1978L0633 — PL — 20.12.1983 — 002.001

Dokument ten służy wyłącznie do celów dokumentacyjnych i instytucje nie ponoszą żadnej odpowiedzialności za jego zawartość

►B ÓSMA DYREKTYWA KOMISJI z dnia 15 czerwca 1978 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (78/633/EWG) (Dz.U. L 206, 29.7.1978, p.43)

zmienione przez:









▼B

ÓSMA DYREKTYWA KOMISJI

z dnia 15 czerwca 1978 r.

ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz

(78/633/EWG)







KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą, uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz ( 1 ), ostatnio zmienioną Aktem Przystąpienia, w szczególności jego art. 2, a także mając na uwadze, co następuje: a także mając na uwadze, co następuje: dyrektywa wymaga, by urzędowa kontrola pasz była prowadzona przy użyciu wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów kontroli zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz; dyrektywy Komisji 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r. ( 2 ), 71/393/EWG z dnia 18 listopada 1971 r. ( 3 ), 72/199/EWG z dnia 27 kwietnia 1972 r. ( 4 ), 73/46/EWG z dnia 5 grudnia 1972 r. ( 5 ), 74/203/EWG z dnia 25 marca 1974 r. ( 6 ), 75/84/EWG z dnia 20 grudnia 1974 r. ( 7 ) oraz 76/372/EWG z dnia 1 marca 1976 r. ( 8 ) ustanowiły szereg metod analizy; postęp prac od tamtej pory wskazuje celowość przyjęcia ósmego zestawu metod; środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz, PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:







Artykuł 1

1. Państwa Członkowskie wymagają, by analizy do celów urzędowej kontroli pasz, na zawartość w nich bacytracyny cynku, flawofosfolipolu, żelaza, miedzi, manganu i cynku, były prowadzone zgodnie z metodami opisanymi w Załączniku do niniejszej dyrektywy.

▼M1 —————

▼B

Artykuł 2

Państwa Członkowskie wprowadzają w życie do dnia 1 stycznia 1979 r. przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy i niezwłocznie powiadamiają o tym Komisję.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.









ZAŁĄCZNIK

▼M2

1. OZNACZANIE BACYTRACYNY CYNKU

— przez dyfuzję na podłożu agarowym —

1. CEL I ZAKRES

Metoda ta służy oznaczaniu bacytracyny cynku w paszach i premiksach. Dolna granica oznaczenia wynosi 5 mg/kg (5ppm) ( 9 ).

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana przy pH 2 przy użyciu mieszaniny metanolu, wody i kwasu solnego, a następnie roztworu siarczku sodu. Dodanie siarczku sodu ma na celu wytrącenie rozpuszczalnych soli miedzi, które mogą zakłócać przebieg oznaczenia. Ekstrakt jest doprowadzany do pH 6,5, stężony (jeśli jest to konieczne) i rozcieńczany. Jego czynność antybiotyczną oznacza się poprzez pomiar dyfuzji bacytracyny cynku na podłożu agarowym, na którym wykonano zaszczepionym Micrococcuc luteus (flavus). Dyfuzja objawia się tworzeniem stref inhibicji drobnoustrojów. Średnica tych stref jest proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku, w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. DROBNOUSTROJE: MICROCOCCUS LUTEUS (FLAVUS) ATCC 10240

3.1. Utrzymanie kultury bakteryjnej

Zaszczepić Micrococcus luteus na agarze z pożywką (4.1) w skośnie ustawionej probówce i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 30 oC. Kulturę bakteryjną należy przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 oC. Ponownie szczepić co 2 tygodnie.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakterii ( 10 )

Zebrać kolonie bakterii z ostatnio szczepionego agaru (3.1) przy użyciu 2-3 ml roztworu chlorku sodu (4.3). Zawiesinę tą należy zaszczepić w 250 ml pożywki, umieszczonej w kolbie Roux, inkubować przez 18-20 godzin w temperaturze 30 oC. Zebrać bakterie do 25 ml roztworu chlorku sodu (4.3) i wymieszać. Rozcieńczyć zawiesinę w stosunku 1/10 przy użyciu roztworu chlorku sodu (4.3). Transmitancja światła przez zawiesinę, mierzona przy 650 nm w celce o grubości 1 cm, powinna wynosić około 75 % w stosunku do roztworu chlorku sodu (4.3). Zawiesina ta może być przechowywana przez 1 tydzień w temperaturze około 4 oC.

4. POŻYWKA I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywka ( 11 )







Pepton mięsny 6,0 g Trypton 4,0 g Ekstrakt z drożdży 3,0 g Ekstrakt z mięsa 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar 10,0–20,0 g Woda 1 000 ml pH 6,5 do 6,6 (po sterylizacji).

4.2. Pożywka do wykonania oznaczenia (11)







Trypton 10,0 g Ekstrakt z drożdży 3,0 g Ekstrakt z mięsa 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar 10,0–20,0 g Tween 80 1 ml Woda 1 000 ml pH 6,5 (po sterylizacji)

4.3. 0,8-procentowy roztwór chlorku sodu (m/v): rozpuścić 8 g chlorku sodu w wodzie i rozcieńczyć do 1 000 ml; wysterylizować.

4.4. Mieszanina metanolu/wody/kwasu solnego (4.6) 80/17,5/2,5 (v/v/v).

4.5. Bufor fosforanowy, pH 6,5



Wodorofosforan potasu, K2HPO4 22,15 g Diwodorofosforan potasu, KH2PO4 27,85 g Woda do 1 000 ml.

4.6. Kwas solny (gęstość: 1,18-1,19).

4.7 Kwas solny (1-molowy).

4.8. Roztwór 1-molowego wodorotlenku sodu.

4.9. Roztwór około 0,5-molowy siarczku sodu

4.10. 0,04-procentowy roztwór purpury bromokrezolowej (m/v): rozpuścić 0,1 g purpury bromokrezolowej w 18,5 ml 0,01-molowym roztworze wodorotlenku sodu. Dopełnić wodą do objętości 250 ml i wymieszać.

4.11. Substancja podstawowa: bacytracyna cynku o znanej aktywności (w jednostkach międzynarodowych).

5. ROZTWORY WZORCOWE

Odważyć ilość podstawowej bacytracyny cynku (4.11), odpowiadającą 1 050 jednostkom miedzynarodowym (zgodnie z podaną aktywnością). Dodać 5 ml 0,1-molowego kwasu solnego (4,7) i odstawić na 15 minut. Dodać 30 ml wody, doprowadzić pH do 4,5 przy użyciu buforu fosforanowego (4,5) (około 4ml), dopełnić wodą do objętości 50ml i dobrze wymieszać (1 ml = 21 jednostek międzynarodowych).

Z tak przygotowanego roztworu, poprzez kolejne rozcieńczenie buforem fosforanowym (4.5), przygotować następujące roztwory:







s8 0,42 j.m./ml s4 0,21 j.m./ml s2 0,105 j.m./ml s1 0,0525 j.m./ml

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU I ROZTWORÓW BADANYCH

6.1. Ekstrakcja

6.1.1. Premiksy i pasze mineralne

Odważyć z próbki ilość 2,0–5,0 g, dodać 29,0 ml mieszaniny (4.4) i 1,0 ml roztworu siarczku sodu (4.9); krótko wstrząsać. Sprawdzić, czy pH wynosi około 2. Wstrząsać przez 10 minut, dodać 30 ml buforu fosforanowego (4.5), wstrząsać przez 15 minut i odwirować. Pobrać właściwą ilość płynu znad osadu, doprowadzić pH do 6,5 przy użyciu 1-molowego roztworu wodorotlenku sodu (4.8), korzystając z pH-metru lub roztworu purpury bromokrezolowej (4.10) jako wskaźnika. Rozcieńczyć przy użyciu buforu fosforanowego (4.5) w celu uzyskania oczekiwanej zawartości bacytracyny cynku 0,42 i.u./ml (= u8).

6.1.2. Koncentraty białkowe

Odważyć z próbki ilość 10,0 g, dodać 49,0 ml mieszaniny (4.4) i 1,0 ml roztworu siarczku sodu (4.9); krótko wstrząsać. Sprawdzić, czy pH wynosi około 2. Wstrząsać przez 10 minut. Dodać 50 ml buforu fosforanowego (4.5), wstrząsać przez 15 minut i odwirować. Pobrać właściwą objętość płynu znad osadu, doprowadzić pH do 6,5 przy użyciu 1-molowego roztworu wodorotlenku sodu (4.8), korzystając z pehametru lub roztworu purpury bromokrezolowej (4.10) jako wskaźnika. Odparować do uzyskania około połowy objętości pierwotnej w parowniku obrotowym w temperaturze nieprzekraczającej 35 oC.

Rozcieńczyć przy użyciu roztworu buforowego fosforanu (4.5) w celu uzyskania oczekiwanej zawartości bacytracyny cynku 0,42 i.u./ml (= u8).

6.1.3. Pozostałe pasze

Odważyć z próbki ilość 10,0 g (20,0 g dla oczekiwanej zawartości bacytracyny cynku 5 mg/kg). Dodać mieszaninę złożoną z 24,0 ml mieszaniny (4.4) i 1,0 ml roztworu siarczku sodu (4.9); homogenizować przez 10 minut. Dodać 25 ml buforu fosforanowego (4.5), wstrząsać przez 15 minut i odwirować. Wziąć 20 ml roztworu płynu znad osadu i doprowadzić pH do 6,5 przy użyciu 1-molowego roztworu wodorotlenku sodu (4.8), korzystając z pH-metru lub roztworu purpury bromokrezolowej (4.10) jako wskaźnika. Odparować do uzyskania objętości 4 ml w wyparce obrotowej w temperaturze nieprzekraczającej 35 oC. Rozcieńczyć pozostałość przy użyciu buforu fosforanowego (4.5) w celu uzyskania oczekiwanej zawartości bacytracyny cynku wynoszącej 0,42 i.u./ml (= u8).

6.2. Roztwory badane

Z roztworu u8 przygotować roztwór u4 (zakładana zawartość: 0,21 j.m./ml), u2 (oczekiwana zawartość: 0,105 j.m./ml) i u1 (zakładana zawartość: 0,0525 j.m./ml), metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu bufora fosforanowego (4.5).

7. PROCEDURA OZNACZENIA

7.1. Szczepienie pożywki do oznaczenia

Szczepić pożywkę do oznaczania (4.1) za pomocą zawiesiny bakterii (3.2) w temperaturze około 50 oC. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (4.1) oznaczyć ilość zawiesiny bakterii wymaganej do uzyskania największych i najczytelniejszych stref inhibicji przy różnych stężeniach bacytracyny cynku.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze przeprowadza się na płytkach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (s8, s4, s2 i s1) i czterech stężeń roztworu badanego (u8, u4, u2 i u1). Te cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umiejscowione na każdej płytce. Aby osiągnąć taki efekt, należy wybrać wystarczająco duże płytki, aby możliwe było zrobienie w podłożu agarowym co najmniej ośmiu otworów o średnicy 10-13 mm, leżących od siebie w odległości nie mniejszej niż 30 mm, licząc od środka otworów. Badanie może być przeprowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką objętość pożywki (4.1), zaszczepionej jak przedstawiono w ppkt 7.1, aby uzyskać warstwę o grubości ok. 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Zostawić do zastygnięcia w poziomym położeniu, wywiercić otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzoną objętość roztworów badanego i wzorcowego (między 0,10 a 0,15 ml na otwór, w zależności od w zależności od średnicy). Należy użyć roztworu o każdym stężeniu, co najmniej cztery razy, aby każde oznaczenie było wykonane na podstawie oceny 32 stref inhibicji.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 30 ± 2 oC.

8. OCENA

Zmierzyć średnicę stref inhibicji z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy kolejnych stężeń i odpowiadające im średnice stref inhibicji. Nakreślić proste o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i dla ekstraktu, postępując np. tak, jak poniżej:

Wyznaczyć punkt „o najlepszej zgodności” dla najniższego poziomu roztworu wzorcowego (SL), używając wzoru:

a)

Wyznaczyć punkt „o najlepszej zgodności” dla najwyższego poziomu roztworu wzorcowego (SH), używając wzoru:

b)

Podobnie obliczyć punkty „o najlepszej zgodności” dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH), podstawiając u1, u2, u4 i u8 zamiast s1, s2, s4 i s8 do powyższych wzorów.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując prostą „o najlepszej zgodności” dla roztworu wzorcowego. Podobnie zaznaczyć wartości UL i UH i połączyć je uzyskując prostą „o najlepszej zgodności” w celu uzyskania odpowiedniej prostej dla ekstraktu.

Jeśli oznaczenie przebiega bez zakłóceń, proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeśli średnie wartości (SH–SL) i (UH–UL) nie różnią się więcej niż o 10 %.

Jeśli okaże się, że proste nie są równoległe, w obliczeniach można pominąć zarówno u1 i s1, jak również u8 i s8. Do obliczenia wartości SL, SH, UL i UH można użyć alternatywnych wzorów, aby otrzymać alternatywne proste „o najlepszej zgodności”:







a′) SL = lub b′) SH = lub

oraz podobnie dla UL i UH. Zadowalające są takie kryteria równoległości, jakie zastosowano powyżej. W sprawozdaniu końcowym należy odnotować fakt, że wynik uzyskano przy użyciu trzech poziomów.

Jeśli proste zostały uznane za równoległe, należy obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) za pomocą jednego z poniższych wzorów, w zależności, czy do oceny równoległości prostych użyto trzech, czy czterech poziomów.

Dla czterech poziomów

c)

Dla trzech poziomów

d)

lub

d′)

Aktywność ekstraktu próbnego = aktywność odpowiedniego wzorca × A

(u8 = s8 × A)

Jeśli względna aktywność nie mieści się w zakresie 0,5–2,0, należy powtórzyć próbę, odpowiednio dostosowując stężenia ekstraktu lub, jeśli nie jest to możliwe, dostosowując stężenia roztworów wzorcowych. Jeśli względna aktywność nadal nie mieści się w wymaganym zakresie, wszystkie otrzymane wyniki należy uznać za przybliżone. Należy to odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Jeśli uznano, że proste nie są równoległe, należy powtórzyć oznaczenie. Jeśli proste nadal nie są równoległe, oznaczenie należy uznać za niezadowalające.

Wynik należy wyrazić w miligramach zawartości bacytracyny na kilogram paszy.

9. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń, przeprowadzonych dla tej samej próbki przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

— 2 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości bacytracyny cynku do 10 mg/kg,

— 20 % względem wartości najwyższej, dla zawartości 10–25 mg/kg,

— 5 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości 25–50 mg/kg,

— 10 % względem wartości najwyższej, dla zawartości powyżej 50 mg/kg.

▼B

2. OZNACZANIE FLAWOFOSFOLIPOLU POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy oznaczaniu flawofosfolipolu w paszach, koncentratach i premiksach. Dolna granica oznaczenia wynosi 1 mg/kg (1 ppm).

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana za pomocą rozcieńczonego metanolu poprzez grzanie pod chłodnicą zwrotną. Po odwirowaniu ekstrakt jest oczyszczany (jeśli konieczne) poprzez obróbkę żywicami jonowymiennymi i rozpuszczanie. Jego aktywność antybiotykowa jest oznaczana poprzez pomiar dyfuzji flawofosfolipolu w podłożu agaru posianym Staphylococcus aureus. Dyfuzja jest widoczna po tworzeniu się stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest bezpośrednio proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Staphylococcus aureus na powierzchnię pożywki agarowej (4.1). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C, i ponawiać posiew co miesiąc na powierzchnię agaru.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej ( 12 )

Odstawić dwie próbówki z kulturą macierzystą (3.1) i posiewać je co tydzień. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C.

Na 24 godziny przed oznaczeniem należy posiać niniejszym przyrostem od dwóch do czterech próbówek zawierających wyciągi z pożywki (4.1). Inkubować 16-18 godzin w temperaturze 37 °C. Wykonać zawiesinę przyrostu w roztworze chlorku sodowego (4.3). Transmisja światła zawiesiny musi wynosić około 40 %, zmierzona przy 578 nm w jednocentymetrowym naczynku, w stosunku do roztworu chlorku sodowego (4.3).

4. POŻYWKI I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywka ( 13 )







Pepton mięsa 6,0 g Trypton 4,0 g Ekstrakt z drożdży 3,0 g Ekstrakt z mięsa 1,5 g Glukoza 1,0 g Agar 15,0 g Woda 1000 ml pH 6,5 (po sterylizacji)

4.2. Odczynnik do oznaczania

4.2.1. Warstwa bazowa ( 14 )







Pepton mięsa 6,0 g Ekstrakt z drożdży 3,0 g Ekstrakt z mięsa 1,5 g Agar 10,0 g Woda 1000 ml pH 6,5 (po sterylizacji)

4.2.2. Warstwa nasienna

Tak jak w pkt 4.1 z dodatkiem 2,0 g silikonowej emulsji przeciwpieniącej ( 15 ).

4.3. 0,4-procentowy (stężenie wagowe) roztwór chlorku sodowego: rozpuścić 4 g chlorku sodowego analitycznie czystego w wodzie i rozcieńczyć do 1000 ml; poddać sterylizacji.

4.4. Czysty metanol.

4.5. Metanol 50 % (objętościowo): rozpuścić 500 ml metanolu (4.4) w 500 ml wody.

4.6. Metanol 80 % (objętościowo): rozpuścić 800 ml metanolu (4.4) w 200 ml wody.

4.7. Trójhydroksymetyloaminometan analitycznie czysty.

4.8. 1,5-procentowy (wagowo) roztwór metanolowy chlorku potasu: rozpuścić 1,5 g chlorku potasu analitycznie czystego w 20 ml wody, uzupełnić do 100 ml metanolem (4.4).

4.9. Wymieniacz kationowy: Dowex 50 W × 8, od 20 do 50 mesh, forma Na (nr kat. Serva nr 41600) lub równoważny.

4.10. Wymieniacz anionowy: Dowex 1 × 2, od 50 do 100 mesh, forma Cl (nr kat. Serva 41010) lub równoważny. Przed użyciem należy trzymać 12-14 godzin w 80-procentowym metanolu (4,6).

4.11. Wełna szklana.

4.12. Papierek wskaźnikowy pH (pH 6,6-8,1).

4.13. Kwas askorbinowy.

4.14. Substancja podstawowa: flawofosfolipol o znanej aktywności.

5. APARATURA

5.1. Szklana próbówka dla chromatografii, wewnętrzna średnica: 9 mm długość: 150-200 mm, z kurkiem odcinającym przy zwężeniu na dole wraz z oszlifowanym połączeniem szklanym (do połączenia z wkraplaczem (5.2) na górze).

5.2. 250-mililitrowy wkraplacz z oszlifowanym połączeniem szklanym.

5.3. 250-mililitrowa kolba stożkowa z oszlifowanym połączeniem szklanym.

5.4. Chłodnica zwrotna z oszlifowanym połączeniem szklanym.

6. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji podstawowej (4.14) w 50-procentowym metanolu (4.5) i rozpuścić, aby otrzymać roztwór podstawowy, zawierający 100 μg flawofosfolipolu na mililitr. Roztwór ten przechowywany w kolbach z zatyczkami w temperaturze 4 °C jest stabilny przez maksymalnie dwa miesiące.

Powyższy roztwór podstawowy rozcieńczać stopniowo za pomocą 50-procentowego metanolu (4.5) i przygotować następujące roztwory:







S8 0,2 μg/ml S4 0,1 μg/ml S2 0,05 μg/ml S1 0,025 μg/ml

7. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

7.1. Ekstrakcja

7.1.1. Koncentraty, premiksyi i pasze mineralne

Odważyć ilościowo próbkę 2,0-5,0 g, dodać około 150 mg kwasu askorbinowego (4.13). Ujednorodnić roztwór za pomocą 150 ml 50-procentowego metanolu (4.5) w kolbie stożkowej (5.3), skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 za pomocą około 400 mg trójhydroksymetyloaminometanu (4.7). Sprawdzić pH za pomocą papierka wskaźnikowego (4.12). Odstawić na 15 minut, ponownie skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 trójhydroksymetyloaminometanem (4.7) i gotować przez 10 minut w chłodnicy zwrotnej, stale mieszając. Zostawić do ostygnięcia, odwirować mieszaninę i zlać ekstrakt.

7.1.2. Pozostałe pasze

Odważyć ilościowo próbkę 5,0-30,0 g, zawierającą przynajmniej 30 μg flawofosfolipolu. Ujednorodnić roztwór za pomocą 150 ml 50-procentowego metanolu (4.5) w kolbie stożkowej (5.3), skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 za pomocą około 400 mg trójhydroksymetyloaminometanu (4.7). Sprawdzić pH za pomocą papierka wskaźnikowego (4.12). Odstawić na 15 minut, skorygować pH do poziomu 8,1-8,2 za pomocą trójhydroksymetyloaminometanu (4.7) i gotować przez 10 minut w chłodnicy zwrotnej, stale mieszając. Zostawić do ostygnięcia, odwirować mieszaninę i zlać ekstrakt.

7.2. Oczyszczanie (etap ten może być pominięty w przypadku koncentratów, premiksów i pasz mineralnych)

Zmieszać 110 ml ekstraktu z 11 g wymieniacza kationowego (4.9), gotować przez jedną minutę pod chłodnicą zwrotną, ciągle mieszając. Oddzielić wymieniacz kationowy przez odwirowanie lub odfiltrowanie. Wymieszać 100 ml ekstraktu ze 150 ml metanolu (4.4) i przechowywać roztwór 12-15 godzin w temperaturze 4 °C. Odfiltrować kłaczkowatą masę po ostygnięciu.

Dół szklanej probówki (5.1) zatkać zatyczką z wełny szklanej (4.11), wlać do probówki 5 ml wymieniacza anionowego (4.10) i przepłukać kolumnę 100 ml 80-procentowego metanolu (4.6). Używając lejka (5.2), przelać do kolumny co najmniej 100 ml odfiltrowanego roztworu, który powinien zawierać 16 μg flawofosfolipolu (200 ml dla próbki 30 g paszy przy 1 ppm). Gdy zachodzi potrzeba, przed wlaniem do kolumny rozcieńczyć filtrat 80-procentowym metanolem (4.6), aby uzyskać zakładaną zawartość flawofosfolipolu wynoszącą 16 μg/100 ml. Wielkość przepływu ustawić na 2 ml na minutę. Odrzucić odciek. Następnie przepłukać kolumnę 50 ml 80-procentowym metanolem (4.6) i odrzucić odciek.

Wymyć flawofosfolipol za pomocą roztworu metanolowego chlorku potasu (4.8), utrzymując przepływ około 2 ml na minutę. Zebrać 50 ml odcieku w szklanej kolbie miarowej, dodać 30 ml wody i wymieszać. Roztwór ten zawiera 0,2 μg/ml (= U8) flawofosfolipolu.

7.3. Roztwory do oznaczania

Gdy zachodzi potrzeba (tj. gdy etap oczyszczania został pominięty), rozcieńczyć ekstrakt uzyskany w pkt 7.1.1 za pomocą 50-procentowego metanolu (4.5), aby uzyskać planowaną zawartość flawofosfolipolu w wysokości 0,2 μg/ml (= U8).

Z roztworu U8 przygotować roztwór U4 (przewidywana zawartość: 0,1 μg/ml), U2 (przewidywana zawartość: 0,05 μg/ml) oraz U1 (przewidywana zawartość: 0,025 μg/ml) na drodze kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) za pomocą 50-procentowego metanolu (4.5).

8. PROCEDURA OZNACZANIA

8.1. Posiew czynnika do oznaczania

Należy posiać czynnik do oznaczania (4.2.2) za pomocą zawiesiny bakteryjnej (3.2) w temperaturze około 50 °C. Za pomocą wstępnych prób na płytkach z czynnikiem do oznaczania (4.2.2) ustalić ilość zawiesiny bakteryjnej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących przy różnych stężeniach flawofosfolipolu (około 30 ml/litr).

8.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S8, S4, S2, S1) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U8, U4, U2, U1). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorzec muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. Mając to na uwadze, należy wybrać odpowiednio duże płytki, które zmieszczą przynajmniej osiem otworów o średnicy 10-13 mm i nie mniej niż 30 mm między środkami, które mają być zrobione w podłożu agaru. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm wysokości.

Do płytek należy wlać odpowiednią ilość czynnika (4.2.1), aby uzyskać 1,5-milimetrową warstewkę (45 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Zostawić poziomo do wyrównania powierzchni, a następnie pokryć ilością czynnika (4.2.2) posianego zgodnie z pkt 8.1, aby uzyskać warstwę o grubości 1 mm (30 ml dla płytki o średnicy 200 mm). Ponownie zostawić w pozycji poziomej, nawiercić otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów do oznaczania i wzorcowych (0,10-0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą).

Zastosować każde stężenie przynajmniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.

8.3. Inkubacja

Inkubować płytki 16-18 godzin w temperaturze 28-30 °C.

9. OCENA

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności od średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL), stosując wzór:

(a)

(b)

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH), wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości S1,S2, S4 i S8 wartości U1, U2, U4 i U6.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je, uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej zgodności, dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż o 10 % od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo U1 i S1 lub U8 i S8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie łączące punkty o najlepszej zgodności:

(a') lub lub

(b') lub lub

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie łączące punkty o najlepszej zgodności powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. To, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów, należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) za pomocą jednego z następujących wzorów.

Dla czterech poziomów:

(c)

Dla trzech poziomów:

(d)

lub

(d')

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana × aktywność względna.

W przypadku gdy linie nie są równoległe, należy powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe, należy obliczyć logarytm aktywności względnej (log A) stosując wzór c). Uzyskany wynik musi być jednak wzięty pod uwagę jako wynik przybliżony, co powinno zostać odnotowane w raporcie końcowym.

10. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

0,5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości flawofosfolipolu 1-2 mg/kg;

25 % względem najwyższej wartości dla zawartości większej niż 2 i do 10 mg/kg;

20 % względem najwyższej wartości dla zawartości większej niż 10 i do 25 mg/kg;

5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych dla zawartości większej niż 25 i do 50 mg/kg;

10 % względem najwyższej wartości dla zawartości powyżej 50 mg/kg.

3. OZNACZANIE PIERWIASTKÓW ŚLADOWYCH ŻELAZA, MIEDZI, MANGANU I CYNKU

1. CEL I ZAKRES

Metoda pozwala na oznaczenie pierwiastków śladowych żelaza, miedzi, manganu i cynku w paszach. Najniższymi granicami oznaczeń są:

żelazo (Fe): 20 mg/kg

miedź (Cu): 10 mg/kg

mangan (Mn): 20 mg/kg

cynk (Zn): 20 mg/kg

2. ZASADA

Próbka jest umieszczana w roztworze kwasu solnego po rozłożeniu ewentualnych części organicznych. Oznaczane są takie pierwiastki, jak: żelazo, miedź, mangan i cynk, po odpowiednim rozcieńczeniu, przy użyciu spektrofotometrii absorpcyjnej atomowej.

3. ODCZYNNIKI

Uwagi wstępne

Do przygotowania odczynników i roztworów analitycznych użyć wody, wolnej od kationów pierwiastków, które mają być oznaczane, uzyskanej albo poprzez podwójną destylację wody w szkle borokrzemianowym lub kwarcowym, albo wody uzdatnionej dwukrotnie za pomocą żywicy kationitowej.

Odczynniki muszą być przynajmniej czystości analitycznej (a.p.). Sprawdzenie, czy odczynniki są wolne od pierwiastka, musi być wykonane ślepą próbą. Jeśli konieczne, odczynniki należy dalej oczyszczać.

W miejsce wzorcowych roztworów opisanych poniżej można użyć wzorcowych roztworów dostępnych w handlu, pod warunkiem że mają one gwarancję i zostały sprawdzone przed użyciem.

3.1. Kwas solny czystości analitycznej (gęstość: 1,19).

3.2. Kwas solny czystości analitycznej (6 N).

3.3. Kwas solny czystości analitycznej (0,5 N).

3.4. 38-40-procentowy kwas fluorowodorowy (objętościowo) z zawartością żelaza poniżej 1 mg Fe na litr oraz pozostałość po odparowaniu poniżej 10 mg (w postaci siarczanu) na litr.

3.5. Kwas siarkowy czystości analitycznej (stężenie: 1,84).

3.6. Nadtlenek wodoru czystości analitycznej (około 100 objętości tlenu (30 % wagowo)).

3.7. Wzorcowy roztwór żelaza (1000 μg Fe/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g drutu żelaznego czystości analitycznej w 200 ml 6 N kwasu solnego (3.2), dodać 16 ml nadtlenku wodoru (3.6) oraz uzupełnić do objętości jednego litra wodą. 3.7.1. Wzorcowy roboczy roztwór żelaza (100 μg Fe/ml) przygotowany poprzez rozcieńczenie wzorcowego roztworu (3.7) za pomocą 1 + 9 wody.

3.8. Wzorcowy roztwór miedzi (1000 μg Cu/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g miedzi sproszkowanej czystości analitycznej w 25 ml 6 N kwasu solnego (3.2), dodać 5 ml nadtlenku wodoru (3.6) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą. 3.8.1. Wzorcowy roboczy roztwór miedzi (10 μg Cu/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (3.8) za pomocą 1 + 9 wody i uzyskany roztwór ponownie rozcieńczony za pomocą 1 + 9 wody.

3.9. Wzorcowy roztwór manganu (1000 μg Mn/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g sproszkowanego manganu czystości analitycznej w 25 ml 6 N kwasu solnego (3.2) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą. 3.9.1. Wzorcowy roboczy roztwór manganu (10 μg Mn/ml) przygotowany poprzez rozcieńczenie wzorcowego roztworu (3.9) za pomocą 1 + 9 wody, a otrzymany roztwór ponownie rozcieńczony 1 + 9 wody.

3.10. Wzorcowy roztwór cynku (1000 μg Zn/ml) przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 1 g taśmy lub folii cynkowej czystości analitycznej w 25 ml 6 N kwasu solnego (3.2) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą. 3.10.1. Wzorcowy roboczy roztwór cynku (10 μg Zn/ml) przygotowany poprzez rozcieńczenie wzorcowego roztworu (3.10) za pomocą 1 + 9 wody, a otrzymany roztwór ponownie rozcieńczony 1 + 9 wody.

3.11. Roztwór chlorku lantanowego, przygotowany w następujący sposób: rozpuścić 12 g tlenku lantanu w 150 ml wody, dodać 100 ml 6 N kwasu solnego (3.2) i uzupełnić do objętości jednego litra wodą.

4. APARATURA

4.1. Piec muflowy z regulacją temperatury i rejestratorem.

4.2. Wyroby szklane muszą być wykonane z odpornego borokrzemianowego szkła i zaleca się użyć aparatury, która jest używana wyłącznie do oznaczania pierwiastków śladowych.

4.3. Tygiel platynowy i (opcjonalnie) tygiel kwarcowy.

4.4. Spektrofotometr absorpcyjny atomowy spełniający wymagania metody odnośnie do czułości i dokładności w wymaganym zakresie.

5. PROCEDURA

5.1. Próbki zawierające części organiczne.

5.1.1. Spopielanie i przygotowywanie roztworu do analizy ( 16 )

i) umieścić 5-10-gramową próbkę, zważoną z dokładnością do 0,2 mg, w kwarcowym lub platynowym tyglu (4.3) (patrz uwaga b), wysuszyć w piecu w temperaturze 105 °C i włożyć tygiel do zimnego pieca muflowego (4.1). Zamknąć piec (patrz uwaga c) i stopniowo podwyższać temperaturę do 450-475 °C przez około 90 minut. Osiągniętą temperaturę należy utrzymywać 4-16 godzin (np. przez noc) w celu usunięcia materiałów z zawartością węgla, a następnie otworzyć piec i pozwolić mu wystygnąć (patrz uwaga d). Przemyć tygiel za pomocą około 5 ml kwasu solnego (3.1) i dodawać kwas powoli i ostrożnie do zlewki (może zajść gwałtowna reakcja z powodu powstania CO2). Dodawać kwas solny (3.1) kroplami i mieszać, dopóki roztwór nie przestanie burzyć się. Odparować do sucha, od czasu do czasu mieszając pałeczką szklaną. Następnie dodać 15 ml 6 N kwasu solnego (3.2) do pozostałości, po czym dodać około 120 ml wody. Należy mieszać pałeczką szklaną, która musi pozostać w zlewce, a zlewkę należy przykryć szkiełkiem zegarkowym. Delikatnie doprowadzić do stanu wrzenia i utrzymywać temperaturę wrzenia, dopóki będzie widać, że więcej popiołu nie może się już rozpuścić. Odfiltrować za pomocą sączka bezpopiołowego i zebrać filtrat w 250-mililitrowej kolbie pomiarowej. Umyć zlewkę i filtr za pomocą 5 ml gorącego 6 N kwasu solnego (3.2) i dwukrotnie wrzącą wodą. Kolbę pomiarową należy napełnić aż do kreski wodą (stężenie kwasu solnego około 0,5 N);

ii) jeśli pozostałość na filtrze jest czarna (węgiel), próbkę z powrotem włożyć do pieca i spopielić ponownie w temperaturze 450-475 °C. Proces spopielania wymagający kilku godzin (od trzech do pięciu godzin) jest zakończony, gdy popiół jest biały lub prawie biały. Rozpuścić pozostałość przy użyciu około 2 ml kwasu solnego (3.1), odparować do sucha i dodać 5 ml 6 N kwasu solnego (3.2). Podgrzać, odfiltrować roztwór do kolby pomiarowej i napełnić kolbę aż do kreski wodą (stężenie kwasu solnego około 0,5 N).

Uwagi:

a) Przy oznaczaniu pierwiastków śladowych ważne jest, aby wystrzegać się ryzyka zanieczyszczenia, szczególnie cynkiem, miedzią i żelazem. Z tego powodu sprzęt używany do przygotowania próbek nie może zawierać tych metali. Aby uniknąć ogólnego ryzyka zanieczyszczeń, należy pracować w środowisku bezpyłowym, przy użyciu skrupulatnie wyczyszczonego sprzętu i dokładnie wymytych wyrobów szklanych. Oznaczanie cynku jest procesem szczególnie wrażliwym na wiele rodzajów zanieczyszczeń, np. z wyrobów szklanych, odczynników, pyłu itd.

b) Waga próbki, która ma być spopielona, jest obliczana na podstawie przybliżonej zawartości pierwiastków śladowych w paszy w stosunku do czułości użytego spektrofotometru. Dla pewnych pasz zawierających niewielkie ilości pierwiastków śladowych może zajść konieczność rozpoczęcia oznaczania od próbek 10-20 g i ostateczny roztwór uzupełnić do objętości tylko 100 ml.

c) Proces spopielania musi być przeprowadzony w zamkniętym piecu bez wdmuchiwania powietrza lub tlenu.

d) Temperatura wskazywana na pirometrze nie może przekraczać 475 °C.

5.1.2. Oznaczanie przy użyciu spektrofotometru

5.1.2.1. Przygotowanie roztworów do wzorcowania Dla każdego z pierwiastków, które mają być oznaczane, należy przygotować, przy użyciu standardowych roztworów roboczych opisanych w pkt 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 oraz 3.10.1, zakres roztworów do wzorcowania, przy czym każdy roztwór do wzorcowania posiada stężenie kwasu solnego około 0,5 N i (w przypadku żelaza, manganu i cynku) stężenie chlorku lantanu równoważne 0,1 % La (wagowo). Wybrane stężenia pierwiastków śladowych muszą mieścić się w zakresie czułości użytego spektrofotometru. Poniższe tabele pokazują jako przykład skład typowych zakresów roztworów do wzorcowania; w zależności jednak od rodzaju i czułości użytego spektrofotometru może okazać się konieczny wybór innych stężeń.



Żelazo μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml roboczego roztworu wzorcowego (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) oraz uzupełnić wodą do objętości 100 ml.



Miedź μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 0,1 ml roboczego roztworu wzorcowego (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8 + uzupełnić wodą do objętości 100 ml.



Mangan μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml roboczego roztworu wzorcowego (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) oraz uzupełnić wodą do objętości 100 ml.



Cynk μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml roboczego roztworu wzorcowego (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 + ml 6 N HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) oraz uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

5.1.2.2. Przygotowanie roztworu do analizy W celu oznaczenia miedzi przygotowany roztwór z pkt 5.1.1 używa się zwykle bezpośrednio. Jeśli zachodzi konieczność przybliżenia stężenia do zakresu roztworu do wzorcowania, podwielokrotna porcja może być wlana za pomocą pipetki do 100-mililitrowej kolby miarowej i uzupełniona do kreski 0,5 N kwasem solnym (3.3). W celu oznaczenia żelaza, manganu i cynku odpipetować podwielokrotną porcję roztworu przygotowanego zgodnie z pkt 5.1.1 do 100-mililitrowej kolby miarowej i uzupełnić do kreski 0,5 N kwasem solnym (3.3) (patrz również pkt 8 „Obserwacje”).

5.1.2.3. Ślepa próba Ślepa próba musi zawierać wszystkie zalecane kroki procedury z pominięciem próbki. Nie wolno używać w ślepej próbie roztworu do wzorcowania „0”.

5.1.2.4. Pomiar absorpcji atomowej Zmierzyć absorpcję atomową roztworów wzorcowych oraz roztworu analizowanego przy użyciu utleniającego płomienia acylenowo-powietrznego o następujących długościach fali: 248,3 nm 324,8 nm 279,5 nm 213,8 nm Każdy pomiar przeprowadzić cztery razy.

5.2. Pasze mineralne

Jeśli próbka nie zawiera cząstek organicznych, to wcześniejsze spopielanie nie jest konieczne. Należy postępować zgodnie z pkt 5.1.1 ppkt i), poczynając od akapitu drugiego. Odparowanie z kwasem fluorowodorowym można pominąć.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Przy użyciu krzywej wzorcowania należy obliczyć stężenie pierwiastków śladowych w roztworze do analizy i zapisać wynik w miligramach pierwiastka śladowego na kilogram próbki (ppm).

7. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka nie powinna przekraczać:

— 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości pierwiastka śladowego do 50 mg/kg;

— 10 % wyższej wartości zawartości pierwiastka śladowego w przedziale 50-100 mg/kg;

— 10 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości pierwiastka śladowego 100-200 mg/kg;

— 5 % wyższej wartości zawartości pierwiastka śladowego powyżej 200 mg/kg;

8. OBSERWACJA

Obecność dużych ilości fosforanów przeszkadza w oznaczeniu żelaza, manganu i cynku. Takie zakłócanie wyników oznaczeń musi być skorygowane poprzez dodanie roztworu chlorku lantanu (3.11). Jeśli jednak w próbce stosunek wagowy,

· 2, to dodanie roztworu chlorku lantanu (3.11) do roztworu do analizy i do roztworów wzorcowych można pominąć.