Verordening (EG) nr. 2091/2002 van de Commissie

van 26 november 2002

houdende wijziging van Verordening (EG) nr. 2870/2000 tot vaststelling van communautaire referentiemethoden voor de analyse van gedistilleerde dranken

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EEG) nr. 1576/89 van de Raad van 29 mei 1989 tot vaststelling van de algemene voorschriften betreffende de definitie, de aanduiding en de aanbiedingsvorm van gedistilleerde dranken(1), gewijzigd bij de Akte van Toetreding van Oostenrijk, Finland en Zweden, en met name op artikel 4, lid 8,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) In de bijlage bij Verordening (EG) nr. 2870/2000 van de Commissie van 19 december 2000 tot vaststelling van communautaire referentiemethoden voor de analyse van gedistilleerde dranken(2) worden de betrokken methoden in detail beschreven.

(2) In het kader van een onderzoekproject dat door de Commissie is gesteund, zijn vier analysemethoden voor de bepaling van respectievelijk trans-anethol in met anijs gearomatiseerde gedistilleerde dranken, glycyrrhizinezuur en chalconen in pastis, en eigeel in eierlikeur en likeur met ei, gevalideerd volgens internationaal erkende procedures.

(3) Deze vier methoden kunnen worden erkend als communautaire referentiemethoden en moeten worden toegevoegd aan de bijlage bij Verordening (EG) nr. 2870/2000.

(4) De in deze verordening vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Uitvoeringscomité voor gedistilleerde dranken,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De bijlage bij Verordening (EG) nr. 2870/2000 wordt gewijzigd als volgt:

1. In de inhoudsopgave van de bijlage wordt "(p.m.)" bij de punten V, VI, VII en IX geschrapt.

2. De hoofdstukken V, VI, VII en IX in de bijlage bij deze verordening worden toegevoegd na hoofdstuk III.

Artikel 2

Deze verordening treedt in werking op de zevende dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.

Gedaan te Brussel, 26 november 2002.

Voor de Commissie

Franz Fischler

Lid van de Commissie

(1) PB L 160 van 12.6.1989, blz. 1.

(2) PB L 333 van 29.12.2000, blz. 20.

BIJLAGE

V. ANETHOL. GASCHROMATOGRAFISCHE BEPALING VAN TRANS-ANETHOL IN GEDISTILLEERDE DRANKEN

1. Toepassingsgebied

Deze methode dient voor de bepaling van trans-anethol in met anijs gearomatiseerde gedistilleerde dranken met behulp van gaschromatografie.

2. Referentienormen

ISO 3696: 1987 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Principe

De concentratie trans-anethol in de gedistilleerde drank wordt bepaald door gaschromatografie (GC). Dezelfde hoeveelheid van een interne standaard, bijvoorbeeld 4-allylanisol (estragol), wanneer estragol niet van nature in het monster aanwezig is, wordt toegevoegd aan het testmonster en aan een referentieoplossing trans-anethol van een bekende concentratie. Beide worden vervolgens met een 45 %-ethanoloplossing verdund en rechtstreeks in het GC-systeem geïnjecteerd. Een extract is nodig vóór de bereiding en analyse van monsters van likeuren met een hoog gehalte aan suikers.

4. Reagentia en materialen

Gebruik bij de analyse uitsluitend reagentia met een zuiverheid van ten minste 98 %. Water van minimaal klasse 3, zoals gedefinieerd in ISO 3696, moet worden gebruikt.

Referentiechemicaliën moeten op een donkere plaats bij ca. 4 °C worden bewaard in een aluminiumreservoir of in flesjes van getint (bruin) glas. De stop moet bij voorkeur van een aluminiumomhulsel zijn voorzien. Trans-anethol moet vóór gebruik vanuit de kristallijne fase worden "ontdooid", maar daarbij mag de temperatuur nooit boven 35 °C komen.

4.1. Ethanol 96 % (v/v) (CAS 64-17-5)

4.2. 1-methoxy-4- (1-propenyl) benzeen; (trans-anethol) (CAS 4180-23-8)

4.3. 4-allylanisol, (estragol) (CAS 140-67-0), voorgestelde interne standaard (IS)

4.4. Ethanol 45 % (v/v)

Voeg 560 g gedistilleerd water toe aan 378 g ethanol 96 % (v/v).

4.5. Bereiding van standaardoplossingen

Alle standaardoplossingen moeten op een donkere plaats bij kamertemperatuur (15-35 °C) worden bewaard in een aluminiumreservoir of in flesjes van getint (bruin) glas. De stop moet bij voorkeur van een aluminiumomhulsel zijn voorzien.

Trans-anethol en 4-allylanisol zijn praktisch onoplosbaar in water en het is daarom noodzakelijk om trans-anethol en 4-allylanisol met een beetje ethanol 96 % (4.1) te verdunnen vóór toevoeging van ethanol 45 % (4.4).

De stockoplossingen moeten elke week vers worden bereid.

4.5.1. Standaardoplossing A

Stockoplossing trans-anethol (concentratie: 2 g/l)

Doe 40 mg trans-anethol (4.2) in een maatkolf van 20 ml (of 400 mg in 200 ml enz.). Voeg een beetje ethanol 96 % (4.1) toe, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

4.5.2. Interne standaardoplossing B

Stockoplossing interne standaard, bijvoorbeeld estragol (concentratie: 2 g/l)

Doe 40 mg estragol (4.3) in een maatkolf van 20 ml (of 400 mg in 200 ml enz.). Voeg een beetje ethanol 96 % (v/v) (4.1) toe, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

4.5.3. Standaardstockoplossingen om de lineariteit van de respons van de detector te controleren

De lineariteit van de respons van de detector moet worden gecontroleerd voor de analyse van een concentratiebereik van trans-anethol in gedistilleerde dranken van 0 g/l tot 2,5 g/l. Tijdens het analyseproces worden de onbekende te analyseren monsters van gedistilleerde dranken tien keer verdund (8.3). Voor de in de methode beschreven analysecondities worden stockoplossingen die corresponderen met concentraties van 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 en 0,25 g/l van trans-anethol in het te analyseren monster, als volgt bereid: neem 0,5, 1, 1,5, 2 en 2,5 ml van stockoplossing A (4.5.1) en pipetteer in afzonderlijke maatkolven van 20 ml; pipetteer 2 ml interne standaardoplossing B (4.5.2) in elke maatkolf, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

Voor de oplossing van 0 g/l wordt de blanco-oplossing (8.4) gebruikt.

4.5.4. Standaardoplossing C

Pipetteer 2 ml standaardoplossing A (4.5.1) in een maatkolf van 20 ml, voeg vervolgens 2 ml interne standaardoplossing B (4.5.2) toe, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

5. Apparatuur

5.1. Een capillaire gaschromatograaf voorzien van een vlamionisatiedetector (FID) en een integrator of een ander systeem voor gegevensverwerking waarmee piekoppervlakten of piekhoogtes kunnen worden gemeten, en met een automatische monsternemer of de noodzakelijke uitrusting voor handmatige monsterinjectie.

5.2. "Split-splitless"-injector

5.3. Capillaire kolom, bijvoorbeeld:

Lengte: 50 m

Interne diameter: 0,32 mm

Filmdikte: 0,2 μm

Stationaire fase: FFAP - gewijzigd TPA polyethyleenglycol gecrosslinkt poreus polymeer

5.4. Gebruikelijke laboratoriumapparatuur: maatkolven klasse A, analytische balans (precisie: ± 0,1 mg).

6. Condities gaschromatografie

Het kolomtype en de kolomafmetingen alsmede de GC-condities moeten zodanig zijn dat anethol en de interne standaard van elkaar en van eventuele andere interfererende substanties gescheiden worden. Typische condities voor de kolom die in 5.3 als voorbeeld wordt gegeven, zijn:

6.1. Dragergas: analytisch helium

6.2. Debiet: 2 ml/min

6.3. Temperatuur van de injector: 250 °C

6.4. Temperatuur van de detector: 250 °C

6.5. Condities van oventemperatuur: isothermisch, 180 °C, looptijd 10 minuten

6.6. Geïnjecteerd volume: 1 μl verdeling 1:40

7. Monsters

De monsters moeten op een donkere plaats bij kamertemperatuur worden bewaard.

8. Procedure

8.1. Monsterscreening op estragol

Om te garanderen dat er niet van nature estragol in het monster aanwezig is, moet een blancoanalyse worden uitgevoerd zonder toevoeging van een interne standaard. Indien estragol van nature aanwezig is, moet een andere interne standaard worden gekozen (bijvoorbeeld menthol).

Pipetteer 2 ml van het monster in een maatkolf van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

8.2. Bereiding van onbekende monsters

Pipetteer 2 ml van het monster in een maatkolf van 20 ml, voeg vervolgens 2 ml interne standaardoplossing B (4.5.2) toe, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

8.3. Blanco

Pipetteer 2 ml interne standaardoplossing B (4.5.2) in een maatkolf van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (v/v) (4.4) en meng zorgvuldig.

8.4. Lineariteitscontrole

Vóór de analyse moet de lineariteit van de respons van de detector gecontroleerd worden door achtereenvolgens elke standaardoplossing voor lineariteitscontrole (4.5.3) in triplo te analyseren.

Bereken uit de piekhoogtes of de piekoppervlakten van elke injectie de verhouding R en zet R uit tegen de concentratie van de moederoplossing in g/l.

R= piekhoogte of piekoppervlakte van trans-anethol gedeeld door de piekhoogte of de piekoppervlakte van estragol.

Deze curve moet lineair zijn.

8.5. Bepaling

Injecteer de blanco-oplossing (8.3), gevolgd door standaardoplossing C (4.5.4) en daarna een van de lineariteitsstandaarden (4.5.3), die als kwaliteitscontrolemonster moet fungeren (dit monster kan op grond van de waarschijnlijke concentratie van trans-anethol in het onbekende monster worden gekozen), en vervolgens vijf onbekende monsters (8.2); injecteer na telkens vijf onbekende monsters een lineariteitsmonster (kwaliteitscontrole), om na te garanderen dat de analyse stabiel is.

9. Berekening van de responsfactor

Meet voor trans-anethol en de interne standaard de piekoppervlakte (met behulp van een integrator of een ander systeem voor gegevensverwerking) of de piekhoogte (handmatige integratie).

9.1. Berekening van responsfactor (RFi)

De responsfactor wordt als volgt berekend:

RFi = (Ci/oppervlakte of hoogtei ) * (oppervlakte of hoogteis/Cis).

Hierbij is:

Ci de concentratie van trans-anethol in standaardoplossing A (4.5.1);

Cis de concentratie van de interne standaard in standaardoplossing B (4.5.2);

oppervlaktei de piekoppervlakte (of de piekhoogte) van trans-anethol;

oppervlakteis de piekoppervlakte (of de piekhoogte) van de interne standaard.

RFi wordt berekend uit de vijf monsters van standaardoplossing C (4.5.4).

9.2. Analyse van de oplossingen van de lineariteitscontrole

Injecteer de oplossingen van de lineariteitscontrole (4.5.3).

9.3. Analyse van het monster

Injecteer de oplossing van het onbekende monster (8.2).

10. Berekening van de resultaten

De formule voor de berekening van de concentratie van trans-anethol is:

ci = Cis * (oppervlakte of hoogtei/oppervlakte of hoogteis) * RFi

Hierbij is:

ci de onbekende concentratie van trans-anethol;

Cis de concentratie van de interne standaard in het onbekende monster (4.5.2);

Oppervlakte of hoogtei de piekoppervlakte of de piekhoogte van trans-anethol;

Oppervlakte of hoogte isis de piekoppervlakte of de piekhoogte van de interne standaard;

RFi de responscoëfficiënt (berekend overeenkomstig 9.1).

De concentratie van trans-anethol wordt uitgedrukt in g/l met één decimaal.

11. Kwaliteitsborging en -controle

De chromatogrammen moeten zodanig zijn dat anethol en de interne standaard van elkaar en van eventuele interfererende substanties gescheiden worden. De waarde RFi wordt berekend uit de resultaten van de vijf injecties van standaardoplossing C (4.5.4). Als de variatiecoëfficiënt (VC % = (standaardafwijking/gemiddelde) * 100) binnen ± 1 % ligt, is de gemiddelde waarde van RFi aanvaardbaar.

De bovengenoemde berekening moet worden gebruikt om de concentratie van trans-anethol in het monster (4.5.3) dat voor kwaliteitscontrole uit de oplossingen voor lineariteitscontrole is geselecteerd, te berekenen.

Als de gemiddelde berekende resultaten van de analyse van de voor de interne kwaliteitscontrole geselecteerde lineariteitsoplossing binnen ± 2,5 % van de theoretische waarde liggen, kunnen de resultaten van de onbekende monsters aanvaard worden.

12. Behandeling van monsters van gedistilleerde dranken met een hoog gehalte aan suikers en van likeurmonsters vóór de GC-analyse

Extractie van alcohol van een gedistilleerde drank met een hoog gehalte aan suikers om de concentratie van trans-anethol te kunnen bepalen door middel van capillaire gaschromatografie.

12.1. Principe

Aan een aliquot van het likeurmonster wordt de interne standaard toegevoegd met een concentratie die vergelijkbaar is met de concentratie van de analyt (trans-anethol) in de likeur. Hieraan worden natriumfosfaatdodecahydraat en watervrije ammoniumsulfaat toegevoegd. Het verkregen mengsel wordt goed geschud en afgekoeld. Er vormen zich twee lagen; de bovenste alcohollaag wordt afgetapt. Er wordt een aliquot van deze alcohollaag genomen en verdund met een 45 %-ethanoloplossing (4.4). (Opmerking: in deze fase wordt geen interne standaard toegevoegd, omdat die reeds is toegevoegd.) De resulterende oplossing wordt met gaschromatografie geanalyseerd.

12.2. Reagentia en materialen

Gebruik bij de extractie uitsluitend reagentia met een zuiverheid boven 99 %.

12.2.1. Ammoniumsulfaat, watervrij (CAS 7783-20-2)

12.2.2. Natriumfosfaat, tweebasisch, dodecahydraat (CAS 10039-32-4)

12.3. Apparatuur

Erlenmeyers, scheikolven, koelkast.

12.4. Procedure

12.4.1. Monsterscreening op estragol

Om te garanderen dat er niet van nature estragol in het monster aanwezig is, moeten een blanco-extractie (12.6.2) en analyse zonder toevoeging van een interne standaard worden uitgevoerd. Indien estragol van nature aanwezig is, moet een andere interne standaard worden gekozen.

12.4.2. Extractie

Pipetteer 5 ml ethanol 96 % (4.1) in een erlenmeyer; doe 50 mg interne standaard (4.3) in deze erlenmeyer en voeg 50 ml van het monster toe. Voeg 12 g ammoniumsulfaat, watervrij (12.2.1) en 8,6 g tweebasisch natriumfosfaat dodecahydraat (12.2.2) toe. Doe de stop op de erlenmeyer.

Schud de erlenmeyer gedurende ten minste 30 minuten. Er mag een mechanisch schudapparaat worden gebruikt, maar geen met teflon gecoate magnetische roerstaaf, aangezien teflon een klein gedeelte van de analyt absorbeert. Opmerking: de toegevoegde zouten zullen niet volledig oplossen.

Zet de afgesloten erlenmeyer ten minste twee uur in een koelkast (T < 5 °C).

Hierna moeten er twee afzonderlijke lagen zijn en een vast residu. De alcohollaag moet helder zijn; indien dit niet het geval is, moet de erlenmeyer opnieuw in de koelkast gezet worden totdat een duidelijke scheiding opgetreden is.

Neem zodra de alcohollaag helder is, een aliquot (10 ml bijvoorbeeld) zonder de waterlaag te verstoren. Doe het aliquot in een bruin flesje en sluit dat goed af.

12.4.3. Bereiding van het te analyseren geëxtraheerde monster

Laat het extract (12.4.2) op kamertemperatuur komen.

Pipetteer 2 ml van de alcohollaag van het op temperatuur gebrachte geëxtraheerde monster in een maatkolf van 20 ml, vul tot de maatstreep aan met ethanol 45 % (4.4) en meng zorgvuldig.

12.5. Bepaling

Volg de in punt 8.5 aangegeven procedure.

12.6. Berekening van de resultaten

Gebruik bij de berekening van de resultaten de volgende formule:

Ci = ( mis/V) * (oppervlaktei/oppervlakteis) * RFi

Hierbij is:

mis het gewicht van de genomen (12.4.2) intrene standaard (4.3) (in mg)

V het volume van het onbekende monster (50 ml)

RFi de responsfactor (9.1)

oppervlaktei de piekoppervlakte van trans-anethol

oppervlakteis de piekoppervlakte van de interne standaard

De resultaten worden uitgedrukt in g/l met één decimaal.

12.7. Kwaliteitsborging en -controle

Volg de onder punt 11 aangegeven procedure.

13. Karakteristieken van de resultaten van de methode (precisie)

Statistische resultaten van het interlaboratoriumonderzoek:

De volgende tabellen geven de waarden voor anethol.

Een internationaal onderzoek naar de resultaten van de methode, uitgevoerd volgens internationaal overeengekomen procedures, heeft de volgende gegevens opgeleverd.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Soorten monsters:

A pastis, blinde duplo's

B pastis, blinde duplo's

C pastis, blinde duplo's

D pastis, blinde duplo's

E pastis, één monster

F pastis, één monster

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Soorten monsters:

G ouzo, "split"-niveaus (*)

H anijs, blinde duplo's

I met anijs gearomatiseerde likeur, duplo's

J met anijs gearomatiseerde likeur, duplo's

VI. GLYCYRRHIZINEZUUR. BEPALING VAN GLYCYRRHIZINEZUUR MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE

1. Toepassingsgebied

Deze methode dient voor de bepaling van glycyrrhizinezuur in met anijs gearomatiseerde gedistilleerde dranken met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC). Verordening (EEG) nr. 1576/89 bepaalt dat een met anijs gearomatiseerde gedistilleerde drank die pastis wordt genoemd, tussen 0,05 en 0,5 g glycyrrhizinezuur per liter moet bevatten.

2. Referentienormen

ISO 3696: 1987 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Principe

De concentratie glycyrrhizinezuur wordt bepaald met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met uv-detectie. Een standaardoplossing en het testmonster worden gefiltreerd en afzonderlijk rechtstreeks in het HPLC-systeem geïnjecteerd.

4. Reagentia en materialen

Gebruik bij de analyse uitsluitend reagentia van HPLC-kwaliteit, absolute ethanol en water van minimaal klasse 3, zoals gedefinieerd in ISO 3696.

4.1. Ethanol 96 % (v/v) (CAS 64-17-5)

4.2. Ammoniumglycyrrhizinaat, C42H62O16NH3 (Glycyrrhizinezuur-ammoniumzout)

(Mol. Wt. 839,98)(CAS 53956-04-0): zuiverheid ten minste 90 %.

(Mol. Wt. glycyrrhizinezuur 822,94)

4.3. IJsazijn, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.4. Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1)

4.5. Ethanol 50 % (v/v)

Voor 1000 ml bij 20 °C:

- ethanol 96 % (v/v) (4.1): 521 ml

- water (2.0): 511 ml.

4.6. Bereiding van de HPLC-elutieoplossingen

4.6.1. Elutieoplossing A (voorbeeld)

80 delen (volumegehalte) water (2.0)

20 delen (volumegehalte) azijnzuur (4.3).

Ontgas de elutieoplossing gedurende vijf minuten.

Opmerking:

Indien het gebruikte water niet gemicrofiltreerd is, is het raadzaam de bereide elutieoplossing te filtreren over een filter voor organische oplossingen met een poriëngrootte kleiner dan of gelijk aan 0,45 μm.

4.6.2. Elutieoplossing B

Methanol (4.4)

4.7. Bereiding van standaardoplossingen

Alle standaardoplossingen moeten na twee maanden vers worden bereid.

4.7.1. Referentieoplossing C

Weeg op 0,1 mg nauwkeurig 25 mg ammoniumglycyrrhizinaat (4.2) af in een maatkolf van 100 ml. Voeg een beetje ethanol 50 % (v/v) (4.5) toe en los het ammoniumglycyrrhizinaat op. Als het ammoniumglycyrrhizinaat opgelost is, aanvullen tot de maatstreep met ethanol 50 % (v/v) (4.5).

Filtreer over een filter voor organische oplossingen.

4.7.2. Standaardoplossingen (gebruikt voor lineariteitscontrole van de respons van het systeem)

Bereid een stockoplossing van 1,0 g/l door op 0,1 mg nauwkeurig 100 mg ammoniumglycyrrhizinaat af te wegen in een maatkolf van 100 ml. Voeg wat ethanol 50 % (v/v) (4.5) toe en los het ammoniumglycyrrhizinaat op. Als het ammoniumglycyrrhizinaat is opgelost, aanvullen tot de maatstreep met ethanol 50 % (v/v) (4.5).

Bereid ten minste vier andere oplossingen die corresponderen met concentraties van 0,05, 0,1, 0,25 en 0,5 g/l ammoniumglycyrrhizinaat door respectievelijk 5, 10, 25 en 50 ml van de stockoplossing van 1,0 g/l te pipetteren in afzonderlijke maatkolven van 100 ml. Vervolgens aanvullen tot de maatstreep met ethanol 50 % (v/v) (4.5) en zorgvuldig mengen.

Filtreer alle oplossingen over een filter voor organische oplossingen.

5. Apparatuur

5.1. Scheidingssysteem

5.1.1. Hogedrukvloeistofchromatograaf

5.1.2. Pompsysteem waarmee een constant of geprogrammeerd debiet met een grote nauwkeurigheid kan worden bereikt en gehandhaafd.

5.1.3. UV spectrofotometrisch detectiesysteem: in te stellen op 254 nm

5.1.4. Ontgassingsysteem voor de oplossingen

5.2. Verwerkingsintegrator of recorder, die compatibel moet zijn met de rest van het systeem.

5.3. Kolom (voorbeeld):

Materiaal: roestvrij staal of glas

Inwendige diameter: 4-5 mm

Lengte: 100-250 mm

Stationaire fase: gecrosslinkte silica met een (bij voorkeur bolvormige) octadecyl functiegroep (C18), maximale deeltjesgrootte: 5 μm.

5.4. Laboratoriumapparatuur

5.4.1. Analytische balans met een precisie van 0,1 mg

5.4.2. Maatkolven klasse A

5.4.3. Apparatuur voor micromembraanfiltratie voor kleine volumes.

6. Condities gaschromatografie

6.1. Elutiekarakteristieken: (voorbeeld)

- debiet: 1 ml/minuut

- oplossing A = 30 %

- oplossing B = 70 %.

6.2. Detectie:

- UV = 254 nm.

7. Procedure

7.1. Bereiding van het monster van gedistilleerde dranken

Filtreer, indien nodig, over een filter voor organische oplossingen (poriëndiameter: 0,45 μm).

7.2. Bepaling

Als de condities voor de gaschromatograe eenmaal gestabiliseerd zijn:

- injecteer 20 μl van referentieoplossing C (4.7.1)

- injecteer 20 μl van de monsteroplossing

- vergelijk de twee chromatogrammen. Identificeer de glycyrrhizinezuurpieken aan de hand van de retentietijd. Meet de oppervlakten (of hoogtes) en bereken de concentratie in g/l op twee decimalen nauwkeurig met behulp van de volgende vergelijking:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Hierbij is:

c de concentratie in g/l van glycyrrhizinezuur in de geanalyseerde gedistilleerde drank;

C de concentratie in g/l van ammoniumglycyrrhizinaat in de referentieoplossing;

h de oppervlakte (of hoogte) van de glycyrrhizinezuurpiek van de geanalyseerde gedistilleerde drank;

H de oppervlakte (of hoogte) van de glycyrrhizinezuurpiek van de referentieoplossing;

P de zuiverheid van de referentieammoniumglycyrrhizinaat (in %);

823 de massa van een mol glycyrrhizinezuur;

840 de massa van een mol ammoniumglycyrrhizinaat.

8. Karakteristieken van de resultaten van de methode (precisie)

Statistische resultaten van het interlaboratoriumonderzoek:

De volgende tabel geeft de waarden voor glycyrrhizinezuur.

Een internationaal onderzoek naar de resultaten van de methode, uitgevoerd volgens internationaal overeengekomen procedures, heeft de volgende gegevens opgeleverd.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Soorten monsters:

A pastis, blinde duplo's

B pastis, "split"-niveaus (*)

C pastis, blinde duplo's

D pastis, blinde duplo's

E pastis, blinde duplo's

VII. CHALCONEN. HPLC-METHODE VOOR ONDERZOEK NAAR DE AANWEZIGHEID VAN CHALCONEN IN PASTIS

1. Toepassingsgebied

Deze methode dient voor de bepaling van de aanwezigheid van chalconen in met anijs gearomatiseerde gedistilleerde dranken. Chalconen zijn natuurlijke kleurstoffen van de flavonoïdenfamilie die voorkomen in zoethout (Glycyrrhiza glabra).

Een met anijs gearomatiseerde gedistilleerde drank mag alleen "pastis" worden genoemd, als het product chalconen bevat (Verordening (EEG) nr. 1576/89).

2. Referentienormen

ISO 3696: 1987, Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods

3. Principe

Er wordt een referentie-extract van zoethout bereid. De aanwezigheid of afwezigheid van chalconen wordt bepaald met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met uv-detectie.

4. Reagentia en materialen

Gebruik bij de analyse uitsluitend reagentia van HPLC-kwaliteit, ethanol 96 % (v/v) en water van klasse 3, zoals gedefinieerd in ISO 3696.

4.1. Ethanol 96 % (v/v) (CAS 64-17-5)

4.2. Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3. Referentiesubstantie: Glycyrrhiza glabra: zoethout, "sweet root".

Grof gemalen zoethout (Glycyrrhiza glabra). Staafjes van een gemiddelde lengte van 10-15 mm en een gemiddelde doorsnee van 1-3 mm.

4.4. Natriumacetaat, CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5. IJsazijn, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6. Bereiding van oplossingen

4.6.1. Ethanol 50 % (v/v)

Voor 1000 ml bij 20 °C:

- ethanol 96 % (v/v) (4.1): 521 ml

- water (2.0): 511 ml

4.6.2. Oplossing A: acetonitril

Acetonitril (4.2) van HPLC analytische zuiverheid.

Ontgas

4.6.3. Oplossing B: 0,1M natriumacetaat bufferoplossing, pH 4,66.

Weeg 8,203 g natriumacetaat (4.4) af, voeg 6,005 g ijsazijn (4.5) toe en vul aan tot 1000 ml met water (2) in een maatkolf.

5. Bereiding van het referentie-extract van glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1. Weeg 10 g gemalen zoethout (Glycyrrhiza glabra) (4.3) af en doe dit in een rondbodemkolf.

- Voeg 100 ml ethanol 50 % (v/v) (4.6.1) toe.

- Kook het mengsel onder reflux gedurende een uur.

- Filtreer.

- Zet het filtraat weg voor later gebruik.

5.2. Neem het zoethoutextract uit de filter

- Doe het in een rondbodemkolf.

- Voeg 100 ml ethanol 50 % (v/v) (4.6.1) toe.

- Kook het mengsel onder reflux gedurende een uur.

- Filtreer. Zet het filtraat weg voor later gebruik.

5.3. De zoethoutextractie moet drie keer achter elkaar worden uitgevoerd.

5.4. Voeg de drie filtraten samen.

5.5. Verdamp het oplosmiddel (van 5.4.) met een rotatieverdamper.

5.6. Vul het verkregen extract (5.5) aan met 100 ml ethanol 50 % (v/v) (4.6.1).

6. Apparatuur

6.1. Scheidingssysteem

6.1.1. Hogedrukvloeistofchromatograaf

6.1.2. Pompsysteem waarmee een constant of geprogrammeerd debiet met hoge druk kan worden bereikt en gehandhaafd.

6.1.3. UV/zichtbaar spectrofotometrisch detectiesysteem dat op 254 en 370 nm kan worden ingesteld.

6.1.4. Ontgassingsysteem voor de oplossingen

6.1.5. Kolomoven die op een temperatuur van 40 ± 0,1 °C kan worden ingesteld.

6.2. Verwerkingsintegrator of recorder die compatibel is met de rest van het scheidingssysteem.

6.3. Kolom

Materiaal: roestvrij staal of glas

Inwendige diameter: 4-5 mm

Stationaire fase: gecrosslinkte silica met een octadecyl afgeleide functiegroep (C18), deeltjesgrootte: 5 μm maximaal (gecrosslinkte fase).

6.4. Gebruikelijke laboratoriumapparatuur:

6.4.1. Analytische balans (precisie: ± 0,1 mg).

6.4.2. Destillatieapparatuur met refluxcondensor, bestaande uit bijvoorbeeld:

- een rondbodemkolf van 250 ml met een gestandaardiseerd verbindingsstuk van geslepen glas,

- een refluxcondensor met een lengte van 30 cm, en

- een warmtebron (door een adequate opstelling moeten eventuele pyrogene reacties met het extractiemateriaal voorkomen worden).

6.4.3. Rotatieverdamper

6.4.4. Filtreerapparaat (bijvoorbeeld Buchnertrechter)

6.5. GC-condities (voorbeeld)

6.5.1. Elutiekarakteristieken van oplossing A (4.6.2) en B (4.6.3):

- verander van 20/80 (v/v) naar 50/50 (v/v) gradiënt in 15 minuten;

- verander van 50/50 (v/v) naar 75/25 (v/v) gradiënt in 5 minuten;

- gelijke concentratie op 75/25 (v/v) gedurende 5 minuten;

- stabilisatie van de kolom tussen de injecties:

- gelijke concentratie op 20/80 (v/v) gedurende 5 minuten.

6.5.2. Debiet: 1 ml/minuut.

6.5.3. Instellingen van de uv-detector:

De detector moet op 370 nm worden ingesteld om de aanwezigheid van chalconen op te sporen, en vervolgens op 254 nm om glycyrrhizinezuur op te sporen.

Opmerking:

de verandering van de golflengte (van 370 nm naar 254 nm) moet 30 seconden vóór het begin van de elutiepiek van glycyrrhizinezuur worden uitgevoerd.

7. Procedure

7.1. Bereiding van het monster van gedistilleerde dranken

Filtreer over een filter voor organische oplossingen (poriëndiameter: 0,45 μm).

7.2. Bereiding van het zoethoutextract (5.6)

Maak vóór de analyse een verdunning van een op tien met ethanol 50 % (v/v) (4.6.1).

7.3. Bepaling

7.3.1. Injecteer 20 μl bereid zoethoutextract (7.2). Voer de analyse uit volgens de in punt 6.5 beschreven GC-condities.

7.3.2. Injecteer 20 μl van de monsteroplossing (7.1). Andere met anijs gearomatiseerde gedistilleerde dranken: Voer de analyse uit volgens de in punt 6.5 beschreven GC-condities.

7.3.3. Vergelijk de twee chromatogrammen. Er moet een grote overeenkomst zijn tussen de twee chromatogrammen in de uittreezone van chalconen (tijdens de detectie op 370 nm onder de hierboven beschreven analysecondities) (zie figuur 1).

8. Karakteristiek chromatogram voor pastis

Figuur 1

Het via de hierboven beschreven methode verkregen chromatogram toont de aanwezigheid van chalconen in "pastis". De pieken 1 tot en met 8 zijn chalconen en piek 9 is glycyrrhizinezuur

>PIC FILE= "L_2002322NL.002301.TIF">

9. Karakteristieken van de resultaten van de methode (precisie)

Resultaten van het interlaboratoriumonderzoek:

De volgende tabel geeft de resultaten van herkenning van aanwezigheid of afwezigheid van chalconen in pastis en met anijs gearomatiseerde gedistilleerde dranken.

Een internationaal onderzoek naar de resultaten van de methode, uitgevoerd volgens internationaal overeengekomen procedures, heeft de volgende gegevens opgeleverd.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Soorten monsters:

A pastis, blinde duplo's

B pastis, één monster

C pastis, één monster

D "pastis" (zonder chalconen), blinde duplo's

E "pastis" (zonder chalconen), blinde duplo's

F met anijs gearomatiseerde likeur (zonder chalconen), blinde duplo's

G met anijs gearomatiseerde likeur (zonder chalconen), blinde duplo's

H ouzo (zonder chalconen), één monster

I ouzo (zonder chalconen), één monster

J anijs (zonder chalconen), blinde duplo's

K "pastis" (zonder chalconen), blinde duplo's

IX. EIGEEL. BEPALING VAN DE CONCENTRATIE EIGEEL IN GEDISTILLEERDE DRANKEN - FOTOMETRISCHE METHODE

1. Toepassingsgebied

Deze methode dient voor de bepaling van de concentratie eigeel in eierlikeur en likeur met ei voor het gebied van 40-250 g/l.

2. Referentienormen

ISO 3696: 1897 Water for analytical laboratory use - Specifications and test methods.

3. Principe

De in ethanol oplosbare fosforverbindingen in eigeel worden geëxtraheerd en het fosformolybdaatcomplex wordt fotometrisch bepaald.

4. Reagentia en materialen

4.1. Dubbel gedistilleerd water

4.2. Diatomeeënaarde

4.3. Ethanol 96 % (v/v) (CAS 64-17-5)

4.4. 15 % magnesiumacetaatoplossing (CAS 16674-78-5)

4.5. 10 % zwavelzuur (CAS 7664-93-9)

4.6. 1 N zwavelzuur

4.7. 0,16 g/l kaliumhydrofosfaatoplossing (CAS 778-77-0), KH2PO4

4.8. Reagens voor fosfaatbepaling:

Los 20 g ammoniummolybdaat (CAS 12054-85-2) (NH4)6Mo7O24.4H2O op in 400 ml water van 50 °C.

Los in een ander recipiënt 1 g ammoniumvanadaat (CAS 7803-55-6) NH4VO3 op in 300 ml warm water, laat het afkoelen en voeg vervolgens 140 ml geconcentreerd salpeterzuur (CAS 7697-37-2) toe. Doe de afgekoelde oplossingen in een maatkolf van 1000 ml en vul aan tot de maatstreep van 1000 ml.

5. Apparatuur

5.1. Erlenmeyer van 100 ml

5.2. Ultrasoon bad (of magneetroerder)

5.3. Maatkolf van 100 ml

5.4. Waterbad van 20 °C

5.5. Filter (Whatman nr. 4 of gelijkwaardig)

5.6. Porseleinen (of platina) kroes

5.7. Kokendwaterbad

5.8. Hete plaat

5.9. Moffeloven

5.10. Maatkolf van 50 ml

5.11. Maatkolf van 20 ml

5.12. Spectrofotometer ingesteld op 420 nm

5.13. Cuvette van 1 cm.

6. Monsters

De monsters moeten vóór de analyse bij kamertemperatuur worden bewaard.

7. Procedure

7.1. Bereiding van het monster

7.1.1. Weeg 10 g van het monster af in een erlenmeyer van 100 ml (5.1).

7.1.2. Voeg geleidelijk 70 ml ethanol (4.3) in kleine porties toe, daarbij telkens de erlenmeyer zwenkend. Plaats vervolgens de erlenmeyer 15 minuten in een ultrasoon bad (5.2) (of roer het mengsel met een magneetroerder (5.2) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur).

7.1.3. Breng de inhoud van de erlenmeyer over in een maatkolf van 100 ml (5.3) en spoel na met ethanol (4.3). Vul tot de maatstreep aan met ethanol (4.3) en zet de maatkolven in een waterbad van 20 °C (5.4). Vul aan tot de maatstreep bij 20 °C.

7.1.4. Voeg een kleine hoeveelheid diatomeeënaarde (4.2) toe en filtreer (5.5), gooi de eerste 20 ml weg.

7.1.5. Breng 25 ml van het filtraat over in een porseleinen (of platina) kroes (5.6). Het filtraat moet vervolgens geconcentreerd worden door voorzichtige verdamping in een kokendwaterbad (5.7) met toevoeging van 5 ml 15 %-magnesiumacetaatoplossing (4.4).

7.1.6. Zet de kroezen op een hete plaat (5.8) en verwarm ze tot ze net droog zijn.

7.1.7. Veras het residu door verhitting tot gloeiing op 600 °C in een moffeloven (5.9) tot de as wit is, minimaal anderhalf uur, maar mag een nacht blijven staan.

7.1.8. Voeg 10 ml 10 %-zwavelzuur (4.5) bij de as; breng de asoplossing, ook via naspoelen met gedistilleerd water (4.1), over in een maatkolf van 50 ml (5.10) en vul op kamertemperatuur tot de maatstreep aan met gedistilleerd water (4.1). Een aliquot van 5 ml van deze asoplossing wordt gebruikt bij de bereiding van de monsteroplossing voor de fotometrische fosfaatbepaling.

7.2. Fotometrische fosfaatbepaling

7.2.1. Vergelijkingsoplossing

7.2.1.1. Doe 10 ml 10 %-zwavelzuur (4.5) in een maatkolf van 50 ml (5.10) en vul tot de maatstreep aan met gedistilleerd water (4.1).

7.2.1.2. Voeg aan een aliquot van 5 ml van deze oplossing (7.2.1.1) in een maatkolf van 20 ml (5.11) 1 ml 1 N zwavelzuur (4.6) en 2 ml fosfaatreagens (4.8) toe en vul tot 20 ml aan met gedistilleerd water (4.1).

7.2.1.3. Sluit de maatkolf af met een los opgezette stop, schud en verwarm gedurende 10 minuten in een kokendwaterbad (5.7); laat vervolgens gedurende 20 minuten afkoelen in een waterbad van 20 °C (5.4).

7.2.1.4. Vul een cuvette van 1 cm (5.13) met deze vergelijkingsoplossing.

7.2.2. Monsteroplossing

7.2.2.1. Voeg aan een aliquot van 5 ml van de asoplossing (7.1.8) in een maatkolf van 20 ml (5.11) 1 ml 1 N zwavelzuur (4.6) en 2 ml fosfaatreagens (4.8) toe en vul tot 20 ml aan met gedistilleerd water (4.1).

7.2.2.2. Sluit de maatkolf af met een los opgezette stop, schud en verwarm gedurende 10 minuten in een kokendwaterbad (5.7); laat vervolgens gedurende 20 minuten afkoelen in een waterbad van 20 °C (5.4.).

7.2.2.3. De gele oplossing die ontstaat, wordt onmiddellijk spectrofotometrisch geanalyseerd (5.12) in een cuvette van 1 cm (5.13) bij 420 nm met de vergelijkingsoplossing (7.2.1.4) als blanco.

7.2.3. Kalibratiecurve

7.2.3.1. Voeg, om de kalibratiecurve te maken, aliquots van 2 ml van het fosfaatreagens (4.8) toe in de maatkolven van 20 ml (5.11) die elk 1 ml 1 N zwavelzuur (4.6) en respectievelijk 0, 2, 4, 6, 8 en 10 ml kaliumhydrofosfaatoplossing (4.7) bevatten, en vul tot de 20 ml maatstreep aan met gedistilleerd water (4.1).

7.2.3.2. Sluit af met een los opgezette stop, schud en verwarm gedurende 10 minuten in een kokendwaterbad (5.7); laat vervolgens gedurende 20 minuten afkoelen in een waterbad van 20 °C (5.4) en analyseer spectrofotometrisch (5.12) in een cuvette van 1 cm (5.13) bij 420 nm met de vergelijkingsoplossing (7.2.1.4) als blanco.

7.2.3.3. Constructie van de kalibratiecurve:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

8. Berekening van de resultaten

Het gehalte aan eigeel in g/l wordt berekend met de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Hierbij is:

110 de omrekeningsfactor voor de totale hoeveelheid P2O5 in g in 100 g eigeel,

mg P2O5 via de kalibratiecurve bepaalde waarde,

dichtheid massa per volume-eenheid (g/ml) van de eierlikeur bij 20 °C,

E gewicht in g van de likeur op basis van eieren,

40 verdunningsfactor voor een aliquot van 5 ml asoplossing.

9. Karakteristieken van de resultaten van de methode (precisie)

Statistische resultaten van het interlaboratoriumonderzoek:

De volgende tabel geeft de waarden voor eigeel.

Een internationaal onderzoek naar de resultaten van de methode, uitgevoerd volgens internationaal overeengekomen procedures, heeft de volgende gegevens opgeleverd.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Soorten monsters:

A Advocaat, Blinde duplo's

B Advocaat, Blinde duplo's

C Advocaat, Blinde duplo's

D Advocaat (verdund), "Split" niveaus (*)

E Advocaat, Blinde duplo's