BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE van 19 november 1992 tot vaststelling van de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten (92/532/EEG)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 91/67/EEG van de Raad van 28 januari 1991 inzake veterinairrechtelijke voorschriften voor het in de handel brengen van aquicultuurdieren en aquicultuurprodukten (1), en met name op artikel 15,

Overwegende dat krachtens artikel 15 van genoemde richtlijn de schema's voor de bemonstering en de methoden voor het stellen van de diagnose met het oog op de opsporing en de bevestiging van ziekten bij aquicultuurdieren, moeten worden vastgesteld;

Overwegende dat het Wetenschappelijk Veterinair Comité, ingesteld bij Beschikking 81/651/EEG van de Commissie (2), geraadpleegd werd;

Overwegende dat de in deze beschikking vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Veterinair Comité,

HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:

Artikel 1

De bemonsteringsschema's en diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van infectieuze hematopoïetische necrose (IHN) en virale hemorrhagische septikemie (VHS) worden vastgesteld in de bijlage.

Artikel 2

Deze beschikking is gericht tot de Lid-Staten. Gedaan te Brussel, 19 november 1992. Voor de Commissie

Ray MAC SHARRY

Lid van de Commissie

(1) PB nr. L 46 van 19. 2. 1991, blz. 1. (2) PB nr. L 233 van 19. 8. 1981, blz. 32.

BIJLAGE

DEEL I

BEMONSTERINGS- EN TESTMETHODEN VOOR VHS- EN IHN-BEWARING I. Bemonstering 1. Bemonsteringsperiode

Op de bedrijven wordt ten minste tweemaal per jaar, namelijk in de periode van oktober tot en met juni of wanneer de watertemperatuur minder dan 14 °C bedraagt, een klinisch onderzoek verricht. Tussen twee onderzoeken moeten ten minste vier maanden verlopen. Alle produktie-eenheden (vijvers, tanks, aquaria, netkooien, enz.) worden onderzocht op de aanwezigheid van dode en zwakke vissen en van vissen met abnormaal gedrag. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de omgeving waar het water wegloopt (indien praktisch mogelijk) aangezien zwakke vissen zich bij voorkeur in die omgeving ophouden wegens de stroming van het water.

2. Selectie en verzameling van monsters

30 tot 150 monsters van vis- en/of ovariële vloeistof worden verzameld om te worden onderzocht overeenkomstig het bepaalde in tabel 1 A. Indien regenboogforel aanwezig is, moet het monster volledig uit die vissoort bestaan. Indien geen regenboogforel aanwezig is, moet het monster bestaan uit vissen van alle andere soorten die vatbaar zijn voor VHS en/of IHN, volgens de lijst in bijlage A bij Richtlijn 91/67/EEG inzake veterinairrechtelijke voorschriften voor het in de handel brengen van aquicultuurdieren en aquicultuurprodukten. De soorten moeten in gelijke mate in het monster vertegenwoordigd zijn. In de eerste vier jaar van de controleperiode die voorafgaat aan het verwerven van de ziektevrije status, moet het monster bestaan uit 150 eenheden, ten einde te garanderen dat 95 % van alle virusdragers wordt opgespoord wanneer 2 % van de populatie drager is van het virus. In de daaropvolgende jaren (behoud van de ziektevrije status) kan het aantal eenheden in het monster tot 30 worden verminderd, ten einde te garanderen dat 95 % van alle virusdragers wordt opgespoord wanneer 10 % van de populatie drager is van het virus (tabel 1 B).

Op een bedrijf waar aan de hand van bewijsstukken kan worden aangetoond dat het altijd vrij is geweest van VHS en IHN (op basis van regelmatige officiële inspecties) mag ook reeds in de eerste vier jaar van de controleperiode met het kleinste monster worden gewerkt.

Wanneer voor de visproduktie meer dan een waterbron wordt gebruikt, mag het monster, ongeacht of het 150 dan wel 30 eenheden telt, zo worden genomen dat alle waterbronnen vertegenwoordigd zijn. Wanneer de aanwezigheid wordt geconstateerd van zwakke vissen, vissen met abnormaal gedrag of pas gestorven vissen (nog niet in ontbinding) moeten bij voorkeur deze vissen in het monster worden opgenomen. Indien dergelijke vissen niet aanwezig zijn, moet het monster bestaan uit gezonde vissen met een normaal voorkomen en moet ervoor worden gezorgd dat alle onderdelen van het bedrijf en alle jaarklassen in het monster vertegenwoordigd zijn.

3. Voorbewerking en verzending van vismonsters

Vóór het vervoer naar het laboratorium worden bij de vissen met steriele scharen of pincetten stukjes weggenomen uit de te onderzoeken organen; deze stukjes worden in plastic buisjes gedaan die zijn gevuld met een transportmedium, dat wil zeggen een celkweekmedium met 10 % kalfsserum en antibiotica. Aanbevolen wordt een combinatie van 200 IE penicilline, 200 mg streptomycine en 200 mg kanamycine per ml, maar ook andere antibiotica die doeltreffend zijn gebleken, mogen worden gebruikt. Het te onderzoeken weefselmateriaal is afkomstig van de milt, de voornier en de hersenen; in sommige gevallen kan ook ovariële vloeistof worden onderzocht (tabellen 1 A en 1 B).

Stukjes orgaan van vijf tot tien vissen (tabellen 1 A en 1 B) mogen in één buisje tot een verzamelmonster worden samengebracht. Ieder monster moet ten minste 1 g weefsel bevatten, zodat de uiteindelijke verdunning 1: 10 bedraagt.

De buisjes worden in geïsoleerde recipiënten (bij voorbeeld dikwandige polystyreendozen) geplaatst met voldoende ijs of "koelpatronen" om de monsters tijdens het vervoer naar het laboratorium koel (op een temperatuur tussen 0 en 5 °C) te houden. Bevriezing van de monsters moet worden vermeden.

Het virologisch onderzoek moet zo snel mogelijk en uiterlijk 48 uur na de bemonstering beginnen. Als de te onderzoeken vis minder dan 6 cm lang is, mag de vis in zijn geheel naar het laboratorium worden gebracht in plastic zakken die op de hierboven beschreven wijze worden gekoeld.

4. Verzamelen van bijkomend diagnostisch materiaal

Overeenkomstig de met het betrokken diagnostisch laboratorium gemaakte afspraken kan van de vissen nog ander weefselmateriaal worden genomen en voor bijkomend onderzoek worden voorbewerkt.

II. Voorbewerking van de monsters voor virologisch onderzoek

1. Homogeniseren van de organen

In het laboratorium wordt de inhoud van de buisjes volledig gehomogeniseerd (met een stomacher, een mixer of een vijzel en stamper) en het homogenaat wordt vervolgens gesuspendeerd in het oorspronkelijke transportmedium. Als het monster bestaat uit hele vis, dat wil zeggen vis met een lengte van minder dan 6 cm, wordt de vis, nadat het stuk achter de anus is verwijderd, met een steriele schaar in kleine stukken geknipt en daarna zoals hierboven beschreven gehomogeniseerd en vervolgens in transportmedium gesuspendeerd in een verhouding 1 op 10.

2. Centrifugeren van het homogenaat

Het homogenaat wordt gecentrifugeerd in een op 2 tot 5 °C gekoelde centrifuge bij 2 000 tot 4 000 g gedurende 15 minuten en het supernatant wordt voor onderzoek verzameld.

Als het monster in transportmedium (dat wil zeggen in contact met antibiotica) is vervoerd, dient het supernatant niet meer met antibiotica te worden behandeld.

Als het monster uit hele vis bestond, dient het homogenaat na het centrifugeren te worden behandeld met de antibiotica die ook zijn toegevoegd aan het transportmedium dat voor het resuspenderen wordt gebruikt; deze behandeling moet worden uitgevoerd gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of gedurende een nacht bij 4 °C.

Door de behandeling met antibiotica wordt bacteriële verontreiniging van de monsters tegengegaan en wordt filtratie door membraanfilters overbodig.

Onmiddellijk na het centrifugeren wordt een volume van het supernatant gemengd met een zelfde hoeveelheid van een adequate verdunning van een bivalent antiserum tegen het virus van infectieuze pancreasnecrose (IPN) (referentiestammen Sp en Ab) en dit mengsel wordt dan bebroed gedurende ten minste 1 uur bij 15 °C of gedurende ten hoogste 18 uur bij 4 °C. De titer van het antiserum, bepaald door middel van een 50 %-plaqueneutralisatietest, moet ten minste 1: 2 000 bedragen.

Alle inocula worden met een antiserum tegen het IPN-virus (in sommige delen van Europa wordt dit virus gevonden bij 50 % van de vismonsters) behandeld om te vermijden dat het IPN-virus CPE doet ontstaan in de geënte celcultures. Door deze behandeling wordt de duur van het virologische onderzoek ingekort en vermindert het aantal gevallen waarin het ontstaan van CPE als indicator voor de aanwezigheid van VHS- of IHN-virus zou moeten worden aangemerkt.

Als de monsters afkomstig zijn van produktie-eenheden die officieel als vrij van IPN-virus worden beschouwd, is het niet verplicht de inocula met antiserum tegen het IPN-virus te behandelen.

III. Virologisch onderzoek

1. Celcultures en groeimedia

BF-2- en EPC- of FHM-cellen worden bij 20 tot 25 °C gekweekt in Eagle's MEM (of varianten daarvan) waaraan 10 % foetaal runderserum en de normale concentraties antibiotica zijn toegevoegd.

Voor cultures in gesloten recipiënten wordt het medium gebufferd met bicarbonaat. Bij celcultures in open recipiënten moet het medium zo met tris-HCl (23mM) en Na-bicarbonaat (6mM) worden gebufferd dat de pH zo dicht mogelijk ligt bij 7,6, de optimale pH-waarde voor virusvermeerdering.

Alleen jonge (4 tot 48 uur oude) celcultures in actieve groei (niet confluent) mogen met weefselmateriaal worden geënt.

2. Enten van celcultures

De met antibiotica behandelde orgaansuspensie wordt op de celcultures geënt in twee verdunningen, namelijk de primaire verdunning en een verdunning 1: 100 daarvan (ten einde homologe interferentie te voorkomen). Ten minste twee cellijnen moeten worden geïnoculeerd (zie punt III.1). De verhouding tussen de hoeveelheid inoculum en het volume van het celkweekmedium moet ongeveer 1: 10 bedragen.

Voor iedere verdunning en iedere cellijn moet ten minste een celoppervlak van 2 cm2 worden gebruikt, wat overeenstemt met één putje van een celkweekplaat met 24 putjes. Het gebruik van celkweekplaten wordt aanbevolen, maar andere recipiënten met ongeveer dezelfde of grotere oppervlakken voor celgroei mogen ook worden aangewend.

3. Bebroeden van celcultures

De geënte celcultures worden gedurende 7 dagen bij 15 °C bebroed. Wanneer de kleur van het celkweekmedium van rood naar geel omslaat, wat wijst op de verzuring van het medium, moet de pH worden bijgesteld met een steriele bicarbonaatoplossing of een stof met dezelfde werking, om ervoor te zorgen dat de cellen gevoelig blijven voor virusinfectie.

Om de gevoeligheid van de celcultures voor infectie te verifiëren, wordt om de 6 maanden een titratie uitgevoerd met VHSV en IHNV uit de ingevroren voorraad.

4. Microscopische waarnemingen

Dagelijks worden de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE gecontroleerd onder een microscoop met vergroting 40 ×. Wanneer duidelijk een CPE wordt geconstateerd, wordt onmiddellijk begonnen met de identificatie van het virus overeenkomstig punt IV.

Tegelijk worden de nodige maatregelen genomen om ervoor te zorgen dat de erkenning wordt geschorst van de produktie-eenheid waaruit het monster dat positief voor virus is bevonden, afkomstig is, en van alle produktie-eenheden die stroomafwaarts daarvan gelegen zijn.

De schorsing wordt gehandhaafd tot laboratoriumonderzoek heeft uitgewezen dat het niet gaat om VHSV of IHNV. De identificatie van het virus, het onderzoek in het referentielaboratorium inbegrepen, mag ten hoogste vier weken in beslag nemen.

5. Voortkweek

Als na incubatie gedurende 7 dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op verse celcultures met ongeveer hetzelfde celoppervlak als de primaire cultuur.

Nadat alle cultures een vries-dooi-cyclus hebben ondergaan, worden gelijke hoeveelheden van het medium van alle cultures/putjes van de primaire cultuur naar cellijn samengevoegd en vervolgens wordt 0,5 ml van dit samengestelde medium gemengd met een zelfde hoeveelheid antiserum tegen IPN-virus, zoals beschreven in punt II.2, en bebroed bij 15 °C gedurende 60 minuten. Vervolgens worden verdunningen van 1: 1 en 1: 100 van dit mengsel op homologe celcultures geënt, zoals beschreven in punt III.2. Vóór de inoculatie mag een pre-incubatie van alle verdunningen met bivalent antiserum tegen het IPN-virus in een adequate verdunning worden toegepast.

De geënte cultures worden daarna gedurende 7 dagen bebroed bij 15 °C en gecontroleerd overeenkomstig punt III.4.

IV. Virusidentificatie

1. Neutralisatie

Wanneer in een celcultuur CPE wordt geconstateerd, wordt het medium verzameld, worden de cellen verwijderd door centrifugering bij lage snelheid of door membraanfiltering (0,45 mm) en wordt het medium vervolgens verdund in celkweekmedium tot op 1: 100 en 1: 10 000.

Aan gelijke hoeveelheden van de verdunningen wordt telkens een zelfde hoeveelheid van elk van de onderstaande reagentia toegevoegd en deze mengsels worden vervolgens 60 minuten bij 15 °C bebroed:

- groepsspecifieke antistoffen tegen het VHSV (Egtved-virus) 1: 50 * - groepsspecifieke antistoffen tegen het infectieuze hematopoïetische necrose-virus (IHNV) 1: 50 * - specifiek bivalent antiserum tegen het infectieuze pancreasnecrose-virus (IPNV) (referentiestammen Sp en Ab) 1: 50 * - medium 1: 1

* of zoals aangegeven door het referentielaboratorium in verband met de mogelijke cytotoxiciteit van de antisera.

De gebruikte reagentia moeten van referentiekwaliteit zijn qua titer en specificiteit.

Ten minste twee celcultures worden geënt met 50 ml van iedere virus-serumcombinatie en vervolgens bebroed bij 15 °C. Ontwikkeling van CPE wordt gecontroleerd overeenkomstig punt III.4.

Wanneer na een week het virus niet met zekerheid is geïdentificeerd, wordt een van de volgende procedures gevolgd:

a) overbrenging van het virus naar een nationaal referentielaboratorium voor visvirussen voor onmiddellijke identificatie;

b) toepassing van IIFT (punt IV.2), Elisa (punt IV.3) of een andere methode voor virusidentificatie met reagentia van referentiekwaliteit.

2. Immunofluorescentie (IIFT)

Voor ieder te identificeren virusisolaat worden EPC-cellen aangebracht op 8 dekglaasjes (of soortgelijke dragers) in een zodanige verhouding dat na 24 uur groei er een confluentie optreedt van ongeveer 60 tot 90 %. Gekozen is voor EPC-cellen omdat zij zich stevig aan glas hechten.

Wanneer de cellen zich aan het glas hebben gehecht (ongeveer één uur na het aanbrengen), of na incubatie van de cultures gedurende ten hoogste 24 uur, worden zij geïnoculeerd met het te identificeren virus. Vier cultures worden geënt in een v/v-verhouding van 1: 10 en vier cultures in een verhouding 1: 100.

Twintig tot dertig uur na inoculatie worden de cultures tweemaal gewassen in Eagle's MEM zonder serum, gefixeerd met aceton en vervolgens gemerkt met behulp van een dubbele-laag-IIFT. De eerste laag reagens bestaat uit goedgekeurd antiserum (als bedoeld in punt IV.1). De tweede laag reagens is een conjugaat van FITC en antiserum gericht tegen het immunoglobuline van de eerste laag. Voor ieder te testen antiserum worden ten minste één cultuur die is geïnoculeerd in een sterkere concentratie, en één cultuur die is geënt in een zwakkere concentratie, gemerkt. In de test moeten ook de nodige negatieve en positieve controles worden opgenomen.

Aan de gemerkte cultures wordt glycerol-fysiologisch zout toegevoegd. De cultures worden onderzocht onder invallend UV-licht. Daarbij wordt gebruik gemaakt van een oculair met vergroting 10× of 12× en van een objectief met vergroting 25× of 40× en met een diafragma >0,7, respectievelijk >1,3. De verdunningen van het primaire antiserum en het met FITC geconjugeerde soortspecifieke immunoglobuline variëren naar gelang van de gekozen of beschikbare microscoopopstelling.

Sommige stammen van het Egtved-virus reageren bij IIFT hevig op antiserum tegen de referentiestam F1, hoewel zij geen reactie geven in neutralisatietests.

3. Enzyme linked immunosorbent assay (Elisa)

Putjes in microtiterplaten (bij voorbeeld Nunc-immunoplaten, Maxisorp, Nunc, Denemarken) worden gedurende een nacht gecoat met aanbevolen verdunningen van proteïne-A-gezuiverde immunoglobulinefracties van het antiserum dat vermeld is in punt IV.1.

Na wassen van de putjes met PBS-Tween-20 buffer wordt het te identificeren virus in de putjes gebracht in verdunningsstappen van twee of vier en 60 minuten bij 37 °C geplaatst om het virus te laten reageren met de antistoffen die voor coating zijn gebruikt. Nadat de platen opnieuw zijn gewassen met PBS-Tween-20 buffer worden gebiotiniseerde antistoffen met een specificiteit die overeenstemt met die van de antistoffen die voor coating zijn gebruikt, toegevoegd, en het geheel wordt met het oog op binding gedurende 60 minuten bij 20 °C geplaatst. Vervolgens worden de platen opnieuw gewassen zoals hierboven beschreven en wordt een conjugaat van HRP met streptavidine toegevoegd en gedurende 1 uur bij 20 °C geplaatst om te laten reageren. Na een laatste wasbeurt wordt het gebonden enzym zichtbaar gemaakt met de normaal bij de Elisa-techniek gebruikte substraten (OPD, TMB, enz.).

De hierboven beschreven Elisa op basis van biotine-avidine is slechts een voorbeeld. Varianten zijn toegestaan, voor zover zij doelmatig zijn gebleken.

Tabel 1 A

Verwerven van de status

Aantal klinische onderzoeken per jaar Aantal vissen waarvan organen zijn onderzocht Aantal vissen waarvan ovariële vloeistof is onderzocht Continentale gebieden a) Bedrijven met broed 2 120 (eerste)

150 (tweede) 30 (eerste)

0 b) Bedrijven met uitsluitend broed 2 0 150 (eerste of tweede) c) Bedrijven zonder broed 2 150 (eerste en tweede) 0 Kustgebieden a) Bedrijven zonder broed 2 30 (eerste en tweede) 0 b) Bedrijven met broed 2 120 (eerste)

150 (tweede) 30 (eerste)

0

Maximumaantal vissen per verzamelmonster: 5.

Tabel 1 B

Behoud van de status

Aantal klinische onderzoeken per jaar Aantal vissen waarvan organen zijn onderzocht Aantal vissen waarvan ovariële vloeistof is onderzocht Continentale gebieden a) Bedrijven met broed 2 15 (eerste of tweede) 15 (eerste of tweede) b) Bedrijven met uitsluitend broed 2 0 30 (eerste of tweede) c) Bedrijven zonder broed 2 30 (eerste of tweede) 0 Kustgebieden a) Bedrijven zonder broed 1 30 (1) (eerste of tweede) 0 b) Bedrijven met broed 2 0 30 (eerste of tweede)

Maximumaantal vissen per verzamelmonster: 10.

(1) De monsters moeten worden verzameld in de tweede tot en met de zesde maand nadat de vissen van zoet naar zout water zijn overgebracht.

DEEL II

DIAGNOSTISCHE PROCEDURES VOOR DE BEVESTIGING VAN IHN EN VHS BIJ VERMOEDELIJKE UITBRAKEN

De diagnose van IHN en VHS kan worden gesteld met behulp van een van de volgende technieken:

- A. Conventionele virusisolatie gevolgd door serologische virusidentificatie.

- B. Virusisolatie en gelijktijdige serologische virusidentificatie.

- C. Snelle diagnosetechnieken (IIFT, Elisa).

Wanneer de diagnose van IHN en VHS voor de eerste keer moet worden gesteld op bedrijven in erkende gebieden, mag techniek C nooit alleen worden gebruikt; in dat geval moet ook gebruik worden gemaakt van de technieken A of B.

Het voor virologisch onderzoek bestemde weefselmateriaal moet in sommige gevallen vergezeld gaan van bijkomend materiaal voor bacteriologisch, parasitologisch, histologisch of ander onderzoek, met het oog op het stellen van een differentiële diagnose. Dat materiaal moet worden verzameld volgens de procedures die zijn beschreven door het Internationaal Bureau voor Besmettelijke Veeziekten (OIE). A. Conventionele virusisolatie gevolgd door serologische virusidentificatie

A.I.1. Selectie van monsters Ten minste tien vissen met typische symptomen van IHN of VHS moeten voor onderzoek worden geselecteerd. A.I.2. Voorbewerking en verzending van vismonsters Vóór het vervoer naar het laboratorium worden bij de vissen met steriele scharen of pincetten stukjes weggenomen uit de te onderzoeken organen; deze stukjes worden in plastic buisjes gedaan die zijn gevuld met een transportmedium, dat wil zeggen een celkweekmedium met 10 % kalfsserum en antibiotica. Aanbevolen wordt een combinatie van 200 IE penicilline, 200 mg streptomycine en 200 mg kanamycine per ml, maar ook andere antibiotica die doeltreffend zijn gebleken, mogen worden gebruikt. De te onderzoeken organen zijn de milt, de voornier en de hersenen. Stukjes orgaan van vijf tot tien vissen mogen in één buisje tot een verzamelmonster worden samengebracht. Ieder monster moet ten minste 1 g weefsel bevatten, zodat de uiteindelijke verdunning ongeveer 1 op 10 bedraagt. De buisjes worden in geïsoleerde recipiënten (bij voorbeeld dikwandige polystyreendozen) geplaatst met voldoende ijs of "koelpatronen" om de monsters tijdens het vervoer naar het laboratorium koel (op een temperatuur tussen 0 en 5 °C) te houden. Bevriezing van de monsters moet worden vermeden. Het virologisch onderzoek moet zo snel mogelijk en uiterlijk 48 uur na de bemonstering beginnen. Als de te onderzoeken vis minder dan 6 cm lang is, mag de vis in zijn geheel naar het laboratorium worden gebracht in plastic zakken die op de hierboven beschreven wijze worden gekoeld. A.I.3. Verzamelen van bijkomend diagnostisch materiaal Overeenkomstig de met het betrokken diagnostisch laboratorium gemaakte afspraken kan van de vissen nog ander weefselmateriaal worden genomen en voor bijkomend onderzoek worden voorbewerkt. A.II.1. Homogeniseren van de organen In het laboratorium wordt de inhoud van de buisjes volledig gehomogeniseerd (met een stomacher, een mixer of een vijzel en stamper) en het homogenaat wordt vervolgens gesuspendeerd in het oorspronkelijke transportmedium. Als het monster bestaat uit hele vis, dat wil zeggen vis met een lengte van minder dan 6 cm, wordt de vis, nadat het stuk achter de anus is verwijderd, met een steriele schaar in kleine stukken geknipt en daarna zoals hierboven beschreven gehomogeniseerd en vervolgens in transportmedium gesuspendeerd in een verhouding 1 op 10. A.II.2. Centrifugeren van het homogenaat Het homogenaat wordt gecentrifugeerd in een op 2 tot 5 °C gekoelde centrifuge bij 2 000 tot 4 000 g gedurende 15 minuten en het supernatant wordt voor onderzoek verzameld. Als het monster in transportmedium (dat wil zeggen in contact met antibiotica) is vervoerd, dient het supernatant niet meer met antibiotica te worden behandeld. Als het monster uit hele vis bestond, dient het homogenaat na het centrifugeren te worden behandeld met de antibiotica die ook zijn toegevoegd aan het transportmedium dat voor het resuspenderen wordt gebruikt; deze behandeling moet worden uitgevoerd gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of gedurende een nacht bij 4 °C. Door de behandeling met antibiotica wordt bacteriële verontreiniging van de monsters tegengegaan en wordt filtratie door membraanfilters overbodig. Onmiddellijk na het centrifugeren wordt een volume van het supernatant gemengd met een zelfde hoeveelheid van een adequate verdunning van een bivalent antiserum tegen het virus van infectieuze pancreasnecrose (IPN) (referentiestammen Sp en Ab) en dit mengsel wordt dan bebroed gedurende ten minste 1 uur bij 15 °C of gedurende ten hoogste 18 uur bij 4 °C. De titer van het antiserum, bepaald door middel van een 50 %-plaqueneutralisatietest, moet ten minste 1: 2 000 bedragen. Alle inocula worden met een antiserum tegen het IPN-virus (in sommige delen van Europa wordt dit virus gevonden bij 50 % van de vismonsters) behandeld om te vermijden dat het IPN-virus CPE doet ontstaan in de geënte celcultures. Door deze behandeling wordt de duur van het virologische onderzoek ingekort en vermindert het aantal gevallen waarin het ontstaan van CPE als indicator voor de aanwezigheid van VHS- of IHN-virus zou moeten worden aangemerkt. Als de monsters afkomstig zijn van produktie-eenheden die officieel als vrij van IPN-virus worden beschouwd, is het niet verplicht de inocula met antiserum tegen het IPN-virus te behandelen. A.III.1. Celcultures en groeimedia BF-2- en EPC- of FHM-cellen worden bij 20 tot 25 °C gekweekt in Eagle's MEM (of varianten daarvan) waaraan 10 % foetaal runderserum en de normale concentraties antibiotica zijn toegevoegd. Voor cultures in gesloten recipiënten wordt het medium gebufferd met bicarbonaat. Bij celcultures in open recipiënten moet het medium zo met tris-HCl (23mM) en bicarbonaat (6mM) worden gebufferd dat de pH zo dicht mogelijk ligt bij 7,6, de optimale pH-waarde voor virusvermeerdering. Alleen jonge (4 tot 48 uur oude) celcultures in actieve groei (niet confluent) mogen met weefselmateriaal worden geënt. A.III.2. Enten van celcultures De met antibiotica behandelde orgaansuspensie wordt op de celcultures geënt in twee verdunningen, namelijk de primaire verdunning en een verdunning 1: 100 daarvan (ten einde homologe interferentie te voorkomen). Ten minste twee cellijnen moeten worden geïnoculeerd (zie punt A.III.1). De verhouding tussen de hoeveelheid inoculum en het volume van het celkweekmedium moet ongeveer 1: 10 bedragen. Voor iedere verdunning en iedere cellijn moet ten minste een celoppervlak van 2 cm2 worden gebruikt, wat overeenstemt met één putje van een celkweekplaat met 24 putjes. Het gebruik van celkweekplaten wordt aanbevolen, maar andere recipiënten met ongeveer dezelfde of grotere oppervlakken voor celgroei mogen ook worden aangewend.

A.III.3. Bebroeden van celcultures De geënte celcultures worden gedurende 7 dagen bij 15 °C bebroed. Wanneer de kleur van het celkweekmedium van rood naar geel omslaat, wat wijst op de verzuring van het medium, moet de pH worden bijgesteld met een steriele bicarbonaatoplossing of een stof met dezelfde werking, om ervoor te zorgen dat de cellen gevoelig blijven voor virusinfectie. Om de gevoeligheid van de celcultures voor infectie te verifiëren, wordt om de 6 maanden een titratie uitgevoerd met VHSV en IHNV uit de ingevroren voorraad. A.III.4. Microscopische waarnemingen Dagelijks worden de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE gecontroleerd onder een microscoop met vergroting 40×. Wanneer duidelijk een CPE wordt geconstateerd, wordt onmiddellijk begonnen met de identificatie van het virus overeenkomstig het bepaalde in punt A.IV. Tegelijk worden de nodige maatregelen genomen om ervoor te zorgen dat de erkenning wordt geschorst van de produktie-eenheid waaruit het monster dat positief voor virus is bevonden, afkomstig is, en van alle produktie-eenheden die stroomafwaarts daarvan gelegen zijn. De schorsing wordt gehandhaafd tot laboratoriumonderzoek heeft uitgewezen dat het niet gaat om VHSV of IHNV. De identificatie van het virus, het onderzoek in het referentielaboratorium inbegrepen, mag ten hoogste vier weken in beslag nemen. A.III.5. Voortkweek Als na incubatie gedurende 7 dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op verse celcultures met ongeveer hetzelfde celoppervlak als de primaire cultuur. Nadat alle cultures een vries-dooi-cyclus hebben ondergaan, worden gelijke hoeveelheden van het medium van alle cultures/putjes van de primaire cultuur samengevoegd naar cellijn en vervolgens wordt 0,5 ml van dit samengestelde medium gemengd met een zelfde hoeveelheid antiserum tegen IPN-virus, zoals beschreven in punt A.II.2, en bebroed bij 15 °C gedurende 60 minuten. Vervolgens worden verdunningen van 1: 1 en 1: 100 van dit mengsel op celcultures geënt, zoals beschreven in punt A.III.2. Vóór de inoculatie mag een pre-incubatie van alle verdunningen met bivalent antiserum tegen het IPN-virus in een adequate verdunning worden toegepast. De geënte cultures worden daarna gedurende 7 dagen bebroed bij 15 °C en gecontroleerd overeenkomstig punt A.III.4. A.IV.1. Neutralisatie Wanneer in een celcultuur CPE wordt geconstateerd, wordt het medium verzameld, worden de cellen verwijderd door centrifugering bij lage snelheid of door membraanfiltering (0,45 mm) en wordt het medium vervolgens verdund in celkweekmedium tot op 1: 100 en 1: 10 000. Aan gelijke hoeveelheden van de verdunningen wordt telkens een zelfde hoeveelheid van elk van de onderstaande reagentia toegevoegd en deze mengsels worden vervolgens 60 minuten bij 15 °C bebroed: - groepsspecifieke antistoffen tegen het VHSV (Egtved-virus) 1: 50 * - groepsspecifieke antistoffen tegen het infectieuze hematopoïetische necrose-virus (IHNV) 1: 50* - specifiek bivalent antiserum tegen het infectieuze pancreasnecrose-virus (IPNV) (referentiestammen Sp en Ab) 1: 50 * - medium 1: 1 * of zoals aangegeven door het referentielaboratorium in verband met de mogelijke cytotoxiciteit van de antisera. De gebruikte reagentia moeten van referentiekwaliteit zijn qua titer en specificiteit. Ten minste twee celcultures worden geënt met 50 ml van iedere virus-serumcombinatie en vervolgens bebroed bij 15 °C. Ontwikkeling van CPE wordt gecontroleerd overeenkomstig punt A.III.4. Wanneer na een week het virus niet met zekerheid is geïdentificeerd, wordt een van de volgende procedures gevolgd: a) overbrenging van het virus naar een nationaal referentielaboratorium voor visvirussen voor onmiddellijke identificatie; b) toepassing van IIFT (punt A.IV.2), Elisa (punt A.IV.3) of een andere methode voor virusidentificatie met reagentia van referentiekwaliteit. A.IV.2. Immunofluorescentie (IIFT) Voor ieder te identificeren virusisolaat worden EPC-cellen aangebracht op 8 dekglaasjes (of soortgelijke dragers) in een zodanige verhouding dat na 24 uur groei er een confluentie optreedt van ongeveer 60 tot 90 %. Gekozen is voor EPC-cellen omdat zij zich stevig aan glas hechten. Wanneer de cellen zich aan het glas hebben gehecht (ongeveer één uur na het aanbrengen), of na incubatie van de cultures gedurende ten hoogste 24 uur, worden zij geïnoculeerd met het te identificeren virus. Vier cultures worden geënt in een v/v-verhouding van 1: 10 en vier cultures in een verhouding 1: 100. Twintig tot dertig uur na inoculatie worden de cultures tweemaal gewassen in Eagle's MEM zonder serum, gefixeerd met aceton en vervolgens gemerkt met behulp van een dubbele-laag-IIFT. De eerste laag reagens bestaat uit goedgekeurd antiserum (als bedoeld in punt A.IV.1). De tweede laag reagens is een conjugaat van FITC en antiserum gericht tegen het immunoglobuline van de eerste laag. Voor ieder te testen antiserum worden ten minste één cultuur die is geïnoculeerd in een sterkere concentratie, en één cultuur die is geënt in een zwakkere concentratie, gemerkt. In de test moeten ook de nodige negatieve en positieve controles worden opgenomen. Aan de gemerkte cultures wordt glycerol-fysiologisch zout toegevoegd. De cultures worden onderzocht onder invallend UV-licht. Daarbij wordt gebruik gemaakt van een oculair met vergroting 10× of 12× en van een objectief met vergroting 25× of 40× en met een diafragma >0,7, respectievelijk >1,3. De verdunningen van het primaire antiserum en het met FITC geconjugeerde soortspecifieke immunoglobuline variëren naar gelang van de gekozen of beschikbare microscoopopstelling. Sommige stammen van het Egtved-virus reageren bij IIFT hevig op antiserum tegen de referentiestam F1, hoewel zij geen reactie geven in neutralisatietests. A.IV.3. Enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) Putjes in microtiterplaten (bij voorbeeld Nunc-immunoplaten, Maxisorp, Nunc, Denemarken) worden gedurende een nacht gecoat met aanbevolen verdunningen van proteïne-A-gezuiverde immunoglobulinefracties van het antiserum dat vermeld is in punt IV.1. Na wassen van de putjes met PBS-Tween-20 buffer wordt het te identificeren virus in de putjes gebracht in verdunningsstappen van twee of vier en 60 minuten bij 37 °C geplaatst om het virus te laten reageren met de antistoffen die voor coating zijn gebruikt. Nadat de platen opnieuw zijn gewassen met PBS-Tween-20 buffer worden gebiotiniseerde antistoffen met een specificiteit die overeenstemt met die van de antistoffen die voor coating zijn gebruikt, toegevoegd, en het geheel wordt met het oog op binding gedurende 60 minuten bij 20 °C geplaatst. Vervolgens worden de platen opnieuw gewassen zoals hierboven beschreven en wordt een conjugaat van HRP met streptavidine toegevoegd en gedurende 1 uur bij 20 °C geplaatst om te laten reageren. Na een laatste wasbeurt wordt het gebonden enzym zichtbaar gemaakt met de normaal bij de Elisa-techniek gebruikte substraten (OPD, TMB, enz.). De hierboven beschreven Elisa op basis van biotine-avidine is slechts een voorbeeld. Varianten zijn toegestaan, voor zover zij doelmatig zijn gebleken.

B. Virusisolatie en gelijktijdige serologische virusidentificatie

B.I.1. Selectie van monsters Zie A.I.1. B.I.2. Voorbewerking en verzending van vismonsters Zie A.I.2. B.II.1. Homogeniseren van de organen Zie A.II.1. B.II.2. Centrifugeren van het homogenaat Zie A.II.2. B.II.3. Behandeling van het supernatant met diagnostische antisera De suspensie met het antibioticum en de tegen IPN behandelde organen wordt verdund in de verhoudingen 1: 10 en 1: 10 000 in een celcultuurmedium; deze hoeveelheid wordt in gelijke delen verdeeld en die delen worden gemengd met een gelijk deel van de in punt A.IV.1 genoemde reagentia en gedurende 60 minuten bij 15 °C bebroed. B.III.1. Celcultures en groeimedia Zie A.III.1. B.III.2. Enten van celcultures Voor elk virus-serummengsel (bereid overeenkomstig punt B.II.3) worden ten minste twee celcultures per cellijn geïnoculeerd met telkens 50 ml. B.III.3. Bebroeden van celcultures Zie A.III.3. B.III.4. Microscopische waarnemingen Dagelijks worden de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE gecontroleerd onder een microscoop met vergroting 40×. Indien CPE wordt verhinderd door een van de gebruikte antisera, kan worden aangenomen dat het virus daardoor is geïdentificeerd. Indien CPE niet door een van de antisera wordt verhinderd, dient het virus te worden geïdentificeerd overeenkomstig het bepaalde in punt A.IV. B.III.5. Voortkweek Als na zeven dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op cultures die zijn geënt met supernatant en groeimedium (B.II.3).

C. Snelle diagnosetechnieken (IIFT, Elisa) IIFT of Elisa wordt overeenkomstig het bepaalde in A.IV.2, respectievelijk A.IV.3, uitgevoerd op overeenkomstig A.II.2 voorbewerkt supernatant. Deze snelle technieken moeten binnen 48 uur na bemonstering met een virologisch onderzoek overeenkomstig het bepaalde in punt A of B worden aangevuld indien:

a) een negatief resultaat werd verkregen, of

b) een positief resultaat werd verkregen uitgaande van monsters van een eerste uitbraak van IHN of VHS in een erkend gebied.