10)

De volgende hoofdstukken C.27, C.28, C.29 en C.30 worden toegevoegd: „C.27 TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR CHIRONOMIDEA IN SEDIMENT EN WATER M.B.V. VERRIJKT SEDIMENT INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn 218 (2004) van de OESO (TG 218). Deze testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoetwaterinsecten van Chironomus sp. aan stoffen. De methode is gebaseerd op bestaande toxiciteitstestprotocollen voor Chironomus riparius en Chironomus tentans die in Europa (1)(2)(3) en Noord-Amerika (4)(5)(6)(7)(8) zijn ontwikkeld en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde Chironomidae worden gebruikt, bijvoorbeeld Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt het sediment met de teststof verrijkt. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het scenario waarbij sediment wordt verrijkt, dient om accumulatie van persistente stoffen in het sediment na te bootsen. Bij dit blootstellingssysteem wordt het sediment van een testsysteem van sediment en water verrijkt. 3. De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organismen zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden overwogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 28-65 dagen voor C. tentans. Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten van een onstabiele stof te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden verwijderd. 4. De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken. 5. Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sediment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten: — de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceerbare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen; — het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voorbehandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunstmatig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests; — door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerangschikt. 6. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 7. Larven in het eerste stadium van Chironomidae worden in sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof blootgesteld. Het sediment wordt met de teststof verrijkt, waarna larven in het eerste stadium aan de gestabiliseerde concentraties sediment en water in de testglazen worden toegevoegd. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van Chironomidae gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met × % (bv. EC15, EC50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken. GEGEVENS OVER DE TESTSTOF 8. De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenliggend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de structuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke chemische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen. REFERENTIESTOFFEN 9. Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarborgen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonderzoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, pentachloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13). GELDIGHEID VAN DE TEST 10. De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan: — het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de test ten minste 70 % zijn (1)(6); — de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte C. riparius en C. yoshimatsui moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor C. tentans is een periode van 20 tot 65 dagen nodig; — aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben; — de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tussenpozen bevestigd. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Testvaten 11. De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm2 per larve bedragen. De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het bovenliggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon). Keuze van de soorten 12. Als testsoort heeft Chironomus riparius de voorkeur. Chironomus tentans is ook geschikt, maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode. Chironomus yoshimatsui mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat bijzonderheden over de kweekmethoden van Chironomus riparius. Er is ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soorten, namelijk Chironomus tentans (4) en Chironomus yoshimatsui (11). Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voorafgaand aan iedere test nodig. Sediment 13. Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sediment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de Chironomidae zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16): a) 4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd; b) 20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet); c) 75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 μm hebben); d) er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel een vochtgehalte van 30-50 % te geven; e) er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO3) toegevoegd om het uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven. Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c). 14. De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontreiniging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is. Water 15. Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als testwater. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ontchloord kraanwater aanvaardbaar, mits de Chironomidae daarin gedurende het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO3, niet hoger zijn dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden gebruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwaliteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden. Stamoplossingen — Verrijkte sedimenten 16. Verrijkte sedimenten worden gewoonlijk in de gekozen concentratie bereid door rechtstreeks een oplossing van de teststof aan het sediment toe te voegen. Een stamoplossing van de in gedeïoniseerd water opgeloste teststof wordt met het kunstmatige sediment gemengd met behulp van een wals of een voedermixer of door handmatig mengen. Indien de teststof slecht in water oplosbaar is, kan deze worden opgelost in een zo klein mogelijk volume van een geschikt organisch oplosmiddel (bv. hexaan, aceton of chloroform). Deze oplossing wordt vervolgens gemengd met 10 g fijn kwartszand per testvat. Laat het oplosmiddel verdampen, zodat het volledig uit het zand wordt verwijderd; vervolgens wordt het zand gemengd met een geschikte hoeveelheid sediment per testglas. Voor het oplossen, dispergeren of emulgeren van de teststof mogen alleen gemakkelijk verdampende oplosmiddelen worden gebruikt. Bij de bereiding van het sediment moet rekening worden gehouden met het zand dat in het mengsel van teststof en zand aanwezig is (het sediment wordt dus met minder zand bereid). De aan het sediment toegevoegde teststof moet zorgvuldig en gelijkmatig over het sediment worden verdeeld. Zo nodig kunnen deelmonsters worden geanalyseerd om de homogeniteit te bepalen. TESTOPZET 17. De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van testopzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest. Opzet voor regressieanalyse 18. De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC15 en EC50) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is, omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (ECx) toe als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapolaties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste concentraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27). 19. Als een ECx-schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf concentraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afgeweken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wanneer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt verhoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist. Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC 20. Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan gewoonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. Limiettest 21. Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). Deze limiettest wordt uitgevoerd bij een concentratie die voldoende hoog is om de besluitvormers in staat te stellen mogelijke toxische effecten van de teststof uit te sluiten; deze concentratie wordt vastgesteld op een niveau dat zich naar verwachting in geen enkele situatie zal voordoen. Een concentratie van 1 000 mg/kg (drooggewicht) wordt aanbevolen. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt. PROCEDURE Blootstellingsomstandigheden Voorbereiding van het verrijkt sediment-watersysteem 22. Voor het aanbrengen van de teststof wordt de in testmethode C.8, Toxiciteit voor regenwormen, beschreven verrijkingsprocedure aanbevolen (14). De verrijkte sedimenten worden in de vaten aangebracht, waaraan voldoende bovenliggend water wordt toegevoegd om te zorgen voor een volumeverhouding van 1:4 tussen het sediment en het water (zie punten 11 en 15). De sedimentlaag moet een dikte van 1,5 tot 3 cm hebben. Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn. 23. De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdampingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie worden aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden gebruikt. Stabilisatie 24. Nadat het verrijkte sediment met bovenliggend water is voorbereid, is het wenselijk de teststof zich te laten verdelen uit de waterfase naar het sediment (3)(4)(6)(13). Dit moet bij voorkeur gebeuren onder de in de test heersende temperatuur- en beluchtingsomstandigheden. De tijd die nodig is voor equilibratie hangt af van het sediment en de stof en kan variëren van enkele uren tot verscheidene dagen en soms zelfs weken (vier-vijf weken). Aangezien veel stoffen ondertussen zouden kunnen afbreken, wordt niet gewacht tot een evenwicht is ontstaan, maar wordt een equilibratieperiode van 48 uur aanbevolen. Aan het eind van deze nadere equilibratieperiode wordt in het bovenliggende water, het poriewater en het sediment, bij ten minste de hoogste en een lagere concentratie, de concentratie van de teststof gemeten (zie punt 38). Op basis van deze analysen van de teststof kan de massabalans worden berekend en kunnen de resultaten als gemeten concentraties worden uitgedrukt. Toevoeging van testorganismen 25. Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn gelegd (twee tot drie dagen voor Chironomus riparius bij 20 °C en één tot vier dagen voor Chironomus tentans bij 23 °C en Chironomus yoshimatsui bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste stadium (2-3 of 1-4 dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6). 26. Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet willekeurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 25 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 voor de NOEC-bepaling. Testconcentraties 27. Om het concentratiebereik van de test te bepalen kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid per Chironomus als in de eigenlijke test, worden de Chironomidae aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen duplo’s vereist. 28. De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uitkomsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en met 20. Controlegroep 29. De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19 en 20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een controlegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd. Testsysteem 30. Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verversing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorganisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijkomende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur. Voedsel 31. De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor C. yoshimatsui). Oudere larven kunnen iets meer voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatieperiode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel (Urtica dioica), witte moerbei (Morus alba), witte klaver (Trifolium repens), spinazie (Spinacia oleracea) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose). Incubatieomstandigheden 32. In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten. 33. De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). Voor C. tentans en C. yoshimatsui bedraagt de aanbevolen temperatuur respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux. Blootstellingsduur 34. De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 65 dagen voor C. tentans. Als eerder muggen uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de controlegroep. Waarnemingen Uitkomst van muggen 35. De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes. 36. De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. verlating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de controlegroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoeveel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzingen voor de meting van het uitkomen. Groei en overleving 37. Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voortzetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor „dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele drooggewicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicranium van elk individu te meten. Analytische bepalingen Concentratie van de teststof 38. Voor aanvang van de test (d.w.z. voordat de larven worden toegevoegd) worden uit ten minste één vat per behandeling monsters van het bulksediment genomen om de concentratie van de teststof in het sediment analytisch te bepalen. Aanbevolen wordt ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sediment te analyseren bij het begin (zie punt 24) en eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem. 39. Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet voor biologische waarnemingen zijn gebruikt. 40. Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoorbeeld 30 minuten bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is. Fysisch-chemische eigenschappen 41. De pH en temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de hoogste concentratie. GEGEVENS EN RAPPORTAGE Verwerking van de resultaten 42. Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overleving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resultaten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ2-r × 2-toets. Zo nodig worden na tien dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald. 43. Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten sedimentconcentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die gebaseerd zijn op en uitgedrukt worden als drooggewicht. 44. Voor de berekening van een puntschatting voor de EC50 of enige andere ECx kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke ECx moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aangetoond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwadratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransformeerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de ECx-waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetransformeerd naar de oorspronkelijke waarde. 45. Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn. Uitkomstquotiënt 46. Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toegepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt. 47. Het aantal uitgekomen muggen per vat, ne, wordt bepaald en gedeeld door het aantal in het vat gestopte larven, na: waarbij: ER = uitkomstquotiënt (emergence ratio); ne = aantal uitgekomen muggen per vat; na = aantal larven dat in één vat is gestopt. 48. Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquotiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd monsters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf. 49. Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een Freeman-Tukey-transformatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin–1) van de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen. 50. Voor uitkomstquotiënten worden de ECx-waarden berekend door middel van regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt. Ontwikkelingstempo 51. Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uitkomt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet rekening worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwikkelingstijd (eenheid: dag–1) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametrische testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikkelingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue respons kunnen ECx = waarden worden geschat door middel van regressieanalyse (bv. (23)(24)). 52. Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijdsinterval tussen dag x en dag x- l ( l = lengte van het inspectie-interval, doorgaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat ( ) wordt als volgt berekend: waarbij: : gemiddeld ontwikkelingstempo per vat; i : index van het inspectie-interval; m : maximumaantal inspectie-intervallen; : in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen; ne : totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef (= ) xi : ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen; waarbij dayi : inspectiedag (dagen na aanbrengen); li : lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag). Testverslag 53. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: — fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (oplosbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem (of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.); — identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, structuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof. Diersoort: — gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden; — informatie over de hantering van eipakketten en larven; — leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten werden gestopt. Testomstandigheden: — gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment; — voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sedimentmonsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing); — bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen (gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test); — bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigenschappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het begin van de test); — dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water; — volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte sediment met en zonder poriewater; — testvaten (materiaal en afmetingen); — sedimentverrijkingsmethode: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s en eventueel gebruik van oplosmiddel; — evenwichtsstabiliseringsfase van het verrijkte sediment-watersysteem: duur en omstandigheden; — incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, beluchting (frequentie en intensiteit); — details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoeveelheid en voederregime. Resultaten: — de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resultaten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen; — kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, hardheid en ammonia; — vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing; — aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per dag; — aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat; — gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per stadium, indien van toepassing; — percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd); — gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd); — schattingen van toxische eindpunten, bv. ECx (met bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische methoden waarmee zij zijn bepaald; — bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode. LITERATUUR: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Testmethode C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen. (15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Aanhangsel 1 DEFINITIES Voor de toepassing van deze testmethode wordt verstaan onder: kunstmatig sediment (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst; „bovenliggend water”: het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten; „poriewater” (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen de sediment- en bodemdeeltjes; „verrijkt sediment”: sediment waaraan teststof is toegevoegd; „teststof”: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels. Aanhangsel 2 Aanbevelingen voor de kweek van Chironomus riparius 1. Larven van Chironomus kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag geschikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uitdroging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 x 30 x 30 cm). 2. De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht (intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren. Verdunningswater 3. Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebruikelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen. Toediening van voedsel aan larven 4. De larven van Chironomus worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven. 5. Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweekmedium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toediening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden. 6. Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van groene algen (bv. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) worden toegevoegd. Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen 7. Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplossing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen volwassen muggen. Uitkomst van muggen 8. In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes. Eipakketten 9. Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle larvenkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwijderd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests gebruikt. 10. Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen. Inrichting van nieuwe kweekvaten 11. Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn een keer per week, of minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer. Bereiding van de testoplossingen M4 en M7 12. Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 en K2HPO4 niet geschikt zijn. Bereiding van het medium M7 13. Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het medium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid door overeenkomstig tabel 3 drie vitaminen toe te voegen aan gedeïoniseerd water; kort voor gebruik wordt 0,1 ml van de gecombineerde vitaminestamoplossing aan het definitieve medium M7 toegevoegd (de vitaminestamoplossing wordt in bevroren toestand in kleine porties bewaard.) Het medium wordt belucht en gestabiliseerd. LITERATUUR: BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. Tabel 1 Stamoplossingen van spoorelementen voor de media M4 en M7 Stamoplossingen (I) Hoeveelheid (mg) aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water Gecombineerde stamoplossing (II) bereiden door de volgende hoeveelheden (ml) van de stamoplossingen (I) te mengen en tot 1 liter gedeïoniseerd water aan te vullen Uiteindelijke concentraties in testoplossingen (mg/l) M4 M7 M4 M7 H3BO3 (15) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 MnCl2 · 4 H2O (15) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 LiCl (15) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 RbCl (15) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 SrCl2 · 6 H2O (15) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 NaBr (15) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 Na2MoO4 · 2 H2O (15) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 CuCl2 · 2 H2O (15) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 ZnCl2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 CaCl2 · 6 H2O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 Na2SeO3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 NH4VO3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 Na2EDTA · 2 H2O (15) (16) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 FeSO4 · 7 H2O (15) (16) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249

Tabel 2 Stamoplossingen van macronutriënten voor de media M4 en M7 Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water (mg) Hoeveelheid stamoplossing van macronutriënten die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden (ml/l) Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7 (mg/l) CaCl2 · 2 H2O 293 800 1,0 293,8 MgSO4 · 7 H2O 246 600 0,5 123,3 KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO3 64 800 1,0 64,8 NaSiO3 · 9 H2O 50 000 0,2 10,0 NaNO3 2 740 0,1 0,274 KH2PO4 1 430 0,1 0,143 K2HPO4 1 840 0,1 0,184

Tabel 3 Vitaminestamoplossing voor de media M4 en M7. De drie vitamineoplossingen worden tot één vitaminestamoplossing samengevoegd Hoeveelheid aangevuld tot 1 liter gedeïoniseerd water (mg) Hoeveelheid vitaminestamoplossing die wordt toegevoegd om de media M4 en M7 te bereiden (ml/l) Uiteindelijke concentraties in de testoplossingen M4 en M7 (mg/l) Thiaminehydrochloride 750 0,1 0,075 Cyanocobalamine (B12) 10 0,1 0,0010 Biotine 7,5 0,1 0,00075 LITERATUUR: Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33. Elendt, B.P. & W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167. Aanhangsel 3 BEREIDING VAN KUNSTMATIG SEDIMENT Samenstelling van het sediment Het kunstmatige sediment wordt als volgt samengesteld: Bestanddeel Eigenschappen % van het sediment (drooggewicht) Turf Veenmosturf, zo dicht mogelijk bij pH 5,5-6,0, zonder zichtbare plantenresten, fijngemalen (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) en aan de lucht gedroogd 4-5 Kwartszand Korrelgrootte: > 50 % van de deeltjes moet binnen het bereik 50-200 μm liggen 75-76 Kaolienklei Met ≥ 30 % kaoliniet 20 Organische koolstof Aangepast door toevoeging van turf en zand 2 (± 0,5) Calciumcarbonaat CaCO3, poedervormig, chemisch zuiver 0,05-0,1 Water Geleidbaarheid ≤ 10 μS/cm 30-50 Bereiding De turf wordt aan de lucht gedroogd en tot een fijn poeder vermalen. Er wordt een suspensie van de vereiste hoeveelheid turfpoeder in gedeïoniseerd water bereid met een kwalitatief hoogwaardig homogeniseerapparaat. De pH van deze suspensie wordt met CaCO3 aangepast tot 5,5 ± 0,5. De suspensie wordt ten minste twee dagen lang onder zachtjes roeren bij 20 ± 2 °C geconditioneerd om de pH te stabiliseren en een stabiele microbiële component te verkrijgen. De pH wordt opnieuw gemeten en moet nu 6,0 ± 0,5 bedragen. Vervolgens wordt de turfsuspensie met de andere bestanddelen (zand en kaolienklei) en gedeïoniseerd water vermengd om een homogeen sediment te verkrijgen met een watergehalte van 30-50 % van het drooggewicht van het sediment. De pH van het uiteindelijke mengsel wordt nogmaals gemeten en zo nodig met CaCO3 tot 6,5-7,5 aangepast. Er worden monsters van het sediment genomen om het drooggewicht en het gehalte aan organische koolstof te bepalen. Aanbevolen wordt het kunstmatige sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Opslag De droge bestanddelen voor de bereiding van het kunstmatige sediment kunnen op een droge en koele plaats bij kamertemperatuur worden bewaard. Het kunstmatige (natte) sediment mag niet worden opgeslagen voordat het in de test wordt gebruikt. Het moet onmiddellijk na afloop van de zevendaagse conditioneringsperiode die de bereiding afsluit, worden gebruikt. LITERATUUR: Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen. Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20. Aanhangsel 4 Chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater Stof Concentraties Vaste deeltjes < 20 mg/l Totaalgehalte aan organische koolstof < 2 mg/l Niet-geïoniseerde ammonia < 1 μg/l Hardheid uitgedrukt als CaCO3 < 400 mg/l (17) Restchloorgehalte < 10 μg/l Totaalgehalte aan organofosfor-pesticiden < 50 ng/l Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en polychloorbifenylen < 50 ng/l Totaalgehalte aan organisch chloor < 25 ng/l Aanhangsel 5 Richtsnoeren voor de monitoring van het uitkomen van larven van chiromidae Op de testglazen worden „emergence traps” geplaatst. Deze vallen zijn vanaf dag 20 tot het eind van de test nodig. Onderstaande tekening toont een voorbeeld van een gebruikte val: A: nylon hor B: omgekeerde kunststofbekers C: bekerglas zonder tuit D: openingen met hor voor wateruitwisseling E: water F: sediment C.28. TEST TER BEPALING VAN DE TOXICITEIT VOOR CHIRONOMIDEA IN SEDIMENT EN WATER M.BV VERRIJKT WATER INLEIDING 1. Deze methode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 219 (2004) van de OESO. De testmethode is bedoeld om de effecten te bepalen van langdurige blootstelling van in het sediment levende larven van tweevleugelige zoetwaterinsecten van Chironomus spp. aan stoffen. Zij berust hoofdzakelijk op de BBA-richtsnoeren en maakt gebruik van een testsysteem van sediment en water met kunstmatige grond en een blootstellingsscenario voor de waterkolom (1). De methode houdt ook rekening met de bestaande toxiciteitstestprotocollen voor Chironomus riparius en Chironomus tentans die in Europa en Noord-Amerika zijn ontwikkeld (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) en aan een ringonderzoek zijn onderworpen (1)(6)(9). Er kunnen ook andere goed gedocumenteerde Chironomidae worden gebruikt, bijvoorbeeld Chironomus yoshimatsui (10)(11). 2. Bij het in deze testmethode gebruikte blootstellingsscenario wordt gebruikgemaakt van verrijkt water. De selectie van het juiste blootstellingsscenario hangt af van het beoogde doel van de test. Het waterblootstellingsscenario, waarbij de waterkolom wordt verrijkt, is bedoeld om een gebeurtenis na te bootsen waarbij een gespoten bestrijdingsmiddel overwaait; het scenario heeft betrekking op de initiële concentratiepiek in het poriewater. Dit scenario is ook bruikbaar voor andersoortige blootstelling (waaronder weglekkende chemische stoffen), maar niet voor accumulatieprocessen die langer duren dan de testperiode. 3. De stoffen die moeten worden getest voor in het sediment levende organismen, zijn gewoonlijk gedurende lange tijd persistent in dit compartiment. De in het sediment levende organismen kunnen via een aantal routes worden blootgesteld. Het relatieve belang van elke blootstellingsroute en de tijd die voor de bijdrage aan de algehele toxische effecten via elke route wordt genomen, hangen af van de fysisch-chemische eigenschappen van de betrokken stof. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan, kan ingestie van besmet voedsel een belangrijke blootstellingsroute zijn. Om de toxiciteit van zeer lipofiele stoffen niet te onderschatten, kan worden overwogen vóór aanbrenging van de teststof voedsel aan het sediment toe te voegen. Om rekening te houden met alle mogelijke blootstellingsroutes, ligt de nadruk bij deze testmethode op langdurige blootstelling. De testduur bedraagt 20-28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 28-65 dagen voor C. tentans. Als voor een specifiek doel, bijvoorbeeld om de effecten van onstabiele stoffen te onderzoeken, kortetermijngegevens vereist zijn, kunnen na een periode van tien dagen aanvullende duplo’s worden verwijderd. 4. De gemeten eindpunten zijn het totale aantal tot adult ontwikkelde dieren en de hiervoor benodigde tijd. Als aanvullende kortetermijngegevens vereist zijn, wordt aanbevolen de overleving en de groei van de larven pas te meten na een periode van tien dagen en zo nodig aanvullende duplo’s te gebruiken. 5. Het gebruik van kunstmatig sediment wordt aanbevolen. Kunstmatig sediment heeft verschillende voordelen ten opzichte van natuurlijke sedimenten: — de experimentele variabiliteit wordt beperkt omdat het een reproduceerbare „genormaliseerde matrix” vormt en niet gezocht hoeft te worden naar niet-besmette schone sedimentbronnen; — het testsediment kent geen seizoensveranderingen en op ieder moment kunnen tests worden gestart; het sediment hoeft niet te worden voorbehandeld om inheemse fauna te verwijderen; het gebruik van kunstmatig sediment beperkt ook de kosten aangezien geen sediment in het veld hoeft te worden verzameld voor routinetests; — door het gebruik van kunstmatig sediment is de toxiciteit van stoffen vergelijkbaar en kunnen stoffen dienovereenkomstig worden gerangschikt: voor verscheidene stoffen zijn de toxiciteitsgegevens uit tests met natuurlijk en kunstmatig sediment vergelijkbaar gebleken (2). 6. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 7. Larven in het eerste stadium van Chironomidae worden in sediment-watersystemen aan een concentratiebereik van de teststof blootgesteld. De test begint op het moment waarop de larven in het eerste stadium in de testbekers met het sediment-watersysteem worden gestopt, waarna het water met de teststof wordt verrijkt. Aan het eind van de test worden het uitkomstquotiënt en het ontwikkelingstempo van Chironomidae gemeten. Zo nodig kunnen tevens na tien dagen de overleving en het gewicht van de larven worden bepaald (hiervoor kunnen zo nodig aanvullende duplo’s worden gebruikt). Deze gegevens worden geanalyseerd door hetzij met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het uitkomen, de overleving of de groei van larven met x % (bv. EC15, EC50 enz.), hetzij een statistische hypothese te toetsen om een NOEC/LOEC te bepalen. In het laatste geval worden de effectwaarden door middel van statistische toetsen met controlewaarden vergeleken. GEGEVENS OVER DE TESTSTOF 8. De oplosbaarheid in water van de teststof, de dampspanning ervan, de gemeten of berekende verdeling in sediment en de stabiliteit in water en sediment moeten bekend zijn. Er moet een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en detectiegrens, beschikbaar zijn voor de kwantitatieve bepaling van de teststof in bovenliggend water, poriewater en sediment. Andere nuttige informatie zijn de structuurformule en de zuiverheid van de teststof. Ook het uiteindelijke chemische lot van de teststof (bv. dissipatie, niet-biologische en biologische afbraak enz.) is nuttige informatie. Nadere richtsnoeren voor het testen van stoffen met zodanige fysisch-chemische eigenschappen dat de uitvoering van de test problematisch is, zijn in (12) opgenomen. REFERENTIESTOFFEN 9. Er kunnen regelmatig tests met referentiestoffen worden uitgevoerd om de betrouwbaarheid van het testprotocol en de testomstandigheden te waarborgen. Voorbeelden van toxische referentiestoffen die met succes in ringonderzoek en valideringsstudies zijn gebruikt, zijn: lindaan, trifluralin, pentachloorfenol, cadmiumchloride en kaliumchloride (1)(2)(5)(6)(13). GELDIGHEID VAN DE TEST 10. De test is alleen geldig als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan: — het uitkomstpercentage in de controlegroepen moet aan het eind van de test ten minste 70 % zijn (1)(6); — de ontwikkeling tot adult van de in de controlevaten gestopte C. riparius en C. yoshimatsui moet binnen 12 tot 23 dagen plaatsvinden; voor C. tentans is een periode van 20 tot 65 dagen nodig; — aan het eind van de test worden de pH en het gehalte aan opgeloste zuurstof in elk vat gemeten. Het zuurstofgehalte moet ten minste 60 % bedragen van de verzadigingswaarde van lucht (ASV) bij de heersende temperatuur en het bovenliggende water moet in alle testvaten een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben; — de watertemperatuur mag niet met meer dan ± 1,0 °C afwijken. De watertemperatuur kan worden geregeld door een isotherme kamer te gebruiken; in dat geval wordt de kamertemperatuur met passende tussenpozen bevestigd. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Testvaten 11. De studie wordt uitgevoerd in bekerglazen met een inhoud van 600 ml en een diameter van 8 cm. Ook andere vaten kunnen geschikt zijn, mits zij voldoende diep zijn voor het bovenliggende water en het sediment. Het sedimentoppervlak moet ten minste 2 tot 3 cm2 per larve bedragen. De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het bovenliggende water moet 1:4 zijn. Testvaten en andere apparatuur die in contact met het testsysteem komt, moeten volledig van glas of een ander chemisch inert materiaal zijn gemaakt (bv. teflon). Keuze van de soorten 12. Als testsoort heeft Chironomus riparius de voorkeur. Chironomus tentans is ook geschikt maar is lastiger in het gebruik en vergt een lagere testperiode. Chironomus yoshimatsui mag ook worden gebruikt. Aanhangsel 2 bevat bijzonderheden over de kweekmethoden van Chironomus riparius. Er is ook informatie beschikbaar over de kweekomstandigheden van andere soorten, namelijk Chironomus tentans (4) en Chironomus yoshimatsui (11). Vóór de test moet de identificatie van de soorten worden bevestigd; als de organismen uit eigen kweek afkomstig zijn, is geen bevestiging voorafgaand aan iedere test nodig. Sediment 13. Er wordt bij voorkeur kunstmatig sediment gebruikt (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd). Als echter natuurlijk sediment wordt gebruikt, moet dit worden gekarakteriseerd (ten minste pH en gehalte aan organische koolstof; bepaling van parameters als C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling worden eveneens aanbevolen) en moet het vrij zijn van verontreinigingen en andere organismen die de Chironomidae zouden kunnen beconcurreren of consumeren. Ook wordt aanbevolen het natuurlijke sediment, voordat het in een test ter bepaling van de toxiciteit voor Chironomidae wordt gebruikt, zeven dagen te laten rusten onder dezelfde omstandigheden die ook in de test zullen heersen. Voor deze test wordt sediment aanbevolen dat op basis van de in testmethode C.8 (14) gebruikte kunstmatige grond als volgt is samengesteld (1)(15)(16): a) 4-5 % (drooggewicht) turf: de pH moet zo dicht mogelijk bij 5,5 tot 6,0 liggen; het is belangrijk dat fijngemalen turf in poedervorm (deeltjesgrootte ≤ 1 mm) wordt gebruikt dat alleen aan de lucht is gedroogd; b) 20 % (drooggewicht) kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet); c) 75-76 % (drooggewicht) kwartszand (overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 μm hebben); d) er wordt gedeïoniseerd water toegevoegd om het uiteindelijke mengsel een vochtgehalte van 30-50 % te geven; e) er wordt chemisch zuiver calciumcarbonaat (CaCO3) toegevoegd om het uiteindelijke sedimentmengsel een pH van 7,0 ± 0,5 te geven. f) Het gehalte aan organische koolstof van het uiteindelijke mengsel moet 2 % (± 0,5 %) bedragen en moet worden aangepast door toevoeging van extra turf en zand overeenkomstig a) en c). 14. De bron van de turf, de kaolienklei en het zand moet bekend zijn. De bestanddelen van het sediment moeten worden gecontroleerd op verontreiniging met chemische stoffen (bv. zware metalen, organische chloor- en fosforverbindingen enz.). In aanhangsel 3 wordt een voorbeeld gegeven van de bereiding van kunstmatig sediment. Menging van droge bestanddelen is ook aanvaardbaar, mits wordt aangetoond dat na toevoeging van het bovenliggende water geen scheiding van de bestanddelen van het sediment plaatsvindt (bv. door drijvende turfdeeltjes) en dat de turf of het sediment voldoende geconditioneerd is. Water 15. Elk water dat aan de in de aanhangsels 2 en 4 vermelde chemische eigenschappen van aanvaardbaar verdunningswater voldoet, is geschikt als testwater. Als kweek- en testwater is elk geschikt water, natuurlijk water (oppervlakte- of grondwater), synthetisch water (zie aanhangsel 2) of ontchloord kraanwater aanvaardbaar, mits de Chironomidae daarin gedurende het kweken en testen overleven zonder tekenen van stress te vertonen. Aan het begin van de test moet het testwater een pH-waarde tussen 6 en 9 hebben en mag de totale hardheid, uitgedrukt als CaCO3, niet hoger zijn dan 400 mg/l. Als echter een interactie tussen de hardheidsionen en de teststof wordt vermoed, moet water met een lagere hardheid worden gebruikt (en is Elendt-medium M4 dus ongeschikt). Voor de hele studie moet één soort water worden gebruikt. De in aanhangsel 4 vermelde kwaliteitskenmerken voor water moeten ten minste twee keer per jaar worden gemeten, of wanneer vermoed wordt dat een significante verandering heeft plaatsgevonden. Stamoplossingen — verrijkt water 16. De testconcentraties worden berekend op basis van de concentraties in de waterkolom, d.w.z. het boven het sediment liggende water. Testoplossingen van de gekozen concentraties worden gewoonlijk bereid door verdunning van een stamoplossing. De stamoplossingen worden bij voorkeur bereid door oplossing van de teststof in het testmedium. Het gebruik van oplosmiddelen of dispergeermiddelen kan in bepaalde gevallen nodig zijn om een stamoplossing van een passende concentratie te verkrijgen. Voorbeelden van geschikte oplosmiddelen zijn aceton, ethanol, methanol, ethyleenglycolmonoëthylether, ethyleenglycoldimethylether, dimethylformamide en triëthyleenglycol. Als dispergeermiddelen mogen Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcellulose en HCO-40 worden gebruikt. De concentratie van de solubilisator in het uiteindelijke testmedium moet minimaal zijn (d.w.z. ≤ 0,1 ml/l) en moet in elke testgroep gelijk zijn. Indien een solubilisator wordt gebruikt, mag dit geen significante effecten op de overleving hebben, noch een zichtbaar negatief effect op de Chironomidae-larven hebben, hetgeen blijkt uit de controlegroep met uitsluitend oplosmiddel. Het gebruik van deze stoffen moet echter zo veel mogelijk worden vermeden. TESTOPZET 17. De testopzet heeft betrekking op het aantal testconcentraties en de factor waarmee ze van elkaar verschillen, het aantal vaten per concentratieniveau en het aantal larven per vat. Er wordt een beschrijving gegeven van testopzetten voor de puntschatting van de EC, de schatting van de NOEC en de uitvoering van een limiettest. Regressieanalyse heeft de voorkeur boven toetsing van een hypothese. Opzet voor regressieanalyse 18. De in de test gebruikte concentraties moeten de effectconcentratie (bv. EC15 en EC50) en het concentratiebereik waarbinnen het effect van de teststof van belang is omvatten. In het algemeen nemen de nauwkeurigheid en in het bijzonder de geldigheid van schattingen van de effectconcentraties (ECx) toe als de effectconcentratie binnen het geteste concentratiebereik ligt. Extrapolaties ver onder de laagste positieve concentratie of boven de hoogste concentraties moeten worden vermeden. Om het concentratiebereik te kiezen, kan een preliminaire bereikbepalingstest worden uitgevoerd (zie punt 27). 19. Als een ECx-schatting moet worden gemaakt, worden ten minste vijf concentraties in triplo getest. In alle gevallen is het raadzaam bij voldoende concentraties te testen om een goede modelschatting mogelijk te maken. Het verschil tussen de concentraties mag niet meer dan factor 2 bedragen (als de dosis-responscurve een geringe helling vertoont, kan hiervan worden afgeweken). Het aantal duplo’s voor elke testgroep kan worden verlaagd wanneer het aantal testconcentraties met een verschillende respons wordt verhoogd. Als het aantal duplo’s wordt verhoogd of de intervallen tussen de testconcentraties worden verkleind, worden de betrouwbaarheidsintervallen van de test gewoonlijk kleiner. Als een schatting van de overleving en de groei van larven na tien dagen moet worden gemaakt, zijn aanvullende duplo’s vereist. Opzet voor de schatting van een NOEC/LOEC 20. Als een LOEC- of NOEC-schatting moet worden gemaakt, worden vijf concentraties getest met ten minste vier duplo’s en mag het verschil tussen de concentraties niet meer dan factor 2 bedragen. Het aantal duplo’s moet toereikend zijn om voldoende onderscheidend vermogen te waarborgen om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Het ontwikkelingstempo kan gewoonlijk worden bepaald met een variantieanalyse (ANOVA), zoals de toets van Dunnett of Williams (17)(18)(19)(20). Voor het uitkomstquotiënt kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (met correctie van Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. Limiettest 21. Als in de preliminaire bereikbepalingstest geen effecten zijn waargenomen, kan een limiettest worden uitgevoerd (één testconcentratie en controlegroep). De limiettest dient om aanwijzingen te verzamelen dat de toxische waarde van de teststof groter is dan de geteste limietconcentratie. Er kan geen concentratie voor deze testmethode worden aanbevolen; die wordt aan het oordeel van de regelgever overgelaten. Gewoonlijk zijn zes duplo’s voor zowel de testgroep als de controlegroep nodig. Aangetoond moet worden dat het onderscheidend vermogen groot genoeg is om een verschil van 20 % met de controlegroep te kunnen vaststellen bij een significantieniveau van 5 % (p = 0,05). Voor de meetrespons (ontwikkelingstempo en gewicht) is de T-toets een geschikte statistische methode, mits de gegevens aan de voorwaarden van deze toets voldoen (normale verdeling, homogene variantie). Als niet aan die voorwaarden wordt voldaan, kan de T-toets voor ongelijke variantie of een verdelingsvrije toets, zoals de Wilcoxon-Mann-Whitney-toets, worden gebruikt. Voor het uitkomstquotiënt is de exacte toets van Fisher geschikt. PROCEDURE Blootstellingsomstandigheden Voorbereiding van het verrijkt water-sedimentsysteem 22. In de testvaten wordt voldoende kunstmatig sediment (zie de punten 13-14 en aanhangsel 3) aangebracht om een laag van ten minste 1,5 cm te vormen. Vervolgens wordt een 6 cm diepe laag water toegevoegd (zie punt 15). De verhouding tussen de dikte van de sedimentlaag en de diepte van het water mag niet groter zijn dan 1:4 en de sedimentlaag mag niet dikker zijn dan 3 cm. Laat het sediment-watersysteem onder voorzichtige beluchting zeven dagen rusten voordat de testorganismen worden toegevoegd (zie punt 14 en aanhangsel 3). Om te voorkomen dat tijdens de toevoeging van testwater aan de waterkolom bestanddelen zich van het sediment afscheiden en fijn materiaal in suspensie wordt gebracht, kan het sediment tijdens het gieten worden afgedekt met een kunststof schijf, die onmiddellijk daarna wordt verwijderd. Ook andere middelen kunnen geschikt zijn. 23. De testvaten worden (bijvoorbeeld met glasplaten) bedekt. Om verdampingsverliezen te compenseren, kan het waterniveau tijdens de studie worden aangevuld tot het oorspronkelijke volume. Om te voorkomen dat zouten ontstaan, moet hiervoor gedestilleerd of gedeïoniseerd water worden gebruikt. Toevoeging van testorganismen 24. Vier tot vijf dagen voordat de testorganismen aan de testvaten worden toegevoegd, worden eipakketten uit de kweken genomen en in kleine vaten in een kweekmedium geplaatst. Er kan ouder medium uit de voorraadcultuur of vers bereid medium worden gebruikt. In het laatste geval wordt aan het kweekmedium een kleine hoeveelheid voedsel, zoals groene algen en/of enkele druppels filtraat uit een fijngemalen suspensie van visvoervlokken, toegevoegd (zie aanhangsel 2). Er worden alleen vers afgezette eipakketten gebruikt. Normaliter beginnen de larven enkele dagen nadat de eieren zijn gelegd (twee tot drie dagen voor Chironomus riparius bij 20 °C en één tot vier dagen voor Chironomus tentans bij 23 °C en Chironomus yoshimatsui bij 25 °C) uit te komen en vindt de groei van de larven plaats in vier stadia die elk vier-acht dagen duren. Voor de test worden larven in het eerste stadium (twee-drie of één-vier dagen na uitkomen) gebruikt. Het stadium van muggen kan mogelijk worden gecontroleerd aan de hand van de breedte van het epicranium (6). 25. Twintig larven in het eerste stadium worden met een stompe pipet willekeurig verdeeld over de testvaten met verrijkt sediment en water. Tijdens het inbrengen van de larven in de testvaten en de eerste 24 uur daarna wordt de beluchting van het water uitgezet (zie de punten 24 en 32). Afhankelijk van de testopzet (zie de punten 19 en 20) bedraagt het aantal larven dat per concentratie wordt gebruikt ten minste 60 voor de EC-puntschatting en 80 voor de NOEC-bepaling. 26. 24 uur na toevoeging van de larven wordt de bovenliggende waterkolom met de teststof verrijkt, waarna weer lichte beluchting wordt toegepast. Onder het wateroppervlak worden met een pipet kleine hoeveelheden van de teststofoplossing ingebracht. Vervolgens wordt het bovenliggende water voorzichtig gemengd, zonder het sediment te verstoren. Testconcentraties 27. Om het concentratiebereik van de test te bepalen, kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd. Daarvoor wordt een reeks sterk gespreide concentraties van de teststof gebruikt. Om te zorgen voor dezelfde oppervlaktedichtheid per Chironomus als in de eigenlijke test, worden de Chironomidae aan elke concentratie van de teststof blootgesteld gedurende een periode die een schatting van de wenselijke testconcentraties mogelijk maakt, en zijn geen duplo’s vereist. 28. De testconcentraties voor de eigenlijke test worden gebaseerd op de uitkomsten van de bereikbepalingstest. Er moeten ten minste vijf concentraties worden gebruikt en geselecteerd, zoals beschreven in de punten 18 tot en met 20. Controlegroep 29. De test omvat controlevaten zonder teststof maar met sediment, met het vereiste aantal duplo’s (zie de punten 19-20). Indien voor het aanbrengen van de teststof een oplosmiddel is gebruikt (zie punt 16), wordt een controlegroep voor het oplosmiddel in het sediment toegevoegd. Testsysteem 30. Er worden statische systemen gebruikt. In uitzonderlijke gevallen kunnen semistatische of doorstroomsystemen met onderbroken of continue verversing van het bovenliggende water worden gebruikt, bijvoorbeeld als de kwaliteitsspecificaties voor het water niet geschikt zijn voor het testorganisme of het chemische evenwicht wordt aangetast (te laag gehalte opgeloste zuurstof, te hoge concentratie excretieproducten, uit het sediment vrijkomende mineralen, gewijzigde pH en/of waterhardheid enz.). Gewoonlijk kan de kwaliteit van het bovenliggende water echter met andere methoden, zoals beluchting, worden verbeterd; deze verdienen de voorkeur. Voedsel 31. De larven moeten, bij voorkeur dagelijks of ten minste drie keer per week, worden gevoerd. Voor jonge larven lijkt in de eerste tien dagen 0,25-0,5 mg visvoer (een suspensie in water of fijngemalen voedsel, bv. TetraMin of TetraPhyll; zie details in aanhangsel 2) per larve per dag voldoende te zijn (0,35-0,5 mg voor C. yoshimatsui). Oudere larven kunnen iets meer voedsel nodig hebben: tijdens de rest van de test zou 0,5-1 mg per larve per dag moeten volstaan. Als schimmelgroei wordt waargenomen of sterfte in de controlegroepen wordt geconstateerd, moet het voedselrantsoen in alle test- en controlegroepen worden verlaagd. Als de schimmelontwikkeling niet kan worden gestopt, moet de test worden herhaald. Voor sterk adsorberende stoffen (bijvoorbeeld met log Kow > 5) of voor stoffen die een covalente binding met het sediment aangaan kan de voor de overleving en natuurlijke groei van de organismen vereiste hoeveelheid voedsel vóór de stabilisatieperiode aan het kunstmatige sediment worden toegevoegd. In dat geval wordt in plaats van visvoer plantaardig materiaal gebruikt, bv. 0,5 % (drooggewicht) fijngemalen bladeren van bv. brandnetel (Urtica dioica), witte moerbei (Morus alba), witte klaver (Trifolium repens), spinazie (Spinacia oleracea) of ander plantaardig materiaal (Cerophyl of alfacellulose). Incubatieomstandigheden 32. In het bovenliggende water in de testvaten wordt bij voorkeur 24 uur na toevoeging van de larven voorzichtige beluchting toegepast en gedurende de test voortgezet (waarbij erop moet worden gelet dat het gehalte aan opgeloste zuurstof niet lager wordt dan 60 % van de ASV). De beluchting vindt plaats via een glazen pasteurpipet die 2-3 cm boven de sedimentlaag wordt bevestigd (bv. één of enkele luchtbellen/s). Als vluchtige stoffen worden getest, kan worden overgewogen het sediment-watersysteem niet te beluchten. 33. De test wordt verricht bij een constante temperatuur van 20 °C (± 2 °C). Voor C. tentans en C. yoshimatsui bedraagt de aanbevolen temperatuur respectievelijk 23 °C en 25 °C (± 2 °C). Er wordt een fotoperiode van 16 uur gebruikt bij een lichtintensiteit van 500 tot 1 000 lux. Blootstellingsduur 34. De blootstelling begint bij toevoeging van larven aan de verrijkte vaten en de controlevaten. De maximale blootstellingsduur bedraagt 28 dagen voor C. riparius en C. yoshimatsui, en 65 dagen voor C. tentans. Als eerder muggen uitkomen, kan de test worden beëindigd nadat minimaal vijf dagen zijn verstreken na verschijning van de laatste volwassen mug in de controlegroep. WAARNEMINGEN Uitkomst van muggen 35. De ontwikkelingstijd en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen worden bepaald. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes. 36. De testvaten worden ten minste drie keer per week geobserveerd om een visuele beoordeling van eventueel afwijkend gedrag te verrichten (bv. verlating van het sediment, ongewoon zwemgedrag), waarbij met de controlegroep wordt vergeleken. In de periode waarin verwacht wordt dat de muggen uitkomen, moet dagelijks een telling van de uitgekomen muggen worden verricht. Dagelijks worden het aantal volledig uitgekomen muggen en hun geslacht geregistreerd. Na identificatie worden de muggen uit de vaten verwijderd. Als er voor het eind van de test eipakketten zijn afgezet, worden deze geregistreerd en vervolgens verwijderd om te voorkomen dat opnieuw larven in het sediment terechtkomen. Ook wordt geregistreerd hoeveel zichtbare poppen niet zijn uitgekomen. Aanhangsel 5 bevat aanwijzingen voor de meting van het uitkomen. Groei en overleving 37. Als gegevens over de overleving en groei van larven na tien dagen vereist zijn, wordt bij het begin gezorgd voor extra testvaten, die voor de voortzetting worden gebruikt. Het sediment van deze aanvullende vaten wordt door een 250 μm-zeef gevoerd, zodat de larven overblijven. De criteria voor „dood” zijn immobiliteit of geen reactie op een mechanische prikkel. Niet meer aangetroffen larven moeten als dode larven worden geteld (aan het begin van de test gestorven larven kunnen door microben zijn afgebroken). Het (asvrije) drooggewicht van de overlevende larven per testvat wordt bepaald en op grond daarvan wordt het gemiddelde individuele drooggewicht per vat berekend. Het is nuttig om te bepalen in welk stadium de overlevende larven zich bevinden; dit kan door de breedte van het epicranium van elk individu te meten. Analytische bepalingen Concentratie van de teststof 38. Er moeten ten minste bij de hoogste en een lagere concentratie monsters van het bovenliggende water, het poriewater en het sediment worden geanalyseerd bij het begin (bij voorkeur een uur na inbrenging van de teststof) en eind van de test. Deze bepalingen van de concentratie van de teststof leveren informatie op over het gedrag en de verdeling van de teststof in het water-sedimentsysteem. Aangezien bemonstering van het sediment bij het begin van de test van invloed kan zijn op het testsysteem (bv. doordat de testlarven worden verwijderd), moeten voor de analytische bepalingen bij het begin van de test en tijdens de test zo nodig aanvullende testvaten worden gebruikt (zie punt 39). Als in een water/sedimentstudie onder vergelijkbare omstandigheden (bv. verhouding sediment/water, soort toepassing, organischekoolstofgehalte van het sediment) de verdeling van de teststof tussen het water en het sediment duidelijk is bepaald, kunnen metingen in het sediment niet noodzakelijk zijn. 39. Wanneer tussenliggende metingen worden verricht (bv. op dag 7) en voor de analyse grotere monsters nodig zijn die niet uit de testvaten kunnen worden genomen zonder het testsysteem te beïnvloeden, worden analytische bepalingen verricht op monsters uit aanvullende testvaten die op dezelfde wijze zijn behandeld (inclusief toevoeging van testorganismen), maar niet voor biologische waarnemingen zijn gebruikt. 40. Om het poriewater te isoleren, wordt aanbevolen te centrifugeren, bijvoorbeeld 30 min bij 10 000 g en een temperatuur van 4 °C. Filtratie kan ook aanvaardbaar zijn, mits aangetoond is dat de teststof niet aan filters adsorbeert. In sommige gevallen kan analyse van de concentraties in het poriewater onmogelijk zijn doordat het monster te klein is. Fysisch-chemische eigenschappen 41. De pH, het gehalte aan opgeloste zuurstof in het testwater en de temperatuur van de testvaten moeten op een geschikte wijze worden gemeten (zie punt 10). De hardheid en het ammoniagehalte moeten bij het begin en het eind van de test in de controlevaten en in één testvat worden gemeten bij de hoogste concentratie. GEGEVENS EN RAPPORTAGE Verwerking van de resultaten 42. Doel van deze test is het bepalen van het effect van de teststof op het ontwikkelingstempo en het totale aantal volledig uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen, of bij de tiendaagse test de effecten op de overleving en het gewicht van de larven. Als er geen aanwijzingen zijn voor een statistisch verschil in gevoeligheid tussen de geslachten, kunnen de resultaten voor mannetjes en vrouwtjes worden samengevoegd voor statistische analysen. Het verschil in gevoeligheid tussen de geslachten kan statistisch worden beoordeeld met bv. een χ2-r × 2 -toets. Zo nodig worden na tien dagen de overleving en het gemiddelde individuele drooggewicht per vat van de larven bepaald. 43. Bij voorkeur aan de hand van de bij het begin van de test gemeten concentraties (zie punt 38) worden effectconcentraties berekend, die als concentratie in het bovenliggende water worden uitgedrukt. 44. Voor de berekening van een puntschatting voor de EC50 of enige andere ECx kunnen de gegevens per vat als echte replicaties worden gebruikt. Bij de berekening van een betrouwbaarheidsinterval voor elke ECx moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, tenzij wordt aangetoond dat deze verwaarloosbaar is. Wanneer voor het model de kleinstekwadratenmethode wordt toegepast, worden de gegevens per vat getransformeerd om de homogeniteit van de variantie te vergroten. Voordat de ECx-waarden worden berekend, moet de respons echter zijn teruggetransformeerd naar de oorspronkelijke waarde. 45. Wanneer de statistische analyse dient om de NOEC/LOEC te bepalen door toetsing van een hypothese, moet rekening worden gehouden met de variabiliteit tussen vaten, bv. met een geneste ANOVA. Als de gebruikelijke ANOVA-aannamen niet opgaan, kunnen robuustere tests (21) wenselijk zijn. Uitkomstquotiënt 46. Het uitkomstquotiënt betreft een binaire respons en kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens consistent zijn met die verwachting, worden geanalyseerd met de toets van Cochran-Armitage, toegepast met stapjes omlaag. Als dit niet het geval is, kan de exacte toets van Fisher of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt, met volgens Bonferroni-Holm gecorrigeerde p-waarden. Als er aanwijzingen zijn dat de variabiliteit tussen duplo’s met dezelfde concentratie groter is dan een binomiale verdeling zou uitwijzen (zogeheten „extrabinomiale” variantie), moet een robuuste toets van Cochran-Armitage of een exacte toets van Fisher, zoals voorgesteld in punt 21, worden gebruikt. 47. Het aantal uitgekomen muggen per vat, ne, wordt bepaald en gedeeld door het aantal in het vat gestopte larven, na: waarbij: ER = uitkomstquotiënt (emergence ratio); ne = aantal uitgekomen muggen per vat; na = aantal larven dat in één vat is gestopt. 48. Bij wijze van alternatief, dat vooral voor grote monsters geschikt is, kan, wanneer een monotone dosisrespons wordt verwacht en de gegevens over het uitkomstquotiënt consistent zijn met die verwachting, het uitkomstquotiënt in geval van extrabinomiale variantie als een continue respons worden behandeld en kunnen procedures als de toets van Williams worden gebruikt. Wanneer er geen sprake is van een monotone dosisrespons, kan de toets van Dunnett geschikt zijn. Als „grote” monsters worden hier beschouwd monsters waarvan per duplo (vat) zowel het aantal uitgekomen als het aantal niet-uitgekomen muggen groter is dan vijf. 49. Voordat ANOVA-methoden worden toegepast, moeten de waarden van het uitkomstquotiënt eerst een hoektransformatie of een freeman-tukeytransformatie ondergaan om een approximatieve normale verdeling te verkrijgen en de variantie te egaliseren. Wanneer de absolute frequenties worden gebruikt, kan de toets van Cochran-Armitage, de exacte toets van Fisher (Bonferroni) of de toets van Mantel-Haenszel worden gebruikt. De hoektransformatie wordt uitgevoerd door de arcsinus (sin–1) van de vierkantswortel van het uitkomstquotiënt te nemen. 50. Voor uitkomstquotiënten worden de ECx-waarden berekend door middel van regressieanalyse (of bv. probit (22), logit, Weibull, geschikte commerciële software enz.). Als geen regressieanalyse mogelijk is (bv. als er minder dan twee partiële responsen zijn), worden andere niet-parametrische methoden, zoals voortschrijdend gemiddelde of eenvoudige interpolatie, gebruikt. Ontwikkelingstempo 51. Met de gemiddelde ontwikkelingstijd wordt bedoeld de gemiddelde tijd tussen het moment waarop de larven in het vat worden gestopt (dag 0 van de test) en het moment waarop de experimentele cohort muggen uitkomt (voor de berekening van de werkelijke ontwikkelingstijd moet rekening worden gehouden met de leeftijd van de larven op het moment van inbrengen). Het ontwikkelingstempo is de reciproke waarde van de ontwikkelingstijd (eenheid: dag–1) en staat voor het deel van de larvenontwikkeling dat per dag plaatsvindt. Het ontwikkelingstempo heeft de voorkeur voor de evaluatie van deze sedimenttoxiciteitsstudies, omdat deze in vergelijking met de ontwikkelingstijd een kleinere variantie en een grotere homogeniteit heeft en de normale verdeling beter benadert. Daarom kunnen sterke parametrische testprocedures beter op het ontwikkelingstempo dan op de ontwikkelingstijd worden toegepast. Voor het ontwikkelingstempo als continue respons kunnen ECx = waarden worden geschat door middel van regressieanalyse (bv. (23)(24)). 52. Bij de volgende statistische tests wordt aangenomen dat het op inspectiedag x waargenomen aantal muggen is uitgekomen in het midden van het tijdsinterval tussen dag x en dag x- l ( l = lengte van het inspectie-interval, doorgaans één dag). Het gemiddelde ontwikkelingstempo per vat ( ) wordt als volgt berekend: waarbij: : gemiddeld ontwikkelingstempo per vat; i : index van het inspectie-interval; m : maximumaantal inspectie-intervallen; : in inspectie-interval i uitgekomen aantal muggen; ne : totaal aantal uitgekomen muggen aan het eind van de proef ( ) xi : ontwikkelingstempo van de in interval i uitgekomen muggen; waarbij: dayi : inspectiedag (dagen na aanbrengen); li : lengte van inspectie-interval i (dagen, gewoonlijk één dag). Testverslag 53. In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: — fysische toestand en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken (oplosbaarheid in water, dampspanning, verdelingscoëfficiënt in de bodem (of in sediment, indien beschikbaar), stabiliteit in water enz.); — identificatiegegevens van de stof (triviale naam, chemische naam, structuurformule, CAS-nummer enz.) met inbegrip van de zuiverheid en de analysemethode voor de kwantitatieve bepaling van de teststof. Diersoort: — gebruikte proefdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden; — informatie over de hantering van eipakketten en larven; — leeftijd van de proefdieren op het moment waarop zij in de testvaten werden gestopt. Testomstandigheden: — gebruikt sediment, d.w.z. natuurlijk of kunstmatig sediment; — voor natuurlijk sediment: de locatie en beschrijving van de sedimentmonsternemingsplaats inclusief, indien mogelijk, vervuilingsgeschiedenis; eigenschappen: pH, gehalte aan organische koolstof, C/N-verhouding en korrelgrootteverdeling (indien van toepassing); — bereiding van het kunstmatige sediment: ingrediënten en eigenschappen (gehalte aan organische koolstof, pH, vocht enz. bij het begin van de test); — bereiding van het testwater (bij gebruik van synthetisch water) en eigenschappen (zuurstofgehalte, pH, geleidbaarheid, hardheid enz. bij het begin van de test); — dikte van de sedimentlaag en diepte van het bovenliggende water; — volume van het bovenliggende en poriewater; gewicht van het natte sediment met en zonder poriewater; — testvaten (materiaal en afmetingen); — bereidingswijze van stamoplossingen en testconcentraties; — aanbrenging van de teststof: toegepaste testconcentraties, aantal duplo’s en eventueel gebruik van oplosmiddel; — incubatieomstandigheden: temperatuur, lichtcyclus en -intensiteit, beluchting (frequentie en intensiteit); — details over het voedsel, met inbegrip van soort voedsel, bereiding, hoeveelheid en voederregime. Resultaten: — de nominale testconcentraties, de gemeten testconcentraties en de resultaten van alle analysen die zijn verricht om de concentratie van de teststof in het testvat te bepalen; — kwaliteit van het water in de testvaten, d.w.z. pH, temperatuur, opgeloste zuurstof, hardheid en ammonia; — vervanging van verdampt testwater, indien van toepassing; — aantal uitgekomen mannelijke en vrouwelijke muggen per vat en per dag; — aantal niet tot mug ontwikkelde larven per vat; — gemiddeld individueel drooggewicht van de larven per vat, en per stadium, indien van toepassing; — percentage uitgekomen muggen per vat en testconcentratie (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd); — gemiddeld ontwikkelingstempo van volledig uitgekomen muggen per duplo en behandeling (mannelijke en vrouwelijke muggen gecombineerd); — schattingen van toxische eindpunten, bv. ECx (met bijbehorende betrouwbaarheidsintervallen), NOEC en/of LOEC, en de statistische methoden waarmee zij zijn bepaald; — bespreking van de resultaten, met inbegrip van een eventuele beïnvloeding van de resultaten van de test die een gevolg is van afwijkingen van deze testmethode. LITERATUUR: (1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995. (2) Fleming R et al. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Final Report to them European Commission. Report No: EC 3738. August 1994. WRc, UK. (3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. From the WOSTA Workshop held in the Netherlands. (4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA. (5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. December 1997. (6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Second edition. EPA 600/R-99/064. March 2000. Revision to the first edition dated June 1994. (7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates. (8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test. (9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Canada. (10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350. (11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57. (12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 23. (13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. September 1995. (14) Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen. (15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175. (16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303. (17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121. (18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491. (19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117. (20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531. (21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48:577-585. (22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221. (23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11:1485-1494. (24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312. Aanhangsel 1 DEFINITIES Voor de toepassing van deze methode wordt verstaan onder: Kunstmatig sediment (ook wel bereid, gereconstitueerd of synthetisch sediment genoemd): een mengsel van materialen waarmee de fysische bestanddelen van natuurlijk sediment worden nagebootst. Bovenliggend water: het water dat in het testvat op het sediment wordt gegoten. Poriewater (ook wel interstitieel water genoemd): het water in de ruimten tussen de sediment- en bodemdeeltjes. Verrijkt water: testwater waaraan teststof is toegevoegd. Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen en mengsels. Aanhangsel 2 Aanbevelingen voor de kweek van Chironomus riparius 1. Larven van Chironomus kunnen worden gekweekt in kristalliseerschalen of grotere houders. Op de bodem van de houder wordt een 5 tot 10 mm dikke laag fijn kwartszand gestrooid. Ook kiezelgoer (bv. Merck, Art 8117) is geschikt gebleken als substraat (in dat geval volstaat een dunnere laag van slechts enkele mm). Vervolgens wordt een enkele cm diepe laag geschikt water toegevoegd. Om verdampingsverliezen te compenseren en uitdroging te voorkomen, worden de waterniveaus zo nodig aangevuld. Indien nodig kan het water worden vervangen. Er wordt voorzichtige beluchting toegepast. De larvenkweekvaten worden in een geschikte kooi geplaatst, zodat de volwassen muggen niet kunnen ontsnappen. De kooi moet groot genoeg zijn om de uitgekomen volwassen muggen te laten zwermen, omdat anders mogelijk niet wordt gecopuleerd (ten minste ca. 30 × 30 × 30 cm). 2. De kooien worden op kamertemperatuur of in een kamer met een constant klimaat bij 20 ± 2 °C gehouden, met een lichtregime van 16 uur licht (intensiteit ca. 1 000 lux), 8 uur donker. Gerapporteerd is dat een relatieve luchtvochtigheid van minder dan 60 % de voortplanting kan belemmeren. Verdunningswater 3. Elk geschikt natuurlijk of synthetisch water kan worden gebruikt. Gebruikelijk zijn bronwater, ontchloord kraanwater en kunstmatige media (bv. Elendt-media M4 en M7, zie hieronder). Voor gebruik moet het water worden belucht. Indien nodig kan het kweekwater worden ververst door voorzichtig het gebruikte water uit de kweekvaten te gieten of hevelen zonder de larvenhulzen te beschadigen. Toediening van voedsel aan larven 4. De larven van Chironomus worden dagelijks gevoerd met ongeveer 250 mg visvoervlokken (TetraMin®, TetraPhyll® of een soortgelijk merk visvoer) per vat. Dit voer kan worden gegeven als droog gemalen poeder of als suspensie in water: aan 20 ml verdunningswater wordt 1,0 g voedervlokken toegevoegd en gemengd, zodat een homogeen mengsel ontstaat. Van dit mengsel kan ongeveer 5 ml per vat per dag worden gebruikt (schudden voor gebruik). Aan oudere larven kan meer voer worden gegeven. 5. Het voedsel wordt aangepast op basis van de waterkwaliteit. Als het kweekmedium troebel wordt, wordt de hoeveelheid voedsel verminderd. De toediening van voedsel moet zorgvuldig worden geobserveerd. Als te weinig voer wordt gegeven, zullen de larven naar de waterkolom uitwijken; als te veel voer wordt gegeven, neemt de microbiële activiteit toe en daalt het zuurstofgehalte. Beide condities kunnen tot lagere groeisnelheden leiden. 6. Wanneer nieuwe kweekvaten worden ingericht, kunnen ook enige cellen van groene algen (bv. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris) worden toegevoegd. Toediening van voedsel aan uitgekomen volwassen muggen 7. Enkele onderzoekers hebben erop gewezen dat een in een sacharoseoplossing gedrenkt wattenschijfje als voedsel kan dienen voor uitgekomen volwassen muggen. Uitkomst van muggen 8. In de larvenkweekvaten zullen zich bij 20 ± 2 °C na ongeveer 13-15 dagen volwassen muggen ontwikkelen. Mannetjes zijn gemakkelijk te herkennen aan hun veerachtige antennes. Eipakketten 9. Zodra in de kweekkooi volwassen muggen aanwezig zijn, worden alle larvenkweekvaten drie keer per week gecontroleerd op afgezette geleiachtige eipakketten. Als eipakketten aanwezig zijn, worden zij voorzichtig verwijderd. Zij worden overgebracht naar een klein schaaltje met een monster van het kweekwater. De eipakketten worden gebruikt om een nieuw kweekvat te beginnen (bv. 2-4 eipakketten per vat) of worden voor toxiciteitstests gebruikt. 10. Larven in het eerste stadium moeten na twee-drie dagen uitkomen. Inrichting van nieuwe kweekvaten 11. Zodra kweken zijn opgezet, moet het mogelijk zijn één keer per week, of minder vaak naargelang de testvoorschriften, een vers larvenkweekvat in te richten, waarbij de oudere vaten worden verwijderd nadat zich volwassen muggen hebben ontwikkeld. Dit systeem zorgt voor een regelmatige aanvoer van volwassen muggen met een minimum aan beheer. Bereiding van de testoplossingen M4 en M7 12. Elendt (1990) heeft het medium M4 beschreven. Het medium M7 wordt op dezelfde wijze als M4 bereid, maar met een vier keer zo lage concentratie van de in tabel 1 vermelde stoffen. Er is een publicatie over het medium M7 in voorbereiding (persoonlijk medegedeeld door Elendt). De testoplossing mag niet volgens Elendt en Bias (1990) worden bereid, omdat de voor de stamoplossingen vermelde concentraties van NaSiO3 5H2O, NaNO3, KH2PO4 en K2HPO4 niet geschikt zijn. Bereiding van het medium M7 13. Elke stamoplossing (I) wordt apart bereid en met deze stamoplossingen (I) wordt een gecombineerde stamoplossing (II) bereid (zie tabel 1). Het medium M7 wordt bereid uit 50 ml gecombineerde stamoplossing (II) en de in tabel 2 vermelde hoeveelheden van elke stamoplossing van macronutriënten en tot 1 liter gedeïoniseerd water aangevuld. Een vitaminestamoplossing wordt bereid do