynie w odniesieniu do tych organicznych 
substancji testowych, które przy wielko ści stężenia używanego 
w badaniu:  
— są rozpuszczalne w wodzie w warunkach badania,  
— posiadaj ą nieznaczne ci śnienie pary w warunkach badania,  
— nie hamuj ą bakterii,  
— są absorbowane w badanym systemie jedynie do pewnego stop ­
nia, 
— nie są tracone w wyniku wytwarzania piany z roztworu testo ­
wego,  
Informacje dotycz ące względnych części składowych materia łu testo­
wego będą użyteczne przy interpretacji otrzymanych wyników, 
w szczególno ści w tych przypadkach, gdzie wyniki s ą słabe lub 
marginalne.  
Pożądane są informacje dotycz ące wpływu toksyczno ści substancji 
na drobnoustroje w celu dokonania interpretacji s łabych wyników 
oraz wyboru w łaściwych wielko ści stężeń. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Wielkość degradacji osi ągniętej na ko ńcu badania odnotowywana 
jest jako „Biodegradacja w badaniu Zahn-Wellens”:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100  
gdzie:  
DT = ( %) biodegradacji w czasie T,  
CA = warto ści DOC (lub COD) w mieszaninie testowej zmie ­
rzone trzy godziny po rozpocz ęciu badania (mg/l) (DOC = 
rozwiązany węgiel organiczny, COD = chemiczne zapo ­
trzebowanie tlenu),  
CT = warto ści DOC lub COD w mieszaninie testowej w chwili 
pobierania próbek (mg/l),  
CB = warto ść DOC lub COD próbki ślepej w chwili pobierania 
próbek (mg/l),  
CBA = warto ść DOC lub COD próbki ślepej, mierzona trzy 
godziny po rozpocz ęciu testu (mg/l).  
Stopień degradacji jest zaokr ąglany do najbli ższej pełnej warto ści 
procentowej.  
Procentow ą degradacj ę stwierdza si ę jako procent ubytku DOC (lub 
COD) z substancji testowej.  
Różnica między mierzon ą wartością po trzech godzinach i obliczon ą, 
lub najlepiej zmierzon ą wartością początkową, może dostarczy ć 
użytecznych informacji dotycz ących wydzielania substancji (zob. 
3.2, Interpretacja wyników).  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
W niektórych przypadkach, w przypadku badania nowych substancji 
użyteczne mog ą okazać się substancje odniesienia; jednak że nie 
można jeszcze zaleci ć szczególnych substancji odniesienia.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Aktywny szlam, po żywki mineralne i materia ł testowy jako jedyne 
źródło węgla w roztworach wodnych umieszczane s ą razem 
w jednym z czterolitrowych szklanych zbiorników wyposa żonych 
w mieszad ło i napowietrzacz. Mieszanina jest mieszana 
i napowietrzana przy temperaturze 20–25  o C przy rozproszonym 
oświetleniu lub w ciemnym pomieszczeniu przez okres 28 dni. 
Proces degradacji jest kontrolowany przez oznaczanie warto ści 
DOC (lub COD) w filtrowanym roztworze codziennie lub 
w innych w łaściwych, regularnych odst ępach czasu. Stosunek 
wydzielonego DOC (lub COD) po ka żdym przedziale czasu do 
wartości, trzy godziny po rozpocz ęciu, wyra żany jest jako procent 
biodegradacji i s łuży jako pomiar stopnia degradacji w danym czasie. 
Wynik nanoszony jest na wykres wzgl ędem czasu, w celu uzyskania 
krzywej biodegradacji.  
W przypadku u życia szczególnej metody analitycznej mo żna 
dokonać pomiaru zmian w st ężeniu pierwotnej moleku ły w wyniku 
biodegradacji (podstawowa biodegradacja).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Odtwarzalno ść niniejszego badania zosta ła pozytywnie potwierdzona 
w próbie pier ścieniowej.  
Czułość metody jest przewa żnie ustalana przez zmienno ść próbki 
ślepej i, w mniejszym stopniu, przez precyzyjne oznaczenie 
rozwiązanego w ęgla organicznego i poziomu badanego zwi ązku 
w roztworze.  
1.6. OPIS PROCEDURY BADAWCZEJ  
1.6.1.  Przygotowania  
1.6.1.1. O d c z y n n i k i  
Woda testowa: woda pitna o zawarto ści węgla organicznego 
< 5 mg/litr. Łączne stężenie jonów wapnia i magnezu nie mo że 
przekracza ć 2,7 mola/litr; w przeciwnym razie wymagane jest 
odpowiednie rozcie ńczenie wod ą dejonizowan ą lub destylowan ą. 
Kwas siarkowy, analityczny odczynnik (A.R.): 50 g/l 
Roztwór wodorotlenku sodu czysty analitycznie: 40 g/l Mineralna po żywka: rozpuszczona w jednym litrze 
dejonizowanej wody: 
chlorek amonowy, NH4Cl, czysty analitycznie: 38,5 g, 
fosforan monosodowy diwodny, NaH2PO4.2H2O, czysty 
analitycznie: 33,4 g, 
fosforan monopotasowy, KH2PO4, czysty analitycznie: 8,5 g, 
fosforan dipotasowy, K2HPO4, czysty analitycznie: 21,75 g.
 
Mieszanina s łuży zarówno jako po żywka, a tak że jako system bufo ­
rowy.  
1.6.1.2. U r z ą d z e n i a  
Szklane zbiorniki o pojemno ści czterμech litrów (np. zbiorniki cylin ­
dryczne).  
Mieszadło ze szklanym lub metalowym mieszakiem na odpowiednim 
trzonku (mieszak powinien obraca ć się około 5–10 cm ponad dnem 
zbiornika). W zamian mo żna użyć magnetycznego mieszaka 
o długości trzonka 7–10 cm.  
Szklana probówka o średnicy wewn ętrznej 2–4 mm w celu dopro ­
wadzenia powietrza. Otwór probówki powinien by ć umieszczony 
około 1 cm ponad dnem zbiornika.  
Wirówka (oko ło 3 550 g).  
Miernik pH.  
Miernik rozpuszczonego tlenu.  
Papierowe filtry.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Urządzenie do filtracji membrany.  
Filtry membranowe, wielko ść poru 0,45 μm. Filtry membranowe s ą 
odpowiednie w przypadku gdy potwierdzone jest, że nie przepusz ­
czają węgla, ani nie wch łaniają substancji w fazie filtracji.  
Sprzęt analityczny do okre ślania sk ładu węgla organicznego 
i chemicznego zapotrzebowania tlenu.  
1.6.1.3. P r z y g o t o w a n i e i n o k u l u m b a k t e r y j n e g o  
Aktywny szlam pochodz ący z biologicznej oczyszczalni ścieków jest 
oczyszczany przez (wielokrotnie) odwirowywanie lub klarowanie 
wodą testową (powyżej). 
Aktywny szlam musi by ć we właściwym stanie. Taki szlam uzyska ć 
można z właściwie pracuj ącej oczyszczalni ścieków. W celu uzys ­
kania różnorodnych gatunków lub szczepów bakterii mo żna zmie­
szać inokulat pochodz ący z różnych źródeł (np. różnych oczyszczalni 
ścieków, ekstraktów gleby, wód rzecznych itd.). Mieszanin ę należy 
oczyszcza ć w sposób opisany powy żej. 
W celu dokonania kontroli aktywnych szlamów, zob. „Kontrola 
funkcjonalna, poni żej”. 
1.6.1.4. P r z y g o t o w a n i e r o z t w o r ó w t e s t o w y c h  
Do zbiornika u żywanego w badaniu nale ży dodać 500 ml wody 
testowej, 2,5 ml/litr mineralnej po żywki i aktywny szlam w ilo ści 
odpowiadaj ącej 0,2–1,0 g/litr suchej masy w ostatecznej mieszaninie. 
Dodać wystarczaj ącą ilość roztworu podstawowego substancji prze ­
znaczonej do badania, tak aby st ężenie DOC w wysoko ści 
50–400 mg/litr da ło mieszanin ę końcową. Odpowiednie warto ści 
COD wynosz ą 100–1 000 mg/litr. Przygotowa ć wodę testową 
o ogólnej obj ętości jednego do czterech litrów. Wybór ca łkowitej 
ilości wody zale ży od liczby próbek, maj ących być pobrane do 
określenia DOC lub COD oraz ilo ści koniecznej do przeprowadzenia 
procedury analitycznej.  
Zazwyczaj ilo ść dwóch litrów uwa żana jest za wystarczaj ącą. 
Zakłada się co najmniej jeden kontrolny zbiornik próbki ślepej 
w celu przeprowadzania badania równoleg łego z ka żdą serią; taki 
zbiornik zawiera jedynie aktywowany szlam i mineraln ą pożywkę 
składającą się z wody testowej o takiej samej ilo ści całkowitej, jak 
w zbiornikach u żywanych do badania.  
1.6.2.  Przeprowadzenie badania  
Naczynia testowe s ą wytrząsane przy u życiu mieszade ł magnetycz ­
nych lub tradycyjnych ( śmigłowych) w warunkach rozproszonego 
oświetlenia b ądź w ciemno ści, w temperaturze 20–25  o C. Napowiet ­
rzanie jest dokonywane powietrzem pod ci śnieniem, czyszczonym za 
pomocą bawełnianego filtra oraz tryskawki, je żeli konieczne. Nie 
należy dopuścić do osiadania szlamu, a st ężenie tlenu nie mo że 
obniżyć się poniżej 2 mg/litr.  
Wartość pH należy kontrolowa ć w regularnych odst ępach czasu (np. 
codziennie) i dostosowa ć do poziomu pH 7–8 w razie konieczno ści. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
Straty spowodowane parowaniem s ą uzupełniane tuż przed ka żdora­
zowym pobieraniem próbek wod ą dejonizowan ą lub destylowan ą, 
w wymaganej ilo ści. Należy zaznaczy ć poziom p łynu na zbiorniku 
przed rozpocz ęciem badania. Nowe znaki nanosi si ę po każdora­
zowym pobieraniu próbek (bez napowietrzania i mieszania). 
Pierwsze próbki zawsze pobierane s ą na trzy godziny po rozpocz ęciu 
badania w celu wykrycia absorpcji materia łu testowego przez 
aktywny szlam.  
Eliminacja materia łu testowego nast ępuje po okre śleniu DOC lub 
COD dokonywanym raz dziennie lub w innych regularnych odst ę­
pach czasu. Próbki ze zbiornika testowego oraz z próbk ą ślepą filtro­
wane są przez dok ładnie oczyszczony filtr papierowy. Pierwsze 5 ml 
przefiltrowanej substancji testowej jest odrzucane. Szlamy trudne do 
przefiltrowania mog ą być wcześniej usuni ęte przez 10-minutowe 
odwirowywanie. Oznaczenia DOC i COD dokonuje si ę co najmniej 
dwukrotnie. Badanie przeprowadza si ę przez okres 28 dni.  
Uwaga:  Mętne próbki filtrowane s ą przez filtry membranowe. Filtry 
membranowe nie mog ą uwalniać ani wch łaniać żadnego materia łu 
organicznego.  
F u n k c j o n a l n a k o n t r o l a a k t y w n e g o s z l a m u  
Zbiornik zawieraj ący znaną substancj ę należy prowadzi ć równolegle 
z każdą badaną serią w celu kontroli funkcjonalnej wydajno ści 
aktywnego szlamu. W tym celu przydatny jest dietylenoglikol.  
P r z y s t o s o w a n i e  
Jeżeli analizy przeprowadzane s ą w stosunkowo krótkich odst ępach 
czasu (np. raz dziennie), przystosowanie mo żna łatwo rozpozna ć po 
krzywej degradacji (zob. wykres 2). Dlatego te ż niniejszego badania 
nie należy rozpoczyna ć bezpośrednio przed weekendem.  
W przypadku gdy dostosowanie wyst ąpi na końcu okresu badania, 
badanie mo żne zostać przedłużone do chwili zako ńczenia degradacji.  
Uwaga:  Jeżeli konieczna jest szersza wiedza w zakresie zachowania 
dostosowanego szlamu, ten sam aktywny szlam nale ży poddać dzia­ 
łaniu tego samego materia łu testowego zgodnie z nast ępującą proce­
durą: 
Należy wyłączyć mieszad ło oraz napowietrzacz i umo żliwić 
osadzenie si ę aktywowanego szlamu. Zebra ć supernatan, nala ć 
dwie litry wody testowej, miesza ć przez 15 minut i umo żliwić 
ponowne osadzenie si ę szlamu. Po ponownym zebraniu supernatanu 
należy użyć pozostały szlam w celu powtórzenia badania z tym 
samym materia łem testowym zgodnie z 1.6.1.4 i 1.6.2 powy żej. 
Można równie ż wyizolowa ć aktywny szlam przez odwirowanie 
zamiast osadzenia.  
Dostosowany szlam mo żna zmiesza ć ze świeżym szlamem w celu 
uzyskania st ężenia o zawarto ści 0,2–1 g suchej masy/litr.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
Ś r o d k i a n a l i t y c z n e  
Zazwyczaj próbki filtrowane s ą przez starannie umyty filtr papie ­
rowy (do mycia nale ży użyć wodę dejonizowan ą). 
Próbki, które wci ąż pozostaj ą mętne należy filtrowa ć przez filtry 
membranowe (0,45 μm). 
Stężenie DOC ustala si ę dwukrotnie na podstawie filtrowanej próbki 
(pierwsze 5 ml nale ży odrzuci ć) za pomoc ą przyrządu TOC. Je żeli 
nie można dokona ć analizy filtratu w tym samym dniu, nale ży prze­
chować go w ch łodziarce do nast ępnego dnia. Nie zaleca si ę dłuż­
szego okresu przechowywania.  
Stężenie DOC ustala si ę w filtratach próbki za pomoc ą analitycznego 
określenia COD na podstawie procedury ustalonej w poz. bibliogra ­
ficznej (2), poni żej. 
2. DANE I ANALIZA  
Stężenia DOC i/lub COD ustala si ę co najmniej dwukrotnie 
w próbkach zgodnie z 1.6.2, powy żej. Degradacja w czasie 
T obliczana jest zgodnie ze wzorem (z definicjami) podanym zgodnie z 1.2, powy żej.
 
Stopień degradacji zaokr ąglany jest do najbli ższej warto ści procen ­
towej. Stopie ń degradacji uzyskany po zako ńczeniu badania odnoto ­
wywany jest jako „Biodegradacja w te ście Zan-Wellens”.  
Uwaga:  W przypadku uzyskania ca łkowitej degradacji przed zako ń­
czeniem okresu badania oraz gdy taki wynik potwierdzony jest drug ą 
analizą przeprowadzon ą w dniu nast ępnym, wówczas badanie mo że 
zostać zakończone.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— początkowe stężenie substancji testowej,  
— wszelkie inne informacje oraz wyniki bada ń dotyczące substancji 
testowej, substancji odniesienia je żeli zostały użyte, i próbki 
ślepej,  
— stężenie po trzech godzinach,  
— krzywa biodegradacji wraz z opisem,  
— data i lokalizacja pobrania próbek badanych organizmów, status 
dostosowania, u żyte stężenie itd.,  
— naukowe powody jakichkolwiek zmian procedury badania.  
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Ubytek DOC (COD), stopniowo nast ępujący przez okres badania 
obejmujący dni lub tygodnie, wskazuje, i ż substancja testowa 
ulega biodegradacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Jednakże fizyko-chemiczna adsorpcja mo że w niektórych przypad ­
kach odegra ć istotną rolę, a sygnalizowane jest to w przypadku 
całkowitego lub cz ęściowego ubytku pocz ątkowego w ci ągu pierw­
szych trzech godzin, a ró żnica między grupą kontroln ą i badanymi 
supernatanami pozostaje na niespodziewanie niskim poziomie.  
Konieczne jest przeprowadzenie dalszych bada ń jeżeli istnieje 
potrzeba rozró żnienia mi ędzy biodegradacj ą (lub częściową biode­
gradacją) a adsorpcj ą. 
Można to osiągnąć na wiele sposobów, ale najbardziej przekonuj ące 
jest użycie supernatantu lub szlamu jako inokulum w te ście podsta ­
wowym (najlepiej te ście respirometrycznym).  
Substancje testowe powoduj ące wysoki, nieadsorpcyjny ubytek DOC 
(COD) w niniejszym badaniu nale ży uważać za substancje wp ły­
wające biodegradacyjnie. Cz ęściowy, nieadsorpcyjny ubytek ozna ­
cza, iż substancja chemiczna ulega biodegradacji co najmniej 
w pewnym stopniu. Niski lub zerowy poziom ubytku DOC (COD) może być spowodowany zahamowaniem aktywno ści drobnoustrojów 
przez substancj ę testową, co można równie ż wykryć przez rozpad 
lub utrat ę szlamu, daj ącego mętne supernatany. Badanie nale ży 
powtórzy ć, wykorzystuj ąc niskie st ężenie substancji testowej.
 
Użycie specyficznej dla danego zwi ązku metody analitycznej lub 
substancji testowej znakowanej izotopem w ęgla 14 C zwiększa 
czułość metody. W przypadku zwi ązków znakowanych  14 C, odzys­
kanie  14 CO 2 potwierdzi, że zaszła biodegradacja.  
W przypadku podawania wyników pocz ątkowej biodegradacji, je żeli 
możliwe, nale ży wyjaśnić zmianę w budowie chemicznej, która 
powoduje utrat ę reakcji macierzystej substancji testowej.  
Potwierdzenie metody analitycznej musi by ć dostarczone wraz 
z reakcją, która zasz ła w próbce ślepej.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD, Pary ż, 1981,  Wytyczne Badania  302 B, decyzja Rady 
C(81) 30 wersja ostateczna.  
(2) Załącznik V C.9 Degradacja: Chemiczne zapotrzebowanie tlenu, 
dyrektywa Komisji 84/449/EWG (Dz.U. L 251 z 19.9.1984, 
s. 1).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Dodatek  
PRZYKŁAD ANALIZY 
Związek organiczny: 4-kwas etoksybenzoesowy 
Teoretyczne st ężenie substancji testowej: 600 mg/l 
Teoretyczne DOC: 390 mg/l 
Inokulum Oczyszczalnia ścieków z 
Stężenie: 1 gram suchej masy/litr 
Poziom dostosowania: Niedostosowany Analiza: Ustalenie DOC 
Ilość próbki: 3 ml 
Substancja kontrolna: Dietylenoglikol Toksyczno ść związku chemicznego: Brak skutków toksyczno ści poniżej 1 000 mg/l 
Użyty test: Test probówkowy fermantacji
 
Czas Substancja kontrolna Substancja testowa 
Próba ślepa 
DOC (  1 ) 
mg/l DOC (  1 ) 
mg/l DOC netto 
mg/l Degradacja 
% DOC (  1 ) 
mg/l DOC netto 
mg/l Degradacja 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 godziny 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 
1 dzień 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 
2 dni 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dni 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 dni 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 dni 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 8 dni 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 9 dni 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dni 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Średnie warto ści potrójnych degradacji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Wykres 1  
Przykłady krzywych biodegradacji
  
Wykres 2  
Przykłady dostosowania szlamu
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  SYMULACYJNE BADANIE W WARUNKACH TLENOWYCH 
W OCZYSZCZALNIACH ŚCIEKÓW: C.10-A: ZESTAWY OSADU 
CZYNNEGO - C.10-B: BIOFILMY  
C.10-A: Zestawy osadu czynnego  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 303 (2001). W latach 50. XX 
w. zdano sobie spraw ę, że nowo wprowadzane środki powierzchniowo 
czynne powoduj ą nadmierne pienienie w oczyszczalniach ścieków i w 
rzekach. Nie by ły w pełni usuwane w drodze rozk ładu tlenowego i w 
niektórych przypadkach ogranicza ły usuwanie substancji organicznych. To 
spowodowa ło podjęcie wielu bada ń na temat tego, jak środki powierzch ­
niowo czynne mog łyby być usuwane ze ścieków i czy nowe substancje 
chemiczne wytwarzane w produkcji przemys łowej poddaj ą się oczyszczaniu. 
W tym celu wykorzystano zestawy modelowe odpowiadaj ące dwóm 
głównym typom tlenowego oczyszczania biologicznego ścieków (zestaw 
osadu czynnego i zestaw ze z łożem zraszanym). Niepraktycznym i bardzo 
kosztownym rozwi ązaniem by łaby dystrybucja ka żdej nowej substancji 
chemicznej i monitorowanie du żych oczyszczalni ścieków, nawet 
w kontek ście lokalnym.  
WSTĘPNE ROZWA ŻANIA  
Zestawy osadu czynnego  
2. Opisano modelowe zestawy osadu czynnego w zakresie wielko ści od 300 
ml do ok. 2 000 ml. Niektóre by ły bardzo podobne do instalacji normalnej 
wielkości i zawiera ły osadniki, z których osad przepompowywany by ł 
z powrotem do zbiornika napowietrzaj ącego, podczas gdy inne nie obejmo ­
wały osadników, np. Swisher (1). Rozmiar przyrz ądu jest efektem kompro ­
misu: z jednej strony musi on by ć wystarczaj ąco duży, by mo żliwe było 
przeprowadzenie z powodzeniem dzia łań mechanicznych oraz zapewnienie 
wystarczaj ącej objętości próbek bez wp ływu na ca łość procedur, z drugiej 
strony za ś nie może wymaga ć nadmiernej przestrzeni i ilo ści materia łów. 
3. Dwa przyrz ądy stosowane powszechnie i z powodzeniem to zestawy 
Husmanna (2) i zestawy naczy ń porowatych (3) (4), u żywane pocz ątkowo 
przy badaniu środków powierzchniowo czynnych; opisano je w niniejszej 
metodzie badawczej. Z powodzeniem u żywano równie ż innych przyrz ądów, 
np. Eckenfeldera (5). Z powodu do ść wysokiego kosztu i wysi łków związa­
nych ze stosowaniem tego badania symulacyjnego jednocze śnie poddano 
analizie prostsze i ta ńsze badania przesiewowe, zawarte obecnie w rozdziale 
C.4 A-F niniejszego za łącznika (6). Do świadczenia z wieloma środkami 
powierzchniowo czynnymi oraz innymi substancjami chemicznymi pokaza ły, 
że te, które przesz ły z powodzeniem badania przesiewowe (szybko biodegra ­
dowalne), ulega ły równie ż degradacji w badaniu symulacyjnym. Niektóre 
substancje, które nie przesz ły z powodzeniem bada ń przesiewowych, przesz ły 
badania naturalnej biodegradowalno ści (rozdzia ły C.12 (7) oraz C.19 (8) 
niniejszego za łącznika), jednak tylko niektóre z tej ostatniej grupy uleg ły 
degradacji w badaniu symulacyjnym, podczas gdy te substancje, które nie przeszły z powodzeniem badania naturalnej podatno ści na biodegradacj ę, 
nie uległy degradacji w badaniach symulacyjnych (9) (10) (11).
 
4. Badania przeprowadzane przy jednym uk ładzie warunków dzia łania są 
wystarczaj ące do niektórych celów; wyniki wyra ża się jako warto ść procen­
tową usunięcia badanej substancji chemicznej lub rozpuszczonego w ęgla 
organicznego (DOC). Opis takiego badania podany jest w niniejszej meto ­
dzie badawczej. Jednak że w przeciwie ństwie do wcze śniejszej wersji niniej ­
szego rozdzia łu, w której opisano tylko jeden typ przyrz ądu do oczyszczania 
ścieków syntetycznych w trybie po łączonym przy zastosowaniu wzgl ędnie ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1062
 
prostej metody degradacji osadu, w niniejszym tek ście przedstawiono szereg 
możliwości. Opisano alternatywy dla typu przyrz ądu, trybu dzia łania oraz 
usuwania ścieków i osadu po degradacji. Niniejszy tekst ściśle odpowiada 
tekstowi ISO 11733 (12), który zosta ł dokładnie przeanalizowany w trakcie 
przygotowa ń, choć metody nie poddano badaniu mi ędzylaboratoryjnemu.  
5. Dla innych celów konieczna jest dok ładniejsza znajomo ść stężenia badanej 
substancji chemicznej w odp ływie, a do tego potrzebny jest model bardziej 
ekstensywny. Przyk ładowo, wspó łczynnik degradacji osadu musi by ć 
dokładniej kontrolowany przez ca ły dzień oraz w ci ągu całego czasu 
badania i konieczne jest przeprowadzenie bada ń na zestawach przy szeregu 
różnych wspó łczynników degradacji. W przypadku najbardziej szczegó łowej 
metody badania nale ży również przeprowadzi ć w dwóch lub trzech ró żnych 
temperaturach: metoda taka zosta ła opisana przez Bircha (13) (14) 
i streszczona w dodatku 6. Jednak że obecna wiedza nie wystarcza do stwier ­
dzenia, który model kinetyczny ma zastosowanie do biodegradacji substancji 
chemicznych w oczyszczaniu ścieków i ogólnie w środowisku wodnym. 
Zastosowanie kinetyki Monoda, podane w dodatku 6 jako przyk ład, jest 
ograniczone do substancji chemicznych obecnych w ilo ści co najmniej 1 
mg/l, ale w opinii niektórych badaczy nawet to musi zosta ć uzasadnione. 
Badania przy st ężeniach bardziej dok ładnie odzwierciedlaj ących stężenia 
występujące w ściekach zosta ły wskazane w dodatku 7, ale takie badania, 
podobnie jak te zawarte w dodatku 6, przedstawione s ą w dodatkach, a nie 
jako osobne metody badawcze.  
Filtry  
6. Dużo mniej uwagi po święcono modelom z łoży zraszanych, by ć może 
dlatego, że są bardziej niewygodne i wi ększe niż instalacje z osadem czyn ­
nym. Gerike i in. stworzyli zestawy z łoży zraszanych i przeprowadzili na 
nich działania w trybie po łączonym (15). Filtry te by ły dość duże (wysoko ść 
2 m, pojemno ść 60 l) i do ka żdego z nich potrzeba by ło aż 2 l/h ścieków. 
Baumann i in. (16) stworzyli symulacj ę złoży zraszanych wk ładając paski 
z „wełny” poliestrowej do 1-metrowych rur (o średnicy wewn ętrznej 14 
mm) po wcze śniejszym zanurzeniu pasków przez 30 min. w st ężonym 
osadzie czynnym. Badana substancja chemiczna jako jedyne źródło C w 
roztworze soli mineralnych by ła przepuszczana przez pionow ą rurę, po 
czym oceniano biodegradacj ę w oparciu o pomiary DOC w odp ływie 
i CO  2 w powstaj ącym gazie.  
7. Biofiltry symulowano w inny sposób (15); na wewn ętrzne powierzchnie 
obracających się rur nachylonych pod niewielkim k ątem w stosunku do 
poziomu podawano ścieki (ok. 250 ml/h) zawieraj ące badan ą substancj ę 
chemiczn ą i pozbawione jej, a zgromadzony odp ływ analizowano pod 
kątem zawarto ści DOC lub w łaściwej badanej substancji chemicznej.  
ZASADA BADANIA  
8. Celem niniejszej metody jest okre ślenie eliminacji oraz pierwotnej lub osta ­
tecznej biodegradacji rozpuszczalnych w wodzie organicznych substancji chemicznych przez mikroorganizmy tlenowe w stale dzia łającym systemie 
badawczym symuluj ącym proces osadu czynnego. Ulegaj ąca łatwej biode ­
gradacji po żywka organiczna oraz badana organiczna substancja chemiczna 
są źródłami węgla i energii dla mikroorganizmów.
 
9. Dwa stale dzia łające zestawy badawcze (instalacje z osadem czynnym lub 
naczynia porowate) pracuj ą jednocze śnie w identycznych warunkach, które 
odpowiadaj ą celowi badania. Średni hydrauliczny czas retencji wynosi 
normalnie 6 h, a średni wiek osadu (czas retencji osadu) od 6 do 10 dni. 
Osad oczyszczany jest przy wykorzystaniu jednej z dwóch metod, badana 
substancja chemiczna jest normalnie dodawana w st ężeniu pomi ędzy 10 
mg/l rozpuszczonego w ęgla organicznego (DOC) a 20 mg/l DOC do wcieku 
(pożywki organicznej) tylko w jednym zestawie. Drugi zestaw wykorzysty ­
wany jest jako zestaw kontrolny do okre ślenia biodegradacji po żywki orga ­
nicznej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1063
 
10. W cz ęsto pobieranych próbkach odp ływów okre śla się poziom DOC – co 
jest lepszym rozwi ązaniem – lub poziom chemicznego zapotrzebowania na 
tlen (ChZT) oraz st ężenie badanej substancji chemicznej (o ile jest to 
konieczne) w odp ływie z zestawu pobieraj ącego badan ą substancj ę 
chemiczn ą przy wykorzystaniu analizy w łaściwej. Przyjmuje si ę, że różnice 
pomiędzy stężeniami DOC lub ChZT w zestawie badawczym i zestawie 
kontrolnym wynikaj ą z działania badanej substancji chemicznej lub jej orga ­
nicznych metabolitów. Ró żnicę tę porównuje si ę z powsta łym we wcieku 
wskutek dodania badanej substancji chemicznej st ężeniem DOC lub ChZT 
w celu okre ślenia eliminacji badanej substancji chemicznej.  
11. Biodegradacj ę można na ogó ł odróżnić od bioadsorpcji dzi ęki dokładnemu 
zbadaniu krzywej czasu eliminacji, a wynik mo żna zazwyczaj potwierdzi ć, 
stosując badanie szybkiej biodegradacji przy wykorzystaniu aklimatyzowa ­
nego inokulum z zestawu, do którego dodaje si ę badaną substancj ę 
chemiczn ą. 
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ  
12. Właściwości badanej substancji chemicznej zwi ązane z czysto ścią, rozpusz­
czalnością w wodzie, lotno ścią i adsorpcj ą powinny by ć znane, tak aby 
możliwa była prawidłowa interpretacja wyników. Na ogó ł nie jest mo żliwe 
badanie lotnych ani nierozpuszczalnych substancji chemicznych, chyba że 
podjęte zostan ą specjalne środki (zob. dodatek 5). Nale ży równie ż znać 
strukturę chemiczn ą, a przynajmniej wzór empiryczny, tak aby mo żna 
było obliczy ć wartości teoretyczne lub sprawdzi ć zmierzone warto ści para­
metrów, np. teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (TZT), rozpuszczony 
węgiel organiczny (DOC) oraz chemiczne zapotrzebowanie na tlen (ChZT).  
13. Informacje na temat toksyczno ści badanej substancji chemicznej dla mikro ­
organizmów (zob. dodatek 4) mog ą być bardzo u żyteczne przy wyborze 
odpowiednich st ężeń do badania i mog ą być niezbędne dla prawid łowej 
interpretacji niskich warto ści biodegradacji.  
POZIOMY PROGOWE  
14. W pierwotnym zastosowaniu niniejszego badania symulacyjnego (potwier ­
dzającego) w odniesieniu do pierwotnej biodegradacji środków powierzch ­
niowo czynnych konieczne jest usuni ęcie ponad 80 % danej substancji 
chemicznej, aby dany środek móg ł zostać wprowadzony do obrotu. Je śli 
poziom 80 % nie zostanie osi ągnięty, dane badanie symulacyjne (potwier ­
dzające) może zostać zastosowane, a środek powierzchniowo czynny mo że 
zostać wprowadzony do obrotu, tylko je śli ponad 90 % danej substancji 
chemicznej zostanie usuni ęte. W przypadku substancji chemicznych zasad ­
niczo nie mówi si ę o przejściu badania z powodzeniem/bez powodzenia, 
a uzyskana warto ść procentowa usuni ęcia może zostać wykorzystana 
w aproksymacji prawdopodobnego st ężenia w środowisku, stosowanej 
przy ocenach zagro żenia chemicznego stwarzanego przez substancje 
chemiczne. Wyniki uk ładają się zazwyczaj w schemat „wszystko albo 
nic”. W licznych badaniach czystych substancji chemicznych stwierdzono wartość procentow ą usunięcia DOC na poziomie > 90 % w ponad trzech 
czwartych, a > 80 % w ponad 90 % substancji, które wykazywa ły jakikol­
wiek znacz ący poziom biodegradowalno ści.
 
15. Stosunkowo niewiele substancji chemicznych (np. środków powierzchniowo 
czynnych) obecnych jest w ściekach w st ężeniach (ok. 10 mg C/l) wykorzy ­
stywanych w niniejszym badaniu. Niektóre substancje chemiczne mog ą 
w tych st ężeniach mie ć działanie hamuj ące, podczas gdy kinetyka usuwania 
innych mo że być utrudniona przy niskich st ężeniach. Bardziej dok ładnej 
oceny degradacji mo żna byłoby dokona ć przy wykorzystaniu zmodyfikowa ­
nych metod i realistycznie niskich st ężeń badanej substancji chemicznej, 
a zgromadzone dane mog łyby zosta ć wykorzystane do obliczenia sta łych 
kinetycznych. Jednak że niezbędne techniki eksperymentalne nie zosta ły 
jeszcze w pe łni zwalidowane, a modele kinetyczne opisuj ące reakcje biode ­
gradacji nie zosta ły jeszcze ustanowione (zob. dodatek 7).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1064
 
SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
16. Dla zapewnienia prawid łowego przeprowadzenia procedury eksperymentu 
warto od czasu do czasu, wraz z substancjami badanymi, testowa ć 
substancje chemiczne, których zachowanie jest znane. Substancje takie to 
na przykład kwas adypinowy, 2-fenylofenol, 1-naftol, kwas 2,2’-bifenylodi ­
karboksylowy, kwas 1-naftalenokarboksylowy itp. (9) (10) (11).  
ODTWARZALNO ŚĆ WYNIKÓW BADA Ń 
17. Istnieje du żo mniej sprawozda ń z badań symulacyjnych ni ż z badań szybkiej 
biodegradowalno ści. Odtwarzalno ść pomiędzy (równoczesnymi) powtórze ­
niami jest na wysokim poziomie (w zakresie 10–15 %) w przypadku 
substancji chemicznych zdegradowanych o 80 % lub wi ęcej, ale 
w przypadku s łabiej zdegradowanych substancji chemicznych wyst ępuje 
większe zró żnicowanie. Ponadto w przypadku niektórych substancji 
chemicznych o warto ści granicznej odnotowano bardzo zró żnicowane 
wyniki (np. 10 % i 90 %) przy ró żnych okazjach w ci ągu 9 tygodni dopusz ­
czonych w badaniu.  
18. W przypadku wyników otrzymanych przy wykorzystaniu obydwu rodzajów 
przyrządów różnice były nieznaczne, ale niektóre substancje chemiczne 
ulegały degradacji w wi ększym zakresie i bardziej dok ładnie w przypadku 
ścieków domowych ni ż ścieków syntetycznych OECD.  
OPIS METODY BADAWCZEJ  
Przyrząd 
Układ badawczy  
19. Układ badawczy dla jednej substancji chemicznej sk łada się z zestawu 
badawczego i zestawu kontrolnego; jednak w przypadku przeprowadzania 
tylko konkretnych analiz (biodegradacja pierwotna) konieczny jest tylko zestaw badawczy. Jeden zestaw kontrolny mo że być wykorzystywany 
przy kilku zestawach badawczych z tymi samymi lub ró żnymi badanymi 
substancjami chemicznymi. W przypadku po łączenia (dodatek 3) ka żdy 
zestaw badawczy musi mie ć własny zestaw kontrolny. Uk ładem badawczym 
może być instalacja z osadem czynnym, zestaw Husmanna (dodatek 1, 
rysunek 1) lub naczynie porowate (dodatek 1, rysunek 2). W obydwu przy ­
padkach konieczne s ą odpowiedniej wielko ści zbiorniki magazynuj ące na 
wcieki i odp ływy oraz pompy dozuj ące wciek i roztwór badanej substancji 
chemicznej, zmieszane lub osobno.
 
20. Każdy zestaw osadu czynnego sk łada się z naczynia napowietrzaj ącego 
o znanej pojemno ści ok. 3 l osadu czynnego oraz osadnika (osadnika wtór ­
nego) o pojemno ści ok. 1,5 l; pojemno ści te można w pewnym zakresie 
zmieniać koryguj ąc wysoko ść osadnika. Naczynia ró żnej wielko ści są 
dopuszczalne, je śli poddawane s ą porównywalnym obci ążeniom hydraulicz ­
nym. Jeśli nie jest mo żliwe utrzymanie temperatury w pomieszczeniu 
badawczym w planowanym zakresie, zaleca si ę zastosowanie naczy ń 
z płaszczem wodnym o kontrolowanej temperaturze wody. Do transportu 
osadu czynnego z osadnika do naczynia napowietrzaj ącego wykorzystuje si ę 
podnośnik powietrzny lub pomp ę dozującą działającą w systemie sta łym lub 
przerywanym w regularnych odst ępach czasu.  
21. System naczy ń porowatych sk łada się z wewnętrznego porowatego cylindra 
o stożkowym dnie umieszczonego w nieco wi ększym naczyniu o tym 
samym kszta łcie, ale wykonanym z nieprzepuszczalnego tworzywa sztucz ­
nego. Odpowiednim materia łem na naczynie porowate jest porowaty poli ­
etylen o maksymalnej średnicy porów 90 μm i grubo ści 2 mm. Oddzielenie 
osadu od po żywki organicznej nast ępuje wskutek ró żnicowego przep ływu 
przez porowate ściany. Odp ływy gromadz ą się w przestrzeni pier ścienia, 
z której przep ływają do naczynia magazynuj ącego. Nie nast ępuje sedymen ­
tacja, a wi ęc nie ma zwrotu osadu. Ca ły układ może być zamontowany 
w kontrolowanej termostatycznie k ąpieli wodnej. Na pocz ątkowych etapach 
naczynia porowate mog ą ulegać zablokowaniu i powodowa ć przelewanie.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1065
 
W takiej sytuacji nale ży wymieni ć zablokowan ą wkładkę na czyst ą, 
najpierw zlewaj ąc osad z naczynia do czystego kub ła i usuwaj ąc zabloko ­
waną wkładkę. Po wytarciu nieprzepuszczalnego cylindra zewn ętrznego 
należy umieścić w nim czyst ą wkładkę i ponownie wprowadzi ć osad do 
naczynia. Ca ły osad, który przylgn ął do bocznych cz ęści zablokowanej 
wkładki, równie ż należy ostrożnie zdjąć i przenie ść. Zablokowane naczynia 
należy wyczyścić najpierw za pomoc ą małej dyszy wodnej w celu usuni ęcia 
pozostałego osadu, nast ępnie poprzez zanurzenie kolejno w rozcie ńczonym 
roztworze podchlorynu sodu i w wodzie, a na koniec dok ładnie spłukać 
wodą. 
22. Do napowietrzenia osadu w naczyniach napowietrzaj ących obydwu uk ładów 
konieczne s ą odpowiednie techniki, na przyk ład zastosowanie spiekanych 
kostek (kamieni napowietrzaj ących) i spr ężonego powietrza. Powietrze 
oczyszcza si ę w razie potrzeby poprzez przepuszczenie przez odpowiedni 
filtr i płukanie. Przez uk ład musi przej ść wystarczaj ąca ilość powietrza, tak 
by możliwe było zachowanie warunków tlenowych i utrzymanie k łaczków 
osadu w zawieszeniu przez ca ły czas trwania badania.  
Przyrząd do filtrowania lub wirówka  
23. Urządzenie do filtrowania próbek z filtrami membranowymi o odpowiedniej 
porowato ści (nominalna średnica otworu 0,45 μm), które adsorbuj ą rozpusz­
czalne organiczne substancje chemiczne i uwalniaj ą węgiel organiczny 
w minimalnym stopniu. W przypadku stosowania filtrów uwalniaj ących 
węgiel organiczny nale ży zmyć filtry dok ładnie gor ącą wodą w celu 
usunięcia wymywalnego w ęgla organicznego. Alternatywnie mo żna zasto­
sować wirówkę mogącą osiągnąć 40 000 m/s  2 . 
Sprzęt do wykonywania analiz  
24. Przyrz ąd konieczny do oznaczenia:  
— DOC (rozpuszczonego w ęgla organicznego) i TOC (ca łkowitego w ęgla 
organicznego) lub ChZT (chemicznego zapotrzebowania na tlen),  
— konkretnej substancji chemicznej, o ile jest to konieczne,  
— zawiesin, pH, st ężenia tlenu w wodzie,  
— temperatury, kwasowo ści i zasadowo ści, 
— amonu, azotynu i azotanu, je śli badanie przeprowadzane jest 
w warunkach nitryfikacyjnych.  
Woda  
25. Woda wodoci ągowa, zawieraj ąca mniej ni ż 3 mg/l DOC. Nale ży określić 
zasadowo ść, jeśli nie jest jeszcze znana.  
26. Woda dejonizowana, zawieraj ąca mniej ni ż 2 mg/l DOC.  
Pożywka organiczna  
27. Jako po żywkę organiczn ą można stosowa ć ścieki syntetyczne, ścieki 
domowe lub mieszanin ę obydwu tych typów. Wykazano (11) (14), że zasto­
sowanie wy łącznie ścieków domowych cz ęsto skutkuje zwi ększoną 
wartością procentow ą usunięcia DOC, a nawet umo żliwia usuni ęcie 
i biodegradacj ę niektórych substancji chemicznych, które nie ulegaj ą biode­
gradacji w przypadku zastosowania syntetycznych ścieków OECD. Ponadto 
stałe lub przerywane dodawanie ścieków domowych cz ęsto stabilizuje osad 
czynny, w tym jego kluczowy potencja ł – dobre osadzanie. Dlatego te ż 
zaleca się stosowanie ścieków domowych. Nale ży zmierzy ć stężenie DOC 
lub ChZT w ka żdej nowej partii po żywki organicznej. Kwasowo ść lub 
zasadowo ść pożywki organicznej powinna by ć znana. Po żywka organiczna 
może wymaga ć dodania odpowiedniego bufora (wodorow ęglanu sodu lub 
diwodorofosforanu potasu), je żeli jej poziom kwasowo ści lub zasadowo ści 
jest niski, w celu utrzymania pH w naczyniu napowietrzaj ącym w trakcie 
badania na poziomie ok. 7,5 ± 0,5. Ilo ść dodawanego bufora oraz moment 
jego dodania nale ży określić indywidualnie w ka żdym przypadku. Je śli 
mieszaniny dodawane s ą w sposób sta ły lub przerywany, poziom DOC 
(lub ChZT) mieszaniny musi by ć utrzymywany na mniej wi ęcej tym 
samym poziomie, np. poprzez rozcie ńczanie wod ą. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1066
 
Ścieki syntetyczne  
28. Rozpu ścić w każdym litrze wody wodoci ągowej: pepton, 160 mg; ekstrakt 
mięsa, 110 mg; mocznik, 30 mg; bezwodny wodorofosforan potasu 
(K 2 HPO  4 ), 28 mg; chlorek sodu (NaCl), 7 mg; dwuwodny chlorek wapnia 
(CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; siedmiowodny siarczan magnezu (Mg  2 SO 4 .7H  2 0), 2 
mg. Ten ściek syntetyczny OECD jest mieszanin ą przykładową i daje 
średnie stężenie DOC we wcieku na poziomie ok. 100 mg/l. Alternatywnie 
można wykorzysta ć inne składy o zbli żonym stężeniu DOC, które bardziej 
odpowiadaj ą prawdziwym ściekom. Je śli wymagany jest mniej st ężony 
wciek, nale ży przy wykorzystaniu wody wodoci ągowej rozcie ńczyć ściek 
syntetyczny, na przyk ład w stosunku 1:1, tak aby uzyska ć stężenie ok. 50 
mg/l. Taki s łabszy wciek umo żliwi lepszy wzrost organizmów nitryfikuj ­ 
ących i modyfikacj ę tę należy stosowa ć w przypadku badania symulacji 
oczyszczalni ścieków wykorzystuj ących nitryfikacj ę. Taki ściek syntetyczny 
można przygotowa ć w wodzie destylowanej w postaci skoncentrowanej 
i przechowywa ć w temperaturze ok. 1 °C przez maksymalnie jeden tydzie ń. 
W razie potrzeby nale ży go rozcie ńczyć wodą wodociągową. (Ta pożywka 
nie jest satysfakcjonuj ąca, np. st ężenie azotu jest bardzo wysokie, 
a zawarto ść węgla dość niska, ale nie mo żna zaproponowa ć niczego 
lepszego poza ewentualnym dodaniem wi ększej ilości fosforanu jako bufora 
i dodatkowego peptonu).  
Ścieki domowe  
29. Wykorzysta ć świeżo osadzone ścieki zbierane codziennie z oczyszczalni 
ścieków przyjmuj ącej głównie ścieki domowe. Ścieki powinny by ć zbierane 
przed wst ępną sedymentacj ą z przelewu osadnika wst ępnego lub z materia łu 
doprowadzanego do instalacji osadu czynnego i zasadniczo nie powinny zawierać cząstek gruboziarnistych. Ścieki można stosowa ć po przechowy ­
waniu ich przez kilka dni (ale zasadniczo nie d łużej niż siedem dni) 
w temperaturze ok. 4 °C, po sprawdzeniu, czy DOC (lub ChZT) nie zmniej ­
szył się znacząco (tzn. o mniej ni ż 20 %) w trakcie przechowywania. Aby 
zmniejszy ć zakłócenia w uk ładzie, przed zastosowaniem nale ży skorygowa ć 
DOC (lub ChZT) ka żdej nowej partii do odpowiedniej sta łej wartości, np. 
poprzez rozcie ńczenie wod ą wodociągową.
 
Osad czynny  
30. Pobra ć osad czynny do inokulacji ze zbiornika napowietrzaj ącego dobrze 
funkcjonuj ącej oczyszczalni ścieków lub z zestawu osadu czynnego o skali 
laboratoryjnej s łużącego do oczyszczania g łównie ścieków domowych.  
Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej  
31. W przypadku substancji chemicznych o odpowiedniej rozpuszczalno ści 
przygotowa ć roztwory podstawowe o w łaściwych st ężeniach (np. 1 do 5 
g/l) w wodzie dejonizowanej lub w cz ęści mineralnej ścieków syntetycz ­
nych. (W przypadku nierozpuszczalnych i lotnych substancji chemicznych 
zob. dodatek 5). Okre ślić DOC i ca łkowity w ęgiel organiczny (TOC) 
roztworu podstawowego i powtórzy ć pomiary przy ka żdej nowej partii. 
Jeśli różnica pomi ędzy DOC a TOC jest wi ększa niż 20 %, sprawdzi ć 
rozpuszczalno ść badanej substancji chemicznej w wodzie. Porówna ć DOC 
lub stężenie badanej substancji chemicznej mierzone za pomoc ą specy­
ficznej analizy roztworu podstawowego o warto ści nominalnej w celu 
stwierdzenia, czy odzyskiwanie jest wystarczaj ące (zazwyczaj mo żna 
spodziewa ć się wartości > 90 %). Sprawdzi ć, w szczególno ści 
w przypadku dyspersji, czy mo żna wykorzysta ć DOC jako parametr anali ­
tyczny, czy te ż możliwe jest zastosowanie wy łącznie techniki analitycznej 
specyficznej dla badanej substancji chemicznej. W przypadku dyspersji konieczne jest odwirowanie próbek. W ka żdej nowej partii zmierzy ć 
DOC, ChZT lub poziom badanej substancji chemicznej za pomoc ą specy­
ficznej metody analitycznej.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1067
 
32. Okre ślić pH roztworu podstawowego. Warto ści krańcowe wskazuj ą, że 
dodanie substancji chemicznej mo że mieć wpływ na pH osadu czynnego 
w układzie badawczym. W takim przypadku w celu uzyskania pH 
o wartości 7 ± 0,5 nale ży zneutralizowa ć roztwór podstawowy dodaj ąc 
niewielkie ilo ści nieorganicznego kwasu lub zasady, ale unikaj ąc strącania 
badanej substancji chemicznej.  
PROCEDURA  
33. Opisano procedur ę dla zestawów osadu czynnego; nale ży ją nieco dosto ­
sować na potrzeby uk ładu naczy ń porowatych.  
Przygotowanie inokulum  
34. Inokulowa ć układ badawczy na pocz ątku badania albo osadem czynnym, 
albo inokulum zawieraj ącym małe stężenie mikroorganizmów. Przecho ­
wywać napowietrzone inokulum w temperaturze pokojowej do momentu 
wykorzystania; zu żyć w ciągu 24 h. W pierwszym przypadku pobra ć próbkę 
osadu czynnego z naczynia napowietrzaj ącego dobrze dzia łającej biolo ­
gicznej oczyszczalni ścieków lub z zestawu osadu czynnego o skali labora ­
toryjnej przyjmuj ącego głównie ścieki domowe. Je śli konieczna jest symu ­
lacja warunków nitryfikacyjnych, pobra ć osad z oczyszczalni ścieków 
wykorzystuj ącej nitryfikacj ę. Określić stężenie zawiesin i – w razie potrzeby 
– skoncentrowa ć osad poprzez sedymentacj ę w taki sposób, by zminimali ­
zować ilość dodawan ą do układu badawczego. Zapewni ć początkowe 
stężenie suchej masy na poziomie ok. 2,5 g/l.  
35. W drugim przypadku u żyć między 2 ml/l a 10 ml/l odp ływu z przydomowej 
biologicznej oczyszczalni ścieków jako inokulum. Dla uzyskania jak najbar ­
dziej zróżnicowanych gatunków bakterii mo żna dodać inokula z ró żnych 
innych źródeł, na przyk ład wody powierzchniowej. W takim przypadku 
osad czynny w uk ładzie badawczym rozwinie si ę i urośnie. 
Dawkowanie po żywki organicznej  
36. Sprawdzi ć, czy pojemniki na wciek i odp ływ oraz rurki z naczy ń na wciek 
i do naczy ń na odpływ są całkowicie czyste, aby uniemo żliwić wzrost 
mikroorganizmów na pocz ątku i w trakcie trwania badania. Z łożyć układy 
badawcze w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (zazwyczaj 
w zakresie 20–25 °C) lub wykorzysta ć zestawy w p łaszczu wodnym. Przy ­
gotować odpowiedni ą ilość koniecznej po żywki organicznej (pkt 27–29). 
Wstępnie nape łnić naczynie napowietrzaj ące i osadnik po żywką organiczn ą 
i dodać inokulum (pkt 34, 35). Rozpocz ąć napowietrzanie w taki sposób, by 
osad był utrzymywany w zawieszeniu i w stanie tlenowym, rozpocz ąć 
dozowanie wcieku i recykling osadzonego osadu. Dawkowa ć pożywkę orga­
niczną ze zbiorników magazynuj ących do zbiorników napowietrzaj ących 
(pkt 20, 21) zestawów badawczych i kontrolnych i zebra ć odpływy 
w podobnych zbiornikach magazynuj ących. W celu uzyskania normalnego 
6-godzinnego hydraulicznego czasu retencji po żywkę organiczn ą pompuje 
się w tempie 0,5 l/h. W celu potwierdzenia tego tempa mierzy ć dzienną 
ilość dozowanej po żywki organicznej, odnotowuj ąc zmniejszenie ilo ści 
pożywki w zbiornikach magazynuj ących. Inne tryby dozowania konieczne 
są do okre ślenia skutków przerywanego uwalniania i „uderzeniowego” 
podawania substancji chemicznych.  
37. Jeśli pożywka organiczna przygotowywana jest do u żytku przez okres 
dłuższy niż 1 dzień, konieczne jest sch ładzanie w temperaturze ok. 4 °C 
lub stosowanie innych odpowiednich metod konserwacji w celu zapobie ­ 
żenia wzrostowi mikroorganizmów i biodegradacji poza zestawami badaw ­
czymi (pkt 29). W przypadku stosowania ścieków syntetycznych mo żna 
przygotowa ć i przechowywa ć w temperaturze ok. 4 °C st ężony roztwór 
podstawowy (np. 10-krotno ść normalnego st ężenia, pkt 28). Taki roztwór 
podstawowy mo żna zmiesza ć przed użyciem z odpowiedni ą ilością wody 
wodociągowej; alternatywnie, mo żna go wpompowa ć bezpośrednio przy 
jednoczesnym osobnym podawaniu wody wodoci ągowej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Dawkowanie badanej substancji chemicznej  
38. Doda ć odpowiedni ą ilość roztworu podstawowego badanej substancji 
chemicznej (pkt 31) do naczynia magazynuj ącego z wciekiem lub 
dawkowa ć bezpośrednio oddzieln ą pompą do naczynia napowietrzaj ącego. 
Normalne średnie stężenie badawcze wcieku powinno wynosi ć pomiędzy 10 
mg/l a 20 mg/l DOC, przy czym górna warto ść nie może przekracza ć 50 
mg/l. Jeśli rozpuszczalno ść badanej substancji chemicznej w wodzie jest 
niska lub prawdopodobne jest wyst ąpienie efektów toksycznych, zmniejszy ć 
stężenie do 5 mg/l DOC lub nawet mniejszej warto ści, ale tylko je śli 
dostępna i wykorzystywana jest odpowiednia szczególna metoda analityczna 
(zdyspergowane badane substancje chemiczne, które s ą słabo rozpuszczalne 
w wodzie, mog ą być dodawane przy u życiu specjalnych technik dawkowa ­
nia, zob. dodatek 5).  
39. Rozpocz ąć dodawanie badanej substancji chemicznej po okresie, w którym 
system ustabilizowa ł się i wydajnie usuwa DOC z po żywki organicznej (ok. 
80 %). Przed dodaniem badanej substancji chemicznej wa żne jest spraw ­
dzanie, czy wszystkie zestawy dzia łają tak samo wydajnie; je śli nie, 
skutecznym rozwi ązaniem jest zazwyczaj zmieszanie poszczególnych porcji 
osadu i ponowne podanie równych ilo ści do poszczególnych zestawów. Je śli 
wykorzystywane jest inokulum z (oko ło) 2,5 g/l (suchej masy) osadu czyn ­
nego, badana substancja chemiczna mo że być dodawana od pocz ątku bada­
nia, poniewa ż bezpośrednie dodawanie wzrastaj ących ilości od samego 
początku przynosi korzy ść w postaci lepszego dostosowywania si ę osadu 
czynnego do badanej substancji chemicznej. Bez wzgl ędu na sposób doda ­
wania badanej substancji chemicznej zaleca si ę, by odpowiednie nat ężenie 
przepływu lub ilo ści w naczyniach magazynuj ących by ły mierzone 
w regularnych odst ępach czasu.  
Postępowanie z osadem czynnym  
40. Stężenie stałego osadu czynnego stabilizuje si ę zazwyczaj pomi ędzy 
wartościami granicznymi w trakcie badania, niezale żnie od zastosowanego 
inokulum, w zakresie pomi ędzy 1 a 3 g/l (suchej masy), w zale żności od 
jakości i stężenia pożywki organicznej, warunków dzia łania, charakteru 
obecnych mikroorganizmów i wp ływu badanej substancji chemicznej.  
41. Mierzy ć zawiesiny w naczyniach napowietrzaj ących co najmniej raz 
w tygodniu i usuwa ć nadwyżkę osadu w celu utrzymania st ężenia na 
poziomie pomi ędzy 1 g/l a 3 g/l (suchej masy) lub kontrolowa ć średni 
wiek osadu utrzymuj ąc go na sta łym poziomie, zazwyczaj w zakresie 
pomiędzy 6 a 10 dni. Je śli wybierze si ę na przyk ład 8-dniowy czas retencji 
osadu, codziennie nale ży usuwać 1/8 objętości osadu czynnego ze zbiornika 
napowietrzaj ącego i odrzuca ć go. Dzia łania te nale ży przeprowadza ć 
codziennie, lub – w miar ę możliwości – przy wykorzystaniu automatycznej 
pompy dzia łającej w sposób przerywany. Utrzymanie st ężenia zawiesiny na 
stałym poziomie lub pomi ędzy bliskimi warto ściami granicznymi nie 
pozwala na zachowanie sta łego czasu retencji osadu, który jest zmienn ą 
operacyjn ą określającą wartość stężenia badanej substancji chemicznej 
w odpływie.  
42. W trakcie trwania badania usuwa ć co najmniej raz dziennie ca ły osad przy ­
legający do ścian naczynia napowietrzaj ącego i osadnika, tak by osad pozos ­
tawał w stanie zawieszonym. Regularnie kontrolowa ć i oczyszcza ć 
wszystkie rurki w celu zapobie żenia wzrostowi biofilmu. Przenosi ć poddany 
sedymentacji osad z osadnika z powrotem do naczynia napowietrzaj ącego, 
najlepiej przy wykorzystaniu pompy pracuj ącej w sposób przerywany. 
W układzie naczy ń porowatych nie zachodzi recykling, ale nale ży zadbać, 
by włożyć czyste naczynia, zanim poziom w naczyniu znacz ąco wzrośnie 
(pkt 21).  
43. W zestawach Husmanna mo że występować słaba sedymentacja i degradacja 
osadu. Sytuacji tej mo żna zaradzi ć poprzez zastosowanie co najmniej 
jednego z poni żej wymienionych dzia łań, jednocze śnie w zestawach badaw ­
czych i kontrolnych:  
— można dodawa ć w regularnych odst ępach, np. co tydzie ń, świeży osad 
lub flokulant (np. 50 g/l FeCl  3 w ilości 2 ml/naczynie), lecz nale ży 
zadbać, by nie nast ąpiła żadna reakcja czy te ż wytrącanie osadu 
w wyniku reakcji pomi ędzy badan ą substancj ą chemiczn ą a FeCl  3 , ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— podno śnik powietrzny mo żna zastąpić pompą perystaltyczn ą, co umo ż­
liwia przep ływ recyrkulacyjny osadu mniej wi ęcej równowa żny przepły­
wowi wcieku i pozwala na rozwini ęcie strefy beztlenowej w osadzie 
poddanym sedymentacji (geometria podno śnika powietrznego ogranicza 
minimalne nat ężenie przep ływu zwróconego osadu do ok. 12-krotno ści 
natężenia przep ływu wcieku),  
— można pompowa ć osad w sposób przerywany z osadnika do 
naczynia napowietrzaj ącego (np. 5 min. co 2,5 h) w celu zwrotu 1 
l/h do 1,5 l/h,  
— można wykorzysta ć nietoksyczn ą substancj ę przeciwpianotwórcz ą 
w minimalnym st ężeniu w celu zapobie żenia stracie wskutek 
pienienia (np. olej silikonowy),  
— można przepu ścić powietrze przez osad w osadniku w krótkich 
uderzeniowych porcjach (np. przez 10 sek., co godzin ę), 
— można w regularnych odst ępach podawa ć pożywkę organiczn ą do 
naczynia napowietrzaj ącego (np. przez 3–10 min co godzin ę). 
Pobieranie próbek i analiza  
44. Mierzy ć w regularnych odst ępach stężenie rozpuszczonego tlenu, tempera ­
turę i pH osadu czynnego w naczyniach napowietrzaj ących. Zapewni ć stałą 
dostępność wystarczaj ącej ilości tlenu (> 2 mg/l) i temperatur ę 
w odpowiednim zakresie (normalnie od 20 °C do 25 °C). Utrzyma ć pH 
na poziomie 7,5 ± 0,5, dawkuj ąc niewielkie ilo ści nieorganicznej zasady 
lub kwasu do naczynia napowietrzaj ącego lub do wcieku, lub zwi ększając 
pojemność buforow ą pożywki organicznej (zob. pkt 27). Je śli zachodzi 
nitryfikacja, wytwarzany jest kwas, utlenienie 1 mg N powoduje wytwo ­
rzenie odpowiednika ok. 7 mg CO  3 –. Częstotliwość pomiarów zale ży od 
mierzonych parametrów oraz stabilno ści systemu i mo żliwe jest wyst ępo­
wanie różnic pomiędzy pomiarami dziennymi i tygodniowymi.  
45. Zmierzy ć DOC lub ChZT we wciekach do naczy ń kontrolnych 
i badawczych. Zmierzy ć stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku 
w zestawie badawczym przy wykorzystaniu analizy w łaściwej lub osza ­
cować je ze stężenia w roztworze podstawowym (pkt 31), wykorzystanej 
pojemności i ilości ścieków dawkowanych do zestawu badawczego. Zaleca 
się obliczenie st ężenia badanej substancji chemicznej w celu zmniejszenia 
zmienności danych dotycz ących stężenia.  
46. Pobra ć odpowiednie próbki z zebranego odp ływu (np. 24-godzinna próbka 
zbiorcza) i przefiltrowa ć je przez membran ę o wielko ści porów 0,45 μm lub 
odwirowa ć je przy ok. 40 000 m/s  2 przez ok. 15 min. Je śli filtrowanie 
sprawia trudno ści, należy zastosowa ć wirowanie. Okre ślić DOC lub ChZT 
co najmniej dwukrotnie w celu zmierzenia ostatecznej biodegradacji i, o ile 
to konieczne, pierwotnej biodegradacji, w drodze analizy specyficznej dla 
badanej substancji chemicznej.  
47. Zastosowanie ChZT mo że spowodowa ć powstanie trudno ści analitycznych 
przy niskich st ężeniach i dlatego zalecane jest wy łącznie, jeśli wykorzystuje 
się odpowiednio wysokie st ężenie badawcze (ok. 30 mg/l). Ponadto 
w przypadku mocno adsorbuj ących substancji chemicznych zaleca si ę, by 
ilość adsorbowanej substancji chemicznej w osadzie by ła mierzona przy 
wykorzystaniu techniki analitycznej specyficznej dla badanej substancji chemicznej.
 
48. Częstotliwość pobierania próbek zale ży od oczekiwanej d ługości trwania 
badania. Zalecana jest cz ęstotliwość trzy razy w tygodniu. Je śli zestawy 
działają wydajnie, nale ży przeznaczy ć okres od 1 do maksymalnie 6 tygodni 
po wprowadzeniu badanej substancji chemicznej na osi ągnięcie stanu usta ­
lonego. W celu oceny wyniku badania uzyska ć co najmniej 15 wa żnych 
wartości w fazie plateau (pkt 59) trwaj ącej normalnie 3 tygodnie. Badanie 
można zakończyć po osiągnięciu odpowiedniego stopnia eliminacji (np. > 
90 %) i uzyskaniu tych 15 warto ści odpowiadaj ących analizom przeprowa ­
dzonym w ka żdym dniu roboczym przez 3 tygodnie. Normalnie okres 
trwania badania nie powinien przekracza ć 12 tygodni po dodaniu badanej 
substancji chemicznej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Jeśli osad ulegnie nitryfikacji oraz je śli zbadany ma by ć wpływ badanej 
substancji chemicznej na nitryfikacj ę, przeanalizowa ć co najmniej raz 
w tygodniu próbki z odp ływu zestawów badawczych i kontrolnych pod 
kątem soli amonowych lub azotynów i azotanów.  
50. Wszystkie analizy, szczególnie okre ślenie poziomu azotu, nale ży przepro ­
wadzać tak szybko, jak to tylko mo żliwe. Jeśli analizy musz ą być przesu­
nięte w czasie, próbki nale ży przechowywa ć w temperaturze ok. 4 °C 
w ciemno ści, w pełnych i szczelnie zamkni ętych butelkach. Je śli próbki 
muszą być przechowywane przez ponad 48 h, zabezpieczy ć je poprzez 
zamrożenie, zakwaszenie (np. stosuj ąc 10 ml/l roztworu kwasu siarkowego 
o stężeniu 400 g/l) lub dodanie odpowiedniej substancji toksycznej (np. 20 
ml/l roztworu chlorku rt ęci(II) o st ężeniu 10 g/l). Zadba ć, by technika 
zabezpieczenia nie mia ła wpływu na wyniki analizy.  
Łączenie zestawów badawczych  
51. Jeśli stosowane jest łączenie (dodatek 3), wymienia ć codziennie t ę samą 
ilość osadu czynnego (150 ml do 1 500 ml w przypadku naczy ń napowiet ­
rzających zawieraj ących 3 litry p łynu) pomi ędzy naczyniami napowietrzaj ­ 
ącymi zestawu badawczego i jego zestawu kontrolnego. Je śli badana 
substancja chemiczna adsorbuje silnie do osadu, wymieni ć tylko supernatant 
osadników. W obydwu przypadkach zastosowa ć współczynnik koryguj ący 
do obliczenia wyników badania (pkt 55).  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Obróbka wyników  
52. Obliczy ć wartość procentow ą eliminacji DOC lub ChZT badanej substancji 
chemicznej w odniesieniu do ka żdej oceny w czasie, wykorzystuj ąc równa­
nie: 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
gdzie:  
D t = % eliminacji DOC lub ChZT w czasie t,  
C s = DOC lub ChZT we wcieku w wyniku dzia łania badanej substancji 
chemicznej, najlepiej oszacowane z roztworu podstawowego (mg/l),  
E = mierzona warto ść DOC lub ChZT w badanym odp ływie w czasie 
t (mg/l),  
E o = mierzona warto ść DOC lub ChZT w kontrolnym odp ływie w czasie 
t (mg/l).  
53. Stopie ń eliminacji DOC lub ChZT w po żywce organicznej w zestawie 
kontrolnym to informacja przydatna przy ocenianiu aktywno ści biodegrada ­
cyjnej osadu czynnego w trakcie badania. Obliczy ć wartość procentow ą 
eliminacji z równania:  
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
gdzie:  
D B = % eliminacji DOC lub ChZT po żywki organicznej w zestawie 
kontrolnym w czasie t,  
C M = DOC lub ChZT po żywki organicznej we wcieku kontrolnym (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Opcjonalnie mo żna obliczy ć wartość procentow ą eliminacji DOC lub ChZT 
wskutek dodania po żywki organicznej oraz badanej substancji chemicznej 
w zestawie badawczym z równania:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
gdzie:  
D T = % eliminacji DOC lub ChZT ca łości wcieku badawczego,  
C T = DOC lub ChZT ca łości wcieku badawczego lub warto ść obliczona 
z roztworów podstawowych (mg/l).  
54. Obliczy ć usunięcie badanej substancji chemicznej, je śli pomiaru dokony ­
wano przy wykorzystaniu swoistej metody analitycznej przy ka żdym 
pomiarze w czasie, z równania:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
gdzie:  
D ST = % pierwotnej eliminacji badanej substancji chemicznej w czasie t,  
S i = mierzone lub szacowane st ężenie badanej substancji chemicznej 
w badanym wcieku (mg/l),  
S e = mierzone st ężenie badanej substancji chemicznej w badanym wcieku 
w czasie t (mg/l).  
55. Jeśli wykorzystano tryb po łączenia, wyrówna ć rozcieńczenie badanej 
substancji chemicznej w naczyniu napowietrzaj ącym przez wymian ę osadu 
z zastosowaniem wspó łczynnika koryguj ącego (zob. dodatek 3). Je śli zasto­
sowano średni hydrauliczny czas retencji trwaj ący 6 h i wymian ę połowy 
objętości osadu czynnego w naczyniu napowietrzaj ącym, stwierdzone 
dzienne warto ści eliminacji (D  t , pkt 52) musz ą zostać skorygowane 
w celu otrzymania prawdziwego stopnia eliminacji – D  tc – badanej 
substancji chemicznej z równania:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Prezentacja wyników badania  
56. Przedstawi ć w postaci wykresu warto ść procentow ą eliminacji D  t (lub D  tc ) 
oraz D  st , jeśli jest dost ępna, w stosunku do czasu (zob. dodatek 2). 
Z kształtu krzywej eliminacji badanej substancji chemicznej ( per se  lub 
jako DOC) mo żna wyciągnąć pewne wnioski co do procesu usuwania.  
Adsorpcja  
57. Jeśli od pocz ątku badania obserwuje si ę wysoką eliminacj ę DOC, badana 
substancja chemiczna jest prawdopodobnie eliminowana w drodze adsorpcji 
do stałego osadu czynnego. Mo żna to udowodni ć poprzez okre ślenie adsor ­
bowanej badanej substancji chemicznej w drodze analizy w łaściwej. Wysoki 
poziom eliminacji DOC adsorbowalnych substancji chemicznych podczas 
całego badania nie jest typowy; zazwyczaj na pocz ątku usuwanie zachodzi 
w dużym stopniu, który nast ępnie spada do równomiernego poziomu. 
Jednak je śli adsorbowalna substancja chemiczna spowodowa ła jakiś rodzaj 
przystosowania populacji bakterii, poziom eliminacji DOC badanej 
substancji chemicznej ulega łby stopniowemu wzrostowi i osi ągał wysoki 
poziom plateau.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Faza zastoju  
58. Tak samo jak w przypadku statycznych bada ń przesiewowych, wiele bada ­
nych substancji chemicznych wymaga fazy zastoju przed wyst ąpieniem 
pełnej biodegradacji. W fazie zastoju nast ępuje przystosowanie lub adaptacja 
bakterii prowadz ących proces degradacji przy jednoczesnym prawie ca łko­
witym braku usuwania badanej substancji chemicznej; nast ępnie zachodzi 
wstępny wzrost tych bakterii. Zak łada się, że ta faza ko ńczy się, a zaczyna 
faza degradacji, kiedy nast ępuje usuni ęcie ok. 10 % wst ępnej ilości badanej 
substancji chemicznej (po adsorpcji, o ile takowa wyst ąpi). Faza zastoju jest 
często bardzo zmienna i s łabo odtwarzalna.  
Faza plateau  
59. Faza plateau na krzywej eliminacji w te ście ciągłym definiowana jest jako ta 
faza, w której nast ępuje maksymalna degradacja. Faza plateau powinna 
trwać co najmniej 3 tygodnie i nale ży w jej trakcie dokona ć około 15 
ważnych pomiarów warto ści. 
Średni stopie ń eliminacji badanej substancji chemicznej  
60. Obliczy ć średnią wartość z warto ści eliminacji (D  t ) badanej substancji 
chemicznej w fazie plateau. W zaokr ągleniu do najbli ższej liczby ca łkowitej 
(1 %) stanowi ona stopie ń eliminacji badanej substancji chemicznej. Zaleca 
się również obliczenie 95 % przedzia łu ufności średniej warto ści. 
Eliminacja po żywki organicznej  
61. Przedstawi ć w postaci wykresu warto ść procentow ą eliminacji DOC lub 
ChZT po żywki organicznej w zestawie kontrolnym (D  B ) w stosunku do 
czasu. Wskaza ć średni stopie ń eliminacji w taki sam sposób jak 
w odniesieniu do badanej substancji chemicznej (pkt 60).  
Wskazywanie na biodegradacj ę 
62. Jeśli substancja chemiczna nie adsorbuje w znacz ącym stopniu do osadu 
czynnego, a krzywa eliminacji ma typowy kszta łt krzywej biodegradacji 
z fazami zastoju, degradacji i plateau (pkt 58, 59), zmierzon ą eliminacj ę 
można bezpiecznie przypisa ć biodegradacji. Je śli zaszło znaczne wst ępne 
usuwanie, badanie symulacyjne nie mo że dokonywa ć rozróżnienia pomi ędzy 
procesami eliminacji biologicznej i abiotycznej. W takich przypadkach, a także w innych sytuacjach, kiedy zachodzi w ątpliwość co do biodegradacji 
(np. jeśli występuje odp ędzanie), przeanalizowa ć adsorbowane badane 
substancje chemiczne lub przeprowadzi ć dodatkowe statyczne badania 
biodegradacji w oparciu o parametry wyra źnie wskazuj ące na procesy biolo ­
giczne. Takie badania to metoda pobierania tlenu (rozdz. C.4 D, E i F niniejszego za łącznika (6)), badanie z pomiarem wytwarzania dwutlenku 
węgla (rozdzia ł C.4 C niniejszego za łącznika (6)) lub metoda ISO pomiaru 
dwutlenku w ęgla w przestrzeni nad roztworem (18) wykorzystuj ąca prein­
kubowane inokulum z badania symulacyjnego. Je śli zmierzone zosta ło 
zarówno usuni ęcie DOC, jak i usuni ęcie właściwej substancji chemicznej, 
znaczące różnice (pierwsza warto ść jest niższa niż druga) pomi ę
dzy 
wartościami procentowymi wskazuj ą obecność w odpływach po średnich 
produktów organicznych, które mog ą być trudniejsze w degradacji ni ż pier­
wotna substancja chemiczna.  
Ważność wyników badania  
63. Informacje na temat normalnej biodegradacji inokulum uzyskuje si ę, jeśli 
określi się stopień eliminacji po żywki organicznej (pkt 53) w zestawie 
kontrolnym. Badanie uznaje si ę za ważne, jeśli stopień eliminacji DOC 
lub ChZT w zestawie kontrolnym (zestawach kontrolnych) wynosi > 
80 % po dwóch tygodniach i nie zaobserwowano żadnych nietypowych 
zjawisk.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1073
 
64. Jeśli zastosowano szybko biodegradowaln ą (referencyjn ą) substancj ę 
chemiczn ą, stopień biodegradacji (D  t , pkt 52) powinien wynie ść > 90 %.  
65. Jeśli badanie przeprowadzane jest w warunkach nitryfikuj ących, średnie 
stężenie w odp ływach powinno wynosi ć < 1 mg/l azotu w postaci amoniaku 
i < 2 mg/l azotu w postaci azotynu.  
66. Jeśli te kryteria (pkt 63–65) nie s ą spełnione, powtórzy ć badanie, wykorzys ­
tując inokulum z innego źródła, zbadać substancj ę odniesienia i dokona ć 
przeglądu wszystkich procedur eksperymentu.  
Sprawozdanie z badania  
67. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— dane identyfikacyjne,  
— charakter fizyczny i w razie potrzeby w łasności fizykochemiczne.  
Warunki badania  
— typ uk ładu badawczego; wszelkie modyfikacje w przypadku badania 
nierozpuszczalnych i lotnych substancji chemicznych,  
— typ po żywki organicznej,  
— proporcja i charakter ścieków przemys łowych obecnych w ściekach, je śli 
są znane,  
— inokulum: charakter i miejsce (miejsca) pobierania próbek, st ężenie 
i wszystkie operacje przygotowania wst ępnego,  
— roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej: zawarto ść DOC 
i ChZT; sposób przygotowywania, je śli jest to zawiesina; wykorzystane 
stężenie badawcze; powody zastosowania warto ści DOC poza zakresem 
10–20 mg/l; metoda dodawania; data pierwszego dodania; ewentualne zmiany,
 
— średni wiek osadu i średni hydrauliczny czas retencji; metoda degradacji 
osadu; metoda likwidowania p ęcznienia, utraty osadu itp.,  
— zastosowane techniki analityczne,  
— temperatura badania,  
— cechy p ęcznienia osadu, indeks obj ętościowy osadu (SVI), zawarto ść 
zawiesin w komorze osadu czynnego (MLSS),  
— wszelkie odchylenia od standardowych procedur i wszelkie okoliczno ści, 
które mog ły mieć wpływ na wyniki.  
Wyniki badania  
— wszystkie mierzone dane (DOC, ChZT, analizy w łaściwe, pH, tempera ­
tura, stężenie tlenu, zawiesiny, substancje chemiczne zawieraj ące azot, 
w stosownych przypadkach,  
— wszystkie obliczone warto ści D  t (lub D  tc ), D  B , D St otrzymane w formie 
tabelarycznej i krzywe eliminacji,  
— informacje na temat faz zastoju i faz plateau, d ługość trwania badania, 
stopień eliminacji badanej substancji chemicznej i po żywki organicznej 
w zestawie kontrolnym wraz z informacjami statystycznymi i potwierdzeniami biodegradowalno ści i ważności badania,
 
— omówienie wyników.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Swisher RD (1987). „Surfactant Biodegradation”, wydanie drugie, Marcel 
Dekker Inc. Nowy Jork, 1085 s.  
(2) Rząd niemiecki (1962). Rozporz ądzenie w sprawie degradowalno ści deter­
gentów w środkach myj ących i czyszcz ących. Bundesgesetzblatt, cz ęść 1, 
nr 49: 698-706.  
(3) Painter HA i King EF (1978a). WRc porous-pot method for assessing 
biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, Zjednoczone Królestwo.
 
(4) Painter HA i King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on 
growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
 
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) Rozdzia ł C.4 niniejszego za łącznika: Oznaczenie szbkiej biodegradowal ­
ności. 
(7) Rozdzia ł C.12 niniejszego za łącznika: Biodegradacja – zmodyfikowane 
badanie SCAS.  
(8) Rozdzia ł C.19 niniejszego za łącznika: Oszacowanie wspó łczynnika 
adsorpcji (K  OC ) na glebie i w osadzie ściekowym przy zastosowaniu wyso ­
kosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)  
(9) Gerike P i Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability 
determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157-173.
 
(10) Gerike P i Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclu ­
sions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.  
(11) Painter HA i Bealing D (1989). Experience and data from the OECD 
activated sludge simulation test. s. 113-138, [w]: Laboratory tests for simu ­
lation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. [red.] Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
 
(12) ISO 11733 (1995; zmieniony 2004). Oznaczanie eliminacji i biodegradacji 
związków organicznych w środowisku wodnym – Test symulacyjny 
z osadem czynnym.  
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg.: 33-48.  
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 
(2): 340-343.  
(15) Gerike P, Fischer WK i Holtmann W (1980). Biodegradability determina ­
tions in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
 
(16) Baumann U, Kuhn G i Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF – Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220.  
(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. s. 91-98 ISBN 011 751661 9.
 
(18) ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the 
analysis of inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Dodatek 1  
Rysunek 1  
Oprzyrządowanie stosowane do oceny biodegradowalno ści 
Zestaw Husmanna
  
A. Naczynie magazynuj ące 
B. Pompa dozuj ąca 
C. Komora napowietrzania (pojemno ść 3 l)  
D. Osadnik  E. Podno śnik powietrzny  
F. Naczynie do zbierania odp ływu 
G. Napowietrzacz  
H. Miernik przep ływu powietrza  
Rysunek 2  
Oprzyrządowanie stosowane do oceny biodegradowalno ści 
Naczynie porowate
  
A. Naczynie magazynuj ące 
B. Pompa dozuj ąca 
C. Porowate naczynie do napowietrzania  
D. Zewn ętrzne nieprzepuszczalne naczynie  F. Naczynie do zbierania odp ływu 
F. Dyfuzor  
G. Miernik przep ływu powietrza  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Rysunek 3  
Szczegóły budowy 3-litrowego naczynia porowatego do napowietrzania
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Dodatek 2  
Przykład krzywej eliminacji
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Dodatek 3  
[INFORMACYJNY]  
ŁĄCZENIE ZESTAWÓW BADAWCZYCH  
W celu zrównowa żenia populacji bakteryjnych w osadzie w zestawie badaw ­
czym, do którego wprowadza si ę ścieki i badan ą substancj ę chemiczn ą, oraz 
w zestawie kontrolnym, do którego wprowadza si ę tylko ścieki, wprowadzono 
codzienną wymianę osadu (1). Procedur ę tę nazwano łączeniem, a metoda znana 
jest jako zestawy łączone. Pierwotnie łączenie stosowano do zestawów osadu 
czynnego Husmanna, ale u żywano go równie ż do zestawów z naczyniami poro ­
watymi (2) (3). Nie odnotowano znacz ących różnic w wynikach zestawów 
niełączonych i łączonych, zarówno w przypadku zestawów Husmanna, jak 
i zestawów naczy ń porowatych, tak wi ęc wydatkowanie czasu i energii na 
łączenie zestawów nie przynosi żadnych korzy ści. 
Wymiana osadu mo że pozornie powodowa ć znaczące usuwanie, poniewa ż część 
badanej substancji chemicznej jest przenoszona, a st ężenia badanej substancji 
w odpływie badanym i kontrolnym staj ą się niemal równe. Dlatego te ż konieczne 
jest stosowanie wspó łczynników koryguj ących, które uzale żnione są od wymie ­
nianej frakcji i średniego hydraulicznego czasu retencji. Opublikowano szczegó ­ 
łowe informacje na temat wylicze ń (1). 
Obliczyć skorygowany stopie ń eliminacji DOC lub ChZT u żywając ogólnego 
wzoru:  
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
gdzie:  
D tc = skorygowany % eliminacji DOC lub ChZT,  
D t = określony % eliminacji DOC lub ChZT,  
a = wymieniona frakcja obj ętości zestawów osadu czynnego,  
r = średni hydrauliczny czas retencji (h).  
Jeśli na przyk ład połowa pojemno ści naczynia napowietrzaj ącego jest wymie ­
niana (a = 0,5), a średni hydrauliczny czas retencji wynosi 6 h, prawid łowy 
wzór to:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
BIBLIOGRAFIA  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled 
Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.  
(2) Painter HA i Bealing D (1989). Experience and data from the OECD acti ­
vated sludge simulation test. s. 113-138, [w]: Laboratory tests for simulation 
of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. [red.] 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, Zjednoczone Królestwo.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Dodatek 4  
OCENA HAMOWANIA OSADU CZYNNEGO  
Procedura z udzia łem badanych substancji chemicznych  
1. Substancja chemiczna (lub ściek) mog ą nie ulega ć degradacji ani usuwaniu 
w badaniu symulacyjnym i mog ą wręcz mieć wpływ hamuj ący na mikro ­
organizmy w osadzie. Inne substancje chemiczne ulegaj ą biodegradacji 
w niskich st ężeniach, ale maj ą działanie hamuj ące w stężeniach wy ższych 
(hormeza). Dzia łanie hamuj ące może ujawnić się na wcze śniejszym etapie 
lub może zostać stwierdzone dzi ęki zastosowaniu badania toksyczno ści przy 
użyciu inokulum podobnego lub identycznego jak to stosowane w badaniu 
symulacyjnym (1). Metody te to hamowanie pobierania tlenu (rozdzia ł C.11 
niniejszego za łącznika (2) oraz ISO 8192(3)) lub hamowanie wzrostu orga ­
nizmów w osadzie (ISO 15522 (4)).  
2. W badaniu symulacyjnym wszelkie dzia łanie hamuj ące wyraża się jako 
różnica poziomu rozpuszczonego w ęgla organicznego (DOC) lub chemicz ­
nego zapotrzebowania na tlen (ChZT) pomi ędzy odpływem z naczynia 
badawczego i z kontrolnego przekraczaj ąca ilość DOC w substancji dodanej 
jako badana substancja chemiczna. Inaczej mówi ąc, wartość procentowa 
usunięcia DOC (i biochemicznego zapotrzebowania na tlen BZT, chemicz ­
nego zapotrzebowania na tlen ChZT lub NH  + 4 ) w poddawanej dzia łaniu 
pożywce organicznej zmniejszy si ę w obecno ści badanej substancji chemicz ­
nej. Jeśli to nastąpi, należy powtórzy ć badanie, zmniejszaj ąc stężenie badanej 
substancji chemicznej do momentu osi ągnięcia poziomu, na którym nie 
występuje hamowanie, i ewentualnie dalej zmniejszaj ąc stężenie do momentu 
biodegradacji badanej substancji chemicznej. Jednak że jeśli badana 
substancja chemiczna (lub ściek) ma negatywny wp ływ na proces we wszyst ­
kich badanych st ężeniach, sugeruje to, że substancja jest trudna do oczysz ­
czania biologicznego, lub te ż że jest ono niemo żliwe, jednak warto powtó ­
rzyć badanie przy wykorzystaniu osadu czynnego z innego źródła lub podda ć 
osad bardziej stopniowemu przystosowaniu.  
3. Z kolei je śli badana substancja chemiczna ulega bioeliminacji przy pierwszej 
próbie przeprowadzenia badania symulacyjnego, jej st ężenie nale ży zwięk­
szyć, jeśli konieczne jest ustalenie, czy dana substancja chemiczna mo że 
mieć działanie hamuj ące. 
4. Przy próbach okre ślenia stopnia hamowania nale ży pamiętać, że populacja 
w osadzie czynnym mo że ulec zmianie, wskutek czego z biegiem czasu 
mikroorganizmy mog ą rozwinąć tolerancj ę na substancj ę chemiczn ą 
o działaniu hamuj ącym.  
5. Obliczenie stopnia hamowania:  
Ogólną procentow ą wartość usunięcia R  o BZT, DOC, ChZT itp. w zestawach 
testowych i kontrolnych mo żna wyliczy ć z: 
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ=I % 
gdzie:  
I = stężenie we wcieku BZT, DOC, ChZT itp. w naczyniach badawczych 
i kontrolnych (mg/l),  
E = odpowiednie st ężenia w odp ływie.  
I i E nale ży skorygowa ć o DOC w odniesieniu do badanej substancji 
chemicznej w zestawach badawczych, w przeciwnym wypadku obliczenia 
procentowej warto ści hamowania b ędą niepoprawne.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
Stopień hamowania wywo łanego obecno ścią badanej substancji chemicznej 
można obliczy ć z: 
% hamowania ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
gdzie:  
R c = procentowa warto ść usunięcia w naczyniach kontrolnych,  
R t = procentowa warto ść usunięcia w naczyniach badawczych.  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Reynolds L  et al . (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.  
(2) Rozdzia ł C.11 niniejszego za łącznika. Biodegradacja – badanie hamowania 
oddychania osadów czynnych.  
(3) ISO 8192 (2007) Jako ść wody – Badanie hamowania zu życia tlenu przez 
osad czynny do utleniania zwi ązków zawieraj ących węgiel i amon.  
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Dodatek 5  
Badane substancje chemiczne s łabo rozpuszczalne w wodzie – lotne 
substancje chemiczne  
Substancje chemiczne s łabo rozpuszczalne w wodzie  
Opublikowano do tej pory niewiele raportów z poddawania substancji chemicz ­
nych słabo rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie badaniom symuluj ­ 
ącym oczyszczanie ścieków (1) (2) (3).  
Nie istnieje jedna metoda dyspersji badanej substancji chemicznej, która mia łaby 
zastosowanie do wszystkich nierozpuszczalnych substancji chemicznych. Dwa z czterech typów metod opisywanych w ISO 10634 (4) wydaj ą się odpowiednie 
do podjęcia prób rozproszenia badanych substancji chemicznych na potrzeby 
badań symulacyjnych; s ą to zastosowanie środków emulguj ących lub energii 
ultradźwiękowej. Nale ży osiągnąć co najmniej 24-godzinne okresy stabilno ści 
dyspersji. Odpowiednio ustabilizowane dyspersje znajduj ące się w zbiorniku ze 
stałym mieszaniem (pkt 38) dawkuje si ę następnie do naczynia napowietrzaj ą­
cego oddzielnie od ścieków domowych (lub syntetycznych).
 
Jeśli dyspersje s ą stabilne, zbada ć, jak można określić ilość badanej substancji 
chemicznej w postaci zdyspergowanej. Jest ma ło prawdopodobne, by odpo ­
wiednie by ło wykorzystanie DOC, zatem nale ży określić dla badanej substancji 
chemicznej w łaściwą metodę analityczn ą, którą można byłoby stosowa ć do 
odpływów, cz ęści stałych odpływów i osadu czynnego. To, co stanie si ę 
z badaną substancj ą chemiczn ą w symulacji procesu osadu czynnego, jest 
wówczas determinowane w fazach ciek łych i sta łych. W ten sposób ustalony 
zostanie „bilans masy” pozwalaj ący określić, czy badana substancja chemiczna 
uległa biodegradacji. B ędzie się to jednak odnosi ć tylko do biodegradacji pier ­
wotnej. Nale ży podjąć próbę wykazania ostatecznej biodegradacji poprzez zasto ­
sowanie respirometrycznego badania szybkiej biodegradowalno ści (rozdzia ł C.4 
niniejszego za łącznika (5) C, F lub D), wykorzystuj ąc jako inokulum osad 
poddany dzia łaniu badanej substancji chemicznej w badaniu symulacyjnym.  
Lotne substancje chemiczne  
Zastosowanie symulacji oczyszczania ścieków do substancji lotnych jest 
dyskusyjne i problematyczne. Tak samo jak w przypadku badanych substancji 
chemicznych s łabo rozpuszczalnych w wodzie, równie ż na temat bada ń symula­
cyjnych z wykorzystaniem lotnych substancji chemicznych opublikowano niewiele raportów. Konwencjonalnego typu przyrz ąd do mieszania pe łnego jest 
adaptowany poprzez uszczelnienie zbiorników napowietrzaj ących i osadników, 
pomiar i kontrol ę przepływu powietrza przy wykorzystaniu mierników przep ływu 
powietrza oraz przepuszczanie gazu uchodz ącego przez pu łapki w celu zebrania 
lotnych substancji organicznych. W niektórych przypadkach wykorzystuje si ę 
pompę próżniową do przepuszczania gazu uchodz ącego przez „zimn ą” pułapkę 
lub pułapkę oczyszczaj ącą zawierającą Tenax i żel silikonowy do analiz metod ą 
chromatografii gazowej. Obecno ść badanej substancji chemicznej w pu łapce 
można określić analitycznie.
 
Badanie przeprowadzane jest w dwóch cz ęściach. Zestawy dzia łają najpierw bez 
osadu – do zbiornika napowietrzaj ącego wpompowuje si ę tylko ścieki synte ­
tyczne i badan ą substancj ę chemiczn ą. Próbki wcieku, odp ływu i gazu uchodz ą­
cego są gromadzone i analizowane pod k ątem obecno ści badanej substancji 
chemicznej przez kilka dni. Na podstawie zgromadzonych danych mo żna obli­
czyć wartość procentow ą (R vs ) badanej substancji chemicznej usuni ętej z układu. 
Następnie przeprowadza si ę normalne badanie biologiczne (z osadem) 
w warunkach operacyjnych identycznych do warunków badania odp ędzania. 
Wykonuje si ę również pomiary DOC lub ChZT w celu sprawdzenia, czy zestawy 
pracują wydajnie. Od czasu do czasu przeprowadza si ę analizy maj ące określić 
ilość badanej substancji chemicznej we wcieku, odp ływie i gazie uchodz ącym 
w pierwszej cz ęści badania; po przystosowaniu przeprowadza si ę częstsze 
analizy. Na podstawie danych w stanie ustalonym mo żna obliczy ć wartość 
procentow ą usunięcia badanej substancji chemicznej z fazy ciek łej przy wyko ­
rzystaniu wszystkich procesów (R  T ) (fizycznych i biologicznych) oraz odsetek 
(R V ) usunięty z układu. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Obliczenie:  
a) W badaniu niebiologicznym udzia ł procentowy (R  VP ) badanej substancji 
chemicznej usuni ętej z układu można obliczy ć ze wzoru:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
gdzie:  
R VP = usunięcie badanej substancji chemicznej poprzez ulatnianie si ę (%),  
S VP = badana substancja chemiczna zgromadzona w pu łapce wyra żona jako 
ekwiwalent st ężenia w fazie p łynnej (mg/l),  
S IP = stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku (mg/l).  
b) W badaniu biologicznym udzia ł procentowy (R  V ) badanej substancji 
chemicznej usuni ętej z układu można obliczy ć ze wzoru:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
gdzie:  
R V = usunięcie badanej substancji chemicznej poprzez ulatnianie si ę 
w badaniu biologicznym (%),  
S V = badana substancja chemiczna zgromadzona w pu łapce w badaniu 
biologicznym, wyra żona jako ekwiwalent st ężenia w płynnym wcieku 
(mg/l),  
S I = stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku (mg/l).  
c) W badaniu biologicznym udzia ł procentowy (R  T ) usunięcia badanej substancji 
chemicznej we wszystkich procesach jest wyliczany ze wzoru:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
gdzie:  
S E = stężenie badanej substancji chemicznej w (p łynnym) odp ływie (mg/l).  
d) Stąd też udział procentowy (R  BA ) usunięty poprzez biodegradacj ę z adsorpcj ą 
można obliczy ć ze wzoru:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Oddzielne badania nale ży przeprowadzi ć w celu okre ślenia, czy badana 
substancja chemiczna podlega adsorpcji; je śli tak, mo żna dokona ć dalszej 
korekty.  
e) Porównanie pomi ędzy proporcjami badanej substancji chemicznej usuni ętej 
w układach badania biologicznego (R  V ) i niebiologicznego (R  VP ) wskazuje 
ogólny wp ływ oczyszczania biologicznego na emisj ę badanej substancji 
chemicznej do atmosfery.  
Przykład: benzen  
Czas retencji osadu = 4 dni  
Ściek syntetyczny; czas retencji = 8 h  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Stąd: 
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % a R  BA = 85 %.  
Przyjęto, że benzen nie ulega adsorpcji na osadzie.  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl 
alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic 
compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control 
Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Jako ść wody – Wytyczne dotycz ące przygotowania 
i obróbki s łabo rozpuszczalnych zwi ązków organicznych w celu oceny ich 
biodegradacji w środowisku wodnym.  
(5) Rozdzia ł C.4 niniejszego za łącznika. Oznaczenie szybkiej biodegradowal ­
ności. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Dodatek 6  
Wpływ czasu retencji osadu (CRO) na podatno ść substancji chemicznych na 
oczyszczanie  
WPROWADZENIE  
1. Metod ę opisaną w głównej cz ęści tekstu stworzono w celu potwierdzenia, 
czy badane substancje chemiczne (zazwyczaj takie, o których wiadomo, że 
są zasadniczo biodegradowalne, ale nie ulegaj ą szybkiej biodegradacji) 
mogą ulec biodegradacji w granicach nak ładanych przez oczyszczalnie ście­
ków. Wyniki podawane s ą w postaci procentowej warto ści usunięcia 
i procentowej warto ści biodegradacji. Warunki dzia łania zestawów osadu 
czynnego i wybór wcieku pozwalaj ą na wyst ępowanie do ść szerokiego 
zakresu st ężeń badanej substancji chemicznej w odp ływie. Badania przepro ­
wadzane s ą tylko dla jednego st ężenia nominalnego osadu sta łego lub 
w odniesieniu do jednego czasu retencji osadu (CRO), a opisane schematy degradacji osadu mog ą spowodowa ć, że wartość CRO b ędzie ulega ć 
znacznym zmianom w trakcie badania, zarówno w odniesieniu do warto ści 
z kolejnych dni, jak i ró żnych warto ści z tego samego dnia.
 
2. W tym wariancie (1) (2) CRO jest kontrolowany w znacznie w ęższych 
ramach przez 24 h (tak jak dzieje si ę to na du żą skalę), co powoduje 
bardziej sta łe stężenie w odp ływach. Zalecane s ą ścieki domowe, poniewa ż 
dają bardziej spójne i wy ższe warto ści procentowe usuni ęcia. Ponadto bada 
się wpływ szeregu warto ści CRO i w bardziej szczegó łowym badaniu 
można określić wpływ różnych temperatur na st ężenie odpływu.  
3. Nie ma zgody co do tego, jakie modele kinetyczne maj ą zastosowanie 
w sytuacji, kiedy substancje chemiczne ulegaj ą biodegradacji 
w warunkach oczyszczania ścieków. Wybrano zastosowanie modelu 
Monoda wzrostu bakterii i u życia substratu (1) (2) do zgromadzonych 
danych, poniewa ż metoda ta mia ła być stosowana tylko do substancji 
chemicznych produkowanych w du żych ilościach, co skutkuje st ężeniami 
w ściekach powy żej 1 mg/l. Wa żność modelu uproszczonego 
i poczynionych za łożeń stwierdzono wykorzystuj ąc szereg zwi ązków oksye ­
tylenowanych o ró żnych stopniach biodegradowalno ści pierwotnej (2) (3).  
Uwaga:  Ten wariant metody jest zgodny z wi ększością tekstu dotycz ącego 
tej metody badawczej C.10-A, za ś poniżej podano wy łącznie te 
aspekty, które s ą odmienne.  
ZASADA BADANIA  
4. Zestawy osadu czynnego z naczyniami porowatymi, które maj ą za zadanie 
ułatwienie (niemal) ci ągłego wytracania mieszanego p łynu, pozwalaj ą na 
bardzo dok ładną kontrolę czasu retencji osadu (CRO lub θ s ), działają 
w trybie niepo łączonym w odniesieniu do szerokiego zakresu czasów 
retencji osadu oraz, opcjonalnie, w ró żnych temperaturach. Czas retencji 
wynosi zazwyczaj od 2 do 10 dni, a temperatura od 5 do 20 °C. Ścieki, 
najlepiej ścieki domowe, oraz roztwór badanej substancji chemicznej 
dawkowane s ą osobno do zestawów w tempie umo żliwiającym otrzymanie 
wymaganego czasu retencji (3 do 6 godzin) oraz wymaganego st ężenia 
badanej substancji chemicznej we wcieku. Równocze śnie, dla celów porów ­
nawczych, dzia łają zestawy kontrolne, które nie otrzymuj ą badanej 
substancji chemicznej.  
5. Możliwe jest wykorzystanie innego typu przyrz ądów, jednak nale ży 
zachować szczególn ą ostrożność, by zapewni ć odpowiedni ą kontrolę CRO. 
Przykładowo, przy wykorzystywaniu instalacji obejmuj ących odstojnik 
konieczne mo że okazać się uwzględnienie utraty cz ęści stałych z odp ływu 
z instalacji. Ponadto nale ży podjąć specjalne środki ostro żności w celu 
uniknięcia błędów wynikaj ących ze zmiany ilo ści osadu w odstojniku.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Zestawy pracuj ą w określonych uk ładach warunków i po osi ągnięciu równo ­
wagi przez oko ło trzy tygodnie uzyskuje si ę średnie stężenia w stanie usta ­
lonym badanej substancji chemicznej w odp ływach i – opcjonalnie – DOC. 
Oprócz oceniania warto ści procentowej usuni ęcia badanej substancji 
chemicznej i – opcjonalnie – DOC, przedstawia si ę w formie graficznej 
stosunek pomi ędzy warunkami dzia łania instalacji a st ężeniem 
w odpływie. Na podstawie tego mo żna obliczy ć próbne sta łe kinetyczne 
oraz przewidzie ć warunki, w jakich badana substancja chemiczna mo że 
być oczyszczana.  
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ  
7. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 12 i 13.  
POZIOMY PROGOWE  
8. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 14 i 15.  
BADANE SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
9. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 16.  
ODTWARZALNO ŚĆ WYNIKÓW BADA Ń 
10. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 17 i 18.  
OPIS METODY  
Przyrząd 
11. Odpowiednim zestawem jest zmodyfikowany uk ład naczy ń porowatych 
(dodatek 6.1). Sk łada się z naczynia wewn ętrznego (wk ładki) 
z porowatego polipropylenu o grubo ści 3,2 mm i maksymalnej średnicy 
porów 90 μm, w którym z łącze jest zgrzane doczo łowo. (Powoduje to, że 
zestaw jest trwalszy ni ż ten opisany w pkt 21 niniejszego rozdzia łu, C.10 
A). Wkładka umieszczona jest w nieprzepuszczalnym polietylenowym 
naczyniu zewn ętrznym, które sk łada się z dwóch cz ęści: okrągłej podstawy, 
w której wywiercono otwory w celu zamocowania dwóch linii powietrznych i jednej linii usuwania osadu oraz górnego cylindra, który przykr ęcony jest 
do podstawy i którego wylot umieszczony jest w takim miejscu, by wska ­
zywał znaną ilość (3 l) w naczyniu porowatym. Jedna z linii powietrznych 
wyposażona jest w kamie ń napowietrzaj ący, a druga ma otwarte zako ń­
czenie i jest usytuowana pod k ątem prostym do kamienia w naczyniu. 
Układ ten powoduje powstanie wystarczaj ących turbulencji, by zapewni ć, 
że zawarto ść naczynia jest ca łkowicie wymieszana oraz utrzyma ć stężenie 
rozpuszczonego tlenu na poziomie wi ększym ni ż 2 mg/l.
 
12. Odpowiedni ą liczbę zestawów utrzymuje si ę w kontrolowanych temperatu ­
rach w zakresie od 5 do 20 °C (± 1 °C), w k ąpieli wodnej lub 
w pomieszczeniach o sta łej temperaturze. Do dawkowania do naczy ń napo­
wietrzających roztworu badanej substancji chemicznej oraz osadzonych 
ścieków w wymaganym tempie (odpowiednio 0–1,0 ml/min i 0–25 ml/min) 
potrzebne s ą pompy; trzecia pompa konieczna jest do usuwania osadu odpa ­
dowego z naczy ń napowietrzaj ących. Niezb ędne bardzo wolne tempo prze ­
pływu osadu odpadowego osi ąga się dzięki zastosowaniu pompy ustawionej 
na wyższą wartość i uruchamianej z przerwami wy łącznikiem czasowym, 
np. działającej przez 10 sekund na minut ę; szybkość podawania 3 ml/min 
daje tempo degradacji 0,5 ml/min.  
Przyrząd do filtrowania lub wirówka  
13. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 23.  
Sprzęt do wykonywania analiz  
14. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 24.  
Woda  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 25 i 26.  
Pożywka organiczna  
16. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 27.  
Ścieki syntetyczne  
17. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 28.  
Ścieki domowe  
18. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 29.  
Osad czynny  
19. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 30.  
Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej  
20. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 31 i 32.  
PROCEDURA  
Przygotowanie inokulum  
21. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 34 – nale ży zastosowa ć osad czynny 
(ok. 2,5 g/l).  
Liczba zestawów badawczych  
22. Do przeprowadzenia prostego testu, tzn. zmierzenia warto ści procentowej 
usunięcia, potrzebna jest tylko jedna warto ść CRO, ale do tego, by uzyska ć 
dane potrzebne do wyliczenia próbnych sta łych kinetycznych, konieczne jest 
4 lub 5 warto ści CRO. Wybiera si ę zazwyczaj warto ści pomiędzy 2 a 10 
dni. Z praktycznego punktu widzenia wygodne jest przeprowadzenie badania na 4 lub 5 CRO jednocze śnie w jednej temperaturze; 
w rozszerzonych badaniach te same warto ści CRO, lub inny zakres warto ści, 
wykorzystuje si ę w innych temperaturach w zakresie od 5 do 20 °C. 
W przypadku pierwotnej biodegradacji (g łówne zastosowanie) konieczny 
jest zazwyczaj tylko jeden zestaw badawczy na jeden uk ład warunków. 
Jednakże do zbadania ostatecznej biodegradowalno ści potrzebny jest zestaw 
kontrolny do ka żdego układu warunków; do zestawu tego dodaje si ę ścieki, 
ale bez badanej substancji chemicznej. Je śli zakłada się obecność badanej 
substancji chemicznej w u żywanych ściekach, konieczne jest zastosowanie 
zestawów kontrolnych przy ocenie pierwotnej biodegradacji i dokonanie 
właściwych korekt w obliczeniach.
 
Dawkowanie po żywki organicznej i badanej substancji chemicznej  
23. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 36–39, jednak nale ży zauważyć, że 
roztwór badanej substancji chemicznej jest dawkowany osobno i że stosuje 
się różne współczynniki degradacji osadu. Nale ży również często, np. dwa 
razy dziennie, monitorowa ć i w miar ę potrzeby korygowa ć – do ± 10 % – 
przepływ wcieku, odp ływu i degradacji osadu. W przypadku wyst ąpienia 
trudności w stosowaniu metod analitycznych przy wykorzystywaniu 
ścieków domowych badanie nale ży przeprowadzi ć z wykorzystaniem 
ścieków syntetycznych, ale nale ży dopilnowa ć, by różne media dawa ły 
porównywalne dane kinetyczne.  
Postępowanie z zestawami osadu czynnego  
24. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 40–43, ale CRO nale ży kontrolowa ć 
tylko poprzez „sta łą” degradacj ę osadu.  
Pobieranie próbek i analiza  
25. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 44–50, z t ą różnicą, że należy 
określić stężenie badanej substancji chemicznej, a okre ślenie DOC jest 
opcjonalne; nie nale ży stosowa ć ChZT.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Opracowanie wyników  
26. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 52–54.  
Prezentacja wyników badania  
27. Zastosowanie ma rozdzia ł C.10 A, pkt 56–62.  
Obliczenie sta łych kinetycznych  
28. Podanie średniego st ężenia plateau badanej substancji chemicznej 
w odpływie i opisanie, jak zmienia si ę ono wraz z warunkami dzia łania 
instalacji, jest bardziej realistycznym rozwi ązaniem ni ż podawanie procen ­
towej biodegradacji pierwotnej. Mo żna tego dokona ć stosując równanie (6) 
z dodatku 6.2, które daje warto ści K  S , μ m oraz θ SC – krytyczn ą wartość 
czasu retencji osadu.  
(Alternatywnie mo żna otrzyma ć przybliżone warto ści K  S i μ m , stosując 
prosty program komputerowy dostosowuj ący teoretyczn ą krzywą wyliczon ą 
z równania 2 (dodatek 6.2) do otrzymanych warto ści eksperymentalnych. 
Mimo że żadne rozwi ązanie nie b ędzie unikalne, mo żna uzyska ć rozsądne 
przybliżenie warto ści K  S i μ m ). 
Zmienno ść wyników  
29. Powszechnie zdarza si ę uzyskiwanie zmiennych warto ści parametrów kine ­
tycznych poszczególnych substancji chemicznych. Uwa ża się, że warunki, 
w jakich hodowany by ł osad, a tak że warunki wyst ępujące w trakcie 
badania (tak jak w pkt 5 i innych badaniach) maj ą duży wpływ na osta ­
teczne wyniki. Jeden z aspektów tej zmienno ści omówili Grady i in. (4), 
którzy zasugerowali, że terminy „zastany” i „swoisty” powinny by ć stoso­
wane do dwóch skrajnych warunków odpowiadaj ących warto ściom 
granicznym stanu fizjologicznego, który kultura mo że osiągnąć w trakcie 
eksperymentu kinetycznego. Je śli stan ten nie mo że zmienić się w trakcie 
badania, warto ści parametru kinetycznego odzwierciedlaj ą warunki 
w środowisku, z którego pobrano mikroorganizmy; warunki te zwane s ą 
„zastanymi” lub obecnie istniej ącymi. Z kolei w odwrotnej sytuacji, je śli 
warunki badania zezwalaj ą na pełny rozwój systemu syntetyzowania bia łka 
dopuszczaj ąc maksymalne mo żliwe tempo wzrostu, otrzymane parametry 
kinetyczne okre śla się jako „swoiste” i s ą one zale żne tylko od charakteru 
substratu i typów bakterii w kulturze. Warto ści zastane uzyskuje si ę poprzez 
utrzymanie stosunku st ężenia substratu do w łaściwych mikroorganizmów 
(S o /X o ) na poziomie niskim, np. 0,025, za ś wartości swoiste powstaj ą, 
kiedy stosunek ten jest wysoki i wynosi np. co najmniej 20. W obydwu 
przypadkach S  o powinno by ć równe odpowiedniej warto ści Ks – sta łej 
półnasycenia – lub j ą przekracza ć. 
30. Zmienno ść i inne aspekty kinetyki biodegradacji omawiano podczas ostat ­
niego warsztatu SETAC (5). Dzi ęki takim badaniom, przeprowadzonym 
i planowanym, powinno by ć niedługo możliwe osiągnięcie jaśniejszego 
obrazu kinetyki w oczyszczalniach ścieków, co umo żliwi lepsz ą interpre­
tację istniejących bada ń oraz zasugeruje lepsze rozwi ązania w przysz łych 
metodach badawczych.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado 
Com. Espanol. Deterg. 33–48.  
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61(2): 
340-343.  
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage 
treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol. 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. 
Wat. Res. 30 (3): 742–748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Warsztat w Port Sunlight, UK. [red.] Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4–6.9.1996. SETAC-Europa, Bruksela.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Dodatek 6.1  
Naczynie porowate z kontrol ą CRO
  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Dodatek 6.2  
Obliczanie sta łych kinetycznych  
1. Zakładając zastosowanie kinetyki Monoda i bilansu masy aktywnych cz ęści 
stałych i substratów w ca łym układzie z osadem czynnym (1), otrzyma ć 
można następujące stany ustalone:  
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
albo 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
gdzie:  
S 1 = stężenie substratu w odp ływie (mg/l),  
K S = stała półnasycenia, przy którym st ężenie μ = μ m /2 (mg/l),  
μ = właściwa szybko ść wzrostu (d  –1 ), 
μ m = maksymalna warto ść μ m (d –1 ), 
K d = właściwa szybko ść rozpadu czynnych cz ęści stałych (d  –1 ), 
θ S = średni czas retencji osadu, CRO (d).  
Zbadanie tego równania prowadzi do nast ępujących wniosków:  
(i) Stężenie w odp ływie jest niezale żne od st ężenia we wcieku (S  0 ); 
dlatego te ż wartość procentowa biodegradacji zmienia si ę wraz ze 
zmianą stężenia we wcieku, S  0 . 
(ii) Jedynym parametrem kontroli instalacji maj ącym wpływ na S  1 jest czas 
retencji osadu, θ S . 
(iii) Przy danym st ężeniu we wcieku, S  0 , wystąpi krytyczny czas retencji 
osadu, taki że: 
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
gdzie:  
θ SC = krytyczny czas retencji osadu, poni żej którego w łaściwe mikro ­
organizmy b ędą wypłukiwane z instalacji.  
(iv) Poniewa ż inne parametry równania (2) s ą powiązane z kinetyk ą 
wzrostu, temperatura mo że mieć wpływ na poziom substratu 
w odpływie i krytyczny wiek osadu, tzn. czas retencji osadu potrzebny 
do otrzymania okre ślonego poziomu oczyszczania wzro śnie wraz ze 
spadkiem temperatury.  
2. Przy bilansie masy cz ęści stałych w uk ładzie naczy ń porowatych 
i zakładając, że stężenie części stałych w odp ływie z instalacji, X  2 , jest 
niskie w porównaniu ze st ężeniem w naczyniu napowietrzaj ącym, X  1 , 
czas retencji osadu wynosi:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
oraz 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
gdzie:  
V = obj ętość naczynia napowietrzaj ącego (l),  
X 1 = stężenie części stałych w naczyniu napowietrzaj ącym (mg/l),  
X 2 = stężenie części stałych w odp ływie, (mg/l),  
Q 0 = natężenie przep ływu wcieku (l/d),  
Q 1 = natężenie przep ływu osadu odpadowego (l/d).  
Dlatego te ż możliwe jest kontrolowanie czasu retencji osadu przy dowolnej 
wstępnie wybranej warto ści poprzez kontrol ę natężenia przep ływu osadu 
odpadowego, Q  1 . 
Wnioski  
3. Głównym celem badania jest przewidywanie st ężenia odpływu, a dzi ęki 
temu poziomu badanej substancji chemicznej w odbiornikach wodnych.  
4. Dzięki wykreśleniu S  1 względem θ S możliwe jest czasem szybkie oszaco ­
wanie krytycznego czasu retencji osadu θ SC , np. krzywa 3 na rysunku 1. 
Jeśli nie jest to mo żliwe, mo żna obliczy ć θ SC , wraz z przybli żonym 
wartościami μ m i K S , dzięki wykreśleniu S  1 względem S  1 ·θ S . 
Przekszta łcenie równania (1) daje  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Jeśli K  d jest małe, wówczas 1 + θ s · K d ~ 1 i [5] staje si ę: 
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
Stąd też wykres powinien by ć linią prostą (zob. rysunek 2) o nachyleniu 
1/μ m i punkcie przeci ęcia K  S /μ m ; tak więc θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Rysunek 1  
Trzy temperatury; pi ęć CRO
  
Rysunek 2  
Linia regresji CRO · S 1 vs S  1 przy T = 5 °C
  
Glosariusz:  
Stężenie odpływu 
Krzywa  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
 
Dodatek 7  
BADANIE PRZY NISKIM ( μg/l) ZAKRESIE ST ĘŻEŃ 
1. Wiele substancji chemicznych obecnych jest normalnie w środowisku 
wodnym, nawet w ściekach, w bardzo niskich st ężeniach (rz ędu μg/l). 
Przy takich st ężeniach raczej nie odgrywaj ą one roli podstawowych 
substratów wzrostowych – bardziej prawdopodobne jest, że ulegną degra­
dacji jako substraty niewzrostowe, drugorz ędne, równoleg łe wobec 
różnorodnych naturalnie wyst ępujących substancji chemicznych zawieraj ­ 
ących węgiel. Dlatego te ż degradacja takich substancji chemicznych nie 
będzie odpowiada ła modelowi opisanemu w dodatku 6. Istnieje wiele 
modeli, które mo żna zastosowa ć, a w warunkach wyst ępujących 
powszechnie w oczyszczalniach ścieków jednocze śnie może działać ich 
kilka. Do wyja śnienia tego zagadnienia potrzeba znacznie wi ęcej badań. 
2. Tymczasem mo żna stosowa ć procedur ę podaną w głównym tek ście (rozdzia ł 
C.10 A), ale tylko do biodegradowalno ści pierwotnej, wykorzystuj ąc odpo­
wiednio niskie st ężenia (< 100 μg/l) oraz zwalidowan ą procedur ę anali­
tyczną. Wartość procentow ą biodegradacji mo żna obliczy ć (zob. pkt 54 
metody badawczej) pod warunkiem że uwzględni się procesy abiotyczne 
(adsorpcję, lotność itp.). Przyk ładem jest tu badanie przeprowadzone przez 
Nyholma i jego wspó łpracowników (1) (2), w którym wykorzystano 4- 
godzinny cykl w systemie sekwencyjnego reaktora biologicznego. Poinfor ­
mowali oni o uzyskaniu sta łych szybko ści reakcji pseudopierwszego rz ędu 
w odniesieniu do 5 substancji chemicznych dodanych do ścieków syntetycz ­
nych w st ężeniu między 5 a 100 μg/l. (W odniesieniu do biodegradowal ­
ności ostatecznej mo żna zastosowa ć badane substancje chemiczne znako ­
wane izotopem  14 C. Opis tego procesu wychodzi poza zakres niniejszej 
metody badawczej, poniewa ż nie istniej ą jeszcze żadne ustalone procedury, 
choć metoda zaproponowana dla ISO 14592 (3) zawiera wskazówki co do 
stosowania substancji chemicznych znakowanych izotopem  14 C. 
Badanie SCAS  
3. Później zaproponowano prostsze badanie dwuetapowe (4) (5) (6); po reali ­
zacji metody pó łciągłego osadu czynnego (SCAS) nast ępują krótkie badania 
kinetyczne próbek pobranych z zestawów SCAS. Uk ład SCAS dzia ła przy 
znanych wspó łczynnikach ubytku osadu (w przeciwie ństwie do pierwotnej 
metody badawczej C.12) i wykorzystuje zmodyfikowane ścieki syntetyczne 
OECD lub ścieki domowe. Ścieki syntetyczne zosta ły zmodyfikowane (z 
powodu zmiennej warto ści pH oraz s łabej sedymentacji osadu) poprzez 
dodanie fosforanu jako bufora, wyci ągu z dro żdży, chlorku żelaza(III) 
i soli pierwiastków śladowych, a ich ChZT zwi ększono do ok. 750 mg/l 
dzięki podniesieniu st ężenia peptonu i ekstraktu mi ęsa. Zestawy dzia łały 
w cyklu 24-godzinnym: napowietrzanie przez 23 h, ubytek osadu, sedymen ­
tacja, usuwanie supernatantu (odp ływu) i dodanie ścieków syntetycznych 
z badaną substancj ą chemiczn ą, do 100 μg/l (tzn. mniej wi ęcej w tym 
samym st ężeniu co stosowane w badaniu krótkoterminowym). Raz 
w tygodniu 10 % ca łości osadu wymieniano na świeży osad w celu utrzy ­
mania równowagi populacji bakterii.  
4. Dokonuje si ę pomiarów st ężeń badanej substancji chemicznej na pocz ątku 
i końcu napowietrzania, a badanie prowadzi si ę do momentu, kiedy osi ąg­
nięte zostanie sta ły poziom usuwania badanej substancji chemicznej; 
zajmuje to od jednego tygodnia do kilku miesi ęcy. 
Badanie krótkoterminowe  
5. Badanie krótkoterminowe (trwaj ące ok. 8 godzin) stosuje si ę w celu 
określenia stałej szybko ści reakcji (pseudo)pierwszego rz ędu w odniesieniu 
do rozpadu badanej substancji chemicznej w osadzie czynnym o znanym, 
ale różnym pochodzeniu i historii. Próbki osadu pobierane s ą 
w szczególno ści z reaktorów SCAS – na koniec okresu napowietrzania, 
kiedy stężenie substratu organicznego jest niskie – w trakcie trwania 
eksperymentu aklimatyzacji (pkt 3, 4). Dla porównania osad mo że być 
również pobierany z równoleg łego zestawu SCAS bez badanej substancji  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
chemicznej. Mieszaniny osadu i badanej substancji chemicznej dodawane 
w co najmniej dwóch st ężeniach w zakresie 1–50 μg/l są napowietrzane, bez 
dodatku ścieków syntetycznych czy innych substratów organicznych. 
Badana substancja chemiczna pozostaj ąca w roztworze jest oznaczana 
w regularnych, np. godzinnych, odst ępach w oparciu o degradowalno ść 
substancji chemicznej, przez okres nie d łuższy niż 24 h. Przed w łaściwą 
analizą próbki s ą odwirowywane.  
Obliczenia  
6. Dane z zestawów SCAS s ą wykorzystywane do obliczenia warto ści 
procentowej usuni ęcia (pkt 54). Tak wi ęc średnią stałą szybkości reakcji, 
K 1 (normalizowan ą w odniesieniu do st ężeń zawiesin) mo żna obliczy ć z: 
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
gdzie:  
t = czas napowietrzania (23 h),  
C e = stężenie pod koniec etapu napowietrzania ( μg/l), 
C i = stężenie na pocz ątku etapu napowietrzania ( μg/l), 
SS = stężenie fazy sta łej osadu czynnego (g/l).  
7. W badaniu krótkoterminowym log % pozosta łego stężenia jest wykre ślany 
względem czasu, a nachylenie wst ępnej części (10–50 % degradacji) 
wykresu jest równowa żne K  1 , stałej szybko ści reakcji (pseudo)pierwszego 
rzędu. Stała jest normalizowana w odniesieniu do st ężenia fazy sta łej osadu 
poprzez podzielenie nachylenia przez st ężenie fazy sta łej. Podawany wynik 
musi równie ż obejmowa ć szczegó łowe informacje na temat wst ępnego 
stężenia badanej substancji chemicznej i zawiesin, czasu retencji osadu, 
podawania i źródła osadu, a tak że szczegó łowe informacje o wst ępnym 
narażeniu na dzia łanie badanej substancji chemicznej (o ile takie nara żenie 
miało miejsce).  
Zmienno ść wyników  
8. Zmienno ść i inne aspekty kinetyki biodegradacji omawiano podczas ostat ­
niego warsztatu SETAC (7). Dzi ęki takim badaniom, przeprowadzonym 
i planowanym, nied ługo możliwe będzie lepsze zrozumienie kinetyki 
w oczyszczalniach ścieków, co umo żliwi lepsz ą interpretacj ę istniejących 
badań oraz zasugeruje lepsze rozwi ązania w przysz łych metodach badaw ­
czych.  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A i Schultz 
B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. 
Biodegradability. Wat. Res. 26: 339–353.  
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, i Ostfeldt P (1993). 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505–1510.  
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality – Evalua ­
tion of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations in water.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP i Frimer-Larsen H (1996). 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851–864.
 
(5) Berg UT i Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711–735.  
(6) Agencja Ochrony Środowiska Danii. (1996). Activated sludge biodegradabi ­
lity simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Ministerstwo Środowiska i Energii, Kopenhaga.
 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Warsztat w Port Sunlight, UK. [red.] Hales SG, Feitjel T, 
King H, Fox K, i Verstraete W. 4–6.9.1996. SETAC-Europa, Bruksela.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmy  
WPROWADZENIE  
1. Badania symulacyjne zwykle stosuje si ę w przypadku chemikaliów, które 
nie przesz ły badania przesiewowego szybkiej biodegradowalno ści (rozdzia ł 
C.4 A do F niniejszego za łącznika (9)), przesz ły natomiast z powodzeniem 
badanie potencjalnej biodegradowalno ści. W drodze wyj ątku badania symu ­
lacyjne stosuje si ę także do każdej substancji chemicznej, o której trzeba 
uzyskać więcej informacji, zw łaszcza chemikaliów o du żej wielko ści obrotu. 
Wówczas zwykle stosuje si ę badanie osadu czynnego (C.10 A). 
W niektórych okoliczno ściach niezb ędne są jednak konkretne informacje 
dotyczące zachowania substancji chemicznej w odpowiedzi na zastosowanie 
metod oczyszczania ścieków wykorzystuj ących biofilmy czyli z łóż zrasza­
nych, obrotowych filtrów biologicznych, z łóż fluidalnych. Aby spe łnić to 
zapotrzebowanie, opracowano ró żne urządzenia.  
2. Gerike  et al . (1) w ramach projektów pilota żowych zastosowali na du żą 
skalę złoża zraszane, stosowane w trybie zespolonym. Z łoża te zajmowa ły 
dużo miejsca i wymaga ły stosunkowo du żych objętości ścieków lub 
ścieków syntetycznych. Truesdale  et al . (2) opisali mniejsze z łoża (ok. 1,8 
m × 15 cm średnicy), które zasilano ściekami naturalnymi wolnymi od 
środków powierzchniowo czynnych, wymagaj ące wciąż raczej du żych obję­
tości ścieków. A ż 14 tygodni zaj ął rozwój „dojrza łego” biofilmu, a po 
pierwszym wprowadzeniu poddanego badaniu środka powierzchniowo czyn ­
nego potrzeba by ło kolejnych 4-8 tygodni, by nast ąpiło przystosowanie.  
3. Baumann  et al.  (3) zaprojektowali znacznie mniejsze z łoże, w którym 
wykorzystali „we łnę” poliestrow ą zanurzon ą uprzednio w osadzie czynnym 
jako chemicznie oboj ętną pożywkę wspomagaj ącą biofilm. Substancja badana 
została zastosowana jako wy łączne źródło węgla, a biodegradowalno ść 
oceniano na podstawie pomiarów rozpuszczonego w ęgla organicznego (DOC) 
we wcieku i odp ływie oraz ilo ści CO  2 w gazie uchodz ącym.  
4. Gloyna  et al.  (4) zastosowali ca łkowicie inn ą metodę w wynalezionym przez 
nich obrotowym reaktorze rurowym. Na wewn ętrznej powierzchni obra ­
cającej się rury, nachylonej pod niewielkim k ątem w stosunku do poziomu, 
na znanej cz ęści powierzchni wywo łano przyrost biofilmu poprzez przep ływ 
wcieku wprowadzanego do rury od strony uniesionego ko ńca. Reaktor 
stosowano do badania biodegradowalno ści środków powierzchniowo czyn ­
nych (5), a tak że do badania optymalnej grubo ści biofilmu i rozproszenia 
przez biofilm (6). Wy żej wymienieni autorzy udoskonalili projekt reaktora, 
wprowadzaj ąc do niego zmian ę, dzięki której mo żna ustalić zawartość CO  2 
w gazie uchodz ącym.  
5. Obrotowy reaktor rurowy zosta ł przyjęty przez Sta ły Komitet Analityków 
(w Zjednoczonym Królestwie) jako standardowa metoda oceny zarówno biodegradowalno ści chemikaliów (7), jak i mo żliwości oczyszczenia 
ścieków oraz ich toksyczno ści (8). Opisana tu metoda ma liczne zalety, 
w tym: prostot ę, niewielki rozmiar, odtwarzalno ść oraz zapotrzebowanie 
na stosunkowo niewielkie ilo ści pożywki organicznej.
 
ZASADA BADANIA  
6. Na wewn ętrzną powierzchni ę wolno obracaj ącej się nachylonej rury podaje 
się ścieki domowe lub syntetyczne oraz badan ą substancj ę chemiczn ą, 
zawartą w mieszaninie lub osobno. Na wewn ętrznej powierzchni rury 
tworzy si ę warstewka drobnoustrojów podobnych do tych wyst ępujących 
w biofiltrach. Warunki dzia łania reaktora dobiera si ę pod kątem odpowied ­
niej eliminacji materii organicznej oraz, w miar ę potrzeby, utleniania 
amoniaku.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Odpływ z rury jest zbierany i osadzany albo filtrowany przed analiz ą pod 
kątem rozpuszczonego w ęgla organicznego (DOC) lub badanej substancji 
chemicznej okre śloną metodą. Zestawy kontrolne nieotrzymuj ące badanej 
substancji chemicznej dzia łają równolegle w tych samych warunkach dla 
celów porównania. Przyjmuje si ę, że różnica pomi ędzy stężeniami DOC 
w odpływach z zestawów badawczych i zestawów kontrolnych wynika 
z działania badanej substancji chemicznej lub jej organicznych metabolitów. 
Różnicę tę porównuje si ę ze stężeniem we wcieku wprowadzonej badanej 
substancji chemicznej (na podstawie DOC) w celu obliczenia poziomu 
eliminacji badanej substancji chemicznej.  
8. Biodegradacj ę można przewa żnie odróżnić od bioadsorpcji przez staranne 
badanie krzywej czasu eliminacji. Potwierdzenie uzyska ć można zazwyczaj 
poprzez zastosowanie badania szybkiej biodegradacji (pobór tlenu lub wytwarzanie dwutlenku w ęgla) z u życiem aklimatyzowanego inokulum 
pobranego na ko ńcu badania z reaktorów otrzymuj ących badan ą substancj ę 
chemiczn ą.
 
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ  
9. Właściwości badanej substancji chemicznej zwi ązane z czysto ścią, rozpusz­
czalnością w wodzie, lotno ścią i adsorpcj ą powinny by ć znane, tak aby 
możliwa była prawidłowa interpretacja wyników.  
10. Zwykle nie jest mo żliwe badanie lotnych ani s łaboro zpuszczalnych chemi ­
kaliów, chyba że podjęte zostan ą szczególne środki ostro żności (zob. 
dodatek 5 do rozdzia łu C.10 A). Nale ży również znać strukturę chemiczn ą, 
a przynajmniej wzór empiryczny, tak aby mo żna było obliczy ć wartości 
teoretyczne lub sprawdzi ć zmierzone warto ści parametrów, np. teoretyczne 
zapotrzebowanie na tlen (TZT) czy zawarto ść rozpuszczonego w ęgla 
organicznego (DOC).  
11. Informacje na temat toksyczno ści badanej substancji chemicznej dla mikro ­
organizmów (zob. dodatek 4 do rozdzia łu C.10 A) mog ą być bardzo 
użyteczne przy wyborze odpowiednich st ężeń do badania i mog ą być 
niezbędne dla prawid łowej interpretacji niskich warto ści biodegradacji.  
POZIOMY PROGOWE  
12. Pocz ątkowo wymagano, by biodegradacja pierwotna środków powierzch ­
niowo czynnych dochodzi ła do 80 % lub wi ęcej, nim substancja chemiczna 
mogła zostać wprowadzona do obrotu. Je śli poziom 80 % nie zostanie 
osiągnięty, można zastosowa ć badanie symulacyjne (potwierdzaj ące), 
a środek powierzchniowo czynny mo żna wprowadzi ć na rynek wy łącznie, 
jeśli ponad 90 % danej substancji chemicznej zostanie usuni ęte. Ogólnie 
w przypadku substancji chemicznych nie mówi si ę o przej ściu 
z powodzeniem/bez powodzenia badania, a uzyskana warto ść procentowa 
usunięcia może zostać wykorzystana w aproksymacji prawdopodobnego 
stężenia w środowisku stosowanej przy ocenach zagro żenia stwarzanego 
przez substancje chemiczne. W wielu badaniach czystych substancji 
chemicznych w przypadku ponad trzech czwartych substancji stwierdzono 
wartość procentow ą usunięcia DOC na poziomie > 90 %, a dla ponad 90 % 
substancji chemicznych, które wykazywa ły jakikolwiek znacz ący poziom 
biodegradowalno ści, wartość ta wynosi ła > 80 %.  
SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
13. Dla prawid łowego przeprowadzenia procedury do świadczalnej warto od 
czasu do czasu, wraz z substancjami badanymi, testowa ć substancje odnie ­
sienia, których zachowanie jest znane. Substancje takie to na przyk ład kwas 
adypinowy, 2-fenylofenol, 1-naftol, kwas 2,2’-bifenylodikarboksylowy, kwas 1-naftalenokarboksylowy.
 
ODTWARZALNO ŚĆ WYNIKÓW BADA Ń 
14. W laboratorium w Wielkiej Brytanii stwierdzono, że względne odchylenie 
standardowe w badaniach wynosi ło 3,5 %, a mi ędzy badaniami 5 % (7).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
OPIS METODY  
Przyrząd 
Obrotowe reaktory rurowe  
15. Przyrz ąd (zob. rysunki 1 i 2 w dodatku 8) sk łada się z baterii rur akrylo ­
wych o d ługości 30,5 cm ka żda i o średnicy wewn ętrznej 5 cm, opartych na 
kołach o gumowanych brzegach, umieszczonych w metalowej oprawie. 
Każda rura posiada ko łnierz zewn ętrzny o szeroko ści ok. 0,5 cm do 
podtrzymania jej na ko łach, jej powierzchnia wewn ętrzna jest zarysowana 
przy użyciu druciaka, od strony uniesionego ko ńca (służącego do podawania 
materiału doprowadzanego) rura wyposa żona jest w g łęboki na 0,5 cm 
kołnierz wewn ętrzny, służący do przytrzymania cieczy. Rury nachylone s ą 
pod kątem około jednego stopnia w stosunku do poziomu, aby uzyska ć czas 
potrzebny na kontakt ze stosowan ą w badaniu po żywką, wprowadzan ą do 
czystej rury. Gumowane ko ła obracają się napędzane silnikiem o powolnych 
obrotach zmiennej pr ędkości. Temperatura rur kontrolowana jest przez ich 
instalację w pomieszczeniu o sta łej temperaturze.  
16. Dzięki zamkni ęciu każdego reaktora rurowego w nieco wi ększej zamkni ętej 
rurze i uszczelnienie po łączeń przeciw wyciekom gazu, uchodz ący gaz CO  2 
można było zebrać w roztworze alkalicznym w celu jego dalszego pomiaru (6).  
17. Dobowy zapas po żywki organicznej, w stosownych przypadkach 
z dodatkiem badanej substancji chemicznej, przeznaczonej do podawania do każdej rury, umieszczono w 20-litrowym zbiorniku magazynuj ącym (A) 
(zob. rysunek 2). W miar ę potrzeby roztwór badanej substancji chemicznej 
może być dawkowany osobno. Przy dnie ka żdego zbiornika magazynuj ącego 
znajduje si ę ujście, które jest pod łączone przez odpowiednie z łączki, np. 
wykonane z gumy silikonowej, przez pomp ę perystaltyczn ą (B), do szklanej 
lub akrylowej rury doprowadzaj ącej, która wprowadzona jest na g łębokość 
2–4 cm do uniesionego ko ńca nachylonej rury (s łużącego do podawania 
materiału doprowadzanego) (C). Pozwala si ę, by odpływ skapywa ł ze znaj­
dujacego si ę niżej końca nachylonej rury do innego zbiornika 
magazynuj ącego (D). Odp ływ jest osadzany lub filtrowany przed analiz ą.
 
Przyrząd do filtrowania lub wirówka  
18. Urządzenie do filtrowania próbek z filtrami membranowymi o odpowiedniej 
porowatno ści (nominalna średnica otworu 0,45 μm), które adsorbuj ą orga­
niczne substancje chemiczne i uwalniaj ą węgiel organiczny w minimalnym 
stopniu. W przypadku stosowania filtrów uwalniaj ących węgiel organiczny 
należy zmyć filtry dok ładnie gor ącą wodą w celu usuni ęcia wymywalnego 
węgla organicznego. Alternatywnie mo żna zastosowa ć wirówkę mogącą 
osiągnąć 40 000 m/s  2 . 
19. Sprzęt do wykonywania analiz s łużący do oznaczenia:  
— zawarto ści rozpuszczonego w ęgla organicznego (DOC), ca łkowitego 
węgla organicznego (TOC) lub chemicznego zapotrzebowania na tlen 
(ChZT),  
— konkretnej substancji chemicznej (metod ą HPLC, GC itp.), o ile jest to 
konieczne,  
— pH, temperatury, kwasowo ści, zasadowo ści, 
— amonu, azotynu i azotanu, je śli badanie przeprowadzane jest 
w warunkach nitryfikacyjnych.  
Woda  
20. Woda wodoci ągowa, zawieraj ąca mniej ni ż 3 mg/l DOC.  
21. Woda destylowana lub dejonizowana, zawieraj ąca mniej ni ż 2 mg/l DOC.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
 
Pożywka organiczna  
22. Jako po żywkę organiczn ą można stosowa ć ścieki syntetyczne, ścieki 
domowe lub mieszanin ę obydwu ich rodzajów. Wykazano, że zastosowanie 
wyłącznie ścieków domowych cz ęsto skutkuje zwi ększonym odsetkiem 
usuniętego DOC (w zestawach osadu czynnego), a nawet umo żliwia biode ­
gradację niektórych substancji chemicznych, które nie ulegaj ą biodegradacji 
w przypadku zastosowania syntetycznych ścieków OECD. Dlatego te ż 
zaleca się stosowanie ścieków domowych. Nale ży zmierzy ć stężenie DOC 
lub ChZT w ka żdej nowej partii po żywki organicznej. Kwasowo ść lub 
zasadowo ść pożywki organicznej powinna by ć znana. Po żywka mo że 
wymagać dodania odpowiedniego bufora (wodorow ęglanu sodu lub wodo ­
rofosforanu potasu), je żeli jej poziom kwasowo ści lub zasadowo ści jest 
niski, w celu utrzymania pH w reaktorze w trakcie badania na poziomie ok. 7,5 ± 0,5. Ilo ść dodawanego bufora oraz moment jego dodania nale ży 
określić indywidualnie dla ka żdego przypadku.
 
Ścieki syntetyczne  
23. Rozpu ścić w każdym litrze wody wodoci ągowej: pepton, 160 mg; ekstrakt 
mięsa, 110 mg; mocznik, 30 mg; fosforan dwupotasowy bezwodny 
(K 2 HPO  4 ), 28 mg; chlorek sodu (NaCl), 7 mg; chlorek wapnia dwuwodny 
(CaCl  2 .2H  2 O), 4 mg; siarczan magnezu siedmiowodny (Mg  2 SO 4 .7H  2 O), 2 
mg. Ten ściek syntetyczny OECD stanowi przyk ład i daje średnie stężenie 
DOC we wcieku na poziomie ok. 100 mg/l. Alternatywnie mo żna wyko­
rzystać inne składy o zbli żonym stężeniu DOC, które bardziej odpowiadaj ą 
prawdziwym ściekom. Taki ściek syntetyczny mo żna przygotowa ć 
w wodzie destylowanej w postaci skoncentrowanej i przechowywa ć 
w temperaturze ok. 1 °C przez maksymalnie jeden tydzie ń. W razie 
potrzeby nale ży go rozcie ńczyć wodą wodociągową. (Ta pożywka nie jest 
satysfakcjonuj ąca, np. stężenie azotu jest bardzo wysokie, a zawarto ść węgla 
dość niska, ale nie zaproponowano niczego lepszego poza ewentualnym 
dodaniem wi ększej ilości fosforanu jako bufora i dodatkowego peptonu).  
Ścieki domowe  
24. Wykorzysta ć świeżo osadzone ścieki zbierane codziennie z oczyszczalni 
ścieków przyjmuj ącej głównie ścieki domowe. Ścieki powinny by ć zbierane 
przed wst ępną sedymentacj ą z przelewu wst ępnego osadnika lub z materia łu 
doprowadzanego do instalacji osadu czynnego i zasadniczo nie powinny zawierać cząsteczek gruboziarnistych. Ścieki można stosowa ć po przecho ­
wywaniu ich przez kilka dni w temperaturze ok. 4 °C, po sprawdzeniu, czy 
poziom DOC (lub ChZT) nie zmniejszy ł się znacząco (tzn. o mniej ni ż 
20 %) w trakcie przechowywania. Aby zmniejszy ć zakłócenia w uk ładzie, 
przed zastosowaniem nale ży skorygowa ć DOC (lub ChZT) ka żdej nowej 
partii do odpowiedniej sta łej wartości, np. poprzez rozcie ńczenie wod ą 
wodociągową.
 
Środek smarny  
25. Do smarowania rolek pompy perystaltycznej mo żna stosowa ć glicerynę lub 
oliwę z oliwek. Obie substancje nadaj ą się do użycia na rurkach z gumy 
silikonowej.  
Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej  
26. W przypadku substancji chemicznych o odpowiedniej rozpuszczalno ści 
przygotowa ć roztwory podstawowe o w łaściwych st ężeniach (np. 1 do 5 
g/l) w wodzie dejonizowanej lub w cz ęści mineralnej ścieków syntetycz ­
nych. W przypadku nierozpuszczalnych substancji chemicznych, zob. dodatek 5 rozdzia łu C.10-A. Bez wprowadzenia modyfikacji do reaktorów 
rurowych (zob. pkt 16) metoda ta nie nadaje si ę do lotnych substancji 
chemicznych. Oznaczy ć DOC i ca łkowity w ęgiel organiczny (TOC) 
roztworu podstawowego i powtórzy ć pomiary przy ka żdej nowej partii. 
Jeśli różnica pomi ędzy DOC a TOC jest wi ększa niż 20 %, sprawdzi ć 
rozpuszczalno ść badanej substancji chemicznej w wodzie. Porówna ć DOC 
lub stężenie badanej substancji chemicznej, mierzone z u życiem swoistej
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1100
 
metody analitycznej w roztworze podstawowym z warto ścią nominaln ą 
w celu stwierdzenia, czy odzysk jest wystarczaj ący (zwykle mo żna 
spodziewa ć się wartości > 90 %). Sprawdzi ć, w szczególno ści 
w przypadku dyspersji, czy mo żna wykorzysta ć DOC jako parametr anali ­
tyczny, czy te ż możliwe jest wy łącznie zastosowanie techniki analitycznej 
swoistej dla badanej substancji chemicznej. W przypadku dyspersji 
konieczne jest odwirowanie próbek. W ka żdej nowej partii zmierzy ć 
DOC, ChZT lub badan ą substancj ę chemiczn ą przy użyciu swoistej metody 
analitycznej.  
27. Okre ślić pH roztworu podstawowego. Warto ści krańcowe wskazuj ą, że 
dodanie substancji chemicznej mo że mieć wpływ na pH osadu czynnego 
w układzie badawczym. W takim przypadku w celu uzyskania pH 
o wartości 7 ± 0,5 nale ży zneutralizowa ć roztwór podstawowy, dodaj ąc 
niewielkie ilo ści kwasu nieorganicznego lub zasady, ale unikaj ąc strącania 
badanej substancji chemicznej.  
PROCEDURA  
Przygotowanie po żywki organicznej do dozowania  
28. Na pocz ątku i w trakcie trwania badania dopilnowa ć, by pojemniki na wciek 
i odpływ oraz rury prowadz ące ze zbiorników na wciek i do zbiorników na 
odpływ były dokładnie oczyszczone, aby usun ąć przyrost mikroorganiz ­
mów.  
29. Codziennie przygotowa ć świeże ścieki syntetyczne (pkt 23) z substancji 
stałych lub ze skoncentrowanego roztworu podstawowego przez odpo ­
wiednie rozcie ńczanie wod ą wodoci ągową. Mierzy ć potrzebn ą ilość 
w cylindrze i dodawa ć do czystego zbiornika na wciek. Do ścieków synte ­
tycznych przed rozcie ńczeniem nale ży także, w miar ę potrzeb, doda ć 
konieczną ilość roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej 
lub substancji odniesienia. W przypadku gdy jest to wygodniejsze lub 
niezbędne dla unikni ęcia strat badanej substancji chemicznej, przygotowa ć 
oddzielny rozcie ńczony roztwór badanej substancji chemicznej w osobnym 
zbiorniku i doprowadza ć go do nachylonych rur za po średnictwem innej 
pompy dozuj ącej. 
30. Alternatywnie, w miar ę możliwości, należy stosowa ć osadzone ścieki 
domowe (pkt 24) zbierane, o ile to mo żliwe, codziennie.  
Praca obrotowych reaktorów rurowych  
31. Do oceny jednej badanej substancji chemicznej potrzebne s ą dwa identyczne 
reaktory rurowe, instalowane w pomieszczeniu o sta łej temperaturze zwykle 
22 ± 2 °C.  
32. Pompy perystaltyczne nastawi ć na podawanie do nachylonych rur, obracaj ­ 
ących się z prędkością 18 ± 2 obr./min, po żywki organicznej w ilo ści 250 
± 25 ml/h (bez badanej substancji chemicznej). Do rur pompy stosowa ć na 
początku oraz regularnie w trakcie badania środek smarny (pkt 25), aby 
zapewnić właściwe dzia łanie i przed łużyć okres użytkowania rur.  
33. Dostosowa ć kąt nachylenia rur w stosunku do poziomu tak, by uzyska ć czas 
przebywania materia łu doprowadzanego w czystej rurze rz ędu 125 ± 12,5 sek. 
Oszacowa ć czas retencji przez dodanie do materia łu doprowadzanego markera 
niebiologicznego (np. NaCl, chemicznie oboj ętnego barwnika): przyjmuje si ę, 
że czas, jaki zajmuje osi ągnięcie najwy ższego stężenia w odp ływie, to średnia 
arytmetyczna czasu retencji (gdy wyst ępuje najgrubsza warstwa biofilmu, czas 
retencji mo że zwiększyć się do ok. 30 min).  
34. Stwierdzono, że te wspó łczynniki, pr ędkości i czasy daj ą odpowiedni 
poziom usuwania (> 80 %) DOC (lub ChZT) i wytwarzaj ą nitryfikowany 
odpływ. Jeśli poziom usuwania jest niewystarczaj ący lub jeśli ma być symu­
lowane dzia łanie konkretnej oczyszczalni ścieków, nale ży zmienić współ­
czynnik przep ływu. W tym drugim przypadku, dostosowa ć współczynnik 
dozowania po żywki organicznej do poziomu, przy jakim dzia łanie reaktora 
odpowiada dzia łaniu danej oczyszczalni ścieków.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1101
 
Inokulacja  
35. Gdy stosowane s ą ścieki syntetyczne, do zapocz ątkowania rozwoju mikro ­
organizmów mo że być wystarczaj ąca inokulacja drog ą powietrzn ą, w innym 
przypadku nale ży do materia łu doprowadzanego przez 3 dni dodawa ć 1 ml/l 
osadzonych ścieków.  
Pomiary  
36. Nale ży w regularnych odst ępach czasu sprawdza ć, czy dawki i pr ędkość 
obrotowa mieszcz ą się w wymaganych granicach. Nale ży także mierzy ć 
pH w odp ływie, w szczególno ści gdy spodziewana jest nitryfikacja.  
Pobieranie próbek i analiza  
37. Metod ę, schemat i cz ęstotliwość pobierania próbek dobiera si ę tak, by by ły 
odpowiednie dla celu badania. Przyk ładowo nale ży pobrać jednorazow ą 
próbkę wcieku i odp ływu lub pobiera ć próbki przez d łuższy okres np. 
3–6 godzin. W pierwszym okresie, bez badanej substancji chemicznej, pobierać próbki dwa razy w tygodniu. Próbki nale ży przefiltrowa ć przez 
membran ę lub odwirowa ć przy ok. 40 000 m/sek
 2 przez oko ło 15 min 
(pkt 18). Przed filtrowaniem przez membran ę może być konieczne 
osadzenie lub przefiltrowanie próbek przez filtr dla cz ąstek grubych. Ozna ­
czyć DOC (lub ChZT) co najmniej w duplikacie oraz w miar ę konieczno ści 
biologiczne zapotrzebowanie na tlen (BZT), amon, azotyn i azotan.  
38. Wszystkie analizy nale ży przeprowadza ć jak najszybciej po zebraniu 
i przygotowaniu próbek. Je śli analizy musz ą zostać odroczone, próbki 
należy przechowywa ć w temperaturze ok. 4 °C w ciemno ści, w pełnych 
i szczelnie zamkni ętych butelkach. Je śli próbki musz ą być przechowywane 
przez ponad 48 h, nale ży zabezpieczy ć je przez g łębokie mro żenie, zakwa ­
szenie lub dodanie odpowiedniej substancji toksycznej (np. 20 ml/l roztworu chlorku rt ęci(II) o st ężeniu 10 g/l). Zadba ć, by technika zabezpieczenia nie 
miała wpływu na wyniki analizy.
 
Okres rozruchu  
39. W tym okresie biofilm na powierzchni przyrasta, by osi ągnąć optymaln ą 
grubość, co zwykle zajmuje oko ło 2 tygodnie i raczej nie przekracza 6 
tygodni. Poziom usuni ętego DOC (lub ChZT) ro śnie (pkt 44) i osi ąga 
wartość plateau. Gdy osi ągnięte zostaje plateau o podobnej warto ści 
w obu rurach, jedna wybierana jest jako próbka kontrolna na pozosta ły 
czas badania, w którym ich dzia łanie powinno pozostawa ć zbliżone. 
Wprowadzenie badanej substancji chemicznej  
40. Na tym etapie doda ć badaną substancj ę chemiczn ą do drugiego reaktora 
w pożądanym st ężeniu, zwykle 10–20 mg C/l. W próbie kontrolnej podaje 
się nadal sam ą pożywkę organiczn ą. 
Okres przystosowania  
41. Kontynuowa ć dokonywanie analiz DOC (lub ChZT) dwa razy w tygodniu, 
a jeśli ma by ć oceniona biodegradowalno ść pierwotna, mierzy ć także 
stężenie badanej substancji chemicznej z u życiem swoistej metody analitycz ­
nej. Po wprowadzeniu po raz pierwszy badanej substancji chemicznej nale ży 
przewidzie ć okres od jednego do sze ściu tygodni (lub d łużej 
w szczególnych warunkach) na przystosowanie. W przypadku gdy procent 
usunięcia badanej substancji (pkt 43-45) osi ąga maksymaln ą wartość, należy 
uzyskać 12–15 wa żnych warto ści z fazy plateau przez okres oko ło 3 tygodni 
w celu oceny średniej procentowej warto ści usunięcia. Badanie uznaje si ę za 
ukończone, jeśli osiągnięty zostaje odpowiednio wysoki poziom eliminacji. 
Nie należy zwykle przekracza ć 12 tygodni trwania badania po dodaniu 
badanej substancji chemicznej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Usuwanie biofilmu  
42. Wzgl ędnie regularnie nast ępuje nagłe usunięcie z rur, czy te ż złuszczanie 
się, nadmiaru filmu. W celu dopilnowania, by pozosta ło to bez wp ływu na 
porównywalno ść wyników, nale ży przewidzie ć co najmniej dwa pe łne cykle 
przyrastania i z łuszczania si ę. 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Opracowanie wyników  
43. Obliczy ć wartość procentow ą eliminacji DOC (lub ChZT) badanej 
substancji chemicznej w odniesieniu do ka żdej oceny w czasie, stosuj ąc 
równanie:  
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
gdzie:  
D t = procentowa eliminacja DOC (lub ChZT) w czasie t,  
Cs = stężenie DOC (lub ChZT) we wcieku w wyniku dzia łania badanej 
substacji chemicznej, najlepiej oszacowane ze st ężenia oraz dodanej 
objętości roztworu podstawowego (mg/l),  
E = mierzona warto ść DOC (lub ChZT) w badanym odp ływie w czasie 
t (mg/l),  
Eo = mierzona warto ść DOC (lub ChZT) w odp ływie kontrolnym w czasie 
t (mg/l).  
Obliczenia powtórzy ć dla substancji odniesienia, je śli jest badana.  
Działanie reaktora kontrolnego  
44. Stopie ń eliminacji (D  B ) DOC (lub ChZT) po żywki organicznej w reaktorach 
kontrolnych stanowi przydatn ą informacj ę przy ocenie biodegraduj ącego 
działania biofilmu w trakcie badania. Obliczy ć wartość procentow ą elimi­
nacji z równania:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
gdzie:  
Cm = DOC (lub ChZT) po żywki organicznej we wcieku kontrolnym 
(mg/l).  
45. Obliczy ć usunięcie (D  ST ) badanej substancji chemicznej, je śli je mierzono, 
przy użyciu właściwej metody analitycznej przy ka żdej ocenie w czasie, 
z równania:  
DST ¼ 100 ð1 Ä Se=SiÞ % 
gdzie:  
Si = mierzone lub, w miar ę możliwości, szacowane st ężenie badanej 
substancji chemicznej we wcieku badanym (mg/l),  
Se = mierzone st ężenie badanej substancji chemicznej we wcieku kontro ­
lnym w czasie t (mg/l).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Jeśli metoda analityczna daje pozytywn ą wartość w nieskorygowanym 
równoważniku ścieków do S  c mg/l, obliczy ć wartość procentow ą usunięcia 
(D SC ) z: 
DSC ¼ 100 ðSi Ä Se þ ScÞ=ðSi þ ScÞ % 
Prezentacja wyników badania  
46. Przedstawi ć w postaci wykresu warto ść procentow ą eliminacji D  t i D ST (lub 
D SC ), jeśli jest dost ępna, w stosunku do czasu (zob. dodatek 2 rozdzia łu 
C.10-A). Jako procentow ą wartość usunięcia badanej substancji chemicznej 
przyjąć średnią arytmetyczn ą (przedstawion ą jako najbli ższą liczbę całko­
witą) i odchylenie standardowe 12-15 warto ści dla D  T (oraz dla D  ST , jeśli 
jest dostępna) uzyskanych w fazie plateau. Z kszta łtu krzywej eliminacji 
można wysnu ć wnioski dotycz ące procesów usuwania.  
Adsorpcja  
47. Jeśli na pocz ątku badania obserwuje si ę wysoką eliminacj ę DOC, badana 
substancja chemiczna jest prawdopodobnie eliminowana przez adsorpcj ę na 
biofilm. Mo żliwe jest udowodnienie tego poprzez oznaczenie adsorbowanej 
badanej substancji chemicznej w z łuszczonych substancjach sta łych 
biofilmu. Wysoki poziom eliminacji DOC adsorbowalnych substancji 
chemicznych podczas ca łego badania nie jest typowy; zazwyczaj na 
początku występuje wysoki poziom usuwania, który nast ępnie spada do 
równomiernego poziomu. Je śli jednak adsorbowana badana substancja 
chemiczna spowodowa ła przystosowanie populacji mikroorganizmów, elimi ­
nacja DOC badanej substancji chemicznej zwi ększyłaby się w następstwie 
i osiągnęła wysoki poziom plateau.  
Faza zastoju  
48. Tak samo jak w przypadku statycznych bada ń przesiewowych, wiele bada ­
nych substancji chemicznych wymaga fazy zastoju przed wyst ąpieniem 
pełnej biodegradacji. W fazie zastoju nast ępuje przystosowanie (lub adapta ­
cja) bakterii odpowiadaj ących za rozk ład przy jednoczesnym prawie ca łko­
witym braku usuwania badanej substancji chemicznej; nast ępnie nast ępuje 
wstępny przyrost tych bakterii. Zak łada się, że ta faza ko ńczy się, a zaczyna 
faza degradacji, kiedy nast ępuje usuni ęcie ok. 10 % wst ępnej ilości badanej 
substancji chemicznej (po adsorpcji, o ile takowa wyst ąpi). Faza zastoju jest 
często bardzo zmienna i s łabo odtwarzalna.  
Faza plateau  
49. Faza plateau na krzywej eliminacji w te ście ciągłym definiowana jest jako ta 
faza, w której nast ępuje najwi ększa degradacja. Faza plateau powinna trwa ć 
co najmniej 3 tygodnie i nale ży w jej trakcie dokona ć około 12–15 wa żnych 
pomiarów warto ści. 
Średni stopie ń eliminacji badanej substancji chemicznej  
50. Obliczy ć średnią wartość z warto ści eliminacji D  t (oraz D  st , jeśli jest 
dostępna) badanej substancji chemicznej w fazie plateau. W zaokr ągleniu 
do najbli ższej liczby ca łkowitej (1 %) stanowi ona stopie ń eliminacji 
badanej substancji chemicznej. Zaleca si ę również obliczenie 95 % prze ­
działu ufności średniej warto ści. W podobny sposób obliczy ć średni stopie ń 
eliminacji (D  B ) pożywki organicznej w naczyniu kontrolnym.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Wskazanie biodegradacji  
51. Jeśli badana substancja chemiczna nie adsorbuje w znacz ącym stopniu na 
biofilmie, a krzywa eliminacji ma typowy kszta łt krzywej biodegradacji 
z fazami zastoju, degradacji i plateau (ust. 48, 49), zmierzon ą eliminacj ę 
można bezpiecznie przypisa ć do biodegradacji. Je śli zaszło znaczne wst ępne 
usuwanie, badanie symulacyjne nie pozwala na dokonanie rozró żnienia 
między procesami eliminacji biologicznej i abiotycznej. W takich przypad ­
kach oraz w innych przypadkach, gdy wyst ępuje wątpliwość dotycząca 
biodegradacji (np. ma miejsce odpadanie biofilmu) nale ży zanalizowa ć 
badaną substancj ę chemiczn ą w próbkach filmu lub przeprowadzi ć dodat­
kowe statyczne badania (przesiewowe) biodegradowalno ści w oparciu 
o parametry jasno wskazuj ące na procesy biologiczne. Takie badania to 
testy poboru tlenu (rozdzia ł C.4 niniejszego za łącznika D, E i F) (9) lub 
badanie, które mierzy wytwarzanie CO  2 (rozdział C.4-C niniejszego 
załącznika dotycz ący metody pomiaru dwutlenku w ęgla w przestrzeni nad 
roztworem) (10); jako inokulum nale ży zastosowa ć biofilm z odpowiedniego 
reaktora, uprzednio poddany dzia łaniu badanej substancji chemicznej.  
52. Jeśli zmierzono zarówno warto ść usuwania DOC, jak i usuwania konkretnej 
substancji chemicznej, znacz ące różnice (ta pierwsza ni ższa od tej drugiej) 
między usuni ętymi warto ściami procentowymi wskazuj ą na obecno ść 
w odpływie półproduktów produktów organicznych, które mog ą być trudne 
do rozłożenia i nale ży je zbada ć. 
Ważność wyników badania  
53. Badanie nale ży uznać za ważne, jeśli stopień eliminacji DOC (lub ChZT) 
(D B ) w zestawach kontrolnych wynosi > 80 % pod dwóch tygodniach dzia ­ 
łania i nie poczyniono obserwacji nietypowych.  
54. Jeśli badano szybko biodegradowaln ą substancj ę chemiczn ą (odniesienia), 
stopień biodegradacji powinien wynosi ć > 90 %, a ró żnica między 
wartościami w duplikatach nie powinna wynosi ć więcej niż 5 %. Jeśli te 
dwa kryteria nie s ą spełnione, dokona ć przeglądu procedur do świadczalnych 
i pozyska ć ścieki domowe z innego źródła. 
55. Podobnie ró żnice między warto ściami biodegradacji z zestawów stanowi ą­
cych duplikaty (je śli są stosowane), poddawanych dzia łaniu badanej 
substancji chemicznej, nie powinny wynosi ć więcej niż 5 %. Jeśli to kryte ­
rium nie jest spe łnione, ale poziom usuwania jest wysoki, prowadzi ć analizę 
przez kolejne trzy tygodnie. Je śli poziom usuwania jest niski, zbada ć 
hamujący wpływ badanej substancji chemicznej, je śli nie jest znany, 
i powtórzy ć badanie przy ni ższym stężeniu badanej substancji chemicznej, 
jeśli to możliwe.  
Sprawozdanie z badania  
56. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć co najmniej nast ępujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— dane identyfikacyjne,  
— cechy fizyczne oraz w stosownych przypadkach w łaściwości fizykoche ­
miczne.  
Warunki badania  
— wszelkie zmiany uk ładu badawczego, zw łaszcza jeśli badane s ą nieroz­
puszczalne lub lotne substancje chemiczne,  
— rodzaj po żywki organicznej,  
— proporcja i charakter odpadów przemys łowych w ściekach, je śli są 
wykorzystywane i znane,  
— metoda inokulacji,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— zawarto ść DOC (rozpuszczonego w ęgla organicznego) i TOC (ca łkowi­
tego węgla organicznego) w roztworze podstawowym badanej substancji 
chemicznej; sposób przygotowania, w przypadku zawiesiny; stosowane stężenia badanej substancji chemicznej, poda ć powody, je śli wykraczaj ą 
poza zakres 10-20 mg/l DOC; metoda podania; data pierwszego poda ­
nia; wszelkie zmiany w st ężeniu,
 
— średni hydrauliczny czas zatrzymania (przy braku przyrostu); pr ędkość 
obrotowa rury; w miar ę możliwoście przybli żony kąt nachylenia,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące złuszczania si ę; czas i nat ężenie,  
— temperatura badania i zakres,  
— stosowane techniki analityczne.  
Wyniki badania  
— w stosownych przypadkach wszelkie dane z pomiarów DOC, ChZT, 
specyficzne analizy, pH, temperatura, substancje chemiczne N,  
— dane z wylicze ń D t (lub D  tc ), D  B , D s uzyskane w postaci tabeli i krzywe 
eliminacji,  
— informacje o fazach zastoju i plateau, czas trwania badania, stopie ń 
eliminacji badanej substancji chemicznej, substancji odniesienia (je śli 
jest badana) i po żywki organicznej (w zestawie kontrolnym) wraz 
z danymi statystycznymi i stwierdzeniami dotycz ącymi biodegradowal ­
ności i ważności badania,  
— omówienie wyników.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations 
in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. 
Res. 14: 753–758.  
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic deter ­
gents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441–444.
 
(3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung 
zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umwelt ­
chem. Ökotox. 10: 214-220.  
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental 
trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355–1357.  
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional tric ­
kling filter. JAOCS 43: 92–94.  
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by 
films of micro-organisms. Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865–881.  
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, 
Londyn.  
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984). Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, Londyn.
 
(9) Rozdzia ł C.4 niniejszego za łącznika: Oznaczanie szybkiej biodegradowal ­
ności A–F.  
(10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Dodatek 8  
Rysunek 1  
Rury obrotowe
  
Glosariusz:  
Widok z góry:  
Widok A/B  
Koła napędzane  
Koła pośredniczące 
Silnik nap ędowy  
Przekładnia redukcyjna  
Kołnierz wewn ętrzny  
Mechanizm przechy łowy 
Napęd za pomoc ą przekładni stożkowej  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Rysunek 2  
Schemat przep ływu
 
A: Zbiornik materia łu doprowadzanego  
B: Pompa perystaltyczna  
C: Rurka obrotowa  
D: Naczynie do zbierania odp ływu 
DEFINICJE  
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana za 
pomocą niniejszej metody badawczej.  
Chemikalia:  „Należy zauważyć, że termin »chemikalia« jest szeroko stosowany 
w porozumieniach UNCED i dokumentach powi ązanych dla uwzgl ędnienia 
substancji, produktów, mieszanin, preparatów i wszelkich innych terminów, które mog ą być stosowane w istniej ących systemach, by wskaza ć cały zakres”.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIODEGRADACJA  
BADANIE HAMOWANIA ODDYCHANIA AKTYWOWANYCH SZLAMÓW  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Opisana metoda ocenia skutki wp ływu substancji testowej na drob ­
noustroje, przez dokonywanie pomiaru stopnia oddychania w określonych warunkach w obecno ści różnych stężeń substancji 
testowej.
 
Celem tej metody jest dostarczenie bardzo szybkiej metody bada ń, 
za pomoc ą której mo żna zidentyfikowa ć związki, które mog ą mieć 
niekorzystny wp ływ na flor ę bakterii aerobowych oczyszczalni, oraz 
wskazać odpowiednie, nieinhibuj ące stężenia substancji testowych, 
które maj ą być użyte w testach biodegradowalno ści. 
Badanie ustalania wielko ści stężeń może poprzedza ć badanie osta ­
teczne. Dostarcza ono informacji dotycz ących zakresu wielko ści 
stężeń mających być zastosowanymi w badaniu g łównym.  
Do projektu badania nale ży włączyć dwie grupy kontrolne bez 
substancji testowej, jedn ą w chwili rozpocz ęcia badania i drug ą po 
zakończeniu serii bada ń. Należy skontrolowa ć każdą partię aktywo­
wanego szlamu, u żywając substancji odniesienia.  
Niniejsza metoda łatwo stosuje si ę do substancji, które ze wzgl ędu 
na ich rozpuszczalno ść w wodzie i nisk ą lotność mogą pozostać 
w wodzie.  
W odniesieniu do substancji o ograniczonej rozpuszczalno ści 
w badanym środku ustalenie EC  50 może okazać się niemożliwe 
Wyniki oparte na wch łanianiu tlenu mog ą doprowadzi ć do błędnych 
wniosków w przypadku, gdy substancja testowa ma sk łonność do 
rozszczepiania fosforylacji oksydacyjnej.  
Przydatne jest posiadanie nast ępujących informacji w celu przepro ­
wadzenia badania:  
— rozpuszczalno ść w wodzie,  
— ciśnienie pary,  
— wzór strukturalny,  
— czysto ść substancji testowej.  
Zalecenie  
Aktywowany szlam mo że zawiera ć potencjalne organizmy chorobo ­
twórcze i nale ży się z nim obchodzi ć ostrożnie. 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Wskaźnik oddychania jest to zu życie tlenowe drobnoustrojów ście­
kowych w szlamie tlenowym, ogólnie wyra żane jako mg O  2 na mg 
szlamu na godzin ę. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
W celu dokonania oblicze ń hamującego wpływu substancji testowej 
przy danym st ężeniu wska źnik oddychania wyra żony jest jako 
procent średniej z dwóch kontrolnych wska źników oddychania.  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
× 100 = procent zahamowania  
gdzie:  
R s = wskaźnik zużycia tlenu przy badanym st ężeniu substancji 
testowej,  
R c1 = wskaźnik zużycia tlenu, grupa kontrolna 1,  
R c2 = wskaźnik zużycia tlenu, grupa kontrolna 2.  
W niniejszej metodzie EC  50 jest stężeniem substancji testowej, przy 
którym wska źnik oddychania wynosi 50 % wska źnika wykazanego 
w grupie kontrolnej w warunkach opisanych w niniejszej metodzie.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Zaleca się użycie 3,5-dichlorofenolu, znanego inhibitora oddychania, 
jako substancji odniesienia i przeprowadzenie badania w celu usta ­
lenia EC  50 każdej partii aktywowanego szlamu jako środek 
kontrolny w celu oznaczenia nieprawid łowości w czu łości szlamu.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Wskaźnik oddychania aktywowanego szlamu zasilonego standar ­
dową ilością ścieku syntetycznego mierzony jest po up ływie kontak ­
towego czasu 30 minut lub trzech godzin, lub po up ływie tych 
okresów czasu łącznie. Dokonuje si ę także pomiaru wska źnika oddy ­
chania tego samego aktywowanego szlamu w obecno ści różnych 
stężeń substancji testowej w odmiennych warunkach. Hamuj ący 
wpływ substancji testowej o danym st ężeniu jest wyra żony jako 
procent średnich wska źników oddychania z dwóch grup kontrolnych. 
Wartość EC  50 obliczana jest z ustale ń różnych stężeń. 
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Wyniki badania s ą ważne, jeżeli: 
— wskaźniki oddychania dwóch grup kontrolnych wynosz ą 15 % 
dla każdej z nich,  
— warto ść EC  50 (30 minut i/lub trzy godziny) 3,5-dichlorofenolu 
mieści się w zakresie 5–30 mg/litr.  
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.6.1.  Odczynniki  
1.6.1.1. R o z t w o r y s u b s t a n c j i t e s t o w e j  
Roztwory substancji testowej s ą przygotowywane w chwili 
rozpoczęcia bada ń z wykorzystaniem roztworu podstawowego. 
Stężenie roztworu podstawowego w wysoko ści 0,5 g/litr jest 
właściwe w przypadku stosowania ni żej zalecanej procedury.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. R o z t w ó r s u b s t a n c j i k o n t r o l n e j  
Roztwór 3,5-dichlorofenolu mo żna przygotowa ć na przyk ład przez 
rozpuszczenie 0,5 g 3,5-dichlorofenolu w 10 ml 1 M NaOH, rozcie ń­
czając w oko ło 30 ml wody destylowanej, dodaj ąc podczas 
mieszania 0,5 M H  2 SO 4 do punktu pocz ątkowego opadu – na koniec 
wymagane jest oko ło 8 ml 0,5 M H  2 SO 4 – a następnie nale ży 
rozcieńczyć mieszanin ę wodą destylowan ą do jednego litra. Warto ść 
pH powinna wówczas wynosi ć 7–8.  
1.6.1.3. Ś c i e k i s y n t e t y c z n e  
Syntetyczn ą pożywkę dla mikroflory ścieku aktywowanego otrzy ­
muje się przez rozpuszczenie nast ępujących ilo ści substancji 
w jednym litrze wody:  
— 16 g pepton,  
— 11 g ekstrakt mi ęsa, 
— 3 g mocznik,  
— 0,7 g NaCl,  
— 0,4 g CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g K  2 HPO  4 . 
Uwaga 1:  Niniejszy ściek syntetyczny jest 100-krotnym koncen ­
tratem w porównaniu z koncentratem opisanym w Raporcie tech ­
nicznym OECD „Proponowana metoda okre ślania biodegradacji 
środków powierzchniowo czynnych stosowanych w syntetycznych 
detergentach” (11 czerwca 1976 r.), z dodatkiem ortofosforanu dipo ­
tasu. 
Uwaga 2:  Jeżeli przygotowany środek nie zostanie niezw łocznie 
zastosowany, nale ży go przechowywa ć bez dost ępu światła 
w temperaturze 0–4  o C, przez okres nie d łuższy niż jeden tydzie ń, 
w warunkach, które nie spowoduj ą żadnej zmiany w jego sk ładzie. 
Środek mo żna równie ż wysterylizowa ć przed przechowaniem lub 
można dodać pepton i ekstrakt mi ęsa tuż przed rozpocz ęciem bada ­
nia. Przed u życiem nale ży go dok ładnie zmiesza ć i dostosowa ć pH. 
1.6.2.  Urz ądzenia  
Urządzenia pomiarowe: dok ładny projekt nie jest istotny. Jednak że 
powinna by ć przestrze ń u góry naczynia, a sonda powinna by ć 
ciasno dopasowana w szyjce kolby pomiarowej.  
Wymagany jest zwyk ły sprzęt laboratoryjny, w szczególno ści nastę­
pujące urządzenia:  
— urządzenia pomiarowe,  
— urządzenie napowietrzaj ące, 
— elektroda pH i urz ądzenia pomiarowe,  
— elektroda O  2 . 
1.6.3.  Przygotowanie inokulum  
Aktywowany szlam pochodz ący z oczyszczalni ścieków 
w przewa żającej mierze oczyszczaj ącej ścieki wewn ętrzne stosowany 
jest w badaniu jako mikrobiologiczne inokulum.  
Jeżeli konieczne, po powrocie do laboratorium gruboziarniste 
cząsteczki mo żna usunąć przez osadzanie przez krótki okres czasu, 
np. 15 minut, i przelanie górnej warstwy drobniejszej suchej masy 
w celu jej u życia. Alternatywnie, szlam mo żna zmiesza ć przez okres 
kilku sekund, wykorzystuj ąc mikser.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Ponadto w przypadku podejrzenia wyst ępowania materia łu hamują­
cego szlam nale ży umyć bieżącą wodą lub roztworem izotonicznym. 
Po odwirowaniu nale ży przelać supernatant (procedur ę powtarza si ę 
trzy razy).  
Niewielką ilość szlamu nale ży zważyć i osuszy ć. Na podstawie 
wyniku mo żna obliczy ć ilość mokrego szlamu, która ma by ć zawie­
szona w wodzie w celu uzyskania aktywowanego szlamu o warto ści 
płynnej zawieszonej suchej masy wynosz ącej 2–4 g/litr. Niniejszy 
poziom daje st ężenie między 0,8 a 1,6 g/litr w badanej substancji, 
jeżeli przestrzegana jest ni żej zalecana procedura.  
Jeżeli szlamu nie mo żna użyć w dniu jego zebrania, nale ży dodać 
50 ml syntetycznego ścieku do ka żdego litra aktywowanego szlamu 
przygotowanego w sposób opisany powy żej; następnie nale ży go 
napowietrza ć przez ca łą noc w temperaturze 20 ± 2  o C. Napowiet ­
rzanie nale ży stosowa ć aż do chwili jego u życia w dniu nast ępnym. 
Przed użyciem nale ży sprawdzi ć i dostosowa ć pH, jeżeli jest to 
konieczne, do warto ści pH 6–8. P łynną zawieszon ą suchą masę 
należy ustalić w sposób okre ślony w poprzednim ust ępie. 
Jeżeli wymagane jest u życie tej samej partii szlamu w kolejnych 
dniach badania (maksymalnie przez cztery dni), nale ży dodać kolejne 
50 ml syntetycznej po żywki dla mikroflory ścieku aktywowanego na 
litr szlamu po zako ńczeniu ka żdego dnia roboczego.  
1.6.4.  Przeprowadzenie badania  
Czas trwania/czas 
kontaktu: 30 minut i/lub trzy godziny, podczas 
którego przeprowadzane jest napowiet ­
rzanie 
Woda: Woda pitna (odchlorowana w razie 
konieczno ści) 
Dostarczenie powietrza: Czyste, bezoleiste powietrze. Strumie ń 
powietrza 0,5–1 litr/minuta 
Aparatura pomiarowa: Kolba o p łaskim dnie taka jak kolba 
BOD 
Tlenomierz: Odpowiednia elektroda tlenowa, 
z rejestratorem 
Pożywka: Ścieki syntetyczne (zob. powy żej) 
Substancja testowa: Substancja testowa jest świeżo przygo­
towywana przed rozpocz ęciem badania. 
Substancje odniesienia: np. 3,5-dichlorofenol (co najmniej trzy 
stężenia) 
Kontrole: Zaszczepiona próbka bez substancji 
testowej 
Temperatura: 20 ± 2  o C. 
Poniżej podano sugerowan ą procedur ę doświadczaln ą, którą można 
zastosowa ć zarówno w badaniu, jak i do substancji odniesienia 
w trzygodzinnym czasie kontaktu.  
Należy użyć kilka zbiorników (np. jednolitrowe zlewki).  
Należy użyć co najmniej pi ęć wielkości stężeń, rozmieszczonych 
o stały czynnik najlepiej nieprzekraczaj ący 3,2.  
W czasie „0” 16 ml syntetycznej po żywki dla mikroflory ścieku 
aktywowanego uzupe łniane jest wod ą do objętości 300 ml. Nale ży 
dodać 200 ml inokulum bakteryjnego, a ca łą mieszanin ę (500 ml) 
wlać do pierwszego zbiornika (pierwsza grupa kontrolna C  1 ). ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Zbiorniki testowe nale ży stale napowietrza ć w celu zapewnienia, że 
rozpuszczony O  2 nie opadnie poni żej wartości 2,5 mg/litr i że 
bezpośrednio przed pomiarem wska źnika oddychania st ężenie O  2 
wyniesie oko ło 6,5 mg/litr.  
Po „15 minutach” (15 minut stanowi bezwzgl ędny, ale wygodny 
przedział czasowy) powy ższa procedura jest powtarzana, 
z wyjątkiem 100 ml podstawowego roztworu substancji testowej, 
które dodaje si ę do 16 ml syntetycznego ścieku przed dodaniem 
wody do 300 ml i inokulum bakteryjnego w celu uzyskania obj ętości 
500 ml. Nast ępnie mieszanina ta jest wlewana do drugiego zbiornika 
i napowietrzana w sposób opisany powy żej. Proces powtarzany jest 
w 15-minutowych przedzia łach czasu z ró żnymi wielko ściami 
podstawowego roztworu substancji testowej celem uzyskania serii zbiorników zawieraj ących różne stężenia substancji testowej. Na 
końcu przygotowuje si ę drugą grupę kontroln ą (C
 2 ). 
Po upływie trzech godzin odnotowuje si ę pH oraz wlewa si ę dobrze 
zmieszaną próbkę pobraną z zawarto ści pierwszego zbiornika do 
urządzeń pomiarowych i dokonuje si ę pomiaru wska źnika oddy ­
chania przez czas do 10 minut.  
Oznaczenie to powtarza si ę w odniesieniu do ka żdego zbiornika 
w 15-minutowych odst ępach w taki sposób, aby czas kontaktu 
w każdym zbiorniku wynosi ł trzy godziny.  
Substancja odniesienia badana jest dla ka żdej partii inokulum bakte ­
ryjnego wed ług tej samej procedury.  
W przypadku dokonywania pomiarów po 30 minutach kontaktu 
wymagany jest odmienny re żym (np. wi ęcej niż jeden tlenomierz).  
Jeżeli konieczny jest pomiar chemicznego zu życia tlenu, nale ży 
przygotowa ć kolejne zbiorniki zawieraj ące substancj ę testową, synte­
tyczną pożywkę dla mikroflory ścieku aktywowanego oraz wod ę, ale 
bez aktywnego szlamu. Nale ży zmierzy ć i odnotowa ć zużycie tlenu 
po 30-minutowym okresie napowietrzania i/lub trzech godzinach (czas kontaktu).
 
2. DANE I OSZACOWANIE  
Wskaźnik oddychania obliczany jest na podstawie historii zapisów 
między około 6,5 mg O  2 /litr a 2,5 mg O  2 /litr lub przez okres 
10 minut, gdzie wska źnik oddychania jest niski. Odcinek krzywej 
oddychania, powy żej którego nast ępuje pomiar wska źnika oddy ­
chania powinien by ć linearny.  
Jeżeli wskaźniki oddychania z dwóch grup kontrolnych nie zawieraj ą 
się w 15 % warto ści każdego z nich lub warto ść EC  50 (30 minut 
i/lub trzy godziny) substancji odniesienia nie zawiera si ę 
w przyjętym przedziale (5–30 mg/litr dla 3,5-dichlorofenolu), 
badanie jest niewa żne i musi zosta ć powtórzone.  
Procent zahamowania obliczany jest dla ka żdej badanej wielko ści 
stężenia (zob. 1.2). Procent zahamowania nanoszony jest na wykres 
względem stężenia na papierze logarytmicznym (lub papierze 
półlogarytmicznym) i uzyskanej warto ści EC  50 . 
95 % limit potwierdzenia dla warto ści EC  50 może zostać ustalony 
przez procedury standardowe.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— dane identyfikacyjne chemicznej substancji testowej,  
— system badania: źródło, stężenie i wst ępne poddanie aktywnego 
szlamu dzia łaniu substancji testowej,  
— warunki badania:  
— pH mieszaniny reakcji przed pomiarem oddychania,  
— temperatura badania,  
— czas trwania badania,  
— substancje odniesienia i pomiar ich EC  50 , 
— pobór abiotycznego tlenu (je żeli dotyczy).  
— wyniki:  
— jakiekolwiek dane pomiarowe,  
— krzywa zahamowania i metoda obliczania EC  50 , 
— EC  50 i, jeżeli to mo żliwe, 95 % limitów pewno ści, EC  20 
i EC  30 , 
— jakiekolwiek uwagi i odst ępstwa od metody badawczej, które 
mogły wpłynąć na wyniki.  
3.2. INTERPRETACJA DANYCH  
Wartość EC  50 należy interpretowa ć jedynie jako wskazówk ę do 
prawdopodobnej toksyczno ści substancji testowej zarówno dla dzia ­ 
łania na ścieki aktywowanym szlamem, jak i dla mikroorganizmów 
występujących w ściekach, poniewa ż złożone wzajemne oddzia ły­
wania zachodz ące w środowisku nie mog ą być odpowiednio stymu ­
lowane podczas badania laboratoryjnego. Ponadto substancje 
testowe, które mog ą hamująco wpływać na utlenianie amoniaku, 
mogą równie ż powodowa ć nietypowe krzywe zahamowania. 
W związku z tym takie krzywe nale ży interpretowa ć z ostrożnością. 
4. ODNIESIENIA  
(1) Międzynarodowy standard ISO 8192-1986.  
(2) Broecker, B., Zahn, R.,  Badania wody  11, 1977, s. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L.,  Chemosfera  10, 1981, s. 
245. 
(4) ETAD (Ekologiczne i Toksykologiczne Stowarzyszenie Prze ­
mysłu Przetwórczego Substancji Barwi ących),  Zalecana Metoda 
nr 103 , również opisana przez:  
(5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, 1976, s. 80.  
(6) Schefer, W., Textilveredlung 6, 1977, s. 247.  
(7) OECD, Pary ż, 1981,  Wytyczne Badania 209 , decyzja Rady 
C (81) 30 wersja ostateczna.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIODEGRADACJA  
ZMODYFIKOWANE BADANIE SCAS  
1. METODA  
1.1. WST ĘP 
Celem metody jest ocena wp ływu całkowitej biodegradacji rozpusz ­
czalnych w wodzie, nielotnych substancji organicznych, w przypadku ich ekspozycji na stosunkowo wysokie st ężenia drob ­
noustrojów przez d ługi okres czasu. Żywotność drobnoustrojów 
utrzymywana jest przez ten okres, codziennie dodaj ąc zasiedlon ą 
pożywkę szlamow ą. (Odnośnie do wymogów zwi ązanych z przerw ą 
weekendow ą, ścieki mo żna przechowywa ć w temperaturze 4
 o C. 
W związku z tym mo żna użyć syntetycznych ścieków (test potwier ­
dzający OECD).  
Może mieć miejsce fizyczna i chemiczna adsorpcja zawieszonych 
substancji sta łych, co nale ży wziąć pod uwag ę przy interpretacji 
wyników (zob. 3.2).  
Z powodu d ługiego okresu zatrzymania fazy p łynnej (36 godzin) 
i nieregularnego dodawania od żywek badanie nie pozoruje faktycz ­
nych warunków wyst ępujących w oczyszczalni ścieków. Wyniki 
otrzymane z ró żnymi substancjami testowymi oznaczaj ą, iż badanie 
wykazuje wysoki wp ływ biodegradacyjny.  
Warunki stworzone w badaniu wysoce sprzyjaj ą wyborowi i/lub 
przystosowaniu drobnoustrojów zdolnych do degradacji badanego 
związku. (Procedur ę można równie ż wykorzysta ć w celu wytwo ­
rzenia zaaklimatyzowanego inokulum mog ącego być zastosowanym 
w innych badaniach).  
W metodzie tej pomiar st ężenia rozwi ązanego w ęgla organicznego 
lub chemicznego zapotrzebowania tlenu wykorzystywany jest 
w celu okre ślenia całkowitej biodegradacji substancji testowej. 
Najlepiej ustala ć DOC po zakwaszeniu i oczyszczeniu ni ż jako 
różnicę C całkowite  – C  nieorganiczne  . 
Równoczesne zastosowanie szczególnej metody analitycznej mo że 
umożliwić ocenę podstawowej biodegradacji substancji (zanik pier ­
wotnej budowy chemicznej).  
Metodę stosuje si ę jedynie w odniesieniu do tych organicznych 
substancji testowych, które przy wielko ści stężenia użytego 
w badaniu:  
— są rozpuszczalne w wodzie (przy co najmniej 20 ml rozpusz ­
czonego w ęgla organicznego/litr),  
— posiadaj ą nieznaczne ci śnienie pary,  
— nie hamuj ą bakterii,  
— nie są znacznie absorbowane w badanym systemie,  
— nie s ą tracone w wyniku wytwarzania piany z badanego 
roztworu.  
Należy ustalić zawartość węgla w organicznym materiale testowym.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
Informacje dotycz ące względnych części składowych materia łu testo­
wego będą użyteczne przy interpretacji otrzymanych wyników, 
w szczególno ści w tych przypadkach gdzie wyniki s ą na niskim 
poziomie lub marginalne.  
Informacje dotycz ące wpływu toksyczno ści substancji na drobnou ­
stroje mog ą okazać się użyteczne w celu dokonania interpretacji 
słabych wyników oraz wyboru w łaściwych wielko ści stężeń. 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
C T = stężenie testowego zwi ązku jako w ęgla organicznego obec ­
nego w lub dodawanego do osadzonego ścieku na pocz ątku 
czasu napowietrzania (mg/litr),  
C t = stężenie rozwi ązanego w ęgla organicznego w supernatanie 
substancji testowej na ko ńcu czasu napowietrzania (mg/litr),  
C c = stężenie rozwi ązanego w ęgla organicznego w supernatanie 
w grupie kontrolnej na ko ńcu czasu napowietrzania (mg/litr).  
W metodzie tej biodegradacja okre ślana jest jako zanik w ęgla orga­
nicznego. Biodegradacj ę można wyrazi ć jako:  
1. Procent ubytku D  da ilości substancji dodawanej codziennie:  
D da ¼ C t Ä ðC t Ä C c Þ 
C t Ü 100  [1] 
gdzie:  
D da = degradacja/dzienna dawka dodana  
2. Procent ubytku D  ssd ilości substancji obecnej przy rozpocz ęciu 
każdego dnia badania:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2 (a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100  [2(b)]  
gdzie:  
D ssd = degradacja/substancja przy rozpocz ęciu każdego dnia;  
wskaźniki i oraz (i + 1) odnosz ą się do dnia pomiaru.  
Zaleca się równanie 2a) w przypadku, gdy ciecz wyp ływająca ze 
zbiornika DOC ró żni się z dnia na dzie ń, podczas gdy równanie 
2b) można zastosowa ć w przypadku, gdy ciecz wyp ływająca ze 
zbiornika DOC pozostaje na wzgl ędnie sta łym poziomie 
w kolejnych dniach.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
W niektórych przypadkach podczas badania nowych substancji 
użyteczne mog ą okazać się substancje odniesienia; jednak że nie 
można zalecić żadnych poszczególnych substancji odniesienia.  
Dane dotycz ące kilku zwi ązków chemicznych przeanalizowanych za 
pomocą prób pier ścieniowych dostarczane s ą głównie w celu prze ­
prowadzenia (zob. dodatek 1) kalibracji metody odpowiednio do 
potrzeb i umo żliwienia dokonania porównania wyników 
w przypadku zastosowania innej metody.  
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Aktywowany szlam, pochodz ący z oczyszczalni ścieków, umiesz ­
czany jest w jednostce dzia łającej na zasadzie szlamu aktywowanego 
o przepływie półstałym (SCAS). Nast ępnie dodawany jest badany 
związek oraz wewn ętrzne ścieki, po czym nast ępuje napowietrzanie 
mieszaniny przez 23 godziny. Po 23 godzinach napowietrzanie 
zostaje przerwane w celu umo żliwienia osadzenia si ę szlamu 
i ubytku supernatantów.  
Następnie szlam pozosta ły w komorze napowietrzania jest mieszany 
z dalszą podwielokrotno ścią badanego zwi ązku i ścieku, a cykl jest 
powtarzany.  
Biodegradacja ustalana jest przez okre ślenie zawarto ści rozwiąza­
nego węgla organicznego w supernatancie. Uzyskana warto ść porów­
nywana jest z warto ścią ustaloną dla płynu otrzymanego z probówki 
kontrolnej dozowanej jedynie osiad łym ściekiem.  
W przypadku u życia szczególnej metody analitycznej mo żna 
dokonać pomiaru zmian w st ężeniu pierwotnej moleku ły w wyniku 
biodegradacji (podstawowa biodegradacja).  
1.5. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
Reprodukcyjno ść metody, oparta na ubytku rozwi ązanego w ęgla 
organicznego, nie zosta ła jeszcze ustalona. (W przypadku rozwa żania 
podstawowej biodegadacji bardzo dok ładne dane uzyskiwane s ą 
w odniesieniu do materia łów degradowanych ekstensywnie).  
Czułość metody jest przewa żnie ustalana przez zmienno ść próbki 
ślepej i, w mniejszym stopniu, przez precyzj ę określenia rozwi ąza­
nego węgla organicznego i poziomu badanego zwi ązku w roztworze 
po rozpocz ęciu każdego cyklu.  
1.6. OPIS PROCEDURY BADAWCZEJ  
1.6.1.  Przygotowania  
Dla każdej substancji testowej oraz grup kontrolnych sk ładana jest 
odpowiednia liczba czystych napowietrzanych jednostek, ewen ­
tualnie mo żna zastosowa ć oryginalne, 1,5-litrowe jednostki 
badawcze SCAS oraz probówki doprowadzaj ące powietrze (rysunek 
1). Sprężone powietrze doprowadzane do jednostek testowych, 
oczyszczone przez bawe łniano-wełniany filtr, nie powinno zawiera ć 
węgla organicznego oraz powinno zosta ć nasycone wod ą w celu 
obniżenia jej ubytku wskutek parowania.  
Próbka zmieszanego p łynu, zawieraj ąca 1–4 g zawieszonej suchej 
masy na litr, otrzymywana jest z oczyszczalni ścieków, oczysz ­
czającej w g łównej mierze ścieki wewn ętrzne. Wymagane jest 
około 150 ml zmieszanego p łynu dla ka żdej napowietrzanej jedno ­
stki. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Roztwory podstawowe substancji testowej przygotowywane s ą 
w wodzie destylowanej; wymagana warto ść stężenia zazwyczaj 
wynosi 400 mg/litr, tak jak w ęgiel organiczny, którego st ężenie 
substancji testowej wynosi 20 mg/litr w ęgla na pocz ątku każdego 
cyklu napowietrzania, je żeli nie zachodzi biodegradacja.  
Dopuszczane s ą wyższe stężenia, jeżeli pozwala na to wp ływ 
toksyczno ści na drobnoustroje.  
Skład węgla organicznego roztworów podstawowych podlega pomia ­
rowi.  
1.6.2.  Warunki badania  
Badanie nale ży przeprowadzi ć w temperaturze 20–25  o C. 
Stosowane jest wysokie st ężenie drobnoustrojów tlenowych (1–4 g/litr 
zawieszonej suchej masy), a skuteczny okres zatrzymania wynosi 36 godzin. Materia ł zawieraj ący węgiel w po żywce szlamowej jest 
rozlegle utleniany, zazwyczaj w ci ągu ośmiu godzin od rozpocz ęcia 
każdego cyklu napowietrzania. Od tego czasu szlam oddycha endoge ­
nicznie przez pozosta ły czas napowietrzania, w którym jedyny 
dostępny substrat stanowi zwi ązek testowy, je żeli równie ż nie ulega 
łatwej metabolizacji. Cechy te, po łączone z codziennym szczepieniem 
substancją testową, w przypadku zastosowania wewn ętrznego ścieku 
jako pożywki, zapewniaj ą wysoce korzystne warunki zarówno dla 
aklimatyzacji, jak i dla wysokiego stopnia biodegradacji.
 
1.6.3.  Przeprowadzenie badania  
Próbka zmieszanego p łynu pochodz ąca z oczyszczalni ścieków, 
oczyszczaj ącej w głównej mierze ścieki wewn ętrzne lub jednostki 
laboratoryjnej, uzyskiwana jest i utrzymywana w warunkach tleno ­
wych aż do chwili jej u życia w laboratorium. Ka żda napowietrzana 
jednostka, a tak że jednostka kontrolna wype łniana jest 150 ml zmie ­
szanego p łynu (w przypadku u życia oryginalnej jednostki testowej 
SCAS nale ży pomnożyć dane wielko ści przez 10) i rozpoczyna si ę 
napowietrzanie. Po 23 godzinach napowietrzanie zostaje przerwane na 45 minut, w celu umo żliwienia osadzenia si ę szlamu. Z kolei 
należy otworzy ć zawór ka żdego zbiornika i pobra ć 100 ml porcj ę 
supernatanu. Próbka osiad łego ścieku wewn ętrznego powinna zosta ć 
pobrana bezpo średnio przed jej u życiem i 100 ml dodawane jest do 
szlamu pozostaj ącego w ka żdej napowietrzanej jednostce. Proces 
napowietrzania rozpoczyna si ę od nowa. W tej fazie nie s ą dodawane 
żadne materia ły testowe, a jednostki zasilane s ą codziennie 
wyłącznie wewn ętrznymi ściekami a
ż do chwili otrzymania czystego 
supernatanu po osadzeniu. Powy ższa faza zazwyczaj trwa dwa 
tygodnie, podczas których rozwi ązany w ęgiel organiczny 
w supernatanie zbli ża się do stałej wartości na ko ńcu każdego 
cyklu napowietrzania.  
Po upływie tego okresu poszczególne osadzone szlamy nale ży zmie­
szać i dodać 50 ml otrzymanego w ten sposób po łączonego szlamu 
do każdej jednostki.  
95 ml osadzonego ścieku i 5 ml wody dodawane jest do jednostek 
kontrolnych, i 95 ml osadzonego ścieku plus 5 ml w łaściwego 
roztworu podstawowego badanego zwi ązku (400 mg/litr) dodawane 
jest do jednostek testowych. Napowietrzanie nale ży rozpocz ąć od 
nowa i kontynuowa ć przez 23 godziny. Nast ępnie nale ży umożliwić 
osadzenie si ę szlamu przez okres 45 minut oraz nale ży ściągnąć 
i przeanalizowa ć supernatan w celu ustalenia sk ładu rozwi ązanego 
węgla organicznego.  
Powyższą procedur ę napełniania i ściągania powtarza si ę codziennie 
przez cały okres trwania badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Przed osadzeniem konieczne jest oczyszczenie ścian jednostek 
w celu zapobie żenia nagromadzania si ę suchej masy ponad poziom 
płynu. W tym celu nale ży użyć oddzielnego skrobaka lub szczotki 
dla każdej z jednostek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzy żowemu.  
Najlepiej, aby warto ść rozwiązanego w ęgla organicznego 
w supernatanie ustalana by ła codziennie, chocia ż dopuszcza si ę 
rzadsze przeprowadzanie analiz. Przed przeprowadzeniem analiz 
płyny filtrowane s ą przez oczyszczone 0,45 μm filtry membranowe 
lub odwirowywane. Filtry membranowe s ą odpowiednie je żeli 
zostanie potwierdzone, i ż nie uwalniaj ą węgla, ani nie absorbuj ą 
substancji w fazie filtracji. Temperatura próbki nie mo że przekracza ć 
40 o C w chwili umieszczenia jej w wirówce laboratoryjnej.  
Długość trwania badania w odniesieniu do zwi ązków wykazuj ących 
niską lub zerow ą biodegradacj ę nie jest okre ślona, ale do świadczenie 
sugeruje, i ż taki okres powinien trwa ć co najmniej 12 tygodni, ale 
nie dłużej niż 26 tygodni.  
2. DANE I OSZACOWANIE  
Wartości rozwi ązanego w ęgla organicznego w supernatanach 
w jednostkach testowych i jednostkach kontrolnych nanoszone s ą 
na wykres wzgl ędem czasu.  
W przypadku osi ągnięcia biodegradacji jej poziom okre ślony 
w jednostce badawczej zbli ży się do poziomu w jednostce kontro ­
lnej. Po ustaleniu sta łej różnicy między dwoma poziomami w trzech 
kolejnych pomiarach liczba kolejnych pomiarów uzale żniona jest od 
możliwości dokonania statystycznej analizy danych oraz nale ży obli­
czyć procentow ą biodegradacj ę związku testowego (D  da lub D  ssd , 
zob. 1.2).  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń powinno, je żeli możliwe, zawiera ć nastę­
pujące informacje:  
— wszelkie informacje dotycz ące rodzaju ścieku, typu zastosowanej 
jednostki oraz wyniki badania dotycz ące substancji testowej, 
substancji odniesienia, je żeli została użyta, oraz próbki ślepej,  
— temperatura,  
— krzywa ubytku zwi ązku wraz z opisem, sposób obliczania (zob. 1.2),  
— data i lokalizacja pobrania próbki aktywowanego szlamu 
i ścieku, poziom przystosowania, st ężenie itd.,  
— naukowe powody jakichkolwiek zmian procedury badawczej,  
— data i podpis.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Ponieważ substancja przeznaczona do badania niniejsz ą metodą nie 
będzie ulega ć łatwej biodegradacji, jakikolwiek ubytek DOC spowo ­
dowany wy łącznie biodegradacj ą przebiega ć będzie stopniowo 
w okresie dni i tygodni, z wyj ątkiem takich przypadków, gdzie 
aklimatyzacja jest nag ła i zasygnalizowana nag łym znikni ęciem 
substancji nast ępującym po okresie kilku tygodni.  
Jednakże fizyko-chemiczna adsorpcja mo że w niektórych przypad ­
kach odegra ć istotną rolę; sygnalizowane jest to w chwili gdy nast ę­
puje całkowity lub cz ęściowy ubytek dodanego DOC na pocz ątku 
badania. To, co nast ępuje później, zale ży od czynników, takich jak 
stopnie adsorpcji i st ężenia zawieszonej suchej masy w odrzuconej 
cieczy wyp ływającej ze zbiornika. Zwykle ró żnica między stęże­
niami DOC w supernatanach w grupie kontrolnej i w grupie badanej stopniowo wzrasta od pocz ątkowej niskiej warto ści, a nast ępnie 
utrzymuje si ę na nowym poziomie warto ści w pozosta łym okresie 
badania, je żeli nie zachodzi aklimatyzacja.
 
Konieczne jest przeprowadzenie dalszych bada ń, jeżeli istnieje 
potrzeba rozró żnienia mi ędzy biodegradacj ą (lub częściową biode­
gradacją) i adsorpcj ą. Można to osi ągnąć na wiele sposobów, ale 
najbardziej przekonuj ące jest u życie supernatantu lub szlamu jako 
inokulum w te ście podstawowym (najlepiej te ście respirometrycz ­
nym).  
Substancje testowe powoduj ące wysoki, nieadsorpcyjny ubytek DOC 
w niniejszym badaniu nale ży uważać za substancje wp ływające 
biodegradacyjnie. Cz ęściowy, nieadsorpcyjny ubytek oznacza, że 
substancja chemiczna ulega co najmniej nieznacznej biodegradacji.  
Niski, lub zerowy poziom ubytku DOC mo że być spowodowany 
zahamowaniem aktywno ści drobnoustrojów przez substancj ę 
testową, co można równie ż wykryć przez rozpad lub utrat ę szlamu, 
dającego mętne supernatany. Badanie nale ży powtórzy ć, wykorzys ­
tując niskie st ężenie substancji testowej.  
Użycie specyficznej dla danego zwi ązku metody analitycznej lub 
substancji testowej znakowanej izotopem w ęgla 14 C zwiększa 
czułość metody. W przypadku zwi ązków znakowanych  14 C odzys­
kanie  14 CO 2 potwierdzi, że zaszła biodegradacja.  
W przypadku podawania wyników z uwzgl ędnieniem pocz ątkowej 
biodegradacji, je żeli możliwe, nale ży wyjaśnić zmianę w budowie 
chemicznej, która powoduje utrat ę reakcji macierzystej substancji 
testowej.  
Zatwierdzenie metody analitycznej musi by ć dostarczone razem 
z reakcją, która zasz ła w próbce ślepej.  
4. ODNIESIENIA  
(1) OECD, Pary ż, 1981,  Wytyczne badania 209 , decyzja Rady 
C (81) 30 wersja ostateczna.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Dodatek 1  
Badanie SCAS: przyk ładowe wyniki  
Substancja C T 
(mg/l) C t – C  c 
(mg/l) Procentowa 
biodegradacja, 
D da Czas trwania 
badania 
(dni) 
Sulfonian 4-acetyloaminobenzenu 17,2 2,0 85 40 
Sulfonian tetrapropylenobenzenu 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 
Glikol dietylenowy 16,5 0,2 98,8 40 
Anilina 16,9 1,7 95,9 40 Cyklopentanotetrakarboksylan 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Dodatek 2  
Przykładowe urz ądzenia badawcze
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOKONCENTRACJA: BADANIE RYB W WARUNKACH 
PRZEPŁYWU  
1. METODA  
Ta metoda biokoncentracji jest powtórzeniem OECD WT 305 
(1996).  
1.1. WPROWADZENIE  
Metoda ta opisuje procedur ę charakteryzowania biokoncentracyjnego 
potencjału substancji znajduj ących się w rybach w warunkach prze ­
pływu. Chocia ż preferuje si ę bardziej wymogi obowi ązujące dla 
badań w warunkach przep ływu, dopuszczalne s ą wymogi obowi ­ 
ązujące dla bada ń w warunkach cz ęściowo statycznych, pod warun ­
kiem że spełnione są kryteria prawid łowości. 
Metoda podaje wystarczaj ące szczegó ły dla przeprowadzenia bada ­
nia, jednocze śnie zezwalaj ąc na stosown ą dowolno ść 
w dostosowywaniu procedury do świadczalnej do warunków 
w poszczególnych laboratoriach oraz na zró żnicowane w łaściwości 
substancji badanych. Jest ona najbardziej prawid łowo stosowana 
w odniesieniu do chemikaliów organicznych o warto ściach log P  ow 
między 1,5 i 6,0 (1), ale mo że być także stosowana do substancji 
superlipofilowych (o warto ści log P  ow > 6,0). Wst ępne oszacowanie 
czynnika biokoncentracji (BCF), czasami oznaczanego jako KB, dla takich substancji b ędzie prawdopodobnie wy ższe niż wartość czyn­
nika biokoncentracji w stanie ustalonym (BCF
 SS ), które spodziewa 
się uzyskać w doświadczeniach laboratoryjnych. Wst ępne oszaco ­
wania czynnika biokoncentracji dla chemikaliów organicznych o wartościach log P
 ow wynoszących oko ło 9,0 mo żna uzyska ć, 
stosując równanie Binteina i inne (2). Parametry, które charaktery ­
zują potencja ł biokoncentracji, zawieraj ą stałą szybkość absorpcji 
(k 1 ), stałą szybkość oczyszczania (k  2 ) oraz BCF  SS . 
Substancje badane oznakowane radiologicznie mog ą ułatwić analizę 
próbek wody i ryb oraz mog ą być wykorzystywane do okre ślania, 
czy konieczne jest wykonanie identyfikacji i kwantyfikacji degrada ­
cji. Jeżeli mierzony jest ogó ł pozostałości radioaktywnych (np. przez 
spalanie lub rozpuszczanie tkanki), BCF jest oparte na zwi ązku 
macierzystym, wszelkich zatrzymanych metabolitach, a tak że na 
asymilowanym w ęglu. Z tego wzgl ędu BCFS, oparty na ogóle 
pozostałości radioaktywnych, nie mo że być bezpośrednio porówny ­
walny z BCF uzyskiwanym w drodze szczegó łowej analizy 
chemicznej wy łącznie zwi ązku macierzystego.  
W badaniach substancji oznaczonych radiologicznie mo żna zasto­
sować procedury oczyszczania w celu okre ślenia czynnika BCF 
w oparciu o zwi ązek macierzysty i, je żeli uzna si ę to za konieczne, 
można opisać główne metabolity. Mo żliwe jest tak że połączenie 
badania metabolizmu ryb z badaniem biokoncentracji poprzez analizę i identyfikacje pozosta łości w tkankach.
 
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Biokoncentracja/bioakumulacja: jest wzrostem koncentracji substancji 
badanej w organizmie lub na nim (jego okre ślonych tkankach), 
w stosunku do koncentracji substancji badanej w otaczaj ącym środo­
wisku.  
Czynnik biokoncentracji (BCF lub K  B ) w każdym momencie 
w trakcie fazy absorpcji tego badania akumulacji jest st ężeniem 
substancji badanej w/na rybie lub w jej okre ślonych tkankach (C  f 
jako μg/g (ppm)), podzielone przez koncentracj ę tej substancji 
chemicznej w otaczaj ącym środowisku (C  w jako μg/ml (ppm)).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
Stały czynnik biokoncentracji (BCF  SS lub K  B ) nie zmienia si ę 
znacząco w długim okresie czasu, st ężenie substancji badanej 
w otaczaj ącym środowisku w tym okresie czasu jest stale.  
Plateau lub stan ustalony osi ągany jest, wykre ślając ilość substancji 
badanej w rybach (C  f ) w zależności od momentu, kiedy krzywa staje 
się równoleg ła do osi czasu, a trzy nast ępujące po sobie analizy C  f , 
wykonane na próbkach pobranych w odst ępach, co najmniej dwóch 
dni, różnią się od siebie o ± 20 % i nie ma znacznych ró żnic między 
trzema okresami pobierania próbek. Przy wspólnej analizie próbek 
wymagane s ą przynajmniej cztery nast ępujące po sobie analizy. 
W odniesieniu do substancji badanych, które s ą pobierane powoli, 
odstępy czasu powinny wynosi ć odpwiednio siedem dni.  
Czynniki biokoncentracji, obliczane bezpo średnio ze sta łych 
wskaźników kinetycznych (k  1 /k 2 ), określane są jako czynniki 
koncentracji kinetycznej, BCF  K . 
Współczynnik podzia łu oktanol-woda (P  ow ) jest to stosunek rozpusz ­
czalności substancji chemicznej w n-oktanolu i wodzie 
w równowadze (metoda A.8), wyra żany także jako K  ow . Logarytm 
P ow wykorzystywany jest jako wska źnik zdolno ści substancji 
chemicznej do biokoncentracji przez organizmy wodne.  
Faza nara żenia na dzia łanie substancji j absorpcji jest to czas, 
w trakcie którego ryby nara żone są na działanie badanej substancji 
chemicznej.  
Stała szybko ść absorpcji (k  1 ) jest warto ścią liczbow ą określającą 
tempo wzrostu koncentracji substancji badanej w rybach i na nich 
(lub w nich czy ich okre ślonych tkankach) w czasie gdy ryby wysta ­
wione są na działanie tej substancji (k  1 wyraża się w dniach  -1 ). 
Faza po nara żeniu na dzia łanie substancji/oczyszczania (ubytku) jest 
to czas nast ępujący po przeniesieniu ryb ze środowiska zawieraj ą­
cego substancje do środowiska wolnego od tej substancji, w trakcie 
którego badane jest oczyszczanie (lub ich okre ślonych tkanek) 
z substancji (ubytek netto).  
Stała szybko ść oczyszczania (ubytku) (k  2 ) jest warto ścią liczbową 
określającą tempo zmniejszania koncentracji substancji badanej 
w badanych rybach (lub ich okre ślonych tkankach) po przeniesieniu 
badanych ryb ze środowiska zawieraj ącego substancje badan ą do 
środowiska wolnego od tej substancji (k  2 wyrażana jest w dniach  -1 ). 
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Badanie sk łada się z dwóch faz: faza nara żenia na dzia łanie 
substancji (absorpcja) i faza po nara żeniu na dzia łanie substancji 
(oczyszczania). Podczas fazy absorpcji oddzielne grupy ryb jednego 
gatunku nara żone są na działanie substancji badanej o co najmniej 
dwóch ró żnych stężeniach. Nast ępnie ryby przenosi si ę do środo­
wiska wolnego od substancji badanej w celu przeprowadzenia fazy 
oczyszczania. Faza oczyszczania jest zawsze konieczna, chyba że 
absorpcja substancji podczas fazy absorpcji jest nieznaczna (np. czynnik BCF jest mniejszy ni ż 10). Stężenie substancji badanej 
w/na rybach (lub w ich okre ślonych tkankach) śledzi się w obu 
fazach badania. Oprócz dwóch bada ń stężeń substancji badanej, 
kontrolowan ą grupę ryb przetrzymuje si ę w identycznych warun ­
kach, z wyj ątkiem obecno ści substancji badanej, w celu odniesienia 
możliwych negatywnych skutków zaobserwowanych w badaniu 
biokoncentracji do odpowiedniej grupy kontrolowanej oraz w celu 
uzyskania bazowych st ężeń substancji badanej.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
Faza absorpcji trwa 28 dni, je żeli nie wyka że się, że równowaga 
została osiągnięta wcześniej. Przewidywany czas trwania fazy absor ­
pcji i czas osi ągnięcia stanu ustalonego mo żna obliczy ć w oparciu 
o równanie podane w za łączniku 3. Nast ępnie rozpoczyna si ę okres 
oczyszczania przez przeniesienie ryb do takiego samego środowiska, 
ale bez substancji badanej w innym czystym naczyniu. W miar ę 
możliwości czynnik biokoncentracji oblicza si ę zarówno jako 
stosunek (BCF  SS ) stężenia w rybach (C  f ) i w wodzie (C  w ) 
w pozornym stanie ustalonym, jak te ż jako kinetyczny czynnik 
biokoncentracji (BCF  K ), będący stosunkiem sta łych szybko ści absor­
pcji (k  1 ) i oczyszczania (k  2 ), uznając kinetyk ę reakcji pierwszego 
rzędu. Jeżeli kinetyka reakcji pierwszego rz ędu jest w oczywisty 
sposób nieprzestrzegana, nale ży zastosowa ć bardziej z łożone wzory 
(załącznik 5).  
Jeżeli stanu ustalonego nie osi ągnie się w ciągu 28 dni, faz ę absor­
pcji należy przedłużyć do czasu osi ągnięcia stanu ustalonego lub do 
60 dni, w zale żności od tego, co nast ąpi najpierw; nast ępnie 
rozpoczyna si ę fazę oczyszczania.  
Stała szybko ść absorpcji, sta ła szybko ść reakcji (lub sta łe 
w przypadku gdy zastosowane s ą bardziej z łożone wzory) oczysz ­
czania (ubytku), czynnik biokoncentracji oraz, w miar ę możliwości, 
przedziały ufności dla ka żdego z tych parametrów oblicza si ę 
w oparciu o wzór, który najlepiej opisuje mierzone st ężenia 
substancji badanej w rybach i wodzie.  
BCF wyra ża się jako funkcje ca łkowitej mokrej masy ryb. Jednak że 
do szczególnych celów mo żna wykorzysta ć określone tkanki lub 
organy (np. mi ęsnie, wątroba), je żeli ryby s ą wystarczaj ąco duże, 
lub podzieli ć ryby na cz ęści jadalne (filet) i niejadalne (wn ętrzności). 
Ze względu na to, że w odniesieniu do wielu substancji organicz ­
nych istnieje wyra źny związek między zdolno ścią do biokoncentracji 
i lipofilowo ści, istnieje tak że odpowiadaj ąca mu zale żność między 
zawartością lipidów w rybach i zaobserwowan ą biokoncentracj ą 
takich substancji. Dlatego w celu zmniejszenia tego źródła zróżnico­
wania w wynikach badania dla substancji o wysokiej lipofilowosci 
(tj. o log P  ow > 3) biokoncentracja powinna by ć wyrażona 
w odniesieniu do zawarto ści lipidów oprócz ca łkowitej masy cia ła. 
Zawartość lipidów powinna by ć określana na takim samym materiale 
biologicznym, jaki jest wykorzystywany dla okre ślania substancji 
badanej, je żeli jest to mo żliwe.  
1.4. INFORMACJE DOTYCZ ĄCE SUBSTANCJI BADANEJ  
Przed przeprowadzaniem badania na biokoncentracj ę powinny by ć 
znane nast ępujące informacje dotycz ące substancji badanej:  
— rozpuszczalno ść w wodzie,  
— współczynnik podzia łu oktanol-woda P  ow (oznaczany tak że jako 
K ow ustalany za pomoc ą metody HPLC w A.8),  
— hydroliza,  
— fotodysocjacja w wodzie, okre ślana w warunkach napromienio ­
wania s łonecznego lub symulowanym napromienianiu 
słonecznym i w warunkach napromieniania badania na biokon ­
centracji (3),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
— napięcie powierzchniowe (np. dla substancji, dla których nie 
można ustalić log P  ow ), 
— prężność pary,  
— biodegradalno ść inicjalna (je żeli dotyczy).  
Inną wymagan ą informacj ą jest toksyczno ść dla ryb, które maj ą być 
wykorzystywane w trakcie badania, najlepiej asymptotyczna LC  50 
(tj. niezale żna od czasu). Dost ępna musi by ć odpowiednia metoda 
analizy o potwierdzonej dok ładności, precyzji i czu łości, dla kwan ­
tyfikacji substancji badanej w roztworach badawczych i materiale 
biologicznym, wraz ze szczegó łami dotycz ącymi przygotowania 
i składowania próbki. Powinna by ć również znana analityczna 
granica detekcji substancji badanej zarówno w wodzie, jak i w tkan ­
kach ryb. Je śli wykorzystywana jest substancja oznakowana  14 C, 
powinien by ć znany udzia ł radioaktywno ści związany 
z zanieczyszczeniami.  
1.5. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Następujące warunki powinny mie ć zastosowanie w odniesieniu do 
badania, aby by ło ono wa żne: 
— zmiana temperatury jest mniejsza ni ż ± 2  o C, 
— stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poni żej 60 % nasycenia,  
— stężenie substancji badanej w komorach utrzymuje si ę na 
poziomie ± 20 % średniej zmierzonych warto ści w trakcie fazy 
absorpcji,  
— śmiertelno ść lub inne negatywne skutki/choroby, zarówno w śród 
ryb kontrolnych, jak i badanych, jest mniejsza ni ż 10 % po 
zakończeniu badania; w przypadku gdy badanie jest przed łużone 
o kilka tygodni lub miesi ęcy, śmiertelno ść lub inne negatywne 
skutki w obydwu grupach ryb powinny by ć niższe niż 5 % 
w stosunku miesi ęcznym i ca łkowicie nie powinny 
przekracza ć 30 %.  
1.6. ZWI ĄZKI ODNIESIENIA  
Wykorzystanie zwi ązków odniesienia o znanej zdolno ści do biokon ­
centracji mo że być użyteczne przy sprawdzaniu procedury do świad­
czalnej, je żeli jest to wymagane. Jednak że niemożliwe jest na razie 
polecenie konkretnych substancji.  
1.7. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.7.1.  Aparatura  
Należy zadbać, aby unika ć wykorzystywania w odniesieniu do 
wszystkich cz ęści aparatury, materia łów, które mog ą rozpuszcza ć 
się, sorbowa ć lub ługować i wywoływać szkodliwe skutki dla ryb. 
Można wykorzystywa ć standardowe, prostok ątne lub cylindryczne 
zbiorniki, wykonane z materia łów chemicznie oboj ętnych i o odpo ­
wiedniej pojemno ści, zgodnej ze wska źnikiem pojemno ści. Wyko ­
rzystanie rur z mi ękkiego plastiku powinno by ć minimalne. Zalecane 
jest wykorzystywanie rur teflonowych, ze stali nierdzewnej i/lub szklanych. Do świadczenie wskaza ło, że dla substancji o wysokich 
współczynnikach absorpcji, jak np. syntetyczne pyretroidy, mo że być 
wymagane szk ło silanizowane. W takich sytuacjach sprz ęt będzie 
musiał po zosta ć wyrzucony po wykorzystaniu.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Woda  
Zwykle do badania wykorzystywana jest woda naturalna, która 
powinna by ć uzyskiwana z niezanieczyszczonego źródła oraz ze 
źródła o jednolitej jako ści. Woda rozcie ńczana powinna by ć jakości, 
która pozwoli na przetrwanie wybranych gatunków ryb przez okres 
trwania aklimatyzacji i okres bada ń oraz nie b ędzie powodowa ła 
pojawienia si ę nieprawid łowego ich wygl ądu lub zachowania. 
W idealnym przypadku powinno si ę wskazać, że badane gatunki 
mogą przeżyć, rosnąć i rozmna żać się w wodzie rozcie ńczonej (np. 
badanie w warunkach laboratoryjnych lub na toksyczno ść w cyklu 
życia). Woda powinna by ć scharakteryzowana, przynajmniej przez 
pH, twardo ść, całkowitą zawartość ciał stałych, całkowitą zawartość 
węgla organicznego oraz w miar ę możliwości amonu, azotynu oraz 
alkaliczno ści i, w odniesieniu do gatunków morskich, zasolenia. 
Parametry, które s ą ważne dla optymalnego dobrostanu ryb, s ą 
znane w pe łni, jednak za łącznik 1 podaje zalecane najwy ższe 
stężenia kilku parametrów dla badanych wód s łodkich i morskich.  
W czasie trwania badania jako ść wody powinna by ć stała. Wartość 
pH powinna mie ścić się w zakresie 6,0–8,5, ale podczas danego 
badania powinna wynosi ć ± 0,5 jednostek pH. W celu zapewnienia, 
że woda rozcie ńczana nie wp łynie negatywnie na wyniki badania 
(np. przez zmian ę właściwości substancji badanej) lub na zacho ­
wanie ryb, co pewien czas nale ży pobiera ć próbki do analizy. 
Powinny zosta ć oznaczone zawarto ści metali ci ężkich (np. Cu, Pb, 
Zn, Cd, Ni), g łównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl, 
SO 4 ), pestycydów (np. ca łkowitej zawarto ści pestycydów organofos ­
forowych i organochlorowych), zawarto ści węgla organicznego 
i zawiesin, np. co trzy miesi ące, w przypadku gdy wiadomo, że 
woda rozcie ńczona ma wzgl ędnie stałą jakość. Jeżeli wykazano, że 
woda ma sta łą jakość przez okres co najmniej jednego roku, ozna ­
czenia mog ą być przeprowadzane rzadziej, a odst ępy czasu mi ędzy 
oznaczeniami wyd łużone (np. co sze ść miesięcy). 
Naturalna zawarto ść cząstek, jak równie ż całkowita zawarto ść węgla 
organicznego (TOC) wody do rozcie ńczania powinna mo żliwie jak 
najniższa, w celu unikni ęcia absorpcji substancji badanej do materii 
organicznej, która mo że zmniejszy ć jej biodost ępność (4). Najwy ższa 
dopuszczalna warto ść wynosi 5 mg/l dla cz ąstek stałych (masa sucha, 
która nie jest przepuszczana przez filtr 0,45 μm) oraz 2 mg/l dla 
całkowitej zawarto ści węgla organicznego (zob. za łącznik 1). 
W miarę potrzeb woda powinna zosta ć przefiltrowana przed wyko ­
rzystaniem. Udzia ł zawarto ści węgla organicznego w wodzie, 
z badania ryb (odchody) oraz z pozosta łości pożywienia powinien 
być możliwie jak najni ższy. W trakcie trwania badania st ężenie 
węgla organicznego w naczyniu do badania nie powinno przekracza ć 
stężenia węgla organicznego pochodz ącego z substancji badanej i – 
jeżeli jest wykorzystywany – środka rozpuszczaj ącego o wi ęcej niż 
10 mg/l (± 20 %).  
1.7.3.  Badane roztwory  
Podstawowy roztwór substancji badanej przygotowywany jest 
w odpowiednim st ężeniu. Roztwór podstawowy powinien by ć przy­
gotowywany przez mieszanie lub wstrz ąsanie substancji badanej 
w wodzie do rozcie ńczania. Nie zaleca si ę wykorzystywania 
rozpuszczalników lub dyspergatorów (czynników rozpuszczaj ących); 
jednakże może to nast ąpić w niektórych przypadkach, w celu 
wytworzenia roztworu podstawowego o odpowiednim st ężeniu. 
Rozpuszczalniki, które mog ą zostać wykorzystane, to etanol, meta ­
nol, eter monometylowy glikolu etylenowego, eter dwumetylenowy glikolu etylenowego, dwumetyloformamid i glikol trójetylenowy. 
Dopuszczalne dyspergatory to kremofor RH40, Tween 80, metylo ­
celuloza 0,01 % i HCO-40. Wykorzystuj ąc czynniki łatwo ulegaj ące 
biodegradacji, nale ży zachowa ć ostrożność, poniewa ż mogą one 
powodowa ć problemy z porostem bakterii w badaniach przep ływo­
wych. Substancja badana mo że być oznakowana radiologicznie 
i powinna by ć o możliwie najwi ększej czysto ści (np. > 98 %).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
W odniesieniu do bada ń przepływowych wymagany jest system, 
który nieprzerwanie dostarcza i rozcie ńcza roztwór podstawowy 
substancji badanej (np. pompa dozuj ąca, rozcie ńczalnik proporcjo ­
nalny, sytnik), w celu dostarczenia koncentratów badanych do komór badawczych. Zezwala si ę na co najmniej pi ęciokrotną wymianę całej 
objętości roztworu dziennie w ka żdej komorze badawczej. Prefero ­
wana ma by ć technika przep ływowa, ale w przypadkach gdy nie jest 
to możliwe (np. gdy zachodzi negatywne dzia łanie na organizmy 
badane), dopuszczalne jest stosowanie techniki pó łstatycznej, pod 
warunkiem że spełnione są kryteria wa żności. Szybko ść przepływu 
roztworów podstawowych i wody do rozcie ńczania powinny by ć 
sprawdzane 48 godzin przed badaniem, a potem co najmniej raz dziennie. W tej kontroli zawarte jest okre ślenie szybko ści przepływu 
przez każdą komorę badawcz ą i zapewnione jest, że nie różni się ona 
między komorami i wewn ątrz nich o wi ęcej niż 20 %.
 
1.7.4.  Wybór gatunków  
Ważnymi kryteriami w wyborze gatunków jest fakt, że są one łatwo 
dostępne, mog ą być uzyskane w odpowiednich rozmiarach i mog ą 
być z powodzeniem przetrzymywane w laboratorium. Inne kryteria 
w odniesieniu do wybierania gatunków obejmuj ą względy rekrea ­
cyjne, handlowe i ekologiczne, jak równie ż porównywaln ą wrażli­
wość, pomyślne wykorzystanie w przesz łości itp.  
Zalecane gatunki do badania s ą podane w za łączniku 2. Inne gatunki 
mogą zostać wykorzystane, ale mo że istnieć konieczno ść dostoso­
wania procedury badawczej celu zapewnienia odpowiednich 
warunków dla przeprowadzenia badania. W takim przypadku powinno zosta ć odnotowane racjonalne uzasadnienie w odniesieniu 
do wyboru gatunku i metody do świadczalnej.
 
1.7.5.  Przetrzymywanie ryb  
Podstawow ą populacje ryb aklimatyzowa ć przez co najmniej dwa 
tygodnie w wodzie w temperaturze badania i karmi ć w oparciu 
o wystarczaj ącą dietę, tego samego rodzaju, która ma by ć wykorzys ­
tana w trakcie badania.  
Po 48-godzinnym okresie adaptacji odnotowuje si ę współczynnik 
śmiertelno ści i stosuje si ę następujące kryteria:  
— śmiertelno ść wyższa niż 10 % populacji w ci ągu siedmiu dni: 
odrzucić całą partię, 
— śmiertelno ść między 5 i 10 % populacji w ci ągu siedmiu dni: 
aklimatyzowa ć przez dodatkowe siedem dni,  
— śmiertelno ść niższa niż 5 % populacji w ci ągu siedmiu dni: 
zaakceptowa ć partię – jeżeli śmiertelno ść jest wyższa niż 5 % 
w ciągu siedmiu dodatkowych dni, odrzuci ć całą partię. 
Zapewnić, że ryby wykorzystywane w badaniu s ą wolne od dostrze ­
galnych chorób i nieprawid łowości. Odrzuci ć wszystkie chore ryby. 
Ryby nie powinny by ć leczone na żadną chorobę w okresie dwóch 
tygodni poprzedzaj ących badanie albo w trakcie badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. PRZEPROWADZENIE BADANIA  
1.8.1.  Badanie wst ępne 
Może być ono użyteczne w celu przeprowadzenia wst ępnego 
doświadczenia w celu zoptymalizowania warunków dla przeprowa ­
dzenia badania ostatecznego, np. wybór st ężenia (stężeń) substancji, 
czasu trwania fazy absorpcji i oczyszczania.  
1.8.2.  Warunki nara żenia na dzia łanie substancji  
1.8.2.1. C z a s t r w a n i a f a z y w c h ł a n i a n i a  
Przewidzenie czasu trwania fazy wch łaniania mo że zostać uzyskane 
w oparciu o do świadczenie praktyczne (np. z poprzedniego badania 
lub nagromadzenia powi ązanej substancji chemicznej) lub w oparciu 
o pewne empiryczne zwi ązki wykorzystuj ące wiedzę dotyczącą albo 
rozpuszczalno ści w wodzie albo wspó łczynnika podzia łu oktanol/ ­
woda substancji badanej (zob. za łącznik 3).  
Faza wch łaniania powinna trwa ć 28 dni, chyba że może zostać 
udowodnione, i ż równowag ę osiągnięto wcześniej. Jeśli stan usta ­
lony nie zosta ł osiągnięty przed up ływem 28 dni, faza absorpcji 
powinna zosta ć przedłużona, pobieraj ąc dalsze pomiary, do momentu 
osiągnięcia stanu ustalonego, lub te ż do 60 dni, w zale żności od 
tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy.  
1.8.2.2. C z a s t r w a n i a f a z y o c z y s z c z a n i a  
Okres po łowy czasu trwania fazy absorpcji jest zazwyczaj wystar ­
czający do zmniejszenia pojawiania si ę (95 %) substancji w masie 
ciała (zob. za łącznik 3 dla wyja śnienia oszacowania). Je żeli czas 
wymagany do osi ągnięcia 95 % straty jest zbyt d ługi, co jest jedno ­
cześnie niepraktyczne, przekraczaj ąc przyk ładowo dwukrotnie 
normalny czas trwania fazy absorpcji (tzn. wi ęcej niż 5–6 dni), 
może zostać wykorzystany krótszy (np. do czasu, a ż stężenie 
substancji badanej jest ni ższe niż 10 % st ężenia substancji 
w stanie ustalonym). Jednak że w odniesieniu do substancji posia ­
dającej bardziej z łożone wzory absorpcji i oczyszczania ni ż te, które 
reprezentuje jednokomorowy model ryby i które oparte s ą na kine­
tyce pierwszego rz ędu, można zastosowa ć dłuższą fazę oczyszczania, 
w celu okre ślenia stałych warto ści wskaźnika utraty. Okres ten 
jednak mo że być regulowany przez okres, w trakcie którego st ężenie 
substancji badanej w rybach pozostaje na poziomie powy żej anali­
tycznego limitu wykrywania.  
1.8.2.3. L i c z b a b a d a n y c h r y b  
Wybrać taką liczba ryb przypadaj ącą na badanie, aby w ka żdej 
próbce by ły co najmniej cztery ryby. Je śli wymagana jest wi ększa 
ilość, niezbędna będzie większa liczba ryb przypadaj ących na bada ­
nie. Jeśli wykorzystywane s ą dorosłe ryby, udokumentowa ć przed 
czy w do świadczeniu wykorzystano samce, samice czy te ż obie płci. 
Jeżeli wykorzystano ryby obu p łci, udokumentowa ć różnice wyst ę­
pujące w zawarto ści lipidów, aby nie mia ły one znaczenia dla 
doświadczenia przed rozpocz ęciem nara żenia na dzia łanie substancji; 
niezbędne może być połączenie wszystkich samic i samców ryb 
w jednym zbiorniku.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
W jakimkolwiek badaniu wybierane s ą ryby o podobnej masie, tak 
aby masa najmniejszej z nich nie by ła mniejsza ni ż dwie trzecie 
masy najwi ększej z ryb. Wszystkie ryby powinny nale żeć do tej 
samej klasy wiekowej i pochodzi ć z tego samego źródła. Ze wzgl ędu 
na to, że masa i wiek ryb maj ą znaczący wpływ na warto ści BCF 
(1), szczegó ły te są odpowiednio udokumentowane. Zaleca si ę 
zważenie podpróbki z zasobów ryb przed rozpocz ęciem badania, 
w celu ustalenia średniej masy.  
1.8.2.4. D o s t a r c z a n i e r y b  
Wykorzystuje si ę wysoką proporcj ę między ilością ryb i wody 
w celu zminimalizowania zmniejszenia w C  w spowodowanego 
przez dodanie ryb na pocz ątku badania, a tak że w celu unikni ęcia 
spadku st ężenia rozpuszczonego tlenu. Proporcje te s ą stosowane 
również w tym celu, aby unikn ąć spadków st ężenia rozpuszczonego 
tlenu. Wa żne jest, aby wska źnik dostarczenia ryb by ł odpowiedni dla 
poszczególnych badanych gatunków. W ka żdym przypadku zaleca 
się, aby wska źnik dostarczenia ryb wynosi ł 0,1–1,0 g ryb (masa 
mokra) na litr wody dziennie. Wysokie wska źniki dostarczania ryb 
mogą być wykorzystane, je śli wykaże się, że wymagane st ężenie 
substancji badanej mo że być zachowane w ramach ogranicze ń ± 
20 % oraz że stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poni żej 
60 % nasycenia.  
Wybierając systemy dostarczania ryb, bierze si ę pod uwag ę naturalne 
środowisko, w którym wyst ępują dane gatunki ryb. Na przyk ład ryby 
żyjące na dnie zbiorników mog ą wymaga ć większej przestrzeni dna 
akwarium w odniesieniu do tej samej obj ętości wody ni ż ryby pela ­
giczne.  
1.8.2.5. K a r m i e n i e  
W czasie aklimatyzacji i badania, ryby s ą karmione wed ług odpo­
wiedniej diety, o znanej ca łkowitej zawarto ści lipidów i bia łek, 
w ilości wystarczaj ącej do utrzymania ich w stanie zdrowym i do 
zachowania ich masy cia ła. Ryby s ą karmione w czasie aklimatyzacji 
i badania ilo ścią pokarmu, na poziomie w przybli żeniu 1–2 % masy 
ich ciała dziennie; utrzymuje to st ężenie lipidów u wi ększości 
gatunków na w miar ę stałym poziomie w czasie badania. Ilo ść 
pokarmu powinna by ć ponownie obliczana, na przyk ład raz na 
tydzień, w celu utrzymania sta łej masy cia ła i zawarto ści lipidów. 
W odniesieniu do tego obliczenia masa cia ła ryb w ka żdej komorze 
badawczej mo że być oszacowana na postawie masy cia ła ryb pobra ­
nych jako próbk ę w tej komorze ostatnio. Nie wa żyć ryb pozostaj ­ 
ących w komorze.  
Pokarm, który nie zosta ł spożyty, oraz ekskrementy s ą wypłukiwane 
z komór badawczych wkrótce po karmieniu (od 30 minut do 1 godziny). Komory s ą utrzymane w miar ę możliwości w czysto ści 
przez okres trwania badania tak, aby st ężenie substancji organicznej 
utrzymane by ło na możliwie jak najni ższym poziomie, ze wzgl ędu 
na to, że obecność węgla organicznego mo że ograniczy ć biodostep ­
ność substancji badanej (1).
 
Ze względu na to, że wiele pokarmów jest uzyskiwanych z m ączki 
rybnej, pokarm powinien by ć analizowany na obecno ść substancji 
badanej. Po żądane jest tak że analizowanie pokarmu na obecno ść 
pestycydów i metali ci ężkich. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. Ś w i a t ł o i t e m p e r a t u r a  
Fotookres trwa zwykle 12–16 godzin, a temperatura (± 2  o C) powinna 
być odpowiednia dla gatunków badanych (zob. za łącznik 2). Powinien 
być znany rodzaj oraz w łaściwości oświetlenia. Nale ży równie ż 
zwrócić uwagę na możliwe fototransformacje substancji badanej 
w warunkach napromieniowania. Unikaj ąc narażenia ryb na dzia łanie 
nienaturalnych fotoproduktów, nale ży wykorzystywa ć odpowiednie 
oświetlenie. W niektórych przypadkach odpowiednie mo że być 
wykorzystanie filtru w celu odfiltrowania promieniowania UV poni żej 
290 nm.  
1.8.2.7. S t ę ż e n i a b a d a n i a  
Ryby są narażone na dzia łanie przynajmniej dwóch st ężeń substancji 
badanej w wodzie w warunkach przep ływu. Zazwyczaj wybiera si ę 
wyższe (lub najwy ższe) stężenie substancji badanej, aby wynosi ło 
około 1 % jego ostrej, asymptotycznej LC  50 , oraz aby by ło przy­
najmniej dziesi ęciokrotnie wy ższe od jej limitu wykrywalno ści 
w wodzie przez wykorzystywan ą metodę analityczn ą. 
Najwyższe stężenie badania mo żna równie ż oznaczyć przez podzie ­
lenie ostrej 96h LC  50 przez odpowiedni ostry/chroniczny wska źnik 
(odpowiednie wska źniki dla niektórych substancji chemicznych 
wynoszą 3–100). Je śli jest to mo żliwe, wybra ć inne stężenie (stęże­
nia), tak aby ró żniło się ono od podanego wy żej współczynnika 
o 10. Je śli nie jest to mo żliwe ze wzgl ędu na kryterium 1 % 
z LC  50 oraz na limit analityczny, mo żna użyć czynnika ni ższego 
od 10 albo te ż wziąć pod uwag ę zastosowanie oznakowanej 
substancji badanej  14 C. Żadne wykorzystane st ężenie nie powinno 
przekracza ć poziomu rozpuszczalno ści substancji badanej.  
W przypadku gdy wykorzystuje si ę czynnik rozpuszczaj ący, jego 
stężenie nie powinno by ć wyższe niż 0,1 ml/l i powinno by ć takie 
samo we wszystkich naczyniach badawczych. Wp ływ stężenia, wraz 
z substancj ą badaną, na całkowitą zawartość węgla organicznego 
w wodzie badanej powinien by ć znany. Jednak że powinny zosta ć 
podjęte wszelkie wysi łki, w celu unikni ęcia wykorzystania takich 
materiałów. 
1.8.2.8. K o n t r o l e  
Powinna zosta ć przeprowadzona jedna kontrola wody do rozcie ń­
czania lub, je żeli jest to stosowne, jedna kontrola obejmuj ącą 
czynnik rozpuszczaj ący powinna zosta ć przeprowadzona oprócz 
badania, pod warunkiem że ustalono, i ż czynnik nie wywiera 
wpływu na ryby. Je śli nie ustalono tego, powinny zosta ć zorganizo ­
wane obie kontrole.  
1.8.3.  Cz ęstotliwość pomiarów jako ści wody  
W trakcie badania powinny zosta ć przeprowadzone pomiary 
rozpuszczonego tlenu, TOC, pH oraz temperatury we wszystkich 
zbiornikach. Ca łkowita twardo ść i zasolenie, je śli jest to odpowied ­
nie, powinno zosta ć zmierzone w czasie kontroli, natomiast jeden ze 
zbiorników powinien zosta ć zbadany przy wy ższym (lub najwy ż­
szym) stężeniu. Jako minimum poziom rozpuszczonego tlenu oraz 
zasolenie, je śli jest to odpowiednie powinno zosta ć zmierzone trzy ­
krotnie: na pocz ątku, w po łowie i pod koniec fazy absorpcji oraz raz 
w tygodniu w czasie fazy oczyszczania. TOC powinno zosta ć zmie­
rzone na pocz ątku badania (24 godziny i 48 godzin przed rozpocz ę­
ciem fazy absorpcji), przed wpuszczeniem ryb oraz przynajmniej raz 
w tygodniu w czasie fazy absorpcji i oczyszczania. Temperatura powinna by ć mierzona codziennie, pH na pocz ątku i na ko ńcu 
każdego okresu, a twardo ść – raz w ci ągu trwania badania. Zaleca 
się ciągłe monitorowanie temperatury, przynajmniej jednym pojem ­
niku.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Pobieranie próbek oraz analiza ryb i wody  
1.8.4.1. P l a n p o b i e r a n i a p r ó b e k r y b i w o d y  
Próbka wody z komór badawczych do oznaczania st ężenia substancji 
badanej, pobierana jest przed wpuszczeniem ryb, oraz w trakcie 
zarówno fazy absorpcji, jak i oczyszczania. Próbki wody pobierane 
są przed karmieniem i w tym samym czasie, co próbki ryb. 
W trakcie fazy absorpcji oznaczane s ą stężenia substancji badanych, 
w celu sprawdzenia ich zgodno ści z kryteriami wa żności. 
Próbki ryb s ą pobierane przynajmniej pi ęć razy podczas fazy absor ­
pcji oraz przynajmniej cztery razy podczas fazy oczyszczania. Ze względu na to, że czasami trudno b ędzie obliczy ć dokładne oszaco ­
wanie warto ści BCF w oparciu o t ą ilość próbek, zw łaszcza je śli 
wskazane s ą inne typy kinetyki ni ż prosta kinetyka pierwszego 
rzędu, wskazane mo że być pobieranie próbek podczas obu faz 
z większą częstotliwością (zob. za łącznik 4). Dodatkowe próbki s ą 
składowane i analizowane jedynie wówczas gdy wyniki bada ń 
próbek pochodz ących z pierwszej serii nie s ą wystarczaj ące do obli ­
czenia warto ści czynnika BCF z po żądaną dokładnością.
 
Przykład dopuszczalnego planu pobierania próbek podany jest 
w załączniku 4. Inne harmonogramy mo żna łatwo obliczy ć, wyko­
rzystując inne przyj ęte wartości P  ow dla określenia czasu nara żenia 
na działanie czynników dla 9 5 % absorpcji.  
Pobieranie próbek kontynuuje si ę podczas fazy absorpcji do 
momentu, kiedy osi ągnięty zostanie stan ustalony lub przez 28 dni, 
w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Je śli 
nie osiągnięto stanu ustalonego przed w okresie 28 dni, pobieranie 
próbek jest kontynuowane do czasu a ż osiągnięty zostanie stan usta ­
lony lub przez 60 dni, w zale żności od tego, który z tych dwóch 
okresów jest krótszy. Przed rozpocz ęciem fazy oczyszczania ryby 
przenoszone s ą do czystych zbiorników.  
1.8.4.2. P o b i e r a n i e i p r z y g o t o w y w a n i e p r ó b e k  
Próbki wody do analizy uzyskiwane na przyk ład przez ich wyp łuki­
wanie z centralnego punktu komory badawczej. Ze wzgl ędu na to, że 
zarówno filtracja, jak i odwirowywanie nie zawsze powoduje oddzie ­
lenie się czynnika bioniedost ępnego z pierwszej substancji od czyn ­
nika biodost ępnego (zw łaszcza w substancjach superlipofilowych, 
tzn. w tych substancjach, które maj ą log P  ow > 5) (1)(5), próbki 
mogą nie być poddawane takim obróbkom.  
Zamiast tego pomiary powinny by ć pobierane w celu utrzymania 
zbiorników w czysto ści oraz zawarto ść całkowita w ęgla organicz ­
nego powinna by ć monitorowana zarówno podczas fazy absorpcji, 
jak i oczyszczania.  
Odpowiednia ilo ść ryb (zwykle co najmniej cztery) jest usuwana 
z komór badawczych podczas ka żdorazowego pobierania próbek. 
Ryby pobrane w próbkach s ą szybko op łukiwane wod ą, plamione 
„na sucho”, zabijane, wykorzystuj ąc odpowiedni i humanitarny 
sposób, a nast ępnie ważone. 
Preferowane jest analizowanie ryby i wody natychmiast po pobraniu 
próbek, w celu zapobie żenia degradacji lub innym stratom oraz 
w celu obliczenia średnich wska źników absorpcji i oczyszczania 
w trakcie post ępowania badania. Natychmiastowa analiza unika 
również opóźnień w określaniu, kiedy plateau zosta ło osiągnięte. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
W przypadku niepowodzenia przeprowadzenia natychmiastowej 
analizy, próbki s ą składowane, wykorzystuj ąc odpowiedni ą metodę. 
Przed rozpocz ęciem badania uzyskiwane s ą informacje dotycz ące 
właściwej metody sk ładowania w odniesieniu do poszczególnych 
substancji badanych – np. g łębokiego zamra żania, przetrzymywania 
w temperaturze 4  o C, czasu trwania sk ładowania, ekstrakcji itp.  
1.8.4.3. J a k o ś ć m e t o d y a n a l i t y c z n e j  
Ze względu na to, że cała procedura uzale żniona jest zasadniczo od 
dokładności, precyzji i czu łości metody analitycznej wykorzysty ­
wanej w odniesieniu do substancji badanej, sprawdzi ć doświadczal­
nie, iż precyzja oraz powtarzalno ść analizy chemicznej, jak równie ż 
odzyskiwanie substancji badanej zarówno z wody, jak i s ą wystar­
czające dla danej metody. Sprawdzi ć również, że substancja badana 
nie jest wykrywalna wykorzystanej wodzie do rozcie ńczania.  
W miarę potrzeb warto ści C  w i C f , uzyskane z badania, s ą korygo­
wane w odniesieniu do warto ści tłowych uzyskanych w czasie 
kontroli. Z próbkami ryb i wody post ępuje się w międzyczasie 
w taki sposób, aby zminimalizowa ć zanieczyszczenie lub straty 
(np. wynikaj ące z adsorpcji przez urz ądzenia do pobierania próbek).  
1.8.4.4. A n a l i z a p r ó b e k r y b  
Jeśli w badaniu wykorzystywane s ą substancje oznakowane radiolo ­
gicznie, mo żliwe jest przeprowadzenie analizy w odniesieniu do 
całkowitego oznaczenia radiologicznego (np. macierzyste 
i metabolity) lub mo żna oczyścić próbki, tak aby zwi ązek macie ­
rzysty móg ł zostać poddany analizie oddzielnie. G łówne metabolity 
mogą zostać również określone w stanie ustalonym lub pod koniec 
fazy pobierania, w zale żności od tego, która z tych faz nast ąpi szyb­
ciej. Jeśli czynnik BCF jest > 1 000 % w kategoriach ca łkowitych 
pozostałości substancji oznakowanej radiologicznie, wskazane mo że 
być, a w odniesieniu do niektórych kategorii chemikaliów, takich jak 
pestycydy, stanowczo zalecane zidentyfikowanie i obliczenie ilości degradatów stanowi ących > 10 % ca łkowitej ilo ści pozosta ­ 
łości substancji w tkankach ryb w stanie ustalonym. Je śli degradaty 
stanowiące > 10 % ca łkowitych pozosta łości substancji o oznaczeniu 
radiologicznym w tkankach ryb s ą zidentyfikowane i obliczone, 
zaleca si ę również identyfikacj ę i podanie ilo ści degradatów 
w wodzie badanej.
 
Stężenie substancji badanej powinno zazwyczaj by ć oznaczane dla 
każdej indywidualnie wa żonej ryby. Je śli nie jest to mo żliwe, można 
zebrać wszystkie próbki w jednym zbiorniku podczas ka żdego pobie ­
rania próbek, ale nie ogranicza to procedur statystycznych, które mogą mieć zastosowanie do danych. Je żeli szczególne procedury 
statystyczne oraz moc statystyczna s ą ważnymi wzgl ędami, odpo ­
wiednia liczba ryb w celu przystosowania odpowiedniej procedury zgromadzenia próbek w jednym zbiorniku powinna zosta ć objęta 
badaniem (6)(7).
 
BCF powinno by ć wyrażone zarówno jako funkcja ca łkowitej masy 
mokrej, jak i, w odniesieniu do substancji wysokolipofilowych, jako 
funkcja zawarto ści lipidów. Zawarto ść lipidów ryb okre śla się 
podczas ka żdorazowego pobierania próbek, je śli jest to mo żliwe. 
Odpowiednie metody powinny zosta ć wykorzystane w celu ozna ­
czenia zawarto ści lipidów (odniesienia 8 i 2 w za łączniku 3). Metoda 
ekstrakcji chloroform/metanol mo że być zalecana jako metoda stan ­
dardowa (9). Ró żne metody nie daj ą identycznych warto ści (10), 
zatem wa żne jest podanie szczegó łów dotycz ących wykorzystanej 
metody. Je śli jest to mo żliwe, analiza dla lipidów cz ęsto powinna 
być przeprowadzona na tym samym ekstrakcie, który wytworzony 
został dla potrzeb analizy na obecno ść substancji badanej, ze 
względu na to, że lipidy cz ęsto musz ą zostać usunięte z ekstraktu 
zanim zostanie on poddany analizie chromatograficznie. Zawarto ść 
lipidów w rybie (podana w mg/kg mokrej masy) pod koniec doświadczenia nie powinna ró żnić się od tej z pocz ątku doświad­
czenia o wi ę
cej niż ± 25 %. Procent zawarto ści ciał stałych w tkance 
powinien zosta ć także odnotowany, w celu umo żliwienia przekszta ł­
cenia stężenia lipidów z bazy mokrej w baz ę stałą. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. DANE  
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW  
Krzywa absorpcji badanej substancji uzyskiwana jest przez 
wykreślenie jej st ężenia w/na rybie (lub w okre ślonych tkankach) 
w fazie absorpcji, w danym czasie, w skali arytmetycznej. Je śli 
krzywa osi ągnęła plateau, to znaczy, że stała się w przybli żeniu 
asymptotyczna do osi czasu, stan ustalony BCF  SS obliczany jest 
w następujący sposób:  
C 1 jako stan ustalony ðśredniaÞ 
C w jako stan ustalony ðśredniaÞ 
W przypadku gdy nie zosta ł osiągnięty stan ustalony, mo że istnieć 
możliwość obliczenia BCF  SS o wystarczaj ącej precyzji dla oceny 
zagrożenia na podstawie „stanu ustalonego” przy 80 % (1,6/k  2 ) lub 
95 % (3,0/k  2 ) równowagi.  
Również czynnik st ężenia (BCF  K ) jest oznaczany jako stosunek 
k 1 /k 2 , dwóch sta łych kinetycznych pierwszego rz ędu. Stała szybkość 
oczyszczania (k  2 ) jest zwykle okre ślana na podstawie krzywej 
oczyszczania (tzn. na podstawie wykresu spadku st ężenia badanej 
substancji w rybie wraz z up ływem czasu). Sta ła szybkość absorpcji 
(k 1 ) wyliczana jest wówczas na podstawie k  2 oraz warto ści C  f , którą 
uzyskuje si ę z krzywej absorpcji (zob. tak że załącznik 5). Prefero ­
waną metodą uzyskiwania BCF  K oraz stałych wska źników, k  1 i k 2 , 
jest wykorzystanie metod oceny parametrów nieliniowych na komputerze (11). W przeciwnym razie dla obliczenia k
 1 i k  2 
można korzysta ć z metod graficznych. Je śli krzywa oczyszczenia 
w wyraźny sposób nie mo że być uznana za krzyw ą procesu pierw ­
szego rzędu, wówczas powinny zosta ć zastosowane modele bardziej 
złożone (zob. odniesienia w za łączniku 3) i powinno si ę zasięgnąć 
rady u biostatystyka.  
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Wyniki powinny by ć interpretowane uwa żnie w przypadku, gdy 
mierzone st ężenia badanych roztworów wyst ępują na poziomach 
zbliżonych do granicy wykrywalno ści metody analitycznej.  
Jasno okre ślone krzywe absorpcji i ubytku wskazuj ą dobrej jako ści 
dane o biost ężeniu. Rozbie żność w stałych absorpcji/oczyszczenia 
między dwoma badanymi st ężeniami powinna by ć niższa niż 
20 %. Powinny zosta ć odnotowane zaobserwowane ró żnice 
dotyczące szybko ści absorpcji/oczyszczenia mi ędzy dwoma zastoso ­
wanymi badanymi st ężeniami, podaj ąc możliwe wyja śnienia. 
Ogólnie granica ufno ści BCFs, na podstawie dobrze zaprojektowa ­
nego podej ścia badawczego, wynosi ± 20 %.  
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDA Ń 
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
3.1. BADANA SUBSTANCJA:  
— własności fizyczne oraz, gdy jest to istotne, w łaściwości 
fizyczno-chemiczne,  
— dane dotycz ące identyfikacji chemicznej ( łącznie z zawarto ścią 
węgla organicznego, w odpowiednich przypadkach),  
— w przypadku oznakowania radiologicznego, dok ładne położenie 
znaczonego atomu (znaczonych atomów) oraz zawarto ść procen­
tową radioaktywno ści, związanej z nieczysto ściami.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. BADANE GATUNKI  
— nazwa naukowa, gatunek, źródło, jakakolwiek obróbka wst ępna, 
aklimatyzacja, wiek, zakres rozmiarów itp.  
3.3. WARUNKI PRZEPROWADZANIA BADANIA:  
— wykorzystana procedura badawcza (np. przep ływowa lub pó łsta­
tyczna),  
— rodzaj i w łaściwości zastosowanego o świetlenia i fotookresów,  
— projekt badania (np. numer i rozmiar komór badawczych, szyb ­
kość wymiany obj ętości wody, liczba powtórze ń, liczba ryb przy ­
padających na powtórzenie, liczba st ężeń badania, d ługość faz 
absorpcji i oczyszczenia, cz ęstotliwość pobierania próbek ryb 
i wody),  
— metoda przygotowania roztworów podstawowych i cz ęstotliwość 
ich odnawiania, (je śli został użyty, nale ży podać czynnik 
rozpuszczaj ący, jego st ężenie oraz jego udzia ł w zawarto ści 
węgla organicznego wody u żywanej do przeprowadzenia bada ń), 
— nominalne st ężenia badania, średnia mierzonych warto ści oraz 
ich standardowe odchylenia, odnosz ące się do naczy ń używanych 
w badaniach, oraz metoda, za pomoc ą której zosta ły one uzys ­
kane,  
— źródło wody do rozcie ńczania, opis jakiejkolwiek obróbki wst ęp­
nej, wyniki przeprowadzenia dowodu na zdolno ść ryb do życia 
w wodzie oraz w łaściwości wody: pH, twardo ść, temperatura, 
stężenie rozpuszczonego tlenu, poziomy pozosta łościowego 
chloru (je śli dokonano pomiaru), w ęgiel organiczny ogó łem, 
zawiesina, stopie ń zasolenia środowiska zastosowanego 
w badaniach (je śli występuje taka potrzeba) oraz inne wykonane 
pomiary,  
— jakość wody w naczyniach wykorzystane w badaniach, pH, twar ­
dość, węgiel organiczny ogó łem (TOC), temperatura oraz 
stężenie rozpuszczonego tlenu,  
— szczegó łowe informacje w sprawie karmienia (np. rodzaj karmy, 
jej źródło, skład – przynajmniej, je śli to mo żliwe, zawarto ść 
lipidów i bia łka, ilość podanej karmy i cz ęstotliwość karmienia),  
— informacje w sprawie post ępowania z próbkami ryb i wody, 
łącznie ze szczegó łami dotycz ącymi przygotowania, sk ładowania, 
ekstrakcji i procedur analitycznych (oraz dok ładność) 
w odniesieniu do badanej substancji i zawarto ści lipidów (je śli 
zmierzono).  
3.4. WYNIKI:  
— wyniki z wszelkich przeprowadzonych bada ń wstępnych,  
— śmiertelno ść ryb kontrolowanych oraz ryb w ka żdej z komór 
narażonych na dzia łanie substancji oraz wszelkie inne zaobser ­
wowane nieprawid łowe zachowania,  
— zawarto ść lipidów ryb (je śli oznaczono w momencie przeprowa ­
dzania badania),  
— krzywe ( łącznie z wszystkimi zmierzonymi danymi) przedsta ­
wiające absorpcj ę i oczyszczenie badanej substancji chemicznej 
w rybie, czas poprzedzaj ący stan ustalony,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— C  f i C w (razem z odchyleniami standardowymi i zakresem, je śli 
jest to stosowne) dla wszystkich czasów pbierania próbek (C  f 
wyrażone w μg/g mokrej masy (ppm)) ca łego organizmu lub 
określonych tkanek, np. lipidy, i C  w w μg/ml (ppm). Warto ści 
C w dla serii kontrolnych (nale ży również zgłosić tło), 
— czynnik biost ężenia w stanie ustalonym (BCF  SS ) i/lub czynnik 
stężenia kinetycznego (BCF  K ) oraz, w stosownych przypadkach, 
95 % granicy ufno ści dla sta łej szybko ści absorpcji 
i oczyszczenia (ubytku), wyra żone w odniesieniu do ca łego orga­
nizmu i ca łkowitej zawarto ści lipidów je śli dokonano pomiaru, 
zwierzęcia lub jego poszczególnych tkanek, granice ufno ści 
i odchylenie standardowe, je śli są dostępne, oraz metody analizy 
obliczeń/danych dla ka żdego stężenia wykorzystanej substancji 
badanej,  
— w przypadku gdy wykorzystano substancje oznakowane radiolo ­
gicznie oraz, je śli jest wymagane, nagromadzenie jakichkolwiek 
wykrytych metabolitów mo że zostać przedstawione,  
— wszystko, co odbiega od normy, je śli chodzi o badanie, wszelkie 
odchylenia od tych procedur oraz wszelkie inne wa żne informa ­
cje; 
zminimalizowa ć ilość wyników jako „niewykrytych w granicy 
wykrywalno ści” w drodze opracowywania metod stosowanych 
przed badaniem i za pomoc ą projektu do świadczalnego, poniewa ż 
wyniki takie nie mog ą być użyte do obliczenia sta łej szybko ści 
reakcji.  
4. BIBLOGRAFIA  
(1) Connell D.W. (1988). Bio accumulation behaviour of persis ­
tent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. 
Toxicol. 102, pp. 117–156.  
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear 
dependence of fish bioconcentration on noctanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 
1, pp. 29–390.  
(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals 
in water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.  
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of 
bioconcentration factors derivedfrom OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bio availability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality 
Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
 
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 
20852. Julyl975.  
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal 
Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human 
and Emronmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research 
Triangle Park, N.C. 27711.  
(8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Rozdzia ł 
2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Nether ­
lands.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099–1105.  
(10) Randall R. C, Lee H, Ozretich R.J, Lake J. L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bio accumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431–1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the 
flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 
1985. Final report Marzecl 987. Autorzy: P. Kristensen i N. 
Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
ZAŁĄCZNIK 1  
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcie ńczania  
Substancja Ograniczenie st ężenia 
1 Cz ąstki stałe 5 mg/l 
2 W ęgiel organiczny ogó łem 2 mg/l 
3 Amoniak niejonizowany 1 μg/l 
4 Chlor pozosta ły 10 μg/l 
5 Pestycydy fosforoorganiczne 50 ng/l 6 Pestycydy z grupy w ęglowodorów chlorowanych oraz 
bifenyle polichlorowane 50 ng/1 
7 Chlor organiczny ogó łem 25 ng/1 
8 Glin 1 μg/l 
9 Arsen 1 μg/l 
10 Chrom 1 μg/l 
11 Kobalt 1 μg/l 
12 Mied ź 1 μg/l 
13 Żelazo 1 μg/l 
14 O łów 1 μg/l 
15 Nikiel 1 μg/l 
16 Cynk 1 μg/l 
17 Kadm 100 ng/1 18 Rt ęć 100 ng/1 
19 Srebro 100 ng/1
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
ZAŁĄCZNIK 2  
Gatunki ryb zalecane do przeprowadzenia badania  
Zalecane gatunki Zalecany zakres 
temperatur 
badania (  o C) Zalecana 
całkowita 
długość badanego 
zwierzęcia (cm)  
1 Danio rerio (  1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
Buchanan) Danio pr ęgowany 20–25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) Strzebla 20–25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 
Karp 20–25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel) Ry żówka 20–25 4,0 ± 1,0 
5 Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 
Gupik 20–25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) Oko ń błękitnoskrzeli (Bluegill) 20–25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) Pstr ąg tęczowy 13–17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) Ciernik 18–20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231.  
W różnych krajach wykorzystano ró żne gatunki wyst ępujące w wodach przybrze żnych i gatunki 
morskie, na przyk ład: 
Spot Leiostomus xanthurus  
Owczarz karpiowaty  Cyprinodon variegatus  
Kiżucz Mienidia beryl  
Szumień mały Cymatogaster aggregata  
Złocica europejska  Parophrys vertulus  
Kur rogacz  Leptocottus armatus  
Ciernik trzypromienny  Gasteroseteus aculeatus  
Labraks  Dicentratracus labrax  
Ukleja  Alburnus alburnus  
Gromadzenie  
Ryby słodkowodne, wymienione w tabeli, s ą łatwe w hodowli i/lub s ą szeroko dost ępne w ciągu 
roku, podczas gdy dost ępność gatunków morskich i zamieszkuj ących wody przybrze żne jest 
częściowo ograniczona do odpowiednich krajów. Nadaj ą się one do hodowli i rozmna żania albo 
w gospodarstwach rybnych, albo w laboratoriach, w warunkach chroni ących je od chorób 
i pasożytów. Ryby te dost ępne są w wielu cz ęściach świata.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
ZAŁĄCZNIK 3  
Przewidywanie czasu trwania faz wch łaniania i oczyszczenia  
1. Przewidywanie czasu trwania fazy wch łaniania  
Przed przeprowadzeniem badania, oszacowa ć k 2 i wskutek tego pewien 
udział procentowy czasu potrzebnego do osi ągnięcia stanu ustalonego 
może zostać uzyskany na podstawie zale żności empirycznych mi ędzy k  2 
a n-oktanolo/wodnym wspó łczynnikiem podzia łu (P  ow ) oraz k  2 i wodną 
rozpuszczalno ścią (s). 
Oszacowanie k  2 (dzień -1 ) może zostać uzyskane na przyk ład 
z następujących zale żności empirycznych (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47(r  2 = 0,95) (równanie 1)  
W odniesieniu do innych zale żności – zob. poz. bibliograficzna (2).  
Jeśli nie jest znany wspó łczynnik podzia łu (P  ow ), można dokona ć oszaco­
wania (3) na podstawie wiedzy o rozpuszczalno ści wodnej substancji, 
wykorzystuj ąc wzór: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (równanie 2)  
gdzie:  
s = rozpuszczalno ść (mol/l): (n = 36).  
Zależności te stosuj ą się jedynie do substancji chemicznych o warto ściach 
log P  ow pomiędzy 2 a 6,5 (4).  
Czas potrzebny do osi ągnięcia pewnego udzia łu procentowego stanu usta ­
lonego mo że zostać uzyskany przez stosowanie oszacowania k  2 , na 
podstawie ogólnego równania kinetycznego, opisuj ącego absorpcje 
i oczyszczanie (kinetyka pierwszego rz ędu): 
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
lub jeśli C  w jest stałe, w nast ępujący sposób:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (równanie 3)  
W momencie zbli żania się do stanu stacjonarnego (t → ∞) równanie 
3 można zredukowa ć (5)(6) do:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w lub C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
Wówczas k  1 /k 2 C w zbliża się do stężenia w rybie w „stanie ustalonym” 
(C f, s ). 
Równanie 3 mo że zostać rozpisane do:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ lub  C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (równanie 4)  
Stosując równanie 4, czas potrzebny do osi ągnięcia udziału procentowego 
stanu ustalonego mo że zostać przewidziany, je śli k  2 jest uprzednio oszaco ­
wane, wykorzystuj ąc równania 1 lub 2.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Jako wytyczna statystycznie optymalny czas trwania fazy absorpcji dla 
wytworzenia, statystycznie mo żliwy do przyj ęcia danych (BCF  K ), jest okre ­
sem, który jest wymagany do tego, aby krzywa logarytmu st ężenia 
substancji badanej w rybie, wykre ślona w zestawieniu z czasem podanym 
liniowo, osi ągnęła swój punkt środkowy 1 1,6/k  2 , lub też 80 % stanu 
ustalonego, ale nie wi ęcej niż 3,0/k  2 lub 95 % stanu ustalonego (7).  
Czas potrzebny do osi ągnięcia 80 % stanu ustalonego (równanie 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 lub t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (równanie 5)  
Podobnie 95 % stanu ustalonego wynosi:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (równanie 6)  
Na przyk ład czas trwania fazy wch łaniania (up) dla substancji badanej 
o log P  ow = 4 wynosi łby (wykorzystuj ąc równania 1, 5 i 6): 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 dni  -1 
up (80 %) = 1,6/0,652, i.e. 2,45 days (59 godzin)  
lub up (95 %) = 3,0/0,652, i.e. 4,60 days (110 godzin)  
Podobnie, w odniesieniu do substancji badanej s = 10  -5 mol/l (log(s) = - 5,0) 
czas trwania wynosi łby (wykorzystuj ąc równania 1, 2, 5 i 6):  
log 10 (P ow ) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 K 2 = 0,414 (5,02) + 1,47  
k 2 = 0,246 dni  -1 
up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dni (156 godzin)  
lub up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dni (293 godzin)  
Alternatywnie, wyra żenie:  
t eq = 6,54 x 10  3 P ow + 55,31 (godzin)  
może być wykorzystane do obliczenia czasu potrzebnego do skutecznego 
osiągnięcia stanu ustalonego (4).  
2. Przewidywanie czasu trwania fazy oczyszczenia  
Przewidywanie ilo ści czasu potrzebnego do wyeliminowania zanieczysz ­
czenia z organizmu do pewnej ilo ści udziału procentowego st ężenia 
początkowego mo że zostać uzyskane na podstawie ogólnego równania, 
opisującego absorpcje i oczyszczanie (kinetyka pierwszego rz ędu) (1)(8).  
Dla fazy oczyszczania przyjmuje si ę C w równe zeru. Równanie mo żna 
zredukowa ć do: 
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f lub C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
Gdzie  C f, o jest stężeniem z pocz ątku stanu oczyszczania 50 %. Oczysz ­
czanie osi ągnięte zostanie wówczas w czasie (t  50 ): 
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 lub t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Podobnie 95 % oczyszczania zostanie osi ągnięte w nast ępującym czasie:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Jeśli 80 % absorpcji wykorzystywane jest w odniesieniu do pierwszego 
okresie (1,6/ k 2 ), a 95 % ubytku w fazie oczyszczania (3,0/ k 2 ), wówczas 
faza oczyszczania jest w przybli żeniu dwa razy d łuższa niż długość fazy 
wchłaniania.  
Jednakże ważne jest, aby odnotowa ć, że oszacowania oparte s ą na założe­
niu, że wzory absorpcji i oczyszczania b ędą zgodne z kinetyk ą pierwszego 
rzędu. Jeśli w wyra źny sposób kinetyka pierwszego rz ędu nie jest prze ­
strzegana, powinny zosta ć wykorzystane bardziej z łożone modele (np. poz. 
bibliograficzna (1)).  
Literatura  (załącznika 3)  
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing 
the bioconcentration of organics in fish.Toxicol. and Chem. 1, pp. 309–320.
 
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCFs 
derived from OecD and ASTM testing methods; influence of p articulate matter to the bio availability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
 
(3) Chiou C.T. and Schmedding (3) (1982). Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16, pp. 
1.4–10.  
(4) Hawker D. W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. 
Wat. Res. 22 (6), pp. 701–707.  
(5) Branson D. R., Blau G.E., Alexander H. C. i Neely W. B. (19 7 5). 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785–792.  
(6) Ernst W. (19 8 5). Accumulation in Aquatic organisms. W: Appraisal 
of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, str. 
243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. i Sauerhoff 
M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. 
Eng. 55, pp. 614–622.
 
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3–19.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
ZAŁĄCZNIK 4  
Teoretyczny przyk ład harmonogramu pobierania próbek w odniesieniu do bada ń biokoncentracji substancji 
o log P  ow = 4 
Pobieranie próbek ryb Harmonogram badania próbek 
Liczba ryb przypadaj ­ 
ących na jedn ą próbkę Liczba próbek wody Minimalna wymagana 
częstotliwość (dni) Dodatkowe pobieranie 
próbek  
Faza wch łaniania -1 
0 2 (*) 
2 Dodać 45–80 ryb 
pierwsza 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
druga 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
trzecia 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
czwarta 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
piąta 4,7 2 6 
Faza oczyszczania Przenieść ryby do 
wody wolnej od 
badanej substancji 
chemicznej 
szósta 5,0 5,3 4 
(4) 
siódma 5,9 7,0 4 
(4) 
ósma 9,3 11,2 4 
(4) 
dziewiąta 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Woda próbki po dostarczeniu co najmniej trzech obj ętości komór. 
Wartości w nawiasach s ą liczbami próbek (woda, ryby), które maj ą zostać pobrane, je śli przeprowadzane jest dodatkowe pobieranie 
próbek.  
Uwagi : Oznaczenie k  2 dla log P  ow z 4,0 przed badaniem wynosi 0,652 dnia  -1 . Całkowita długość trwania eksperymentu ustalona jest na 
3 × faza absorpcji = 3 × 4,6 dnia, np. 14 dni. W odniesieniu do oszacowania absorpcji – odnie ść się do załącznika 3.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
ZAŁĄCZNIK 5  
Rozróżnianie modeli  
Większość danych dotycz ących biokoncentracji uznano za do ść dobrze opisane 
za pomoc ą prostego modelu dwukomorowego o dwóch parametrach, jak wska ­
zano za pomoc ą krzywej prostoliniowej, która zbli ża się do punktów st ężenia 
w rybach, w czasie fazy oczyszczania, gdy s ą one wykre ślone na papierze 
półlogarytmicznym. (W przypadku gdy punktów tych nie mo żna opisać za 
pomocą krzywej prostoliniowej, wówczas nale ży zastosowa ć modele z łożone, 
zob. na przyk ład Spacie i Hamelink, poz. bibliograficzna (1) w za łączniku 3).  
Graficzne metody oznaczania sta łej szybko ści oczyszczania (ubytku) k  2 
Wykreślić stężenie substancji badanej zawartej w ka żdej z próbek ryb w czasie 
pobierania próbek na papierze pó łlogarytmicznym. Nachyleniem tej linii jest k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Należy zauważyć, że odchylenia od linii prostej mog ą wskazywa ć na bardziej 
złożony schemat oczyszczania ni ż ten oparty na kinetyce pierwszego rz ędu. 
Metoda graficzna mo że być zastosowana do analizowania typów oczyszczania, 
które są odchyleniem od kinetyki procesu pierwszego rz ędu. 
Graficzne metody oznaczania sta łej szybko ści absorpcji k  1 
Mając podane k  2 , obliczyć k 1 w następujący sposób:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ (równanie 1)  
Wartość C f odczytywana jest ze środkowego punktu cz ęści gładkiej krzywej 
absorpcji, powsta łej w oparciu o dane, gdy st ężenie logarytmiczne jest 
wykreślone w zale żności od czasu (w skali arytmetycznej).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Metoda komputerowego obliczania sta łych szybko ści absorpcji 
i oczyszczania (ubytku)  
Preferowan ą metodą uzyskiwania czynnika biokoncentracji oraz sta łych szyb ­
kości reakcji, k  1 i k 2 , jest wykorzystanie metod oceny parametrów nieliniowych 
na komputerze. Programy te przypisuj ą wartości dla k  1 i k 2 w oparciu o zestaw 
danych dotycz ących czasu sekwencyjnego st ężenia i modelu:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü Í 
1 Ä e Äk 2 t Î 
0 < t < t  c (równanie 2)  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c (równanie 3)  
gdzie: t  c = czas przy ko ńcu fazy absorpcji  
Podejście to przewiduje standardowe oszacowania odchyle ń k 1 i k 2 . 
Ponieważ k 2 w większości przypadków mo że zostać oszacowane na podstawie 
krzywej oczyszczenia z do ść wysoką dokładnością oraz ze wzgl ędu na istnienie 
silnego zwi ązku między dwoma parametrami k  1 i k 2 , gdy obliczane s ą równo­
cześnie, wskazane mo że być obliczanie najpierw k  2 , jedynie na podstawie danych 
dotyczących oczyszczania, a w nast ępnej kolejno ści obliczanie k  1 , na podstawie 
danych dotycz ących wch łaniania, u żywając regresji nieliniowej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  BADANIE ROZWOJU M ŁODYCH RYB  
1. METODA  
Niniejsza metoda wp ływu toksyczno ści na rozwój jest kopi ą OECD 
TG 215 (2000).  
1.1. WPROWADZENIE  
Niniejszy badanie jest przeznaczone do oceny skutków przed łużonej 
ekspozycji na dzia łanie substancji chemicznych na rozwój m łodocia­
nych ryb. Jest on oparty na metodzie, rozwini ętej i powszechnie 
stosowanej (1)(2) w ramach Unii Europejskiej, dla oceny dzia łania 
substancji chemicznych na rozwój m łodego pstr ąga tęczowego 
(Oncorynchus mykiss ) w warunkach przep ływowych. Inne dobrze 
udokumentowane gatunki mo żna równie ż zastosowa ć. Na przyk ład 
uzyskano do świadczenie z bada ń rozwoju danio pr ęgowanego 
(Danio rerio ) ( 1 ) (3)(4) i  Oryzias latipes  (5)(6)(7).  
Zob. także Ogólne wprowadzenie cz ęść C. 
1.2. DEFINICJE  
Najniższy obserwowany skutek st ężenia (LOEC):  jest to 
najmniejsze badane st ężenie substancji badanej, przy którym obser ­
wuje się znaczący skutek (przy p < 0,05) w porównaniu 
z doświadczeniem kontrolnym. Jednak że wszystkie badane st ężenia 
powyżej LOEC musz ą wykazywa ć szkodliwy skutek, równy lub 
większy niż ten obserwowany przy LOEC.  
Nieobserwowany skutek st ężenia (NOEC):  jest stężeniem badanym 
bezpośrednio poni żej LOEC.  
EC x : w niniejszej metodzie jest st ężeniem badanej substancji, która 
powoduje x % zmienno ści we wska źniku rozwoju ryb w porównaniu 
z doświadczeniem kontrolnym.  
Wskaźnik obciążenia:  jest wilgotn ą masą ryb na obj ętość wody.  
Gęstość wyjściowa:  jest liczb ą ryb do obj ętości wody.  
Wskaźnik szczególnego rozwoju okre ślonej ryby:  wyrażenie 
wskaźnika rozwoju okre ślonej jednostki w oparciu o jej pocz ątkową 
wagę. 
Średni zbiornikowy wska źnik szczególnego rozwoju:  wyrażenie 
średniego wska źnika wzrostu populacji w zbiorniku przy jednym 
stężeniu.  
Wskaźnik pseudoszczególnego rozwoju:  wyrażenie wska źnika 
określonego rozwoju w proporcji do średniej wagi pocz ątkowej 
populacji zbiornika.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1146  
( 1 ) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish 
(Danio rerio ), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative 
method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
 1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Młode ryby w fazie wyk ładniczej rozwoju s ą umieszczane po 
zważeniu w komorach do bada ń i eksponowane w zakresie st ężenia 
subletalnego substancji badanej rozpuszczonej w najlepiej strumie ­
niem wody lub je śli to niemo żliwe, we w łaściwych, pó łstatycznych 
(statycznie odnawialnych) warunkach. Czas trwania badania wynosi 28 dni. Ryby s ą karmione codziennie. Racje żywności są oparte na 
początkowej wadze ryb i przeliczane po 14 dniach. Na koniec 
badania ryby s ą ważone ponownie. Skutki w odniesieniu do 
wskaźników rozwoju s ą analizowane, stosuj ąc model regresyjny 
w celu prognozowania st ężenia, które spowoduje x % zmienno ści 
w wskaźniku rozwoju, tj. EC
 x (np. EC  10 , EC  20 lub EC  30 ). Alterna ­
tywnie, dane s ą porównywane z obj ętością w doświadczeniu kontro ­
lnym w celu ustalenia najni ższego obserwowanego skutku st ężenia 
(LOEC), a st ąd też nieobserwowanego skutku st ężenia (NOEC).  
1.4. INFORMACJE DOTYCZ ĄCE SUBSTANCJI BADANEJ  
Wyniki badania ostrej toksyczno ści (zob. metoda badania C.1), 
najlepiej przeprowadzone z gatunkami wybranymi do niniejszego 
badania, powinny by ć dostępne. Oznacza to, że rozpuszczalno ść 
w wodzie i ci śnienie pary badanej substancji s ą znane, 
a wiarygodna analityczna metoda jest dost ępna w odniesieniu do 
ujęcia ilościowego substancji w roztworach badanych, ze znan ą 
i udokumentowan ą dokładnością oraz granic ą wykrywalno ści. 
Użyteczne informacje obejmuj ą wzór strukturalny, czysto ść substan­
cji, stabilno ść w wodzie i na świetle, pK  a , P ow oraz wyniki badania 
całkowitej biodegradacji (zob. metoda C.4).  
1.5. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ł ważne, stosuje si ę następujące warunki:  
— śmiertelno ść w doświadczeniach kontrolnych nie mo że przekra ­
czać 10 % na koniec badania,  
— średnia waga ryb w do świadczeniach kontrolnych musi wzrosn ąć 
wystarczaj ąco, aby pozwoli ć na wykrycie minimalnych zmian 
wskaźnika rozwoju uznanego za znacz ący. Próba pier ścieniowa 
(2) wykaza ła, że w odniesieniu do pstr ąga tęczowego średnia 
waga ryb w do świadczeniach kontrolnych wzros ła co najmniej 
o połowę (tj. 50 %) ich średniej wagi pocz ątkowej przez ponad 
28 dni; tj. waga pocz ątkowa: 1 g/ryba (= 100 %), waga ko ńcowa 
po 28 dniach: ≥ 1,5 g/ryba ( ≥ 150 %),  
— stężenie tlenu rozpuszczonego musi wynosi ć co najmniej 60 % 
wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie badania,  
— różnica temperatury wody nie mo że być większa niż ± 1  o C 
między komorami do bada ń przez ca ły czas trwania badania 
i musi by ć utrzymywana w obr ębie 2  o C zakresu temperatur 
określonego w odniesieniu do gatunków badanych (dodatek 1).  
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Aparatura  
Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególno ści następujący: 
— mierniki tlenu i pH metry,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
— sprzęt do oznaczania alkaliczno ści i twardo ści wody,  
— odpowiednia aparatura do pomiaru temperatury, zalecane jest 
stałe monitorowanie,  
— zbiorniki wykonane z chemicznie oboj ętnego materia łu 
o odpowiedniej obj ętości w zale żności do zalecanej g ęstości 
wyjściowej i obci ążenia (zob. pkt 1.8.5 i dodatek 1),  
— waga o odpowiedniej dok ładności (tj. dok ładności do ± 0,5 %).  
1.6.2.  Woda  
Każda woda, w której badane gatunki wykazuj ą odpowiednie d ługo­
terminowe prze życie i wzrost, mo że być stosowana jako woda do 
badań. Musi by ć stałej jakości w okresie trwania badania. Warto ść 
pH wody powinna by ć w zakresie 6,5–8,5, lecz w trakcie danego 
badania musi by ć w zakresie ± 0,5 pH. Twardo ść powyżej 140 mg/l 
(jako CaCO  3 ) jest zalecana. W celu zapewnienia, aby rozcie ńczająca 
woda nie mia ła falowego wp ływu na wyniki badania (np. przez 
kompleksowanie substancji badanej), nale ży okresowo pobiera ć 
próbki wody do analizy. Co trzy miesi ące na przyk ład powinny 
być wykonane pomiary metali ci ężkich (takich jak Cu, Pb, Zn, 
Hg, Cd i Ni), g łównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, 
Cl i SO  4 ), pestycydów (np. ca łkowita ilo ść fosforo- 
i chloroorganicznych), ca łkowity w ęgiel organiczny i zawiesina 
ciał stałych, w przypadku gdy rozcie ńczająca woda jest znana jako 
stosunkowo sta ła w jakości. Jeśli można przedstawi ć dane, że jakość 
wody była stała przynajmniej przez rok, oznaczenia mog ą być mniej 
częste i przedzia ły poszerza si ę (np. co sze ść miesięcy). Kilka cech 
chemicznych akceptowalnej wody rozcie ńczającej wymieniono 
w dodatku 2.  
1.6.3.  Roztwory u żyte w badaniu  
Roztwory w badaniu o wybranym st ężeniu są przygotowywane 
poprzez rozcie ńczanie roztworu podstawowego.  
Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez proste 
wymieszanie badanej substancji w wodzie rozcie ńczającej 
w sposób mechaniczny (np. mieszad ło lub ultrad źwięki). Kolumny 
nasyceniowe (rozpuszczaj ące) mogą być użyte do uzyskania odpo ­
wiednio st ężonego roztworu podstawowego.  
W kilku przypadkach mo że być wymagane u życie rozpuszczalników 
lub dyspergatorów ( środków rozpuszczaj ących) w celu wykonania 
odpowiednio st ężonego roztworu podstawowego. Przyk ładami odpo ­
wiednich rozpuszczalników s ą aceton, etanol, metanol, dimetylosul ­
fotlenek, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przyk ładami 
odpowiednich dyspergatorów s ą Cremophor RH40, Tween 80, Mety ­
loceluloza 0,01 % i HCO-40. Nale ży zachowa ć ostrożność przy 
użyciu łatwo biodegradowalnych środków (np. aceton) i/lub wyso ­
kolotnych zwi ązków, gdy ż mogą być przyczyn ą problemów 
z rozwojem bakterii w przep ływach bada ń. Gdy stosuje si ę środki 
rozpuszczaj ące, nie mog ą one mie ć znaczącego wpływu na wzrost 
ryb i widocznych negatywnych dzia łań na młode ryby, jak odkryto 
w doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Dla bada ń przepływowych wymagany jest system ci ągłego dozo ­
wania i rozcie ńczania roztworu podstawowego substancji badanej 
(np. pompa dozuj ąca, rozcie ńczalnik proporcjonalny, system nasyca ­
nia) do przesy łania serii st ężeń do komór do bada ń. Szybkości prze­
pływów roztworu podstawowego i rozcie ńczającej wody musz ą być 
sprawdzane okresowo, najlepiej codziennie w trakcie trwania bada ­
nia, oraz nie mog ą zmieniać się więcej niż 10 % w trakcie badania. 
Badanie pier ścieniowe (2) wykaza ło, że w odniesieniu do pstr ąga 
tęczowego cz ęstotliwość wymiany wody w trakcie trwania badania 
jest akceptowalna przy 6 litrów/g ryby/dzie ń (zob. pkt 1.8.2.2).  
Dla bada ń półstatycznych (odnawialnych) cz ęstotliwość odnawiania 
ośrodka zale ży od stabilno ści substancji badanej, lecz zalecane jest 
codzienne odnawianie wody. Je śli ze wst ępnych bada ń stabilności 
(zob. pkt 1.4) wynika, że stężenie substancji badanej nie jest stabilne 
(tj. poza zakresem nominalnego 80–120 % lub spada poni żej 80 % 
zmierzonego st ężenia pocz ątkowego) przez okres odnowienia, nale ży 
rozważyć celowość użycia badania przep ływowego.  
1.6.4.  Wybór gatunków  
Pstrąg tęczowy ( Oncorhynchus mykiss ) jest zalecanym gatunkiem do 
niniejszego badania, poniewa ż uzyskano najwi ęcej doświadczeń z 
prób pier ścieniowych z tym gatunkiem (1)(2). Mo żna jednak że 
zastosowa ć inne, dobrze udokumentowane gatunki, lecz mo że być 
niezbędne przyj ęcie procedury badania w celu zapewnienia odpo ­
wiednich warunków badania. Dost ępne są doświadczenia, na przy ­
kład z danio pr ęgowanym ( Danio rerio ) (3)(4) i  Oryzias latipes  
(5)(6)(7). W takim przypadku powinno by ć podane racjonalne 
uzasadnienie wyboru i metody eksperymentalnej.  
1.6.5.  Przetrzymanie ryb  
Badane ryby musz ą być wybrane z populacji wyj ściowej pojedyn ­
czo, najlepiej z tego samego tar ła, przetrzymywanego co najmniej 
dwa tygodnie przed badaniem w warunkach jako ści wody 
i oświetlenia zbli żonych do stosowanych w badaniu. Powinny one 
być karmione racj ą minimum 2 % wagi cia ła dziennie, a najlepiej 
4 % wagi cia ła na dzie ń przez okres przetrzymania i w trakcie 
trwania badania.  
Przez nast ępujący od rozpocz ęcia okres 48 godzin notowana jest 
śmiertelno ść i stosuje si ę następujące kryteria:  
— śmiertelno ść większa niż 10 % populacji przez siedem dni: 
odrzucić całą partię, 
— śmiertelno ść między 5 % i 10 % populacji: aklimatyzacja przez 
siedem dodatkowych dni, je śli więcej niż 5 % śmiertelno ści 
w ciągu tych siedmiu dni, odrzuci ć całą partię, 
— śmiertelno ść mniejsza od 5 % populacji w ci ągu siedmiu dni: 
dopuścić partię. 
Ryby nie mog ą być taktowane leczniczo przez dwa tygodnie poprze ­
dzające badanie ani w ci ągu jego trwania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. PROJEKT BADANIA  
„Projekt badania” odnosi si ę do wyboru ilo ści i odstępów stężeń 
badanych, liczb ą zbiorników dla ka żdego poziomu i liczb ą ryb na 
zbiornik. W idealnym przypadku taki projekt badania powinien by ć 
wybierany z uwzgl ędnieniem:  
— celu badania,  
— metody statystycznej analizy, która b ędzie wykorzystana,  
— dostępność i źródła finansowania eksperymentu.  
Oświadczenie o celu badania powinno, je śli jest to mo żliwe, okre ślać 
statystyczn ą zdolność, przy której ró żnica danego wymiaru (np. we 
wskaźniku rozwoju) wymaganego jest mo żliwa do obserwacji lub, 
alternatywnie, precyzj ą, z jaką EC  x (na przyk ład x = 10, 20 lub 30, 
a najlepiej nie mniej ni ż 10) ma by ć oszacowane. Bez tego zwi ęz­ 
łego określenie zakresu badania nie mo że być podane.  
Istotne jest, aby uzna ć, że projekt, który jest optymalny (najlepszy 
z użyciem źródeł) przy użyciu jednej metody analizy statystycznej, 
nie jest koniecznie optymalny dla innej. Zalecany projekt dla osza ­
cowania LOEC/NOEC dlatego nie by łby taki sam jak zalecany dla 
analizy metod ą regresji.  
W większości przypadków, analiza regresyjna jest zalecana dla 
analizy wariancji, z przyczyn omówionych przez Stephan i Rogers (8). Jednak że jeżeli nie znaleziono odpowiedniego modelu regresji 
(r
 2 < 0,9) powinna by ć zastosowana metoda NOEC/LOEC.  
1.7.1.  Projekt analizy regresyjnej  
Ważnymi rozwa żaniami w projekcie badania, które maj ą być zana­
lizowane metod ą regresyjn ą, są: 
— skutek st ężenia (np. EC  10, 20, 30  ) i zakres st ężeń powyżej, którego 
wpływ substancji badanej jest poza zainteresowaniem, powinien 
być koniecznie osi ągnięty przez st ężenie włączone do bada ń. 
Dokładność, z którą ocena wp ływu stężenia jest wykonywana, 
jest najlepsza, gdy wp ływ stężenia jest po środku zakresu bada ­
nych stężeń. Wstępne badanie szukania zakresu mo że być 
pomocne w wybraniu w łaściwych st ężeń badanych,  
— w celu zapewnienia zadawalaj ącego modelu statystycznego 
badanie powinno obejmowa ć co najmniej jeden zbiornik 
kontrolny i pi ęć dodatkowych zbiorników o ró żnych stężeniach. 
Tam gdzie to jest stosowne, gdy stosowany jest środek ułat­
wiający rozpuszczanie, nale ży przeprowadzi ć obok serii badanej 
jedno doświadczenie kontrolne z tym środkiem przy najwy ższym 
badanym st ężeniu (zob. pkt 1.8.3 i 1.8.4),  
— właściwe serie geometryczne lub serie logarytmiczne (9) (zob. 
dodatek 3) mog ą być wykorzystane. Zaleca si ę odstępy logaryt ­
miczne w st ężeniach badanych,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
— o ile jest dost ępne więcej niż sześć zbiorników, dodatkowe zbior ­
niki musz ą być użyte albo do zapewnienia powtórzenia lub 
rozdziału w poprzek zakresu st ężeń, w celu zapewnienia bli ż­
szego odst ępu poziomów. Oba z tych środków s ą w równym 
stopniu po żądane.  
1.7.2.  Projekt dotycz ący oszacowania NOEC/LOEC przy u życiu 
analizy wariancji (ANOVA)  
Zalecane jest posiadanie skopiowanych zbiorników dla ka żdego 
stężenia i analizy statystycznej na poziomie zbiornika (10). Bez 
skopiowanych zbiorników nie mo żna zastosowa ć poprawek dla 
zmienności między zbiornikami, poza spodziewanymi dla poszcze ­
gólnych ryb. Jednak że doświadczenie pokaza ło (11), że zmienno ść 
między zbiornikami jest bardzo ma ła w porównaniu ze zmienno ścią 
w obrębie zbiorników (tj. mi ędzy rybami) w badanym przypadku. 
Dlatego wzgl ędnie dopuszczaln ą alternatyw ą jest przeprowadzenie 
analizy statystycznej na poziomie poszczególnych ryb.  
Zwyczajowo stosuje si ę co najmniej pi ęć stężeń badanych 
w serii geometrycznej ze wspó łczynnikiem zalecanym nieprzekra ­
czającym 3,2.  
Ogólnie, gdy badania s ą prowadzone ze skopiowanymi zbiornikami, 
liczba skopiowanych zbiorników kontrolnych, a zatem i liczba ryb 
musi być podwojona przy ka żdym badaniu st ężenia, które powinny 
być równowa żnych rozmiarów (12)(13)(14). Z drugiej strony, przy 
nieobecno ści skopiowanych zbiorników, liczba ryb w grupie kontro ­
lnej powinna by ć taka sama jak liczba przy ka żdym badaniu 
stężenia.  
Jeśli ANOVA ma opiera ć się na zbiornikach, a nie na poszczegól ­
nych rybach (poci ąga to albo oznaczanie poszczególnych ryb albo 
użycie „pseudoszczególnych” wska źników rozwoju (zob. pkt 2.1.2), 
zachodzi potrzeba wystarczaj ącego skopiowania zbiorników w celu 
zapewnienia oznaczenia standardowego odchylenia „st ężeń 
w obrębie zbiorników”. To oznacza, że stopień swobody b łędu 
w analizie wariancji musi wynosi ć co najmniej 5 (11). Je śli tylko 
doświadczenia kontrolne s ą powielane zachodzi niebezpiecze ństwo, 
że zmienno ść błędu będzie obci ążona, poniewa ż może to zwiększyć 
rozważaną wartość średnią wskaźnika rozwoju. Poniewa ż wskaźnik 
rozwoju prawdopodobnie zmniejszy si ę ze wzrostem st ężenia, będzie 
to powodowa ło przeszacowanie zmienno ści. 
1.8. PROCEDURA  
1.8.1.  Wybór i wa żenie ryb badanych  
Istotne jest, aby zminimalizowa ć zmienno ść wagi ryb na pocz ątku 
badania. Odpowiedni zakres wymiarowy dla ró żnych gatunków zale ­
canych do wykorzystania w tym badaniu podano w dodatku 
1. W odniesieniu do ca łej partii ryb wykorzystanych w badaniu 
zakres poszczególnych wag na pocz ątku badania powinien by ć 
idealnie utrzymany w obr ębie ± 10 % średniej arytmetycznej wagi, 
a w żadnym przypadku nie mo że przekracza ć 25 %. Zalecane jest 
zważenie podpróbki ryb przed badaniem, w celu oszacowania śred­
niej wagi.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
Należy wstrzyma ć żywienie populacji na 24 godziny przed rozpocz ę­
ciem badania. Ryby powinny by ć wybrane losowo. Stosuj ąc ogólne 
znieczulenie (np. roztwór wodny 100 mg/l tricainy metanosulfonianu (MS 222) zneutralizowanej przez dodanie dwóch cz ęści dwuwęglanu 
sodu na jedn ą część MS 222), ryby powinny by ć zważone poje­
dynczo w stanie wilgotnym (osuszone) z dok ładnością podaną 
w dodatku 1. Ryby, których waga jest w zamierzonym zakresie powinny by ć zatrzymane i nast ępnie losowo rozdzielone do zbior ­
ników do bada ń. Całkowita waga ryb w ka żdym zbiorniku powinna 
być odnotowana. U życie znieczulenia u łatwia manipulacj ę rybami 
(włączając suszenie i wa żenie) mo że jednak powodowa ć stres 
i zranienia dla m łodocianych ryb, w szczególno ści dla gatunków 
o małych wymiarach. Dlatego manipulowanie m łodocianymi rybami 
musi być wykonane z najwy ższą troską, aby zapobiec stresom 
i zranieniom badanych zwierz ąt.
 
Ryby są ważone ponownie w 28 dniu badania (zob. pkt 1.8.6). 
Jednakże jeśli jest to uwa żane za niezb ędne przeliczenie racji żywie­
niowej, ryby s ą ważone ponownie 14 dnia badania (zob. pkt 1.8.2.3). 
Inne metody, takie jak metoda fotograficzna, mog ą być stosowane do 
ustalania zmiany rozmiarów ryb, na podstawie których mo żna dosto­
sować racje żywieniowe.  
1.8.2.  Warunki ekspozycji  
1.8.2.1.  Czas trwania  
Czas trwania badania wynosi ≥ 28 dni.  
1.8.2.2.  Wska źnik obciążenia i gęstości wyjściowe  
Istotne jest, aby wska źnik obciążenia i gęstość wyjściowa by ły 
właściwe dla wykorzystanych gatunków badanych (zob. dodatek 
1). Jeśli gęstość wyjściowa jest za wysoka, wtedy stres z powodu 
zatłoczenia mo że prowadzi ć do zmniejszenia wska źnika rozwoju 
i prawdopodobnie do choroby. Je śli jest za ma ła, może wytwarza ć 
zachowywanie terytorialne, które równie ż wpływa na rozwój. 
W każdym przypadku wska źnik obciążenia powinien by ć wystar­
czająco niski, aby st ężenie tlenu rozpuszczonego wynosi ło przynaj ­
mniej 60 % ASV i by ło utrzymywana bez napowietrzania. Próba 
pierścieniowa (2) pokaza ła, że w odniesieniu do pstr ąga tęczowego 
wskaźnik obciążenia dla 16 pstr ągów po 3–5 gram w 40-litrowej 
objętości jest dopuszczalny. Zalecana cz ęstotliwość usuwania wody 
w czasie trwania badania wynosi 6 litrów/gram ryby/dzie ń. 
1.8.2.3.  Karmienie  
Ryby musz ą być karmione w łaściwym pokarmem (dodatek 1) 
w wystarczaj ącej ilości dla wytworzenia akceptowalnego wska źnika 
rozwoju. Nale ży zwrócić uwagę, aby zapobiec rozwojowi mikrobów 
i mętności wody. Dla pstr ąga tęczowego wska źnik 4 % ich wagi 
ciała dziennie prawdopodobnie spe łnia te warunki (2)(15)(16)(17). 
Dzienna racja mo że być podzielona na dwie równe porcje 
i podawana rybom w dwóch posi łkach dziennie, w odst ępie co 
najmniej pi ęciu godzin. Racje s ą oparte na pocz ątkowej ca łkowitej 
wadze ryb w ka żdym zbiorniku do bada ń. Jeśli ryby s ą ważone 
ponownie 14 dnia racje s ą wtedy przeliczane. Karmienie powinno 
być wstrzymane na 24 godziny przed wa żeniem.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Niezjedzony pokarm i odchody ryb musz ą być usuwane ze zbior ­
ników do bada ń codziennie, poprzez staranne czyszczenie dna zbior ­
ników stosuj ąc ssanie.  
1.8.2.4.  Światło i temperatura  
Czas naświetlania i temperatura wody musz ą być odpowiednie dla 
badanego gatunku (dodatek 1).  
1.8.3.  Stężenia użyte w badaniu  
Zwykle wymagane jest pi ęć stężeń badanych, poza projektem 
badania (zob. pkt 1.7.2). Wcze śniejsza znajomo ść toksyczno ści 
substancji badanej (np. z badania ostrej toksyczno ści i/lub ustalonego 
w badaniach zakresu) pomaga w doborze w łaściwych st ężeń bada­
nych. Najwy ższe stężenie badane nie mo że przekracza ć granicy 
rozpuszczalno ści substancji w wodzie.  
W przypadku gdy środek ułatwiający rozpuszczenie towarzyszy 
w przygotowaniu roztworu wyj ściowego jego ko ńcowe stężenie nie 
może być większe niż 0,1 ml/l i zalecane jest takie same we wszyst ­
kich zbiornikach do bada ń (zob. pkt 1.6.3). Jednak że należy dołożyć 
wszelkich stara ń, aby unikn ąć użycia takich materia łów. 
1.8.4.  Do świadczenia kontrolne  
Liczba do świadczeń kontrolnych wody rozcie ńczającej zależy od 
projektu badania (zob. pkt 1.7–1.7.2). Je śli stosowany jest środek 
ułatwiający rozpuszczanie, powinna by ć przeprowadzona taka sama 
liczba do świadczeń kontrolnych co liczba do świadczeń kontrolnych 
z wodą rozcieńczającą. 
1.8.5.  Cz ęstotliwość oznaczeń analitycznych i pomiarów  
W czasie trwania badania st ężenia substancji badanej s ą oznaczane 
w regularnych odst ępach czasu (zob. poni żej). 
W badaniach przep ływowych wska źniki przep ływu rozcie ńczalnika 
i roztworu wyj ściowego toksykanta musz ą być sprawdzane 
w odstępach czasu, najlepiej codziennie, i nie mog ą się zmieniać 
więcej niż 10 % w trakcie badania. W przypadku gdy oczekuje 
się, że stężenie badanej substancji b ędzie w zakresie ± 20 % warto ści 
nominalnej (tj. w zakresie 80–120 %; zob. pkt 1.6.2 i 1.6.3), jest 
zalecane, aby jako minimum wykona ć analizę najmniejszego 
i największego st ężenia substancji badanej na pocz ątku badania 
i w tygodniowych odst ępach czasu, w okresie pó źniejszym. 
W przypadku gdy oczekuje si ę, że stężenie substancji badanej pozo ­
stanie w zakresie ± 20 % nominalnej warto ści (na podstawie danych 
stabilności substancji badanej), niezb ędne jest analizowanie wszyst ­
kich stężeń badanych, ale przy zastosowaniu tego samego systemu.  
W półstatycznych (odnawialnych) badaniach, w przypadku gdy 
oczekuje si ę, że stężenie badanej substancji pozostanie w zakresie 
± 20 % nominalnej warto ści, jest zalecane, aby jako minimum anali ­
zować najniższe i najwy ższe stężenia badane świeżo po przygoto ­
waniu i zaraz przed odnowieniem, na pocz ątku bada ń 
i cotygodniowo w okresie pó źniejszym. Dla bada ń gdzie nie ocze ­
kuje się, że stężenie substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20 % 
nominału, wszystkie badane st ężenia musz ą być analizowane, przy 
zastosowaniu tego samego systemu co dla substancji bardziej stabil ­
nych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Zalecane jest, aby wyniki oparte by ły na pomierzonych st ężeniach. 
Jeżeli jednak że dostępne dowody wykazuj ą, że stężenie badanej 
substancji w roztworze mo żna z powodzeniem utrzymywa ć 
w obszarze ± 20 % nominalnego lub wst ępnie zmierzonego st ężenia 
poprzez okres badania, wtedy wyniki mog ą być oparte na 
wartościach nominalnych lub zmierzonych.  
Próbki mog ą wymagać przefiltrowania (np. stosuj ąc 0,45 μm wymiar 
poru) lub odwirowania. Odwirowanie jest zalecan ą procedur ą. 
Jednakże jeśli badany materia ł nie adsorbuje si ę na filtrze, dopusz ­
czalna jest te ż filtracja.  
W czasie trwania badania powinny by ć mierzone tlen rozpuszczony, 
pH i temperatura we wszystkich zbiornikach. Ca łkowita twardo ść, 
alkaliczno ść i zasolenie (je śli dotyczy) musz ą być mierzone 
w doświadczeń kontrolnych i w zbiorniku o najwy ższym stężeniu. 
Jako minimum nale ży pomierzy ć rozpuszczony tlen i zasolenie (je śli 
dotyczy) trzy razy (na pocz ątku, w środku i pod koniec badania). 
W badaniach pó łstatycznych jest zalecane, aby rozpuszczony tlen by ł 
mierzony cz ęściej, najlepiej przed i po ka żdej wymianie wody lub co 
najmniej raz na tydzie ń. Wartość pH na pocz ątku i na ko ńcu każdej 
wymiany wody w badaniach statycznych odnawialnych i co najmniej 
cotygodniowo w badaniach przep ływowych. Twardo ść i alkaliczno ść 
powinny by ć mierzone jednorazowo w ka żdym badaniu. Zalecane 
jest stałe monitorowanie temperatury w przynajmniej jednym zbior ­
niku do bada ń. 
1.8.6.  Obserwacje  
Ważenie: pod koniec badania wszystkie ryby, które prze żyły, muszą 
być zważone jako masa wilgotna (osuszone) albo grupowo 
z badanego zbiornika albo pojedynczo. Zalecane jest wa żenie ryb 
z badanego zbiornika, zamiast poszczególnych ryb, gdy ż wymaga 
to indywidualnego oznaczenia ryby. W przypadku pomiarów wagi 
poszczególnych ryb, w celu oznaczenia wska źnika szczególnego 
rozwoju okre ślonej ryby, wybrana technika oznaczania powinna 
zapobiega ć stresowaniu zwierz ąt (alternatywne do oznaczania 
w stanie zamro żonym jest stosowne oznaczenie ryby np. kolorow ą 
cienką linią). 
Ryby powinny by ć sprawdzane codziennie w czasie trwania okresu 
badania na jakiekolwiek zewn ętrzne odst ępstwa od normalno ści 
(takie jak krwotoki, odbarwienia) oraz nienormalne zachowanie. Każdy przypadek śmiertelny musi by ć odnotowany, a martwa ryba 
usunięta tak szybko jak to mo żliwe. Martwe ryby nie s ą zastępo­
wane, wska źnik obciążenia i gęstość wyjściowa są wystarczaj ące, 
aby zapobiec wp ływowi na rozwój poprzez zmiany w ilo ści ryb na 
zbiornik. Jednak że zachodzi potrzeba dostosowania wska źnika 
żywieniowego.
 
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Jest zalecane, aby statystyka obejmowa ła zarówno projekt, jak 
i analizę badania, poniewa ż niniejsza metoda badania pozwala na 
uwzględnienie znacznej zmiany w projekcie do świadczenia, tak ą 
jak na przyk ład ilość komór do bada ń, liczbę stężeń badanych, liczb ę 
ryb itd. Uwzgl ędniając dostępne opcje w projekcie badania, nie 
podano tutaj informacji dotycz ących procedur statystycznych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
Wskaźniki rozwoju nie powinny by ć obliczane w odniesieniu do 
zbiorników do bada ń, gdy śmiertelno ść przekracza 10 %. Jednak że 
wskaźnik śmiertelno ści powinien by ć wskazany w odniesieniu do 
wszystkich st ężeń badanych.  
Którakolwiek metoda jest stosowana do analizy danych, g łównym 
pojęciem jest wska źnik szczególnego rozwoju r mi ędzy czasem t  1 
i czasem t  2 . Może to być określone na kilka sposobów zale żnych 
od tego, czy ryby by ły indywidualnie oznaczane czy nie albo czy 
wymagana jest średnia zbiornika.  
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100  
gdzie:  
r 1 = wskaźnik szczególnego rozwoju okre ślonej ryby,  
r 2 = średniego zbiornikowy wska źnik szczególnego rozwoju,  
r 3 = wskaźnik pseudoszczególnego rozwoju,  
w 1 , w 2 = wagi poszczególnych ryb w czasach odpowiednio t  1 i t 2 , 
log e w 1 = logarytm wagi okre ślonej ryby na pocz ątku okresu bada ­
nia, 
log e w 2 = logarytm wagi okre ślonej ryby pod koniec okresu bada ­
nia, 
log e W 1 = średnia logarytmów warto ści w  1 w odniesieniu do ryb 
w zbiorniku na pocz ątku okresu badania,  
log e W 2 = średnia logarytmów warto ści w  2 w odniesieniu do ryb 
w zbiorniku pod koniec okresu badania,  
t 1 , t 2 = czas (dni) od startu do ko ńca okresu badania  
r 1 , r 2 , r 3 może być obliczony w odniesieniu do okresu 0–28 dni i, 
tam gdzie to jest stosowne (np. gdy pomiar wykonano w 14 dniu) w odniesieniu do okresów czasu 0–14 i 14–28 dni.
 
2.1.1.  Regresyjna analiza wyników (modelowanie st ężenie-reakcja)  
Niniejsza metoda analizy dostosowuje odpowiedni ą matematyczn ą 
zależność między wska źnikiem szczególnego rozwoju a st ężeniem 
i stąd umożliwia obliczenie „EC  X ”, tj. każdej wymaganej warto ści 
WE. Stosuj ąc niniejsz ą metodę obliczenia r dla okre ślonej ryby (r  1 ), 
nie jest konieczne i zamiast tego analiza mo że być oparta na średniej 
zbiornikowej warto ści r (r  2 ). Ta ostatnia metoda jest zalecana. Jest 
także bardziej w łaściwa w przypadku u życia najmniejszych gatun ­
ków.  
Średnie zbiornikowe wska źniki szczególnego rozwoju (r  2 ) muszą być 
wykreślone graficznie w zale żności od stężenia w celu sprawdzenia 
zależności reakcji st ężenia. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
Dla wyra żenia zale żności między r  2 a stężeniem powinien by ć 
wybrany w łaściwy model, a wybór musi by ć poparty odpowiednim 
uzasadnieniem.  
Jeśli ilości ryb, które prze żyły w każdym zbiorniku s ą nierówne, 
wtedy proces dostosowania modelu albo prostego albo nieliniowego powinien by ć rozważony, aby uwzgl ędnić nierówno ść rozmiarów 
grup.
 
Metoda dostosowania modelu musi umo żliwiać oszacowanie czy na 
przykład EC  20 i jego rozrzut (czy b łąd standardowy czy przedzia ł 
ufności) może być wyprowadzony. Wykres dopasowanego modelu 
powinien by ć przedstawiony w zale żności od danych tak, aby odpo ­
wiedniość dopasowania modelu by ła widoczna (8)(18)(29)(20).  
2.1.2.  Analiza wyników dla oszacowania LOEC  
Jeżeli badanie obejmuje skopiowane zbiorniki przy wszystkich 
poziomach st ężeń, oszacowanie LOEC mo że być oparte na analizie 
wariancji (ANOVA) średniego zbiornikowego wska źnika szczegól ­
nego rozwoju (zob. pkt 2.1), wed ług odpowiednich metod (np. 
badania Dunnetta lub Williamsa (12)(13)(14)(21)) porównywania 
średniego r w odniesieniu do ka żdego stężenia ze średnią r w odnie ­
sieniu do do świadczeń kontrolnych dla okre ślenia najni ższego stęże­
nia, dla którego ta ró żnica jest znacz ąca przy poziomie prawdopo ­
dobieństwa 0,05. Je śli wymagane przyj ęcie dla metod parametrycz ­
nych nie odpowiada nienormalnemu rozk ładowi (np. badanie 
Shapiro-Wilka) lub heterogenicznej wariancji (badanie Bartletta), należy podjąć rozważania w celu przekszta łcenia danych do jedno ­
litych wariancji przed zastosowaniem ANOVA albo przeprowadze ­
niem ważonego ANOVA.
 
Jeśli badanie nie obejmuje duplikatów zbiorników dla ka żdego stęże­
nia, ANOVA oparta o zbiorniki b ędzie niesensytywna albo niemo ż­
liwa. W tej sytuacji dopuszczalnym kompromisem jest ANOVA na pseudoszczególnym wska źniku rozwoju r
 3 dla poszczególnych ryb.  
Średnia r  3 dla każdego stężenia badanego mo że wtedy by ć porów­
nywana ze średnią r 3 dla doświadczeń kontrolnych. LOEC mo że być 
wtedy okre ślona jak poprzednio. Trzeba jednak uzna ć, że niniejsza 
metoda nie umo żliwia wprowadzania poprawek, ani nie zabezpiecza 
przed zmienno ściami mi ędzy zbiornikami, poza tymi, które s ą 
liczone dla zmienno ści między poszczególnymi rybami. Jednak że 
doświadczenie pokaza ło (8), że zmienno ść między zbiornikami jest 
bardzo ma ła w porównaniu z zmienno ścią wewnątrz zbiorników (tj. 
między rybami). Je śli poszczególne ryby nie s ą włączone do analizy, 
poboczna metoda identyfikacji i uzasadnienie jej u życia życia musz ą 
być przedstawione.  
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Wyniki musz ą być interpretowane z ostro żnością w przypadku, gdy 
mierzone st ężenie toksykanta w roztworach badanych wypada na 
poziomie granicy wykrywalno ści metody analitycznej lub 
w badaniach pó łstatycznych, gdy st ężenie substancji badanej obni ża 
się między świeżo przygotowanymi roztworami i przed wymian ą. 
2.3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— natura fizyczna i odpowiednie w łaściwości fizykochemiczne,  
— dane identyfikacji chemicznej w łączając czystość i metodę anali­
tyczną kwantyfikacji substancji badanej, tam gdzie jest to 
stosowne.  
2.3.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— możliwie nazwa naukowa,  
— szczep, wymiar, dostawca, wszystkie przedtraktowania itp.  
2.3.3.  Warunki badania:  
— zastosowana procedura badania (np. pó łstatyczna/odnawialna, 
przepływowa, obci ążenie, gęstość wyjściowa itp.),  
— projekt badania (np. liczba zbiorników do bada ń, stężenia badane 
i duplikatów, liczba ryb na zbiornik),  
— metoda przygotowania roztworów wyj ściowych i cz ęstotliwość 
odnawiania ( środek ułatwiający rozpuszczanie i jego st ężenie 
musi być podane, je śli jest stosowany),  
— nominalne st ężenia użyte w badaniu, średnie wielko ści mierzo ­
nych i ich standardowe odchylenia w zbiornikach do bada ń 
metody, którymi je uzyskano, oraz dowody, że pomiary odnosz ą 
się do stężeń substancji badanej w prawdziwym roztworze,  
— charakterystyka wody rozcie ńczającej: pH, twardo ść, alkalicz ­
ność, temperatura, st ężenie rozpuszczonego tlenu, poziom pozos ­
tałości chloru (je śli jest zmierzony), ca łkowity w ęgiel organiczny, 
zawieszone cz ąstki stałe, zasolenie o środka badanego (je śli jest 
zmierzony) oraz ka żde inne wykonane pomiary,  
— jakość wody w obr ębie zbiorników do bada ń: pH, twardo ść, 
temperatura i st ężenie rozpuszczonego tlenu,  
— szczegó łowe informacje dotycz ące karmienia (np. rodzaj po ży­
wienia, źródło, ilość podawana i cz ęstotliwość). 
2.3.4.  Wyniki:  
— dowody, że doświadczenia kontrolne odpowiadaj ą kryteriom 
ważności dla prze życia oraz dane śmiertelno ści zdarzaj ącej się 
w każdym stężeniu badanym,  
— zastosowane techniki statystyczno-analityczne, statystyka oparta 
na duplikatach lub rybach, opracowanie danych i uzasadnienie 
użytych technik,  
— stabelaryzowane dane wagi średniej i indywidualnej ryb 
w dniach 0, 14 (je śli są zmierzone) i 28 warto ści średniej zbior ­
nikowej lub pseudoszczególnych wska źników rozwoju (je śli to 
stosowne) w okresie 0–28 dni lub mo żliwie 0–14 i 14–28,  
— wyniki analizy statystycznej (tj. analizy regresyjnej lub ANOVA) 
zalecane w tabelarycznej i graficznej formie oraz LOEC (p = 
0,05) i NOEC lub EC  x z, o ile mo żliwe, błędami standardowymi, 
jeśli właściwe,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— wypadki wszystkich niezwyk łych reakcji ryb i wszystkie 
wizualne efekty, wytworzone przez substancj ę badaną. 
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals 
(CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for 
Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. 
WRc Report No PRD 1388-M/2.  
(2) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring 
Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on 
the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
 
(3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic 
chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855–1870.  
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., 
Munk R., Scholz N. and Hofte B. B. (1991). Effect of 3,4- dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Bra ­
chydanio rerio): results of a comparative laboratory study. 
Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157–164.
 
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biolo ­
gical field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
 
(6) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., 
Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long- term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Ory ­
zias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287–297.
 
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). 
Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese 
medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA- 
600/3-91-063. US Environmental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
 
(8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using 
regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Sympo ­
sium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328–338.
 
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity 
tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, 
Ontario, Report EPS 1/RM/28, 81 p.
 
(10) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.  
(11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests 
for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts 
on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 
10–12 December 1991.
 
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
 
(13) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482–491.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1158
 
(14) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103–117.  
(15) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). 
A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout,  
Oncorhynchus mykiss : effect of feeding level. Aquaculture 
120, pp. 123–133.
 
(16) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed 
cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout,  Oncorhynchus mykiss . Journal of Fish 
Biology, 37, pp. 33–41.
 
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. 
Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
 
(18) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. 
Chem. 11, pp. 1485–1494.  
(19) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, 
J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). 
Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival 
and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA- 6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
 
(20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for 
chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protec ­
tion Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minne ­
sota. Tech. Rep. No 05–88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
 
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510–531.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1159
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
DODATEK 1  
GATUNKI RYB ZALECANE DO BADANIA I ODPOWIEDNIE WARUNKI BADANIA  
Gatunki Zalecana tempera ­
tura badania zakres 
temperatur 
( o C) Okres na świetlania 
(godziny) Zalecany zakres 
początkowej wagi 
ryby 
(g) Wymagana dok ład­
ność pomiarowa Wskaźnik obci­ 
ążenia 
(g/l) Gęstość wyjściowa 
(na litr) Pokarm Czas trwania 
badania 
(dni) 
Zalecane gatunki:  
Oncorhynchus mykiss  
Pstrąg tęczowy 12,5–16,0 12 – 16 1 – 5 100 mg 1,2 – 2,0 4 Sucha pasza dla narybka ≥ 28 
Inne dobrze udokumentowane 
gatunki:  
Danio rerio  
Zebrafish 21 – 25 12 – 16 0,050 – 0,100 1 mg 0,2 – 1,0 5 – 10 Żywa żywność (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28 
Oryzias latipes  
Ricefish (Medaka) 21 – 25 12 – 16 0,050 – 0,100 1 mg 0,2–1,0 5 – 20 Żywa żywność (Brachionus 
Artemia)  ≥ 28
DODATEK 2  
NIEKTÓRE CECHY CHEMICZNE DOPUSZCZONEJ WODY 
ROZCIE ŃCZAJĄCEJ  
Substancja St ężenie 
Cząstki stałe < 20 mg/l 
Całkowity w ęgiel organiczny < 2 mg/l 
Niezjonizowany amoniak < 1 μg/l 
Pozostałość chloru < 10 μg/l 
Całkowite pestycydy fosforoorganiczne < 50 ng/l 
Całkowite pestycydy chloroorganiczne plus polichloro ­
wane bifenyle < 50 ng/1 
Calkowity chlor organiczny < 25 ng/1  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1161
 
DODATEK 3  
Logarytmiczne serie st ężeń odpowiednich dla badania toksyczno ści (9)  
Kolumna (liczba st ężeń między 100 i 10 lub mi ędzy 10 i 1) (*) 
1 2 3 i 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 65 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Serie pi ęciu (lub wi ęcej) kolejnych st ężeń mogą być wybrane z kolumny. Punkt środkowy mi ędzy stężeniami w kolumnie (x) s ą 
znajdowane w kolumnie (2x + 1). Zamieszczone warto ści przedstawiaj ą stężenia wyra żone w procentach obj ętościowo lub wagowo 
(mg/l lub μg/l). Warto ści mogą być zwielokrotniane lub dzielone przez ka żdą potęgę 10, jeśli to konieczne. Kolumna 1 mo że być 
używana, je śli była znaczna niepewno ść w poziomie toksyczno ści. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  RYBY, KRÓTKOTERMINOWE BADANIE TOKSYCZNO ŚCI 
NA EMBRIONIE I NARYBKU  
1. METODA  
Niniejsze badanie toksyczno ści krótkoterminowej jest kopi ą OECD 
TG 212 (1998).  
1.1. WPROWADZENIE  
Niniejsze krótkoterminowe badanie toksyczno ści na rybim embrionie 
i narybku jest krótkoterminowym badaniem, w którym etapy życia 
od świeżo zapłodnionego jaja do ko ńca stadium narybka s ą poddane 
ekspozycji. W badaniu tym niewymagane jest karmienie, pod warun ­
kiem że próba zostanie uko ńczona do momentu, w którym narybek 
są jeszcze żywione z worka żółtka. 
Celem badania jest okre ślenie śmiertelnego i, w ograniczonym zakre ­
sie, podśmiertelnego dzia łania substancji chemicznych na szczególne 
stadia oraz gatunki badane. Niniejsze badanie dostarcza u żytecznych 
informacji, tak że: a) stanowi po łączenie mi ędzy badaniami śmier­
telnymi i pod śmiertelnymi; b) jest wykorzystywane jako badanie 
obrazujące dla badania na pe łnym wczesnym stadium życia albo 
dla badań przewlek łej toksyczno ści; i c) jest wykorzystywane dla 
badania gatunków w przypadku, gdy techniki gospodarki rolnej nie 
są wystarczaj ąco zaawansowane do obj ęcia okresu zmian od stanu 
endogennego do egzogennego żywienia si ę. 
Należy uwzględnić, że tylko badania obejmuj ące wszystkie stadia 
cyklu życia ryby s ą ogólnie zdolne do dok ładnego oszacowania 
przewlekłej toksyczno ści substancji chemicznych na ryby oraz że 
jakiekolwiek zmniejszenie nara żenia odnosz ące się do etapów 
życia zmniejsza sensytywno ść i tak oszacowan ą za nisko przewlek łą 
toksyczno ść. Dlatego oczekuje si ę, że badanie na embrionie 
i narybku b ędą mniej sensytywne ni ż badanie na pe łnym wczesnym 
stadium życia, szczególnie w odniesieniu do substancji chemicznych 
o wysokiej lipofilno ści (log P  ow > 4) oraz substancji chemicznych 
o szczególnym sposobie toksycznego dzia łania. Jednak że mniejsze 
różnice w sensytywno ści między dwoma badaniami s ą oczekiwane 
w odniesieniu do substancji chemicznych o nieszczególnym, narkotycznym sposobie dzia łania (1).
 
Przed publikacj ą niniejszego badania wi ększość doświadczeń z tym 
badaniem embrionu i narybka by ło ze słodkowodn ą rybą Danio rerio  
Hamilton-Buchanan ( Teleostei, Cyprinidae  – zwyczajowa nazwa 
zebrafish). Bardziej szczegó łowe informacje dotycz ące przeprowa ­
dzania bada ń dla tego gatunku podano w dodatku 1. Nie wyklucza 
to użycia innych gatunków, w odniesieniu do których do świadczenie 
jest równie ż dostępne (tabela 1).  
1.2. DEFINICJE  
Najniższy obserwowany skutek st ężenia (LOEC):  jest to 
najmniejsze badane st ężenie substancji badanej, przy której obser ­
wuje się znaczący skutek (przy p < 0,05) w porównaniu 
z doświadczeniem kontrolnym. Jednak że wszystkie badane st ężenia 
powyżej LOEC musz ą wykazywa ć szkodliwy skutek, równy lub 
większy niż ten obserwowany przy LOEC.  
Nieobserwowany skutek st ężenia (NOEC):  jest stężeniem badanym 
bezpośrednio poni żej LOEC.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. ZASADA BADANIA  
Stadia embrionalne i narybka s ą eksponowane na zakres st ężeń 
badanej substancji rozpuszczonej w wodzie. W granicach protoko łu 
jest mo żliwy wybór mi ędzy procedurami pó łstatyczną 
i przepływową. Wybór zale ży od natury badanej substancji. Badanie 
rozpoczyna si ę od umieszczenia zap łodnionych jaj w komorze do 
badań i jest ko ńczone zaraz przed tym, gdy worek żółtka jakiejkol ­
wiek larwy w jakiejkolwiek z komór do bada ń został całkowicie 
zaabsorbowany lub przed śmiercią głodową rozpoczynaj ącą się 
w doświadczeniach kontrolnych. Skutki śmiertelne i pod śmiertne 
są oceniane i porównywane z warto ściami kontrolnymi w celu usta ­
lenia najni ższego obserwowanego skutku st ężenia, a st ąd nieobser ­
wowanego skutku st ężenia. Alternatywnie, mog ą być one analizo ­
wane, stosuj ąc model regresyjny w celu oszacowania st ężenia powo ­
dującego dany skutek procentowy (tj. LC/ECx, gdzie x jest 
określony jako skutek %).  
1.4. INFORMACJE DOTYCZ ĄCE SUBSTANCJI U ŻYTEJ 
W BADANIU  
Wyniki badania ostrej toksyczno ści (zob. metoda C.1) najlepiej prze ­
prowadzonego z gatunkami wybranymi do niniejszego badania powinny by ć dostępne. Wyniki mog ą być użyteczne w doborze 
odpowiedniego zakresu badanych st ężeń w badaniu we wczesnym 
stadium życia. Rozpuszczalno ść w wodzie ( łącznie 
z rozpuszczalno ścią w wodzie badanej) i ci śnienie pary badanej 
substancji powinny by ć znane. Powinna by ć dostępna wiarygodna 
metoda analityczna do oznaczania ilo ściowego substancji 
w roztworach badanych ze znan ą i udokumentowan ą dokładnością 
oraz granic ą wykrywalno ści.
 
Informacje dotycz ące substancji badanej, które s ą przydatne 
w ustaleniu warunków badania, obejmuj ą wzór strukturalny, czysto ść 
substancji, stabilno ść w wodzie i na świetle, pKa, P  ow i wyniki 
badania ca łkowitej biodegradacji (zob. metoda C.4).  
1.5. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ło ważne, mają zastosowanie nast ępujące warunki:  
— całkowite prze życie zap łodnionych jaj w do świadczeniach 
kontrolnych, a tam gdzie to jest odpowiednie – w zbiornikach 
tylko rozpuszczalnikowych, musi by ć większe niż lub równe 
granicom okre ślonym w dodatkach 2 oraz 3,  
— stężenie tlenu rozpuszczonego musi wynosi ć między 60 a 100 % 
wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie badania,  
— temperatura wody nie mo że się różnić więcej niż ± 1,5  o C 
między komorami do bada ń lub mi ędzy kolejnymi dniami 
w dowolnym momencie podczas trwania badania i powinno 
być w granicach zakresu temperatur, okre ślonego w odniesieniu 
do badanych gatunków (dodatki 2 i 3).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Komory do bada ń 
Można użyć jakiekolwiek szklane i inne oboj ętne chemicznie zbior ­
niki. Wymiary zbiorników musz ą być dostatecznie du że, aby 
zapewnić zgodność ze wska źnikiem obci ążenia (zob. pkt 1.7.1.2). 
Jest zalecane, aby komory do bada ń były losowo rozmieszczone 
w obszarze badania. Losowo zaprojektowany blok z traktowaniem w każdym bloku jest zalecane do ca łkowicie losowo wybranego 
projektu, gdy wyst ępują systematyczne skutki w laboratorium, 
które mog ą być skontrolowane poprzez wykorzystanie blokowania. 
Blokowanie, je śli jest wykorzystane, powinno by ć uwzględnione 
w późniejszej analizie danych. Komory do bada ń powinny by ć ekra­
nowane od niepo żądanych zak łóceń.
 
1.6.2.  Wybór gatunków ryb  
Zalecane gatunki ryb podano w tabeli 1A. To nie wyklucza wyko ­
rzystania innych gatunków (przyk łady podano w tabeli 1B), ale 
procedura badania musi by ć dostosowana w celu zapewnienia odpo ­
wiednich warunków badania. W tym przypadku nale ży podać racjo­
nalne uzasadnienie dla wyboru gatunku i metody do świadczalnej.  
1.6.3.  Utrzymanie wyl ęgu ryb  
Szczegółowe informacje dotycz ące utrzymania wyl ęgu wyjściowego 
w zadawalaj ących warunkach mo żna znaleźć w OECD TG 210 (  1 ) 
i w bibliografii (2)(3)(4)(5)(6).  
1.6.4.  Post ępowanie z embrionami i larwami  
Embriony i larwy poddawane s ą wystawianie na badanie w obr ębie 
głównego zbiornika, w mniejszych zbiornikach wyposa żonych 
w siatki po bokach lub na ko ńcach, pozwalaj ące na przep ływ 
roztworu badanego przez zbiornik. Nieburzliwy przep ływ przez te 
małe zbiorniki jest powodowany przez zanurzanie ich za pomoc ą 
ramienia poruszaj ącego zbiornik w gór ę i w dół, ale utrzymuj ącego 
zawsze organizmy w zanurzeniu; mo żna wykorzysta ć także system 
syfonowop łuczący. Zapłodnione jaja łososiowatych ryb s ą podpie­
rane na pólkach lub siatkach ze szczelinami wystarczaj ąco dużymi, 
by umożliwić larwom spadanie przez nie po wyl ęgu. Użycie paste ­
ryzowanych pipet jest w łaściwe do usuni ęcia embrionów i larw 
w badaniach pó łstatycznych z ca łkowitym odnawianiem codziennym 
(zob. pkt 1.6.6).  
W przypadku gdy pojemniki na jaja, siatki albo oczka u żywano do 
utrzymywania jaj wewn ątrz głównego zbiornika do bada ń, umoco­
wania te powinny by ć usunięte po wyl ęgu larw (  1 ), poza zachowa ­
niem oczek zapobiegaj ących ucieczce ryb. Je śli zachodzi koniecz ­
ność przeniesienia larw, nie mo żna ich wystawia ć na powietrze i nie 
wolno używać sieci do wypuszczania ryb z pojemników jaj (taka 
ostrożność nie jest konieczna dla troch ę mniej delikatnych gatunków, 
np. karpia). Czas takiego przeniesienia zmienia si ę w zależności od 
gatunku i przeniesienia nie zawsze s ą konieczne. Dla techniki pó łsta­
tycznej mo żna stosowa ć zlewki lub p łytkie pojemniki, a je śli 
konieczne – wyposa żone w ekran z oczkami, nieznacznie podnie ­
siony powy żej dna zlewki. Je śli objętość tych pojemników jest 
wystarczaj ąca do zapewnienia wymaga ń obciążenia (zob. 1.7.1.2), 
nie jest konieczne przenoszenie embrionów lub larw.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992. Test Guideline 210, Fish, Early-life Stage Toxicity Test.
 1.6.5.  Woda  
Każda woda, która odpowiada chemicznym cechom akceptowalnej 
wody rozcie ńczającej, jak wymieniono w dodatku 4, i w której 
badane gatunki wykazuj ą przeżycie w do świadczeniu kontrolnym, 
co najmniej tak dobre jak te opisane w dodatkach 2 i 3, mo że być 
stosowana jako woda do bada ń. Powinna by ć stałej jakości w okresie 
trwania badania. Warto ść pH wody powinna pozostawa ć w zakresie 
± 0,5 jednostek pH. W celu zapewnienia, aby rozcie ńczająca woda 
nie miała falowego wp ływu na wyniki badania (np. przez komple ­
ksowanie substancji badanej) lub negatywnego dzia łania na przepro ­
wadzenie wyl ęgu wyjściowego, nale ży okresowo pobiera ć próbki 
wody do analizy. Co trzy miesi ące, na przyk ład, powinny by ć doko­
nane pomiary metali ci ężkich (takich jak Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), 
głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl i SO  4 ), 
pestycydów (np. ca łkowita ilo ść fosforo- i chloroorganicznych), 
całkowitych w ęgli organicznych i zawiesin cia ł stałych, 
w przypadku gdy rozcie ńczająca woda jest znana jako stosunkowo 
stała w jakości. Jeśli można przedstawi ć dane, że jakość wody by ła 
stała przynajmniej przez rok, oznaczenia mog ą być mniej cz ęste 
a przedzia ły rozszerza si ę (np. co sze ść miesięcy). 
1.6.6.  Roztwory stosowane w badaniu  
Roztwory w badaniu o wybranym st ężeniu są przygotowywane 
poprzez rozcie ńczanie roztworu podstawowego.  
Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez proste 
wymieszanie badanej substancji w wodzie rozcie ńczającej 
w sposób mechaniczny (np. mieszad ło lub ultrad źwięki). Kolumny 
nasyceniowe (rozpuszczaj ące) stosuje si ę do uzyskania odpowiednio 
stężonego roztworu podstawowego. W najszerszym mo żliwym 
zakresie nale ży unikać stosowania rozpuszczalników lub dyspergato ­
rów; jednak że takie zwi ązki mogą być wymagane w kilku przypad ­
kach w celu wykonania odpowiednio st ężonego roztworu podstawo ­
wego. Przyk ładami odpowiednich rozpuszczalników s ą aceton, 
etanol, metanol, dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid i glikol 
trójetylenowy. Przyk ładami odpowiednich dyspergatorów s ą 
Cremophor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO- 40. Należy zachowa ć ostrożność przy użyciu łatwo biodegradowal ­
nych środków (np. aceton) i/lub wysokolotnych zwi ązków, gdy ż 
mogą być przyczyn ą problemów z rozwojem bakterii 
w przepływach bada ń. Gdy stosuje si ę środki rozpuszczaj ące, nie 
mogą one mieć znaczącego wp
ływu na prze życie i widocznych nega ­
tywnych dzia łań na wczesne stadium życia, jak odkryto przy 
doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem. Jednak że należy 
dołożyć wszelkich stara ń, aby zapobiec stosowaniu takich materia ­ 
łów. 
W odniesieniu do techniki pó łstatycznej mog ą być prowadzone dwie 
różne procedury odnawiania; albo (i) nowe roztwory badane s ą przy­
gotowywane w czystych zbiornikach, a jaja i larwy, które prze żyły, 
są delikatnie przenoszone do nowych zbiorników w ma łej objętości 
starego roztworu, zapobiegaj ąc ekspozycji na dzia łanie powietrza; 
albo (ii) organizmy badane s ą utrzymywane w zbiornikach, o ile 
proporcja (co najmniej trzy czwarte) wody badanej jest zmieniona. 
Częstotliwość odnawiania o środka zale ży od stabilno ści substancji 
badanej, lecz zalecane jest codzienne odnawianie wody. Je śli 
z badań stabilności pierwotnej (zob. pkt 1.4) wynika, że stężenie 
substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem nominalnego 
80–120 % lub spada poni żej 80 % zmierzonego st ężenia pocz ątko­
wego) ponad okres odnowienia, nale ży rozważyć celowość użycia 
badania przep ływowego. W ka żdym przypadku nale ży zachowa ć 
ostrożność, aby zapobiec stresom dla larw w trakcie czynno ści odna­
wiania wody.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1166
 
W odniesieniu do bada ń przepływowych wymagany jest system 
ciągłego dozowania i rozcie ńczania roztworu podstawowego 
substancji badanej (np. pompa dozuj ąca, rozcie ńczalnik proporcjo ­
nalny, system nasycania) do przesy łania serii st ężeń do komór do 
badań. Szybko ści przep ływów roztworu podstawowego 
i rozcieńczającej wody powinny by ć sprawdzane okresowo, najlepiej 
codziennie w trakcie trwania badania, oraz nie powinny zmienia ć się 
więcej niż 10 % w trakcie badania. Jako odpowiedni uznano 
wskaźnik przep ływu równowa żny co najmniej pi ęciu objętościom 
komory w ci ągu 24 godzin (2).  
1.7. PROCEDURA  
Przydatne informacje dotycz ące przeprowadzania na rybich embrio ­
nach i narybku bada ń toksyczno ści jest dost ępna w literaturze, której 
kilka przyk ładów jest w łączone do cz ęści bibliograficznej niniej ­
szego tekstu (7)(8)(9).  
1.7.1.  Warunki ekspozycji  
1.7.1.1.  Czas trwania  
Badanie powinno rozpocz ąć się w ciągu 30 minut po zap łodnieniu 
jaj. Embriony s ą zanurzane w roztworze badanym przed lub, tak 
szybko jak to mo żliwe, po rozpocz ęciu stadium rozszczepienia 
tarczek zarodowych, a w ka żdym przypadku przed rozpocz ęciem 
stadium gastruli. W odniesieniu do jaj uzyskanych od dostawcy handlowego niemo żliwe jest rozpocz ęcie badania niezw łocznie po 
zapłodnieniu. Poniewa ż na sensytywno ść badania powa żnie wpływa 
opóźnienie rozpocz ęcia badania, badanie powinno by ć zapoczątko­
wane w ci ągu ośmiu godzin po zap łodnieniu. Poniewa ż larwy nie s ą 
karmione w czasie trwania okresu ekspozycji, badanie musi by ć 
zakończone w chwili, zanim woreczek żółtkowy jakiejkolwiek 
larwy w którejkolwiek z komór zostanie ca łkowicie zaabsorbowany 
lub przed pocz ątkiem śmierci głodowej w do świadczeniach kontro ­
lnych. Czas trwania zale ży od wykorzystanych gatunków. Kilka 
zalecanych czasów trwania podano w dodatku 2 i 3.
 
1.7.1.2.  Obci ążenie 
Liczba zap łodnionych jaj na pocz ątku badania musi by ć wystar­
czająca, aby spe łnić wymagania statystyczne. Powinny by ć one 
losowo rozdzielone mi ędzy zabiegami, po co najmniej 30 zap łodnio­
nych jaj, rozdzielonych równo (lub tak równo jak to mo żliwe, 
ponieważ jest trudne uzyskanie równych partii przy u życiu niektó ­
rych gatunków) mi ędzy co najmniej trzy skopiowane komory do 
badań używane na jedno st ężenie. Wska źnik obciążenia (biomasa 
na objętość roztworu badanego) powinien by ć wystarczaj ąco niski, 
aby stężenie rozpuszczonego tlenu wynosi ło co najmniej 60 % ASV 
i mogło być utrzymane bez napowietrzania. W odniesieniu do bada ń 
przepływowych wska źnik obciążenia nieprzekraczaj ący 0,5 g/l na 24 
godziny i nieprzekraczaj ący 5 g/l roztworu w dowolnym momencie 
są zalecane (2).  
1.7.1.3.  Światło i temperatura  
Okres na świetlania i temperatura wody badanej musi by ć właściwa 
dla badanego gatunku (dodatek 2 i 3). W celu monitorowania tempe ­
ratury właściwe jest u życie dodatkowego zbiornika do bada ń. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Stężenia użyte w badaniu  
Zwykle wymagane jest pi ęć stężeń do bada ń w odstępie o sta ły 
wskaźnik nieprzekraczaj ący 3,2. Przy wyborze zakresu st ężeń bada­
nych w badaniach toksyczno ści ostrej nale ży wziąć pod uwag ę 
krzywą zależności LC  50 od okresu ekspozycji. U życie mniej ni ż 
pięciu stężeń, na przyk ład w badaniach granicznych i w ęższego 
odstępu stężenia, w pewnych okoliczno ściach mo że być właściwe. 
Jeżeli użyto mniej ni ż pięciu stężeń powinno by ć dostarczone 
uzasadnienie. St ężenie substancji wy ższe niż 96 godzin LC  50 lub 
100 mg/l, którekolwiek jest ni ższe, nie wymaga badania. Najwy ższe 
stężenie badane nie mo że przekracza ć granicy rozpuszczalno ści 
substancji w wodzie.  
W przypadku gdy środek ułatwiający rozpuszczenie jest wykorzys ­
tany w przygotowaniu roztworów badanych (zob. pkt 1.6.6), jego 
końcowe stężenie nie mo że być większe niż 0,1 ml/l i zalecane jest 
takie same we wszystkich zbiornikach do bada ń. 
1.7.3.  Do świadczenia kontrolne  
Jedno do świadczenie kontrolne z wod ą rozcieńczającą (powtórzona 
odpowiednio), a tak że, jeśli jest to stosowne, jedno do świadczenie 
kontrolne ze środkiem u łatwiającym rozpuszczanie (powtórzone 
odpowiednio) powinno by ć dodatkowo przeprowadzone obok serii 
badań. 
1.7.4.  Cz ęstotliwość oznaczeń analitycznych i pomiarów  
W czasie trwania badania st ężenia substancji badanej s ą oznaczane 
w regularnych odst ępach czasu.  
W półstatycznych (odnawialnych) badaniach, w przypadku gdy 
oczekuje si ę że stężenie substancji utrzyma si ę w zakresie ± 20 % 
nominalnego (tj. w zakresie 80–120 %; zob. pkt 1.4, i 1.6.6), jest 
zalecane, aby jako minimum analizowa ć najniższe i najwy ższe 
stężenia badane świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowie ­
niem, nast ępnie w co najmniej trzech przypadkach oddzielonych 
równo poprzez badanie (tj. analizy powinny by ć wykonywane na 
próbce z tego samego roztworu – świeżo przygotowanym i przy 
wymianie).  
W odniesieniu do bada ń, w których nie oczekuje si ę, że stężenie 
substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20 % nominalnego (na bazie danych stabilno ści substancji) niezb ędne jest analizowanie 
wszystkich badanych st ężeń, świeżo po przygotowaniu i przy 
wymianie, zgodnie z tymi samymi warunkami (tj. w co najmniej trzech przypadkach oddzielonych równo poprzez badanie). Ozna ­
czanie st ężenia substancji badanej przed wymian ą wymagane jest 
tylko na jednej z kopii zbiornika przy ka żdym stężeniu badanym. 
Oznaczenia powinny by ć dokonywane nie cz ęściej niż co siedem 
dni. Zalecane jest, aby wyniki oparte by ły na pomierzonych st ęże­
niach. Je żeli jednak że dostępne dowody s ą zdolne wykaza ć, że 
stężenie badanej substancji w roztworze zosta ło z powodzeniem 
utrzymane w zakresie ± 20 % nominalnego lub wst ępnie zmierzo ­
nego stężenia, poprzez okres badania, wtedy wyniki mog ą być oparte 
na początkowych warto ściach nominalnych lub zmierzonych.
 
W odniesieniu do bada ń przepływowych w łaściwe jest u życie 
podobnego do opisanego dla bada ń półstatycznych, sposobu pobie ­
rania próbek (lecz pomiar „starych” roztworów nie jest stosowany w tym przypadku). Jednak że gdy czas trwania badania jest d łuższy 
niż siedem dni, wskazane jest podniesienie ilo ści pobieranych próbek 
podczas pierwszego tygodnia (np. trzy zestawy pomiarów) w celu 
zapewnienia aby st ężenia badane pozosta ły stałe.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
Próbki mog ą wymagać odwirowania lub przefiltrowania (np. stosuj ąc 
0,45 μm wymiar poru). Jednak że ani odwirowanie, ani filtracja nie 
skutkują zawsze rozdzieleniem frakcji niebioprzyswajalnej substancji 
badanej od tej, która jest bioprzyswajalna, zatem próbki nie mog ą 
być przedmiotem takiego przetwarzania.  
W czasie trwania badania tlen rozpuszczony, pH oraz temperatura 
powinny by ć mierzone we wszystkich zbiornikach do bada ń. Całko­
wita twardo ść i zasolenie (je śli dotyczy) powinny by ć mierzone 
w doświadczeniach kontrolnych i w zbiorniku o najwy ższym stęże­
niu. Jako minimum nale ży pomierzy ć rozpuszczony tlen i zasolenie 
(jeśli dotyczy) trzy razy (na pocz ątku, w środku i na koniec badania). 
W badaniach pó łstatycznych jest zalecane, aby rozpuszczony tlen by ł 
mierzony cz ęściej, najlepiej przed i po ka żdej wymianie wody lub co 
najmniej raz na tydzie ń. Wartość pH na pocz ątku i na ko ńcu każdej 
wymiany wody w badaniach statycznych odnawialnych i co najmniej cotygodniowo w badaniach przep ływowych. Twardo ść powinna by ć 
zmierzona jednorazowo w ka żdym badaniu. Temperatura powinna 
być mierzona codziennie i zalecane jest sta łe monitorowanie tempe ­
ratury w przynajmniej jednym zbiorniku do bada ń.
 
1.7.5.  Obserwacje  
1.7.5.1.  Stadium rozwoju embrionalnego  
Stadium embrionalne (tj. stadium gastruli) na pocz ątku ekspozycji na 
działanie substancji badanej powinno by ć sprawdzone tak dok ładnie 
jak to mo żliwe. Mo żna tego dokona ć stosując reprezentatywn ą 
próbkę jaj odpowiednio zabezpieczonych i przezroczystych. Mo żna 
również uwzględnić literaturę w odniesieniu do opisu i ilustracji 
stadiów embrionalnych (2)(5)(10)(11).  
1.7.5.2.  Wylęg i przeżycie 
Obserwacje w zakresie wyl ęgania i prze życia powinny by ć dokony­
wane co najmniej raz dziennie, a liczby powinny by ć zarejestrowane. 
Pożądane może być częstsze dokonywanie obserwacji na pocz ątku 
badania (np. co 30 minut w ci ągu trzech pierwszych godzin), 
ponieważ w kilku przypadkach czas prze życia jest bardziej istotny 
od jedynie liczby zgonów (np. gdy wyst ępują skutki ostrej toksycz ­
ności). Martwe embriony i larwy powinny by ć usunięte natychmiast 
po zauwa żeniu, gdy ż gwałtownie si ę rozkładają. Należy zachowa ć 
najwyższą ostrożność przy usuwaniu martwych osobników, aby nie 
stłuc lub fizycznie uszkodzi ć przylegaj ących jaj/larw, które s ą bardzo 
delikatne i wra żliwe. Kryteria dotycz ące zgonu zmieniaj ą się według 
stadium życia:  
— w odniesieniu do jaj:  szczególnie we wczesnym stadium 
znacząca strata przezroczysto ści i zmiany w zabarwieniu spowo ­
dowane przez koagulacj ę i/lub str ącania bia łek prowadz ące do 
białego, nieprzezroczystego wygl ądu, 
— w odniesieniu do embrionów:  zanik ruchu organów i/lub 
uderzeń serca i/lub nieprzezroczyste odbarwienie dla gatunków, 
które są zwykle przezroczyste,  
— w odniesieniu do larw:  nieruchomo ść i/lub brak ruchu oddecho ­
wego i/lub brak bicia serca i/lub bia łe nieprzezroczyste zabar ­
wienie centralnego systemu nerwowego i/lub brak reakcji na 
bodźce mechaniczne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Anormalny wygl ąd 
Liczba larw wykazuj ących anormalno ści w kszta łcie ciała i/lub 
pigmentacji, stadium absorpcji żółtko-torba powinny by ć rejestro­
wane w odpowiednich odst ępach czasu zale żnych od czasu trwania 
badania i charakteru opisanej nienormalno ści. Należy zauważyć, że 
anormalne embriony i larwy zdarzaj ą się w naturalny sposób i w 
doświadczeniu(-ach) kontrolnym(-ych) mo że ich by ć rzędu kilku 
procent w jakim ś gatunku. Anormalne zwierz ęta powinny by ć 
jedynie usuni ęte ze zbiorników do bada ń i zabite.  
1.7.5.4.  Anormalne zachowanie  
Abnormalno ści, np. hiperwentylacja, nieskoordynowane p ływanie 
i nietypowy spokój powinny by ć zarejestrowane w odpowiednich 
odstępach czasu zale żnych od czasu trwania badania. Skutki te, 
choć trudne do okre ślenia ilościowego, gdy s ą obserwowane, poma ­
gają w interpretacji danych dotycz ących śmiertelno ści, tj. dostarczaj ą 
informacji dotycz ących sposobu toksycznego dzia łania substancji.  
1.7.5.5.  Długość 
Na koniec badania zalecany pomiar indywidualnych d ługości; można 
zastosowa ć standardow ą, widełkową lub całkowitą długość. Jeśli 
jednakże występuje ogonowe gnicie p łetwy lub nad żerka, nale ży 
zastosowa ć długość nominaln ą. Ogólnie, w dobrze przebiegaj ącej 
próbie wspó łczynnik rozrzutu d ługości między kopiami 
w doświadczeniach kontrolnych powinien wynosi ć ≤ 20 %.  
1.7.5.6.  Waga  
Na koniec badania, mierzona mo że być waga indywidualna; bardziej 
pożądana jest sucha waga: (24 h w 60  o C) od wilgotnej wagi 
(suszenie bibu łą). Ogólnie, w dobrze przebiegaj ącej próbie wspó ł­
czynnik rozrzutu wagi mi ędzy kopiami w do świadczeniach kontro ­
lnych powinien wynosi ć ≤ 20 %.  
Obserwacje te wynikaj ą z niektórych lub ze wszystkich nast ępuj­ 
ących danych dost ępnych dla analizy statystycznej:  
— skumulowana śmiertelno ść, 
— liczba zdrowych larw na koniec badania,  
— czas rozpocz ęcia wylęgu i czas zako ńczenia wyl ęgu (tj. 90 % 
wylęgu w każdej kopii),  
— ilość larw wyl ęgających się każdego dnia,  
— długość (i waga) zwierz ąt, które prze żyły na koniec badania,  
— ilość larw zdeformowanych lub o anormalnym wygl ądzie,  
— ilość larw wykazuj ących anormalne zachowanie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Jest zalecane, aby statystyka by ła włączona w projekt jak i analiz ę 
badania, poniewa ż niniejsza metoda badania umo żliwia uwzgl ęd­
nienie znacznej zmiany w projekcie do świadczenia, tak ą jak na przy ­
kład ilość komór do bada ń, liczbę stężeń badanych, liczb ę zapłod­
nionych jaj i zmierzone parametry. Uwzgl ędniając dostępne opcje 
w projekcie badania, nie podano tutaj informacji dotycz ących 
procedur statystycznych.  
Jeśli LOEC/NOECs maj ą być oszacowane niezb ędne jest 
w odniesieniu do zmienno ści analizowanych mi ędzy każdym 
zestawem kopii, zastosowanie analizy wariancji (ANOVA) lub 
procedury tablicy wielodzielczej. W celu wykonania wielokrotnego porównania mi ędzy wynikami dla poszczególnych st ężeń i tych dla 
doświadczeń kontrolnych metoda Dunnetta jest uznana za u żyteczną 
(12)(13). Inne przydatne przyk łady są także dostępne (14)(15). 
Rozmiar skutku wykrywalnego przy u życiu ANOVA lub innych 
procedur (tj. moc badania) powinna by ć obliczona i przedstawiona. 
Należy odnotowa ć, że nie wszystkie obserwacje wymienione w pkt 
1.7.5.6 są odpowiednie do analizy statystycznej przy zastosowaniu 
ANOVA. Na przyk ład skumulowana śmiertelno ść i liczba zdrowych 
larw na ko ńcu badania s ą analizowane przy wykorzystaniu metod 
probitowych.
 
Jeśli LC/EC  x s mają być oszacowane, odpowiednia(-e) krzywa(-e), 
takie jak krzywa logistyczna, musz ą być dopasowane do interesuj ­ 
ących danych, stosuj ąc metodę statystyczn ą taką jak najmniejszych 
kwadratów lub nieliniow ą najmniejszych kwadratów. Krzywa(-e) 
powinna(-y) by ć parametryzowana(-e) tak, aby interesuj ące LC/EC  x 
oraz jego b łąd standardowy by ły szacowane bezpo średnio. To 
znacznie u łatwia obliczenie granic ufno ści wokół LC/EC  x . Pod 
warunkiem, że nie ma s łusznych przyczyn, nale ży zalecać poziomy 
ufności dwustronne, o za łożonej 95 % ufno ści. Zalecane jest, aby 
procedura dopasowania dostarcza ła sposoby w zakresie oceniania 
znaczenia braku dopasowania. Stosuje si ę graficzne metody dla 
dopasowania krzywych. Analiza regresyjna jest odpowiednia 
w odniesieniu do wszystkich obserwacji wymienionych w pkt 1.7.5.6.
 
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Wyniki powinny by ć interpretowane z ostro żnością w przypadku, 
gdy mierzone st ężenie toksykanta w roztworach badanych oscyluje 
na poziomie granicy wykrywalno ści metody analitycznej. Interpre ­
tacja wyników w odniesieniu do st ężeń powyżej rozpuszczalno ści 
substancji w wodzie równie ż powinna by ć dokonywana 
z ostrożnością. 
2.3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
2.3.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— charakter fizyczny i odpowiednie w łaściwości fizykochemiczne,  
— dane identyfikacji chemicznej w łączając czystość i metodę anali­
tyczną kwantyfikacji substancji badanej tam gdzie to jest 
właściwe.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— nazwa naukowa, szczep, liczba rodzicielskich ryb (tj. ile samic 
użyto do dostarczenia żądanej ilo ści jaj do bada ń), źródło 
i metodę zbierania zap łodnionych jaj i dalsze post ępowanie.  
2.3.3.  Warunki badania:  
— zastosowana procedura testowa (np. pó łstatyczna lub przep ły­
wowa, okres czasu od zap łodnienia do rozpocz ęcia badania, obci ­ 
ążenie itp.),  
— okres(-y) na świetlania,  
— projekt badania (np. liczba komór do bada ń i kopii, liczba 
embrionów na kopi ę, stężenia badane i w kopiach, liczba ryb 
na zbiornik),  
— metoda przygotowania roztworów wyj ściowych i cz ęstotliwość 
odnawiania ( środek ułatwiający rozpuszczanie i jego st ężenie 
powinny by ć podane, je śli jest zastosowany),  
— nominalne st ężenia badane, średnie wielko ści mierzonych i ich 
standardowe odchylenia w zbiornikach do bada ń metody, 
którymi je uzyskano oraz dowody, że pomiary odnosz ą się do 
stężeń substancji badanej w roztworze,  
— cechy wody rozcie ńczającej: pH, twardo ść, temperatura, st ężenie 
rozpuszczonego tlenu, poziom pozosta łości chloru (je śli jest 
zmierzony), ca łkowity w ęgiel organiczny, zawieszone cz ąstki 
stałe, zasolenie o środka badanego (je śli jest zmierzone) oraz 
wszelkie inne wykonane pomiary,  
— jakość wody w zbiornikach do bada ń: pH, twardo ść, temperatura 
i stężenie rozpuszczonego tlenu.  
2.3.4.  Wyniki:  
— wyniki ze wszystkich wst ępnych bada ń stabilno ści badanej 
substancji,  
— dowody, że doświadczenia kontrolne odpowiadaj ą kryteriom 
ważności w odniesieniu do prze życia badanych gatunków 
(dodatki 2 i 3),  
— dane dotycz ące śmiertelno ści/przeżycia na stadiach embrionu 
i larwy oraz ca łkowita śmiertelno ść/przeżycie,  
— dni do wyl ęgu i liczba wyl ęgłych, 
— dane dotycz ące długości (i wagi),  
— zasięg i opis morfologicznych anormalno ści, jeśli istnieją, 
— zasięg i opis efektów zachowania, je śli istnieją, 
— analiza statystyczna i opracowanie danych,  
— w odniesieniu do bada ń analizowanych przy pomocy ANOVA, 
najniższy obserwowany skutek st ężenia (LOEC) przy p = 0,05 
i nieobserwowany skutek st ężenia (NOEC) w odniesieniu do 
każdej ocenianej reakcji, w łączając opisanie procedur statystycz ­
nych użytych do wskazania wymiaru skutku wykrywalnego,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— w odniesieniu do bada ń analizowanych przy u życiu technik 
regresyjnych, LC/ECx i przedzia łów ufności wraz z wykresem 
dopasowanego modelu stosowanego dla ich wyliczenia,  
— wyjaśnienie dotycz ące każdego odchylenia od niniejszej metody 
badania.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
Term Fish Early Life Stage Tests in Relation to other FELS Test Methods. Final report to the Commission of the European Communities, 60 pp. June 1990.
 
(2) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life- 
Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing 
and Materials. E 1241-88. 26 pp.  
(3) Brauhn J. L. and Schoettger R. A. (1975). Acquisition and 
Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, 
Channel Catfish and Bluegills. p. 54, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota.
 
(4) Brungs W. A. and Jones B. R. (1977). Temperature Criteria for 
Freshwater Fish: Protocol and Procedures. p. 128, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota.
 
(5) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish 
(Brachydanio rerio) in Fisheries Research. A Literature 
Review. J. Biol. 10, pp. 121–173.  
(6) Legault R. (1958). A Technique for Controlling the Time of 
Daily Spawning and Collecting Eggs of the Zebrafish, Brachy ­
danio rerio (Hamilton-Buchanan) Copeia, 4, pp. 328–330.  
(7) Dave G., Damgaard B., Grande M., Martelin J. E., Rosander 
B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval Toxi ­
city Test with Zebrafish (Brachydanio rerio) Using Chromium 
and Zinc as Toxicants. Environmental Toxicology and Chemis ­
try, 6, pp. 61–71.  
(8) Birge J. W., Black J. A. and Westerman A. G. (1985). Short- 
term Fish and Amphibian Embryo-larval Tests for Determining the Effects of Toxicant Stress on Early Life Stages and Esti ­
mating Chronic Values for Single Compounds and Complex 
Effluents. Environmental Toxicology and Chemistry 4, pp. 807–821.
 
(9) Van Leeuwen C. J., Espeldoorn A. and Mol F. (1986). Aquatic 
Toxicological Aspects of Dithiocarbamates and Related Compounds. III. Embryolarval Studies with Rainbow Trout 
(Salmo gairdneri). J. Aquatic Toxicology, 9, pp. 129–145.
 
(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
ment. Carolina Tips 32(4): 1-4. Carolina Biological Supply 
Company.  
(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
Its care and Development. Carolina Biological Supply Company, North Carolina. 36 pp.
 
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for 
Comparing Several Treatments with Control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, pp. 1096–1121.  
(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
with a Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.  
(14) Mc Clave J. T., Sullivan J. H. and Pearson J.G. (1980). Statis ­
tical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data. Proceedings 
of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
(15) Van Leeuwen C. J., Adema D. M. M. and Hermes J. (1990). 
Quantitative Structure-Activity Relationships for Fish Early 
Life Stage Toxicity. Aquatic Toxicology, 16, pp. 321–334.  
(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
Stages of Salmonid Fish (Rainbow Trout, Coho Salmon or Atlantic Salmon). Biological Test Method Series. Report EPS 1/RM/28, December 1992, 81 pp.
 
(17) Dave G. and Xiu R. (1991). Toxicity of Mercury, Nickel, Lead 
and Cobalt to Embryos and Larvae of Zebrafish, Brachydanio 
rerio. Arch. of Environmental Contamination and Toxicology, 
21, pp. 126–134.  
(18) Meyer A., Bierman C. H. and Orti G. (1993). The phyloge ­
netic position of the Zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology-an invitation to the comperative methods. Proc. Royal Society of London, Series B, 252: pp. 
231–236.
 
(19) Ghillebaert F., Chaillou C, Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference 
Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and Environmental Safety 32, pp. 19–28.
 
(20) US EPA, (1991). Guidelines for Culturing the Japanese 
Medaka, Oryzias latipes. EPA report EPA/600/3-91/064, Dec. 
1991, EPA, Duluth.  
(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka, (Oryzias latipes). EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., Mclntyre D. O., Poccocic T. 
L., Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow (Pimephales promelas) larval survival and growth test: an intra- 
and interlaboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, pp. 
1189–1203.
 
(23) Calow P. (1993). Handbook of Ecotoxicology, Blackwells, 
Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
rine and Marine fish.
 
(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
mental, ecological and evolutionary perspectives, Junk Publ., 
Dordrecht, 280 pp.  
(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
W. S. Hoar and D. J. Randall eds., Fish Physiology, Vol. XIA, Academic press, pp. 1–58.
 
Tabela 1A  
Gatunki ryb zalecane do badania  
SŁODKOWODNE  
Oncorhynchus mykiss  
Pstrąg tęczowy (9)(16)  
Danio rerio  
Danio pręgowany (7)(17)(18)  
Cyprinus caprio  
Karp zwyk ły (8)(19)  
Oryzias latipes  
(20)(21)  
Pimephales promelas  
(8)(22)  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Tabela 1B  
Przykłady innych dobrze udokumentowanych gatunków, które równie ż zostały użyte 
SŁODKOWODNE S ŁONOWODNE  
Carassius auratus  
Karaś srebrzysty (8)  Menidia peninsulae  
(23)(24)(25)  
Lepomis macrochirus  (8) Clupea harengus  
Śledź (24)(25)  
Gadus morhua  
Dorsz (24)(25)  
Cyprinodon variegatus  
(23)(24)(25)  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
DODATEK 1  
WSKAZÓWKI DOTYCZ ĄCE PROWADZENIA BADANIA TOKSYCZ ­
NOŚCI NA EMBRIONACH I NARYBKU RYBY DANIO PR ĘGOWANY  
(BRACHYDANIO RERIO)  
WPROWADZENIE  
Danio pręgowany pochodzi z wybrze ża Coromandel w Indiach, gdzie zamiesz ­
kuje szybko p łynące strumienie. Jest to zwyk ła akwaryjna ryba z rodziny karpio ­
watych, a informacje na temat procedur opieki nad ni ą i hodowaniu mo żna 
znaleźć w publikacjach informacyjnych o tropikalnych rybach. Jej biologia 
i badania łowisk zosta ły przedstawione przez Laale (1).  
Ryba rzadko przekracza 45 mm d ługości. Ciało jest cylindryczne z 7–9 ciemno ­
niebieskimi poziomymi srebrzystymi pasami. Pasy te przebiegaj ą przez ogon 
i płetwy odbytowe. Grzbiet jest oliwkowozielony. Samce s ą szczuplejsze od 
samic. Samice s ą bardziej srebrzyste i ich odw łok jest rozszerzony, szczególnie 
przed tarłem. 
Dorosłe ryby są w stanie tolerowa ć duże wahania temperatur, pH i twardo ści. 
Jednakże w celu uzyskania zdrowej ryby produkuj ącej jaja dobrej jako ści, 
powinny by ć zapewnione optymalne warunki.  
W czasie trwania tar ła samiec ściga i bodzie samic ę i jak tylko jaja zostan ą 
wyrzucone, zap ładnia je. Jaja, które s ą przezroczyste i nieklej ące, opadaj ą na 
dno, gdzie s ą zjadane przez doros łe ryby. Światło wpływa na tar ło. Jeśli poranne 
światło jest odpowiednie, ryby tr ą się we wczesnych godzinach poprzedzaj ących 
świt. 
Samice produkuj ą partie kilkuset jaj w odst ępach tygodniowych.  
WARUNKI RYB RODZICIELSKICH, ROZMNA ŻANIE I WCZESNE 
STADIA ŻYCIA  
Należy wybrać odpowiedni ą liczbę zdrowych ryb i trzyma ć je w odpowiedniej 
wodzie (np. dodatek 4) przynajmniej dwa tygodnie przed zamierzonym tar łem. 
Grupie ryb nale ży pozwoli ć rozmnażać się co najmniej raz, przed utworzeniem 
partii jaj u żywanych w badaniu. G ęstość zarybienia w czasie trwania tego okresu 
nie może przekracza ć 1 gram ryby na jeden litr. Regularne zmiany wody lub 
użycie systemów oczyszczania umo żliwia zastosowanie wy ższej gęstości. 
Temperatura wody w zbiornikach przetrzymuj ących powinna by ć utrzymana na 
poziomie 25 ± 2  o C. Rybom nale ży dostarczy ć różnorodną dietę, która sk łada się 
na przykład z handlowej suchej karmy, żywych świeżo wylęgniętych Arthemia , 
ochotkowatych,  Daphnii , białych robaków ( Enchytraeids ). 
Poniżej określono dwie procedury, które w praktyce doprowadzi ły do dosta ­
tecznej partii zdrowych, zap łodnionych jaj dla prowadzenia badania:  
(i) Osiem samic i szesna ście samców jest umieszczanych w zbiorniku zawieraj ­ 
ącym 50 litrów wody rozcie ńczającej, osłonięte od bezpo średniego światła 
i pozostawione tak d ługo jak to mo żliwe niezak łócenie przez co najmniej 48 
godzin. Tack ę na ikrę umieszczono na dnie akwarium, po po łudniu dnia 
przed startem badania. Tacka na ikr ę składa się z ramy (pleksiglas lub 
inny odpowiedni materia ł), o 5–7 cm wysoko ści z 2–5 mm grub ą siatką 
dołączoną na górze i 10–30 μm drobną siatką na dnie. Pewna liczba „drzew 
ikrowych” sk ładających się z nieskręconej nylonowej liny jest do łączona do 
grubej siatki ramy. Po pozostawieniu ryb przez 12 godzin w ciemno ści 
włącza się słabe światło, które zapocz ątkowuje tar ło. Dwie do czterech 
godzin po tarle tacka na ikr ę jest wyjmowana i jaja s ą zbierane. Tacka na 
ikrę zapobiega zjedzeniu jaj przez ryby i w tym samym czasie pozwala na 
łatwe zbieranie jaj. Grupa ryb powinna co najmniej raz trze ć się, przed 
tarłem z którego jaja s ą wykorzystywane do bada ń. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
(ii) Pięć do dziesi ęciu rybich samców i samica s ą umieszczone oddzielnie na co 
najmniej dwa tygodnie przed planowanym tar łem. Po 5–10 dniach odw łoki 
samic będą poszerzone i ich rodne brodawki widoczne. Samce nie posiadaj ą 
brodawek. Tar ło jest przeprowadzane w zbiornikach do tar ła wyposa żonych 
w fałszywe dno z siatki (jak wy żej). Zbiornik jest nape łniany wod ą rozcień­
czającą, tak aby g łębokość wody powy żej siatki wynosi ła 5–10 cm. Jedna 
samica i dwa samce s ą umieszczane w zbiorniku na dzie ń przed planowanym 
tarłem. Temperatura wody jest stopniowo podnoszona do poziomu wy ższego 
niż temperatura aklimatyzacji. Światło jest wy łączane i zbiornik pozostaje 
w możliwym zakresie w niezak łóconym stanie. Rano w łącza się słabe 
światło, które zapocz ątkowuje tar ło. Po 2–4 godzinach ryby s ą usuwane, 
a jaja zbierane. Je śli potrzebne s ą większe partie jaj, uzyskuje si ę je od jednej 
samicy, dostateczna ilo ść zbiorników do tar ła zostaje pod łączona równolegle. 
Poprzez rejestrowanie sukcesu reprodukcyjnego indywidualnych samic przed 
badaniem (wielko ść i jakość partii) samice z najwy ższym sukcesem repro ­
dukcyjnym s ą wybierane do hodowli.  
Jaja powinny by ć przeniesione do zbiorników do bada ń za pomoc ą szklanych 
rurek (o wewn ętrznej średnicy nie mniej ni ż 4 mm) zaopatrzonych w elastyczn ą 
cebulkę ssącą. Ilość wody towarzysz ąca jajom przy ich przenoszeniu powinna 
być tak niewielka, na ile to mo żliwe. Jaja s ą cięższe niż woda i opadaj ą w rurce. 
Należy zachowa ć ostrożność, aby zapobiec kontaktowi jaj (i larw) z powietrzem. 
Należy wykona ć badania mikroskopowe próbki(-ek) z partii w celu zapewnienia, 
aby nie posiada ły one żadnych nieregularno ści w pierwszym stadium rozwojo ­
wym. Dezynfekcja jaj jest niedopuszczalna.  
Wskaźnik śmiertelno ści jaj jest najwy ższy w pierwszych 24 godzinach po 
zapłodnieniu. Śmiertelno ść 5–40 % obserwowana jest cz ęsto w trakcie trwania 
tego okresu. Jaja degeneruj ą się jako wynik niedostatecznego zap łodnienia lub 
wad rozwojowych. Jako ść partii jaj wydaje si ę zależna od samic, chocia ż 
niektóre samice produkuj ą konsekwentnie jaja dobrej jako ści, jakiej inne nigdy 
nie dają. Także wskaźnik rozwoju i wska źnik wylęgu zmienia si ę od jednej partii 
do drugiej. Zap łodnione z powodzeniem jaja i p ęcherzyki żółtkowe larw prze ­ 
żywają na wysokim poziomie, zwykle powy żej 90 %. Przy 25  o C jaja wyl ęgają 
sie 3–5 dni po zap łodnieniu i woreczek żółtkowy absorbuje si ę około 13 dni po 
zapłodnieniu.  
Rozwój embrionalny zosta ł dobrze okre ślony przez Hisaoka i Battle (2). Dzi ęki 
przejrzysto ści jaj i larw powyl ęgowych obserwuje si ę postępujący rozwój ryby 
oraz wyst ępowanie zniekszta łceń. W około cztery godziny po tarle niezap łod­
nione jaja s ą odróżnialne od zap łodnionych (3). Dla sprawdzenia tego, jaja 
i larwy są umieszczane w zbiornikach do bada ń o małej objętości i są obserwo ­
wane pod mikroskopem.  
Warunki badania maj ącego zastosowanie do wczesnych stadiów życia są 
zamieszczone w dodatku 2. Optymalne warto ści pH i twardo ści wody wynosz ą 
odpowiednio 7,8 i 250 mg CaCO  3 /l. 
OBLICZENIA I STATYSTYKI  
Proponowane jest podej ście dwuetapowe. Najpierw dane dotycz ące śmiertelno ści, 
nienormalny rozwój i czas wyl ęgu są analizowane statystycznie. Nast ępnie, 
w odniesieniu do tych st ężeń, przy których nie ma skutków negatywnych 
żadnego z tych rejestrowanych parametrów, ocenia si ę statystycznie d ługość 
ciała. Niniejsze podej ście jest wskazane, gdy ż toksykant mo że zabijać selek­
tywnie mniejsze ryby, opó źniać czas wyl ęgu i powodowa ć znaczne zniekszta ł­
cenia, prowadz ąc w ten sposób do b łędnych pomiarów d ługości. Ponadto jest to 
z grubsza ta sama ilo ść ryb zmierzonych do poddania traktowaniu, zapewniaj ąc 
ważność statystyki badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
OKREŚLENIA LC  50 I EC  50 
Procent prze życia jaj i larw jest obliczany i korygowany w odniesieniu do 
śmiertelno ści w doświadczeniach kontrolnych zgodnie z wzorem Abbotta (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
gdzie,:  
P = skorygowany % prze życia,  
P' = % prze życia obserwowanego w st ężeniu do bada ń, 
C = prze życie w do świadczeniu kontrolnym.  
Jeśli to możliwe, LC  50 jest oznaczana odpowiedni ą metodą na końcu badania.  
Jeśli włączenie morfologicznych anormalno ści w EC  50 jest pożądane, wskazówki 
można znaleźć w Stephan (5).  
OSZACOWANIE LOEC NOEC  
Celem badania na jajach i narybku jest porównanie niezerowego st ężenia 
z doświadczeniem kontrolnym, tj. okre ślenie LOEC. Dlatego wielokrotne proce ­
dury porównawcze musz ą być zastosowane (6)(7)(8)(9)(10).  
BIBLIOGRAFIA  
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish (Brachydanio 
rerio) in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, pp. 121–173.
 
(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
pp. 
(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabarbling 
(Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan). Journal of Applied Ichthyology, 2, pp. 173–181.
 
(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, pp. 1–333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Fifth Conference, ASTM STP 766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
for Testing and Materials, pp. 69–81.
 
(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096–1121.
 
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with 
a Control. Biometrics, 20, pp. 482–491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Biometrics, 27, pp. 103–117.
 
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with 
a Zero Dose Control. Biometrics 28, pp. 519–531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
DODATEK 2  
WARUNKI BADANIA, CZAS TRWANIA I KRYTERIA PRZE ŻYCIA W ODNIESIENIU DO ZALECANYCH GATUNKÓW  
Gatunek Temperatura 
( o C) Stopień 
zasolenia 
(0/00) Czas 
naświetlania 
(h) Czas trwania stadium 
(dni) 
Typowy czas trwania badania Przeżycie w do świadczeniu 
kontronym 
(minimum %) 
Embrion Narybek Powodzenie 
wylęgu Powylęgowe  
SŁODKOWODNE  
Brachydanio rerio  
Danio pręgowany 25 ± 1 — 12–16 3–5 8–10 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 5 dni po 
wylęgu (8–10 dni) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Pstrąg tęczowy 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± l (  2 ) 0 ( 3 ) 30–35 25–30 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 20 dni po wylęgu (50–55 dni) 66 70  
Cyprinus carpio  
Zwykły karp 21–25 — 12–16 5 > 4 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 4 dni po 
wylęgu (8–9 dni) 80 75  
Oryzias latipes  24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± l (  2 ) — 12–16 8–11 4–8 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 5 dni po wylęgu (13–16 dni) 80 80  
Pimephales promelas  25 ± 2 — 16 4–5 5 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 4 dni po 
wylęgu (8–9dni) 60 70
 
( 1 ) Dla embrionów. 
( 2 ) Dla larw. 
( 3 ) Ciemno ść dla embrionów i larw do jednego tygodnia po wyl ęgu, z wyj ątkiem, gdy s ą ich sprawdzane. Nast ępnie przyt łumione o świetlenie przez badanie.
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1180
 ▼B 
DODATEK 3  
Warunki badania, czas trwania i kryteria prze życia w odniesieniu do innych dobrze udokumentowanych gatunków  
Gatunki Temperatura 
( o C) Stopień 
zasolenia (0/00) Czas 
naświetlania 
(godz.) Czas trwania stadium (dni) 
Typowy czas trwania badania embrionów 
i narybka Przeżycie w do świadczeniu 
kontrolnym (minimum %) 
Embrion Badanie narybka Powodzenie 
wylęgu Powylęgowe  
SŁODKOWODNE  
Carassius auratus  
Karaś srebrzysty 24 ± 1 — — 3–4 > 4 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 4 dni po wylęgu (7 dni) — 80  
Leopomis macrochirus  
Bassek bl ękitny 21 ± 1 — 16 3 > 4 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 4 dni po 
wylęgu (7 dni) — 75 
SŁONOWODNE  
Menidia peninsulae  22–25 15–22 12 1,5 10 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 5 dni po wylęgu (6–7 dni) 80 60  
Clupea harengus  
Śledź pospolity 10 ± 1 8–15 12 20–25 3–5 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 3 dni po wylęgu (23–27dni) 60 80  
Gadus morhua  
Dorsz 5 ± 1 5–30 12 14–16 3–5 Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 3 dni po 
wylęgu (18 dni) 60 80  
Cyprinodon variegatus  25 ± 1 15–30 12 — — Tak szybko jak to mo żliwe po zap łodnieniu 
(wczesne stadium gastruli) do 4/7dni po wylęgu (28 dni) > 75 80
DODATEK 4  
NIEKTÓRE CECHY CHEMICZNE DOPUSZCZONEJ WODY 
ROZCIE ŃCZAJĄCEJ  
Substancja St ężenie 
Cząstki stale < 20 mg/l 
Całkowity w ęgiel organiczny < 2 mg/l 
Niezjonizowany amoniak < 1 μg/l 
Szczątkowy chlor < 10 μg/l 
Całkowite pestycydy fosforoorganiczne < 50 μg/l 
Całkowite pestycydy chloroorganiczne plus polichloro ­
wane bifenyle < 50 ng/l 
Całkowity chlor organiczny < 25 ng/l  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  PSZCZO ŁY MIODNE – BADANIE TOKSYCZNO ŚCI OSTREJ 
DROGĄ POKARMOW Ą 
1. METODA  
Niniejsza metoda badania toksyczno ści ostrej jest kopi ą OECD TG 
213 (1998).  
1.1. WPROWADZENIE  
Niniejszy badanie toksyczno ści jest laboratoryjn ą metodą, zaprojek ­
towaną do oceny ostrej toksyczno ści środków ochrony ro ślin 
i innych substancji chemicznych do doros łych robotnic pszczó ł 
miodnych.  
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczno ści substancji chemicznej 
oznaczenie ostrej toksyczno ści drogą pokarmow ą dla pszczó ł miod­
nych jest wymagane np. gdy jest prawdopodobna ekspozycja pszczó ł 
na działanie danej substancji chemicznej. Badanie toksyczno ści ostrej 
drogą pokarmow ą jest przeprowadzane dla ustalenia w łaściwej 
toksyczno ści dla pszczó ł, pestycydów i innych substancji chemicz ­
nych. Wyniki niniejszego badania powinny by ć wykorzystane do 
określenia potrzeby dalszej oceny. W szczególno ści niniejsza metoda 
może być zastosowana w programach odcinkowych oceny niebez ­
pieczeństwa pestycydów dla pszczó ł, w oparciu o kolejne post ępy 
badań toksyczno ści laboratoryjnych do pó łpolowych i polowych 
eksperymentów (1). Pestycydy mog ą być badane jako substancje 
aktywne (a.s.) lub jako wytworzone produkty.  
Standard toksyczno ści powinien by ć zastosowany do sprawdzenia 
wrażliwości pszczó ł i precyzji procedury badania.  
1.2. DEFINICJE  
Ostra toksyczno ść drogą pokarmow ą: jest negatywnymi skutkami 
powstającymi w granicach maksymalnego okresu 96 godzin po 
podaniu doustnym pojedynczej dawki badanej substancji.  
Dawka:  jest ilością substancji badanej spo żytej. Dawka jest wyra żana 
jako masa ( μg) substancji badanej na badane zwierz ę (μg/pszczoła). 
Rzeczywista dawka dla ka żdej pszczo ły nie mo że być obliczona, 
ponieważ są karmione wspólnie, ale średnia dawka mo że być oszaco­
wana (ca łkowita ilo ść spożytej substancji badanej/ilo ść badanych 
pszczół w jednej klatce).  
LD 50 (średnia dawka śmiertelna) drog ą pokarmow ą: jest staty ­
stycznie wyprowadzon ą pojedyncz ą dawką substancji, która powo ­
duje zgonu 50 % zwierz ąt przy podaniu drog ą pokarmow ą. Wartość 
LD 50 jest wyra żona w ( μg) substancji badanej na pszczo łę. 
W odniesieniu do pestycydów substancj ą badaną może być 
substancja aktywna (a.s.) albo wytworzony produkt zawieraj ący 
jedną lub więcej niż jedną substancj ę aktywną. 
Śmiertelno ść: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest 
zupełnie nieruchome.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Dorosłe robotnice pszczó ł miodnych ( Apis mellifera ) są ekspono ­
wane w zakresie dawek substancji badanej rozproszonej 
w roztworze sacharozy. Nast ępnie pszczo ły są karmione t ą samą 
dietą, wolną od substancji badanej. Śmiertelno ść jest rejestrowana 
codziennie podczas co najmniej 48 godzin i porównywana z wartościami kontrolnymi. Je śli wskaźnik śmiertelno ści zwiększa 
się między 24 i 48 godzin ą, podczas gdy śmiertelno ść 
w doświadczeniu kontrolnym pozostaje na akceptowalnym poziomie, 
tj. < 10 %, w łaściwe jest rozci ągnięcie czasu trwania badania do 
maksimum 96 godzin. Wyniki s ą analizowane w celu obliczenia 
LD
 50 w 24 i 48 godzinie i, w przypadku gdy badanie jest przed łu­ 
żone, w 72 i 96 godzinie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ło ważne, mają zastosowanie nast ępujące warunki:  
— średnia śmiertelno ść dla wszystkich do świadczeń kontrolnych nie 
może przekracza ć 10 % na ko ńcu badania,  
— LD  50 normy toksyczno ści spełnia określony zakres.  
1.5. OPIS METODY BADANIA  
1.5.1.  Zbieranie pszczó ł 
Młode dojrza łe robotnice pszczó ł z tej samej rasy musz ą być użyte, 
tj. pszczo ły w tym samym wieku, statusie żywieniowym itd. 
Pszczoły powinny by ć uzyskane z kolonii, w łaściwie odżywianej, 
zdrowej, tak dalece jak to mo żliwe wolnej od chorób, o w łaściwej 
królowej, o znanej historii i fizjologicznym statusie. Mog ą być 
zebrane rano przed u życiem lub wieczorem przed badaniem 
i przechowane w warunkach badania do nast ępnego dnia. Odpo ­
wiednie s ą pszczoły zebrane z ram, bez potomstwa. Nale ży uniknąć 
zbierania pszczó ł wczesną wiosną lub późną jesienią, gdyż podczas 
tego okresu maj ą zmienion ą fizjologi ę. Jeżeli badania musz ą być 
prowadzone wczesn ą wiosną lub późną jesienią, pszczoły umieszcza 
się w inkubatorze i hoduje przez tydzie ń na „pszczelim chlebie” 
(pyłek zebrany z grzebienia) i roztworze sacharozy. Pszczo ły trakto­
wane substancjami chemicznymi, takimi jak antybiotyki, produkty przeznaczone do zwalczania warrozy itd., nie powinny by ć używane 
do badań toksyczno ści przez cztery tygodnie od czasu ko ńca ostat­
niego traktowania.
 
1.5.2.  Pomieszczenie i warunki żywienia  
Stosuje si ę łatwe do czyszczenia i dobrze wentylowane klatki. 
Należy stosowa ć właściwe materia ły, na przyk ład stal nierdzewn ą, 
siatkę drucianą, plastikowe lub jednorazowe drewniane klatki. Zale ­
cane są grupy po dziesi ęć pszczół na klatk ę. Wymiary klatek do 
badań muszą być właściwe do ilo ści pszczó ł, tj. zapewnia ć wystar­
czającą przestrze ń. 
Pszczoły powinny by ć trzymane w ciemno ści, w pokoju do świad­
czalnym w temperaturze 25 ± 2  o C. Wilgotno ść względna, zwykle 
około 50–70 %, powinna by ć rejestrowana w czasie badania. Proce ­
dury post ępowania, w łączając traktowanie i obserwacje, prowadzi si ę 
w dziennym świetle. Roztwory sacharozy w wodzie o st ężeniu 
końcowym 500 g/l (50 % wag./obj.) powinny by ć stosowane jako 
pokarm. Po podaniu próbnych dawek pokarm powinien by ć zapew­
niany  ad libitum.  System podawania pokarmu powinien umo żliwiać 
rejestrowanie poboru pokarmu powinien odniesieniu do ka żdej klatki 
(zob. pkt 1.6.3.1). Mo że to być szklana rura (oko ło 50 mm d ługości 
i 10 mm szeroko ści z otwartym zw ężającym się końcem do oko ło 
2 mm średnicy).  
1.5.3.  Przygotowanie pszczó ł 
Zebrane pszczo ły mogą być przypadkowo rozmieszczane w klatkach 
do badań rozmieszczonych losowo w pokoju do świadczalnym.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Pszczoły mogą być zagłodzone przez 2 h przed rozpocz ęciem bada ­
nia. Zalecane jest, aby pszczo ły pozbawiono pokarmu przed trakto ­
waniem, tak aby wszystkie pszczo ły miały równe warunki odno śnie 
do zawarto ści jelit na pocz ątku badania. Konaj ące pszczo ły powinny 
być usunięte i zastąpione zdrowymi przed rozpocz ęciem badania.  
1.5.4.  Przygotowanie dawek  
W przypadku gdy substancja badana jest zwi ązkiem mieszaj ącym się 
z wodą, roztwarza si ę ją bezpośrednio w 50 % roztworze sacharozy. 
W odniesieniu do produktów technicznych i substancji o niskiej rozpuszczalno ści w wodzie stosuje si ę nośniki takie, jak organiczne 
rozpuszczalniki, emulgatory lub dyspergatory o niskiej toksyczno ści 
dla pszczó ł (np. aceton, dimetyloformamid, dimetylosulotlenek). 
Stężenie nośnika zale ży od rozpuszczalno ści badanej substancji 
i powinno by ć takie same dla wszystkich badanych st ężeń. Jednakże 
1 % stężenie nośnika jest ogólnie w łaściwe i nie mo że być przekra­
czane.
 
Powinny by ć przygotowane roztwory kontrolne, tj. w przypadku gdy 
stosuje si ę rozpuszczalnik lub dyspergator do rozpuszczenia 
substancji badanej, nale ży użyć dwóch oddzielnych roztworów 
kontrolnych: roztwór w wodzie i roztwór sacharozy z uk ładem 
rozpuszczalnik/dyspergator o st ężeniu stosowanym w roztworach 
dozujących.  
1.6. PROCEDURA  
1.6.1.  Grupy badane i kontrolne  
Liczba dawek i testowanych kopii musi spe łniać wymagania staty ­
styczne dla oznaczenia LD  50 z 95 % granic ą ufności. Zwykle pi ęć 
dawek w serii geometrycznej, ze wska źnikiem nieprzekraczaj ącym 
2,2 i obejmuj ącym zakres dla LD  50 , jest wymaganych dla badania. 
Jednakże wskaźnik rozcie ńczenia i liczba st ężeń w odniesieniu do 
dozowania musz ą być ustalone w zale żności od zbocza krzywej 
toksyczno ści (dawka w zale żności od śmiertelno ści) 
i uwzględnione w ramach wybranej metody statystycznej do analizy 
wyników. Badanie znalezienia zakresu umo żliwia wybór w łaściwych 
stężeń do dozowania.  
Należy użyć minimum trzech kopii grup badanych, po 10 pszczó ł 
każda, dozowanych ka żdym stężeniem badanym. Minimum trzy 
kontrolne partie, ka żda po 10 pszczó ł, powinny by ć dodatkowo 
włączone w przebieg serii bada ń. Partie kontrolne powinny by ć 
także włączone, gdy stosowany jest uk ład rozpuszczalnik/no śnik 
(zob. pkt 1.5.4).  
1.6.2.  Norma toksyczno ści 
W badane serie nale ży włączyć normę toksyczno ści. Co najmniej 
trzy dawki musz ą być wybrane do pokrycia warto ści oczekiwanej 
LD 50 . Co najmniej trzy skopiowane klatki, ka żda zawieraj ąca 10 
pszczół, należy użyć dla każdej badanej dawki. Zalecan ą normą 
toksyczno ści jest dimetoat, dla którego doniesienie o LD  50 -24 h, 
drogą pokarmow ą jest w zakresie 0,10–0,35 μg a.s./pszczo ła (2). 
Jednakże inne normy toksyczno ści byłyby równie ż dopuszczalne 
w przypadku, gdy mo żna dostarczy ć wystarczaj ących danych do 
sprawdzenia oczekiwanej reakcji na dawk ę (np. paration).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Ekspozycja  
1.6.3.1.  Podawanie dawek  
Każdej badanej grupie pszczó ł należy dostarczy ć 100–200 μl 50 % 
roztworu sacharozy w wodzie, zawieraj ącego badan ą substancj ę 
o właściwym st ężeniu. Wi ększa obj ętość jest wymagana 
w odniesieniu do produktów o niskiej rozpuszczalno ści, niskiej 
toksyczno ści lub stężeniu w sk ładzie, poniewa ż muszą być zastoso­
wane wy ższe proporcje w roztworze sacharozy. Ilo ść traktowanej, 
spożytej diety przez grup ę musi być monitorowana. Zu żyty podajnik 
(zwykle 3–4 godz.) powinien by ć usunięty z klatki i zast ąpiony 
podajnikiem wype łnionym tylko roztworem sacharozy. Roztwory 
sacharozy s ą wtedy dostarczane  ad libitum . W odniesieniu do niektó ­
rych związków odrzucenie wy ższego stężenia dawki badanej objawia 
się w małej konsumpcji pokarmu lub jej braku. Po maksimum 6 
godz. niespo żyta traktowana dieta powinna by ć zastąpiona samym 
roztworem sacharozy. Ilo ść spożytej traktowanej diety musi by ć 
oszacowana (np. pomiar obj ętość/waga pozosta łej traktowanej diety).  
1.6.3.2.  Czas trwania  
Zalecany czas trwania badania wynosi 48 godz. po zast ąpieniu 
roztworu badanego, roztworem samej sacharozy. Je śli śmiertelno ść 
nadal wzrasta do wi ęcej niż 10 % po pierwszych 24 godz., czas 
trwania badania powinien by ć przedłużony do maksimum 96 godz., 
zapewniaj ąc, że śmiertelno ść w doświadczeniu kontrolnym nie prze ­
wyższa 10 %.  
1.6.4.  Obserwacje  
Śmiertelno ść jest rejestrowana w 4 godziny po rozpocz ęciu badania, 
a w okresie pó źniejszym w 24 i 48 godzinie (tj. po podaniu dawki). 
Jeśli wymagany jest przed łużony okres obserwacji, nast ępne oceny 
powinny by ć dokonane w 24 godzin przedzia łach czasowych, do 
maksimum 96 godzin, pod warunkiem że śmiertelno ść 
w doświadczeniu kontrolnym nie przekroczy 10 %.  
Ilości pokarmu spo żytego na grup ę powinna by ć oszacowana. 
Porównanie wska źników spo życia traktowanej i nietraktowanej 
diety w danych 6 godzinach dostarcza informacji o strawno ści 
diety traktowanej.  
Wszystkie anormalne efekty zachowania zaobserwowane w trakcie 
okresu badania powinny by ć zarejestrowane.  
1.6.5.  Badanie graniczne  
W pewnych przypadkach (np. gdy oczekuje si ę, że substancja 
badana posiada nisk ą toksyczno ść) należy przeprowadzi ć badanie 
graniczne, stosuj ąc 100 μg a.s./pszczo łę w celu ukazania, że LD  50 
jest większa niż niniejsza warto ść. Ta sama procedura powinna by ć 
zastosowana do, w łączając trzy skopiowane grupy badane dla dawki 
badanej, odpowiednich do świadczeń kontrolnych, oceny ilo ści trak­
towanej diety spo żytej oraz u życia normy toksyczno ści. Jeśli wystę­
puje śmiertelno ść, powinny by ć przeprowadzone pe łne badania. Je śli 
obserwuje si ę podśmiertelne skutki (zob. pkt 1.6.4), powinny by ć 
one zarejestrowane.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. DANE  
Dane powinny by ć zestawione w formie tabelarycznej, pokazuj ąc 
w odniesieniu do ka żdej traktowanej grupy, jak równie ż 
w odniesieniu do grup kontrolnych i grup norm toksyczno ści, ilość 
użytych pszczó ł, śmiertelno ść w dowolnym momencie obserwacji 
i liczbę pszczół o negatywnym zachowaniu. Analiza danych śmier­
telności właściwymi metodami statystycznymi (np. analiza probi ­
towa, średnia krocz ąca, prawdopodobie ństwo dwumianu) (3)(4). 
Wykreślone krzywe dawka-reakcja w ka żdym zalecanym momencie 
obserwacji i obliczenia zboczy krzywych oraz średnie dawki śmier­
telne (LD  50 ) z 95 % granicami ufno ści. Poprawki dotycz ące śmier­
telności w doświadzeniach kontrolnych mog ą być dokonane przy 
użyciu poprawki Abbotta (4)(5). W przypadku gdy traktowana 
dieta nie jest ca łkowicie spo żyta, powinna by ć ustalona dawka 
substancji badanej spo żytej przez grup ę. LD  50 powinna by ć wyra­ 
żona w μg substancji badanej na pszczo łę. 
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
2.2.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— charakter fizyczny i stosowne w łaściwości fizyko-chemiczne (np. 
stabilność w wodzie, ci śnienie pary),  
— dane dotycz ące identyfikacji chemicznej w łączając wzór struktu ­
ralny, czysto ść (tj. w odniesieniu do pestycydów identyfikacj ę 
i stężenie aktywnej(-ych) substancji).  
2.2.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— nazwa naukowa, rasa, przybli żony wiek (w tygodniach), metoda 
zbierania, dane dotycz ące zbierania,  
— informacje dotycz ące kolonii u żywanych do zbierania pszczó ł 
badanych, w łączając stan zdrowotny, choroby wieku doros łego, 
wszystkie wcze śniejsze traktowania itd.  
2.2.3.  Warunki badania:  
— temperatura i wilgotno ść względna pokoju do świadczalnego,  
— warunki pomieszczenia w łączając typ, wymiary i materia ł klatki,  
— metody przygotowania roztworu wyj ściowego i roztworów bada ­
nych (rozpuszczalnik i jego st ężenia musz ą być podane, gdy 
zostały zastosowane),  
— metoda przygotowania roztworu wyj ściowego i cz ęstotliwość 
odnawiania ( środek ułatwiający rozpuszczanie i jego st ężenia 
muszą być podane, gdy zosta ły zastosowane),  
— projekt badania, np. liczba i st ężenia badane u żyte, ilość 
doświadczeń kontrolnych w odniesieniu do ka żdego stężenia 
badanego i do świadczenia kontrolnego, liczba kopii klatek 
i liczba pszczó ł na klatkę, 
— data badania.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Wyniki:  
— wyniki bada ń wstępnego szukania zakresu, je śli wykonano,  
— pierwotne dane: śmiertelno ść przy ka żdej dawce badanej 
w dowolnym momencie obserwacji,  
— wykresy krzywych dawka-reakcja na koniec badania,  
— warto ść LD  50 z granicami ufno ści 95 % w zalecanym momencie 
obserwacji, w odniesieniu do substancji badanej i normy toksycz ­
ności, 
— zastosowane procedury statystyczne do okre ślenia LD  50 , 
— śmiertelno ść w doświadczeniach kontrolnych,  
— inne skutki biologiczne zaobserwowane lub pomierzone, np. 
anormalne zachowanie pszczó ł (włączając odrzucenie dawki 
badanej), wska źnik spo życia diety w traktowanych 
i nietraktowanych grupach,  
— wszelkie odchylenia od opisanych tutaj procedur badania oraz 
wszelkie inne istotne informacje.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection 
Products-Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151–165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees  (Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119–125.  
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, pp. 99–113.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265–267.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  PSZCZO ŁY MIODNE – BADANIE KONTAKTOWEJ 
TOKSYCZNO ŚCI OSTREJ  
1. METODA  
Niniejsza metoda badania kontaktowej toksyczno ści ostrej jest kopi ą 
OECD TG 214 (1998 r.).  
1.1. WPROWADZENIE  
Niniejsze badanie toksyczno ści jest laboratoryjn ą metodą, zaprojek ­
towaną do oceny kontaktowej ostrej toksyczno ści środków ochrony 
roślin i innych substancji chemicznych do doros łych robotnic pszczó ł 
miodnych.  
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczno ści substancji chemicznej 
oznaczenie ostrej toksyczno ści kontaktowej dla pszczó ł miodnych 
jest wymagane np. gdy jest prawdopodobna ekspozycja pszczó ł na 
działanie danej substancji chemicznej. Badanie kontaktowej toksycz ­
ności ostrej jest przeprowadzane dla ustalenia w łaściwej toksyczno ści 
w odniesieniu do pszczó ł, pestycydów i innych substancji chemicz ­
nych. Wyniki niniejszego badania powinny by ć wykorzystane do 
określenia potrzeby dalszej oceny. W szczególno ści niniejsza metoda 
może być stosowana w programach odcinkowych oceny niebezpie ­
czeństwa pestycydów dla pszczó ł, w oparciu o kolejne post ępy 
badań toksyczno ści laboratoryjnych do pó łpolowych i polowych 
eksperymentów (1). Pestycydy mog ą być badane jako substancje 
aktywne (a.s.) lub jako wytworzone produkty.  
Norma toksyczno ści powinna by ć zastosowana do sprawdzenia 
wrażliwości pszczó ł i precyzji procedury badania.  
1.2. DEFINICJE  
Ostra toksyczno ść drogi pokarmowej:  są to negatywne skutki 
powstające w granicach maksymalnego okresu 96 godzin po miej ­
scowym podaniu pojedynczej dawki substancji.  
Dawka:  jest ilością substancji badanej zastosowanej. Dawka jest 
wyrażana jako masa ( μg) substancji badanej na badane zwierz ę (μg/­
pszczołę). 
LD 50 (średnia dawka śmiertelna) kontaktowa:  jest statystycznie 
wyprowadzon ą pojedyńczą dawką substancji, która powoduje zgon 
u 50 % zwierz ąt poprzez kontakt. Warto ść LD  50 jest wyrażona w μg 
substancji badanej na pszczo łę. W odniesieniu do pestycydów 
substancją badaną może być substancja aktywna (a.s.) albo wytwo ­
rzony produkt zawieraj ący jedną lub więcej niż jedną substancj ę 
aktywną. 
Śmiertelno ść: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest 
zupełnie nieruchome.  
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Dorosłe robotnice pszczó ł miodnych ( Apis mellifera ) są ekspono ­
wane w zakresie dawek substancji badanej rozproszonej we 
właściwym no śniku, przez bezpo średnie na łożenie na tu łów (kropel ­
ki). Czas trwania badania wynosi 48 godz. Je śli wskaźnik śmiertel­
ności zwiększa się między 24 a 48 godz., podczas gdy śmiertelno ść 
w doświadzeniach kontrolnych pozostaje na akceptowalnym pozio ­
mie, tj. < 10 %, w łaściwe jest przed łużenie czasu trwania badania do 
maksimum 96 godz. Śmiertelno ść jest rejestrowana codziennie 
i porównywana z warto ściami kontrolnymi. Wyniki s ą analizowane 
w celu obliczenia LD  50 w 24 i 48 godz. oraz, w przypadku gdy 
badanie jest przed łużone, w 72 i 96 godz.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ło ważne, mają zastosowanie nast ępujące warunki:  
— średnia śmiertelno ść w odniesieniu do wszystkich do świadczeń 
kontrolnych nie mo że przekracza ć 10 % na ko ńcu badania,  
— LD  50 normy toksyczno ści odpowiada okre ślonemu zakresowi.  
1.5. OPIS METODY BADANIA  
1.5.1.  Zbieranie pszczó ł 
Młode dojrza łe robotnice pszczó ł z tej samej rasy powinny by ć 
użyte, tj. pszczo ły w tym samym wieku, statusie żywieniowym itd. 
Pszczoły powinny by ć uzyskane z kolonii, w łaściwie odżywianej, 
zdrowej, tak dalece jak to mo żliwe wolnej od chorób, o w łaściwej 
królowej, o znanej historii i fizjologicznym statusie. Musz ą być 
zebrane rano przed u życiem lub wieczorem przed badaniem 
i przechowane w warunkach badania do nast ępnego dnia. Odpo ­
wiednie s ą pszczoły zebrane z ram, bez potomstwa. Nale ży uniknąć 
zbierania pszczó ł wczesną wiosną lub późną jesienią, gdyż podczas 
tego okresu maj ą zmienion ą fizjologi ę. Jeżeli badania musz ą być 
prowadzone wczesn ą wiosną lub późną jesienią, pszczoły umieszcza 
się w inkubatorze i hoduje przez tydzie ń na „pszczelim chlebie” 
(pyłek zebrany z grzebienia) i roztworze sacharozy. Pszczo ły trakto­
wane substancjami chemicznymi, takimi jak antybiotyki, produkty 
przeznaczone do zwalczania warrozy itd., nie mog ą być używane 
do badań toksyczno ści przez cztery tygodnie od chwili zako ńczenia 
ostatniego traktowania.  
1.5.2.  Pomieszczenie i warunki żywienia  
Stosuje si ę łatwe do czyszczenia i dobrze wentylowane klatki. 
Należy stosowa ć właściwe materia ły, na przyk ład stal nierdzewn ą, 
siatkę drucianą, plastikowe lub jednorazowe drewniane klatki. Zale ­
cane są grupy po dziesi ęć pszczół na klatk ę. Wymiary klatek do 
badań muszą być odpowiednie do ilo ści pszczó ł, tj. zapewnia ć 
wystarczaj ącą przestrze ń. 
Pszczoły powinny by ć trzymane w ciemno ści, w pokoju do świad­
czalnym w temperaturze 25 ± 2  o C. Wilgotno ść względna, zwykle 
około 50–70 %, powinna by ć rejestrowana w czasie badania. Proce ­
dury post ępowania w łączając traktowanie i obserwacje prowadzi si ę 
w dziennym świetle. Roztwory sacharozy w wodzie o st ężeniu 
końcowym 500 g/l (50 % wag./obj.) stosowane s ą jako pokarm 
podawany  ad libitum  w czasie trwania badania, u żywając podajnik 
pszczół. Może to być szklana rura (oko ło 50 mm d ługości i 10 mm 
szerokości z otwartym zw ężającym się końcem do oko ło 2 mm 
średnicy).  
1.5.3.  Przygotowanie pszczó ł 
Zebrane pszczo ły są znieczulane dwutlenkiem w ęgla lub azotem 
w celu zastosowania substancji badanej. Ilo ść środka znieczulaj ącego 
i czas ekspozycji powinien by ć zminimalizowany. Konaj ące pszczo ły 
powinny by ć usunięte i zast ąpione zdrowymi pszczo łami przed 
rozpoczęciem badania.  
1.5.4.  Przygotowanie dawek  
Substancja badana ma by ć zastosowana jako roztwór w no śniku, tj. 
organicznym rozpuszczalniku lub wodnego roztworu ze środkiem 
zwilżającym. Z organicznych rozpuszczalników zalecany jest aceton, 
lecz mog ą być użyte inne organiczne rozpuszczalniki o niskiej 
toksyczno ści dla pszczó ł (np. dwumetyloformamid, dwumetylosul ­
fotlenek). Dla rozproszonych w wodzie okre ślonych produktów 
i wysokopolarnych substancji organicznych nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikowych organicznych no śnikach, roztwory łatwiej 
podawać, gdy przygotuje si ę słaby roztwór handlowego środka zwil ­ 
żającego (np. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
Powinny by ć przygotowane w łaściwe roztwory kontrolne, tj. 
w przypadku gdy u żyto rozpuszczalnika albo dyspergator dla 
rozpuszczenia substancji badanej, powinny by ć zastosowane dwie 
kontrolne grupy, jedna traktowana wod ą i jedna traktowana uk ładem 
rozpuszczalnik/dyspergator.  
1.6. PROCEDURA  
1.6.1.  Grupy badane i kontrolne  
Liczba dawek i badanych kopii powinna odpowiada ć wymaganiom 
statystycznym dotycz ącym okre ślenia LD  50 z granicami ufno ści 
95 %. Zwykle pi ęć dawek w serii geometrycznej, ze wska źnikiem 
nieprzekraczaj ącym 2,2 i obejmuj ącym zakres dla LD  50 , jest wyma ­
ganych w odniesieniu do bada ń. Jednakże liczba dawek musi by ć 
ustalona w zale żności od zbocza krzywej toksyczno ści (dawka 
w zależności od śmiertelno ści) i z uwzgl ędnieniem wybranej metody 
statystycznej do analizy wyników. Badanie szukania zakresu umo ż­
liwia wybór w łaściwych st ężeń do dozowania.  
Należy użyć minimum trzech kopii grup badanych, po 10 pszczó ł 
każda, dozowanych ka żdym stężeniem badanym.  
Minimum trzy kontrolne partie, ka żda po 10 pszczó ł, powinny by ć 
dodatkowo w łączone w przebieg serii bada ń. Jeśli rozpuszczalnik 
organiczny lub środek zwil żający jest stosowany, trzy partie kontro ­
lne, każda po 10 pszczó ł dla rozpuszczalnika i środka zwil żającego, 
muszą być włączone.  
1.6.2.  Norma toksyczno ści 
W badane serie nale ży włączyć normę toksyczno ści. Co najmniej 
trzy dawki powinny by ć wybrane do pokrycia oczekiwanej warto ści 
LD 50 . Co najmniej trzy skopiowane klatki, ka żda zawieraj ąca 10 
pszczół, należy użyć przy każdej badanej dawce. Zalecan ą normą 
toksyczno ści jest dimetoat, dla którego o świadczone ustnie LD  50 - 
24 h, drog ą pokarmow ą jest w zakresie 0,10–0,35 μg a.s./pszczo łę 
(2). Jednak że inne normy toksyczno ści byłyby równie ż dopuszczalne 
w przypadku, gdy mo żna dostarczy ć wystarczaj ących danych do 
sprawdzenia oczekiwanej reakcji na dawk ę (np. paration).  
1.6.3.  Ekspozycja  
1.6.3.1.  Podawanie dawek  
Znieczulone pszczo ły są pojedynczo poddawane zabiegowi miej ­
scowemu podaniu dawki. Pszczo ły są losowo poddawane ró żnym 
próbnym i kontrolnym dawkom. Obj ętość 1 μl roztworu zawieraj ą­
cego substancj ę badaną o odpowiednim st ężeniu powinna by ć 
podana mikroaplikatorem do grzbietowej strony tu łowia każdej 
pszczoły. Można użyć inne obj ętości, jeśli jest to uzasadnione. Po 
podaniu dawki pszczo ły są umieszczane w klatkach do bada ń 
i żywione roztworami sacharozy.  
1.6.3.2.  Czas trwania  
Zalecany czas trwania badania wynosi 48 godz. Je śli śmiertelno ść 
wzrasta o wi ęcej niż 10 % mi ędzy 24 a 48 godz., czas trwania 
badania powinien by ć przedłużony do maksimum 96 godz., pod 
warunkiem że śmiertelno ść przy doświadczeniu kontrolnym nie prze ­
wyższa 10 %.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Obserwacje  
Śmiertelno ść jest rejestrowana w 4 godzinie po dozowaniu, a w 
okresie pó źniejszym w 24 i 48 godzinie. Je śli wymagany jest prze ­
dłużony okres obserwacji, dalsze oceny powinny by ć dokonywane 
w 24-godzinnych przedzia łach czasowych, do maksimum 96 godzin, 
pod warunkiem że śmiertelno ść przy doświadczeniu kontrolnym nie 
przekracza 10 %.  
Wszystkie anormalne skutki zachowywania si ę w czasie trwania 
badania powinny by ć zarejestrowane.  
1.6.5.  Badanie graniczne  
W niektórych przypadkach (np. gdy oczekuje si ę, że substancja 
badana posiada nisk ą toksyczno ść) można przeprowadzi ć badanie 
graniczne, stosuj ąc 100 μg a.s./pszczo ła w celu ukazania, że LD  50 
jest większa niż niniejsza warto ść. Ta sama procedura powinna by ć 
zastosowana, w łączając trzy skopiowane grupy badane, 
w odniesieniu do dawki badanej, odpowiednich dawek kontrolnych oraz użycia normy toksyczno ści. Jeśli występuje śmiertelno ść, 
powinny by ć przeprowadzone pe łne badania. Je śli obserwuje si ę 
podśmiertelne skutki (zob. pkt 1.6.4), powinny one by ć zarejestro ­
wane.
 
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. DANE  
Dane powinny by ć zestawione w formie tabelarycznej, pokazuj ąc 
w odniesieniu do ka żdej traktowanej grupy, jak równie ż 
w odniesieniu do grup kontrolnych i grup normy toksyczno ści, 
ilość użytych pszczó ł, śmiertelno ść w każdym momencie obserwacji 
i liczbę pszczół o negatywnym zachowaniu. Analiza danych dotycz ­ 
ących śmiertelno ści właściwymi metodami statystycznymi (np. 
analiza probitowa, średnia krocz ąca, prawdopodobie ństwo 
dwumianu) (3)(4). Wykre ślone krzywe dawka-reakcja w ka żdym 
zalecanym momencie obserwacji (tj. 24, 48 godz. i, je śli to 
stosowne, 72 i 96 godz.) i obliczenia zboczy krzywych oraz średnie 
dawki śmiertelne (LD  50 ) z granicami ufno ści 95 %. Poprawki 
w odniesieniu do śmiertelno ści przy do świadczeniu kontrolnym 
powinny by ć wykonane przy u życiu poprawki Abbotta (4)(5). 
LD 50 powinna by ć wyrażona w μg substancji badanej na pszczo łę. 
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
2.2.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— charakter fizyczny i stosowne w łaściwości fizyko-chemiczne (np. 
stabilność w wodzie, ci śnienie pary),  
— dane identyfikacji chemicznej, w łączając wzór strukturalny, czys ­
tość (tj. w odniesieniu do pestycydów identyfikacj ę i stężenie 
aktywnej substancji).  
2.2.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— nazwa naukowa, rasa, przybli żony wiek (w tygodniach), metoda 
zbierania, dane dotycz ące zbierania,  
— informacje dotycz ące kolonii u żywanych do zbierania pszczó ł 
badanych, w łączając stan zdrowotny, choroby wieku doros łego, 
wszystkie wcze śniejsze traktowania itd.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Warunki badania:  
— temperatura i wilgotno ść względna pokoju do świadczalnego,  
— warunki pomieszczenia, w łączając typ, wymiary i materia ł klatki,  
— metody podawania substancji badanej, np. u żyty nośnik, rozpusz ­
czalnik, obj ętość zastosowanego roztworu badanego, u żyte znie­
czulenie,  
— projekt badania, np. ilo ść i użyte dawki badane, liczba do świad­
czeń kontrolnych dla próbnej dawki i pomiaru, liczba kopii 
klatek i liczba pszczó ł na klatk ę, 
— data badania.  
2.2.4.  Wyniki:  
— wyniki bada ń wstępnego szukania zakresu, je śli wykonano,  
— pierwotne dane: śmiertelno ść przy ka żdym stężeniu badanym 
w każdej chwili obserwacji,  
— wykresy krzywych dawka-reakcja na koniec badania,  
— warto ść LD  50 z 95 % limitem zaufania w ka żdym zalecanym 
momencie obserwacji, w odniesieniu do substancji badanej i normy toksyczno ści,
 
— zastosowane procedury statystyczne do okre ślenia LD  50 , 
— śmiertelno ść w doświadczeniach kontrolnych,  
— inne skutki biologiczne zaobserwowane lub pomierzone 
i wszystkie anormalne reakcje pszczó ł, 
— wszelkie odchylenia od opisanej tutaj metody badania i wszystkie 
inne istotne informacje.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision -Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection 
Products-Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 
151–165. March 1993.  
(2) Gough, H. J., Mclndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity 
tests on honeybees  (Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal of 
Apicultural Research 22, pp. 119–125.  
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99–113.
 
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness 
of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265–267.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORPCJA/DESORPCJA PRZY U ŻYCIU METODY 
RÓWNOWAGI OKRESOWEJ  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest kopi ą OECD TG 106, w odniesieniu do 
określenia adsorpcji/desorpcji gleby przy u życiu metody równowagi 
okresowej (2000 r.).  
1.1. WPROWADZENIE  
Metoda uwzgl ędnia prób ę obrączkową i warsztat dotycz ący wyboru 
gleby dla rozwoju badania adsorpcji (1)(2)(3)(4), a tak że istniejące 
wytyczne na poziomie krajowym (5)(6)(7)(8)(9)(10)(11).  
Badania adsorpcji/desorpcji s ą użyteczne dla uzyskania podstawo ­
wych informacji dotycz ących mobilno ści substancji chemicznych 
i ich roz łożeniu w ziemnych, wodnych i powietrznych cz ęściach 
biosfery (12)(13)(14)(15)(16)(17)(18)(19)(20)(21). Informacje mog ą 
być wykorzystywane w przewidywaniu lub szacowaniu na przyk ład 
zdolności substancji chemicznych do degradacji (22)(23), przekszta ł­
cania i poboru przez organizmy (24); wymywania przez profil gleby 
(16)(18)(19)(21)(25)(26)(27)(28); lotno ści z gleby (21)(29)(30); 
ucieczki z powierzchni ziemi do wód naturalnych (18)(31)(32). Dane dotycz ące adsorpcji s ą wykorzystywane do celów porównaw ­
czych i modelowania (19)(33)(34)(35).
 
Rozłożenie substancji chemicznej mi ędzy glebę a fazę wodną jest 
złożonym procesem zale żnym od wielu ró żnych czynników: charak ­
teru chemicznego substancji (12)(36)(37)(38)(39)(40), cech gleby 
(4)(12)(13)(14)(41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48)(49), czynników 
klimatycznych takich, jak opady deszczu, temperatury, światła 
słonecznego i wiatru. W ten sposób liczne zjawiska i mechanizmy 
włączają się w proces adsorpcji substancji chemicznej przez gleb ę 
i nie mog ą być określone całościowo przez uproszczony model labo ­
ratoryjny, jak w niniejszej metodzie. Jednak że jeśli nawet ta próba 
nie może objąć środowiskowo mo żliwych przypadków, to dostarcza 
cennych informacji odnosz ących się do adsorpcji substancji chemicz ­
nych w środowisku.  
Zob. także Ogólne wprowadzenie.  
1.2. ZAKRES  
Metoda ma na celu oszacowanie zachowywania adsorpcji/desorpcji 
substancji w glebie. Celem jest uzyskanie warto ści sorpcji, która jest 
użyteczna do przewidywania podzia łu w różnorodności warunków 
środowiskowych; do tego celu wspó łczynniki adsorpcji równowa ­
gowej są ustalane w odniesieniu do substancji chemicznych 
w różnych glebach, jako funkcja cech gleby (np. zawarto ść węgla 
organicznego, zawarto ść gliny i tekstura gleby oraz pH). Nale ży 
użyć różnych typów gleby w celu obj ęcia jak najszerzej zdarzenia 
współdziałań danej substancji z glebami naturalnymi.  
W niniejszej metodzie adsorpcja przedstawia proces wi ązania się 
substancji chemicznej do powierzchni gleby; nie odró żnia między 
różnymi procesami adsorpcji (fizyczna i chemiczna adsorpcja) 
i takimi procesami, jak rozk ład katalizowany powierzchniowo, 
masową adsorpcj ą i chemiczn ą reakcją. Adsorpcji zdarzaj ącej się 
na cząstkach koloidów ( średnica < 0,2 μm) wytwarzanych przez 
gleby nie uwzgl ędniono.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Parametrami gleby, przypuszczalnie najistotniejszymi, w odniesieniu 
do gleby s ą: zawarto ść węgla organicznego (3)(4)(12)(13)(14)(41) 
(43)(44)(45)(46)(47)(48); zawarto ść gliny i tekstura gleby (3)(4)(41) 
(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48) i pH w odniesieniu do zjonizowanych związków (3)(4)(42). Inne parametry gleby, które maj ą wpływ na 
absorpcję/desorpcję określonej substancji, to efektywna zdolno ść 
wymiany kationu (ECEC), zawarto ść amorficznego żelaza 
i tlenków glinu, szczególnie w odniesieniu do gleb wulkanicznych i tropikalnych (4), jak równie ż powierzchnia w łaściwa (49).
 
Badanie jest zaprojektowane do oceny adsorpcji substancji 
chemicznej na ró żnego typu glebach o zró żnicowanym zakresie 
zawartości węgla organicznego, zawarto ści gliny i tekstury gleby 
oraz pH. Obejmuje to trzy warstwy:  
Warstwa 1:  Badania wst ępne w celu ustalenia:  
— proporcji gleba/roztwór,  
— czasu równowagi dla adsorpcji i ilo ści substancji 
badanej zaadsorbowanej w równowadze,  
— adsorpcji substancji badanej na powierzchni zbior ­
nika badanego i stabilno ść badanej substancji 
w czasie trwania okresu badania.  
Warstwa 2:  Badanie klasyfikacji: adsorpcja jest badana na pi ęciu 
różnych typach gleby za pomoc ą kinetyki adsorpcji 
w pojedynczym st ężeniu oraz okre ślenie wspó łczyn­
nika podzia łu K  d i Ko  c . 
Warstwa 3:  Określenie izoterm adsorpcji Freundlicha dla ustalenia 
wpływu stężenia na zasi ęg adsorpcji na glebach.  
Badania desorpcji za pomoc ą kinetyki desorpcji/ ­
Freundlicha desorpcji izotermy (dodatek 1).  
1.3. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Symbol Definicja Jednostki  
A t i procent adsorpcji w czasie t  i % 
A eq procent adsorpcji w równowadze adsorpcji %  
m s ads ðt i Þ masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie 
w czasie t  i μg 
m s ads ðΔt i Þ masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie podczas 
trwania przedzia łu czasowego Δt i μg 
m s ads ðeqÞ masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie 
w równowadze adsorpcji μg 
m 0 masa substancji badanej w probówce na pocz ątku badania 
adsorpcji μg 
m m ads ðt i Þ masa substancji badanej, zmierzona w podwielokrotno ści 
(v a A ) w punkcie czasu ti μg 
m aq ads ðeqÞ masa substancji w roztworze przy równowadze adsorpcji μg 
m soil wielkość fazy gleby, wyra żona jako sucha masa gleby g  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Symbol Definicja Jednostki  
C st stężenie masowe roztworu podstawowego substancji μg cm-  3 
C 0 początkowe stężenie masowe roztworu badanego 
w kontakcie z gleb ą μg cm-  3 
C aq ads ðt i Þ stężenie masowe substancji w fazie wodnej w czasie t  i , 
w którym dokonywana jest analiza μg cm-  3 
C s ads ðeqÞ zawartość substancji zaadsorbowanej na glebie przy 
równowadze adsorpcji μg cm-  1 
C aq ads ðeqÞ stężenie masowe substancji w fazie wodnej przy równo ­
wadze adsorpcji μg cm-  3 
V 0 początkowa obj ętość fazy wodnej w kontakcie z gleb ą, 
w czasie trwania badania adsorpcji cm 3 
v a A objętość podwielokrotno ści, w której substancja badana 
została zmierzona cm 3 
K d współczynnik podzia łu dla adsorpcji cm  3 g -1 
K oc znormalizowany wspó łczynnik adsorpcji w ęgla cm  3 g -1 
K om znormalizowany wspó łczynnik cia ł organicznych cm  3 g -1 
K F ads współczynnik adsorpcji Freundlicha μg 1-l/n (cm  3 ) 1/n g -1 
1/n wyk ładnik Freundlicha  
D t i procent desorpcji w punkcie czasu ti %  
D Δt i procent desorpcji odpowiadaj ący przedzialowi czasu Δ ti % 
K des pozorny wspolczynnik desorpcji μg cm-1 
K F des wspolczynnik desorpcji Freundlicha μg 1-1n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq des ðt i Þ masa badanej substancji zdesorbowana z gleby w czasie t  j μg 
m m des ðΔt i Þ masa badanej substancji zdesorbowana z gleby w czasie 
Δt i μg 
m m des ðeqÞ masa substancji ustalona analitycznie w wodnej fazie przy 
równowadze desorpcyjnej μg 
m aq des ðeqÞ całkowita masa badanej substancji zdesorbowanej przy 
równowadze desorpcyjnej μg 
m s des ðΔt i Þ masa substancji pozostaj ąca zaadsorbowana na glebie po 
przedziale czasowym Δt i μg 
m aq A masa substancji pozosta ła z równowagi adsorpcji z 
powodu nieca łkowitego podstawienia obj ętości μg 
C s des ðeqÞ zawartość badanej substancji pozostaj ąca zaadsorbowana 
na glebie przy równowadze desorpcyjnej μg g -1 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Symbol Definicja Jednostki  
C aq des ðeqÞ stężenie masowe badanej substancji w fazie wodnej przy 
równowadze desorpcyjnej μg cm  -3 
V T całkowita obj ętość fazy wodnej w kontakcie z gleb ą 
w czasie trwania do świadczenia kinetyki desorpcji wyko ­
nanego metod ą seryjną cm 3 
V R objętość nadsączu usuni ętego z probówki po osi ągnięciu 
równowagi adsorpcji, zast ąpionego t ą samą objętością 
roztworu 0,01 M CaCl  2 cm 3 
v a D Objętość podwielokrotno ści pobrana do celu analitycznego 
w czasie (i), w czasie trwania do świadczenia kinetyki 
adesorpcji wykonanego metod ą seryjną cm 3 
V ra i D objętość roztworu pobrana z probówki (i) dla pomiaru 
substancji badanej, w do świadczeniu kinetyki adesorpcji 
(metoda równoleg ła) cm 3 
V r F objętość roztworu pobrana z probówki dla pomiaru 
substancji badanej w rownowadze desorpcji cm 3 
MB bilans masy % 
m E całkowita masa substancji badanej ekstrahowanej z gleby 
i ścianek zbiornika badanego w dwóch kolejnych czyn ­
nościach μg 
V rec objętość nadsączu odzyskana po równowadze adsorpcji cm  3 
P ow współczynnik podzia łu oktanol/woda 
pKa sta ła dysocjacji 
S w rozpuszczalno ść w wodzie g 1  -1 
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Znane obj ętości roztworów badanej substancji, nieetykietowanej czy 
też etykietowanej izotopami o znanym st ężeniu w 0,01 M CaCl  2 są 
dodane do próbek gleby o znanej suchej masie, wcze śniej zrówno ­
ważone w 0,01 M CaCl  2 . Mieszanina jest mieszana przez w łaściwy 
czas. Zawiesiny gleby rozdziela si ę następnie przez odwirowanie i, 
jeśli pożądane, filtrowane, a faza wodna analizowana. Ilo ść 
substancji badanej zaadsorbowana na próbce gleby jest obliczona 
jako różnica między ilością substancji badanej pocz ątkowo obecnej 
w roztworze a ilo ścią pozostałą na koniec do świadczenia (metoda 
pośrednia).  
Jako opcja, ilo ść badanej substancji zaadsorbowanej jest tak że 
bezpośrednio ustalana analiz ą gleby (metoda bezpo średnia). 
Niniejsza procedura obejmuj ąca stopniow ą ekstrakcj ę gleby 
właściwym rozpuszczalnikiem, jest zalecana w przypadku, gdy 
różnica w stężeniu roztworu substancji nie mo że być dokładnie usta ­
lona. Przyk ładami takich przypadków s ą: adsorpcja substancji 
badanej na ściankach zbiornika, niestabilno ść substancji badanej 
w skali czasu do świadczenia, s łabej adsorpcji daj ącej tylko ma łe 
zmiany st ężenia w roztworze i silna adsorpcja powoduj ąca niskie 
stężenie, którego nie mo żna dokładnie okre ślić. Jeśli stosuje si ę 
substancję etykietowan ą izotopowo, ekstrakcji z gleby mo żna zapo­
biec za pomoc ą analizy fazy gleby przez spalanie i obliczenie scyn ­
tylacji na cieczowym liczniku. Jednak że cieczowy licznik scyntyla ­
cyjny jest technik ą nieokreśloną, która nie mo że rozróżnić między 
macierzystymi a przekszta łconymi produktami; dlatego musi by ć 
używana tylko wtedy je żeli badana substancja chemiczna jest 
stabilna w czasie trwania bada ń. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMACJE DOTYCZ ĄCE SUB STANCJI BADANEJ  
Odczynniki chemiczne powinny by ć czystości analitycznej. Zalecane 
jest użycie nieetykietowanych substancji badanych o znanym sk ła­
dzie i czysto ści co najmniej 95 % lub etykietowanych izotopami 
substancji badanych o znanym sk ładzie oraz radioczysto ści. 
W przypadku wska źników o krótkim czasie pó łtrwania nale ży zasto­
sować poprawki na rozk ład. 
Przed przeprowadzeniem badania adsorpcji-desorpcji powinny by ć 
dostępne następujące informacje o badanej substancji:  
a) rozpuszczalno ść w wodzie (A.6);  
b) ciśnienie pary (A.4) i/lub sta ła Henry'ego;  
c) rozkład abiotyczny: hydroliza jako funkcja pH (C.7);  
d) współczynnik podzia łu (A.8);  
e) szybka biodegradacja (C.4) lub aerobowe i anaerobowe prze ­
kształcenia w glebie;  
f) pKa niezjonizowanych substancji;  
g) bezpośrednia fotoliza w wodzie (tj. UV-Vis widmo absorpcji 
w wodzie, wydajno ść kwantowa) i fotodegradacja na glebie.  
1.6. MO ŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA BADANIA  
Badanie ma zastosowanie do substancji chemicznych, dla których 
jest dost ępna analityczna metoda z dostateczn ą dokładnością. 
Ważnym parametrem wp ływającym na wiarygodno ść wyników, 
w szczególno ści kiedy stosowana jest metoda po średnia, jest stabil ­
ność substancji badanej w zakresie czasu badania. Dlatego wst ępnym 
warunkiem jest sprawdzenie stabilno ści we wst ępnych badaniach, 
jeśli obserwuje si ę przekszta łcenie w skali czasu badania, zalecane 
jest, aby prowadzono g łówne badania poprzez analiz ę zarówno gleby 
jak i fazy wodnej.  
Trudności w prowadzeniu niniejszego badania powstaj ą 
w odniesieniu do substancji badanych, o niskiej rozpuszczalno ści 
w wodzie (S  w < 10  -4 g 1  -1 ), jak równie ż w odniesieniu do wysoce 
naładowanych substancji, spowodowanych przez fakt, że stężenie 
w fazie wodnej nie mo że być zmierzone analitycznie 
z wystarczaj ącą dokładnością. W tych przypadkach nale ży podjąć 
dodatkowe czynno ści. Wytyczne dotycz ące sposobu post ępowania 
z takimi problemami podano we w łaściwych punktach niniejszej 
metody.  
Przy badaniu lotnych substancji nale ży zachowa ć ostrożność by 
zapobiec stratom w czasie trwania badania.  
1.7. OPIS METODY  
1.7.1.  Aparatura i odczynniki chemiczne  
Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególno ści następujące urządze­
nia: 
a) probówki lub zbiorniki do prowadzenia do świadczeń. Istotne jest, 
aby te probówki i zbiorniki:  
— pasowa ły bezpośrednio do aparatury wirówki w celu zmini ­
malizowania manipulacji i przenoszenia b łędów,  
— były wykonane z oboj ętnego materia łu o minimalnej adsorpcji 
badanej substancji na jego powierzchni;  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) urządzenie do mieszania: podwieszany wibrator lub równowa żny 
osprzęt, utrzymuj ący glebę w postaci zawiesiny;  
c) wirówka: zalecana wysokoobrotowa, na przyk ład siła odwiro ­
wania > 3 000 g, kontrolowana odno śnie do temperatury, zdolna 
do usuwania cz ąstek o średnicy wi ększej niż 0,2 μm z roztworu 
wodnego. Pojemniki powinny by ć zamykane w czasie wirowania 
i mieszania w celu unikni ęcia zmian i strat wody; w celu zmini ­
malizowania adsorpcji na nich nale ży użyć nieaktywne 
zamknięcia na przyk ład pokrywki śrubowe z teflonu;  
d) fakultatywnie: urz ądzenie filtracyjne; filtry o porowato ści 0,2 μm, 
sterylne, jednorazowego u żytku. Nale ży zwróci ć szczególn ą 
uwagę przy wyborze materia łu filtra aby unikn ąć jakichkolwiek 
strat na nim; w odniesieniu do s łabo rozpuszczalnych substancji 
badanych nie zaleca si ę filtra z materia łu organicznego;  
e) analityczne oprzyrz ądowanie, odpowiednie do pomiarów st ężenia 
badanej substancji chemicznej;  
f) suszarka laboratoryjna, zdolna utrzyma ć temperatur ę od 103  o C 
do 110  o C. 
1.7.2.  Scharakteryzowanie i wybór gleb  
Gleby powinny by ć scharakteryzowane przez trzy parametry 
uważane za w du żej mierze odpowiedzialne za zdolno ści adsorp ­
cyjne: w ęgiel organiczny, zawarto ść gliny i tekstura gleby oraz 
pH. Jak ju ż wspomniano (zob. zakres) inne fizykochemiczne w łaści­
wości gleby wp ływają na adsorpcj ę/desorpcję określonych substancji 
i powinny by ć rozważone w takich przypadkach.  
Metody u żywane do scharakteryzowania gleby s ą bardzo istotne oraz 
posiadają znaczący wpływ na wyniki. Dlatego jest zalecane, aby pH 
gleby by ło mierzone w roztworze 0,01 M CaCl  2 (jest to roztwór 
używany w badaniach adsorpcja/desorpcja) zgodnie z odpowiedni ą 
metodą ISO (ISO-10390-1). Jest tak że zalecane, aby inne stosowne 
właściwości gleby by ły ustalane zgodnie ze standardowymi meto ­
dami (na przyk ład „Handbook of Soil Analysis” ISO); pozwala to 
na oparcie analizowanych danych sorpcji, na globalnie znormalizo ­
wanych parametrach gleby. Niektóre wytyczne dotycz ące istniej ­ 
ących standardowych metod analiz gleby i jej charakterystyk ę 
podano w bibliografii (50–52). W odniesieniu do kalibracji metod badania gleby zalecane jest stosowanie gleb odniesienia.
 
Wytyczne dotycz ące wyboru gleb do do świadczeń adsorpcja/ ­
desorpcja podano w tabeli 1. Siedem wybranych gleb pokrywa 
typy gleb spotykane w ró żnych strefach geograficznych. Dla podat ­
nych na jonizacj ę substancji badanych wybrane gleby powinny 
pokrywać szeroki zakres pH, w celu umo żliwienia oceny adsorpcji 
substancji w jej zjonizowanych i niezjonizowanych formach. 
Wytyczne dotycz ące tego jak wiele ró żnych gleb nale ży użyć na 
różnych stadiach badania podano pod 1.9 „Wykonanie badania”.  
Jeśli inne typy gleb s ą preferowane powinny one charakteryzowa ć 
się tymi samymi parametrami i powinny mie ć zbliżone zmiany we 
właściwościach do tych opisanych w tabeli 1, nawet je śli nie zesta ­
wiają one dok ładnie kryteriów.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Tabela 1  
Wytyczne dotycz ące wyboru próbek gleby dla adsorpcji/desorpcji  
Typ gleby Zakres pH (w 0,01 
M CaCl  2 ) Zawartość węgla 
organicznego ( %) Zawartość gliny ( %) Tekstura gleby (  1 ) 
1 4,5–5,5 1,0–2,0 65–80 glina 
2 > 7,5 3,5–5,0 20–40 glina formierska 
3 5,5–7,0 1,5–3,0 15–25 mul formierski 4 4,0–5,5 3,0–4,0 15–30 i ł 
5 < 4,0–6,0 (
 2 ) < 0,5–1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10–15 (  2 ) piasek formierski 
6 > 7,0 < 0,5–1,0 (  2 ) ( 3 ) 40–65 glina i ł/glina 
7 < 4,5 > 10 < 10 piasek/piasek 
formierski  
( 1 ) Zgodnie z FAO I systemem US (85). 
( 2 ) Odpowiednie zmienne powinny wykazywa ć wartości w ramach podanego zakresu. Jednak że jeśli występują trudności 
ze znalezieniem w łaściwego materia łu gleby, warto ści poniżej wskazuj ą akceptowalne minimum. 
( 3 ) Gleby z mniej ni ż 0,3 % w ęgla organicznego mog ą zakłócać korelację między organiczn ą zawartością a adsorpcj ą. 
Jest zalecane u życie gleb o minimalnej zawarto ści węgla organicznego 0,3 %.  
1.7.3.  Zbieranie i przechowywanie próbek gleby  
1.7.3.1.  Zbieranie  
Nie ma specjalnych technik ani narz ędzi zalecanych do pobierania 
próbek; technika pobierania próbek zale ży od celu badania (53)(54) ­
(55)(56)(57)(58).  
Należy rozważyć: 
a) szczegó łowe informacje dotycz ące historii pola jest konieczne, 
obejmuje to umiejscowienie, rodzaje wegetacji, traktowanie 
pestycydami i/lub nawozami, dodatki biologiczne lub przypad ­
kowe zanieczyszczenia. Zalecenia normy ISO dotycz ące pobie­
rania próbek (ISO 10381-6) powinny zosta ć spełnione 
w odniesienia do opisu miejsca pobierania próbek;  
b) miejsce pobierania próbek musi by ć określone przez UTM (uni ­
wersalne poprzeczne odwzorowanie Mercatora – europejski 
poziom geodezyjny) lub wspó łrzedne geograficzne; mo że to 
umożliwić ponowne zebranie okre ślonej gleby w przysz łości 
lub może pomóc w okre śleniu gleby w ró żnych systemach klasy ­
fikacyjnych u żywanych w ró żnych krajach Zbierana powinna by ć 
gleba z poziomu A do maksymalnej g łębokości do 20 cm. 
W szczególno ści w odniesieniu do gleb typu n. 7, je śli poziom 
O h jest obecny jako cz ęść gleby, która powinna by ć włączona 
przy zbieraniu próbek.  
Próbki gleby powinny by ć przetransportowane z u życiem pojem ­
ników i w warunkach temperatury, które zapewniaj ą, aby 
początkowe właściwości gleby nie zosta ły zmienione w znacz ący 
sposób.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Przechowywanie  
Zalecane jest u życie tylko świeżo pobranych gleb z pola. Tylko 
w przypadkach, gdy jest to niemo żliwe, gleba jest przechowywana 
w temperaturze otoczenia oraz powinna by ć wysuszona powietrzem. 
Nie ma zalecanej granicy czasu przechowywania, lecz gleby prze ­
chowywane d łużej niż trzy lata powinny by ć ponownie przeanalizo ­
wane przed u życiem w odniesieniu do ich zawarto ści węgla orga­
nicznego, pH i CEC.  
1.7.3.3.  Post ępowanie i przygotowanie próbek gleby do bada ń 
Gleby są suszone powietrzem w temperaturze otoczenia (zalecane 
20–25  o C). Rozdrobnienie powinno by ć prowadzone z minimaln ą 
siłą, tak aby pierwotna tekstura gleby zmieni ła się tak niewiele, 
jak to mo żliwe. Gleby przesiewa si ę do wielko ści cząstki < 2 mm; 
zalecenia normy ISO dotycz ące pobierania próbek gleby (ISO 
10381-6) powinny by ć spełnione w odniesieniu do procesu przesie ­
wania. Zalecana jest staranna homogenizacja, gdy ż poprawia to 
odtwarzalno ść wyników. Zawarto ść wilgoci w ka żdej glebie jest 
określana z trzech podwielokrotno śći ogrzewanych w temperaturze 
105  o C do zaniku wyst ępowania znacz ących różnic wagi (oko ło 12 
godzin). W odniesieniu do wszystkich oblicze ń masa gleby oznacza 
wysuszon ą w suszarce such ą masę, tj. wag ę gleby skorygowan ą 
o zawarto ść wilgoci.  
1.7.4.  Przygotowanie substancji u żytej w badaniu do zastosowania na 
glebę 
Substancja badana jest rozpuszczona w roztworze 0,01 M CaCl  2 
w destylowanej lub dejonizowanej wodzie; roztwór CaCl  2 stosuje 
się jako rozpuszczalnik fazy wodnej do poprawy odwirowania 
i zminimalizowania wymiany kationowej. Zalecane st ężenie 
roztworu podstawowego powinno by ć trzy rzędy wyższe niż granica 
wykrywalno ści stosowanej metody analitycznej. Niniejszy próg 
gwarantuje dok ładne pomiary w odniesieniu do metodologii stoso ­
wanej w niniejszej metodzie; ponadto st ężenie roztworu podstawo ­
wego powinno by ć poniżej rozpuszczalno ści w wodzie badanej 
substancji.  
Roztwór podstawowy powinien by ć przygotowany tu ż przed zasto ­
sowaniem do próbek gleby oraz powinien by ć on trzymany 
zamknięty w ciemno ści w 4  o C. Czas przechowywania zale ży od 
stabilności substancji badanej i jej st ęzenia w roztworze.  
Tylko w odniesieniu do s łabo rozpuszczalnych substancji (S  w < 10  -4 
g 1 -1 ), gdy trudno rozpu ścić substancj ę badaną, potrzebny mo że być 
środek ułatwiający rozpuszczenie. Środek ułatwiający rozpuszczenie: 
a) powinien by ć mieszalny z wod ą, jak też z metanolem lub aceto ­
nitrylem; b) jego st ężenie nie powinno przekracza ć 1 % całkowitej 
objętości roztworu podstawowego i powinno stanowi ć mniej ni ż to 
w roztworze substancji badanej, która wchodzi w kontakt z gleb ą 
(zalecany mniej ni ż 0,1 %); oraz c) nie powinien by ć środkiem 
powierzchniowo czynnym lub ulega ć solwolitycznym reakcjom 
z badaną substancj ą. Użycie środka ułatwiającego rozpuszczanie 
powinno by ć przewidziane i usprawiedliwione przy przedstawianiu 
danych.  
Inną alternatyw ą dla słabo rozpuszczalnych substancji jest dodanie 
substancji badanej do systemu badanego przez wybijanie: substancja badana jest rozpuszczona w organicznym rozpuszczalniku, jej podwielokrotno ść do systemu gleby a 0,01 M roztworu CaCl
 2 
w destylowanej lub dejonizowanej wodzie. Zawarto ść rozpuszczal ­
nika w fazie wodnej powinna by ć tak niska jak to mo żliwe, zwykle 
nie przekracza 0,1 %. Wybijanie z roztworu organicznego mo że ulec 
objętościowej nieodtwarzalno ści. Dlatego wprowadza si ę dodatkowy 
błąd, tak że stężenie substancji badanej i korozpuszczalnika nie jest 
takie samo we wszystkich badaniach.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1200
 
1.8. WARUNKI WST ĘPNE PRZEPROWADZANIA BADANIA 
ADSORPCJI/DESORPCJI  
1.8.1.  Metoda analityczna  
Kluczowe parametry wp ływające na dok ładność pomiarów sorpcji 
obejmują: dokładność metody analitycznej w analizie obu roztworów 
i faz adsorbowanych, stabilno ść i czystość substancji badanej, osi ąg­
nięcie równowagi sorpcji, rozpi ętość zmian st ężenia roztworu, 
stosunek gleba/roztwór i zmiany w strukturze gleby w czasie trwania 
procesu równowagi (35)(59–62). Niektóre przyk łady dotycz ące 
danych dok ładności podano w dodatku 2.  
Wiarygodno ść używanej metody analitycznej musi by ć sprawdzona 
w zakresie st ężeń, które prawdopodobnie wynikn ą w trakcie badania. 
Eksperymentator powinien czu ć się swobodnie, aby rozwija ć odpo­
wiednie metody z w łaściwą dokładnością, precyzją, odtwarzalno ścią, 
granicami wykrywalno ści i je poprawia ć. Wytyczne dotycz ące tego 
w jaki sposób nale ży prowadzi ć takie badania podano 
w doświadczeniu poni żej. 
Właściwa obj ętość 0,01 M CaCl  2 , np. 100 cm  3 , jest mieszana 
w ciągu 4 godz. z odwa żką gleby, np. 20 g, o wysokiej adsorbo ­
walności, tj. z wysok ą zawartością węgla organicznego oraz gliny; te 
odważki i wielko ści zmieniaj ą się w zależności od potrzeb analitycz ­
nych, lecz stosunek gleba/roztwór wynosz ący 1:5 jest dogodnym 
punktem pocz ątkowym. Mieszanin ę odwirowuje si ę, a fazę wodną 
filtruje. Pewn ą objętość roztworu podstawowego substancji badanej 
dodaje się do drugiej dla uzyskania nominalnego st ężenia, w zakresie 
stężenia, które prawdopodobnie wyst ąpi w czasie trwania badania. 
Objętość ta nie powinna przekracza ć 10 % ko ńcowej obj ętości fazy 
wodnej, w celu zmiany w najmniejszym mo żliwym zakresie charak ­
teru roztworu przedrównowagowego. Roztwór poddaje si ę analizie.  
Ślepa próba, sk ładająca się z systemu gleba + roztwór CaCl  2 (bez 
substancji badanej), musi by ć włączona w celu sprawdzenia arte ­
faktów w metodzie analitycznej oraz dla macierzystych efektów powodowanych przez gleb ę.
 
Analityczne metody, które mog ą być stosowane do pomiarów sorpcji 
zawierają chromatografi ę gazowo-cieczow ą (GLC), wysokiej 
rozdzielczo ści chromatografi ę cieczową (HPLC), spektrometri ę (np. 
spektrometria GC/masa, spektrometria HPLC/masa) i cieczow ą scyn­
tylacyjną (w odniesieniu do substancji etykietowanych izotopami). 
Niezależnie od u żywanych metod analitycznych, jest uznane za 
odpowiednie, je śli wykrywalno ść wynosi mi ędzy 90 a 110 % 
wartości nominalnej. W celu umo żliwienia wykrycia oraz oceny po 
zajściu podzia łu granice wykrywalno ści metody analitycznej 
powinny by ć co najmniej dwa rz ędy wielko ści, poniżej stężenia 
nominalnego.  
Cechy i granice wykrywalno ści metody analitycznej dost ępnej do 
przeprowadzenia bada ń adsorpcji maj ą istotną rolę w okre ślaniu 
warunków badania i ca łego doświadczalnego przeprowadzenia bada ­
nia. Niniejsza metoda wskazuje ogóln ą doświadczaln ą drogę, 
dostarcza zalece ń i wytycznych dotycz ących rozwi ązań alternatyw ­
nych, w przypadku gdy metoda analityczna i laboratoryjne środki 
mogą nakładać ograniczenia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Wybór optymalnych proporcji gleba/roztwór  
Wybór w łaściwych proporcji gleby do roztworu w badaniach sorpcji 
zależy od wspó łczynnika podzia łu K  d oraz wzgl ędnego stopnia 
pożądanej adsorpcji. Zmiana st ężenia substancji w roztworze okre śla 
statystyczn ą dokładność pomiaru opartego na kszta łcie równania 
adsorpcji i granicy analitycznej metodologii w wykrywaniu st ężenia 
substancji chemicznej w roztworze. Dlatego w praktyce ogólnej jest użyteczne ustalenie kilku proporcji, w odniesieniu do których 
procent adsorpcji wynosi powy żej 20 %, a zalecany > 50 % (62), 
ponieważ należy dążyć do utrzymania st ężenia substancji badanej 
w wodnej fazie wystarczaj ąco wysoko, aby mog ło być ono zmie ­
rzone dok ładnie. Jest to szczególnie istotne w przypadku wysokiego 
procentu adsorpcji.
 
Dogodne podej ście do wyboru w łaściwej proporcji gleba/woda jest 
oparte na szacowaniu warto ści K  d przez badania wst ępne albo przez 
ustalone techniki szacowania (dodatek 3). Wybór w łaściwej proporcji 
dokonywany jest w oparciu o wykres proporcji gleba/roztwór w zależności od K
 d w odniesieniu do ustalonego procenta adsorpcji 
(rys. 1). W tym wykresie przyj ęto, że równanie adsorpcji jest 
liniowe (  1 ). Stosowana zale żność jest uzyskiwana przez przekszta ł­
cenie równania (4) dla K  d do postaci równania (1):  
V 0 
m soil ¼ Í 
m 0 
m s ads ðeqÞ Ä 1 Î 
K d (1) 
lub w jego postaci logarytmicznej, przyjmuj ąc ze R = m  soil /V 0 
i A eq %/100 =  m s ads ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ ÄlogK  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # (2)
 
Rys. 1. Zależność między stosunkami gleba do roztworu i K  d 
przy różnych procentach zaadsorbowanej substancji badanej  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C s ads ðeqÞ ¼ K  d · C aq ads ðeqÞ:
 Rysunek 1 przedstawia proporcje gleba/roztwór jako funkcje K  d dla 
różnych poziomów adsorpcji. Na przyk ład przy proporcji gleba/ ­
roztwór 1:5 i K  d 20 zachodzi w przybli żeniu 80 % adsorpcji. Dla 
uzyskania 50 % adsorpcji dla tego samego Kd nale ży zastosowa ć 
proporcję 1:25. Takie podej ście do wyboru w łaściwych proporcji 
gleba/roztwór daje badaczowi elastyczno ść w spełnieniu do świad­
czalnych wymaga ń. 
Dziedziny, które s ą trudniejsze do rozwi ązania, są tymi, w których 
substancja chemiczna jest wysoce adsorbowana lub bardzo nieznacz ­
nie. W przypadku wyst ępowania niskiej adsorpcji stosunek 1:1 
gleba/roztwór jest zalecany, chocia ż w odniesieniu do niektórych 
bardzo organicznych typów gleb, konieczne s ą mniejsze proporcje 
do uzyskania zawiesiny. Analityczna metodologia do pomiaru 
małych zmian st ężeń w roztworach musi by ć stosowana 
z ostrożnością; inaczej pomiar adsorpcji b ędzie niedok ładny. 
Z drugiej strony, bardzo wysokie wspó łczynniki podzia łu K  d , 
dochodzące do 1:100 stosunek gleba/roztwór w celu pozostawienia 
znaczącej ilości substancji w roztworze. Jednak że należy zwróci ć 
uwagę na zapewnienie dobrego mieszania oraz odpowiedniego 
czasu na doj ście systemu do równowagi. Alternatywnym podej ściem 
do rozwi ązania takich ekstremalnych przypadków, gdy brakuje 
stosownej metodologii analitycznej, jest przewidywanie warto ści 
K d w zastosowaniu technik oceny, opartych na przyk ład, 
o warto ści P  ow (dodatek 3). Mo że to by ć przydatne 
w szczególno ści w odniesieniu do nisko adsorbowalnych polarnych 
substancji chemicznych o P  ow < 20 oraz dla lipofilowych, wysoce 
sorpcyjnych substancji o P  ow > 10  4 . 
1.9. WYKONANIE BADANIA  
1.9.1.  Warunki badania  
Wszystkie do świadczenia s ą wykonywane w temperaturze otoczenia 
oraz, jeśli to możliwe, w sta łej temperaturze mi ędzy 20 a 25  o C. 
Warunki odwirowania powinny umo żliwić usunięcie z roztworu 
cząstek większych ni ż 0,2 μm. Ta warto ść oddziela cz ąstki najmniej ­
szych rozmiarów, uwa żanych za cz ąstkę stałą i jest granic ą między 
stałą i koloidaln ą cząstką. Wytyczne dotycz ące sposobu okre ślania 
warunków odwirowania podano w dodatku 4.  
Jeśli udogodnienia w zakresie odwirowania nie mog ą zapewni ć 
usunięcia cząstek większych od 0,2 μm, stosowana mo że być kombi­
nacja odwirowania oraz filtracji przez filtr 0,2 μm. Filtry te powinny 
być wykonane z odpowiedniego oboj ętnego materia łu, zapobiegaj ą­
cego stratom na nim. W ka żdym przypadku nale ży udowodni ć, że 
nie powstaj ą na nim jakiekolwiek straty substancji badanej podczas 
trwania filtracji.  
1.9.2.  Warstwa 1 – Badania wst ępne 
Cel prowadzenia bada ń wstępnych podano ju ż w punkcie dotycz ­ 
ącym zakresu. Wytyczne dotycz ące określania takiego badania wraz 
z doświadczeniem sugerowanym podano poni żej. 
1.9.2.1.  Wybór optymalnych proporcji gleba/roztwór  
Używa się dwa typy gleby i trzy proporcje gleba/roztwór (sze ść 
doświadczeń). Jeden rodzaj gleby ma wysok ą zawartość węgla orga­
nicznego i gliny, druga nisk ą zawartość węgla organicznego i gliny. 
Sugerowane s ą następujące proporcje gleby do roztworu:  
— 50 g gleby i 50 cm  3 roztworu wodnego substancji badanej (pro ­
porcja 1/1),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g gleby i 50 cm  3 roztworu wodnego substancji badanej (pro ­
porcja 1/5),  
— 2 g gleby i 50 cm  3 roztworu wodnego substancji badanej (pro ­
porcja 1/25).  
Minimalna ilo ść gleby, przy której przeprowadza si ę doświadczenie, 
zależy od mo żliwości laboratorium i wykonania zastosowanych 
metod analitycznych. Jednak że jest zalecane u życie co najmniej 1 
g, a najlepiej 2 g, w celu uzyskania wiarygodnych wyników badania.  
Jedna próbka kontrolna jedynie z substancj ą badaną w roztworze 
0,01 M CaCl  2 (bez gleby) podlega dok ładnie tym samym kolejnym 
czynnościom jak badane systemy, w celu sprawdzenia stabilno ści 
badanej substancji w roztworze CaCl  2 i możliwej adsorpcji na 
powierzchni badanego zbiornika.  
Ślepa próba gleby z tak ą samą ilością gleby i ca łkowitej obj ętości 
50 cm  3 roztworu 0,01 M CaCl  2 (bez substancji badanej) podlega 
takiej samej procedurze badania. S łuży to jako dodatkowa kontrola 
w czasie trwania analizy maj ącej na celu wykrycie zak łócających 
substancji lub zanieczyszczonych gleb.  
Wszystkie do świadczenia, łącznie z próbami ślepymi i kontrolnymi, 
powinny by ć wykonane przynajmniej z duplikatem. Ca łkowita ilo ść 
próbek które powinny by ć przygotowane dla bada ń mogą być obli­
czone w odniesieniu do metodologii, która zastanie zastosowana.  
Metody w zakresie bada ń wstępnych i badania g łówne są ogólnie 
takie same, wyj ątki są wspomniane tam, gdzie to jest odpowiednie.  
Wysuszone powietrzem próbki gleby s ą równowa żone przez 
wytrząsanie minimaln ą objętością 45 cm  3 0,01 M CaCl  2 w ciągu 
nocy (12 godz.) przed dniem do świadczenia. Nast ępnie dodaje si ę 
pewną ilość roztworu podstawowego substancji badanej w celu 
dostosowania ko ńcowej obj ętości do 50 cm  3 . Objętość dodanego 
roztworu podstawowego: a) nie powinna przekroczy ć 10 % 
końcowej obj ętości 50 cm  3 fazy wodnej w celu zmiany, 
w możliwie najmniejszym zakresie charakteru roztworu przed 
równowag ą; oraz b) powinna zdecydowanie wp ływać na wyniki 
początkowego st ężenia substancji badanej b ędącej w kontakcie 
z glebą (C  0 ) co najmniej dwa rz ędy wielko ści więcej niż granica 
wykrywalno ści metody analitycznej; niniejszy próg zabezpiecza 
możliwość prowadzenia dok ładnych pomiarów nawet gdy zachodzi 
silne adsorpcja (> 90 %) i okre ślenia późniejszych izoterm adsorpcji. 
Zaleca si ę również, jeśli to mo żliwe, aby pocz ątkowe st ężenie 
substancji (C  0 ) nie przekracza ło połowy jej granicy rozpuszczalno ści. 
Przykład sposobu obliczenia st ężenia roztworu podstawowego (C  st ) 
podano poni żej. Przyj ęto granic ę wykrywalno ści 0,01 μg cm-  3 
i 90 % adsorpcji; zatem zalecane wst ępne stężenie substancji badanej 
w kontakcie z gleb ą powinno wynosi ć l μg cm-  3 (dwa rzędy wiel­
kości wyższe niż granica wykrywalno ści). O ile dodano zalecan ą 
maksymaln ą objętość roztworu podstawowego, tj 5–45 cm  3 
0,01 M CaCl  2 roztworowa równowaga (= 10 % roztworu podstawo ­
wego do 50 cm  3 całkowitej obj ętości fazy wodnej), st ężenie 
roztworu podstawowego powinno wynosi ć 10 μg cm  -3 ; to jest trzy 
rzędy wielko ści wyższej niż granica wykrywalno ści metody anali ­
tycznej.  
Wartość pH fazy wodnej powinna by ć mierzona przed i po kontakcie 
z glebą, poniewa ż ma to istotne znaczenie w ca łkowitym procesie 
adsorpcji, w szczególno ści w odniesieniu do jonizowalnych substancji.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
Mieszanina jest wytrz ąsana do osi ągnięcia równowagi adsorpcji. 
Czas równowagi w glebach jest wysoce zmienny w zale żności od 
substancji chemicznej i gleby; okres 24 godzin jest ogólnie wystar ­
czający (77). W badaniach wst ępnych próbki mog ą być zbierane 
sekwencyjnie przez 48 godzin okresu mieszania (np. w 4, 8, 24, 
48 godzin). Jednak że czas analizy powinien by ć określony 
elastycznie w odniesieniu do rozk ładu pracy laboratorium.  
Istnieją dwie mo żliwości w odniesieniu do analizy substancji badanej 
w roztworze wodnym: a) metoda równoleg ła; i b) metoda seryjna. 
Należy pokreślić, że chociaż metoda równoleg ła jest doświadczalnie 
bardziej uci ążliwa, to matematyczne opracowanie wyników jest 
prostsze (dodatek 5). Jednak że wybór metodologii która ma by ć 
zastosowana pozostawiona jest eksperymentatorowi, który musi 
rozważyć dostępne urządzania i zasoby laboratorium.  
a) Metoda równoleg ła: przygotowuje si ę próbki w tej samej 
proporcji gleba/roztwór, w liczbie zale żnej od tego w ilu prze ­
działach czasowych chce si ę zbadać kinetykę adsorpcji. Po odwi ­
rowaniu i je śli jest to po żądane, po filtracji faza wodna z pierw ­
szej probówki jest usuwana mo żliwie całkowicie i mierzona po, 
na przykład 4 godzinach, druga probówka po 8 godzinach, trzecia 
po 24 godzinach itd.  
b) Metoda seryjna: przygotowuje si ę tylko kopie próbek odniesieniu 
do każdej proporcji gleba/roztwór. W okre ślonych przedzia łach 
czasu mieszanina jest wirowana w celu rozdzielenia faz. Ma ła 
podwielokrotno ść fazy wodnej jest niezw łocznie analizowana 
w odniesieniu do substancji badanej; nast ępnie doświadczenie 
prowadzi si ę nadal z oryginaln ą mieszanin ą. Jeśli zastosowano 
filtrację po odwirowaniu, laboratorium powinno posiada ć 
urządzenia umo żliwiające przeprowadzenie filtracji ma łych 
wodnych podwielokrotno ści. Zalecane jest, aby ca łkowite 
podwielokrotno ści pobrane nie przekracza ły 1 % ca łkowitej obj ę­
tości roztworu, w celu nie powodowania znacz ących zmian 
proporcji gleba/roztwór i zmniejszenia masy rozpuszczonej 
zdolnej do adsorpcji w czasie trwania badania.  
Procentowa adsorpcja  A t i jest obliczana w ka żdym punkcie czasu (t  i ) 
na podstawie nominalnego pocz ątkowego st ężenia i zmierzonego 
stężenia w chwili pobierania próbek (t  i ), skorygowana 
w odniesieniu do warto ści ślepej próby. Wykresy  A t i w zależności 
od czasu (rys. 1 dodatek 5) s ą generowane w celu oszacowania 
osiągnięcia plateau równowagowego (  1 ). Warto ść K  d 
w równowadze jest równie ż obliczana. W oparciu o t ę wartość K d , 
właściwe proporcje gleba/roztwór s ą wybierane z rys. l, tak aby 
procent adsorpcji osi ągał powyżej 20 %, a zalecane > 50 % (61). 
Wszystkie maj ące zastosowanie równania i zasady wykre ślania 
podano w punkcie „Dane i sprawozdawczo ść” oraz w dodatku 5.  
1.9.2.2.  Okre ślenie czasu równowagi adsorpcji i ilo ści badanej substancji 
zaadsorbowanej w równowadze  
Jak już wspomniano, wykresy  A t i lub C aq ads w zależności od czasu 
pozwalają oszacowa ć osiągnięcie równowagi adsorpcji i ilo ści 
badanej substancji zaadsorbowanej w równowadze. Rysunki 1 i 2 w dodatku 5 wskazuj ą przykłady takich wykresów. Czas równowagi 
jest czasem potrzebnym systemowi do osi ągnięcia plateau.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) Krzywa st ężenia substancji badanej fazie wodnej  C  aq ads Ê Ì  
w zależności od czasu mo że 
być również wykorzystana do oszacowania osi ągnięcia plateau równowagowego (zob. 
rys. 2 w dodatku 5).
 Jeśli przy okre ślonej glebie nie wyst ępuje plateau, tylko sta ły wzrost, 
może być to spowodowane czynnikami zak łócającymi, takimi jak 
biodegradacja lub powolne rozproszenie. Biodegradacja mo że być 
wykazana przez powtórzenie do świadczenia ze sterylizowan ą próbką 
gleby. Jeśli nie uzyskano plateau nawet w tym przypadku, ekspery ­
mentator powinien poszukiwa ć innych zjawisk, które mog ły wpłynąć 
na to szczególne badanie; mo że to być dokonane z w łaściwymi 
zmianami warunków do świadczenia (temperatura, czas wytrz ąsania, 
proporcje gleba/roztwór). Pozostawia si ę do uznania ekperymenta ­
tora, czy stosowa ć nadal procedur ę badania pomimo mo żliwosci 
nieuzyskania równowagi.  
1.9.2.3.  Adsorpcja na powierzchni zbiornika badanego i stabilno ść 
substancji u żytej w badaniu  
Niektóre informacje dotycz ące adsorpcji substancji badanej na 
powierzchni badanego zbiornika, jak równie ż dotyczące jej stabil ­
ności są wyprowadzane poprzez analizowanie próbek kontrolnych. 
Jeżeli obserwuje si ę uszczuplenie wi ększe niż standardowy b łąd 
metody analitycznej, mo że to świadczyć o abiotycznej degradacji 
i/lub adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika. Rozró żnienie 
między tymi dwoma zjawiskami mo że być uzyskane przez grun ­
towne mycie ścian zbiornika znan ą ilością właściwego rozpuszczal ­
nika oraz przez poddanie roztworu z mycia analizie w odniesieniu do 
substancji badanej. Je śli nie obserwuje si ę adsorpcji na powierzchni 
zbiornika badanego, uszczuplenie oznacza abiotyczn ą niestabilno ść 
substancji badanej. Je śli wykryto adsorpcj ę, konieczna jest zmiana 
materiału zbiornika badanego. Jednak że danych dotycz ących 
adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika, uzyskanych w wyniku tego do świadczenia nie mo żna bezpo średnio ekstrapo ­
lować do doświadczenia gleba/roztwór. Obecno ść gleby oddzia ły­
wuje na t ę
 adsorpcj ę. 
Dodatkowe informacje dotycz ące stabilno ści substancji badanej 
mogą być uzyskane przez okre ślenie macierzystego bilansu masy 
w czasie. Oznacza to, że faza wodna, ekstrakt z gleby i ścianki 
zbiornika badanego s ą analizowane w odniesieniu do substancji 
badanej. Ró żnica między masą badanych substancji chemicznych 
dodanych a sum ą mas badanych substancji chemicznych w fazie 
wodnej, ekstraktów z gleby i ścianek zbiornika badanego jest 
równa masie zdegradowanej i/lub ulotnionej i/lub nieekstrahowanej. W celu dokonania okre ślenia bilansu masy równowaga adsorpcyjna 
powinna by ć osiągnięta w czasie do świadczenia.
 
Bilans masy wykonuje si ę na obu glebach i w odniesieniu do jednej 
proporcji gleba/roztwór na gleb ę, co daje uszczuplenie ponad 20 % 
i zalecane > 50 % w równowadze. Po zako ńczeniu do świadczenia 
znalezienia proporcji z analiz ą ostatniej próbki wodnej fazy po 48 
godzinach, fazy s ą rozdzielane przez odwirowanie i, je śli jest to 
pożądane, filtrowane. Faza wodna jest w najszerszym mo żliwym 
zakresie odzyskiwana oraz dodany jest odpowiedni rozpuszczalnik 
ekstrakcyjny (wspó łczynnik ekstrakcji co najmniej 95 %) do gleby, 
aby wyekstrahowa ć substancj ę badaną. Zaleca si ę co najmniej dwie 
kolejne ekstrakcje. Ilo ść substancji badanej w ekstrakcie z gleby 
i zbiornika badanego jest okre ślana, a bilans masy oblicza si ę (rów­
nanie 10, Dane i sprawozdawczo ść). Jeżeli jest mniejszy ni ż 90 %, 
substancję badaną uznaje si ę za niestabiln ą w skali czasu badania. 
Jednakże badania mog ą nadal by ć prowadzone, uwzgl ędniając 
niestabilno ść substancji badanej, w tym przypadku zalecane jest 
analizowanie obu faz w badaniu g łównym.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.2.4.  Warstwa 2 – Kinetyka adsorpcji przy jednym st ężeniu substancji 
badanej  
Stosuje si ę pięć typów gleb, wybranych z tabeli 1. Zalet ą jest, że 
można włączyć niektóre lub wszystkie gleby u żyte w badaniach 
wstępnych, je śli to stosowne, spo śród tych pi ęciu gleb. W tym przy ­
padku warstwa 2 nie zostaje powtórzona w odniesieniu do gleb użytych w badaniach wst ępnych.
 
Czas równowagi, stosunek gleba/roztwór, waga próbki gleby, obj ę­
tość fazy wodnej w kontakcie z gleb ą oraz stężenie substancji 
badanej w roztworze s ą wybierane w oparciu o wyniki bada ń wstęp­
nych. Zalecane jest, aby analiza zosta ła wykonana po oko ło 2, 4, 6, 
8 (możliwie także 10) i 24 godz. czasu kontaktu; czas mieszania 
może być przedłużony do maksimum 48 godz. w przypadku 
substancji chemicznej wymagaj ącej dłuższego czasu równowagi 
w odniesieniu do wyników poszukiwania proporcji. Jednak że czas 
analizy nale ży rozważyć elastycznie.  
Każde doświadczenie (jedna gleba i jeden roztwór) jest co najmniej 
raz kopiowane, aby umo żliwić oszacowanie odchylenia wyników. 
W każde doświadczenie w łączona jest ślepa próba. Obejmuje to 
glebę i roztwór 0,01 M CaCl  2 , bez substancji badanej, odpowiednio 
wagę oraz obj ętość identyczne do tych z do świadczenia. Kontrolna 
próbka tylko z substancj ą badaną w roztworze 0,01 M CaCl  2 (bez 
gleby) podlega tej samej procedurze badania, s łużąc jako zabezpie ­
czenie przed nieoczekiwanym.  
Procent adsorpcji jest obliczany w ka żdym punkcie czasu  A t i i/lub 
przedziale czasowym  A  Δt i (wedle potrzeby) i jest wykre ślany 
w zależności od czasu. Wspó łczynnik podzia łu K  d w równowadze, 
jak równie ż znormalizowany wspó łczynnik adsorpcji w ęgla orga­
nicznego K  oc (w odniesieniu do niepolarnych substancji chemicz ­
nych organicznych) s ą również obliczane.  
Wyniki badania adsorpcji kinetycznej  
Liniowa warto ść Kd jest zasadniczo dok ładna aby opisa ć zachowanie 
sorpcyjne w glebie (35)(78) i przedstawia wyra żenie mobilno ści 
właściwej substancji chemicznych w glebie. Na przyk ład ogólnie 
w substancjach chemicznych o K  d < 1 cm  3 g -1 są uznawane za 
jakościowo mobilne. Podobnie, schemat klasyfikacji mobilno ści 
oparty o warto ści K  oc został rozwinięty przez MacCall  et al.  (16). 
Dodatkowo, schematy klasyfikacji wyp łukiwania istniej ą w oparciu 
o zależność między K  oc a DT-50 (  1 ) (32)(79).  
Również, zgodnie z badaniami analizy b łędów (61), warto ści K  d 
poniżej 0,3 cm  3 g -1 nie można oszacowa ć dokładnie z obni żenia 
stężenia w fazie wodnej, nawet je żeli zastosowano najbardziej 
korzystny (z punktu widzenia dok ładności) stosunek gleba/roztwór, 
tj. 1:1. Zaleca si ę w tym przypadku analiz ę obu faz, gleby i roztworu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: czas degradacji dla 50 % badanej substancji.
 W odniesieniu do powy ższych uwag jest zalecane, aby badania 
zachowania adsorpcyjnego substancji chemicznych w glebie i ich 
potencjalna mobilno ść były nadal prowadzone przez oznaczanie 
izoterm adsorpcji Freundlicha dla tych systemów, dla których możliwe jest oznaczenie K
 d , wraz z protoko łem doświadczalnym 
zastosowanym w niniejszej metodzie badania. Dok ładne oznaczenie 
jest możliwe jeżeli warto ść, która wynika z pomno żenia K  d 
i proporcji gleba/roztwór jest > 0,3, gdy pomiary s ą oparte na spadku 
stężenia w wodnej fazie (metoda po średnia), lub > 0,1, gdy analizo ­
wane są obie fazy (metoda bezpo średnia) (61).  
1.9.2.5.  Warstwa 3 – Izotermy adsorpcji i kinetyka desorpcji/izotermy 
desorpcji  
1.9.2.5.1. I z o t e r m y a d s o r p c j i  
Używa się pięć stężeń substancji badanej, obejmuj ące najlepiej dwa 
rzędy wielko ści; przy wyborze tych st ężeń powinny by ć uwzględ­
nione rozpuszczalno ść w wodzie i wynik ła stężeniowa równowaga 
wodną. W trakcie bada ń musi by ć zachowany ten sam stosunek 
gleba/roztwór. Badanie adsorpcji jest prowadzone, jak opisano 
powyżej, z tą tylko ró żnicą, że faza wodna jest analizowana tylko 
raz w czasie niezb ędnym do osi ągnięcia równowagi, jak ustalono 
wcześniej w warstwie 2. St ężenia równowagowe w roztworze s ą 
określone, a ilo ść zaadsorbowana jest obliczona z uszczuplenia 
substancji badanej w roztworze lub metod ą bezpośrednią. Zaadsor ­
bowana masa na jednostk ę masy gleby jest wykre ślana jako funkcja 
stężenia równowagi badanej substancji (zob. Dane 
i sprawozdawczo ść). 
Wyniki z do świadczenia izoterm adsorpcji  
Z matematycznych modeli adsorpcji dot ąd proponowanych, izoterma 
Freundlicha jest jedn ą z najczęściej stosowanych do opisu procesów 
adsorpcji. Bardziej szczegó łowe informacje dotycz ące interpretacji 
i ważności modelu adsorpcji s ą określone w bibliografii (41)(45) ­
(80)(81)(82).  
Uwaga:  Należy wspomnie ć, że porównanie warto ści K  F (współ­
czynnik adsorpcji Freundlicha) w odniesieniu do ró żnych substancji 
jest tylko mo żliwe, gdy te warto ści K  F są wyrażone w tych samych 
jednostkach (83).  
1.9.2.5.2. K i n e t y k a d e s o r p c j i  
Celem tego do świadczenia jest zbadanie, czy substancja chemiczna 
jest odwracalnie czy nieodwracalnie adsorbowana w glebie. 
Niniejsza informacja jest istotna poniewa ż proces desorpcji równie ż 
ma istotne znaczenie w zachowaniu si ę substancji chemicznych 
w glebie pól. Ponadto dane w zakresie desorpcji s ą użyteczne jako 
dane wejściowe w komputerowym modelowaniu symulacji przebiegu 
rozpuszczania i p łukania. Je śli badania desorpcji s ą pożądane, jest 
zalecane, aby badania opisane poni żej były prowadzone na ka żdym 
systemie, dla którego dok ładne oznaczenie K  d w poprzedzaj ącym 
doświadczenie kinetyki adsorpcji by ło możliwe.  
Podobnie jak w badaniach kinetyki adsorpcji, istniej ą dwie mo żli­
wości wykonania do świadczenia kinetyki desorpcji: a) metoda 
równoleg ła; i b) metoda seryjna. Wybór zastosowanej metodologii 
pozostawia si ę uznaniu eksperymentatora, który musi uwzgl ędnić 
dostępne urządzenia i zasoby laboratorium.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1208
 
a) Metoda równoleg ła: w odniesieniu do ka żdej gleby wybranej do 
przeprowadzenia bada ń desorpcji, przygotowuje si ę próbki o tym 
samym proporcji gleba/roztwór, w liczbie zale żnej od tego w ilu 
przedziałach czasowych chce si ę zbadać kinetyki desorpcji. 
Powinno si ę użyć tych samych przedzia łów czasowych jak 
w doświadczeniu kinetyki adsorpcji; jednak że całkowity czas 
może być przedłużony, jeśli to właściwe, w celu osi ągnięcia 
przez system równowagi desorpcji. W ka żdym doświadczeniu 
(jedna gleba, jeden roztwór) w łącza się ślepą próbę. Obejmuje 
to glebę i roztwór 0,01 M CaCl  2 , bez substancji badanej, odpo ­
wiednio nawa żkę oraz obj ętość identyczne do tych 
z doświadczenia. Kontrolna próbka tylko z substancj ą badaną 
w roztworze 0,01 M CaCl  2 (bez gleby) podlega tej samej proce ­
durze badania. Wszystkie mieszaniny gleby z roztworem s ą 
mieszane do osi ągnięcia równowagi adsorpcji (jak wcze śniej 
określono w warstwie 2). Nast ępnie fazy s ą rozdzielane przez 
odwirowanie, a fazy wodne s ą usuwane w najszerszym 
możliwym zakresie. Obj ętość oddzielonego roztworu jest zast ę­
powana przez równ ą objętość 0,01 M CaCl  2 bez substancji bada ­
nej, a nowe mieszaniny s ą ponownie mieszane. Faza wodna z 
pierwszej probówki jest usuwana ca łkowicie, jak to mo żliwe 
i mierzona po, na przyk ład 2 godz., druga probówka po 4 godzi ­
nach, trzecia po 6 godzinach itd. do osi ągnięcia równowagi 
desorpcji.  
b) Metoda seryjna: po do świadczeniu kinetyki adsorpcji, mieszanina 
jest odwirowana i faza wodna jest usuwana w najszerszym 
możliwym zakresie. Obj ętość roztworu usuni ętego jest zast ępo­
wana przez równ ą objętość 0,01 M CaCl  2 bez substancji badanej. 
Nowa mieszanina jest mieszana do osi ągnięcia równowagi 
desorpcji. W trakcie tego okresu czasu, w okre ślonych przedzia ­ 
łach czasowych, mieszanina jest odwirowywana w celu rozdzie ­
lenia faz. Ma ła podwielokrotno ść fazy wodnej jest niezw łocznie 
analizowana w odniesieniu do substancji badanej; nast ępnie 
doświadczenie prowadzi si ę nadal z pierwotn ą mieszanin ą. Obję­
tość każdej poszczególnej podwielokrotno ści powinna by ć 
mniejsza ni ż 1 % całkowitej objeto ści. Taka sama ilo ść świeżego 
roztworu 0,01 M CaCl  2 jest dodawana do mieszaniny w celu 
utrzymania proporcji gleby do roztworu a mieszanie jest konty ­
nuowane do nast ępnego przedzia łu czasowego.  
Procent desorpcji jest obliczany w ka żdym punkcie czasu  ðD t i Þ i/lub 
przedziale czasowym  ðD Δt i Þ (wedle potrzeb badania) i jest 
wykreślana w zale żności od czasu. Wspó łczynnik desorpcji K  des 
w równowadze jest tak że obliczany. Wszystkie maj ące zastosowanie 
równania podano w dodatku 5 i „Dane i sprawozdawczo ść”. 
Wyniki z do świadczenia kinetyki desorpcji  
Wspólne wykre ślenie procentu desorpcji  D  t i i adsorpcji  A  t i w zależności od czasu umo żliwia oszacowanie odwracalno ści 
procesu adsorpcji. Je śli równowaga desorpcji jest osi ągana nawet 
w obrębie podwojonego czasu równowagi adsorpcji, a ca łkowita 
desorpcja jest wi ększa niż 75 % ilo ści adsorbowanej, adsorpcja jest 
uważana za odwracaln ą. 
1.9.2.5.3. I z o t e r m y d e s o r p c j i  
Izotermy desorpcji Freundlicha s ą określone na glebach u żywanych 
w doświadczeniu izoterm adsorpcji. Badanie desorpcji jest prowa ­
dzone jak opisano w punkcie „Kinetyka desorpcji”, z t ą tylko 
różnicą, że faza wodna analizowana jest tylko raz, w równowadze 
desorpcji. Ilo ść substancji badanej zdesorbowanej jest obliczana. 
Zawartość substancji badanej pozostaj ącej zaadsorbowan ą na glebie 
w równowadze desorpcji jest wykre ślana jako funkcja st ężenia 
równowagi substancji badanej w roztworze.(zob. Dane 
i sprawozdawczo ść oraz dodatek 5).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Dane analityczne s ą przedstawione w formie tabelarycznej (zob. 
dodatek 6). Podano poszczególne pomiary i obliczone średnie. Poka ­
zano graficzne przedstawienie izoterm adsorpcji. Dokonanie oblicze ń 
opisano poni żej. 
Do celów badania uznaje si ę, że waga 1 cm  3 roztworu wodnego 
wynosi 1 g. Stosunek gleba/roztwór wyra żony w jednostkach wag./ ­
wag. lub wag./obj. jest t ą samą liczbą. 
2.1. ADSORPCJA  
Adsorpcja ( A t i ) jest okre ślona jako procent substancji zaadsorbo ­
wanej na glebie w proporcji do ilo ści na pocz ątku badania 
w warunkach badania. Je śli substancja badana jest stabilna i nie 
adsorbuje si ę w znacznym stopniu na ściankach zbiornika,  A  t i oblicza si ę w każdym punkcie czasu t  i , zgodnie z równaniem:  
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 ð%Þ (3) 
gdzie:  
A t i = procent adsorpcji w punkcie czasu t  i ( %),  
m s ads ðt i Þ = masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie 
w czasie t  i (μg), 
m 0 = masa substancji badanej w probówce badanej, na 
początku badania ( μg). 
Szczegółowe informacje dotycz ące sposobu obliczenia procenta 
adsorpcji  A t i dla metody równoleg łej i seryjnej podano w dodatku 5.  
Współczynnik podzia łu K  d jest proporcj ą między zawarto ścią 
substancji w fazie gleby i masowym st ężeniem substancji 
w roztworze wodnym, w warunkach badania, gdy osi ągnięta jest 
równowaga adsorpcji.  
K d ¼ C s ads ðeqÞ 
C aq ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
gdzie:  
C s ads ðeqÞ = zawarto ść substancji zaadsorbowana na glebie 
w równowadze adsorpcji ( μg g -1 ), 
C aq ads ðeqÞ = stężenie masowe substancji w fazie wodnej 
w równowadze adsorpcji ( μg cm  -3 ). To stężenie jest 
oznaczone analitycznie, uwzgl ędniając wartości dane 
w ślepej próbie,  
m s ads ðeqÞ = masa substancji zaadsorbowana na glebie 
w równowadze adsorpcji ( μg), 
m aq ads ðeqÞ = masa substancji w roztworze w równowadze adsorpcji 
(μg), 
m soil = ilość fazy gleby, wyra żona w suchej masie gleby (g),  
V 0 = początkowa obj ętość fazy wodnej w kontakcie z gleb ą 
(cm  3 ). 
Zależność między A  eq i K d jest określona przez:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
gdzie:  
A eq = procent adsorpcji w równowadze adsorpcji, %.  
Znormalizowany wspó łczynnik adsorpcji w ęgla organicznego K  oc 
wiąże współczynnik podzia łu K  d z zawarto ścią węgla organicznego 
próbki gleby:  
K oc ¼ K  d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
gdzie:  
% OC = procent w ęgla organicznego w próbce gleby (g g  -1 ). 
Współczynnik K  oc przedstawia pojedyncz ą wartość, która charakte ­
ryzuje podzielenie g łównie niepolarnych substancji organicznych 
między węglem organicznym w glebie lub osadzie i wodzie. 
Adsorpcja tych substancji chemicznych jest skorelowana 
z zawarto ścią związków organicznych sorbuj ącego ciała stałego 
(7); zatem warto ści K  oc zależą od właściwych cech próchnicowych 
frakcji, które ró żnią się znacznie zdolno ścią sorpcji z powodu ró żnic 
w pochodzeniu, genezie itd.  
2.1.1.  Izotermy adsorpcji  
Równanie izoterm Freundlicha wi ąże ilość substancji badanej zaad ­
sorbowanej ze st ężeniem substancji badanej w roztworze 
w równowadze (równanie 8).  
Dane są opracowywane jak w „Adsorpcja” i, w odniesieniu do 
każdej probówki badanej, jest obliczana zawarto ść substancji badanej 
zaadsorbowanej na glebie po badaniu adsorpcji ( C s ads ðeqÞ, gdzie 
indziej oznaczane jako as x/m). Przyjmuj ąc, że równowaga zosta ła 
osiągnięta i że C s ads ðeqÞ przedstawia warto ść równowagi:  
C s ads ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ 
m soil ¼ C 0 Ä C aq ads ðeqÞ h i
:V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
Równanie adsorpcji Freundlicha jest wskazane w (8):  
C s ads ðeqÞ ¼ K F ads Ö C aq ads ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
lub w postaci liniowej:  
logC  s ads ðeqÞ ¼ logK  F ads þ 1=n·logC  aq ads ðeqÞ (9) 
gdzie:  
K F ads = współczynnik adsorpcji Freundlicha; jego wymiarem 
jest cm  3 g -1 tylko gdy l/n = 1; we wszystkich innych przy ­
padkach nachylenie l/n jest wprowadzone w wymiar  K F ads 
(μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ) 
n = sta ła regresji; l/n ogólnego zakresu mi ędzy 0,7–1,0, wska ­
zując, że dane sorpcji s ą często lekko nieliniowe.  
Równania (8) i (9) s ą wykreślane i warto ściK F ads i l/n są wyliczane 
analizą regresyjn ą, używając równanie 9. Wspó łczynnik korelacji r  2 
równania logarytmicznego jest równie ż wyliczany. Przyk ład takich 
wykresów podano na rys. 2.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Rys. 2.  Wykres adsorpcji Freundlicha, normalny i linearyzowany  
2.1.2.  Bilans masy  
Bilans masy (MB) okre śla się jako procent substancji, który mo że 
być analitycznie odzyskany po badaniu adsorpcji w zale żności od 
nominalnej ilo ści substancji na pocz ątku badania.  
Opracowywanie danych rozró żni, czy rozpuszczalnik jest ca łkowicie 
mieszalny z wod ą. W przypadku rozpuszczalników mieszalnych 
z wodą opracowanie danych opisanych pod „Desorpcja” mo że być 
stosowane do okre ślenia ilości substancji odzyskanej przez ekstrakcj ę 
rozpuszczalnikiem. Je śli rozpuszczalnik jest s łabo mieszalny z wod ą, 
określenie odzyskanej ilo ści musi by ć dokonane.  
Bilans masy MB w odniesieniu do adsorpcji jest obliczany nast ępuj­ 
ąco; przyjmuje si ę, że pojęcie (mE) odpowiada sumie badanych mas 
substancji chemicznych wyekstrahowanych z gleby i powierzchni 
zbiornika badanego, rozpuszczalnikiem organicznym:  
MB ¼ V rec ·C aq ads ðeqÞ þ m E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
gdzie:  
MB = bilans masy ( %),  
m E = całkowita masa substancji badanej wyekstrahowanej 
z gleby i ścian zbiornika badanego w dwóch krokach ( μg), 
C 0 = początkowe st ężenie masowe roztworu badanego 
w kontakcie z gleb ą (μg cm  -3 ), 
V rec = objętość nadsączu odzyskanego po równowadze adsorp ­
cyjnej (cm  3 ). 
2.2. DESORPCJA  
Desorpcję (D) okre śla się jako procent substancji badanej zdesorbo ­
wanej w zale żności od ilości substancji uprzednio zaadsorbowanej, 
w warunkach badania:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100ð%Þ (11) 
gdzie:  
D t i = procent desorpcji w punkcie czasu t  i ( %),  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m aq des ðt i Þ = masa substancji badanej zdesorbowanej z gleby 
w punkcie czasu t  i (μg), 
m s ads ðeqÞ = masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie 
w równowadze adsorpcji ( μg). 
Szczegółowe informacje dotycz ące sposobu obliczenia procentu 
desorpcji  D t i dla metody równoleg łej i seryjnej podano w dodatku 5.  
Pozorny wspó łczynnik desorpcji (K  des ) jest, w warunkach badania, 
proporcją między zawarto ścią substancji pozostaj ącą w fazie gleby 
a stężeniem masowym substancji desorbowanej w roztworze 
wodnym, gdy osi ągnięta jest równowaga desorpcji:  
K des ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m aq des ðeqÞ V T 
m soil (cm  3 g -1 ) (12)  
gdzie:  
K des = współczynnik desorpcji (cm  3 g -1 ), 
m aq des ðeqÞ = całkowita masa substancji badanej zdesorbowanej 
z gleby w równowadze desorpcji ( μg), 
V T = całkowita obj ętość fazy wodnej w kontakcie z gleb ą 
w czasie trwania badania kinetyki desorpcji (cm  3 ). 
Wytyczne dotycz ące obliczania  m aq des ðeqÞ podano w dodatku 5 pod 
pozycją „Desorpcja”.  
Uwaga:  
Jeśli badanie adsorpcji, które by ło poprzedzaj ące było wykonane 
metodą równoleg łą objętość V  T w równaniu 12 uznaje si ę za 
równe V  0 . 
2.2.1.  Izotermy desorpcji  
Równanie izoterm desorpcji Freundlicha wi ąże zawarto ść substancji 
badanej pozostaj ącej zaadsorbowanej na glebie, ze st ężeniem 
substancji badanej w roztworze w równowadze desorpcji (równanie 16).
 
W odniesieniu do ka żdej probówki badanej, zawarto ść substancji 
pozostającej zaadsorbowan ą na glebie, w równowadze desorpcji, 
jest obliczana nast ępująco: 
C s des ðeqÞ ¼ m s ads ðeqÞ Ä m aq des ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m aq des ðeqÞ jest okre ślone jako:  
m aq des ðeqÞ ¼ m  m des ðeqÞ · V 0 
V r F Ä m  aq A (μg) (14) 
gdzie:  
C s des ðeqÞ = zawarto ść substancji badanej pozostaj ącej zaadsorbo ­
waną na glebie w równowadze desorpcji ( μg g -1 ), 
m m des ðeqÞ = masa substancji okre ślona analitycznie w fazie 
wodnej w równowadze desorpcji ( μg), ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m aq A = masa substancji badanej pozosta łej z równowagi 
adsorpcji z powodu niepe łnego podstawienia obj ę­
tości (μg), 
m aq des ðeqÞ = masa substancji w roztworze w równowadze adsorpcji 
(μg); 
m aq A ¼ m  aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = objętość roztworu pobrana z probówki do pomiaru substancji 
badanej, w równowadze desorpcji (cm  3 ), 
V r = objętość nadsączu usuni ętego z probówki po uzyskaniu 
równowagi adsorpcji i zast ąpieniu przez t ę samą objętość 
roztworu 0,01 M CaCl  2 (cm  3 ). 
Równanie desorpcji Freundlicha znajduje si ę w (16):  
C s des ðeqÞ ¼ K  F des · C aq des ðeqÞ 1=n (μg g -1 ) (16) 
lub w postaci liniowej:  
log C  s des ðeqÞ ¼ log K  F des þ 1=n · log C  aq des ðeqÞ (17) 
gdzie:  
K F des = współczynnik desorpcji Freundlicha,  
n = sta ła regresji,  
C aq des ðeqÞ = stężenie masowe substancji w fazie wodnej 
w równowadze desorpcji ( μg cm  -3 ). 
Równania 16 i 17 mog ą być wykreślone, a warto ści K F des i l/n są 
obliczane za pomoc ą analizy regresyjnej, stosuj ąc równanie 17.  
Uwaga:  
Jeśli wykładnik l/n adsorpcji lub desorpcji Freundlicha jest równy 1, 
stałe wiążące adsorpcj ę lub desorpcj ę Freundlicha ( K F ads i K F des ), 
będą równe odpowiednio sta łym równowagi adsorpcji lub desorpcji 
(K d i K des ), a wykresy C  s vs C  aq będą liniowe. Je śli wykładniki nie 
są równe 1, krzywe C  s vs C  aq będą nieliniowe, a sta łe adsorpcji 
i desorpcji b ędą się zmieniać wzdłuż izoterm.  
2.2.2.  Sprawozdanie z badania  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
— Pełna identyfikacja u żytych próbek gleby, w łączając: 
— geograficzne odniesienie miejsca (szeroko ść geograficzna, 
długość geograficzna),  
— data pobierania próbek,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— użyty rodzaj (np. gleba rolnicza, le śna itd.),  
— głębokość pobierania próbek,  
— zawarto ść piasek/mul/glina,  
— warto ści pH (w 0,01 M CaCl  2 ), 
— zawarto ść węgla organicznego,  
— zawarto ść substancji organicznych,  
— zawarto ść azotu,  
— stosunek C/N,  
— zdolno ść wymiany kationu (mmol/kg),  
— wszystkie informacje odnosz ące się do zbierania 
i przechowywania próbek,  
— tam gdzie to jest stosowne, wszystkie istotne informacje 
dotyczące interpretacji adsorpcja/desorpcja substancji badanej,  
— bibliografia dla metod zastosowanych dla oznaczenia ka żdego 
parametru,  
— informacje dotycz ące substancji badanej, je śli to stosowne,  
— temperatura do świadczeń, 
— warunki odwirowania,  
— procedura analityczna zastosowana do analizy substancji badanej,  
— uzasadnienie w odniesieniu do ka żdego użycia środka ułatwiają­
cego rozpuszczanie do przygotowania roztworu w łaściwego 
substancji badanej,  
— wyjaśnienie korekt wykonanych w obliczeniach, je śli to odpo ­
wiednie,  
— dane zgodnie z formularzem (dodatek 6) wraz z prezentacj ą 
graficzną, 
— wszystkie informacje i obserwacje pomocne dla interpretacji 
wyników badania.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02 045, Part II.  
(2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of 
Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 
02 045, Part I.  
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication 
No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995 (June 1995).
 
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ ­
Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Deter ­
mining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in 
Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
 
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Appli ­
cation for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 
1988): Criteria for registration of pesticides as especially 
dangerous to health or especially harmful to the environment.  
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant 
Protection Products, Biological Research Centre for Agricul ­
ture and Forestry, Braunschweig, Germany.  
(12) Calvet R., (1989), „Evaluation of adsorption coefficients and 
the prediction of the mobilities of pesticides in soils”, in 
Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
 
(13) Calvet R., (1980), „Adsorption-Desorption Phenomena” in 
Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance 
ed.), Academic Press, London, pp. 83–122.  
(14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), „The sorption of 
nonpolar organics by soils and sediments” in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society 
of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31–44.
 
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., 
(1974), „An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media”. Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29–35.
 
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger 
H. J., (1981), „Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis”, in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxi ­
cants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington 
DC.
 
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R. H., (1965), 
„Movement and sorption of chemicals applied to the soil”. Weeds, 13, pp. 185–190.
 
(18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L., (1970) „Deter ­
mination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils”. 
J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524–528.  
(19) Russell M. H., (1995), „Recommended approaches to assess 
pesticide mobility in soil” in Environmental Behavior of Agro ­
chemicals (ed. T. R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley 
& Sons Ltd.  
(20) Esser H. O., Hemingway R. J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. 
W. and Holland P. T., (1988), „Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides”, 
IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, 
pp. 901–932.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1216
 
(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), „Experi ­
mental models for studying the persistence of pesticides in 
soils”. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137–157, BCPC, Surrey, UK.
 
(22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), „Persistence of 
herbicides in soil”. J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269–273.  
(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), „Chemical hydrolysis of 
2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption”. Pestic. 
Sci. 12, pp. 45–52.
 
(24) Guth J. A., Gerber H. R., and Schlaepfer T., (1977), „Effect of 
adsorption, movement and persistence on the biological avai ­
lability of soil-applied pesticides”. Proc. Br. Crop Prot. Conf., 3, pp. 961–971.
 
(25) Osgerby J. M., (1973), „Process affecting herbicide action in 
soil”. Pestic. Sci., 4, pp. 247–258.  
(26) Guth J. A., (1972), „Adsorptions- und Einwascheverhalten von 
Pflanzenschutzmitteln in Boden”. Schr. Reihe Ver. Wass. 
-Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143–154.  
(27) Hamaker J. W., (1975), „The interpretation of soil leaching 
experiments”, in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R. Haque and V.H. freed), pp. 135–172, Plenum Press, NY.
 
(28) Helling C. S., (1971), „Pesticide mobility in soils”. Soil Sci. 
Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732–210.  
(29) Hamaker J. W., (1972), „Diffusion and volatilization” in 
Organic chemicals in the soil environment (C.A.I. Goring 
and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49–143.  
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), „Rate of volatilisation of 
pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results 
with those determined in a laboratory model system”. Pestic. Sci. 12, pp. 37–44.
 
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield C.G., 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide 
Wastes, pp. 297–325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(32) Gustafson D. I., (1989), „Groundwater ubiquity score: a simple 
method for assessing pesticide teachability”. J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339–357.
 
(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). „Computed effects of 
adsorption kinetics on pesticide movement in soils”. J. of Soil 
Sci., 28, pp. 340–350.  
(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), „Measured and simu ­
lated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils”. Pest. Sci., 11, pp. 389–395.
 
(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), „Sorption estimates 
for modeling”, in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., 
Book Series no. 2, pp. 80–101,
 
(36) Lambert S. M., (1967), „Functional relationship between sorp ­
tion in soil and chemical structure”. J. Agri. Food Chem., 15, 
pp. 572–576.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1217
 
(37) Hance R. J., (1969), „An empirical relationship between 
chemical structure and the sorption of some herbicides by 
soils”. J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667–668.  
(38) Briggs G. G. (1969), „Molecular structure of herbicides and 
their sorption by soils”. Nature, 223, 1288.  
(39) Briggs G. G. (1981). „Theoretical and experimental relation ­
ships between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor”. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050–1059.
 
(40) Sabljic A., (1984), „Predictions of the nature and strength of 
soil sorption of organic polutance by molecular topology”. J. 
Agric. Food Chem., 32, pp. 243–246.  
(41) Bailey G. W., and White J. L., (1970), „Factors influencing the 
adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil”. Residue Rev., 32, pp. 29–92.
 
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), „Adsorp ­
tion of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate”. Soil Sci. Soc. Amer. 
Proc. 32: pp. 222–234.
 
(43) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere 10, pp. 833–846.
 
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), „Soil Sorption 
of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners”. Environ. Toxi ­
col. Safety 21, pp. 1–17.  
(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), „Adsorption in 
organic chemicals” in Organic Chemicals in the Soil Environ ­
ment (Goring C.A.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49–143.
 
(46) Deli J., and Warren G. F., 1971, „Adsorption, desorption and 
leaching of diphenamid in soils”. Weed Sci. 19: pp. 67–69.  
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, 
(1975), „Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils”. Weed Science, Vol. 23, pp. 454–457.
 
(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), 
„Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic prepara ­
tions” in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency, Vienna.
 
(49) Pionke H. B., and Deangelis R. J., (1980), „Methods for distri ­
buting pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase”, CREAMS, in A Field Scale Model for 
Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Manage ­
ment Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documenta ­
tion, USDA Conservation Research report.
 
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality-General 
aspects; chemical and physical methods of analysis; biological 
methods of analysis. First Edition (1994).  
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. 
Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.  
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. 
E., eds. „Methods of Soil Analysis”, Vol 1 and 2, American 
Society of Agronomy, Madison, WI, 1982.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1218
 
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality-Sampling-Part 1: Guidance on 
the design of sampling programmes.  
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality-Sampling-Part 2: Guidance on 
sampling techniques.  
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality-Sampling-Part 3: Guidance on 
safety of sampling.  
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality-Sampling-Part 4: Guidance on 
the investigation of natural and cultivated soils.  
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality-Sampling-Part 5: Guidance on 
the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
 
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality-Sampling-Part 6: Guidance 
on the collection, handling and storage of soil for the asses ­
sment of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), „Precision in pesti ­
cide adsorption measurements”. Soil Sci. Am. Proc, 34, pp. 
353–354.  
(60) Grover R., and Hance R. J. (1970), „Effect of ratio of soil to 
water on adsorption of linuron and atrazine”. Soil Sci., pp. 109–138.
 
(61) Boesten, J. J. T. I, „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system”. 
Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31–41.  
(62) Boesten, J. J. T. I. „Influence of soil/liquid ratio on the expe ­
rimental error of sorption coefficients in relation to OECD 
guideline 106”. Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26–29 April 1994.
 
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), „Comportement 
de substances herbicides dans le sol en fonction de leur struc ­
ture chimique”. Weed Res. 21, pp. 227–231.  
(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), „Empirical prediction 
of organic pollutants sorption in natural sediments”. J. Envi ­
ron.Qual., 10(3), pp. 382–386.  
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), 
„Partition equilibria of non-ionic organic compounds between 
soil organic matter and water”. Environ. Sci. Technol., 17(4), 
pp. 227–231.  
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), „Sorption of organic 
substances by soils and sediments”. J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297–312.
 
(67) Vowles P. D., and Mantoura R. F. C, (1987), „Sediment-water 
partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons”. Chemosphere, 16(1), pp. 109–116.
 
(68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). 
Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environ ­
mental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
 
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). „Relationship 
between water solubility, soil sorption, octanol-water partitio ­
ning and concentration of chemicals in the biota” in Aquatic 
Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), pp.78–115, ASTM STP 
707, Philadelphia.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1219
 
(70) Chiou C. T., Peters L. J., and Freed V. H., (1979), „A physical 
concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compo ­
unds”. Science, Vol. 206, pp. 831–832.  
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C, 
(1981), „Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption”. Soil Sci. Soc. Am. J. 45, 
pp. 38–42.
 
(72) Karickhoff S. W., (1981), „Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils”. Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833–846.
 
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), „Adsorption de 13 herbi ­
cides et insecticides par le sol. Relation solubilite-reactivite”. 
Revue de l'Agric, 34 (4), pp. 319–322.  
(74) Muller M., Kórdel W. (1996), „Comparison of screening 
methods for the determination/estimation of adsorption coeffi ­
cients on soil”. Chemosphere, 32(12), pp. 2493–2504.  
(75) Kórdel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), „HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test”. Chemosphere 30 (7), pp. 1373–1384.
 
(76) Kórdel W., Stutte J., Kotthoff G. (1993), „HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on 
soil-comparison of different stationary phases”. Chemosphere 27 (12), pp. 2341–2352.
 
(77) Hance, R. J., (1967), „The Speed of Attainment of Sorption 
Equilibria in Some Systems Involving Herbicides”. Weed 
Research, Vol. 7, pp. 29–36.  
(78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), „The retention 
processes: mechanisms” in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. 
Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
 
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. 
(1984), „Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses”, in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical 
Society, Washington, DC.
 
(80) Giles C. H., (1970), „Interpretation and use of sorption isot ­
herms” in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14–32.
 
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, 
(1960), „Studies in adsorption: XL A system of classification 
of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils”. J. Chem. Soc, pp. 3973–93.
 
(82) Calvet R., Terce M., and Arvien J. C, (1980), „Adsorption des 
pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques 
generates de l'adsorption”. Ann. Agron. 31: pp. 239–251.  
(83) Bedbur E., (1996), „Anomalies in the Freundlich equation”, 
Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environ ­
ment, 13–15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.  
(84) Guth, J. A., (1985), „Adsorption/desorption”, in Joint Interna ­
tional Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1–3, Canterbury, UK.
 
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
DODATEK 1  
Plan Badania
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
DODATEK 2  
WPŁYW DOK ŁADNOŚCI METODY ANALITYCZNEJ I ZMIAN 
STĘŻENIA NA DOK ŁADNOŚĆ WYNIKÓW ADSORPCJI  
Z następującej tabeli (84) jasno wynika, że kiedy ró żnica między mas ą 
początkową (m  o = 110 μg) a masą równowagi (m m aq ads ðeqÞ = 100 μg) substancji 
badanej w roztworze jest bardzo ma ła, błąd 5 % w pomiarze st ężenia 
w równowadze powoduje b łąd 50 % w obliczeniu masy substancji zaadsorbo ­
wanej w glebie (m  m s ads ðeqÞ) i 52,4 % w obliczeniu K  d . 
Ilość gleby m  soil = 10 g 
Objętość roztworu V  0 = 100 cm  3 
m aq ads ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm  -3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
DLA A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 wartosc 
rzeczy­
wista 10 1,00 wartosc 
rzeczy­
wista 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 
105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
DLA A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 wartosc 
rzeczy­
wista 60,0 6,00 wartosc 
rzeczy­
wista 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 
55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
DLA A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg or 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 wartosc 
rzeczy­
wista 108,9 10,89 wartosc 
rzeczy­
wista 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
gdzie: 
äm s ads ðeqÞ = m 0 Ä m aq ads ðeqÞ; C s ads ðeqÞ ¼ ½C 0 Ä C aq ads ðeqÞâ V 0 
m bodem: Kd ¼ m s ads ðeqÞ 
m aq ads ðeqÞ V 0 
m bodem  
m s ads ðeqÞ = masa substancji badanej w fazie gleby w równowadze, μg, 
m aq ads ðeqÞ = masa substancji badanej w fazie gleby w równowadze, μg, 
C s ads ðeqÞ = zawarto ść substancji badanej w fazie gleby w równowadze, 
μg g  -1 , 
C aq ads ðeqÞ = masowe st ężenie substancji badanej w fazie wodnej 
w równowadze, μg cm  -3 
R = b łąd analityczny w oznaczaniu  
R‡ = b łąd obliczony spowodowany b łędem analitycznym R.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
DODATEK 3  
TECHNIKI OSZACOWANIA DLA K  d 
1. Techniki oszacowania pozwalaj ą na przewidzenie K  d opartego na korela ­
cjach z, na przyk ład wartością P ow (12)(39)(63–68), danymi dotycz ącymi 
wodnej rozpuszczalno ści (12)(19)(21)(39)(68–73) lub danych polarno ści 
wyprowadzonych z zastosowania HPLC w fazie odwróconej (74–76). Jak 
wskazano w tabelach 1 i 2, istniej ą K oc lub K  om obliczone tymi równaniami 
i następnie, pośrednio, K  d z równań: 
K oc ¼ K  d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. Pojecie tych korelacji jest oparte na dwóch za łożeniach: 1) jest to 
substancja organiczna gleby, która g łównie wp ływa na adsorpcje substancji; 
i 2) wspó łdziałania wywo łane są głównie substancjami niepolarnymi. Jako 
wynik te korelacje: 1) nie s ą, lub są tylko w pewnym zakresie, stosowane 
do substancji polarnych, i 2) nie s ą stosowane w przypadkach, gdy zawar ­
tość substancji organicznych w glebie jest bardzo ma ła (12). Dodatkowo, 
chociaż odkryto zadawalaj ące korelacje mi ędzy P  ow i adsorpcj ą (19), tego 
samego nie mo żna powiedzie ć o zależności między rozpuszczalno ścią 
w wodzie i zakresem adsorpcji (19)(21); tak wi ęc badania s ą w istotnym 
stopniu sprzeczne.  
3. Niektóre przyk łady korelacji mi ędzy wspó łczynnikiem adsorpcji 
a współczynnikiem podzia łu oktanol-woda, jak równie ż rozpuszczalno ść 
w wodzie, podano odpowiednio w tabelach 1 i 2.  
Tabela 1  
Przykłady korelacji mi ędzy wspó łczynnikiem podzia łu adsorpcji a wspó łczynnikiem podzia łu oktanol-woda; 
dalsze przyk łady w (12)(68)  
Substancja Korelacje Autorzy  
Podstawione moczniki log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Aromatyczne chlorowane log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Różne pestycydy log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl i Mingelgrin (1984) (66) 
Aromatyczne w ęglowodory log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles i Mantoura (1987) (67)  
Tabela 2  
Przykłady korelacji mi ędzy wspó łczynnikiem podzia łu adsorpcji i rozpuszczalno ścią w wodzie; dalsze 
przykłady zob. (68)(69)  
Związki Korelacje Autorzy  
Różne pestycydy Log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl i Mingelgrin (1984) (66) 
Alifatyczne, aromatyczne 
substancje chlorowane log K  om = (4,040 +/- 0,038) – (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
α-naftol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Cykliczne, alifatyczne 
aromatyczne log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981)(72) 
Różne związki log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
DODATEK 4  
OBLICZENIA W ODNIESIENIU DO OKRE ŚLNIA WARUNKÓW 
WIROWANIA  
1. Czas odwirowania jest podany za pomoc ą następującego wzoru, w łączając 
sferyczne cz ąstki: 
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
tn ðR b=R t Þ (1) 
Do celów uproszczenia, wszystkie parametry s ą opisane w jednostkach nie- 
SI (g, cm).  
gdzie:  
ω = szybko ść obrotowa (=2  п rpm/60), rad s  -1 , 
rpm = broty na minut ę, 
η = lepko ść roztworu, g s  -1 cm -1 , 
r p = promie ń cząstki, cm,  
ρ s = gęstość gleby, g cm  -3 , 
ρ aq = gęstość roztworu, g cm  -3 , 
R t = odległość od środka wirnika wirówki do górnego poziomu 
roztworu w probówce wirówki, cm,  
R b = odległość od środka wirnika wirówki do dna probówki, cm  
R b -R t = długość mieszaniny gleba/roztwór w probówce wirówki, cm.  
W ogólnej praktyce stosuje si ę podwojony obliczony czas w celu zapew ­
nienia całkowitego oddzielenia.  
2. Równanie (1) mo że być uproszczone dalej, je śli założymy, że lepkość (η) 
i gęstość (ρ aq ) roztworu jest równa lepko ści i gęstości wody w 25  o C; 
zatem, η = 8,95 x 10  -3 g s -1 cm -1 i ρ aq = 1,0 g, cm  -3 . 
Zatem, czas wirowania jest podany za pomoc ą równania (2)  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln Rb 
Rt (2) 
3. Z równania 2 jasno wynika, że dwa parametry s ą ważne dla okre ślania 
warunków wirowania, tj. czas (t) szybko ść (rpm), w celu uzyskania 
rozdzielenia cz ąstek o szczególnym wymiarze (w tym przypadku promie ń 
0,1 μm): 1) g ęstość gleby; oraz 2) d ługość mieszaniny w probówce 
wirówki (R  b -R t ), tj. odleg łość, którą przebywa cz ąstka z góry roztworu 
do dna probówki, oczywi ście dla ustalonej obj ętości długość mieszaniny 
w probówce zale ży od kwadratu promienia probówki.  
4. Rysunek 1 przedstawia zmiany w czasie wirowania (t) w zale żności od 
szybkości wirowania (rpm) dla ró żnych gęstości gleby ( ρ s ) (rys. la) 
i różnych długości mieszaniny w probówkach wirówki (rys. 2a). Z rys. 
la wpływ gęstości gleby wynika w sposób oczywisty, na przyk ład dla 
klasycznego wirowania przy 3000 rpm czas wirowania wynosi w przybli żeniu 240 min dla g ęstości gleby 1,2 g cm
 3 , podczas gdy jest 
to tylko 50 min. dla 2,0 g cm  3 . Podobnie, z rys. lb, dla klasycznego 
wirowania 3000 rpm czas wirowania wynosi w przybli żeniu 50 min dla 
długości mieszaniny 10 cm i tylko 7 min. dla d ługości 1 cm. Jednak że 
istotne jest odkrycie optymalnej zale żności między wirowaniem które 
wymaga mo żliwie mniejszej d ługości i ułatwionego post ępowania ekspery ­
mentatora w rozdzielaniu faz po odwirowaniu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Ponadto przy okre ślaniu do świadczalnych warunków rozdzielania faz 
gleba/roztwór, istotne jest rozwa żenie możliwości istnienia trzeciej „pseu ­
dofazy”, koloidów. Cz ąstki te, o wielko ści mniejszej ni ż 0,2 (μm, mają 
ważny wpływ na ca ły mechanizm adsorpcji substancji w zawiesinie gleby. 
Gdy wirowanie jest wykonywane jak opisano powy żej, koloidy pozostaj ą 
w fazie wodnej i podlegaj ą analizie wraz z wodn ą fazą. W ten sposób 
informacja o ich wp ływie jest tracona.  
Jeśli laboratorium prowadz ące badanie posiada urz ądzenia ultrawiruj ące lub 
ultrafiltruj ące, adsorpcja/desorpcja substancji w glebie mo że być badana 
dogłębiej, włączając informacje o adsorpcji substancji na koloidach. 
W tym przypadku nale ży zastosowa ć ultrawirowanie przy 60 000 rpm/min 
lub ultrafiltracj ę z filtrem o porowato ści 100 000 daltonów w celu rozdzie ­
lenia trzech faz gleby, koloidów i roztworu. Protokó ł badania powinien by ć 
również odpowiednio zmodyfikowany w celu obj ęcia wszystkich trzech faz 
analizą substancji.  
Rys. 1a.
  
Zmiany czasu wirowania (t) w zale żności od szybko ści wirowania (rpm) 
w odniesieniu do ró żnych gęstości gleb (p  s ). R  t = 10 cm, R  b -R t = 10 cm, 
η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 i ρ aq = 1,0 g cm  -3 przy 25  o C. 
Rys. 1b.
  
Zmiany czasu wirowania (t) w zale żności od szybko ści wirowania (rpm) 
w odniesieniu do ró żnych długości mieszaniny w probówce wirówki 
(R b -R t ) = L; R  t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g cm  -3 
przy 25  o C i ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
DODATEK 5  
OBLICZANIE ADSORPCJI A (%) I DESORPCJI D (%)  
Schemat czasowy procedury jest nast ępujący:
 
W odniesieniu do wszystkich oblicze ń zakłada się, że substancja badana jest 
stabilna i nie adsorbuje si ę w sposób znacz ący na ściankach naczynia.  
ADSORPCJA A (A%)  
a) Metoda równoleg ła 
Procent adsorpcji jest obliczany w odniesieniu do ka żdej probówki badanej 
(i) w każdym punkcie czasu (t  i ), zgodnie z równaniem:  ( 1 ) 
A t i ¼ m s ads ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) (  1 ) 
Człony niniejszego równania s ą obliczane nast ępująco: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m s ads ðt i Þ ¼ m  0 Ä C aq ads ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
gdzie:  
A t i = procent adsorpcji ( %) w punkcie czasu t  i , 
m s ads ðt i Þ = masa substancji badanej na glebie, w czasie t  i w którym 
wykonywana jest analiza ( μg), 
m 0 = masa substancji badanej w probówce badanej, przy 
rozpoczęciu badania ( μg), 
C 0 = stężenie masowe pocz ątkowe roztworu badanego w kontakcie 
z glebą (μg cm  -3 ), ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1226  
( 1 ) Równanie ma zastosowanie do obu metod, bezpo średniej i po średniej. Wszystkie inne 
równania stosowane s ą tylko dla metody po średniej.
 C aq ads ðt i Þ = stężenie masowe substancji w fazie wodnej w czasie t  i 
w którym prowadzona jest analiza ( μg cm  -3 ); niniejsze 
stężenie jest ustalone analitycznie, uwzgl ędniając wielkości 
określone ślepą próbą. 
V 0 = początkowa obj ętość roztworu badanego w kontakcie z gleb ą 
(cm  3 ). 
Wartości procentu adsorpcji  A t i lub C aq ads ðt i Þ są wykreślane w zale żności od 
czasu i czasu, po którym osi ągana jest równowaga sorpcji. Przyk łady takich 
wykresów podano odpowiednio na rys. 1 i rys.2.
  
Rys. 1.  
Krzywa równowagi adsorpcji
  
Rys.2  
Stężenie masowe substancji badanej w fazie wodnej (C  aq ) w zależności od czasu  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Metoda szeregowa  
Następujące równania s ą uwzględniane, je śli zastosowano procedur ę 
adsorpcji, przez oznaczenie substancji badanej w ma łych podwielokrot ­
nościach fazy wodnej przy w łaściwych przedzia łach czasu.  
— W ramach ka żdego przedzia łu czasu ilo ść substancji zaadsorbowanej na 
glebie jest obliczana w nast ępujący sposób:  
— dla pierwszego przedzia łu czasu Δt 1 = t 1 -t 0 
m s ads ðΔt 1 Þ ¼ m  0 Ä m m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
(4) 
— dla drugiego przedzia łu czasu Δt 2 = t 2 -t 1 
m s ads ðΔt 2 Þ ¼ m  m ads ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
(5) 
— dla trzeciego przedzia łu czasu Δt3 = t3-t2  
m s ads ðΔt 3 Þ ¼ m m ads ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m  m ads ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î 
(6) 
— dla n-tego przedzia łu czasu Atn = tn-tn-1  
m s ads ðΔt n Þ ¼ m  m ads ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m m ads ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ê Ì  
v a A 0 
@ 1 
A (7) 
— Procent adsorpcji w ka żdym przedziale czasowym,  A Δt i , jest obliczany 
przez zastosowanie nast ępującego równania:  
A Δt i ¼ m s ads ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) 
gdzie procent adsorpcji  ðA t i Þ w punkcie czasu t  i jest podany za pomoc ą 
równania:  
A t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m s ads ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Wartości adsorpcji  A t i lub A Δt i (w odniesieniu do potrzeb badania) s ą 
wykreślane w zale żności od czasu i czasu po którym uzyskana równo ­
waga sorpcji jest sta ła. 
— Przy czasie równowagi t  eq : 
— masa substancji badanej zaadsorbowana na glebie wynosi:  
m s ads ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— masa substancji badanej w roztworze wynosi:  
m aq ads ðeqÞ ¼ m  0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m s ads ðΔt i Þ (11) 
— i procent adsorpcji w równowadze wynosi:  
A eq ¼ m s ads ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Parametry u żyte powy żej są określone jako:  
m s ads ðΔt 1 Þ; m s ads ðΔt 2 Þ; :::; m s ads ðΔt n Þ = masa substancji zaadsorbowana 
na glebie w ci ągu przedzia łów 
czasu, odpowiednio Δt 1 , Δt 2 ,..., 
Δt n (μg), 
m m ads ðt 1 Þ; m m ads ðt 2 Þ; :::; m n ads ðt n Þ = masa substancji zmierzona 
w podwielokrotno ści v a A , odpo­
wiednio w punktach czasu t  1 , t 2 , 
…, t  n (μg), 
m s ads ðeqÞ = masa substancji zaadsorbowanej 
na glebie przy równowadze 
adsorpcji ( μg), 
m aq ads ðeqÞ = masa substancji w roztworze przy 
równowadze adsorpcji ( μg), 
v a A = objętość podwielokrotno ści 
w której substancja badana jest mierzona (cm
 
A Δt i = procent adsorpcji odpowiadaj ący 
przedziałowi czasowemu Δt i 
( %),  
A eq = procent adsorpcji przy równo ­
wadze adsorpcji ( %).  
DESORPCJA D (A%)  
Czas t  0 rozpoczęcia doświadczenia kinetyki desorpcji, jest okre ślany jako 
moment, w którym maksymalna odzyskana obj ętość roztworu badanej substancji 
(po osiągnięciu równowagi adsorpcji) jest podstawiana równ ą objętością 
roztworu 0,01 M CaCl  2 . 
a) Metoda równoleg ła 
W punkcie czasu t  i , masa substancji badanej jest mierzona w fazie wodnej 
pobranej z probówki i  V  i 
r Ê Ì  
masa zdesorbowana jest obliczana wed ług 
równania:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m aq A (13) 
Przy równowadze desorpcji t  i = t eq i zatem  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ 
Masa substancji badanej zdesorbowanej podczas przedzia łu czasowego ( Δt i ) 
jest podana za pomoc ą równania:  
m aq des ðΔt i Þ ¼ m  aq des ðt i Þ Ä Σ 
j ¼ 1 i ¼ 1 
m aq des ðjÞ (14) 
Procent desorpcji jest obliczany:  
w punkcie czasu t  i z równania:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
i podczas przedzia łu czasowego ( Δt i ) z równania:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
gdzie:  
D t i = procent desorpcji w punkcie czasu t  i ( %),  
D Δt i = procent desorpcji odpowiadaj ący przedzia łowi czasu Δt i 
( %),  
m aq des ðt 1 Þ = masa substancji zdesorbowanej w punkcie czasu t  i (μg), 
m aq des ðΔt 1 Þ = masa zaadsorbowanej substancji badanej w ci ągu prze­
działu czasu Δt i (μg), 
m m des ðt i Þ = masa substancji badanej zmierzona analitycznie w czasie t  i 
w objętości roztworu  V r i pobranej do analizy ( μg), 
m aq A = masa substancji badanej pozostaj ącej z równowagi 
adsorpcji wymaganej do niepe łnego podstawienia obj ętości 
(μg), 
m aq A ¼ m aq ads ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m aq ads ðeqÞ = masa substancji badanej w roztworze w równowadze 
adsorpcji ( μg), 
V R = objętość nadsączu zlanego z probówki po osi ągnięciu 
równowagi adsorpcji i zast ąpieniu tą samą ilością roztworu 
0,01 M CaCl  2 (cm  3 ), 
V r i = objętość roztworu pobranego z probówki (i) do pomiaru 
substancji badanej w do świadczeniu kinetyki desorpcji 
(cm  3 ). 
Wielkości desorpcji  D  t i lub D  Δt i (zgodnie z potrzebami bada ń) są 
wykreślane w zale żności od czasu i czasu po którym uzyskana równowaga 
desorpcji jest sta ła. 
b) Metoda szeregowa  
Następujące równania s ą uwzględniane, je śli zastosowano procedur ę 
adsorpcji, przez oznaczenie substancji badanej w ma łych podwielokrot ­
nościach ðv a A Þ fazy wodnej (metoda szeregowa w 1.9. Wykonanie badania). 
Zakłada ona, że: a) obj ętość nadsączu zlanego z probówki po do świad­
czeniu kinetyki adsorpcji, by ła zastąpiona tą samą objętością roztworu 0,01 
M CaCl2 (V  R ); i b) ca łkowita obj ętość fazy wodnej w kontakcie z gleb ą 
(V T ) w czasie trwania do świadczenia pozostaje sta ła oraz jest podana za 
pomocą równania:  
V T ¼ V  0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
W punkcie czasu t  i : 
— masa substancji badanej jest mierzona w ma łej podwielokrotno ści 
v a D Ê Ì  
, a masa desorbowana jest obliczana wed ług równania:  
m aq des ðt i Þ ¼ m  m des ðt i Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä ði Ä 1Þ · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A (19) 
— w równowadze desorpcji t  i = t eq , a zatem  m aq des ðt i Þ = m aq des ðeqÞ, 
— procent desorpcji  D t i obliczany jest wed ług równania:  
D t i ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
W przedziale czasowym ( Δt i ): 
W trakcie ka żdego przedzia łu czasu ilo ść substancji desorbowanej jest 
obliczana nast ępująco: 
— dla pierwszego przedzia łu czasu Δt 1 = t 1 -t 0 
m aq des ðΔt 1 Þ ¼ m  m des ðt 1 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A and m  s des ðt 1 Þ ¼ m  s aq ðeqÞ Ä m aq des ðΔt 1 Þ (21) 
— dla drugiego przedzia łu czasu Δt 2 = t 2 -t 1 
m aq des ðΔt 2 Þ ¼ m  m des ðt 2 Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq des ðΔt 1 Þ · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A Ä m  aq A · V T Ä v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
m s des ðt 2 Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä m  aq des ðΔt 1 Þ þ m aq des ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— dla n-tego przedzia łu czasu Δt n = t n -t n-1 
m aq des ðΔt n Þ ¼ Ï 
m m des ðt n Þ · Í 
V T 
v a D Î 
Ä m  aq A · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v a D Ê Ì  
V T 0 
@ 1 
A 
Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 nÄ1 V T Ä n Ä ið Þ  · v a D Ê Ì  
V T · m aq des ðΔt i Þ 0 
@ 1 
A # 
m s des ðt n Þ ¼ m  s ads ðeqÞ Ä Σ 
i ¼ 1; n ≠ 1 n 
m aq des ðΔt i Þ (23) 
Ostatecznie procent desorpcji w ka żdym przedziale czasowym,  D Δt i , jest 
wyliczany, stosuj ąc następujące równanie:  
D Δt i ¼ m aq des ðΔt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
gdzie procent desorpcji  D t i w punkcie czasu t  i jest podany za pomoc ą 
równania:  
D t i ¼ Σ 
j ¼ Δt 1 Δt i 
m aq des ðjÞ 
m s ads ðeqÞ · 100 ¼ m aq des ðt i Þ 
m s ads ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
Gdzie powy ższe użyte parametry s ą określone jako:  
m s des ðΔt 1 Þ, m s des ðΔt 2 Þ,... , m s des ðΔt n Þ = masa substancji zaadsorbowanej 
na glebie po przedzia łach czaso ­
wych Δt 1 , Δt 2 ,..., Δt n odpo­
wiednio ( μg); 
m aq des ðΔt 1 Þ, m aq des ðΔt 2 Þ,... , m aq des ðΔt n Þ = masa substancji badanej zdesor ­
bowanej podczas przedzia łów 
czasowych Δt 1 , Δt 2 ,..., Δt n odpo­
wiednio ( μg); 
m m des ðt 1 Þ, m m des ðt 2 Þ,... , m m des ðt n Þ = masa substancji zmierzona 
w podwielokrotno ści v  D 
a Ê Ì  
w punktach czasu t  1 ,t 2 ,..., t  n , 
odpowiednio ( μg); 
V T = całkowita obj ętość fazy wodnej 
w kontakcie z gleb ą, podczas 
trwania do świadczenia kine ­
tycznej desorpcji, przeprowadzo ­
nego metod ą szeregow ą (cm  3 ), 
m A 
aq = masa substancji badanej pozos ­
tałej z równowagi adsorpcji 
wymagana do niepe łnego 
podstawienia obj ętości (μg), 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = objętość nadsączu usuni ętego 
z probówki po uzyskaniu równo ­
wagi adsorpcji i zast ąpiona tą 
samą objętością roztworu 0,01 
M CaCl  2 (cm  3 ), 
v D 
a = objętość podwielokrotno ści 
pobranej do celów analitycznych z probówki (i), w czasie trwania 
doświadczenia kinetyki deso ­
rpcji, wykonywanej metod ą 
seryjną (cm
 3 ), 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
DODATEK 6  
ADSORPCJA-DESORPCJA W GLEBACH: ARKUSZ PRZEDSTAWIANIA DANYCH  
Badana substancja:  
Badana gleba:  
Zawartość suchej masy w glebie (105  o C, 12 godz.): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Odpowiednio ść metody analitycznej  
Zważona gleba g 
Gleba: sucha masa 8 
Objętość roztworu CaCl  2 cm 3 
Nominalne st ężenie roztworu ko ńcowego μg cm  -3 
Analityczne st ężenie roztworu ko ńcowego μg cm  -3 
Zasada zastosowanej metody analitycznej:  
Kalibracja metody analitycznej:  
Badana substancja:  
Badana gleba:  
Zawartość suchej masy w glebie (105  o C, 12 godz.): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Zastosowana analityczna metodologia: Po średnia □ Równoleg ła □ Szeregowa  □ 
Bezpośredn­
ia □ 
Badanie adsorpcji: próbki badane  
Symbol Jednostki Czas 
równoważenia Czas 
równoważenia Czas 
równoważenia Czas 
równoważenia 
Probówka nr 
Zważona gleba — g 
Gleba: sucha masa m  soil g 
Objętość wody w zwa żonej 
glebie (obliczona) v ws cm 3 
Objętość 0,01 M CaCl  2 
roztworu do zrównowa żenia 
gleby cm 3 
Objętość roztworu podstawo ­
wego cm 3 
Całkowita obj ętość fazy wodnej 
w kontakcie z gleb ą V o cm 3 
Początkowe stężenie badanego 
roztworu C o μg cm  -3 
Masa substancji badanej na 
początku badania m 0 μg ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Symbol Jednostki Czas 
równoważenia Czas 
równoważenia Czas 
równoważenia Czas 
równoważenia 
Po mieszaniu i odwirowaniu  
METODA PO ŚREDNIA 
Metoda równoleg ła 
Stężenie w wodnej fazie badanej 
substancji, w łączając ślepą 
próbę C aq ads ðt i Þ μg cm  -3 
Metoda szeregowa 
Podwielokrotna masa zmierzona 
substancji badanej  m m ads ðt i Þ μg 
METODA BEZPO ŚREDNIA 
Masa badanej substancji zaad ­
sorbowanej na glebie  m s ads ðt i Þ μg 
Obliczenie adsorpcji 
Adsorpcja  A  t i % 
A Δt i % 
Środek 
Współczynnik adsorpcji K  d cm 3 g -1 
Środek 
Współczynnik adsorpcji K  oc cm 3 g -1 
Środek  
Badana substancja:  
Badana gleba:  
Zawartość suchej masy w glebie (105  o C, 12 godz.): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Badanie adsorpcji: próby ślepe i kontrolne  
Symbol Jednostki Ślepa Ślepa Kontrolna  
Probówka nr 
Zważona gleba g 0 0 
Ilość wody w zwa żonej glebie(obli ­
czona) cm 3 — — 
Dodana obj ętość roztworu 0,01 Μ 
CaCl  2 cm 3 
Dodana obj ętość roztworu podstawo ­
wego substancji badanej cm 3 0 0 
Całkowita obj ętość fazy wodnej (obli ­
czona) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Symbol Jednostki Ślepa Ślepa Kontrolna  
Początkowe stężenie substancji 
badanej w fazie wodnej μg cm  -3 
Po mieszaniu i odwirowaniu  
Stężenie w fazie wodnej μg cm  3 
Uwaga: je śli konieczne, doda ć kolumny.  
Badan substancja:  
Badana gleba:  
Zawartość suchej masy w glebie (105  o C, 12 godz.): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Bilans masy  
Symbol Jednostki  
Probówka nr 
Zważona gleba — g 
Gleba: sucha masa m  soil g 
Objętość wody w zwa żonej glebie (obli ­
czona) V WS ml 
Objętość roztworu 0,01 Μ CaCl  2 do 
równoważenia gleby ml 
Objętość roztworu podstawowego cm  3 
Całkowita obj ętość fazy wodnej 
w kontakcie z gleb ą V 0 cm 3 
Początkowe stężenie roztworu badanego C  o μg cm  -3 
Czas równowa żenia — h  
Po mieszaniu i odwirowaniu  
Stężenie wodnej fazy substancji badanej 
w równowadze adsorpcji, w łączono 
korektę na ślepą próbę C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Czas równowa żenia t  eq h 
Pierwsze rozcie ńczenie rozpuszczalnikiem 
Usunięta objętość fazy wodnej V  rec cm 3 
Dodana obj ętość rozpuszczalnika ΔV cm  3 
Pierwszasza ekstrakcja rozpuszczalnikiem 
Analizowany sygna ł w rozpuszczalniku S  E1 var. 
Stężenie substancji badanej 
w rozpuszczalniku C E1 μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Symbol Jednostki  
Masa substancji wyekstrahowanej 
z gleby i ścianek zbiornika M E1 μg 
Drugie rozcie ńczenie rozpuszczalnikiem 
Usunięta objętość rozpuszczalnika ΔV S cm 3 
Dodana obj ętość rozpuszczalnika ΔV cm  3 
Druga ekstrakcja rozpuszczalnikiem 
Analizowany sygna łw fazie rozpuszczal ­
nika S E2 var. 
Stężenie substancji badanej 
w rozpuszczalniku CE2 μg cm  -3 
Masa substancji wyekstrahowanej 
z gleby i ścianek zbiornika m E2 μg 
Całkowita masa substancji badanej 
wyekstrahowanej w dwóch kolejnych krokach m
 E μg 
Bilans masy MB %  
Badana substancja:  
Badana gleba:  
Zawartość suchej masy w glebie (105  o C, 12 godz.): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Izotermy adsorpcji  
Symbol Jednostki  
Probówka nr 
Zważona gleba — g 
Gleba:sucha masa E g 
Objętość wody w zwa żonej 
glebie (obliczona) V WS cm 3 
Objętość roztworu 0,01 
M CaCl  2 do zrównowa żenia 
gleby cm 3 
Objętość dodanego roztworu 
podstawowego cm 3 
Całkowita obj ętość fazy wodnej 
w kontakcie z gleb ą (obliczona) V 0 cm 3 
Stężenie roztworu C  0 μg cm  -3 
Czas równowa żenia — h  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Symbol Jednostki  
Po mieszaniu i odwirowaniu  
Stężenie substancji w fazie 
wodnej, w łączono poprawk ę na 
ślepą próbę C aq ads ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatura  o C 
Masa adsorpcji na jednostk ę 
gleby  C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Analiza regresyjna:  
wartość K F ads : 
wartość 1/n:  
Współczynnik regresji r  2 : 
Badana substancja:  
Badana gleba:  
Zawartość suchej masy w glebie (105  o C, 12 godz.): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Zastosowana analityczna Po średnia 
Równoleg ła □ Szeregowa  □ Metodolo ­
gia: □ 
Badanie desorpcji  
Symbol Jednostki Przedział 
czasu Przedział 
czasu Przedział 
czasu Przedział 
czasu  
Probówka nr pochodz ąca z kroku 
adsorpcji 
Masa substancji zaadsorbowanej na 
glebie w równowadze adsorpcji  m s ads ðeqÞ μg 
Usunięta objętość fazy wodnej, 
zastąpiona przez 0,01 M CaCl  2 V R cm 3 
Całkowita obj ętość fazy 
wodnej w kontakcie z glebą PM V
 0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Masa substancji badanej pozostaj ąca 
w równowadze adsorpcji wymagana do niepełnego podstawienia obj ętości
 m aq A μg 
Kinetyka desorpcji  
Zmierzona masa substancji zdesorbo ­
wanej z gleby w czasie t  i m m des ðt i Þ μg 
Objętość roztworu pobra ­
nego z probówki (i) do 
pomiaru substancji badanej PM v
 i r cm 3 
SM v  a D cm 3 
Masa substancji zdesorbowana z gleby 
w czasie t  i (obliczona)  m aq des ðt i Þ μg 
Masa substancji zdesorbowana z gleby 
w czasie trwania przedzia łu czasowego 
Δt i (obliczona)  m aq des ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Symbol Jednostki Przedział 
czasu Przedział 
czasu Przedział 
czasu Przedział 
czasu  
Procent desorpcji  
Desorpcja w czasie t  i D t i % 
Desorpcja w przedziale czasowym D  Δti D Δt i % 
Pozorny wspó łczynnik desorpcji K  des 
PM: metoda równoleg ła 
SM: metoda szeregowa  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  OSZACOWANIE WSPÓ ŁCZYNNIKA ADSORPCJI (K  OC ) NA 
GLEBIE I W OSADZIE ŚCIEKOWYM PRZY ZASTOSO ­
WANIU WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII 
CIECZOWEJ (HPLC)  
1. METODA  
Niniejsza metoda jest kopi ą OECD TG121 (2000).  
1.1. WPROWADZENIE  
Zachowanie si ę sorpcji substancji w glebach lub osadach ściekowych 
może być opisane za pomoc ą parametrów okre ślonych do świad­
czalnie w rozumieniu metody badania C.18. Wa żnym parametrem 
jest wspó łczynnik adsorpcji, który okre śla się jako stosunek mi ędzy 
stężeniem substancji w gleba/osad ściekowy a st ężeniem substancji 
w fazie wodnej w równowadze adsorpcji. Wspó łczynnik adsorpcji 
znormalizowany do zawarto ści węgla organicznego gleby K  oc jest 
użytecznym wska źnikiem zdolno ści wiązania substancji chemicznych 
na ciałach organicznych gleby i osadu ściekowego oraz pozwalaj ­ 
ącym na dokonanie porówna ń między różnymi substancjami 
chemicznymi. Niniejszy parametr mo że być oszacowany poprzez 
korelacje rozpuszczalno ści wodnej i wspó łczynnikiem podzia łu n- 
oktanol/woda (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).  
Metoda do świadczalna opisana w niniejszym badaniu, u żywa HPLC 
dla oszacowania wspó łczynnika adsorpcji K  oc w glebie i w osadzie 
ściekowym (8). Oceny s ą wyższej wiarygodno ści niż te z oblicze ń 
QSAR (9). Jako metoda oszacowania nie mo że w pełni zastąpić 
doświadczeń okresowej równowagi, zastosowanej w metodzie 
badanej C18. Jednak że oszacowany K  oc jest użyteczny dla wyboru 
właściwych parametrów badania dla bada ń adsorpcja/desorpcja 
zgodnie z metod ą badania C.18, poprzez wyliczenie K  d (współ­
czynnik podzia łu) lub K  f (współczynnik adsorpcji Freundlicha) 
zgodnie z równaniem 3 (zob. pkt 1.2).  
1.2. DEFINICJE  
K d : Współczynnik podzia łu jest zdefiniowany jako stosunek st ężenia 
równowagi C roztworu substancji badanej w systemie dwufazowym 
składającym się z sorbentu (gleba lub osad ściekowy) i fazy wodnej; 
jest to warto ść bezwymiarowa, natomiast st ężenia w obu fazach 
są wyrażone na podstawie waga/waga. W przypadku st ężenia 
w fazie wodnej podano je na bazie waga/obj ętość, zatem jednostk ą 
jest ml· g -1 . K  d zmienia si ę z właściwościami sorbentu i mo że być 
zależny od stężenia. 
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
gdzie:  
C soil = stężenie substancji badanej w glebie w równowadze 
(μg· g -1 ), 
C sludge  = stężenie substancji badanej w osadzie w równowadze 
(μg· g -1 ), 
C aq = stężenie substancji badanej w fazie wodnej 
w równowadze ( μg· g -1 , μg ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : Współczynnik adsorpcji Freundlicha definiuje si ę jako stężenie 
substancji badanej w glebie lub osadzie ściekowym (x/m), gdy 
stężenie równowagi C  aq w fazie wodnej jest równe jeden; jednostk ą 
jest μg· g -1 sorbenta. Warto ść zmienia si ę z właściwościami sorbenta.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
gdzie:  
x/m = ilo ść substancji badanej x ( μg) zaadsorbowanej na ilo ści 
sorbenta m (g) w równowadze  
1/n = nachylenie izotermy adsorpcji Freundlicha  
C aq = stężenie substancji badanej w fazie wodnej w równowadze 
(μg . ml  -1 ) 
AtC aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : Współczynnik podzia łu (K  d ) lub wspó łczynnik adsorpcji Freun ­
dlicha (K  f ) znormalizowany do zawarto ści węgla organicznego (f  oc ) 
sorbenta; w szczególno ści dla niezjonizowanych substancji chemicz ­
nych, jest to przybli żony wska źnik dla zasi ęgu adsorpcji mi ędzy 
substancją a sorbentem, pozwalaj ący na dokonanie porówna ń między 
różnymi substancjami chemicznymi. W zale żności od wymiarów K  d 
i K f , K oc są bezwymiarowe lub maj ą jednostki ml . g  -1 lub μg . g  -1 
ciała organicznego.  
Koc ¼ K d 
f oc bezwymiarowe lub ml ·g Ä1 Ê Ì  
lub K f 
f oc μg · g Ä1 Ê Ì  (3) 
Zależność między K  oc i K  d nie zawsze jest liniowa i w ten sposób 
wartości K  oc mogą różnić się od gleby do gleby, ale ich ró żnorod­
ność jest znacznie zmniejszona porównuj ąc do warto ści K  d lub K  f . 
Współczynnik adsorpcji (K  oc ) jest wyprowadzony ze wspó łczynnika 
zdolności (k'') przy u życiu krzywej kalibracji, wykre ślając log k' 
w zależności od log K  oc wybranych zwi ązków odniesienia.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
gdzie:  
t R = HPLC czas retencji substancji badanej i substancji odnie ­
sienia (minuty)  
t 0 = HPLC czas martwy (minuty) (zob. pkt 1.8.2).  
P ow : współczynnik podzia łu oktanol-woda jest okre ślony jako 
stosunek st ężenia roztworu substancji w n-oktanolu i wody; jest 
bezwymiarow ą wartością. 
P ow ¼ C oktanol  
C aq ð¼ K ow Þ (5) 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Wzór strukturalny, czysto ść, stała dysocjacji (je śli to właściwe) 
powinny by ć znane przed zastosowaniem metody. Informacje 
dotyczące rozpuszczalno ści w wodzie i rozpuszczalnikach organicz ­
nych, wspó łczynniku podzia łu oktanol-woda oraz cechy hydrolizy s ą 
przydatne.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
Aby skorelowa ć zmierzone przez HPLC dane retencji substancji 
badanej i jej wspó łczynnik adsorpcji K  oc , ustalana jest krzywa kalib ­
racji log K  oc w zależności od log k'. Powinno by ć zastosowane 
minimum sze ść punktów odniesienia, co najmniej jeden powy żej 
i jeden poni żej wartości oczekiwanej substancji badanej. Dok ładność 
metody b ędzie znacz ąco poprawiona, je śli substancje wzorcowe s ą 
strukturalnie zwi ązane z zastosowan ą substancj ą badaną. Jeśli takie 
dane nie s ą dostępne, jest zadaniem u żytkownika wybranie w łaści­
wych substancji wzorcowych. W tym przypadku powinien zosta ć 
wybrany bardziej ogólny zestaw strukturalnie heterogenicznych 
substancji. Substancje stosowane i warto ści Κ oc są wymienione 
w dodatku w tabeli 1 dotycz ącej osadów ściekowych i w tabeli 3 
dotyczącej gleb. Wybór innych substancji kalibracyjnych powinien 
być uzasadniony.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
HPLC wykonuje si ę na analitycznych kolumnach nape łnionych 
handlowo dost ępnym cyjanopropylem w fazie sta łej zawieraj ącej 
lipofilowe i polarne grupy cz ąsteczkowe. Umiarkowanie stacjonarna 
faza polarna jest oparta na stosowanej matrycy krzemionkowej: 
-O-Si — CH  2 — CH  2 — CH  2 -CN 
krzemionka niepolarna po łowa (odst ęp) polarna 
połowa 
Zasada metody badania jest podobna do metody badania A.8 (wspó ł­
czynnik podzia łu, HPLC metoda). Podczas przej ścia przez kolumn ę 
wraz z ruchom ą fazą, substancja badana oddzia łuje z faz ą stacjo­
narną. W wyniku rozdzielenia mi ędzy fazami ruchom ą 
i stacjonarn ą badana substancja jest opó źniona. Podwójny sk ład 
fazy stacjonarnej posiadaj ącej polarne i niepolarne powierzchnie 
pozwala na wspó łdziałanie polarnych i niepolarnych grup cz ąsteczki 
w podobny sposób jak dla matryc cia ł organicznych w glebie lub 
osadu ściekowego. Umo żliwia to zale żności między czasem retencji 
na kolumnie i wspó łczynnikiem adsorpcji na powstaj ących substan ­
cjach organicznych.  
Wartość pH ma znacz ący wpływ na zachowania sorpcyjne, 
w szczególno ści w odniesieniu do substancji polarnych. 
W odniesieniu do gleb rolniczych lub zbiorników oczyszczalni ścieków pH zwykle zmienia si ę między 5,5 a 7,5. Dla podatnych 
na jonizacj ę substancji nale ży wykona ć dwa badania zarówno 
z formą jonową, jak i niejonow ą we właściwych roztworach bufo ­
rowych, ale tylko w przypadkach, gdy co najmniej 10 % zwi ązku 
badanego jest zdysocjowana w zakresie pH 5,5–7,5.
 
Ponieważ tylko zale żność między retencj ą na kolumnie HPLC 
a współczynnikiem adsorpcji jest wykorzystywana do oceny, nie 
jest wymagana analityczna metoda ilo ściowa i konieczne jest 
określenie tylko czasu retencji. Je śli dostępny jest odpowiedni zestaw 
substancji odniesienia i stosowane mog ą być standardowe warunki 
doświadczalne, metoda stanowi szybki i skuteczny sposób oszaco ­
wania wspó łczynnika adsorpcji Κ oc . 
1.5. MO ŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA BADANIA  
Metoda HPLC ma zastosowanie do substancji chemicznych (nieety ­
kietowanych lub etykietowanych) w odniesieniu do których jest dostępny właściwy system detakcji (np. spektrofotometer, detektor 
radioaktywno ści) i które s ą wystarczaj ąco stabilne podczas czasu 
trwania do świadczenia. Mo że to by ć szczególnie u żyteczne 
w odniesieniu do substancji chemicznych które s ą trudne do bada ń 
w innych systemach do świadczalnych (tj. substancje lotne, 
substancje nierozpuszczalne w wodzie w st ężeniu które mo że być 
analitycznie zmierzone, substancje z wysokim powinowactwem do powierzchni systemów inkubacyjnych). Metoda jest u żyteczna 
w odniesieniu do mieszanin daj ących pasma nierozuszczalnej elucji. 
W takim przypadku górne i dolne granice warto ści log Κ
 oc 
związków mieszaniny badanej powinny by ć określone. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
Zanieczyszczenia mog ą czasem powodowa ć problemy dotycz ące 
interpretacji wyników z HPLC, lecz maj ą małe znaczenie 
w zakresie w jakim substancja badana mo że analitycznie by ć 
wyraźnie określona oraz oddzielana od zanieczyszcze ń. 
Metoda jest uzasadniona w odniesieniu do substancji wymienionych 
w tabeli 1 w dodatku oraz by ła równie ż stosowana do ró żnych 
innych substancji chemicznych nale żących do nast ępujących 
chemicznych klas:  
— aminy aromatyczne (np. trifluralin, 4-chloroanilina, 3,5-dinitroa ­
nilina, 4-metyloanilina, N-metyloanilina, 1-naftyloamina),  
— estry aromatycznych kwasów karboksylowych (np. metyloester 
kwasu benzoesowego, ester etylowy kwasu 3,5-dinitrobenzoeso ­
wego),  
— węglowodory aromatyczne (np. toluen, ksylen, etylobenzen, 
nitrobenzen),  
— estry kwasu aryloksyfenoksypropioniowego (np.diclofop-mety ­
lowy, fenoxaprop-etylowy, fenoxaprop-P-etylowy),  
— środki grzybobójcze benzimidazolu i imidazolu (np. carbenda ­
zim, fuberidazol, triazoxid),  
— amidy kwasu karboksylowego (np. 2-chlorobenzamid, N,N-dime ­
tylobenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-metylobenzamid, 2-nitro ­
benzamid, 3-nitrobenzamid),  
— chlorowane w ęglowodory (np. endosulfan, DDT, heksachloro ­
benzen, quintozen, 1,2,3-trichlorobenzen),  
— fosforoorganiczne środki owadobójcze (np. azinphos-metylowy, 
disulfoton, fenamiphos, isofenphos, pyrazophos, sulprofos, tria ­
zophos),  
— fenole (np. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorofenol, 
2,4,6-trichlorofenol, 1-naftol),  
— pochodne fenylomocznika (np. isoproturon, monolinuron, pency ­
curon),  
— pigmentowe barwniki (np. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, 
Direct Red 81),  
— węglowodory poliaromatyczne (np. acetonaften, naftalen),  
— środki chwastobójcze 1,3,5-triazyny (np. prometryn, propazine, 
simazine, terbutryn),  
— pochodne triazolu (np. tebuconazole, triadimefon, tradimenol, 
triapenthenol).  
Metody nie stosuje si ę do substancji, które reaguj ą z eluentem albo 
z fazą stacjonarn ą. Nie jest tak że stosowana do substancji, które 
oddziaływają w szczególny sposób ze sk ładnikami nieorganicznymi 
(np. tworzenie grup kompleksów z minera łami gliny). Metoda nie 
działa z substancjami powierzchniowo czynnymi, zwi ązkami 
nieorganicznymi i umiarkowanymi lub mocnymi organicznymi 
kwasami i zasadami. Warto ści log Κ oc w zakresie 1,5–5,0 mog ą 
być określone. Podatne na jonizacj ę substancje musz ą być mierzone, 
stosując buforowan ą fazę ruchomą, należy jednak zachowa ć ostroż­
ność, aby zapobiec str ącaniu się składników buforu lub substancji 
badanej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
1.6.1.  Dok ładność 
Zwykle wspó łczynnik adsorpcji substancji badanej mo że być szaco­
wany w zakresie ± 0,5 log jednostki warto ści określonej przez okre ­
sową metodę równowagi (zob. tabela 1 w dodatku). Wy ższa dokład­
ność może być uzyskana, je śli substancje odniesienia zastosowane s ą 
strukturalnie zwi ązane z substancj ą badaną. 
1.6.2.  Powtarzalno ść 
Oznaczenia powinny by ć prowadzone przynajmniej w dwóch 
kopiach. Warto ści log Κ oc wyprowadzone z poszczególnych 
pomiarów powinny mie ścić się w zakresie 0,25 log jednostki.  
1.6.3.  Odtwarzalno ść 
Doświadczenie uzyskane dotychczas przy zastosowaniu metody 
podtrzymuje jej zasadno ść. Badania metod ą HPLC, z u życiem 48 
substancji (g łównie pestycydów), w odniesieniu do których by ły 
dostępne wiarygodne dane Κ oc na glebach, da ło współczynnik kore ­
lacji równy R = 0,95 (10)(11).  
Między laboratoryjne badanie porównawcze z 11 uczestnicz ącymi 
laboratoriami przeprowadzono, aby poprawi ć i uwiarygodni ć metodę 
(12). Wyniki podano w tabeli 2 dodatku.  
1.7. OPISANIE METODY BADANIA  
1.7.1.  Wst ępne oszacowanie wspó łczynnika adsorpcji  
Współczynnik podzia łu oktanol-woda P  ow (= Κ ow ) oraz, w pewnym 
zakresie, wodna rozpuszczalno ść może być używana jako wska źnik 
dla zasięgu adsorpcji w szczególno ści dla niejonowych substancji, 
a w ten sposób mo że być używana do wst ępnego znalezienia 
zakresu. Rozmaito ść przydatnych korelacji opublikowano 
w odniesieniu do kilku grup substancji chemicznych (1)(2)(3)(4)(5) ­
(6)(7).  
1.7.2.  Aparatura  
Wymagane s ą: cieczowy chromatograf po łączony z bezpulsacyjn ą 
pompą i odpowiednim urz ądzeniem wykrywaj ącym. Zalecane jest 
użycie zaworu wtryskowego z p ętlą wtryskow ą. Należy użyć hand­
lowego cyjanopropylu chemicznie zwi ązanego żywicą na bazie krze ­
mionki (np. Hypersil i Zorbax CN). Kolumna ochronna z tego 
samego materia łu może być ustawiona mi ędzy systemem wtrysku 
i kolumną analityczn ą. Kolumny od ró żnych dostawców mog ą różnić 
się znacznie w wydajno ści rozdzielania. Jako wytyczne, powinny 
być osiągnięte następujące masowe proporcje podzia łu k': log k' 
> 0,0 dla log Κ oc = 3,0 i log k' > 0,4 dla log Κ oc = 2,0 przy u życiu 
metanol/woda 55/45 % jako faza ruchoma.  
1.7.3.  Fazy ruchome  
Zbadano kilka ruchomych faz i nast ępujące dwie s ą zalecane:  
— metanol/woda (55/45 % obj./obj.),  
— metanol/0,01M bufor cytrynianowy pH 6,0 (55/45 % obj./obj.).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Metanol czysto ści HPLC oraz destylowana woda lub bufor cytrynia ­
nowy są używane do przygotowania elucyjnego rozpuszczalnika. 
Mieszanina jest odgazowywana przed u życiem. Powinna by ć 
używana elucja izokratyczna. Je śli mieszaniny metanol/woda nie s ą 
właściwe, nale ży wypróbowa ć inne mieszaniny rozpuszczalnik 
organiczny/woda, np. etanol/woda lub acetonitryl/woda. 
W odniesieniu do zwi ązków jonowych zaleca si ę użycie buforów 
w celu stabilizacji pH. Nale ży zachowa ć ostrożność, aby zapobiec 
wytrącaniu się soli i uszkodzeniu kolumny, co zdarza si ę przy 
niektórych mieszaninach faza organiczna/bufor.  
Nie można używać żadnych dodatków, takich jak odczynniki 
z wolną parą elektronow ą, poniewa ż wpływają na właściwości 
sorpcji fazy stacjonarnej. Takie zmiany w fazie stacjonarnej s ą 
nieodwracalne. Z tej przyczyny obowi ązkowe jest, aby do świad­
czenia z u życiem dodatków prowadzi ć w oddzielnych kolumnach.  
1.7.4.  Substancje rozpuszczone  
Substancje badane i substancje odniesienia powinny by ć rozpusz­
czone w fazie ruchomej.  
1.8. WYKONANIE BADANIA  
1.8.1.  Warunki badania  
Temperatura w czasie trwania pomiarów powinna by ć rejestrowana. 
Użycie segmentu kolumny z kontrolowan ą temperatur ą jest silnie 
zalecane w celu zapewnienia sta łych warunków w czasie trwania 
procesu kalibracji, oszacowania i pomiaru substancji badanej.  
1.8.2.  Oznaczenie czasu martwego t  o 
Stosuje si ę w odniesieniu do okre ślenia czasu martwego dla dwóch 
różnych metod (zob. tak że pkt 1.2).  
1.8.2.1.  Okre ślenie czasu martwego t  o za pomoc ą serii homologicznych  
Niniejsza procedura daje wiarygodne i standaryzowane warto ści t  o . 
W zakresie szczegó łowych informacji zob. metoda badania A.8: 
współczynnik podzia łu (n-oktanol/woda), metoda HPLC.  
1.8.2.2.  Okre ślenie czasu martwego t  o substancjami oboj ętnymi, niezatrzymy ­
wanymi przez kolumn ę 
Niniejsza technika jest oparta na wtrysku roztworów formamidu, 
mocznika lub azotanu sodowego. Pomiary powinny by ć wykonane 
co najmniej dwa razy.  
1.8.3.  Oznaczanie czasów retencji t  R 
Należy wybrać substancje odniesienia, jak opisano w pkt 1.3. S ą one 
wstrzykiwane jako mieszaniny wzorcowe dla ustalenia ich czasów 
retencji, upewniaj ąc się, że czas retencji ka żdego wzorca nie jest 
zakłócony przez obecno ść innego wzorca. Kalibracja powinna by ć 
wykonywana w regularnych odst ępach czasu, co najmniej dwa razy 
dziennie, w celu wyja śnienia niespodziewanych zmian w dzia łaniu 
kolumny. Dla najlepszego sposobu wstrzykni ęcia kalibracyjne 
powinny by ć prowadzone przed i po wstrzykni ęciu badanej 
substancji w celu zapewnienia, aby czas retencji nie zmienia ł się. 
Substancje badane s ą wstrzykiwane oddzielnie, w ilo ściach tak 
małych, jak to mo żliwe (aby zapobiec przeci ążeniu kolumny), 
a ich czasy retencji s ą określone. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
W celu podniesienia zaufania do pomiarów, nale ży wykona ć 
podwójne okre ślenia. Warto ści log K  oc uzyskane z poszczególnych 
pomiarów powinny wchodzi ć w zakres 0,25 log jednostki.  
1.8.4.  Ocena  
Masowe proporcje podzia łu k' są obliczane od martwego czasu do 
czasów retencji t  R wybranych substancji odniesienia, wed ług 
równania 4 (zob. pkt 1.2). Dane log k' dotycz ące substancji odnie ­
sienia są wykreślane wzgl ędem ich warto ści log Κ oc z doświadczeń 
równowagi wsadowej podanych w tabeli 1 i 3 dodatku. Stosuj ąc 
niniejszy wykres, warto ść log k' badanej substancji jest zatem 
używana do okre ślania warto ści log Κ oc . Jeśli rzeczywiste wyniki 
wskazują, że log Κ oc substancji badanej jest poza zakresem kalibra ­
cji, badanie nale ży powtórzy ć stosując inne, bardziej w łaściwe 
substancje odniesienia.  
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Sprawozdanie musi zawiera ć następujące informacje:  
— identyczno ść substancji badanej i substancji odniesienia ich czys ­
tość i wartości pK  a , jeśli to stosowne,  
— opis wyposa żenia i warunki dzia łania, np. typ i wymiary kolumn 
analitycznych (z ochron ą), sposoby wykrywania, faza ruchoma 
(proporcje sk ładników i pH), zakres temperatur w czasie trwania 
pomiarów,  
— czas martwy i zastosowana metoda jego okre ślenia,  
— ilość substancji badanej i substancji odniesienia wprowadzonej 
do kolumny,  
— czas retencji ró żnych zwi ązków odniesienia u żytych do kalibra ­
cji, 
— szczegó łowe informacje dotycz ące spasowania linii regresji (log 
k' vs log Κ oc ) i wykres linii regresji,  
— dane średniej retencji i oszacowane warto ści d log K  oc 
w odniesieniu do testowanego zwi ązku, 
— chromatogramy.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, 
McGraw-Hill, New York.  
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the 
adsorption coefficient ( Κ oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1 67.  
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relation ­
ships between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the 
parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050–1059.  
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 
227–231.
 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic 
substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, 
B19, pp. 297–312.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic compo ­
unds, Science, 106, pp. 831–832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorp ­
tion of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833–846.
 
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application 
of the HPLC-screening method for the determination of the 
adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35 ­
(1/2), pp. 121–128.  
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening 
methods for the estimation of adsorption coefficients on 
soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493–2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemos ­
phere, 27(12), pp. 2341–2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of 
nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measure ­
ments and experience with the applicability of the modified 
OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285–304.  
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373–1384.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
DODATEK  
Tabela 1  
Porównanie warto ści K  oc w odniesieniu do gleb i osadu ściekowego oraz obliczone warto ści metodą rozdzielania 
HPLC  ( 1 ), ( 2 ) 
Substancja CAS No log Κ oc 
osad kanali ­
zacyjny log Κ oc 
HPLC Δ log Κ oc gleb log Κ oc 
HPLC Δ 
Atrazyna 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linuron 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fention 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monuron 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantren 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Fenyloester kwasu benzoe ­
sowego 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzamid 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 
4-nitrobenzamid 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 
Acetanilid 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 
Anilina 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-dichloroanilina 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121–128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludge s. 
Chemosphere, 35 (1/2), pp. 107–119.  
Tabela 2  
Wyniki interlaboratoryjnego badania porównawczego (11 uczestnicz ących laboratoriów) przeprowadzonego 
w celu poprawy i uwiarygodnienia metody HPLC  ( 1 ) 
Substancja Nr CAS log Κ oc Κ oc log Κ oc 
(OECD 106) (metoda HPLC)  
Atrazine 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monuron 150-68-5 1,99 100 ± 8 2,00 Triapenthenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 
Linuron 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 
Fenthion 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373–1384.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabela 3  
Zalecane substancje odniesienia dla metody przegl ądowej HPLC opartej o dane adsorpcji gleby  
Substancja wzorcowa Nr CAS Log Κ oc średnie 
wartości od 
równowagi 
wsadowej Liczba danych 
K oc Log S.D. Źródło 
Acetanilid 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-nitrobenzamid 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N.N-dimetylobenzamid 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-metylobenzamid 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Benzoesan metylu 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazyna 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturon 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamid 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilina 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamid 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazoxide 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazophos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linuron 330-55-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftalen 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiocarb 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Barwnik Acid Yellow 219 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Trichlorobenzen 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
γ-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fention 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Barwnik Direct Red 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pyrazophos 13457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
α-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop metylowy 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantren 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Barwnik Basic Blue 41 (mie ­
szany) 26850-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
ODT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoefftiienten organischern Chemikalien mit der HPLC. UBA R & 
D Report No 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen. W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285–304. 
( c ) Dane dostarczone przez przemys ł. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  BADANIE ROZRODCZO ŚCI DAPHNIA MAGNA  
1. METODA  
Niniejsza metoda badania toksyczno ści dla rozrodczo ści jest kopi ą 
OECD TG 211 (1998).  
1.1. WPROWADZENIE  
Głównym celem badania jest ocena skutków dzia łania substancji 
chemicznych na zdolno ść rozrodczo ści Daphnia magna.  
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI  
Zwierzęta rodzicielskie:  są tymi samicami  Daphnia  obecnymi na 
początku badania i których zdolno ść rozrodczo ści jest przedmiotem 
badań. 
Potomstwo:  są to młode Daphnia  produkowane przez zwierz ęta 
rodzicielskie w trakcie badania.  
Najniższy obserwowany skutek st ężenia (LOEC):  jest to 
najmniejsze badane st ężenie substancji badanej, przy którym obser ­
wuje się statystycznie istotny skutek dotycz ący rozrodczo ści 
i śmiertelno ści zwierz ąt macierzystych (przy p < 0,05) przy porów ­
naniu z do świadczeniem kontrolnym, w ramach okre ślonego czasu 
trwania ekspozycji na badania. Jednak że wszystkie badane st ężenia 
powyżej LOEC musz ą wykazywa ć szkodliwy skutek, równy lub 
większy niż ten obserwowany przy LOEC. Gdy te dwa warunki 
nie mogą być spełnione, musz ą być podane wszystkie wyja śnienia 
w odniesieniu do sposobu w jaki LOEC (i st ąd NOEC) zosta ło 
wybrane.  
Nieobserwowany skutek st ężenia (NOEC):  jest stężeniem badanym 
bezpośrednio poni żej LOEC, które, gdy jest porównane 
z doświadczeniem kontrolnym, nie ma statystyczni istotnego skutku 
(p < 0,05), w ramach okre ślonego czasu trwania ekspozycji na bada ­
nie. 
EC x : jest stężeniem substancji badanej rozpuszczonej w wodzie 
powodującym w x % redukcj ę w rozrodczo ści Daphnia magna  
w ramach okresu ekspozycji na badanie.  
Wewnętrzny wska źnik wzrostu:  jest miar ą wzrostu populacji, która 
łączy zdolno ść rozrodcz ą i określoną wiekowo śmiertelno ść (20)(21)­
(22). W populacji w stanie zrównowa żonym jest równy zero. Dla 
rozwijających populacji b ędzie dodatni, a dla kurcz ących się popu­
lacji będzie ujemny. Jest oczywiste, że ten drugi jest niepodtrzy ­
mujący i ostatecznie prowadzi do zaniku.  
Granica wykrywania:  najniższe stężenie, które mo że być wykryte, 
ale nie mo żna go ilo ściowo oznaczy ć. 
Granica oznaczania:  najniższe stężenie, które mo żna zmierzy ć 
ilościowo.  
Śmiertelno ść: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest nieru ­
chome, tj. gdy nie jest w stanie p ływać lub nie jest obserwowany 
ruch przydatków lub odw łoka, w ci ągu 15 sekund po łagodnym 
poruszeniu zbiornika badanego. (Je śli jest stosowana inna definicja, 
musi być to zrelacjonowane wraz z odniesieniem).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. ZASADA METODY BADANIA  
Młode samice  Daphnia  (zwierzęta rodzicielskie), w wieku poni żej 24 
godzin na pocz ątku badania, s ą wystawiane na dzia łanie substancji 
badanej dodanej do wody w zakresie st ężeń. Czas trwania badania 
wynosi 21 dni. Na ko ńcu badania szacowana jest ca łkowita ilo ść 
żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierz ę rodzicielskie, 
które prze żyło do końca badania. To oznacza, że młode wyprodu ­
kowane przez doros łe zmarłe w czasie trwania badania s ą wyklu­
czone z oblicze ń. Zdolność rozrodcza zwierz ąt rodzicielskich mo że 
być wyrażona w inny sposób (np. liczba żyjącego potomstwa wypro ­
dukowanego na zwierz ę na dzień od pierwszego dnia zaobserwo ­
wania potomstwa), lecz powinno to by ć przedstawione jako dodatek 
do całkowitej liczby m łodocianych wyprodukowanych na żywych 
rodziców na ko ńcu badania. Zdolno ść rozrodcza zwierz ąt wystawia ­
nych na dzia łanie substancji badanej jest porównywana do tej 
z doświadczenia kontrolnego w celu ustalenia najni ższego obserwo ­
wanego skutku st ężenia (LOEC), a st ąd nieobserwowanego skutku 
stężenia (NOEC). Ponadto, w najszerszym mo żliwym zakresie, dane 
analizuje si ę, stosując model regresji w celu prognozowania st ężenia 
powodującego x % zmniejszenia zdolno ści rozrodczej (tj. EC  50 , 
EC 20 lub EC  10 ). 
Przeżycie zwierz ąt rodzicielskich i czas do produkcji potomstwa 
musi by ć równie ż przedstawiony. Inne skutki zwi ązane 
z substancj ą dotyczące parametrów takich jak rozwój (np. d ługość) 
i możliwy wewn ętrzny wska źnik wzrostu mo że być również 
zbadany.  
1.4. INFORMACJE DOTYCZ ĄCE SUBSTANCJI U ŻYTEJ 
W BADANIU  
Powinny by ć dostępne wyniki badania toksyczno ści ostrej (zob. 
metoda C.2, cz ęść I) wykonanej na  Daphnia magna.  Wyniki mog ą 
być użyteczne przy wyborze w łaściwego zakresu st ężeń badanych 
w badaniach rozrodczo ści. Rozpuszczalno ść w wodzie i ci śnienie 
pary substancji badanej powinny by ć znane, jak równie ż powinna 
być dostępna niezawodna metoda okre ślania ilościowego substancji 
w roztworach badanych o udokumentowanej wydajno ści i granicy 
określenia.  
Informacje dotycz ące substancji badanej, które mog ą być użyteczne 
w ustalaniu warunków badania, obejmuj ą: wzór strukturalny, czys ­
tość substancji, stabilno ść w świetle, stabilno ść w warunkach bada ­
nia, pKa, P  ow i wyniki badania szybkiej biodegradacji (zob. metoda 
C.4).  
1.5. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ło ważne, powinny by ć spełnione nast ępujące 
kryteria wykonania do świadczeń kontrolnych:  
— śmiertelno ść zwierząt rodzicielskich (samice  Daphnia ) nie prze ­
wyższa 20 % na koniec badania,  
— średnia liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na 
zwierzę rodzicielskie prze żywające na koniec badania wynosi 
≥ 60. 
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Aparatura  
Zbiorniki do bada ń i inna aparatura, która wchodzi w kontakt 
z roztworami badanymi, powinny by ć wykonane ca łkowicie ze 
szkła lub innego chemicznie oboj ętnego materia łu. Zbiornikami do 
badań będą zwykłe szklane zlewki.  
Ponadto wymagane s ą wszystkie lub kilka z nast ępujących sprz ętów: 
— miernik tlenu (z mikroelektrod ą lub innym odpowiednim wypo ­
sażeniem do pomiaru rozpuszczonego tlenu w próbkach o ma łej 
objętości), ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— odpowiedni aparat do kontroli temperatury,  
— pH metr,  
— wyposa żenie do okre ślenia twardo ści wody,  
— sprzęt do okre ślenia całkowitego w ęgla organicznego (TOC) 
w wodzie lub wyposa żenie do okre ślenia zapotrzebowania na 
chemiczny tlen (COD),  
— odpowiednia aparatura do kontroli parametrów światła i pomiaru 
intensywno ści oświetlenia.  
1.6.2.  Organizmy u żyte w badaniu  
Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu jest  Daphnia magna  
Straus. Inne gatunki  Daphnia  wykorzystuje si ę, zapewniaj ąc, że 
odpowiadaj ą właściwym kryteriom wa żności (kryterium wa żności 
dotyczące zdolno ści rozrodczej przy do świadczeniach kontrolnych 
powinny by ć właściwe w odniesieniu do gatunku  Daphnia ). Jeśli 
wykorzystane s ą inne gatunki  Daphnia,  muszą być one wyra źnie 
określone i ich wykorzystanie musi by ć uzasadnione.  
Najlepiej, aby klon by ł określony za pomoc ą genotypowania. 
Badania (1) wykaza ły, że zdolno ści reprodukcyjne klonu 
A (pochodz ącego z IRCHA we Francji) (3) konsekwentnie odpo ­
wiada kryterium wa żności średniej ≥ 60 potomstwa na rodzicielskie 
zwierzę przeżywające, gdy jest hodowane zgodnie z warunkami 
opisanymi w niniejszej metodzie. Jednak że inne klony s ą akcepto­
walne, pod warunkiem że wykazano że kultura  Daphnia  spełnia 
kryteria wa żności dotycz ące badania.  
Na początku badania zwierz ęta powinny by ć młodsze niż 24 godziny 
i nie musz ą być pierwszym potomstwem. Powinny one pochodzi ć ze 
zdrowej hodowli (tj. niewykazuj ące takich oznak stresu, jak wysoka 
śmiertelno ść, obecności samców i ephippia, opó źnień w produkcji 
pierwszego potomstwa, zwierz ąt odbarwionych itd.). Podstawowe 
zwierzęta muszą być utrzymywane w warunkach w łaściwych dla 
ich hodowli ( światło, temperatura, o środek, karmienie i ilo ść 
zwierząt na jednostk ę objętości), zbliżonych do tych stosowanych 
w badaniu. Je śli ośrodek hodowli  Daphnia  używany w badaniu 
różni się od rutynowego dla hodowli  Daphnia , jest dobr ą praktyką 
włączyć okres aklimatyzacji przed badaniem, zwykle oko ło trzech 
tygodni (tj. jedno pokolenie), aby zapobiec stresowi zwierz ąt rodzi­
cielskich.  
1.6.3.  Ośrodek badania  
Jest zalecane, aby w badaniu u żyć w pełni określony ośrodek. 
Umożliwia to zapobie żenie użyciu dodatków (np. wodorostów, 
ekstraktu ziemi itd.), które trudno scharakteryzowa ć, a w ten sposób 
poprawić możliwości standaryzacji mi ędzy laboratoriami. O środki 
Elendt M4 (4) i M7 (zob. dodatek 1) uznano za w łaściwe do tego 
celu. Są też akceptowane inne o środki odpowiednie w tym celu (np. 
(5)(6)) które dostarczaj ą zdolności dla hodowli  Daphnia  spełnienia 
kryteriów wa żności dotycz ących badania.  
Jeśli stosowane o środki zawieraj ą niezdefiniowane dodatki, powinny 
być one wyra źnie określone, a informacja o nich powinna by ć 
zawarta w sprawozdaniu z bada ń dotyczącym ich sk ładu, 
w szczególno ści w odniesieniu do zawarto ści węgla organicznego, 
mogącą wpływać na dostarczan ą dietę. Jest zalecane, aby ca łkowity 
węgiel organiczny (TOC) i/lub zapotrzebowanie na tlen chemiczny 
(COD) w przygotowanych dodatkach o środka podstawowego by ł 
ustalony i dokonany szacunek wynikowego udzia łu TOC/COD 
w ośrodku badanym. Zalecane jest aby poziomy TOC w o środku 
(tj. przed dodaniem alg) by ły poniżej 2 mg/l (7).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
W przypadku substancji badanych, zawieraj ących metale, istotne jest 
aby uwzgl ędniać, że właściwości ośrodka (np. twardo ść, zdolność 
chelatującą) mogą wpływać na toksyczno ść badanej substancji. 
Z tej przyczyny jest po żądany w pe łni zdefiniowany o środek. 
Jednakże obecnie jedynymi w pe łni zdefiniowanymi o środkami 
uznanymi za odpowiednie dla hodowli d ługoterminowej  Daphnia 
magna  są Elendt M4 i M7. Oba o środki zawieraj ą związek chela ­
tujący EDTA. Prace wykaza ły (2), że „oczywista toksyczno ść” 
kadmu jest ogólnie ni ższa, gdy badanie rozrodczo ści jest prowadzone 
w ośrodkach M4 i M7 ni ż w ośrodkach niezawieraj ących EDTA. M4 
i M7 dlatego nie s ą zalecane do bada ń substancji zawieraj ących 
metale, a inne o środki zawieraj ące znane środki chelatuj ące powinny 
być również unikane. W odniesieniu do substancji zawieraj ących 
metale mo że być wskazane u życie alternatywnego o środka, takiego 
jak na przyk ład odtworzona świeża twarda woda ASTM (7), która 
nie zawiera EDTA, z dodatkiem ekstraktu wodorostów (8). Ta kombinacja odtworzonej świeżej twardej wody ASTM i ekstraktu 
wodorostów jest tak że odpowiednia dla d ługoterminowej hodowli 
oraz badania  Daphnia magna  (2), chocia ż obserwuje si ę łagodne 
działanie chelatuj ące z powodu sk ładnika organicznego 
w dodanym ekstrakcie wodorostu.
 
Na początku i w trakcie trwania badania st ężenie rozpuszczonego 
tlenu powinno by ć powyżej 3 mg/l. Warto ść pH powinna by ć 
w zakresie 6–9 i zwykle nie powinna ró żnić się o więcej niż 1,5 
jednostki w ka żdym pojedynczym badaniu. Twardo ść powyżej 
140 mg/l (jako CaCO  3 ) jest zalecana. Badania na tym poziomie 
i powyżej wykaza ły zdolność rozrodcz ą w zgodno ści z kryteriami 
ważności (9)(10).  
1.6.4.  Roztwory u żyte w badaniu  
Roztwory u żyte o wybranych st ężeniach są zwykle przygotowywane 
przez rozcie ńczenie roztworu podstawowego. Zalecane jest przygo ­
towanie roztworów podstawowych przez rozpuszczenie substancji badanej w o środku badanym.
 
W niektórych przypadkach stosowanie rozpuszczalników organicz ­
nych lub dyspergatorów mo że być wymagane w celu uzyskania 
odpowiednio st ężonego roztworu podstawowego, ale nale ży dołożyć 
wszelkich stara ń, aby zapobiec u życiu takich materia łów. Przyk ła­
dami odpowiednich rozpuszczalników s ą aceton, etanol, metanol, 
dwumetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przyk ładami odpowied ­
nich dyspergatorów s ą Cremophor RH40, metyloceluloza 0,01 % 
i HCO-40. W ka żdym przypadku substancja badana w roztworach 
badanych nie powinna przekracza ć granicy rozpuszczalno ści 
w ośrodku badanym.  
Rozpuszczalniki s ą stosowane do wykonania roztworu podstawo ­
wego, który mo że być dozowany ściśle do wody. W zalecanym 
stężeniu rozpuszczalnika w ko ńcowym o środku badanym (tj. < 0,1 
ml/l) rozpuszczalniki wymienione powy żej nie będą toksyczne i nie 
mogą podnosić rozpuszczalno ści substancji w wodzie.  
Dyspergatory mog ą pomaga ć w dokładnej dawce i rozproszeniu. 
Przy zalecanym st ężeniu w ko ńcowym o środku badanym (< 0,1 
ml/l) dyspergatory wymienione powy żej nie będą toksyczne i nie 
będą podnosić rozpuszczalno ści substancji w wodzie.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. PROJEKT BADANIA  
Traktowanie powinno by ć rozdzielone do zbiorników do bada ń, 
a wszystkie nast ępujące czynno ści ze zbiornikami do bada ń powinny 
być prowadzone metod ą losową. Niezastosowanie si ę do tego mo że 
powodowa ć powstanie b łędów systematycznych, które mog ą być 
zinterpretowane jako wp ływ stężenia. W szczególno ści jeśli jednostki 
doświadczalne s ą obsługiwane wed ług traktowania lub st ężenia, 
wtedy niektóre zwi ązane z czasem skutki, takie jak zm ęczenie opera ­
tora lub inny b łąd mogą prowadzi ć do powa żniejszych skutków przy 
wyższych stężeniach. Ponadto, je śli na wyniki badania prawdopo ­
dobnie wp łyną początkowe lub środowiskowe warunki, takie jak 
położenie w laboratorium, nale ży rozważyć wykonanie badania 
blokowego.  
1.8. PROCEDURA  
1.8.1.  Warunki ekspozycji  
1.8.1.1.  Czas trwania  
Czas trwania badania wynosi 21 dni.  
1.8.1.2.  Załadunek  
Zwierzęta rodzicielskie s ą utrzymywane pojedynczo, jedno na 
zbiornik do bada ń, z 50–100 ml o środka w ka żdym zbiorniku.  
Większe objętości czasem s ą niezbędne do spe łnienia wymaga ń 
procedury analitycznej stosowanej do okre ślania stężenia substancji 
badanej, chocia ż zakładanie kopii w odniesieniu do analizy 
chemicznej jest te ż dopuszczalne. Je śli stosuje si ę objętości większe 
niż 100 ml, racje podawane  Daphnia  mogą wymaga ć zwiększenia 
w celu zapewnienia odpowiedniej dost ępności pożywienia 
i zgodności z kryteriami wa żności. W odniesieniu do bada ń przepły­
wowych alternatywne projekty mog ą być rozważane, z przyczyn 
technicznych (np. cztery grupy po 10 zwierz ąt w większej objętości 
badanej) lecz wszystkie zmiany projektu badania powinny by ć 
przedstawione.  
1.8.1.3.  Liczba zwierz ąt 
W odniesieniu do pó łstatycznych bada ń co najmniej 10 zwierz ąt jest 
trzymanych pojedynczo przy ka żdym stężeniu badanym i co 
najmniej 10 zwierz ąt trzymanych pojedynczo w seriach kontrolnych.  
W odniesieniu do bada ń przepływowych 40 zwierz ąt, podzielonych 
na grupy po 10 zwierz ąt w każdym stężeniu badanym, okaza ło się 
być odpowiednie (1). Mniejsza liczba organizmów badanych mo że 
być wykorzystana, a minimum 20 zwierz ąt na stężenie, podzielonych 
w dwie lub wi ęcej kopii z równ ą ilością zwierząt (np. cztery kopie 
każda z pięcioma  daphnid . Należy zauważyć, że w odniesieniu do 
badań, w których zwierz ęta są trzymane w grupach, nie jest mo żliwe 
wyrażenie zdolno ści rozrodczej jako ca łkowitej liczby żyjącego 
potomstwa wyprodukowanego na rodzicielskie zwierz ę, które żyje 
na końcu badania, je śli zwierzęta rodzicielskie zmar ły. W tych przy ­
padkach zdolno ść rozrodcza powinna by ć wyrażona jako „ca łkowita 
liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na rodzica obecnego 
na początku badania”.  
1.8.1.4.  Karmienie  
W odniesieniu do bada ń półstatycznych karmienie powinno by ć 
wykonywane najlepiej codziennie, lecz przynajmniej trzy razy na tydzień (tj. zgodnie z wymianami o środka). Odchylenia od tego 
(np. w odniesieniu do bada ń przepływowych) powinno by ć przed­
stawione.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
W czasie trwania badania dieta zwierz ąt rodzicielskich powinno 
składać się z żyjących komórek glonowych jednego lub wi ęcej 
z następujących typów:  Chlorella  sp.,  Selenastrum capricornutum  
(obecnie  Pseudokirchneriella subcapitata  (11)) i  Scenedesmus 
subspicatus.  Dostarczana dieta powinna by ć oparta na ilo ści węgla 
organicznego dostarczanego ka żdemu zwierz ęciu rodzicielskiemu. 
Badania (12) wykaza ły, że dla  Daphnia magna  poziomy racji 
między 0,1 i 0,2 mg C/ Daphnia /dzień są wystarczaj ące do uzyskania 
odpowiedniej liczby potomstwa spe łniającego kryteria wa żności. 
Racje dostarczane s ą jako sta ły wskaźnik poprzez czas badania 
albo, jeśli to jest po żądane, stosuj ąc niski wska źnik na pocz ątku 
i zwiększany w czasie trwania badania, uwzgl ędniając rozwój 
zwierząt rodzicielskich. W tym przypadku racje powinny nadal 
pozostawa ć w granicach zalecanego zakresu 0,1–0,2 mg C/ Daphnia /­
dzień przez ca ły czas.  
Jeśli mają być stosowane środki zast ępcze, takie jak ilo ść komórek 
glonowych lub absorpcja światła, do karmienia na wymaganym 
poziomie racji (tj. dla wygody poniewa ż pomiar zawarto ści węgla 
zabiera czas), ka żde laboratorium musi wykona ć swój własny nomo ­
gram odnosz ący się do zależności środka zast ępczego oraz zawar ­
tości węgla hodowli glonów (zob. dodatek 2 dotycz ący zalece ń 
odnoszących się do wykonania nomogramu). Nomogramy powinny 
być sprawdzane co najmniej corocznie i cz ęściej, gdy warunki 
hodowli glonów uleg ły zmianie. Odkryto, że absorpcja światła jest 
lepszą namiastk ą dla zawarto ści węgla niż ilość komórek (13).  
W celu zminimalizowania obj ętości kultur glonów dostarczanych do 
ośrodka zbiorników do bada ń Daphnia  powinny by ć karmione 
koncentratem glonów w no śniku. Stężenie glonów mo że być uzys­
kane przez odwirowanie zawiesiny w destylowanej albo dejonizo ­
wanej wodzie, z pierwotnej zawiesiny lub z o środka kultur  Daphnia . 
1.8.1.5.  Światło 
16 godzin światła przy intensywno ści nieprzekraczaj ącej 15–20 
uE · m  -2 · s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
Temperatura o środka badanego powinna by ć w zakresu 18–22  o C. 
Jednakże w odniesieniu do jednego badania nie mo że, jeśli to możli­
wie, różnić się o więcej niż 2 o C w ramach tych granic (np. 18–20, 
19–21 lub 20–22  o C). Właściwe mo że być użycie dodatkowego 
zbiornika badanego do celów monitorowania temperatury.  
1.8.1.7.  Napowietrzanie  
W czasie trwania badania zbiorniki do bada ń nie mog ą być napo­
wietrzane.  
1.8.2.  Stężenie użyte w badaniu  
Zwykle powinno by ć co najmniej pi ęć stężeń ułożonych w serii 
geometrycznej ze wska źnikiem odst ępu najlepiej nieprzekraczaj ącym 
3,2 oraz w łaściwej liczbie kopii dla ka żdego stężenia badanego (zob. 
pkt 1.8.1.3). Powinno by ć przedstawione uzasadnienie w przypadku 
zastosowania mniej ni ż pięciu stężeń. Nie powinny by ć badane 
substancje powy żej ich granicy rozpuszczalno ści w ośrodku bada ­
nym. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
W określaniu zakresu st ężeń należy uwzględnić do następuje:  
(i) jeśli celem jest uzyskanie LOEC/NOEC, najni ższe stężenie 
badane musi by ć wystarczaj ąco niskie, aby p łodność przy tym 
stężeniu nie by ła znacząco niższa niż w przy do świadczeniu 
kontrolnym. W innym przypadku badanie b ędzie musia ło być 
powtórzone ze zmniejszonym najni ższym stężeniem;  
(ii) jeśli celem jest uzyskanie LOEC/NOEC, najwy ższe stężenie 
badane musi by ć wystarczaj ąco wysokie, aby p łodność przy 
tym stężeniu była znacząco niższa niż w doświadczeniu kontro ­
lnym. W innym przypadku badanie b ędzie musia ło być powtó­
rzone ze zwi ększonym najwy ższym stężeniem;  
(iii) jeśli szacowane jest EC  X odnoszące się do skutków dotycz ących 
rozrodczo ści wskazane jest u życie wystarczaj ącego stężenia 
w celu okre ślenia EC  X z właściwym poziomem wiarygodno ści. 
Jeśli szacowany jest EC  50 odnoszące się do skutków dotycz ­ 
ących rozrodczo ści, wskazane jest, aby najwy ższe stężenie 
badane by ło wyższe niż ten EC  50 . Inaczej, cho ć będzie jeszcze 
możliwe oszacowanie EC  50 , przedzia ł ufności dla EC  50 będzie 
bardzo szeroki i nie b ędzie możliwe zadawalaj ące ocenienie 
odpowiednio ści dopasowanego modelu;  
(iv) zakres st ężeń badanych nie powinien obejmowa ć żadnych 
stężeń, które maj ą statystycznie znacz ący wpływ na prze życie 
dorosłych, poniewa ż powoduje to zmian ę charakteru badania 
z badania prostej rozrodczo ści na badanie z łożonej rozrodczo ści 
i śmiertelno ści, wymagaj ący bardziej z łożonej analizy staty ­
stycznej.  
Uprzednia wiedza dotycz ąca toksyczno ści substancji badanej (np. 
z badania ostrego i/lub bada ń szukania zakresu) powinna by ć 
pomocna w wyborze w łaściwych st ężeń badanych.  
W przypadku gdy rozpuszczalnik lub dyspergator stosowano do 
pomocy w przygotowaniu roztworów badanych (zob. pkt 1.6.4), ich końcowe stężenie w zbiornikach do bada ń nie powinno przekra ­
czać 0,1 ml/l oraz powinno by ć takie samo we wszystkich zbiorni ­
kach do bada ń.
 
1.8.3.  Do świadczenia kontrolne  
Do serii badanej dodatkowo musi by ć włączona jedna seria 
kontrolna badanego o środka oraz, je żeli to właściwe, jedna seria 
kontrolna zwieraj ąca rozpuszczalnik lub dyspergator. Gdy stosowany 
jest rozpuszczalnik lub dyspergator ich st ężenie powinno by ć takie 
samo jak u żywane w zbiornikach zawieraj ących substancj ę badaną. 
Należy użyć właściwą ilość kopii (zob. pkt 1.8.1.3).  
Ogólnie, w dobrze przebiegaj ącym badaniu wspó łczynnik zmian 
wokół średniej ilo ści żyjącego potomstwa produkowanego urodzo ­
nego na jedno rodzicielskie zwierz ę w doświadczeniu(-ach) kontro ­
lnym(-ch) powinna wynosi ć < 25 % oraz powinno to by ć przedsta­
wione w odniesieniu do projektów badania stosuj ącego pojedynczo 
trzymane zwierz ęta. 
1.8.4.  Odnawianie o środka użytego w badaniu  
Częstotliwość odnawiania o środka zale ży od stabilno ści substancji 
badanej, lecz powinna nast ępować co najmniej trzy razy na tydzie ń. 
Jeśli z wstępnego badania stabilno ści (zob. pkt 1.4) wynika, że 
stężenie substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem 
80–120 % nominalnego lub spada poni żej 80 % mierzonego st ężenia 
początkowego) poza maksymalnym okresem odnawiania (tj. trzy 
dni), nale ży rozważyć częstszą wymianę ośrodka lub zastosowania 
badania przep ływowego.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Gdy ośrodek jest wymieniany w badaniach pó łstatycznych, przygo ­
towuje się drugą serię zbiorników do bada ń, a zwierz ęta rodzicielskie 
są do nich przenoszone, na przyk ład szklan ą pipetą o odpowiedniej 
średnicy. Obj ętość ośrodka przenoszonego z  Daphnia  powinna by ć 
zminimalizowana.  
1.8.5.  Obserwacje  
Wyniki obserwacji dokonanych w trakcie trwania badania powinny 
być odnotowane w arkuszach danych (zob. przyk łady w dodatkach 3 
i 4). Jeśli inne pomiary s ą wymagane (zob. 1.3 i 1.8.8) dodatkowe 
obserwacje mog ą być wymagane.  
1.8.6.  Potomstwo  
Potomstwo wyprodukowane prze ka żde zwierz ę rodzicielskie 
powinno by ć usunięte i policzone codziennie od pojawienia si ę 
pierwszego potomstwa, w celu powstrzymania ich przed zjedzeniem pokarmu przeznaczonego dla doros łych. Do celów niniejszej metody 
potrzebne jest tylko liczenie ilo ści żyjącego potomstwa, lecz obec ­
ność przerwanych jaj lub martwego potomstwa powinna by ć także 
odnotowana.
 
1.8.7.  Śmiertelno ść 
Śmiertelno ść zwierząt rodzicielskich powinna by ć rejestrowana 
najlepiej codziennie, co najmniej w tych samych porach, gdy liczone 
jest potomstwo.  
1.8.8.  Inne parametry  
Chociaż niniejsza metoda jest przeznaczona zasadniczo do oceny 
skutków dotycz ących rozrodczo ści, możliwe jest, że inne efekty 
zostaną wystarczaj ąco określone, aby umo żliwić ich statystyczn ą 
analizę. Wysoce po żądane są pomiary rozwoju, poniewa ż dostarczaj ą 
one informacji dotycz ących mo żliwych skutków pod śmiertelnych, 
które mog ą być bardziej u żyteczne ni ż tylko sam pomiar rozrod ­
czości; pomiar d ługości zwierz ąt rodzicielskich (tj. d ługość ciała, 
wyłączając kolec odbytowy) jest zalecany na ko ńcu badania. Inne 
parametry do zmierzenia lub obliczenia obejmuj ą: czas do produkcji 
pierwszego potomstwa (i dalszego potomstwa), liczb ę i rozmiary 
potomstwa na zwierz ę, liczbę poronień, obecność samic lub ephippi ę 
oraz wewn ętrzny wska źnik przyrostu populacji.  
1.8.9.  Cz ęstotliwość analitycznych okre śleń i pomiarów  
Stężenie tlenu, temperatura, warto ści twardo ści i pH powinny by ć 
mierzone co najmniej raz tygodniowo, w świeżych i starych roztwo ­
rach, w kontrolnych i w najwy ższych stężeniach badanej substancji.  
W czasie trwania badania st ężenia substancji u żytej w badaniu s ą 
określane w regularnych odst ępach czasu.  
W półstatycznych badaniach, w przypadku gdy oczekuje si ę, że 
stężenie substancji pozostanie w zakresie ± 20 % nomina łu (tj. 
w zakresie 80–120 % – zob. pkt 1.4 i 1.8.4), jest zalecane, aby jako minimum analizowa ć najniższe i najwy ższe stężenia użyte 
w badaniu świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowieniem, 
po jednym w czasie trwania pierwszego tygodnia badania (tj. analizy powinny by ć dokonane na próbce z tego samego roztworu – gdy 
świeżo przygotowany i przy odnowieniu). Te okre ślenia powinny 
być powtarzane przynajmniej w odst ępach tygodniowych, 
w późniejszym czasie.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
W odniesieniu do bada ń, w których nie oczekuje si ę, że stężenie 
substancji u żytej w badaniu pozostanie w zakresie ± 20 % nomina łu, 
konieczne jest analizowanie wszystkich st ężeń po świeżym przygo ­
towaniu i przy odnowieniu. Jednak że w odniesieniu do tych bada ń, 
w których zmierzone pocz ątkowe stężenie nie jest w zakresie ± 20 % 
nominału, lecz gdy mog ą być dostarczone wystarczaj ące dowody 
wskazujące, że wstępne stężenia są powtarzalne i stabilne (tj. 
w zakresie 80–120 % st ężenia pocz ątkowego), oznaczenia chemiczne 
mogą być zmniejszone w tygodniu 2 i 3 badania do najwy ższego 
i najniższego stężenia badanego. We wszystkich przypadkach ozna ­
czenie st ężenia substancji u żytej w badaniu przed odnowieniem 
wymaga jedynie prowadzenia na jednym kopiowanym zbiorniku dla każdego stężenia badanego.
 
W odniesieniu do bada ń przepływowych w łaściwe jest u życie 
podobnego do opisanego dla bada ń półstatycznych, sposobu pobie ­
rania próbek (lecz pomiar „starych” roztworów nie jest stosowany w tym przypadku). Jednak że wskazane jest zwi ększenie ilo ści pobie­
ranych próbek podczas pierwszego tygodnia (np. trzy zestawy 
pomiarów) w celu zapewnienia, aby st ężenia badane pozosta ły stałe. 
W tego typu badaniach jednostka przep ływu rozcie ńczalnika 
i substancji badanej powinny by ć sprawdzane codziennie.
 
Jeśli istnieją dowody, że stężenie substancji badanej jest zadawa ­
lająco utrzymywane w granicach ± 20 % nominalnego lub zmierzo ­
nego pocz ątkowego st ężenia poprzez badanie, wtedy wyniki 
oparte są o nominalne lub zmierzone pocz ątkowe warto ści. Jeśli 
odchylenie od nominalnego lub zmierzonego st ężenia jest wi ększe 
niż ± 20 %, wyniki musz ą być wyrażone w średniej wa żonej czasu 
(zob. dodatek 5).  
2. DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Celem niniejszego badania jest ustalenie dzia łania substancji u żytej 
w badaniu na ca łkowitą liczbę żywego potomstwa wyprodukowa ­
nego na zwierz ę rodzicielskie, żyjące na koniec badania. Ca łkowita 
liczba potomstwa na zwierz ę rodzicielskie powinna by ć obliczona 
w odniesieniu do ka żdego badanego zbiornika (tj. kopii). Je śli 
w jakimś skopiowanym zbiorniku zwierze rodzicielskie zmar ło 
w czasie trwania badania lub okaza ło się samcem, to ta kopia jest 
wyłączona z analizy. Analiza jest wtedy oparta na zmniejszonej 
ilości kopii.  
W odniesieniu do oszacowania LOEC, a st ąd NOEC, w odniesieniu 
do skutków substancji chemicznych dotycz ących zdolno ści rozrod ­
czej, konieczne jest obliczenie średniej zdolno ści rozrodczej poprzez 
kopie dla ka żdego stężenia i złożonego pozosta łego standardowego 
odchylenia poprzez u życie analizy wariancji (ANOVA). Średnia 
w odniesieniu do ka żdego stężenia musi by ć porównana ze średnią 
doświadczenia kontrolnego, stosuj ąc właściwą metodę wielokrotnego 
porównania. U żyteczne s ą badania Dunnetta lub Williamsa (14)(15) ­
(16)(17). Koniecznie nale ży sprawdzi ć, czy za łożenie metody 
ANOVA homogeniczno ści odchylenia jest utrzymane. Jest zalecane, 
aby zosta ło to wykonane w sposób graficzny ni ż poprzez formalnie 
znaczące badanie (18); odpowiedni ą alternatyw ą jest przeprowa ­
dzenie badania Bartletta. Je śli to założenie nie jest utrzymane, nale ży 
rozważyć przekszta łcenie danych do shomogenizowania wariancji, 
przed przeprowadzeniem ANOVA albo przeprowadzi ć ważoną 
ANOVA. Zakres skutków wykrywalnych przy zastosowaniu 
ANOVA (tj. najmniej znacz ącej różnicy) powinien by ć obliczony 
i odnotowany.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Dla oszacowania st ężenia, które spowoduje 50 % zmniejszenia zdol ­
ności rozrodczej (tj. EC  50 ), odpowiednia krzywa, taka jak krzywa 
logistyczna powinna by ć dopasowana do danych, u żywając metodę 
statystyczn ą, taką jak najmniejszych kwadratów. Krzywa musi by ć 
sparametryzowana, tak aby EC  50 i jej błąd standardowy mo żna było 
obliczyć bezpośrednio. U łatwiałoby to obliczenie granic ufno ści 
w zakresie EC  50 . O ile istniej ą słuszne przyczyny, aby preferowa ć 
różne poziomy ufno ści, dwustronne 95 % granice ufno ści powinny 
być podawane. Procedura spasowania powinna zasadniczo dostar ­
czać środki oceny znaczenia braku spasowania. Mo że to być wyko­
nane graficznie lub przez podzielenie pozosta łej sumy kwadratów na 
„brak pasowania” i „czyste sk ładniki błędu”, a przeprowadzenie 
badania istotno ści w odniesieniu do braku spasowania. Poniewa ż 
obróbka daj ąca wysok ą płodność prawdopodobnie zapewni wi ększe 
odchylenie w ilo ści młodych osobników wyprodukowanych ni ż 
obróbka daj ąca niską płodność, muszą być podjęte rozważania do 
zważenia obserwowanych warto ści dla odzwierciedlenia ró żnych 
wariancji w ró żnych opracowywanych grupach (zob. podstawowe 
informacje w bibliografii (18)).  
W analizie danych z ko ńcowego badania obr ączkowego (2) spaso ­
wano krzyw ą logistyczn ą, posługując się następującym modelem, 
chociaż inny odpowiedni model mo że być użyty: 
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
gdzie:  
Y = ca łkowita liczba m łodych osobników na zwierz ę rodzicielskie 
żyjące na koniec badania (obliczone w odniesieniu ka żdego 
zbiornika),  
x = st ężenie substancji,  
c = oczekiwana ilo ść młodych osobników, gdy x = 0,  
x 0 = EC  50 w populacji,  
b = parametr nachylenia.  
Niniejszy model jest prawdopodobnie odpowiedni w du żej ilości 
sytuacji, ale s ą badania, dla których nie jest w łaściwy. Wa żność 
powyższego sugerowanego modelu powinna zosta ć sprawdzona. 
W niektórych przypadkach model hormesis, w którym niskie 
stężenia powoduj ą lepsze wyniki mo że być właściwy (19).  
Inne skutki st ężeń, takie jak EC  10 lub EC  20 , mogą również być 
oszacowane, chocia ż bardziej po żądane jest u życie różnej paramet ­
ryzacji modelu, z którego oszacowano EC  50 . 
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące dane:  
2.2.1.  Substancja u żyta w badaniu:  
— charakter fizyczny i stosowne w łaściwości fizykochemiczne,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— dane identyfikacji chemicznej, w łączając czystość. 
2.2.2.  Gatunki u żyte w badaniu:  
— klon (czy by ł typowany genetycznie), dostawca lub źródło (jeśli 
jest znane) i warunki stosowanej hodowli. Je śli użyto innego 
gatunku ni ż Daphnia  powinno to by ć przedstawione 
i uzasadnione.  
2.2.3.  Warunki badania:  
— stosowana procedura badania (np. pó łstatyczna lub przep ływowa, 
objętość, obciążenie w ilo ści Daphnia  na litr),  
— czas trwania na świetlania i intensywno ść światła, 
— projekt badania (np. ilo ść kopii, ilo ść rodziców na kopi ę), 
— szczegó łowe informacje dotycz ące kultur stosowanego o środka,  
— jeśli stosowano, dodatki materia łów organicznych, w łączając ich 
skład, źródło, metod ę przygotowania, TOC/COD preparatów 
podstawowych, oszacowanie wynik łego TOC/COD w o środku 
badanym,  
— szczegó łowe informacje o karmieniu, w łączając ilość (w mg C/ ­ 
Daphnia /dzień) i plan (np. typ karmy, w łączając dla glonów 
właściwą nazwę, gatunek i – je śli znany szczep – warunki 
kultur),  
— metoda przygotowania roztworów podstawowych i cz ęstotliwość 
odnawiania (musz ą być podane st ężenia rozpuszczalników 
i dyspergantów, je śli je użyto). 
2.2.4.  Wyniki:  
— wyniki ze wszystkich wst ępnych bada ń dotyczące stabilno ści 
substancji badanej,  
— nominalne st ężenia badane i wyniki wszystkich analiz ustalaj ­ 
ących stężenia substancji badanej w zbiornikach do bada ń (zob. 
przykładowy arkusz danych w dodatku 4); zdolno ść wyjściową 
metody i granice oznaczania powinny by ć również przedsta ­
wione,  
— jakość wody w zbiornikach do bada ń (tj. pH, temperatura, 
stężenie rozpuszczonego tlenu, TOC i/lub COD oraz twardo ść, 
tam gdzie to ma zastosowanie) (zob. przyk ładowy arkusz danych 
w dodatku 3),  
— pełny zapis żyjącego potomstwa ka żdego zwierz ęcia rodziciel ­
skiego (zob. przyk ładowy arkusz danych w dodatku 3),  
— ilość zgonów mi ędzy zwierz ętami rodzicielskimi i data kiedy 
nastąpiły (zob. przyk ładowy arkusz danych w dodatku 3),  
— współczynnik rozrzutu dla kontroli p łodności (oparty na ca łko­
witej ilości żyjącego potomstwa na ilo ść żywych pod koniec 
badania zwierz ąt rodzicielskich),  
— wykres ca łkowitej liczby żyjącego potomstwa na zwierz ę rodzi­
cielskie (w odniesieniu do ka żdej kopi) żyjące na koniec badania 
w zależności od stężenia substancji badanej,  
— najniższy obserwowany skutek st ężenia (LOEC) dla rozrod ­
czości, włączając opis zastosowanych procedur statystycznych 
i wskazanie zakresu skutków jaki jest wykrywany oraz nie obser ­
wowany skutek st ężenia (NOEC) dla rozrodczo ści; gdzie 
stosowne, nale ży także przedstawi ć LOEC/NOEC 
w odniesieniu do śmiertelno ści zwierz ąt rodzicielskich,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— tam gdzie to jest stosowne, ECX w odniesieniu do rozrodczo ści 
i przedzia łów zaufania oraz wykres dopasowanego modelu 
użytego do oblicze ń, nachylenie krzywej dawka – reakcja i jej 
błąd standardowy,  
— inne obserwowane skutki biologiczne lub pomiary: przedsta ­
wienie wszystkich innych biologicznych skutków zaobserwowa ­
nych lub pomierzonych (np. rozwój zwierz ąt rodzicielskich) 
włączając właściwe uzasadnienie,  
— wytłumaczenie wszystkich odchyle ń od metody badania.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the  Daphnia magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V M. and 
Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257–265.
 
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An 
ultrastructural approach to antennal damage in  Daphnia 
magna  Straus. Protoplasma, 154, pp. 25–33.  
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of 
Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber 
(ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
 
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring 
waters as standard medium for culturing  Daphnia magna.  Bull. 
Environ. Contain. Toxicol., 47, pp. 775–782.  
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity 
Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P. A. 20 pp.  
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
Daphnia magna  Straus for use in ecotoxicological tests; 
problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European 
Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Lokke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144–148.
 
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
ducibility of a life-cycle toxicity test with  Daphnia magna.  
Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1–8.  
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two 
cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185–196.
 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
1990. Biologice Prace, 36, 209.  
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward 
a standard  Daphnia  juvenile production test. Environmental 
Toxicology and Chemistry, 12, pp. 2053–2058.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1260
 
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the 
relationship between total organic carbon with three commonly 
used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459–466.
 
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc, 50, pp. 1096–1121.  
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.  
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, pp. 103–117.  
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510–531.  
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, pp. 93–96.  
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, 
pp. 532.  
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 
1156–1166.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
DODATEK 1  
PRZYGOTOWANIE W PE ŁNI ZDEFINIOWANYCH O ŚRODKÓW 
ELENDT M7 I M4  
Aklimatyzacja do o środków Elendt M7 i M4  
Niektóre laboratoria do świadczyły trudno ści w bezpo średnim przeniesieniu  
Daphnia  do ośrodków M4 (1) i M7. Jednak że pewien sukces zosta ł osiągnięty 
ze stopniow ą aklimatyzacj ą, tj. zastępując własny ośrodek najpierw 30 % Elendt, 
następnie do 60 % Elendt, a nast ępnie do 100 % Elendt. Okresy czasu potrzebne 
do aklimatyzacji mog ą trwać do jednego miesi ąca. 
PRZYGOTOWANIE  
Mikroelementy  
Odrębne roztwory podstawowe (I) poszczególnych mikroelementów s ą uprzednio 
przygotowywane w wodzie o odpowiedniej czysto ści, np. dejonizowanej, desty ­
lowanej lub odwróconej osmozie. Z tych ró żnych roztworów podstawowych (I) 
jest przygotowywany drugi pojedynczy roztwór podstawowy (II), który zawiera 
wszystkie mikroelementy (po łączony roztwór), np.:  
Roztwór podstawowy I 
(pojedyncze substancje) Ilość dodana do 
wody 
(mg/l) Stężenie (w 
stosunku do 
ośrodka M4) 
(krotność) Do przygotowania po łączonego 
roztworu podstawowego II doda ć 
następującą ilość roztworu 
podstawowego I do wody 
(ml/l) 
M 4 M 7 
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
KI 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA * 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Oba roztwory Na  2 EDTA i FeSO  2 przygotowano oddzielnie, zlane razem 
i niezwłocznie autoklawowane. To daje: 
21 Fe-EDTA roztwór 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Ośrodki M4 i M7  
Ośrodki M4 i M7 s ą przygotowane przy u życiu roztworu podstawowego II, 
makrosubstancje od żywcze i witaminy, jak nast ępuje:  
Ilość dodana do 
wody 
(mg/l) Stężenie (w 
stosunku do 
ośrodka M4) 
(krotność) Ilość roztworu podstawowego do 
przygotowania o środka 
(ml/1) 
M 4 M 7 
Roztwór podstawowy II po łączone mikroele ­
menty 20 50 50 
Makro-od żywcze roztwory podstawowe (pojedy ńcze substancje) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Roztwór zwi ązany witamin — 10 000 0,1 0,1 
Podstawowy roztwór zwi ązany witamin przygotowano poprzez dodanie 3 witamin 
do 1 litra wody jak wskazano poni żej: 
Hydrochlorek tiaminy 750 10 000 — — Cyjanocobalamina (B1
 2 ) 10 10 000 — — 
Biotyna 7,5 10 000 — —  
Wsad połączonych witamin jest przechowywany w zamro żeniu w ma łych podwielokrotno ściach. Witaminy s ą dodawane do o środka 
krótko przed u życiem.  
Uwagi  Aby zapobiec wytr ącaniu się soli przy przygotowaniu kompletnego o środka, doda ć podwielokrotno ści roztworów podstawowych 
do około 500-800 ml dejonizowanej wody a nast ępnie dope łnić do 1 litra. 
Pierwszą publikacj ę o ośrodku M4 mo żna znaleźć w, B.P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructural approach 
to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
DODATEK 2  
ANALIZA CA ŁKOWITEGO W ĘGLA ORGANICZNEGO (TOC) 
I WYKONANIE NOMOGRAMU ZAWARTO ŚCI TOC W POKARMIE 
GLONOWYM  
Należy uwzględnić, że zawarto ść węgla w pokarmie glonowym nie b ędzie 
mierzona bezpo średnio, ale z korelacji (tj. nomogramów) z pomiarami zast ęp­
czymi, takimi jak ilo ść komórek glonowych lub absorbancja światła. 
TOC powinien by ć zmierzony raczej wysokotemperaturowym utlenieniem ni ż 
ultrafioletem lub metod ą nadsiarczanow ą. (Zob. The Instrumental Determination 
of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
 
Dla wykonania nomogramu glony powinny by ć oddzielone od o środka rozwoju 
poprzez odwirowanie nast ępujące po ponownym utworzeniu zawiesiny w wodzie 
destylowanej. Pomiar zast ępczego parametru i st ężenia TOC w ka żdej potrojonej 
próbce. Destylowana woda jako ślepa próba powinna by ć zanalizowana, 
a stężenie TOC wydedukowane ze st ężenia próbki glonów o danym TOC.  
Nomogram musi by ć liniowy ponad wymagany zakres st ężenia węgla. Przyk łady 
pokazano poni żej. 
Uwaga: Nie powinno to by ć zastosowane do konwersji; istotne jest, aby labora ­
torium przygotowa ło swoje w łasne nomogramy.
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
DODATEK 3  
PRZYKŁADOWY ARKUSZ DANYCH ZAPISU WYMIANY O ŚRODKA, DANYCH FIZYKO-CHEMICZNYCH MONITOROWANIA, KARMIENIA, ROZRODCZO ŚCI DAPHNIA 
I ŚMIERTELNO ŚCI DOROS ŁYCH  
Doświadczenie nr: Data rozpocz ęcia: Klon: O środek: Typ pokarmu Substancja badana: St ężenie nominalne 
Dzień 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Odnawianie o środka 
(takt) 
PH (  1 ) nowy 
stary 
O 2 mg/l (  1 ) nowy 
stary 
Temperatura (  o C) (  1 ) nowy 
stary 
Żywność dostar­
czona (takt) 
Nie żywe 
potomstwo (  2 ) Całk owity 
zbiornik 1 
2 
3 
4 5
 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Doświadczenie nr: Data rozpocz ęcia: Klon: O środek: Typ pokarmu Substancja badana: St ężenie nominalne 
Dzień 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Całko wity 
Skumulowana śmiertelno ść 
dorosłych (
 3 ) 
( 1 ) Wskazuje, który zbiornik by ł użyty w do świadczeniu. 
( 2 ) Zapis śmiertelno ści wszystkich doros łych zwierz ąt jako „M” w stosownym okienku. 
( 3 ) Zapis przerw wyl ęgu jako „AB” w stosownym okienku.
 DODATEK 4  
PRZYKŁADOWY ARKUSZ DANYCH DOTYCZ ĄCYCH ZAPISU WYNIKÓW ANALIZY CHEMICZNEJ  
a) Pomierzone st ężenia  
Stężenie Próbka tydzie ń 1 Próbka tydzie ń 2 Próbka tydzie ń 3 
Świeża Stara Świeża Stara Świeża Stara  
b) Pomierzone st ężenia jako procent nomina łu 
Stężenie nomi ­
nalne Próbka tydzie ń 1 Próbka tydzie ń 2 Próbka tydzie ń 3 
Świeża Stara Świeża Stara Świeża Stara  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
DODATEK 5  
OBLICZANIE ŚREDNIEJ WA ŻONEJ CZASU  
Średnia wa żona czasu  
Podane st ężenie substancji badanej mo że wypaść w okresie czasu mi ędzy odna ­
wianiami o środka, dlatego konieczne jest, aby uwa żać, które st ężenie powinno 
być wybrane jako reprezentatywne w zakresie st ężeń doświadczanych przez 
dorosłe Daphnia.  Wybór powinien by ć oparty na zarówno rozwa żaniach biolo ­
gicznych, jak i statystycznych. Na przyk ład, jeśli sądzi się, że rozrodczo ść 
podlega do świadczalnie g łównie maksymalnemu st ężeniu, wtedy nale ży użyć 
maksymalnego st ężenia. Jednak że jeśli skumulowane lub d ługoterminowe dzia ­ 
łanie substancji toksycznej jest uznawane za najwa żniejsze, wtedy bardziej 
właściwe jest średnie stężenie. W takim przypadku, stosown ą średnią do zasto ­
sowania jest czasowo wa żona średnia stężenia, poniewa ż uwzględnia zmiany 
w chwilowym st ężeniu czasowym.  
Rysunek 1:  
Przykład średniej wa żonej czasu
  
Rysunek 1 wskazuje przyk ład (uproszczony) badania trwaj ącego siedem dni 
z odnowieniem o środka w dniach 0, 2 i 4.  
Cienka zygzakowata linia przedstawia st ężenie w ka żdym punkcie czasu. Spadek 
stężenia ocenia si ę jako proces wyk ładniczy zanikaj ący. 
Sześć wykreślonych punktów przedstawia pomierzone st ężenia na pocz ątku i na 
końcu czasu ka żdego odnowienia.  
Gruba linia pokazuje po łożenie czasowo wa żonej średniej.  
Średnia wa żona czasu jest obliczana tak, aby powierzchnia pod średnią ważoną 
była równa powierzchni pod krzyw ą stężenia. Obliczenia w odniesieniu do 
powyższego przyk ładu zilustrowano w tabeli 1.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Tabela 1  
Obliczanie średniej wa żonej czasu  
Odnowienie nr Dni Conc0 Conc1 Ln(Conc0) Ln(Conc1) Powierzchnia  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Suma dni: 7 Suma 
powierzchni 50,091 
Średnia TW 7,156
 
Dni jest ilością dni w okresie odnowienia.  
Conc0  jest zmierzonym st ężeniem na pocz ątku każdego okresu odnowienia.  
Conc1  jest zmierzonym st ężeniem na ko ńcu każdego okresu odnowienia.  
Ln(Conc0)  jest naturalnym logarytmem st ężenia 0.  
Ln(Conc1)  jest naturalnym logarytmem st ężenia 1.  
Powierzchnia  jest powierzchni ą pod krzyw ą wykładniczą dla każdego okresu odnowienia. 
Jest obliczona za pomoc ą: 
powierzchnia ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
lnðConc 0Þ Ä lnðConc 1Þ Ü dni 
Średnia wa żona czasu ( średnia  TW) jest  całkowitą powierzchni ą podzielon ą 
przez  sumę dni. 
Oczywiście odniesieniu do badania rozrodczo ści Daphnia  tabela musi by ć 
rozszerzona, aby obj ąć 21 dni.  
Jest wiadome, że gdy podejmuje si ę obserwacj ę tylko na pocz ątku i na ko ńcu 
każdego okresu odnawiania, nie jest mo żliwe stwierdzenie, że proces spadku jest 
rzeczywiście gwałtowny. Ró żne krzywe powstaj ą przy różnych obliczeniach dla 
„powierzchni”. Jednak że wykładniczy proces zanikaj ący nie jest nieprawdopo ­
dobny oraz jest prawdopodobnie najlepsz ą krzywą do zastosowania wobec braku 
innych informacji.  
Wymagana jest jednak uwa żna praca, je śli analiza chemiczna nie odkryje jakiej ś 
substancji na ko ńcu okresu odnowienia. O ile mo żliwe jest oszacowanie jak 
szybko substancja znikn ęła z roztworu, niemo żliwe jest uzyskanie rzeczywistej 
powierzchni pod krzyw ą, a stąd niemożliwe jest uzyskanie wiarygodnej średniej 
ważonej czasu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIA PRZEMIAN 
AZOTU  
1. METODA  
Ta metoda jest równowa żna OECD TG 216 (2000).  
1.1 WPROWADZENIE  
Ta metoda badawcza opisuje laboratoryjn ą metodę opracowan ą do 
badania d ługookresowych skutków jednorazowego wystawienia na 
działanie środków chemicznych dla aktywno ści mikroorganizmów 
glebowych zwi ązanej z przemianami azotu. To badanie jest oparte 
głównie na zaleceniach Europejskiej i Śródziemnomorskiej Organi ­
zacji Ochrony Ro ślin (1). Jednak że inne wytyczne, w tym wytyczne 
German Biologische Bundesanstalt (2), Ameryka ńskiej Agencji 
Ochrony Środowiska (3) SETAC (4) i Mi ędzynarodowej Organizacji 
Normalizacyjnej (5), tak że zostały wzięte pod uwag ę. W czasie 
warsztatów OECD na temat Selekcji Gleb/Osadów, maj ących 
miejsce w Belgirate we W łoszech w 1995 (6), ustalono ilo ść 
i rodzaj gleb stosowanych w tym badaniu. Zalecenia w sprawie pobierania, przenoszenia i przechowywania próbek gleby s ą oparte 
na wytycznych metodycznych wed ług ISO (7) i zaleceniach 
z warsztatów w Belgirate. W ocenie i interpretacji toksycznych 
właściwości badanej substancji mo że być wymagane okre ślenie 
skutków dzia łania dla aktywno ści mikrobiologicznej, np. je żeli są 
wymagane dane na temat potencjalnych efektów ubocznych dzia ­ 
łania środków ochrony upraw na mikroflor ę glebową lub jeżeli 
spodziewane jest wystawienie mikroorganizmów na dzia ł
anie 
związków chemicznych innych ni ż środki ochrony upraw. Badanie 
przemiany azotu jest prowadzone w celu okre ślenia wpływu dzia ­ 
łania takich zwi ązków chemicznych na mikroflor ę. Jeżeli badane s ą 
substancje agrochemiczne (np. środki ochrony upraw, nawozy, 
związki chemiczne stosowane w le śnictwie), to s ą prowadzone 
zarówno badania przemiany azotu, jak i w ęgla. Jeżeli badane s ą 
substancje nieagrochemiczne, wystarczaj ące jest badanie przemian 
azotu. Jednak że, jeżeli warto ści EC  50 w badaniach przemiany 
azotu znajd ą się w zakresie, w którym taki zwi ązek chemiczny 
uznaje się za dostępny w handlu inhibitor nitryfikacji (np. nitropiry ­
na), można przeprowadzi ć badania przemian azotu w celu uzyskania 
dodatkowych informacji.  
Gleby sk ładają się ze składników o żywionych i nieo żywionych, 
które wyst ępują w złożonych i heterogenicznych mieszaninach. 
Mikroorganizmy odgrywaj ą istotną rolę w rozkładzie i przemianie 
materii organicznej w żyznych glebach, gdzie wiele gatunków przy ­
czynia się do różnych aspektów żyzności gleby. Jakikolwiek d ługoo­
kresowy wp ływ na procesy biochemiczne mo że potencjalnie zak łócić 
obieg substancji biogennych, a to mo że zmienić żyzność gleb. Prze ­
miany w ęgla i azotu wyst ępują we wszystkich żyznych glebach. 
Pomimo że biocenozy bakteryjne ró żnią się w poszczególnych 
rodzajach gleb, szlaki przemian s ą w zasadzie takie same.  
Ta opisana metoda badawcza jest przeznaczona do wykrywania 
długookresowych niepomy ślnych skutków dzia łania substancji na 
procesy przemiany azotu w natlenionych powierzchniowych warstwach gleb. Metoda badawcza pozwala tak że na okre ślenie 
skutków dzia łania substancji na przemiany w ęgla przez mikroflor ę 
glebową. Tworzenie azotanów ma miejsce po degradacji wi ązań 
węgiel-azot. Z tego powodu, je żeli zostan ą stwierdzone jednakowe 
tempa produkcji azotu w glebie badanej i kontrolnej, istnieje wysokie prawdopodobie ństwo, że główne szlaki degradacji w ęgla 
są nienaruszone i funkcjonalne. Substrat wybrany do bada ń (sprosz­
kowana m ączka z lucerny) ma korzystny stosunek w ęgla do azotu 
(na ogół pomiędzy 12/1 a 16/1). Z tego powodu ograniczony zostaje 
deficyt w ęgla podczas badania, a je żeli w wyniku dzia łania związku 
chemicznego zostan ą uszkodzone biocenozy bakteryjne, mog ą się 
odtworzy ć w ciągu 100 dni.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Badania, na podstawie których zasta ła opracowana ta metoda badaw ­
cza, były na pocz ątku przeznaczone dla substancji, dla których 
można było przewidzie ć ich ilość będącą w kontakcie z gleb ą. Tak 
się dzieje, na przyk ład, w przypadku środków ochrony upraw, gdzie 
znana jest ich ilo ść podawana w terenie. Dla substancji agrochemicz ­
nych wystarczaj ące jest badanie dwóch dawek odpowiadaj ących 
ilości podanej lub przewidywanej. Substancje agrochemiczne mog ą 
być badane jako aktywne dodatki (a.i.) lub jako gotowe produkty. 
Jednakże badanie nie jest ograniczone do substancji agrochemicz ­
nych. Zmieniaj ąc zarówno ilo ści substancji badanej podanej do 
gleby, jak i sposób interpretacji wyników, badania mog ą być stoso­
wane do substancji chemicznych, których przewidywana ilo ść prze­
chodząca do gleby jest nieznana. Wobec tego dla substancji 
chemicznych innych ni ż agrochemiczne okre śla się wpływ różnych 
stężeń na przemiany azotu. Wyniki tych bada ń są wykorzystywane 
do przygotowania krzywej zale żności dawka-odpowied ź i obliczenia 
wartości EC  x , gdzie x zdefiniowano jako % oddzia ływania.  
1.2. DEFINICJE  
Przemiany azotu:  to ostateczna degradacja materii organicznej 
zawierającej azot, w wyniku dzia łania mikroorganizmów, poprzez 
procesy amonifikacji i nitryfikacji, do odpowiednich nieorganicznych 
produktów ko ńcowych azotanowych.  
EC x (stężenie efektywne):  to stężenie substancji badanej w glebie, 
które powoduje x procentow ą inhibicję przemian azotu do azotanu.  
EC 50 (mediana st ężenia efektywnego):  stężenie substancji w glebie, 
które powoduje 50-procentow ą (50 %) inhibicj ę przemian azotu do 
azotanu.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  
1.4. ZASADA METODY BADANIA  
Przesiana gleba jest wzbogacona sproszkowan ą mączką roślinną 
i albo poddawana dzia łaniu badanej substancji, albo pozostawiona 
nienaruszona (próbka kontrolna). Je żeli badane s ą substancje agro ­
chemiczne, zaleca si ę stosowanie przynajmniej dwóch st ężeń 
i powinny one by ć wybrane w odniesieniu do najwy ższego stężenia, 
jakie może występować w terenie. Po 0, 7, 14 dniach i po 28 dniach 
inkubacji próbki gleby badanej i kontrolnej s ą ekstrahowane odpo ­
wiednim rozpuszczalnikiem i oznaczane s ą ilości azotanów 
w ekstraktach. Tempo wytwarzania azotanów w próbce badanej jest porównywane z tempem w próbce kontrolnej i obliczane jest 
odchylenie procentowe mi ędzy próbk ą badaną a kontroln ą. 
Wszystkie badania s ą prowadzone przynajmniej przez 28 dni. Je żeli 
28 dnia ró żnice pomi ędzy glebami badanymi a kontrolnymi b ędą 
równe lub wi ększe niż 25 %, badania s ą kontynuowane przez 
maksymalnie 100 dni. Je żeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, 
do próbek gleby dodawana jest seria st ężeń badanej substancji 
i mierzone s ą ilości wytworzonych azotanów w próbce badanej 
i kontrolnej po 28 dniach inkubacji. Wyniki bada ń z wieloma st ęż
e­
niami są analizowane przy u życiu modelu regresyjnego i obliczane 
są wartości EC  x (to jest EC  50 , EC  25 i/lub EC  10 ). Zob. definicje.  
1.5. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Oceny wyników bada ń substancji agrochemicznych s ą oparte na 
stosunkowo niewielkich ró żnicach ( średnia warto ść ± 25 %) 
pomiędzy stężeniem azotanów w kontrolnych i badanych próbkach 
gleby, wi ęc duże różnice próbek kontrolnych mog ą prowadzi ć do 
fałszywych wyników. Z tego powodu odchylenia pomi ędzy powtó ­
rzeniami próbek kontrolnych powinny by ć mniejsze ni ż ± 15 %.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Aparatura  
Stosowane s ą pojemniki z materia łów chemicznie oboj ętnych. 
Powinny one mie ć odpowiedni ą pojemno ść zgodnie z procedur ą 
stosowaną do inkubacji gleb, to jest inkubacji w masie lub jako 
serii pojedynczych próbek gleby (zob. sekcja 1.7.1.2). Powinno si ę 
zwrócić uwagę na minimalizacj ę utraty wody i umo żliwienie 
wymiany gazów podczas badania (np. pojemniki do bada ń mogą 
być przykryte perforowan ą folią polietylenow ą). Jeżeli badane s ą 
substancje lotne, powinno si ę stosowa ć pojemniki umo żliwiające 
uszczelnienie i gazoszczelne. Powinny by ć takiej wielko ści, aby 
około jednej czwartej ich obj ętości było wypełnione próbk ą gleby.  
Stosowane jest nast ępujące standardowe wyposa żenie laboratoryjne:  
— mieszad ło: mechaniczna wytrz ąsarka lub urz ądzenie podobne,  
— wirówka (pojemno ść 3 000g) lub filtr (stosuj ąc papier bezazota ­
nowy),  
— instrument o odpowiedniej czu łości i powtarzalno ści do analizy 
azotanów.  
1.6.2.  Wybór i ilo ść rodzajów gleb  
Stosowany jest jeden rodzaj gleb. Zalecanymi w łasnościami 
gleby są: 
— zawarto ść piasku: nie mniej ni ż 50 % i nie wi ęcej niż 75 %,  
— pH: 5,5–7,5,  
— zawarto ść węgla organicznego: 0,5–1,5 %,  
— powinna zosta ć zmierzona mikrobiologiczna biomasa (8)(9) i jej 
zawartość węgla powinna wynosi ć przynajmniej 1 % ca łkowitej 
masy węgla organicznego w glebie.  
Przeważnie, gleby o takich w łasnościach stanowi ą najgorszy przypa ­
dek, poniewa ż adsorpcja badanej substancji chemicznej jest mini ­
malna, a jej dost ępność dla mikroflory maksymalna. Wynika 
z tego, że badania innych gleb s ą na ogół niepotrzebne. Jednak że 
w pewnych okoliczno ściach, to jest gdy przewiduje si ę, że substancja 
badana będzie stosowana g łównie w okre ślonych glebach, takich jak 
kwaśne gleby le śne lub dla substancji chemicznych z ładunkiem 
elektrostatycznym, mo że być konieczne zastosowanie dodatkowych 
rodzajów gleb.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Pobieranie i przechowywanie próbek gleby  
1.6.3.1.  Pobieranie  
Powinny by ć dostępne szczegó łowe informacje na temat historii 
obszaru, z jakiego zosta ła pobrana badana próbka gleby. Szczegó ­ 
łowe informacje powinny obejmowa ć dokładną lokalizacj ę, szatę 
roślinną, daty poddania dzia łaniu środków ochrony upraw, podanie 
nawozów organicznych lub nieorganicznych, dodanie materia łów 
biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Obszar wybrany 
do pobrania gleby powinien umo żliwiać długookresowe u żytkowa­
nie. Odpowiednie do tego s ą stałe pastwiska, pola okresowo zasie ­
wane zbo żami (z wyj ątkiem kukurydzy) lub g ęsto nawo żone 
zielonką. Wybrany obszar do pobierania próbek nie powinien by ć 
poddawany dzia łaniu produktów ochrony upraw przez co najmniej 
jeden rok przed pobraniem próbek. Nie powinno si ę również 
podawać żadnych nawozów organicznych przez co najmniej sze ść 
miesięcy. Stosowanie nawozów mineralnych jest dozwolone tylko 
wtedy, gdy jest zgodne z wymogami upraw i próbki gleby nie powinny by ć pobierane przez co najmniej trzy miesi ące po podaniu 
nawozu. Nale ży unikać stosowania gleb poddanych dzia łaniu 
nawozów o znanym dzia łaniu biologicznym (np. cyjanamid wapnia).
 
Pobierania próbek nale ży unikać podczas lub bezpo średnio po d łuż­
szych okresach (przekraczaj ących 30 dni) suszy lub zalania wod ą. 
Dla gleb zaoranych, próbki powinny by ć pobierane z g łębokości od 
0 do 20 cm. Dla łąk (pastwisk) lub innych gleb, które nie s ą orane 
przez dłuższy czas (przynajmniej jeden sezon wegetacyjny), maksy ­
malna głębokość pobierania próbek mo że być nieco wi ększa niż 
20 cm (np. do 25 cm).  
Próbki gleb powinny by ć transportowane przy u życiu odpowiednich 
pojemników i w warunkach temperaturowych gwarantuj ących, że 
początkowe własności gleby nie zostan ą znacząco zmienione.  
1.6.3.2.  Przechowywanie  
Preferuje si ę stosowanie gleb świeżo zebranych. Je żeli nie mo żna 
uniknąć przechowywania w laboratorium, gleba mo że być przecho­
wywana w ciemno ści w temperaturze 4 ± 2  o C przez maksymalnie 
trzy miesi ące. Należy zapewni ć warunki do napowietrzania gleby 
podczas jej przechowywania. Je żeli gleby s ą pobierane z obszarów, 
które zamarzaj ą przez przynajmniej trzy miesi ące w roku, mo żna 
wziąć pod uwag ę przechowywanie przez sze ść miesięcy 
w temperaturze od minus 18  o C do minus 22  o C. Mikrobiologiczna 
biomasa przechowywanych gleb jest mierzona przed ka żdym 
eksperymentem i zawarto ść węgla w biomasie powinna wynosi ć co 
najmniej 1 % ca łkowitej zawarto ści węgla organicznego w glebie 
(zob. sekcja 1.6.2).  
1.6.4.  Post ępowanie i przygotowanie gleby do bada ń 
1.6.4.1.  Inkubacja wst ępna 
Jeżeli gleba by ła przechowywana (zob. sekcja 1.6.4.2), zalecana jest 
wstępna inkubacja przez okres 2–28 dni. Temperatura i zawarto ść 
wilgoci w glebie podczas wst ępnej inkubacji powinny by ć podobne 
do tych, jakie b ędą w czasie badania (zob. sekcje 1.6.4.2 i 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2  Właściwości fizyczno-chemiczne  
Z gleby usuwane s ą ręcznie większe obiekty (to jest kamienie, cz ęści 
roślin itp.) i jest przesiewana na wilgotno, bez nadmiernego wysu ­
szenia do ziarnisto ści mniejszej lub równej 2 mm. Zawarto ść wilgoci 
w próbce gleby powinna zosta ć zwiększona przy u życiu wody desty ­
lowanej lub dejonizowanej do warto ści pomiędzy 40 a 60 % maksy ­
malnej pojemno ści wodnej.  
1.6.4.3.  Wzbogacanie substratem organicznym  
Gleba powinna zosta ć wzbogacona odpowiednim substratem orga ­
nicznym, np. m ączką części zielonych lucerny (g łówny komponent 
to Medicago sativa ) ze stosunkiem C/N od 12/1 do 16/1. Zalecany 
jest dodatek lucerny do gleby w ilo ści 5 g lucerny na kilogram gleby 
(sucha masa).  
1.6.5.  Przygotowanie substancji badanej do podania do gleby  
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przy u życiu nośnika. 
Nośnikiem mo że być woda (dla substancji rozpuszczalnych 
w wodzie) lub oboj ętne ciało stałe, takie jak drobnoziarnisty piasek 
kwarcowy (rozmiar ziaren 0,1–0,5 mm). Nale ży unikać nośników 
ciekłych innych ni ż woda (np. organiczne rozpuszczalniki, takie 
jak aceton, chloroform), poniewa ż mogą niszczyć mikroflor ę. Jeżeli 
stosowanym no śnikiem jest piasek, mo że on być powleczony badan ą 
substancją rozpuszczon ą lub zawieszon ą w odpowiednim rozpusz ­
czalniku. W takich przypadkach przed wymieszaniem z gleb ą należy 
usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie. Dla zachowania optymal ­
nego rozk ładu substancji badanej w glebie zaleca si ę stosowanie 10 
g piasku na kilogram gleby (w suchej masie). Próbki kontrolne s ą 
poddawane dzia łaniu równowa żnej ilości tylko wody i/lub piasku 
kwarcowego.  
Jeżeli badane s ą lotne substancje chemiczne, powinno si ę unikać 
strat podczas poddawania dzia łaniu i nale ży podjąć próbę zapew­
nienia jednorodnego rozk ładu w glebie (np. badana substancja 
powinna by ć nastrzykni ęta do gleby w kilku miejscach).  
1.6.6.  Stężenia stosowane w badaniach  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, powinno si ę stosować 
przynajmniej dwa st ężenia. Niższe stężenie powinno odzwierciedla ć 
przynajmniej maksymaln ą, oczekiwan ą ilość dochodz ącą do gleby 
w praktycznym zastosowaniu, natomiast wy ższe stężenie powinno 
być wielokrotno ścią niższego. St ężenia substancji badanej dodanej 
do gleby s ą obliczane przy za łożeniu równomiernego wprowadzenia 
na głębokość 5 cm i g ęstości nasypowej gleby 1,5. Dla substancji 
agrochemicznych dodawanych bezpo średnio do gleby lub dla 
substancji chemicznych o przewidywalnej ilo ści dochodz ącej do 
gleby zalecanymi st ężeniami do bada ń są maksymalne przewidy ­
walne stężenia środowiskowe (Predicted Environmental Concentra ­
tion – PEC) i ich pi ęciokrotno ść. Substancje, dla których przewiduje 
się kilkakrotne stosowanie w jednym sezonie, powinny by ć badane 
przy stężeniach wyliczonych poprzez przemno żenie PEC przez ocze ­
kiwaną maksymaln ą liczbę zastosowa ń. Wyższe badane st ężenie nie 
powinno jednak przekracza ć dziesięciokrotno ści pojedynczej stoso ­
wanej maksymalnej ilo ści. Jeżeli badane s ą substancje nieagroche ­
miczne, stosowane s ą ciągi geometryczne przynajmniej pi ęciu stężeń. 
Badane st ężenia powinny pokry ć zakres potrzebny do okre ślenia 
wartości EC  x . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. PROWADZENIE BADANIA  
1.7.1.  Warunki ekspozycji  
1.7.1.1.  Próbki badane i kontrolne  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, gleba dzielona jest na 
trzy równe wagowo cz ęści. Dwie cz ęści są mieszane z no śnikiem 
zawierającym badany produkt, a trzecia jest mieszana z samym 
nośnikiem (próbka kontrolna). Zalecane s ą przynajmniej trzy powtó ­
rzenia, zarówno dla gleb poddanych dzia łaniu badanej substancji, jak 
i niepoddanych. Je żeli badane s ą środki nieb ędące substancjami 
agrochemicznymi, gleba dzielona jest na sze ść równych wagowo 
części. Pięć próbek jest mieszanych z no śnikiem zawieraj ącym 
substancję badaną, a szósty mieszany jest z samym no śnikiem. 
Zaleca si ę trzy powtórzenia, zarówno dla próbek badanych, jak 
i próbek kontrolnych. Nale ży zadbać o zapewnienie homogenicznego 
rozprowadzenia substancji badanej w poddanych jej dzia łaniu 
próbkach gleby. Podczas mieszania powinno si ę uniknąć sklejania 
lub zbrylania gleby.  
1.7.1.2.  Inkubacja próbek gleby  
Inkubacja mo że być prowadzona na dwa sposoby: jako zbiorcze 
próbki ka żdej gleby poddanej i niepoddanej dzia łaniu badanej 
substancji albo jako seria pojedynczych podpróbek równej wielko ści, 
poddanych i niepoddanych dzia łaniu badanej substancji. Jednak że 
jeżeli badane s ą substancje lotne, badania powinny by ć prowadzone 
jedynie na serii pojedynczych podpróbek. Je żeli gleby s ą inkubo­
wane w masie, przygotowywane s ą duże ilości gleby poddanej 
i niepoddanej dzia łaniu badanej substancji i podpróbki do analizy 
są pobierane w miar ę potrzeby podczas badania. Ilo ść przygotowana 
wstępnie do ka żdego poddania dzia łaniu i do kontroli zale ży od 
wielkości podpróbek, ilo ści powtórze ń stosowanych do analizy 
oraz przewidywanej maksymalnej liczby pobieranych próbek. 
Gleby inkubowane w jednej obj ętości powinny zosta ć dokładnie 
wymieszane przed podzia łem na mniejsze próbki. Je żeli gleby s ą 
inkubowane jako seria pojedynczych próbek, ka żda poddana dzia ­ 
łaniu substancji badanej i kontrolna masa gleby jest dzielona na 
wymagan ą liczbę podpróbek, które s ą wykorzystywane w miar ę 
potrzeb. W eksperymentach, gdzie przewiduje si ę więcej niż dwa 
próbkowania, powinna by ć przygotowywana wystarczaj ąca liczba 
podpróbek do wszystkich powtórze ń i próbkowa ń. Przynajmniej 
trzy powtórzone próbki badanej gleby powinny by ć inkubowane 
w warunkach napowietrzania (zob. sekcja 1.7.1.1). Podczas wszyst ­
kich bada ń powinny by ć stosowane odpowiednie pojemniki, 
z wystarczaj ącą przestrzeni ą nad powierzchni ą próbki, w celu unik ­
nięcia rozwoju warunków beztlenowych. Je żeli badane s ą substancje 
lotne, badanie powinno by ć prowadzone wy łącznie na serii pojedyn ­
czych podpróbek.  
1.7.1.3.  Warunki bada ń i czas ich trwania  
Badanie jest prowadzone w ciemno ści w temperaturze pokojowej 20 
± 2  o C. Zawarto ść wilgoci w próbkach gleb podczas badania 
powinna wynosi ć 40–60 % maksymalnej pojemno ści wodnej (zob. 
sekcja 1.6.4.2) w przedziale ± 5 %. Mo żna dodawa ć wodę destylo­
waną i dejonizowan ą, stosownie do potrzeb.  
Minimalny czas trwania bada ń wynosi 28 dni. Je żeli badane s ą 
substancje agrochemiczne, porównywane s ą szybkości tworzenia 
azotanów próbki badanej i kontrolnej. Je żeli 28 dnia wyniki ró żnią 
się od siebie o wi ęcej niż 25 %, badanie jest kontynuowane a ż do 
osiągnięcia warto ści równej lub mniejszej od 25 % lub przez maksy ­
malnie 100 dni, w zale żności od tego, co nast ąpi wcześniej. Dla 
substancji nieb ędących agrochemicznymi badanie przerywa si ę po 
28 dniach. 28 dnia oznaczane s ą ilości azotanów w próbce badanej 
i kontrolnej i obliczane s ą wartości EC  x . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Próbkowanie i analiza gleb  
1.7.2.1.  Harmonogram próbkowania gleb  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, próbki gleby s ą analizo­
wane pod k ątem azotanów w dniach 0, 7, 14 i 28. Je żeli wymagane 
jest przed łużenie badania, dalsze pomiary powinny by ć wykonywane 
co 14 dni po dniu 28.  
Jeżeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, stosuje si ę przynaj­
mniej pięć stężeń i próbki gleby s ą analizowane na azotany na 
początku (dzie ń 0) i na ko ńcu okresu ekspozycji (28 dzie ń). 
Można dodać pomiary po średnie, np. 7 dnia, je żeli zostanie to 
uznane za konieczne. Dane uzyskane 28 dnia s ą stosowane do 
wyznaczenia warto ści EC  x dla substancji chemicznej. Je żeli jest to 
pożądane, mo żna wykorzysta ć wyniki z dnia 0 dla próbek kontro ­
lnych do podania pocz ątkowej ilo ści azotanów w glebie.  
1.7.2.2.  Analizy próbek gleby  
Ilość wytworzonych azotanów w ka żdej próbce poddanej dzia łaniu 
badanej substancji i w próbce kontrolnej jest okre ślana przy ka żdym 
próbkowaniu. Azotany s ą ekstrahowane z gleby przez wytrz ąsanie 
próbek z odpowiednim rozpuszczalnikiem, to jest 0,1 M roztwór chlorku potasu. Zaleca si ę 5 ml roztworu KCl na gram suchej 
masy równowa żnej ilości gleby. W celu optymalizacji ekstrakcji 
pojemnik zawieraj ący glebę i roztwór ekstrakcyjny nie powinien 
być napełniony bardziej ni ż do połowy. Mieszanina jest wytrz ąsana 
z szybko ścią 150 rpm przez 60 minut. Mieszanina jest odwirowy ­
wana lub filtrowana, a faza ciek ła analizowana na azotany. Roztwory 
wolne od cz ąstek stałych mogą być przechowywane przed analiz ą 
w temperaturze minus 20 ± 5
 o C przez okres do sze ściu miesi ęcy. 
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, powinna zosta ć zareje­
strowana ilo ść wytworzonych azotanów w ka żdej próbce gleby 
i wartość średnia wszystkich powtórze ń powinna zosta ć przedsta ­
wiona w formie tabeli. Tempa przemian azotu nale ży zinterpretowa ć 
przy użyciu odpowiednich i powszechnie akceptowanych metod 
statystycznych (np. test F, 5 % poziom istotno ści). Ilości wytworzo ­
nych azotanów wyra żane są w mg azotanów/kg suchej masy 
gleby/dzie ń. Tempo tworzenia azotanów w ka żdej próbce poddanej 
działaniu badanej substancji jest porównywane z próbk ą kontroln ą 
i obliczane jest odchylenie procentowe od próbki kontrolnej.  
Jeżeli badane s ą substancje nieb ędące agrochemicznymi, oznaczana 
jest ilość utworzonych azotanów w ka żdym powtórzeniu i do oceny 
wartości EC  x przygotowywana jest krzywa zale żności dawka-odpo ­
wiedź. Ilości azotanów (to jest mg azotanów/kg suchej masy gleby) 
oznaczone w badanych próbkach po 28 dniach s ą porównywane 
z wartościami okre ślonymi dla próbki kontrolnej. Na podstawie 
tych danych obliczane s ą wielkości % inhibicji dla ka żdego bada ­
nego stężenia. Te warto ści procentowe s ą wykreślane w zale żności 
od stężenia, a nast ępnie wykorzystuje si ę procedury statystyczne do 
obliczenia warto ści EC  x . Granice przedzia łu ufności (p = 0,95) dla 
obliczanej warto ści EC  x są również określane przy u życiu standar ­
dowych procedur (10)(11)(12).  
Badane substancje zawieraj ące wysokie ilo ści azotu mog ą przyczy­
niać się do ilości azotanów wytworzonych w czasie bada ń. Jeżeli te 
substancje s ą badane w du żych stężeniach (np. zwi ązki chemiczne 
przewidziane do wielokrotnego stosowania), w badaniach trzeba uwzględnić odpowiednie próbki kontrolne (tj. gleba i substancja 
badana, ale bez m ączki roślinnej). Dane z tych próbek kontrolnych 
muszą zostać uwzględnione w obliczeniach EC
 x . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Jeżeli są oceniane wyniki bada ń substancji agrochemicznych 
i różnica tempa tworzenia azotanów pomi ędzy niższym stężeniem 
(to jest maksymalne przewidywane st ężenie) a próbk ą kontroln ą 
jest mniejsza lub równa 25 %, w którymkolwiek momencie 
pomiarów po up ływie 28 dni, produkt mo że zostać oceniony, jako 
niemający długookresowego wp ływu na przemiany azotu w glebie. 
Jeżeli oceniane s ą wyniki uzyskane dla substancji chemicznych 
innych ni ż agrochemiczne, stosowane s ą wartości EC  50 , EC  25 i/lub 
EC 10 . 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Raport z bada ń musi zawiera ć następujące informacje:  
Pełną identyfikacj ę używanej gleby, w tym:  
— położenie geograficzne miejsca (d ługość, szeroko ść), 
— informacje o historii miejsca (to jest szata ro ślinna, podawanie 
środków ochrony upraw, nawo żenie, przypadkowe zanieczysz ­
czenia itp.),  
— przyk łady wykorzystania (gleby uprawne, lasy itp.),  
— głębokość pobierania próbek (cm),  
— zawarto ści piasku/i łów/gliny ( % suchej masy),  
— pH (w wodzie),  
— zawarto ść węgla organicznego ( % suchej masy),  
— zawarto ść azotu ( % suchej masy),  
— początkowe stężenie azotanów (mg azotanów/kg suchej masy),  
— zdolno ść wymiany kationów (mmol/kg),  
— mikrobiologiczna biomasa wyra żona jako procent w ęgla orga­
nicznego,  
— odniesienia do metod stosowanych do oznaczania wszystkich 
parametrów,  
— wszystkie informacje odnosz ące się do pobierania 
i przechowywania próbek gleby,  
— szczegó ły wstępnej inkubacji gleby, je żeli była stosowana.  
Substancja badana:  
— charakter fizyczny i w razie potrzeby w łasności fizyczno- 
chemiczne,  
— dane identyfikacji chemicznej, w razie potrzeby, w tym wzór 
strukturalny, czysto ść (tj. dla środków ochrony upraw procent 
składnika aktywnego), zawarto ść azotu.  
Substrat:  
— źródło substratu,  
— skład (to jest m ączka z lucerny, m ączka z cz ęści zielonych lucer ­
ny), 
— stężenie węgla i azotu ( % suchej masy),  
— ziarnisto ść (mm).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Warunki badania:  
— informacje szczegó łowe dotycz ące wzbogacenia gleby substratem 
organicznym,  
— liczba u żytych stężeń badanej substancji chemicznej i w razie 
potrzeby uzasadnienie wybranych st ężeń, 
— szczegó łowe informacje dotycz ące podania substancji badanej do 
gleby,  
— temperatura inkubacji,  
— zawarto ść wilgoci na pocz ątku i w trakcie badania,  
— zastosowana metoda inkubacji gleby (to jest w ca łej objętości lub 
w serii pojedynczych próbek),  
— liczba powtórze ń, 
— liczba poborów próbek,  
— metoda zastosowana do ekstrakcji azotanów z gleby.  
Wyniki:  
— procedura analityczna i wyposa żenie stosowane do analizy azota ­
nów,  
— dane tabelaryczne zawieraj ące pojedyncze i średnie warto ści 
pomiarów azotanów,  
— odchylenie pomi ędzy powtórzeniami dla próbki badanej 
i kontrolnej,  
— wyjaśnienie poprawek wprowadzonych w obliczeniach, je żeli 
dotyczy,  
— odchylenie procentowe dla stopnia tworzenia azotanów dla 
każdego próbkowania lub, w razie potrzeby, EC  50 z 95 % 
granicą poziomu ufno ści, inne EC  x (to jest EC  25 lub EC  10 ) z 
podaniem przedzia łów ufności oraz wykres reakcji na dawk ę, 
— statystyczne opracowanie wyników,  
— wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyni ­
ków.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality – Determination of 
Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influ ­
ence of Chemicals on these Processes. Technical Committee 
ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality - Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18–20 janvier 1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrate induced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation extraction method.  
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, 99–113.  
(11) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN 
WĘGLA  
1. METODA  
Ta metoda jest równowa żna OECD TG 217 (2000).  
1.1. WPROWADZENIE  
Ta metoda badawcza opisuje metod ę laboratoryjn ą opracowan ą do 
badania potencjalnych d ługoterminowych skutków jednorazowego 
poddania dzia łaniu środków ochrony upraw i innych substancji 
chemicznych dla przemian w ęgla spowodowanych przez mikroorga ­
nizmy glebowe. To badanie jest oparte g łównie na zaleceniach Euro ­
pejskiej i Śródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Ro ślin (1). 
Jednakże inne wytyczne, w tym wytyczne German Biologische 
Bundesanstalt (2), Ameryka ńskiej Agencji Ochrony Środowiska (3) 
i SETAC (4) tak że zostały wzięte pod uwag ę. W czasie warsztatów 
OECD na temat Selekcji Gleb/Osadów, maj ących miejsce 
w Belgirate we W łoszech w 1995 (6), ustalono ilo ść i rodzaj gleb 
stosowanych w tym badaniu. Zalecenia w sprawie pobierania, prze ­
noszenia i przechowywania próbek gleby s ą oparte na wytycznych 
metodycznych wed ług ISO (6) i zaleceniach z warsztatów 
w Belgirate.  
W ocenie i interpretacji toksycznych w łaściwości badanej substancji 
może być wymagane okre ślenie skutków dzia łania dla aktywno ści 
mikrobiologicznej np. je żeli są wymagane dane na temat potencjal ­
nych efektów ubocznych dzia łania środków ochrony upraw dla 
mikroflory glebowej lub je żeli spodziewane jest wystawienie mikro ­
organizmów na dzia łanie związków chemicznych innych ni ż środki 
ochrony upraw. Badanie przemian w ęgla jest prowadzone w celu 
określenia wp ływu dzia łania takich substancji chemicznych na 
mikroflor ę. Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne (np. środki 
ochrony upraw, nawozy, zwi ązki chemiczne stosowane 
w leśnictwie), to s ą prowadzone zarówno badania przemian w ęgla, 
jak i azotu. Je żeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, wystar ­
czające jest badanie przemian azotu. Jednak że jeżeli wartości EC  50 
w badaniach przemian azotu znajd ą się w zakresie, w którym taki 
związek chemiczny uznaje si ę za dostępny w handlu inhibitor nitry ­
fikacji (np. nitropiryna), mo żna przeprowadzi ć badania przemian 
azotu w celu uzyskania dodatkowych informacji.  
Gleby sk ładają się ze składników o żywionych i nieo żywionych, 
które wyst ępują w złożonych i heterogenicznych mieszaninach. 
Mikroorganizmy odgrywaj ą istotną rolę w rozkładzie i przemianie 
materii organicznej w żyznych glebach, gdzie wiele gatunków przy ­
czynia się do różnych aspektów żyzności gleby. Jakikolwiek d ługoo­
kresowy wp ływ na procesy biochemiczne mo że potencjalnie zak łócić 
obieg substancji biogennych, a to mo że zmienić żyzność gleb. Prze ­
miany w ęgla i azotu wyst ępują we wszystkich żyznych glebach. 
Pomimo że biocenozy bakteryjne ró żnią się w poszczególnych 
rodzajach gleb, szlaki przemian s ą w zasadzie takie same.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
Ta metoda badawcza jest przeznaczona do wykrywania d ługookre­
sowych, niepomy ślnych skutków dzia łania substancji dla procesów 
przemian w ęgla w napowietrzonych, powierzchniowych warstwach 
gleb. Badanie jest czu łe na zmiany wielko ści i aktywno ści biocenoz 
bakteryjnych odpowiedzialnych za przemiany w ęgla, poniewa ż 
poddaje te biocenozy zarówno oddzia ływaniu chemicznemu, jak 
i deficytowi w ęgla. Stosowana jest piaszczysta gleba o niskiej zawar ­
tości materii organicznej. Ta gleba jest poddawana dzia łaniu badanej 
substancji, a nast ępnie jest inkubowana w warunkach pozwalaj ących 
na szybki metabolizm mikrobiologiczny. W tych warunkach źródła 
łatwo dost ępnego w ęgla w glebie s ą gwałtownie wyczerpywane. 
Powoduje to deficyt w ęgla, który zarówno zabija komórki mikrobio ­
logiczne, jak i powoduje przej ście w stan u śpienia i/lub zarodniko ­
wania. Je żeli badanie trwa d łużej niż 28 dni, suma wszystkich tych 
reakcji mo że zostać zmierzona w próbkach kontrolnych (niepodda ­
nych dzia łaniu badanej substancji) jako stopniowy spadek aktywnej 
metabolicznie biomasy mikrobiologicznej (7). Je żeli biomasa 
w glebie ubogiej w w ęgiel, w warunkach badania, jest poddawana 
działaniu substancji chemicznej, to mo że ona nie wróci ć do takiego 
samego poziomu, jak próbka kontrolna. St ąd zaburzenia spowodo ­
wane przez badan ą substancj ę w dowolnym momencie podczas 
badania cz ęsto trwają aż do zakończenia badania.  
Badania, na podstawie których zasta ła opracowana ta metoda badaw ­
cza, były na pocz ątku przeznaczone dla substancji, dla których 
można było przewidzie ć ich ilość będącą w kontakcie z gleb ą. Tak 
się dzieje, na przyk ład, w przypadku środków ochrony upraw, gdzie 
znana jest ich ilo ść podawana w polu. Dla produktów agrochemicz ­
nych wystarczaj ące jest badanie dwóch dawek odpowiadaj ących 
ilości podanej lub przewidywanej. Substancje agrochemiczne mog ą 
być badane jako aktywne dodatki (a.i.) lub jako gotowe produkty. 
Jednakże badanie nie jest ograniczone do substancji chemicznych 
o przewidywalnych st ężeniach środowiskowych. Zmieniaj ąc zarówno 
ilości substancji badanej podanej do gleby, jak i sposób interpretacji 
wyników, badania mog ą być stosowane do substancji chemicznych, 
których przewidywana ilo ść będąca w kontakcie z gleb ą jest 
nieznana. Wobec tego dla substancji chemicznych innych ni ż agro­
chemiczne okre śla się wpływ różnych stężeń na przemian ę węgla. 
Wyniki tych bada ń są wykorzystywane do przygotowania wykresu 
reakcji na dawk ę i obliczenia warto ści EC  x , gdzie x zdefiniowano 
jako % oddzia ływania.  
1.2. DEFINICJE  
Przemiany w ęgla: to degradacja materii organicznej w wyniku dzia ­ 
łania mikroorganizmów do ko ńcowych, nieorganicznych produktów 
przemiany, jakim jest ditlenek w ęgla. 
EC x (stężenie efektywne):  to stężenie substancji badanej w glebie, 
które powoduje x-procentow ą inhibicję przemian w ęgla do ditlenku 
węgla. 
EC 50 (mediana st ężenia efektywnego):  stężenie substancji w glebie, 
które powoduje 50-procentow ą inhibicję przemian w ęgla do ditlenku 
węgla. 
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Brak.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Przesiana gleba jest albo poddawana dzia łaniu substancji badanej, 
albo pozostawiona nienaruszona (próbka kontrolna). Je żeli badane 
są substancje agrochemiczne, zaleca si ę stosowanie przynajmniej 
dwóch stężeń i powinny one by ć wybrane w odniesieniu do najwy ż­
szego stężenia, jakie mo że występować w terenie. Po 0, 7, 14 i 28 
dniach inkubacji próbki gleb poddanych dzia łaniu badanej substancji 
i próbki kontrolne s ą mieszane z glukoz ą i przez kolejne 12 godzin 
jest mierzone tempo respiracji indukownej glukozy. Tempo respiracji 
wyraża się ilością uwolnionego ditlenku w ęgla (mg dwutlenku 
węgla/kg suchej gleby/h) lub ilo ścią pochłoniętego tlenu (mg tlenu/ ­
kg suchej gleby/h). Średnie tempo respiracji w próbce gleby 
poddanej dzia łaniu badanej substancji jest porównywane z tempem 
respiracji dla próbki kontrolnej, a nast ępnie oblicza si ę odchylenie 
procentowe próbki badanej od próbki kontrolnej. Wszystkie badania 
są prowadzone przynajmniej przez 28 dni. Je żeli 28 dnia ró żnice 
pomiędzy glebami badanymi a kontrolnymi b ędą równe lub wi ększe 
niż 25 %, badania kontynuuje si ę w odstępach 14-dniowych przez 
maksymalnie 100 dni. Je żeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, 
do próbek gleby dodawana jest seria st ężeń badanej substancji i po 
28 dniach mierzone s ą tempa respiracji indukowanej glukoz ą (to jest 
średnia ilo ść wytworzonego ditlenku w ęgla lub zu żytego tlenu). 
Wyniki bada ń z serii st ężeń są analizowane przy u życiu modelu 
regresyjnego i obliczane s ą wartości EC  x (to jest EC  50 , EC  25 i/lub 
EC 10 ). Zob. definicje.  
1.5. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Oceny wyników bada ń substancji agrochemicznych s ą oparte na 
stosunkowo niewielkich ró żnicach ( średnia warto ść ± 25 %) 
pomiędzy uwolnionym ditlenkiem w ęgla lub zu żytym tlenem 
w (lub przez) kontrolnych i badanych próbkach gleby, wi ęc duże 
różnice próbek kontrolnych mog ą prowadzi ć do fałszywych wyni ­
ków. Z tego powodu odchylenia pomi ędzy powtórzeniami próbek 
kontrolnych powinny by ć mniejsze ni ż ± 15 %.  
1.6. OPIS METODY BADANIA  
1.6.1.  Aparatura  
Stosowane s ą pojemniki z materia łów chemicznie oboj ętnych. 
Powinny one mie ć odpowiedni ą pojemno ść zgodnie z procedur ą 
stosowaną do inkubacji gleb, to jest inkubacji w masie lub jako 
serii pojedynczych próbek gleby (zob. sekcja 1.7.1.2). Powinno si ę 
zwrócić uwagę na minimalizacj ę utraty wody i umo żliwienie 
wymiany gazów podczas badania (np. pojemniki do bada ń mogą 
być przykryte perforowan ą folią polietylenow ą). Jeżeli badane s ą 
substancje lotne, powinno si ę stosowa ć pojemniki umo żliwiające 
uszczelnienie i gazoszczelne. Powinny by ć takiej wielko ści, aby 
około jednej czwartej ich obj ętości było wypełnione próbk ą gleby.  
Dla oznaczenia respiracji indukowanej glukoz ą, wymagany jest 
system inkubacyjny oraz przyrz ądy do pomiaru produkcji ditlenku 
węgla lub zu życia tlenu. Przyk łady takich systemów i urz ądzeń 
można znaleźć w literaturze (8)(9)(10)(11).  
1.6.2.  Wybór i ilo ść próbek gleb  
Stosowany jest jeden rodzaj gleb. Zalecanymi w łasnościami gleby 
są: 
— zawarto ść piasku: nie mniej ni ż 50 % i nie wi ęcej niż 75 %,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5–7,5,  
— zawarto ść węgla organicznego: 0,5–1,5 %,  
— powinna zosta ć zmierzona mikrobiologiczna biomasa (12)(13) 
i jej zawarto ść węgla powinna wynosi ć przynajmniej 1 % ca łko­
witej masy w ęgla organicznego w glebie.  
Przeważnie gleby o takich w łasnościach stanowi ą najgorszy przypa ­
dek, poniewa ż adsorpcja badanej substancji chemicznej jest mini ­
malna, a jej dost ępność dla mikroflory maksymalna. Wynika 
z tego, że badania innych gleb s ą na ogół niepotrzebne. Jednak że 
w pewnych okoliczno ściach, to jest gdy przewiduje si ę, że substancja 
badana będzie stosowana g łównie w okre ślonych glebach, takich jak 
kwaśne gleby le śne lub dla substancji chemicznych z ładunkiem 
elektrostatycznym, mo że być konieczne zastosowanie dodatkowych 
rodzajów gleb.  
1.6.3.  Pobieranie i przechowywanie próbek gleby  
1.6.3.1.  Pobieranie  
Powinny by ć dostępne szczegó łowe informacje na temat historii 
obszaru, z jakiego zosta ła pobrana badana próbka gleby. Szczegó ­ 
łowe informacje powinny obejmowa ć dokładną lokalizacj ę, szatę 
roślinną, daty poddania dzia łaniu środków ochrony upraw, podanie 
nawozów organicznych lub nieorganicznych, dodanie materia łów 
biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Obszar wybrany 
do pobrania gleby powinien umo żliwiać długookresowe u żytkowa­
nie. Odpowiednie do tego s ą stałe pastwiska, pola okresowo zasie ­
wane zbo żami (z wyj ątkiem kukurydzy) lub g ęsto nawo żone 
zielonką. Wybrany obszar do pobierania próbek nie powinien by ć 
poddawany dzia łaniu produktów ochrony upraw przez co najmniej 
jeden rok przed pobraniem próbek. Nie powinno si ę również 
podawać żadnych nawozów organicznych przez co najmniej sze ść 
miesięcy. Stosowanie nawozów mineralnych jest dozwolone tylko 
wtedy, gdy jest zgodne z wymogami upraw i próbki gleby nie powinny by ć pobierane przez co najmniej trzy miesi ące po podaniu 
nawozu. Nale ży unikać stosowania gleb poddanych dzia łaniu 
nawozów o znanym dzia łaniu biologicznym (np. cyjanamid wapnia).
 
Pobierania próbek nale ży unikać podczas lub bezpo średnio po d łuż­
szych okresach (przekraczaj ących 30 dni) suszy lub zalania wod ą. 
Dla gleb zaoranych próbki powinny by ć pobierane z g łębokości od 0 
do 20 cm. Dla łąk (pastwisk) lub innych gleb, które nie s ą orane 
przez dłuższy czas (przynajmniej jeden sezon wegetacyjny), maksy ­
malna głębokość pobierania próbek mo że być nieco wi ększa niż 
20 cm (np. do 25 cm). Próbki gleb powinny by ć transportowane 
przy użyciu odpowiednich pojemników i w warunkach temperaturo ­
wych gwarantuj ących, że początkowe własności gleby nie zostan ą 
znacząco zmienione.  
1.6.3.2.  Przechowywanie  
Preferuje si ę stosowanie gleb świeżo zebranych. Je żeli nie mo żna 
uniknąć przechowywania w laboratorium, gleba mo że być przecho­
wywana w ciemno ści w temperaturze 4 ± 2  o C przez maksymalnie 
trzy miesi ące. Należy zapewni ć warunki do napowietrzania gleby 
podczas jej przechowywania. Je żeli gleby s ą pobierane z obszarów, 
które zamarzaj ą przez przynajmniej trzy miesi ące w roku, mo żna 
wziąć pod uwag ę przechowywanie przez sze ść miesięcy 
w temperaturze minus 18  o C. Mikrobiologiczna biomasa przechowy ­
wanych gleb jest mierzona przed ka żdym eksperymentem 
i zawarto ść węgla w biomasie powinna wynosi ć co najmniej 1 % 
całkowitej zawarto ści węgla organicznego w glebie (zob. sekcja 
1.6.2).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Post ępowanie i przygotowanie gleby do bada ń 
1.6.4.1.  Inkubacja wst ępna 
Jeżeli gleba by ła przechowywana (zob. sekcje 1.6.4.2 i 1.7.1.3), 
zalecana jest wst ępna inkubacja przez okres 2–28 dni. Temperatura 
i zawarto ść wilgoci w glebie podczas wst ępnej inkubacji powinny 
być podobne do tych, jakie b ędą stosowane w czasie badania (zob. 
sekcje 1.6.4.2 i 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Właściwości fizyczno-chemiczne  
Z gleby usuwane s ą ręcznie większe obiekty (to jest kamienie, cz ęści 
roślin itp.) i jest ona przesiewana na wilgotno, bez nadmiernego 
wysuszenia do ziarnisto ści mniejszej lub równej 2 mm. Zawarto ść 
wilgoci w próbce gleby powinna zosta ć zwiększona przy u życiu 
wody destylowanej lub dejonizowanej do warto ści pomiędzy 40 
a 60 % maksymalnej zdolno ści utrzymywania wody.  
1.6.5.  Przygotowanie substancji badanej do podania do gleby  
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przy u życiu nośnika. 
Nośnikiem mo że być woda (dla substancji rozpuszczalnych 
w wodzie) lub oboj ętne ciało stałe, takie jak drobnoziarnisty piasek 
kwarcowy (rozmiar ziaren 0,1–0,5 mm). Nale ży unikać nośników 
ciekłych innych ni ż woda (np. organiczne rozpuszczalniki, takie 
jak aceton, chloroform), poniewa ż mogą niszczyć mikroflor ę. Jeżeli 
stosowanym no śnikiem jest piasek, mo że on być powleczony badan ą 
substancją rozpuszczon ą lub zawieszon ą w odpowiednim rozpusz ­
czalniku. W takich przypadkach przed wymieszaniem z gleb ą należy 
usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie. Dla zachowania optymal ­
nego rozk ładu substancji badanej w glebie, zaleca si ę stosowanie 10 
g piasku na kilogram gleby (w suchej masie). Próbki kontrolne s ą 
poddawane dzia łaniu równowa żnej ilości tylko wody i/lub piasku 
kwarcowego.  
Jeżeli badane s ą lotne substancje chemiczne, powinno si ę unikać 
strat podczas poddawania dzia łaniu i nale ży podjąć próbę zapew­
nienia jednorodnego rozk ładu w glebie (np. badana substancja 
powinna by ć nastrzykni ęta do gleby w kilku miejscach).  
1.6.6.  Stężenia stosowane w badaniach  
Jeżeli badane s ą środki ochrony upraw lub inne substancje 
chemiczne o przewidywalnym st ężeniu środowiskowym, powinno 
się stosować przynajmniej dwa st ężenia. Niższe stężenie powinno 
odzwierciedla ć przynajmniej maksymaln ą, oczekiwan ą ilość 
dochodzącą do gleby w praktycznym zastosowaniu, natomiast 
wyższe stężenie powinno by ć wielokrotno ścią niższego. St ężenia 
substancji badanej dodanej do gleby s ą obliczane przy za łożeniu 
równomiernego wprowadzenia na g łębokość 5 cm i g ęstości nasy­
powej gleby 1,5. Dla substancji agrochemicznych dodawanych bezpośrednio do gleby lub dla substancji chemicznych, 
o przewidywalnej ilo ści dochodz ącej do gleby, zalecanymi st ęże­
niami do bada ń są maksymalne przewidywalne st ężenia środowi­
skowe (Predicted Environmental Concentration – PEC) i ich pi ęcio­
krotność. Substancje, dla których przewiduje si ę kilkakrotne stoso ­
wanie w jednym sezonie, powinny by ć badane przy st ężeniach wyli ­
czonych poprzez przemno żenie PEC przez oczekiwan ą maksymaln ą 
liczbę zastosowa ń. Wyższe badane st ężenie nie powinno jednak 
przekracza ć dziesięciokrotno ści pojedynczej stosowanej maksymalnej 
ilości. 
Jeżeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, stosowane s ą ciągi 
geometryczne przynajmniej pi ęciu stężeń. Badane st ężenia powinny 
pokryć zakres potrzebny do okre ślenia warto ści EC  x . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. PROWADZENIE BADANIA  
1.7.1.  Warunki ekspozycji  
1.7.1.1.  Próbki badane i kontrolne  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, gleba dzielona jest na 
trzy równe wagowo cz ęści. Dwie cz ęści są mieszane z no śnikiem 
zawierającym badany produkt, a trzecia jest mieszana z samym 
nośnikiem (próbka kontrolna). Zalecane s ą przynajmniej trzy powtó ­
rzenia, zarówno dla gleb poddanych dzia łaniu badanej substancji, jak 
i niepoddanych. Je żeli badane s ą środki nieb ędące substancjami 
agrochemicznymi, gleba dzielona jest na sze ść równych wagowo 
części. Pięć próbek jest mieszanych z no śnikiem zawieraj ącym 
substancję badaną, a szósty mieszany jest z samym no śnikiem. 
Zaleca si ę trzy powtórzenia, zarówno dla próbek badanych, jak 
i próbek kontrolnych. Nale ży zadbać o zapewnienie homogenicznego 
rozprowadzenia substancji badanej w poddanych jej dzia łaniu 
próbkach gleby. Podczas mieszania powinno si ę uniknąć sklejania 
lub zbrylania gleby.  
1.7.1.2.  Inkubacja próbek gleby  
Inkubacja mo że być prowadzona na dwa sposoby: jako zbiorcze 
próbki ka żdej gleby poddanej i niepoddanej dzia łaniu badanej 
substancji, albo jako seria pojedynczych podpróbek równej wiel ­
kości, poddanych i niepoddanych dzia łaniu badanej substancji. 
Jednakże jeżeli badane s ą substancje lotne, badania powinny by ć 
prowadzone jedynie na serii pojedynczych podpróbek. Je żeli gleby 
są inkubowane w masie, przygotowywane s ą duże ilości gleby 
poddanej i niepoddanej dzia łaniu badanej substancji i podpróbki do 
analizy są pobierane w miar ę potrzeby podczas badania. Ilo ść przy­
gotowana wst ępnie do ka żdego poddania dzia łaniu i do kontroli 
zależy od wielko ści podpróbek, ilo ści powtórze ń stosowanych do 
analizy oraz przewidywanej maksymalnej liczby pobieranych próbek. 
Gleby inkubowane w jednej obj ętości powinny zosta ć dokładnie 
wymieszane przed podzia łem na mniejsze próbki. Je żeli gleby s ą 
inkubowane jako seria pojedynczych próbek, ka żda poddana dzia ­ 
łaniu substancji badanej i kontrolna masa gleby jest dzielona na 
wymagan ą liczbę podpróbek, które s ą wykorzystywane w miar ę 
potrzeb. W eksperymentach, gdzie przewiduje si ę więcej niż dwa 
próbkowania, powinna by ć przygotowywana wystarczaj ąca liczba 
podpróbek do wszystkich powtórze ń i próbkowa ń. Przynajmniej 
trzy powtórzone próbki badanej gleby powinny by ć inkubowane 
w warunkach napowietrzania (zob. sekcja 1.7.1.1). Podczas wszyst ­
kich bada ń powinny by ć stosowane odpowiednie pojemniki, 
z wystarczaj ącą przestrzeni ą nad powierzchni ą próbki, w celu unik ­
nięcia rozwoju warunków beztlenowych. Je żeli badane s ą substancje 
lotne, badanie powinno by ć prowadzone wy łącznie na serii pojedyn ­
czych podpróbek.  
1.7.1.3.  Warunki bada ń i czas ich trwania  
Badanie jest prowadzone w ciemno ści w temperaturze pokojowej 20 
± 2  o C. Zawarto ść wilgoci w próbkach gleb podczas badania 
powinna wynosi ć 40–60 % maksymalnej pojemno ści wodnej (zob. 
sekcja 1.6.4.2) w przedziale ± 5 %. Mo żna dodawa ć wodę destylo­
waną i dejonizowan ą, stosownie do potrzeb.  
Minimalny czas trwania bada ń wynosi 28 dni. Je żeli badane s ą 
substancje agrochemiczne, porównywane s ą ilości wydzielonego 
ditlenku w ęgla lub zu żytego tlenu dla próbki badanej i kontrolnej. 
Jeżeli 28 dnia wyniki ró żnią się od siebie o wi ęcej niż 25 %, badanie 
jest kontynuowane a ż do osiągnięcia warto ści równej lub mniejszej 
od 25 % lub przez maksymalnie 100 dni, w zale żności od tego, co 
nastąpi wcześniej. Jeżeli badane s ą substancje nieb ędące środkami 
agrochemicznymi, badanie przerywa si ę po 28 dniach. 28 dnia ozna ­
czane są ilości wydzielonego ditlenku w ęgla lub zu żytego tlenu 
w próbce badanej i kontrolnej i obliczane s ą wartości EC  x . ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Próbkowanie i analiza gleb  
1.7.2.1.  Harmonogram próbkowania gleb  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, próbki gleby s ą analizo­
wane pod k ątem oddychania pod wp ływem glukozy w dniach 0, 7, 
14 i 28. Je żeli wymagane jest przed łużenie badania, dalsze pomiary 
powinny by ć wykonywane co 14 dni po dniu 28.  
Jeżeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, stosuje si ę przynaj­
mniej pięć stężeń i próbki gleby s ą analizowane na respiracj ę wywo­ 
łaną glukozą na początku (dzień 0) i na ko ńcu okresu ekspozycji (28 
dzień). Można dodać pomiary po średnie, np. 7 dnia, je żeli zostanie 
to uznane za konieczne. Dane uzyskane 28 dnia s ą stosowane do 
wyznaczenia warto ści EC  x dla substancji chemicznej. Je żeli jest to 
pożądane, mo żna wykorzysta ć wyniki z dnia 0 próbek kontrolnych 
do oszacowania pocz ątkowych ilo ści aktywnej metabolicznie 
biomasy mikrobiologicznej w glebie (12).  
1.7.2.2.  Pomiary tempa respiracji indukowanej glukoz ą 
Tempo respiracji indukowanej glukoz ą w każdej próbce badanej 
i kontrolnej jest okre ślane przy ka żdorazowym próbkowaniu. Próbki 
gleby są mieszane z odpowiedni ą ilością glukozy w celu wywo łania 
warunków do natychmiastowej reakcji respiracyjnej. Ilo ść glukozy 
potrzebnej do wywo łania maksymalnej reakcji respiracyjnej dla 
danej gleby mo że zostać wyznaczona we wst ępnym badaniu 
z wykorzystaniem serii st ężeń glukozy (14). Jednak że dla piaszczy ­
stych gleb zawieraj ących 0,5–1,5 % w ęgla organicznego na ogó ł 
wystarczaj ące jest zastosowanie 2 000 mg do 2 000 mg glukozy 
na kg suchej masy gleby. Glukoza mo że zostać roztarta z czystym 
piaskiem kwarcowym (10 g piasku na kg suchej masy gleby) 
i homogenicznie wymieszana z gleb ą. 
Próbki gleby wzbogaconej glukoz ą są inkubowane w aparaturze 
odpowiedniej do mierzenia tempa respiracji albo w sposób ci ągły, 
albo co godzin ę bądź co dwie godziny (zob. sekcja 1.6.1) 
w temperaturze 20 ± 2  o C. Uwalniany ditlenek w ęgla lub zu żyty 
tlen są mierzone przez kolejnych 12 godzin, a pomiary powinny 
rozpocząć się tak szybko, jak to mo żliwe, to jest w ci ągu 1–2 godzin 
od dodania glukozy. Okre śla się całkowite ilo ści wydzielonego 
ditlenku w ęgla lub poch łoniętego tlenu w ci ągu 12 godzin 
i wyznacza si ę średnią wartość tempa respiracji.  
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Jeżeli badane s ą substancje agrochemiczne, powinien zosta ć zapisany 
uwolniony ditlenek w ęgla lub poch łonięty tlen z ka żdej próbki gleby 
i wartość średnia wszystkich powtórze ń powinna zosta ć przedsta ­
wiona w formie tabeli. Wyniki powinny nale ży zinterpretowa ć 
przy użyciu odpowiednich i powszechnie akceptowanych metod 
statystycznych (np. test F, 5 % poziom istotno ści). Tempo respiracji 
indukowanej glukoz ą jest wyra żane w mg ditlenku w ęgla/kg suchej 
masy gleby/h lub mg tlenu/kg suchej masy gleby/h. Średnie tempo 
tworzenia si ę ditlenku w ęgla lub średnie tempo poch łaniania tlenu 
dla każdej badanej próbki jest porównywane z próbk ą kontroln ą 
i obliczane jest odchylenie procentowe od próbki kontrolnej.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Jeżeli badane s ą substancje nieagrochemiczne, oznacza si ę ilość 
wydzielonego ditlenku w ęgla lub poch łoniętego tlenu przez ka żdą 
próbkę i do oceny warto ści EC  x przygotowywana jest krzywa zale ż­
ności dawka-reakcja. Tempo respiracji indukowanej glukoz ą (to jest 
mg ditlenku w ęgla/kg suchej masy gleby/h lub mg tlenu/kg suchej 
masy gleby/h) okre ślone w badanych próbkach jest porównywane 
z wartością określoną dla próbki kontrolnej. Na podstawie tych 
danych obliczane s ą wielkości % inhibicji dla ka żdego badanego 
stężenia. Te warto ści procentowe s ą wykreślane w zale żności od 
stężenia, a nast ępnie wykorzystuje si ę procedury statystyczne do 
obliczenia warto ści EC  x . Granice przedzia łu ufności (p = 0,95) dla 
obliczanej warto ści EC  x są również określane przy u życiu standar ­
dowych procedur (15)(16)(17).  
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Jeżeli są oceniane wyniki bada ń substancji agrochemicznych 
i różnica między tempem respiracji przy ni ższym stężeniu (to jest 
maksymalne przewidywane st ężenie) a tempem respiracji próbki 
kontrolnej jest mniejsza lub równa 25 %, w którymkolwiek 
momencie pomiarów po up ływie 28 dni, produkt mo że zostać 
oceniony, jako niemaj ący długookresowego wp ływu na przemiany 
węgla w glebie. Je żeli oceniane s ą wyniki uzyskane dla substancji 
chemicznych innych ni ż agrochemiczne, stosowane s ą wartości 
EC 50 , EC  25 i/lub EC  10 . 
3. SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
RAPORT Z BADA Ń 
Raport z bada ń musi zawiera ć następujące informacje:  
Pełną identyfikacj ę używanej gleby, w tym:  
— położenie geograficzne miejsca (d ługość, szeroko ść), 
— informacje o historii miejsca (to jest szata ro ślinna, podawanie 
środków ochrony upraw, nawo żenie, przypadkowe zanieczysz ­
czenia itp.),  
— przyk łady wykorzystania (gleby uprawne, lasy itp.),  
— głębokość pobierania próbek (cm),  
— zawarto ści piasku/i łów/gliny ( % suchej masy),  
— pH (w wodzie),  
— zawarto ść węgla organicznego ( % suchej masy),  
— zawarto ść azotu ( % suchej masy),  
— zdolno ść wymiany kationów (mmol/kg),  
— początkowa mikrobiologiczna biomasa wyra żona jako procent 
węgla organicznego,  
— odniesienia do metod stosowanych do oznaczania wszystkich 
parametrów,  
— wszystkie informacje odnosz ące się do pobierania 
i przechowywania próbek gleby,  
— szczegó ły wstępnej inkubacji gleby je żeli była stosowana.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Substancja badana:  
— charakter fizyczny i w razie potrzeby w łasności fizyczno- 
chemiczne,  
— dane identyfikacji chemicznej, w razie potrzeby, w tym wzór 
strukturalny, czysto ść (t.j. dla środków ochrony upraw procent 
składnika aktywnego), zawarto ść azotu.  
Warunki badania:  
— informacje szczegó łowe dotycz ące wzbogacenia gleby substratem 
organicznym,  
— liczba u żytych stężeń badanej substancji chemicznej i w razie 
potrzeby uzasadnienie wybranych st ężeń, 
— szczegó łowe informacje dotycz ące podania substancji badanej do 
gleby,  
— temperatura inkubacji,  
— zawarto ść wilgoci na pocz ątku i w trakcie badania,  
— zastosowana metoda inkubacji gleby (to jest w ca łej objętości lub 
w serii pojedynczych próbek),  
— liczba powtórze ń, 
— czas poborów próbek,  
Wyniki:  
— metoda i wyposa żenie stosowane do pomiaru szybko ści oddycha ­
nia, 
— dane tabelaryczne zawieraj ące pojedyncze i średnie warto ści 
ilości ditlenku w ęgla lub tlenu,  
— odchylenie pomi ędzy powtórzeniami dla próbki badanej 
i kontrolnej,  
— wyjaśnienie poprawek wprowadzonych w obliczeniach, je żeli 
dotyczy,  
— odchylenie procentowe dla stopnia oddychania pod wp ływem 
glukozy dla ka żdego próbkowania lub, w razie potrzeby, EC  50 
z 95 % granic ą przedzia łu ufności, inne EC  x (to jest EC  25 lub 
EC 10 ) z podaniem przedzia łów ufności oraz wykres reakcji na 
dawkę, 
— statystyczne opracowanie wyników, w razie potrzeby,  
— wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyni ­
ków.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1–16, 1994.
 
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1–1 (2nd eds., 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guide ­
lines; Proposed rule. September 28, 1987.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europe, Brussels.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.  
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality – Sampling. Guidance on the 
collection, handling and storage of soil for the grade of aerobic 
microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra.. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45–60.  
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil respiration, in "Methods of Soil 
Analysis – Part 2: Chemical and Microbiological Properties. 
Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831–871.
 
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality – Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality – Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant 
and Soil, 116: 77–81.  
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 1: Substrateinduced oddychania 
method.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigationextraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegemiber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. 
(Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzens ­
chutzd., Braunschweig, 38: 113–120.
 
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99–113.
 
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New-York.  
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. 
Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  PRZEMIANY W GLEBIE W WARUNKACH NATLENIENIA 
I BEZTLENOWYCH  
1. METODA  
Ta metoda badawcza jest równowa żna OECD TG 307 (2002).  
1.1. WPROWADZENIE  
Ta metoda badawcza jest oparta na istniej ących wytycznych (1)(2) ­
(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Metoda opisana w tej metodzie badawczej jest 
przeznaczona do oceny przemian substancji chemicznych w glebie, w warunkach natlenienia i beztlenowych. Eksperymenty s ą prowa­
dzone w celu wyznaczenia: (i) szybko ści przemian substancji bada ­
nej; oraz (ii) charakteru i szybko ści tworzenia oraz zanikania 
produktów przemian, których dzia łaniu mog ą zostać poddane orga ­
nizmy w glebie. Takie badania s ą wymagane dla substancji chemicz ­
nych, które s ą bezpośrednio podawane do gleby lub mog ą przeni­
knąć do środowiska glebowego. Wyniki takich bada ń laboratoryj ­
nych mog ą być także wykorzystane do opracowania protoko łów 
pobierania próbek i analizy dla zwi ązanych bada ń w terenie.
 
Badania w warunkach tlenowych i beztlenowych jednego rodzaju 
gleby na ogó ł wystarczaj ą do oceny szlaków przemian (8)(10)(11). 
Tempa przemian powinny by ć określone przy u życiu co najmniej 
trzech dodatkowych rodzajów gleb (8)(10).  
W czasie warsztatów OECD w sprawie wyboru gleb i osadów, które 
odbyły się w Belgirate we W łoszech w 1995 roku (10), uzgodniono, 
w szczególno ści, rodzaje gleb do stosowania w tym badaniu i ich 
liczbę. Rodzaje badanych gleb powinny by ć reprezentacyjne dla 
warunków środowiskowych, w których substancja b ędzie stosowana 
lub uwalniania. Na przyk ład związki chemiczne, które mog ą być 
uwalniane w klimacie subtropikalnym lub tropikalnym, powinny być badane przy pomocy ferrazoli lub nitrozoli (system FAO). 
Uczestnicy warsztatów podali równie ż zalecenia dotycz ące pobiera ­
nia, przenoszenia i przechowywania próbek gleby na podstawie wytycznych ISO (15). W tej metodzie uwzgl ędniono tak że gleby 
pod mokre uprawy ry żu.
 
1.2. DEFINICJE  
Substancja badana:  jakakolwiek substancja, czy to zwi ązek macie ­
rzysty czy te ż odnośne produkty przemian.  
Produkty przemian:  wszystkie substancje powsta łe w wyniku 
biotycznych lub abiotycznych reakcji przemian substancji badanej, 
w tym CO  2 , i produkty w pozosta łościach zwi ązanych.  
Pozostałości związane: „Pozostałości związane” stanowi ą związki 
w glebie, ro ślinach lub zwierz ętach, które pozostaj ą po ekstrakcji 
w materiale macierzystym w postaci substancji macierzystej lub jej 
metabolitu(-ów)/produktów przemiany. Metoda ekstrakcji nie mo że 
zmieniać w sposób znacz ący samych zwi ązków lub struktury mate ­
riału macierzystego. Charakter wi ązania mo żna częściowo wyja śnić 
przez metody ekstrakcji zmieniaj ące materia ł macierzysty 
i wyspecjalizowane techniki analityczne. Do dzi ś, na przyk ład, 
zostały w ten sposób zidentyfikowane wi ązania kowalencyjne zjoni ­
zowane i sorpcyjne, a tak że pułapkowanie. Na ogó ł tworzenie si ę 
pozostałości związanych znacz ąco redukuje biodost ępność 
i bioprzyswajalno ść (12) (zmodyfikowane w stosunku do IUPAC 
1984 (13)).  
Przemiany tlenowe:  reakcje zachodz ące w obecno ści tlenu cz ąstecz­
kowego (14).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Przemiany beztlenowe:  reakcje zachodz ące z wykluczeniem tlenu 
cząsteczkowego (14).  
Gleba:  jest mieszanin ą składników chemicznych mineralnych 
i organicznych, te drugie zawieraj ą związki o wysokiej zawarto ści 
węgla i azotu, i o wysokiej masie atomowej, o żywioną przez drobne 
(najczęściej mikro-) organizmy. Gleba mo że występować w dwóch 
stanach:  
a) niezak łóconym, tak jak si ę rozwija ła z up ływem czasu, 
z charakterystycznymi warstwami ró żnych rodzajów gleb;  
b) zakłóconym, jak to ma na ogó ł miejsce na polach uprawnych lub 
kiedy próbki s ą pobierane przez kopanie i stosowane w tej meto ­
dzie badawczej (14).  
Mineralizacja:  to całkowita degradacja zwi ązku organicznego do 
CO 2 i H  2 O w warunkach tlenowych lub CH  4 , CO  2 i H  2 O 
w warunkach beztlenowych. W kontek ście tej metody badawczej, 
w której stosowane s ą związki znakowane  14 C, mineralizacja 
oznacza ekstensywn ą degradacj ę, podczas której znaczone atomy 
węgla są utleniane z wydzieleniem odpowiedniej ilo ści 14 CO 2 (14).  
Okres pó łtrwania:  t 0,5 to czas potrzebny do przemiany 50 % 
substancji badanej, je żeli przemiana mo że zostać opisana kinetyk ą 
pierwszego rz ędu; nie zale ży od stężenia.  
DT 50 (czas zaniku 50):  czas, w którym st ężenie substancji badanej 
zmniejsza si ę o 50 %; ta wielko ść różni się od okresu pó łtrwania t  0,5 , 
jeżeli przemiana nie mo że zostać opisana kinetyk ą pierwszego rz ędu. 
DT 75 (czas zaniku 75):  czas, w jakim st ężenie substancji badanej 
zmniejsza si ę o 75 %.  
DT 90 (czas zaniku 90):  czas, w jakim st ężenie substancji badanej 
zmniejsza si ę o 90 %.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Substancje odniesienia powinny by ć stosowane do charakteryzacji 
i/lub identyfikacji produktów przemian przy pomocy metod spektro ­
skopowych i chromatograficznych.  
1.4. ZASTOSOWANIE BADANIA  
Metoda mo że być stosowana do wszystkich substancji chemicznych 
(nieznakowanych lub znakowanych izotopowo), dla których jest dostępna metoda analityczna o wystarczaj ącej czu łości 
i dokładności. Może być stosowana do zwi ązków słabo lotnych, 
nielotnych, rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych w wodzie. Badanie nie powinno by ć stosowane do substancji chemicznych 
o wysokiej lotno ści z gleby (np. fumigantów, rozpuszczalników 
organicznych), które nie mog ą utrzymać się w glebie w warunkach 
eksperymentalnych badania.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMACJE O SUBSTANCJI BADANEJ  
Nieznakowane i znakowane izotopowo substancje badane mog ą być 
stosowane do pomiaru tempa przemian. Materia ł znakowany jest 
wymagany do badania szlaków przemian i do okre ślenia bilansu 
masowego. Zaleca si ę znakowanie izotopem  14 C, ale inne izotopy, 
takie jak  13 C, 15 N, 3 H, 32 P, także mogą być użyteczne. Na tyle, na 
ile jest to mo żliwe, znacznik powinien by ć umiejscowiony 
w najbardziej stabilnej cz ęści (częściach) cz ąsteczki (  1 ). Czysto ść 
substancji badanej powinna wynosi ć przynajmniej 95 %.  
Przed przyst ąpieniem do bada ń przemian tlenowych i beztlenowych 
w glebie, powinny by ć dostępne następujące informacje na temat 
substancji badanej:  
a) rozpuszczalno ść w wodzie (metoda A.6),  
b) rozpuszczalno ść w rozpuszczalnikach organicznych,  
c) prężność pary (metoda A.4) i sta ła proporcjonalno ści w prawie 
Henry'ego,  
d) współczynnik podzia łu n-oktanol/woda (metoda A.8),  
e) stabilno ść chemiczna w ciemno ści (hydroliza) (metoda C.7),  
f) pK  a , jeżeli moleku ła jest podatna na protonowanie lub deproto ­
nowanie (wytyczne OECD 112) (16).  
Inne przydatne informacje mog ą obejmowa ć dane na temat toksycz ­
ności substancji badanej dla mikroorganizmów w glebie (metody 
badawcze C.21 i C.22) (16).  
Powinny by ć dostępne metody analityczne (w tym metody ekstrakcji 
i czyszczenia) do oznaczania ilo ściowego i identyfikacji substancji 
badanej i jej produktów przemian.  
1.6. ZASADA METODY BADAWCZEJ  
Próbki gleby s ą poddawane dzia łaniu substancji badanej 
i inkubowane w ciemno ści w kolbie biometrycznej lub w uk ładzie 
przepływowym, w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (w 
stałej temperaturze i wilgotno ści gleby). W odpowiednich odst ępach 
czasu próbki gleby s ą ekstrahowane i analizowane pod k ątem obec ­
ności substancji macierzystej i produktów przemian. Produkty lotne 
są także pobierane do analizy przy u życiu odpowiednich urz ądzeń do 
ich absorpcji. Stosuj ąc materia ł znakowany izotopem  14 C, można 
mierzyć różne stopnie mineralizacji substancji badanej poprzez 
pułapkowanie wydzielonego  14 CO 2 i można określić bilans masowy, 
obejmujący tworzenie pozosta łości związanych w glebie.  
1.7. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
1.7.1.  Odzysk  
Ekstrakcja i analiza przynajmniej podwójnych próbek gleby natych ­
miast po dodaniu substancji badanej daje, pierwsze wskazanie co do 
powtarzalno ści metody analitycznej i jednorodno ści procedury poda ­
wania substancji badanej. Odzysk dla nast ępnych etapów ekspery ­
mentu jest podawany przez odnosz ący się do nich bilans masowy. 
Odzysk powinien mie ścić się w zakresie 90–110 % dla znakowanych 
substancji chemicznych (8) i 70–110 % dla nieznakowanych substancji chemicznych (3).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Na przyk ład jeżeli substancja badana zawiera jeden pier ścień, wymagane jest znakowanie 
na tym pier ścieniu; je żeli substancja badana zawiera dwa lub wi ęcej pierścieni, mog ą być 
potrzebne oddzielne badania w celu oceny losu ka żdego znakowanego pier ścienia i w 
celu otrzymania odpowiednich informacji na temat powstawania produktów przemian.
 1.7.2.  Powtarzalno ść i czułość metody analitycznej  
Powtarzalno ść metody analitycznej (wy łączając sprawno ść 
początkowej ekstrakcji) dla oznaczenia ilo ściowego substancji 
badanej i produktów przemian mo że zostać sprawdzona przez 
powtórną analizę tego samego ekstraktu z gleby inkubowanej 
wystarczaj ąco długo, aby dosz ło do wytworzenia produktów prze ­
mian.  
Granica wykrywalno ści (LOD) metody analitycznej dla badanej 
substancji i produktów przemian powinna wynosi ć co najmniej 
0,01 mg × kg  -1 gleby (dla substancji badanej) lub 1 % podanej 
dawki, w zale żności od tego, co jest ni ższe. Granica kwantyfikacji 
(LOQ) tak że powinna zosta ć określona.  
1.7.3.  Dok ładność danych przemian  
Analiza regresji st ężeń substancji badanej w funkcji czasu daje odpo ­
wiednie informacje o rzetelno ści krzywej przemian i pozwala na 
obliczenie granic przedzia łu ufności dla okresu pó łtrwania (w przy ­
padku kinetyki pseudo pierwszorz ędowej) lub warto ści DT  50 oraz 
w razie potrzeby warto ści DT  75 i DT  90 . 
1.8. OPIS METODY  
1.8.1.  Wyposa żenie i odczynniki  
Układ inkubacyjny sk łada się ze statycznych systemów zamkni ętych 
lub odpowiednich systemów przep ływowych (7)(17). Przyk łady 
odpowiedniej aparatury do przep ływowej i kolby biometrycznej do 
inkubacji gleby s ą przedstawione odpowiednio na rys. 1 i 2. Obydwa 
systemy inkubacyjne maj ą swoje zalety i ograniczenia (7)(17).  
Wymagane jest standardowe wyposa żenie laboratoryjne, zw łaszcza 
następujące: 
— instrumenty analityczne, takie jak aparaty do GLC, HPLC, TLC, 
włączając w to odpowiednie uk łady detekcji do analizy 
substancji znakowanych i nieznakowanych izotopowo lub 
metodę inwersji rozrzedzonych izotopów,  
— instrumenty do celów identyfikacji (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, 
NMR itp.),  
— cieczowy licznik scyntylacyjny,  
— aparat do przeprowadzania utleniania do spalania materia łów 
radioaktywnych,  
— wirówka,  
— aparatura do ekstrakcji (na przyk ład wirówka rurowa do zimnej 
ekstrakcji i aparat ekstrakcyjny Soxhleta do ci ągłej ekstrakcji pod 
chłodnicą zwrotną), 
— instrumenty do zat ężania roztworów i ekstraktów (np. wirówka 
próżniowa),  
— łaźnia wodna,  
— mieszad ła mechaniczne (np. zgniatarka, mikser obrotowy).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Do stosowanych odczynników zalicza si ę na przyk ład: 
— NaOH, czysty do analizy, 2 mol · dm  -3 , lub inne odpowiednie 
zasady (np. KOH, etanoloamina),  
— H  2 SO 4 , czysty do analizy, 0,05 mol · dm  -3 , 
— glikol etylenowy, czysty do analizy,  
— stałe materia ły absorpcyjne, takie jak wapno sodowe 
i poliuretanowe wk łady, 
— rozpuszczalniki organiczne, czyste do analizy, takie jak aceton, 
metanol itp.,  
— ciecz scyntylacyjna.  
1.8.2.  Podawanie substancji badanej  
W celu dodania i rozprowadzenia w glebie substancja badana mo że 
być rozpuszczona w wodzie (dejonizowanej lub destylowanej) lub 
w razie potrzeby w minimalnej ilo ści acetonu lub innego rozpusz ­
czalnika organicznego (6), w jakiej substancja badana jest wystar ­
czająco rozpuszczalna i stabilna. Jednak że ilość wybranego rozpusz ­
czalnika nie powinna mie ć znaczącego wpływu na aktywno ść mikro­
biologiczn ą gleby (zob. sekcje 1.5 i 1.9.2–1.9.3). Nale ży unikać 
stosowania rozpuszczalników, które inhibituj ą aktywno ść mikrobio ­
logiczną, takich jak: chloroform, dichlorometan i inne rozpuszczal ­
niki fluorowcowane.  
Substancja badana mo że być również dodana w stanie sta łym, np. 
wymieszana z piaskiem kwarcowym (6) lub w ma łej podpróbce 
badanej gleby, która zosta ła wysuszona na powietrzu 
i wysterylizowana. Je żeli substancja badana jest dodawana przy 
użyciu rozpuszczalnika, rozpuszczalnik powinien zosta ć odparowany 
przed dodaniem szczytowej podpróbki do w łaściwej, niesterylnej 
próbki gleby.  
Dla większości substancji chemicznych, których g łówną drogą 
dostępu do gleby jest osad ściekowy/zastosowania rolnicze, 
substancja badana powinna zosta ć najpierw dodana do szlamu, 
który nast ępnie jest wprowadzany do próbki gleby (zob. sekcje 
1.9.2 i 1.9.3).  
Stosowanie gotowych produktów nie jest rutynowo zalecane. 
Jednakże np. dla s łabo rozpuszczalnych substancji badanych zasto ­
sowanie gotowych materia łów może być odpowiednim rozwi ąza­
niem.  
1.8.3.  Gleby  
1.8.3.1.  Wybór gleb  
Do określenia szlaków przemian, mo że być stosowana gleba repre ­
zentatywna, glina piaszczysta, glina i łowa, glina, lub piasek gliniasty 
(zgodnie z klasyfikacj ą FAO i USDA (18)), o pH 5,5–8,0, zawar ­
tości węgla organicznego 0,5–2,5 % i mikrobiologicznej biomasie 
stanowiącej co najmniej 1 % ca łkowitej zawarto ści węgla organicz ­
nego (10).  
Do badania tempa przemian powinny zosta ć użyte przynajmniej trzy 
dodatkowe gleby reprezentuj ące szereg istotnych gleb. Te gleby 
powinny mie ć różną zawartość węgla organicznego, pH, zawarto ść 
gliny i mikrobiologicznej biomasy (10).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Wszystkie gleby powinny zosta ć scharakteryzowane, przynajmniej 
pod wzgl ędem tekstury ( % piasku, % i łów, % gliny) (zgodnie 
z klasyfikacj ą FAO i USDA (18)), pH, pojemno ści wymiany 
kationowej, w ęgla organicznego, g ęstości nasypowej, w łasności 
retencji wody (  1 ) i mikrobiologicznej biomasy (tylko do bada ń 
w warunkach natlenienia). Dodatkowe informacje na temat w łaści­
wości gleby mog ą być przydatne przy interpretacji wyników. Dla 
określenia własności gleby mog ą być stosowane zalecane metody 
przedstawione w literaturze (19)(20)(21)(22)(23). Mikrobiologiczna 
biomasa powinna by ć oznaczona z wykorzystaniem metody respi ­
racji wywo łanej przez substrat (SIR) (25)(26) lub metodami alterna ­
tywnymi (20).  
1.8.3.2.  Pobieranie, przenoszenie i przechowywanie gleb  
Powinny by ć dostępne szczegó łowe informacje na temat historii 
obszaru, z jakiego zosta ła pobrana badana próbka gleby. Szczegó ­ 
łowe informacje powinny obejmowa ć dokładną lokalizacj ę, szatę 
roślinną, poddawanie dzia łaniu substancji chemicznych, poddawanie 
działaniu nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki mate ­
riałów biologicznych lub inne zanieczyszczenia. Gleby, które by ły 
poddawane dzia łaniu substancji badanej lub jej strukturalnych 
analogów w ci ągu ostatnich czterech lat, nie powinny by ć używane 
do badania przemian (10)(15).  
Gleba powinna by ć świeżo zebrana z pola (z poziomu A lub 
z wierzchniej warstwy o grubo ści 20 cm), z tak ą zawarto ścią 
wody, jaka u łatwia przesiewanie. Dla gleb innych ni ż gleby z pól 
ryżowych, powinno si ę unikać pobierania próbek podczas lub 
bezpośrednio po d ługich okresach (> 30 dni) suszy, mrozu, zale ­
wania (14). Próbki powinny by ć transportowane w sposób, który 
minimalizuje zmiany zawarto ści wody w glebie oraz powinny by ć 
przechowywane w ciemnym miejscu, z mo żliwie swobodnym 
dostępem powietrza. Na ogó ł do tego celu wystarczaj ąca jest lu źno 
związana torba polietylenowa.  
Gleba powinna zosta ć przetworzona mo żliwie szybko po pobraniu 
próbki. Ro ślinność, większe okazy fauny glebowej oraz kamienie 
powinny zosta ć usunięte przed przesianiem gleby przez 2 mm 
sito, które usuwa drobne kamienie, okazy fauny i szcz ątki roślin. 
Należy unikać intensywnego suszenia i kruszenia gleby przed prze ­
siewaniem (15).  
Jeżeli zimą pobieranie próbek z pola jest trudne (gleba zamarzni ęta 
lub pokryta warstw ą śniegu), mo żna pobrać próbkę z partii gleby 
przechowywanej w szklarni pod pokryciem ro ślinnym (np. trawa 
lub mieszanina trawy i koniczyny). Zdecydowanie preferuje si ę 
badanie gleb świeżo pobranych z terenu, ale je żeli zebrana 
i przetworzona gleba musi by ć przechowywana przed rozpocz ęciem 
badań, przechowywanie musi by ć w odpowiednich warunkach 
i tylko przez ograniczony czas (4 ± 2  o C przez maksymalnie trzy 
miesiące), aby utrzyma ć aktywno ść mikrobiologiczn ą ( 2 ). Szczegó ­ 
łowe instrukcje pobierania, obchodzenia si ę i przechowywania gleby, 
przeznaczonej do eksperymentów z bioprzemianami, mo żna znaleźć 
w (8)(10)(15)(26)(27).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) Własności retencji wody gleby mo żna zmierzy ć jako pojemno ść połowa, jako pojemno ść 
wodna lub jako si ła ssąca gleby (pF). Wyja śnienia zamieszczono w za łączniku 
1. W sprawozdaniu z bada ń należy podać, czy własności retencji wody i g ęstość nasy­
pową gleb okre ślono w próbkach z terenu niezaburzonego, czy w próbkach zaburzonych 
(przetworzonych). 
( 2 ) Ostatnie wyniki bada ń pokazują, że gleby ze stref umiarkowanych równie ż mogą być 
przechowywane w temp. –20  o C przez okres d łuższy niż trzy miesi ące (28)(29) bez 
znaczących strat aktywno ści mikrobiologicznej.
 Przed użyciem przetworzonej gleby w tym badaniu, powinna ona 
być wstępnie inkubowana, aby umo żliwić kiełkowanie i usuni ęcie 
nasion, i aby przywróci ć równowag ę metabolizmu mikrobiologicz ­
nego nast ępującą po przeniesieniu próbki z pola lub z warunków 
przechowywania do warunków inkubowania. Na ogó ł wystarczaj ący 
jest okres wst ępnej inkubacji 2–28 dni, w temperaturze i wilgotno ści 
zbliżonych do tych, jakie panuj ą w czasie w łaściwego badania (15). 
Czas przechowywania i wst ępnej inkubacji łącznie nie powinien 
przekracza ć trzech miesi ęcy. 
1.9. PROWADZENIE BADA Ń 
1.9.1.  Warunki badania  
1.9.1.1.  Temperatura badania  
Podczas ca łego okresu badania gleby powinny by ć inkubowane 
w ciemno ści w stałej temperaturze reprezentatywnej dla warunków 
klimatycznych, w których wyst ąpi wykorzystanie lub uwolnienie 
substancji badanej. Zaleca si ę temperatur ę około 20 ± 2  o C dla 
wszystkich substancji badanych, jakie mog ą przenikn ąć do gleby 
w klimacie umiarkowanym. Temperatura powinna by ć monitoro ­
wana.  
Dla substancji chemicznych podawanych lub uwalnianych do gleby 
w chłodniejszych strefach klimatycznych (np. w krajach pó łnocnych, 
podczas okresów jesieni/zimy) powinno si ę inkubowa ć dodatkowe 
próbki gleby, ale w ni ższej temperaturze (np. 10 ± 2  o C). 
1.9.1.2.  Zawarto ść wilgoci  
Do badań przemian w warunkach natlenienia powinna zosta ć skory­
gowana zawarto ść wilgoci (  1 ) i powinna by ć utrzymywana na 
poziomie pF od 2,0 do 2,5 (3). Zawarto ść wilgoci jest wyra żana 
jako masa wody na mas ę suchej gleby i powinna by ć regularnie 
kontrolowana (np. w odst ępach dwutygodniowych) przez wa żenie 
kolby inkubacyjnej, a straty wody powinny by ć kompensowane 
przez dodawanie wody (najlepiej sterylnie filtrowana woda z kranu). Nale ży uważać, by uniemo żliwić lub zminimalizowa ć 
straty substancji badanej i/lub produktów transformacji w wyniku 
ulatniania si ę i/lub fotodegradacji (je śli zachodzi) podczas uzupe ł­
niania wilgoci.
 
Do badania przemian w warunkach beztlenowych i dla warunków 
pól ryżowych, gleba jest nasycana wod ą przez zalewanie.  
1.9.1.3.  Inkubacja w warunkach tlenowych  
W systemach przep ływowych warunki natlenienia b ędą utrzymane 
w wyniku przerywanego przep ływu cieczy lub ci ągłej wentylacji 
nawilżonym powietrzem. W kolbach biometrycznych wymiana 
powietrza jest uzyskiwana przez dyfuzj ę. 
1.9.1.4.  Sterylne warunki tlenowe  
Aby uzyska ć informacje na temat znaczenia abiotycznej przemiany 
substancji badanej, próbki gleby mog ą zostać wysterylizowane 
(metody sterylizacji zob. poz. bibliograficzne (16) i (29)), 
poddawane dzia łaniu sterylnych substancji badanych (np. dodawanie 
roztworu przez filtr sterylny) i natleniane nawil żonym sterylnym 
powietrzem zgodnie z opisem w sekcji 1.9.1.3. Dla gleb pod mokre uprawy ry żu gleba i woda powinny by ć sterylizowane 
i inkubacja powinna by ć prowadzona jak opisano w sekcji 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) Gleba nie powinna by ć ani za mokra, ani za sucha, aby utrzyma ć odpowiednie napowiet ­
rzenie i od żywienie mikroflory glebowej. Zawarto ść wilgoci zalecana dla optymalnego 
wzrostu mikrobiologicznego mie ści się z zakresie od 40–60 % zdolno ści utrzymywania 
wody (WHC) i 0,1–0,33 bara (6). Ten drugi zakres jest równowa żny zakresowi pF 
2,0–2,5. Typowe zawarto ści wilgoci ró żnych rodzajów gleb s ą podane w za łączniku 2.
 1.9.1.5.  Beztlenowe warunki inkubacji  
Aby stworzy ć i utrzyma ć warunki beztlenowe, gleba jest 
poddawana dzia łaniu substancji badanej i inkubowana 
w warunkach natlenienia przez 30 dni lub jeden okres pó łtrwania 
lub DT  50 (w zależności od tego, który jest krótszy), nast ępnie jest 
zalewana wod ą (warstwa 1–3 cm wody nad powierzchni ą) 
i system inkubowania jest przep łukiwany strumieniem gazu oboj ęt­
nego (np. azot lub argon) (  1 ). Układ badawczy musi pozwala ć na 
pomiary takie, jak pH, st ężenie tlenu i potencja ł redoks oraz 
zawierać urządzenie do wychwytywania produktów lotnych. 
Układ biometryczny musi by ć zamknięty i uniemo żliwiać dosta­
wanie się powietrza poprzez dyfuzj ę. 
1.9.1.6.  Warunki inkubacji mokrej uprawy ry żu 
Do badania przemian w warunkach mokrej uprawy ry żu, gleba jest 
zalewana warstw ą wody o grubo ści warstwy oko ło l–5cm, 
a substancja badana jest dodawana do fazy wodnej (9). Zaleca si ę 
głębokość gleby przynajmniej 5 cm. System jest wentylowany 
powietrzem, tak jak w warunkach natlenienia. Nale ży monitorowa ć 
i podawa ć pH, stężenie tlenu i potencja ł redoks warstwy wody. 
Niezbędny jest przynajmniej dwutygodniowy okres wst ępnej inku ­
bacji przed rozpocz ęciem bada ń przemian (zob. sekcja 1.8.3.2).  
1.9.1.7.  Czas trwania bada ń 
Czas badania stopnia przemian i ich szlaków nie powinien przekra ­
czać 120 dni (  2 ) (3)(6)(8), poniewa ż można oczekiwa ć, że po tym 
czasie spadnie aktywno ść mikrobiologiczna w sztucznych warunkach 
laboratoryjnych izolowanych od naturalnej wymiany sk ładników. 
Jeżeli jest to konieczne do scharakteryzowania zaniku substancji 
badanej, a tak że tworzenia i zaniku g łównych produktów przemian, 
badania mog ą być prowadzone w d łuższym okresie czasu (np. 6 lub 
12 miesięcy) (8). Powody d łuższej inkubacji powinny zosta ć przed­
stawione w sprawozdaniu z bada ń i powinny by ć dołączone pomiary 
biomasy sporz ądzone podczas i na ko ńcu tego okresu.  
1.9.2.  Prowadzenie bada ń 
Około 50–200 g gleby (w suchej masie) jest umieszczane w ka żdej 
kolbie inkubacyjnej (zob. rysunki 1 i 2 w za łączniku 3), a nast ępnie 
gleba jest poddawana dzia łaniu substancji badanej jedn ą z metod 
przedstawionych w sekcji 1.8.2. Je żeli stosowane s ą rozpuszczalniki 
organiczne do podania substancji badanej, nale ży je usun ąć z gleby 
poprzez odparowanie. Nast ępnie gleba jest dok ładnie mieszana przy 
pomocy szpatu łki i/lub poprzez wstrz ąsanie kolby. Je żeli badanie jest 
prowadzone w warunkach mokrej uprawy ry żu, gleba z wod ą 
powinny zosta ć dokładnie wymieszane po dodaniu substancji bada ­
nej. Małe podwielokrotno ści (np. 1 g) gleby poddanej dzia łaniu 
powinny by ć analizowane pod k ątem substancji badanej w celu 
sprawdzenia równomiernego rozk ładu. Dla metody alternatywnej, 
zob. poni żej. ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) Warunki tlenowe dominuj ą w glebach powierzchniowych i nawet w glebach 
podpowierzchniowych, jak pokazano w pracy badawczej sponsorowanej przez UE [K. 
Takagi et al. (1992). Microbial dirersity and activity in subsoils: Methods, field site, 
seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environment. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17–21 sierpnia 1992 r., Sigtuna, 
Szwecja]. Warunki beztlenowe mog ą występować jedynie okazjonalnie podczas zale ­
wania gleb po silnych opadach deszczu lub kiedy na polach ry żowych są tworzone 
warunki ry żowe. 
(
 2 ) Badania tlenowe mog ą być zakończone przed up ływem 120 dni, pod warunkiem że 
w tym czasie jednoznacznie zostanie osi ągnięta ostateczna ścieżka przemiany 
i ostateczna mineralizacja. Zako ńczenie badania jest mo żliwe po 120 dniach lub kiedy 
zostanie przemienione przynajmniej 90 % substancji badanej, ale tylko wtedy, gdy 
utworzy si ę przynajmniej 5 % C0  2 .
 Stopień poddania dzia łaniu substancji badanej powinien odpowiada ć 
największemu stopniowi podania środka ochrony upraw zalecanemu 
w instrukcji stosowania i jednorodnemu wprowadzeniu na odpo ­
wiednią głębokość na polu (np. górna warstwa 10 cm (  1 ) gleby 
(7)). Na przyk ład dla substancji chemicznych stosowanych na li ście 
lub na gleb ę bez wprowadzania do niej, odpowiednia g łębokość do 
obliczenia, ile substancji chemicznej nale ży dodać do kolby wynosi 
2,5 cm. Dla substancji chemicznych wprowadzanych do gleby, odpo ­
wiednia g łębokość jest g łębokością wprowadzania okre śloną 
w instrukcji stosowania. Dla wi ększości substancji chemicznych 
podawaną ilość należy oszacowa ć na podstawie najbardziej istotnego 
szlaku wnikania; na przyk ład jeżeli główny szlak wnikania w gleb ę 
prowadzi przez osad ściekowy, substancja chemiczna powinna by ć 
dozowana do osadu w st ężeniu, które odzwierciedla oczekiwane 
stężenie w osadzie, a ilo ść osadu dodawanego do gleby powinna 
odzwierciedla ć zwykłe wprowadzanie osadu do gleby uprawnej. 
Jeżeli to stężenie nie jest wystarczaj ąco wysokie do zidentyfikowania 
głównych produktów przemian, pomocna powinna by ć inkubacja 
oddzielnej próbki gleby zawieraj ącej wyższe stężenie, nale ży jednak 
unikać stężeń, które po przekroczeniu pewnego poziomu wp ływają 
na mikrobiologiczne funkcje w glebie (zob. sekcje 1.5 i 1.8.2).  
Alternatywnie, mo żna podda ć działaniu substancji badanej wi ększą 
partię gleby (to jest 1–2 kg), dok ładnie mieszaj ąc w odpowiednim 
urządzeniu do mieszania, i nast ępnie przenie ść w małych porcjach 
50–200 g do kolby inkubacyjnej (na przyk ład stosując rozdzielacz do 
próbek). Ma łe podwielokrotno ści (np. 1 g) partii gleby poddanej 
działaniu substancji badanej powinny by ć analizowane na jej obec ­
ność w celu sprawdzenia równomierno ści rozprowadzenia. Procedura 
ta jest preferowana, poniewa ż umożliwia bardziej równomierne 
rozprowadzenie substancji badanej w glebie.  
Także próbki gleby niepoddane dzia łaniu substancji badanej inku ­
buje się w tych samych warunkach (natlenienia), jak próbki poddane 
jej działaniu. Próbki te stosowane s ą do pomiarów biomasy podczas 
badań i na ich koniec.  
Jeżeli substancja badana podawana jest w postaci rozpuszczonej 
w rozpuszczalniku (rozpuszczalnikach) organicznym, próbki gleby traktowane tak ą samą ilością rozpuszczalnika (rozpuszczalników) 
są inkubowane w tych samych warunkach (natlenienia), jak próbki 
gleby poddanej dzia łaniu substancji badanej. Te próbki u żywane do 
pomiarów biomasy na pocz ątku, w trakcie i na ko ńcu badań, w celu 
określenia wpływu rozpuszczalnika (rozpuszczalników) na biomas ę 
mikrobiologiczn ą.
 
Kolby zawieraj ące glebę poddaną działaniu badanej substancji s ą 
albo podłączone do systemu przep ływowego opisanego na rys. 1, 
albo zamykane kolumn ą absorpcyjn ą przedstawion ą na rys. 2 (zob. 
załącznik 3).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) Obliczenie st ężenia pocz ątkowego na powierzchni z wykorzystaniem nast ępującego 
równania:  
C soil mg =kg soil ½ â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d kg  soil=m 3 h i  
C soil = Stężenie pocz ątkowe stężenie w glebie (mg · kg -1 ). 
A = Podana ilo ść [kg· ha -1 ]; 1 = grubo ść warstwy gleby z pola (m); d = g ęstość 
nasypowa sucha gleby (kg · m -3 ). 
Z reguły podana ilo ść 1 kg· ha  -1 powoduje st ężenie w glebie oko ło l mg· kg  -1 
w warstwie o grubo ści 10 cm (przy za łożeniu gęstości nasypowej 1 g · cm  -3 ).
 1.9.3  Pobieranie próbek i pomiar  
Dwie kolby inkubacyjne s ą usuwane w odpowiednich odst ępach 
czasu i próbki gleby s ą ekstrahowane odpowiednimi rozpuszczalni ­
kami o ró żnej polarno ści, a następnie analizuje si ę ich zawarto ść pod 
kątem substancji badanej i/lub produktów przemian. W dobrze 
zaprojektowanych badaniach jest wystarczaj ąca liczba kolb, tak aby 
można było poświęcić dwie kolby dla ka żdego poboru próbek. 
Także, roztwory absorpcyjne i absorbenty sta łe są usuwane 
w różnych odst ępach czasu (co 7 dni przez pierwszy miesi ąc, 
a potem w odst ępach 17 dniowych) podczas i na zako ńczenie inku ­
bacji każdej gleby i analizowane pod k ątem produktów lotnych. Poza 
tym, dla próbki gleby pobranej zaraz po podaniu (próbka z dnia 0) 
powinno si ę przygotowa ć przynajmniej 5 dodatkowych punktów 
pomiarowych. Odst ępy czasu powinny by ć tak dobrane, aby 
można było określić profil zaniku substancji badanej i profil 
tworzenia i zaniku produktów przemian (np. 0, 1, 3, 7 dni; 2, 3 
tygodnie; 1, 2, 3 miesi ące itd.).  
Jeżeli stosowane s ą substancje badane znakowane izotopem  14 C, 
niewyekstrahowane izotopy promieniotwórcze b ędą kwantyfikowane 
przy pomocy spalania, a dla ka żdego odst ępu próbkowania b ędzie 
obliczany bilans masy.  
W przypadkach inkubacji w warunkach beztlenowych i w warun ­
kach mokrej uprawy ry żu faza glebowa i faza wodna s ą analizowane 
razem na obecno ść substancji badanej i produktów przemian lub 
rozdzielane przy pomocy filtracji lub odwirowania przed ekstrakcj ą 
i analizą. 
1.9.4  Badania opcjonalne  
Badania w warunkach natlenienia i braku sterylno ści w dodatkowym 
zakresie temperatur i wilgotno ści gleby mog ą być przydatne do 
oszacowania wp ływu temperatury i wilgotno ści gleby na tempo prze ­
mian substancji badanej i/lub produktów przemian w glebie.  
Można podjąć próbę dalszej charakteryzacji izotopów promienio ­
twórczych, które nie uleg ły ekstrakcji, stosuj ąc na przyk ład 
ekstrakcję płynem nadkrytycznym.  
2. DANE  
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW  
Ilości substancji badanej, produktów przemian, substancji lotnych 
(tylko w %) i nieulegaj ących ekstrakcji powinny zosta ć podane 
jako % zastosowanego st ężenia pocz ątkowego i tam, gdzie to doty ­
czy, jako mg · kg  -1 gleby (na podstawie suchej masy gleby) dla 
każdego odst ępu pobierania próbek. Bilans masy nale ży podać 
w procencie zastosowanego st ężenia pocz ątkowego dla ka żdego 
odstępu pobierania próbek. Graficzna prezentacja st ężenia substancji 
badanej w zale żności od czasu pozwoli na oszacowanie okresu 
półtrwania lub DT  50 . Główne produkty przemian powinny zosta ć 
zidentyfikowane, a ich st ężenia także powinny zosta ć wykreślone 
w zależności od czasu, w celu przedstawienia ich tempa powsta ­
wania i zaniku. G łównym produktem przemian jest ka żdy produkt 
stanowiący >10 % podanej dawki zmierzony w którymkolwiek 
momencie podczas bada ń. 
Pułapkowane produkty lotne daj ą pewien wska źnik odno śnie do 
potencjału lotności substancji badanej i jej produktów przemian 
pochodzących z gleby.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Przez zastosowanie oblicze ń z odpowiednim modelem kinetycznym 
powinno si ę otrzymać dokładniejsze okre ślenie okresu pó łtrwania lub 
wartości DT  50 i, w miar ę potrzeby, warto ści DT  75 i DT  90 . Okres 
półtrwania i warto ści DT  50 powinny by ć podane razem z opisem 
stosowanej metody, rz ędowości kinetyki i wspó łczynnikiem determi ­
nacji (r  2 ). Preferowana jest kinetyka pierwszego rz ędu, chyba że r 2 
< 0,7. Je śli jest to odpowiednie, obliczenia powinny zosta ć także 
wykonane dla g łównych produktów przemian. Przyk łady odpowied ­
nich modeli s ą opisane w pozycjach bibliograficznych 31 i 35.  
W przypadku bada ń tempa prowadzonych w ró żnych temperaturach, 
tempo przemian powinno zosta ć opisane w funkcji temperatury dla 
zakresu temperatur eksperymentu, przy u życiu zależności Arrheniusa 
w postaci:  
k ¼ A ÄB=T lub lnk ¼ 1nA Ä B 
T 
gdzie ln A i B s ą stałymi regresji wyznaczonymi odpowiednio z 
przecięcia i nachylenia najlepszej krzywej dopasowania otrzymanej 
z regresji liniowej ln k od l/T, k jest sta łą tempa reakcji 
w temperaturze T, gdzie T jest wyra żone w kelwinach. Nale ży 
uważać na ograniczony zakres temperatur, w którym spe łnione jest 
równanie Arreheniusa w przypadku przemian zale żnych od aktyw ­
ności mikrobiologicznej.  
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Choć badania s ą prowadzone w sztucznych warunkach laboratoryj ­
nych, wyniki pozwol ą na ocenę tempa przemian substancji badanej, 
a także tempa powstawania i zaniku produktów przemian 
w warunkach panuj ących w terenie (36)(37).  
Badanie szlaków przemian substancji badanej dostarcza informacji 
o sposobie, w jaki podana substancja zostaje zmieniona pod 
względem strukturalnym w glebie w wyniku reakcji chemicznych 
i mikrobiologicznych.  
3. SPRAWOZDANIE  
RAPORT Z BADA Ń 
Sprawozdanie z bada ń musi zawiera ć: 
Substancja badana:  
— nazwę zwyczajow ą, nazwę systematyczn ą, numer CAS, wzór 
strukturalny (ze wskazaniem pozycji znacznika(-ów), je żeli jest 
zastosowany materia ł znakowany izotopowo) oraz odno śne 
właściwości fizyczno-chemiczne (zob. sekcja 1.5),  
— stopie ń czystości substancji badanej (zanieczyszczenia),  
— stopie ń czystości radiochemicznej znakowanych substancji 
chemicznych i rodzaj aktywno ści (w razie potrzeby).  
Substancje odniesienia:  
— nazwa systematyczna i struktura substancji odniesienia stoso ­
wanej do charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów przemian.  
Badane gleby:  
— szczegó łowe informacje dotycz ące miejsca pobrania,  
— data i procedura pobierania próbek gleby,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— właściwości gleb, takie jak: pH, zawarto ść węgla organicznego, 
tekstura ( % piasku, % i łu, % gliny), pojemno ść wymiany katio ­
nowej, g ęstość nasypowa, w łasności retencji wody i biomasa 
mikrobiologiczna,  
— długość przechowywania gleby i warunki przechowywania (je żeli 
była przechowywana).  
Warunki bada ń: 
— daty wykonywania bada ń, 
— ilość podanej substancji badanej,  
— stosowane rozpuszczalniki i metoda podawania substancji bada ­
nej, 
— początkowa masa gleby poddanej dzia łaniu substancji badanej 
i ilość pobierana do analizy przy ka żdym odst ępie pobierania 
próbek,  
— opis stosowanego systemu inkubacyjnego,  
— stopie ń przepływu powietrza (tylko dla systemu przep ływowego),  
— temperatura prowadzenia eksperymentu;  
— nawilżenie gleby w czasie inkubacji,  
— biomasa mikrobiologiczna na pocz ątku, w trakcie i na zako ń­
czenie bada ń w warunkach natlenienia,  
— pH, st ężenie tlenu i potencja ł redoks pocz ątkowy, w trakcie i na 
zakończenie bada ń w warunkach beztlenowych i w warunkach 
mokrej uprawy ry żu, 
— metoda(y) ekstrakcji,  
— metody kwantyfikacji i identyfikacji substancji badanej oraz 
główne produkty przemian w glebie i absorbentach,  
— ilość powtórze ń i liczba próbek kontrolnych;  
Wyniki:  
— wynik oznaczenia aktywno ści mikrobiologicznej,  
— powtarzalno ść i czułość stosowanych metod analitycznych,  
— stopie ń odzysku ( % warto ści dla wa żnych bada ń podano 
w sekcji 1.7.1),  
— stabelaryzowane wyniki wyra żone jako % podanej pocz ątkowo 
dawki i w miar ę potrzeby, jako mg · kg -1 gleby (w suchej masie),  
— bilans masowy podczas i na zako ńczenie bada ń, 
— charakterystyka niepodlegaj ących ekstrakcji (zwi ązanych) 
izotopów lub pozosta łości w glebie,  
— kwantyfikacja uwolnionego CO  2 i innych lotnych zwi ązków,  
— wykresy st ężeń substancji badanej w glebie w zale żności od 
czasu, w miar ę potrzeby, dla g łównych produktów przemian,  
— okres pó łtrwania lub DT  50 , DT  75 i DT  90 dla substancji badanej 
i w miar ę potrzeby, dla g łównych produktów przemian, 
włączając w to granice przedzia łów ufności, ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— oszacowanie tempa degradacji abiotycznej w warunkach steryl ­
nych,  
— ocena kinetyki przemian substancji badanej w miar ę potrzeby 
głównych produktów przemian,  
— proponowane szlaki przemian, w miar ę potrzeby,  
— dyskusja i interpretacja wyników,  
— surowe dane (to jest, przyk ładowe chromatogramy, przyk ładowe 
obliczenia tempa przemian i średnie stosowane do identyfikacji 
produktów przemian).  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Grade 
Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.  
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(3) Unia Europejska (EU) (1995). Dyrektywa Komisji 95/36/EC 
z dnia 14 lipca 1995 zmieniaj ąca dyrektyw ę Rady 
91/414/EEC dotycz ącą wprowadzania do obrotu środków 
ochrony ro ślin. Załącznik II, cz ęść A i załącznik III, cz ęść 
A: Losy i zachowanie si ę w środowisku.  
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). 
Application for registration of a pesticide. Section G: Beha ­
viour of the product and its metabolites in soil, water and air.  
(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Priifung von Pflan ­
zenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutz ­
mitteln im Boden – Abbau, Umwandlung und Metabolismus.  
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory 
tests for biodegradation of organic chemicals in soil – Part 1: 
Aerobic conditions.  
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality. Laboratory incubation systems 
for measuring the mineralization of organic chemicals in soil 
under aerobic conditions.  
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(9) MAFF – Japan 2000 – Draft Guidelines for transformation 
studies of pesticides in soil – Aerobic metabolism study in 
soil under paddy field conditions (flooded).  
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selec ­
tion of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.  
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions 
between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic 
Press, 123–157.  
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley . VCH (1998).  
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945–956 (IUPAC 1984).  
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality – Sampling – Part 6: 
Guidance on the collection, handling and storage of soil for 
the grade of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(16) Załącznik V do dyrektywy 67/548/EEC.  
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85–114.
 
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed 
Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
 
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
ralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(20) Metodas of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Strona, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
 
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
– General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
 
(22) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologis ­
chen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologis ­
chen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
kunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.  
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological 
method for the quantitative measurement of microbial biomass 
in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215–221.  
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality – Determination of 
soil microbial biomass – Part 1: Substrate-induced respiration 
method. Part 2: fumigation-extraction method.  
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for 
pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. 
L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45–60.  
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation 
in the environment: Aerobic and biotransformation of pesti ­
cides in water solution environment. Proceedings of the 16th 
Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105–120.  
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on 
biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology 
and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).  
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K, Sten ­
strom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold 
storage of soil on microbial activities and biomass. In Pestici ­
des, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Euro ­
pe). 
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethy ­
lene oxide on soil microbial content and some chemical charac ­
teristics. Plant and Soil 102, 197–200.  
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte 
auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im 
Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141–146.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1304
 
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical model ­
ling to the soil persistence and accumulation of pesticides. 
Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbi ­
cides, 181–199.  
(33) Goring, C.A.I., Laskowski, D.A., Hamaker, J.W., Meikle, 
R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In 
„Environmental Dynamics of Pesticides”. R. Haque and V.H. 
Freed, Eds., 135–172.  
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpre ­
tation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz – Nachrichten 
Bayer 39, 188–204.  
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues. I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer 33, 
47–60.  
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissi ­
pation in soil; a new model based on spatial variability. Envi ­
ronm. Sci. Technol. 24, 1032–1041.  
(37) Hurle K, Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In 
Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), 
Academic Press, 83–122  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
ZAŁĄCZNIK 1  
NAPIĘCIE WODY, POJEMNO ŚĆ POLOWA GLEBY (FC) I POJEMNO ŚĆ WODNA 
(WHC)  ( 1 ) 
Wysokość słupa wody 
(cm) pF (  a ) bar (  b ) Uwagi  
10 7 7 10  4 Sucha gleba 
1,6*10  4 4,2 16 Pocz ątek więdnięcia 
10 4 4 10 
10 3 3 1 
6*10  2 2,8 0,6 
3,3*10  2 2,5 0,33 (  c ) 
Zakres pojemno ści 
polowej gleby (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5 0,033 10 1 0,01 WHC (w przybli żeniu) 
1 0 0,001 Gleba nasycona wod ą
 
( a ) pF = log z cm s łupa wody. 
( b ) l bar = 105 Pa. 
( c ) Odpowiada przybli żonej zawarto ści wody 10 % w piasku, 35 % w piasku gliniastym, 45 % w glinie. 
( d ) Pojemno ść polowa nie jest sta ła, ale zmienia si ę w zakresie pF od 1,5 do 2,5.  
Napięcie wody  jest mierzone w cm wysoko ści słupa wody lub w barach. Z powodu du żego zakresu 
napięcia kapilarnego jest wyra żane po prostu, jako warto ść pF, która jest równowa żna 
logarytmowi cm s łupa wody.  
Pojemność polowa  jest definiowana jako ilo ść wody, jaka mo że być przechowywana pomimo 
grawitacji przez naturaln ą ziemię przez 2 dni po d łuższym okresie opadów lub po odpowiedniej 
irygacji. Jest okre ślana w nienaruszonej glebie  in situ  w terenie. Ten pomiar nie mo że więc być 
stosowany do naruszonych, laboratoryjnych próbek gleb. Warto ści FC oznaczone w naruszonych 
glebach mog ą wykazywa ć większe odchylenia systematyczne.  
Pojemność wodna  (WHC) jest wyznaczana w laboratorium przy u życiu nienaruszonej i naruszonej 
gleby przez nasycanie s łupa gleby wod ą w wyniku ruchów kapilarnych. Jest to szczególnie 
użyteczne dla gleb naruszanych i mo że osiągać wartość do 30 % wy ższą niż największa pojemno ść 
polowa  8 . Jest te ż łatwiejsza do wyznaczenia eksperymentalnie, ni ż rzetelne wyznaczenie 
wartości FC.  
Uwagi  
( 1 ) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
ZAŁĄCZNIK 2  
ZAWARTO ŚĆ WILGOCI W GLEBIE (g wody na 100 g suchej gleby) DLA RÓ ŻNYCH 
RODZAJÓW GLEB Z RÓ ŻNYCH KRAJÓW  
Rodzaj gleby w danym kraju 
Wilgotno ść gleby Kraj 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Piasek Niemcy 28,7 8,8 3,9 
Piasek gliniasty Niemcy 50,4 17,9 12,1 Piasek gliniasty Szwajcaria 44,0 35,3 9,2 Glina ilasta Szwajcaria 72,8 56,6 28,4 Ił gliniasty Brazylia 69,7 38,4 27,3 
Ił gliniasty Japonia 74,4 57,8 31,4 
Glina piaszczysta Japonia 82,4 59,2 36,0 
Glina ilasta USA 47,2 33,2 18,8 
Glina piaszczysta USA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) pojemno ść wodna (WHC).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
ZAŁĄCZNIK 3  
Rysunek 1  
Przykłady aparatury przep ływowej do bada ń związków chemicznych w glebie  ( 1 ) ( 2 )
 
Rysunek 2  
Przykład kolby biometrycznej do bada ń przemian chemicznych w glebie  ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W UK ŁADACH 
OSADÓW WODNYCH  
1. METODA  
Ta metoda badawcza jest równowa żna z OECD TG 308 (2002).  
1.1. WPROWADZENIE  
Substancje chemiczne mog ą dostawać się do płytkich lub g łębokich 
wód powierzchniowych takimi szlakami, jak bezpo średnie wprowa ­
dzenie, znoszenie wód rozpylonych, sp ływ, odwadnianie, usuwanie 
odpadów, ścieki przemys łowe, gospodarcze lub rolnicze i opady 
atmosferyczne. Ta metoda badawcza opisuje metod ę laboratoryjn ą 
do oceny tlenowej i beztlenowej przemiany organicznych substancji chemicznych w uk ładach osadów wodnych. Jest oparta na istniej ­ 
ących wytycznych (1)(2)(3)(4)(5)(6). Podczas Warsztatów OECD na 
temat Selekcji Gleb/Osadów, które odby ły się w Belgirate, we 
Włoszech w 1995 (7), uzgodniono w szczególno ści liczbę i rodzaj 
osadów do stosowania w tym badaniu. Podano równie ż zalecenia 
odnoszące się do pobierania, przenoszenia i przechowywania próbek 
osadów, oparte na wytycznych ISO (8). Takie badania s ą wymagane 
dla substancji chemicznych, które s ą bezpośrednio wprowadzane do 
wody lub, co do których istnieje mo żliwość dostania si ę do środo­
wiska wodnego poprzez szlaki opisane powy żej.
 
Warunki w naturalnych uk ładach osadów wodnych s ą często tlenowe 
w górnej fazie wodnej. Warstwa powierzchniowa osadu mo że być 
zarówno natleniona, jak i niedotleniona, podczas gdy g łębsze osady 
są zazwyczaj beztlenowe. Aby uwzgl ędnić wszystkie te mo żliwości, 
w tym dokumencie opisano zarówno badania w warunkach tleno ­
wych, jak i beztlenowych. Badanie w warunkach tlenowych symu ­
luje natlenion ą kolumnę wodną nad warstw ą osadów natlenionych ze 
stopniowo niedotlenionym podk ładem. Badanie w warunkach beztle ­
nowych symuluje ca łkowicie beztlenowy uk ład woda-osad. Je śli 
okoliczno ści wskazuj ą, że jest konieczne znaczne odej ście od tych 
zaleceń, na przyk ład poprzez u życie nienaruszonych rdzeni osado ­
wych lub osadów, które mog ły zostać poddane dzia łaniu substancji 
badanych, dla tych celów s ą dostępne inne metody (9).  
1.2. DEFINICJE  
W każdym przypadku nale ży używać standardowych mi ędzynarodo ­
wych jednostek (SI).  
Substancja badana:  jakakolwiek substancja, czy to zwi ązek macie ­
rzysty czy te ż odnośne produkty przemian.  
Produkty przemian:  wszystkie substancje powsta łe w wyniku 
biotycznych lub abiotycznych reakcji przemian substancji badanej, w tym CO
 2 i produkty w pozosta łościach zwi ązanych.  
Pozostałości związane: „Pozostałości związane” stanowi ą związki 
w glebie, ro ślinach lub zwierz ętach, które pozostaj ą po ekstrakcji 
w materiale macierzystym w postaci substancji macierzystej lub jej 
metabolitu(-ów)/produktów przemiany. Metoda ekstrakcji nie mo że 
zmieniać w sposób znacz ący samych zwi ązków lub struktury mate ­
riału macierzystego. Charakter wi ązania mo żna częściowo wyja śnić 
przez metody ekstrakcji zmieniaj ące materia ł macierzysty 
i wyspecjalizowane techniki analityczne. Do dzi ś, na przyk ład, 
zostały w ten sposób zidentyfikowane wi ązania kowalencyjne zjoni ­
zowane i sorpcyjne, a tak że pułapkowanie. Na ogó ł tworzenie si ę 
pozostałości związanych znacz ąco redukuje biodost ępność 
i bioprzyswajalno ść (10) [zmodyfikowane w stosunku do IUPAC 
1984 (11)].  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Przemiany tlenowe:  (utlenianie): reakcje zachodz ące w obecno ści 
tlenu cząsteczkowego (12).  
Przemiany beztlenowe:  (redukcja): reakcje zachodz ące 
z wykluczeniem tlenu cz ąsteczkowego (12).  
Wody naturalne:  są wodami powierzchniowymi otrzymanymi ze 
stawów, rzek, strumieni itp.  
Osad:  jest mieszanin ą mineralnych i organicznych sk ładników 
chemicznych, te drugie zawieraj ące związki o wysokiej zawarto ści 
węgla i azotu i o du żych masach cz ąsteczkowych. Jest osadzony 
przez wod ę naturalną i tworzy z t ą wodą granicę rozdziału. 
Mineralizacja:  to całkowita degradacja zwi ązku organicznego do 
CO 2 i H  2 O w warunkach tlenowych lub CH  4 , CO  2 i H  2 O 
w warunkach beztlenowych. W kontek ście tej metody badawczej, 
w której stosowane s ą związki znakowane  14 C, mineralizacja 
oznacza ekstensywn ą degradacj ę, podczas której znaczone atomy 
węgla są utleniane z wydzieleniem odpowiedniej ilo ści 14 CO 2 
Czas pó łtrwania:  t 0,5 to czas potrzebny do przemiany 50 % 
substancji badanej, je żeli przemiana mo że zostać opisana kinetyk ą 
pierwszego rz ędu; nie zale ży od stężenia.  
DT 50 (Czas zaniku 50):  to czas, w którym pocz ątkowe stężenie 
substancji badanej zmniejsza si ę o 50 %.  
DT 75 (Czas zaniku 75):  to czas, w którym pocz ątkowe stężenie 
substancji badanej zmniejsza si ę o 75 %.  
DT 90 (Czas zaniku 90):  to czas, w którym pocz ątkowe stężenie 
substancji badanej zmniejsza si ę o 90 %.  
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
Substancje odniesienia powinny by ć stosowane do identyfikacji 
i oznaczenia ilo ściowego produktów przemian metodami spektrosko ­
powymi i chromatograficznymi.  
1.4. INFORMACJE O SUBSTANCJI BADANEJ  
Nieznakowane i znakowane izotopowo substancje badane mog ą być 
użyte do pomiaru tempa przemian, chocia ż preferowany jest materia ł 
znakowany. Materia ł znakowany jest wymagany do badania szlaków 
przemian i do okre ślenia bilansu masowego. Zaleca si ę znakowanie 
izotopem  14 C, ale inne izotopy, takie jak  13 C, 15 N, 3 H, 32 P, także 
mogą być użyteczne. Tak, jak to tylko mo żliwe, znacznik powinien 
być umiejscowiony w najbardziej stabilnej cz ęści(ach) cz ąsteczki (  1 ). 
Chemiczna lub/i radiochemiczna czysto ść substancji testowej 
powinna wynosi ć co najmniej 95 %.  
Przed rozpocz ęciem badania powinny by ć dostępne nast ępujące 
informacje o substancji badanej:  
a) rozpuszczalno ść w wodzie (metoda A.6),  
b) rozpuszczalno ść w rozpuszczalnikach organicznych,  
c) prężność pary (metoda A.4) i sta ła proporcjonalno ści w prawie 
Henry'ego,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Na przyk ład, jeżeli substancja badana zawiera jeden pier ścień, wymagane jest znako ­
wanie na tym pier ścieniu; je żeli substancja badana zawiera dwa lub wi ęcej pierścieni, 
mogą być potrzebne oddzielne badania w celu oceny losu ka żdego znakowanego 
pierścienia i w celu otrzymania odpowiednich informacji na temat powstawania 
produktów przemian.
 d) współczynnik podzia łu n-oktanol/woda (metoda A.8),  
e) współczynnik adsorpcji (odpowiednio K  d , K  f , K  oc ) (metoda 
C.18),  
f) hydroliza (metoda C.7),  
g) stała dysocjacji (pK  a ) [OECD Wytyczna 112] (13),  
h) struktura chemiczna substancji badanej i pozycja znacznika(ów) 
izotopowych je śli dotyczy.  
Uwaga:  Należy podać temperatur ę, w której wykonano te pomiary.  
Inne przydatne informacje mog ą obejmowa ć dane na temat toksycz ­
ności substancji badanej dla mikroorganizmów, dane na temat biode ­
gradalności gotowej i/lub nieod łącznej, oraz dane o tlenowych 
i beztlenowych przemianach w glebie.  
Powinny by ć dostępne metody analityczne (w tym metody ekstrakcji 
i czyszczenia) do identyfikacji i oznaczania ilo ściowego substancji 
badanej i jej produktów przemian w wodzie i w osadzie (patrz sekcja 
1.7.2).  
1.5 ZASADA METODY BADAWCZEJ  
W opisanej metodzie dla tego badania stosuje si ę tlenowy 
i beztlenowy uk ład osadu wodnego (zobacz za łącznik 1), który 
umożliwia:  
(i) pomiar tempa przemiany substancji badanej w uk ładzie woda- 
osad;  
(ii) pomiar tempa przemiany substancji badanej w osadzie;  
(iii) pomiar tempa mineralizacji substancji badanej i/lub jej 
produktów przemiany (gdy stosowana jest substancja badana znakowana izotopem
 14 C); 
(iv) identyfikacja i oznaczenie ilo ściowe produktów przemiany 
w fazach wodnej i w osadu, w tym bilans masowy (gdy stoso ­
wana jest znakowana substancja badana);  
(v) pomiar rozdzia łu substancji badanej i jej produktów przemiany 
między dwie fazy podczas okresu inkubacji w ciemno ści (by 
uniknąć, na przyk ład, zakwitu glonów) w sta łej temperaturze. 
Czasy pó łtrwania, warto ści DT  50 , DT  75 i DT  90 są określone, tam 
gdzie potwierdzaj ą to dane, ale nie powinny by ć ekstrapolowane 
daleko poza okres eksperymentalny (zob. sekcja 1.2).  
Do badań odpowiednio w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych 
wymagane s ą conajmniej dwa osady wraz z towarzysz ącymi im 
wodami (7). Jednak że mogą wystąpić przypadki, gdzie powinny 
być użyte więcej niż dwa osady wodne, na przyk ład, dla substancji 
chemicznych, które mog ą być obecne w środowiskach s łodkowod­
nych i/lub morskich.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1311
 
1.6. ZASTOSOWANIE BADANIA  
Metoda ogólnie mo że być stosowana dla substancji chemicznych 
(znakowanych i nieznakowanych izotopowo), dla których jest dostępna metoda analityczna o wystarczaj ącej czu łości 
i dokładności. Może być stosowana do zwi ązków słabo lotnych, 
nielotnych, rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych w wodzie. Badanie nie powinno by ć stosowane do substancji chemicznych, 
o wysokiej lotno ści z wody (np.: fumiganty, rozpuszczalniki orga ­
niczne), które nie mog ą być zatrzymane w wodzie i/lub osadzie 
w warunkach eksperymentalnych badania.
 
Metoda ta zosta ła, jak dot ąd, zastosowana do badania przemian 
substancji chemicznych w wodzie s łodkiej i osadach, ale 
w zasadzie mo że być także zastosowana do uk ładów estuaryjno- 
morskich. Nie nadaje si ę do symulacji warunków wód p łynących 
(np. rzek) lub otwartego morza.  
1.7. KRYTERIA JAKO ŚCIOWE  
1.7.1.  Odzysk  
Ekstrakcja i analiza, co najmniej podwójnych próbek wód i osadów 
natychmiast po dodaniu substancji badanej daje pierwsze wskazanie 
co do powtarzalno ści metody analitycznej i jednorodno ści procedury 
podawania substancji badanej. Odzysk dla nast ępnych etapów 
eksperymentu jest podawany przez odnosz ący się do nich bilans 
masowy (gdy stosowane s ą materiały znakowane). Odzysk powinien 
mieścić się w zakresie od 90 % do 110 % dla znakowanych 
substancji chemicznych (6) i od 70–110 % dla nieznakowanych substancji chemicznych.
 
1.7.2.  Powtarzalno ść i czułość metody analitycznej  
Powtarzalno ść metody analitycznej (z wy łączeniem pocz ątkowej 
wydajności ekstrakcji) dla okre ślenia ilo ści substancji badanej 
i produktów przemian mo że być sprawdzona przez powtórzenie 
analizy tego samego ekstraktu próbek wody lub osadu, które by ły 
inkubowane wystarczaj ąco długo, aby wytworzy ły się produkty prze ­
mian.  
Granica wykrywalno ści (LOD) metody analitycznej dla substancji 
badanej i dla produktów przemian powinna by ć na poziomie przy ­
najmniej 0,01 mg · kg -1 wody lub osadu (jako substancji badanej) lub 
1 % pocz ątkowej ilo ści podanej do uk ładu badanego, w zale żności 
od tego, co jest ni ższe. Granica kwantyfikacji (LOQ) równie ż 
powinna zosta ć określona.  
1.7.3.  Dok ładność danych przemiany  
Analiza regresji st ężeń substancji badanej w funkcji czasu daje 
właściwe informacje o dok ładności krzywej przemian i pozwala na 
obliczenie granic przedzia łu ufności dla okresu pó łtrwania (przy 
założeniu kinetyki pseudo pierwszego rz ędu) lub warto ści DT  50 , 
oraz w razie potrzeby, warto ści DT  75 i DT  90 . 
1.8. OPIS METODY  
1.8.1.  Badany uk ład i aparatura  
Badanie powinno by ć przeprowadzone w pojemnikach szklanych 
(np. butlach, probówkach wirówkowych), chyba że wstępne infor ­
macje (jak wspó łczynnik podzia łu n-oktanol-woda, dane sorpcyjne 
itp.) pokazuj ą, że badana substancja mo że przylega ć do szkła, 
w takim przypadku mo żna rozwa żyć materiał alternatywny (taki 
jak teflon). Tam gdzie wiadomo, że substancja badana przywiera 
do szkła, można złagodzić ten problem przez u życie jednej lub 
więcej następujących metod:  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1312
 
— określenie masy substancji badanej i produktów przemian sorbo ­
wanych do szk ła, 
— zapewni ć mycie rozpuszczalnikiem ca łego sprzętu szklanego na 
końcu badania,  
— używać produktów gotowych (zobacz te ż sekcja 1.9.2),  
— używać zwiększonej ilo ści współrozpuszczalnika do dodawania 
substancji badanej do uk ładu; jeśli jest użyty wspó łrozpuszczal ­
nik, powinien to by ć współrozpuszczalnik, który nie solwatuje 
substancji badanej.  
Przykłady typowej aparatury badawczej, np.: uk łady przep ływowe 
i biometryczne s ą pokazane odpowiednio w za łącznikach 2 i 3 
(14). Inne u żyteczne uk łady inkubacyjne s ą opisane w pozycji biblio ­
graficznej 15. Konstrukcja aparatury badawczej powinna umo żliwiać 
wymianę powietrza lub azotu i zatrzymywanie produktów lotnych. 
Wymiary aparatury musz ą być takie, aby spe łniały wymagania 
badania (patrz sekcja 1.9.1). Wentylacj ę można zapewni ć albo 
przez łagodne barbotowanie, albo przez przedmuchiwanie powiet ­
rzem lub azotem powierzchni wody. W tym drugim przypadku, wskazane łagodne mieszanie wody od góry mo że być wskazane 
dla lepszego rozprowadzenia tlenu lub azotu w wodzie. Nie powinno 
się używać powietrza pozbawionego CO
 2 , poniewa ż może to powo ­
dować wzrost pH wody. W ka żdym razie zaburzenie osadu jest 
niepożądane i powinno si ę go w miar ę możliwości unikać. Lekko 
lotne substancje chemiczne powinny by ć badane w uk ładzie biomet ­
rycznym, z łagodnym mieszaniem powierzchni wody. Mo żna 
również użyć zamkniętych naczy ń z fazą gazową powietrza atmos ­
ferycznego lub azotu nad roztworem, z wewn ętrznym pojemnicz ­
kiem do wy łapywania produktów lotnych (16). Regularna wymiana 
gazów znad powierzchni roztworu jest wymagana w badaniach 
tlenowych, żeby skompensowa ć zużycie tlenu przez biomas ę. 
Odpowiednie pu łapki do wy łapywania lotnych produktów przemian 
obejmują, między innymi, 1 mol · dm  -3 roztworu wodorotlenku 
potasu lub wodorotlenku sodu dla ditlenku w ęgla (  1 ) i glikol etyle ­
nowy, etanolamin ę lub 2 % roztwór parafiny w ksylenie dla 
związków organicznych. Cz ęści lotne powstaj ące w warunkach 
beztlenowych, takie jak metan, mog ą być wyłapywane przez, na 
przykład, sita molekularne. Takie cz ęści lotne mog ą być spalone, 
na przykład do CO  2 poprzez przepuszczanie gazu przez rur ę kwar­
cową wypełnioną CuO w temperaturze 900  o C i wychwytywanie 
powstałego CO  2 w aparacie absorpcyjnym z alkaliami (17).  
Wymagane jest oprzyrz ądowanie laboratoryjne do analizy 
chemicznej substancji badanej i produktów przemian (np.: chromato ­
grafia gazowo-cieczowa (GLC), wysokoci śnieniowa chromatografia 
cieczowa (HPLC), chromatografia cienkowarstwowa (TLC), spektro ­
skopia masowa (MS), chromatografia gazowa sprz ężona ze spektro ­
metrią masową (GC-MS), chromatografia cieczowa sprz ężona ze 
spektrometri ą masową (LC-MS), magnetyczny rezonans j ądrowy 
(NMR) itp.), w łączając w to uk łady do wykrywania substancji 
chemicznych znakowanych i nieznakowanych radioizotopami. Je śli 
jest stosowany materia ł znakowany radioizotopem, b ędzie równie ż 
potrzebny cieczowy licznik scyntylacyjny i aparat do utleniania przez spalanie (do spalania próbek osadów przed analizy promieniotwór ­
czości).
 
W miarę potrzeby wymagane jest inne standardowe wyposa żenie 
laboratoryjne do oznacze ń fizykochemicznych i biologicznych (zob. 
sekcja tabela 1, sekcja 1.8.2.2), szk ło laboratoryjne, substancje 
chemiczne i odczynniki.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1313  
( 1 ) Poniewa ż te zasadowe roztwory absorpcyjne poch łaniają również ditlenek w ęgla 
z wentylacji powietrzem i utworzony przez respiracj ę w doświadczeniach tlenowych, 
muszą być regularnie wymieniane, aby unikn ąć ich nasycenia, a tym samym utraty 
zdolności absorpcyjnej.
 1.8.2.  Wybór i liczba osadów wodnych.  
Miejsca pobierania próbek powinny by ć wybierane stosownie do 
celu badania w dowolnej sytuacji. Przy wyborze miejsc pobierania próbek nale ży uwzględnić historię ewentualnych rolniczych, przemy ­
słowych i gospodarczych wp ływów na zlewni ę i wody w górze 
rzeki. Osady nie powinny by ć użyte, jeśli zostały zanieczyszczone 
substancją badaną lub jej analogami strukturalnymi w ci ągu ostatnich 
czterech lat.
 
1.8.2.1.  Wybór osadów  
Zazwyczaj u żywa się dwóch osadów do bada ń w warunkach tleno ­
wych (7). Dwa wybrane osady powinny si ę różnić pod wzgl ędem 
zawartości węgla organicznego i budowy. Jeden osad powinien mie ć 
wysoką zawartość węgla organicznego (2,5–7,5 %) i budow ę drob­
noziarnist ą, drugi osad powinien mie ć niską zawartość węgla orga­
nicznego (0,5–2,5 %) i budow ę gruboziarnist ą. Różnica zawarto ści 
węgla organicznego powinna zazwyczaj wynosi ć co najmniej 2 %. 
„Budowa drobnoziarnista” jest zdefiniowana jako suma [glina +i ł] ( 1 ) 
o zawarto ści > 50 % a „budowa gruboziarnista” jest zdefiniowana 
jako suma [glina + i ł] o zawarto ści < 50 %. Ró żnica zawarto ści 
[glina + i ł] dla tych dwóch osadów powinna zwykle wynosi ć co 
najmniej 20 %. W przypadku gdy substancja chemiczna mo że 
także dostać się do wody morskiej, przynajmniej jeden z uk ładów 
woda-osad powinien by ć pochodzenia morskiego.  
Dla bada ń w warunkach ściśle beztlenowych, dwa osady (wraz 
z towarzysz ącymi wodami) powinny by ć pobrane ze stref beztleno ­
wych powierzchniowych cz ęści wód (7). Obie fazy osadowa i wodna 
powinny by ć przenoszone i transportowane ostro żnie bez dost ępu 
tlenu.  
Przy wyborze osadów mog ą być ważne inne parametry i powinny 
być rozpatrywane dla ka żdego przypadku indywidualnie. Na przy ­
kład zakres pH osadów by łby ważny dla badania substancji chemicz ­
nych, których przemiana i/lub sorpcja mog ą być zależne od pH. 
Zależność sorpcji od pH mo że być odzwierciedlone w warto ści 
pK a substancji badanej.  
1.8.2.2.  Charakterystyka próbek woda-osad  
Kluczowe parametry, które musz ą być zmierzone i podane 
w sprawozdaniu (w odniesieniu do u żytej metody) zarówno dla 
wód, jak i osadów, oraz etap badania, na którym te parametry powinny zosta ć określone, są podsumowane w tabeli poni żej. Dla 
informacji, metody okre ślania tych parametrów s ą podane 
w bibliografii (18)(19)(20)(21).
 
Dodatkowo mo że zachodzi ć potrzeba pomiaru i sprawozdania innych 
parametrów stosownie do indywidualnego przypadku (np.: dla wody 
słodkiej: cz ąstki zawieszone, zasadowo ść, twardość, przewodnictwo, 
NO  3 /PO  4 (stosunek i warto ści bezwzgl ędne); dla osadów: zdolno ść 
wymiany kationowej, pojemno ść wodna, w ęglany, ca łkowity azot 
i fosfor; a dla uk ładów morskich: zasolenie). Analiza osadów 
i wody na azotany, siarczany, żelazo bioprzyswajalne i ewentualnie 
inne akceptory elektronowe, równie ż może być przydatna do oceny 
warunków redoks, szczególnie w odniesieniu do przemian beztleno ­
wych.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1314  
( 1 ) [Glina i i ł] jest frakcj ą mineraln ą osadu o ziarnisto ści < 50 μm
 Pomiar parametrów do charakteryzacji próbek woda-osad (7)(22)(23)  
Parametr Etap procedury 
pobieranie 
próbek 
w terenie późniejsze 
przeno­
szenie początek 
przygoto­
wania początek 
badania podczas 
badania koniec 
badania  
Woda  
Pochodzenie/ źródło x 
Temperatura x pH x x x x x 
TOC x x x 
Stężenie O
 2 (*) x x x x x 
Potencjał redoks (*) x x x x  
Osad  
Pochodzenie/ źródło x 
Głębokość warstwy x 
pH x x x x x 
Rozkład wielko ści cząstek x 
TOC x x x x Biomasa mikrobiologiczn a (**) x x x Potencjał redoks (*) Obser ­
wacja (kolor/ 
zapach) x x x x
 
(*) Ostatnie badania pokazuj ą, że pomiary st ężeń tlenu w wodzie i potencja łów redoks nie maj ą ani mechanistycznej, ani 
predykcyjnej warto ści, tak d ługo, jak zaburzony jest wzrost i rozwój populacji mikrobiologicznej w wodach 
powierzchniowych (24)(25). Oznaczenie zapotrzebowania na tlen biochemiczny (BOD, przy pobieraniu próbek 
w terenie, na pocz ątku i na ko ńcu badania) i st ężeń mikro/makro sk ładników biogennych Ca, Mg i Mn (na pocz ątku 
i na końcu badania) w wodzie i pomiar ca łkowitego N i ca łkowitego P (przy pobieraniu próbek w terenie i na ko ńcu 
badania) mo że być lepszym narz ędziem do interpretacji i oceny tempa bioprzemian tlenowych i ich szlaków. 
(**) Metoda tempa respiracji mikrobiologicznej (26), metoda zadymiania (27) lub zliczanie na podk ładzie rozmno że­
niowym (np. bakterie, promieniowce, grzyby i ca łe kolonie) dla bada ń w warunkach tlenowych; tempo metanogenezy 
dla badań beztlenowych.  
1.8.3.  Pobieranie, przenoszenie i przechowywanie  
1.8.3.1.  Pobieranie  
Przy pobieraniu próbek osadu nale ży korzysta ć z projektu wytycz ­
nych ISO o pobieraniu próbek osadu dennego (8). Próbki osadu 
powinny by ć pobierane z ca łej górnej warstwy osadu, o grubo ści 
od 5 do 10 cm. Towarzysz ąca mu woda powinna by ć pobrana 
z tego samego miejsca lub lokalizacji i w tym samym czasie, co osad. Dla bada ń w warunkach beztlenowych osad i towarzysz ąca 
woda powinny by ć pobrane i transportowane bez dost ępu tlenu 
(28) (zob. sekcja 1.8.2.1). Niektóre urz ądzenia do pobierania próbek 
są opisane w literaturze (8)(23).
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1315
 
1.8.3.2.  Przenoszenie  
Osad jest oddzielany od wody przez filtracj ę i przesiewany na mokro 
przez 2 mm sito przy u życiu nadmiaru miejscowej wody, która jest 
potem wylewana. Nast ępnie, znane ilo ści osadów i wody s ą 
mieszane z po żądaną prędkością (zob. sekcja 1.9.1) w kolbach inku ­
bacyjnych przez okres przystosowawczy (zob. sekcja 1.8.4). Dla badań w warunkach beztlenowych wszystkie kroki na etapie przeno ­
szenia musz ą być wykonane bez dost ępu tlenu (29)(30)(31)(32)(33).
 
1.8.3.3.  Przechowywanie  
Bardzo zaleca si ę użycie świeżo pobranego osadu, je śli jednak 
konieczne jest jego przechowywanie, osad i woda powinny by ć 
przesiane, jak opisano powy żej i przechowywane razem, zalane 
wodą (6–10 cm warstwy wody), w ciemno ści, w temperaturze 4 ± 
2 o C 4 przez maksymalnie 4 tygodnie (7)(8)(23). Próbki przeznaczone 
do badań w warunkach tlenowych powinny by ć przechowywane 
przy swobodnym dost ępie powietrza (np.: w otwartych pojemni ­
kach), natomiast próbki do bada ń beztlenowych, bez dost ępu tlenu. 
Podczas transportu i magazynowania nie mo że zajść zamrożenie 
osadu i wody i wysuszenie osadu.  
1.8.4.  Przygotowanie próbek osad/woda do badania  
Okres przystosowawczy powinien nast ąpić przed dodaniem 
substancji badanej, gdzie ka żda próbka osad/woda jest umieszczana 
w naczyniu inkubacyjnym, do u życia w badaniu g łównym, 
i przystosowanie powinno by ć prowadzone dok ładnie w tych samych 
warunkach, co inkubacja (zob. sekcja 1.9.1). Okres przystosowawczy 
jest to czas potrzebny do osi ągnięcia przez uk ład umiarkowanej 
stabilności, co odzwierciedla pH, st ężenie tlenu w wodzie, potencja ł 
redoks osadu i wody, oraz makroskopowa separacja faz. Okres przy ­
stosowawczy powinien zazwyczaj trwa ć od jednego do dwóch 
tygodni i nie powinien przekroczy ć czterech tygodni. Wyniki ozna ­
czeń wykonanych w tym okresie powinny zosta ć podane 
w sprawozdaniu.  
1.9. PROWADZENIE BADA Ń 
1.9.1.  Warunki badania  
Badanie powinno by ć wykonane w aparaturze inkubacyjnej (patrz 
sekcja 1.8.1) przy stosunku wody do osadu na poziomie mi ędzy 
3:1 a 4:1, oraz grubo ścią warstwy osadu 2,5 cm (± 0,5 cm) (  1 ). 
Zaleca się minimaln ą ilość 50 g osadu (w suchej masie) na naczynie 
inkubacyjne.  
Badanie powinno by ć wykonane w ciemno ści, w stałej temperaturze 
z przedzia łu 10–30  o C. Właściwa jest temperatura (20 ± 2)  o C. 
W razie potrzeby, mo żna rozwa żyć, stosownie do indywidualnego 
przypadku, dodatkow ą niższą temperatur ę (np. 10  o C), zależnie od 
informacji wymaganych od badania. Temperatura inkubacji powinna 
być monitorowana i podana w sprawozdaniu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Ostatnie badania pokaza ły, że przechowywanie w temp. 4  o C może prowadzi ć do spadku 
zawartości węgla organicznego w osadzie, co mo że ewentualnie skutkowa ć spadkiem 
aktywności mikrobiologicznej. (34)
 1.9.2.  Obróbka i podanie substancji badanej  
Używane jest jedno badane st ężenie substancji chemicznej (  1 ). Dla 
środków ochrony upraw wprowadzanych bezpo średnio do cz ęści 
wód, nale ży przyjąć maksymaln ą dawkę na etykiecie, jako maksy ­
malny stopie ń podania obliczony na podstawie pola powierzchni 
wody w naczyniu do badania. W innych przypadkach, u żyte stężenie 
powinno by ć oparte na przewidywaniach emisji środowiskowych. 
Należy uważać, aby zapewni ć, że zastosowane b ędzie odpowiednie 
stężenie substancji badanej, żeby scharakteryzowa ć szlak przemian 
oraz powstawanie i zanik produktów przemian. Mo że być konieczne 
zastosowanie wi ększych dawek (np.: 10 razy) w sytuacjach, 
w których st ężenia substancji badanej s ą bliskie granicy wykrywal ­
ności na pocz ątku badania i/lub w których g łówne produkty prze ­
mian nie mog ą być łatwo wykryte, je żeli są obecne w ilo ści 10 % 
stopnia podania substancji badanej. Jednak że jeśli używa się 
wyższych stężeń testowych, nie powinny one mie ć znaczącego 
niekorzystnego wp ływu na aktywno ść mikrobiologiczn ą układu 
woda-osad. Żeby osiągnąć stałe stężenie substancji badanej 
w naczyniach o ró żnych wymiarach, mo żna uznać za stosowne 
korektę ilości podanego materia łu, na podstawie wysoko ści słupa 
wody w naczyniu w stosunku do g łębokości wody w terenie (któr ą 
przyjmuje si ę jako 100 cm, ale mog ą być użyte inne g łębokości). 
Zob. załącznik 4 w celu uzyskania przyk ładowych oblicze ń. 
W idealnym przypadku substancja badana powinna by ć podana jako 
roztwór wodny do fazy wodnej uk ładu badanego. Je śli nie da si ę 
tego unikn ąć, użycie małych ilości mieszaj ących się z wodą rozpusz­
czalników (takich jak aceton, etanol) jest dopuszczalne dla podania i rozprowadzenia substancji badanej, ale nie powinno przekroczy ć 
1 % v/v i nie powinno mie ć niekorzystnego wp ływu na aktywno ść 
mikrobiologiczn ą układu badanego. Nale ży zachowa ć ostrożność 
przy wytwarzaniu roztworu wodnego substancji badanej – mo że 
być właściwe użycie kolumn do wytwarzania i wst ępnego mieszania, 
aby zapewni ć kompletn ą homogeniczno ść. Po dodaniu roztworu 
wodnego do uk ładu badanego zaleca si ę delikatne mieszanie fazy 
wodnej, aby mo żliwie najmniej zaburzy ć osad.
 
Nie zaleca si ę rutynowego u żywania gotowych produktów, jako że 
składniki preparatu mog ą wywiera ć wpływ na rozdzia ł substancji 
badanej i/lub produktów przemian pomi ędzy fazę wodną a osad. 
Jednakże dla substancji badanych o niskiej rozpuszczalno ści 
w wodzie zastosowanie produktów gotowych mo że być właściwym 
rozwiązaniem.  
Liczba naczy ń inkubacyjnych zale ży od tego, ile razy s ą pobierane 
próbki (zob. sekcja 1.9.3). Nale ży uwzględnić wystarczaj ącą liczbę 
układów badanych, tak żeby przy ka żdorazowym pobraniu próbek 
można było poświęcić dwa uk łady. Jeżeli stosuje si ę układy 
kontrolne wodnego uk ładu osadowego, nie powinny by ć ona 
poddawane dzia łaniu substancji badanej. Uk łady kontrolne mog ą 
być użyte do oznaczenia biomasy mikrobiologicznej osadu 
i całkowitego w ęgla organicznego w wodzie i osadzie na ko ńcu 
badania. Dwa z uk ładów kontrolnych (np. jeden uk ład kontrolny 
każdego osadu wodnego) mog ą być stosowane do monitorowania 
wymaganych parametrów w osadzie i w wodzie podczas okresu przystosowawczego (zob. tabela w sekcji 1.8.2.2). Dwa dodatkowe układy kontrolne musz ą być uwzględnione w przypadku, gdy 
substancja badana jest podana przy pomocy rozpuszczalnika, aby 
zmierzyæ niekorzystne skutki dla aktywno ści mikrobiologicznej 
układu badanego.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) Badanie z drugim st ężeniem mo że być przydatne dla substancji chemicznych, które 
przechodz ą do wód powierzchniowych innymi szlakami wej ścia, powoduj ących znacznie 
inne stężenia, pod warunkiem, że niższe stężenie może być analizowane z wystarczaj ącą 
dokładnością.
 1.9.3.  Czas badania i pobieranie próbek  
Eksperyment badawczy nie powinien zazwyczaj trwa ć dłużej niż 100 
dni (6) i powinien by ć kontynuowany tak d ługo, aż zostanie 
określony szlak degradacji i model rozk ładu woda/osad lub kiedy 
90 % substancji badanej zaniknie poprzez przemiany i/lub parowa ­
nie. Liczba pobra ń próbek powinna wynosi ć co najmniej sze ść 
(włączając czas zerowy), z opcjonalnym wst ępnym badaniem (zob. 
sekcja 1.9.4) stosowanym do ustalenia w łaściwego re żimu pobierania 
próbek i czasu trwania badania, chyba że dostępne są wystarczaj ące 
dane o substancji badanej z poprzednich bada ń. Dla hydrofobowych 
substancji badanych mog ą być konieczne dodatkowe punkty pobie ­
rania próbek podczas pocz ątkowego okresu badania, w celu 
określenia stopnia rozdzia łu między fazę wodną a osadow ą. 
We właściwych momentach pobierania próbek ca łe naczynia inku ­
bacyjne (w powtórzeniach) usuwa si ę do analizy. Osad i woda znad 
niego są analizowane osobno (  1 ). Należy ostrożnie usunąć wodę 
powierzchniow ą, żeby jak najmniej zaburzy ć osad. Ekstrakcja 
i scharakteryzowanie substancji badanej i produktów przemian 
powinno nast ąpić po właściwych procedurach analitycznych. Nale ży 
uważać przy usuwaniu materia łu, który móg ł zostać zaadsorbowany 
do naczynia inkubacyjnego, albo do łączących rur stosowanych do 
wyłapania cz ęści lotnych.  
1.9.4.  Opcjonalne wst ępne badanie  
Jeśli czas trwania i re żim pobierania próbek nie mog ą być oszaco­
wane na podstawie innych odno śnych bada ń substancji badanej, 
można uznać za stosowne opcjonalne wst ępne badanie, które 
powinno by ć przeprowadzone przy u życiu tych samych warunków 
badania, jakie zosta ły zaproponowane do badania ostatecznego. 
Odnośne warunki do świadczalne i wyniki z badania wst ępnego, 
jeśli je przeprowadzono, powinny by ć pokrótce przedstawione 
w sprawozdaniu.  
1.9.5.  Pomiary i analizy  
Przy ka żdym pobieraniu próbek st ężenie substancji badanej 
i produktów przemiany w wodzie i osadzie powinno by ć zmierzone 
i podane w sprawozdaniu (jako st ężenie i jako procent ca łości dostar­
czonej). Generalnie, produkty przemian wykryte przy ≥ 10 % zasto ­
sowanej radioaktywno ści w całym układzie woda-osad przy ka żdo­
razowym pobieraniu próbek powinny zosta ć zidentyfikowane, chyba 
że można przedstawi ć rozsądne uzasadnienie braku potrzeby identy ­
fikacji. Produkty przemian, których st ężenie ciągle wzrasta podczas 
badania, równie ż powinny by ć uwzględnione do identyfikacji nawet, 
jeśli ich stężenia nie przekraczaj ą granic podanych wy żej, jako że 
może to wskazywa ć na trwałość. To drugie powinno by ć rozpatry ­
wane indywidualnie, stosownie do przypadku, z uzasadnieniem 
przedstawionym w sprawozdaniu.  
Wyniki z uk ładu wychwytuj ącego gazy/cz ęści lotne (CO  2 i inne, np.: 
lotne zwi ązki organiczne) powinny by ć podawane przy ka żdym 
pobieraniu próbek. Nale ży podać w sprawozdaniu tempo mineraliza ­
cji. Pozosta łości w osadzie nieulegaj ące ekstrakcji (zwi ązane) 
powinny by ć podawane przy ka żdym pobieraniu próbek.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1318  
( 1 ) W przypadkach gdy mo że łatwo wyst ąpić gwałtowne ponowne utlenianie produktów 
przemian beztlenowych, podczas pobierania próbek i analizy nale ży utrzymywa ć warunki 
beztlenowe.
 2. DANE  
2.1. OBRÓBKA WYNIKÓW  
Całkowity bilans masy lub odzysk (zob. sekcja 1.7.1) dodanych 
radioizotopów ma by ć obliczany przy ka żdorazowym pobieraniu 
próbek. Wyniki powinny by ć podawane jako procent dodanych 
radioizotopów. Rozdzia ł izotopów mi ędzy wod ę a osad nale ży 
podać jako stężenia i procenty, przy ka żdym pobieraniu próbek.  
Czas półtrwania, DT  50 , i w razie potrzeby, DT  75 i DT  90 substancji 
badanej powinny by ć obliczone wraz z ich granicami przedzia łu 
ufności (zob. sekcja 1.7.3). Informacje o szybko ści rozpraszania 
substancji badanej w wodzie i osadzie mo żna otrzyma ć poprzez 
użycie odpowiednich narz ędzi oceny. Mog ą to być zastosowania 
kinetyki pseudo pierwszego rz ędu, empiryczne techniki dopasowania 
krzywych, które stosuj ą rozwiązania graficzne lub numeryczne 
i wiele bardziej z łożonych ocen z wykorzystaniem, na przyk ład, 
modeli jedno- lub wieloprzedzia łowych. Dalsze szczegó łowe infor ­
macje mo żna otrzyma ć z odnośnych publikacji (35)(36)(37).  
Wszystkie podej ścia mają swoje słabe i mocne strony i znacznie si ę 
różnią w swojej z łożoności. Założenie kinetyki pierwszego rz ędu 
może być zbytnim uproszczeniem procesów degradacji i rozdzia łu, 
ale tam, gdzie jest to mo żliwe daje termin (sta ła tempa lub czas 
półtrwania), który jest łatwo zrozumia ły i o warto ści 
w modelowaniu symulacyjnym i obliczeniach przewidywanych stężeń środowiskowych. Podej ścia empiryczne lub przemiany 
liniowe mog ą dawać lepsze dopasowanie krzywych do danych 
i dlatego pozwalaj ą na lepsze oszacowanie czasów pó łtrwania, 
DT
 50 i, w razie potrzeby, warto ści DT  75 i DT  90 . Użycie wyprowa ­
dzonych sta łych jest jednak ograniczone. Modele przedzia łowe mog ą 
wytwarza ć wiele użytecznych sta łych o warto ści w ocenie ryzyka, 
które opisuj ą tempo degradacji w ró żnych przedzia łach i rozdzia ł 
substancji chemicznej. Powinny by ć one równie ż użyte do oszaco ­
wania sta łych tempa dla powstawania i degradacji g łównych 
produktów przemian. We wszystkich przypadkach wybrana metoda 
musi by ć uzasadniona i osoba badaj ąca powinna przedstawi ć 
graficznie i/lub statystycznie zgodno ść wyników do świadczenia z 
przewidywaniami.  
3. SPRAWOZDANIE  
3.1 SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancja badana:  
— nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór struk ­
turalny (wskazuj ący pozycj ę znacznika (znaczników), je śli użyty 
jest materia ł znakowany izotopowo) i odno śne właściwości 
fizyczno- chemiczne,  
— czysto ść (zanieczyszczenia) substancji badanej,  
— radiochemiczna czysto ść znakowanej substancji chemicznej 
i aktywno ść molowa (w razie potrzeby).  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Substancje odniesienia:  
— nazwa chemiczna i struktura substancji odniesienia u żytej do 
scharakteryzowania i/lub identyfikacji produktów przemian  
Badany osad i wody:  
— lokalizacja i opis miejsca (miejsc) pobierania próbek wodnego 
osadu, z uwzgl ędnieniem, je śli to możliwe, historii zanieczysz ­
czenia,  
— wszystkie informacje odnosz ące się do pobierania, przechowy ­
wania (je śli było) i przystosowania uk ładów woda-osad,  
— charakterystyka próbek woda-osad wymieniona w tabeli w sekcji 
1.8.2.2.  
Warunki badania:  
— zastosowany uk ład badawczy (np. przep ływ, biometr, sposób 
wentylacji, metoda mieszania, poziom wody, masa osadu, grubość zarówno warstwy wody, jak i osadu, wymiary naczy ń 
do badań itp.)
 
— podanie substancji badanej do uk ładu badanego: u żyte stężenie 
badane, liczba powtórze ń i sposób kontroli podawania substancji 
badanej (np.: ewentualne u życie rozpuszczalnika), itp.,  
— temperatura inkubacji,  
— ilość razy pobierania próbek,  
— metody ekstrakcji i wydajno ści, tak jak i metody analityczne 
i granice wykrywalno ści, 
— metody charakterystyki/identyfikacji produktów przemiany,  
— odchylenia od protoko łu badawczego lub warunków badania 
podczas badania.  
Wyniki:  
— nieobrobione dane liczbowe analiz reprezentatywnych (wszystkie 
nieobrobione dane musz ą być przechowywane w archiwum 
GLP),  
— powtarzalno ść i czułość zastosowanych metod analitycznych,  
— stopie ń odzysku (warto ści procentowe dla wa żnego badania s ą 
podane w sekcji 1.7.1),  
— tabele wyników wyra żone, jako % dostarczonej dawki i w 
mg· kg  -1 w wodzie, osadzie i ca łkowitym uk ładzie (tylko w %) 
dla substancji badanej i w razie potrzeby dla produktów przemian 
i izotopów nieulegaj ących wyekstrahowaniu,  
— bilans masowy podczas i na koniec bada ń, 
— graficzne przedstawienie przemian we frakcjach wody i osadu 
oraz w ca łym układzie (wraz z mineralizacj ą), 
— tempo mineralizacji,  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— czas pó łtrwania, DT  50 i w razie potrzeby warto ści DT  75 i DT  90 
dla substancji badanej i, je żeli jest to w łaściwe, dla g łównych 
produktów przemian w wodzie, w osadzie i w ca łym układzie, 
wraz z granicami przedzia łów ufności, 
— ocena kinetyki przemiany substancji badanej i w razie potrzeby 
głównych produktów przemian,  
— proponowany szlak przemian, w razie potrzeby,  
— dyskusja wyników.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the 
registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability 
and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
 
(2) Commission for registration of pesticides: Application for 
registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section 
G.2.1 (a). The Netherlands.
 
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary 
guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides 
in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United- Kingdom.
 
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). 
Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) – Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35–37.
 
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision 
N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, 
Anaerobic aquatic metabolism.  
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing 
the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr 
Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.  
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the 
OECD Workshop on Selection of Soils/sediments, Belgirate, Italy, 18–20 January 1995.
 
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality – Sampling – Part 12: 
Guidance on sampling of bottom sediments.  
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation 
test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 
712-C-98-080.  
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).  
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and 
plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).  
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil 
(adopted 12 May 1981).  
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the 
Testing of Chemicals.  
(14) Scholz, K., Fritz R., Anderson C. and Spiteller M. (1988) 
Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. 
BCPC – Pests and Diseases, 3B-4, 149–158.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1321
 
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the 
fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry 
(D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds.), Vol. 1, 85–114. J. Wiley & Sons.
 
(16) Madsen, T., Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inocu ­
lation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631–637.
 
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of 
detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C- 
labelled model surfactants. Water Research 21, 661–667.  
(18) Black, C.A. (1965). Metodas of Soil Analysis. Agronomy 
Monograph No. 9. American Society of Agronomy, Madison.  
(19) APHA (1989). Standard Metodas for Examination of Water 
and Wastewater (17th edition). American Public Health Asso ­
ciation, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
 
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Metodas and Applications. 
Longman.  
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential 
measurements. Anal. Chemistry 44, 1038–1039.  
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on 
testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop „A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests”, 3–4 July 1991.
 
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on 
sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine 
environments. From the Workshop On Sediment Toxicity 
Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
 
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.T.M. (1997). Pesticide 
biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 
2858–2868.
 
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). 
Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in 
nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329–338.  
(26) Anderson, T.H., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon 
requirements of actively-metabolising microbial populations 
under  in-situ  conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197–203.  
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality – Determination of soil 
microbial biomass – Part 2: Fumigation-extraction method.  
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the 
Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sedi ­
ment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13–21.  
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General metoda for 
determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850–857.
 
(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, 
U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening 
of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 
1527–1550.  
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegrada ­
tion tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 
1499–1509.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1322
 
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A partia test for asses ­
sing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under 
realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597–3603.
 
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic 
chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). 
EPA 712-C-98-090.  
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sedi ­
ment characteristics and drying sediment on sorption coeffi ­
cients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961–968.
 
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical inter ­
pretation and graphic representation of the degradational beha ­
viour of pesticide residues II. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 39, 187–203.
 
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and 
graphic representation of the degradational behaviour of pesti ­
cide residues I. Pflanzenschutz – Nachrichten Bayer, 33, 47–60.
 
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment 
model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water 
systems. Brighton Crop Protection Conference – Pest and Diseases, pp. 1349–1354.
 ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
ZAŁĄCZNIK 1  
WYTYCZNE DLA UKLADÓW BADAWCZYCH W WARUNKACH 
TLENOWYCH I BEZTLENOWYCH  
Układ badań w warunkach tlenowych  
Układ badań w warunkach tlenowych opisany w tej metodzie badawczej 
składa się z natlenionej warstwy wody (typowe st ężenie tlenu w zakresie 7 do 
10 mg· l -1 ) i z warstwy osadu, natlenionej na powierzchni i beztlenowej poni żej 
powierzchni (typowy średni potencja ł redoks (E  h ) w strefie beztlenowej osadu 
w zakresie od - 80 do - 190 mV). Nawil żone powietrze przechodzi nad 
powierzchni ą wody w ka żdym urządzeniu do inkubacji, aby utrzyma ć wystar­
czającą ilość tlenu w przestrzeni nad roztworem.  
Układ badań w warunkach beztlenowych  
Dla układu bada ń w warunkach beztlenowych procedura badawcza jest zasad ­
niczo taka sama, jak przedstawiono dla uk ładów tlenowych z tym, że nawilżony 
azot przep ływa nad powierzchni ą wody w ka żdym urządzeniu inkubacyjnym, 
aby utrzyma ć atmosfer ę azotową w przestrzeni nad roztworem. Osad i woda s ą 
uważane za beztlenowe, je śli potencja ł redoks (E  h ) jest niższy niż - 100 mV.  
W badaniu w warunkach beztlenowych ocena mineralizacji obejmuje pomiar 
wydzielonego ditlenku w ęgla i metanu.  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
ZAŁĄCZNIK 2  
PRZYKŁAD APARATURY PRZEP ŁYWOWO-GAZOWEJ
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
ZAŁĄCZNIK 3  
PRZYKŁADY APARATURY BIOMETRYCZNEJ
  ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
ZAŁĄCZNIK 4  
PRZYKŁADOWE OBLICZENIA DLA DAWKI DOSTARCZANEJ DO 
NACZYŃ BADAWCZYCH  
Wewnętrzna średnica cylindra: = 8 cm 
Wysokość słupa wody bez osadu: = 12 cm 
Pole powierzchni: 3,142 × 42 = 50,3 cm  2 
Stopień dostarczania: 500 g substancji bada ­
nej/ha odpowiada 5 μg/cm  2 
Dawka ca łkowita μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Korekta ilo ści w odniesieniu do g łębokości 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Pojemność słupa wody: 50,3 × 12 = 603 ml 
Stężenie w wodzie: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml lub 50 μg/l ▼B 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  MINERALIZACJA TLENOWA W WODZIE POWIERZCH ­
NIOWEJ — SYMULACYJNE BADANIE BIODEGRADACJI  
1. METODA  
Niniejsza metoda odpowiada OECD TG 309 (2004) (1).  
1.1. WST ĘP 
Celem niniejszego badania jest zmierzenie czasowego przebiegu 
biodegradacji badanej substancji w ma łym stężeniu 
w napowietrzonej naturalnej wodzie oraz ilo ściowe wyra żenie 
wyników obserwacji w postaci wyra żeń szybkości w ujęciu kinetycz ­
nym. Niniejsze badanie symulacyjne jest laboratoryjn ą próbą prowa­
dzoną w systemie okresowym, opart ą na metodzie wstrz ąsanej kolby, 
mającą na celu wyznaczenie szybko ści tlenowej biodegradacji 
substancji organicznych w próbkach naturalnej wody powierzch ­
niowej (s łodkiej, słonawej lub morskiej). Jest ono oparte na ISO/DIS 
14592–1 (2) i zawiera równie ż elementy zaczerpni ęte w metod 
badawczych C.23 i C.24 (3)(4). Ewentualnie, przy d ługich czasach 
badania, prowadzenie badania w systemie okresowym zast ępuje się 
prowadzeniem go w systemie pó łciągłym, aby nie dopu ścić do 
pogorszenia si ę stanu mikrokosmosu. Zasadniczym celem symulacji 
jest określenie mineralizacji badanej substancji w wodzie powierzch ­
niowej, przy czym mineralizacja stanowi podstaw ę do wyra żenia 
kinetyki degradacji. Jednak że dodatkowym drugorz ędnym celem 
badania jest uzyskanie informacji o pierwotnej degradacji oraz infor ­
macji o g łównych produktach przemiany. Identyfikacja produktów 
przemiany oraz, je śli to możliwe, ilościowe okre ślenie ich st ężeń, są 
szczególnie wa żne w przypadku substancji, które bardzo wolno 
ulegają mineralizacji (np. przy pó łokresach zaniku dla ca łkowitego 
szczątkowego  14 C przekraczaj ących 60 dni). Z powodu ogranicze ń 
analitycznych do identyfikacji i ilo ściowego oznaczania g łównych 
produktów przemiany zwykle nale ży używać wyższych stężeń 
badanej substancji (np. > 100 μg/l). 
Niskie stężenie w niniejszym badaniu oznacza st ężenie (np. mniejsze 
niż 1 μg/l — 100 μg/l), które jest na tyle niskie, i ż zapewnia, że 
kinetyka biodegradacji uzyskana w badaniu odzwierciedla kinetyki spodziewane w środowisku. W stosunku do ca łkowitej masy ulegaj ­ 
ących biodegradacji substratów w ęglowych dost ępnych w naturalnej 
wodzie u żytej do badania badana substancja obecna w niskim 
stężeniu posłuży jako drugorz ędny substrat. Oznacza to, że spodzie ­
wana kinetyka biodegradacji jest kinetyk ą pierwszego rz ędu („nieros ­
nącą”) i że badana substancja mo że ulegać degradacji poprzez 
„kometabolizm”. Kinetyka pierwszego rz ędu oznacza, i ż 
szybkość degradacji (mg/l/dzie ń) jest proporcjonalna do st ężenia 
substratu, które maleje w czasie. W przypadku rzeczywistej kinetyki 
pierwszego rz ędu właściwa stała szybkości degradacji, k, jest nieza ­
leżna od czasu i st ężenia. Oznacza to, że k nie zmienia si ę znacząco 
w trakcie przebiegu do świadczenia i nie zmienia si
ę wraz ze zwi ęk­
szeniem st ężenia pomi ędzy doświadczeniami. Z definicji sta ła 
właściwej szybko ści degradacji jest równa wzgl ędnej zmianie 
stężenia przez czas k = (1/C) · (dC/dt). Cho ć w zaleconych warun ­
kach zwykle spodziewane s ą kinetyki pierwszego rz ędu, to mog ą 
istnieć pewne sytuacje, w których bardziej odpowiednie s ą inne 
kinetyki. Odchylenia od kinetyki pierwszego rz ędu można obser­
wować np. wówczas, je żeli szybko ść biotransformacji jest ograni ­
czana przez zjawiska zwi ązane z transportem masy, takie jak szyb ­
kość dyfuzji, a nie przez szybko ść reakcji biologicznej. Jednak że 
dane można niemal zawsze opisa ć przy pomocy kinetyki pseudo 
pierwszego rz ędu, przyjmuj ąc stałą szybkości zależną od stężenia. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
Przed badaniem nale ży dysponowa ć danymi o podatno ści na biode ­
gradację badanej substancji w wy ższych stężeniach (np. uzyskanymi 
ze standardowych prób przesiewowych), jak równie ż danymi 
o podatno ści na degradacj ę abiotyczn ą, produktach przemian oraz 
istotnych w łasnościach fizykochemicznych, w celu umo żliwienia 
przeprowadzenia planowania do świadczeń oraz interpretacji wyni ­
ków. Wyznaczenie podatno ści na ostateczn ą biodegradacj ę umoż­
liwia zastosowanie badanych substancji znakowanych za pomoc ą 
14 C i okre ślenie rozk ładu fazy  14 C na końcu badania. Gdy u żyta 
jest nieznakowana badana substancja, to ostateczn ą biodegradacj ę 
można oszacowa ć jedynie wówczas, je śli badane jest wy ższe 
stężenie i znane s ą wszystkie g łówne produkty przemiany.  
1.2. DEFINICJE  
Pierwotna biodegradacja : strukturalna zmiana (przemiana) 
substancji chemicznej przez mikroorganizmy, powoduj ąca utratę 
chemicznej to żsamości. 
Biodegradacja funkcjonalna : strukturalna zmiana (przemiana) 
substancji chemicznej przez mikroorganizmy, powoduj ąca utratę 
określonej własności. 
Ostateczna biodegradacja tlenowa : rozkład substancji chemicznej 
przez mikroorganizmy w obecno ści tlenu do dwutlenku w ęgla, wody 
i soli mineralnych wszelkich innych obecnych pierwiastków (mine ­
ralizacja) oraz wytworzenie nowej biomasy i produktów organicz ­
nych biosyntezy drobnoustrojowej.  
Mineralizacja : rozkład substancji chemicznej lub materii orga ­
nicznej przez mikroorganizmy w obecno ści tlenu do dwutlenku 
węgla, wody i soli mineralnych wszelkich innych obecnych pier ­
wiastków.  
Faza zastoju : czas od rozpocz ęcia badania do osi ągnięcia przysto ­
sowania si ę przez mikroorganizmy powoduj ące degradacj ę oraz 
wzrostu stopnia biodegradacji substancji chemicznej lub materii 
organicznej do wykrywalnego poziomu (np. 10 % maksymalnej teoretycznej biodegradacji, b ądź niższego, w zale żności od dok ład­
ności techniki pomiarowej).
 
Maksymalny poziom biodegradacji : zapisany w procentach stopie ń 
biodegradacji substancji chemicznej lub materii organicznej podczas 
badania, powy żej którego nie nast ępuje dalsza biodegradacja 
w trakcie badania.  
Podstawowy substrat : zbiór naturalnych źródeł węgla i energii, 
które zapewniaj ą wzrost i utrzymanie biomasy drobnoustrojowej.  
Drugorzędny substrat : składnik substratowy obecny w tak niskim 
stężeniu, iż wskutek jego degradacji w łaściwym mikroorganizmom 
dostarczane s ą jedynie nieznaczne ilo ści węgla i energii 
w porównaniu do ilo ści węgla i energii dostarczanych 
w wyniku degradacji g łównych sk ładników substratowych (podsta ­
wowych substratów).  
Stała szybko ści degradacji : kinetyczna sta ła szybkości pierwszego 
rzędu lub pseudo pierwszego rz ędu, k (d  –1 ), która wskazuje szybko ść 
procesów biodegradacji. Dla do świadczenia prowadzonego okresowo 
k oszacowuje si ę na podstawie pocz ątkowej cz ęści krzywej biode ­
gradacji uzyskanej po ko ńcu fazy opó źniania.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Czas półtrwania, t  1/2 (d): termin u żywany do charakteryzowania 
szybkości reakcji pierwszego rz ędu. Jest to przedzia ł czasu, który 
odpowiada zmniejszeniu si ę stężenia o czynnik 2. Czas pó łtrwania 
i stała szybkości biodegradacji zwi ązane są równaniem t  1/2 = ln2/k.  
Półokres degradacji, DT  50 (d): termin u żywany do ilo ściowego 
wyrażenia wyniku bada ń biodegradacji. Jest to przedzia ł czasu, 
wraz z faz ą opóźniania, potrzebny do osi ągnięcia warto ści biodegra ­
dacji wynosz ącej 50 %.  
Granica wykrywalno ści (LOD) i granica kwantyfikacji (LOQ) : 
granica wykrywalno ści (LOD) jest to st ężenie substancji, poni żej 
którego to żsamości substancji nie mo żna odróżnić od ubocznych 
efektów analitycznych. Granica kwantyfikacji (LOQ) jest to st ężenie 
substancji, poni żej którego st ężenia nie mo żna oznaczy ć 
z zadowalaj ącą dokładnością. 
Rozpuszczony w ęgiel organiczny (RWO) : ta część węgla organicz ­
nego w próbce wody, której nie mo żna usunąć za pomoc ą określonej 
metody rozdzielania faz, na przyk ład poprzez odwirowanie przy 
40 000 ms  –2 przez 15 min lub przez filtracj ę przeponow ą 
z użyciem przepon o średnicy porów 0,2 μm–0,45 μm. 
Aktywno ść całkowitego organicznego  14 C (TOA) : całkowita 
aktywność 14 C związana z w ęglem organicznym.  
Aktywno ść rozpuszczonego organicznego  14 C (DOA) : całkowita 
aktywność 14 C związana z rozpuszczonym w ęglem organicznym.  
Aktywno ść organicznego  14 C w postaci cz ąstek stałych (POA) : 
całkowita aktywno ść 14 C związana z w ęglem organicznym 
w postaci cz ąstek stałych. 
1.3. STOSOWALNO ŚĆ BADANIA  
Niniejsze badanie symulacyjne stosuje si ę do nielotnych lub 
nieznacznie lotnych substancji organicznych badanych w niskich 
stężeniach. Gdy u żywa się kolb otwartych do atmosfery (np. 
zamkniętych watą), to substancje o sta łych prawa Henry’ego mniej ­
szych ni ż około 1 Pa·m  3 /mol (ok. 10  –5 atm·m  3 /mol) mo żna 
w praktyce uwa żać za nielotne. Gdy u żywa się zamkniętych kolb 
z przestrzeni ą nad roztworem, to mo żliwe jest badanie nieznacznie 
lotnych substancji (o sta łych prawa Henry’ego < 100 Pa·m  3 /mol lub 
< 10  –3 atm·m  3 /mol) bez strat z uk ładu próbnego. Strata substancji 
znakowanych przy pomocy  14 C może wystąpić, jeśli nie zachowuje 
się prawidłowych środków ostro żności podczas usuwania CO  2 . 
W takich sytuacjach mo że być konieczne wychwycenie CO  2 
w wewnętrznym absorberze z alkaliami lub u życie zewn ętrznego 
układu absorbera CO  2 (bezpośrednie oznaczanie  14 CO 2 ; zob. dodatek 
3). Do wyznaczania kinetyki biodegradacji, st ężenia badanej 
substancji musz ą być niższe od jej rozpuszczalno ści w wodzie. 
Należy zwrócić uwagę jednak, że literaturowe warto ści rozpuszczal ­
ności w wodzie mog ą być znacznie wy ższe niż rozpuszczalno ść 
badanej substancji w naturalnych wodach. Ewentualnie rozpuszczal ­
ność badanych substancji szczególnie trudno rozpuszczalnych 
w wodzie mo żna ustalić przy użyciu naturalnych wód.  
Metoda mo że być stosowana do symulowania biodegradacji w wodzie 
powierzchniowej wolnej od du żych cząstek („próba pelagiczna”) lub 
w mętnej wodzie powierzchniowej, która mo że istnieć np. w pobli żu 
granicy faz woda/osad („próba z zawieszonym osadem”).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. ZASADA BADANIA  
Badanie przeprowadza si ę w systemie okresowym przez inkubo ­
wanie badanej substancji sam ą wodą powierzchniow ą („próba pela ­
giczna”) lub wod ą powierzchniow ą doprawion ą zawieszonymi 
cząstkami sta łymi/osadem w ilo ści 0,01–1 g/l suchej masy („próba 
z zawieszonym osadem”), symuluj ąc zbiornik wodny 
z zawieszonymi cz ąstkami sta łymi lub ponownie zawieszonym 
osadem. St ężenie zawieszonych cz ąstek stałych/osadu w dolnym 
zakresie tego przedzia łu jest typowe dla wi ększości wód powierzch ­
niowych. Kolby próbne inkubuje si ę w ciemno ści w temperaturze 
środowiska w warunkach aerobowych, stosuj ąc mieszanie. W celu 
określenia kinetyki degradacji nale ży użyć co najmniej dwóch 
różnych stężeń badanej substancji. St ężenia powinny ró żnić się od 
siebie o czynnik 5–10 i powinny reprezentowa ć spodziewany zakres 
stężeń w środowisku. Maksymalne st ężenie badanej substancji nie 
powinno przekracza ć 100 μg/l, lecz aby zapewni ć, że biodegradacja 
będzie przebiega ć zgodnie z kinetyk ą pierwszego rz ędu preferowane 
jest stężenie wynosz ące 10 μg/l lub mniej. Najni ższe stężenie nie 
powinno przekracza ć 10 μg/l, lecz preferowane s ą niższe stężenia 
próbne, wynosz ące 1–2 μg/l lub poni żej 1 μg/l. Zwykle zadowalaj ącą 
analizę tak niskich st ężeń można wykona ć, używając dostępnych 
w handlu substancji znakowanych za pomoc ą 14 C. Z uwagi na ogra ­
niczenia analityczne cz ęsto niemo żliwe jest zmierzenie st ężenia 
badanej substancji z wymagan ą dokładnością, jeżeli badana 
substancja jest zastosowana w st ężeniu ≤ 100 μg/l (zob. akapit 
drugi w sekcji 1.7.2). Do identyfikacji i ilo ściowego oznaczenia 
głównych produktów przemiany lub wówczas, gdy nie jest dost ępna 
konkretna metoda analityczna o niskiej granicy wykrywania, mog ą 
być stosowane wy ższe stężenia badanej substancji (> 100 μg/l, 
a niekiedy > 1 mg/l). Je żeli badane s ą wysokie st ężenia badanej 
substancji, to mo że być niemożliwe wykorzystanie wyników do 
oszacowania sta łej i czasu pó łtrwania degradacji pierwszego rz ędu, 
gdyż degradacja prawdopodobnie nie b ędzie przebiega ć zgodnie 
z kinetyk ą pierwszego rz ędu. 
Degradacj ę śledzi się w odpowiednich odst ępach czasu, mierz ąc 
resztkowy  14 C lub stężenie resztkowe badanej substancji, gdy stoso ­
wana jest specyficzna analiza chemiczna. Oznakowanie za pomoc ą 
14 C najbardziej trwa łej części cząsteczki zapewnia wyznaczenie 
całkowitej mineralizacji, podczas gdy oznakowanie przy pomocy  
14 C mniej trwa łej części cząsteczki, jak równie ż zastosowanie specy ­
ficznej analizy, umo żliwia ocen ę jedynie biodegradacji pierwotnej. 
Jednakże najbardziej trwa ła część cząsteczki niekoniecznie obejmuje 
właściwą funkcjonaln ą część cząsteczki (któr ą można powiązać 
z określoną własnością, taką jak toksyczno ść, bioakumulacja, itp.). 
W tej sytuacji, aby śledzić eliminacj ę określonej własności, stosowne 
może być wykorzystanie badanej substancji, która jest oznakowana 
za pomoc ą 14 C w części funkcjonalnej.  
1.5. INFORMACJE O BADANEJ SUBSTANCJI  
Do niniejszego badania mog ą być używane substancje próbne 
zarówno znakowane, jak i nieznakowane izotopem promieniotwór ­
czym. Zalecana jest technika znakowania za pomoc ą 14 C 
i znakowanie zwykle powinno by ć wykonane w najbardziej trwa łej 
części(-ach) cz ąsteczki (zob. równie ż — sekcja 1.4). W przypadku 
substancji zawieraj ących więcej niż jeden pier ścień aromatyczny, 
najlepiej jeden lub wi ęcej atomów w ęgla w ka żdym pier ścieniu 
powinno by ć oznakowanych za pomoc ą 14 C. Ponadto, najkorzystniej 
jest, jeśli za pomoc ą 14 C oznakowany jest jeden lub wi ęcej atomów 
węgla po obydwu stronach wi ązań łatwo ulegaj ących degradacji. 
Chemiczna i/lub radiochemiczna czysto ść badanej substancji 
powinna wynosi ć > 95 %. Dla substancji znakowanych izotopem 
promieniotwórczym, preferowana jest aktywno ść właściwa 
wynosząca ok. 50 μCi/mg (1,85 MBq) lub wi ęcej, aby u łatwić 
pomiary  14 C w badaniach prowadzonych przy niskich pocz ątkowych 
stężeniach. Powinny by ć dostępne nast ępujące dane o badanej 
substancji:  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— rozpuszczalno ść w wodzie [metoda A.6],  
— rozpuszczalno ść w organicznym rozpuszczalniku(-ach) (sub ­
stancje stosowane z rozpuszczalnikiem lub substancje o niskiej rozpuszczalno ści w wodzie),
 
— stała dysocjacji (pKa), je żeli substancja jest podatna na proto ­
nację lub deprotonacj ę [OECD TG 112] (5),  
— ciśnienie pary [metoda A.4] oraz sta ła prawa Henry’ego,  
— chemiczna trwa łość w wodzie i w ciemno ści (hydroliza) [metoda 
C.7].  
Gdy słabo rozpuszczalne w wodzie substancje s ą badane w wodzie 
morskiej, to mo że być przydatna znajomo ść stałej wysalania (lub 
stałej „Setczenowa”) K  s , którą określa wyrażenie: log (S/S’) = K  s 
C m , w którym S i S’ jest rozpuszczalno ścią, odpowiednio, 
w wodzie s łodkiej i w wodzie morskiej, a C  m stężeniem molowym 
soli. 
Jeżeli badanie przeprowadza si ę jako „prób ę zawieszonego osadu”, 
to powinny by ć również dostępne następujące dane:  
— współczynnik podzia łu n-oktanol/woda [metoda A.8],  
— współczynnik adsorpcji [metoda C.18].  
Do innych przydatnych danych mog ą należeć: 
— stężenie w środowisku, je śli jest znane lub oszacowane,  
— toksyczno ść badanej substancji w stosunku do mikroorganizmów 
[metoda C.11],  
— gotowa i/lub naturalna podatno ść na biodegradacj ę [metody 
C.4 A–F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5)],  
— podatno ść na aerobow ą lub anaerobow ą biodegradacj ę 
w badaniach przemiany w glebie i osadzie/wodzie [metody C.23, C.24].
 
1.6. SUBSTANCJA ODNIESIENIA  
Jako substancj ę odniesienia nale ży zastosowa ć substancj ę, która 
normalnie łatwo ulega degradacji w warunkach aerobowych (tj. 
anilinę lub benzoesan sodu). Spodziewany okres dla degradacji 
aniliny i benzoesanu sodu wynosi zwykle mniej ni ż 2 tygodnie. 
Zadaniem substancji odniesienia jest zapewnienie, że aktywno ść 
drobnoustrojowa wody zawiera si ę w pewnych granicach, tzn. że 
woda zawiera aktywn ą populacj ę drobnoustrojów.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1332
 
1.7. KRYTERIA JAKO ŚCI 
1.7.1.  Odzysk  
Natychmiast po dodaniu badanej substancji ka żde początkowe 
stężenie nale ży sprawdzi ć poprzez pomiary aktywno ści 14 C lub, 
w przypadku nieznakowanych substancji, za pomoc ą analiz chemicz ­
nych, w co najmniej podwójnych próbkach. Dostarcza to informacji o stosowalno ści i powtarzalno ści metody analitycznej oraz 
o jednorodno ści rozk ładu badanej substancji. Zwykle 
w późniejszych analizach danych u żywa się zmierzonej pocz ątkowej 
aktywności
 14 C lub stężenia badanej substancji zamiast nominalnego 
stężenia, gdy ż w ten sposób kompensuje si ę straty spowodowane 
sorpcją i błędami dozowania. Dla substancji znakowanej za pomoc ą 
14 C poziom odzysku na ko ńcu doświadczenia dany jest przez bilans 
masy (zob. ostatni akapit w sekcji 1.8.9.4). Najlepiej jest, je śli bilans 
masy znakowanej izotopem promieniotwórczym zawiera si ę 
w granicach 90–110 %, natomiast dla nieznakowanych badanych 
substancji dok ładność analityczna powinna prowadzi ć do pocz ątko­
wego odzysku wynosz ącego 70–110 %. Zakresy te nale ży interpre ­
tować jako docelowe i nie nale ży używać ich jako kryteriów dla 
przyjęcia badania. Ewentualnie dok ładność analityczn ą można 
wyznaczy ć dla badanej substancji w ni ższym st ężeniu niż 
początkowe stężenie oraz dla g łównych produktów przemiany.  
1.7.2.  Powtarzalno ść i czułość metody analitycznej  
Powtarzalno ść metody analitycznej (w tym wydajno ść początkowej 
ekstrakcji) w ilo ściowym oznaczaniu badanej substancji oraz 
produktów przemiany, je śli stosowne, nale ży sprawdzi ć za pomoc ą 
pięciu powtórzonych analiz indywidualnych ekstraktów wody 
powierzchniowej.  
Granica wykrywalno ści (LOD) metody analitycznej dla badanej 
substancji i dla produktów przemiany powinna wynosi ć co najmniej 
1 % pocz ątkowej ilo ści wprowadzonej do badanego uk ładu, jeśli to 
możliwe. Granica kwantyfikacji (LOQ) powinna by ć mniejsza lub 
równa 10 % zastosowanego st ężenia. Analizy chemiczne wielu 
substancji organicznych i produktów ich przemiany cz ęsto wyma ­
gają, aby badana substancja by ła wprowadzona w stosunkowo 
dużym stężeniu, tj. > 100 μg/l. 
1.8. OPIS METODY BADAWCZEJ  
1.8.1.  Sprz ęt 
Badanie mo żna prowadzi ć w kolbach sto żkowych lub cylindrycz ­
nych o odpowiedniej pojemno ści (np. 0,5 lub 1,0 litra) zamkni ętych 
korkiem silikonowym lub gumowym b ądź w kolbach na surowic ę 
z wieczkami szczelnymi dla CO  2 (np. przykrywkami z gumy buty ­
lowej). Inn ą możliwością jest prowadzenie badania przy u życiu 
wielu kolb i zbieranie ca łych kolb, co najmniej podwójnie, 
o każdym czasie przewidzianym na pobranie próbki (zob. ostatni 
akapit w sekcji 1.8.9.1). Dla nielotnych badanych substancji, które 
nie są oznakowane izotopem promieniotwórczym, nie s ą wymagane 
gazoszczelne korki lub przykrywki; odpowiednie s ą luźne tampony 
z waty, które zapobiegaj ą zanieczyszczeniu z powietrza (zob. akapit 
drugi w sekcji 1.8.9.1). Nieznacznie lotne substancje nale ży badać 
w układzie typu biometr z łagodnym mieszaniem powierzchni wody. 
Aby być pewnym, że nie wyst ępuje zanieczyszczenie bakteryjne, 
przed użyciem naczynia mo żna dodatkowo wysterylizowa ć przez 
ogrzanie lub autoklawizowanie. Ponadto u żywany jest nast ępujący 
standardowy sprz ęt laboratoryjny:  
— stół wibracyjny lub mieszad ła magnetyczne do ci ągłego 
mieszania kolb próbnych,  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— wirówka,  
— pehametr,  
— turbidymetr do nefelometrycznych pomiarów zm ętnienia,  
— piec lub kuchenka mikrofalowa do oznacze ń masy suchej,  
— aparat do filtracji przeponowej,  
— autoklaw lub piec do sterylizacji szk ła laboratoryjnego,  
— urządzenia do manipulacji substancjami oznakowanymi przy 
pomocy  14 C, 
— sprzęt do ilościowego okre ślania aktywno ści 14 C w próbkach 
pobranych z roztworów wychwytuj ących CO  2 oraz, jeśli to 
wymagane, w próbkach osadu,  
— sprzęt analityczny do oznaczania badanej substancji (i substancji 
odniesienia), je żeli stosowana jest specyficzna analiza chemiczna 
(np. chromatograf gazowy, wysokoci śnieniowy chromatograf 
cieczowy).  
1.8.2.  Roztwory wzorcowe badanej substancji  
Do sporz ądzenia roztworów podstawowych badanej substancji 
i substancji odniesienia u żywa się wody dejonizowanej (zob. akapit 
pierwszy w sekcji 1.8.7). Woda dejonizowana powinna by ć wolna 
od substancji, które mog ą być toksyczne dla mikroorganizmów, za ś 
stężenie rozpuszczonego w ęgla organicznego (RWO) nie powinno 
być większe niż 1 mg/l (6).  
1.8.3.  Pobranie i transport wody powierzchniowej  
Miejsce do pobrania próbki wody powierzchniowej nale ży wybrać 
stosownie do celu badania w danej sytuacji. Przy wyborze miejsc do pobrania próbki nale ży wziąć pod uwag ę historię możliwych wpro ­
wadzanych zanieczyszcze ń rolniczych, przemys łowych lub domo ­
wych. Jeżeli wiadomo, że środowisko wodne by ło zanieczyszczane 
badaną substancj ą lub jej strukturalnymi analogami w ci ągu poprzed ­
nich czterech lat, to nie nale ży go wykorzystywa ć do pobrania wody 
do badania, chyba że wyraźnym celem badacza jest zbadanie 
szybkości degradacji w poprzednio eksponowanych miejscach. 
W miejscu pobrania nale ży zmierzy ć pH i temperatur ę wody. 
Ponadto nale ży odnotowa ć głębokość pobierania próbki oraz wygl ąd 
próbki wody (np. barw ę i mętność) (zob. sekcja 3). Nale ży zmierzy ć 
stężenie tlenu i/lub potencja ł redoks w wodzie i w powierzchniowej 
warstwie osadu, aby wykaza ć istnienie warunków aerobowe, chyba 
że jest to oczywiste na podstawie oceny wygl ądu i historycznych 
doświadczeń dotyczą
cych miejsca. Wod ę powierzchniow ą należy 
transportowa ć w dokładnie wyczyszczonym pojemniku. Podczas 
transportu, temperatura próbki nie powinna znacz ąco przekracza ć 
temperatury stosowanej w badaniu. Zalecane jest och łodzenie do 
temperatury 4 °C, je śli czas trwania transportu przekracza 2–3 
godziny. Próbki wody nie wolno zamra żać. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Przechowywanie i przygotowywanie wody powierzchniowej  
Badanie najlepiej jest rozpocz ąć w ciągu jednego dnia od pobrania 
próbki. Przechowywanie wody, je śli konieczne, powinno by ć ogra­
niczone do minimum i w żadnym wypadku nie mo że przekroczy ć 
maksymalnego okresu wynosz ącego 4 tygodnie. Do czasu u życia 
próbkę wody nale ży utrzymywa ć w temperaturze 4 °C 
z napowietrzaniem. Przed u życiem nale ży usunąć duże cząstki, np. 
za pomoc ą filtracji przez filtr nylonowy o rozmiarze otworów 
100 μm lub przez zgrubny filtr papierowy b ądź poprzez sedymenta ­
cję. 
1.8.5.  Sporz ądzenie wody doprawionej osadem (do wyboru)  
Do próby zawieszonego osadu do kolb zawieraj ących naturaln ą 
wodę (przefiltrowan ą w celu usuni ęcia dużych cząstek, jak opisano 
w sekcji 1.8.4) dodaje si ę osad powierzchniowy, aby uzyska ć zawie­
sinę; stężenie zawieszonych cz ąstek stałych powinno zawiera ć się 
w granicach 0,01–1 g/l. Osad powierzchniowy powinien pochodzi ć 
z tego samego miejsca, z którego pobrano próbk ę wody. 
W zależności od konkretnego środowiska wodnego osad powierzch ­
niowy mo że charakteryzowa ć się wysoką zawartością węgla orga­
nicznego (2,5–7,5 %) i drobnoziarnist ą strukturą lub nisk ą zawar­
tością węgla organicznego (0,5–2,5 %) i gruboziarnist ą strukturą (3). 
Osad powierzchniowy mo żna przygotowa ć następująco: pobra ć kilka 
rdzeni osadu, u żywając rurki z przezroczystego tworzywa sztucz ­
nego, natychmiast po pobraniu próbek odci ąć górne warstwy aero ­
bowe (od powierzchni do g łębokości maks. 5 mm) i po łączyć je 
z sobą. Otrzyman ą w wyniku próbk ę osadu nale ży przetransportowa ć 
w pojemniku z du żą objętością powietrza nad osadem, aby utrzyma ć 
osad w warunkach aerobowych (och łodzić do temperatury 4 °C, je śli 
czas transportu przekracza 2–3 godziny). Z próbki osadu nale ży 
sporządzić zawiesin ę w badanej wodzie w stosunku 1:10 i do 
czasu użycia utrzymywa ć w temperaturze 4 °C z napowietrzaniem. 
Przechowywanie osadu, je śli jest wymagane, powinno by ć ograni­
czone do minimum i w żadnym wypadku nie mo że przekroczy ć 
maksymalnego okresu wynosz ącego 4 tygodnie.  
1.8.6.  Procedura pó łciągła (do wyboru)  
Jeśli występuje długa zwłoka czasowa, to mo że być wymagana 
dłuższa inkubacja (trwaj ąca kilka miesi ęcy), zanim mo żna będzie 
zmierzyć znaczącą degradacj ę badanej substancji. Je śli wiadomo 
o tym z poprzedniego badania substancji, to badanie mo żna 
rozpocząć, stosując procedur ę półciągłą, która pozwala na okresow ą 
wymianę części badanej wody lub zawiesiny (zob. dodatek 2). Alter ­
natywnie normalne badanie prowadzone w systemie okresowym 
można zamieni ć na badanie pó łciągłe, jeśli nie zosta ła 
osiągnięta degradacja badanej substancji w ci ągu około 60 dni 
badania z u życiem procedury okresowej (zob. akapit drugi 
w sekcji 1.8.8.3).  
1.8.7.  Dodanie substancji badanej (lub odniesienia)  
W przypadku substancji o wysokiej rozpuszczalno ści w wodzie (> 
1 mg/L) i ma łej lotności (stałe prawa Henry’ego < 1 Pa·m  3 /mol lub 
< 10  –5 atm·m  3 /mol) roztwór podstawowy mo żna sporz ądzić 
w wodzie dejonizowanej (zob. sekcja 1.8.2); odpowiedni ą objętość 
roztworu podstawowego dodaje si ę do naczy ń próbnych, aby 
uzyskać żądane stężenie. Obj ętość każdego dodawanego roztworu 
podstawowego nale ży ograniczy ć do praktycznie mo żliwego 
minimum (< 10 % ko ńcowej obj ętości cieczy, je śli to możliwe). 
Inna procedura polega na rozpuszczeniu badanej substancji 
w dużej objętości badanej wody, co mo żna uważać za procedur ę 
alternatywn ą dla użycia rozpuszczalników organicznych.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1335
 
Jeśli to nieuniknione, roztwory podstawowe nielotnych substancji 
o słabej rozpuszczalno ści w wodzie nale ży sporządzić przy użyciu 
lotnego rozpuszczalnika organicznego, lecz ilo ść rozpuszczalnika 
dodanego do uk ładu nie powinna przekracza ć 1 % obj. i nie powinna 
mieć negatywnych wp ływów na aktywno ść drobnoustrojów. 
Rozpuszczalnik nie powinien wp ływać na stabilno ść badanej 
substancji w wodzie. Rozpuszczalnik nale ży ograniczy ć do bardzo 
małej ilości, tak aby nie zwi ększył znacząco stężenia RWO 
w badanej wodzie lub zawiesinie. Nale ży to sprawdzi ć za pomoc ą 
analizy specyficznej dla substancji lub, je śli to możliwe, za pomoc ą 
analizy RWO (6). Nale ży starać się ograniczy ć ilość przenoszonego 
rozpuszczalnika do absolutnie niezb ędnej wielko ści oraz upewni ć 
się, że ilość badanej substancji mo że rozpuścić się w końcowej obj ę­
tości badanej wody. Do wprowadzenia badanej substancji do naczy ń 
próbnych mo żna użyć innych technik, takich jak opisane w (7) i (8). 
Gdy do wprowadzenia badanej substancji u żyty jest rozpuszczalnik 
organiczny, to próby z rozpuszczalnikiem zawieraj ące badaną wodę 
(bez dodatków) i badan ą wodę z dodatkiem substancji odniesienia 
należy potraktowa ć podobnie, jak aktywne naczynia próbne zapra ­
wione badan ą substancj ą w nośniku rozpuszczalnikowym. Celem 
użycia prób kontrolnych z rozpuszczalnikiem jest zbadanie mo żli­
wych ujemnych skutków powodowanych przez rozpuszczalnik 
w populacji mikroorganizmów, uwidocznionych przez degradacj ę 
substancji odniesienia.  
1.8.8.  Warunki badania  
1.8.8.1.  Temperatura badania  
Inkubacja powinna odbywa ć się w ciemno ści (preferowane) lub 
w rozproszonym świetle w regulowanej temperaturze (± 2 °C), 
którą może być temperatura polowa lub standardowa temperatura 
20–25 °C. Temperatur ą polową może być rzeczywista temperatura 
próbki w czasie jej pobierania lub średnia temperatura otoczenia 
w miejscu pobierania próbki.  
1.8.8.2.  Mieszanie  
Należy zapewni ć mieszanie poprzez ci ągłe wstrząsanie lub miesza ­
nie, aby utrzyma ć cząstki i mikroorganizmy w zawiesinie. Mieszanie 
ułatwia równie ż przenoszenie tlenu z przestrzeni nad ciecz ą do 
cieczy, tak aby mog ły być należycie utrzymane warunki aerobowe. 
Ustawić kolby na stole wibracyjnym (z pr ędkością mieszania ok. 100 
obr./min) lub u żyć mieszad ła magnetycznego. Mieszanie musi by ć 
ciągłe. Jednak że wstrząsanie lub mieszanie powinno by ć możliwie 
jak najbardziej łagodne, przy jednoczesnym utrzymywaniu jedno ­
rodnej zawiesiny.  
1.8.8.3.  Czas trwania badania  
Czas trwania badania zwykle nie powinien przekracza ć 60 dni, 
chyba że zastosowana jest procedura pó łciągła z okresow ą wymianą 
badanej zawiesiny (zob. sekcja 1.8.6 i dodatek 2). Jednak że okres 
badania w przypadku próby okresowej mo że być przedłużony do 90 
dni, jeżeli degradacja badanej substancji rozpocz ęła się w ciągu 
pierwszych 60 dni. Degradacj ę monitoruje si ę w odpowiednich 
odstępach czasu poprzez wyznaczanie aktywno ści resztkowego  14 C 
lub wydzielonego  14 CO 2 (zob. sekcja 1.8.9.4) i/lub za pomoc ą 
analizy chemicznej (sekcja 1.8.9.5). Czas inkubacji musi by ć wystar­
czająco długi, aby oceni ć proces degradacji. Stopie ń degradacji 
najlepiej powinien przekracza ć 50 %; w przypadku substancji powoli 
ulegających degradacji, stopie ń degradacji musi by ć dostateczny 
(zwykle wi ększy niż 20 % degradacji), aby zapewni ć oszacowanie 
kinetycznej sta łej szybko ści degradacji.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
Należy prowadzi ć okresowe pomiary pH i st ężenia tlenu w uk ładzie, 
chyba że poprzednie do świadczenia uzyskane z podobnych bada ń 
z udziałem próbek wody i osadu pobranych z tego samego miejsca 
wskazują, że pomiary takie s ą niepotrzebne. W pewnych warunkach 
może zdarzyć się, że metabolizm podstawowych substratów przy 
znacznie wy ższych stężeniach w wodzie lub osadzie spowoduje na 
tyle duże wydzielenie si ę CO  2 i wyczerpanie si ę tlenu, że znacząco 
zmieni warunki do świadczalne podczas badania.  
1.8.9.  Procedura  
1.8.9.1.  Przygotowanie kolb do próby pelagicznej  
Przenieść odpowiedni ą objętość badanej wody do kolb próbnych do 
około jednej trzeciej obj ętości kolby, ale nie mniej ni ż około 100 ml. 
Jeżeli użytych jest wiele kolb (w celu umo żliwienia zebrania 
całych kolb o ka żdym czasie pobierania próbek), to odpowiednia 
objętość badanej wody równie ż wynosi oko ło 100 ml, gdy ż 
małe objętości próbek mog ą wpływać na d ługość fazy 
zastoju. Badan ą substancj ę dodaje si ę z roztworu podstawowego, 
jak opisano w sekcjach 1.8.2 i 1.8.7. Nale ży użyć co najmniej 
dwóch ró żnych stężeń badanej substancji, ró żniących się o czynnik 
5–10, aby okre ślić kinetykę degradacji i obliczy ć kinetyczn ą stałą 
szybkości degradacji. Obydwa wybrane st ężenia powinny by ć 
mniejsze ni ż 100 μg/l, a najlepiej powinny zawiera ć się 
w przedziale < 1–10 μg/l. 
Zamknąć kolby korkami lub przykrywkami nieprzepuszczalnymi dla 
powietrza i CO  2 . Dla nieznakowanych za pomoc ą 14 C nielotnych 
badanych substancji chemicznych odpowiednie s ą luźne tampony 
z waty, które zapobiegaj ą przedostawaniu si ę zanieczyszcze ń z 
powietrza (zob. sekcja 1.8.1), pod warunkiem i ż wiadomo, że 
wszelkie g łówne produkty degradacji s ą nielotne i je żeli stosowane 
jest bezpo średnie oznaczanie CO  2 (zob. dodatek 3).  
Inkubowa ć kolby w wybranej temperaturze (zob. sekcja 1.8.8.1). 
Pobrać próbki do analizy chemicznej lub pomiarów  14 C na pocz ątku 
badania (tj. przed rozpocz ęciem się biodegradacji; zob. sekcja 1.7.1), 
a następnie w odpowiednich odst ępach czasu w trakcie przebiegu 
badania. Próbkowanie mo żna przeprowadzi ć przez pobranie 
podpróbek (np. porcji po 5 ml) z ka żdego replikatu lub przez 
zebranie ca łych kolb o ka żdym czasie próbkowania. Mineralizacj ę 
badanej substancji mo żna określić pośrednio lub bezpo średnio (zob. 
dodatek 3). Zwykle podczas fazy degradacji (tj. po zako ńczeniu fazy 
zastoju) wymaganych jest minimum pi ęć punktów próbkowania 
w celu oszacowania wiarygodnej sta łej szybko ści, chyba że można 
uzasadnić, iż dla substancji szybko ulegaj ących degradacji wystarcz ą 
trzy punkty próbkowania. W przypadku substancji, które nie ulegaj ą 
szybko degradacji, mo żna z łatwością wykona ć większą ilość 
pomiarów podczas fazy degradacji i dlatego do oszacowania 
k należy użyć więcej punktów danych. Nie mo żna podać ustalonego 
harmonogramu pobierania próbek, gdy ż szybkość biodegradacji jest 
zmienna; jednak że zaleca si ę, aby pobra ć próbkę raz na tydzie ń, 
jeśli degradacja jest powolna. Je żeli badana substancja szybko 
ulega degradacji, to pobranie próbki powinno odbywa ć się raz na 
dzień w ciągu pierwszych trzech dni, a nast ępnie co dwa lub trzy 
dni. W niektórych sytuacjach, jak na przyk ład w przypadku 
substancji szybko hydrolizuj ących, mo że być konieczne pobieranie 
próbek w odst ępach godzinnych. Zaleca si ę, aby przed badaniem 
przeprowadzi ć badanie wst ępne w celu okre ślenia odpowiednich 
odstępów próbkowania. Je żeli próbki musz ą być dostępne do dalszej 
specjalnej analizy, to wskazane jest, aby pobra ć większą ilość 
próbek, a nast ępnie wybra ć te, które b ędą analizowane na ko ńcu 
doświadczenia, post ępując według strategii „wstecz”, zgodnie 
z którą ostatnie próbki s ą analizowane jako pierwsze (zob. akapit 
drugi w sekcji 1.8.9.5, gdzie podano wskazówki dotycz ące trwałości 
próbek w czasie przechowywania).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Liczba kolb i próbek  
Przygotowa ć dostateczn ą ilość kolb próbnych, tak aby mie ć: 
— kolby próbne; co najmniej po dwie kolby do ka żdego stężenia 
badanej substancji (najlepiej minimum 3) lub wiele kolb 
próbnych do ka żdego stężenia, jeżeli o każdym czasie próbko ­
wania zbierane s ą całe kolby (symbol F  T ), 
— kolby próbne do obliczenia bilansu masy; co najmniej pod dwie 
kolby do ka żdego badanego st ężenia (symbol F  M ), 
— ślepą próbę kontroln ą, bez badanej substancji; co najmniej jedn ą 
kolbę próbną zawieraj ącą tylko badan ą wodę (symbol F  B ), 
— porównawcz ą próbę kontroln ą; po dwie kolby z substancj ą 
odniesienia (np. anilin ą lub benzoesanem sodu, o st ężeniu 10 
μg/l) (symbol F  C ). Celem porównawczej próby kontrolnej jest 
potwierdzenie minimalnej aktywno ści drobnoustrojów. Je śli jest 
to dogodne, mo żna użyć substancji odniesienia znakowanej 
izotopem promieniotwórczym, tak że wówczas, gdy degradacja 
badanej substancji jest monitorowana za pomoc ą analiz chemicz ­
nych,  
— steryln ą próbę kontroln ą; jedną lub dwie kolby zawieraj ące 
wysterylizowan ą badaną wodę do zbadania mo żliwej 
abiotycznej degradacji lub innego niebiologicznego usuwania 
badanej substancji (symbol F  S ). Biologiczn ą aktywno ść można 
zatrzymać przez autoklawizowanie badanej wody (121 °C; 
20 min) lub przez dodanie środka toksycznego (np. azydku sodo ­
wego (NaN  3 ) o stężeniu 10–20 g/l, chlorku rt ęciowego (HgCl  2 ) 
o stężeniu 100 mg/l lub formaliny o st ężeniu 100 mg/l) b ądź 
przez napromieniowanie promieniami gamma. Je żeli wykorzys ­
tuje się HgCl  2 , to nale ży go zutylizowa ć, tak jak odpad 
toksyczny. W przypadku wody z osadem dodanym w du żej ilości 
nie jest łatwo uzyska ć sterylne warunki; w takim przypadku 
zaleca się kilkukrotne (np. trzykrotne) autoklawizowanie. Nale ży 
wziąć pod uwag ę, że wskutek autoklawizowania mo że zmienić 
się charakterystyka sorpcyjna osadu,  
— próby kontrolne z rozpuszczalnikiem, zawieraj ące badaną wodę 
oraz badan ą wodę z substancj ą odniesienia; po dwie kolby 
potraktowane tak ą samą ilością rozpuszczalnika i przy zastoso ­
waniu takiej samej procedury, jak u żyta do wprowadzania 
badanej substancji. Celem jest zbadanie mo żliwych negatywnych 
wpływów rozpuszczalnika przez okre ślenie degradacji badanej 
substancji.  
W planie badania badacz powinien wzi ąć pod uwag ę względne 
znaczenie zwi ększonej ilo ści powtórze ń doświadczalnych 
w zależności od zwi ększonej krotno ści próbkowania. Dok ładna 
liczba potrzebnych kolb zale żeć będzie od metody u żytej do 
mierzenia degradacji (zob. akapit trzeci w sekcji 1.8.9.1; sekcja 
1.8.9.4 i dodatek 3).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1338
 
O każdym czasie próbkowania, z ka żdej kolby próbnej nale ży pobrać 
dwie podpróbki (np. porcje po 5 ml). Je żeli używa się wielu kolb dla 
umożliwienia zbierania ca łych kolb, to ka żdorazowo podczas 
próbkowania nale ży poświęcić minimum dwie kolby (zob. akapit 
pierwszy w sekcji 1.8.9.1).  
1.8.9.3.  Przygotowanie kolb do próby z zawieszonym osadem [do wyboru]  
Dodać do naczy ń próbnych niezb ędne objętości badanej wody 
i osadu, je śli jest wymagany (zob. sekcja 1.8.5). Przygotowanie 
kolb do próby z zawieszonym osadem jest takie samo, jak dla próby pelagicznej (zob. sekcje 1.8.9.1 i 1.8.9.2). Najlepiej jest użyć butelek na osocze lub kolb o podobnym kszta łcie. Umie ścić 
zamknięte kolby poziomo na wstrz ąsarce. Oczywi ście otwarte kolby 
w przypadku nielotnych substancji nieznakowanych za pomoc ą
 14 C 
należy ustawić w pozycji pionowej; w tym przypadku zaleca si ę 
mieszanie magnetyczne i u życie mieszade łek magnetycznych pokry ­
tych szkłem. Jeśli to konieczne, napowietrza ć butelki, aby utrzyma ć 
odpowiednie warunki aerobowe.  
1.8.9.4.  Oznaczenia radiochemiczne  
Wydzielaj ący się 14 CO 2 mierzy si ę pośrednio i bezpo średnio (zob. 
dodatek 3).  14 CO 2 oznacza si ę pośrednio na podstawie ró żnicy 
pomiędzy początkową aktywno ścią 14 C w badanej wodzie lub zawie ­
sinie a ca łkowitą aktywno ścią resztkow ą podczas pobierania próbek, 
zmierzoną po zakwaszeniu próbki do pH 2–3 i usuni ęciu CO  2 . 
Węgiel nieorganiczny zostaje w ten sposób usuni ęty, a zmierzona 
aktywność resztkowa pochodzi od materia łu organicznego. Po śred­
niego oznaczania  14 CO 2 nie należy stosowa ć, jeżeli podczas prze ­
miany badanej substancji tworz ą się główne produkty przemiany, 
które są lotne (zob. dodatek 3). Je śli to mo żliwe, wydzielenie  
14 CO 2 należy zmierzy ć bezpośrednio (zob. dodatek 3) podczas 
pobierania próbek w co najmniej jednej kolbie próbnej; procedura ta umożliwia sprawdzenie zarówno bilansu masy, jak i procesu 
biodegradacji, lecz ogranicza si ę do prób prowadzonych 
z zamkni ętymi kolbami.
 
Jeżeli wydzielony  14 CO 2 mierzy si ę bezpośrednio podczas badania, 
to w tym celu na pocz ątku badania nale ży przygotowa ć większą 
ilość kolb. Bezpo średnie oznaczanie  14 CO 2 jest zalecane, je żeli 
podczas przemiany badanej substancji tworz ą się lotne g łówne 
produkty przemiany. W ka żdym momencie pomiaru dodatkowe 
kolby próbne zakwasza si ę do pH 2–3, a  14 CO 2 zbiera si ę 
w wewnętrznym lub zewn ętrznym absorberze (zob. dodatek 3).  
Ewentualnie, badan ą substancj ę znakowan ą za pomoc ą 14 C oraz 
główne produkty przemiany mo żna oznacza ć przy zastosowaniu 
radiochromatografii (np. chromatografii cienkowarstwowej, RAD- TLC) lub HPLC z detekcj ą radiochemiczn ą.
 
Ewentualnie mo żna wyznaczy ć rozkład fazowy pozostaj ącej radio­
aktywności (zob. dodatek 1) oraz resztkowej badanej substancji 
i produktów przemiany.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
Na końcu badania nale ży wyznaczy ć bilans masy przez bezpo średni 
pomiar  14 CO 2 , używając oddzielnych kolb próbnych, z których 
próbki nie s ą pobierane w trakcie badania (zob. dodatek 3).  
1.8.9.5.  Specyficzna analiza chemiczna  
Jeśli dysponuje si ę czułą specyficzn ą metodą analityczn ą, to pier­
wotną biodegradacj ę można ocenić, mierząc całkowite resztkowe 
stężenie badanej substancji, zamiast u żywania technik znakowania 
izotopem promieniotwórczym. Je żeli użyta jest substancja znako ­
wana izotopem promieniotwórczym (w celu zmierzenia ca łkowitej 
mineralizacji), to równolegle mo żna wykona ć specyficzn ą analizę 
chemiczn ą, aby uzyska ć przydatne dodatkowe informacje 
i sprawdzi ć procedur ę. Specyficznych analiz chemicznych mo żna 
również użyć do zmierzenia produktów przemiany powsta łych 
podczas degradacji badanej substancji i jest to zalecane dla substan ­
cji, które s ą mineralizowane z czasem pó łtrwania przekraczaj ącym 
60 dni. Za ka żdym razem podczas próbkowania nale ży zmierzy ć 
stężenie badanej substancji i produktów przemiany i poda ć je 
w sprawozdaniu (jako st ężenie i jako procentowo ść zastosowanego 
stężenia). Na ogó ł powinno si ę identyfikowa ć produkty przemiany 
wykryte w ilo ści ≥ 10 % zastosowanego st ężenia podczas ka żdego 
próbkowania, o ile nie jest uzasadnione inaczej istotnymi wzgl ędami. 
Produkty przemiany, dla których st ężenia wzrastaj ą w sposób ci ągły 
podczas badania, nale ży równie ż uwzględnić przy identyfikacji, 
nawet jeśli ich stężenia nie przekraczaj ą podanej wy żej granicy, 
gdyż może to oznacza ć utrzymywanie si ę tendencji. Analizy 
produktów przemiany w próbach sterylizowanych powinny by ć 
wzięte pod uwag ę, jeżeli uważa się za możliwą szybką abiotyczn ą 
przemianę badanej substancji (np. hydroliz ę). Potrzeb ę kwantyfikacji 
i identyfikacji produktów przemiany nale ży rozważyć dla każdego 
przypadku oddzielnie, z podaniem uzasadnie ń w sprawozdaniu. 
Techniki ekstrakcji za pomoc ą rozpuszczalnika organicznego nale ży 
zastosowa ć zgodnie ze wskazówkami podanymi w odno śnej proce ­
durze analitycznej.  
Wszystkie próbki nale ży przechowywa ć w temperaturze 2–4 °C i w 
warunkach hermetycznych, je śli analizę przeprowadza si ę w ciągu 24 
godzin (preferowane). Do d łuższego przechowywania, próbki nale ży 
zamrozić do temperatury poni żej – 18 °C lub chemicznie zakonser ­
wować. Zakwaszanie nie jest zalecanym sposobem konserwacji 
próbek, poniewa ż zakwaszone próbki mog ą być nietrwałe. Jeżeli 
próbki nie s ą zanalizowane w ci ągu 24 i s ą poddane d łuższemu 
przechowywaniu, to nale ży przeprowadzi ć badanie trwa łości podczas 
przechowywania w celu wykazania trwa łości substancji chemicznych 
będących przedmiotem zainteresowania w temperaturze poni żej – 
18 °C lub w warunkach konserwacji. Je żeli metoda analityczna 
wiąże się z ekstrakcj ą rozpuszczalnikow ą lub ekstrakcj ą fazy stałej 
(SPE), to ekstrakcj ę należy wykona ć natychmiast po pobraniu próbki 
lub po przechowaniu sch łodzonej próbki maksymalnie przez 24 
godziny.  
W zależności od czu łości metody analitycznej, mog ą być konieczne 
większe obj ętości próbek ni ż te, które podano w sekcji 
1.8.1. Badanie mo żna łatwo przeprowadzi ć z objętościami próbnymi 
wynoszącymi jeden litr w kolbach o pojemno ści 2–3 litrów, co 
pozwala na pobranie próbek o obj ętości ok. 100 ml.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. DANE ORAZ SPORZ ĄDZENIE SPRAWOZDANIA  
2.1. OBRÓBKA WYNIKÓW  
2.1.1.  Wykre ślne przedstawienie danych  
Zaokrąglić czasy pobierania próbek do ca łkowitej liczby godzin 
(chyba że substancja ulega istotnej degradacji w czasie trwaj ącym 
w minutach lub godzinach), lecz nie do ca łkowitej liczby dni. 
Wykreślić oszacowane warto ści aktywno ści resztkowej badanej 
substancji (dla substancji znakowanych za pomoc ą 14 C) lub stężenie 
resztkowe (dla nieznakowanych substancji) w zale żności od czasu na 
wykresie liniowym lub pó łlogarytmicznym (zob. rysunki 1a, 1b). 
Jeśli miała miejsce degradacja, to porówna ć wyniki z kolb F  T 
z wynikami z kolb F  S . Jeżeli średnie wyników uzyskanych z kolb 
z badaną substancj ą (F  T ) i kolb sterylizowanych (F  S ) różnią się 
o mniej ni ż 10 %, to mo żna założyć, że 
zaobserwowana degradacja jest w przewa żającej mierze abiotyczna. 
Jeżeli degradacja w kolbach F  S jest mniejsza, to wielko ści tych 
można użyć do skorygowania wielko ści uzyskanych z kolb F  T (przez 
odjęcie), aby oszacowa ć stopień biodegradacji. Gdy wykonywane s ą 
dodatkowe analizy dla g łównych produktów przemiany, to nale ży 
również przedstawi ć wykres ich powstawania i spadku zawarto ści, 
oprócz wykresu spadku zawarto ści badanej substancji.  
Oszacowa ć czas trwania fazy zastoju t  L na podstawie 
krzywej degradacji (wykresu pó łlogarytmicznego) przez ekstrapo ­
lację jej liniowej cz ęści do zerowej degradacji lub, alternatywnie, 
przez wyznaczenie czasu dla przybli żonej 10 % degradacji (zob. 
rysunki 1a i 1b). Na podstawie wykresu pó łlogarytmicznego osza ­
cować stałą szybkości pierwszego rz ędu, k, oraz jej b łąd standar ­
dowy za pomoc ą regresji liniowej ln (aktywno ści resztkowej  14 C 
lub stężenia badanej substancji) w zale żności od czasu. 
W szczególno ści w przypadku pomiarów  14 C użyć tylko danych 
należących do pocz ątkowej liniowej cz ęści krzywej po zako ńczonej 
fazie zastoju i wybra ć raczej niewielk ą liczbę reprezentatywnych 
danych ni ż większą liczbę bardziej niepewnych danych. Niepewno ść 
obejmuje tu b łędy związane z zaleconym bezpo średnim u życiem 
zmierzonych aktywno ści resztkowego  14 C (zob. poni żej). Niekiedy 
może być właściwe obliczenie dwu ró żnych sta łych szybko ści, 
jeżeli degradacja przebiega dwufazowo. W tym celu okre ślono 
dwie różne fazy krzywej degradacji. Obliczenia sta łej szybko ści, k, 
oraz czasu pó łtrwania t  ½ = ln2/k nale ży przeprowadzi ć dla każdej 
spośród indywidualnych replikatowych kolb, gdy podpróbki s ą 
pobrane z tej samej kolby, lub u żywając średnich warto ści, gdy 
podczas ka żdego próbkowania zbierane s ą pełne kolby (zob. ostatni 
akapit w sekcji 1.8.9.2). Gdy u żyta jest pierwsza z wymienionych 
procedur, to sta łą szybkości i czas pó łtrwania nale ży podać 
w sprawozdaniu dla ka żdej z indywidualnych replikatowych kolb 
oraz jako warto ść średnią z błędem standardowym. Je śli użyto wyso­
kich stężeń badanej substancji, to krzywa degradacji mo że znacznie 
odbiegać od linii prostej (wykresu pó łlogarytmicznego) i kinetyka 
pierwszego rz ędu może nie by ć ważna. Określenie półokresu nie 
posiada wi ęc znaczenia. Jednak że dla ograniczonego zakresu danych 
można zastosowa ć kinetykę pseudo pierwszego rz ędu i oszacowa ć 
półokres degradacji DT  50 (czas do osi ągnięcia 50 % degradacji). 
Należy pamiętać jednak, że przebiegu czasowego degradacji poza 
wybranym zakresem danych nie da si ę przewidzie ć przy użyciu 
DT 50 , który jest jedynie deskryptorem danego zbioru danych. Anali ­
tyczne narz ędzia służące do u łatwienia oblicze ń statystycznych 
i dopasowywania krzywych s ą łatwo dost ępne i zaleca si ę użycie 
tego rodzaju oprogramowania.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Jeżeli wykonywane s ą specyficzne analizy chemiczne, nale ży osza­
cować stałe szybko ści i czas pó łtrwania dla pierwotnej degradacji, 
jak powy żej dla całkowitej mineralizacji. Je żeli pierwotna degradacja 
jest procesem ograniczaj ącym, to mo żna niekiedy u żyć punktów 
danych z ca łego przebiegu degradacji. Wynika to st ąd, iż pomiary 
te są bezpośrednie, w przeciwie ństwie do pomiarów aktywno ści 14 C. 
Jeżeli są używane substancje znakowane za pomoc ą 14 C, to bilans 
masy nale ży wyrazić w procentach zastosowanego st ężenia, przynaj ­
mniej na ko ńcu badania.  
2.1.2.  Aktywno ść resztkowa  
Gdy znakowana za pomoc ą 14 C część substancji organicznej ulega 
biodegradacji, to znaczna cz ęść 14 C zamienia si ę w 14 CO 2 , podczas 
gdy reszta zostaje zu żyta do wzrostu biomasy i/lub syntezy pozako ­
mórkowych metabolitów. Dlatego pe łna „ostateczna” biodegradacja 
substancji nie powoduje 100 % zamiany jej w ęgla w  14 CO 2 . 14 C 
wbudowany w produkty utworzone w wyniku biosyntezy jest 
następnie powoli uwalniany jako  14 CO 2 na skutek „wtórnej minera ­
lizacji”. Z tych powodów wykresy zale żności aktywno ści resztko ­
wego organicznego  14 C (zmierzonej po usuni ęciu CO  2 ) lub wytwo ­
rzonego  14 CO 2 od czasu wykazywa ć będą tworzenie si ę „ogona” po 
zakończeniu degradacji. Komplikuje to kinetyczn ą interpretacj ę 
danych i w tym celu do oszacowania sta łej szybko ści degradacji 
zwykle nale ży wykorzysta ć tylko pocz ątkową część krzywej (po 
zakończeniu si ę fazy zastoju a przed osi ągnięciem ok. 
50 % degradacji). Je żeli badana substancja ulega degradacji, to 
całkowita aktywno ść resztkowego organicznego  14 C jest zawsze 
wyższa od aktywno ści 14 C związanego z pozosta łą nienaruszon ą 
badaną substancj ą. Jeżeli badana substancja ulega degradacji 
wskutek reakcji pierwszego rz ędu i stały ułamek α zostaje zminera ­
lizowany do CO  2 , to pocz ątkowe nachylenie krzywej zaniku  14 C 
(całkowity organiczny  14 C w zale żności od czasu) b ędzie równe α 
razy nachylenie odpowiedniej krzywej dla st ężenia badanej 
substancji (lub, ściślej biorąc, części badanej substancji oznakowanej 
za pomoc ą 14 C). Gdy u żywa się pomiarów aktywno ści całkowitego 
organicznego  14 C bez korekty, to obliczona sta ła 
szybkości degradacji b ędzie stanowi ć ostrożne oszacowanie. Proce ­
dury szacowania st ężeń badanych substancji na podstawie aktyw ­
ności radiochemicznych, oparte o ró żne upraszczaj ące założenia, 
zostały opisane w literaturze (2)(9)(10)(11). Procedury takie 
najłatwiej jest stosowa ć do substancji szybko ulegaj ących degradacji.  
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW  
Jeżeli stwierdza si ę, że k jest niezale żna od dodanego st ężenia (tj. 
jeżeli obliczona k jest w przybli żeniu taka sama przy ró żnych stęże­
niach badanej substancji), to mo żna założyć, że stała szybko ści 
pierwszego rz ędu jest reprezentatywna dla zastosowanych warunków 
badania, tj. badanej substancji, próbki wody i temperatury badania. 
To, w jakim stopniu wyniki mo żna uogólni ć lub ekstrapolowa ć do 
innych uk ładów, musi zosta ć określone na podstawie specjalistycznej 
opinii. Je żeli użyte jest wysokie st ężenie badanej substancji i w 
związku z tym degradacja nie przebiega zgodnie z kinetyk ą pierw­
szego rzędu, to danych nie mo żna wykorzysta ć do bezpo średniego 
oszacowania sta łej szybko ści pierwszego rz ędu lub odpowiadaj ącego 
jej czasu pó łtrwania. Jednak że dane pochodz ące z badania, w którym 
użyto wysokiego st ężenia badanej substancji, mog ą nadal by ć przy­
datne do oszacowania stopnia ca łkowitej mineralizacji i/lub wykrycia 
i kwantyfikacji produktów przemiany.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Jeżeli znane s ą szybkości procesów powoduj ących strat ę, innych ni ż 
biodegradacja (np. hydrolizy lub ulatniania si ę), to można odjąć je 
od szybko ści straty netto zaobserwowanej podczas badania, uzys ­
kując przybli żone oszacowanie szybko ści biodegradacji. Dane dla 
hydrolizy, na przyk ład, można uzyska ć ze sterylnej próby kontrolnej 
lub z równoleg łego badania z u życiem wy ższego stężenia badanej 
substancji.  
Pośrednie i bezpo średnie oznaczanie  14 CO 2 (sekcja 1.8.9.4 i dodatek 
3) można zastosowa ć jedynie do pomiaru stopnia mineralizacji 
badanej substancji do CO  2 . Do analizy st ężeń badanej substancji 
znakowanej za pomoc ą 14 C oraz powstawania g łównych produktów 
przemiany mo żna zastosowa ć radiochromatografi ę (RAD-TLC) lub 
HPLC (akapit trzeci w sekcji 1.8.9.4). Aby umo żliwić bezpośrednie 
oszacowanie czasu pó łtrwania g łówne produkty przemiany 
(określone jako ≥ 10 % zastosowanej ilo ści badanej substancji) 
muszą być nieobecne. Je żeli występują główne produkty przemiany, 
zgodnie z powy ższym okre śleniem, wymagana jest szczegó łowa 
ocena danych. Mo że ona obejmowa ć wielokrotne badania i/lub iden ­
tyfikację produktów przemiany (zob. akapit pierwszy w sekcji 
1.8.9.5), chyba że los produktów przemiany mo żna w sposób 
rozsądny oceni ć na podstawie do świadczenia (np. informacji 
o drodze degradacji). Poniewa ż część badanej substancji ulegaj ąca 
przemianie w CO  2 jest zmienna (zale żąc w dużej mierze od st ężenia 
badanej substancji oraz innych dost ępnych substratów, warunków 
badania oraz zespo łu drobnoustrojów), badanie to nie pozwala na 
proste oszacowanie ostatecznej biodegradacji, jak w próbie zanikania RWO; lecz wynik jest podobny do uzyskanego przy pomocy 
badaniu respirometrycznym. Stopie ń mineralizacji b ędzie więc 
mniejszy lub równy minimalnemu poziomowi ostatecznej biodegra ­
dacji. Aby uzyska ć pełniejszy obraz ostatecznej biodegradacji (mine ­
ralizacji i w łączenia do biomasy), na ko ńcu badania nale ży przepro ­
wadzić analizę rozkładu fazowego
 14 C (zob. dodatek 1).  14 C 
w określonej puli sk ładać się będzie z  14 C włączonego do bakte ­
ryjnej biomasy oraz  14 C zesorbowanego do cz ąstek organicznych.  
2.3. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Jeżeli substancja odniesienia nie ulega degradacji w spodziewanym 
przedziale czasu (dla aniliny i benzoesanu sody zwykle krótszym ni ż 
dwa tygodnie), to wa żność badania jest niepewna i musi zosta ć 
poddana dalszej weryfikacji lub, alternatywnie, badanie nale ży 
powtórzy ć z nową próbką wody. W zgodnym z ISO pier ścieniowym 
teście metody, w którym uczestniczy ło siedem laboratoriów z ca łej 
Europy, dostosowane sta łe szybkości degradacji dla aniliny wynosi ły 
w granicach od 0,3 do 1,7 dzie ń –1 ze średnią 0,8 d  –1 w 20 °C i z 
błędem standardowym ± 0,4 d  –1 (t ½ = 0,9 dnia). Typowe czasy 
zastoju wynosi ły 1–7 dni. Podano, że badane wody mia ły bakteryjn ą 
biomasę odpowiadaj ącą 10  3 –10  4 jednostek tworz ących koloni ę 
(CFU) na ml. Szybko ści degradacji w bogatych w sk ładniki 
odżywcze wodach środkowoeuropejskich by ły większe niż 
w skandynawskich wodach oligotroficznych, co mo że być spowodo ­
wane innym troficznym statusem lub uprzedni ą ekspozycj ą na 
substancje chemiczne.  
Całkowity odzysk (bilans masy) na ko ńcu doświadczenia powinien 
zawierać się w granicach 90–110 % dla substancji znakowanych 
izotopem promieniotwórczym, podczas gdy dla substancji nieznako ­
wanych pocz ątkowy odzysk na pocz ątku doświadczenia powinien 
wynosić 70–110 %. Jednak że podane zakresy nale ży interpretowa ć 
jedynie jako cele i nie nale ży używać ich jako kryteriów dla przy ­
jęcia badania.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
W sprawozdaniu z badania nale ży wyraźnie podać typ badania, tj. 
czy jest to próba pelagiczna czy próba zawieszonego osadu, przy czym powinno ono równie ż zawierać co najmniej nast ępujące infor­
macje:
 
Badana substancja i substancja(-e) odniesienia:  
— nazwy pospolite, nazwy chemiczne (zalecane nazwy IUPAC i/lub 
CAS), numery CAS, wzory strukturalne (wskazuj ące położenie  
14 C, jeśli użyta jest substancja znakowana izotopem promienio ­
twórczym) oraz stosowne w łasności fizykochemiczne badanej 
substancji i substancji odniesienia (zob. sekcje 1.5 i 1.6),  
— nazwy chemiczne, numery CAS, wzory strukturalne (wskazuj ące 
położenie  14 C, jeśli użyta jest substancja znakowana izotopem 
promieniotwórczym) oraz stosowne w łasności fizykochemiczne 
substancji u żytych jako wzorce do identyfikacji i kwantyfikacji 
produktów przemiany,  
— czysto ść (zanieczyszczenia) badanej substancji i substancji odnie ­
sienia,  
— radiochemiczna czysto ść znakowanej substancji chemicznej oraz 
aktywność właściwa (tam gdzie stosowne).  
Woda powierzchniowa:  
Należy podać, jako minimum, nast ępujące informacje dotycz ące 
próbki wody:  
— lokalizacja i opis miejsca pobrania próbki, w tym, je śli to 
możliwe, historia zanieczyszczenia,  
— data i godzina pobrania próbki,  
— składniki od żywcze (ca łkowity N, amon, azotyn, azotan, ca łko­
wity P, rozpuszczony ortofosforan),  
— głębokość pobrania,  
— wygląd próbki (np. barwa i m ętność), 
— RWO i TOC,  
— BOD,  
— temperatura i pH w miejscu oraz czas pobrania,  
— potencja ł tlenowy i redoks (obowi ązkowy tylko wówczas, je śli 
warunki aerobowe nie s ą oczywiste),  
— zasolenie lub konduktywno ść (w przypadku wody morskiej lub 
słonawej),  
— zawieszone cz ąstki stałe (w przypadku m ętnej próbki),  
— ewentualnie inne istotne informacje o miejscu próbkowania 
w czasie pobierania próbki (np. faktyczne lub historyczne dane 
dotyczące natężenia przep ływu rzek lub pr ądów morskich, pobli ­
skie ważniejsze odprowadzenia ścieków i ich typ, warunki 
atmosferyczne poprzedzaj ące czas pobrania próbki),  
oraz nieobowi ązkowo:  
— biomas ę drobnoustrojów (np. bezpo średnią liczbę uzyskan ą za 
pomocą oranżu akrydynowego lub jednostki tworz ące koloni ę), ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— węgiel nieorganiczny,  
— stężenie chlorofilu a jako swoiste oszacowanie biomasy alg.  
Ponadto nale ży podać następujące informacje o osadzie, je śli prze­
prowadzona jest próba zawieszonego osadu:  
— głębokość pobrania osadu,  
— wygląd osadu (np. zabarwiony, szlamowaty, mulisty lub piasz ­
czysty),  
— struktura (np. % grubego piasku, drobnego piasku, mu łu i gliny),  
— ciężar suchej masy w g/l zawieszonych cz ąstek, stężenie TOC 
lub utrata ci ężaru po zap łonie, jako miara zawarto ści materii 
organicznej,  
— pH,  
— potencja ł tlenowy i redoks (obowi ązkowy tylko wówczas, je śli 
warunki aerobowe nie s ą oczywiste).  
Warunki badania:  
— upływ czasu od pobrania do u życia w badaniu laboratoryjnym, 
przechowywanie próbki i wst ępna obróbka próbki, daty przepro ­
wadzenia bada ń, 
— ilość zastosowanej substancji badanej, st ężenie próbne oraz 
substancja odniesienia,  
— metoda wprowadzenia badanej substancji, w tym ewentualne 
użycie rozpuszczalników,  
— objętość użytej wody powierzchniowej i osadu (je śli jest użyty) 
oraz objętość pobrana ka żdorazowo do analizy,  
— opis zastosowanego uk ładu badawczego.  
Jeśli nie maj ą być utrzymane warunki ciemno ści — informacje 
o warunkach „rozproszonego światła”, 
— informacje o metodzie(-ach) zastosowanej do przygotowania 
sterylizowanych prób kontrolnych (np. temperatura, czas i ilo ść 
obróbek w autoklawie),  
— temperatura inkubacji,  
— informacje o analitycznych technikach i metodzie(-ach) 
zastosowanej/ych do pomiarów radiochemicznych oraz do spraw ­
dzania bilansu masy i pomiarów rozk ładu fazowego (je śli jest 
przeprowadzony),  
— liczba replikatów.  
Wyniki:  
— procenty odzysku (zob. sekcja 1.7.1),  
— powtarzalno ść i czułość zastosowanych metod analitycznych, 
w tym granica wykrywalno ści (LOD) oraz granica kwantyfikacji 
(LOQ) (zob. sekcja 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— wszystkie zmierzone dane (w tym punkty czasowe próbkowania) 
oraz obliczone warto ści w postaci tabelarycznej 
i krzywych degradacji; dla ka żdego stężenia próbnego i dla 
każdej replikatowej kolby nale ży podać współczynnik korelacji 
liniowej dla nachylenia wykresu logarytmicznego, oszacowan ą 
fazę zastoju oraz sta łą szybkości pierwszego rz ędu lub pseudo 
pierwszego rz ędu (jeśli to możliwe) oraz odpowiadaj ący jej czas 
półtrwania degradacji (lub okres pó łtrwania, t  50 ), 
— podać stosowne warto ści jako średnie z wyników zaobserwowa ­
nych w indywidualnych replikatach, np. d ługość fazy zastoju, 
stałą szybkości degradacji i czas pó łtrwania degradacji (lub t  50 ), 
— określić kategori ę układu, jako niezaadaptowany lub zaadapto ­
wany, na podstawie wygl ądu krzywej degradacji oraz na 
podstawie ewentualnego wp ływu stężenia próbnego,  
— wyniki ko ńcowego sprawdzenia bilansu masy oraz wyniki 
pomiarów rozk ładu fazowego (je śli są wykonane),  
— frakcja zmineralizowanego  14 C oraz, je żeli zastosowane s ą specy­
ficzne analizy, ko ńcowy poziom pierwotnej degradacji,  
— identyfikacja, molowe st ężenie i procentowo ść zastosowanej 
badanej substancji oraz g łównych produktów przemiany (zob. 
akapit pierwszy w sekcji 1.8.9.5), tam gdzie stosowne,  
— proponowana droga przemiany, tam gdzie stosowne,  
— omówienie wyników.  
4. LITERATURA  
(1) OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
— Simulation Biodegradation Test.  
(2) ISO/DIS 14592–1 (1999) Water quality — Evaluation of the 
aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations — Part 1: Shake flask batch test with surface water or 
surface water/sediment suspensions.  
(3) Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in 
soil. 
(4) Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
aquatic sediments.  
(5) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, 
Paris.  
(6) ISO 8245 (1999). Water quality — Guidelines on the determi ­
nation of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC).
 
(7) ISO 10634 (1995). Water quality — Guidance for the prepara ­
tion and treatment of poorly water-soluble organic compounds 
for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 
(8) OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity 
testing of difficult substances and mixtures. Environmental 
Health and Safety Publications. Series on Testing and Asses ­
sment. No 22 (to be published summer 2000).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1346
 
(9) Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineraliza ­
tion kinetics with the variables of substrate concentration and 
population density. Appl. Environ. Microbiol. 47, 394–401.  
(10) Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
mination of biodegradation rates of  14 C-labeled chemicals at 
low concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Envi ­
ron. Saf. 45, 274–283.  
(11) ISO/CD 14592–1 (1999). Ring test report: Water Quality — 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compo ­
unds at low concentrations part 1 — report of 1998/1999 ring- test. Shake flask batch test with surface water or surface water/ ­
sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Dodatek 1  
Rozkład fazowy  14 C 
Aby sprawdzi ć procedur ę, rutynowe pomiary aktywno ści pozosta łego całkowi­
tego organicznego  14 C (TOA) nale ży uzupełnić pomiarami bilansu masy polegaj ­ 
ącymi na bezpo średnim wyznaczaniu wydzielonego  14 CO 2 po wychwyceniu go 
w absorberze (zob. dodatek 3). Dodatnie wytworzenie si ę 14 CO 2 samo w sobie 
jest bezpo średnim dowodem biodegradacji, w odró żnieniu od degradacji abio ­
tycznej lub innych mechanizmów straty, takich jak ulatnianie si ę lub sorpcja. 
Dodatkowe u żyteczne informacje charakteryzuj ące przebieg biodegradacji mo żna 
uzyskać z pomiarów rozk ładu TOA pomi ędzy stan rozpuszczony (aktywno ść 
rozpuszczonego organicznego  14 C, DOA) a stan cz ąstkowy (aktywno ść cząstko­
wego organicznego  14 C, POA) po separacji cz ąstek stałych poprzez filtracj ę 
przeponow ą lub odwirowanie. Na POA sk łada się badana substancja zesorbo ­
wana na biomasie drobnoustrojów oraz na innych cz ąstkach, oraz w ęgiel badanej 
substancji, który zosta ł zużyty na syntez ę nowego materia łu komórkowego, 
a przez to w łączony do frakcji biomasy cz ąstkowej. Utworzenie si ę rozpusz­
czonego materia łu organicznego  14 C można oszacowa ć jako DOA na ko ńcu 
biodegradacji (plateau na krzywej zale żności degradacji od czasu).  
Oszacowa ć rozkład fazowy resztkowego  14 C w wybranych próbkach przez prze ­
filtrowanie próbek na filtrze przeponowym 0,22 μm lub 0,45 μm wykonanym 
z materia łu, który nie adsorbuje znacz ących ilości badanej substancji (odpo ­
wiednie mog ą być filtry poliw ęglanowe). Je żeli sorpcja badanej substancji na 
filtrze jest zbyt du ża, aby mo żna było ją pominąć (należy to sprawdzi ć przed 
doświadczeniem), to zamiast filtracji mo żna zastosowa ć odwirowanie z wysok ą 
prędkością (2 000 g; 10 min).  
Postąpić z filtratem lub odwirowanym materia łem tak, jak opisano w dodatek 3 
dla niefiltrowanych próbek. Rozpu ścić filtry przeponowe w odpowiednim p łynie 
scyntylacyjnym i wykona ć zliczenie, jak zwykle, normalnie stosuj ąc tylko 
metodę stosunku zewn ętrznego wzorca, aby dokona ć poprawki wygaszania, 
bądź użyć utleniacza próbki. Je żeli zastosowane zosta ło odwirowanie, to 
z grudki utworzonej z frakcji cz ąstkowej ponownie utworzy ć zawiesin ę 
w 1–2 ml wody destylowanej i przenie ść do fiolki scyntylacyjnej. Nast ępnie 
przemyć dwukrotnie 1 ml wody destylowanej i przenie ść wodę płuczącą do 
fiolki. Jeśli to konieczne, zawiesin ę można osadzi ć w żelu w celu wykonania 
cieczowego zliczenia scyntylacyjnego.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Dodatek 2  
Procedura pó łciągła 
Może być konieczna przed łużona inkubacja trwaj ąca do kilku miesi ęcy po to, 
aby osiągnąć degradacj ę opornych substancji. Czas trwania badania normalnie 
nie powinien przekracza ć 60 dni, chyba że cechy pierwotnej próbki wody s ą 
utrzymywane przez wymian ę zawiesiny próbnej. Jednak że okres badania mo że 
być wydłużony do maksimum 90 dni bez wymiany zawiesiny próbnej, 
jeżeli degradacja badanej substancji rozpocz ęła się w ciągu pierwszych 60 dni.  
Podczas inkubacji przez d ługie okresy, ró żnorodność zespołu drobnoustrojów 
może ulec zmniejszeniu na skutek ró żnych mechanizmów straty oraz wskutek 
możliwego zmniejszania si ę w próbce wody ilo ści istotnych sk ładników od żyw­
czych i podstawowych substratów w ęglowych. Dlatego zaleca si ę, aby zasto ­
sować badanie pó łciągłe w celu zadowalaj ącego wyznaczenia 
szybkości degradacji substancji wolno ulegaj ących degradacji. Badanie nale ży 
rozpocząć przez zastosowanie procedury pó łciągłej, jeżeli — na podstawie 
wcześniejszego do świadczenia — spodziewane jest, że do osi ągnięcia 
20 % degradacji badanej substancji niezb ędny jest okres inkubacji wynosz ący 
trzy miesi ące. Alternatywnie, normalne badanie prowadzone w systemie okre ­
sowym mo żna zamieni ć na badanie pó łciągłe, jeżeli w ciągu około 60 dni 
badania z u życiem procedury okresowej nie osi ągnięto degradacji badanej 
substancji. Procedur ę półciągłą nożna zatrzyma ć i kontynuowa ć badanie jako 
doświadczenie okresowe, gdy odnotuje si ę istotną degradacj ę (np. > 20 %).  
W badaniu pó łciągłym, co dwa tygodnie wymienia si ę około jedną trzecią obję­
tości zawiesiny próbnej na świeżo pobraną wodę z badaną substancj ą, dodaną do 
początkowego st ężenia. Podobnie, do wymiennej wody dodaje si ę osad do 
początkowego st ężenia (0,01–1 g/l), je żeli przeprowadza si ę dodatkowo prób ę 
zawieszonego osadu. Przeprowadzaj ąc badanie z zawieszonymi cz ąstkami 
stałymi osadu, wa żne jest, aby równie ż podczas wymiany wody utrzymywa ć 
układ w stanie pe łnego zawieszenia i aby czas przebywania by ł identyczny dla 
cząstek stałych i wody, gdy ż w przeciwnym razie utracone zostanie zamierzone 
podobieństwo do jednorodnego uk ładu wodnego bez ustalonych faz. Z tych 
względów, gdy stosowana jest procedura pó łciągła, preferowane jest pocz ątkowe 
stężenie zawieszonych osadów w dolnym przedziale wyznaczonego zakresu.  
Zalecone dodanie badanej substancji oznacza, że początkowe stężenie badanej 
substancji nie zostaje przekroczone wskutek cz ęściowej wymiany zawiesiny 
próbnej, a przez to unika si ę adaptacji, któr ą często obserwuje si ę przy wysokich 
stężeniach badanej substancji. Poniewa ż procedura obejmuje zarówno ponown ą 
inokulację, jak i kompensacj ę wyczerpanych sk ładników od żywczych i g łównych 
substratów, zostaje przywrócona pocz ątkowa różnorodność zespołu drobnoustro ­
jów, a czas trwania badania mo żna w zasadzie wyd łużać do niesko ńczoności. 
Gdy stosuje si ę procedur ę półciągłą, należy pamiętać, że resztkowe st ężenie 
badanej substancji musi by ć skorygowane pod wzgl ędem dodanych lub usuni ę­
tych ilości badanej substancji podczas ka żdej procedury wymiany. St ężenie 
całkowitej i rozpuszczonej badanej substancji mo że być używane zamiennie 
w przypadku zwi ązków ma ło sorbujących. Sorpcja jest nieznacz ąca (< 5 %) 
w określonych warunkach (0,1–1 g cz ąstek stałych/l) dla substancji o log Kow 
< 3 (ważne dla zwi ązków oboj ętnych, lipofilowych). Ilustruje to nast ępujący 
przykład obliczeniowy. 0,1 g/l cz ąstek stałych w przybli żeniu odpowiada 
10 mg w ęgla na litr (u łamek węgla, f  C = 0,01). Zak ładając, że: 
Log K  ow (badanej substancji) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
Współczynnik podzia łu, K  d = f C × K  oc 
zatem, rozpuszczony u łamek całkowitego st ężenia (C-woda (C  w )/C-całkowity 
(C t )) wynosi:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Dodatek 3  
Oznaczanie  14 CO  2 
Pośrednie oznaczanie  14 CO  2 
Dla rutynowych pomiarów metoda po średnia jest zwykle najmniej czasoch łonną 
i najbardziej dok ładną metodą, jeżeli badana substancja jest nielotna i nie 
zamienia si ę w lotne produkty przemiany. Nale ży jedynie przenie ść niefiltrowane 
próbki, o obj ętości np. 5 ml, do fiolek scyntylacyjnych. Odpowiednia aktywno ść 
w próbkach wynosi pocz ątkowo 5 000–10 000 dpm (80–170 Bq), a minimalna 
początkowa aktywno ść wynosi oko ło 1 000 dpm. CO  2 należy usunąć po zakwa ­
szeniu do pH 2–3 przy pomocy 1–2 kropli st ężonego H  3 PO 4 lub HCl. Usuni ęcia 
CO 2 można dokona ć poprzez barbotowanie powietrzem przez oko ło ½–1 
godziny. Alternatywnie fiolki mo żna energicznie wstrz ąsać przez 1–2 godziny 
(na przyk ład na wstrz ąsarce mikrop łytowej) lub, stosuj ąc łagodniejsze wstrz ąsa­
nie, pozostawi ć na noc. Nale ży sprawdzi ć efektywno ść procedury usuwania CO  2 
(przez przed łużenie okresu napowietrzania lub wstrz ąsania). Nast ępnie nale ży 
dodać ciecz scyntylacyjn ą odpowiedni ą do zliczania próbek wodnych, ujedno ­
rodnić próbkę na mieszadle wirowym i wyznaczy ć radioaktywno ść za pomoc ą 
cieczowego zliczania scyntylacyjnego, odejmuj ąc aktywno ść tła stwierdzon ą 
w ślepych próbach (F  B ). O ile badana woda nie jest silnie zabarwiona lub nie 
zawiera wysokiego st ężenia cząstek stałych, próbki zwykle b ędą wykazywa ć 
równomierne wygaszanie i wystarczaj ące będzie wykonanie poprawek wyga ­
szania przy u życiu zewn ętrznego wzorca. Je żeli badana woda jest silnie zabar ­
wiona, to konieczna mo że być poprawka wygaszania poprzez dodanie wewn ętrz­
nego wzorca. Je śli stężenie cząstek stałych jest wysokie, to mo że nie by ć 
możliwe uzyskanie jednorodnego roztworu lub żelu bądź też może występować 
duża zmienno ść wygaszania pomi ędzy próbkami. W takim przypadku mo żna 
użyć metody zliczania opisanej poni żej dla szlamów próbnych. Je żeli badanie 
przeprowadza si ę jako prób ę zawieszonego osadu, to pomiar  14 CO 2 można 
wykonać pośrednio, pobieraj ąc jednorodn ą próbkę 10 ml badanej 
wody/zawiesiny i rozdzielaj ąc fazy przez odwirowanie z odpowiedni ą prędkością 
(np. 40 000 m/s  2 przez 15 min). Faz ę wodną należy następnie potraktowa ć, jak 
opisano powy żej. Aktywno ść 14 C w fazie cz ąstkowej (POA) nale ży wyznaczy ć 
przez ponowne sporz ądzenie zawiesiny osadu w niewielkiej obj ętości wody 
destylowanej, przeniesienie jej do fiolek scyntylacyjnych i dodanie cieczy scyn ­
tylacyjnej w celu utworzenia żelu (do tego celu dost ępne są specjalne ciecze 
scyntylacyjne). W zale żności od charakteru cz ąstek (np. zawarto ści w nich mate ­
riału organicznego), mo że być możliwe roztworzenie próbki przez noc za 
pomocą solubilizatora tkankowego, a nast ępnie ujednorodnienie na mieszadle 
wirowym przed dodaniem cieczy scyntylacyjnej. Alternatywnie POA mo żna 
wyznaczy ć przez spalenie w nadmiarze tlenu, u żywając utleniacza próbek. 
Podczas zliczania nale ży zawsze w łączyć wewnętrzne wzorce, a tak że może 
być niezbędne dokonanie korekt wygaszania przy u życiu dodatku wewn ętrznego 
wzorca dla ka żdej indywidualnej próbki.  
Bezpośrednie oznaczanie  14 CO  2 
Jeżeli wydzielony  14 CO 2 mierzy si ę bezpośrednio, to nale ży to wykona ć, przy­
gotowując na pocz ątku badania wi ększą ilość kolb, zbieraj ąc kolby próbne 
w każdym punkcie pomiaru przez zakwaszenie kolb próbnych do pH 2–3 
i wychwycenie  14 CO 2 w wewnętrznym (umieszczonym w ka żdej kolbie próbnej 
na początku badania) lub zewn ętrznym absorberze. Jako czynnika absorbuj ącego 
można użyć absorbera alkalicznego (np. 1 N roztwór NaOH lub tabletki NaOH), 
atanolaminy lub absorbera na jej bazie lub absorbery dost ępne w handlu. Do 
bezpośrednich pomiarów  14 CO 2 , kolby powinny by ć zamknięte np. za pomoc ą 
przykrywki z gumy butylowej.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Rysunek 1a  
Przykład arytmetycznego wykresu danych (aktywno ść resztkowa w zale żności od czasu)
  
Rysunek 1b  
Przykład półlogarytmicznego wykresu plot danych (ln z aktywno ści resztkowej 
w zależności od czasu)
  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  BADANIE INHIBICJI WZROSTU GATUNKU  LEMNA  
1. METODA  
Niniejsza metoda odpowiada TG 221 OECD (2006) (1). W śród 
organów UE panuje powszechna zgoda co do tego, że badanie  
Lemna  jest odpowiedni ą alternatyw ą dla badania na glonach 
w przypadku mocno zabarwionych substancji (2) (3).  
1.1. WST ĘP 
Niniejsza metoda badawcza s łuży do oceny toksyczno ści substancji 
w stosunku do ro ślin słodkowodnych gatunku  Lemna  (rzęsy 
wodnej). Jest ona oparta o istniej ące wytyczne (4)(5)(6)(7)(8)(9), 
lecz zawiera modyfikacje tych że metod, uwzgl ędniające najnowsze 
badania i konsultacje w sprawie szeregu podstawowych kwestii. 
Proponowana metoda zosta ła potwierdzona za pomoc ą międzynaro­
dowej próby pier ścieniowej (10).  
Niniejsza metoda badawcza opisuje gatunki  Lemna gibba  i Lemna 
minor , z których obydwa zosta ły szeroko zbadane i s ą przedmiotem 
przywołanych wy żej norm. Taksonomia gatunków  Lemna  jest 
trudna, gdy ż komplikuje j ą istnienie wielu ró żnych fenotypów. 
Choć w przypadku  Lemna  może występować genetyczna zmienno ść 
pod wzgl ędem reakcji na czynniki toksyczne, to obecnie istnieje 
niewystarczaj ąca ilość danych na temat tego źródła zmienno ści, tak 
aby zaleci ć określony klon do u życia z niniejsz ą metodą badawcz ą. 
Należy zwrócić uwagę, że badanie nie jest przeprowadzane aksenicz ­
nie, lecz na poszczególnych etapach w trakcie procedury badawczej podejmowane s ą kroki, aby ograniczy ć zanieczyszczenie innymi 
organizmami do minimum.
 
Opisano szczegó ły badania z odnawianiem (badanie pó łstatyczne 
i przepływowe) i bez odnawiania (badanie statyczne) roztworu testo ­
wego. W zale żności od celów badania oraz od wymaga ń regulacyj ­
nych zaleca si ę, aby rozwa żyć zastosowanie metody pó łstatycznej 
i przepływowej, np. dla substancji, które s ą szybko tracone 
z roztworu na skutek ulatniania si ę, fotodegradacji, wytr ącania się 
lub biodegradacji. Dalsze wskazówki podano w (11).  
1.2. DEFINICJE  
Do celów niniejszej metody badawczej u żyto następujących definicji 
i skrótów:  
Biomasa : jest to ci ężar suchej masy substancji żywej obecnej 
w populacji. W niniejszym badaniu zwykle mierzy si ę surogaty 
biomasy, takie jak liczba lub powierzchnia li ści, a przez to u życie 
określenia „biomasa” odnosi si ę również do tych surogatowych miar.  
Chloroza : jest to żółknienie tkanki li ści. 
Klon : jest to organizm lub komórka powsta ła z pojedynczego osob ­
nika przez rozmna żanie bezp łciowe. Osobniki z tego samego klonu 
są zatem genetycznie identyczne.  
Kolonia : oznacza skupisko macierzystych lub pochodnych li ści 
(zwykle 2 do 4) przyczepionych do siebie nawzajem. Niekiedy 
określana jest mianem ro śliny. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : jest to st ężenie substancji testowej rozpuszczonej w po żywce, 
które powoduje redukcj ę wzrostu  Lemna  o x % (np. 50 %) w danym 
okresie ekspozycji (który nale ży wyraźnie podać, jeśli odbiega od 
pełnego lub normalnego czasu trwania badania). Aby jednoznacznie 
oznaczyć wartość EC wynikaj ącą z szybko ści wzrostu lub uzysku, 
do szybko ści wzrostu u żywa się symbolu „E  r C” a do uzysku 
symbolu „E  y C”, po którym nast ępuje użyta zmienna pomiarowa, 
np. E  r C (liczba li ści). 
Badanie przep ływowe : jest to badanie, w którym roztwory testowe 
są wymieniane w sposób ci ągły. 
Liść: jest to indywidualna/pojedyncza „li ściopodobna” struktura 
rośliny rzęsy wodnej. Jest to najmniejsza jednostka, tj. osobnik, 
zdolna do rozmna żania się. 
Garbatość: oznacza li ście o zgarbionym lub spuchni ętym wygl ądzie.  
Wzrost : jest to przyrost zmiennej pomiarowej, jak np. liczba li ści, 
ciężar masy suchej, ci ężar masy wilgotnej lub powierzchnia li ści, 
w ciągu okresu badania.  
Szybkość wzrostu  (średnia w łaściwa szybko ść wzrostu ): jest to 
logarytmiczny przyrost biomasy w ci ągu okresu ekspozycji.  
Najmniejszy obserwowany poziom st ężenia (LOEC) : jest to 
najniższe stężenie testowe, przy którym obserwuje si ę, że substancja 
ma statystycznie istotny redukuj ący wpływ na wzrost (przy p < 0,05) 
w porównaniu do próby kontrolnej, w danym czasie ekspozycji. Jednakże wszystkie badane st ężenia powy żej LOEC musz ą mieć 
szkodliwy skutek równy lub wi ększy niż te, które s ą obserwowane 
przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mog ą być spełnione, to nale ży 
podać pełne wyjaśnienie, w jaki sposób LOEC (a st ąd NOEC) 
zostało wybrane.
 
Zmienne pomiarowe : są to dowolnego typu zmienne, które mierzy 
się, aby wyrazi ć punkt ko ńcowy badania przy u życiu jednej lub 
więcej różnych zmiennych odpowiedzi. W niniejszej metodzie 
zmiennymi pomiarowymi s ą: liczba li ści, powierzchnia li ści, ciężar 
masy świeżej i ciężar masy suchej.  
Monokultura : jest to kultura z jednym gatunkiem ro śliny. 
Martwica : jest to umar ła (tj. bia ła lub nasi ąknięta wodą) tkanka 
listna.  
Nieobserwowany wp ływ stężenia (NOEC) : jest to st ężenie testowe 
bezpośrednio poni żej LOEC.  
Fenotyp : są to obserwowalne cechy organizmu zdeterminowane 
przez wspó łoddziaływanie jego genów z jego środowiskiem.  
Zmienne odpowiedzi : są to zmienne s łużące do oszacowywania 
toksyczno ści, uzyskane na podstawie zmierzonych zmiennych 
opisujących biomas ę za pomoc ą różnych metod obliczania. 
W przypadku niniejszej metody zmiennymi odpowiedzi s ą: szyb­
kości wzrostu i uzysk, które otrzymuje si ę ze zmiennych pomiaro ­
wych, takich jak liczba li ści, powierzchnia li ści, ciężar masy świeżej 
lub ciężar masy suchej.  
Badanie pó łstatyczne (z odnawianiem) : jest to badanie, w którym 
roztwór testowy jest okresowo wymieniany w okre ślonych odst ępach 
czasu w trakcie badania.  
Badanie statyczne : jest to metoda badania bez odnawiania roztworu 
testowego w trakcie badania.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Punkt ko ńcowy badania : opisuje ogólny czynnik, który b ędzie 
ulegał zmianie pod wp ływem testowej substancji chemicznej 
w stosunku do próby kontrolnej, jako cel badania. W niniejszej metodzie punktem ko ńcowym badania jest inhibicja wzrostu, któr ą 
można wyrazi ć za pomoc ą różnych zmiennych odpowiedzi opartych 
o jedną lub więcej zmiennych pomiarowych.
 
Pożywka : jest to kompletne syntetyczne pod łoże hodowlane, na 
którym ro śliny wzrastaj ą, gdy są wyeksponowane na dzia łanie 
substancji testowej. Substancja testowa zwykle jest rozpuszczona w pożywce.
 
Uzysk : jest to warto ść zmiennej pomiarowej wyra żająca biomas ę na 
końcu okresu ekspozycji minus warto ść zmiennej pomiarowej na 
początku okresu ekspozycji.  
1.3. ZASADA BADANIA  
Wzrastającym wyk ładniczo kulturom ro ślinnym rodzaju  Lemna  
umożliwia się wzrastać w postaci monokultur przy ró żnych stęże­
niach substancji testowej w ci ągu okresu siedmiu dni. Celem badania 
jest ilościowe okre ślenie zwi ązanych z substancj ą oddziaływań na 
wegetatywny wzrost w ci ągu tego okresu, na podstawie ocen wybra ­
nych zmiennych pomiarowych. G łówną zmienną pomiarow ą jest 
liczba liści. Mierzy si ę również co najmniej jedn ą inną zmienną 
pomiarow ą (całkowitą powierzchni ę liści, ciężar masy suchej lub 
świeżej), gdyż niektóre substancje mog ą wpływać o wiele bardziej 
na inne zmienne pomiarowe ni ż ilość liści. Aby okre ślić ilościowo 
skutki zwi ązane z substancj ą, wzrost w roztworach testowych porów ­
nuje się do wzrostu w próbach kontrolnych i wyznacza si ę stężenie 
powodujące inhibicj ę wzrostu o okre ślone x % (np. 50 %) i wyra ża 
się je jako EC  x (np. EC  50 ). 
Punktem ko ńcowym badania jest inhibicja wzrostu wyra żona jako 
logarytmiczny przyrost zmiennej pomiarowej ( średnia w łaściwa 
szybkość wzrostu) w ci ągu okresu ekspozycji. Na podstawie śred­
nich właściwych szybko ści wzrostu zarejestrowanych w serii 
roztworów testowych wyznacza si ę stężenie powoduj ące inhibicj ę 
szybkości wzrostu o okre ślone x % (np. 50 %) i wyra ża się je 
jako E  r C x (np. E  r C 50 ). 
Dodatkow ą zmienną odpowiedzi u żytą w niniejszej metodzie badaw ­
czej jest uzysk, który mo że być potrzebny do spe łnienia okre ślonych 
wymagań regulacyjnych w niektórych krajach. Jest on zdefiniowany 
jako zmienne pomiarowe na ko ńcu okresu ekspozycji minus zmienne 
pomiarowe na pocz ątku okresu ekspozycji. Na podstawie uzysku 
zarejestrowanego w serii roztworów testowych oblicza si ę stężenie 
powodujące inhibicj ę uzysku o okre ślone x % (np. 50 %) i wyra ża 
się je jako E  y C x (np. E  y C 50 ). 
Ponadto mo żna statystycznie okre ślić najniższe stężenie zaobserwo ­
wanego skutku (LOEC) oraz st ężenie braku obserwowanego skutku 
(NOEC).  
1.4. INFORMACJE O SUBSTANCJI TESTOWEJ  
Należy dysponowa ć metodą analityczn ą o należytej czułości do 
ilościowego oznaczenia substancji w po żywce.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
Informacje o substancji testowej, które mog ą być przydatne 
w ustaleniu warunków badania obejmuj ą wzór strukturalny, czysto ść, 
rozpuszczalno ść w wodzie, trwa łość w wodzie i świetle, pK  a , K ow , 
ciśnienie pary oraz podatno ść na biodegradacj ę. Rozpuszczalno ść 
w wodzie i ci śnienie pary mog ą posłużyć do obliczenia sta łej 
prawa Henry’ego, która wska że, czy mo żliwe są znaczące straty 
substancji testowej w ci ągu okresu badania. Pomo że to stwierdzi ć, 
czy powinny zosta ć podjęte szczególne kroki w celu ograniczenia 
takich strat. Gdy dane o rozpuszczalno ści i trwa łości substancji 
testowej s ą niepewne, zaleca si ę, aby oceni ć je w warunkach bada ­
nia, przy uwzgl ędnieniu po żywki wzrostowej, temperatury 
i warunków o świetlenia, które maj ą być zastosowane w badaniu.  
Gdy szczególnie wa żna jest kontrola pH po żywki, np. gdy bada si ę 
metale lub substancje, które s ą hydrolitycznie nietrwa łe, zaleca si ę 
dodanie bufora do po żywki wzrostowej (zob. akapit pierwszy 
w sekcji 1.7.4). Dalsze wskazówki dotycz ące badania substancji 
o własnościach fizykochemicznych, które utrudniaj ą ich badanie, 
podano w (11).  
1.5. SUBSTANCJA ODNIESIENIA  
Jako sposób sprawdzenia procedury badawczej mo żna zbada ć 
substancję(-e) odniesienia, tak ą jak 3,5-dwuchlorofenol u żywany 
w międzynarodowej próbie pier ścieniowej (10). Wskazane jest testo ­
wanie substancji odniesienia co najmniej dwa razy do roku lub gdy 
badanie jest wykonywane z mniejsz ą częstotliwością, równolegle 
z określaniem toksyczno ści substancji testowej.  
1.6. WA ŻNOŚĆ BADANIA  
Aby badanie by ło ważne, czas podwojenia liczby li ści w próbie 
kontrolnej musi by ć mniejszy ni ż 2,5 dnia (60 godz.), co odpowiada 
w przybli żeniu siedmiokrotnemu wzrostowi w ci ągu siedmiu dni 
oraz średniej w łaściwej szybko ści wzrostu wynosz ącej 0,275 d  –1 . 
Gdy używa się pożywki i badanie przeprowadzane jest 
w warunkach opisanych w niniejszej metodzie badawczej, kryterium to można spełnić stosując warunki badania statycznego (8). Przewi ­
duje się również, że kryterium to b ędzie możliwe do spe łnienia 
w warunkach badania pó łstatycznego i przep ływowego. Obliczenie 
czasu podwojenia przedstawiono w sekcji 2.1.
 
1.7. OPIS METODY  
1.7.1.  Przyrz ąd 
Cały sprzęt mający kontakt z po żywkami musi by ć wykonany ze 
szkła lub innego chemicznie oboj ętnego materia łu. Naczynia szklane 
używane do celów hodowli kultur i badania powinny by ć wolne od 
zanieczyszcze ń chemicznych, które mog łyby zosta ć wypłukane do 
pożywki oraz powinny by ć sterylne. Naczynia badawcze powinny 
mieć dostateczn ą szeroko ść, tak aby li ście różnych kolonii 
w naczyniach kontrolnych uros ły bez zachodzenia na siebie na 
koniec badania. Nie ma znaczenia, czy korzenie dotykaj ą dna naczy ń 
badawczych, lecz zaleca si ę minimaln ą głębokość 20 mm 
i minimaln ą objętość 100 ml w ka żdym naczyniu badawczym. 
Wybór naczy ń badawczych nie ma szczególnie wa żnego znaczenia, 
o ile spełnione są te wymagania. Odpowiednie okaza ły się szklane 
zlewki, naczy ńka krystalizacyjne lub szalki Petriego o odpowiednich 
wymiarach. Naczynia badawcze musz ą być przykryte, tak aby ogra ­
niczyć do minimum parowanie i przypadkowe zanieczyszczenie, 
przy jednoczesnym umo żliwieniu niezb ędnej wymiany powietrza. 
Odpowiednie naczynia badawcze, a w szczególno ści pokrywy, nie 
powinny dopuszcza ć do zacienienia lub zmian charakterystyki 
widmowej światła. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
Kultury i naczynia badawcze nie powinny by ć trzymane razem. 
Najlepiej mo żna to zapewni ć, używając oddzielnych klimatycznych 
komór wzrostowych, inkubatorów lub pomieszcze ń. Oświetlenie 
i temperatura musz ą być regulowane i utrzymywane na sta łym 
poziomie (zob. sekcja 1.7.8).  
1.7.2.  Badany organizm  
Organizmem u żytym do niniejszego badania jest  Lemna gibba  lub 
Lemna minor . Krótkie opisy gatunków rz ęsy wodnej, których u żyto 
do badania toksyczno ści, zamieszczono w dodatku 1. Materia ł 
roślinny mo żna uzyska ć z kolekcji kultur, z innego laboratorium 
lub z terenu. Je żeli rośliny są zebrane z terenu, to przed u życiem 
należy je trzyma ć przez co najmniej osiem tygodni w kulturze w tej 
samej po żywce, co u żyta do badania. Miejsca w terenie wykorzys ­
tane do zebrania pocz ątkowych kultur musz ą być wolne od 
wyraźnych źródeł zanieczyszczenia. Je żeli uzyskane s ą one 
z innego laboratorium lub z kolekcji kultur, to powinny by ć trzy­
mane w podobny sposób przez co najmniej trzy tygodnie. W sprawozdaniu nale ży zawsze poda ć źródło materia łu roślinnego 
oraz gatunek i klon (je śli jest znany) u żyty do badania.
 
Należy użyć monokultur, które s ą w sposób widoczny wolne od 
zanieczyszczenia innymi organizmami, takimi jak glony i pierwotniaki. Zdrowe ro śliny L. minor  składać się będą z kolonii 
zawierających od dwóch do pi ęciu liści, podczas gdy zdrowe kolonie  
L. gibba  mogą zawierać do siedmiu li ści.
 
Jakość i jednorodno ść roślin użytych do badania b ędzie mie ć 
znaczący wpływ na jego wynik i dlatego powinny one by ć wybie­
rane ze staranno ścią. Należy używać młodych, szybko rosn ących 
roślin bez widocznych zmian chorobowych lub odbarwienia (chloro ­
zy). O dobrej jako ści kultur świadczy du ża częstość występowania 
kolonii zawieraj ących co najmniej dwa li ście. Duża liczba pojedyn ­
czych liści oznacza stres środowiskowy, np. ograniczenie sk ładników 
odżywczych i materia łu roślinnego z takich kultur nie nale ży używać 
do badania.  
1.7.3.  Hodowla  
Aby zmniejszy ć częstotliwość utrzymania kultur (np. gdy przez 
pewien okres nie planuje si ę badań nad  Lemna ), kultury mo żna 
utrzymywa ć w warunkach zmniejszonego o świetlenia i obni żonej 
temperatury (4–10 °C). Szczegó ły dotyczące hodowli kultury podano 
w dodatku 2. Wyra źne oznaki zanieczyszczenia glonami lub innymi 
organizmami wymaga ć będą powierzchniowej sterylizacji podpróbki 
liści Lemna , a następnie przeniesienia jej do świeżej pożywki (zob. 
dodatek 2). W takim przypadku pozosta łą zanieczyszczon ą kulturę 
należy odrzuci ć. 
Co najmniej siedem dni przed badaniem, dostateczn ą ilość kolonii 
przenosi si ę aseptycznie do świeżej sterylnej po żywki i przez 7–10 
dni hoduje si ę kulturę w warunkach badania.  
1.7.4.  Po żywka  
Dla Lemna minor  i Lemna gibba  zalecane s ą różne pożywki, jak 
opisano poni żej. Należy dokładnie rozwa żyć włączenie bufora pH do 
pożywki (MOPS (kwasu 4-morfolinopropanosulfonowego, nr CAS 
1132–61–2; nr EINECS 214–478–5) w po żywce  L. minor  oraz 
NaHCO  3 w pożywce  L. gibba ), gdy podejrzewa si ę, że mógłby on 
reagować z substancj ą testową i wpłynąć na wyra żenie jej toksycz ­
ności. Dopuszczalna jest równie ż pożywka Steinberga (12), o ile 
spełnione są kryteria wa żności. ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Do hodowli kultur i badania  L. minor  zalecana jest modyfikacja 
pożywki wzrostowej  Lemna  według normy szwedzkiej (SIS). Sk ład 
tej pożywki podano w dodatku 3.  
Do hodowli kultur i badania  L. gibba  zaleca si ę pożywkę wzrostow ą 
20X AAP, opisan ą w dodatku 3.  
Pożywka Steinberga, opisana w dodatku 3, jest równie ż odpowiednia 
dla L. minor , lecz mo że być także użyta do  L. gibka , o ile spe łnione 
są kryteria wa żności. 
1.7.5.  Roztwory testowe  
Roztwory testowe sporz ądza się zazwyczaj przez rozcie ńczenie 
roztworu podstawowego. Roztwory podstawowe substancji testowej sporządza się zwykle przez rozpuszczenie substancji w po żywce 
wzrostowej.
 
Najwyższe badane st ężenie substancji zwykle nie powinno przekra ­
czać rozpuszczalno ści tej substancji w wodzie w warunkach badania. 
Należy jednak zauwa żyć, że gatunki  Lemna  unoszą się na 
powierzchni i mog ą być wyeksponowane na substancje, które 
gromadzą się na granicy faz woda-powietrze (jak np. substancje 
słabo rozpuszczalne w wodzie lub hydrofobowe b ądź substancje 
powierzchniowo czynne). W takiej sytuacji ekspozycja b ędzie 
wynikać z substancji innej ni ż będąca w roztworze i st ężenia próbne 
mogą, w zależności od charakterystyki substancji testowej, przekro ­
czyć rozpuszczalno ść w wodzie. W przypadku substancji o niskiej 
rozpuszczalno ści w wodzie mo że być konieczne sporz ądzenie stężo­
nego roztworu podstawowego lub dyspersji substancji przy u życiu 
rozpuszczalnika organicznego lub dyspergatora. Nale ży dołożyć 
wszelkich stara ń, aby unikn ąć użycia takich substancji. U życie 
pomocniczych rozpuszczalników lub dyspergatorów nie powinno powodowa ć fitotoksyczno ści. Na przyk ład, do powszechnie u żywa­
nych rozpuszczalników, które nie powoduj ą fitotoksyczno ści 
w stężeniach do 100 μl·l
 –1 należy aceton i dwumetyloformamid. 
Jeżeli użyty jest rozpuszczalnik lub dyspergator, to 
w sprawozdaniu nale ży podać jego końcowe stężenie, które powinno 
być utrzymane na minimalnym poziomie ( ≤ 100 μl·l –1 ) i we wszel ­
kich zabiegach i próbach kontrolnych powinno by ć zachowane takie 
samo stężenie rozpuszczalnika i dyspergatora. Dalsze wskazówki na 
temat użycia dyspergatorów podano w (11).  
1.7.6.  Grupy badane i kontrolne  
W doborze odpowiednich st ężeń testowych pomocna b ędzie 
uprzednia znajomo ść toksyczno ści substancji testowej w stosunku 
do Lemna , np. z próby wyznaczania zakresu. W ostatecznym 
badaniu toksyczno ści powinno zwykle by ć co najmniej pi ęć stężeń 
testowych uporz ądkowanych w postaci szeregu geometrycznego. 
Współczynnik rozdzia łu pomiędzy stężeniami testowymi w miar ę 
możliwości nie powinien przekracza ć 3,2, lecz mo że być zastoso­
wana większa warto ść, gdy krzywa st ężenie-odpowied ź jest płaska. 
Jeżeli użyto poniżej pięciu stężeń, należy podać uzasadnienie. Przy 
każdym stężeniu testowym nale ży użyć co najmniej trzy replikaty.  
Przy ustalaniu zakresu st ężeń (w przypadku próby wyznaczania 
zakresu i/lub ostatecznego badania toksyczno ści), należy wziąć pod 
uwagę, co następuje: ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Aby okre ślić EC  x , stężenia testowe powinny zawiera ć w swoim 
zakresie warto ść EC  x w celu zapewnienia odpowiedniego 
poziomu ufno ści. Na przyk ład, jeżeli oszacowuje si ę EC  50 , to 
najwyższe stężenie nie powinno by ć większe od warto ści EC  50 . 
Jeżeli warto ść EC  50 leży poza zakresem st ężeń testowych, to 
związane z tym poziomy ufno ści będą większe i odpowiednia 
ocena statystycznego dopasowania modelu mo że nie by ć 
możliwa.  
— Jeżeli celem jest oszacowanie LOEC/NOEC, to najni ższe 
stężenie testowe powinno by ć dostatecznie niskie, aby wzrost 
nie był znacząco mniejszy ni ż wzrost grupy kontrolnej. Ponadto 
najwyższe stężenie testowe powinno by ć dostatecznie wysokie, 
aby wzrost by ł znacząco mniejszy ni ż w grupie kontrolnej. Je śli 
nie jest to spe łnione, to badanie b ędzie musia ło zostać powtó­
rzone przy zastosowaniu innego zakresu st ężeń (chyba, że 
najwyższe stężenie równe jest granicznej rozpuszczalno ści lub 
maksymalnemu wymaganemu st ężeniu granicznemu, np. 
100 mg·l  –1 ). 
Każde badanie powinno obejmowa ć próby kontrolne obejmuj ące tę 
samą pożywkę, liczbę liści i kolonii, warunki środowiskowe 
i procedury, w postaci naczy ń badawczych, lecz bez substancji testo ­
wej. Jeżeli użyty jest pomocniczy rozpuszczalnik lub dyspergator, 
należy objąć dodatkow ą próbę kontrolną z użyciem rozpuszczalnika/ ­
dyspergatora o tym samym st ężeniu, co w naczyniach z substancj ą 
testową. Liczba replikatowych naczy ń kontrolnych (oraz, 
w stosownym wypadku, naczy ń z rozpuszczalnikiem) powinna by ć 
co najmniej równa, a najlepiej dwukrotnie wi ększa od liczby naczy ń 
użytych do ka żdego stężenia testowego.  
Jeżeli nie jest wymagane wyznaczenie NOEC, to plan badania 
można zmieni ć, zwiększając liczbę stężeń i zmniejszaj ąc liczbę repli­
katów przypadaj ących na st ężenie. Jednak że liczba replikatów 
kontrolnych musi wynosi ć co najmniej trzy.  
1.7.7.  Ekspozycja  
Kolonie sk ładające się z 2–4 widocznych li ści przenosi si ę z kultury 
inokulum i losowo przydziela do naczy ń badawczych w warunkach 
aseptycznych. Ka żde naczynie badawcze powinno zawiera ć łącznie 
9–12 liści. Liczba li ści i kolonii powinna by ć taka sama w ka żdym 
naczyniu. Do świadczenie uzyskane z niniejszej metody oraz 
z danych z próby pier ścieniowej wykaza ło, że użycie trzech repli ­
katów na prób ę, z każdym replikatem zawieraj ącym pocz ątkowo 
9–12 liści, jest wystarczaj ące do wykrycia ró żnic we wzro ście 
wynoszących w przybli żeniu 4–7 % inhibicji obliczonego na 
podstawie szybko ści wzrostu (10–15 % obliczonego na podstawie 
uzysku) pomi ędzy próbami (10).  
Wymagany jest zrandomizowany plan umieszczania naczy ń badaw­
czych w inkubatorze, aby ograniczy ć do minimum wp ływ prze­
strzennych ró żnic natężenia światła i temperatury. Wymagany jest 
również zblokowany plan lub losowe przestawianie naczy ń podczas 
dokonywania obserwacji (lub cz ęstsze przestawianie).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Jeżeli wstępna próba stabilno ści wykazuje, że nie mo żna utrzyma ć 
stężenia substancji testowej (tj. mierzone st ężenie spada poni żej 
80 % zmierzonego pocz ątkowego st ężenia) w czasie trwania badania 
(7 dni), zalecane s ą warunki badania pó łstatycznego. W takim przy ­
padku kolonie nale ży wyeksponowa ć na świeżo sporządzone 
roztwory testowe i kontrolne co najmniej dwukrotnie w ci ągu 
badania (np. w dniach 3 i 5). Cz ęstotliwość ekspozycji na świeżą 
pożywkę zależeć będzie od stabilno ści substancji testowej; do utrzy ­
mania prawie sta łych stężeń wysoce niestabilnych lub lotnych 
substancji mo że być wymagana wi ększą częstotliwość. 
W niektórych sytuacjach mo że być wymagana procedura przep ły­
wowa (11)(13).  
Scenariusz ekspozycji poprzez na łożenie na li ście (natrysk) nie jest 
objęty niniejsz ą metodą badawcz ą; można natomiast znale źć go 
w (14).  
1.7.8.  Warunki inkubacji  
Należy zastosowa ć ciągłe oświetlenie w postaci ciep łego lub ch łod­
nego światła fluorescencyjnego o nat ężeniu wybranym z zakresu 
85–135 μE·m  –2 ·s –1 , zmierzonym w promieniowaniu aktywnym dla 
fotosyntezy (400–700 nm) w punktach o takiej samej odleg łości od 
źródła światła, co li ście Lemna  (równowa żnym 6 500–10 000 
luksów). Wszelkie ró żnice w stosunku do wybranego nat ężenia 
światła na badanej powierzchni nie powinny przekracza ć ± 15 %. 
Na mierzon ą wartość będzie mieć wpływ metoda detekcji i pomiaru 
światła, w szczególno ści typ czujnika. Przedk ładane są czujniki 
sferyczne (które reaguj ą na światło ze wszystkich k ątów powy żej 
i poniżej płaszczyzny pomiaru) oraz czujniki „kosinusowe” (które 
reagują na światło ze wszystkich k ątów powy żej płaszczyzny 
pomiaru) nad czujniki jednokierunkowe i b ędą one dawa ć wyższe 
wskazania dla opisywanego tu typu wielopunktowego źródła światła. 
Temperatura w naczyniach badawczych powinna wynosi ć 24 ± 2 °C. 
Wartość pH pożywki kontrolnej nie powinna wzrosn ąć w ciągu 
badania o wi ęcej niż 1,5 jednostki. Jednak że odchylenie o wi ęcej 
ni 1,5 jednostki nie spowoduje uniewa żnienia badania, je śli można 
wykazać, że spełnione są kryteria wa żności. Dodatkowej uwagi 
wymaga dryft pH w szczególnych przypadkach, takich jak podczas badania nietrwa łych substancji lub metali. Dalsze wskazówki przed ­
stawiono w (11).
 
1.7.9.  Czas trwania  
Badanie zostaje zako ńczone po 7 dniach od przeniesienia ro ślin do 
naczyń badawczych.  
1.7.10.  Pomiary i oznaczenia analityczne  
Na początku badania liczy si ę i rejestruje liczb ę liści w naczyniach 
badawczych, zwracaj ąc uwagę na uwzgl ędnienie wystaj ących, 
wyraźnie widocznych li ści. Liczb ę liści wydających się wyglądać 
normalne lub nienormalne nale ży określić na początku badania, co 
najmniej raz na 3 dni w ci ągu okresu ekspozycji (tj. co najmniej 2 
razy podczas 7-dniowego okresu) oraz na zako ńczenie badania. 
Należy odnotowa ć zmiany w rozwoju ro ślin, np. pod wzgl ędem 
wielkości liści, wyglądu, oznak martwicy, chlorozy lub garbato ści, 
rozbicia kolonii lub utraty zdolno ści utrzymywania si ę na 
powierzchni wody oraz d ługości i wyglądu korzeni. Nale ży również 
odnotowa ć istotne cechy po żywki (np. obecno ść nierozpuszczonej 
substancji, wzrost glonów w naczyniu badawczym).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Oprócz okre ślenia liczby li ści w ciągu badania ocenia si ę również 
wpływy substancji testowej na jedn ą (lub wi ęcej) następujących 
zmiennych pomiarowych:  
(i) całkowitą powierzchni ę liści; 
(ii) ciężar masy suchej;  
(iii) ciężar masy świeżej. 
Całkowita powierzchnia li ści ma tę zaletę, że może być określona 
dla każdego naczynia badawczego i kontrolnego na pocz ątku, 
podczas i na koniec badania. Ci ężar masy suchej lub świeżej należy 
wyznaczy ć na pocz ątku badania na podstawie próbki kultury 
inokulum reprezentatywnej dla tego, co jest u żyte do rozpocz ęcia 
badania, oraz na ko ńcu badania przy u życiu materia łu roślinnego 
z każdego naczynia badawczego i kontrolnego. Je śli nie mierzy si ę 
powierzchni li ści, to przedk łada się ciężar masy suchej nad ci ężar 
masy świeżej. 
Całkowitą powierzchni ę liści oraz ci ężar masy suchej i ci ężar masy 
świeżej można wyznaczy ć następująco: 
(i) Całkowita powierzchnia li ści: całkowitą powierzchni ę liści 
wszystkich kolonii mo żna określić za pomoc ą analizy obrazu. 
Sylwetkę naczynia badawczego i li ści można uchwyci ć za 
pomocą kamery wideo (np. ustawiaj ąc naczynie na kopioramie), 
a otrzymany w wyniku obraz podda ć digitalizacji. Poprzez 
kalibrację za pomoc ą płaskich kszta łtów o znanej powierzchni 
można następnie wyznaczy ć całkowitą powierzchni ę liści 
w naczyniu badawczym. Nale ży pamiętać, aby wykluczy ć 
zakłócenie spowodowane przez obrze że naczynia badawczego. 
Alternatywne, cho ć bardziej pracoch łonne podej ście, polega na 
wykonaniu fotokopii wszystkich naczy ń badawczych i ro ślin, 
wycięciu otrzymanej sylwetki kolonii i wyznaczeniu ich 
powierzchni przy u życiu analizatora powierzchni li ści lub 
papieru milimetrowego. Odpowiednie mog ą być również inne 
techniki (np. okre ślenie stosunku ci ężaru papieru powierzchni 
sylwetki kolonii do powierzchni jednostkowej).  
(ii) Ciężar masy suchej: z ka żdego naczynia badawczego zbiera si ę 
wszystkie kolonie i przep łukuje się wodą destylowan ą lub dejo­
nizowaną. Odsącza się je bibułą w celu usuni ęcia nadmiaru 
wody, a nast ępnie suszy w temperaturze 60 °C do sta łej 
masy. Nale ży dołączyć wszelkie fragmenty korzeni. Ci ężar 
suchej masy nale ży wyrazi ć z dokładnością co najmniej do 
0,1 mg.  
(iii) Ciężar masy świeżej: wszystkie kolonie przenosi si ę do 
uprzednio zwa żonych probówek z polistyrenu (lub innego 
obojętnego materia łu) z ma łymi (1 mm) otworami 
w zaokrąglonym dnie. Nast ępnie probówki odwirowuje si ę z 
prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze poko ­
jowej. Probówki zawieraj ące wysuszone kolonie ponownie 
waży się i oblicza si ę ciężar masy świeżej przez odj ęcie ciężaru 
pustej probówki.  
1.7.10.1.  Częstotliwość pomiarów i oznacze ń analitycznych  
Jeżeli zastosowany jest statyczny plan badania, to nale ży zmierzy ć 
pH każdej próby na pocz ątku i na ko ńcu badania. Je żeli zastosowany 
jest półstatyczny plan badania, to nale ży zmierzy ć pH w ka żdej partii 
„świeżego” roztworu testowego przed ka żdą wymian ą oraz 
w odpowiednich „zu żytych” roztworach.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
Natężenie światła należy zmierzy ć w komorze wzrostu, inkubatorze 
lub pomieszczeniu w ró żnych punktach o takiej samej odleg łości od 
źródła światła, co liście Lemna . Pomiaru nale ży dokona ć co najmniej 
raz w ciągu badania. Temperatur ę pożywki w naczyniu zast ępczym 
utrzymywanym w takich samych warunkach w komorze wzrostu, 
inkubatorze lub pomieszczeniu nale ży rejestrowa ć co najmniej 
codziennie.  
Podczas badania, w odpowiednich ost ępach czasu oznacza si ę 
stężenia substancji testowej. W badaniach statycznych minimalnym 
wymogiem jest oznaczenie st ężeń na początku i na ko ńcu badania.  
W badaniach pó łstatycznych, gdzie nie jest spodziewane, że stężenie 
substancji testowej pozostanie w granicach ± 20 % st ężenia nomi ­
nalnego, niezb ędne jest zanalizowanie wszystkich świeżo sporządzo­
nych roztworów oraz tych samych roztworów przy ka żdej wymianie 
(zob. akapit trzeci w sekcji 1.7.7). Jednak że w przypadku bada ń, 
gdzie zmierzone pocz ątkowe stężenie substancji testowej nie mie ści 
się w granicach ± 20 % nominalnego, lecz gdzie mo żna dostarczy ć 
dostatecznych dowodów wykazuj ących, że początkowe stężenia są 
powtarzalne i stabilne (tj. zawieraj ą się w granicach 80–120 % 
początkowego st ężenia), oznaczenia chemiczne mo żna przeprowa ­
dzać tylko na najwy ższych i najni ższych stężeniach testowych. We 
wszystkich przypadkach, oznaczenie st ężeń substancji testowej przed 
wymianą musi by ć wykonane tylko na jednym replikatowym 
naczyniu przy ka żdym stężeniu testowym (lub zawarto ściach naczy ń 
połączonych z sob ą według replikatu).  
Jeżeli zastosowana jest badanie przep ływowe, to odpowiednim 
systemem jest system pobierania próbek podobny do opisanego dla badań półstatycznych, wraz z analiz ą na pocz ątku, w środku i na 
końcu badania, lecz pomiar „zu żytych” roztworów nie jest odpo ­
wiedni w tym przypadku. W tego typu badaniu nale ży codziennie 
sprawdza ć natężenie przep ływu rozcie ńczalnika i substancji testowej 
lub roztworu podstawowego substancji testowej.
 
Jeżeli istniej ą dowody, że stężenie substancji testowej zosta ło zado­
walająco utrzymane w granicach ± 20 % nominalnego lub zmierzo ­
nego pocz ątkowego st ężenia w ci ągu całego badania, to analiz ę 
wyników mo żna oprzeć na nominalnych lub zmierzonych pocz ątko­
wych warto ściach. Jeżeli odchylenie od nominalnych lub zmierzo ­
nych pocz ątkowych st ężeń jest większe niż ± 20 %, analiz ę wyników 
należy oprzeć na średnim geometrycznym st ężeniu podczas 
ekspozycji lub na modelach opisuj ących spadek st ężenia substancji 
testowej (11).  
1.7.11.  Badanie graniczne  
W pewnych okoliczno ściach, np. gdy wst ępne badanie wskazuje, że 
substancja testowa nie ma toksycznych oddzia ływań przy stężeniach 
do 100 mg·l  –1 lub do jej granicznej rozpuszczalno ści w pożywce 
(zależnie od tego, co jest mniejsze), mo żna przeprowadzi ć badanie 
graniczne polegaj ące na porównaniu odpowiedzi w grupie kontrolnej 
i jednej grupie poddawanej zabiegowi (o st ężeniu 100 mg·l  –1 lub 
równym rozpuszczalno ści granicznej). Bardzo zalecane jest, aby by ło 
to poparte analiz ą stężenia ekspozycji. Do badania granicznego 
stosują się wszystkie poprzednio opisane warunki badania 
i kryteria wa żności, poza tym że liczba replikatów poddawanych 
zabiegowi powinna by ć dwukrotnie zwi ększona. Wzrost w grupie 
kontrolnej i poddawanej zabiegowi mo żna zanalizowa ć przy pomocy 
testu statystycznego do porównywania średnich, np. testu t Studenta.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. DANE I SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
2.1. CZAS PODWOJENIA  
Aby okre ślić czas podwojenia (T  d ) liczby li ści oraz spe łnienie przez 
badanie niniejszego kryterium wa żności (sekcja 1.6), u żywa się 
poniższego wzoru z danymi uzyskanymi z naczy ń kontrolnych:  
T d = ln 2/μ 
gdzie μ jest średnią właściwą szybkością wzrostu wyznaczon ą 
w sposób opisany w akapicie pierwszym i drugim w sekcji 2.2.1.  
2.2. ZMIENNE ODPOWIEDZI  
Celem badania jest okre ślenie wp ływów substancji testowej na 
wegetatywny wzrost  Lemna . Niniejsza metoda badawcza opisuje 
dwie zmienne odpowiedzi, gdy ż państwa członkowskie maj ą różne 
preferencje i potrzeby regulacyjne. Aby wyniki badania by ły akcep­
towalne we wszystkich pa ństwach cz łonkowskich, skutki powinny 
być ocenione przy u życiu obydwu zmiennych odpowiedzi a) i b) 
opisanych poni żej. 
a) Średnia w łaściwa szybko ść wzrostu: t ę zmienną odpowiedzi 
oblicza si ę na podstawie zmian logarytmów liczb li ści, 
a ponadto na podstawie zmian logarytmów innego parametru pomiarowego (ca łkowitej powierzchni li ści oraz ci ężaru masy 
suchej lub ci ężaru masy świeżej) w czasie (wyra żonych na dzie ń) 
w grupach kontrolnych i w ka żdej grupie poddawanej zabiegowi. 
Niekiedy okre śla się ją mianem wzgl ędnej szybko ści wzrostu 
(15).
 
b) Uzysk: t ę zmienną odpowiedzi oblicza si ę na podstawie zmian 
liczby liści, a ponadto na podstawie zmian innego parametru 
pomiarowego (ca łkowitej powierzchni li ści oraz ci ężaru masy 
suchej lub ci ężaru masy świeżej) w grupach kontrolnych i w 
każdej grupie poddawanej zabiegowi, a ż do końca badania.  
Należy zauważyć, że wartości toksyczno ści obliczone przy u życiu 
tych dwu zmiennych odpowiedzi nie s ą porównywalne i ró żnica ta 
musi być rozpoznana, gdy u żywa się wyników badania. Je żeli speł­
nione są warunki badania okre ślone w niniejszej metodzie badaw ­
czej, to warto ści EC  x oparte na średniej w łaściwej szybko ści wzrostu 
(E r C x ) bywają zwykle wy ższe od wyników opartych na uzysku 
(E y C x ), ze wzgl ędu na podstaw ę matematyczn ą odnośnych podej ść. 
Nie należy interpretowa ć tego jako ró żnicy czułości pomiędzy tymi 
dwiema zmiennymi odpowiedzi, lecz jedynie, że wartości te są różne 
matematycznie. Poj ęcie średniej w łaściwej szybko ści wzrostu oparte 
jest na ogólnym wyk ładniczym przebiegu wzrostu rz ęsy 
w nieograniczonych kulturach, gdzie toksyczno ść szacowana jest 
na podstawie wp ływów na szybko ść wzrostu, nie b ędąc zależną od 
bezwzględnego poziomu w łaściwej szybko ści wzrostu kultury 
kontrolnej, nachylenia krzywej st ężenie–odpowied ź lub czasu 
trwania badania. Natomiast wyniki oparte na zmiennej odpowiedzi w postaci uzysku s ą zależne od wszystkich tych pozosta łych zmien ­
nych. E
 y C x jest zależne od właściwej szybko ści wzrostu gatunków 
rzęsy użytych w ka żdym badaniu oraz od maksymalnej w łaściwej 
szybkości wzrostu, która mo że być różna dla ró żnych gatunków, 
a nawet dla ró żnych szczepów. Tej zmiennej odpowiedzi nie 
powinno si ę używać do porównywania czu łości na czynniki 
toksyczne pomi ędzy gatunkami rz ęsy lub nawet ró żnymi ich szcze ­
pami. Cho ć z naukowego punktu widzenia do szacowania toksycz ­
ności preferowane jest pos ługiwanie si ę średnią właściwą szybkością 
wzrostu, to oszacowania toksyczno ści na podstawie uzysku s ą 
również objęte niniejsz ą metodą badawcz ą, aby uczyni ć zadość 
obecnym wymogom regulacyjnym istniej ącym w niektórych krajach.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
Oszacowania toksyczno ści powinny by ć oparte na liczbie li ści oraz 
na dodatkowych zmiennych pomiarowych (ca łkowitą powierzchni ę 
liści, ciężar masy suchej lub ci ężar masy świeżej), poniewa ż niektóre 
substancje mog ą mieć znacznie wi ększy wpływ na inne zmienne 
pomiarowe ni ż na liczb ę liści. Skutek ten nie zosta łby wykryty 
jedynie przez obliczenie liczby li ści. 
Liczba liści, jak równie ż każda inna rejestrowana zmienna pomia ­
rowa, tj. ca łkowita powierzchnia li ści, ciężar masy suchej lub ci ężar 
masy świeżej, jest zapisywana w postaci tabelarycznej wraz ze st ęże­
niami substancji testowej podczas ka żdego pomiaru. Pó źniejsza 
analiza danych, np. w celu oszacowania LOEC, NOEC lub EC  x , 
powinna by ć oparta na warto ściach dla indywidualnych replikatów, 
a nie na obliczonych średnich dla ka żdej grupy poddawanej zabie ­
gowi.  
2.2.1.  Średnia w łaściwa szybko ść wzrostu  
Średnią właściwą szybkość wzrostu dla konkretnego okresu oblicza 
się jako logarytmiczny przyrost zmiennych wzrostu — liczb li ści 
oraz jednej innej zmiennej pomiarowej (ca łkowitej powierzchni li ści, 
ciężaru masy suchej lub ci ężaru masy świeżej) — przy u życiu poni ż­
szego wzoru, dla ka żdego replikatu grupy kontrolnej i grup 
poddawanych zabiegowi:  
μ iÄj ¼ ln ðN j Þ – ln ðN i Þ 
t 
gdzie:  
— μ i–j : średnia właściwa szybko ść wzrostu od czasu i do j,  
— N  i : zmienna pomiarowa w naczyniu badawczym lub kontro ­
lnym o czasie i,  
— N  j : zmienna pomiarowa w naczyniu badawczym lub kontro ­
lnym o czasie j,  
— t: okres od czasu i do j.  
Dla każdej grupy poddawanej zabiegowi i grupy kontrolnej obliczy ć 
średnią wartość szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji.  
Średnią właściwą szybkość wzrostu nale ży obliczy ć dla całego 
okresu badania (czas „i” w powy ższym równaniu jest pocz ątkiem 
badania, a czas „j” jest ko ńcem badania). Dla ka żdego stężenia 
testowego i próby kontrolnej obliczy ć średnią wartość średniej 
właściwej szybko ści wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji. 
Ponadto nale ży ocenić szybkość wzrostu wed ług odcinków, aby 
określić skutki substancji testowej wyst ępujące w czasie okresu 
ekspozycji (np. przez badanie krzywych wzrostu przekszta łconych 
na postać logarytmiczn ą). Znaczące różnice pomi ędzy szybko ścią 
wzrostu dla poszczególnych odcinków a średnią szybkością wzrostu 
świadczą o odchyleniu od sta łego wyk ładniczego wzrostu 
i uzasadniaj ą dokładne zbadanie krzywych wzrostu. W takim przy ­
padku rozwa żnym podej ściem byłoby porównanie w łaściwych szyb ­
kości wzrostu uzyskanych z kultur poddawanych zabiegowi w ci ągu 
okresu maksymalnej inhibicji z w łaściwymi szybko ściami wzrostu 
dla kultur kontrolnych w ci ągu tego samego okresu.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
Następnie można obliczy ć procentow ą inhibicję szybkości wzrostu 
(I r ) dla każdego stężenia testowego (grupy poddawanej zabiegowi), 
według następującego równania:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
gdzie:  
— % I  r : procentowa inhibicja średniej w łaściwej szybko ści 
wzrostu,  
— μ C : średnia warto ść μ w grupie kontrolnej,  
— μ T : średnia warto ść μ w grupie poddawanej zabiegowi.  
2.2.2.  Uzysk  
Wpływy na uzysk okre śla się na podstawie dwu zmiennych pomia ­
rowych: liczby li ści oraz jednej innej zmiennej pomiarowej (ca łko­
witej powierzchni li ści, ciężaru masy suchej lub ci ężaru masy świe­ 
żej) istniej ących w ka żdym naczyniu badawczym na pocz ątku i na 
końcu badania. Dla ci ężaru masy suchej lub ci ężaru masy świeżej 
początkową biomasę określa się na podstawie próbki li ści pobranej 
z tej samej partii u żytej do zaszczepienia naczy ń badawczych (zob. 
akapit drugi w sekcji 1.7.3). Dla ka żdego stężenia testowego i grupy 
kontrolnej obliczy ć średnią wartość uzysku wraz z oszacowaniami 
wariancji. Średnie procentowe inhibicji uzysku (% I  y ) można obli­
czyć dla każdej poddawanej zabiegowi grupy w nast ępujący sposób:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
gdzie:  
— % I  y : procentowe zmniejszenie uzysku,  
— b  C : biomasa ko ńcowa minus biomasa pocz ątkowa dla grupy 
kontrolnej,  
— b  T : biomasa ko ńcowa minus biomasa pocz ątkowa dla grupy 
poddawanej zabiegowi.  
2.2.3.  Wykre ślanie krzywych st ężenie-odpowied ź 
Należy wykre ślić krzywe st ężenie-odpowied ź wiążące średnią 
procentow ą inhibicję zmiennej odpowiedzi (I  r , lub I  y obliczone jak 
pokazano w ostatnim akapicie sekcji 2.2.1 lub w sekcji 2.2.2) i logarytm st ężenia substancji testowej.
 
2.2.4.  Oszacowanie EC  x 
Oszacowania EC  x (np. EC  50 ) powinny by ć oparte zarówno na śred­
niej właściwej szybko ści wzrostu (E  r C x ) jak i na uzysku (E  y C x ), 
z których ka żde powinno by ć oparte na liczbie li ści oraz jednej 
dodatkowej zmiennej pomiarowej (ca łkowitą powierzchni ę liści, 
ciężar masy suchej lub ci ężar masy świeżej). Wynika to st ąd, że 
istnieją takie substancje testowe, które wp ływają różnie na liczb ę 
liści i inne zmienne pomiarowe. Żądanymi parametrami toksyczno ści 
są więc cztery warto ści EC  x dla każdego obliczonego poziomu inhi ­
bicji x: E  r C x (liczba liści); E  r C x (całkowita powierzchnia li ści, ciężar 
masy suchej lub ci ężar masy świeżej); E  y C x (liczba liści); oraz E  y C x 
(całkowita powierzchnia li ści, ciężar masy suchej lub ci ężar masy 
świeżej). ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. PROCEDURY STATYSTYCZNE  
Celem jest uzyskanie ilo ściowej zale żności stężenie-odpowied ź za 
pomocą analizy regresji. Mo żliwe jest zastosowanie wa żonej regresji 
liniowej po przeprowadzeniu linearyzuj ącej transformacji danych 
odpowiedzi — na przyk ład do jednostek probit lub logit albo 
Weibulla (16), lecz preferowane s ą procedury regresji nieliniowej, 
które lepiej znosz ą nieuniknione nieregularno ści danych i odchylenia 
od gładkich rozk ładów. Przy zbli żaniu się do zerowej lub do ca łko­
witej inhibicji, nieregularno ści takie mog ą zostać powiększone przez 
transformacj ę, zakłócając analizę (16). Nale ży zwróci ć uwagę, że 
standardowe metody analizy przy u życiu transformat probit, logit 
lub Weibulla s ą przeznaczone do stosowania do danych kwantalo ­
wych (np. śmiertelno ści lub prze żywalności) i musz ą zostać zmody­
fikowane z dostosowaniem do danych szybko ści wzrostu lub 
biomasy. Szczegó łowe procedury wyznaczania warto ści EC  x na 
podstawie ci ągłych danych mo żna znaleźć w (17), (18) i (19).  
Dla każdej zmiennej odpowiedzi, która ma by ć analizowana, nale ży 
użyć zależności stężenie-odpowied ź do obliczenia oszacowa ń punk­
towych warto ści EC  x . W miarę możliwości dla każdego oszacowania 
należy określić granice ufno ści 95 %. Dok ładność dopasowania 
danych odpowiedzi do modelu regresji nale ży ocenić graficznie lub 
statystycznie. Analiz ę regresji nale ży przeprowadzi ć, używając odpo­
wiedzi indywidualnych replikatów zamiast średnich z grup poddawa ­
nych zabiegowi.  
Oszacowania EC  50 i granice ufno ści można równie ż otrzymać przy 
użyciu interpolacji liniowej z ładowaniem pocz ątkowym (20), je żeli 
dostępne modele/metody regresji s ą nieodpowiednie dla danych.  
W celu oszacowania LOEC, a st ąd NOEC, konieczne jest porów ­
nanie średnich z grup poddawanych zabiegowi przy u życiu technik 
analizy wariancji (ANOVA). Średnią dla każdego stężenia nale ży 
następnie porówna ć ze średnią kontroln ą przy użyciu odpowiedniej 
metody wielokrotnego porównania lub testu trendu. Przydatny mo że 
być test Dunnetta lub Williamsa (21)(22)(23)(24). Nale ży ocenić, czy 
przyjęte w ANOVA za łożenie homogeniczno ści wariancji pozostaje 
w mocy. Ocen ę tę można przeprowadzi ć graficznie lub za pomoc ą 
formalnego testu (25). Odpowiednimi do tego celu testami s ą testy 
Levene’a lub Bartletta. Niespe łnienie za łożenia o homogeniczno ści 
wariancji mo żna niekiedy skorygowa ć za pomoc ą logarytmicznego 
przekszta łcenia danych. Je żeli heterogeniczno ść wariancji jest 
skrajnie du ża i nie mo że być skorygowana przez transformacj ę, to 
należy rozważyć analizę za pomoc ą metod takich, jak testy trendu 
stopniowego obni żania Jonkheere’a. Dodatkowe wskazówki 
dotyczące wyznaczania NOEC mo żna znaleźć w (19).  
Rozwój naukowy, jaki ostatnio nast ąpił, doprowadzi ł do zalecenia 
zarzucenia poj ęcia NOEC i zast ąpienia go opartymi o regresj ę osza­
cowaniami punktowymi EC  x . Dla niniejszego badania  Lemna  nie 
ustalono odpowiedniej warto ści x. Jednak że, odpowiednim wydaje 
się przedzia ł 10–20 % (w zale żności od wybranej zmiennej odpo ­
wiedzi), a najlepiej nale ży podać zarówno EC  10 jak i EC  20 . 
3. SPORZ ĄDZANIE SPRAWOZDANIA  
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA  
Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Substancja testowa:  
— fizyczny charakter i w łasności fizykochemiczne, w tym graniczna 
rozpuszczalno ść w wodzie,  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— dane identyfikacyjne substancji chemicznej (np. numer CAS), 
w tym czysto ść. 
Badane gatunki:  
— nazwa naukowa, klon (je śli jest znany) oraz źródło. 
Warunki badania:  
— zastosowana procedura badawcza (statyczna, pó łstatyczna lub 
przepływowa),  
— data rozpocz ęcia badania i czas jego trwania,  
— pożywka,  
— opis planu do świadczalnego: naczynia badawcze i przykrywki, 
objętości roztworów, liczba kolonii i li ści przypadaj ących na 
naczynie badawcze na pocz ątku badania,  
— stężenia testowe (nominalne i zmierzone, gdy stosowne) oraz 
liczba replikatów na st ężenie,  
— metody sporz ądzania roztworów podstawowych i testowych, 
w tym u życie ewentualnych rozpuszczalników lub dyspergato ­
rów, 
— temperatura podczas badania,  
— źródło światła, natężenie i jednorodno ść światła, 
— warto ści pH po żywki testowej i kontrolnej,  
— stężenia substancji testowej oraz metoda analizy wraz 
z odpowiednimi danymi oceny jako ści (badania walidacyjne, 
odchylenia standardowe lub granice ufno ści analiz),  
— metody okre ślania liczby li ści i innych zmiennych pomiarowych, 
np. ciężaru masy suchej, ci ężaru masy świeżej lub powierzchni 
liści, 
— wszelkie odst ępstwa od niniejszej metody badawczej.  
Wyniki:  
— dane pierwotne: liczba li ści oraz inne zmienne pomiarowe 
w każdym naczyniu badawczym i kontrolnym podczas ka żdej 
obserwacji i okazji analizy,  
— średnie i odchylenia standardowe dla ka żdej zmiennej pomiaro ­
wej, 
— krzywe wzrostu dla ka żdego stężenia (zalecane ze zmienn ą 
pomiarow ą przekszta łconą do postaci logarytmicznej, zob. akapit 
drugi w sekcji 2.2.1),  
— czas podwojenia/szybko ść wzrostu w grupie kontrolnej na 
podstawie liczby li ści, 
— obliczone zmienne odpowiedzi dla ka żdego replikatu poddawa ­
nemu zabiegowi, wraz z warto ściami średnimi 
i współczynnikiem zmienno ści dla repplikatów,  
— graficzne przedstawienie zale żności stężenie/skutek,  
— oszacowania punktów ko ńcowych toksyczno ści dla zmiennych 
odpowiedzi, np. EC  50 , EC  10 , EC  20 oraz związane z nimi prze ­
działy ufności. W przypadku obliczenia — LOEC i/lub NOEC 
oraz metody statystyczne u żyte do ich wyznaczenia,  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— jeżeli zastosowana zosta ła ANOVA — wielko ść skutku, który 
można wykry ć (np. najmniejsza znacz ąca różnica),  
— wszelka stymulacja wzrostu stwierdzona w którejkolwiek próbie,  
— wszelkie wizualne oznaki fitotoksyczno ści, jak równie ż obser­
wacje roztworów testowych,  
— omówienie wyników, w tym ewentualny wp ływ na wynik 
badania wynikaj ący z odstępstw od niniejszej metody badawczej.  
4. LITERATURA  
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna Sp. Growth Inhibition Test.  
(2) Wykorzystanie bada ń Lemna w odniesieniu do zabarwionych 
substancji opisano w sekcji 13.5.3 Podr ęcznika decyzji UE 
z lipca 2006 r., dost ępnego pod adresem http:// ­
ecb.jrc.ec.europa.eu/new-chemicals.  
(3) Guidance on information requirements and chemical safety 
assessment — Chapter R.7b: Endpoint specific guidance; Table 7.8.3 Summary of difficult substance testing issues, 
dostępny pod adresem
 
http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/ ­
information_requirements_en.htm?time=1234958685#A  
(4) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reap ­
proved 1998). pp. 733–742. In, Annual Book of ASTM Stan ­
dards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; 
Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.  
(5) USEPA — United States Environmental Protection Agency. 
(1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  
Lemna  spp., „Public draft”. EPA 712-C-96–156. 8pp.  
(6) AFNOR — Association Française de Normalisation. (1996). 
XP T 90–337: Détermination de l’inhibition de la croissance 
de Lemna minor . 10pp.  
(7) SSI — Swedish Standards Institute. (1995). Water quality — 
Determination of growth inhibition (7-d)  Lemna minor , 
duckweed. SS 02 82 13. 15pp. (in Swedish).  
(8) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for 
Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte,  Lemna minor . EPS 1/RM/37–120 pp.
 
(9) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registra ­
tion of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and 
Evaluation. Canadian Wildlife Service, Technical Report Series 
No. 145.  
(10) Sims I., Whitehouse P., and Lacey R. (1999) The OECD  
Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 
003. WRc plc — Environment Agency.  
(11) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity 
Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environ ­
mental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No.23.
 
(12) ISO DIS 20079. Water Quality — Determination of the Toxic 
Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed 
(Lemna minor ) — Duckweed Growth Inhibition Test.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1367
 
(13) Walbridge C. T. (1977). A flow-through testing procedure with 
duckweed ( Lemna minor L .). Environmental Research Labora ­
tory — Duluth, Minnesota 55804. US EPA Report No. EPA- 600/3–77 108. September 1977.
 
(14) Lockhart W. L., Billeck B. N. and Baron C. L. (1989). 
Bioassays with a floating plant ( Lemna minor ) for effects of 
sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 
353–359.  
(15) Huebert, D.B. and Shay J.M. (1993) Considerations in the 
assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxi ­
cology and Chemistry, 12, 481–483.  
(16) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological Assays 
with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19, 713–718.
 
(17) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157–167.  
(18) Bruce R.D. and Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for 
modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485–1494.
 
(19) OECD. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data.  
(20) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic 
toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Asses ­
sment Center Technical Report 05–88. USEPA, Duluth, MN.  
(21) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
Assoc., 50, 1096–1121.  
(22) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics, 20, 482–491.  
(23) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treatment 
means when several dose levels are compared with a zero dose 
control. Biometrics, 27: 103–117.  
(24) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(25) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose- 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, 93–96.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1368
 
Dodatek 1  
Opis gatunków  Lemna  
Roślina wodna powszechnie zwana rz ęsą, obejmuj ąca gatunki  Lemna , należy do 
rodziny  Lemnaceae , na którą składa się szereg wyst ępujących na ca łym świecie 
gatunków w czterech rodzajach. Ich ró żny wygląd i taksonomia zosta ły wyczer ­
pująco opisane (1)(2).  Lemna gibba  i L. minor  są gatunkami reprezentatywnymi 
dla obszarów o klimacie umiarkowanym i s ą powszechnie u żywane do bada ń 
toksyczno ści. Obydwa gatunki maj ą pływającą lub zanurzon ą tarczowat ą łodygę 
(liść) i bardzo cienkie wypustki korzenia wychodz ące ze środka dolnej 
powierzchni ka żdego liścia. Gatunki  Lemna  rzadko wytwarzaj ą kwiaty i ro śliny 
rozmnażają się poprzez wegetatywne wytwarzanie nowych li ści (3). 
W porównaniu do starszych ro ślin młode rośliny bywaj ą zazwyczaj bledsze, 
mają krótsze korzenie i sk ładają się z dwóch do trzech li ści o różnych rozmia ­
rach. Ma ły rozmiar gatunku  Lemna , jego prosta budowa, bezp łciowe rozmna ­ 
żanie się oraz krótki czas trwania pokolenia sprawiaj ą, że rośliny tego rodzaju s ą 
bardzo dogodne do bada ń laboratoryjnych (4)(5).  
Z powodu prawdopodobnej zmienno ści międzygatunkowej pod wzgl ędem wraż­
liwości ważne są jedynie porównania czu łości w obrębie gatunku.  
Przykłady gatunków  Lemna , które by ły używane do bada ń: źródła literatu ­
rowe dotycz ące gatunków  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as 
a function of intensity and duration of light. J. Phys. Chem., 29: 935–941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. 
EPA 712-C-96–156. 8pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90–337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10pp.  
Szwedzki Instytut Norm (SIS). (1995). Jako ść wody — Wyznaczanie inhibicji 
wzrostu (7-d) rz ęsy Lemna minor , SS 02 82 13. s. 15. (w j ęzyku szwedzkim).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting 
Static Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415–91 (Reapproved 1998). 
pp. 733–742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., „Public draft”. EPA 
712-C-96–156. 8pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959–1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87–96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481–483.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102–2111.  
Źródła gatunków  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria (Kolekcja 
kulturowa glonów i cyjanobakterii Uniwersytetu w Toronto)  
Department of Botany, University of Toronto (Wydzia ł Botaniki Uniwersytetu 
w Toronto)  
Toronto, Ontario, KANADA, M5S 3 B2  
Tel.: +1–416–978–3641  
Faks: +1–416–978–5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University (Uniwersytet Stanu Pó łnocna Karolina)  
Forestry Dept (Wydzia ł Leśnictwa)  
Duckweed Culture Collection (Kolekcja kulturowa rz ęsy wodnej)  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695–8002  
USA  
Tel.: 001 (919) 515–7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University 
(Instytut Bada ń Stosowanych nad Środowiskiem, Uniwersytet w Sztokholmie)  
106 91 Sztokholm  
SZWECJA  
Tel.: +46 8 674 7240  
Faks: +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA) (Federalna Agencja Środowiskowa)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
NIEMCY  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Literatura  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the 
descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221–287.  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland.  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utili ­
zation of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82–991150–0–0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo.  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1–14.  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7–22.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Dodatek 2  
Utrzymanie kultury podstawowej  
Kultury podstawowe mog ą być utrzymywane w niskich temperaturach (4–10 °C) 
przez dłuższy okres bez konieczno ści odtwarzania. Po żywka wzrostowa dla 
gatunku  Lemna  może być taka sama jak u żywana do bada ń, lecz do kultur 
podstawowych mo żna używać innych po żywek bogatych w sk ładniki od żywcze.  
Okresowo pewn ą ilość młodych, jasnozielonych ro ślin przenosi si ę do zawieraj ­ 
ących świeżą pożywkę naczyń przeznaczonych na nowe kultury, stosuj ąc tech­
nikę aseptyczn ą. W proponowanych tu ch łodniejszych warunkach hodowanie 
podkultur mo żna prowadzi ć w odstępach czasu wynosz ących do trzech miesi ęcy. 
Należy używać chemicznie czystych (przep łukanych kwasem) i sterylnych 
naczyń na nowe kultury oraz stosowa ć sterylne techniki manipulacji. W razie 
zanieczyszczenia kultury podstawowej, np. glonami lub grzybami, nale ży podjąć 
kroki maj ące na celu wyeliminowanie zanieczyszczaj ących organizmów. 
W przypadku glonów i wi ększości innych zanieczyszczaj ących organizmów 
można tego dokona ć przez powierzchniow ą sterylizacj ę. Pobiera si ę próbkę 
zanieczyszczonego materia łu roślinnego i odcina si ę korzenie. Nast ępnie materia ł 
energicznie wytrz ąsa się w czystej wodzie, po czym zanurza si ę w 0,5 % (obj.) 
roztworze podchlorynu sodowego na czas od 30 sekund do 5 minut. Materia ł 
roślinny nast ępnie płucze się sterylną wodą i przenosi si ę, jako pewn ą liczbę 
partii, do przeznaczonych na kultury naczy ń zawieraj ących świeżą pożywkę 
wzrostow ą. Wiele li ści obumrze w wyniku tego zabiegu, zw łaszcza jeśli stoso­
wane będą dłuższe okresy ekspozycji, lecz niektóre spo śród tych, które prze żyją, 
będą zazwyczaj wolne od zanieczyszczenia. Li ście te mo żna następnie użyć do 
ponownego zaszczepienia nowych kultur.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Dodatek 3  
Pożywki  
Dla L. minor  i L. gibba  zalecane s ą różne pożywki wzrostowe. Dla  L. minor  
zaleca się zmodyfikowan ą pożywkę według Normy Szwedzkiej (SIS), natomiast 
dla L. gibba  zalecana jest po żywka 20X AAP. Sk łady obydwu po żywek podano 
poniżej. Przy sporz ądzaniu tych po żywek nale ży użyć substancji chemicznych 
gatunku odczynnikowego lub analitycznego oraz wody dejonizowanej.  
Pożywka wzrostowa dla  Lemna  według Normy Szwedzkiej (SIS)  
— Roztwory podstawowe I–V sterylizuje si ę przez obróbk ę w autoklawie 
(120 °C, 15 minut) lub za pomoc ą filtracji przez przepon ę (o wielko ści 
porów oko ło 0,2 μm). 
— Roztwór podstawowy VI (i opcjonalnie VII) sterylizuje si ę wyłącznie przez 
filtrację przeponow ą; roztworów tych nie nale ży obrabia ć w autoklawie.  
— Sterylne roztwory podstawowe nale ży przechowywa ć w warunkach ch łod­
nych i ciemnych. Roztwory podstawowe I–V nale ży usunąć po sześciu 
miesiącach, natomiast roztwory podstawowe VI (i opcjonalnie VII) maj ą 
dopuszczalny okres przechowywania wynosz ący jeden miesi ąc. 
Nr roztworu 
podstawowego Substancja Stężenie 
w roztworze 
podstawowym 
(g· l  –1 ) Stężenie 
w sporządzonej 
pożywce (mg·l  –1 ) Sporządzona po żywka 
Pierwiastek St ężenie (mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 · 4H  2 O 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 
ZnSO  4 · 7H  2 O 
CuSO  4 · 5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 · 6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010 1,00 
0,20 0,010 0,050 
0,0050 
0,010 B 
Mn Mo Zn 
Cu 
Co 0,17 
0,056 0,0040 0,011 
0,0013 
0,0020 
VI FeCl
 3 · 6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (bufor) 490 490 — —  
— Aby sporz ądzić jeden litr po żywki SIS, do 900 ml dejonizowanej wody 
dodaje się: 
— 10 ml roztworu podstawowego I,  
— 5 ml roztworu podstawowego II,  
— 5 ml roztworu podstawowego III,  
— 5 ml roztworu podstawowego IV,  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml roztworu podstawowego V,  
— 5 ml roztworu podstawowego VI,  
— 1 ml roztworu podstawowego VII (opcjonalnie).  
Uwaga:  Dla niektórych badanych substancji mo że być potrzebny dodatkowy roztwór 
podstawowy VII (bufor MOPS) (zob. ostatni akapit w sekcji 1.4).  
— pH reguluje si ę do 6,5 ± 0,2 przy u życiu 0,1 lub 1 molowego HCl albo 
NaOH, a obj ętość uzupełnia się do jednego litra, u żywając wody dejonizo ­
wanej.  
Pożywka wzrostowa 20X AAP  
Roztwory podstawowe sporz ądza się w sterylnej wodzie destylowanej lub dejo ­
nizowanej.  
Sterylne roztwory podstawowe nale ży przechowywa ć w warunkach ch łodnych 
i ciemnych. W takich warunkach, dopuszczalny okres przechowywania roztworów podstawowych wynosi ć będzie co najmniej 6–8 tygodni.
 
Dla pożywki 20X AAP sporz ądza się pięć roztworów podstawowych sk ładników 
odżywczych (A1, A2, A3, B i C), u żywając substancji chemicznych gatunku 
odczynnikowego. 20 ml ka żdego roztworu podstawowego sk ładników od żyw­
czych dodaje si ę do około 850 ml dejonizowanej wody, tworz ąc pożywkę wzros­
tową. pH reguluje si ę do 7,5 ± 0,1 przy u życiu 0,1 lub 1 molowego HCl albo 
NaOH, a obj ętość uzupełnia się do jednego litra, u żywając wody dejonizowanej. 
Pożywkę następnie przefiltrowuje si ę przez filtr przeponowy (ok.) 0,2 μm do 
sterylnego pojemnika.  
Pożywkę wzrostow ą przeznaczon ą do bada ń należy sporządzić 1–2 dni przed 
użyciem, aby pozwoli ć na ustabilizowanie si ę pH. Przed u życiem nale ży spraw­
dzić i wyregulowa ć, w razie potrzeby, pH po żywki wzrostowej przez dodanie 0,1 
lub 1 M NaOH albo HCl, jak opisano powy żej. 
Nr roztworu 
podstawowego Substancja Stężenie 
w roztworze 
podstawowym 
(g·l –1 ) (*) Stężenie 
w sporządzonej 
pożywce 
(mg·l  –1 ) (*) Sporządzona po żywka 
Pierwiastek Stężenie 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 ·7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 
0,16 
0,30 3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 
3,2 
6,0 66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn 
Fe 
— Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 
0,66 
— 31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) O ile nie podano inaczej.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Przypis: Teoretycznie odpowiednie ko ńcowe stężenie wodorow ęglanu (które pozwoli 
uniknąć znacznej regulacji pH) wynosi 15 mg/l, a nie 300 mg/l. Jednak że histo­
ryczne stosowanie od żywki 20X AAP, w tym w próbie pier ścieniowej dla niniej ­
szej metody, oparte jest na st ężeniu 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse i R. Lacey. 
(1999) The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing 
of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — 
Environmental Agency).  
Pożywka STEINBERGA (za ISO 20079)  
Stężenia i roztwory podstawowe  
— Zmodyfikowana po żywka Steinberga zastosowana jest w ISO 20079 dla 
samego  Lemna minor  (gdyż tylko  Lemna minor  jest tam dopuszczona), 
lecz próby wykaza ły, iż można uzyskiwa ć dobre wyniki równie ż 
w przypadku  Lemna gibba . 
— Przy sporz ądzaniu po żywki nale ży użyć substancji chemicznych gatunku 
odczynnikowego lub analitycznego oraz wody dejonizowanej.  
— Sporz ądzić odżywkę z roztworów podstawowych lub 10-krotnie zat ężonej 
odżywki, co pozwala na maksymalne st ężenie odżywki bez wytr ącenia.  
Tabela 1  
Pożywka STEINBERGA o stabilizowanym pH (zmodyfikowana wg Altenburgera)  
Substancja Po żywka  
Makroelementy  masa cz ąsteczkowa mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 · 7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Mikroelementy  masa cz ąsteczkowa μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 · 7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 · 4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 · 6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
Sól dwusodowa EDTA, 
dwuwodna 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Tabela 2  
Roztwory podstawowe (makroelementy)  
1. Makroelementy (zat ężone 50-krotnie)  g/l  
Roztwór podstawowy 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Roztwór podstawowy 2:  
MgSO  4 · 7H  2 O 5,00  
Roztwór podstawowy 3:  
Ca(NO  3 ) 2 · 4H  2 O 14,75  
Tabela 3  
Roztwory podstawowe (mikroelementy)  
2. Mikroelementy (zat ężone 1 000-krotnie)  mg/l  
Roztwór podstawowy 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Roztwór podstawowy 5:  
ZnSO  4 · 7H  2 O 180,0  
Roztwór podstawowy 6:  
Na 2 MoO  4 · 2H  2 O 44,0  
Roztwór podstawowy 7:  
MnCl  2 · 4H  2 O 180,0  
Roztwór podstawowy 8:  
FeCl  3 · 6H  2 O 760,00 
Sól dwusodowa EDTA, dwuwodna 1 500,00  
— Roztwory podstawowe 2 i 3 oraz oddzielnie 4–7 mo żna połączyć z sobą 
(biorąc pod uwag ę wymagane st ężenia).  
— Aby zapewni ć dłuższą przechowalno ść roztworów podstawowych, nale ży 
poddać je obróbce w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min lub, 
alternatywnie, przeprowadzi ć sterylną filtrację (0,2 μm). Dla roztworu podsta ­
wowego 8 zdecydowanie zaleca si ę sterylną filtrację (0,2 μm). 
Sporządzenie po żywki STEINBERGA (zmodyfikowanej) o st ężeniu 
końcowym  
— Dodać 20 ml roztworów podstawowych 1, 2 i 3 (zob. tabela 2) do oko ło 
900 ml wody dejonizowanej, aby unikn ąć wytrącenia.  
— Dodać 1,0 ml roztworów podstawowych 4, 5, 6, 7 i 8 (zob. tabela 3).  
— pH powinno wynosi ć 5,5 ± 0,2 (wyregulowa ć przez dodanie ograniczonej do 
minimum obj ętości roztworu NaOH lub HCl).  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Uzupe łnić wodą do 1 000 ml.  
— Jeżeli roztwory s ą wysterylizowane i u żyta jest odpowiednia woda, to nie ma 
konieczno ści dalszej sterylizacji. Je żeli sterylizacji dokonuje si ę na końcowej 
pożywce, to roztwór podstawowy 8 nale ży dodać po obróbce w autoklawie 
(w temperaturze 121 °C przez 20 min).  
Sporządzenie 10-krotnie zat ężonej pożywki STEINBERGA (zmodyfikowa ­
nej) do średnioterminowego przechowywania  
— Dodać 20 ml roztworów podstawowych 1, 2 i 3 (zob. tabela 2) do oko ło 
30 ml wody, aby unikn ąć wytrącenia.  
— Dodać 1,0 ml roztworów podstawowych 4, 5, 6, 7 i 8 (zob. tabela 3). 
Uzupełnić wodą do 100 ml.  
— Jeżeli roztwory s ą wysterylizowane i u żyta jest odpowiednia woda, to nie ma 
konieczno ści dalszej sterylizacji. Je żeli sterylizacji dokonuje si ę na końcowej 
pożywce, to roztwór podstawowy 8 nale ży dodać po obróbce w autoklawie 
(w temperaturze 121 °C przez 20 min).  
— pH po żywki (końcowe stężenie) powinno wynosi ć 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  BADANIE TOKSYCZNO ŚCI W UK ŁADZIE OSAD-WODA NA 
OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGACONEGO 
OSADU  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna dotycz ącej badań wytycznej 
OECD nr 218 (2004). Niniejsz ą metodę zaprojektowano, by oceni ć skutki 
przedłużonego nara żenia żyjących w osadach larw  Chironomus  sp., nale ż­ 
ących do rz ędu słodkowodnych muchówek, na dzia łanie chemikaliów. 
Metoda opiera si ę na protoko łach badania toksyczno ści obowi ązujących 
dla Chironomus riparius  i Chironomus tentans , które opracowano 
w Europie (1) (2) (3) i Ameryce P łn. (4) (5) (6) (7) (8) i potwierdzono 
w badaniu mi ędzylaboratoryjnym (1) (6) (9). Mo żna także wykorzystywa ć 
inne dobrze udokumentowane gatunki ochotkowatych, np.  Chironomus 
yoshimatsui  (10) (11).  
2. Scenariusz nara żenia stosowany w tej metodzie badawczej polega na wzbo ­
gacaniu osadu substancj ą badaną. Wybór odpowiedniego scenariusza nara ­ 
żenia zależy od zamierzonego zastosowania badania. Scenariusz polegaj ący 
na wzbogacaniu osadu ma na celu symulacj ę utrzymywania si ę w osadzie 
podwyższonego st ężenia chemikaliów. Ten uk ład narażenia obejmuje wzbo ­
gacanie osadu w uk ładzie badawczym osad denny-woda.  
3. Substancje, które nale ży przebada ć pod kątem organizmów żyjących 
w osadach, zwykle pozostaj ą w tym uk ładzie przez d ługi czas. Organizmy 
żyjące w osadach mog ą być narażane na dzia łanie substancji kilkoma 
drogami. Wzgl ędne znaczenie danej drogi nara żenia i czas, jaki jest 
potrzebny, by przyczyni ła się ona do ogólnych skutków toksycznych, zale ży 
od fizykochemicznych w łaściwości danej substancji chemicznej. 
W przypadku substancji silnie adsorbuj ących (np. substancji o log K  ow > 
5) lub w przypadku substancji tworz ących wi ązanie kowalencyjne 
z osadami, znacz ącą drogą narażenia może być przyjmowanie zanieczysz ­
czonego pokarmu. Aby zapobiec niedoszacowaniu toksyczno ści wysokoli ­
pofilowych substancji, mo żna rozważyć zastosowanie pokarmu dodawanego 
do osadu przed wprowadzeniem substancji badanej. Aby uwzgl ędnić 
wszelkie mo żliwe drogi nara żenia, niniejsza metoda badawcza ukierunko ­
wana jest na nara żenie długoterminowe. Badanie trwa od 20 do 28 dni 
w przypadku  C. riparius  i C. yoshimatsui , a w przypadku  C. tentans  od 
28 do 65 dni. Je śli do okre ślonego celu potrzebne s ą dane krótkoterminowe, 
na przykład w celu zbadania skutków dzia łania substancji niestabilnych, po 
okresie dziesi ęciu dni mo żna usunąć dodatkowe replikaty.  
4. Mierzone punkty ko ńcowe to ca łkowita liczba wyl ęgniętych doros łych osob­
ników i czas do wyl ęgu. Jeśli potrzebne s ą dodatkowe dane krótkotermi ­
nowe, zaleca si ę, by pomiarów prze życia i wzrostu larw dokonywa ć po 
okresie dziesi ęciu dni, korzystaj ąc w stosownych przypadkach 
z dodatkowych replikatów.  
5. Zalecane jest stosowanie osadów preparowanych. Osady preparowane s ą 
korzystniejsze od osadów naturalnych z kilku wzgl ędów:  
— zmienno ść eksperymentalna jest ograniczona, poniewa ż osad preparo ­
wany stanowi odtwarzaln ą „zestandaryzowan ą matrycę”, tak że wyeli­
minowana zostaje potrzeba znalezienia źródeł niezanieczyszczonego 
i czystego osadu,  
— badania mo żna rozpocz ąć w każdej chwili, unikaj ąc zmienno ści sezo­
nowej badanego osadu i nie jest konieczna wst ępna obróbka osadu 
w celu usuni ęcia rodzimej fauny; stosowanie osadu preparowanego 
zmniejsza tak że koszty zwi ązane ze zbieraniem w terenie dostatecznych 
ilości osadu na potrzeby rutynowych bada ń, 
— zastosowanie osadu preparowanego umo żliwia porównanie toksyczno ści 
i stosown ą klasyfikacj ę substancji.  
6. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 1.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
ZASADA METODY BADANIA  
7. Larwy ochotkowatych w pierwszym stadium larwalnym poddawane s ą dzia­ 
łaniu badanej substancji chemicznej o ró żnym stopniu st ężenia w uk ładach 
osad denny-woda. Osad wzbogaca si ę badaną substancj ą chemiczn ą, 
a następnie larwy w pierwszym stadium larwalnym wprowadza si ę do 
zlewek, w których ustabilizowano st ężenia badanej substancji w osadzie 
i wodzie. Na ko ńcu badania mierzy si ę współczynnik wyl ęgu i rozwoju 
ochotkowatych. W miar ę potrzeby prze życie i masa larw mog ą być także 
mierzone po 10 dniach (z wykorzystaniem w stosownych przypadkach 
dodatkowych replikatów). Dane te analizowane s ą przy użyciu modelu 
regresyjnego w celu oszacowania st ężenia, które spowodowa łoby zmniej ­
szenie wyl ęgu, przeżycia lub wzrostu larw o x % (np.EC  15 , EC  50 itd.) albo 
przez badanie hipotezy statystycznej w celu okre ślenia stężenia, przy którym 
nie obserwuje si ę szkodliwych zmian (NOEC) lub najni ższego stężenia, przy 
którym obserwuje si ę szkodliwe zmiany (LOEC). To ostatnie wymaga 
porównania warto ści zmian z warto ściami kontrolnymi z u życiem bada ń 
statystycznych.  
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ  
8. Nale ży znać rozpuszczalno ść substancji badanej w wodzie, pr ężność par, 
podział substancji w osadzie oraz jej stabilno ść w wodzie i osadzie, uzys ­
kane w wyniku pomiarów lub oblicze ń. Powinna by ć dostępna wiarygodna 
metoda analityczna do oznaczania ilo ściowego substancji badanej w osadzie, 
wodzie porowej i warstwie wody powy żej osadu ze znan ą 
i udokumentowan ą dokładnością oraz granic ą wykrywalno ści. Użyteczne 
informacje obejmuj ą wzór strukturalny i czysto ść substancji badanej. Do 
przydatnych informacji nale żą także dane dotycz ące chemicznych losów 
substancji w środowisku (np. jej rozpraszanie, rozk ład abiotyczny 
i biotyczny itd.). Dalsze wskazówki dotycz ące badania substancji 
o własnościach fizykochemicznych utrudniaj ących ich badanie podano 
w pozycji (12) w bibliografii.  
SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
9. Substancje odniesienia mog ą być okresowo badane dla zagwarantowania, że 
protokół i warunki badania s ą rzetelne. Przyk łady substancji toksycznych 
stosowanych z powodzeniem w badaniach mi ędzylaboratoryjnych 
i walidacyjnych: lindan, trifluralina, pentachlorofenol, chlorek kadmu 
i chlorek potasu (1) (2) (5) (6) (13).  
WAŻNOŚĆ BADANIA  
10. Aby badanie by ło ważne, obowi ązują następujące warunki:  
— odsetek wyl ęgniętych osobników doros łych w próbach kontrolnych musi 
na końcu badania by ć co najmniej na poziomie 70 % (1) (6),  
— w naczyniach zawieraj ących próby kontrolne wyl ęg osobników doro ­
słych C. riparius  i C. yoshimatsui  z larw powinien nast ąpić między 
12. a 23. dniem od ich wprowadzenia do naczynia; w przypadku  C. 
tentans  niezbędny jest okres od 20 do 65 dni,  
— na ko ńcu badania nale ży zmierzy ć wartość pH oraz st ężenie rozpusz ­
czonego tlenu w ka żdym naczyniu. St ężenie tlenu powinno wynosi ć co 
najmniej 60 procent warto ści nasycenia powietrzem (ASV) w wybranej 
temperaturze, a warto ść pH w warstwie wody powy żej osadu powinna 
we wszystkich naczyniach u żywanych do badania znajdowa ć się 
w przedziale 6–9,  
— temperatura wody nie powinna ró żnić się o więcej niż ± 1,0 °C. Tempe ­
raturę wody mo żna kontrolowa ć przy użyciu pomieszczenia izotermicz ­
nego i w takim przypadku temperatura pomieszczenia powinna by ć 
potwierdzana w stosownych odst ępach czasowych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
OPIS METODY  
Naczynia u żywane do badania  
11. Badanie prowadzone jest w szklanych zlewkach o pojemno ści 600 ml 
i średnicy 8 cm. Inne naczynia tak że mogą nadawać się do badania, 
powinny jednak zapewnia ć odpowiedni ą głębokość warstwy osadu 
i warstwy wody powy żej. Powierzchnia osadu powinna by ć wystarczaj ąca, 
by zapewni ć od 2 do 3 cm  2 na larwę. Stosunek g łębokości warstwy osadu 
do warstwy wody powy żej powinien wynosi ć 1:4. Naczynia do badania 
i inne przyrz ądy mające kontakt z uk ładem badawczym powinny by ć 
w całości wykonane ze szk ła lub innego chemicznie oboj ętnego materia łu 
(np. teflonu).  
Wybór gatunków  
12. Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu powinien by ć w miarę możliwości 
Chironomus riparius . Odpowiedni jest tak że Chironomus tentans , ale jest 
trudniejszy w hodowli i wymaga d łuższego okresu badania. Mo żna także 
korzystać z Chironomus yohimatsui . Szczegó ły metod hodowli dla  Chiro­
nomus riparius  podano w dodatku 2. Informacje dotycz ące warunków 
hodowli s ą także dostępne dla innych gatunków, tj.  Chironomus tentans  
(4) i Chironomus yoshimatsui  (11). Przed przeprowadzeniem badania nale ży 
potwierdzi ć identyfikacj ę gatunków, ale nie jest to wymagane przed ka żdym 
badaniem, je śli organizmy pochodz ą z hodowli wewn ątrzlaboratoryjnej.  
Osad  
13. W miar ę możliwości należy stosowa ć osad preparowany (zwany tak że 
osadem regenerowanym, sztucznym lub syntetycznym). Je śli jednak 
korzysta si ę z osadu naturalnego, nale ży go scharakteryzowa ć (co najmniej 
pod kątem pH, zawarto ści węgla organicznego, zaleca si ę także określenie 
innych parametrów, takich jak stosunek C/N i granulometria). Osad taki powinien by ć wolny od zanieczyszcze ń i innych organizmów, które 
mogłyby konkurowa ć z ochotkowatymi lub je zjada ć. Zaleca si ę także, by 
przed jego wykorzystaniem w badaniu toksyczno ści dla ochotkowatych 
naturalny osad by ł przez siedem dni kondycjonowany w tych samych 
warunkach, jakie panowa ć będą następnie podczas badania. Do wykorzys ­
tania w tym badaniu (1) (15) (16) zaleca si ę następujący osad preparowany 
oparty na sztucznej glebie stosowanej w metodzie badawczej C.8 (14):
 
a) torf 4–5 % (w przeliczeniu na such ą masę): wartość pH możliwie najbar ­
dziej zbli żona do przedzia łu 5,5 do 6,0; wa żne jest, by stosowa ć torf 
w postaci sproszkowanej, drobno zmielony (wielko ść cząstek ≤ 1 mm) 
i suszony wy łącznie powietrzem;  
b) glinka kaolinowa 20 % (w przeliczeniu na such ą masę) (zawarto ść kaoli­
nitu w miar ę możliwości powyżej 30 %);  
c) piasek kwarcowy 75–76 % (w przeliczeniu na such ą masę) (powinien 
przeważać drobny piasek, w którym ponad 50 % cz ąstek mierzy od 50 
do 200 μm); 
d) dla uzyskania wilgotno ści końcowej mieszkanki na poziomie od 30–50 
% dodaje si ę wodę dejonizowan ą; 
e) w celu skorygowania pH ko ńcowej mieszaniny osadu do warto ści 7,0 
± 0,5 dodaje si ę do niej chemicznie czysty w ęglan wapnia (CaCO  3 ). 
Zawartość węgla organicznego w ko ńcowej mieszaninie powinna 
wynosić 2 % (± 0,5 %) i nale ży ją skorygowa ć przy użyciu odpowied ­
nich ilości torfu i piasku, zgodnie z lit. a) i c).  
14. Źródło torfu, glinki kaolinowej i piasku powinno by ć znane. Sk ładniki 
osadu nale ży sprawdzi ć pod kątem zanieczyszczenia chemicznego (np. 
metalami ci ężkimi, zwi ązkami chloroorganicznymi, zwi ązkami fosforoorga ­
nicznymi itp.). W dodatku 3 podano przyk ładowy sposób przygotowania 
osadu preparowanego. Dopuszczalne jest tak że mieszanie suchych sk ładni­
ków, o ile wyka że się, że po dodaniu warstwy wody powy żej osadu sk ład­
niki osadu si ę nie rozdzielaj ą (np. nie unosz ą się cząstki torfu) oraz że torf 
lub osad jest poddawany dostatecznemu kondycjonowaniu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1379
 
Woda  
15. Jako wod ę do badania mo żna stosowa ć każdy rodzaj wody, której charak ­
terystyka zgodna jest z charakterystyk ą chemiczn ą wody nadaj ącej się do 
rozcieńczania, jak opisano w dodatkach 2 i 4. Do hodowli ochotkowatych 
i do badania mo że służyć każdy odpowiedni rodzaj wody, np. woda natu ­
ralna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenerowana (zob. dodatek 2) lub odchlorowana woda wodoci ągowa, pod warunkiem że ochotkowate 
przeżyją w niej przez okres hodowli i badania bez wykazywania oznak 
stresu. Na pocz ątku badania warto ść pH wody do badania powinna wynosi ć 
od 6 do 9, a twardo ść ogółem wody wyra żona w zawarto ści CaCO
 3 nie 
powinna by ć wyższa niż 400 mg/l. Je śli jednak podejrzewa si ę, że między 
jonami powoduj ącymi twardo ść wody a substancj ą badaną dochodzi do 
interakcji, powinna by ć stosowana woda o mniejszej twardo ści (a zatem 
w takim przypadku nie wolno u żywać pożywki Elendta M4). Przez okres 
całego badania nale ży stosowa ć ten sam rodzaj wody. Cechy jako ści wody, 
wymienione w dodatku 4, nale ży mierzyć co najmniej dwa razy w roku lub 
ilekroć zachodzi podejrzenie, że mogły one ulec znacznej zmianie.  
Roztwory podstawowe – osady wzbogacane  
16. Wzbogacone osady o wybranym st ężeniu substancji badanej s ą zwykle 
przygotowywane przez dodanie roztworu tej substancji bezpo średnio do 
osadu. Roztwór podstawowy substancji badanej rozpuszczonej 
w dejonizowanej wodzie miesza si ę z osadem gotowym z u życiem walcarki, 
mieszalnika lub r ęcznie. Je żeli substancja badana s łabo rozpuszcza si ę 
w wodzie, mo żna ją rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku organicz ­
nym, w mo żliwie jak najmniejszej jego ilo ści (np. w heksanie, acetonie lub 
chloroformie). Roztwór taki nast ępnie miesza si ę z drobnym piaskiem kwar ­
cowym, w ilo ści 10 gramów na jedno naczynie. Rozpuszczalnikowi nale ży 
pozwolić wyparowa ć i całkowicie znikn ąć z piasku; piasek nast ępnie miesza 
się z osadem w okre ślonej ilości na każdą zlewkę. Do rozpuszczenia, rozrze ­
dzenia lub zemulsyfikowania substancji badanej mog ą być użyte jedynie 
łatwo ulatniaj ące się czynniki. Nale ży mieć na uwadze, że przy preparo ­
waniu osadu nale ży uwzględniać piasek zawarty w mieszance substancji 
badanej z piaskiem (czyli osad nale ży przygotowa ć z mniejszej ilo ści pias­
ku). Nale ży dopilnowa ć, by substancja badana dodana do osadu zosta ła 
w nim starannie i równo rozprowadzona. W razie konieczno ści dla 
określenia jednorodno ści mieszanki nale ży zanalizowa ć podpróbki.  
PROJEKT BADANIA  
17. Projekt badania obejmuje dobór liczby badanych st ężeń i ich zróżnicowanie, 
liczby naczy ń zawierających dane st ężenie substancji i liczby larw na jedno 
naczynie. Opisano projekty dotycz ące punktowego oszacowania warto ści 
EC, oszacowania warto ści NOEC i przeprowadzenia badania granicznego.  
Projekt analizy regresyjnej  
18. Stężenie powoduj ące zmiany (np. EC  15 , EC  50 ) i zakres st ężeń, powyżej 
którego skutki dzia łania substancji badanej staj ą się przedmiotem zaintere ­
sowania, nale ży wyskalowa ć z zastosowaniem st ężeń ujętych w badaniu. 
Ogólnie, dok ładność, a w szczególno ści ważność naukowa, z jak ą można 
oszacowa ć stężenia powoduj ące zmiany (EC  x ), poprawia si ę, gdy stężenie 
powodujące zmiany wchodzi w zakres badanych st ężeń. Należy unikać 
ekstrapolowania wyników znacznie poni żej najniższego stężenia dającego 
wynik dodatni lub powy żej najwyższego stężenia. Wst ępne badanie usta ­
lające zakres jest pomocne przy wyborze zakresu st ężeń do zastosowania 
(zob. pkt 27).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1380
 
19. Jeśli trzeba oszacowa ć EC  x , należy zbadać co najmniej pi ęć stężeń i trzy 
replikaty dla ka żdego stężenia. W ka żdym przypadku zaleca si ę stosowanie 
dostatecznych st ężeń substancji badanej, aby umo żliwić dobre oszacowanie 
parametrów modelu. Wspó łczynnik odst ępów między stężeniami nie powi ­
nien być większy niż dwa (z wyj ątkiem przypadków, gdy krzywa 
dawka-odpowied ź ma łagodny przebieg). Liczba replikatów przy ka żdym 
podaniu dawki substancji badanej mo że być zmniejszona, je śli zwiększy 
się liczbę stężeń substancji badanej daj ących różne odpowiedzi. Zwi ększenie 
liczby replikatów lub zmniejszenie wielko ści odstępów między badanymi 
stężeniami zwykle prowadzi do zw ężenia przedzia łów ufności dla danego 
badania. Je śli celem jest oszacowanie prze życia i wzrostu larw w okresie 10 
dni, wymagane s ą dodatkowe replikaty.  
Projekt dotycz ący oszacowania NOEC/LOEC  
20. Jeśli celem jest oszacowanie warto ści LOEC lub NOEC, nale ży zastosowa ć 
pięć stężeń substancji badanej z co najmniej czterema replikatami, 
a współczynnik odst ępów między stężeniami nie powinien by ć większy 
niż dwa. Liczba replikatów powinna by ć na tyle du ża, by zapewni ć odpo­
wiednią moc statystyczn ą dla wykrycia 20 % ró żnicy z prób ą kontrolną przy 
istotności wynosz ącej 5 % (p = 0,05). W przypadku wspó łczynnika rozwoju 
zwykle stosowna jest analiza wariancji (ANOVA), np. badanie Dunnetta 
i badanie Williamsa (17) (18) (19) (20). W przypadku wspó łczynnika 
wylęgu można stosowa ć test Cochrana-Armitage’a, test dok ładny Fishera 
(z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela.  
Badanie graniczne  
21. Jeśli we wst ępnym badaniu ustalaj ącym zakres nie zaobserwowano żadnych 
zmian, mo żna przeprowadzi ć badanie graniczne (jedno st ężenie badane 
i jedna próba kontrolna). Celem badania granicznego jest przeprowadzenie badania przy dostatecznie wysokim st ężeniu substancji badanej, by umo ż­
liwić decydentom wykluczenie jej ewentualnych toksycznych skutków, 
a granicę ustala si ę na poziomie st ężenia, co do którego nie przewiduje 
się, by mog ło kiedykolwiek wyst ąpić. Zaleca si ę stężenie 1 000 mg/kg (w 
przeliczeniu na such ą masę). Zazwyczaj konieczne jest co najmniej 6 repli ­
katów zarówno dla próby poddawanej dzia łaniu substancji, jak i dla próby 
kontrolnej. Nale ży wykaza ć odpowiedni ą moc statystyczn ą, która pozwala 
wykryć 20 % ró żnicę w porównaniu z prób ą kontroln ą przy 5 % poziomie 
istotności (p = 0,05). Przy odpowiedzi metrycznej (wspó łczynnik rozwoju 
i masa) odpowiedni ą metodą statystyczn ą jest test t-Studenta, je śli dane 
spełniają warunki tego testu (normalno ść rozkładu zmiennych, jednorodno ść 
wariancji). Je śli te warunki nie s
ą spełnione, mo żna zastosowa ć test t dla 
nierównych wariancji lub test nieparametryczny, np. test Manna-Whitneya- 
Wilcoxona. W przypadku wspó łczynnika wyl ęgu odpowiedni jest test 
dokładny Fishera.  
PROCEDURA  
Warunki nara żenia na dzia łanie substancji  
Przygotowanie uk ładu osad wzbogacony – woda  
22. Dla podawania substancji badanej zalecana jest procedura wzbogacania 
opisana w metodzie badawczej C.8: Toksyczno ść dla dżdżownic (14). 
Osad wzbogacony umieszcza si ę w naczyniach, a nast ępnie dodaje si ę 
wodę powyżej osadu, aby uzyska ć współczynnik obj ętości osadu do wody 
równy 1:4 (zob. pkt 11 i 15). G łębokość warstwy osadu powinna znajdowa ć 
się w przedziale 1,5-3 cm. Podczas dodawania badanej wody w celu uzys ­
kania słupa wody nad osadem, aby unikn ąć oddzielenia sk ładników osadu 
i ponownego zawieszenia w wodzie drobnoziarnistego materia łu, osad na 
czas zalewania mo żna nakryć plastikowym kr ążkiem, a kr ążek następnie od 
razu usun ąć. Właściwe może być także zastosowanie innych przyrz ądów.  
23. Naczynia do badania powinny by ć przykryte (np. szklanymi p łytkami). 
W razie konieczno ści w czasie badania poziom wody uzupe łnia się do 
pierwotnej obj ętości, aby wyrówna ć jej ubytek spowodowany parowaniem. 
Należy w tym celu u żywać wody destylowanej lub dejonizowanej, aby 
zapobiec odk ładaniu się soli. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Stabilizacja  
24. Po tym jak zostanie ju ż przygotowany osad wzbogacony z warstw ą wody 
powyżej, należy umożliwić podział substancji badanej mi ędzy fazą wodną 
i osadem (3) (4) (6) (13). W miar ę możliwości powinno si ę to odbywa ć 
w tych samych warunkach temperatury i napowietrzenia, co panuj ące 
w badaniu. Okres ustalania stanu równowagi zale ży od osadu i substancji 
chemicznej, i mo że być rzędu kilku godzin lub kilku dni, a w rzadkich 
przypadkach trwa ć do kilku tygodni (4–5 tygodni). Jako że jest to czas 
wystarczaj ący dla rozk ładu wielu chemikaliów, nie oczekuje si ę stanu 
równowagi, ale zaleca si ę stosowanie 48-godzinnego okresu ustalania 
równowagi. Na koniec tego dalszego okresu ustalania równowagi nale ży 
zmierzyć stężenie substancji badanej w warstwie wody powy żej osadu, 
wodzie porowej i w osadzie, co najmniej przy najwy ższym stężeniu 
i przy ni ższym stężeniu (zob. pkt 38). Takie oznaczenia analityczne 
substancji badanej umo żlwiają obliczenie bilansu masy i wyra żenie 
wyników w oparciu o zmierzone st ężenia.  
Dodanie organizmów badanych  
25. Na cztery do pi ęciu dni przed umieszczeniem organizmów badanych 
w naczyniach u żywanych do badania pakiety jaj nale ży wyjąć z hodowli 
i umieścić w małych naczyniach w po żywce hodowlanej. Mo żna w tym celu 
zastosowa ć pożywkę wykorzystywan ą w hodowli podstawowej lub po żywkę 
świeżo przygotowan ą. Jeśli stosowana jest ta ostatnia, do po żywki hodow ­
lanej nale ży dodać niewielk ą ilość pokarmu, np. zielenice lub kilka kropel 
filtratu z drobno zmielonej zawiesiny pokarmu w p łatkach dla ryb (zob. 
dodatek 2). Nale ży korzysta ć wyłącznie ze świeżo złożonych pakietów jaj. 
Wylęg larw zaczyna si ę przeważnie kilka dni po z łożeniu pakietów jaj (2 do 
3 dni w przypadku  Chironomus riparius  w temperaturze 20 °C oraz 1 do 4 
dni w przypadku  Chironomus tentans  w temperaturze 23 °C i  Chironomus 
yoshimatsui  w temperaturze 25 °C), a wzrost larw nast ępuje w czterech 
stadiach larwalnych, przy czym ka żde z nich trwa od 4 do 8 dni. Do 
badania nale ży stosowa ć larwy w pierwszym stadium larwalnym (2–3 lub 
1–4 dni po wyl ęgu). Stadium rozwoju kuczmanów mo żna sprawdzi ć 
stosując pomiar szeroko ści puszki g łowowej (6).  
26. Dwadzie ścia larw w pierwszym stadium larwalnym przydziela si ę losowo do 
każdego naczynia do świadczalnego zawieraj ącego osad wzbogacony i wod ę 
przy użyciu tępo zakończonej pipety. Po wprowadzeniu larw do naczy ń 
należy zatrzyma ć napowietrzanie wody i nie uruchamia ć go przez dob ę 
po ich wprowadzeniu (zob. pkt 25 i 32). Zgodnie z zastosowanym 
projektem badania (zob. pkt 19 i 20) w celu oszacowania punktu EC nale ży 
zastosowa ć co najmniej 60 larw na st ężenie, a w celu oznaczenia warto ści 
NOEC - 80 larw.  
Badane st ężenia 
27. Badanie ustalaj ące zakres mo że być przydatne do okre ślenia zakresu st ężeń 
dla ostatecznego badania. W tym celu stosuje si ę szereg roztworów 
o znacznie ró żniących się od siebie st ężeniach substancji badanej. Aby 
zapewnić tę samą gęstość powierzchni na ochotkowate, co stosowana 
w ostatecznym badaniu, ochotkowate poddaje si ę narażeniu na ka żde 
stężenie substancji badanej przez okres pozwalaj ący oszacowa ć odpowiednie 
jej stężenie badane i nie wymagane s ą replikaty.  
28. Decyzje dotycz ące stężeń substancji badanej w ostatecznym badaniu podej ­
muje się w oparciu o wynik badania ustalaj ącego zakres. Jak opisano w pkt 
18 do 20, nale ży zastosowa ć i wybrać co najmniej pi ęć stężeń. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Próby kontrolne  
29. Naczynia zawieraj ące próby kontrolne bez substancji badanej, ale zawie ­
rające osad, powinny by ć uwzględnione w badaniu z odpowiedni ą liczbą 
replikatów (zob. pkt 19 i 20). Je śli do wprowadzenia substancji badanej 
został użyty rozpuszczalnik (zob. pkt 16), nale ży dodać próbę kontroln ą 
zawierającą osad z rozpuszczalnikiem.  
Układ badawczy  
30. Stosowane s ą układy statyczne. W wyj ątkowych przypadkach, na przyk ład 
gdy okre ślone w specyfikacjach cechy jako ści wody stan ą się nieodpo ­
wiednie dla organizmu badanego lub narusz ą równowag ę chemiczn ą (np. 
poziomy rozpuszczonego tlenu spadn ą zbyt nisko, st ężenie produktów 
wydalniczych za bardzo wzro śnie lub nast ąpi uwalnianie minera łów 
z osadu, które wp łynie na warto ść pH lub twardo ść wody) mo żna stosowa ć 
układy półstatyczne lub przep ływowe z okresowym lub sta łym odnawianiem 
wody powy żej osadu. Inne metody poprawy jako ści wody powy żej osadu, 
np. napowietrzanie, zwykle jednak wystarczaj ą i należy w miarę możliwości 
z nich korzysta ć. 
Pokarm  
31. Larwy trzeba karmi ć, w miarę możliwości codziennie lub co najmniej trzy 
razy w tygodniu. Odpowiedni do karmienia m łodych larw przez pierwsze 10 
dni wydaje si ę pokarm dla ryb (zawiesina w wodzie lub drobno zmielony 
pokarm, np. Tetra-Min lub Tetra-Phyll; zob. szczegó łowe informacje 
w dodatku 2) w ilo ści 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg w przypadku  C. yoshimat ­
sui) na larw ę dziennie. Starsze larwy mog ą potrzebowa ć nieco wi ęcej 
pokarmu: 0,5-1 mg na larw ę na dzień powinno by ć wystarczaj ącą ilością 
przez pozosta łą część badania. Je śli obserwuje si ę wzrost grzybów lub 
śmiertelno ść w próbach kontrolnych, nale ży wówczas we wszystkich 
próbach kontrolnych i do świadczalnych ograniczy ć i kontrolowa ć ilość 
pokarmu. Je śli nie można powstrzyma ć rozwoju grzybów, nale ży powtórzy ć 
badanie. Przy badaniu substancji silnie adsorbuj ących (np. o log K  ow > 5) 
lub w przypadku substancji tworz ących wiązanie kowalencyjne z osadem, 
ilość pokarmu niezb ędną do zapewnienia prze życia i naturalnego wzrostu 
organizmów mo żna dodać do osadu preparowanego przed okresem stabili ­
zacji. W tym celu zamiast pokarmu dla ryb nale ży stosowa ć surowiec 
roślinny, np. dodatek 0,5 % (w przeliczeniu na such ą masę) drobno zmie ­
lonych liści np. pokrzywy zwyczajnej ( Urtica dioica ), morwy bia łej (Morus 
alba), koniczyny bia łej (Trifolium repens ), szpinaku ( Spinacia oleracea ), 
można też użyć innego surowca ro ślinnego (produktu Cerophyl lub 
alfa-celulozy).  
Warunki inkubacji  
32. W miar ę możliwości w ciągu 24 godzin od wprowadzenia larw nale ży 
zapewnić delikatne napowietrzanie warstwy wody powy żej osadu 
w naczyniach do badania, a nast ępnie kontynuowa ć je przez ca ły okres 
badania (nale ży dopilnowa ć, by stężenie rozpuszczonego tlenu nie spad ło 
poniżej 60 procent ASV). Napowietrzanie prowadzone jest z u życiem 
szklanej pipety Pasteura przytwierdzonej 2-3 cm nad warstw ą osadu (tj. 
w ilości jednego lub kilku b ąbli powietrza/sek.). Przy badaniu lotnych 
chemikaliów mo żna rozwa żyć nienapowietrzanie uk ładu osad-woda.  
33. Badanie przeprowadza si ę w stałej temperaturze 20 °C (± 2 °C). Zalecane 
temperatury w przypadku  C. tentans  i C. yoshimatsui  to odpowiednio 23 °C 
i 25 °C (± 2 °C). Stosuje si ę 16-godzinny fotoperiod, a nat ężenie światła 
powinno wynosi ć od 500 do 1 000 luksów.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Czas trwania nara żenia 
34. Czas trwania nara żenia rozpoczyna si ę od wprowadzenia larw do naczy ń 
z próbą wzbogacon ą i naczyń zawieraj ących próby kontrolne. Maksymalny 
czas trwania nara żenia wynosi 28 dni w przypadku  C. riparius  i C. yoshi ­
matsui , a w przypadku  C. tentans  65 dni. Je śli kuczmany wyl ęgną się 
wcześniej, badanie mo żna zakończyć po co najmniej pi ęciu dniach od 
wylęgu ostatniego doros łego osobnika w próbie kontrolnej.  
Obserwacje  
Wylęg osobników doros łych 
35. Nale ży określić czas rozwoju i ca łkowitą liczbę w pełni wylęgniętych 
samców i samic kuczmanów. Samce łatwo zidentyfikowa ć dzięki ich pierza ­
stym czułkom.  
36. Naczynia do badania nale ży obserwowa ć co najmniej trzy razy w tygodniu 
w celu wzrokowej oceny ewentualnego nieprawid łowego zachowania (np. 
porzucanie osadu, nietypowy sposób p ływania) w porównaniu z prób ą 
kontrolną. W okresie spodziewanego wyl ęgu kuczmanów konieczne jest 
codzienne ich zliczanie. P łeć i liczbę w pełni wylęgniętych kuczmanów 
należy zapisywa ć codziennie. Po identyfikacji kuczmany usuwane s ą 
z naczyń. Pakiety jaj z łożone przed zako ńczeniem badania nale ży odnoto­
wać, a następnie usun ąć, by zapobiec ponownemu wprowadzeniu larw do 
osadu. Nale ży także odnotowa ć liczbę widocznych poczwarek, z których nie 
wylęgły się kuczmany. Wytyczne dotycz ące pomiaru wyl ęgu zawarte s ą 
w dodatku 5.  
Wzrost i prze życie 
37. Jeśli mają być dostarczone dane dotycz ące 10-dniowego prze życia i wzrostu 
larw, nale ży na pocz ątku włączyć do badania dodatkowe naczynia, by 
mogły być w tym celu wykorzystane. Aby zebra ć larwy, osad z tych dodat ­
kowych naczy ń należy przesiać, używając sita 250 μm. Kryteriami zgonu s ą 
nieruchomo ść lub brak reakcji na bodziec mechaniczny. Larwy nieodzys ­
kane nale ży także liczyć jako martwe (larwy, które pad ły na pocz ątku 
badania, mog ły zostać rozłożone przez drobnoustroje). Nale ży określić 
suchą masę (bez popio łu) larw pozosta łych przy życiu na ka żde naczynie 
do badania i obliczy ć średnią suchą masę pojedynczej larwy na ka żde 
naczynie. Przydatne jest okre ślenie, w którym stadium larwalnym znajduj ą 
się larwy pozosta łe przy życiu; w tym celu mo żna stosowa ć pomiar puszki 
głowowej ka żdego osobnika.  
Pomiary analityczne  
Stężenie substancji badanej  
38. Przed rozpocz ęciem badania (np. wprowadzeniem larw) z co najmniej 
jednego naczynia na ka żde doświadczenie pobiera si ę próbki ca łej objętości 
osadu w celu dokonania pomiarów analitycznych st ężenia substancji badanej 
w osadzie. Zaleca si ę, by na pocz ątku i na ko ńcu badania przeanalizowa ć co 
najmniej próbki wody z warstwy powy żej osadu, wody porowej i osadu 
(zob. pkt 24), przy najwy ższym stężeniu i przy ni ższym stężeniu. Takie 
oznaczenie st ężenia substancji badanej daje wiedz ę na temat zachowania/ 
podziału substancji badanej w uk ładzie woda-osad.  
39. Gdy dokonuje si ę pomiarów po średnich (np. w 7. dniu) lub je śli do analizy 
potrzeba du żych próbek, których nie mo żna pobrać z naczyń do badania bez 
wpływania na uk ład badawczy, nale ży dokona ć oznaczeń analitycznych na 
próbkach pochodz ących z dodatkowych naczy ń do badania przygotowanych 
w ten sam sposób (zawieraj ących także organizmy badane), ale niewykorzy ­
stywanych do obserwacji biologicznych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. Aby oddzieli ć wodę porową, zaleca si ę odwirowanie osadu przy 10 000 g w 
temp. 4 °C przez 30 min. Je śli jednak substancja badana nie adsorbuje si ę 
na filtrze, dopuszczalna jest te ż filtracja. W niektórych przypadkach zanali ­
zowanie st ężeń w wodzie porowej mo że nie być możliwe, poniewa ż wiel­
kość próbki jest zbyt ma ła. 
Parametry fizykochemiczne  
41. Warto ść pH i temperatura w naczyniach do badania powinny by ć odpo­
wiednio mierzone (zob. pkt 10). Twardo ść i zawarto ść amoniaku nale ży 
zmierzyć w próbach kontrolnych i w jednym naczyniu do badania przy 
najwyższym stężeniu na pocz ątku i na ko ńcu badania.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Opracowanie wyników  
42. Celem badania jest okre ślenie wpływu substancji badanej na wspó łczynnik 
rozwoju i ca łkowitą liczbę w pełni wylęgniętych samic i samców kucz ­
manów lub, w przypadku bada ń 10-dniowych, skutków dla prze życia 
i masy larw. Je śli nie ma wskaza ń dotyczących statystycznie istotnych 
różnic we wra żliwości osobników ka żdej płci, wyniki dotycz ące osobników 
męskich i żeńskich mog ą zostać połączone do celów analizy statystycznej. 
Różnice we wra żliwości między płciami mo żna oszacowa ć statystycznie 
z wykorzystaniem np. tablicy rozk ładu chi-kwadrat χ 2 -r × 2. W razie 
konieczno ści przeżycie larw i średnią suchą masę larwy na naczynie nale ży 
określić po 10 dniach.  
43. Warto ści stężeń powoduj ące zmiany, wyra żone w suchej masie, nale ży 
obliczyć w miarę możliwości w oparciu o zmierzone st ężenia substancji 
w osadzie na pocz ątku badania (zob. pkt 38).  
44. Aby obliczy ć oszacowanie punktowe dla EC  50 i innych EC  x , jako praw ­
dziwe replikaty mo żna wykorzystywa ć dane statystyczne dotycz ące poszcze ­
gólnych naczy ń. Przy wyliczaniu przedzia łu ufności dla EC  x należy 
uwzględnić zmienno ść między naczyniami lub nale ży wykaza ć, że zmien­
ność ta jest tak niewielka, że można ją pominąć. Jeżeli model zosta ł dopa­
sowany przy u życiu metody najmniejszych kwadratów, do danych staty ­
stycznych dotycz ących poszczególnych naczy ń należy zastosowa ć prze­
kształcenie, aby poprawi ć jednorodno ść wariancji. Warto ści EC  x należy 
jednak liczy ć po przekszta łceniu odpowiedzi z powrotem do warto ści pier­
wotnej.  
45. W przypadku gdy analiza statystyczna ma na celu okre ślenie warto ści 
NOEC/LOEC przez zastosowanie badania hipotezy statystycznej, nale ży 
wziąć pod uwag ę zmienno ść między naczyniami, np. przez zastosowanie 
zagnieżdżonej analizy wariancji. Ewentualnie w przypadkach, w których 
występują naruszenia zwyk łych założeń analizy wariancji, odpowiednie 
mogą być bardziej odporne testy (21).  
Współczynnik wyl ęgu 
46. W przypadku gdy oczekuje si ę monotonicznej zale żności dawka-odpowied ź, 
a dane te s ą spójne z tym oczekiwaniem, wspó łczynniki wyl ęgu, które s ą 
danymi dwuwarto ściowymi, mo żna zanalizowa ć z użyciem testu 
Cochrana-Armitage’a stosowanego na zasadzie krokowej wstecznej. W innym przypadku mo żna zastosowa ć test dok ładny Fishera lub test 
Mantela-Haenszela z granicznym poziomem istotno ści skorygowanym 
metodą Bonferroniego-Holma. Je śli są dowody na wi ększą zmienno ść 
między replikatami w ramach tego samego st ężenia, niż wskazywa łby na 
to rozkład dwumianowy (co okre śla się często jako zmienno ść większą niż 
zmienność w rozk ładzie dwumianowym), wówczas nale ży zastosowa ć 
odporny test Cochrana-Armitage’a lub test dok ładny Fishera, tak jak propo ­
nuje się w pozycji (21) w bibliografii.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Suma kuczmanów wyl ęgniętych na ka żde naczynie, n  e , jest okre ślana 
i dzielona przez liczb ę wprowadzonych larw, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
gdzie:  
ER = wspó łczynnik wyl ęgu, 
n e = liczba wyl ęgniętych kuczmanów na ka żde naczynie,  
n a = liczba wprowadzonych larw na ka żde naczynie.  
47. Najw łaściwszą alternatyw ą w przypadku du żych próbek, w których wyst ę­
puje wariancja wi ększa niż wariancja w rozk ładzie dwumianowym, jest 
traktowanie wspó łczynnika wyl ęgu jako zmiennej ci ągłej i stosowanie takich 
procedur jak test Williama, gdy oczekuje si ę monotonicznej zale żności 
dawka-odpowied ź i oczekiwanie to jest zgodne z danymi dotycz ącymi 
współczynnika wyl ęgu. Jeśli założenie dotycz ące monotoniczno ści nie jest 
spełnione, odpowiedni by łby test Dunnetta. Uznaje si ę, że próbka jest du ża, 
gdy zarówno liczba wyl ęgniętych kuczmanów, jak i liczba larw, z których 
one nie powsta ły, przekracza pi ęć na każde naczynie stanowi ące replikat.  
48. Aby zastosowa ć metody analizy wariancji, warto ści współczynnika wyl ęgu 
należy najpierw przekszta łcić, stosując przekszta łcenie pierwiastkowe 
i arcsin lub przekszta łcenie Freemana-Tukeya w celu otrzymania przybli żo­
nego normalnego rozk ładu i wyrównania wariancji. Przy u życiu częstości 
bezwzględnej można zastosowa ć test Cochrana-Armitage’a, test dok ładny 
Fishera (z korekt ą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela. Przekszta ł­
cenie pierwiastkowe i arcsin stosuje si ę przez wyznaczenie funkcji 
odwrotnej wzgl ędem sinusa (sin  –1 ) pierwiastka wspó łczynnika wyl ęgu. 
49. W przypadku wspó łczynników wyl ęgu warto ści EC  x oblicza si ę, stosując 
analizę regresji (lub np. analiz ę probitow ą (22), logitow ą, analizę Weibulla, 
odpowiednie oprogramowanie komercyjne itd.). Je śli analiza regresji 
zawodzi (np. w przypadku gdy wyst ępują mniej ni ż dwie częściowe odpo ­
wiedzi), stosuje si ę inne metody nieparametryczne, takie jak średnia 
krocząca lub prosta interpolacja.  
Współczynnik rozwoju  
50. Średnia czasu rozwoju to średni czas od wprowadzenia larw (dzie ń 0 bada­
nia) do wyl ęgu kuczmanów tworz ących kohort ę badaną (w celu policzenia 
rzeczywistego czasu rozwoju nale ży uwzględnić wiek larw w chwili wpro ­
wadzenia). Wspó łczynnik rozwoju stanowi odwrotno ść czasu rozwoju (jed ­
nostka: 1/dzie ń) i przedstawia t ę część rozwoju larwy, która nast ępuje 
każdego dnia. Do celów oceny omawianych bada ń dotyczących toksycz ­
ności w osadzie preferowany jest wspó łczynnik rozwoju, jako że jego 
wariancja jest mniejsza, jest bardziej jednorodny i bli ższy normalnemu 
rozkładowi w porównaniu z czasem rozwoju. Dlatego silne metody para ­
metryczne badania stosowa ć można raczej w odniesieniu do wspó łczynnika 
rozwoju ni ż do czasu rozwoju. Dla wspó łczynnika rozwoju jako odpowiedzi 
ciągłej można szacowa ć wartości EC  x , stosując analizę regresji (zob. np. 
(23) (24)).  
51. Do celów poni ższych bada ń statystycznych przyjmuje si ę, że liczba kucz ­
manów zaobserwowanych w dniu kontroli x wyl ęgła się w średniej arytme ­
tycznej odst ępu czasu mi ędzy dniem x a dniem x-1 (1 = d ługość odstępu 
czasowego mi ędzy kontrolami, zwykle 1 dzie ń). Średnia arytmetyczna 
współczynnika rozwoju na ka żde naczynie ( x) liczona jest wed ług następują­
cego wzoru:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
gdzie:  
x: średnia arytmetyczna wspó łczynnika rozwoju na ka żde naczynie,  
i: wska źnik odstępu czasowego mi ędzy kontrolami,  
m: maksymalna liczba odst ępów czasowych mi ędzy kontrolami,  
ƒ i : liczba kuczmanów wyl ęgniętych w odst ępie czasowym mi ędzy kontro ­
lami i, 
n e : całkowita liczba kuczmanów wyl ęgniętych na koniec do świadczenia, 
(= P ƒ i ) 
x i : współczynnik rozwoju kuczmanów wyl ęgniętych w odst ępie czasowym 
między kontrolami  i, 
x i ¼ 1 Í 
day  i Ä 1 i 
2 Î 
gdzie:  
day  i : dzień kontroli (dni od wprowadzenia),  
l i : długość odstępu czasowego mi ędzy kontrolami  i (w dniach, zwykle 1 
dzień). 
Sprawozdanie z badania  
52. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć co najmniej nast ępujące informacje:  
Substancja badana  
— cechy fizyczne i w stosownych przypadkach w łaściwości fizykoche ­
miczne (rozpuszczalno ść w wodzie, pr ężność par, wspó łczynnik 
podziału w glebie (lub w osadzie, je śli jest dost ępny), stabilno ść 
w wodzie itd.),  
— dane identyfikacyjne substancji chemicznej (nazwa zwyczajowa, nazwa 
chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny) w tym czysto ść i metoda 
analityczna oznaczania ilo ściowego substancji badanej.  
Badany gatunek  
— zwierz ęta wykorzystane w badaniu: gatunek, nazwa naukowa, źródło 
organizmów i warunki hodowli,  
— informacje dotycz ące postępowania z pakietami jaj i larwami,  
— wiek zwierz ąt badanych w chwili umieszczenia w naczyniu do badania.  
Warunki badania  
— użyty osad, tj. osad naturalny lub preparowany,  
— w przypadku osadu naturalnego – lokalizacja i opis miejsca pobrania 
próbki osadu, w tym, je śli to możliwe, historia zanieczyszczenia; charak ­
terystyka: pH, zawarto ść węgla organicznego, stosunek C/N 
i granulometria (w stosownych przypadkach),  
— przygotowanie osadu preparowanego: sk ładniki i charakterystyka 
(zawartość węgla organicznego, pH, wilgotno ść itd. na pocz ątku bada­
nia), 
— przygotowanie wody do badania (je śli stosowana jest woda regenero ­
wana) i jej charakterystyka (st ężenie tlenu, pH, przewodno ść właściwa, 
twardość itd. na pocz ątku badania),  
— głębokość warstwy osadu i warstwy wody powy żej, 
— objętość warstwy wody powy żej osadu i wody porowej; masa mokrego 
osadu z wod ą porową i bez niej,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— naczynia do badania (materia ł i wielko ść), 
— metoda wzbogacania osadu: u żyte stężenia badane, liczba replikatów 
i użyty rozpuszczalnik, je śli go zastosowano,  
— faza stabilizacji i równowagi uk ładu wzbogacony osad-woda: czas 
trwania i warunki,  
— warunki inkubacji: temperatura, cykl i nat ężenie oświetlenia, napowiet ­
rzanie (cz ęstotliwość i natężenie),  
— szczegó łowe informacje o żywieniu, w tym rodzaj pokarmu, przygoto ­
wanie, schemat żywienia i ilo ść pokarmu.  
Wyniki  
— nominalne st ężenia badane, zmierzone st ężenia badane i wyniki wszyst ­
kich analiz ustalaj ących stężenia substancji badanej w naczyniach do 
badań, 
— jakość wody w naczyniach do badania, tj. pH, temperatura, rozpusz ­
czony tlen, twardo ść i zawarto ść amoniaku,  
— uzupe łnienie wyparowanej wody do badania, je śli nastąpiło, 
— liczbę wylęgniętych męskich i żeńskich kuczmanów na ka żde naczynie 
na każdy dzień, 
— liczba larw, z których nie nie wyl ęgły się kuczmany, na ka żde naczynie,  
— w stosownych przypadkach, średnia sucha masa larw na ka żde naczynie 
do badania i na ka żde stadium larwalne,  
— odsetek wyl ęgniętych kuczmanów na ka żdy replikat i na ka żde stężenie 
substancji badanej (samice i samce kuczmanów łącznie),  
— średni wspó łczynnik rozwoju w pe łni wylęgniętych kuczmanów na 
każdy replikat i wspó łczynnik poddania dzia łaniu substancji badanej 
(samice i samce kuczmanów łącznie),  
— oszacowania toksycznych punktów ko ńcowych, np. EC  x (i powiązane 
przedziały ufności), warto ść stężenia, przy którym nie obserwuje si ę 
szkodliwych zmian (NOEC), lub najni ższe stężenie, przy którym obser ­
wuje się szkodliwe zmiany (LOEC) oraz metody statystyczne u żyte 
w celu ich okre ślenia,  
— omówienie wyników, w tym ewentualny wp ływ na wynik badania 
będący skutkiem odst ępstw od niniejszej metody badawczej.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. M. Streloke i H. Köpp (red.). Berlin 1995.
 
(2) Fleming R i in . (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Sprawozdanie ko ńcowe dla Komisji Europejskiej. Nr sprawoz ­
dania: EC 3738. Sierpie ń 1994. WRc, Zjednoczone Królestwo.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Materia ły 
z warsztatów WOSTA zorganizowanych w Niderlandach.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Inverteb ­
rates. pp 1125-1241. W: ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Tom 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechno ­
logy; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Sprawozdanie SPE 1/RM/32. Grudzie ń 
1997.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Wyd. 
drugie. EPA 600/R-99/064. Marzec 2000. Zmiana wydania pierwszego z czerwca 1994 r.
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 23.
 
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with 
a Reference Toxicant. Sprawozdanie EPS 1/RM/30. Wrzesie ń 1995 r.  
(14) Metoda badawcza C.8 z niniejszego za łącznika: Toksyczno ść dla dżdżow­
nic. 
(15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
(16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 
3291–3303.  
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096–1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics, 20: 482–491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 
103–117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics, 28: 510–531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling conti ­
nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Dla celów niniejszej metody badawczej stosowane s ą następujące definicje:  
Osad preparowany  lub regenerowany, sztuczny lub syntetyczny, stanowi 
mieszanin ę materiałów używaną do naśladowania sk ładników fizycznych natu ­
ralnego osadu.  
Warstwa wody powy żej osadu  to woda, któr ą zalano osad w naczyniu do 
badania.  
Woda porowa  to woda wype łniająca przestrze ń między cząstkami osadu i gleby.  
Osad wzbogacony  to osad, do którego dodano substancj ę badaną. 
Badana substancja chemiczna:  każda substancja lub mieszanina badana za 
pomocą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Dodatek 2  
Zalecenia dotycz ące hodowli  Chironomus riparius  
1. Larwy ochotki ( Chironomus ) można hodowa ć w naczyniach krystalizacyj ­
nych lub wi ększych zbiornikach. Na dnie zbiornika rozprowadza si ę drobny 
piasek kwarcowy, tworz ąc cienką warstwę grubości od 5 do 10 mm. Odpo ­
wiednim substratem okaza ła się także ziemia okrzemkowa (np. Merck, Art 
8117), w przypadku której wystarczaj ąca jest cie ńsza warstwa grubo ści 
najwyżej kilku milimetrów. Nast ępnie dodaje si ę odpowiedni ą wodę na 
głębokość kilku centymetrów. Poziomy wody nale ży uzupełniać, aby 
wyrównać stratę spowodowan ą parowaniem i zapobiec wysychaniu. Wod ę 
w razie konieczno ści można zastępować. Należy zapewni ć delikatne napo ­
wietrzanie. Naczynia do chowu larw nale ży przechowywa ć w odpowiedniej 
klatce, aby zapobiec ucieczce wyl ęgniętych osobników doros łych. Klatka 
powinna by ć na tyle du ża, by umo żliwić rojenie wyl ęgniętych osobników 
dorosłych, inaczej mo że nie dojść do kopulacji (co najmniej ok. 30 × 30 × 
30 cm).  
2. Klatki powinny by ć trzymane w temperaturze pokojowej lub 
w pomieszczeniu o sta łych warunkach środowiska w temperaturze 20 
± 2 °C z fotoperiodem wynosz ącym 16 godzin światła (o natężeniu ok. 
1 000 luksów) i 8 godzin ciemno ści. Odnotowywano, że wilgotno ść 
powietrza mniejsza ni ż 60 % RH mo że przeszkodzi ć rozmnażaniu.  
Woda do rozcie ńczania  
3. Można stosowa ć każdy rodzaj wody naturalnej lub syntetycznej. 
Powszechnie stosowana jest woda gruntowa, odchlorowana woda wodoci ą­
gowa i sztuczne po żywki (np. po żywka Elendta „M4” lub „M7”, zob. tak że 
poniżej). Woda przed u życiem powinna by ć napowietrzona. W miar ę 
potrzeby woda do hodowli mo że być odnawiana przez ostro żne odlewanie 
lub wypłukiwanie zu żytej wody z naczy ń hodowlanych bez niszczenia 
oprzędów larw.  
Karmienie larw  
4. Larwy  Chironomus  należy karmić pokarmem w p łatkach dla ryb (Tetra 
Min®, Tetra Phyll® lub innej marki pokarmem dla ryb) w ilo ści ok. 250 
mg na ka żde naczynie na dzie ń. Można go podawa ć w postaci suchego 
mielonego proszku lub jako zawiesin ę w wodzie: 1 g pokarmu 
w płatkach dodaje si ę do 20 ml wody do rozcie ńczenia i rozdrabnia si ę 
do uzyskania jednorodnej mieszanki. Preparat ten mo żna stosowa ć jako 
pokarm w ilo ści ok. 5 ml na ka żde naczynie na dzie ń (przed u życiem 
wstrząsnąć). Starsze larwy mog ą dostawać go więcej. 
5. Żywienie dostosowuje si ę do jakości wody. Je śli pożywka do hodowli staje 
się mętna, nale ży ograniczy ć karmienie. Podawanie pokarmu nale ży 
starannie monitorowa ć. Zbyt ma ła ilość pożywienia spowoduje migracj ę 
larw w kierunku s łupa wody, a zbyt du ża wywoła zwiększoną aktywno ść 
drobnoustrojów i zmniejszone st ężenie tlenu. Oba rodzaje warunków mog ą 
spowodowa ć ograniczenie wspó łczynnika wzrostu.  
6. Przy przygotowywaniu nowych naczy ń do hodowli mo żna też dodać 
komórki niektórych gatunków zielenic (np.  Scenedesmus subspicatus , Chlo­
rella vulgaris ). 
Karmienie wyl ęgniętych osobników doros łych 
7. Niektórzy badacze sugeruj ą, by do karmienia wyl ęgniętych osobników doro ­
słych używać tamponu z we łny bawe łnianej nas ączonego nasyconym 
roztworem sacharozy.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Wylęg osobników doros łych 
8. Przy temperaturze 20 ± 2 °C po ok. 13–15 dniach w naczyniach do hodowli 
z larw wyl ęgną się osobniki doros łe. Samce łatwo zidentyfikowa ć dzięki 
pierzastym czu łkom.  
Pakiety jaj  
9. Po tym, jak osobniki doros łe pojawią się w klatce hodowlanej, nale ży trzy 
razy w tygodniu sprawdza ć we wszystkich naczyniach do chowu larw, czy 
nie zostały złożone galaretowate pakiety jaj. Je śli tak, nale ży je ostro żnie 
usunąć, a następnie przenie ść do niewielkiego naczynia zawieraj ącego 
próbkę wody używanej do hodowli. Pakiety jaj wykorzystuje si ę do zapo­
czątkowania hodowli w nowym naczyniu (np. od 2 do 4 pakietów jaj na 
naczynie) lub do bada ń toksyczno ści. 
10. Larwy w pierwszym stadium larwalnym powinny wyl ęgnąć się po 2–3 
dniach.  
Przygotowanie hodowli w nowych naczyniach  
11. Po tym, jak hodowle zostan ą założone, powinno by ć możliwe przygoto ­
wanie nowej hodowli larw w świeżym naczyniu raz na tydzie ń lub rzadziej, 
w zależności od wymogów badania, przy czym starsze naczynia, po wyl ęg­
nięciu się w nich doros łych kuczmanów, usuwa si ę. Stosując ten układ, 
uzyskuje si ę stałą podaż dorosłych osobników przy zminimalizowaniu 
zarządzania.  
Przygotowanie roztworów testowych „M4” i „M7”  
12. Pożywka „M4” zosta ła opisana przez Elendta (1990). Po żywkę „M7” przy ­
gotowuje si ę jak pożywkę „M4”, z wyj ątkiem substancji wskazanych 
w tabeli 1, których st ężenie w „M7” jest czterokrotnie mniejsze ni ż 
w „M4”. Publikacja na temat po żywki „M7” znajduje si ę 
w przygotowaniu (Elendt, informacje w łasne). Roztwór testowy nie powi ­
nien być przygotowywany zgodnie z instrukcjami Elendta i Biasa (1990), 
ponieważ stężenia NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 oraz K  2 HPO  4 podane 
dla przygotowania roztworów podstawowych nie s ą odpowiednie.  
Przygotowanie po żywki „M7”  
13. Każdy roztwór podstawowy (I) przygotowuje si ę oddzielnie, a z roztworów 
podstawowych (I) przygotowuje si ę łączony roztwór podstawowy (II) (zob. 
tabela 1). Pi ęćdziesiąt ml łączonego roztworu podstawowego (II) oraz 
podane w tabeli 2 ilo ści każdego roztworu podstawowego makrosk ładnika 
odżywczego dope łnia się do 1 litra wod ą dejonizowan ą, aby przygotowa ć 
pożywkę „M7”. Roztwór podstawowy witamin przygotowuje si ę przez 
dodanie trzech witamin do wody dejonizowanej, jak wskazano w tabeli 3. Do końcowej po żywki „M7” na krótko przed u życiem dodaje si ę 0,1 ml 
łączonego roztworu podstawowego witamin (roztwór podstawowy witamin 
przechowuje si ę zamrożony w ma łych podwielokrotno ściach.) Po żywka jest 
napowietrzana i stabilizowana.
 
BIBLIOGRAFIA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 
1995.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Tabela 1  
Roztwory podstawowe pierwiastków śladowych dla po żywek M4 i M7  
Roztwory podstawowe (I) Ilość (mg) dope ł­
niana do 1 litra 
wodą dejonizo ­
waną W celu przygotowania łączonego 
roztworu podstawowego (II): zmie ­
szać następujące ilości (ml) 
roztworów podstawowych (I) 
i dopełnić do 1 litra wod ą dejonizo ­
waną Końcowe stężenia w roztworach 
testowych (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Te substancje ró żnią się w przypadku M4 i M7, jak okre ślono wyżej. 
( 2 ) Roztwory te s ą przygotowywane oddzielnie, nast ępnie zlewane razem i niezw łocznie autoklawowane.  
Tabela 2  
Roztwory podstawowe makrosk ładników od żywczych w przypadku po żywek M4 i M7  
Ilość (mg) dope łniana 
do 1 litra wod ą 
dejonizowan ą Ilość (ml/l) roztworów 
podstawowych makrosk ład­
ników od żywczych w celu 
przygotowania po żywek 
M4 i M7 Końcowe stężenia 
(mg/l) w roztworach 
testowych po żywek 
M4 i M7  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Tabela 3  
Roztwór podstawowy witamin dla po żywek M4 i M7. Wszystkie trzy roztwory witamin łączy 
się, by otrzyma ć jeden roztwór podstawowy witamin  
Ilość (mg) dope łniana 
do 1 litra wod ą dejoni­
zowaną 
(mg) Ilość (ml/l) roztworu podsta ­
wowego witamin dodawa ­
nego w celu przygotowania 
pożywek 
M4 i M7 Końcowe stężenia (mg/l) 
w roztworach testowych 
pożywek 
M4 i M7  
Hydrochlorek tiaminy 750 0,1 0,075 
Cyjanokobalamina 
(B12) 10 0,1 0,0010 
Biotyna 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAFIA  
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 
25–33.  
Elendt, B.P. i W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Dodatek 3  
PRZYGOTOWANIE OSADU PREPAROWANEGO  
Skład osadu  
Skład osadu preparowanego powinien by ć następujący: 
Składnik W łaściwości % suchej 
masy osadu  
Torf Torf z rozk ładu mchu 
torfowca (Sphagnum), 
w miar ę możliwości 
o warto ści pH równej 
5,5–6,0, bez widocznych 
pozostałości roślin, drobno 
zmielony (wielko ść cząstek 
≤ 1 mm), suszony powiet ­
rzem 4–5 
Piasek kwarcowy Wielko ść ziaren: > 50 % 
cząstek powinna mie ścić się 
w przedziale 50–200 μm. 75–76 
Glinka kaolinowa Zawarto ść kaolinitu ≥ 30 % 20 
Węgiel organiczny Skorygowana przez dodanie 
torfu i piasku 2 (± 0,5) 
Węglan wapnia CaCO  3 , sproszkowany, 
chemicznie czysty 0,05–0,1 
Woda Przewodno ść właściwa ≤ 10 
μS/cm 30–50  
Przygotowanie  
Torf suszy si ę powietrzem i mieli na drobny proszek. Zawiesin ę wymaganej 
ilości proszku torfowego w wodzie dejonizowanej przygotowuje si ę z użyciem 
wysokosprawnego urz ądzenia do homogenizacji. Warto ść pH zawiesiny koryguje 
się z użyciem CaCO  3 do poziomu 5,5 ± 0,5. W celu ustabilizowania pH 
i komponentu mikrobiologicznego zawiesin ę kondycjonuje si ę przez co najmniej 
dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie j ą mieszając. Ponownie mierzy si ę 
pH, którego warto ść powinna wynosi ć 6,0 ± 0,5. Nast ępnie zawiesin ę torfową 
miesza si ę z innymi sk ładnikami (piaskiem i glink ą kaolinow ą) oraz wod ą dejo­
nizowaną, aby otrzyma ć jednorodny osad z zawarto ścią wody w przedziale 
30–50 procent suchej masy osadu. Warto ść pH końcowej mieszaniny ponownie 
mierzy si ę i koryguje w miar ę potrzeby za pomoc ą CaCO  3 do poziomu 6,5 do 
7,5. Próbki osadu pobiera si ę, aby okre ślić suchą masę i zawarto ść węgla orga­
nicznego. Nast ępnie przed ich wykorzystaniem w badaniu toksyczno ści dla 
ochotkowatych zaleca si ę, by osad preparowany kondycjonowa ć przez siedem 
dni w tych samych warunkach, jakie panowa ć będą następnie podczas badania.  
Przechowywanie  
Suche sk ładniki do przygotowywania osadu sztucznego mog ą być przechowy ­
wane w suchym i ch łodnym miejscu w temperaturze pokojowej. Nie powinno si ę 
przechowywa ć (mokrego) osadu preparowanego przed jego u życiem w badaniu. 
Osad nale ży wykorzysta ć natychmiast po 7-dniowym okresie kondycjonowania, 
kończącym proces jego przygotowania.  
BIBLIOGRAFIA  
Rozdział C.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść dla dżdżownic.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10–20.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Dodatek 4  
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcie ńczania  
Substancja St ężenia 
Cząstki stałe < 20 mg/l 
Całkowity w ęgiel organiczny < 2 mg/l 
Niezjonizowany amoniak < 1 μg/l 
Twardość w przeliczeniu na CaCO  3 < 400 mg/l (*) 
Chlor resztkowy < 10 μg/l 
Całkowita zawarto ść pestycydów fosforoorganicznych < 50 ng/l 
Całkowita zawarto ść pestycydów chloroorganicznych 
plus polichlorowanych bifenyli < 50 ng/l 
Całkowity chlor organiczny < 25 ng/l  
(*) Należy jednak pami ętać, że jeżeli podejrzewa si ę interakcj ę między jonami powoduj ­ 
ącymi twardo ść wody a substancj ą badaną, powinna by ć stosowana woda o mniejszej 
twardości (a zatem w takim przypadku nie wolno u żywać pożywki Elendta M4).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Dodatek 5  
Wytyczne dotycz ące monitorowania wyl ęgu larw ochotkowatych  
Na szklanych zlewkach do badania umieszczono pu łapki na wyl ęgnięte kucz­
many. Pu łapki te potrzebne s ą od 20 dnia badania do zako ńczenia badania. 
Poniżej przedstawiono rysunek przedstawiaj ący przykładową pułapkę:
 
A: siatka nylonowa  
B: odwrócone kubeczki plastikowe  
C: zlewka do badania bez dzióbka  D: osiatkowane otwory do wymiany wody  
E: woda  
F: osad  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  BADANIE TOKSYCZNO ŚCI W UK ŁADZIE OSAD-WODA NA 
OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGACONEJ WODY  
WPROWADZENIE  
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 219 (OECD TG 219) (2004). 
Niniejszą metodę badawcz ą zaprojektowano, by oceni ć skutki przed łużo­
nego nara żenia na dzia łanie chemikaliów na żyjących w osadach larw  
Chironomus  sp., nale żących do rz ędu słodkowodnych muchówek. Jest ona 
oparta głównie na wytycznych BBA dotycz ących układu badawczego 
osad-woda z u życiem sztucznej gleby oraz na scenariuszu nara żenia 
w słupie wody (1). Uwzgl ędnia się w niej równie ż protokoły badania 
toksyczno ści obowiązujące dla  Chironomus riparius  i Chironomus tentans , 
które opracowano w Europie i Ameryce P łn. (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) 
i potwierdzono w badaniu mi ędzylaboratoryjnym (1) (6) (9). Mo żna także 
wykorzystywa ć inne dobrze udokumentowane gatunki ochotkowatych, np.  
Chironomus yoshimatsui  (10) (11).  
2. Scenariusz nara żenia stosowany w tej metodzie badawczej polega na wzbo ­
gacaniu wody substancj ą badaną. Wybór odpowiedniego scenariusza nara ­ 
żenia zależy od zamierzonego zastosowania badania. Scenariusz nara żenia 
w wodzie, polegaj ący na wzbogacaniu s łupa wody, s łuży do symulowania 
znoszenia cieczy roboczej w przypadku pestycydów i obejmuje pocz ątkowy 
szczyt stężenia w wodzie porowej. Jest on równie ż przydatny w odniesieniu 
do innych rodzajów nara żenia (w tym wycieków chemicznych), z wyj ątkiem 
procesów akumulacji trwaj ących dłużej niż okres badania.  
3. Substancje, które nale ży przebada ć pod kątem organizmów żyjących 
w osadach, zwykle pozostaj ą w tym uk ładzie przez d ługi czas. Organizmy 
żyjące w osadach mog ą być narażane na dzia łanie substancji kilkoma 
drogami. Wzgl ędne znaczenie danej drogi nara żenia i czas, jaki jest 
potrzebny, by przyczyni ła się ona do ogólnych skutków toksycznych, zale ży 
od fizykochemicznych w łaściwości danej substancji chemicznej. 
W przypadku substancji silnie adsorbuj ących (np. substancji o log K  ow > 
5) lub w przypadku substancji tworz ących wiązanie kowalencyjne z osadami 
znaczącą drogą narażenia może być przyjmowanie zanieczyszczonego 
pokarmu. Aby zapobiec niedoszacowaniu toksyczno ści wysokolipofilowych 
substancji, mo żna rozwa żyć zastosowanie pokarmu dodawanego do osadu 
przed wprowadzeniem substancji badanej. Aby uwzgl ędnić wszelkie 
możliwe drogi nara żenia, niniejsza metoda badawcza ukierunkowana jest 
na narażenie długoterminowe. Badanie trwa od 20 do 28 dni 
w przypadku  C. riparius  i C. yoshimatsui , a w przypadku  C. tentans  od 
28 do 65 dni. Je śli do okre ślonego celu potrzebne s ą dane krótkoterminowe, 
na przykład w celu zbadania skutków dzia łania substancji niestabilnych, po 
okresie dziesi ęciu dni mo żna usunąć dodatkowe replikaty.  
4. Mierzone punkty ko ńcowe to ca łkowita liczba wyl ęgniętych doros łych osob­
ników i czas do wyl ęgu. Jeśli potrzebne s ą dodatkowe dane krótkotermi ­
nowe, zaleca si ę, by pomiarów prze życia i wzrostu larw dokonywa ć po 
okresie dziesi ęciu dni, korzystaj ąc w stosownych przypadkach 
z dodatkowych replikatów.  
5. Zalecane jest stosowanie osadów preparowanych. Osady preparowane s ą 
korzystniejsze od osadów naturalnych z kilku wzgl ędów:  
— zmienno ść eksperymentalna jest ograniczona, poniewa ż osad preparo ­
wany stanowi odtwarzaln ą „zestandaryzowan ą matrycę”, tak że wyeli­
minowana zostaje potrzeba znalezienia źródeł niezanieczyszczonego 
i czystego osadu,  
— badania mo żna rozpocz ąć w każdej chwili, unikaj ąc zmienno ści sezo­
nowej badanego osadu, i nie jest konieczna wst ępna obróbka osadu 
w celu usuni ęcia rodzimej fauny; stosowanie osadu preparowanego 
zmniejsza tak że koszty zwi ązane ze zbieraniem w terenie dostatecznych 
ilości osadu na potrzeby rutynowych bada ń, ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— zastosowanie osadu preparowanego umo żliwia porównanie toksyczno ści 
i stosown ą klasyfikacj ę substancji: dane dotycz ące toksyczno ści 
pochodzące z bada ń z osadami naturalnymi i sztucznymi by ły porów­
nywalne dla kilku substancji chemicznych (2).  
6. Definicje s ą zamieszczone w dodatku 1.  
ZASADA BADANIA  
7. Larwy ochotkowatych w pierwszym stadium larwalnym poddawane s ą dzia­ 
łaniu substancji badanej w ró żnych stężeniach w uk ładach osad-woda. 
Badanie rozpoczyna si ę od umieszczenia larw w pierwszym stadium 
larwalnym w zlewkach do badania zawieraj ących układ osad-woda, 
a następnie wzbogaca si ę wodę w substancj ę badaną. Na końcu badania 
mierzy si ę współczynnik wyl ęgu i rozwoju ochotkowatych. W miar ę 
potrzeby prze życie i masa larw mog ą być także mierzone po 10 dniach (z 
wykorzystaniem w stosownych przypadkach dodatkowych replikatów). 
Dane te analizowane s ą przy użyciu modelu regresji w celu oszacowania 
stężenia, które spowodowa łoby zmniejszenie wyl ęgu, przeżycia lub wzrostu 
larw o x % (np. EC  15 , EC  50 itd.) albo przez testowanie hipotez statystycz ­
nych w celu okre ślenia stężenia, przy którym nie obserwuje si ę szkodliwych 
zmian (NOEC), lub najni ższego stężenia, przy którym obserwuje si ę szkod­
liwe zmiany (LOEC). To ostatnie wymaga porównania warto ści zmian 
z wartościami kontrolnymi z u życiem bada ń statystycznych.  
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ  
8. Nale ży znać rozpuszczalno ść substancji badanej w wodzie, pr ężność par, 
podział substancji w osadzie oraz jej stabilno ść w wodzie i osadzie, uzys ­
kane w wyniku pomiarów lub oblicze ń. Powinna by ć dostępna wiarygodna 
metoda analityczna do oznaczania ilo ściowego substancji badanej w osadzie, 
wodzie porowej i warstwie wody powy żej osadu ze znan ą 
i udokumentowan ą dokładnością oraz granic ą wykrywalno ści. Użyteczne 
informacje obejmuj ą wzór strukturalny i czysto ść substancji badanej. Do 
przydatnych informacji nale żą także dane dotycz ące chemicznych losów 
substancji w środowisku (np. jej rozpraszanie, rozk ład abiotyczny 
i biotyczny itd.). Dalsze wskazówki dotycz ące badania substancji 
o własnościach fizykochemicznych utrudniaj ących ich badanie podano 
w pozycji (12) w bibliografii.  
SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
9. Substancje odniesienia mog ą być okresowo badane dla zagwarantowania, że 
protokół i warunki badania s ą rzetelne. Przyk łady substancji toksycznych 
stosowanych z powodzeniem w badaniach mi ędzylaboratoryjnych 
i walidacyjnych: lindan, trifluralina, pentachlorofenol, chlorek kadmu 
i chlorek potasu (1) (2) (5) (6) (13).  
WAŻNOŚĆ BADANIA  
10. Aby badanie by ło ważne, obowi ązują następujące warunki:  
— odsetek wyl ęgniętych osobników doros łych w próbach kontrolnych musi 
na końcu badania by ć co najmniej na poziomie 70 % (1) (6),  
— w naczyniach zawieraj ących próby kontrolne wyl ęg osobników doro ­
słych C. riparius  i C. yoshimatsui  z larw powinien nast ąpić między 
12. a 23. dniem od ich wprowadzenia do naczynia; w przypadku  C. 
tentans  niezbędny jest okres od 20 do 65 dni,  
— na ko ńcu badania nale ży zmierzy ć wartość pH oraz st ężenie rozpusz ­
czonego tlenu w ka żdym naczyniu. St ężenie tlenu powinno wynosi ć co 
najmniej 60 % warto ści nasycenia powietrzem (ASV) w wybranej 
temperaturze, a warto ść pH w warstwie wody powy żej osadu powinna 
we wszystkich naczyniach u żywanych do badania znajdowa ć się 
w przedziale 6–9,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— temperatura wody nie powinna ró żnić się o więcej niż ± 1,0 °C. Tempe ­
raturę wody mo żna kontrolowa ć przy użyciu pomieszczenia izotermicz ­
nego i w takim przypadku temperatura pomieszczenia powinna by ć 
potwierdzana w stosownych odst ępach czasowych.  
OPIS METODY  
Naczynia u żywane do badania  
11. Badanie prowadzone jest w szklanych zlewkach o pojemno ści 600 ml 
i średnicy 8 cm. Inne naczynia tak że mogą nadawać się do badania, 
powinny jednak zapewnia ć odpowiedni ą głębokość warstwy osadu 
i warstwy wody powy żej. Powierzchnia osadu powinna by ć wystarczaj ąca, 
by zapewni ć od 2 do 3 cm  2 na larwę. Stosunek g łębokości warstwy osadu 
do warstwy wody powy żej powinien wynosi ć 1:4. Naczynia do badania 
i inne przyrz ądy mające kontakt z uk ładem badawczym powinny by ć 
w całości wykonane ze szk ła lub innego chemicznie oboj ętnego materia łu 
(np. teflonu).  
Wybór gatunków  
12. Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu powinien by ć w miarę możliwości 
Chironomus riparius . Odpowiedni jest tak że Chironomus tentans , ale jest 
trudniejszy w hodowli i wymaga d łuższego okresu badania. Mo żna także 
korzystać z Chironomus yohimatsui.  Szczegó ły metod hodowli dla  Chiro­
nomus riparius  podano w dodatku 2. Informacje dotycz ące warunków 
hodowli s ą także dostępne dla innych gatunków, tj.  Chironomus tentans  
(4) i Chironomus yoshimatsui  (11). Przed przeprowadzeniem badania nale ży 
potwierdzi ć identyfikacj ę gatunków, ale nie jest to wymagane przed ka żdym 
badaniem, je śli organizmy pochodz ą z hodowli wewn ątrzlaboratoryjnej.  
Osad  
13. W miar ę możliwości należy stosowa ć osad preparowany (zwany tak że 
osadem regenerowanym, sztucznym lub syntetycznym). Je śli jednak 
korzysta si ę z osadu naturalnego, nale ży go scharakteryzowa ć (co najmniej 
pod kątem pH, zawarto ści węgla organicznego, zaleca si ę także określenie 
innych parametrów, takich jak stosunek C/N i granulometria). Osad taki powinien by ć wolny od zanieczyszcze ń i innych organizmów, które 
mogłyby konkurowa ć z ochotkowatymi lub je zjada ć. Zaleca si ę także, by 
przed jego wykorzystaniem w badaniu toksyczno ści dla ochotkowatych 
naturalny osad by ł przez siedem dni kondycjonowany w tych samych 
warunkach, jakie panowa ć będą następnie podczas badania. Do wykorzys ­
tania w tym badaniu (1) (15) (16) zaleca si ę następujący osad preparowany 
oparty na sztucznej glebie stosowanej w metodzie badawczej C.8 (14):
 
a) torf 4–5 % (w przeliczeniu na such ą masę): wartość pH możliwie najbar ­
dziej zbli żona do przedzia łu 5,5 do 6,0; wa żne jest, by stosowa ć torf 
w postaci sproszkowanej, drobno zmielony (wielko ść cząstek ≤ 1 mm) 
i suszony wy łącznie powietrzem;  
b) glinka kaolinowa 20 % (w przeliczeniu na such ą masę) (zawarto ść kaoli­
nitu w miar ę możliwości powyżej 30 %);  
c) piasek kwarcowy 75–76 % (w przeliczeniu na such ą masę) (powinien 
przeważać drobny piasek, w którym ponad 50 % cz ąstek mierzy od 50 
do 200 μm); 
d) dla uzyskania wilgotno ści końcowej mieszkanki na poziomie od 30-50 % 
dodaje się wodę dejonizowan ą; 
e) w celu skorygowania pH ko ńcowej mieszanki osadu do warto ści 7,0 
± 0,5 dodaje si ę do niej chemicznie czysty w ęglan wapnia (CaCO  3 ); 
f) zawarto ść węgla organicznego w ko ńcowej mieszance powinna wynosi ć 
2 % (± 0,5 %) i nale ży ją skorygowa ć przy użyciu odpowiednich ilo ści 
torfu i piasku, zgodnie z lit. a) i c).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. Źródło torfu, glinki kaolinowej i piasku powinno by ć znane. Sk ładniki 
osadu nale ży sprawdzi ć pod kątem zanieczyszczenia chemicznego (np. 
metalami ci ężkimi, zwi ązkami chloroorganicznymi, zwi ązkami fosforoorga ­
nicznymi itp.). W dodatku 3 podano przyk ładowy sposób przygotowania 
osadu preparowanego. Dopuszczalne jest tak że mieszanie suchych sk ładni­
ków, o ile wyka że się, że po dodaniu warstwy wody powy żej osadu sk ład­
niki osadu si ę nie rozdzielaj ą (np. nie unosz ą się cząstki torfu) oraz że torf 
lub osad jest poddawany dostatecznemu kondycjonowaniu.  
Woda  
15. Jako wod ę do badania mo żna stosowa ć każdy rodzaj wody, której charak ­
terystyka zgodna jest z charakterystyk ą chemiczn ą wody nadaj ącej się do 
rozcieńczania, jak opisano w dodatkach 2 i 4. Do hodowli ochotkowatych 
i do badania mo że służyć każdy odpowiedni rodzaj wody, np. woda natu ­
ralna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenerowana (zob. dodatek 2) lub odchlorowana woda wodoci ągowa, pod warunkiem że ochotkowate 
przeżyją w niej przez okres hodowli i badania bez wykazywania oznak 
stresu. Na pocz ątku badania warto ść pH wody do badania powinna wynosi ć 
od 6 do 9, a twardo ść ogółem wody w przeliczeniu na CaCO
 3 nie powinna 
być wyższa niż 400 mg/l. Je śli jednak podejrzewa si ę, że między jonami 
powodującymi twardo ść wody a substancj ą badaną dochodzi do interakcji, 
powinna by ć stosowana woda o mniejszej twardo ści (a zatem w takim 
przypadku nie wolno u żywać pożywki Elendta M4). Przez okres ca łego 
badania nale ży stosowa ć ten sam rodzaj wody. Cechy jako ści wody, wymie ­
nione w dodatku 4, nale ży mierzyć co najmniej dwa razy w roku lub ilekro ć 
zachodzi podejrzenie, że mogły one ulec znacznej zmianie.  
Roztwory podstawowe – woda wzbogacana  
16. Badane st ężenia oblicza si ę na podstawie st ężeń w słupie wody, tj. 
w warstwie wody powy żej osadu. Roztwory testowe o wybranych st ężeniach 
są zwykle przygotowywane przez rozcie ńczenie roztworu podstawowego. 
Zalecane jest przygotowanie roztworów podstawowych przez rozpuszczenie 
substancji badanej w po żywce. W niektórych przypadkach wymagane mo że 
być stosowanie rozpuszczalników lub środków dysperguj ących w celu uzys ­
kania odpowiednio st ężonego roztworu podstawowego. Przyk ładami odpo ­
wiednich rozpuszczalników s ą aceton, etanol, metanol, eter monoetylowy 
glikolu etylenowego, eter dimetylowy glikolu etylenowego, dimetylofor ­
mamid i glikol trójetylenowy. Dopuszczalne środki dysperguj ące to kremofor 
RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. St ężenie środka 
rozpuszczaj ącego w ko ńcowej po żywce powinno by ć minimalne (tj. ≤ 0,1 
ml/l) i jednakowe we wszystkich zabiegach. Gdy stosuje si ę środki rozpusz ­
czające, nie mog ą one mie ć znaczącego wpływu na prze życie ani widocz ­
nego szkodliwego dzia łania na larwy ochotkowatych, wykazanego 
w doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem. Nale ży jednak do łożyć 
wszelkich stara ń, aby unikn ąć użycia takich substancji.  
PROJEKT BADANIA  
17. Projekt badania obejmuje dobór liczby badanych st ężeń i ich zróżnicowanie, 
liczby naczy ń zawierających dane st ężenie substancji i liczby larw na jedno 
naczynie. Opisano projekty dotycz ące punktowego oszacowania warto ści 
EC, oszacowania warto ści NOEC i przeprowadzenia badania granicznego. 
Zaleca si ę raczej analiz ę regresji ni ż podejście oparte na badaniu hipotez.  
Projekt analizy regresyjnej  
18. Stężenie efektywne (np. EC  15 , EC  50 ) i zakres st ężeń, powyżej którego skutki 
działania substancji badanej staj ą się przedmiotem zainteresowania, nale ży 
wyskalowa ć z zastosowaniem st ężeń ujętych w badaniu. Na ogó ł dokład­
ność, a zwłaszcza wa żność, z jakimi mo żna dokona ć oceny st ężeń efektyw­
nych (EC  x ), są wyższe, gdy st ężenie efektywne mie ści się w zakresie bada ­
nych stężeń. Należy unikać ekstrapolowania wyników znacznie poni żej ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
najniższego stężenia dającego wynik dodatni lub powy żej najwy ższego 
stężenia. Wst ępne badanie ustalaj ące zakres jest pomocne przy wyborze 
zakresu st ężeń do zastosowania (zob. pkt 27).  
19. Jeśli trzeba oszacowa ć EC  x , należy zbadać co najmniej pi ęć stężeń i trzy 
replikaty dla ka żdego stężenia. W ka żdym przypadku zaleca si ę stosowanie 
dostatecznych st ężeń substancji badanej, aby umo żliwić dobre oszacowanie 
parametrów modelu. Wspó łczynnik odst ępów między stężeniami nie powi ­
nien być większy niż dwa (z wyj ątkiem przypadków, gdy krzywa 
dawka-odpowied ź ma łagodny przebieg). Liczba replikatów przy ka żdym 
podaniu dawki substancji badanej mo że być zmniejszona, je śli zwiększy 
się liczbę stężeń substancji badanej daj ących różne odpowiedzi. Zwi ększenie 
liczby replikatów lub zmniejszenie wielko ści odstępów między badanymi 
stężeniami zwykle prowadzi do zw ężenia przedzia łów ufności dla danego 
badania. Je śli celem jest oszacowanie prze życia i wzrostu larw w okresie 10 
dni, wymagane s ą dodatkowe replikaty.  
Projekt dotycz ący oszacowania NOEC/LOEC  
20. Jeśli celem jest oszacowanie warto ści LOEC/NOEC, nale ży zastosowa ć pięć 
stężeń substancji badanej z co najmniej czterema replikatami, 
a współczynnik odst ępów między stężeniami nie powinien by ć większy 
niż dwa. Liczba replikatów powinna by ć na tyle du ża, by zapewni ć odpo­
wiednią moc statystyczn ą dla wykrycia 20 % ró żnicy z prób ą kontrolną przy 
istotności wynosz ącej 5 % (p = 0,05). W przypadku wspó łczynnika rozwoju 
zwykle stosowna jest analiza wariancji (ANOVA), np. badanie Dunnetta i badanie Williamsa (17) (18) (19) (20). W przypadku wspó łczynnika 
wylęgu można stosowa ć test Cochrana-Armitage’a, test dok ładny Fishera 
(z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela.
 
Badanie graniczne  
21. Jeśli we wst ępnym badaniu ustalaj ącym zakres nie zaobserwowano żadnych 
zmian, mo żna przeprowadzi ć badanie graniczne (jedno st ężenie badane 
i jedna próba kontrolna). Celem badania granicznego jest pokazanie, że 
toksyczno ść substancji badanej jest wi ększa niż zbadane st ężenie graniczne. 
W ramach niniejszej metody badawczej nie mo żna zaproponowa ć zaleca­
nego stężenia; kwesti ę tę pozostawia si ę uznaniu organów regulacyjnych. 
Zazwyczaj koniecznych jest co najmniej 6 replikatów zarówno dla próby poddawanej dzia łaniu substancji, jak i dla próby kontrolnej. Nale ży wykaza ć 
odpowiedni ą moc statystyczn ą, która pozwala wykry ć 20 % ró żnicę 
w porównaniu z prób ą kontroln ą przy 5 % poziomie istotno ści (p = 0,05). 
Przy odpowiedzi metrycznej (wspó łczynnik rozwoju i masa) odpowiedni ą 
metodą statystyczn ą jest test t-Studenta, je śli dane spe łniają warunki tego 
testu (normalno ść rozkładu zmiennych, jednorodno ść wariancji). Je śli te 
warunki nie s ą spełnione, mo żna zastosowa
ć test t-Studenta dla nierównych 
wariancji lub test nieparametryczny, np. test Manna-Whitneya-Wilcoxona. W przypadku wspó łczynnika wyl ęgu odpowiedni jest test dok ładny Fishera.
 
PROCEDURA  
Warunki nara żenia na dzia łanie substancji  
Przygotowanie uk ładu woda wzbogacona-osad  
22. Do naczy ń do badania dodaje si ę odpowiednie ilo ści preparowanego osadu 
(zob. pkt 13–14 oraz dodatek 3), aby powsta ła warstwa o grubo ści co 
najmniej 1,5 cm. Wod ę dodaje si ę do głębokości 6 cm (zob. pkt 15). 
Stosunek g łębokości warstwy osadu do warstwy wody nie powinien prze ­
kraczać 1:4, a warstwa osadu nie powinna by ć wyższa niż 3 cm. Przed 
dodaniem organizmów badanych uk ład osad-woda nale ży delikatnie napo ­
wietrzać przez siedem dni (zob. pkt 14 oraz dodatek 3). Podczas dodawania 
badanej wody do s łupa wody nad osadem, aby unikn ąć oddzielenia sk ład­
ników osadu i ponownego zawieszenia w wodzie drobnoziarnistego mate ­
riału, osad na czas zalewania mo żna nakryć plastikowym kr ążkiem, a kr ążek 
następnie od razu usun ąć. Właściwe może być także zastosowanie innych 
przyrządów. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Naczynia do badania powinny by ć przykryte (np. szklanymi p łytkami). 
W razie konieczno ści w czasie badania poziom wody uzupe łnia się do 
pierwotnej obj ętości, aby wyrówna ć brak spowodowany jej parowaniem. 
Należy w tym celu u żywać wody destylowanej lub dejonizowanej, aby 
zapobiec odk ładaniu się soli.  
Dodanie organizmów badanych  
24. Na cztery-pi ęć dni przed umieszczeniem organizmów badanych 
w naczyniach u żywanych do badania pakiety jaj nale ży wyjąć z hodowli 
i umieścić w małych naczyniach w po żywce hodowlanej. Mo żna w tym celu 
zastosowa ć pożywkę wykorzystywan ą w hodowli podstawowej lub po żywkę 
świeżo przygotowan ą. Jeśli stosowana jest ta ostatnia, do po żywki hodow ­
lanej nale ży dodać niewielk ą ilość pokarmu, np. zielenice lub kilka kropel 
filtratu z drobno zmielonej zawiesiny pokarmu w p łatkach dla ryb (zob. 
dodatek 2). Nale ży korzysta ć wyłącznie ze świeżo złożonych pakietów jaj. 
Wylęg larw zaczyna si ę przeważnie kilka dni po z łożeniu pakietów jaj (2 do 
3 dni w przypadku  Chironomus riparius  w temperaturze 20 °C oraz 1 do 4 
dni w przypadku  Chironomus tentans  w temperaturze 23 °C i  Chironomus 
yoshimatsui  w temperaturze 25 °C), a wzrost larw nast ępuje w czterech 
stadiach larwalnych, przy czym ka żde z nich trwa od 4 do 8 dni. Do 
badania nale ży stosowa ć larwy w pierwszym stadium larwalnym (2–3 lub 
1–4 dni po wyl ęgu). Stadium larwalne kuczmanów mo żna sprawdzi ć, 
stosując pomiar szeroko ści puszki g łowowej (6).  
25. Dwadzie ścia larw w pierwszym stadium larwalnym przydziela si ę losowo do 
każdego naczynia do świadczalnego zawieraj ącego osad wzbogacony i wod ę 
przy użyciu tępo zakończonej pipety. Po wprowadzeniu larw do naczy ń 
należy zatrzyma ć napowietrzanie wody i nie uruchamia ć go przez dob ę 
po ich wprowadzeniu (zob. pkt 24 i 32). Zgodnie z zastosowanym projektem badania (zob. pkt 19 i 20) w celu oszacowania punktowego EC należy zastosowa ć co najmniej 60 larw na st ężenie, a w celu oznaczenia 
wartości NOEC – 80 larw.
 
26. Dwadzie ścia cztery godziny po dodaniu larw s łup wody powy żej osadu 
wzbogacany jest w substancj ę badaną i ponownie zapewniane jest delikatne 
napowietrzanie. Ma łe ilości roztworów substancji badanej wprowadza si ę 
pod powierzchni ę wody za pomoc ą pipety. Wod ę powyżej osadu nale ży 
następnie ostro żnie zamiesza ć, tak aby go nie poruszy ć. 
Badane st ężenia 
27. Badanie ustalaj ące zakres mo że być przydatne do okre ślenia zakresu st ężeń 
dla ostatecznego badania. W tym celu stosuje si ę szereg roztworów 
o znacznie ró żniących się od siebie st ężeniach substancji badanej. Aby 
zapewnić tę samą gęstość powierzchni na ochotkowate, co stosowana 
w ostatecznym badaniu, ochotkowate poddaje si ę narażeniu na ka żde 
stężenie substancji badanej przez okres pozwalaj ący oszacowa ć odpowiednie 
jej stężenie badane i nie wymagane s ą replikaty.  
28. Decyzje dotycz ące stężeń substancji badanej w ostatecznym badaniu podej ­
muje się w oparciu o wynik badania ustalaj ącego zakres. Jak opisano w pkt 
18 do 20, nale ży zastosowa ć i wybrać co najmniej pi ęć stężeń. 
Próby kontrolne  
29. Naczynia zawieraj ące próby kontrolne bez substancji badanej, ale zawie ­
rające osad, powinny by ć uwzględnione w badaniu z odpowiedni ą liczbą 
replikatów (zob. pkt 19 i 20). Je śli do wprowadzenia substancji badanej 
został użyty rozpuszczalnik (zob. pkt 16), nale ży dodać próbę kontroln ą 
zawierającą osad z rozpuszczalnikiem.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Układ badawczy  
30. Stosowane s ą układy statyczne. W wyj ątkowych przypadkach, na przyk ład 
gdy okre ślone w specyfikacjach cechy jako ści wody stan ą się nieodpo ­
wiednie dla organizmu badanego lub narusz ą równowag ę chemiczn ą (np. 
poziomy rozpuszczonego tlenu spadn ą zbyt nisko, st ężenie produktów 
wydalania za bardzo wzro śnie lub nast ąpi uwalnianie minera łów z osadu, 
które wpłynie na warto ść pH lub twardo ść wody), mo żna stosowa ć układy 
półstatyczne lub przep ływowe z okresowym lub sta łym odnawianiem wody 
powyżej osadu. Inne metody poprawy jako ści wody powy żej osadu, np. 
napowietrzanie, zwykle jednak wystarczaj ą i należy w miar ę możliwości 
z nich korzysta ć. 
Pokarm  
31. Larwy trzeba karmi ć, w miarę możliwości codziennie lub co najmniej trzy 
razy w tygodniu. Odpowiedni do karmienia m łodych larw przez pierwsze 10 
dni wydaje si ę pokarm dla ryb (zawiesina w wodzie lub drobno zmielony 
pokarm, np. TetraMin lub TetraPhyll, zob. szczegó łowe informacje 
w dodatku 2) w ilo ści 0,25–0,5 mg (0,35–0,5 mg w przypadku  C. yoshi ­
matsui ) na larw ę dziennie. Starsze larwy mog ą potrzebowa ć nieco wi ęcej 
pokarmu: 0,5–1 mg na larw ę na dzień powinno by ć wystarczaj ącą ilością 
przez pozosta łą część badania. Je śli obserwuje si ę wzrost grzybów lub 
śmiertelno ść w próbach kontrolnych, nale ży wówczas we wszystkich 
próbach kontrolnych i do świadczalnych ograniczy ć i kontrolowa ć racje 
żywieniowe. Je śli nie można powstrzyma ć rozwoju grzybów, nale ży powtó­
rzyć badanie. Przy badaniu substancji silnie adsorbuj ących (np. o log K  ow > 
5) lub w przypadku substancji tworz ących wiązanie kowalencyjne z osadem 
ilość pokarmu niezb ędną do zapewnienia prze życia i naturalnego wzrostu 
organizmów mo żna dodać do osadu preparowanego przed okresem stabili ­
zacji. W tym celu zamiast pokarmu dla ryb nale ży stosowa ć surowiec 
roślinny, np. dodatek 0,5 % (w przeliczeniu na such ą masę) drobno zmie ­
lonych liści np. pokrzywy zwyczajnej ( Urtica dioica ), morwy bia łej (Morus 
alba), koniczyny bia łej (Trifolium repens ), szpinaku ( Spinacia oleracea ), 
można też użyć innego surowca ro ślinnego (produktu  Cerophyl  lub 
alfa-celulozy).  
Warunki inkubacji  
32. W miar ę możliwości w ciągu 24 godzin od wprowadzenia larw nale ży 
zapewnić delikatne napowietrzanie warstwy wody powy żej osadu 
w naczyniach do badania, a nast ępnie kontynuowa ć je przez ca ły okres 
badania (nale ży dopilnowa ć, by stężenie rozpuszczonego tlenu nie spad ło 
poniżej 60 % ASV). Napowietrzanie prowadzone jest z u życiem szklanej 
pipety Pasteura przytwierdzonej 2–3 cm nad warstw ą osadu (tj. w ilo ści 
jednego lub kilku b ąbli powietrza/sek.). Przy badaniu lotnych chemikaliów 
można rozwa żyć nienapowietrzanie uk ładu osad-woda.  
33. Badanie przeprowadza si ę w stałej temperaturze 20 °C (± 2 °C). Zalecane 
temperatury w przypadku  C. tentans  i C. yoshimatsui  to odpowiednio 23 °C 
i 25 °C (± 2 °C). Stosuje si ę 16-godzinny fotoperiod, a nat ężenie światła 
powinno wynosi ć od 500 do 1 000 luksów.  
Czas trwania nara żenia 
34. Czas trwania nara żenia rozpoczyna si ę od wprowadzenia larw do naczy ń 
z próbą wzbogacon ą i naczyń zawieraj ących próby kontrolne. Maksymalny 
czas trwania nara żenia wynosi 28 dni w przypadku  C. riparius  i C. yoshi ­
matsui , a w przypadku  C. tentans  65 dni. Je śli kuczmany wyl ęgną się 
wcześniej, badanie mo żna zakończyć po co najmniej pi ęciu dniach od 
wylęgu ostatniego doros łego osobnika w próbie kontrolnej.  
OBSERWACJE  
Wylęg osobników doros łych 
35. Nale ży określić czas rozwoju i ca łkowitą liczbę w pełni wylęgniętych 
samców i samic kuczmanów. Samce łatwo zidentyfikowa ć dzięki ich pierza ­
stym czułkom. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Naczynia do badania nale ży obserwowa ć co najmniej trzy razy w tygodniu 
w celu wzrokowej oceny ewentualnego nieprawid łowego zachowania (np. 
porzucanie osadu, nietypowy sposób p ływania) w porównaniu z prób ą 
kontrolną. W okresie spodziewanego wyl ęgu kuczmanów konieczne jest 
codzienne ich zliczanie. P łeć i liczbę w pełni wylęgniętych kuczmanów 
należy zapisywa ć codziennie. Po identyfikacji kuczmany usuwane s ą 
z naczyń. Pakiety jaj z łożone przed zako ńczeniem badania nale ży odnoto­
wać, a następnie usun ąć, by zapobiec ponownemu wprowadzeniu larw do 
osadu. Nale ży także odnotowa ć liczbę widocznych poczwarek, z których nie 
wylęgły się kuczmany. Wytyczne dotycz ące pomiaru wyl ęgu zawarte s ą 
w dodatku 5.  
Wzrost i prze życie 
37. Jeśli mają być dostarczone dane dotycz ące 10-dniowego prze życia i wzrostu 
larw, nale ży na pocz ątku włączyć do badania dodatkowe naczynia, by 
mogły być w tym celu wykorzystane. Aby zebra ć larwy, osad z tych dodat ­
kowych naczy ń należy przesiać, używając sita 250 μm. Kryteriami zgonu s ą 
nieruchomo ść lub brak reakcji na bodziec mechaniczny. Larwy nieodzys ­
kane nale ży także liczyć jako martwe (larwy, które pad ły na pocz ątku 
badania, mog ły zostać rozłożone przez drobnoustroje). Nale ży określić 
suchą masę (bez popio łu) larw pozosta łych przy życiu na ka żde naczynie 
do badania i obliczy ć średnią suchą masę pojedynczej larwy na ka żde 
naczynie. Przydatne jest okre ślenie, w którym stadium larwalnym znajduj ą 
się larwy pozosta łe przy życiu; w tym celu mo żna stosowa ć pomiar puszki 
głowowej ka żdego osobnika.  
Pomiary analityczne  
Stężenie substancji badanej  
38. Na pocz ątku i na ko ńcu badania trzeba przeanalizowa ć co najmniej próbki 
wody z warstwy powy żej osadu, wody porowej i osadu (najlepiej godzin ę 
po wprowadzeniu substancji badanej), przy najwy ższym stężeniu i przy 
niższym stężeniu. Takie oznaczenie st ężenia substancji badanej daje wiedz ę 
na temat zachowania/podzia łu substancji badanej w uk ładzie woda-osad. 
Pobieranie próbek osadu na pocz ątku badania mo że wpływać na układ 
badawczy (np. poprzez usuni ęcie badanych larw), a zatem do wykonywania 
oznaczeń analitycznych na pocz ątku i w trakcie badania nale ży 
w stosownych przypadkach u żywać dodatkowych naczy ń do badania (zob. 
pkt 39). Pomiary osadu mog ą nie być konieczne, je śli podział substancji 
badanej mi ędzy wodą i osadem zosta ł wyraźnie określony w badaniu wody/ 
osadu w porównywalnych warunkach (np. stosunek osadu do wody, rodzaj zastosowania, zawarto ść węgla organicznego w osadzie).
 
39. Gdy dokonuje si ę pomiarów po średnich (np. w 7. dniu) lub je śli do analizy 
potrzeba du żych próbek, których nie mo żna pobrać z naczyń do badania bez 
wpływania na uk ład badawczy, nale ży dokona ć oznaczeń analitycznych na 
próbkach pochodz ących z dodatkowych naczy ń do badania przygotowanych 
w ten sam sposób (zawieraj ących także organizmy badane), ale nie wyko ­
rzystywanych do obserwacji biologicznych.  
40. Aby oddzieli ć wodę porową, zaleca si ę odwirowanie osadu np. przy 10 000 
g w temp. 4 °C przez 30 min. Je śli jednak substancja badana nie adsorbuje 
się na filtrze, dopuszczalna jest te ż filtracja. W niektórych przypadkach 
zanalizowanie st ężeń w wodzie porowej mo że nie być możliwe, poniewa ż 
wielkość próbki jest zbyt ma ła. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Parametry fizykochemiczne  
41. Warto ść pH, st ężenie rozpuszczonego tlenu w wodzie do badania 
i temperatura w naczyniach do badania powinny by ć odpowiednio mierzone 
(zob. pkt 10). Twardo ść i zawarto ść amoniaku nale ży zmierzy ć w próbach 
kontrolnych i w jednym naczyniu do badania przy najwy ższym stężeniu na 
początku i na ko ńcu badania.  
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Opracowanie wyników  
42. Celem badania jest okre ślenie wpływu substancji badanej na wspó łczynnik 
rozwoju i ca łkowitą liczbę w pełni wylęgniętych samic i samców kucz ­
manów lub, w przypadku bada ń 10-dniowych, skutków dla prze życia 
i masy larw. Je śli nie ma wskaza ń dotyczących statystycznie istotnych 
różnic we wra żliwości osobników ka żdej płci, wyniki dotycz ące osobników 
męskich i żeńskich mog ą zostać połączone do celów analizy statystycznej. 
Różnice we wra żliwości między płciami mo żna oszacowa ć statystycznie 
z wykorzystaniem np. tablicy rozk ładu chi-kwadrat χ 2 -r x 2. W razie 
konieczno ści przeżycie larw i średnią suchą masę larwy na naczynie nale ży 
określić po 10 dniach.  
43. Warto ści stężeń powoduj ące zmiany, wyra żone jako st ężenia w wodzie 
powyżej osadu, nale ży obliczy ć w miar ę możliwości w oparciu 
o zmierzone st ężenia na pocz ątku badania (zob. pkt 38).  
44. Aby obliczy ć oszacowanie punktowe dla EC  50 i innych EC  x , jako praw ­
dziwe replikaty mo żna wykorzystywa ć dane statystyczne dotycz ące poszcze ­
gólnych naczy ń. Przy wyliczaniu przedzia łu ufności dla EC  x należy 
uwzględnić zmienno ść między naczyniami lub nale ży wykaza ć, że zmien­
ność ta jest tak niewielka, że można ją pominąć. Jeżeli model zosta ł dopa­
sowany przy u życiu metody najmniejszych kwadratów, do danych staty ­
stycznych dotycz ących poszczególnych naczy ń należy zastosowa ć prze­
kształcenie, aby poprawi ć jednorodno ść wariancji. Warto ści EC  x należy 
jednak liczy ć po przekszta łceniu odpowiedzi z powrotem do warto ści pier­
wotnej.  
45. W przypadku gdy analiza statystyczna ma na celu okre ślenie warto ści 
NOEC/LOEC przez zastosowanie badania hipotezy statystycznej, nale ży 
wziąć pod uwag ę zmienno ść między naczyniami, np. przez zastosowanie 
zagnieżdżonej analizy wariancji. Ewentualnie w przypadkach, w których 
występują naruszenia zwyk łych założeń analizy wariancji, odpowiednie 
mogą być bardziej odporne testy (21).  
Współczynnik wyl ęgu 
46. W przypadku gdy oczekuje si ę monotonicznej zale żności dawka-odpowied ź, 
a dane te s ą spójne z tym oczekiwaniem, wspó łczynniki wyl ęgu, które s ą 
danymi dwuwarto ściowymi, mo żna zanalizowa ć z użyciem testu 
Cochrana-Armitage’a stosowanego na zasadzie krokowej wstecznej. 
W innym przypadku mo żna zastosowa ć test dok ładny Fishera lub test 
Mantela-Haenszela z granicznym poziomem istotno ści skorygowanym 
metodą Bonferroniego-Holma. Je śli są dowody na wi ększą zmienno ść 
między replikatami w ramach tego samego st ężenia niż wskazywa łby na 
to rozkład dwumianowy (co okre śla się często jako zmienno ść większą 
niż zmienno ść w rozkładzie dwumianowym), wówczas nale ży zastosowa ć 
odporny test Cochrana-Armitage’a lub test dok ładny Fishera, tak jak propo ­
nuje się w pozycji (21) w bibliografii.  
47. Suma kuczmanów wyl ęgniętych na ka żde naczynie, n  e , jest okre ślana 
i dzielona przez liczb ę wprowadzonych larw, n  a : 
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
gdzie:  
ER = wspó łczynnik wyl ęgu, 
n e = liczba wyl ęgniętych kuczmanów na ka żde naczynie,  
n a = liczba wprowadzonych larw na ka żde naczynie.  
48. Najw łaściwszą alternatyw ą w przypadku du żych próbek, w których wyst ę­
puje wariancja wi ększa niż wariancja w rozk ładzie dwumianowym, jest 
traktowanie wspó łczynnika wyl ęgu jako odpowiedzi ci ągłej i stosowanie 
takich procedur jak test Williamsa, gdy oczekuje si ę monotonicznej zale ż­
ności dawka-odpowied ź i oczekiwanie to jest zgodne z danymi dotycz ącymi 
współczynnika wyl ęgu. Jeśli założenie dotycz ące monotoniczno ści nie jest 
spełnione, odpowiedni by łby test Dunnetta. Uznaje si ę, że próbka jest du ża, 
gdy zarówno liczba wyl ęgniętych kuczmanów, jak i liczba larw, z których 
się one nie wyl ęgły, przekracza pi ęć na każde naczynie stanowi ące replikat.  
49. Aby zastosowa ć metody analizy wariancji, warto ści współczynnika wyl ęgu 
należy najpierw przekszta łcić, stosując przekszta łcenie pierwiastkowe 
i arcsin lub przekszta łcenie Freemana-Tukeya w celu otrzymania przybli żo­
nego normalnego rozk ładu i wyrównania wariancji. Przy u życiu częstości 
bezwzględnej można zastosowa ć test Cochrana-Armitage’a, test dok ładny 
Fishera (z korekt ą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela. Przekszta ł­
cenie pierwiastkowe i arcsin stosuje si ę przez wyznaczenie funkcji 
odwrotnej wzgl ędem sinusa (sin  –1 ) pierwiastka wspó łczynnika wyl ęgu. 
50. W przypadku wspó łczynników wyl ęgu warto ści EC  x oblicza si ę, stosując 
analizę regresji (lub np. analiz ę probitow ą (22), logitow ą, analizę Weibulla, 
odpowiednie oprogramowanie komercyjne itd.).Je śli analiza regresji zawodzi 
(np. w przypadku gdy wyst ępują mniej ni ż dwie cz ęściowe odpowiedzi), 
stosuje si ę inne metody nieparametryczne, takie jak średnia krocz ąca lub 
prosta interpolacja.  
Współczynnik rozwoju  
51. Średnia czasu rozwoju to średni czas od wprowadzenia larw (dzie ń 0 bada­
nia) do wyl ęgu kuczmanów tworz ących kohort ę badaną (w celu policzenia 
rzeczywistego czasu rozwoju nale ży uwzględnić wiek larw w chwili wpro ­
wadzenia). Wspó łczynnik rozwoju stanowi odwrotno ść czasu rozwoju (jed ­
nostka: 1/dzie ń) i przedstawia t ę część rozwoju larwy, która nast ępuje 
każdego dnia. Do celów oceny omawianych bada ń dotyczących toksycz ­
ności w osadzie preferowany jest wspó łczynnik rozwoju, jako że jego 
wariancja jest mniejsza, jest bardziej jednorodny i bli ższy normalnemu 
rozkładowi w porównaniu z czasem rozwoju. Dlatego silne metody para ­
metryczne badania stosowa ć można raczej w odniesieniu do wspó łczynnika 
rozwoju ni ż do czasu rozwoju. Dla wspó łczynnika rozwoju jako odpowiedzi 
ciągłej można szacowa ć wartości EC  x , stosując analizę regresji (zob. np. 
(23) (24)).  
52. Do celów poni ższych bada ń statystycznych przyjmuje si ę, że liczba kucz ­
manów zaobserwowanych w dniu kontroli x wyl ęgła się w średniej arytme ­
tycznej odst ępu czasu mi ędzy dniem x a dniem x-l (1 = d ługość odstępu 
czasowego mi ędzy kontrolami, zwykle 1 dzie ń). Średnia arytmetyczna 
współczynnika rozwoju na ka żde naczynie ( x) liczona jest wed ług następują­
cego wzoru:  
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
gdzie:  
x: średnia arytmetyczna wspó łczynnika rozwoju na ka żde naczynie,  
i: wskaźnik odstępu czasowego mi ędzy kontrolami,  
m: maksymalna liczba odst ępów czasowych mi ędzy kontrolami,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : liczba kuczmanów wyl ęgniętych w odst ępie czasowym mi ędzy kontro ­
lami i,  
n e : całkowita liczba kuczmanów wyl ęgniętych na koniec do świadczenia, (= P ƒ i ) 
x i : współczynnik rozwoju kuczmanów wyl ęgniętych w odst ępie czasowym 
między kontrolami i.  
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
gdzie:  
day  i : dzień kontroli (dni od wprowadzenia),  
l i : długość odstępu czasowego mi ędzy kontrolami i (w dniach, zwykle 1 
dzień). 
Sprawozdanie z badania  
53. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć co najmniej nast ępujące informacje:  
Substancja badana  
— cechy fizyczne i w stosownych przypadkach w łaściwości fizykoche ­
miczne (rozpuszczalno ść w wodzie, pr ężność par, wspó łczynnik 
podziału w glebie (lub w osadzie, je śli jest dost ępny), stabilno ść 
w wodzie itd.),  
— dane identyfikacyjne substancji chemicznej (nazwa zwyczajowa, nazwa 
chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny), w tym czysto ść i metoda 
analityczna oznaczania ilo ściowego substancji badanej.  
Badany gatunek  
— zwierz ęta wykorzystane w badaniu: gatunek, nazwa naukowa, źródło 
organizmów i warunki hodowli,  
— informacje dotycz ące postępowania z pakietami jaj i larwami,  
— wiek zwierz ąt badanych w chwili umieszczenia w naczyniu do badania.  
Warunki badania  
— użyty osad, tj. osad naturalny lub preparowany,  
— w przypadku osadu naturalnego – lokalizacja i opis miejsca pobrania 
próbki osadu, w tym, je śli to możliwe, historia zanieczyszczenia; charak ­
terystyka: pH, zawarto ść węgla organicznego, stosunek C/N 
i granulometria (w stosownych przypadkach),  
— przygotowanie osadu preparowanego: sk ładniki i charakterystyka 
(zawartość węgla organicznego, pH, wilgotno ść itd. na pocz ątku bada­
nia), 
— przygotowanie wody do badania (je śli stosowana jest woda regenero ­
wana) i jej charakterystyka (st ężenie tlenu, pH, przewodno ść właściwa, 
twardość itd. na pocz ątku badania),  
— głębokość warstwy osadu i warstwy wody powy żej, 
— objętość warstwy wody powy żej osadu i wody porowej; masa mokrego 
osadu z wod ą porową i bez niej,  
— naczynia do badania (materia ł i wielko ść), 
— metody przygotowania roztworu podstawowego i badanych st ężeń, ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— wprowadzenie substancji badanej: u żyte stężeni, liczba replikatów 
i użyty rozpuszczalnik, je śli go zastosowano,  
— warunki inkubacji: temperatura, cykl i nat ężenie oświetlenia, napowiet ­
rzanie (cz ęstotliwość i natężenie),  
— szczegó łowe informacje o żywieniu, w tym rodzaj pokarmu, przygoto ­
wanie, schemat żywienia i ilo ść pokarmu.  
Wyniki  
— nominalne st ężenia badane, zmierzone st ężenia badane i wyniki wszyst ­
kich analiz ustalaj ących stężenia substancji badanej w naczyniach do 
badań, 
— jakość wody w naczyniach do badania, tj. pH, temperatura, rozpusz ­
czony tlen, twardo ść i zawarto ść amoniaku,  
— uzupe łnienie wyparowanej wody do badania, je śli nastąpiło, 
— liczbę wylęgniętych męskich i żeńskich kuczmanów na ka żde naczynie 
na każdy dzień, 
— liczba larw, z których nie wyl ęgły się kuczmany, na ka żde naczynie,  
— w stosownych przypadkach średnia sucha masa larw na ka żde naczynie 
do badania i na ka żde stadium larwalne,  
— odsetek wyl ęgniętych kuczmanów na ka żdy replikat i na ka żde stężenie 
substancji badanej (samice i samce kuczmanów łącznie),  
— średni wspó łczynnik rozwoju w pe łni wylęgniętych kuczmanów na 
każdy replikat i wspó łczynnik poddania dzia łaniu substancji badanej 
(samice i samce kuczmanów łącznie),  
— oszacowania toksycznych punktów ko ńcowych, np. EC  x (i powiązane 
przedziały ufności), warto ść stężenia, przy którym nie obserwuje si ę 
szkodliwych zmian (NOEC), lub najni ższe stężenie, przy którym obser ­
wuje się szkodliwe zmiany (LOEC) oraz metody statystyczne u żyte 
w celu ich okre ślenia,  
— omówienie wyników, w tym ewentualny wp ływ na wynik badania 
będący skutkiem odst ępstw od niniejszej metody badawczej.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Develop ­
ment and validation of a new test system. M. Streloke i H. Köpp (red.). 
Berlin 1995.  
(2) Fleming R i in. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Sprawozdanie ko ńcowe dla Komisji Europejskiej. Nr sprawoz ­
dania: EC 3738. Sierpie ń 1994. WRc, Zjednoczone Królestwo.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and 
Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Materia ły 
z warsztatów WOSTA zorganizowanych w Niedrlandach.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the 
Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Inverteb ­
rates. 1125–1241. W: ASTM International 2002 Annual Book of Stan ­
dards. Tom 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechno ­
logy; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.  
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
using Larvae of Freshwater Midges ( Chironomus tentans  or Chironomus 
riparius ). Biological Test Method. Sprawozdanie SPE 1/RM/32. Grudzie ń 
1997.  
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Wyd. 
drugie. EPA 600/R-99/064. Marzec 2000. Zmiana wydania pierwszego 
z czerwca 1994 r.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  
(Chironomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National 
Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
 
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345–350.  
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. 
Sanit. Zool. 37(1): 47–57.  
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety 
Publications, Series on Testing and Assessment nr 23.  
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of 
Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Sprawozdanie EPS 1/RM/30. Wrzesie ń 1995 r.
 
(14) Rozdzia ł C.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść dla dżdżownic.  
(15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. 
Chem. 13: 1163–1175.  
(16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for 
Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291–3303.
 
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096–1121.  
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. 
Biometrics 20: 482–491.  
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 
103–117.  
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control. Biometrics 28: 510–531.  
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of 
clustered binary data. Biometrics 48: 577–585.  
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model. Water Research 18: 213–221.  
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling conti ­
nuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485–1494.
 
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. 
Sci. 66: 298–312.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Dla celów niniejszej metody badawczej stosowane s ą następujące definicje:  
Osad preparowany  lub regenerowany, sztuczny lub syntetyczny stanowi 
mieszanin ę materiałów używaną do naśladowania sk ładników fizycznych natu ­
ralnego osadu.  
Warstwa wody powy żej osadu  to woda, któr ą zalano osad w naczyniu do 
badania.  
Woda porowa  to woda wype łniająca przestrze ń między cząstkami osadu i gleby.  
Woda wzbogacona  to woda do badania, do której dodano substancj ę badaną. 
Badana substancja chemiczna:  każda substancja lub mieszanina badana za 
pomocą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Dodatek 2  
Zalecenia dotycz ące hodowli  Chironomus riparius  
1. Larwy ochotki ( Chironomus ) można hodowa ć w naczyniach krystalizacyj ­
nych lub wi ększych zbiornikach. Na dnie zbiornika rozprowadza si ę drobny 
piasek kwarcowy, tworz ąc cienką warstwę grubości od 5 do 10 mm. Odpo ­
wiednim substratem okaza ła się także ziemia okrzemkowa (np. Merck, Art 
8117), w przypadku której wystarczaj ąca jest cie ńsza warstwa grubo ści 
najwyżej kilku milimetrów. Nast ępnie dodaje si ę odpowiedni ą wodę na 
głębokość kilku centymetrów. Poziomy wody nale ży uzupełniać, aby 
wyrównać stratę spowodowan ą parowaniem i zapobiec wysychaniu. Wod ę 
w razie konieczno ści można zastępować. Należy zapewni ć delikatne napo ­
wietrzanie. Naczynia do chowu larw nale ży przechowywa ć w odpowiedniej 
klatce, aby zapobiec ucieczce wyl ęgniętych osobników doros łych. Klatka 
powinna by ć na tyle du ża, by umo żliwić rojenie wyl ęgniętych osobników 
dorosłych, inaczej mo że nie dojść do kopulacji (co najmniej ok. 30 × 30 × 
30 cm).  
2. Klatki powinny by ć trzymane w temperaturze pokojowej lub 
w pomieszczeniu o sta łych warunkach środowiska w temperaturze 20 
± 2 °C z fotoperiodem wynosz ącym 16 godzin światła (o natężeniu ok. 
1 000 luksów) i 8 godzin ciemno ści. Odnotowywano, że wilgotno ść 
powietrza mniejsza ni ż 60 % RH mo że przeszkodzi ć rozmnażaniu.  
Woda do rozcie ńczania  
3. Można stosowa ć każdy rodzaj wody naturalnej lub syntetycznej. 
Powszechnie stosowana jest woda gruntowa, odchlorowana woda wodoci ą­
gowa i sztuczne po żywki (np. po żywka Elendta „M4” lub „M7”, zob. tak że 
poniżej). Woda przed u życiem powinna by ć napowietrzona. W miar ę 
potrzeby woda do hodowli mo że być odnawiana przez ostro żne odlewanie 
lub wypłukiwanie zu żytej wody z naczy ń hodowlanych bez niszczenia 
oprzędów larw.  
Karmienie larw  
4. Larwy  Chironomus  należy karmić pokarmem w p łatkach dla ryb (Tetra 
Min®, Tetra Phyll® lub innej marki pokarmem dla ryb) w ilo ści ok. 250 
mg na ka żde naczynie na dzie ń. Można go podawa ć w postaci suchego 
mielonego proszku lub jako zawiesin ę w wodzie: 1 g pokarmu 
w płatkach dodaje si ę do 20 ml wody do rozcie ńczenia i rozdrabnia si ę 
do uzyskania jednorodnej mieszanki. Preparat ten mo żna stosowa ć jako 
pokarm w ilo ści ok. 5 ml na ka żde naczynie na dzie ń (przed u życiem 
wstrząsnąć). Starsze larwy mog ą dostawać go więcej. 
5. Żywienie dostosowuje si ę do jakości wody. Je śli pożywka do hodowli staje 
się mętna, nale ży ograniczy ć karmienie. Podawanie pokarmu nale ży 
starannie monitorowa ć. Zbyt ma ła ilość pożywienia spowoduje migracj ę 
larw w kierunku s łupa wody, a zbyt du ża wywoła zwiększoną aktywno ść 
drobnoustrojów i zmniejszone st ężenie tlenu. Oba rodzaje warunków mog ą 
spowodowa ć ograniczenie wspó łczynnika wzrostu.  
6. Przy przygotowywaniu nowych naczy ń do hodowli mo żna też dodać 
komórki niektórych gatunków zielenic (np.  Scenedesmus subspicatus , Chlo­
rella vulgaris ). 
Karmienie wyl ęgniętych osobników doros łych 
7. Niektórzy badacze sugeruj ą, by do karmienia wyl ęgniętych osobników doro ­
słych używać tamponu z we łny bawe łnianej nas ączonego nasyconym 
roztworem sacharozy.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Wylęg osobników doros łych 
8. Przy temperaturze 20 ± 2 °C po ok. 13–15 dniach w naczyniach do hodowli 
z larw wyl ęgną się osobniki doros łe. Samce łatwo zidentyfikowa ć dzięki 
pierzastym czu łkom.  
Pakiety jaj  
9. Po tym, jak osobniki doros łe pojawią się w klatce hodowlanej, nale ży trzy 
razy w tygodniu sprawdza ć we wszystkich naczyniach do chowu larw, czy 
nie zostały złożone galaretowate pakiety jaj. Je śli tak, nale ży je ostro żnie 
usunąć, a następnie przenie ść do niewielkiego naczynia zawieraj ącego 
próbkę wody używanej do hodowli. Pakiety jaj wykorzystuje si ę do zapo­
czątkowania hodowli w nowym naczyniu (np. 2–4 pakietów jaj na naczynie) 
lub do bada ń toksyczno ści. 
10. Larwy w pierwszym stadium larwalnym powinny wyl ęgnąć się po 2–3 
dniach.  
Przygotowanie hodowli w nowych naczyniach  
11. Po tym, jak hodowle zostan ą założone, powinno by ć możliwe przygoto ­
wanie nowej hodowli larw w świeżym naczyniu raz na tydzie ń lub rzadziej, 
w zależności od wymogów badania, przy czym starsze naczynia po wyl ęg­
nięciu się w nich doros łych kuczmanów si ę usuwa. Stosuj ąc ten uk ład, 
uzyskuje si ę stałą podaż dorosłych osobników przy zminimalizowaniu 
zarządzania.  
Przygotowanie roztworów testowych „M4” i „M7”  
12. Pożywka „M4” zosta ła opisana przez Elendta (1990). Po żywkę „M7” przy ­
gotowuje si ę jak pożywkę „M4”, z wyj ątkiem substancji wskazanych 
w tabeli 1, których st ężenie w „M7” jest czterokrotnie mniejsze ni ż 
w „M4”. Publikacja na temat po żywki „M7” znajduje si ę 
w przygotowaniu (Elendt, informacje w łasne). Roztwór testowy nie powi ­
nien być przygotowywany zgodnie z instrukcjami Elendta i Biasa (1990), 
ponieważ stężenia NaSiO  3 5 H  2 O, NaNO  3 , KH  2 PO 4 oraz K  2 HPO  4 podane 
dla przygotowania roztworów podstawowych nie s ą odpowiednie.  
Przygotowanie po żywki „M7”  
13. Każdy roztwór podstawowy (I) przygotowuje si ę oddzielnie, a z roztworów 
podstawowych (I) przygotowuje si ę łączony roztwór podstawowy (II) (zob. 
tabela 1). 50 ml łączonego roztworu podstawowego (II) oraz podane 
w tabeli 2 ilo ści każdego roztworu podstawowego makrosk ładnika od żyw­
czego dope łnia się do 1 litra wod ą dejonizowan ą, aby przygotowa ć pożywkę 
„M7”. Roztwór podstawowy witamin przygotowuje si ę przez dodanie trzech 
witamin do wody dejonizowanej, jak wskazano w tabeli 3. Do ko ńcowej 
pożywki „M7” na krótko przed u życiem dodaje si ę 0,1 ml łączonego 
roztworu podstawowego witamin (roztwór podstawowy witamin przecho ­
wuje się zamrożony w ma łych podwielokrotno ściach). Po żywka jest napo ­
wietrzana i stabilizowana.  
Tabela 1  
Roztwory podstawowe pierwiastków śladowych w przypadku po żywek M4 i M7  
Roztwory podstawowe (I) Ilość (mg) 
dopełniana do 1 
litra wodą 
dejonizowan ą W celu przygotowania łączonego 
roztworu podstawowego (II): 
zmieszać następujące ilości (ml) 
roztworów podstawowych (I) 
i dopełnić do 1 litra wod ą 
dejonizowan ą Końcowe stężenia w w roztworach 
testowych (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Roztwory podstawowe (I) Ilość (mg) 
dopełniana do 1 
litra wodą 
dejonizowan ą W celu przygotowania łączonego 
roztworu podstawowego (II): 
zmieszać następujące ilości (ml) 
roztworów podstawowych (I) 
i dopełnić do 1 litra wod ą 
dejonizowan ą Końcowe stężenia w w roztworach 
testowych (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na
 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na2EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Te substancje ró żnią się w przypadku M4 i M7, jak okre ślono wyżej. 
( 2 ) Roztwory te s ą przygotowywane oddzielnie, nast ępnie zlewane razem i niezw łocznie autoklawowane.  
Tabela 2  
Roztwory podstawowe makrosk ładników od żywczych w przypadku po żywek M4 i M7  
Ilość (mg) dope łniana 
do 1 litra wod ą 
dejonizowan ą Ilość (ml/l) roztworów 
podstawowych 
makroskładników 
odżywczych w celu 
przygotowania po żywek 
M4 i M7 Końcowe stężenia 
(mg/l) w roztworach 
testowych po żywek 
M4 i M7  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Tabela 3  
Roztwór podstawowy witamin w przypadku po żywek M4 i M7  
Ilość (ml/l) roztworu podstawowego witamin dodawanego w celu przygotowania po żywek M4 i M7  
Wszystkie trzy roztwory 
witamin łączy się, by 
otrzymać jeden roztwór 
podstawowy witamin. Ilość (mg) dope łniana do 1 
litra wodą dejonizowan ą Końcowe stężenia (mg/l) 
w roztworach testowych 
pożywek M4 i M7  
Hydrochlorek tiaminy 750 0,1 0,075 
Cyjanokobalamina 
(B12) 10 0,1 0,0010 
Biotyna 7,5 0,1 0,00075  
BIBLIOGRAFIA  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. M. Streloke i H. Köpp (red.). Berlin 1995.  
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25–33.  
Elendt BP i Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157–1167.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Dodatek 3  
PRZYGOTOWANIE OSADU PREPAROWANEGO  
Skład osadu  
Skład osadu preparowanego powinien by ć następujący: 
Składnik W łaściwości % suchej 
masy osadu  
Torf Torf z rozk ładu mchu 
torfowca (Sphagnum), 
w miar ę możliwości 
o warto ści pH równej 
5,5–6,0, bez widocznych 
pozostałości roślin, drobno 
zmielony (wielko ść cząstek 
≤ 1 mm), suszony powiet ­
rzem 4–5 
Piasek kwarcowy Wielko ść ziaren: > 50 % 
cząstek powinna mie ścić się 
w przedziale 50–200 μm. 75-76 
Glinka kaolinowa Zawarto ść kaolinitu ≥ 30 % 20 
Węgiel organiczny Skorygowana przez dodanie 
torfu i piasku 2 (±0,5) 
Węglan wapnia CaCO  3 , sproszkowany, 
chemicznie czysty 0,05–0,1 
Woda Przewodno ść właściwa ≤ 10 
μS/cm 30–50  
Przygotowanie  
Torf suszy si ę powietrzem i mieli na drobny proszek. Zawiesin ę wymaganej 
ilości proszku torfowego w wodzie dejonizowanej przygotowuje si ę z użyciem 
wysokosprawnego urz ądzenia do homogenizacji. Warto ść pH zawiesiny koryguje 
się z użyciem CaCO  3 do poziomu 5,5 ± 0,5. W celu ustabilizowania pH 
i komponentu mikrobiologicznego zawiesin ę kondycjonuje si ę przez co najmniej 
dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie j ą mieszając. Ponownie mierzy si ę 
pH, którego warto ść powinna wynosi ć 6,0 ± 0,5. Nast ępnie zawiesin ę torfową 
miesza si ę z innymi sk ładnikami (piaskiem i glink ą kaolinow ą) oraz wod ą dejo­
nizowaną, aby otrzyma ć jednorodny osad z zawarto ścią wody w przedziale 
30–50 procent suchej masy osadu. Warto ść pH końcowej mieszaniny ponownie 
mierzy si ę i koryguje w miar ę potrzeby za pomoc ą CaCO  3 do poziomu 6,5 do 
7,5. Próbki osadu pobiera si ę, aby okre ślić suchą masę i zawarto ść węgla orga­
nicznego. Nast ępnie przed ich wykorzystaniem w badaniu toksyczno ści dla 
ochotkowatych zaleca si ę, by osad preparowany kondycjonowa ć przez siedem 
dni w tych samych warunkach, jakie panowa ć będą następnie podczas badania.  
Przechowywanie  
Suche sk ładniki do przygotowywania osadu sztucznego mog ą być przechowy ­
wane w suchym i ch łodnym miejscu w temperaturze pokojowej. Nie powinno si ę 
przechowywa ć (mokrego) osadu preparowanego przed jego u życiem w badaniu. 
Osad nale ży wykorzysta ć natychmiast po 7-dniowym okresie kondycjonowania, 
kończącym proces jego przygotowania.  
BIBLIOGRAFIA:  
Rozdział C.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść dla dżdżownic.  
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubi ­
ficid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 
39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Dodatek 4  
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcie ńczania  
Substancja St ężenia 
Cząstki stałe < 20 mg/l 
Całkowity w ęgiel organiczny < 2 mg/l 
Niezjonizowany amoniak < 1 μg/l 
Twardość w przeliczeniu na CaCO  3 < 400 mg/l (*) 
Chlor resztkowy < 10 μg/l 
Całkowita zawarto ść pestycydów fosforoorganicznych < 50 ng/l 
Całkowita zawarto ść pestycydów chloroorganicznych 
plus polichlorowanych bifenyli < 50 ng/l 
Całkowity chlor organiczny < 25 ng/l  
(*) Należy jednak pami ętać, że jeżeli podejrzewa si ę interakcj ę między jonami powoduj ­ 
ącymi twardo ść wody a substancj ą badaną, powinna by ć stosowana woda o mniejszej 
twardości (a zatem w takim przypadku nie wolno u żywać pożywki Elendta M4).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Dodatek 5  
Wytyczne dotycz ące monitorowania wyl ęgu larw ochotkowatych  
Na szklanych zlewkach do badania umieszczono pu łapki na wyl ęgnięte kucz­
many. Pu łapki te potrzebne s ą od 20 dnia badania do zako ńczenia badania. 
Poniżej przedstawiono rysunek przedstawiaj ący przykładową pułapkę:
 
A: siatka nylonowa  
B: odwrócone kubeczki plastikowe  
C: zlewka bez dzióbka do badania  D: osiatkowane otwory do wymiany wody  
E: woda  
F: osad  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  SZYBKA BIODEGRADOWALNO ŚĆ – CO  2 W  SZCZELNIE 
ZAMKNI ĘTYCH NACZYNIACH (Badanie fazy gazowej nad roztworem)  
WSTĘP 
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna z dotycz ącą badań wytyczn ą 
OECD nr 310 (2006). Niniejsza metoda badawcza jest metod ą przesiewow ą 
służącą do oceny szybkiej biodegradowalno ści chemikaliów, która dostarcza 
podobnych informacji, jak sze ść metod badawczych A–F opisanych 
w rozdziale C.4 niniejszego za łącznika. Zatem substancj ę chemiczn ą dającą 
dodatnie wyniki w niniejszej metodzie badawczej mo żna uznać za ulegaj ącą 
szybkiej biodegradacji, a co za tym idzie, ulegaj ącą szybkiej degradacji 
w środowisku.  
2. Ogólnie przyj ętą metodę badania wydzielania si ę dwutlenku w ęgla (CO  2 ) 
(1), opart ą na pierwotnym badaniu Sturma (2) s łużącym ocenie biodegrado ­
walności organicznych substancji chemicznych w drodze pomiaru ilo ści 
dwutlenku w ęgla wytworzonego w wyniku aktywno ści mikrobiologicznej, 
wybierano zazwyczaj w pierwszej kolejno ści, by zbada ć słabo rozpuszczalne 
chemikalia oraz te, które silnie adsorbuj ą. Wybiera si ę ją także dla chemi ­
kaliów rozpuszczalnych (ale nie lotnych), poniewa ż wielu uznaje wydzie ­
lanie się dwutlenku w ęgla za jedyny jednoznaczny dowód aktywno ści 
mikrobiologicznej. Usuwanie rozpuszczonego w ęgla organicznego mo żna 
uzyskać w drodze procesów fizykochemicznych – adsorpcji, ulatniania si ę, 
strącania, hydrolizy – jak równie ż aktywno ści mikrobiologicznej oraz wielu 
reakcji niebiologicznych, w których zu żywany jest tlen; rzadko CO  2 
powstaje z substancji organicznych w sposób abiotyczny. W pierwotnym 
i zmodyfikowanym badaniu Sturma (1) (2) CO  2 usuwa się z fazy ciek łej do 
naczyń absorbuj ących w drodze napowietrzania (tzn. przepuszczania 
powietrza poddawanego obróbce przez po żywkę ciekłą celem usuni ęcia 
CO 2 ), natomiast w wersji Larsona (3) (4) CO  2 przemieszcza si ę 
z naczynia reakcyjnego do absorberów dzi ęki przepuszczaniu powietrza 
wolnego od CO  2 przez faz ę gazową nad roztworem i dodatkowo ci ągłemu 
potrząsaniu naczyniem badawczym. Naczyniem reakcyjnym potrz ąsa się 
jedynie w modyfikacji Larsona; mieszanie jest przewidziane jedynie 
w przypadku substancji nierozpuszczalnych wymienionych w normie ISO 9439 (5) oraz w pierwotnej wersji ameryka ńskiej (6); w obu tych normach 
przewidziano napowietrzanie, a nie wymian ę fazy gazowej nad roztworem. 
W innej oficjalnej metodzie ameryka ńskiej EPA (7), opartej na metodzie 
Gledhilla (8), potrz ąsane naczynie reakcyjne jest zamkni ęte dla atmosfery, 
a wytworzony CO
 2 gromadzi si ę w wewn ętrznej pu łapce alkalicznej 
bezpośrednio z fazy gazowej, tak jak w klasycznych kolbach respirometrów 
Warburga/Barcrofta.  
3. Wykazano jednak, że węgiel nieorganiczny (IC) kumuluje si ę w pożywce, 
gdy standardowe, zmodyfikowane badanie Sturma stosuje si ę do kilku 
chemikaliów (9). Stwierdzono st ężenie w ęgla nieorganiczneog 
w wysoko ści nawet 8 mg/l w czasie rozk ładu aniliny o zawarto ści 20 mg 
C/l. Zatem gromadzenie si ę CO  2 w pułapkach alkalicznych nie oddawa ło 
wiernie ilo ści CO  2 wyprodukowanego mikrobiologicznie w mi ędzyczasie 
w trakcie rozk ładu. W efekcie specyfikacja, zgodnie z któr ą, aby badana 
substancja chemiczna zosta ła sklasyfikowana jako ulegaj ąca szybkiej biode ­
gradacji, w ci ągu 10-dniowego „okna” (10 dni bezpo średnio po osi ągnięciu 
10-procentowej biodegradacji) nale ży zebrać > 60 % teoretycznej maksy ­
malnej ilo ści wytworzonego CO  2 (ThCO  2 ), nie zostanie spe łniona dla 
niektórych chemikaliów, które zosta łyby tak sklasyfikowane przy u życiu 
metody usuwania rozpuszczalnego w ęgla organicznego (DOC).  
4. Jeśli wartość procentowego rozk ładu jest mniejsza ni ż oczekiwana, w ęgiel 
nieorganiczny by ć może nagromadzi ł się w badanym roztworze. Wówczas 
degradowalno ść można ocenić za pomoc ą innych bada ń na szybk ą biode­
gradowalno ść. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Inne wady metodologii Sturma (która jest uci ążliwa, czasoch łonna, bardziej 
podatna na b łędy doświadczalne i nie daje si ę zastosowa ć do chemikaliów 
lotnych) ju ż wcze śniej spowodowa ły poszukiwania techniki 
z zastosowaniem szczelnie zamkni ętych naczy ń, innej niż metoda Gledhilla, 
zamiast metody przep ływowo-gazowej (10) (11). Boatman i in. (12) doko ­
nali przegl ądu wcześniejszych metod i przyj ęli system zamkni ętej prze­
strzeni nad roztworem, w której CO  2 uwalniano do fazy gazowej nad 
roztworem pod koniec inkubacji poprzez zakwaszenie po żywki. CO  2 
mierzono metod ą chromatografii gazowej (GC)/analizy w ęgla 
nieorganicznego (IC) w automatycznie pobieranych próbkach fazy gazowej 
nad roztworem, jednak nie uwzgl ędniono rozpuszczonego w ęgla 
nieorganicznego (DIC) w fazie ciek łej. Ponadto zastosowane naczynia 
były bardzo ma łe (20 ml) i zawiera ły jedynie 10 ml po żywki, co powodo ­
wało problemy np. przy dodawaniu z konieczno ści bardzo ma łych ilości 
nierozpuszczalnych badanych substancji chemicznych, a w zaszczepionej pożywce mo że być niewystarczaj ąca ilość mikroorganizmów zdolnych do 
rozłożenia badanych substancji chemicznych lub te ż może ich nie by ć 
wcale.
 
6. Trudno ści te w niezale żnych badaniach przezwyci ężyli Struijs i Stoltenkamp 
(13) oraz Birch i Fletcher (14); drugie z tych bada ń było inspirowane 
doświadczeniem badaczy z aparatur ą stosowan ą w badaniu biodegradacji 
beztlenowej (15). W poprzedniej metodzie (13) CO  2 mierzy si ę 
w przestrzeni nad roztworem po zakwaszeniu i ustaleniu stanu równowagi, natomiast w drugiej (14) mierzono DIC zarówno w fazie gazowej, jak i w fazie ciek łej, bez dodawania substancji; ponad 90 % wytworzonego IC 
znajdowa ło się w fazie ciek łej. Obie metody posiada ły zalety 
w porównaniu z badaniem Sturma: system badawczy by ł bardziej zwarty 
i łatwiejszy w obs łudze, umo żliwia on badanie lotnych chemikaliów 
i możliwe jest unikni ęcie opóźnienia w pomiarze wytworzonego CO
 2 . 
7. Te dwa podej ścia połączono w normie ISO dotycz ącej oznaczania gazowego 
CO 2 nad roztworem (16), któr ą poddano badaniu mi ędzylaboratoryjnemu 
(17) i to ta norma stanowi podstaw ę dla niniejszej metody badawczej. 
Podobnie te dwa podej ścia zastosowano w metodzie ameryka ńskiej EPA 
(18). Zalecono dwie metody pomiaru CO  2 , mianowicie CO  2 w fazie 
gazowej nad roztworem po zakwaszeniu (13) oraz IC w fazie ciek łej po 
dodaniu nadmiaru zasady. Drug ą metodę wprowadzi ł Peterson w czasie 
badania mi ędzylaboratoryjnego CONCAWE (19) niniejszej metody pomiaru 
CO 2 w fazie gazowej nad roztworem, zmodyfikowanej dla celów pomiaru 
naturalnej podatno ści na biodegradacj ę. W niniejsz ą metodę badawcz ą 
włączono zmiany wprowadzone w 1992 r. (20) w ramach rewizji metod 
opisanych w rozdziale C.4 niniejszego za łącznika w odniesieniu do szybkiej 
biodegradowalno ści, tak że warunki (po żywka, czas trwania itp.) s ą poza 
tym takie same, jak zastosowane w poprawionym badaniu Sturma (20). Birch i Fletcher (14) wykazali, że przy pomocy niniejszej metody pomiaru 
CO
 2 w fazie gazowej nad roztworem otrzymano bardzo podobne wyniki, jak 
w przypadku tych samych chemikaliów w badaniu mi ędzylaboratoryjnym 
OECD (21) w odniesieniu do poprawionych metod badawczych.  
ZASADA BADANIA  
8. Badan ą substancj ę chemiczn ą zawieraj ącą zwykle 20 mg C/l, jako jedyne 
źródło węgla i energii inkubuje si ę w buforowej po żywce mineralnej, któr ą 
zaszczepiono mieszan ą populacj ą mikroorganizmów. Badanie przeprowadza 
się w szczelnie zamkni ętych butlach z powietrzem w fazie gazowej nad 
roztworem, co zapewnia zbiornik tlenu na potrzeby biodegradacji tlenowej. Wydzielanie si ę CO
 2 wynikające z całkowitej biodegradacji tlenowej 
badanej substancji chemicznej okre śla się w drodze pomiaru ilo ści IC 
wytworzonego w badanych butlach przekraczaj ącej ilość wytworzon ą 
w naczyniach ślepej próby zawieraj ących jedynie zaszczepion ą pożywkę. 
Stopień biodegradacji wyra ża się jako odsetek teoretycznej maksymalnej 
ilości wytworzonego IC (ThIC), w odniesieniu do ilo ści badanej substancji 
chemicznej (jak np. w ęgiel organiczny) dodanej na pocz ątku. 
9. Możliwy jest równie ż pomiar usuwania DOC lub stopnia pierwotnej biode ­
gradacji badanej substancji chemicznej (20).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ  
10. Zawarto ść węgla organicznego (% w/w) badanej substancji chemicznej musi 
być znana z jej struktury chemicznej lub w wyniku pomiaru, tak by mo żliwe 
było obliczenie procentowego rozk ładu. W przypadku lotnych badanych 
substancji chemicznych do okre ślenia odpowiedniego stosunku obj ętości 
fazy gazowej nad roztworem do obj ętości cieczy pomocna jest zmierzona 
lub obliczona sta ła Henry’ego. Informacje na temat toksyczno ści badanej 
substancji chemicznej dla mikroorganizmów s ą przydatne przy wyborze 
odpowiedniego st ężenia stosowanego w badaniu oraz przy interpretacji 
wyników wskazuj ących na s łabą biodegradowalno ść: zaleca si ę uwzględ­
nienie kontroli hamowania, chyba że wiadomo, że badana substancja 
chemiczna nie hamuje aktywno ści mikrobiologicznej (zob. pkt 24).  
ZAKRES STOSOWANIA METODY  
11. Badanie ma zastosowanie do badanych substancji chemicznych rozpuszczal ­
nych i nierozpuszczalnych w wodzie, chocia ż należy zapewni ć dobrą 
dyspersję badanej substancji chemicznej. Stosuj ąc zalecany stosunek obj ę­
tości fazy gazowej nad roztworem do obj ętości cieczy 1:2, mo żna badać 
lotne chemikalia o sta łej Henry’ego wynosz ącej do 50 Pa.m  3 .mol  –1 , gdyż 
proporcja badanej substancji chemicznej w przestrzeni nad roztworem nie 
przekroczy 1 % (13). Mniejsz ą objętość fazy gazowej nad roztworem mo żna 
zastosowa ć przy badaniu chemikaliów, które s ą bardziej lotne, ale ich biodo ­
stępność może być ograniczona, zw łaszcza je śli są słabo rozpuszczalne 
w wodzie. U żytkownicy musz ą jednak dopilnowa ć, aby stosunek obj ętości 
fazy gazowej nad roztworem do obj ętości cieczy oraz st ężenie badanej 
substancji chemicznej by ły takie, że dostępna będzie wystarczaj ąca ilość 
tlenu, by mo żliwa była całkowita biodegradacja tlenowa (np. nale ży unikać 
wysokiego st ężenia substratu i niewielkiej obj ętości przestrzeni nad roztwo ­
rem). Wytyczne w tej kwestii mo żna znaleźć w (13) (23).  
SUBSTANCJE ODNIESIENIA  
12. Celem sprawdzenia procedury badania nale ży równolegle bada ć substancj ę 
odniesienia o znanej biodegradowalno ści. W tym celu mo żna zastosowa ć 
anilinę, benzoesan sodu lub glikol etylenowy przy badaniu rozpuszczalnych 
w wodzie badanych substancji chemicznych oraz 1-oktanol dla s łabo 
rozpuszczalnych badanych substancji chemicznych (13). Biodegradacja 
tych chemikaliów musi wynie ść > 60 % ThIC w ci ągu 14 dni.  
ODTWARZALNO ŚĆ 
13. W przewidzianym norm ą ISO badaniu mi ędzylaboratoryjnym metody (17) 
uzyskano nast ępujące rezultaty przy zastosowaniu zalecanych warunków, 
w tym badanej substancji chemicznej zawieraj ącej 20 mg C/l.  
Badana substancja 
chemiczna Średnia 
biodegradacja 
procentowa 
(28d) Współczynnik 
zmienności 
(%) Liczba 
laboratoriów  
Anilina 90 16 17 
1-Oktanol 85 12 14  
Zmienność wewnętrzna badania (odtwarzalno ść) przy zastosowaniu aniliny 
była niska, a wspó łczynniki zmienno ści nie przekracza ły 5 % w prawie 
wszystkich rundach badania. W dwóch przypadkach, w których odtwarzal ­
ność była gorsza, wi ększa zmienno ść wynikała prawdopodobnie z du żej 
produkcji IC w ślepych próbach. Odtwarzalno ść była gorsza dla 1-oktanolu, 
jednak nadal wynosi ła mniej ni ż 10 % dla 79 % rund badania. Ta wi ększa 
zmienność wewnętrzna badania mog ła wynika ć z błędów w dozowaniu, 
gdyż trzeba by ło wstrzykn ąć niewielk ą objętość (3 do 4 μl) 1-oktanolu do 
szczelnie zamkni ętych badanych butli. Wy ższe wspó łczynniki zmienno ści 
otrzymano by przy zastosowaniu ni ższych stężeń badanych substancji 
chemicznych, zw łaszcza st ężeń mniejszych ni ż 10 mg C/l. Mo żna to 
częściowo przezwyci ężyć, redukuj ąc stężenie ca łkowitego w ęgla 
nieorganicznego (TIC) w inokulum.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. W przeprowadzonym w UE badaniu mi ędzylaboratoryjnym (24) pi ęciu 
środków powierzchniowo czynnych zawieraj ących 10 mg C/l otrzymano 
następujące wyniki:  
Badana substancja 
chemiczna Średnia 
biodegradacja 
procentowa 
(28d) Współczynnik 
zmienności 
(%) Liczba 
laboratoriów  
Sulfonian 
tetrapropylenobenzenu 17 45 10 
Sulfobursztynian 
diizooktylu 
(anionowy) 72 22 9 
Chlorek 
heksadecylotrimetyla ­
moniowy (*) 
(kationowy) 75 13 10 
Oksyetylenowany 
izononylofenol  9 
(niejonowy) 41 32 10 
Kokamidopropylo 
Dimetylohydroksy 
Sulfobetaina (amfoteryczna) 60 23 11
 
(*) Dodano SiO  2 celem neutralizacji toksyczno ści. 
Wyniki pokazuj ą, że na ogó ł zmienno ść była wyższa dla środków 
powierzchniowo czynnych s łabiej ulegaj ących rozk ładowi. Zmienno ść 
wewnętrzna badania wynosi ła mniej ni ż 15 % w ponad 90 % przypadków, 
przy czym najwy ższa dochodzi ła do 30-40 %.  
Uwaga:  Większość środków powierzchniowo czynnych nie stanowi poje ­
dynczych odmian cz ąsteczkowych, ale raczej mieszaniny izome ­
rów, homologów itp., które ulegaj ą rozkładowi po ró żnym charak ­
terystycznym okresie opó źnienia i z inn ą szybkością, co skutkuje 
„niejasnymi”, os łabionymi krzywymi, tak że wartość progowa 
60 % mo że nie zosta ć osiągnięta w 10-dniowym „oknie”, nawet 
jeśli każda z poszczególnych odmian cz ąsteczkowych poddana 
badaniu osobno osi ągnęłaby warto ść > 60 % w ci ągu 10 dni. 
Można to zaobserwowa ć także w przypadku innych z łożonych 
mieszanin.  
OPIS METODY  
Urządzenia  
15. Zwyk łe urządzenia laboratoryjne oraz:  
a) szklane butelki na osocze, szczelnie zamkni ęte korkami z kauczuku buty ­
lowego i zaciskanymi uszczelkami aluminiowymi. Zalecany rozmiar to 
„125 ml” o łącznej obj ętości ok. 160 ml (w tym przypadku obj ętość 
każdej butelki powinna by ć znana jako 160 ± 1 ml). Mo żna użyć mniej­
szego naczynia, je żeli wyniki spe łniają warunki opisane w pkt 66 i 67;  
b) analizator w ęgla lub inny przyrz ąd (np. chromatograf gazowy) do 
pomiarów w ęgla nieorganicznego;  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) strzykawki o du żej precyzji do pobierania próbek gazowych i ciek łych; 
d) wytrząsarka orbitalna w środowisku o kontrolowanej temperaturze;  
e) Zaopatrzenie w powietrze wolne od CO  2 – można je przygotowa ć prze­
prowadzaj ąc powietrze przez granule wapna sodowanego lub stosuj ąc 
mieszanin ę gazową 80 % N  2 /20 % O  2 (fakultatywnie) (zob. pkt 28);  
f) membranowe urz ądzenie filtracyjne o porowato ści 0,20–0,45 μm (fakul­
tatywnie);  
g) analizator w ęgla organicznego (fakultatywnie).  
Odczynniki  
16. W ca łym badaniu nale ży stosowa ć odczynniki do analiz.  
Woda  
17. Nale ży stosowa ć wodę destylowan ą lub dejonizowan ą, zawieraj ącą ≤1 mg/l 
całkowitego w ęgla organicznego. Odpowiada to ≤ 5 % pocz ątkowej zawar ­
tości węgla organicznego wprowadzonej zalecan ą dawką badanej substancji 
chemicznej.  
Roztwory podstawowe na po żywkę mineraln ą 
18. Roztwory podstawowe oraz po żywki mineralne s ą podobne do stosowanych 
w normie ISO 14593 (16) oraz w badaniach C.4 na „szybk ą biodegrado ­
walność” (20). Zastosowanie wi ększego st ężenia chlorku amonu (2,0 g/l 
zamiast 0,5 g/l) powinno by ć konieczne jedynie w bardzo wyj ątkowych 
przypadkach, np. kiedy st ężenie badanej substancji chemicznej wynosi > 
40 mg C/l. Roztwory podstawowe nale ży przechowywa ć w warunkach 
chłodniczych i usuwa ć po sześciu miesi ącach lub wcze śniej, jeśli wystąpią 
objawy str ącania lub rozwoju mikroorganizmów. Nale ży przygotowa ć nastę­
pujące roztwory podstawowe:  
a) diwodorofosforan potasu (KH  2 PO 4 ) 8,50 g  
wodorofosforan potasu, (K  2 HPO  4 ) 21,75 g  
wodorofosforan sodu dwuwodny (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40 g  
chlorek amonu (NH  4 Cl) 0,50 g  
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra. Warto ść pH tego roztworu 
powinna wynosi ć 7,4 (± 0,2). Je śli jest inaczej, nale ży przygotowa ć 
nowy roztwór;  
b) chlorek wapnia dwuwodny (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40 g  
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra;  
c) siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50 g  
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra;  
d) chlorek żelaza(III) sze ściowodny (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25 g  
Rozpuścić w wodzie i dope łnić do 1 litra oraz doda ć jedną kroplę stężo­
nego HCl.  
Przygotowanie po żywki mineralnej  
19. Zmiesza ć 10 ml roztworu a) z ok. 800 ml wody (pkt 17), nast ępnie doda ć 1 
ml roztworów b), c) i d) i dope łnić wodą do 1 litra (pkt 17).  
Inne odczynniki  
20. Stężony kwas ortofosforowy (H  3 PO 4 ) (> 85 % w/v).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Roztwór 7M wodorotlenku sodu  
21. Rozpu ścić 280 g wodorotlenku sodu (NaOH) w 1 litrze wody (pkt 17). 
Określić stężenie DIC w tym roztworze i uwzgl ędnić tę wartość przy obli ­
czaniu wyników badania (zob. pkt 55 i 61), zw łaszcza w świetle kryterium 
ważności określonego w pkt 66 b). Przygotowa ć nowy roztwór, je śli 
stężenie DIC jest zbyt wysokie.  
Badana substancja chemiczna  
22. Przygotowa ć roztwór podstawowy wystarczaj ąco rozpuszczalnej w wodzie 
badanej substancji chemicznej w wodzie (pkt 17) lub w po żywce (pkt 19), 
najlepiej w st ężeniu 100-krotnie wi ększym niż ostateczne st ężenie, które ma 
być zastosowane w badaniu; mo że być konieczne dostosowanie pH 
roztworu podstawowego. Roztwór podstawowy nale ży dodać do pożywki 
mineralnej, by uzyska ć ostateczne st ężenie węgla organicznego mi ędzy 2 
a 40 mg C/l, najlepiej 20 mg C/l. Je śli zastosuje si ę stężenia mniejsze ni ż 
wymienione, uzyskana precyzja mo że ulec pogorszeniu. Rozpuszczalne 
i nierozpuszczalne chemikalia ciek łe można dodać bezpośrednio do naczy ń 
za pomoc ą wysoce precyzyjnych strzykawek. S łabo rozpuszczalne 
i nierozpuszczalne badane substancje chemiczne mog ą wymaga ć specjal­
nego podej ścia (25). Do wyboru jest:  
a) bezpośrednie dodanie znanych, zwa żonych ilo ści; 
b) rozpraszanie ultrad źwiękowe przed dodaniem;  
c) dyspersja za pomoc ą środków emulguj ących; wymagane jest okre ślenie 
przed dodaniem, czy dzia łają one hamuj ąco, czy stymuluj ąco na aktyw ­
ność mikrobiologiczn ą; 
d) adsorpcja ciek łych badanych substancji chemicznych lub rozpuszczenie 
w odpowiednim lotnym rozpuszczalniku, na oboj ętną pożywkę lub 
podłoże (np. filtr z w łókna szklanego), nast ępnie odparowanie rozpusz ­
czalnika, je śli został użyty, i bezpo średnie dodanie znanych ilo ści; 
e) dodanie do pustego naczynia badawczego znanej obj ętości roztworu 
badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku łatwo przechodz ącym 
w fazę lotną, a następnie odparowanie rozpuszczalnika.  
Środki lub rozpuszczalniki u żyte w lit. c), d) i e) nale ży zbadać pod kątem 
ewentualnego dzia łania stymuluj ącego lub hamuj ącego dla aktywno ści 
mikrobiologicznej (zob. pkt 42b)).  
Substancja odniesienia  
23. Przygotowa ć roztwór podstawowy (rozpuszczalnej) substancji odniesienia 
w wodzie (pkt 17), najlepiej w st ężeniu 100-krotnie wi ększym ni ż osta­
teczne stężenie, które ma by ć zastosowane (20 mg C/l) w badaniu.  
Kontrola dzia łania hamuj ącego  
24. Badane substancje chemiczne cz ęsto nie wykazuj ą istotnego rozk ładu 
w warunkach stosowanych przy ocenianiu szybkiej biodegradowalno ści. 
Jedyną możliwą przyczyn ą jest to, że badana substancja chemiczna dzia ła 
hamująco na inokulum w st ężeniu, w którym jest stosowana w badaniu. 
Kontrolę działania hamuj ącego mo żna uwzgl ędnić w projekcie badania 
celem ułatwienia identyfikacji (z perspektywy czasu) dzia łania hamuj ącego 
jako możliwej przyczyny lub czynnika przyczyniaj ącego się do tego stanu 
rzeczy. Ewentualnie kontrola dzia łania hamuj ącego może wykluczy ć takie 
interferencje i wykaza ć, że zerowy lub niewielki rozk ład można przypisa ć 
jedynie brakowi podatno ści na dzia łanie mikroorganizmów w warunkach, 
w których przeprowadza si ę badanie. Aby uzyska ć informacje co do 
toksyczno ści badanej substancji chemicznej dla mikroorganizmów (tleno ­
wych), nale ży przygotowa ć roztwór w po żywce zawieraj ący badan ą 
substancję chemiczn ą i substancj ę odniesienia (pkt 19), ka żdą odpowiednio 
w tym samym st ężeniu, w jakim jest dodawana (zob. ust 22 i 23).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1424
 
Inokulum  
25. Inokulum mo żna uzyska ć z różnych źródeł: osad czynny; odp ływ 
z oczyszczalni ścieków (niechlorowany); wody powierzchniowe i gleby; 
lub z mieszaniny tych że (20). Nale ży sprawdzi ć aktywno ść biodegradacyjn ą 
źródła poprzez zastosowanie substancji odniesienia. Niezale żnie od źródła 
nie należy stosowa ć mikroorganizmów wcze śniej nara żonych na badan ą 
substancję chemiczn ą, jeśli procedura ma by ć stosowana do badania szyb ­
kiej biodegradowalno ści. 
Ostrzeżenie: Osad czynny, ścieki i odp ływ z oczyszczalni ścieków zawieraj ą 
czynniki chorobotwórcze i nale ży obchodzi ć się z nimi ostro ż­
nie. 
26. Z do świadczenia wynika, że optymalna obj ętość inokulum to taka, która:  
— jest wystarczaj ąca, by da ć odpowiedni ą aktywno ść biodegradacyjn ą, 
— rozkłada substancj ę odniesienia w okre ślonym procentowo stopniu (zob. 
pkt 66),  
— daje od 10  2 do 10  5 jednostek tworz ących koloni ę na mililitr 
w mieszaninie ko ńcowej,  
— zazwyczaj daje st ężenie 4 mg/l zawiesiny cia ł stałych w mieszaninie 
końcowej w przypadku zastosowania osadu czynnego; mo żliwe jest 
użycie stężeń do 30 mg/l, jednak mog ą one znacznie zwi ększyć 
produkcję CO  2 naczyniach ślepej próby (26),  
— wnosi mniej ni ż 10 % pierwotnego st ężenia węgla organicznego, wpro ­
wadzanego przez badan ą substancj ę chemiczn ą, 
— wynosi na ogó ł 1-10 ml inokulum na 1 litr badanego roztworu.  
Osad czynny  
27. Świeżą próbkę osadu czynnego zbiera si ę z komory napowietrzania oczysz ­
czalni ścieków lub urz ądzenia w skali laboratoryjnej, przerabiaj ącego 
głównie ścieki domowe. W razie konieczno ści cząstki gruboziarniste nale ży 
usunąć w drodze odsiewania (np. stosuj ąc sito oczkowe o rozmiarze oczek 
1 mm  2 ), a osad nale ży utrzymywa ć w warunkach tlenowych a ż do chwili 
użycia.  
28. Ewentualnie zsedymentowa ć lub odwirowa ć (np. przy 1 100 × g przez 10 
minut) po usuni ęciu wszystkich cz ąstek gruboziarnistych. Odrzuci ć super­
natant. Mo żna przemy ć osad w roztworze mineralnym. Zawiesi ć stężony 
osad w po żywce mineralnej dla uzyskania st ężenia 3–5 g zawiesiny cia ł 
stałych/l. Nast ępnie napowietrza ć do wymaganego momentu.  
29. Osad nale ży pobrać z prawid łowo dzia łającej konwencjonalnej oczyszczalni 
ścieków. Je żeli osad trzeba pobra ć z oczyszczalni o wysokiej szybko ści 
oczyszczania lub podejrzewa si ę zawartość inhibitorów, nale ży go przemy ć. 
Zsedymentowa ć lub odwirowa ć ponownie zawieszony osad po energicznym 
wymieszaniu, odrzuci ć supernatant i ponownie zawiesi ć przemyty osad 
w dalszej obj ętości pożywki mineralnej. Powtarza ć tę procedur ę do czasu, 
gdy uzna si ę, iż osad jest wolny od nadmiaru substratów lub inhibitorów.  
30. Po osi ągnięciu ponownego zawieszenia lub w przypadku osadu niepodda ­
nego obróbce odstawi ć próbkę tuż przed jej u życiem celem ustalenia suchej 
masy ciał stałych w zawiesinie.  
31. Inną możliwością jest homogenizacja osadu czynnego (3–5 g zawiesiny cia ł 
stałych/l). Rozdrobni ć osad w homogenizatorze Waringa przy średniej szyb ­
kości przez 2 minuty. Zsedymentowa ć rozdrobniony osad przez 30 minut 
lub dłużej, w razie potrzeby, i zdekantowa ć ciecz do u życia jako inokulum 
w ilości ok. 10 ml/l po żywki mineralnej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1425
 
32. Jeszcze wi ększą redukcję wydzielania CO  2 w ślepej próbie mo żna osiągnąć 
napowietrzaj ąc osad w nocy powietrzem wolnym od CO  2 . Jako st ężenia 
inokulum w tym badaniu nale ży zastosowa ć 4 mg/l cia ł stałych z osadu 
czynnego (13).  
Ścieki oczyszczone  
33. Ewentualnie inokulum mo żna uzyska ć ze ścieków oczyszczonych 
z oczyszczalni ścieków lub urz ądzenia w skali laboratoryjnej przyjmuj ącego 
głównie ścieki domowe. Nale ży utrzymywa ć próbkę w warunkach tleno ­
wych i użyć w dniu pobrania lub w razie potrzeby wst ępnie kondycjonowa ć. 
Ścieki nale ży przefiltrowa ć przez filtr gruboziarnisty celem usuni ęcia 
grubych cz ąstek stałych, a tak że zmierzy ć wartość pH. 
34. Celem zmniejszenia zawarto ści IC filtrat napowietrza si ę powietrzem 
wolnym od CO  2 (pkt 15-e) przez 1 godzin ę, utrzymuj ąc pH na poziomie 
6,5 za pomoc ą kwasu ortofosforowego (pkt 20). Warto ść pH przywraca si ę 
do pierwotnego poziomu za pomoc ą wodorotlenku sodu (pkt 21), a po 
sedymentacji przez ok. 1 godzin ę odpowiedni ą objętość supernatantu 
pobiera si ę do inokulacji. Wspomniana procedura napowietrzania zmniejsza 
zawartość IC w inokulum. Np. gdy jako inokulum zastosowano maksymaln ą 
zalecaną objętość przefiltrowancyh, napowietrzonych ścieków (100 ml) na 
litr, ilość IC obecnego w naczyniach kontrolnej ślepej próby kszta łtowała się 
w zakresie mi ędzy 0,4 a 1,3 mg/l (14), co odpowiada 2–6,5 % C w badanej 
substancji chemicznej przy zawarto ści 20 mg C/l i 4–13 % przy zawarto ści 
10 mg C/l.  
Wody powierzchniowe  
35. Pobiera si ę próbkę odpowiedniej wody powierzchniowej. Nale ży ją utrzy­
mywać w warunkach tlenowych i u żyć w dniu pobrania. Je żeli to konieczne, 
należy zatężyć próbkę poprzez filtracj ę lub odwirowanie. Obj ętość inokulum 
do zastosowania w ka żdym z naczy ń badawczych powinna spe łniać kryteria 
podane w pkt 26.  
Gleby  
36. Pobiera si ę próbkę odpowiedniej gleby z g łębokości do 20 cm poni żej 
powierzchni gleby. Kamienie, resztki ro ślin i bezkr ęgowce nale ży usunąć 
z próbki gleby przed przesianiem jej przez sito o oczkach 2 mm (je śli 
próbka jest zbyt wilgotna, by mo żna ją było przesiać natychmiast, wówczas 
należy częściowo wysuszy ć ją powietrzem, aby u łatwić przesiewanie). 
Należy ją utrzymywa ć w warunkach tlenowych i u żyć w dniu pobrania. 
(Jeśli próbka jest transportowana w lu źno zawiązanej torbie polietylenowej, 
można ją przechowywa ć w torbie w temperaturze od 2 do 4 °C przez okres 
do jednego miesi ąca). 
Wstępne przygotowanie inokulum  
37. Inokulum mo że być wstępnie kondycjonowane do warunków eksperymen ­
talnych, lecz nie wst ępnie adaptowane do badanej substancji chemicznej. 
Wstępne kondycjonowanie mo że zmniejszy ć wydzielanie CO  2 w ślepej 
próbie. Wst ępne kondycjonowanie obejmuje napowietrzanie osadu czynnego 
po rozpuszczeniu w po żywce do 30 mg/l wilgotnym powietrzem wolnym od 
CO 2 przez maksymalnie 5-7 dni w temperaturze badania.  
PROCEDURA BADANIA  
Liczba butli  
38. Liczba butli (pkt 15-a) potrzebnych do badania b ędzie zależna od częstot­
liwości analizy i czasu trwania badania.  
39. Zaleca si ę poddawanie analizie trzech butli w wystarczaj ącej liczbie 
odstępów czasowych, tak aby mo żna było zidentyfikowa ć 10-dniowe 
okno. Na koniec badania analizuje si ę co najmniej pi ęć badanych butli 
(pkt 15-a) z zestawów a), b) i c) (zob. pkt 42), aby umo żliwić obliczenie 
przedziałów ufności wynosz ących 95 % w odniesieniu do średniej warto ści 
procentowej biodegradacji.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1426
 
Zaszczepiona po żywka  
40. Inokulum stosuje si ę w stężeniu 4 mg/l cz ąstek stałych osadu czynnego. 
Bezpośrednio przed u życiem nale ży przygotowa ć wystarczaj ącą ilość 
zaszczepionej po żywki poprzez dodanie na przyk ład 2 ml odpowiednio 
spreparowanego osadu czynnego (pkt 27-32) w dawce 2 000 mg/l do 1 
litra pożywki mineralnej (pkt 19). W przypadku wykorzystania ścieków 
oczyszczonych nale ży dodać maksymalnie 100 ml odp ływu (pkt 33) do 
900 ml po żywki mineralnej (pkt 19) i rozcie ńczyć pożywką do objętości 
1 litra.  
Przygotowanie butli  
41. Podwielokrotno ści zaszczepionej po żywki rozdziela si ę do replikowanych 
butli, aby zapewni ć stosunek obj ętości fazy gazowej nad roztworem do 
objętości cieczy wynosz ący 1:2 (np. doda ć 107 ml do butli o pojemno ści 
160 ml). Mo żna zastosowa ć inne proporcje – zob. ostrze żenie w pkt 11. 
Podczas korzystania z ka żdego rodzaju inokulum nale ży dopilnowa ć, aby 
zaszczepiona po żywka była w wystarczaj ącym stopniu wymieszana, co ma 
na celu zapewnienie równego rozdzielenia cieczy mi ędzy butle do badania.  
42. Przygotowuje si ę zestawy butli (pkt 15a) zawieraj ące następujące elementy:  
a) naczynia do badania (oznaczone jako F  T ) zawieraj ące badaną substancj ę 
chemiczn ą; 
b) próby ślepe (oznaczone jako F  B ) zawieraj ące wyłącznie pożywkę do 
badania wraz z inokulum; nale ży równie ż dodać wszelkie substancje 
chemiczne, rozpuszczalniki, środki lub filtry z w łókna szklanego u żyte 
do wprowadzenia badanej substancji chemicznej do naczynia do badania;  
c) naczynia (oznaczone jako F  C ) zawieraj ące substancj ę odniesienia na 
potrzeby sprawdzenia procedury;  
d) w razie potrzeby naczynia (oznaczone jako F  I ) służące do sprawdzenia 
możliwych skutków hamuj ących badanej substancji chemicznej, zawie ­
rające zarówno badan ą substancj ę chemiczn ą, jak i substancj ę odniesienia 
w takim samym st ężeniu (pkt 24) jak odpowiednio w butlach F  T i F C ; 
e) naczynia (oznaczone jako F  S ) służące do sprawdzenia mo żliwego abio ­
tycznego rozk ładu jak a) plus 50 mg/l HgCl  2 lub wysterylizowane 
w inny sposób (np. poprzez autoklawowanie).  
43. Rozpuszczalne w wodzie badane substancje chemiczne i substancje odnie ­
sienia dodaje si ę jako wodne roztwory podstawowe (pkt 22, 23 i 24), aby 
uzyskać stężenie wynosz ące 10–20 mg C/l.  
44. Nierozpuszczalne badane substancje chemiczne i nierozpuszczalne 
substancje odniesienia dodaje si ę do butli w ró żny sposób (zob. pkt 22a–e), 
w zależności od charakteru badanej substancji chemicznej, albo przed doda ­
niem zaszczepionej po żywki, albo pó źniej – zale żnie od metody post ępo­
wania z badan ą substancj ą chemiczn ą. W przypadku korzystania z jednej 
z procedur okre ślonych w pkt 22a–e, butle na potrzeby ślepej próby F  B (pkt 
42b) nale ży potraktowa ć w podobny sposób, lecz z pomini ęciem badanej 
substancji chemicznej lub substancji odniesienia.  
45. Lotne badane substancje chemiczne nale ży wstrzykn ąć do szczelnie 
zamkniętych butli (pkt 47) za pomoc ą mikrostrzykawki. Dawk ę oblicza 
się w oparciu o wstrzykni ętą objętość oraz gęstość badanej substancji 
chemicznej.  
46. W razie konieczno ści do naczy ń należy dodać wody, aby uzyska ć taką samą 
objętość cieczy w ka żdym naczyniu. Trzeba zagwarantowa ć, że stosunek 
objętości fazy gazowej nad roztworem do obj ętości cieczy (zazwyczaj 1:2) 
i stężenie badanej substancji chemicznej by ły takie, by w fazie gazowej by ła 
dostępna wystarczaj ąca ilość tlenu, aby umo żliwić całkowitą biodegradacj ę. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1427
 
47. Nast ępnie wszystkie butle szczelnie si ę zamyka, na przyk ład przykrywk ą 
z kauczuku butylowego i aluminiow ą nakrętką. Lotne badane substancje 
chemiczne nale ży dodać na tym etapie (pkt 45). Je żeli spadek st ężenia 
rozpuszczalnego w ęgla organicznego w roztworze testowym ma by ć moni­
torowany, a analizy czasu zerowego maj ą być przeprowadzone dla wst ęp­
nego stężenia węgla nieorganicznego (sterylne kontrole, pkt 42) lub innych 
wyznaczników, nale ży odjąć odpowiedni ą próbkę z naczynia do badania. To 
naczynie do badania i jego zawarto ść następnie odrzuca si ę. 
48. Szczelnie zamkni ęte butle umieszcza si ę na wytrz ąsarce obrotowej (pkt 
15d), ustawiaj ąc wystarczaj ącą szybkością wstrząsania, aby zawarto ść butli 
była dobrze wymieszana i utrzymywana w zawiesinie (np. 150-200 obr./ 
min) i inkubuje w ciemno ści w temperaturze 20 °C, któr ą należy utrzy­
mywać z maksymalnym odchyleniem ± 1 °C.  
Pobieranie próbek  
49. Schemat pobierania próbek b ędzie zale żał od okresu zastoju i szybko ści 
biodegradacji badanej substancji chemicznej w uj ęciu kinetycznym. Butle 
są przeznaczane do analizy w dniu pobierania próbek, który powinien przy ­
padać przynajmniej raz w tygodniu lub cz ęściej (np. dwa razy w tygodniu), 
jeśli potrzebna jest pe łna krzywa rozk ładu. Wymagan ą liczbę replikowanych 
butli, odpowiadaj ących butlom F  T , F B i F C oraz F  I i F S , jeżeli są używane, 
zabiera si ę z wytrząsarki (zob. pkt 42). Zazwyczaj badanie trwa 28 dni. Je śli 
krzywa biodegradacji wskazuje na to, że plateau osi ągnięto przed 28. dniem, 
wówczas badanie mo żna zakończyć wcześniej niż 28. dnia. Nale ży pobrać 
próbki z pi ęciu butli przeznaczonych na 28. dzie ń badania do analizy 
i wykorzysta ć wyniki do obliczenia granic ufno ści lub wspó łczynnika 
zmienności wartości procentowej biodegradacji. Z butli na potrzeby kontroli 
dotyczących hamowania i abiotycznego rozk ładu nie trzeba pobiera ć próbek 
tak często jak z innych butli – wystarczy w 1. i 28. dniu.  
Analiza w ęgla nieorganicznego  
50. Wytwarzanie CO  2 w butlach okre śla się poprzez pomiar wzrostu st ężenia 
węgla nieorganicznego podczas inkubacji. Istniej ą dwie dost ępne metody 
zalecane na potrzeby pomiaru ilo ści węgla nieorganicznego wytworzonej 
w ramach badaniu. Opisano je bezpo średnio poni żej. Poniewa ż metody 
mogą dawać nieco odmienne wyniki, w jednej rundzie badania nale ży 
korzystać tylko z jednej z nich.  
51. Metod ę a) zaleca si ę, jeżeli pożywka mo że zawiera ć pozostałości np. bibu ły 
filtracyjnej z w łókna szklanego lub nierozpuszczaln ą badaną substancj ę 
chemiczn ą. Analizę tę można wykona ć za pomoc ą chromatografu gazo ­
wego, jeżeli analizator w ęgla jest niedost ępny. Ważne jest, aby podczas 
analizy gazu z fazy gazowej nad roztworem temperatura butli by ła równa 
temperaturze badania lub zbli żona do niej. Metoda b) mo że być łatwiejsza 
dla laboratoriów wykorzystuj ących do pomiaru w ęgla nieorganicznego 
analizatory w ęglowe. Wa żne jest, aby roztwór wodorotlenku sodu (pkt 21) 
używany do przekszta łcenia CO  2 w węglan był świeżo przygotowany lub by 
jego zawarto ść węgla nieorganicznego by ła znana, tak aby mo żna było 
uwzględnić go przy obliczaniu wyników badania (zob. pkt 66-b).  
Metoda a): zakwaszenie do pH < 3  
52. Przed rozpocz ęciem każdej partii analiz analizator w ęgla nieorganicznego 
jest kalibrowany przy u życiu odpowiedniej normy dotycz ącej węgla nieorga ­
nicznego (np. 1 % w/w CO  2 w N  2 ). Stężony kwas ortofosforowy (pkt 20) 
wstrzykuje si ę przez korek ka żdej butli, z których pobiera si ę próbki, aby 
obniżyć pH pożywki do < 3 (np. dodaj ąc 1 ml do 107 ml po żywki do 
badania). Butle ponownie umieszcza si ę w wytrz ąsarce. Po godzinie 
wytrząsania w temperaturze badania butle s ą usuwane z wytrz ąsarki, 
podwielokrotno ści (np. 1 ml) gazu s ą pobierane z fazy gazowej nad 
roztworem w ka żdej butli i wstrzykiwane do analizatora w ęgla nieorganicz ­
nego. Zmierzone st ężenia węgla nieorganicznego rejestruje si ę w mg C/l.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1428
 
53. Zgodnie z zasad ą tej metody po zakwaszeniu do pH < 3 i pozostawieniu do 
ustalenia stanu równowagi w temperaturze 20 °C sta ła równowagi rozmiesz ­
czenia CO  2 między fazami ciek łą a gazow ą w butlach do badania wynosi 
1,0, jeżeli jest mierzona jako st ężenie (13). Nale ży to co najmniej raz 
wykazać dla układu badawczego w nast ępujący sposób:  
Przygotowa ć butle zawieraj ące 5 i 10 mg/l w ęgla nieorganicznego, wyko ­
rzystując roztwór bezwodnego w ęglanu sodu (Na  2 CO 3 ) w wolnej od CO  2 
wodzie przygotowanej poprzez zakwaszenie wody do pH 6,5 za pomoc ą 
stężonego kwasu ortofosforowego (pkt 20), napowietrzenie przez noc 
powietrzem niezawieraj ącym CO  2 i podniesienie pH do poziomu oboj ętnego 
za pomoc ą zasady. Nale ży dopilnowa ć, aby stosunek obj ętości fazy gazowej 
nad roztworem do obj ętości cieczy by ł taki sam jak w badaniu (np. 1:2). 
Należy zakwasi ć i pozostawi ć do ustalenia stanu równowagi w sposób 
opisany w pkt 52, a nast ępnie zmierzy ć stężenie węgla nieorganicznego 
w fazie gazowej nad roztworem i w fazie ciek łej. Trzeba sprawdzi ć, czy 
oba stężenia są jednakowe w dopuszczalnych granicach b łędu badania. 
Jeżeli nie, operator powinien dokona ć przeglądu procedur. Tej kontroli 
rozmieszczenia w ęgla nieorganicznego pomi ędzy fazami ciek łą i gazow ą 
nie trzeba przeprowadza ć za każdym razem, gdy wykonuje si ę badanie. 
Przypuszczalnie mo żna byłoby przeprowadza ć ją podczas kalibracji.  
54. Jeżeli ma zosta ć zmierzone usuwanie rozpuszczalnego w ęgla organicznego 
(wyłącznie w przypadku badanych substancji chemicznych rozpuszczalnych 
w wodzie), próbki nale ży pobrać z fazy ciek łej z oddzielnych (niezakwa ­
szonych) butli, przefiltrowa ć przez filtr membranowy i wstrzykn ąć do anali­
zatora rozpuszczalnego w ęgla organicznego. W razie konieczno ści można te 
butle wykorzysta ć do innych analiz, aby zmierzy ć biodegradacj ę pierwotn ą. 
Metoda b): przekszta łcenie CO  2 w węglan 
55. Przed ka żdą serią analiz analizator w ęgla nieorganicznego jest kalibrowany 
przy użyciu odpowiedniej normy - na przyk ład roztworu wodorow ęglanu 
sodu (NaHCO  3 ) w wodzie wolnej od CO  2 (zob. pkt 53) w przedziale od 0 
do 20 mg/l jako w ęgiel nieorganiczny. Roztwór wodorotlenku sodu (7M, 
pkt 21) (np. 1 ml na 107 ml po żywki) wstrzykuje si ę przez przykrywk ę 
każdej butli, z których pobiera si ę próbki, a butle wytrz ąsa się przez godzin ę 
w temperaturze badania. Nale ży użyć tego samego roztworu NaOH na 
wszystkich butlach przeznaczonych na okre ślony dzie ń, lecz niekoniecznie 
podczas ka żdego pobierania próbek w czasie trwania badania. Je żeli przy 
każdym pobieraniu próbek potrzebne s ą bezwzględne ślepe warto ści węgla 
nieorganicznego, oznaczanie w ęgla nieorganicznego w roztworze NaOH 
będzie niezb ędne przy ka żdym użyciu tego roztworu. Butle wyjmuje si ę 
z wytrząsarki i odstawia do ustalenia. Z ka żdego naczynia pobiera si ę 
strzykawk ą odpowiednie obj ętości (np. 50 do 1 000 μl) fazy ciek łej. Próbki 
wstrzykuje si ę do analizatora w ęgla nieorganicznego i rejestruje st ężenia. 
Należy dopilnowa ć, aby używany analizator by ł odpowiednio wyposa żony 
do analizowania próbek zasadowych otrzymywanych w ramach tej metody.  
56. Zgodnie z zasad ą tej metody po dodaniu zasady i wytrz ąsaniu stężenie 
węgla nieorganicznego w fazie gazowej nad roztworem jest nieznaczne. 
Należy to co najmniej raz skontrolowa ć dla układu badawczego, stosuj ąc 
normy dotycz ące węgla nieorganicznego, poprzez dodanie zasady, pozosta ­
wienie do ustalenia stanu równowagi i zmierzenie st ężenia węgla nieorga ­
nicznego w fazie gazowej nad roztworem i w fazie ciek łej (zob. pkt 53). 
Stężenie w fazie gazowej nad roztworem powinno by ć zbliżone do zera. Tej 
kontroli praktycznie ca łkowitej absorpcji CO  2 nie trzeba przeprowadza ć za 
każdy razem, gdy przeprowadza si ę badanie.  
57. Jeżeli ma zosta ć zmierzone usuwanie rozpuszczalnego w ęgla organicznego 
(wyłącznie w przypadku badanych substancji chemicznych rozpuszczalnych 
w wodzie), próbki nale ży pobrać z fazy ciek łej z oddzielnych (niezawieraj ­ 
ących dodatku zasady) butli, przefiltrowa ć przez filtr membranowy 
i wstrzykn ąć do analizatora rozpuszczalnego w ęgla organicznego. W razie 
konieczno ści można te butle wykorzysta ć do innych analiz, aby zmierzy ć 
biodegradacj ę pierwotn ą. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Obliczanie wyników  
58. Przy za łożeniu 100 % mineralizacji badanej substancji chemicznej na CO  2 , 
nadwyżka ThIC wytworzonego w ślepych próbach kontrolnych jest równa 
TOC dodanemu do ka żdej butli do badania na pocz ątku badania, czyli:  
ThIC ¼ TOC  
Całkowita masa (mg) nieorganicznego w ęgla (TIC) w ka żdej butli wynosi: 
TIC ¼ ðmg Cw plynie þ mg Cw fazie gazowej nad roztworem Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ równanie [1]  
gdzie:  
V L = objętość płynu w butli (w litrach),  
CL = st ężenie IC w p łynie (mg/l w przeliczeniu na w ęgiel),  
VH = obj ętość fazy gazowej nad roztworem (w litrach),  
CH = st ężenie IC w fazie gazowej nad roztworem (mg/l w przeliczeniu 
węgiel).  
Obliczenia TIC na potrzeby dwóch metod analitycznych stosowanych do 
pomiaru w ęgla nieorganicznego w opisanym tu badaniu omówiono w pkt 60 
i 61 poni żej. Procentow ą biodegradacj ę (% D ) w każdym przypadku uzys ­
kuje się w następujący sposób: 
%D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 równanie [2]  
gdzie:  
TICt = mg TIC w butli do badania w czasie t,  
TICb = średni mg TIC w butlach zawieraj ących próby ślepe w czasie t,  
TOC = mg TOC dodany na pocz ątku badania do naczynia do badania.  
Procentow ą biodegradacj ę % D oblicza si ę dla butli do badania (F  T ), butli 
odniesienia (F  C ) oraz, je śli zastosowano, butli do monitorowania dzia łania 
hamującego (F  I ), na podstawie odpowiednich ilo ści TIC wytworzonego do 
czasu każdego pobierania próbek.  
59. W przypadku znacz ącego wzrostu zawarto ści TIC w kontrolach sterylnych 
(F S ) w czasie trwania badania mo żna uznać, że zaszedł abiotyczny rozk ład 
badanej substancji chemicznej i nale ży to uwzgl ędnić w obliczeniach D w 
równaniu [2].  
Zakwaszanie do pH < 3  
60. Jako że zakwaszenie do pH < 3 i ustalenie równowagi skutkuj ą wyrówna ­
niem się stężenia TIC w fazie p łynnej i gazowej, jedynie st ężenie IC w fazie 
gazowej wymaga pomiaru. Tym samym z równania [1]  
TIC ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , gdzie V  B = objętość butli z surowic ą. 
Przekszta łcenie CO  2 w węglan 
61. W ramach tej metody obliczenia wykonuje si ę tak jak w równaniu [1], ale 
nie uwzgl ędnia się nieznacznej ilo ści IC w fazie gazowej, czyli  
V H Ü C H ¼ 0, a TIC ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Prezentacja wyników  
62. Krzyw ą biodegradacji uzyskuje si ę poprzez wykre ślenie procentowej biode ­
gradacji D w czasie inkubacji oraz, je śli jest to mo żliwe, wskazuje si ę fazę 
zastoju, faz ę biodegradacji, 10-dniowe „okno” i faz ę plateau, czyli faz ę, 
w której osi ągnięto maksymalny rozk ład, a krzywa biodegradacji wyrówna ła 
się. Jeśli uzyskano porównywalne wyniki dla równoleg łych naczy ń do 
badania F  T (& 20 % ró żnicy), wykre śla się średnią krzywą (zob. dodatek 
2, rysunek 1); je śli nie – wykre śla się krzywe dla ka żdego naczynia. Okre śla 
się średnią wartość procentowej biodegradacji w fazie plateau lub dokonuje 
się oszacowania najwy ższej warto ści (np. kiedy krzywa spada w fazie 
plateau), ale istotne jest, by mie ć na uwadze, że w tym drugim przypadku 
wartość ta nie mo że być wartością odstającą. W sprawozdaniu z badania 
należy wskaza ć maksymalny stopie ń biodegradacji jako „stopie ń biodegra ­
dacji badanej substancji chemicznej”. Je śli liczba naczy ń do badania nie 
była wystarczaj ąca do wskazania fazy plateau, zmierzone dane 
z ostatniego dnia badania wykorzystuje si ę do obliczenia warto ści średniej. 
Taka ostatnia warto ść, będąca średnią pięciu replikatów, pozwala na wska ­
zanie dok ładności, z jak ą określono warto ść procentow ą biodegradacji. 
Należy także przedstawi ć wartość uzyskaną na koniec okresu 10-dniowego 
„okna”.  
63. W taki sam sposób wykre śla się krzywą dla substancji odniesienia, F  C , oraz, 
jeśli je zastosowano, kontroli eliminacji abiotycznej, F  S , i kontroli dzia łania 
hamującego, F  I . 
64. Ilości TIC obecne w ślepych próbach kontrolnych (F  B ) odnotowuje si ę jako 
te w kolbach F  S (kontrola abiotyczna), je śli takie naczynia uwzgl ędniono 
w badaniu.  
65. Nale ży obliczy ć D dla naczy ń F I , w oparciu o teoretyczny wynik IC 
spodziewany jedynie ze sk ładnika odniesienia mieszaniny. Je śli, w dniu 
28. [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] × 100 > 25 %, mo żna założyć, że badana 
substancja chemiczna zahamowa ła działanie inokulum, co mo że wiązać 
się z niskimi warto ściami D  FT uzyskanymi w warunkach badania. 
W takim przypadku badanie mo żna powtórzy ć z wykorzystaniem ni ższego 
badanego st ężenia, a najlepiej zmniejszaj ąc DIC w inokulum oraz TIC 
powstały w ślepych próbach kontrolnych, jako że w przeciwnym wypadku 
mniejsze st ężenie zmniejszy dok ładność metody. Mo żna także wykorzysta ć 
inne inokulum. Je śli w butelkach F  S (abiotyczne) obserwuje si ę znaczny 
wzrost (> 10 %) ilo ści TIC, mog ły zajść procesy rozk ładu abiotycznego.  
Ważność wyników  
66. Badanie uznaje si ę za ważne, jeśli: 
a) średni procentowy rozk ład w naczyniach F  C zawierających substancj ę 
odniesienia wynosi > 60 % do 14. dnia inkubacji; oraz  
b) średnia ilo ść TIC obecnego w ślepych próbach kontrolnych F  B na koniec 
badania wynosi > 3 mg C/l.  
Jeśli te pu łapy nie zosta ły osiągnięte, badanie nale ży powtórzy ć 
z wykorzystaniem inokulum z innego źródła lub nale ży dokona ć przeglądu 
procedur. Na przyk ład, jeśli problem stanowi wysoka warto ść IC wytwo ­
rzonego w ślepej próbie, nale ży zastosowa ć procedur ę opisaną w pkt 27–32.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Procentowy rozk ład w naczyniu F  C zawierającym substancj ę odniesienia. 
( 2 ) Procentowy rozk ład w naczyniu F  I .
 67. Jeśli badana substancja chemiczna nie osi ąga 60 % ThIC oraz wykazano, że 
nie ma dzia łania hamuj ącego (pkt 65), badanie mo żna powtórzy ć ze zwięk­
szonym st ężeniem inokulum (do 30 mg/l osadu czynnego i 100 ml wcieku/l) 
lub inokulami z innych źródeł, zwłaszcza je śli rozkład mieścił się 
w przedziale 20 do 60 %.  
Interpretacja wyników  
68. Biodegradacja > 60 % ThIC w ci ągu 10-dniowego „okna” w opisanym tu 
badaniu pokazuje, że badana substancja chemiczna ulega szybkiej biodegra ­
dacji w warunkach tlenowych.  
69. Jeśli nie osiągnięto wartości progowej 60 % ThIC, nale ży określić wartość 
pH w pożywkach w butlach, których odczynu nie zmieniono na kwa śny ani 
zasadowy; warto ść poniżej 6,5 mo że wskazywa ć, że doszło do nitryfikacji. 
W takim przypadku badanie nale ży powtórzy ć z zastosowaniem roztworu 
buforowego o wy ższym stężeniu.  
Sprawozdanie z badania  
70. Nale ży sporządzić tabelę z % D dla ka żdej butli do badania (F  T ), butli 
odniesienia (F  c ) oraz, je śli zastosowano, kontrolnej butli dzia łania hamuj ą­
cego (F  I ) dla każdego dnia pobierania próbek. Je śli dla butli z replikatami 
uzyskano porównywalne wyniki, nale ży wykreślić krzywą średniej % D w 
czasie. Nale ży odnotowa ć wartości TIC w ślepych próbach kontrolnych (F  B ) 
oraz w sterylnych próbach kontrolnych (F  S ), a także DOC lub inne 
wyznaczniki oraz ich procentowe usuwanie.  
71. Nale ży określić średnią wartość % D w fazie plateau lub zastosowa ć 
najwyższą wartość, jeśli krzywa biodegradacji spada w fazie plateau, oraz 
przedstawi ć ją jako „stopie ń biodegradacji badanej substancji chemicznej”. 
Ważne, by upewni ć się, że w drugim przypadku najwy ższa warto ść nie jest 
wartością odstającą. 
72. Sprawozdanie z badania musi zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer w rejestrze CAS, wzór 
strukturalny i istotne w łaściwości fizykochemiczne,  
— czysto ść (zanieczyszczenia) badanej substancji chemicznej.  
Warunki badania  
— odniesienie do niniejszej metody badawczej,  
— opis zastosowanego uk ładu badawczego (np. obj ętość naczynia, stosunek 
przestrzeni nadpowierzchniowej do p łynu, metoda mieszania itp.),  
— wprowadzenie badanej substancji chemicznej oraz substancji odniesienia 
do układu badawczego; zastosowane badane st ężenie i ilo ść węgla 
dawkowana do ka żdej butli do badania, wszelkie zastosowane rozpusz ­
czalniki,  
— szczegó łowe informacje na temat zastosowanego inokulum, wszelkiego 
wstępnego poddawania dzia łaniu substancji i wst ępnego przygotowywa ­
nia, 
— temperatura inkubacji,  
— walidacja zasady analizy IC,  
— główne cechy charakterystyczne zastosowanego analizatora IC (oraz 
wszelkie inne zastosowane metody analityczne),  
— liczba replikatów.  
Wyniki  
— dane surowe i obliczone warto ści dotycz ące biodegradowalno ści 
w formie tabeli,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— wykres procentowego rozk ładu w czasie dotycz ący badanej substancji 
chemicznej i substancji odniesienia, faza zastoju, faza rozk ładu, 10- 
dniowe „okno” oraz nachylenie krzywej,  
— procentowe usuwanie w fazie plateau, na koniec badania oraz po okresie 
10-dniowego „okna”,  
— uzasadnienie w przypadku ewentualnego odrzucenia wyników badania,  
— wszelkie inne fakty, które s ą istotne dla przeprowadzonej procedury,  
— omówienie wyników.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Rozdzia ł C.4 niniejszego za łącznika: Oznaczenie biodegradowalno ści – 
badanie wydzielania CO  2 (metoda C.4-C).  
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation. J. A. Oil Chem. Soc. 50: 
159-167.  
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153–1161.  
(4) Larson RJ, Hansmann MA i Bookland EA (1996). Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
 
(5) ISO 9439 (1990; zmienione w 1999). Water Quality – Evaluation of ulti ­
mate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium – Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substances Washington, DC.  
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922–929.  
(9) Weytjens D, Van Ginneken I i Painter HA (1994). The recovery of carbon 
dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801–812.
 
(10) Ennis DM i Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181–185.  
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). 
Appl. Env. Microbiol. 35: 51–53.  
(12) Boatman RJ, Cunningham SL i Ziegler DA (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233–243.
 
(13) Struijs J i Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204–211.
 
(14) Birch RR i Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemos ­
phere 23: 507–524.  
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust 
H, i Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegra ­
dation. Chemosphere 19: 1527–1550.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biode ­
gradability of organic compounds in an aerobic medium-method by 
analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C0  2 biodegradation test, Chemos ­
phere 34: 1813–1822.  
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed 
vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and 
Toxic Substance Washington, DC.  
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR 
i Starkey M (1999). An „inherent” biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 
3219–3235.
 
(20) Rozdzia ł C.4 niniejszego za łącznika: Oznaczenie biodegradowalno ści. 
(21) OECD (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano i M. Takatsuki; CITI). Pary ż.
 
(22) Rozdzia ł 11 niniejszego za łącznika, Badanie zahamowania oddychania 
osadu czynnego.  
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ i Dekkers ALM (1995). A rationale for 
the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biode ­
gradation 6: 319–327.  
(24) UE (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research 
Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, Zjednoczone Królestwo.  
(25) ISO 10634 (1996) Water Quality – Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Dodatek 1  
SKRÓTY I DEFINICJE  
IC: węgiel nieorganiczny  
ThCO  2 : teoretyczny dwutlenek w ęgla (mg) to ilo ść dwutlenku w ęgla obliczona 
jako wytworzona ze znanej lub zmierzonej zawarto ści węgla w badanej 
substancji chemicznej, przy pe łnej mineralizacji; wyra żana także jako mg 
dwutlenku w ęgla wydzielonego na mg badanej substancji chemicznej.  
DOC:  rozpuszczony w ęgiel organiczny to w ęgiel organiczny obecny 
w roztworze lub taki, który przechodzi przez filtr o średnicy 0,45 mikrometra 
lub pozostaje w supernatancie po odwirowaniu przy ok. 4 000 g (oko ło 40 000 
m sec  -2 ) przez 15 min.  
DIC:  rozpuszczony w ęgiel nieorganiczny  
ThIC:  teoretyczny w ęgiel nieorganiczny  
TIC:  całkowity w ęgiel nieorganiczny  
Ulegający szybkiej biodegradacji:  arbitralna klasyfikacja substancji chemicz ­
nych, które spe łniają kryteria pewnych okre ślonych bada ń przesiewowych 
dotyczących ostatecznej biodegradacji; badania te s ą tak rygorystyczne, i ż 
zakłada się, że takie substancje chemiczne szybko i w pe łni ulegną biodegradacji 
w środowisku wodnym w warunkach tlenowych.  
10-dniowe „okno”:  10 dni bezpo średnio po osi ągnięciu 10 % biodegradacji.  
Biodegradowalno ść naturalna:  klasyfikacja substancji chemicznych, 
w przypadku których istniej ą jednoznaczne dowody na biodegradacj ę (pierwotn ą 
lub ostateczn ą) wynikaj ące z jakiegokolwiek badania biodegradowalno ści. 
Ostateczna biodegradacja tlenowa:  stopień rozkładu osiągnięty, kiedy badana 
substancja chemiczna jest w pe łni zutylizowana przez mikroorganizmy w wyniku 
wytwarzania dwutlenku w ęgla, wody, soli mineralnych i nowych elementów 
komórek (biomasa).  
Mineralizacja:  całkowity rozk ład organicznej substancji chemicznej na CO  2 
i H 2 O w warunkach tlenowych, oraz na CH  4 , CO  2 i H 2 O w warunkach beztle ­
nowych.  
Faza zastoju:  czas od pocz ątku badania do czasu aklimatyzacji lub adaptacji 
mikroorganizmów rozk ładających oraz do czasu zwi ększenia si ę stopnia biode ­
gradacji badanej substancji chemicznej lub materii organicznej do wykrywalnego 
poziomu (np. 10 % maksymalnej teoretycznej biodegradacji lub mniej, w zależności od dok ładności techniki pomiaru).
 
Faza rozk ładu:  czas od zako ńczenia okresu zastoju do czasu osi ągnięcia 90 % 
maksymalnego stopnia rozk ładu. 
Faza plateau:  faza, podczas której osi ągnięto maksymalny rozk ład, a krzywa 
biodegradacji wyrówna ła się. 
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Dodatek 2  
Przykładowa krzywa biodegradacji  
Rysunek 1  
Biodegradacja 1-oktanolu w ramach badania CO  2 w fazie gazowej nad 
roztworem
  
Glosariusz:  
Biodegradacja  
Faza rozk ładu 
Maksymalny stopie ń biodegradacji  
Faza plateau  
10-dniowe „okno”  
Czas przeprowadzania badania (dni)  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C. 30.  BIOAKUMULACJA W SK ĄPOSZCZETACH L ĄDOWYCH  
WSTĘP 
1. Niniejsza metoda badawcza jest równowa żna metodzie opisanej 
w dotycz ącej badań wytycznej OECD nr 317 (OECD TG 317) (2010). 
W odniesieniu do metod badawczych dotycz ących wpływu na środowisko 
metodę „Biokoncentracja: badanie ryb w warunkach przep ływu” (rozdzia ł 
C.13 niniejszego za łącznika (49)) oraz metod ę „Bioakumulacja 
w bentosowych sk ąposzczetach żyjących w osadzie” (53) opublikowano 
odpowiednio w 1996 i 2008 r. Ekstrapolacja danych dotycz ących bioaku ­
mulacji w gatunkach wodnych na organizmy l ądowe, takie jak d żdżownice, 
jest trudna, a cz ęsto w ogóle niemo żliwa. Do oceny bioakumulacji 
substancji chemicznych w glebie stosuje si ę obecnie modele obliczeniowe 
oparte na lipofilno ści badanej substancji chemicznej, np. (14) (37), na przy ­
kład w wytycznych technicznych UE (19). Potrzeba opracowania metody 
badawczej specyficznej dla danego ustroju zosta ła już poruszona, np. (55). 
Taka metoda jest w szczególno ści istotna w ocenie zatrucia wtórnego 
w lądowych łańcuchach pokarmowych (4). Istnieje kilka krajowych metod 
badawczych, za pomoc ą których bada si ę kwestię bioakumulacji 
w organizmach innych ni ż ryby, np. (2) i (72). Metod ę pomiaru bioakumu ­
lacji z zanieczyszczonych gleb w d żdżownicach ( Eisenia fetida , Savigny) 
i wazonkowcowatych opracowa ło Ameryka ńskie Stowarzyszenie Bada ń 
i Materia łów (ASTM) (3). Uznana na scenie mi ędzynarodowej metoda 
określania bioakumulacji w glebie wzbogaconej zwi ększy efektywno ść 
oceny ryzyka zwi ązanego z obecno ścią substancji chemicznych 
w ekosystemach l ądowych, np. (25) (29).  
2. Bezkr ęgowce spo żywające glebę są narażone na zwi ązane w glebie 
substancje chemiczne. W śród takich zwierz ąt są skąposzczety l ądowe, 
które odgrywaj ą ważną rolę dla struktury i funkcji gleb (15) (20). Sk ąposz­
czety lądowe żyją w glebie i cz ęściowo na powierzchni gleby (zw łaszcza 
w ściółce); często stanowi ą najliczniejsz ą grupę gatunków w biomasie (54). 
Przyczyniaj ąc się do bioturbacji gleby oraz stanowi ąc żer dla innych 
zwierząt, zwierzęta te mog ą mieć silny wp ływ na biodost ępność substancji 
chemicznych dla innych organizmów, takich jak bezkr ęgowce (np. 
drapieżne roztocza i chrz ąszcze; np. (64)) lub drapie żniki z grupy 
kręgowców (np. lisy i mewy) (18) (62). Niektóre gatunki sk ąposzczetów 
lądowych wykorzystywane obecnie w badaniach ekotoksykologicznych 
opisano w dodatku 5.  
3. W opracowanym przez ASTM standardowym przewodniku dotycz ącym 
przeprowadzania bada ń laboratoryjnych toksyczno ści i bioakumulacji 
w glebie z wykorzystaniem gatunku z rodziny d żdżownicowatych  Eisenia 
fetida  oraz gatunku z rodziny wazonkowcowatych  Enchytraeus albidus  (3) 
przedstawiono wiele wa żnych i użytecznych szczegó łowych informacji na 
temat wyników niniejszej metody badawczej dotycz ącej bioakumulacji 
w glebie. Inne dokumenty, do których odniesienia zawiera niniejsza metoda 
badawcza, to rozdzia ł C.13 niniejszego za łącznika „Biokoncentracja: 
badanie ryb w warunkach przep ływu” (49) oraz OECD TG 315 „Bioaku ­
mulacja w bentosowych sk ąposzczetach żyjących w osadzie” (53). Wa żnymi 
źródłami informacji na temat niniejszej metody badawczej s ą również prak­
tyczne do świadczenia dotycz ące badań nad bioakumulacj ą w glebie opisane 
w literaturze, np. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79).
 
4. Niniejsza metoda badawcza mo że w większości przypadków by ć stosowana 
w odniesieniu do stabilnych, neutralnych organicznych substancji chemicz ­
nych, które ulegaj ą adsorpcji do gleb. Za pomoc ą niniejszej metody badaw ­
czej możliwe jest badanie pod k ątem bioakumulacji wi ązanych w glebie, 
stabilnych zwi ązków metaloorganicznych. Metoda ta ma zastosowanie 
również w przypadku metali i innych pierwiastków śladowych.  
WARUNEK KONIECZNY  
5. Badania pomiaru bioakumulacji substancji chemicznej w sk ąposzczetach 
lądowych przeprowadza si ę z wykorzystaniem metali ci ężkich (zob. np. 
(63)) oraz trwa łych organicznych substancji chemicznych o warto ściach 
log K  ow pomiędzy 3,0 a 6,0, np. (40). Takie badania maj ą także zastoso ­
wanie do:  
— substancji chemicznych o log K  ow powyżej 6,0 (super-hydrofobowe 
substancje chemiczne),  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— substancji chemicznych, które nale żą do klasy organicznych substancji 
chemicznych, o których wiadomo, że mają zdolność do bioakumulacji 
w żywych organizmach, np. substancji powierzchniowo czynnych lub 
wysoce adsorpcyjnych,  
— substancji chemicznych, które wskazuj ą na zdolno ść do bioakumulacji 
z racji w łaściwości strukturalnych, np. analogi substancji chemicznych, 
o których wiadomo, że mają zdolność do bioakumulacji, oraz  
— metali.  
6. Informacje na temat badanej substancji chemicznej, takie jak nazwa zwycza ­
jowa, nazwa chemiczna (najlepiej nazwa IUPAC), wzór strukturalny, numer 
w rejestrze CAS, czysto ść, środki ostro żności, odpowiednie warunki prze ­
chowywania oraz metody analityczne, nale ży uzyskać przed rozpocz ęciem 
badania. Ponadto znane powinny by ć następujące informacje:  
a) rozpuszczalno ść w wodzie;  
b) współczynnik podzia łu oktanol/woda, K  ow ; 
c) współczynnik podzia łu gleba-woda, wyra żony jako K  oc ; 
d) prężność par;  
e) podatno ść na rozkład (np. w glebie, wodzie);  
f) znane metabolity.  
7. Można zastosowa ć badane substancje chemiczne znakowane izotopowo lub 
nieznakowane izotopowo. Aby u łatwić analizę, zaleca si ę jednak stosowanie 
substancji chemicznej znakowanej izotopowo. Tak ą decyzję należy podjąć 
na podstawie granic wykrywalno ści lub wymogu pomiaru macierzystej 
badanej substancji chemicznej i metabolitów. Je śli stosuje si ę badaną 
substancję chemiczn ą znakowan ą izotopowo i dokonuje si ę pomiaru ca łko­
witych pozosta łości radioaktywnych, wa żne jest, by znakowane izotopowo 
pozostałości, zarówno w glebie, jak i w organizmach badanych, zosta ły 
scharakteryzowane pod k ątem procentowej zawarto ści macierzystej badanej 
substancji chemicznej i znakowanej niemacierzystej substancji chemicznej, 
np. w próbkach pobranych w stanie ustalonym lub pod koniec etapu absor ­
pcji, w celu umo żliwienia obliczenia wspó łczynnika bioakumulacji dla 
macierzystej badanej substancji chemicznej i danych metabolitów w glebie (zob. pkt 50). Konieczne mo że być zmodyfikowanie opisanej tu metody, np. 
w celu zapewnienia wystarczaj ącej biomasy, na potrzeby pomiaru niezna ­
kowanych izotopowo organicznych badanych substancji chemicznych lub metali. Przy pomiarze ca łkowitych pozosta łości radioaktywnych (za pomoc ą 
scyntylacyjnego licznika cieczowego po ekstrakcji, spaleniu lub rozpusz ­
czeniu tkanek) wspó łczynnik bioakumulacji okre śla się na podstawie macie ­
rzystej badanej substancji chemicznej i metabolitów. Wspó łczynnik bioaku ­
mulacji nale ży obliczy ć na podstawie st ężenia macierzystej badanej 
substancji chemicznej w organizmach oraz ca łkowitych pozosta łości radio­
aktywnych. Nast ępnie na podstawie wspó łczynnika bioakumulacji nale ży 
obliczyć współczynnik akumulacji biota-gleba, znormalizowany do zawar ­
tości lipidów organizmu oraz zawarto ści węgla organicznego w glebie, aby 
zapewnić porównywalno ść wyników z ró żnych bada ń bioakumulacji.  
8. Toksyczno ść badanej substancji chemicznej dla gatunków wykorzystanych 
w badaniu powinna by ć znana, np. st ężenie efektywne (ECx) lub st ężenie 
śmiertelne (LCx) dla okresu etapu absorpcji (np. (19)). Wybrane st ężenie 
badanej substancji chemicznej powinno wynosi ć około 1 % jej ostrego 
bezobjawowego LC  50 , oraz powinno by ć co najmniej dziesi ęciokrotnie 
wyższe niż jej granica wykrywalno ści w glebie dla zastosowanej metody 
analitycznej. Preferowanymi warto ściami dotycz ącymi toksyczno ści są 
wartości pozyskane z d ługoterminowych bada ń nad subletalnymi punktami 
końcowymi (51) (52), je śli takie dane s ą dostępne. Jeśli jednak nie s ą one 
dostępne, pomocnych informacji dostarczy badanie toksyczno ści ostrej (zob. 
np. (23)).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Dost ępna powinna by ć odpowiednia metoda analityczna o znanej dok ład­
ności, precyzji oraz czu łości w celu oznaczenia ilo ściowego substancji 
chemicznej w badanych roztworach, w glebie oraz w materiale biologicz ­
nym, wraz ze szczegó łowymi informacjami na temat przygotowania 
i przechowywania próbek oraz kartami charakterystyki materia łów. Znane 
powinny by ć także analityczne granice wykrywalno ści jednostki badanej 
w glebie oraz tkance organizmów. Je śli stosuje si ę badaną substancj ę 
chemiczn ą znakowan ą węglem 14C, znana powinna by ć promieniotwór ­
czość właściwa (np. Bq mol-1) oraz odsetek promieniotwórczo ści związany 
z zanieczyszczeniami. Promieniotwórczo ść właściwa badanej substancji 
chemicznej powinna by ć dostatecznie wysoka, aby u łatwić analizę, zaś 
stężenia badane nie powinny wywo ływać skutków toksycznych.  
10. Badanie mo żna przeprowadzi ć z wykorzystaniem gleby sztucznej lub gleb 
naturalnych. Informacje na temat cech charakterystycznych zastosowanej gleby naturalnej, np. pochodzenia gleby lub jej sk ładników, pH, zawarto ści 
węgla organicznego, rozk ładu wielko ści cząstek (procent piasku, i łu i gliny) 
oraz zdolno ści zatrzymywania wody, powinny by ć znane przed rozpocz ę­
ciem badania (3) (48).
 
ZASADA BADANIA  
11. Parametry, które charakteryzuj ą bioakumulacj ę badanej substancji 
chemicznej obejmuj ą współczynnik bioakumulacji (BAF), sta łą szybkości 
absorpcji (k  s ) oraz sta łą szybkości eliminacji (k  e ). Ich definicje podano 
w dodatku 1.  
12. Badanie sk łada się z dwóch etapów: etapu absorpcji (nara żenia) i etapu 
eliminacji (po nara żeniu). Podczas etapu absorpcji replikaty z grupami orga ­
nizmów poddaje si ę narażeniu poprzez gleb ę, którą wzbogacono badan ą 
substancją chemiczn ą. Oprócz zwierz ąt badanych, w identycznych warun ­
kach niezawieraj ących jednak badanej substancji chemicznej przetrzymuje 
się grupy organizmów kontrolnych. Mierzy si ę masę suchą i zawarto ść 
lipidów organizmów badanych. Pomiary mo żna przeprowadzi ć 
z wykorzystaniem organizmów z grupy kontrolnej. Warto ści dotycz ące 
analizy tła (ślepa próba) mo żna uzyska ć poprzez analiz ę próbek organizmów 
kontrolnych i gleby. Na potrzeby etapu eliminacji organizmy przenosi si ę do 
gleby niezawieraj ącej badanej substancji chemicznej. Etap eliminacji jest 
zawsze wymagany, chyba że absorpcja badanej substancji chemicznej 
podczas etapu nara żenia nie by ła znacząca. Etap eliminacji dostarcza infor ­
macji na temat szybko ści, z jaką badana substancja chemiczna jest wydalana 
przez organizmy badane (np. (27)). Je śli podczas etapu absorpcji nie osi ąg­
nięto stanu ustalonego, parametry kinetyczne – kinetyczny wspó łczynnik 
bioakumulacji (BAFk), sta łą lub stałe szybko ści absorpcji i eliminacji – 
należy określić w oparciu o jednoczesne dopasowanie wyników z etapu 
absorpcji i eliminacji. St ężenie badanej substancji chemicznej w/na organiz ­
mach monitoruje si ę w trakcie obydwu etapów badania.  
13. Podczas etapu absorpcji pomiarów dokonuje si ę w chwili pobierania próbek 
przez okres trwaj ący do 14 dni (w przypadku wazonkowcowatych) lub 21 
dni (w przypadku d żdżownic), do czasu osi ągnięcia stanu ustalonego (11) 
(12) (67). Stan ustalony zachodzi, gdy wykres st ężenia w organizmach 
w czasie jest równoleg ły do osi czasu, a trzy nast ępujące po sobie analizy 
stężenia wykonane na próbkach pobranych w odst ępach czasowych co 
najmniej dwóch dni nie ró żnią się od siebie wi ęcej niż o ± 20 % na 
podstawie porówna ń statystycznych (np. analiza wariancji, analiza regresji).  
14. Etap eliminacji sk łada się z przeniesienia organizmów badanych do naczy ń 
z takim samym pod łożem, lecz niezawieraj ącym badanej substancji 
chemicznej. Podczas etapu eliminacji pomiarów dokonuje si ę w chwili 
pobierania próbek przez 14 dni (w przypadku wazonkowcowatych) lub 21 dni (w przypadku d żdżownic), o ile wcze śniej oznaczenie analityczne nie 
wykaże redukcji pozosta łości badanej substancji chemicznej w organizmach 
na poziomie 90 %. St ężenie badanej substancji chemicznej w organizmach
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1439
 
pod koniec etapu eliminacji przedstawia si ę w sprawozdaniu jako niewy ­
eliminowane pozosta łości. Współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym 
(BAFss) nale ży oblicza ć zarówno jako stosunek st ężenia w organizmach 
(Ca) i w glebie (Cs) przy ewidentnym stanie ustalonym, jak i jako kine ­
tyczny wspó łczynnik bioakumulacji (BAFK), czyli stosunek sta łej szybko ści 
absorpcji z gleby (ks) oraz sta łej szybko ści eliminacji (ke) (zob. definicje 
w dodatku 1), przy za łożeniu kinetyki reakcji pierwszego rz ędu (zob. obli ­
czenia w dodatku 2). Je śli w sposób ewidentny kinetyka reakcji pierwszego 
rzędu nie znajduje zastosowania, nale ży zastosowa ć inne modele.  
15. Stała szybkości absorbcji, sta ła szybkości eliminacji (lub sta łe, jeśli zasto­
sowano inne modele), kinetyczny wspó łczynnik bioakumulacji (BAFK) 
oraz, tam, gdzie to mo żliwe, granice ufno ści każdego z tych parametrów, 
oblicza si ę za pomoc ą komputerowych modeli równa ń (zob. wytyczne 
w dodatku 2). Odpowiednio ść dopasowania modelu mo żna określić na 
podstawie, na przyk ład, wspó łczynnika korelacji lub wspó łczynnika deter ­
minacji (wspó łczynniki o warto ściach zbli żonych do 1 wskazuj ą na dobre 
dopasowanie) lub chi-kwadrat. Zakres b łędu standardowego lub granicy 
ufności dla szacowanych parametrów tak że może wskazywa ć na odpowied ­
niość dopasowania modelu.  
16. Aby zmniejszy ć zróżnicowanie wyników badania dla badanych substancji 
chemicznych o wysokim poziomie lipofilno ści, współczynniki bioakumu ­
lacji nale ży wyrazić w odniesieniu do zawarto ści lipidów oraz w ęgla orga­
nicznego (kg w ęgla organicznego w glebie kg-1 zawarto ści lipidów 
w organizmie). Takie podej ście wynika z faktu, że w przypadku niektórych 
klas substancji chemicznych istnieje wyra źne powiązanie między zdolno ścią 
do bioakumulacji a lipofilno ścią; zostało to potwierdzone w przypadku ryb 
(47). Istnieje zwi ązek między zawarto ścią lipidów w rybach 
a bioakumulacj ą takich substancji chemicznych. W przypadku organizmów 
bentosowych stwierdzono podobne korelacje, np. (30) (44). Tak ą korelację 
wykazano tak że w przypadku sk ąposzczetów l ądowych, np. (5) (6) (7) (14). 
Jeśli dostępna jest wystarczaj ąca ilość tkanek organizmów, zawarto ść 
lipidów w zwierz ętach badanych mo żna określić z wykorzystaniem tego 
samego materia łu biologicznego, który zastosowano do okre ślenia stężenia 
badanej substancji chemicznej. Do pomiaru zawarto ści lipidów mo żna 
wykorzysta ć także zwierzęta kontrolne.  
WAŻNOŚĆ BADANIA  
17. Aby badanie by ło ważne, grupy kontrolne oraz grupy poddane dzia łaniu 
substancji musz ą spełnić następujące kryteria:  
— pod koniec badania ca łkowita śmiertelno ść podczas etapu absorpcji 
i etapu eliminacji nie powinna przekroczy ć 10 % (w przypadku d żdżow­
nic) lub 20 % (w przypadku wazonkowcowatych) ca łkowitej liczby 
organizmów wykorzystanych w badaniu,  
— w przypadku gatunków  Eisenia fetida  i Eisenia andrei  średnia strata 
masy wed ług pomiarów na koniec etapu absorpcji i na koniec etapu 
eliminacji nie powinna przekracza ć 20 % w porównaniu z pocz ątkową 
żywą wagą na początku każdego z etapów.  
OPIS METODY  
Badane gatunki  
18. Do badania bioakumulacji zaleca si ę wykorzystanie kilku gatunków 
skąposzczetów l ądowych. Najcz ęściej stosowane gatunki,  Eisenia fetida  
lub Eisenia andrei  (dżdżownicowate), lub te ż Enchytraeus albidus , Enchyt­
raeus crypticus  lub  Enchytraeus luxuriosus  (wazonkowcowate), opisano 
w dodatku 5.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Przyrządy 
19. Nale ży dołożyć starań, aby unika ć stosowania materia łów, w odniesieniu do 
wszystkich cz ęści sprzętu, które mog ą rozpuścić badaną substancj ę 
chemiczn ą, sprawić, że ulegnie ona adsorpcji, lub te ż wypłukać inne 
substancje chemiczne, a tak że materia łów, które maj ą szkodliwe dzia łanie 
na zwierz ęta badane. Mo żna zastosowa ć standardowe prostok ątne lub cylin ­
dryczne naczynia, wykonane z chemicznie oboj ętnego materia łu 
i posiadaj ące odpowiedni ą pojemno ść, zgodnie ze wska źnikiem obci ążenia, 
tj. liczbą organizmów badanych. Sprz ęt mający kontakt z badanymi po żyw­
kami może być wykonany ze stali nierdzewnej, plastiku lub szk ła. Naczynia 
do badania nale ży odpowiednio nakrywa ć, aby zapobiec uciekaniu organiz ­
mów, jednocze śnie zapewniaj ąc im wystarczaj ący dopływ powietrza. 
W przypadku substancji chemicznych o wysokich wspó łczynnikach adsorp ­
cji, takich jak syntetyczne pyretroidy, konieczne mo że być zastosowanie 
szkła silanizowanego. W takich sytuacjach sprz ęt po użyciu należy wyrzuci ć 
(49). Jednostki badane znakowane izotopowo oraz substancje lotne nale ży 
zabezpieczy ć przed uchodzeniem. Nale ży zastosowa ć pułapki (np. szklane 
płuczki gazowe) zawieraj ące odpowiednie absorbenty zatrzymuj ące wszelkie 
pozostałości odparowuj ące z naczy ń do badania.  
Gleba  
20. Badana gleba powinna by ć takiej jako ści, która pozwoli na prze życie oraz 
optymalnie tak że rozmna żanie organizmów badanych w okresie aklimaty ­
zacji i badanych okresów, przy czym takie organizmy nie powinny charak ­
teryzować się nieprawid łowym wygl ądem ani zachowaniem. Organizmy 
powinny zakopywa ć się w glebie.  
21. Jako pod łoże w badaniach zaleca si ę wykorzystanie sztucznej gleby opisanej 
w rozdziale C.8 niniejszego za łącznika (48). Opis przygotowania sztucznej 
gleby do wykorzystania w badaniach bioakumulacji oraz zalecenia dotyczące przechowywania sztucznej gleby podano w dodatku 4. Wysu ­
szoną powietrzem sztuczn ą glebę można przechowywa ć do czasu jej wyko ­
rzystania w temperaturze pokojowej.
 
22. Naturalne gleby z niezanieczyszczonych miejsc mog ą jednak równie ż 
posłużyć jako gleba badana lub jako gleba do hodowli. Gleby naturalne 
należy scharakteryzowa ć, podając co najmniej ich pochodzenie (miejsce 
zebrania), pH, zawarto ść węgla organicznego, rozk ład wielko ści cząstek 
(procent piasku, i łu i gliny), maksymaln ą zdolność zatrzymywania wody 
oraz procentow ą zawartość wilgoci (3). U żytecznych informacji powinna 
dostarczy ć także analiza gleby lub jej sk ładników pod k ątem mikrozanie ­
czyszczeń, przeprowadzona przed zastosowaniem takiej gleby. Je śli wyko­
rzystuje si ę glebę z użytków rolnych, taka gleba nie powinna by ć wcześniej 
poddawana dzia łaniu środków ochrony ro ślin ani obornika od zwierz ąt 
poddanych dzia łaniu takich substancji, przez co najmniej jeden rok 
w przypadku nawozów, a w przypadku nawozów organicznych – przez co najmniej sze ść miesięcy przed pobraniem próbek (50). Procedury mani ­
pulacji dotycz ące gleb naturalnych przed ich zastosowaniem w badaniach 
ekotoksykologicznych przeprowadzanych z wykorzystaniem sk ąposzczetów 
opisano w (3). W przypadku gleb naturalnych okres ich przechowywania w laboratorium powinien by ć możliwie jak najkrótszy.
 
Zastosowanie badanej substancji chemicznej  
23. Badan ą substancj ę chemiczn ą wprowadza si ę do gleby. Pod uwag ę należy 
wziąć fizykochemiczne w łaściwości badanej substancji chemicznej. Badan ą 
substancję chemiczn ą rozpuszczaln ą w wodzie nale ży przed jej zmieszaniem 
z glebą całkowicie rozpu ścić w wodzie. Zalecana procedura wzbogacania 
dla badanych substancji chemicznych s łabo rozpuszczalnych w wodzie obej ­
muje powleczenie badan ą substancj ą chemiczn ą jednego lub wi ększej liczby 
składników (sztucznej) gleby. Na przyk ład piasek kwarcowy, lub jego cz ęść, 
można namoczy ć w roztworze badanej substancji chemicznej 
i odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego, który nast ępnie powoli  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1441
 
odparuje do sucha. Tak ą powleczon ą frakcję można następnie wymiesza ć 
z mokrą glebą. Największą zaletą tej procedury jest to, że do gleby nie 
wprowadza si ę rozpuszczalnika. W przypadku zastosowania gleby naturalnej 
badaną substancj ę chemiczn ą można dodać poprzez wzbogacenie wysu ­
szonej powietrzem cz ęści gleby, zgodnie z opisem dotycz ącym sztucznej 
gleby powy żej, lub poprzez wmieszanie badanej substancji chemicznej do 
mokrej gleby, przeprowadzaj ąc następnie etap odparowania, je śli zastoso ­
wano środek rozpuszczaj ący. Zasadniczo w miar ę możliwości należy unikać 
kontaktu mokrej gleby z rozpuszczalnikami. Nale ży wziąć pod uwag ę nastę­
pujące kwestie (3):  
— Jeśli zastosowano rozpuszczalnik inny ni ż woda, powinien to by ć 
rozpuszczalnik, który mo żna wymiesza ć z wodą lub odprowadzi ć (na 
przykład odparowa ć), pozostawiaj ąc na glebie wy łącznie badan ą 
substancję chemiczn ą. 
— Jeśli stosuje si ę kontrolę rozpuszczalnika, nie ma potrzeby kontroli 
ujemnej. W kontroli rozpuszczalnika nale ży zastosowa ć najwyższe 
stężenie rozpuszczalnika dodane do gleby oraz rozpuszczalnik z tej 
samej partii, któr ą wykorzystano do wykonania roztworu podstawowego. 
Toksyczno ść i lotność rozpuszczalnika oraz rozpuszczalno ść badanej 
substancji chemicznej w wybranym rozpuszczalniku powinny by ć głów­
nymi kryteriami branymi pod uwag ę przy wyborze odpowiedniego 
środka rozpuszczaj ącego.  
24. W przypadku substancji chemicznych, które s ą słabo rozpuszczalne 
w wodzie oraz w rozpuszczalnikach organicznych, z dan ą ilością badanej 
substancji chemicznej mo żna wymiesza ć drobno zmielony piasek kwar ­
cowy, w ilo ści 2,0-2,5 g na jedno naczynie do badania, np. u żywając 
moździerza i t łuczka, w celu otrzymania po żądanego badanego st ężenia. 
Taką mieszanin ę piasku kwarcowego i badanej substancji chemicznej dodaje 
się do uprzednio zwil żonej gleby i dok ładnie miesza z odpowiedni ą ilością 
dejonizowanej wody w celu otrzymania wymaganej zawarto ści wilgoci. 
Otrzyman ą mieszanin ę przekłada się do naczy ń do badania. Procedur ę tę 
powtarza si ę dla każdego badanego st ężenia, a tak że przygotowuje si ę odpo­
wiednią kontrolę z wykorzystaniem drobno zmielonego piasku kwarcowego, 
w ilości 2,0-2,5 g na jedno naczynie do badania.  
25. Stężenie badanej substancji chemicznej w glebie nale ży określić po wzbo ­
gacaniu. Jednolite rozprowadzenie badanej substancji chemicznej w glebie 
należy zweryfikowa ć przed wprowadzeniem badanych organizmów. Metod ę 
zastosowan ą do wzbogacania oraz uzasadnienie wyboru okre ślonej proce ­
dury wzbogacania, nale ży przedstawi ć w sprawozdaniu (24).  
26. Równowag ę między glebą a wodą porową należy najlepiej uzyska ć przed 
dodaniem organizmów; zaleca si ę okres czasu wynosz ący cztery dni przy 
temperaturze 20 °C. W przypadku wielu organicznych substancji s łabo 
rozpuszczalnych w wodzie czas wymagany do osi ągnięcia prawdziwej 
równowagi mi ędzy frakcj ą, która uleg ła adsorpcji a frakcj ą, która uleg ła 
rozpuszczeniu, liczy si ę w dniach lub miesi ącach. W zale żności od celu 
badania, na przyk ład, jeśli dąży się do odtworzenia warunków środowisko ­
wych, wzbogacona gleba mo że być „postarzana” przez d łuższy okres, np. 
w przypadku metali mo że on wynosi ć trzy tygodnie przy temperaturze 
20 °C (22).  
Hodowla badanych organizmów  
27. Organizmy nale ży przetrzymywa ć w sta łej kulturze laboratoryjnej. 
Wytyczne na temat metod dotycz ących kultur laboratoryjnych dla gatunków  
Eisenia fetida  i Eisenia andrei  oraz gatunków z rodziny wazonkowcowatych 
przedstawiono w dodatku 5 (zob. równie ż (48) (51) (52)).  
28. Organizmy wykorzystane w badaniach nie powinny wykazywa ć dających 
się zaobserwowa ć oznak chorób, anomalii ani paso żytów.  
PRZEPROWADZENIE BADANIA  
29. Podczas etapu absorpcji organizmy s ą narażone na dzia łanie badanej 
substancji chemicznej. Etap absorpcji powinien trwa ć 14 dni (w przypadku 
wazonkowcowatych) lub 21 dni (w przypadku d żdżownic), chyba że wyka­
zano, iż osiągnięto stan ustalony.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Na potrzeby etapu eliminacji organizmy przenosi si ę do gleby niezawie ­
rającej badanej substancji chemicznej. Pierwsz ą próbkę należy pobrać po 
4-24 godzinach po rozpocz ęciu etapu eliminacji. Przyk łady harmonogramów 
pobierania próbek, dla etapu absorpcji trwaj ącego 21 dni i etapu eliminacji 
trwającego 21 dni, przedstawiono w dodatku 3.  
Organizmy badane  
31. W przypadku wielu gatunków l ądowych z rodziny wazonkowcowatych 
masa poszczególnych osobników jest bardzo niska (np. 5-10 mg masy 
mokrej na jednego osobnika w przypadku  Enchytraeus albidus  oraz jeszcze 
mniej w przypadku  Enchytraeus crypticus  lub  Enchytraeus luxuriosus ); 
w celu przeprowadzenia pomiarów masy i analizy chemicznej konieczne 
może być łączne ważenie organizmów z naczy ń do badania stanowi ących 
replikaty (tj. wszystkie organizmy z naczynia stanowi ącego replikat zostan ą 
wykorzystane do uzyskania jednego wyniku analizy tkanki). Do ka żdego 
replikatu dodaje si ę 20 osobników z rodziny wazonkowcowatych; nale ży 
wykorzysta ć co najmniej trzy replikaty. Je śli analityczna granica wykrywal ­
ności badanej substancji chemicznej jest wysoka, konieczne mo że być 
wykorzystanie wi ększej liczby organizmów. W przypadku gatunków bada ­
nych o wi ększej masie poszczególnych osobników ( Eisenia fetida  i Eisenia 
andrei ) można wykorzysta ć naczynia stanowi ące replikaty zawieraj ące 
jednego osobnika.  
32. Dżdżownice wykorzystane w badaniu powinny mie ć podobną masę (np. 
osobniki z gatunku  Eisenia fetida  i Eisenia andrei  powinny mie ć masę 
250-600 mg na jednego osobnika). Wazonkowcowate (np.  Enchytraeus 
albidus ) powinny mie ć długość około 1 cm. Wszystkie organizmy wyko ­
rzystane w konkretnym badaniu powinny pochodzi ć z tego samego źródła, 
a także powinny by ć dorosłymi zwierz ętami z klitellum (zob. dodatek 5). 
Jako że masa i wiek zwierz ęcia mogą mieć wpływ na warto ści współczyn­
nika bioakumulacji (np. z powodu ró żnej zawarto ści lipidów lub obecno ści 
jaj), takie parametry nale ży dokładnie odnotowa ć i wziąć pod uwag ę 
podczas interpretacji wyników. Ponadto w trakcie etapu nara żenia może 
dojść do złożenia kokonów, co równie ż będzie miało wpływ na warto ści 
współczynnika bioakumulacji. Zaleca si ę zważenie podpróbki organizmów 
badanych przed rozpocz ęciem badania w celu oszacowania ich średniej 
masy suchej i mokrej.  
33. Nale ży zastosowa ć wysoki stosunek gleby do organizmów w celu zminima ­
lizowania spadku st ężenia badanej substancji chemicznej w glebie podczas 
etapu absorpcji. W przypadku gatunków  Eisenia fetida  i Eisenia andrei  
zaleca się minimaln ą ilość wynoszącą 50 g suchej masy gleby na jeden 
organizm, a w przypadku wazonkowcowatych – co najmniej 10-20 g suchej masy gleby na jedno naczynie do badania. Naczynia powinny 
zawierać warstwę gleby głębokości 2-3 cm (w przypadku wazonkowcowa ­
tych) lub 4-5 cm (w przypadku d żdżownic).
 
34. Organizmy zastosowane w badaniu usuwa si ę z hodowli (np. wazonkowco ­
wate za pomoc ą pęsety jubilerskiej). Doros łe zwierzęta przenosi si ę do 
badanej gleby niepoddanej dzia łaniu badanej substancji chemicznej w celu 
ich aklimatyzacji, oraz karmi (zob. pkt 36). Je śli warunki badania ró żnią się 
od warunków hodowli, do przystosowania organizmów do warunków 
badania powinien wystarczy ć etap aklimatyzacji trwaj ący 24-72 godziny. 
Po aklimatyzacji d żdżownice op łukuje się w szklanych naczyniach (np. 
szalkach Petriego) z czyst ą wodą, a następnie waży przed wprowadzeniem 
ich do gleby badanej. Przed wa żeniem nadmiar wody nale ży usunąć 
z dżdżownic poprzez delikatne otarcie ich o kraw ędź naczynia lub poprzez 
ich ostrożne osuszenie za pomoc ą lekko zwil żonego ręcznika papierowego.  
35. Zachowania badanych organizmów zwi ązane z zakopywaniem si ę w glebie 
należy obserwowa ć i odnotowywa ć. W badaniach z wykorzystaniem 
dżdżownic zwierz ęta (kontrolne i poddawane dzia łaniu substancji) zazwy ­
czaj zakopuj ą się w glebie w ci ągu okresu trwaj ącego kilka godzin. Nale ży 
to sprawdzi ć nie później niż 24 godziny po wprowadzeniu organizmów do 
naczyń do badania. Je śli dżdżownice nie zakopuj ą się w glebie (np. ponad 
10 % organizmów przez ponad po łowę etapu absorpcji), oznacza to, że 
warunki badania nie s ą odpowiednie lub badane organizmy nie s ą zdrowe.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1443
 
W takim przypadku badanie nale ży przerwa ć i powtórzy ć. Wazonkowco ­
wate żyją w większości przypadków w porach w glebie oraz ich integument 
często może jedynie cz ęściowo pozostawa ć w kontakcie z otaczaj ącym ich 
podłożem. Zakłada się, że narażenie wazonkowcowatych zakopuj ących się 
w glebie i niezakopuj ących się jest równowa żne, a wi ęc w przypadku 
wazonkowcowatych niezakopuj ących się powtórzenie badania nie jest 
konieczne.  
Karmienie  
36. Nale ży zaplanowa ć karmienie, je śli stosuje si ę glebę z niską całkowitą 
zawartością węgla organicznego. Je śli zastosowano gleb ę sztuczną, zaleca 
się tygodniow ą porcję pożywienia (tj. organizmy nale ży karmić raz na 
tydzień) wynosz ącą 7 mg wysuszonego obornika na g masy suchej gleby 
w przypadku d żdżownic, oraz tygodniow ą porcję wynoszącą 2-2,5 mg zmie ­
lonych płatków owsianych na g masy suchej gleby w przypadku wazon ­
kowcowatych (11). Pierwsz ą porcję pożywienia nale ży wymiesza ć z glebą 
bezpośrednio przed dodaniem badanych organizmów. Zaleca si ę stosowanie 
tego samego rodzaju po żywienia co w przypadku hodowli (zob. dodatek 5).  
Światło i temperatura  
37. Badania nale ży przeprowadza ć w warunkach kontrolowanego cyklu światło/ 
ciemność 16/8 godzin, z zalecanym nat ężeniem światła na obszarze 
z naczyniami do badania na poziomie 400-800 luksów (3). Temperatura przeprowadzania badania powinna wynosi ć 20 ± 2 °C przez ca ły czas 
trwania badania.
 
Badane st ężenia 
38. Stosuje si ę jedno st ężenie. Sytuacje, w których wymagane jest dodatkowe 
stężenie lub st ężenia, nale ży uzasadni ć. Jeśli toksyczno ść (ECx) badanej 
substancji chemicznej jest zbli żona do analitycznej granicy wykrywalno ści, 
zaleca się stosowanie badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo 
z wysokim poziomem promieniotwórczo ści właściwej. W przypadku metali 
stężenie powinno by ć wyższe niż poziom naturalnego t ła w tkankach 
i glebie.  
Replikaty  
39. Minimalna liczba naczy ń stanowi ących replikaty poddanych dzia łaniu 
substancji na potrzeby pomiarów kinetycznych (etap absorpcji i eliminacji) 
powinna wynosi ć trzy na jeden punkt pobierania próbek. Ca łkowita liczba 
przygotowanych replikatów powinna by ć wystarczaj ąca, by obj ąć wszystkie 
pobrania próbek podczas etapu absorpcji i eliminacji.  
40. Na potrzeby obserwacji biologicznych i pomiarów (np. stosunek masy 
suchej do masy mokrej, zawarto ść lipidów) oraz na potrzeby analizy st ężeń 
tła w organizmach i glebie, nale ży zapewni ć co najmniej 12 naczy ń stano­
wiących replikaty kontroli ujemnej (cztery pobrane na pocz ątku i cztery na 
koniec etapu absorpcji, oraz cztery pobrane na koniec etapu eliminacji), je śli 
nie zastosowano rozpuszczalnika innego ni ż woda. Je śli do zastosowania 
badanej substancji chemicznej wykorzystano środek rozpuszczaj ący, oprócz 
replikatów poddanych dzia łaniu substancji nale ży zapewni ć kontrol ę 
rozpuszczalnika obejmuj ącą wszystkie sk ładniki prócz jednostki badanej 
(na początku etapu absorpcji nale ży pobrać próbki z czterech naczy ń stano­
wiących replikaty oraz cztery próbki na koniec etapu absorpcji i cztery na 
koniec etapu eliminacji). W takim przypadku mo żna zapewni ć także cztery 
dodatkowe naczynia stanowi ące replikaty kontroli ujemnej (bez rozpuszczal ­
nika) na potrzeby opcjonalnego pobierania próbek na koniec etapu absor ­
pcji. Takie replikaty mo żna porówna ć pod kątem parametrów biologicznych 
z kontrolą rozpuszczalnika w celu uzyskania informacji na temat mo żliwego 
wpływu rozpuszczalnika na organizmy badane. Zaleca si ę zapewnienie 
wystarczaj ącej liczby dodatkowych rezerwowych naczy ń stanowi ących 
replikaty (np. o śmiu) na potrzeby poddawania dzia łaniu substancji i kontroli.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1444
 
Częstotliwość pomiarów jako ści gleby  
41. pH gleby, zawarto ść wilgoci w glebie oraz jej temperatur ę (stałą) 
w pomieszczeniu badawczym nale ży mierzy ć na pocz ątku i na ko ńcu 
etapu absorpcji i etapu eliminacji. Raz na tydzie ń należy skontrolowa ć 
zawartość wilgoci w glebie poprzez zwa żenie naczy ń do badania oraz 
porównanie faktycznych mas z pocz ątkowymi masami na pocz ątku badania. 
Straty wody nale ży uzupełniać poprzez dodanie dejonizowanej wody.  
Pobieranie próbek oraz analiza organizmów i gleby  
42. Przyk ładowy harmonogram etapów absorpcji i eliminacji w badaniach 
bioakumulacji z wykorzystaniem d żdżownic i wazonkowcowatych przedsta ­
wiono w dodatku 3.  
43. Próbki gleby pobiera si ę z naczyń do badania w celu okre ślenia stężenia 
badanej substancji chemicznej przed dodaniem organizmów, a tak że podczas 
etapu absorpcji i etapu eliminacji. Podczas badania okre śla się stężenia 
badanej substancji chemicznej w organizmach i glebie. Zasadniczo mierzy się całkowite stężenia w glebie. Opcjonalnie mo żna dokona ć pomiaru st ężeń 
w wodzie porowej. W takim przypadku nale ży przed rozpocz ęciem badania 
przedstawi ć uzasadnienie i odpowiednie metody oraz takie informacje 
należy uwzględnić także w sprawozdaniu.
 
44. Próbki organizmów i gleby pobiera si ę co najmniej sze ść razy podczas etapu 
absorpcji i eliminacji. Je śli wykazano stabilno ść badanej substancji chemicz ­
nej, liczb ę analiz gleby mo żna zmniejszy ć. Zaleca si ę analizowanie co 
najmniej trzech replikatów na pocz ątku i na ko ńcu etapu absorpcji. Je śli 
stężenie w glebie mierzone na ko ńcu etapu absorpcji ró żni się od stężenia 
początkowego o ponad 30 %, próbki gleby pobrane w innych datach nale ży 
również poddać analizie.  
45. Za ka żdym razem przy pobieraniu próbek nale ży usunąć z gleby organizmy 
znajdujące się w danym replikacie (np. przez wy łożenie gleby z replikatu na 
płytką tackę i wyjęcie organizmów za pomoc ą miękkiej pęsety jubilerskiej), 
a następnie opłukać je szybko w wodzie na p łytkiej szklanej lub metalowej 
tacce. Nale ży usunąć nadmiar wody (zob. pkt 34). Nast ępnie nale ży 
ostrożnie przenie ść organizmy do zwa żonego uprzednio naczynia i od 
razu je zwa żyć, wraz z zawarto ścią układu pokarmowego.  
46. Dżdżownicom ( Eisenia  sp.) nale ży umożliwić wypróżnienie się przez noc, 
np. na wilgotnej bibule filtracyjnej na przykrytych szalkach Petriego (zob. pkt 34). Gdy d żdżownice si ę wypróżnią, należy określić masę organizmów 
w celu dokonania oceny ewentualnego spadku biomasy podczas badania 
(zob. kryteria wa żności opisane w pkt 17). Wa żenie i analiz ę tkanek wazon ­
kowcowatych przeprowadza si ę bez etapu wypró żniania, jako że jest to 
technicznie trudne z uwagi na ma ły rozmiar tych organizmów. Po 
końcowym okre śleniu masy organizmy nale ży niezwłocznie uśmiercić, za 
pomocą najbardziej odpowiedniej metody (np. u żywając ciekłego azotu lub 
zamrażając je w temperaturze poni żej -18 °C).
 
47. Podczas etapu eliminacji organizmy wymieniaj ą zanieczyszczon ą zawartość 
układu pokarmowego na czyst ą glebę. Oznacza to, że pomiary próbek 
pobranych z organizmów bez wypró żnienia (w tym przypadku wazonkow ­
cowatych) bezpo średnio przed etapem eliminacji zawieraj ą zanieczyszczon ą 
glebę z układu pokarmowego. W przypadku sk ąposzczetów wodnych 
zakłada się, że większość zanieczyszczonej zawarto ści układu pokarmowego 
zostaje zast ąpiona czystym osadem po pocz ątkowym okresie etapu elimi ­
nacji trwaj ącym 4–24 godziny, np. (46). Podobne ustalenia odnotowano 
w przypadku d żdżownic w badaniach dotycz ących akumulacji znakowanego 
izotopowo kadmu i cynku (78). W przypadku wazonkowcowatych bez wypróżnienia jako st ężenie w tkance po wypró żnieniu mo żna przyjąć 
stężenie pierwszej próbki pobranej podczas etapu eliminacji. Aby 
uwzględnić rozcieńczenie stężenia jednostki badanej przez niezanieczysz ­
czoną glebę podczas etapu eliminacji, mas ę zawartości układu pokarmo
­
wego mo żna oszacowa ć na podstawie stosunku masy mokrej organizmu/ 
masy popio łu z organizmu lub masy suchej organizmów/masy popio łu 
z organizmu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1445
 
48. Próbki gleby i organizmów nale ży podda ć analizie niezw łocznie po 
usunięciu organizmów (tj. w ci ągu 1-2 dni), aby zapobiec rozk ładowi lub 
innym stratom, a tak że zaleca si ę obliczenie przybli żonej szybko ści absor­
pcji i eliminacji w trakcie trwania badania. Je śli analizę wykonuje si ę 
z opóźnieniem, próbki nale ży przechowywa ć z zastosowaniem odpowiedniej 
metody, np. g łębokiego zamra żania (≤ -18 °C).  
49. Nale ży sprawdzi ć, czy dok ładność i odtwarzalno ść analizy chemicznej, 
a także odzysk badanej substancji chemicznej z próbek gleby 
i organizmów s ą zadowalaj ące dla danej metody. Nale ży odnotowa ć efek­
tywność ekstrakcji, granic ę wykrywalno ści oraz granic ę oznaczalno ści. 
Należy także sprawdzi ć, czy badana substancja chemiczna nie jest wykry ­
walna w naczyniach kontrolnych w st ężeniach wy ższych niż tło. Jeśli 
stężenie badanej substancji chemicznej w organizmie badanym Ca wynosi 
> 0 w organizmach kontrolnych, nale ży to uwzgl ędnić przy obliczaniu 
parametrów kinetycznych (zob. dodatek 2). Przez ca ły okres trwania badania 
wszystkimi próbkami nale ży posługiwać się w taki sposób, by zminimali ­
zować ich zanieczyszczenie i straty (np. wynikaj ące z adsorpcji badanej 
substancji chemicznej na przyrz ądzie do pobierania próbek).  
50. W przypadku zastosowania badanych substancji chemicznych znakowanych 
izotopowo mo żliwe jest przeprowadzenie analizy macierzystej substancji 
chemicznej i metabolitów. Okre ślenie ilo ściowe macierzystej badanej 
substancji chemicznej i metabolitów w stanie ustalonym lub na koniec etapu absorpcji dostarcza wa żnych informacji. Próbki powinny wtedy by ć 
„oczyszczone”, aby macierzysta badana substancja chemiczna mog ła zostać 
osobno okre ślona ilościowo. Je śli poszczególne metabolity przekraczaj ą 
10 % całkowitej promieniotwórczo ści w analizowanej próbce lub próbkach, 
zaleca się określenie takich metabolitów.
 
51. Odzysk ca łkowity, oraz odzysk badanej substancji chemicznej 
w organizmach, glebie a tak że, jeśli zastosowano, w pu łapkach zawieraj ­ 
ących absorbenty umo żliwiające zatrzymanie odparowuj ącej badanej 
substancji chemicznej, nale ży odnotowa ć i przedstawi ć w sprawozdaniu.  
52. Łączne traktowanie osobników pochodz ących z konkretnego naczynia do 
badania jest dopuszczalne w przypadku organizmów z rodziny wazonkow ­
cowatych, które s ą mniejsze ni ż dżdżownice. Je śli takie łączenie obejmuje 
zmniejszenie liczby replikatów, ogranicza to statystyczne procedury, jakie można zastosowa ć do danych. Je śli wymagana jest konkretna procedura 
i moc statystyczna, nale ży w badaniu zastosowa ć odpowiedni ą liczbę 
naczyń do badania stanowi ących replikaty, w celu uwzgl ędnienia po żąda­
nego łączenia, procedury i mocy.
 
53. Zaleca si ę, by wspó łczynnik bioakumulacji by ł wyrażony zarówno jako 
funkcja ca łkowitej masy suchej oraz, w razie konieczno ści (np. 
w przypadku wysoce hydrofobowych substancji chemicznych), jako funkcja 
zawartości lipidów. Do okre ślenia zawarto ści lipidów nale ży zastosowa ć 
odpowiednie metody (w tym celu nale ży dostosowa ć istniejące metody, 
np. (31) (58)). W ramach takich metod stosuje si ę technikę ekstrakcji 
z wykorzystaniem chloroformu/metanolu. W celu unikni ęcia jednak rozpusz ­
czalników chlorowanych nale ży zastosowa ć zmodyfikowan ą metodę Bligha 
i Dyera (9) zgodnie z opisem w (17). Jako że w wyniku zastosowania 
różnych metod mo żna uzyska ć różniące się wartości, ważne jest podanie 
szczegółowych informacji na temat zastosowanej metody. Je śli jest to 
możliwe, tj. je śli jest dost ępna wystarczaj ąca ilość tkanki organizmów, 
analizę lipidów nale ży przeprowadzi ć z użyciem tej samej próbki lub 
ekstraktu, których u żyto do analizy badanej substancji chemicznej, jako że 
lipidy często musz ą zostać usunięte z ekstraktu przed analiz ą za pomoc ą 
chromatografii (49). Do pomiaru zawarto ści lipidów mo żna równie ż wyko­
rzystać zwierzęta kontrolne, a warto ści dotycz ące zawarto ści lipidów mog ą 
następnie zosta ć wykorzystane do normalizowania warto ści współczynnika 
bioakumulacji. Przy zastosowaniu tego drugiego podej ścia ogranicza si ę 
zanieczyszczenie przyrz ądów badan ą substancj ą chemiczn ą. ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1446
 
DANE I SPRAWOZDAWCZO ŚĆ 
Opracowanie wyników  
54. Krzyw ą absorpcji badanej substancji chemicznej uzyskuje si ę poprzez 
wykreślenie jej st ężenia w/na organizmach podczas etapu absorpcji 
w czasie w skali arytmetycznej. Kiedy krzywa osi ągnie plateau lub stan 
ustalony (zob. definicje w dodatku 1), wspó łczynnik bioakumulacji 
w stanie ustalonym oblicza si ę na podstawie:  
C a wstanie ustalonym lub na ko ńcu etapu absorpcji ðśredniaÞ 
C s wstanie ustalonym lub na ko ńcu etapu absorpcji ðśredniaÞ 
C a stanowi st ężenie badanej substancji chemicznej w organizmie badanym.  
C s stanowi st ężenie badanej substancji chemicznej w glebie.  
55. W przypadku nieosi ągnięcia stanu ustalonego kinetyczny wspó łczynnik 
akumulacji (BAFK), oparty na sta łych szybko ści, należy określić na 
podstawie wspó łczynnika bioakumulacji w stanie równowagi zgodnie 
z poniższym opisem:  
— należy określić współczynnik akumulacji (BAF  K ) jako stosunek k  s /k e , 
— szybko ść absorpcji i eliminacji najlepiej obliczy ć jednocze śnie (zob. 
równanie 11 w dodatku 2),  
— stałą szybkości eliminacji (k  e ) określa się zazwyczaj na podstawie 
krzywej eliminacji (tj. wykresu st ężenia jednostki badanej 
w organizmach podczas etapu eliminacji). Sta łą szybkości absorpcji k  s 
oblicza si ę następnie na podstawie takiego k  e oraz warto ści C  a , którą 
uzyskuje si ę z krzywej absorpcji – zob. opis tych metod w dodatku 2. 
Preferowan ą metodą uzyskania kinetycznego wspó łczynnika akumulacji 
oraz stałych szybko ści, k  s i k e jest zastosowanie nieliniowych kompute ­
rowych metod estymacji parametrycznej. Je śli w sposób ewidentny 
eliminacja nie jest procesem pierwszego rz ędu, należy zastosowa ć 
bardziej z łożone modele.  
Sprawozdanie z badania  
56. Sprawozdanie z badania powinno zawiera ć następujące informacje:  
Badana substancja chemiczna  
— wszelkie dost ępne informacje na temat toksyczno ści ostrej lub przewle ­
kłej (np. EC  x , LC  x” NOEC) badanej substancji chemicznej w odniesieniu 
do żyjących w glebie sk ąposzczetów,  
— czysto ść, cechy fizyczne i w łaściwości fizykochemiczne, np. wspó ł­
czynnik podzia łu oktanol/woda, rozpuszczalno ść w wodzie,  
— dane identyfikacyjne substancji chemicznej; źródło jednostki badanej, 
nazwę i stężenie wszelkich zastosowanych rozpuszczalników,  
— w przypadku zastosowania badanej substancji chemicznej znakowanej 
izotopowo, dok ładne położenie znakowanych atomów, promieniotwór ­
czość właściwą oraz czysto ść radiochemiczn ą. 
Badane gatunki  
— nazwę naukow ą, szczep, źródło, wszelkie przypadki wcze śniejszego 
poddania dzia łaniu, aklimatyzacj ę, wiek, rozmiar-zakres itp.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Warunki badania  
— zastosowan ą procedur ę badania,  
— rodzaj i charakterystyk ę zastosowanego o świetlenia i jego cykl lub 
cykle,  
— projekt badania (np. liczb ę i rozmiar naczy ń do badania, mas ę gleby 
i wysoko ść warstwy gleby, liczb ę replikatów, liczb ę organizmów 
w każdym replikacie, liczb ę badanych st ężeń, czas trwania etapu absor ­
pcji i eliminacji, cz ęstotliwość pobierania próbek),  
— uzasadnienie wyboru materia łu, z którego wykonano naczynia do bada ­
nia, 
— metod ę przygotowania i zastosowania jednostki badanej, a tak że uzasad­
nienie wyboru konkretnej metody,  
— badane st ężenia nominalne, średnie mierzonych warto ści oraz ich odchy ­
lenia standardowe w naczyniach do badania, a tak że metodę uzyskania 
takich warto ści, 
— źródło składników gleby sztucznej lub – w przypadku zastosowania gleb 
naturalnych – pochodzenie gleby, opis wszelkich wcze śniejszych proce ­
sów, jakim zosta ła poddana, wyniki kontroli (prze życie, rozwój biomasy, 
rozmnażanie), charakterystyk ę gleby (pH, ca łkowitą zawartość węgla 
organicznego, rozk ład wielko ści cząstek (procent piasku, i łu i gliny), 
maksymaln ą zdolność zatrzymywania wody, procentow ą zawarto ść 
wilgoci na pocz ątku i na ko ńcu badania, oraz wszelkie inne dokonane 
pomiary),  
— szczegó łowe informacje na temat traktowania próbek gleby 
i organizmów, w tym szczegó łowe informacje na temat procedur przy ­
gotowania, przechowywania, wzbogacania, ekstrakcji oraz procedur 
analitycznych (oraz precyzji) zastosowanych w odniesieniu do jednostki badanej w organizmach i glebie, oraz zawarto ść lipidów (je śli zmierzo ­
no), a tak że odzysk jednostki badanej.
 
Wyniki  
— śmiertelno ść organizmów kontrolnych i organizmów w ka żdym 
naczyniu do badania oraz wszelkie zaobserwowane niestandardowe 
zachowania (np. unikanie gleby, nierozmna żanie się w badaniu bioaku ­
mulacji z wykorzystaniem wazonkowcowatych),  
— stosunek masy suchej do masy mokrej gleby i organizmów badanych 
(przydatne do normalizacji),  
— masy mokre organizmów przy ka żdym pobieraniu próbek; w przypadku 
dżdżownic masy mokre na pocz ątku badania oraz przy ka żdym pobie ­
raniu próbek, przed wypró żnieniem si ę i po wypró żnieniu się organiz­
mów,  
— zawarto ść lipidów w organizmach badanych (je śli ustalono),  
— krzywe, pokazuj ące kinetyk ę absorpcji i eliminacji badanej substancji 
chemicznej w organizmach, oraz okres czasu konieczny do osi ągnięcia 
stanu ustalonego,  
— C  a i C s (wraz z odchyleniem standardowym i zakresem, w stosownych 
przypadkach) dla wszystkich przypadków pobierania próbek (C  a wyra­ 
żone jako g kg  –1 mokrej i suchej masy ca łego ciała, a C  s wyrażone jako 
g kg  –1 mokrej i suchej masy gleby). Je śli wymagany jest wspó łczynnik 
akumulacji biota-gleba (np. na potrzeby porównania wyników z dwóch 
lub większej liczby bada ń przeprowadzonych z wykorzystaniem zwierz ąt 
o różnej zawarto ści lipidów), C  a można dodatkowo wyrazi ć jako g kg  –1 
zawartości lipidów organizmu, a C  s jako g kg  –1 węgla organicznego 
w glebie,  
— współczynnik bioakumulacji (wyra żony jako kg gleby ·kg –1 organizmu), 
stałą szybkości absorpcji gleby k  s (wyrażoną jako g gleby kg  –1 orga­
nizmu dzie ń –1 ), stałą szybkości eliminacji k  e (wyrażoną w dzień –1 ); 
współczynnik akumulacji biota-gleba (wyra żony jako kg w ęgla orga­
nicznego w glebie kg  –1 zawartość lipidów w organizmach) nale ży 
również przedstawi ć w sprawozdaniu,  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— jeśli zmierzono: procent macierzystej substancji chemicznej, metabolitów 
oraz związanych substancji resztkowych (tj. procent badanej substancji 
chemicznej, która nie mo że zostać poddana ekstrakcji za pomoc ą 
powszechnych metod ekstrakcji) wykryte w glebie i zwierz ętach bada ­
nych,  
— metody statystyczne zastosowane do analizy danych.  
Ocena wyników  
— zgodno ść wyników z kryteriami wa żności wymienionymi w pkt 17,  
— nieoczekiwane lub niestandardowe wyniki, np. niepe łna eliminacja 
badanej substancji chemicznej ze zwierz ąt badanych.  
BIBLIOGRAFIA:  
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane ( γ- 
HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Praca magisterska, Uniwer ­
sytet w Coimbrze.  
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. Ameryka ń­
skie Stowarzyszenie Bada ń i Materia łów (ASTM), E 1688-00a.  
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil 
toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm  Eisenia 
fetida  and the Enchytraeid potworm  Enchytraeus albidus.  ASTM Interna ­
tional, E1676-04: 26 s.  
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger 
G (2000). The assessment of bioaccumulation. W: Hutzinger, O. (red.), 
The Handbook of Environmental Chemistry, t. 2 cz ęść J (t. red.: B. Beek): 
Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235–276.
 
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The 
toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms ( Eisenia andrei ): 
Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93–99.  
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & 
Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earth ­
worms ( Eisenia andrei ): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 
154–165.  
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel 
C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei ). Ecotox. Environ. Safety 31: 185–191.
 
(8) Bell AW (1958). The anatomy of  Enchytraeus albidus , with a key to the 
species of the genus  Enchytraeus.  Ann. Mus. Novitat. 1902: 1–13.  
(9) Bligh EG i Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and 
purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911–917.  
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. 
INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 s.  
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein 
P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environ ­
mental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D nr: 298 64 416.
 
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccu ­
mulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes  Enchyt­
raeus luxuriosus  and  Enchytraeus albidus  (Enchytraeidae, Oligochaeta, 
Annelida). Hydrobiologia 463: 185–196.  
(13) Conder JM i Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of 
Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm  Eisenia fetida.  
J. Soils Sediments 3: 13–20.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1449
 
(14) Connell DW i Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earth ­
worm System. Chemosphere 20: 91-100.  
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 
37: 2–29.  
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, w: Bioindicators and biomonitors. Markert, 
B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (red.). Elsevier Science Ltd., The 
Netherlands, s. 555–576.  
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH 
interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shel ­
lfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and 
Testing Programme.  
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, Jenni-Eiermann S, Bach ­
mann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 29: 140–145.
 
(19) Rozporz ądzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady 
z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwole ń 
i stosowanych ogranicze ń w zakresie chemikaliów (REACH), utworzenia 
Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniaj ące dyrektyw ę 1999/45/WE 
i rozporz ądzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporz ądzenie Komisji (WE) 
nr 1488/94, jak równie ż dyrektyw ę Rady 76/769/EWG i dyrektywy 
Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE (Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1).
 
(20) Edwards CA i Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. 
wydanie trzecie, Chapman & Hall, Londyn, 426 s.  
(21) OECD (2008),  Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates , 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paryż. 
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th i Römbke J (2009). Vali ­
dation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten 
Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Sprawoz ­
danie dla federalnej agencji środowiskowej (Umweltbundesamt 
Dessau-Rosslau), R&D nr: 204 67 458: 149 s. Dost ępne do pobrania 
pod adresem: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
 
(23) Elmegaard N i Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesti ­
cide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 s.
 
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxi ­
city test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. 
Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.  
(25) Prokuratura Europejska (EPPO) (2003). Environmental Risk Assessment 
scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, 
EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/ 
EPPO 33: 195–208.  
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk 
assessment? Chemosphere 32: 1897–1905.  
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, 
Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumula ­
tion. Chemosphere 29: 1501–1514.  
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6- 
Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure 
(Dichlorprop) beim Regenwurm  Lumbricus rubellus  (Oligochaeta, Lumbri ­
cidae). Praca naukowa, Uniwersystet w Moguncji, 156 s.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1450
 
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von 
Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF – Z. Umweltchem, 
Ökotox. 15: 78–84.  
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcen ­
tration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225–1231.  
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods 
for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099–1105.
 
(32) Hawker DW i Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of 
lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 
701–707.  
(33) Hund-Rinke K i Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil 
assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sedi ­
ments 1: 15–20.  
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der 
Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxi ­
kologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisen ­
traeger, A. (red.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59–81.  
(35) ISO 11268-2 (1998) Soil Quality – Effects of pollutants on earthworms 
(Eisenia fetida ). Part 2: Determination of effects on reproduction.  
(36) Jaenike J (1982). „ Eisenia foetida ” is two biological species. Megadrilogica 
4: 6–8.  
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of 
organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080–2090.
 
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). 
Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in  Eisenia andrei  (Oli­
gochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953–961.  
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, 
DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms ( Eisenia andrei , Oligo­
chaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. 
Chem. 22: 767–775.
 
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the 
routes of exposure for organic chemicals in the earthworm,  Eisenia andrei  
(Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399–3404.  
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Compa ­
rison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305–312.
 
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and func ­
tion in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217–232.  
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von  14 C-Hexachlorbenzol 
und  14 C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Praca naukowa, uniwer ­
sytet w Monachium, 137 s.  
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic 
aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod  Pontoporeia 
hoyi.  Environ. Sci. Toxicol. 23: 588–595.  
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accu ­
mulation in  Lumbricus rubellus  under laboratory conditions compared with 
accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17–26.  
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging 
for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with  
Lumbriculus variegates.  Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244–1249.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1451
 
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log 
K ow /log BCF correlations, w: R. Nagel and R. Loskill (red.): Bioaccumu ­
lation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
 
(48) Rozdzia ł C.8 niniejszego za łącznika. Toksyczno ść dla dżdżownic.  
(49) Rozdzia ł C.13 niniejszego za łącznika. Biokoncentracja: badanie ryb 
w warunkach przep ływu.  
(50) Rozdzia ł C.21 niniejszego za łącznika. Mikroorganizmy żyjące w glebie: 
badanie przemian azotu.  
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, 
Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Pary ż. 
(52) Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), 
Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, 
Paryż. 
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, 
Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paryż.
 
(54) .Petersen H i Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna 
populations and their role in decomposition processes. Oikos 39: 287–388.  
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology 
Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scientific Publ., Oxford. 378–396.  
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen 
der Konzentration von Pflanzenschutzmitteln und dem Octanol-Wasser- Koeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77–81.
 
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of 
cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm  Eisenia 
fetida.  RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.  
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation 
of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envi ­
ron.Toxicol. Chem. 10: 1431–1436.  
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulation ­
stests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 s.  
(60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an 
international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 s.
 
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, 
w: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (red.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105–129.
 
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). 
Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on 
Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, 
Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107–127.  
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). 
Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110–2120.
 
(64) Schlosser H-J i Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für 
Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. 
NF 34: 413–433.
 
(65) Schmelz R i Collado R (1999).  Enchytraeus luxuriosus  sp. nov., a new 
terrestrial oligochaete species (Enchytraeide, Clitellata, Annelida). Caro ­
linea 57: 93–100.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1452
 
(66) Sims R W i Gerard BM (1985). Earthworms, w: Kermack, D. M. & 
Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) 
No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr W. Backhuys.  
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares 
AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557–2563.
 
(68) Spacie A i Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the 
bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309–320.  
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scrog ­
gins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. w: Advances in earthworm ecotoxico ­
logy. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (red.). Setac 
Press, Pensacola, 67–81.
 
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM 
(2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail  Orchesella cincta.  Environ. Toxi ­
col. Chemistry 22: 1167–1171.
 
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept 
und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.  
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation 
of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second 
Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, 
Duluth, MN, March 2000.  
(73) Van Brummelen TC i Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of 
benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod  Porcellio scaber.  Arch. Environ. 
Contam. Toxicol. 31: 277–285.  
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the 
toxicity of chemicals for earthworms; a review, w: Ecotoxicology of Earth ­
worms (red. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
 
(75) Van Gestel CA i Ma W-C (1990). An approach to quantitative 
structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. 
Chemosphere 21: 1023–1033.  
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). 
Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil inver ­
tebrates. Environmental Pollution 136: 409–417.  
(77) Venter JM i Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm  
Eisenia fetida  (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161–165.  
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van 
Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm  Lumbricus rubellus  exposed to contaminated flood ­
plain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843–1851.
 
(79) Widianarko B i Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival 
analysis in bioassays using nonpersistent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402–406.
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1453
 
Dodatek 1  
DEFINICJE  
Bioakumulacja  to wzrost st ężenia badanej substancji chemicznej w organizmie 
lub na organizmie w stosunku do st ężenia badanej substancji chemicznej 
w otaczaj ącym środowisku. Bioakumulacja wynika zarówno z procesu biokon ­
centracji, jak i z procesu biomagnifikacji (zob. poni żej). 
Biokoncentracja  to wzrost st ężenia badanej substancji chemicznej w/na organiz ­
mie, wynikaj ący z absorpcji substancji chemicznej wy łącznie z otaczaj ącego 
środowiska (np. poprzez powierzchni ę ciała oraz spo żytą glebę), w stosunku 
do stężenia badanej substancji chemicznej w otaczaj ącym środowisku.  
Biomagnifikacja  to wzrost st ężenia badanej substancji chemicznej w/na organiz ­
mie, wynikaj ący głównie ze absorpcji zanieczyszczonego po żywienia lub żeru, 
w stosunku do st ężenia badanej substancji chemicznej w takim po żywieniu lub 
żerze. Biomagnifikacja mo że prowadzi ć do przeniesienia lub akumulacji jedno ­
stki badanej w ramach sieci pokarmowych.  
Eliminacja  badanej substancji chemicznej stanowi strat ę takiej substancji 
chemicznej z tkanki badanego organizmu w drodze czynnych lub biernych proce ­
sów, przy czym taka strata zachodzi niezale żnie od obecno ści lub braku jednostki 
badanej w otaczaj ącym środowisku.  
Współczynnik bioakumulacji  (BAF) w dowolnym momencie podczas etapu 
absorpcji w trakcie opisanego tu badania bioakumulacji stanowi st ężenie badanej 
substancji chemicznej w/na badanym organizmie (C  a wyrażone w g·kg -1 suchej 
masy organizmu) podzielone przez st ężenie substancji chemicznej w otaczaj ącym 
środowisku (C  s wyrażone jako g ·kg -1 suchej masy gleby); wspó łczynnik bioaku ­
mulacji wyra ża się w jednostkach kg gleby ·kg -1 organizmu.  
Współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym  (BAF  ss ) to wspó łczynnik 
bioakumulacji w stanie ustalonym, który nie zmienia si ę w znacz ący sposób 
przez d ługi okres czasu, a st ężenie badanej substancji chemicznej 
w otaczaj ącym środowisku (C  s wyrażane jako g.kg  -1 suchej masy gleby) jest 
podczas tego okresu sta łe. 
Współczynniki bioakumulacji  obliczane bezpo średnio na podstawie stosunku 
stałej szybko ści absorpcji gleby do sta łej szybko ści eliminacji (k  s oraz k  e , zob. 
poniżej) nazywa si ę kinetycznymi wspó łczynnikami bioakumulacji (BAF  K ). 
Współczynnik akumulacji biota-gleba  (BSAF) stanowi st ężenie badanej 
substancji chemicznej o znormalizowanym poziomie lipidów w/na organizmie badanym, podzielone przez st ężenie badanej substancji chemicznej 
o znormalizowanym poziomie w ęgla organicznego w glebie w stanie ustalonym. 
C
 a w takim przypadku wyra ża się jako g·kg -1 zawartości lipidów w organizmie, 
a C  s jako g·kg -1 zawartości węgla organicznego w glebie; wspó łczynnik akumu ­
lacji biota-gleba wyra ża się w kg węgla organicznego ·kg -1 lipidów.  
Plateau  lub stan ustalony  określa się jako równowag ę między procesem absor ­
pcji a procesem eliminacji, które zachodz ą równolegle podczas etapu nara żenia. 
Stan ustalony zostaje osi ągnięty na wykresie wspó łczynnika bioakumulacji 
w czasie w momencie, kiedy krzywa staje si ę równoleg ła do osi czasu, a trzy 
następujące po sobie analizy wspó łczynnika bioakumulacji, wykonane na 
próbkach pobranych w odst ępach co najmniej dwóch dni, ró żnią się od siebie 
nie więcej niż w 20 % i mi ędzy trzema okresami pobierania próbek nie ma 
statystyczne istotnych ró żnic. W przypadku badanych substancji chemicznych, 
które wolno ulegaj ą absorpcji, bardziej odpowiednie b ędą odstępy czasowe 
wynoszące siedem dni (49).  
Współczynnik podzia łu węgiel organiczny-woda  (K  oc ) to stosunek st ężenia 
substancji chemicznej w/na frakcji w ęgla organicznego gleby i st ężenia substancji 
chemicznej w wodzie w warunkach równowagi.  
Współczynnik podzia łu oktanol-woda  (K  ow ) jest to stosunek rozpuszczalno ści 
substancji chemicznej w n-oktanolu i wodzie w warunkach równowagi, okre ślany 
czasami tak że jako P  ow . Logarytm K  ow (log  Kow ) wykorzystuje si ę jako wska źnik 
zdolności substancji chemicznej do bioakumulacji w organizmach wodnych.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Etap absorpcji lub nara żenia to czas, w trakcie którego organizmy badane 
poddaje si ę narażeniu na dzia łanie badanej substancji chemicznej.  
Stała szybko ści absorpcji gleby  (k s ) stanowi warto ść liczbową określającą szyb­
kość wzrostu st ężenia jednostki badanej w/na organizmie badanym, wynikaj ą­
cego z etapu absorpcji substancji z gleby. k  s wyraża się jako g gleby kg  -1 
organizmu d  -1 . 
Etap eliminacji  to czas nast ępujący po przeniesieniu organizmów badanych 
z zanieczyszczonego środowiska do środowiska niezawieraj ącego jednostki bada ­
nej, kiedy to bada si ę eliminacj ę (lub strat ę netto) substancji chemicznej 
z organizmów badanych.  
Stała szybko ści eliminacji  (k e ) stanowi warto ść liczbową określającą szybkość 
zmniejszania si ę stężenia jednostki badanej w/na organizmie badanym, po prze ­
niesieniu organizmów badanych ze środowiska zawieraj ącego jednostk ę badaną 
do środowiska niezawieraj ącego danej substancji chemicznej; k  e wyraża się jako 
d -1 . 
Badana substancja chemiczna:  jakakolwiek substancja lub mieszanina badana 
za pomoc ą niniejszej metody badawczej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Dodatek 2  
Obliczanie parametrów absorpcji i eliminacji  
Głównym punktem ko ńcowym badania bioakumulacji jest wspó łczynnik bioaku ­
mulacji. Zmierzony wspó łczynnik bioakumulacji mo żna obliczy ć poprzez podzie ­
lenie stężenia w organizmie badanym, C  a , przez st ężenie w glebie, C  s , w stanie 
ustalonym. Je śli podczas etapu absorpcji nie osi ągnięto stanu ustalonego, oblicza 
się kinetyczny wspó łczynnik bioakumulacji na podstawie sta łych szybko ści 
zamiast wspó łczynnika bioakumulacji w stanie ustalonym. Nale ży jednak 
zwrócić uwagę, czy wspó łczynnik bioakumulacji jest oparty na st ężeniach 
w stanie ustalonym, czy te ż nie. 
Kinetyczny wspó łczynnik bioakumulacji, sta łą szybkości absorpcji (k  s ) i stałą 
szybkości eliminacji (k  e ) uzyskuje si ę zazwyczaj poprzez zastosowanie kompu ­
terowych, nieliniowych metod estymacji parametrycznej, np. na podstawie 
modeli opisanych w (68). Je śli przyjąć zestaw danych dotycz ących czasu 
sekwencyjnego st ężenia i równania modelowe: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [równanie 1]  
lub 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [równanie 2]  
gdzie:  
C a = stężenie substancji chemicznej w organizmach [g kg-1 masy mokrej lub 
suchej],  
k s = stała szybkości absorpcji w tkance [g gleby kg-1 organizmu d-1],  
C s = stężenie substancji chemicznej w glebie [g kg-1 masy mokrej lub suchej],  
k e = stała szybkości eliminacji [d-1],  
t c = czas na koniec etapu absorpcji,  
takie programy komputerowe obliczaj ą wartości dla kinetycznego wspó łczynnika 
bioakumulacji, k  s i k e . 
Gdy stężenie tła w organizmach nienara żonych na dzia łanie substancji, np. 
w dniu 0, ró żni się znacznie od zera (taka sytuacja mo że pojawić się na przyk ład 
w przypadku metali), takie st ężenie tła (C  a,0 ) należy uwzględnić w takich równa ­
niach, aby wygl ądały one nast ępująco: 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [równanie 3]  
oraz 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c [równanie 4]  
W przypadku zaobserwowania podczas etapu absorpcji znacz ącego spadku 
w czasie st ężenia badanej substancji chemicznej w glebie, nale ży zastosowa ć 
następujące modele, np. (67) (79): 
C s ¼ C 0 ðe –k 
0 t Þ [równanie 5]  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
gdzie:  
C s = stężenie substancji chemicznej w glebie [g kg-1 masy mokrej lub suchej],  
k 0 = stała szybkości rozkładu w glebie [d-1],  
C 0 = początkowe stężenie substancji chemicznej w glebie [g kg-1 masy mokrej 
lub suchej]. 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [równanie 6] 
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c [równanie 7]  
gdzie:  
C a = stężenie substancji chemicznej w organizmach [g kg-1 masy mokrej lub 
suchej],  
k s = stała szybkości absorpcji w tkance [g gleby kg-1 organizmu d-1],  
k 0 = stała szybkości rozkładu w glebie [d-1],  
k e = stała szybkości eliminacji [d-1],  
t c = czas na koniec etapu absorpcji.  
W przypadku osi ągnięcia podczas etapu absorpcji stanu ustalonego (tj. t = ∞) 
równanie 1 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c [równanie 1]  
można zredukowa ć do: 
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
lub 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K [równanie 8]  
Stężenie jednostki badanej w tkance organizmu w stanie ustalonym (C  a,ss ) 
oblicza si ę wtedy za pomoc ą k s /k e x C  s . 
Współczynnik akumulacji biota-gleba mo żna obliczy ć w następujący sposób: 
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip [równanie 9]  
gdzie f  oc stanowi frakcj ę węgla organicznego w glebie, a f  lip frakcję lipidów 
w organizmie, przy czym warto ści te nale ży określić na podstawie próbek pobra ­
nych z badania oraz, odpowiednio, na podstawie masy suchej lub mokrej.  
Kinetykę eliminacji mo żna modelowa ć za pomoc ą danych z etapu eliminacji oraz 
poprzez zastosowanie nast ępującego modelu równania oraz komputerowej, nieli ­
niowej metody estymacji parametrycznej. Je śli dane pomiarowe wykre ślone 
w czasie wskazuj ą na stały wykładniczy spadek st ężenia jednostki badanej 
w zwierz ętach, do opisania przebiegu eliminacji w czasie mo żna zastosowa ć 
model jednoprzedzia łowy (równanie 9). 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t [równanie 10]  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Procesy eliminacji czasami okazuj ą się dwufazowe, wykazuj ąc szybki spadek C  a 
na wczesnych etapach, który zmienia si ę w wolniejsz ą stratę jednostek badanych 
na późniejszych etapach eliminacji, np. (27) (68). Takie dwa etapy mo żna inter­
pretować, zakładając, że w organizmie istniej ą dwa różne przedzia ły, z których 
jednostka badana jest eliminowana z ró żną szybkością. W takich przypadkach 
należy przeanalizowa ć odnośną literaturę, np. (38) (39) (40) (78).  
Przy zastosowaniu modeli równa ń przedstawionych powy żej parametry kine ­
tyczne (k  s i k e ) można obliczy ć również za jednym razem, stosuj ąc model kine ­
tyki reakcji pierwszego rz ędu do wszystkich danych z etapu absorpcji i eliminacji 
jednocześnie. Aby pozna ć opis metody, która pozwala na takie po łączone obli ­
czanie sta łych szybko ści absorpcji i eliminacji, mo żna zapozna ć się z pozycjami 
w bibliografii (41), (73) i (70). 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
[równanie 11]  
Uwaga:  Jeśli parametry absorpcji i eliminacji szacuje si ę jednocze śnie na 
podstawie po łączonych danych z etapu absorpcji i eliminacji, „m” 
w równaniu 11 stanowi deskryptor, który umo żliwia programowi 
komputerowemu przypisanie pod-terminów równania do zestawów 
danych z odpowiedniego etapu oraz poprawne przeprowadzenie oceny (m = 1 dla etapu absorpcji, m = 2 dla etapu eliminacji).
 
Niemniej jednak takie modele równa ń należy stosowa ć z ostrożnością, zwłaszcza 
jeśli podczas badania zachodz ą zmiany w biodost ępności badanej substancji 
chemicznej, biodegradacja lub rozk ład (zob. np. (79)).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Dodatek 3  
PRZYKŁADOWE HARMONOGRAMY BADA Ń BIOAKUMULACJI 
W GLEBIE  
Badanie z wykorzystaniem d żdżownic  
a) Etap absorpcji z pobieraniem próbek w 8 datach na potrzeby obliczenia 
kinetyki  
Dzień Czynno ść 
–6 kondycjonowanie przygotowanej gleby przez 48 godzin; 
–4 wzbogacenie frakcji gleby roztworem substancji chemicznej; 
odparowanie wszelkich rozpuszczalników; wymieszanie sk ład­
ników gleby; rozprowadzenie gleby do naczy ń do badania; osi ą­
ganie równowagi w warunkach badania – 4 dni (3 tygodnie w przypadku gleby wzbogaconej metalem); 
–3 do –1 oddzielenie organizmów badanych od kultury w celu ich aklima ­
tyzacji; przygotowanie i nawil żenie składników gleby; 
0 pomiar temperatury i pH gleby; usuni ęcie próbek gleby z naczy ń 
poddawanych dzia łaniu substancji oraz kontroli rozpuszczalnika 
w celu okre ślenia stężenia badanej substancji chemicznej; 
dodanie porcji po żywienia; zwa żenie i randomizowane rozprowa ­
dzenie organizmów do naczy ń do badania; zachowanie wystar ­
czającej liczby podpróbek organizmów na potrzeby okre ślenia 
analitycznych warto ści dotycz ących tła, masy mokrej i suchej 
oraz zawarto ści lipidów; zwa żenie wszystkich naczy ń do badania 
w celu kontrolowania wilgotno ści gleby; skontrolowanie 
dopływu powietrza, je śli stosuje si ę zamknięty system badania; 
1 skontrolowanie dop ływu powietrza, odnotowanie zachowa ń orga­
nizmów i temperatury; pobranie próbek gleby i organizmów 
w celu okre ślenia stężenia jednostki badanej; 
2 takie jak w dniu 1; 
3 skontrolowanie dop ływu powietrza, zachowa ń organizmów 
i temperatury; 
4 takie jak w dniu 1; 
5–6 takie jak w dniu 3; 
7 takie jak w dniu 1; dodanie porcji po żywienia; kontrola wilgot ­
ności gleby poprzez ponowne zwa
żenie naczy ń do badania oraz 
uzupełnienie odparowanej wody; 
8–9 takie jak w dniu 3; 
10 takie jak w dniu 1; 
11–13 takie jak w dniu 3; 
14 takie jak w dniu 1; dodanie porcji po żywienia; kontrola wilgot ­
ności gleby poprzez ponowne zwa żenie naczy ń do badania oraz 
uzupełnienie odparowanej wody; 
15–16 takie jak w dniu 3; 
17 takie jak w dniu 1; 
18–20 takie jak w dniu 3;  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Dzień Czynno ść 
21 takie jak w dniu 1; pomiar temperatury i pH gleby; kontrola 
wilgotności gleby poprzez ponowne zwa żenie naczy ń do badania; 
koniec etapu absorpcji; przeniesienie organizmów z pozosta łych 
poddawanych nara żeniu replikatów do naczy ń zawieraj ących 
czystą glebę w celu rozpocz ęcia etapu eliminacji (bez wypró ­ 
żniania się organizmów); pobranie próbek gleby i organizmów 
z kontroli rozpuszczalnika. 
Czynności wykonywane przed nara żeniem (etap osi ągania 
równowagi) nale ży zaplanowa ć w czasie, uwzgl ędniając właści­
wości badanej substancji chemicznej. 
Czynności opisane dla dnia 3 nale ży wykonywa ć codziennie 
(przynajmniej w dni robocze).  
b) Etap eliminacji  
Dzień Czynno ść 
–6 przygotowanie i nawil żenie składników gleby; kondycjonowanie 
przygotowanej gleby przez 48 godzin; 
–4 wymieszanie sk ładników gleby; rozprowadzenie gleby do naczy ń 
do badania; inkubacja w warunkach badania przez 4 dni; 
0 (koniec etapu 
absorpcji) pomiar temperatury i pH gleby; wa żenie i randomizowane 
rozprowadzenie organizmów do naczy ń do badania; dodanie 
porcji po żywienia; przeniesienie organizmów z pozosta łych 
poddawanych nara żeniu replikatów do naczy ń zawieraj ących 
czystą glebę; pobranie próbek gleby i organizmów po 4–6 godzi ­
nach w celu okre ślenia stężenia badanej substancji chemicznej; 
1 skontrolowanie dop ływu powietrza, odnotowanie zachowa ń orga­
nizmów i temperatury; pobranie próbek gleby i organizmów w celu okre ślenia stężenia badanej substancji chemicznej; 
2 takie jak w dniu 1; 
3 skontrolowanie dop ływu powietrza, zachowa ń organizmów 
i temperatury; 
4 takie jak w dniu 1; 
5–6 takie jak w dniu 3; 
7 takie jak w dniu 1; dodanie porcji po żywienia; kontrola wilgot ­
ności gleby poprzez ponowne zwa żenie naczy ń do badania oraz 
uzupełnienie odparowanej wody; 
8–9 takie jak w dniu 3; 
10 takie jak w dniu 1; 
11–13 takie jak w dniu 3; 
14 takie jak w dniu 1; dodanie porcji po żywienia; kontrola wilgot ­
ności gleby poprzez ponowne zwa żenie naczy ń do badania oraz 
uzupełnienie odparowanej wody; 
15–16 takie jak w dniu 3; 
17 takie jak w dniu 1;
 ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Dzień Czynno ść 
18–20 takie jak w dniu 3; 
21 takie jak w dniu 1; pomiar temperatury i pH gleby; kontrola 
wilgotności gleby poprzez ponowne zwa żenie naczy ń do badania; 
pobranie próbek gleby i organizmów z kontroli rozpuszczalnika. 
Przygotowanie gleby przed rozpocz ęciem etapu eliminacji nale ży 
przeprowadza ć w taki sam sposób, w jaki mia ło to miejsce 
w przypadku etapu absorpcji. 
Czynności opisane dla dnia 3 nale ży wykonywa ć codziennie 
(przynajmniej w dni robocze).  
Badanie z wykorzystaniem wazonkowcowatych  
a) Etap absorpcji z pobieraniem próbek w 8 datach na potrzeby obliczenia 
kinetyki  
Dzień Czynno ść 
–6 kondycjonowanie przygotowanej gleby przez 48 godzin; 
–4 wzbogacanie frakcji gleby roztworem substancji chemicznej; 
odparowanie wszelkich rozpuszczalników; wymieszanie sk ład­
ników gleby; rozprowadzenie gleby do naczy ń do badania; osi ą­
ganie równowagi w warunkach badania – 4 dni (3 tygodnie 
w przypadku gleby wzbogaconej metalem); 
–3 do –1 oddzielenie organizmów badanych od kultury w celu ich aklima ­
tyzacji; przygotowanie i nawil żenie składników gleby; 
0 pomiar temperatury i pH gleby; usuni ęcie próbek gleby z naczy ń 
poddawanych dzia łaniu substancji oraz kontroli rozpuszczalnika 
w celu okre ślenia stężenia badanej substancji chemicznej; 
dodanie porcji po żywienia; zwa żenie i randomizowane rozprowa ­
dzenie organizmów do naczy ń do badania; zachowanie wystar ­
czającej liczby podpróbek organizmów na potrzeby okre ślenia 
analitycznych warto ści dotycz ących tła, masy mokrej i suchej 
oraz zawarto ści lipidów; zwa żenie wszystkich naczy ń do badania 
w celu kontrolowania wilgotno ści gleby; skontrolowanie 
dopływu powietrza, je śli stosuje si ę zamknięty system badania; 
1 skontrolowanie dop ływu powietrza, odnotowanie zachowa ń orga­
nizmów i temperatury; pobranie próbek gleby i organizmów 
w celu okre ślenia stężenia jednostki badanej; 
2 takie jak w dniu 1; 3 skontrolowanie dop ływu powietrza, zachowa ń organizmów 
i temperatury; 
4 takie jak w dniu 1; 
5–6 takie jak w dniu 3; 
7 takie jak w dniu 1; dodanie porcji po żywienia; kontrola wilgot ­
ności gleby poprzez ponowne zwa
żenie naczy ń do badania oraz 
uzupełnienie odparowanej wody; 
9 takie jak w dniu 1; 
10 takie jak w dniu 3;  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Dzień Czynno ść 
11 takie jak w dniu 1; 
12–13 takie jak w dniu 3; 
14 takie jak w dniu 1; dodanie porcji po żywienia; pomiar tempera ­
tury i pH gleby; kontrola wilgotno ści gleby poprzez ponowne 
zważenie naczy ń do badania; koniec etapu absorpcji; przenie ­
sienie organizmów z pozosta łych poddawanych nara żeniu repli ­
katów do naczy ń zawierających czyst ą glebę w celu rozpocz ęcia 
etapu eliminacji (bez wypró żniania się organizmów); pobranie 
próbek gleby i organizmów z kontroli rozpuszczalnika. 
Czynności wykonywane przed nara żeniem (etap osi ągania 
równowagi) nale ży zaplanowa ć w czasie, uwzgl ędniając właści­
wości badanej substancji chemicznej. 
Czynności opisane dla dnia 3 nale ży wykonywa ć codziennie 
(przynajmniej w dni robocze).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Dodatek 4  
Gleba sztuczna – zalecenia dotycz ące jej przygotowania i przechowywania  
Jako że gleby naturalne z konkretnego źródła mogą nie być dostępne przez ca ły 
rok, a organizmy rodzime oraz obecno ść mikrozanieczyszcze ń mogą mieć wpływ 
na badanie, w opisanym tu badaniu zaleca si ę stosowanie pod łoża sztucznego, 
sztucznej gleby zgodnie z rozdzia łem C.8 niniejszego za łącznika, Toksyczno ść 
dla dżdżownic (48). W takiej glebie prze żyć, rozwijać się i rozmna żać może 
kilka gatunków badanych, a tak że zapewnia si ę w ten sposób maksymaln ą stan­
daryzację oraz porównywalno ść warunków badania i hodowli w ramach danego 
laboratorium oraz mi ędzy laboratoriami.  
Składniki gleby 
Torf: 10 % Torf z rozk ładu torfowca (Sphagnum), 
zgodnie z wytyczn ą OECD nr 207 (48); 
Piasek kwarcowy: 70 % Pprzemys łowy piasek kwarcowy (wysu ­
szony powietrzem); wielko ść ziaren: ponad 
50 % cz ąstek powinna mie ścić się 
w przedziale 50–200 μm, ale wszystkie 
cząstki powinny by ć ≤ 2 mm; 
Glinka kaolinowa: 20 % Zawarto ść kaolinitu ≥ 30 %; 
Węglan wapnia: ≤ 1 % CaCO  3 , sproszkowany, chemicznie czysty.  
Opcjonalnie zawarto ść węgla organicznego w glebie sztucznej mo żna zmniej ­
szyć, np. poprzez obni żenie zawarto ści torfu do 4–5 % suchej gleby oraz odpo ­
wiednie zwi ększenie zawarto ści piasku. Dzi ęki takiemu zmniejszeniu zawarto ści 
węgla organicznego mog ą zmniejszy ć się możliwości adsorpcji badanej 
substancji chemicznej do gleby (w ęgiel organiczny), a dost ępność badanej 
substancji chemicznej dla organizmów mo że wzrosn ąć (74). Wykazano, że 
gatunki  Enchytraeus albidus  i Eisenia fetida  mogą spełniać warunki wa żności 
dotyczące rozmna żania, jeśli bada si ę je w glebach naturalnych o ni ższej zawar ­
tości węgla organicznego, np. 2,7 % (33) (61), oraz istniej ą doświadczenia poka ­
zujące, że pozwala na to równie ż zastosowanie gleby sztucznej przy zawarto ści 
torfu na poziomie 5 %.  
Przygotowanie  
Suche składniki gleby dok ładnie się miesza (np. w du żym mieszalniku laborato ­
ryjnym). Tak ą czynność należy przeprowadzi ć około tygodnia przed rozpocz ę­
ciem badania. Wymieszane suche sk ładniki gleby nale ży nawilżyć dejonizowan ą 
wodą co najmniej 48 godzin przed zastosowaniem badanej jednostki, w celu 
wyrównania/stabilizacji kwasowo ści. W celu okre ślenia pH stosuje si ę miesza­
ninę gleby i roztworu 1 M KCl w stosunku 1:5. Je śli wartość pH nie mie ści się 
w wymaganym przedziale (6,0 ± 0,5), do gleby dodaje si ę odpowiedni ą ilość 
CaCO  3 lub przygotowuje si ę nową partię gleby.  
Maksymaln ą zdolność zatrzymywania wody gleby sztucznej okre śla się zgodnie 
z ISO 11268-2 (35). Co najmniej dwa dni przed rozpocz ęciem badania such ą 
glebę sztuczną nawilża się poprzez dodanie odpowiedniej ilo ści wody dejonizo ­
wanej lub regenerowanej w celu uzyskania oko ło połowy końcowej zawarto ści 
wody. Ko ńcowa zawarto ść wody powinna wynosi ć 40–60 % maksymalnej zdol ­
ności zatrzymywania wody. Na pocz ątku badania uprzednio nawil żoną glebę 
dzieli się na liczb ę partii odpowiadaj ącą liczbie badanych st ężeń oraz kontroli 
zastosowanych w badaniu, a zawarto ść wilgoci dostosowuje si ę do poziomu 
40–60 % maksymalnej zdolno ści zatrzymywania wody poprzez zastosowanie 
roztworu jednostki badanej lub poprzez dodanie wody dejonizowanej lub rege ­
nerowanej. Zawarto ść wilgoci okre śla się na początku i na ko ńcu badania (przy 
temperaturze 105 °C). Zawarto ść wilgoci powinna by ć optymalna dla wymogów 
dotyczących danego gatunku (zawarto ść wilgoci sprawdza si ę w następujący 
sposób: je śli glebę delikatnie ściśnie się w dłoni, między palcami powinny 
pojawić się kropelki wody).  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1463
 
Przechowywanie  
Suche sk ładniki gleby sztucznej mo żna, do czasu ich wykorzystania, przecho ­
wywać w temperaturze pokojowej. Przygotowan ą i uprzednio nawil żoną glebę 
można przed wzbogaceniem przechowywa ć w chłodnym miejscu przez maksy ­
malny okres trzech dni; nale ży dołożyć starań, by zminimalizowa ć odparowanie 
wody. Gleb ę wzbogacon ą jednostk ą badaną należy zastosowa ć niezwłocznie, 
chyba że istnieją informacje wskazuj ące, że daną glebę można przechowywa ć 
bez wpływu dla toksyczno ści i biodost ępności jednostki badanej. Próbki wzbo ­
gaconej gleby mo żna następnie, do czasu ich analizy, przechowywa ć 
w warunkach zalecanych dla danej jednostki badanej.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1464
 
Dodatek 5  
Gatunki sk ąposzczetów l ądowych zalecane do wykorzystania w badaniu 
bioakumulacji z gleby  
Dżdżownice  
Zaleca si ę wykorzystanie w badaniu gatunku  Eisenia fetida  (Savigny 1826), 
należącego do rodziny d żdżownicowatych. Od 1972 r. rozró żnia się dwa 
podgatunki tego gatunku ( Eisenia fetida  i Eisenia andrei  (10)). Wed ług Jaenike 
(36) są to dwa prawdziwie osobne gatunki.  Eisenia fetida  można łatwo rozpozna ć 
dzięki jej jasnym żółtym paskom mi ędzy segmentami, za ś Eisenia andrei  charak­
teryzuje si ę jednolitą ciemnoczerwon ą barwą. Gatunki te pochodz ą prawdopo ­
dobnie z regionu Morza Czarnego, a obecnie wyst ępują na całym świecie, 
zwłaszcza w siedliskach modyfikowanych przez dzia łalność człowieka, na przy ­
kład w pryzmach kompostowych. Organizmy obydwu tych gatunków mo żna 
wykorzystywa ć do badań ekotoksykologicznych i bada ń bioakumulacji.  
Eisenia fetida  i Eisenia andrei  są dostępne na rynku, np. jako przyn ęta na ryby. 
W porównaniu z innymi d żdżownicami z rodziny d żdżownicowatych organizmy 
te mają krótki cykl życia i osi ągają dojrzałość w ciągu ok. 2–3 miesi ęcy (w 
temperaturze pokojowej). Optymaln ą dla nich temperatur ą jest ok. 20–24 °C. 
Gatunki te preferuj ą względnie wilgotne pod łoża z prawie neutralnym pH oraz 
wysoką zawarto ścią materia łu organicznego. Jako że od oko ło 25 lat 
powszechnie wykorzystuje si ę je w zestandaryzowanych badaniach ekotoksyko ­
logicznych, ich hodowla jest dobrze opisana (48) (77).  
Obydwa gatunki mo żna hodowa ć w różnych odchodach zwierz ęcych. Pożywką 
hodowlan ą zalecaną przez ISO (35) jest mieszanina obornika ko ńskiego lub 
krowiego oraz torfu w stosunku 50:50. Taka po żywka powinna mie ć wartość 
pH na poziome oko ło 6 do 7 (regulowane w ęglanem wapnia), niskie przewod ­
nictwo jonowe (ni ższe niż 6 mS/cm lub ni ższe niż 0,5 % st ężenia soli) oraz nie 
powinna by ć zbyt zanieczyszczona amoniakiem lub zwierz ęcym moczem. Mo żna 
także zastosowa ć dostępną na rynku gleb ę ogrodnicz ą niezawieraj ącą dodatków 
lub też glebę sztuczną zgodnie z OECD (48), lub te ż mieszanin ę takich dwóch 
gleb w proporcji 50:50. Pod łoże powinno by ć wilgotne, ale nie zbytnio mokre. 
Do hodowli odpowiednie s ą skrzynki hodowlane o pojemno ści od 10 do 50 
litrów.  
Aby uzyska ć organizmy o standardowym wieku i masie, hodowl ę najlepiej 
rozpocząć z zastosowaniem kokonów. W tym celu doros łe organizmy dodaje 
się do skrzynki hodowlanej zawieraj ącej świeże podłoże w celu wytworzenia 
kokonów. Do świadczenie pokazuje, że dobre wska źniki rozmna żania uzyskuje 
się przy zag ęszczeniu na poziomie oko ło 100 doros łych organizmów na kg 
podłoża (masa mokra). Po 28 dniach usuwa si ę dorosłe organizmy. D żdżownice 
wyklute z kokonów wykorzystuje si ę do badania w chwili, gdy osi ągną one 
dojrzałość po co najmniej 2 miesi ącach, lecz nie d łużej niż po 12 miesi ącach.  
Organizmy z gatunków opisanych powy żej można uznać za zdrowe, je śli prze­
kopują się przez pod łoże, nie próbuj ą opuścić podłoża oraz rozmna żają się 
w sposób ci ągły. Bardzo powolne poruszanie si ę lub żółta tylna ko ńcówka (w 
przypadku  Eisenia fetida ) wskazuj ą na zużycie podłoża. W takim przypadku 
zaleca si ę zastosowanie świeżego podłoża lub mniejszej liczby zwierz ąt na 
jedną skrzynkę. 
Dodatkowa wybrana bibliografia  
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean 
Soc. Londyn, 6: 1–58.  
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. 
Landwirtsch. 7: 1–81.  
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S.  
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. 
Oikos 28: 49–55.  
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 
180–201.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. 
Londyn 31: 1–171.  
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm 
Ecology – from Darwin to vermiculture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, 
Londyn. 331–338 s.  
Wazonkowcowate  
Zaleca si ę wykorzystanie w badaniu gatunku  Enchytraeus albidus  Henle 1837.  
Enchytraeus albidus  jest jednym z najwi ększych (do 15 mm) gatunków z rodziny 
wazonkowcowatych, typ: pier ścienice, klasa: sk ąposzczety, oraz wyst ępuje na 
całym świecie (8). Organizmy tego gatunku mo żna spotka ć w siedliskach 
morskich, limnicznych i l ądowych, g łównie w rozk ładającej się materii orga ­
nicznej (wodorosty, kompost), oraz rzadziej tak że na łąkach (42). Ta du ża tole­
rancja ekologiczna oraz niektóre odmiany morfologiczne wskazuj ą, że 
w przypadku tego gatunku mog ą istnieć różne rasy.  
Enchytraeus albidus  jest dost ępny na rynku, sprzedawany jako pokarm dla ryb. 
Należy sprawdzi ć, czy kultura nie jest zanieczyszczona innymi, zazwyczaj mniej ­
szymi, gatunkami (60). Je śli takie zanieczyszczenie wyst ępuje, wszystkie orga ­
nizmy badane nale ży umyć w wodzie na szalkach Petriego. Nast ępnie w celu 
rozpoczęcia nowej kultury wybiera si ę duże dorosłe osobniki z gatunku  Enchyt­
raeus albidus  (z pomoc ą mikroskopu stereoskopowego). Wszystkie inne orga ­
nizmy odrzuca si ę. Cykl życia tego gatunku jest krótki i organizmy osi ągają 
dojrzałość w okresie od 33 dni (przy temperaturze 18 °C) do 74 dni (przy 
temperaturze 12 °C). W badaniu nale ży wykorzysta ć wyłącznie kultury przecho ­
wywane w laboratorium przez okres co najmniej 5 tygodni bez żadnych 
problemów (jedno pokolenie).  
Inne gatunki z rodzaju  Enchytraeus  również nadają się do wykorzystania 
w badaniu, zw łaszcza  Enchytraeus luxuriosus.  Organizmy tego gatunku s ą praw­
dziwymi mieszka ńcami gleby, co zosta ło opisane w (65). W przypadku wyko ­
rzystania innych gatunków  Enchytraeus  należy je wyra źnie zidentyfikowa ć oraz 
przedstawi ć uzasadnienie wyboru gatunku.  
Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) jest gatunkiem nale żącym do 
tej samej grupy co  Enchytraeus luxuriosus . Nie ma pewno ści, czy gatunek ten 
żyje na polach, jako że jego opisy dotycz ą wyłącznie kultur d żdżownic i pryzm 
kompostowych (Römbke 2003). Tym samym nieznane s ą jego pierwotne wyma ­
gania ekologiczne. Niemniej jednak niedawne badania laboratoryjne 
z wykorzystaniem ró żnych gleb naturalnych potwierdzi ły, że gatunek ten ma 
dużą tolerancj ę na właściwości gleby, takie jak pH i tekstura (Jänsch i in. 2005). 
Ostatnio gatunek ten cz ęsto wykorzystuje si ę w badaniach ekotoksykologicznych 
z uwagi na łatwość jego hodowli i badania, np. Kuperman i in. 2003). Jednak 
w porównaniu z  Enchytraeus albidus  jest to gatunek o ma łym rozmiarze (3–12 
mm; średnio 7 mm (Westheide & Müller 1996)), co utrudnia jego stosowanie. 
Przy wykorzystaniu tego gatunku, zamiast  Enchytraeus albidus,  rozmiar naczynia 
do badania mo że być mniejszy, lecz nie musi. Ponadto nale ży wziąć pod uwag ę, 
że ten gatunek rozmna ża się bardzo szybko i jego czas trwania pokolenia wynosi 
mniej niż 20 dni przy temperaturze 20 ± 2 °C (Achazi i in. 1999), a nawet krócej 
w wyższych temperaturach.  
Organizmy z gatunku  Enchytraeus albidus  (a także inne gatunki z rodzaju  
Enchytraeus ) można hodowa ć w dużych plastikowych skrzyniach (np. 
o wymiarach 30 × 60 × 10 cm lub 20 × 12 × 8 cm, które s ą odpowiednie do 
hodowli organizmów ma łego rozmiaru) wype łnionych mieszanin ą gleby 
sztucznej i dost ępnej na rynku niezanieczyszczonej gleby ogrodowej niezawie ­
rającej dodatków. Nale ży unikać kompostu, poniewa ż może on zawiera ć 
toksyczne substancje chemiczne, na przyk ład metale ci ężkie. Przed wykorzysta ­
niem gleby hodowlanej nale ży z niej usun ąć faunę poprzez trzykrotne g łębokie 
zamrażanie. Mo żna także wykorzysta ć czystą glebę sztuczną, jednak szybko ść 
rozmnażania może być wtedy mniejsza ni ż wyniki uzyskiwane przy zastoso ­
waniu pod łoża mieszanego. Pod łoże powinno mie ć pH na poziomie 6,0 ± 0,5. 
Kulturę przechowuje si ę w inkubatorze w temperaturze 15 ± 2 °C, bez światła. 
We wszystkich przypadkach nale ży unikać temperatury wy ższej niż 23 °C. Gleba 
sztuczna/naturalna powinna by ć wilgotna, lecz nie mokra. Gdy gleb ę delikatnie 
ściśnie się w dłoni, między palcami powinny pojawi ć się jedynie ma łe krople 
wody. We wszystkich przypadkach nale ży unikać warunków beztlenowych (np. 
jeśli stosuje si ę pokryw ę, należy wykona ć odpowiedni ą liczbę otworów 
w pokrywie w celu zapewnienia wystarczaj ącej wymiany powietrza). Gleba 
hodowlana powinna by ć napowietrzana poprzez ostro żne wymieszanie jej raz 
w tygodniu.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1466
 
Organizmy nale ży karmić raz w tygodniu  ad libitum  płatkami owsianymi, które 
umieszcza si ę w zagłębieniu na powierzchni gleby i przykrywa gleb ą. Jeśli 
w pojemniku pozosta ło pożywienie z poprzedniego karmienia, ilo ść podawanego 
pożywienia nale ży odpowiednio dostosowa ć. Jeśli na pozosta łym pożywieniu 
wyrosły grzyby, nale ży je wymieni ć na now ą porcję płatków owsianych. 
W celu stymulowania rozmna żania co dwa tygodnie do p łatków owsianych 
można dodać dostępny na rynku proszek proteinowy z witaminami. Po trzech 
miesiącach zwierz ęta przenosi si ę do świeżo przygotowanej kultury lub pod łoża 
do hodowli. P łatki owsiane, które nale ży przechowywa ć w szczelnie zamykanych 
naczyniach, nale ży autoklawowa ć lub podgrza ć, aby unikn ąć infekcji przenoszo ­
nych przez roztocza żerujące na pokarmach suchych (np.  Glyzyphagus  sp., Astig ­
mata, Acarina) lub roztocza drapie żne (np.  Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles , 
Gamasida, Acarina). Po zdezynfekowaniu po żywienie si ę mieli, aby mo żna je 
było łatwo rozmie ścić na powierzchni ę gleby. Innym mo żliwym źródłem poży­
wienia są drożdże piekarskie lub pokarm dla ryb TetraMin  ® . 
Zasadniczo warunki hodowli s ą wystarczaj ące, jeśli organizmy nie staraj ą się 
opuścić podłoża, przekopuj ą się szybko poprzez gleb ę, mają lśniącą zewnętrzną 
powłokę bez przyklejaj ących się do niej cz ąstek gleby, maj ą mniej wi ęcej 
białawą barwę oraz jeśli widoczne s ą organizmy w ró żnym wieku. Organizmy 
można uznać za zdrowe, je śli rozmna żają się w sposób ci ągły. 
Dodatkowa wybrana bibliografia  
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing 
success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae, Oligochaeta). 
Newsletter on Enchytraeidae 6: 117–126.  
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species. Environ. Reviews 13: 51–83.
 
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, 
Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus crypticus  (Oligo­
chaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651–656.
 
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. 
Pedobiologia 47: 607–616.  
Westheide W i Graefe U (1992). Two new terrestrial  Enchytraeus  species (Oli ­
gochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479–488.  
Westheide W i Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchyt ­
raeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263–267.  ▼M4 2008R0440 — PL — 24.08.2014 — 005.001 — 1467