VERORDENING (EG) Nr. 1081/96 VAN DE COMMISSIE van 14 juni 1996 tot vaststelling van een referentiemethode voor de opsporing van koemelk en koemelkcaseïnaat in kaas van schape-, geite- of buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk en tot intrekking van Verordening (EEG) nr. 690/92

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EEG) nr. 804/68 van de Raad van 27 juni 1968 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelprodukten (1), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 2931/95 van de Commissie (2), en met name op artikel 9, lid 3, artikel 16, leden 1 en 4, en artikel 17, lid 14,

Overwegende dat op grond van Verordening (EEG) nr. 508/71 van de Raad van 8 maart 1971 houdende vaststelling van de algemene regels voor de toekenning van steun voor de particuliere opslag van bewaarkaas (3) steun kan worden verleend voor de particuliere opslag van uit schapemelk vervaardigde kaas; dat op grond van artikel 17 van Verordening (EEG) nr. 804/68 een speciale restitutie voor diezelfde produkten kan worden vastgesteld; dat wordt verwacht dat uit bepaalde derde landen in het kader van preferentiële regelingen kaas van schape-, geite- of buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk in de Gemeenschap zullen worden ingevoerd;

Overwegende dat, gezien bovengenoemde bepalingen betreffende kaas van schape-, geite- of buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk, via adequate controles moet worden geverifieerd of in de betrokken produkten geen koemelk is verwerkt; dat een gemeenschappelijke referentiemethode voor de opsporing van koemelk dient te worden vastgesteld, maar dat dit onverlet laat dat routinemethoden mogen worden gebruikt, mits die aan bepaalde criteria beantwoorden;

Overwegende dat een referentiemethode die geldt voor kaas van schape-, geite- of buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk in de plaats komt van de referentiemethode die is beschreven in Verordening (EEG) nr. 690/92 van de Commissie (4) en die derhalve kan worden ingetrokken;

Overwegende dat de in deze verordening vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Comité van beheer voor melk en zuivelprodukten,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De in de bijlage opgenomen referentiemethode voor analyse wordt toegepast om te waarborgen dat kaas die uitsluitend uit schape-, geite- of buffelmelk of uit een mengsel van schape-, geite- en buffelmelk mag zijn vervaardigd, geen koemelkcaseïne bevat.

Koemelkcaseïne wordt geacht aanwezig te zijn, als het schijnbare gehalte aan koemelkcaseïne in het geanalyseerde monster gelijk is aan of hoger is dan het betrokken gehalte van het in de bijlage beschreven referentiemonster, dat 1 % koemelk bevat.

Artikel 2

Voor de opsporing van koemelkcaseïne in de in artikel 1 bedoelde kaassoorten mogen routinemethoden worden gebruikt op de volgende voorwaarden:

- met de methode moet een gehalte van 0,5 % of lager opgespoord kunnen worden,

- de methode mag geen vals positieve resultaten geven; als dit niet uitgesloten is, dient ieder monster dat een positieve uitslag geeft met gebruikmaking van de referentiemethode te worden geanalyseerd,

- koemelkcaseïne moet ook na lange rijpingsperiodes, zoals die onder gebruikelijke handelsomstandigheden voorkomen, met de vereiste gevoeligheid kunnen worden opgespoord. Als voor een bepaalde in artikel 1 bedoelde kaassoort niet aan deze eis kan worden voldaan, moet deze kaas worden geanalyseerd met gebruikmaking van de referentiemethode.

Artikel 3

Verordening (EEG) nr. 690/92 wordt ingetrokken. Verwijzingen naar Verordening (EEG) nr. 690/92 gelden als verwijzingen naar deze verordening.

Artikel 4

Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Zij is van toepassing met ingang van 1 oktober 1996.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.

Gedaan te Brussel, 14 juni 1996.

Voor de Commissie

Franz FISCHLER

Lid van de Commissie

(1) PB nr. L 148 van 28. 6. 1968, blz. 13.

(2) PB nr. L 307 van 20. 12. 1995, blz. 10.

(3) PB nr. L 58 van 11. 3. 1971, blz. 1.

(4) PB nr. L 74 van 20. 3. 1992, blz. 23.

BIJLAGE

REFERENTIEMETHODE VOOR DE OPSPORING VAN KOEMELK EN KOEMELKCASEÏNAAT IN KAAS VAN SCHAPE-, GEITE- OF BUFFELMELK OF VAN MENGSELS VAN SCHAPE-, GEITE- EN BUFFELMELK

1. Doel

Detectie van koemelk en koemelkcaseïnaat in kaas van schape-, geite- of buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk door middel van iso-elektrische focussering van ã-caseïnen na plasminolyse.

2. Toepassingsgebied

De methode is bruikbaar voor een gevoelige specifieke detectie van niet-warmtebehandelde en warmtebehandelde koemelk, alsmede van koemelkcaseïnaat in verse en gerijpte kaas die is gemaakt van schape-, geite- of buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk. Zij is niet geschikt voor de opsporing van melk- en kaasvervalsing door gebruik van warmtebehandelde concentraten van eiwit uit wei van runderen.

3. Principe van de methode

3.1. Isoleren van caseïnen uit kaas en uit de standaarden.

3.2. De geïsoleerde caseïnen worden opgelost en geïncubeerd met plasmine (EC.3.4.21.7).

3.3. De met plasmine behandelde caseïnen worden iso-elektrisch gefocusseerd in aanwezigheid van ureum en de eiwitten worden gekleurd.

3.4. De gekleurde patronen van ã3-caseïne en ã2-caseïne (aanwijzing voor koemelk) worden beoordeeld door vergelijken van het met het monster verkregen patroon met het patroon dat in dezelfde gel van de standaarden met 0 % en 1 % koemelk is verkregen.

4. Reagentia

Tenzij anders aangegeven, worden chemicaliën van analysekwaliteit gebruikt. Water is tweemaal gedestilleerd of van gelijkwaardige zuiverheid.

Opmerking: De onderstaande bijzonderheden zijn van toepassing op in eigen laboratorium vervaardigde ureum bevattende polyacrylamide-gels van 265 × 125 × 0,25 mm. Bij gebruik van gels van een ander type of met andere afmetingen worden de scheidingsomstandigheden zo nodig aangepast.

Iso-elektrische focussering

4.1. Reagentia voor de bereiding van de ureum bevattende polyacrylamide-gels.

4.1.1. Voorraad-geloplossing

Los op in water:

4,85 g acrylamide

0,15 g N, N'-methyleen-bis-acrylamide (BIS)

48,05 g ureum

15,00 g glycerol (87 % m/m),

en vul aan tot 100 ml. Bewaar de oplossing in een bruine glazen fles in de koelkast.

Opmerking: In plaats van de genoemde afgewogen hoeveelheden van de neurotoxische acrylamiden kan een in de handel verkrijgbare gerede oplossing van acrylamide/BIS worden gebruikt. Indien een dergelijke oplossing 30 % m/v acrylamide en 0,8 % m/v BIS bevat, wordt een volume van 16,2 ml gebruikt in plaats van de aangegeven gewichten. De houdbaarheid van de voorraadoplossing is maximaal tien dagen; indien de geleidbaarheid meer dan 5 ìS bedraagt wordt gedeïoniseerd door 30 minuten roeren met 2 g Amberlite MB-3, gevolgd door filtreren door een 0,45 ìm membraan.

4.1.2. Geloplossing

Een geloplossing wordt bereid door mengen van chemicaliën en amfolyten met de voorraad-geloplossing (zie 4.1.1).

9,0 ml voorraadoplossing

24 mg ß-alanine

500 ìl amfolyt pH 3,5-9,5 (1)

250 ìl amfolyt pH 5-7 (2)

250 ìl amfolyt pH 6-8 (3).

De geloplossing wordt gemengd en 2 tot 3 minuten in een ultrasoonbad of onder verminderde druk ontgast.

Opmerking: De geloplossing wordt vlak voor het gieten van de gel (zie 6.2) bereid.

4.1.3. Katalysatoroplossingen

4.1.3.1. N, N, N', N'-tetramethyl-ethyleendiamine (TEMED)

4.1.3.2. 40 % m/v ammoniumpersulfaat (PER): 800 mg PER wordt opgelost in 2 ml water.

Opmerking: Er wordt altijd een vers bereide PER-oplossing gebruikt.

4.2. Contactvloeistof

Petroleum of vloeibare paraffine

4.3. Anodeoplossing

5,77 g fosforzuur (85 % m/m) wordt met water tot 100 ml aangevuld.

4.4. Kathodeoplossing

2,00 g natriumhydroxide wordt in water opgelost en tot 100 ml met water verdund.

Monstervoorbereiding

4.5. Reagentia voor eiwitisolatie

4.5.1. Verdund azijnzuur (25,0 ml ijsazijn verdund met water tot 100 ml).

4.5.2. Dichloormethaan

4.5.3. Aceton

4.6. Eiwitoplossende buffer

5,75 g glycerol (87 % m/m)

24,03 g ureum

250 mg dithiotreïtol

worden in gedestilleerd water opgelost en tot 50 ml aangevuld.

Opmerking: Wordt in de koelkast bewaard; houdbaarheid één week.

4.7. Reagentia voor plasminesplitsing van caseïnen

4.7.1. Ammoniumcarbonaatbuffer

Een 0,2 mol/l oplossing van ammoniumwaterstofcarbonaat (1,58 g/100 ml water) bevattende 0,05 mol/l ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 1,46 g/100 ml), wordt tot pH 8 getitreerd met een 0,2 mol/l oplossing van ammoniumcarbonaat (1,92 g/100 ml water) bevattende 0,05 mol/l EDTA.

4.7.2. Runderplasmine (EC. 3.4.21.7), activiteit ten minste 5 U/ml

4.7.3. å-aminocapronzuur voor enzymremming

2,624 g å-aminocapronzuur (6-amino-n-hexaanzuur) wordt opgelost in 100 ml 40 % (v/v) ethanol.

4.8. Standaarden

4.8.1. Gecertificeerde standaarden van een mengsel van gestremde magere geitemelk met 0 % en 1 % koemelk zijn verkrijgbaar bij het Instituut voor referentiematerialen en -metingen van de Commissie, B-2440 Geel, België.

4.8.2. Bereiding van voorlopige laboratoriumstandaarden van gestremde buffelmelk met 0 % en 1 % koemelk.

Magere melk wordt bereid door 20 minuten losse rauwe buffelmelk, of koemelk bij 37 °C bij 2 500 g te centrifugeren. Nadat de buis met inhoud snel tot 6-8 °C is afgekoeld, wordt de bovendrijvende vetlaag volledig verwijderd. Voor de bereiding van de standaard van 1 % wordt in een bekerglas van 1 liter 5,00 ml magere koemelk aan 495 ml magere buffelmelk toegevoegd, waarna de pH door toevoeging van verdund melkzuur (10 % m/v) op 6,4 wordt gebracht. De temperatuur wordt op 35 °C ingesteld, waarna 100 ìl kalfsstremsel (1:10 000, circa 3 000 U/ml) wordt toegevoegd, één minuut wordt geroerd en de beker één uur afgedekt met aluminiumfolie op 35 °C wordt gehouden zodat de wrongel zich kan vormen. Nadat de wrongel is gevormd, wordt de gestremde melk in zijn geheel gevriesdroogd, zonder voorafgaand homogeniseren of aftappen van de wei. Na het vriesdrogen wordt het produkt fijngemalen tot een homogeen poeder. Voor de bereiding van de 0 % standaard wordt dezelfde werkwijze gevolgd, met gebruikmaking van zuivere magere buffelmelk. De standaarden moeten bij -20 °C worden opgeslagen.

Opmerking: Het verdient aanbeveling de zuiverheid van de buffelmelk voor de bereiding van de standaarden te controleren door middel van iso-elektrische focussering van de met plasmine behandelde caseïnen.

Reagentia voor eiwitkleuring

4.9. Fixeeroplossing

150 ml trichloorazijnzuur wordt opgelost in water en tot 1 000 ml aangevuld.

4.10. Ontkleuroplossing

500 ml methanol en 200 ml ijsazijn worden met gedestilleerd water tot 2 000 ml aangevuld.

Opmerking: De ontkleuroplossing wordt dagelijks vers bereid; dit kan gebeuren door gelijke volumes van de voorraadoplossing van 50 % (v/v) methanol en 20 % (v/v) ijsazijn met elkaar te mengen.

4.11. Kleuroplossingen

4.11.1. Kleuroplossing (voorraadoplossing 1)

3,0 g Coomassie briljantblauw G 250 (Color Index 42655) wordt met behulp van een magneetroerder in ongeveer 45 minuten opgelost in 1 000 ml 90 % (v/v) methanol, waarna wordt afgefiltreerd door twee middelsnelle vouwfilters.

4.11.2. Kleuroplossing (voorraadoplossing 2)

5,0 g kopersulfaat-pentahydraat wordt opgelost in 1 000 ml 20 % (v/v) azijnzuur.

4.11.3. Kleuroplossing (werkoplossing)

125 ml van elk van de voorraadoplossingen (4.11.1, 4.11.2) wordt vlak voor de kleurreactie gemengd.

Opmerking: De kleuroplossing dient te worden bereid op de dag van gebruik.

5. Apparatuur

5.1. Glasplaten (265 × 125 × 4 mm); rubberen rol (breedts 15 cm); vlakke tafel

5.2. Gel-dragerfolie (265 × 125 mm)

5.3. Afdekfolie (280 × 125 mm). Langs beide zijden wordt een strook plakband (280 × 6 × 0,25 mm) gehecht (zie figuur 1).

5.4. Elektrofocusseringskamer met koelplaat (b.v. 265 × 125 mm) met geschikte spanningsbron (≥ 2,5 kV) of automatische elektroforese-inrichting.

5.5. Rondpompcryostaat, gethermostatifeerd op 12 ± 0,5 °C

5.6. Centrifuge, instelbaar op 3 000 g

5.7. Elektrodestroken (≥ 265 mm lang)

5.8. Plastic druppelflessen voor anodeoplossing en kathodeoplossing

5.9. Monsterdragers (10 × 5 mm viscose of weinig eiwitabsorberend filtreerpapier)

5.10. Roestvast stalen schaar, mes en pincet

5.11. Roestvast stalen of glazen kleurings- en ontkleuringsschalen (b.v. instrumentbakjes van 280 × 150 mm)

5.12. Instelbare staafhomogenisator (schachtdiameter 10 mm), snelheidsregeling tussen 8 000 en 20 000 tpm

5.13. Magneetroerder

5.14. Ultrasoonbad

5.15. Filmlasapparaat

5.16. Micropipetten van 5-25 ìl

5.17. Vacuümverdamper of vriesdroger

5.18. Thermostatisch geregeld waterbad, instelbaar op 35 en 40 ± 1 °C, met schudinrichting

5.19. Densitometer met aflezing bij ë = 634 nm

6. Werkwijze

6.1. Monstervoorbereiding

6.1.1. Isoleren van caseïnen

Een met 5 g droge massa overeenkomende hoeveelheid kaas of standaard wordt afgewogen in een centrifugebuis van 100 ml, er wordt 60 ml gedestilleerd water toegevoegd en gehomogeniseerd met een staafhomogenisator (8 000-10 000 tpm). De pH wordt met verdund azijnzuur (4.5.1) op 4,6 gebracht en het geheel wordt gecentrifugeerd (5 minuten, 3 000 g). Het vet en de wei worden gedecanteerd, het residu wordt in 40 ml gedestilleerd water (met verdund azijnzuur (4.5.1) op pH 4,5 gebracht) gehomogeniseerd (20 000 tpm), er wordt 20 ml dichloormethaan (4.5.2) toegevoegd, waarna opnieuw wordt gehomogeniseerd en wordt gecentrifugeerd (5 minuten, 3 000 g). De caseïnelaag, die tussen de waterfase en de organische fase drijft (zie figuur 2), wordt met een spatel opgetrokken en beide fasen worden afgeschonken. De caseïne wordt opnieuw gehomogeniseerd in 40 ml gedestilleerd water (zie boven) en 20 ml dichloormethaan (4.5.2) en gecentrifugeerd. Deze bewerkingen worden herhaald totdat de beide extractiefasen kleurloos zijn (2 tot 3 maal). Het eiwitresidu wordt gehomogeniseerd met 50 ml droge aceton (4.5.3) en door een middelsnel vouwfilterpapier gefiltreerd. Het residu op het filter wordt tweemaal met telkens 25 ml aceton gewassen, aan de lucht of onder een stikstofstroom gedroogd en in een mortier verpoederd.

Opmerking: Droge geïsoleerde caseïnen moeten bij -20 °C worden bewaard.

6.1.2. Plasminesplitsing van ß-caseïnen ter versterking van ã-caseïnen

25 mg geïsoleerde caseïne (6.1.1) wordt gesuspendeerd in 0,5 ml ammoniumcarbonaat-buffer (4.7.1) en 20 minuten gehomogeniseerd, in een ultrasone behandeling. Na verwarming tot 40 °C wordt 10 ìl plasmine (4.7.2) toegevoegd, gemengd en één uur bij 40 °C onder voortdurend schudden geïncubeerd. Hierna wordt ter remming van het enzym 20ìl å-aminocapronzuuroplossing (4.7.3) toegevoegd, waarna 200 mg vast ureum en 2 mg dithiotreïtol worden toegevoegd.

Opmerking: Teneinde meer symmetrie in de gefocusseerde caseïnebanden te verkrijgen verdient het aanbeveling de oplossing na de toevoeging van het å-aminocapronzuur te vriesdrogen en de residuen vervolgens in 0,5 ml ureumbuffer (4.6) op te lossen.

6.2. Bereiding van de ureumhoudende acrylamidegels

Het gel-dragerfolie (5.2) wordt met behulp van enkele druppels water op een glasplaat (5.1) gerold, waarna eventueel overtollig water met een papieren handdoek of een tissue wordt verwijderd. Het afdekfolie (5.3) wordt op dezelfde wijze met afstandhouders (0,25 mm) op een tweede glasplaat gerold. De plaat wordt horizontaal op een vlakke tafel gelegd. Aan de bereide en ontluchte geloplossing (4.1.2) wordt van elk van de katalysatoroplossingen van TEMED en PER (4.1.3.2) 10 ìl toegevoegd, waarna het geheel kort wordt gemengd en gelijkmatig over het midden van het dekblad uitgegoten. Plaats de plaat met het gel-dragerfolie op een smalle kant en met de bladkant naar beneden op het afdekfolie en laat de plaat met het gel-dragerfolie langzaam zakken, zodat zich tussen de bladen een gelfilm vormt die zich gelijkmatig en zonder bellen verspreidt (zie figuur 3). De plaat met het gel-dragerfolie wordt helemaal naar beneden gelaten, waarbij een dunne spatel wordt gebruikt, en bij wijze van gewicht worden nog drie glasplaten op de plaat gelegd. Wanneer de polymerisatie is voltooid (ongeveer 60 minuten), wordt de op de plaat met het gel-dragerfolie gepolymeriseerde gel samen met het afdekfolie door tikken op de glasplaten verwijderd. De achterkant van de plaat met het gel-dragerfolie wordt zorgvuldig van gelresten en ureum ontdaan. De "gel-sandwich" wordt in plasticfolie gelast en bewaard in de koelkast (maximaal zes weken).

Opmerking: De afdekfolie met afstandhouders kan opnieuw worden gebruikt. De polyacrylamidegel kan in kleinere stukken worden gesneden, hetgeen aanbeveling verdient wanneer er weinig monsters zijn of wanneer een automatische elektroforese-inrichting wordt gebruikt (twee gels, afmetingen 4,5 × 5 cm).

6.3. Iso-elektrische focussering

De koelthermostaat wordt op 12 °C ingesteld. De achterkant van het geldragerfolie wordt met petroleum afgeveegd, waarna midden op het koelblok enkele druppels petroleum (4.2) worden aangebracht. De gel-sandwich wordt met de dragerzijde naar beneden op het koelblok gelegd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen bellen ontstaan. Eventuele overtollige petroleum wordt weggeveegd en het afdekfolie wordt verwijderd. De elektrodestroken worden in de elektrodeoplossingen (4.3, 4.4) nat gemaakt, op de lengte van de gel afgekipt en op de in aanmerking komende posities aangebracht (afstand tussen de elektroden 9,5 cm).

De focussering wordt uitgevoerd onder de onderstaande omstandigheden:

6.3.1. Gelformaat: 265 × 125 × 0,25 mm

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Opmerking: Indien de dikte of de breedte van de gels wordt veranderd, dienen de waarden voor de stroomsterkte en het vermogen te worden aangepast (b.v. tweemaal zo hoge waarden voor de stroomsterkte en voor het vermogen bij gebruik van een gel van 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2. Voorbeeld van een voltageprogramma voor een automatische elektroforese-inrichting (twee gels van 5,0 × 4,5 cm), elektroden zonder stroken rechtstreeks op de gel aangebracht

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

De monsterdrager wordt in stap 2 bij 0 Vh aangebracht.

De monsterdrager wordt in stap 2 bij 30 Vh verwijderd.

6.4. Eiwitkleuring

6.4.1. Eiwit-fixering

Direct na het uitschakelen van de stroom worden de elektrodestroken verwijderd en wordt de gel in een kleurings-/ontkleuringsschaal met 200 ml fixeermiddel (4.9) gebracht; 15 minuten laten staan onder voortdurend schudden.

6.4.2. Wassen en kleuren van de gelplaat

Giet het fixeermiddel volledig af en was de gelplaat tweemaal telkens 30 seconden met 100 ml ontkleuroplossing (4.10). De ontkleuroplossing wordt afgegoten en de schaal wordt met 250 ml kleuroplossing (4.11.3) gevuld; de kleur wordt onder zachtjes schudden in 45 minuten ontwikkeld.

6.4.3. Ontkleuren van de gelplaat

De kleuroplossing wordt afgegoten en de gelplaat wordt tweemaal telkens met 100 ml ontkleuroplossing (4.10) gewassen en ten minste 2 of 3 × 15 minuten met 200 ml ontkleuroplossing geschud, totdat de achtergrond schoon en ongekleurd is. Vervolgens wordt de gelplaat gespoeld met gedestilleerd water (2 × 2 minuten) en aan de lucht in 2 tot 3 uur of met een föhn in 10 tot 15 minuten gedroogd.

Opmerking 1: Het fixeren, wassen, kleuren en ontkleuren wordt uitgevoerd bij 20 °C. Geen hogere temperaturen toepassen.

Opmerking 2: Indien de voorkeur wordt gegeven aan zilverkleuring (b.v. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code nr. 17-1150-01), moeten de met plasmine behandelde caseïnemonsters tot 5 mg/ml worden verdund.

7. Beoordeling

De beoordeling vindt plaats door vergelijking van de eiwitpatronen van het onbekende monster met die van referentiemonsters op dezelfde gel. Detectie van koemelk in kaas van schape-, geite- en buffelmelk of mengsels van schape-, geite- en buffelmelk geschiedt aan de hand van de ã2- en ã3-caseïnen, waarvan het iso-elektrisch punt ligt tussen pH 6,5 en pH 7,5 (zie de figuren 4a, 4b en 5). De detectiegrens ligt beneden 0,5 %.

7.1. Visuele beoordeling

Voor een visuele beoordeling van de hoeveelheid koemelk verdient het aanbeveling de concentraties van monsters en standaarden aan te passen zodat vergelijkbare intensiteiten van de schape-, geite- en/of buffel-ã2-caseïnen en -ã3-caseïnen worden verkregen (zie "ã2 E,G,B" en "ã3 E,G,B" in de figuren 4a, 4b en 5). Daarna kan de hoeveelheid koemelk (minder dan, gelijk aan of meer dan 1 %) in het onbekende monster rechtstreeks worden bepaald door vergelijking van de intensiteit van de runder-ã3- en -ã2-caseïnen (zie "ã3C" en "ã2C" in de figuren 4a, 4b en 5) met die van 0 % en 1 % referentiestandaarden (schapen, geiten) of voorlopige laboratoriumstandaarden (buffel).

7.2. Densitometrische beoordeling

Zo mogelijk wordt voor de bepaling van de verhouding van het piekoppervlak van runder- tot schape-, geite- en/of buffel-ã2- en -ã3-caseïnen (zie figuur 5) densitometrie (5.19) toegepast. De hiermee verkregen waarde wordt vergeleken met de verhouding van ã2- en ã3-caseïnen in de op dezelfde gel geanalyseerde 1 %-standaard (schapen, geiten) of voorlopige laboratoriumstandaarden (buffel).

Opmerking: De methode werkt bevredigend wanneer er in de standaard van 1 % een duidelijk positief signaal is voor zowel runder-ã2- als ã3-caseïnen, maar niet in de standaard van 0 %. Is dat anders, dan dient de procedure aan de hand van de bijzonderheden van de methode te worden verbeterd.

Een monster wordt als positief beoordeeld, als zowel de runder-ã2- als -ã3-caseïnen of de bijbehorende piekoppervlakken gelijk zijn aan of groter dan in de 1 % standaard.

8. Literatuurverwijzingen

1. Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of ã2-caseins, Milchwissenschaft 45, blz. 708-711 (1990).

2. Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffallo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, blz. 83-85 (1995).

3. Krause I., Berner I., Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte - and carrier ampholyte/immobilized pH gradient - isoelectric focusing of ã-caseins using plasmin as signal amplifier, Electrophoresis-Forum '89 (B. J. Radola, ed.) blz. 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

4. Krause I., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf- und Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaligen Polyacrylamidgelen, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, blz. 195-199 (1982).

5. Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 ìm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films, Electrophoresis 1, blz. 43-56 (1980).

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 1: Schematische tekening van het dekblad

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 2: Caseïnelaag die na centrifugering tussen de waterlaag en de organische laag drijft

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 3: Opklapmethode voor het gieten van ultradunne polyacrylamidegels

a = afstandsband (0,25 mm); b = dekblad (5.3); c, e = glasplaten (5.1); d = geloplossing (4.1.2); f = gel-draagblad (5.2)

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 4a: Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen van kaas van schape- en geitemelk met verschillende hoeveelheden koemelk.

% CM = percentage koemelk; C = koe; E = schaap; G = geit.

Bovenste helft van de IEF-gel.

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 4b: Iso-elektrische focussering van met plasmine behandelde caseïnen van kaas van mengsels van schape-, geite- en buffelmelk met verschillende hoeveelheden koemelk.

% CM = percentage koemelk; 1+ = monster met 1 % koemelk en waaraan halfweg zuivere rundercaseïne is toegevoegd; C = koe; E = schaap; G = geit; B = buffel.

Totale scheidingsafstand van de IEF-gel.

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 5: Superpositie van densitogrammen van standaarden (STD) en van monsters kaas van een mengsel van schape- en geitemelk na iso-elektrische focussering.

a,b = standaarden met 0 en 1 % koemelk; c-g = kaasmonsters met 0,1,2,3 en 7 % koemelk. C = koe; E = schaap; G = geit.

De bovenste helft van de IEF-gel is onderzocht bij ë = 634 nm.

(1) De produkten Ampholine® pH 3,5-9,5 (Pharmacia) en Resolyte® pH 5-7 en pH 6-8 (BDH, Merck) blijken bijzonder geschikt voor het bewerkstelligen van de gewenste scheiding van ã-caseïnen.