Beschikking van de Commissie

van 4 juli 2000

tot vaststelling van diagnostische procedures, monsternemingsprocedures en criteria voor de evaluatie van de resultaten van laboratoriumtests voor de bevestiging en de differentiële diagnose van vesiculaire varkensziekte

(kennisgeving geschied onder nummer C(2000) 1805)

(Voor de EER relevante tekst)

(2000/428/EG)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 92/119/EEG van de Raad van 17 december 1992 tot vaststelling van algemene communautaire maatregelen voor de bestrijding van bepaalde dierziekten en van specifieke maatregelen ten aanzien van de vesiculaire varkensziekte(1), laatstelijk gewijzigd bij de Akte van Toetreding van Oostenrijk, Finland en Zweden, en met name op bijlage II, punt 3,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) Het is nodig dat op het niveau van de Gemeenschap diagnostische procedures, monsternemingsprocedures en criteria voor de evaluatie van de resultaten voor de bevestiging van vesiculaire varkensziekte en voor snelle onderscheiding ten opzichte van mond- en klauwzeer worden vastgesteld, zodat een betere bestrijding van beide dierziekten kan worden gewaarborgd.

(2) In bijlage IIII van Richtlijn 92/119/EEG zijn de functies en taken van de communautaire referentielaboratoria voor de vesiculaire varkensziekte vastgesteld onder andere inhoudende dat, in overleg met de Commissie, de in de lidstaten toegepaste procedures voor de diagnose van genoemde ziekte moeten worden gecoördineerd. Deze functies en taken omvatten periodieke organisatie van vergelijkende tests en levering van standaardreagentia in de hele Gemeenschap.

(3) Recentelijk zijn laboratoriumtests ontwikkeld om ervoor te zorgen dat vesiculaire varkensziekte snel wordt geconstateerd en wordt onderscheiden van mond- en klauwzeer.

(4) De resultaten van de meest recente vergelijkende tests in de Gemeenschap wijzen er met name op dat betrouwbare tests zijn ontwikkeld voor de opsporing van het antigeen of het genoom van het virus van vesiculaire varkensziekte en dat voor de virologische diagnose van vesiculaire varkensziekte deze tests met succes kunnen worden gebruikt in de plaats van de virusisolatietest.

(5) De ervaring van de laatste jaren met de bestrijding van vesiculaire varkensziekte heeft ertoe geleid dat de monsternemingsprocedures en de criteria voor de evaluatie van de resultaten van laboratoriumtests zijn bepaald die het meest geschikt zijn voor een juiste diagnose van deze ziekte in uiteenlopende situaties.

(6) Er is rekening gehouden met het advies en de aanbevelingen van het Wetenschappelijk Comité gezondheid en welzijn van dieren.

(7) De in deze beschikking vastgestelde maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Permanent Veterinair Comité,

HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:

Artikel 1

1. De lidstaten zorgen ervoor dat de bevestiging van vesiculaire varkensziekte en de differentiële diagnose van mond- en klauwzeer worden gebaseerd op:

a) opsporing van klinische symptomen van de ziekte;

b) opsporing van virus, antigeen of genoom in monsters van epitheelweefsel, blaasjesvocht of feces;

c) aantoning van een specifieke antilichaamrespons in serummonsters,

een en ander volgens de in de handleiding in de bijlage bij deze beschikking vastgestelde diagnostische procedures, monsternemingsprocedures en criteria voor de evaluatie van de resultaten van laboratoriumtests.

2. De in bijlage II, punt 5, van Richtlijn 92/119/EEG vermelde diagnoselaboratoria mogen echter wijzigingen aanbrengen in de laboratoriumtests warvan sprake in de handleiding in de bijlage bij deze beschikking of andere tests gebruiken, op voorwaarde dat kan worden aangetoond dat die even gevoelig en specifiek zijn.

De gevoeligheid en specificiteit van de gewijzigde of de andere tests moet worden geëvalueerd in het kader van de periodieke vergelijkende tests die worden georganiseerd door het communautaire referentielaboratorium voor vesiculaire varkensziekte.

Artikel 2

Deze beschikking is van toepassing met ingang van 1 oktober 2000.

Artikel 3

Deze beschikking is gericht tot de lidstaten.

Gedaan te Brussel, 4 juli 2000.

Voor de Commissie

David Byrne

Lid van de Commissie

(1) PB L 62 van 15.3.1993, blz. 69.

BIJLAGE

HANDLEIDING PROCEDURES VOOR DIAGNOSE EN MONSTERNEMING, EN CRITERIA VOOR DE EVALUATIE VAN DE RESULTATEN VAN LABORATORIUMTESTS VOOR DE BEVESTIGING EN DIFFERENTIËLE DIAGNOSE VAN VESICULAIRE VARKENSZIEKTE

HOOFDSTUK I

Inleiding, doelstellingen en definities

1. Deze handleiding:

a) voorziet in richtlijnen en minimale eisen met betrekking tot diagnostische procedures, monsterneming en criteria voor de evaluatie van de resultaten van laboratoriumtests voor een juiste diagnose van vesiculaire varkensziekte. Ook wordt in het bijzonder de nadruk gelegd op de differentiële diagnose van mond- en klauwzeer;

b) omvat tevens de bepalingen van bijlage II van Richtlijn 92/119/EEG, met name van de punten 4, 7 en 8;

c) is in principe bedoeld voor de autoriteiten die verantwoordelijk zijn voor de bestrijding van vesiculaire varkensziekte. Daarom ligt de nadruk op de principes en toepassingen van laboratoriumtests en de evaluatie van de resultaten daarvan en niet zozeer op gedetailleerde beschrijvingen van laboratoriumtechnieken.

2. In het kader van deze handleiding gelden de volgende definities:

a) "een seropositief varken" is elk varken waarvan het serum een antilichaamtiter heeft die gelijk is aan of hoger is dan die van het referentieserum 4 voor vesiculaire varkensziekte als bedoeld in hoofdstuk X bij de virusneutralisatietest die door het nationale laboratorium wordt gebruikt;

b) "een singletonreactor" is elk seropositief varken op een bedrijf dat bij serologisch onderzoek op vesiculaire varkensziekte een positief resultaat oplevert, maar dat niet eerder in aanraking is geweest met het virus van de vesiculaire varkensziekte en waarbij geen bewijzen zijn dat de infectie zich heeft verspreid naar varkens waarmee de singletonreactor in aanraking is geweest. Een seropositief varken wordt als bewezen singletonreactor aangemerkt als is voldaan aan de in hoofdstuk VIII, deel C, vermelde voorwaarden;

c) "contactvarkens" zijn varkens die direct in aanraking komen of in de voorgaande 28 dagen in aanraking zijn geweest met een of meer seropositieve varkens of met een of meer varkens die vermoedelijk met het virus van de vesiculaire varkensziekte zijn besmet. Contactvarkens kunnen in hetzelfde hok gehuisvest zijn of zijn geweest, of in aangrenzende hokken als onderling contact tussen de varkens van de verschillende hokken mogelijk is.

HOOFDSTUK II

Richtlijnen voor controle van varkens met klinische symptomen van vesiculaire varkensziekte

1. De lidstaten zorgen ervoor dat, wanneer de aanwezigheid van vesiculaire varkensziekte op een bedrijf wordt vermoed, een statistisch significant aantal varkens zo snel mogelijk door de officiële dierenarts wordt onderzocht om de in hoofdstuk IX genoemde klinische symptomen van de ziekte op te sporen.

2. De lidstaten zorgen ervoor dat, wanneer varkens klinische symptomen vertonen die duiden op vesiculaire varkensziekte of op mond- en klauwzeer, de differentiële diagnostiek door juiste bemonstering en de juiste laboratoriumtests zo snel mogelijk worden uitgevoerd overeenkomstig de bepalingen in de hoofdstukken IV, VII en VIII van deze handleiding.

HOOFDSTUK III

Procedures voor monsternemingen en transport van monsters

1. Iedereen die een varkenshouderij binnengaat of verlaat waar vermoedelijk vesiculaire varkensziekte heerst, moet de striktste voorzorgsmaatregelen inzake hygiëne in acht nemen die nodig zijn om het risico van besmetting met of verspreiding van het virus te verkleinen.

2. Alle varkens waarbij een monster wordt genomen, moeten een individueel merkteken krijgen zodat ze voor een eventuele herbemonstering kunnen worden geïdentificeerd. Aanbevolen wordt dat van elk varken waarbij een monster is genomen de plaats wordt geregistreerd waar het op het bedrijf wordt gehouden, samen met de individuele identificatiecode van het dier, met name wanneer een monster wordt genomen bij een verdacht varken.

3. De monsters moeten voorzien van de juiste formulieren naar het laboratorium worden gezonden. Op de formulieren moeten de bijzonderheden worden vermeld betreffende de voorgeschiedenis van de bemonsterde varkens, alsmede eventueel waargenomen klinische symptomen.

4. Omdat elke vesiculaire aandoening bij varkens mond- en klauwzeer kan zijn, moeten speciale voorzorgsmaatregelen worden getroffen om de verdachte monsters veilig te verpakken. Deze voorzorgsmaatregelen betreffen hoofdzakelijk het voorkomen van breuk of lekkage van de verpakking, alsmede van de kans op besmetting, maar ze zijn ook belangrijk om ervoor te zorgen dat de monsters in goede staat aankomen. Als de monsters met nat ijs worden vervoerd, moet weglekken van water worden voorkomen. Verpakkingen met monsters waarin vermoedelijk het virus van de vesiculaire varkensziekte voorkomt, mogen niet worden geopend vanaf het ogenblik dat ze buiten de besmette gebouwen en terreinen zijn tot ze in het laboratorium aankomen.

5. Monsters waarin vermoedelijk het virus van de vesiculaire varkensziekte voorkomt, mogen, tenzij al uitgesloten is dat in die monsters het mond- en klauwzeervirus voorkomt, alleen worden onderzocht in een laboratorium waaraan, overeenkomstig de communautaire wetgeving met betrekking tot de bestrijding van mond- en klauwzeer, een vergunning is verleend voor het werken met het mond- en klauwzeervirus voor diagnostische doeleinden.

6. Als de verwachte transporttijd naar het ontvangende laboratorium minder dan 48 uur bedraagt, mogen alle monsters bij 4 °C worden vervoerd; in overige gevallen moeten ze worden bewaard bij een temperatuur die niet lager is dan - 20 °C.

7. Monsters die afkomstig zijn uit andere lidstaten dan het Verenigd Koninkrijk en bestemd zijn voor het communautaire referentielaboratorium mogen alleen als luchtvracht naar de vliegvelden Londen-Heathrow of Londen-Gatwick worden vervoerd. Voor de verzending moet het laboratorium via fax (+44-1483-232621) of e-mail worden geïnformeerd over de bijzonderheden van de lijnvlucht, datum, verwachte aankomsttijd en het nummer van de luchtvrachtbrief, zodat het pakje bij aankomst kan worden gelokaliseerd. Het pakje moet als volgt worden geadresseerd: Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory Community Reference Laboratory for swine vesicular disease Ash Road, Pirbright, Woking Surrey GU24 ONF England , UK

Bovendien moet op het etiket de volgende informatie worden vermeld: "Animal Pathological Material of no commercial value. Perishable. Fragile. To be collected at airport by addressee. Not to be opened outside the laboratory.".

De zendingen worden op het vliegveld door daartoe bevoegd personeel van het communautaire referentielaboratorium afgehaald met een speciale algemeen geldende importvergunning die voor dit doel door het Britse Ministry of Agriculture, Food and Fisheries is afgegeven. Dit is een permanente regeling, zodat geen afzonderlijke vergunning voor elke invoer nodig is. Materiaal dat mogelijk besmet is met de vesiculaire varkensziekte, mag niet door onbevoegd personeel als handbagage het Verenigd Koninkrijk worden binnengebracht. Koeriersdiensten mogen niet worden ingeschakeld.

8. Het vervoer van monsters naar de nationale laboratoria moet worden uitgevoerd volgens de instructies die zijn vastgesteld door de bevoegde autoriteit van de lidstaten.

HOOFDSTUK IV

Procedures voor monsterneming op een bedrijf met klinisch verdachte varkens

1. Wanneer de aanwezigheid van vesiculaire varkensziekte op een bedrijf wordt vermoed omdat klinische symptomen van de ziekte zijn waargenomen, moeten bij representatieve groepen varkens die deze symptomen vertonen, de juiste monsters worden genomen voor bevestiging van de ziekte en voor de differentiële diagnose van mond- en klauwzeer.

2. Op deze bedrijven gaat voor diagnostiek de voorkeur uit naar monsters die bij varkens met de kenmerkende symptomen van de ziekte worden genomen van epitheelweefsel en blaasjesvocht uit nog niet of recent opengebarsten blaasjes waarin het virus van de vesiculaire varkensziekte, de specifieke virusantigenen of het virusgenoom kan worden opgespoord. Aanbevolen wordt een monster te nemen bij vijf à zes van dergelijke varkens.

3. Zelfs als vers epitheelweefsel en blaasjesvocht in voldoende hoeveelheden (1 g of meer) beschikbaar zijn, moeten ook de volgende monsters worden genomen:

a) bloedmonsters van verdachte varkens en contactvarkens voor serologisch onderzoek, en

b) fecesmonsters van verdachte varkens, van de vloer van hun hok en van aangrenzende hokken voor virologisch onderzoek.

4. De monsters moeten worden genomen en vervoerd overeenkomstig de volgende procedures:

a) epitheelmonsters en blaasjesvocht:

- indien mogelijk moet een monster worden genomen van minstens 1 g epitheelweefsel van een nog niet of recent opengebarsten blaasje. Aanbevolen wordt dat de varkens voor de monsterneming worden gesedeerd, zowel om letsel bij het personeel te voorkomen als voor het welzijn van de varkens;

- als de epitheelmonsters direct (binnen drie uur) naar het nationale laboratorium worden getransporteerd, mogen ze droog worden vervoerd en gekoeld worden bewaard. Als waarschijnlijk meer dan drie uur nodig zal zijn, moeten de monsters in een kleine hoeveelheid transportmedium worden geplaatst. Dit medium bestaat uit gelijke hoeveelheden glycerol en 0,04 M fosfaatbuffer of een andere gelijkwaardige buffer (hepes), zodat het optimale pH-bereik (pH 7,2-7,6) voor overleving van het mond- en klauwzeervirus gehandhaafd blijft. Het transportmedium moet voor extra antimicrobiële activiteit antibiotica bevatten. Geschikte antibiotica en hun eindconcentratie per ml zijn:

i) penicilline 1000 IU,

ii) neomycine (sulfaat) 100 IU,

iii) polymyxine B (sulfaat) 50 IU,

iv) mycostatine 100 IU,

- als blaasjesvocht uit een niet-opengebarsten blaasje kan worden afgenomen, moet dit onverdund en afzonderlijk verpakt worden bewaard;

b) bloedmonsters:

- bloedmonsters kunnen voor serologisch en virologisch onderzoek worden genomen. Bloedmonsters worden echter in het algemeen alleen genomen om antilichamen op te sporen bij varkens die vermoedelijk zijn genezen van een klinische of subklinische infectie, omdat in monsters van epitheelweefsel, blaasjesvocht en feces van varkens met klinische symptomen van de ziekte het virus beter kan worden opgespoord dan in bloedmonsters. Aanbevolen wordt om bloed af te nemen met behulp van een vacutainer zonder anticoagulans en de vacutainers ongeopend te vervoeren;

c) fecesmonsters:

- fecesmonsters van de vloer van de gebouwen waarin vermoedelijk varkens zijn of waren gehuisvest die geïnfecteerd zijn met vesiculaire varkensziekte, of fecesuitstrijkjes en fecesmonsters van verdachte levende varkens moeten stevig en lekvrij worden verpakt.

Verpakkingen met verdachte monsters moeten aan de buitenkant worden gedesinfecteerd voordat ze naar het laboratorium worden vervoerd. Geschikte desinfectantia zijn:

- natriumhydroxide (1:100 verdunning);

- formaline (1:9 verdunning van een oplossing van formaline die minimaal 34 % formaldehyde bevat), en

- natriumhypochloriet (2 % beschikbaar chloor).

Deze desinfectantia moeten voorzichtig worden gebruikt.

HOOFDSTUK V

Procedures voor monsterneming voor serocontrole bij vesiculaire varkensziekte

1. Wanneer serocontrole wordt uitgevoerd:

a) voor controle op bedrijven waarvoor er geen aanwijzingen of vermoedens bestaan dat de ziekte er voorkomt;

b) voor controle in slachthuis, markt, verzamelpunt of gelijksoortige locatie door middel van routinematige bemonstering voor serologisch onderzoek;

c) als niet-discriminerende controle bij het importbedrijf op varkens afkomstig uit andere lidstaten,

moeten bij de varkens bloedmonsters voor serologisch onderzoek worden genomen ofwel overeenkomstig de bepalingen van de programma's of plannen voor monitoring of uitroeiing die zijn goedgekeurd in het kader van Beschikking 90/424/EEG(1) of Richtlijn 90/425/EEG(2) van de Raad of, wanneer dergelijke bepalingen ontbreken, overeenkomstig procedures vastgesteld door de bevoegde autoriteit van de lidstaten.

2. Wanneer serocontrole wordt uitgevoerd:

a) voor controle van bedrijven binnen de beschermings- en toezichtsgebieden die zijn ingesteld na bevestiging van uitbraken van de ziekte overeenkomstig bijlage II, punten 7 en 8, van Richtlijn 92/119/EEG, of

b) voor controle van de bedrijven als bedoeld in artikel 9 van Richtlijn 92/119/EEG,

moeten bij de varkens bloedmonsters voor serologisch onderzoek worden genomen overeenkomstig het volgende schema:

- op fokbedrijven moet zo gerandomiseerd worden bemonsterd dat een 5 % prevalentie van seroconversie met een 95 % betrouwbaarheidsinterval wordt opgespoord;

- op bedrijven met alleen mestvarkens moet zo worden bemonsterd dat het totale aantal monsters dat is genomen ten minste gelijk is aan het aantal dat nodig is om een prevalentie van 5 % met een 95 % betrouwbaarheidsinterval op te sporen. De monsters moeten uit zoveel mogelijk willekeurig gekozen hokken worden genomen;

- op gemengde fok- en mestbedrijven moet elke groep varkens die in afzonderlijke gebouwen is gehuisvest, zo worden bemonsterd dat 5 % prevalentie van seroconversie met een 95 % betrouwbaarheidsinterval wordt opgespoord.

HOOFDSTUK VI

Verdere acties en procedures voor herbemonstering als seropositieve varkens worden aangetroffen

1. Als op een bedrijf na de controle als bedoeld in hoofdstuk V, punt 1, onder a), of punt 2 één enkel seropositief varken wordt opgespoord, zorgt de bevoegde autoriteit ervoor dat:

a) indien dit nog niet is gebeurd, voor dit bedrijf de maatregelen als bedoeld in artikel 4 van Richtlijn 92/119/EEG worden toegepast;

b) op het bedrijf een controle wordt uitgevoerd overeenkomstig de in hoofdstuk II, punt 1, bedoelde bepalingen;

c) bloedmonsters voor serologisch onderzoek worden genomen bij:

- het verdachte varken;

- contactvarkens die in hetzelfde hok en in aangrenzende hokken aan dat van het verdachte varken zijn gehuisvest; deze varkens moeten zo worden bemonsterd dat in het hok 50 % prevalentie van seroconversie met een 95 % betrouwbaarheidsinterval wordt opgespoord.

2. De bevoegde autoriteit kan echter beslissen de in punt 1, onder a), bedoelde maatregelen op te heffen als:

a) het epidemiologische onderzoek dat is uitgevoerd overeenkomstig artikel 8 van Richtlijn 92/119/EEG erop wijst dat vesiculaire varkensziekte niet op het bedrijf is ingesleept;

b) geen klinische symptomen van vesiculaire varkensziekte op het bedrijf zijn opgespoord, en

c) het bedrijf niet ligt in een toezichtsgebied of beschermingsgebied dat is ingesteld na een bevestigde uitbraak van de ziekte of dat onderworpen is aan andere beperkingen in verband met een bevestigde uitbraak van een ziekte,

en op voorwaarde dat

- vanuit het bedrijf geen varkens worden vervoerd voor intracommunautair handelsverkeer, en

- varkens van het betrokken bedrijf alleen worden vervoerd naar het slachthuis om onmiddellijk te worden geslacht of naar een ander bedrijf waarvandaan geen varkens worden vervoerd voor intracommunautair handelsverkeer,

een en ander totdat de resultaten van verdere controles en van de serologische tests aantonen dat vesiculaire varkensziekte definitief kan worden uitgesloten.

3. Als de controles en de serologische tests die zijn uitgevoerd overeenkomstig punt 1, onder b) en c):

a) negatieve resultaten opleveren of alleen het eerder positief bevonden varken als positief bevestigen (singletonreactor), kan vesiculaire varkensziekte worden uitgesloten. De in punt 1, onder a), bedoelde maatregelen worden opgeheven, tenzij het bedijf ligt in een beschermingsgebied of toezichtsgebied dat is ingesteld rond een uitbraak van de ziekte en waarin uitroeiingsmaatregelen van kracht moeten blijven overeenkomstig bijlage II, punt 7 of 8, van Richtlijn 92/119/EEG;

b) erop wijzen dat meer dan één seropositief varken op het bedrijf aanwezig is, moet de aanwezigheid van vesiculaire varkensziekte worden bevestigd of moeten, als niet is voldaan aan de voorwaarden van bijlage II, punt 4, van Richtlijn 92/119/EEG om de aanwezigheid van deze ziekte te kunnen bevestigen, bij het bedrijf nog meer monsters worden genomen overeenkomstig de in punt 4 bedoelde bemonsteringsprocedures.

4. Als op een bedrijf na monsterneming en na het serologisch onderzoek bedoeld in hoofdstuk V, punt 1, onder a) en c), of punt 2 meer dan één seropositief varken wordt opgespoord, maar niet is voldaan aan de voorwaarden van bijlage II, punt 4, van Richtlijn 92/119/EEG om de aanwezigheid van vesiculaire varkensziekte te kunnen bevestigen, zorgt de bevoegde autoriteit ervoor dat:

a) de in artikel 4 van Richtlijn 92/119/EEG bedoelde bepalingen worden toegepast of van toepassing blijven;

b) een controle op het bedrijf wordt uitgevoerd overeenkomstig de in hoofdstuk II, punt 1, bedoelde bepalingen;

c) bij de seropositieve varkens en contactvarkens extra bloedmonsters voor serologisch onderzoek worden genomen overeenkomstig punt 1, onder c);

d) bij varkens in de andere gebouwen van het bedrijf bloedmonsters voor serologisch onderzoek worden genomen volgens de in hoofdstuk V, punt 2, bedoelde procedure;

e) voldoende fecesmonsters voor virologisch onderzoek worden genomen van:

- de seropositieve varkens;

- de vloer van de hokken waar seropositieve varkens zijn gehuisvest en van aangrenzende hokken;

- willekeurig geselecteerde hokken in andere gebouwen op het bedrijf.

Fecesmonsters die volgens de eerste twee hierboven genoemde punten zijn verzameld, moeten zo snel mogelijk worden onderzocht. Als deze monsters negatief zijn, maar de resultaten van de serologische tests erop wijzen dat het virus van de vesiculaire varkensziekte zich naar andere gebouwen zou kunnen hebben verspreid, moeten de fecesmonsters die zijn verzameld overeenkomstig het derde hierboven genoemde punt ook worden onderzocht.

Als na deze verdere controles en onderzoeken niet is voldaan aan de voorwaarden van bijlage II, punt 4, van Richtlijn 92/119/EEG om de aanwezigheid van vesiculaire varkensziekte te kunnen bevestigen, worden de seropositieve varkens afgemaakt of geslacht overeenkomstig de bepalingen in bijlage II, punt 4, onder d), van Richtlijn 92/119/EEG. Als echter, naast de bij de eerdere monsterneming seropositief bevonden varkens, nog meer varkens seropositief zijn bevonden, worden de hierboven in a), b), c), d) en e) vastgestelde bepalingen en procedures mutatis mutandis opnieuw toegepast.

5. Onverminderd de in artikel 9 van Richtlijn 92/119/EEG bedoelde maatregelen, moet de bevoegde autoriteit, als na de controles bedoeld in hoofdstuk V, punt 1, onder b) of c), een of meer seropositieve varkens worden opgespoord, ervoor zorgen dat:

a) indien noodzakelijk en uitvoerbaar, passende extra controles inclusief bemonstering worden uitgevoerd om op de plaats waar deze varkens zijn opgespoord vesiculaire varkensziekte te bevestigen of uit te sluiten, waarbij rekening wordt gehouden met de plaatselijk situatie;

b) op het bedrijf waar deze varkens oorspronkelijk vandaan komen, de in artikel 4 van Richtlijn 92/119/EEG bedoelde maatregelen worden toegepast;

c) op het bedrijf waar deze varkens oorspronkelijk vandaan komen, een controle wordt uitgevoerd overeenkomstig de in hoofdstuk II, punt 1, bedoelde bepalingen, en

d) bij de varkens op het bedrijf waar de seropositieve varkens oorspronkelijk vandaan komen, bloedmonsters voor serologisch onderzoek worden genomen overeenkomstig de in hoofdstuk V, punt 2, bedoelde bepalingen.

6. De bevoegde autoriteit kan echter beslissen de in punt 5, onder b), bedoelde maatregelen op te heffen als:

a) het epidemiologische onderzoek dat is uitgevoerd overeenkomstig de artikelen 4 en 8 van Richtlijn 92/119/EEG erop wijst dat vesiculaire varkensziekte niet op het bedrijf is ingesleept;

b) geen klinische symptomen van vesiculaire varkensziekte op het bedrijf zijn opgespoord, en

c) het bedrijf niet ligt in een toezichtsgebied of beschermingsgebied dat is ingesteld na een bevestigde uitbraak van de ziekte of dat onderworpen is aan andere beperkingen in verband met een bevestigde uitbraak van een ziekte,

en op voorwaarde dat

- vanuit het bedrijf geen varkens worden vervoerd voor intracommunautair handelsverkeer, en

- varkens van het betrokken bedrijf alleen worden vervoerd naar het slachthuis om onmiddellijk te worden geslacht of naar een ander bedrijf waarvandaan geen varkens worden vervoerd voor intracommunautair handelsverkeer,

een en ander totdat de resultaten van verdere controles en van de serologische tests aantonen dat vesiculaire varkensziekte definitief kan worden uitgesloten.

HOOFDSTUK VII

Principes en toepassingen van virologische test en evaluatie van de resultaten

A. Opsporen van het virusantigeen

1. Het viraal antigeen van de vesiculaire varkensziekte wordt tegenwoordig bij voorkeur opgespoord door middel van een indirecte sandwich Elisa in plaats van de complementbindingsreactie. De test is dezelfde als die welke voor de diagnose van mond- en klauwzeer wordt toegepast. De tests voor beide ziekten moeten tegelijkertijd worden uitgevoerd, tenzij mond- en klauwzeer al is uitgesloten. Deze test wordt met name aanbevolen voor monsters van epitheelweefsel of van vocht afkomstig uit vesiculaire laesies, waarin bij sterk besmette varkens zowel het virus van vesiculaire varkensziekte als van mond- en klauwzeer met hoge titers aanwezig kan zijn en deze binnen enkele uren kunnen worden opgespoord(3).

Op Elisa-platen (multiwell modules) worden twee rijen (duplo's) gecoat met konijnantiserum tegen het virus van de vesiculaire varkensziekte en tegen elk van de zeven serotypen van het mond- en klauwzeervirus. Dit zijn de bindingssera. Aan elk van de rijen worden suspensies van de onderzoekmonsters toegevoegd. Ook worden de juiste controles meegenomen. Bij de volgende stap wordt aan de beide rijen homoloog caviadetectieserum toegevoegd, gevolgd door konijnanticaviadetectieserum geconjugeerd met een enzym als mierikswortelperoxidase. Tussen alle stappen wordt zorgvuldig gewassen om ongebonden reagentia te verwijderen. De reactie is positief als na toevoeging van een chromogen en substraat een kleurreactie optreedt. Bij sterk positieve reacties zal deze kleurreactie met het blote oog zichtbaar zijn, maar de resultaten kunnen ook spectrofotometrisch worden afgelezen. In dat geval wijst een gemeten absorptie van meer dan 0,1 ten opzichte van de referentie op een positieve reactie.

2. Voor antigeendetectie van vesiculaire varkensziekte en voor de differentïele diagnose van mond- en klauwzeer in epitheelmonsters, blaasjesvocht of geïnfecteerde weefselkweken kunnen alternatieve, op monoklonale antilichamen gebaseerde Elisa-systemen worden gebruikt. Hierbij worden geselecteerde monoklonale antilichamen als bindingsantilichaam gebruikt en met peroxidase-geconjugeerde monoklonale antilichamen als detecterend antilichaam.

3. Een op monoklonale antilichamen gebaseerde Elisa kan worden gebruikt om de antigene variatie te onderzoeken tussen virusstammen van de vesiculaire varkensziekte. Via weefselkweek verkregen virusantigenen worden gebonden door een hyperimmuun konijnantiserum gericht tegen vesiculaire varkensziekte dat aan de vaste fase is geabsorbeerd. Vervolgens laat men geschikte panels van monoklonale antilichamen een reactie aangaan en de binding van de monoklonale antilichamen aan de veldstammen wordt vergeleken met de binding aan de ouderstammen. Overeenkomstige binding wijst op de aanwezigheid van epitopen die zowel bij de ouderstammen als de veldstammen voorkomen.

B. Isolatie en kweek van het virus

1. Als routinebepaling moeten gevoelige celkweken worden geïnoculeerd met heldere suspensies van monsters van epitheelweefsel, blaasjesvocht of feces die vermoedelijk het virus van de vesiculaire varkensziekte bevatten. Als de kwaliteit en kwantiteit van de monsters van vesiculaire laesies die voor onderzoek zijn ingeleverd onvoldoende zijn voor direct onderzoek door middel van Elisa, zal het virus in weefselkweek moeten worden gekweekt om het virale antigeen te vermeerderen.

2. Om het virus te isoleren en te kweken, worden monolayer-culturen van IB-RS-2-cellen geïnoculeerd met heldere epitheelsuspensie. Er dienen twee verdunningen van de epitheelsuspensie te worden gebruikt, een hoge (1/500) en een lage (1/10), om interferentie met de virusgroei door interferon te vermijden. Afgifte van interferon zal de groei van het virus van de vesiculaire varkensziekte verstoren. Voor virusisolatie worden aan het onderhoudsmedium alleen antibiotica toegevoegd. Voor differentiële diagnostiek van het mond- en klauwzeervirus moeten ook primaire schildkliercellen van runderen of baby hamster niercellen (BHK-21 ) worden geïnoculeerd.

3. Indien een volledig, cytopathisch effect optreedt, moet het supernatant van positieve kweken worden opgevangen en voor virusidentificatie bij de Elisatest worden gebruikt. Na 48 of 72 uur moeten verse weefselkweken met negatieve kweken worden geïnoculeerd en deze blinde passage moet na 72 uur worden beoordeeld. Wanneer na een volgende blinde passage geen cytopathisch effect optreedt, kan het monster voor wat de aanwezigheid van levend virus betreft, als negatief worden gekwalificeerd.

4. Suspensies van fecesmonsters kunnen worden behandeld als beschreven in punt 1. Aangezien de feces over het algemeen minder virussen bevatten dan epitheel, is het essentieel dat wanneer er bij de eerste twee passages geen cytopathisch effect optreedt, een derde blinde passage wordt uitgevoerd.

5. Gelijktijdige inoculatie van een varkenscellijn en van een van de hierboven genoemde weefselkweeksystemen (bij voorkeur primaire schildkliercellen van runderen) is een nuttig hulpmiddel om vast te stellen of vesiculaire monsters het virus van de vesiculaire varkensziekte of het mond- en klauwzeervirus bevatten, aangezien het eerste virus alleen in cellen afkomstig van varkens zal groeien. Virusisolaten van mond- en klauwzeer met een langdurige voorgeschiedenis van transmissie tussen varkens kunnen echter ook bij voorkeur groeien in kweeksystemen met varkenscellen.

C. De polymerase-kettingreactie (PCR) voor genoomdetectie

1. Nucleïnezuuramplificatietechnieken kunnen worden toegepast om met behulp van PCR het genoom van het virus van de vesiculaire varkensziekte in klinisch materiaal aan te tonen. Deze technieken kunnen ook worden aangewend om relaties tussen isolaten van het virus van de vesiculaire varkensziekte vast te stellen door van een deel van het genoom de nucleotidenvolgorde te bepalen. Er zijn PCR-technieken ontwikkeld om de gevoeligheid van de diagnose te verbeteren. Zo zijn er iets van elkaar verschillende reverse transcriptase-PCR-procedures beschreven waarbij primers worden gebruikt die corresponderen met sterk geconserveerde zones in de 1C- en 1D-genen.

2. De PCR-techniek is snel (de resultaten zijn gewoonlijk binnen 24 uur beschikbaar), spoort alle genotypen van het virus van de vesiculaire varkensziekte op en is voldoende gevoelig voor toepassing bij monsters die zijn genomen bij gevallen waarin klinische ziekte wordt vermoed.

3. Als subklinische infectie wordt vermoed, of wanneer na verdwijnen van de klinische ziekte monsters worden genomen of als wordt gewerkt met fecesmonsters, bieden versterkte RT-PCR-technieken, zoals "nested" RT-PCR, immuun-PCR, ELISA-PCR en meer verfijnde RNA-extractiemethoden, een detectiesysteem dat minstens zo gevoelig, maar aanzienlijk sneller is dan meervoudig overzetten op weefselkweek.

4. Door binnen het 1D-gen dat codeert voor het belangrijke structurele eiwit VP1 de volgorde van ongeveer 200 nucleotiden te bepalen, is het mogelijk de stammen van het virus van de vesiculaire varkensziekte in te delen aan de hand van hun sequentieovereenkomst en de stammen die in verschillende regio's of op verschillende tijdstippen ziekte veroorzaken epidemiologisch met elkaar in verband te brengen.

D. Evaluatie van de resultaten van virologisch onderzoek

De opsporing van antigenen of het genoom van het virus van de vesiculaire varkensziekte door middel van Elisa en PCR heeft dezelfde diagnostische waarde als virusisolatie.

Virusisolatie moet echter als referentietest worden beschouwd en moet, zo nodig, als confirmatietest worden gebruikt, met name als een positieve Elisa of PCR niet gepaard gaat met:

a) de opsporing van klinische symptomen van de ziekte;

b) de opsporing van seropositieve varkens, of

c) een direct epidemiologisch verband met een bevestigde uitbraak.

HOOFDSTUK VIII

Principes en toepassingen van virologische test en evaluatie van de resultaten

A. Virus Neutralisatie (VN)-test

1. De kwantitatieve VN-microtest voor het opsporen van antilichamen tegen het virus van de vesiculaire varkensziekte wordt uitgevoerd met IB-RS-2-cellen of een equivalent celsysteem op microtiterplaten van weefselkweekkwaliteit en voorzien van platte bodem.

2. Het virus wordt in monolayer-culturen van IB-RS-2-cellen gekweekt en bewaard ofwel bij - 20 °C na toevoeging van 50 % glycerol ofwel bij - 70 °C zonder glycerol. De sera worden vóór het onderzoek gedurende 30 minuten bij 56 °C geïnactiveerd.

B. Elisa's

1. De Elisa-test die wordt gebruikt om antilichamen op te sporen, is een op monoklonale antilichamen gebaseerde competitieve Elisa. Als het serummonster antilichamen tegen het virus van de vesiculaire varkensziekte bevat, zal de binding van een geselecteerd peroxidase-geconjugeerd monoklonale antilichaam aan het virusantigeen worden geremd.

In deze Elisa wordt het antigeen van het virus van de vesiculaire varkensziekte aan de vaste fase gebonden met behulp van monoklonale antilichamen; vervolgens worden de serummonsters bij de juiste verdunning geïncubeerd, gevolgd door toevoeging van het peroxidase-geconjugeerde monoklonale antilichaam. Vervolgens wordt de remming van het monoklonale antilichaambinding bepaald door middel van een substraat en een chromogen.

2. Het tijdstip van infectie bij het varken of op het besmette bedrijf kan worden vastgesteld met behulp van een indirecte bindings-Elisa. Bij deze test wordt varkens-IgG of varkens-IgM met behulp van isotype-specifieke monoklonale antilichamen opgespoord.

Bij de isotype-specifieke Elisa wordt het virale antigeen met een antigeenbindend antilichaam aan de vaste fase gebonden. Als het serum antilichamen bevat tegen het virus van de vesiculaire varkensziekte, worden deze opgespoord met behulp van een peroxidase-geconjugeerd anti-varken-IgG of anti-varken-IgM monoklonaal antilichaam. Vervolgens wordt deze binding door middel van een substraat en chromogen gemeten.

Met behulp van de isotype-specifieke Elisa kan ook onderscheid worden gemaakt tussen singletonreactoren en varkens die werkelijk positief zijn, als bedoeld in deel C.

C. Toepassing van serologische tests en evaluatie van de resultaten

1. De VN-test en de Elisa zijn de serologische tests die worden aanbevolen. Hoofdstuk X geeft een lijst van de referentiesera die bij het communautaire referentielaboratorium beschikbaar zijn met het oog op uitvoering van gestandaardiseerde serologische tests in de Gemeenschap.

De VN-test moet als referentietest worden beschouwd, maar heeft als nadeel dat het twee tot drie dagen duurt voor deze is afgerond en dat hiervoor weefselkweekfaciliteiten nodig zijn.

De Elisa is sneller en kan gemakkelijker worden gestandaardiseerd. De betrouwbaarste tot nu toe beschreven Elisa-test om antilichamen tegen vesiculaire varkensziekte op te sporen, is de monoklonale antilichaam competitieve Elisa. Deze test wordt aanbevolen als screeningsonderzoek voor een groot aantal monsters.

Zo nodig moet echter de VN-test als confirmatietest worden toegepast, in het bijzonder nadat op een bedrijf voor het eerst positieve monsters zijn opgespoord. Varkens die met Elisa positief reageren maar met de VN-test negatief, kunnen worden genegeerd.

2. Aangenomen mag worden dat op een bedrijf een singletonreactor(4) aanwezig is, als één seropositief varken wordt opgespoord en aan de volgende criteria wordt voldaan:

a) op het bedrijf geen klinische symptomen van de ziekte zijn;

b) er geen relevante voorgeschiedenis van de ziekte op het bedrijf bestaat;

c) er geen voorgeschiedenis van contact met een bekende uitbraak van de ziekte is.

3. Een varken wordt als bewezen singletonreactor aangemerkt wanneer:

a) bij follow-up-onderzoek geen andere seropositieve varkens worden opgespoord;

b) bemonstering bij contactvarkens nadat de singletonreactor is opgespoord, geen seroconversie laat zien;

c) de antilichaamtiter bij herhaalde monsterneming gelijk blijft of daalt.

4. Voor bevestiging inzake een singletonreactor moet echter ook rekening worden gehouden met de volgende bijkomende criteria en principes:

a) singletonreactoren komen voor met een revalentie van ongeveer 1 per 1000 varkens;

b) sera afkomstig van singletonreactoren hebben in het algemeen het volgende profiel:

- lage antilichaamtiter bij VN-test;

- dubieus positief bij de op monoklonale antilichamen gebaseerde competitieve Elisa;

- uitsluitend IgM en geen IgG bij de voor vesiculaire varkensziekte isotype-specifieke Elisa(5).

HOOFDSTUK IX

Klinische symptomen en kenmerken van vesiculaire varkensziekte

Vesiculaire varkensziekte is een besmettelijke ziekte bij varkens die door een enterovirus van de Picornaviridae-familie wordt veroorzaakt. De ziekte kan subklinisch, mild of ernstig verlopen. Dit hangt af van de virusstam, de verspreidingsroute en mate van infectie en de veehouderijomstandigheden. Bijkomende stressfactoren als transport, samenvoeging met andere varkens en extreme temperaturen kunnen ook predisponeren voor het ontstaan van klinische symptomen.

De ziekte wordt gekenmerkt door milde koorts en blaasjes op de kroonrand, de klauwkussens op de hiel, de huid van de poten en minder vaak op snuit, lippen, tong en tepels. De morbiditeit kan tot 100 % bedragen, maar de mortaliteit is zeer laag tot nihil.

Infectie kan in een onduidelijke of milde vorm optreden, waarbij slechts een tijdelijke achteruitgang optreedt in het algemene uiterlijk van de varkens, maar waardoor wel binnen enkele dagen virusneutraliserende antilichamen(6) ontstaan.

Vanwege het subklinische of milde karakter van de ziekte wordt deze vaak voor het eerst vermoed na serologisch onderzoek voor ziektecontrole of exportcertificering. Recente uitbraken van vesiculaire varkensziekte in Europa werden gekenmerkt door minder ernstige klinische symptomen of het ontbreken van symptomen, zodat de diagnose vaak afhing van serologisch onderzoek.

De klinische symptomen van vesiculaire varkensziekte zijn echter niet te onderscheiden van die van mond- en klauwzeer. Elke vesiculaire aandoening moet in eerste instantie worden behandeld als vermoeden van mond- en klauwzeer en de differentiële diagnose moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.

De incubatietijd van vesiculaire varkensziekte bij individuele dieren bedraagt meestal twee tot zeven dagen, waarna tijdelijk koorts tot 41 °C kan optreden, maar het kan voorkomen dat de klinische symptomen op het bedrijf pas na langere tijd duidelijk worden. Er ontstaan dan blaasjes op de kroonrand, doorgaans op de overgang met de hiel. De hele kroonrand kan worden aangetast, waardoor de hoef kan losraken. In zeldzamere gevallen kunnen er ook blaasjes ontstaan op de snuit, met name op de neus, en op de lippen en de tong, alsmede op de tepels; op de knieën kunnen oppervlakkige erosies zichtbaar zijn. Zieke varkens kunnen kreupel lopen en gedurende een aantal dagen niet willen eten.

Jongere varkens worden ernstiger ziek, hoewel sterfte ten gevolge van vesiculaire varkensziekte zeer zelden voorkomt, anders dan bij mond- en klauwzeer bij biggen.

Zenuwachtigheid is gemeld, maar is ongewoon. Abortus is geen typisch kenmerk van vesiculaire varkensziekte. Hartfalen als gevolg van multifocale myocarditis en encefalomyocarditis kan een kenmerk zijn van mond- en klauwzeer, met name bij jonge biggen, maar komt bij vesiculaire varkensziekte niet voor.

Binnen twee tot drie weken treedt meestal volledig herstel op met dan als enig blijvend teken van de infectie een donkere, horizontale lijn op de hoef op de plaats waar de groei tijdelijk onderbroken is.

Besmette varkens kunnen het virus al vanaf 48 uur voor de eerste manifestatie van klinische symptomen uitscheiden via neusvocht, speeksel en feces. De meeste virussen worden in de eerste zeven dagen na infectie gevormd en de virusuitscheiding via neusvocht of speeksel stopt doorgaans binnen twee weken. Het virus kan tot 20 dagen na infectie uit de feces worden geïsoleerd, hoewel aanwezigheid tot drie maanden is gemeld. Het virus kan gedurende een aanzienlijke periode aanwezig blijven in necrotisch weefsel rond opengebarsten blaasjes en in de feces.

HOOFDSTUK X

Referentiesera voor vesiculaire varkensziekte

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

(1) PB L 224 van 18.8.1990, blz. 19.

(2) PB L 224 van 18.8.1990, blz. 29.

(3) Bij positieve Elisa-resultaten bevat het monster ten minste 105 TCID50 (Tissue Culture Infectious Doses) van het virus.

(4) Een klein deel van de singletonreactoren kan met een van de huidige serologische tests voor vesiculaire varkensziekte worden opgespoord. De factoren die verantwoordelijk zijn voor singletonreactoren zijn onbekend. Serologische kruisactiviteit met het virus van de vesiculaire varkensziekte kan optreden ten gevolge van infectie met een ander, tot nu tot niet geïdentificeerd, picornavirus of kan het gevolg zijn van andere niet-specifieke factoren aanwezig in het serum.

(5) In serummonsters van varkens besmet met het virus van de vesiculaire varkensziekte wordt gewoonlijk of alleen specifiek IgG of én IgG én IgM opgespoord, terwijl sera van singletonreactoren meestal alleen IgM bevatten. Specifiek IgG zal niet worden opgespoord in serummonsters van varkens die in de voorgaande tien tot 14 dagen besmet zijn met het virus van de vesiculaire varkensziekte, maar specifiek IgG zou in een tweede bloedmonster opgespoord moeten worden. Recent geïnfecteerde varkens kunnen echter niet met voldoende betrouwbaarheid worden onderscheiden van singletonreactoren voordat hun immuunrespons omslaat van IgM- tot IgG-productie. Zie ook hoofdstuk IX en voetnoot 6.

(6) Specifiek IgM kan meestal na twee tot drie dagen na infectie in het bloed worden opgespoord en verdwijnt na ongeveer 30 tot 50 dagen; specifiek IgG kan meestal na tien tot 14 dagen na infectie en gedurende een aantal jaren in het bloed worden opgespoord. Het Ig-isotype kan worden bepaald door middel van de Elisa-test beschreven in hoofdstuk VIII, deel B, punt 2.