RICHTLIJN 98/64/EG VAN DE COMMISSIE van 3 september 1998 tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van aminozuren, ruwvet en olaquindox in diervoeders en houdende wijziging van Richtlijn 71/393/EEG (Voor de EER relevante tekst)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 70/373/EEG van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (1), laatstelijk gewijzigd bij de Akte van Toetreding van Oostenrijk, Finland en Zweden, en met name op artikel 2,

Overwegende dat in Richtlijn 70/373/EEG is bepaald dat de officiële controle van diervoeders die tot deel heeft na te gaan of aan de op grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake de kwaliteit en de samenstelling van diervoeders gestelde eisen is voldaan, volgens communautaire bemonsterings- en analysemethoden wordt verricht;

Overwegende dat in Richtlijn 79/373/EEG van de Raad van 2 april 1979 betreffende de handel in mengvoeders (2), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 97/47/EG van de Commissie (3), en in Richtlijn 93/74/EEG van de Raad van 13 september 1993 betreffende diervoeders met bijzonder voedingsdoel (4), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 96/25/EG (5), is bepaald dat het gehalte aan aminozuren en aan ruwvet in de etikettering van de voeders moet worden vermeld;

Overwegende voorts dat in Richtlijn 70/524/EEG van de Raad van 23 november 1970 betreffende toevoegingsmiddelen in de diervoeding (6), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 98/19/EG van de Commissie (7), is bepaald dat het gehalte aan olaquindox in de etikettering moet worden aangegeven, wanneer deze stof aan het mengvoeder is toegevoegd;

Overwegende dat in Tweede Richtlijn 71/393/EEG van de Commissie van 18 november 1971 betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders (8), laastelijk gewijzigd bij Richtlijn 84/4/EEG (9), met name analysemethoden zijn vastgesteld voor de bepaling van ruwvet; dat de daarin beschreven methode moet worden gewijzigd;

Overwegende dat voor de controle op deze stoffen communautaire analysemethoden moeten worden vastgesteld;

Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor veevoeder,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:

Artikel 1

De lidstaten schrijven voor dat de analyses in het kader van de officiële controle van diervoeders op het gehalte aan aminozuren, ruwvet en olaquindox volgens de in de bijlage omschreven methoden worden uitgevoerd.

Artikel 2

In de bijlage bij Richtlijn 71/393/EEG wordt punt "4. Bepaling van ruwvet" vervangen door de tekst van deel B van de bijlage bij de onderhavige richtlijn.

Artikel 3

1. De lidstaten doen de nodige wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om uiterlijk op 31 december 1998 aan deze richtlijn te voldoen. Zij stellen de Commissie hiervan onmiddelijk in kennis.

Zij passen deze bepalingen toe vanaf 1 januari 1999.

Wanneer de lidstaten deze bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen naar de onderhavige richtlijn verwezen of wordt hierna verwezen bij de officiële bekendmaking van die bepalingen. De regels voor deze verwijzing worden door de lidstaten vastgesteld.

2. De lidstaten delen de Commissie de tekst van alle belangrijke bepalingen van intern recht mede die zij op het onder deze richtlijn vallende gebied vaststellen.

Artikel 4

Deze richtlijn treedt in werking op de twintigste dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Artikel 5

Deze richtlijn is gericht tot de lidstaten.

Gedaan te Brussel, 3 september 1998.

Voor de Commissie

Franz FISCHLER

Lid van de Commissie

(1) PB L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2.

(2) PB L 86 van 6. 4. 1979, blz. 30.

(3) PB L 211 van 5. 8. 1997, blz. 45.

(4) PB L 237 van 22. 9. 1993, blz. 23.

(5) PB L 125 van 23. 5. 1996, blz. 35.

(6) PB L 270 van 14. 12. 1970, blz. 1.

(7) PB L 96 van 28. 3. 1998, blz. 39.

(8) PB L 279 van 20. 12. 1971, blz. 7.

(9) PB L 15 van 18. 1. 1984, blz. 28.

BIJLAGE

DEEL A

BEPALING VAN AMINOZUREN

1. Doel en toepassingsgebied

Deze methode dient voor de bepaling van de vrije (synthetische en natuurlijke) aminozuren en de totale hoeveelheid (vrije en in peptiden gebonden) aminozuren in diervoeders, waarbij gebruik wordt gemaakt van een aminozuuranalysator. De methode kan worden gebruikt voor bepaling van de volgende aminozuren: cyst(e)ine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, asparaginezuur, glutaminezuur, glycine, histidine, isoleucine, leucine, fenylalanine, proline, serine, tyrosine en valine.

Deze methode maakt geen onderscheid tussen het aminozuur zelf en zijn zouten, en kan niet differentiëren tussen de D- en L-vorm van aminozuren. De methode kan niet worden gebruikt voor de bepaling van tryptofaan of van hydroxyanalogen van aminozuren.

2. Principe

2.1. Vrije aminozuren

De vrije aminozuren worden met verdund zoutzuur geëxtraheerd. Stikstofhoudende macromoleculen die meegaan bij de extractie worden geprecipiteerd met sulfosalicylzuur en verwijderd door filtratie. De pH van de gefiltreerde oplossing wordt op 2,20 gebracht. De aminozuren worden gescheiden door ionenwisselingschromatografie, en na reactie met ninhydrine bepaald door fotometrische detectie bij 570 nm.

2.2. Totaal aminozuurgehalte

De gekozen werkwijze is afhankelijk van de te onderzoeken aminozuren. Cyst(e)ine en methionine moeten vóór hydrolyse tot resp. cysteïnezuur en methioninesulfon worden geoxideerd. Tyrosine moet worden bepaald in hydrolysaten van niet-geoxideerde monsters. Alle andere aminozuren die in punt 1 zijn genoemd kunnen zowel in geoxideerde als in niet-geoxideerde monsters worden bepaald.

De oxidatie wordt uitgevoerd bij 0 °C met een mengsel van permierenzuur en fenol. Overmaat oxidatiemiddel wordt ontleed met natriumbisulfiet. Het geoxideerde of niet-geoxideerde monster wordt gehydrolyseerd met zoutzuur (c = 6 mol/l) gedurende 23 uur. De pH van het hydrolysaat wordt op 2,20 gebracht. De aminozuren worden door ionenwisselingschromatografie van elkaar gescheiden, en worden bepaald door reactie met ninhydrine gevolgd door fotometrische detectie bij 570 nm (440 nm voor proline).

3. Reagentia

Er moet dubbel gedestilleerd water of water van vergelijkbare kwaliteit worden gebruikt (geleidbaarheid NUM>A × E × MW × F

>DEN>B × W × 1 000

= g amionzuur per kg monster

Vermenigvuldig bij gebruik van een interne standaard met:

>NUM>D

>DEN>C

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Cystine en cysteïne worden beide in hydrolysaten van geoxideerde monsters bepaald als cysteïnezuur, maar berekend als cystine (C6H12N2O4S2, MW 240,30) door gebruik te maken van MW 120,15 (= 0,5 × 240,30).

Methionine wordt in hydrolysaten van geoxideerd monster bepaald als methioninesulfon, maar berekend als methionine met behulp van het MW van methionine: 149,21.

Toegevoegd vrij methionine wordt na extractie bepaald als methionine; voor de berekening wordt hetzelfde MW gebruikt.

6.1. Het totale verdunningsvolume van extracten (F) voor de bepaling van vrije aminozuren (5.2) wordt als volgt berekend:

F = 100 ml ×

>NUM>(10 ml + 5ml)

>DEN>10 ml

×

>NUM>Vml

>DEN>10 ml

V = eindvolume van het extract.

7. Evaluatie van de methode

De methode is in 1990 getest in een internationaal ringonderzoek, waarvoor vier soorten voer zijn gebruikt (mengvoer voor varkens, slachtkuikenvoer, eiwitconcentraat, voormengsel). De waarden, na eliminatie van de uitschieters, van gemiddelde en standaardafwijking worden gegeven in onderstaande tabel:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

7.1. Herhaalbaarheid

Herhaalbaarheidswaarden voor de onderzochte aminozuren. De herhaalbaarheid, uitgedrukt als "standaardafwijking binnen het laboratorium" van bovengenoemd ringonderzoek wordt weergegeven in onderstaande tabellen:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

7.2. Reproduceerbaarheid

De waarden van de standaardafwijking tussen laboratoria onderling, verkregen in bovengenoemd ringonderzoek worden weergegeven in onderstaande tabel:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

8. Gebruik van referentiematerialen

Of de methode op de juiste manier is toegepast dient te worden geverifieerd door duplobepaling van gecertificeerde referentiematerialen, voorzover beschikbaar. Aanbevolen wordt de calibratie uit te voeren met gecertificeerde aminozuurijkoplossingen.

9. Opmerkingen

9.1. Op grond van de verschillen tussen aminozuuranalysatoren moeten de eindconcentraties van de ijkoplossingen van standaardaminozuren (3.27.4 en 3.27.5) en van het hydrolysaat (5.3.4) als richtlijn worden beschouwd.

Het lineaire meetbereik van het apparaat moet voor alle aminozuren worden gecontroleerd.

De standaardoplossing wordt verdund met een citraatbuffer om pieken te geven in het midden van het bereik.

9.2. Indien HPLC-apparatuur wordt gebruikt voor de analyse van de hyrolysaten dienen de proefomstandigheden te worden geoptimaliseerd in overeenstemming met de aanbevelingen van de leverancier.

9.3. Bij toepassing van de methode op diervoeders die meer dan 1 % chloride bevatten (krachtvoer, minerale voeders, voedingssupplementen) is het mogelijk dat voor methionine een te lage waarde wordt gemeten en is een speciale behandeling vereist.

DEEL B

BEPALING VAN RUWVET

1. Doel en toepassingsgebied

Methoden voor de bepaling van het gehalte aan ruwvet in diervoeder. De methoden gelden niet voor de analyse van oliehoudende zaden en vruchten, bedoeld in Verordening nr. 136/66/EEG van de Raad van 22 september 1966.

Naar gelang van de aard en samenstelling van het diervoeder en de reden van de analyse moet één van de twee hieronder omschreven methoden worden gevolgd.

1.1. Methode A - rechtstreeks extraheerbaar ruwvet

Deze methode is toepasselijk voor enkelvoudige diervoeders van plantaardige oorsprong, met uitzondering van die waarvoor methode B kan worden toegepast.

1.2. Methode B - totaal ruwvet

Deze methode is toepasselijk voor enkelvoudige diervoeders van dierlijke oorsprong en voor alle mengvoeders. Zij moet worden gebruikt voor alle diervoeder waaruit het ruwvet niet volledig kan worden geëxtraheerd zonder voorafgaande hydrolyse. Dit geldt bijvoorbeeld voor glutenproducten, gist, aardappeleiwitten en producten die behandelingen als extrusie, vervlokking en verhitting ondergaan.

1.3. Interpretatie van de resultaten

In alle gevallen waarin met methode B, als uitkomst, een hoger percentage wordt geconstateerd dan met methode A, wordt de uitkomst van methode B als de juiste waarde beschouwd.

2. Beginsel

2.1. Methode A

Het ruwvet wordt geëxtraheerd met petroleumether. Het oplosmiddel wordt afgedistilleerd en het residu gedroogd en gewogen.

2.2. Methode B

Het monster wordt bij verhoogde temperatuur met zoutzuur behandeld. Het mengsel wordt afgekoeld en gefiltreerd. Het residu wordt gewassen en gedroogd en verder volgens methode A geanalyseerd.

3. Reagentia

3.1. Petroleumether, kooktraject: 40-60 °C. De broomwaarde moet minder dan 1 zijn en het verdampingsresidu minder dan 2 mg/100 ml.

3.2. Natriumsulfaat, watervrij.

3.3. Zoutzuur 3M.

3.4. Filtermateriaal, bijvoorbeeld kiezelgoer, Hyflo-supercel.

4. Apparatuur

4.1. Extractieapparaat. Indien het apparaat werkt met een hevel (Soxhlet) moet de refluxsnelheid zodanig zijn dat ongeveer tien cyclussen per uur worden doorlopen; bij apparaten zonder hevel moet de refluxsnelheid ongeveer 10 ml per minuut zijn.

4.2. Extractiehulzen die geen in petroleumether oplosbaar materiaal bevatten en een aan de eisen van 4.1 aangepaste porositeit hebben.

4.3. Droogstof, hetzij een vacuümstoof ingesteld op 75 °C ± 3 °C of een oven met luchtcirculatie ingesteld op 100 °C ± 3 °C.

5. Uitvoering

5.1. Methode A (zie punt 8.1)

Weeg 5 g van het monster tot op 1 mg nauwkeurig af, breng dit in een extractiehuls (4.2) en dek het af met ontvette watten.

Breng de huls in een extractieapparaat (4.1) en extraheer gedurende zes uur met petroleumether (3.1). Vang het extract op in een van enkele stukjes puimsteen (1) voorzien, gedroogd en getarreerd kolfje.

Destilleer het oplosmiddel af en droog het residu vervolgens gedurende anderhalf uur in de droogstof (4.3). Laat afkoelen in een exsiccator en weeg. Droog nogmaals gedurende 30 minuten om zeker te zijn dat het gewicht van het vet constant is (het gewichtsverlies tussen de twee wegingen moet minder bedragen dan 1 mg).

5.2. Methode B

Weeg 2,5 g van het monster tot op 1 mg nauwkeurig af (8.2), breng het in een bekerglas van 400 ml of een erlenmeyerkolf van 300 ml en voeg 100 ml zoutzuur 3M (3.3) en enkele stukjes puimsteen toe. Bedek het bekerglas met een horlogeglas of sluit de erlenmeyerkolf aan op een terugvloeikoeler. Breng het mengsel op een kleine vlam of op een kookplaat net aan de kook en laat het gedurende een uur zachtjes koken. Zorg ervoor dat zich geen materiaal aan de wand vastzet.

Koel het mengsel af en voeg zoveel filtermateriaal (3.4) toe, dat bij het filtreren geen vetverlies optreedt. Filtreer door nat, vetvrij dubbel filtreerpapier. Was het residu met koud water totdat het waswater neutraal is. Controleer of het filtraat vet bevat. Indien in het filtraat vet aanwezig is, moet het monster vóór de hydrolyse geëxtraheerd worden met petroleumether, volgens methode A.

Breng het dubbelfilter met residu op een horlogeglas en droog het gedurende anderhalf uur in een droogstoof op 100 °C ± 3 °C.

Breng het dubbele filter met gedroogd residu in een extractiehuls (4.2) en dek het af met ontvette watten. Breng de huls in een extractieapparaat (4.1) en handel verder als beschreven onder punt 5.1, tweede en derde alinea.

6. Weergave van de resultaten

Druk het gewicht van het residu uit in percenten van het monster.

7. Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud op hetzelfde monster, door dezelfde analyst, mag de volgende waarden niet overschrijden:

- 0,2 % in absolute waarde, voor gehalten aan ruwvet lager dan 5 %,

- 4,0 % van het hoogste resultaat voor gehalten tussen 5 en 10 %,

- 0,4 % in absolute waarde, voor gehalten boven 10 %.

8. Opmerkingen

8.1. Producten met een hoog vetgehalte, die moeilijk fijn te maken zijn, of waarvan moeilijk een homogeen analysemonster kan worden getrokken, worden als volgt behandeld:

Weeg 20 g van het monster op 1 mg nauwkeurig af en meng dit met 10 g of meer watervrij natriumsulfaat (3.2). Extraheer het mengsel met petroleumether (3.1) zoals beschreven onder punt 5.1. Breng het volume van het extract met petroleumether (3.1) op 500 ml en meng. Breng 50 ml van deze oplossing in een van enkele stukjes puimsteen (2) voorziene, gedroogde en getarreerde kolf. Destilleer het oplosmiddel af, droog het residu en handel verder als beschreven onder punt 5.1, laatste alinea.

Verwijder het oplosmiddel uit het extractieresidu in de huls en maak het residu dan fijn tot een deeltjesgrootte van 1 mm. Breng het residu weer in de huls (geen natriumsulfaat toevoegen) en handel verder als beschreven onder punt 5.1, tweede en derde alinea.

Bereken het vetgehalte in percenten van het monster met de volgende formule:

(10 a + b) × 5

waarin:

a = massa in g van het residu na de eerste extractie (aliquoot deel van het extract)

b = massa in g van het residu na de tweede extractie.

8.2. Bij vetarme waren kan van 5 g analysemateriaal worden uitgegaan.

8.3. Het kan nodig zijn om, vóór hydrolyse en extractie via methode B, aan voer voor gezelschapsdieren dat een hoog vochtgehalte heeft, watervrij natriumsulfaat toe te voegen.

8.4. Ten aanzien van het bepaalde in punt 5.2. kan het doeltreffender zijn om warm in plaats van koud water te gebruiken om het residu, na filtrering, te wassen.

8.5. Het kan nodig zijn sommige voeders langer dan anderhalf uur te drogen. Te veel drogen moet evenwel worden voorkomen aangezien dit tot lage resultaten kan leiden. Er mag gebruik worden gemaakt van een microgolfoven.

8.6. Als het ruwvetgehalte hoger is dan 15 % verdient het aanbeveling om het monster vóór hydrolyse via methode A en vervolgens nogmaals via methode B te extraheren. Dit hangt tot op zekere hoogte af van de aard van het diervoeder en de aard van het ruwvet in het voeder.

DEEL C

BEPALING VAN OLAQUINDOX (2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxyde)

1. Doel en toepassingsgebied

Deze methode dient voor de bepaling van olaquindox in diervoeders. De onderste bepalingsgrens is 5 mg/kg.

2. Principe

Het monster wordt geëxtraheerd met een mengsel van methanol en water. Het gehalte aan olaquindox wordt bepaald met reversed phase hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met UV-detectie.

3. Reagentia

3.1. Methanol.

3.2. Methanol, HPLC-kwaliteit.

3.3. Water, HPLC-kwaliteit.

3.4. Mobiele fase HPLC

Een mengsel van water (3.3) en methanol (3.2), 900 + 100 (V + V).

3.5. Standaardstof: zuiver olaquindox 2-[N-2'-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxaline-N1,N4-dioxyde, E 851.

3.5.1. Standaardvoorraadoplossing olaquindox, 250 ìg/ml

Weeg 50 mg olaquindox (3.5) op 0,1 mg nauwkeurig af, los dit op in een maatkolf van 200 ml in ca. 190 ml water. Plaats de kolf gedurende 20 minuten in een ultrasoonbad (4.1). Na de ultrasoonbehandeling moet de oplossing op kamertemperatuur worden gebracht, tot aan de merkstreep worden aangevuld met water en worden gemengd. Wikkel de kolf in aluminiumfolie en bewaar de kolf in een koelkast. De oplossing is zo één maand houdbaar.

3.5.2. Standaardtussenoplossing olaquindox, 25 ìg/ml

Breng 10,0 ml van de standaardoplossing (3.5.1) over in een maatkolf van 100 ml, vul aan tot de merkstreep met mobiele fase (3.4) en meng. Wikkel de kolf in aluminiumfolie en bewaar de kolf in een koelkast. Deze oplossing moet dagelijks vers worden bereid.

3.5.3. IJkoplossingen

Breng in een reeks maatkolven van 50 ml respectievelijk 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 en 20,0 ml standaardtussenoplossing (3.5.2). Vul aan tot de merkstreep met mobiele fase (3.4) en meng. Wikkel de kolven in aluminiumfolie. Deze oplossingen komen overeen met respectievelijk 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 en 10,0 ìg olaquindox per ml. Deze oplossingen moeten iedere dag vers worden bereid.

4. Apparatuur

4.1. Ultrasoonbad.

4.2. Mechanisch schudapparaat.

4.3. HPLC-apparatuur met UV-detector met variabele golflengte of diode array detector.

4.3.1. Vloeistofchromatografiekolom, 250 mm × 4 mm, C18, vulling van 10 ìm of een soortgelijke kolom.

4.4. Membraanfilters, 0,45 ìm.

5. Werkwijze

NB: Olaquindox is lichtgevoelig. Alle bewerkingen moeten bij gedempt licht of in bruin glaswerk plaatsvinden.

5.1. Algemeen

5.1.1. Een blanco diervoeder dient te worden geanalyseerd om te controleren dat noch olaquindox noch storende stoffen aanwezig zijn.

5.1.2. De recovery dient te worden bepaald door analyse van het blanco diervoeder waaraan een vergelijkbare hoeveelheid olaquindox is toegevoegd als aanwezig in het monster. Voor een gehalte van 50 mg/kg wordt 10,0 ml standaardvoorraadoplossing (3.5.1) in een erlenmeyer van 250 ml gedaan en ingedampt tot een volume van 0,5 ml. Voeg 50 g blanco diervoeder toe, meng zorgvuldig, laat gedurende tien minuten staan en meng vervolgens nog enige malen, alvorens de extractiestap (5.2) uit te voeren.

NB: Voor het doel van deze methode dient het blanco diervoeder van vergelijkbare soort te zijn als het monster en dient hierin geen olaquindox detecteerbaar te zijn.

5.2. Extractie

Weeg ongeveer 50 g monster op 0,01 g nauwkeurig af. Breng het over in een erlenmeyer van 1 000 ml, voeg 100 ml methanol (3.1) toe en plaats de erlenmeyer vijf minuten in een ultrasoonbad (4.1). Voeg 410 ml water toe en laat nog 15 minuten in het ultrasoonbad staan. Haal de erlenmeyer uit het ultrasoonbad, plaats hem 30 minuten op het schudapparaat (4.2) en filtreer door een gevouwen filtreerpapiertje. Breng 10,0 ml filtraat in een maatkolf van 20 ml, vul die aan tot de merkstreep met water en meng. Een fractie wordt door een membraanfilter (4.4) gefiltreerd (zie punt 9. Opmerking). Vervolg met de HPLC-bepaling (5.3).

5.3. HPLC-bepaling

5.3.1. Parameters

De volgende condities worden als leidraad aangegeven. Andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Controleer de stabiliteit van het chromatografische systeem door enige malen de ijkoplossing (3.5.3) van 2,5 ìg/ml te injecteren totdat constante piekhoogten en retentietijden worden verkregen.

5.3.2. IJklijn

Injecteer elke ijkoplossing (3.5.3) enkele malen en meet voor elke concentratie de piekhoogte (-oppervlakte). Maak een ijklijn met de gemiddelde piekhoogten of -oppervlakten als ordinaat en de bijbehorende concentraties als abscis.

5.3.3. Monsteroplossing

Injecteer het monsterextract (5.2) enige malen waarbij hetzelfde volume als voor de ijkoplossingen wordt gebruikt en bepaal de gemiddelde piekhoogte (-oppervlakte) van de olaquindoxpieken.

6. Berekening van de resultaten

Bepaal uit de gemiddelde hoogte (oppervlakte) van de olaquindoxpieken van de monsteroplossing op basis van de ijklijn (5.3.2) de concentratie van de monsteroplossing in ìg/ml.

Het gehalte aan olaquindox w in mg/kg in het monster wordt verkregen met behulp van onderstaande formule:

w = >NUM>c × 1 000

>DEN>m

waarin:c = concentratie olaquindox van de monsteroplossing (5.2) in ìg/ml

m = massa van de analyseportie in g.

7. Validatie van de resultaten

7.1. Identiteit

De identiteit van de geanalyseerde stof kan worden bevestigd door cochromatografie of met een diode array detector, waarbij de spectra van het monsterextract (5.2) en de ijkoplossing met 5,0 ìg/ml (3.5.3) worden vergeleken.

7.1.1. Cochromatografie

Voeg aan een deel van het monsterextract (5.2) een geschikte hoeveelheid van een ijkoplossing (3.5.3) toe. De toegevoegde hoeveelheid olaquindox moet ongeveer gelijk zijn aan de geschatte hoeveelheid olaquindox in het monsterextract.

Alleen de hoogte van de olaquindoxpiek mag naar verhouding toenemen, waarbij rekening wordt gehouden met zowel de toegevoegde hoeveelheid als met de verdunning van het extract. De piekbreedte op de helft van de maximale piekhoogte moet binnen ± 10 % van de oorspronkelijke breedte liggen.

7.1.2. Diode array detectie

De resultaten worden op grond van de volgende criteria beoordeeld:

a) De golflengten van de absorbtiemaxima van de spectra van het monster en de standaard, opgenomen op de top van de chromatografische piek, moeten overeenkomen binnen een marge die wordt bepaald door het oplossend vermogen van het detectiesysteem. Voor diode array detectie is deze marge meestal ± 2 nm.

b) Tussen 220 en 400 nm mogen de spectra van het monster en de standaard, opgenomen op de top van de chromatografische piek voor het gedeelte van de spectra met een relatieve absorptie van 10-100 % niet van elkaar verschillen. Aan dit criterium is voldaan wanneer dezelfde maxima aanwezig zijn en de afwijking tussen de spectra op geen enkel punt meer dan 15 % van de absorptie van de standaard bedraagt.

c) Tussen 220 en 400 nm mogen de spectra in de buigpunten en op de top van de chromatografische piek van het monsterextract voor het gedeelte van de spectra met een relatieve absorptie van 10-100 % niet van elkaar verschillen. Aan dit criterium is voldaan wanneer dezelfde maxima aanwezig zijn en de afwijking tussen de spectra op geen enkel punt meer dan 15 % van de absorptie van het spectrum van de top bedraagt.

Indien aan een van deze criteria niet is voldaan, is de aanwezigheid van de te analyseren stof niet bevestigd.

7.2. Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van twee parallelle, op hetzelfde monster verrichte bepalingen mag bij olaquindoxgehalten tussen 10 en 200 mg/kg niet meer dan 15 % van het hoogste resultaat bedragen.

7.3. Recovery

Voor het blancomonster met toevoeging dient het terugvindingspercentage ten minste 90 % te bedragen.

8. Resultaten van een ringonderzoek

Binnen de Europese Unie is een ringonderzoek georganiseerd waarbij vier monsters biggenvoer, waaronder één blanco, door 13 laboratoria zijn onderzocht. De resultaten worden hieronder vermeld:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

9. Opmerking

Hoewel de methode niet is gevalideerd voor diervoeders met meer dan 100 mg/kg olaquindox, zouden bevredigende resultaten bereikt kunnen worden door minder af te wegen en/of het extract (5.2) te verdunnen om een concentratie binnen het bereik van de ijklijn (5.3.2) te krijgen.

(1) Neem, indien het vet later kwalitatief moet worden onderzocht, glasparels in plaats van de stukjes puimsteen.