A.

Test ELISA blokujący lub kompetycyjny przeprowadza się zgodnie z następującym protokołem: Test ELISA w modyfikacji kompetycyjnej, wykorzystujący przeciwciała monoklonalne 3–17-A3 jest w stanie zidentyfikować przeciwciała skierowane przeciwko wszystkim znanym serotypom wirusa choroby niebieskiego języka (Bluetongue) (BTV). Zasada testu polega na przerwaniu reakcji pomiędzy antygenem BTV i grupowo specyficznym monoklonalnym przeciwciałem (3–17-A3) poprzez dodanie surowicy testowej. Przeciwciała skierowane przeciwko BTV obecne w surowicy testowej blokuję reaktywność przeciwciał monoklonalnych (Mab), przez co ograniczona jest spodziewana reakcja barwna po dodaniu znakowanych enzymatycznie przeciwciał mysich oraz chromogenu/substratu. Surowice mogą być badane w pojedynczym rozcieńczeniu 1:5 (test plamkowy — dodatek 1) lub mogą być miareczkowane (miareczkowanie surowicy — dodatek 2) punktu końcowego. Wartości zahamowania wyższe, niż 50 % można uznać za pozytywne. 1. Odpowiednie, płaskodenne płytki do testu ELISA. 2. Antygen: dostarczany jako koncentrat wyciągu z komórek, przygotowywany według podanego poniżej sposobu, przechowywany w temperaturze –20 °C albo–70 °C. 3. Bufor blokujący: Izotoniczny roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami (PBS), zawierający 0,3 % BTV ujemnej surowicy dorosłego bydła, 0,1 % (v/v) Tween — 20 (dostarczany jako syrop Monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu) w PBS. 4. Przeciwciała monoklonalne: 3–17-A3 (dostarczane jako supernatant z hodowli tkankowych linii komórkowej hybridoma) skierowane przeciwko grupowo swoistemu polipeptydowi VP7, przechowywane w temperaturze -20 °C lub liofilizowane i przed użyciem rozcieńczane w stosunku 1/100 z buforem blokującym. 5. Konjugat: królicza globulina przeciwko przeciwciałom mysim (adsorbowane i przemyte) sprzężone z peroksydazą chrzanową, przechowywany w temperaturze 4 °C, w ciemności. 6. Chromogen i substrat: ortofenylo dwuamina (ODP-chromogen) w końcowym stężeniu 0,4 mg/ml w sterylnej wodzie destylowanej. Nadtlenek wodoru (30 % w/v-substratu) 0,05 % v/v dodawany tuż przed użyciem (5μl H2O2 na 10 ml OPD). (Należy obchodzić się z OPD ostrożnie — używać rękawic gumowych — przypuszczalny mutagen). 7. 1 molowy kwas siarkowy: 26,6 ml kwasu dodane do 473,4 ml destylowane wody. (Należy pamiętać, aby zawsze dodawać kwas do wody, nigdy wodę do kwasu). 8. Wytrząsarka obrotowa. 9. Czytnik płytek ELISA (test można odczytać wizualnie). Cc: kontrola konjugatu (bez surowicy/bez przeciwciał monoklonalnych); C++: silnie dodatnia surowica kontrolna; C+: słabo dodatnia surowica kontrolna; C-: ujemna surowica kontrolna; Cm: kontrola przeciwciał monoklonalnych (bez surowicy).



Dodatek 1: Format testu plamkowego (1:5) — (40 surowic/płytkę) Kontrole Surowice testowe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 B Cc C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C C ++ C ++ D C ++ C ++ E C + C + F C + C + G Cm Cm 40 H Cm Cm 40



Dodatek 2: Format miareczkowania surowicy (10 surowic/płytkę) Kontrole Surowice testowe 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Cc C- 1:5 1:5 B Cc C- 1:10 1:10 C C ++ C ++ 1:20 1:20 D C ++ C ++ 1:40 1:40 E C + C + 1:80 1:80 F C + C + 1:160 1:160 G Cm Cm 1:320 1:320 H Cm Cm 1:640 1:640 Kontrola konjugatu (Cc) : Studzienki 1A i 1B są pustą kontrolą składającą się z antygenu BTV oraz konjugatu. Może być używana do zerowania czytnika ELISA. Kontrola Mab (Cm) : Kolumny 1 i 2, wiersze G i H to kontrola przeciwciał monoklonalnych, zawierająca antygen BTV, przeciwciała monoklonalne i konjugat. Te studzienki wykazują najsilniejsze zabarwienie. Wartość gęstości optycznej odczytu dla tej kontroli odpowiada wartości zahamowania równej 0 %. Kontrola dodatnia (C++, C-) : Kolumny 1 i 2, wiersze C-D-E-F. Studzienki te zawierają antygen BTV, odpowiednio silne i słabe dodatnie surowice BTV, Mab i konjugat. Kontrola ujemna (C-) : Studzienki 2A i 2B są kontrolą ujemną zawierająca antygen BTV, ujemną surowicę BTV, Mab i konjugat. Surowice testowe : Przy badaniach serologicznych i szybkich badaniach screeningowych, surowice mogą być badane w pojedynczym rozcieńczeniu 1:5 (Dodatek 1). Alternatywnie można zbadać 10 surowic w rozcieńczeniu wahającym się od 1:5 do 1:640 (Dodatek 2). Pozwala to uzyskać przybliżone wskazania co do miana przeciwciał w surowicy testowej. 1. Rozcieńczyć antygen BTV do wstępnie mianowanego stężenia w PBS, poddać krótkiej sonikacji w celu rozproszenia skupisk wirusa (jeśli sonikator nie jest dostępny, silnie wstrząsnąć pipetą), po czym dodać po 50 μl do wszystkich studzienek płytki przeznaczonej do testu ELISA. Należy postukać w ścianki płytki w celu rozproszenia antygenu. 2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w wytrząsarce obrotowej. Przemyć płytki trzykrotnie poprzez zalanie ich nie sterylnym PBS i opróżnienie, po czym osuszyć na bibule. 3. Kontrolować studzienki: dodać 100 μl buforu blokującego do studzienek oznaczonych jako Cc. Dodać 50 μl dodatniej i ujemnej surowicy kontrolnej w rozcieńczeniu 1:5 (10 μl surowicy + 40 μl blokującego buforu, odpowiednio do studzienek C-, C + oraz C++. Dodać 50 μl buforu blokującego do studzienek kontrolnych Mab. Metoda testu plamkowego: dodać każdej z badanych surowic w rozcieńczeniu 1:5 w buforze blokującym, w celu zduplikowania studzienek w kolumnach od 3 do 12 (10 μl surowicy + 40 μl buforu blokującego), lub Metoda miareczkowania surowicy: przygotować serię dwukrotnie wzrastających rozcieńczeń każdej z próbek testowych (1:5 do 1:640) w buforze blokującym, w ośmiu studzienkach w pojedynczych kolumnach od 3 do 12. 4. Natychmiast po dodaniu surowic testowych, rozcieńczyć Mab w stosunku 1:100 w buforze blokującym oraz dodać 50 μl do wszystkich studzienek na płytce, z wyjątkiem kontroli ślepej. 5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w wytrząsarce obrotowej. Przemyć trzykrotnie PBS i osuszyć na bibule. 6. Rozcieńczyć koncentrat króliczy przeciwko przeciwciałom mysim do 1/5 000 w buforze blokującym i dodać 50 μl do wszystkich studzienek na płytce. 7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w wytrząsarce obrotowej. Przemyć trzykrotnie PBS i osuszyć na bibule. 8. Rozmrozić OPD i bezpośrednio przed użyciem dodać 5 μl 30 % nadtlenku wodoru do każdych 10 ml OPD. Dodać 50 μl do wszystkich studzienek na płytce. Należy poczekać około 10 minut na wytworzenie się reakcji barwnej, po czym zatrzymać reakcję przy pomocy 1 M kwasu siarkowego (50 μl na studzienkę). Reakcja barwna powinna pojawić się w studzienkach kontrolnych Mab oraz w studzienkach zawierających surowice bez przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka. 9. Ocenić płytki wizualnie lub przy pomocy czytnika spektrofotometrycznego i zapisać wyniki. Używając pakietu oprogramowania, wydrukować wartości gęstości optycznej (OD) oraz procent zahamowania (PI) dla testowanej i kontrolnej surowicy w odniesieniu do wartości średniej policzonej na podstawie wyników odnotowanych w studzienkach kontrolnych antygenu. Odnotowane wartości OD i PI pozwolą ustalić, czy wyniki testu mieszczą się w akceptowalnych granicach. Wartość górnej granicy kontrolnej (UCL) i niższej granicy kontrolnej (LCL) dla kontroli Mab (antygen plus Mab przy braku obecności surowic testowych) wynoszą pomiędzy wartościami gęstości optycznej 0,4 i 1,4. Każda płytka, która nie spełnia powyższych kryteriów musi zostać odrzucona. Jeśli pakiet oprogramowania nie jest dostępny, wartości OD należy wydrukować korzystając z opcji drukowania w teście ELISA. Należy obliczyć średnią wartość OD dla studzienek kontroli antygenu, która równa jest 100 %. Określić 50 % wartości OD i ręcznie obliczyć, czy każda z próbek jest dodatnia lub ujemna. Wartość procentu zahamowania (PI) = 100 — (OD każdej z kontroli testu/średnia wartość OD z Cm) × 100. Zduplikowane studzienki zawierające ujemną surowicę kontrolną, a także zduplikowane studzienki z próbą ślepą blank powinny wskazywać wartości PI pomiędzy + 25 % i –25 %, a także odpowiednio pomiędzy + 95 % i + 105 %. Nie spełnienie powyższych kryteriów nie unieważnia wyniku pochodzącego z danej płytki, ale sugeruje, że kolor tła cały czas się zmienia. Silna i słaba dodatnia surowica kontrolna powinna wskazywać wartość PI pomiędzy + 81 % i + 100 %, i odpowiednio pomiędzy + 51 % i + 80 %. Próg diagnozy dla surowic testowych to 50 % (PI 50 % lub OD 50 %). Próbki dające wynik PI powyżej 50 % należy uznać za ujemne. Próbki, w przypadku których wartość PI wynosi powyżej i poniżej progu dla zduplikowanych studzienek, uznaje się za wątpliwe; próbki takie można ponownie zbadać testem plamkowym lub/i testem miareczkowania. Próbki pozytywne również mogą zostać poddane miareczkowaniu w celu określenia stopnia, w jakim ich wynik jest pozytywny. Odczyt wizualny: Próbki dodatnie i ujemne można z łatwością rozróżnić wizualnie; próbki słabo dodatnie lub silnie ujemne mogą być trudne do interpretacji wizualnej. 1. Przemyć 40–60 butli Roux zawierających jednowarstwową hodowlę komórek BHK-21 należy płukać trzykrotnie podłożem Eagle'a bez surowicy, a następnie zakazić serotypem 1 wirusa choroby niebieskiego języka w podłożu Eagle'a bez surowicy. 2. Inkubować w temperaturze 37 °C i sprawdzać codziennie na obecność efektu cytopatycznego (cpe). 3. Gdy efekt cytopatyczny obejmuje 80–90 % komórek hodowli jednowarstwowej w każdej butli Roux, należy zebrać wirus przez energiczne potrząsanie w celu odklejenia komórek od powierzchni szkła. 4. Odwirować zawiesinę przy 2 000–3 000 obr/min w celu osadzenia komórek. 5. Zlać supernatant i zawiesić osad komórek w około 30 ml PBS zawierającym 1 % sarkozylu i 2 ml fluorku fenylometylosulfonylu (bufor do lizy). Może to powodować utworzenie żelu z komórek, co można ograniczyć dodając więcej buforu do lizy. Uwaga: fluorek fenylometylosulfonylu jest szkodliwy — należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. 6. Rozbić komórki przy użyciu sondy ultradźwiękowej przy amplitudzie 30 mikronów w ciągu 60 sekund. 7. Wirować przy 10 000 obr/min przez 10 minut. 8. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze + 4 °C, a pozostały osad komórek ponownie zawiesić w 10–20 ml buforu do lizy. 9. Rozbić komórki ultradźwiękami i odwirować. Zebrać uzyskany supernatant i powtórzyć procedurę po raz trzeci, ponownie zbierając supernatant. 10. Połączyć porcje supernatantu i odwirować na poduszce z 40 % sacharozy (w/v w PBS) używając 30 ml probówek wirowniczych Beckmanna i rotora SW120, przy 24 000 obr/min w temperaturze + 4 °C w ciągu 120 minut. 11. Odrzucić supernatant, wysuszyć probówki i ponownie zawiesić osad w PBS przy użyciu sonifikatora. Tak uzyskany antygen należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze –20 °C Antygen choroby niebieskiego języka do testu ELISA jest miareczkowany przy pomocy pośredniego testu ELISA. Dwukrotnie wzrastające rozcieńczenia antygenu mianuje się względem stałego rozcieńczenia 1/100 przeciwciała monoklonalnego 3–17-A3, zgodnie z następującym protokołem: 1. Przygotować rozcieńczenie 1:20 antygenu BTV w PBS w studzienkach płytki w szeregu dwukrotnie wzrastających rozcieńczeń (w objętości 50 μl/studzienkę), przy pomocy pipety wielokanałowej. 2. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej. 3. Spłukać płytkę trzykrotnie przy użyciu PBS. 4. Do każdej studzienki płytki dodać 50 μl rozcieńczenia 1:50 przeciwciała monoklonalnego 3–17-A3. 5. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej. 6. Spłukać płytkę trzykrotnie przy użyciu PBS 7. Do każdej studzienki dodać po 50 μl konjugatu króliczej antyglobuliny przeciwko mysim przeciwciałom, znakowanego peroksydazą chrzanową w optymalnym wstępnym stężeniu. 8. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej. 9. Dodać substrat i chromogen według podanego poprzednio opisu. Zatrzymać reakcję barwną po 10 minutach przez dodanie do każdej studzienki 1 M kwasu siarkowego (50 μl/studzienkę). W teście kompetycyjnym należy stosować nadmiar przeciwciała monoklonalnego gdyż pozwala to wybrać rozcieńczenie antygenu, które znajduje się na opadającej krzywej titracyjnej (nie w obszarze plateau) i daje około 0,8 OD po 10 minutach