Verordening (EG) nr. 213/2001 van de Commissie

van 9 januari 2001

houdende uitvoeringsbepalingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999, wat betreft de referentiemethoden voor de analyse en de kwaliteitsbeoordeling van melk en zuivelproducten, en houdende wijziging van de Verordeningen (EG) nr. 2771/1999 en (EG) nr. 2799/1999

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EG) nr. 1255/1999 van de Raad van 17 mei 1999 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelproducten(1), en met name op de artikelen 10 en 15, artikel 26, lid 3, artikel 29, lid 1, en artikel 31, lid 14,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) Bij de Verordeningen (EEG) nr. 1216/68, (EEG) nr. 3942/92, (EG) nr. 86/94, (EG) nr. 2721/95, (EG) nr. 1080/96, (EG) nr. 1081/96, (EG) nr. 1082/96, (EG) nr. 1854/96, (EG) nr. 880/98 en (EG) nr. 1459/98 van de Commissie, waarvan de volledige referenties in bijlage XXVI bij deze verordening zijn vermeld, zijn de referentie- en routinemethoden voor de analyse en de kwaliteitsbeoordeling van melk en zuivelproducten en de toepassingsgebieden en -regels voor die methoden vastgesteld. Om redenen van duidelijkheid en om de marktdeelnemers in de betrokken sector één enkel corpus met de genoemde toepassingsmethoden en -regels te verstrekken, moeten de bovengenoemde verordeningen worden herschreven en worden samengebracht in één tekst. Met hetzelfde doel moeten Verordening (EG) nr. 2771/1999 van de Commissie van 16 december 1999 houdende uitvoeringsbepalingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999 van de Raad ten aanzien van de interventiemaatregelen op de markt voor boter en room(2), en Verordening (EG) nr. 2799/1999 van 17 december 1999 houdende uitvoeringsbepalingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999 van de Raad ten aanzien van de toekenning van steun voor ondermelk en mageremelkpoeder voor voederdoeleinden en de verkoop van voornoemd mageremelkpoeder(3), worden gewijzigd om de bijlagen over analysemethoden te kunnen opnemen in deze verordening.

(2) De samenstellings- en kwaliteitskenmerken van melk en zuivelproducten die zijn vastgesteld in het kader van de regelingen van Verordening (EG) nr. 1255/1999, moeten worden geverifieerd om te garanderen dat zij strikt beantwoorden aan de vastgestelde eisen.

(3) Vaak wordt bepaald dat de referentiemethoden voor dergelijke controles de methoden zijn die worden bekendgemaakt door internationale organisaties zoals CEN, IDF, ISO en AOAC, en die regelmatig door die organisaties worden bijgewerkt. In bepaalde gevallen is een communautaire referentiemethode vastgesteld. In andere gevallen is in de communautaire wetgeving geen referentiemethode gespecificeerd. Om uniforme toepassing van de referentiemethoden te garanderen, is het dienstig jaarlijks een lijst van referentiemethoden vast te stellen en te bepalen dat de toe te passen referentiemethode op die lijst moeten voorkomen.

(4) De toepassing van routinemethoden mag niet worden uitgesloten; derhalve moeten de voorwaarden voor de toepassing van dergelijke methoden nader worden bepaald.

(5) Om te komen tot een uniforme praktijk voor de beoordeling van de analyseresultaten, moeten ook terzake gemeenschappelijke methoden worden vastgesteld. Dit geldt ook voor de sensorische beoordeling van de betrokken producten en voor heronderzoek bij betwisting van resultaten.

(6) Voor bepaalde analyses bestaan momenteel geen internationaal aanvaarde en gevalideerde referentiemethodes; als gevolg daarvan zijn geen gegevens beschikbaar over de verschillen in analyseresultaten tussen laboratoria. Derhalve moeten op communautair niveau methoden worden vastgesteld die volgens internationaal vastgestelde regels zijn gevalideerd en die als referentiemethode worden toegepast.

(7) In Verordening (EG) nr. 2571/97 van de Commissie van 15 december 1997 betreffende de verkoop van boter tegen verlaagde prijs en de toekenning van steun voor room, boter en boterconcentraat voor de vervaardiging van banketbakkerswerk, consumptie-ijs en andere voedingsmiddelen(4), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 635/2000(5), is bepaald dat in sommige omstandigheden verklikstoffen aan room, boter of boterconcentraat moeten worden toegevoegd om te garanderen dat deze producten de voorgeschreven eindbestemming krijgen. Gezien het belang van de toevoeging van verklikstoffen voor het deugdelijk functioneren van de regeling en om gelijke behandeling van de marktdeelnemers die van die regeling gebruik maken te garanderen, is het dienstig, voor zover mogelijk, gemeenschappelijke methoden vast te stellen voor de kwantitatieve bepaling van sommige van die verklikstoffen;

(8) De toevoeging van verklikstoffen aan boterconcentraat moet worden gecontroleerd overeenkomstig Verordening (EEG) nr. 3143/85 van de Commissie van 11 november 1985 betreffende de afzet tegen verlaagde prijs van interventieboter bestemd voor onmiddellijk verbruik in de vorm van boterconcentraat(6), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 101/1999(7), overeenkomstig Verordening (EG) nr. 429/90 van de Commissie van 20 februari 1990 betreffende de toekenning, via openbare inschrijving, van steun voor boterconcentraat voor rechtstreekse consumptie in de Gemeenschap(8), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 124/1999(9), en overeenkomstig Verordening (EG) nr. 2571/97. De strikte naleving van de bepalingen voor het gebruik van verklikstoffen in boterconcentraat is essentieel om fraude te voorkomen. Het is derhalve dienstig een gemeenschappelijke methode vast te stellen voor het opsporen van deze verklikstoffen.

(9) Op grond van artikel 9 van Verordening (EG) nr. 1255/1999 mag steun voor de particuliere opslag van uit schapenmelk vervaardigde kaas worden verleend. Op grond van artikel 31 van diezelfde verordening kan voor diezelfde producten een bijzondere restitutie worden toegekend. Verder is bepaald dat uit bepaalde derde landen onder preferentiële voorwaarden kaas van schapen-, geiten- of buffelmelk of van mengsels van schapen-, geiten- en buffelmelk in de Gemeenschap wordt ingevoerd. Met het oog op de bovenstaande bepalingen moet via adequate controles worden geverifieerd of in de betrokken producten geen koemelk is verwerkt. Derhalve dient een communautaire referentiemethode voor het opsporen van koemelk te worden vastgesteld, hetgeen geen beletsel mag zijn voor de toepassing van routinemethoden, mits die aan bepaalde criteria beantwoorden.

(10) In Verordening (EEG) nr. 2921/90 van de Commissie van 10 oktober 1990 betreffende de steunverlening voor ondermelk die tot caseïne en caseïnaten wordt verwerkt(10), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 2654/1999(11), is bepaald dat de afwezigheid van colibacteriën moet worden aangetoond. De internationaal aanvaarde referentiemethode voor het onderzoek van melk en zuivelproducten op colibacteriën is de internationale norm FIL73A: 1985. Voor het opsporen van colibacteriën in een bepaalde hoeveelheid product kan deze norm evenwel slechts in een gewijzigde vorm worden toegepast. Derhalve wordt een op bovengenoemde norm gebaseerde communautaire referentiemethode voor het onderzoek op colibacteriën vastgesteld.

(11) In Verordening (EEG) nr. 2658/87 van de Raad van 23 juli 1987 met betrekking tot de tarief- en statistieknomenclatuur en het gemeenschappelijk douanetarief(12), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 254/2000(13), is de hoogte van de invoerrechten voor mengvoeders van GN-code 2309 gedifferentieerd volgens het gehalte aan zuivelproducten. Om ervoor te zorgen dat de betrokken bepalingen uniform worden toegepast, moet een voor alle lidstaten verplichte methode voor de analyse van het gehalte aan lactose worden vastgesteld, waarbij voor een algemeen aanvaarde methode moet worden gekozen.

(12) In Verordening (EG) nr. 1255/1999 is bepaald dat boter en mageremelkpoeder voor interventie, en mageremelkpoeder voor vervoedering aan bepaalde kwaliteitseisen moeten voldoen. Derhalve moeten referentiemethoden voor de toetsing aan die eisen worden vastgesteld.

(13) Voor de tenuitvoerlegging van sommige van de methoden die bij deze verordening worden ingevoerd, is een aanpassingsperiode nodig. De toepassing van die methoden moet derhalve worden uitgesteld.

(14) Het Comité van beheer voor melk en zuivelproducten heeft geen advies uitgebracht binnen de door zijn voorzitter vastgestelde termijn,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

HOOFDSTUK I

ALGEMENE BEPALINGEN

Artikel 1

Doel en toepassingsgebied

In deze verordening worden de regels vastgesteld voor de toepassing van de in de regelingen in het kader van Verordening (EG) nr. 1255/1999 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelproducten vastgestelde methoden voor chemische, fysische en microbiologische analyse en voor sensorische evaluatie van melk en zuivelproducten, alsmede sommige van die methoden.

Artikel 2

Lijst van methoden

1. De lijst van referentiemethoden die van toepassing zijn op de in artikel 1 bedoelde analyses is in bijlage I vastgesteld.

2. Ten minste eenmaal per jaar werkt de Commissie de lijst bij overeenkomstig de procedure van artikel 42 van Verordening (EG) nr. 1255/1999.

Artikel 3

Routinemethoden

Voor de op grond van de communautaire regelgeving uit te voeren analyses mogen routinemethoden worden toegepast, op voorwaarde dat deze goed worden geijkt en regelmatig aan de referentiemethode worden getoetst.

De in bijlage II vervatte procedure kan worden toegepast ter controle van de met routinemethoden verkregen resultaten die de in de betrokken verordeningen vastgestelde grenswaarden benaderen.

Bij geschillen gelden de uitkomsten volgens de referentiemethode.

Artikel 4

Validatie van referentiemethoden

1. Een referentiemethode wordt gevalideerd als zij overeenstemt met vooraf vastgestelde precisiecriteria betreffende de herhaalbaarheids- en de reproduceerbaarheidsgrens.

2. Als een in de betrokken verordeningen vastgestelde referentiemethode niet gevalideerd is, stellen de lidstaten een voorlopige reproduceerbaarheidsgrens vast.

Deze grens wordt bepaald overeenkomstig de procedure van bijlage III, onder b). Gedurende de eerste achttien maanden na de inwerkingtreding van deze verordening mogen de lidstaten echter een gelijkwaardige procedure toepassen.

Ten minste eenmaal per jaar wordt geverifieerd of de vastgestelde grens wordt gehaald.

3. Wanneer uit de resultaten van de toepassing van gevalideerde referentiemethoden of methoden met voorlopige precisiecijfers blijkt dat een grens is overschreden, wordt de in bijlage IV beschreven methode ter evaluatie van de analyseresultaten gebruikt om het kritische verschil ten opzichte van die grens te bepalen.

Artikel 5

Aanvaardbaarheid van analyseresultaten

1. De analyses worden uitgevoerd in laboratoria die een interne kwaliteitscontroleprocedure toepassen conform de in bijlage V, onder a), beschreven methode of een methode van een vergelijkbaar niveau.

Een gedetailleerde beschrijving van de toegepaste methode moet in de laboratoria voorhanden zijn.

2. De laboratoria stellen hun eigen precisienormen binnen een reeks voor alle methoden vast volgens:

a) de in bijlage V, onder b), vastgestelde methode, of

b) een gevalideerde en gepubliceerde methode waarvan de herhaalbaarheid vaststaat.

Of de reproduceerbaarheidsgrens wordt gehaald, moet tenminste eenmaal per jaar worden geverifieerd overeenkomstig de procedure van bijlage III, onder a).

Het bepaalde in de tweede alinea wordt niet toegepast als het laboratorium in de loop van het jaar heeft deelgenomen aan een expertisetestprogramma.

3. Het laboratoriumverslag over de analyseresultaten moet voldoende gegevens bevatten om de resultaten aan de hand van de bijlagen IV en VIII te kunnen beoordelen.

4. De resultaten van een analyse worden aanvaardbaar geacht als zij zijn verkregen overeenkomstig de aanvaardbaarheidscriteria die zijn aangegeven in de in lid 1 bedoelde interne kwaliteitscontroleprocedure en beantwoorden aan de in lid 2 bedoelde eigen precisienormen.

Artikel 6

Sensorische evaluatie

1. Voor boter worden de procedures van bijlage VI toegepast om het werk van de beoordelaars en de betrouwbaarheid van de resultaten te controleren. De in bijlage VII beschreven procedure wordt toegepast als referentiemethode voor de sensorische evaluatie.

2. Voor melk en andere zuivelproducten dan boter gebruiken de lidstaten als referentiemethode voor de sensorische evaluatie hetzij norm FIL 99C/1997, hetzij vergelijkbare andere methodes, die zij aan de Commissie meedelen.

De methodes van bijlage VI kunnen worden toegepast om het werk van de beoordelaars en de betrouwbaarheid van de resultaten te controleren.

Artikel 7

Bemonstering; betwisting van de analyseresultaten

1. Voor de op grond van de communautaire regelgeving vereiste analyses moeten monsters in duplo worden genomen.

2. De in bijlage VIII vastgestelde procedure wordt toegepast in gevallen waarin de resultaten van een analyse niet door de betrokken marktdeelnemer worden geaccepteerd.

HOOFDSTUK II

ANALYSEMETHODEN

Artikel 8

Vocht-, drogestof- en vetgehalte van boter

1. De in bijlage IX beschreven analysemethode geldt als referentiemethode voor de bepaling van het vochtgehalte van boter.

2. De in bijlage X beschreven analysemethode geldt als referentiemethode voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van boter.

3. De in bijlage XI beschreven analysemethode geldt als referentiemethode voor de bepaling van het vetgehalte van boter.

Artikel 9

Verklikstoffen

1. De in bijlage XII beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de bepaling van het vanillinegehalte van boterconcentraat, boter of room.

2. De in bijlage XIII beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de kwantitatieve bepaling van de ethylester van β-apo-8'-caroteenzuur in boterconcentraat of boter.

3. De in bijlage XIV beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de bepaling van het gehalte aan stigmasterol of β-sitosterol van boterconcentraat of boter.

4. Boterconcentraat, boter of room worden geacht overeenkomstig de betrokken communautaire regelgeving van verklikstoffen te zijn voorzien, als de behaalde analyseresultaten overeenstemmen met de specificaties van punt 8 van de in de leden 1, 2 en 3 bedoelde bijlagen.

Artikel 10

Opsporing van koemelkcaseïne

1. De in bijlage XV opgenomen referentieanalysemethode wordt toegepast om te garanderen dat kaas die uitsluitend uit schapen-, geiten- of buffelmelk of uit een mengsel van schapen-, geiten- en buffelmelk mag zijn vervaardigd, geen koemelkcaseïne bevat.

Koemelkcaseïne wordt geacht aanwezig te zijn, als het schijnbare gehalte aan koemelkcaseïne van het geanalyseerde monster gelijk is aan of hoger is dan het betrokken gehalte van het referentiemonster van bijlage XV, dat 1 % koemelk bevat.

2. Voor de opsporing van koemelkcaseïne in de in lid 1 bedoelde kaassoorten mogen onder de volgende voorwaarden routinemethoden worden gebruikt:

a) met de methode moet een gehalte van 0,5 % of minder opgespoord kunnen worden,

b) de methode mag geen vals-positieve resultaten geven,

c) de koemelkcaseïne moet ook na lange rijpingsperiodes, zoals die in de handel gebruikelijk kunnen zijn, met de vereiste gevoeligheid kunnen worden opgespoord.

Als niet aan de onder b) genoemde voorwaarde wordt voldaan, moet ieder positief bevonden monster met gebruikmaking van de referentiemethode worden geanalyseerd.

Als voor een van de in lid 1 bedoelde kaassoorten niet aan de onder c) bedoelde eis wordt voldaan, moet deze kaas worden geanalyseerd met gebruikmaking van de referentiemethode.

Artikel 11

Opsporing van colibacteriën

1. De in bijlage XVI beschreven referentieanalysemethode geldt voor het onderzoek op colibacteriën van boter, mageremelkpoeder, caseïne en caseïnaten.

2. Routinemethodes voor het onderzoek op colibacteriën mogen worden gebruikt, op voorwaarde dat de verkregen resultaten vergelijkbaar zijn met die van de in de genoemde bijlage beschreven referentiemethode. De routinemethodes moeten met name een afdoende detectiegrens hebben. Vals-negatieve resultaten mogen niet voorkomen. Als vals-positieve resultaten niet kunnen worden uitgesloten, moet elk positief resultaat aan de hand van de referentiemethode worden bevestigd.

Artikel 12

Lactosegehalte

De methode voor het bepalen van het gehalte aan lactose (melksuiker) van de producten van GN-code 2309 is beschreven in bijlage XVII.

Artikel 13

Opsporing van lebwei

1. De methode voor het opsporen van lebwei in voor openbare opslag bestemde mageremelkpoeder is beschreven in bijlage XVIII.

2. De methode voor het opsporen van lebwei in mageremelkpoeder en in mengvoeders is beschreven in bijlage XIX.

Artikel 14

Opsporing van karnemelk

De methode voor het opsporen van karnemelk in mageremelkpoeder is beschreven in bijlage XX.

Artikel 15

Antibioticaresiduen

De methode voor het opsporen van antibiotica- en sulfonamide/dapsonresiduen in mageremelkpoeder is beschreven in bijlage XXI.

Artikel 16

Gehalte aan mageremelkpoeder

De methode voor het bepalen van het gehalte aan mageremelkpoeder van mengvoeders is beschreven in bijlage XXII.

Artikel 17

Opsporing van zetmeel

De methode voor het opsporen van zetmeel in mageremelkpoeder, in gedenatureerd mageremelkpoeder en in mengvoeder, is beschreven in bijlage XXIII.

Artikel 18

Vochtgehalte van zurekarnemelkpoeder

De methode voor het bepalen van het vochtgehalte van voor gebruik in mengvoeders bestemd zurekarnemelkpoeder is beschreven in bijlage XXIV.

Artikel 19

Opsporing van vreemd vet

De methode voor de opsporing van vreemd vet in melkvet is beschreven in bijlage XXV.

HOOFDSTUK III

SLOTBEPALINGEN

Artikel 20

Wijziging van Verordening (EG) nr. 2771/1999

Verordening (EG) nr. 2771/1999 wordt als volgt gewijzigd:

1. In artikel 4, lid 1, wordt de eerste zin vervangen door: "De bevoegde autoriteiten controleren de boterkwaliteit volgens de in bijlage I bedoelde analysemethoden aan de hand van monsters die op de in bijlage IV aangegeven wijze zijn genomen.".

2. In bijlage I wordt voetnoot 2 vervangen door "Zie bijlage I bij Verordening (EG) nr. 213/2001.".

3. De bijlagen II en III worden geschrapt.

4. In bijlage IV worden in punt 2, voorlaatste regel, de woorden "van bijlage III" vervangen door de woorden "van bijlage VII bij Verordening (EG) nr. 213/2001.".

Artikel 21

Wijziging van Verordening (EG) nr. 2799/1999

Verordening (EG) nr. 2799/1999 wordt als volgt gewijzigd:

1. In artikel 20 worden de leden 1, 2, 3 en 4 vervangen door: "1. Het gehalte aan mageremelkpoeder van de mengsels en de mengvoeders wordt geverifieerd door middel van een ten minste in duplo verrichte analyse volgens de in bijlage XXII bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven methode, aangevuld met de in artikel 17, lid 3, van deze verordening genoemde controlemaatregelen. Indien de resultaten van deze verificaties niet met elkaar overeenstemmen, is het resultaat van de controles ter plaatse doorslaggevend.

2. De afwezigheid van lebwei wordt aangetoond volgens de in bijlage XIX bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven methode.

3. Het zetmeelgehalte van de mengvoeders wordt bepaald door middel van de in artikel 17, lid 3, van deze verordening genoemde controlemaatregelen, ter aanvulling waarvan de in bijlage XXIII bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven analysemethode moet worden toegepast.

4. Het vochtgehalte van zurekarnemelkpoeder wordt bepaald volgens de in bijlage XXIV bij Verordening (EG) nr. 213/2001 beschreven analysemethode.".

2. De bijlagen III, IV, V en VI worden geschrapt.

Artikel 22

Intrekking

De Verordeningen (EEG) nr. 1216/68, (EEG) nr. 3942/92, (EEG) nr. 86/94, (EG) nr. 2721/95, (EG) nr. 1854/96, (EG) nr. 1080/96, (EG) nr. 1081/96, (EG) nr. 1082/96, (EG) nr. 880/98 en (EG) nr. 1459/98 worden ingetrokken.

Verwijzingen naar de ingetrokken verordeningen gelden als verwijzingen naar deze verordening.

Artikel 23

Inwerkingtreding

Deze verordening treedt in werking op de zevende dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.

De methoden van de bijlagen III, IV, punt 4, V, VI, en VIII worden echter achttien maanden na de inwerkingtreding van deze verordening van toepassing.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.

Gedaan te Brussel, 9 januari 2001.

Voor de Commissie

Franz Fischler

Lid van de Commissie

(1) PB L 160 van 26.6.1999, blz. 48.

(2) PB L 333 van 24.12.1999, blz. 11.

(3) PB L 340 van 31.12.1999, blz. 3.

(4) PB L 350 van 20.12.1997, blz. 3.

(5) PB L 76 van 25.3.2000, blz. 9.

(6) PB L 298 van 12.11.1985, blz. 9.

(7) PB L 11 van 16.1.1999, blz. 14.

(8) PB L 45 van 21.2.1990, blz. 8.

(9) PB L 16 van 21.1.1999, blz. 19.

(10) PB L 279 van 11.10.1990, blz. 22.

(11) PB L 325 van 17.12.1999, blz. 10.

(12) PB L 256 van 7.9.1987, blz. 1.

(13) PB L 28 van 3.2.2000, blz. 16.

BIJLAGE I

(Artikel 2)

LIJST VAN REFERENTIEMETHODENOpmerking bij de lijst van EU-referentiemethoden:

Opmerking 1: Isolatie melkvet: volgens IDF-norm 6B:1989 (donker bewaren).

Opmerking 2: Er is geen referentiemethode vastgesteld.

Opmerking 3: Monsterbereiding overeenkomstig IDF-norm 122C:1996 of overeenkomstig IDF-norm 73A:1985.

Opmerking 4: Incubatie gedurende 48 uur bij een temperatur van 55 °C, uitdroging van het kweekmedium moet worden tegengegaan.

Opmerking 5: Percentage vetvrije vaste stof = percentage droge stof - percentage vet.

Opmerking 6: De boter moet voldoen aan de in bijlage V bij Verordening (EG) nr. 2771/1999 van de Commissie bedoelde nationale kwaliteitsklasse van de producerende lidstaat.

Opmerking 7: Richtlijn 84/4/EEG van de Commissie.

Opmerking 8: Verordening (EG) nr. 1758/94 van de Commissie (PB L 183 van 19.7.1994, blz. 14).

Opmerking 9: Richtlijn 78/633/EEG van de Commissie.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

BIJLAGE II

(Artikel 3)

CONTROLE VAN MET ROUTINEMETHODEN VERKREGEN RESULTATEN DIE DE IN DE VERORDENINGEN VASTGESTELDE GRENSWAARDEN VOOR DE SAMENSTELLINGS- EN KWALITEITSKENMERKEN BENADEREN

Als mo een in een verordening vastgestelde grens voor de samenstellings- en kwaliteitskenmerken is, dan is de beslisgrens

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

als RRout/RRef <= 1.RRout: Reproduceerbaarheidsyrens van de routinemethode

RRef: Reproduceerbaarheidsgrens van de referentiemethode

Als mo een bovengrens is en RRout/Rref > 1, dan wordt de beslisgrens verkregen met de formule

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Als mo onder dezelfde omstandigheden een ondergrens is, dan wordt de beslisgrens verkregen door

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin CrD95: kritisch verschil met de referentiemethode, zie bijlage IV

Wanneer mo een bovengrens is, moet een met een routinemethode verkregen eindresultaat dat boven de beslisgrens ligt, door een met de referentiemethode verkregen eindresultaat worden vervangen. Dat eindresultaat moet ten minste op hetzelfde aantal analyses/monsters gebaseerd zijn als het eindresultaat van de routinemethode.

Wanner mo een ondergrens is, moet dezelfde procedure worden gevolgd voor een met een routinemethode verkregen eindresultaat dat onder de beslisgrens ligt.

Opmerking

De bovenbeschreven procedure kan worden gehanteerd als er geen detecteerbare matrixeffecten zijn.

Matrixeffecten kunnen op de volgende wijze worden gedetecteerd: voor elk voor ijking gebruikt monster wordt het verschil (wi) tussen de met de refentiemethode en de met de routinemethode verkregen resultaten bepaald.

De met de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

m: aantal voor ijking gebruikte monsters

berekende standaarddeviatie wordt vergeleken met het rekenkundig gemiddelde van de herhaalbaarheidsstandaarddeviatie van de referentie- en de routinemethode.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Een matrixeffect kan niet worden uitgesloten als

>PIC FILE= "L_2001037NL.001502.EPS">

waarin:

f= m (f: aantal vrijheidsgraden)

α= kans op fout; α = 0,05.

In dit geval zijn verdere onderzoekingen nodig voordat een beslisgrens kan worden vastgesteld.

BIJLAGE III

(Artikelen 4 en 5)

a) Procedure ter bepaling van de handhaving van een vastgestelde reproduceerbaarheidsgrens (chemische analyse)

Of aan de reproduceerbaarheidsgrens de hand wordt gehouden, wordt gecontroleerd door de laboratoriumresultaten te vergelijken met de resultaten van een ervaren laboratorium(1) die met een identiek monster zijn verkregen. In beide laboratoria wordt een dubbele bepaling uitgevoerd en de resultaten worden geëvalueerd aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

CrD95: kritisch verschil (P = 0,95)

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van twee in laboratorium 1 verkregen resultaten

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van twee in laboratorium 2 verkregen resultaten

R: reproduceerbaarheidsgrens: door interpolatie te bepalen,

r: herhaalbaarheidsgrens: als precisie met concentratie varieert.

Als het kritische verschil wordt overschreden, moet binnen twee maanden een nieuwe proef worden uitgevoerd. Ingeval bij deze tweede proef niet aan de reproduceerbaarheidsgrens de hand wordt gehouden, moeten de bevoegde autoriteiten de nodige maatregelen nemen.

b) Procedure om aan een voorlopige reproduceerbaarheidsgrens te komen (chemische analyse)

Een voorlopige reproduceerbaarheidsgrens (Rprov) wordt verkregen door de volgende vergelijking te gebruiken:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van twee in laboratorium 1 verkregen resultaten

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: gemiddelde van twee in laboratorium 2 verkregen resultaten (zie bijlage IIIa)

r: herhaalbaarheidsgrens of voorlopige herhaalbaarheidsgrens.

Opmerkingen:

1. Rprov kan worden gebruikt om het kritische verschil te berekenen (zie bijlage VI).

2. Rprov wordt gesteld op 2r als de voor Rprov berekende waarde lager is dan 2r.

3. Als de berekende waarde hoger is dan 3r of hoger dan tweemaal de met de vergelijking van Horwitz(2) voorspelde R-waarde, dan is Rprov onaanvaardbaar hoog en kan die niet ter berekening van het kritische verschil worden gebruikt.

4. Rprov dient minstens eenmaal per jaar te worden bepaald op grond van de in twee laboratoria verkregen resultaten (zie bijlage IV).

5. De gemiddelde waarde van Rprov dient te worden gebruikt ter berekening van kritische verschillen. De onder de punten 2 en 3 gegeven regels gelden voor de gemiddelde waarde van Rprov.

De reproduceerbaarheidsgrens (R-waarde) wordt verkregen uit de berekende RSDR-waarde als

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

= rekenkundig gemiddelde van de verkregen resultaten.)

Enkele voorbeelden van berekende RSDR-waarden

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Een concentratie van de te analyseren stof van 1 g/100 g geeft het volgende resultaat:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>.

(1) In het algemeen moet het ervaren laboratorium een laboratorium zijn dat met succes heeft deelgenomen hetzij aan een validatie van de testmethode, hetzij aan een expertisetest.

(2) Vergelijking van Hortwitz:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

RSDR: Relatieve standaardafwijking van de reproduceerbaarheid

c: als decimale fractie uitgedrukte concentratie (voorbeeld: 10 g/100 g = 0,1).

Referentie:

Peeler, J. T., Horwitz, W. en Albert, R.

J. Ass. Off. Anal. Chem.

72 (5), 784-806 (1989).

BIJLAGE IV

(Artikel 4)

EVALUATIE VAN MET GEVALIDEERDE METHODEN VERKREGEN ANALYSERESULTATEN

Blijkt uit het analyseresultaat dat een grens is overschreden, dan wordt het rekenkundig gemiddelde van twee of meer resultaten berekend. De volgende procedure is van toepassing:

1. In gevallen waarin het analyseresultaat een eenmalig resultaat betreft, moet een tweede analyse onder herhaalbare omstandigheden worden uitgevoerd. Als de twee analyses niet onder herhaalbare omstandigheden kunnen worden uitgevoerd, moet in duplo onder herhaalbare omstandigheden nog een analyse worden uitgevoerd en moeten die resultaten worden gebruikt om na te gaan of aan het kritische verschil wordt voldaan.

2. De absolute waarde van het verschil tussen het rekenkundig gemiddelde van de onder herhaalbare omstandigheden verkregen resultaten en de grens wordt bepaald. Een absolute waarde van het verschil hoger dan het kritische verschil betekent dat het monster dat geanalyseerd is, niet aan de eisen voldoet.

Het kritische verschil wordt bepaald aan de hand van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van de verkregen resultaten

mo: grenswaarde

n: aantal analyses/monster

Als de precisie met de concentratie varieert, kan het nodig zijn r en R door interpolatie te bepalen.

Normaliter moet uit een voor een monster gemeld eindresultaat blijken dat aan een grens is voldaan.

Eindresultaten:

- binnen de spreiding

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

en

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>, als de grens een maximum is;

- binnen de spreiding

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

en

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>, als de grens een minimum is;

dienen derhalve slechts bij uitzondering voor te komen.

Eindresultaten binnen de genoemde spreidingen zijn alleen aanvaardbaar als ze hoogstens eenmaal op de vijf per zending geanalyseerde monsters voorkomen. Als minder dan vijf monsters per zending worden geanalyseerd, is één resultaat binnen de genoemde spreiding aanvaardbaar. Aan de regel dat slechts één resultaat binnen de genoemde spreidingen per vijf geanalyseerde monsters wordt verkregen, moet echter de hand worden gehouden als een producent herhaaldelijk zendingen aanbiedt.

3. Als het eindresultaat x wordt berekend met een formule van de vorm x = y1 +/- y2 (voorbeeld: water + gehalte aan vetvrije droge stof in boter om het vetgehalte te berekenen) waarin y1 en y2 de eindresultaten van het type eenmalige analyse zijn, dan worden de totale herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen rx en Rx van de eindresultaten x berekend als:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin r1 respectievelijk r2 de herhaalbaarheidsgrenzen, en R1 respectievelijk R2 de reproduceerbaarheidsgrenzen zijn van y1 respectievelijk y2.

x wordt met de grens mo vergeleken volgens de in punt 1 en punt 2 gespecificeerde regels. Het kritische verschil wordt bepaald aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin x het rekenkundig gemiddelde van de verkregen resultaten xi is.

4. Als het eindresultaat wordt berekend aan de hand van een formule van de vorm:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(voorbeeld: vet in gehalte aan droge stof van kaas)

waarin y1 en y2 de eindresultaten van het type eenmalige analyse zijn, dan worden de totale herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen rx en Rx berekend als:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

μ1: grens- of doelwaarde voor y1 (voorbeeld: vet)

μ2: grens- of doelwaarde voor y2 (voorbeeld: droge stof)

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

r1: herhaalbaarheidsgrens, y1

r2: herhaalbaarheidsgrens, y2

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

R1: reproduceerbaarheidsgrens, y1

R2: reproduceerbaarheidsgrens, y2

De procedures ter berekening van rx en Rx zijn uitsluitend van toepassing als de relatieve herhaalbaarheids- en reproduceerbaarheidsgrenzen (r*1; r*2; R*1; R*2) lager zijn dan of gelijk zijn aan 0,15.

x wordt vergeleken met de grens μx volgens de in punt 1 en punt 2 gespecificeerde regels. Het kritische verschil wordt bepaald aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin x het rekenkundig gemiddelde is van de in chronologische volgorde verkregen resultaten x(1).

(1) NB:

Als bijvoorbeeld de resultaten y11, y12, y21 en y22 zijn verkregen, moet het rekenkundig gemiddelde van y11/y21 en y12/y22 worden berekend.

BIJLAGE V

INTERNE CONTROLE

(Artikel 5)

a) Procedure voor interne kwaliteitscontrole (IKC) (chemische analyse)

Definitie van controlemateriaal

Een materiaal dat voor IKC-doeleinden wordt gebruikt en geheel of gedeeltelijk aan dezelfde procedure wordt onderworpen als de onderzochte materialen.

Een controlemateriaal kan bijvoorbeeld zijn:

- gecertificeerd referentiemateriaal,

- eigen referentiemateriaal,

- door interlaboratoriumonderzoek gevalideerd materiaal,

- aanvullend materiaal.

Procedure voor de invoering van IKC

Het laboratorium dient een IKC in te voeren overeenkomstig de in het IUPAC-document "Harmonized Guidelines for Internal Quality Control in analytical laboratories"(1) (Geharmoniseerde richtlijnen voor interne kwaliteitscontrole in analytische laboratoria) beschreven procedure.

IKC wordt uitgevoerd door bij de analytische procedure controlematerialen te betrekken of door herhaalde analyse van het proefmonster. De scheikundige samenstelling van de controlematerialen moet overeenkomen met die van de proefmonsters en de materialen moeten gedurende de desbetreffende periode voldoende stabiel zijn. Aangetoond moet worden dat ze voor analyse goed in identieke porties kunnen worden verdeeld en dat de concentratie van de te analyseren stof voor het beoogde doel geschikt is.

Een controlemateriaal moet minstens eenmaal in elke analysereeks worden opgenomen en de verkregen waarde moet op een controlekaart worden uitgezet teneinde de fouten op lange termijn te kunnen meten. Daarnaast moet het laboratorium periodiek aantonen dat binnen de reeks aan de herhaalbaarheidsvoorwaarden wordt voldaan. Dit wordt bereikt door analyse in duplo van controle- en/of proefmaterialen. De resultaten van deze analyses dienen met eventueel gepubliceerde herhaalbaarheidsgrenzen en bestaande gegevens over eigen precisie te worden vergeleken.

Bij gebruik van controlematerialen moeten de bij de analyse van het controlemateriaal verkregen waarden tussen de analysereeksen op een kaart volgens Shewhart (ISO 8258 (1991)) met adequate controlegrenzen worden uitgezet. De actiegrenzen worden vastgesteld op:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

worden gesteld, waarbij st de totale standaarddeviatie is,

en de waarschuwingsgrenzen worden vastgesteld op:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Totale standaarddeviatie:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

sb: standaarddeviatie tussen analysereeksen

sw: standaarddeviatie binnen analysereeks

n: aantal bepalingen.

In gevallen waarin geen controlematerialen worden gebruikt (b.v. omdat ze niet houdbaar zijn), moet minstens een van de proefmaterialen in elke reeks in duplo worden geanalyseerd.

De absolute veschillen die binnen een reeks door analyses in duplo aan het licht komen (zie bijlage III), moeten worden uitgezet. De middelste lijn is 1,128 sw, de ondergrens is 0 en de bovengrens (actiegrens) is 3,686 sw, waarbij sw de standaarddeviatie binnen een analysereeks is.

De controleprocedure dient materialen in lage en hoge concentraties te omvatten als de concentratiespreiding breed is.

Als de proefmaterialen een grote concentratiespreiding van de te analyseren stoffen omvatten, dient het laboratorium het verband tussen precisie en concentratie vast te stellen. Is de precisie evenredig aan de concentratie, dan moet de volgende controle worden uitgevoerd op basis van relatieve precisie (d.w.z. absoluut verschil als percentage van de gemiddelde waarde).

Er is sprake van een toestand waarin de analyse niet onder controle is als zich een van onderstaande mogelijkheden voordoet:

A. de huidige waarde van de "plot" valt buiten de actiegrenzen,

B. de huidige waarde en de vorige waarde vallen buiten de waarschuwingsgrenzen maar binnen de actiegrenzen,

C. in het geval dat controlematerialen worden gebruikt, vallen negen opeenvolgende waarden aan dezelfde zijde van de gemiddeldenlijn.

Het laboratorium dient op een niet onder controle zijnde toestand te reageren door:

A. de analyse te staken hangende diagnostisch onderzoek en maatregelen ter correctie en

B. de resultatenreeks af te keuren en de proefmaterialen hernieuwd te analyseren.

b) Procedure ter selectie van eigen controlemateriaal en ter bepaling van "eigen" precisiegrenzen (chemische analyse)

Gegevens over de precisie binnen een laboratorium kunnen worden verkregen door herhaalde analyse van controlematerialen en/of door herhaalde analyse van proefmonsters.

De volgende methode dient als richtlijn voor laboratoria die precisieparameters gaan invoeren voor variaties binnen en tussen reeksen die daarna worden gebruikt voor het ontwerpen van controlekaarten. Laboratoria mogen alternatieve procedures hanteren mits ze afdoende kunnen aantonen dat er nauwkeurige precisiegegevens mee kunnen worden verkregen.

1. Selectie van controlematerialen

Wanneer het voor het laboratorium gewenst is een controlemateriaal te gebruiken, moeten eerst gegevens worden verzameld om grenzen vast te stellen. Zo mogelijk dienen Gecertificeerde Referentiematerialen (GRM's) te worden gebruikt. In aanmerking komende controlematerialen dienen binnen een reeks onder herhaalbare omstandigheden te worden geanalyseerd, waaronder geschikte GRM's, en zij moeten worden onderworpen aan herhaling en randomisatie. Als deze methode niet bruikbaar is, dienen de laboratoria te trachten aan expertisetests deel te nemen en te komen tot consensusgemiddelden (toegekende waarden), die kunnen worden beschouwd als een conventioneel juist gemiddelde, waaraan een zinvolle (betekenis-hebbende) onzerkerheid zou kunnen worden verbonden. Andere procedures zijn bijvoorbeeld het toekennen van een juiste waarde door formulering of het gebruik van controlematerialen waaraan een bekende hoeveelheid van de te analyseren stof is toegevoegd.

Wanneer het laboratorium regelmatig dit type analyse uitvoert, en al statistische controle heeft ingesteld, moeten daarnaast eventuele nieuwe controlematerialen (die bijvoorbeeld nodig zijn omdat de voorraad uitgeput raakt) worden verkregen met betrekking tot onder controle zijnde analyses met gebruikmaking van de bestaande materialen.

2. Vaststelling van grenswaarden

Na selectie van een controlemateriaal moet het laboratorium voor dit materiaal precisiegetallen binnen en tussen reeksen vaststellen.

Als minimumeis bij de vaststelling van de precisie binnen een reeks dient het controlemateriaal bij 12 gelegenheden in duplo te worden geanalyseerd. Analyse in duplo dient onder herhaalbare omstandigheden te worden uitgevoerd, d.w.z. dezelfde persoon, dezelfde reagentia enz. Analyse in duplo van het controlemateriaal dient binnen een analysereeks gerandomiseerd plaats te vinden. Elke analyse in duplo dient over een bepaalde periode op een aparte dag te worden uitgevoerd om inzicht te krijgen in een redelijke variatie van reeks tot reeks, rekening houdend met normale variaties, b.v. reagentia, herijking van instrumenten en, indien van toepassing, verschillende personen.

N.B.:

Men dient te bedenken dat het gebruik van gegevens die niet geheel representatief zijn voor de variatie tussen reeksen, overbodige herhaling van analyses met zich kan brengen doordat er te enge grenzen worden vastgesteld. Omgekeerd is een laboratorium dat precisiegegevens aanlevert die te onnauwkeurig zijn, mogelijk niet in staat aan de in referentiemethoden voorgeschreven grenzen te voldoen, kan het mogelijk slecht presteren in vergelijking met vergelijkbare laboratoria en levert het mogelijk geen gegevens aan die voor het beoogde doel bruikbaar zijn.

2.1. Bepaling van de precisie binnen reeksen

2.1.1. Precisie binnen reeksen wanneer controlemateriaal beschikbaar is

De gegevens over analyses in duplo (minimaal 12 duplo's) dienen eerst aan de test op maximale variantie van Cochran te worden onderworpen. Bij die test wordt het maximale interval van duplobepalingen in het kwadraat vergeleken met de som van gekwadrateerde intervallen.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin

di= het verschil tussen analyses in duplo.

De waarde van Cochrans criterium C, wordt met waarden in de tabellen vergeleken (ISO 5725 (1994)). Wanneer een waarde als onbetrouwbaar of als uitbijter kan worden geclassificeerd, dient het resultaat te worden gecontroleerd om tot een verklaring te komen, b.v. een technische fout, een rekenfout, een vergissing bij de uitvoering van de test, analyse van het verkeerde monster. Als de verklaring voor de technische fout zodanig is dat het onmogelijk blijkt het omstreden resultaat te vervangen, dient het als een echte uitbijter te worden geëcarteerd. Als er eventuele onbetrouwbare waarden of uitbijters overblijven die niet te verklaren zijn, worden de onbetrouwbare waarden als juist gehandhaafd en worden de statistische uitbijters geëcarteerd. Het laboratorium dient te trachten aan vervangende waarden te komen.

Zodra het laboratorium meent dat de gegevens vrij van uitbijters zijn, wordt de standaarddeviatie binnen een analysereeks sw als volgt verkregen:

Voor ieder paar xi1, x i2 van de p duplogegevens worden de som van de duplo's,

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

en het verschil van de duplo's,

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

berekend en opgeteld tot

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Een schatting van de standaarddeviatie binnen een analysereeks is

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

De eigen precisiegrens is 2,8 sw.

Als een referentiemethode wordt gebruikt, dient de eigen precisiegrens met de gepubliceerde herhaalbaarheidsgrens te worden vergeleken. Het laboratorium dient aan de eis van de referentiemethode te voldoen. Voldoet het laboratorium hier niet aan, dan moet een onderzoek worden ingesteld.

De gestelde grenzen moeten als voorlopig worden beschouwd en moeten kunnen worden herzien.

2.1.2. Precisie binnen de reeks wanneer geen controlemateriaal beschikbaar is.

Het laboratorium kan er de voorkeur aan geven de precisie binnen de reeks vast te stellen door analyse in duplo van representatieve proefmonsters (minimaal 12 duplobepalingen). In gevallen waarin het niet mogelijk is controlematerialen te gebruiken, bijvoorbeeld vanwege de instabiliteit ervan, moeten door middel van deze methode duplogegevens worden verzameld.

N.B.:

Er wordt van uitgegaan dat de analyses een relatief beperkte serie waarden omvatten en dat derhalve voor alle monsters één enkele waarde kan worden gehanteerd. In gevallen waarin de spreiding van de resultaten groter is, bijvoorbeeld boven een orde van grootte, en de precisie van de concentratie afhangt, dienen de laboratoria het gebruik van relatieve standaarddeviaties te onderzoeken.

De gegevens dienen aan de toets van Cochran te worden onderworpen, zoals in 2.1.1 Zodra het laboratorium meent dat de gegevens vrij van uitbijters zijn, kunnen de standaarddeviatie binnen een analysereeks en de eigen precisiegrens worden verkregen als in paragraaf 2.1.1.

De standaarddeviatie binnen een reeks sw kan worden gebruikt om controlekaarten te maken (zie bijlage II). De gestelde grenzen dienen als voorlopig te worden beschouwd en kunnen worden herzien.

2.2. Bepaling van precisie tussen analysereeksen

Bereken de gemiddelde waarde (s1/2) per paar en onderwerp die aan de toets van Grubb (ISO 5725 (1994)). De criteria voor afkeuring/aanvaarding van uitbijters of onbetrouwbare waarden zijn zoals in 2.1.1 beschreven. Het laboratorium dient te trachten aan een vervangende waarde te komen voor elk geëcarteerd resultaat. Zodra het laboratorium meent dat de gegevens vrij van uitbijters zijn, wordt de standaarddeviatie tussen analysereeksen sb berekend.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

of 0 als de uitdrukking onder het vierkantswortelteken negatief is.

De totale standaarddeviatie st wordt gebruikt voor het aanmaken van controlekaarten voor het gemiddelde van n bepalingen (zie bijlage II). De gestelde grenzen dienen als voorlopig te worden beschouwd en kunnen worden herzien.

3. Herziening van initiële grenzen

Vastgestelde controlegrenzen als hierboven beschreven moeten als eerste schattingen worden beschouwd.

Teneinde de grenzen die zijn gesteld op basis van aanvaardbare precisie binnen een analysereeks (paragraaf 2.1.2), up-to-date te brengen, dienen meer duplogegevens over proefmonsters te worden verzameld. Het tijdsverloop vóór een herziening hangt tot op zekere hoogte van de analysefrequentie af. Als richtlijn geldt dat de gegevens dienen te worden herzien nadat nog eens 10 analyses in duplo zijn verkregen. Al die gegevens dienen dan aan de toest van Cochran te worden onderworpen en de grenzen dienen op grond van het nieuwe standaarddeviatiegetal opnieuw te worden vastgesteld. Volgende beslissingen over de validiteit van controlegrenzen moeten in het licht van nadere gegevens worden genomen.

De herziening van de eerste over de precisie tussen analysereeksen verkregen gegevens hangt ook van de analysefrequentie af. Als richtlijn geldt dat het nodig is de eerste uitgangspunten met betrekking tot de standaarddeviatie en het gemiddelde te herzien, nadat nog eens 10 uitkomsten van de analyse van het conrolemateriaal zijn verkregen met een frequentie van één analyse per charge.

Al deze gegevens dienen aan de toets van Grubb voor uitbijters te worden onderworpen. Het gemiddelde en de standaarddeviatie dienen op grond van de nieuwe gegevens te worden herberekend.

Daarnaast dient het laboratorium in dit stadium een Cusum-kaart (BS S700: (1984) en amendement 5480 (1987)) toe te passen om eventuele problemen die bijvoorbeeld met de veroudering van reagentia kunnen samenhangen, te onderzoeken. Alle enkele resultaten die buiten de grenzen van het Cusum "V-masker" vallen, moeten worden onderzocht.

De nieuwe grenzen (gemiddelde en standaarddeviatie) moeten met behulp van de Cusumtechniek regelmatig worden gecontroleerd. Iedere aanwijzing dat de validiteit van het controlemateriaal in twijfel wordt getrokken, moet grondig worden onderzocht.

4. Melding van precisiegegevens

De volgende inlichtingen dienen aan het bevoegde nationale gezag ter beschikking te worden gesteld:

- gebruikte methode,

- standaarddeviatie binnen analysereeks, sw, en eigen precisiegrens,

- standaarddeviatie tussen analysereeksen, sb,

- totale standaarddeviatie, s1,

- aantal ter verkrijging van precisiegegevens benodigde analyses.

(1) M. Thompson en R. Wood: "Pure and Applied Chemistry" 67 (4), 649-666 (1995).

BIJLAGE VI

(Artikel 6)

EVALUATIE VAN DE BEOORDELAARS EN DE BETROUWBAARHEID VAN DE RESULTATEN BIJ SENSORISCHE ANALYSES

De volgende procedures zijn van toepassing als methoden van puntentoekenning worden gebruikt (IDF-norm 99C/1997).

a) Bepaling van de "herhaalbaarheidsindex"

Over een periode van 12 maanden moet een beoordelaar minstens tien monsters als blinde duplo's analyseren. Dit zal meestal tijdens verscheidene sessies plaatsvinden. De resultaten voor de afzonderlijke productkenmerken worden geëvalueerd aan de hand van onderstaande formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin

wI: herhaalbaarheidsindex

xi1: score voor de eerste evaluatie van monster xi

xi2: score voor de tweede evaluatie van monster xi

n: aantal monsters

De te evalueren monsters dienen voor een grote kwaliteitsspreiding representatief te zijn. wI mag niet hoger zijn dan 1,5 (vijfpuntsschaal).

b) Bepaling van de "deviatie-index"

Deze index dient te worden gebruikt om na te gaan of een beoordelaar dezelfde schaal voor de evaluatie van de kwaliteit gebruikt als een ervaren groep beoordelaars. De door de beoordelaar verkregen scores worden met het gemiddelde van de door de groep beoordelaars verkregen scores vergeleken.

Onderstaande formule wordt gebruikt ter evaluatie van de resultaten:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

xil; xi2: zie onder a)

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>;

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: Gemiddelde score van de groep beoordelaars voor de eerste rescpectievelijk de tweede evaluatie van monster xi.

n: aantal monsters (minstens 10 per 12 maanden).

De te evalueren monsters moeten representatief zijn voor een grote kwaliteitsspreiding. D1 mag niet hoger zijn dan 1,5 (vijfpuntsschaal).

De lidstaten moeten moeilijkheden met de toepassing van deze procedure aangeven.

c) Vergelijking van de in verschillende regio's van een lidstaat en in verschillende lidstaten verkregen resultaten

Indien van toepassing, moet minstens eenmaal per jaar een toets worden georganiseerd die het mogelijk maakt de door beoordelaars uit verschillende regio's verkregen resultaten onderling te vergelijken. Als significante verschillen worden geconstateerd, moeten de nodige maatregelen worden genomen om de oorzaak ervan te achterhalen en om tot vergelijkbare resultaten te komen.

De lidstaten mogen toetsten organiseren waarmee de door hun eigen beoordelaars en door beoordelaars van naburige lidstaten verkregen resultaten kunnen worden vergeleken. Significante verschillen dienen tot een diepgaand onderzoek te leiden met de bedoeling tot vergelijkbare resultaten te komen.

De lidstaten moeten de uitslag van de vergelijkingen aan de Commissie meedelen.

BIJLAGE VII

(Artikel 6)

SENSORISCHE EVALUATIE VAN BOTER

1. Doel

Het doel van deze procedure voor de sensorische evaluatie van boter is een uniforme methode vast te stellen die in alle lidstaten van toepassing is.

2. Definities

Sensorische evaluatie (beoordeling): het onderzoek naar de eigenschappen van een product door middel van de zintuigen.

Panel: een groep geselecteerde beoordelaars die tijdens de beoordeling, zonder onderling contact en zonder elkaar te beïnvloeden, hun werk doen.

Toekennen van punten: de sensorische evaluatie door een panel met gebruikmaking van een cijferschaal. Er moet een nomenclatuur voor de afwijkingen worden gehanteerd.

Classificeren: een classificatie van de kwaliteit op grond van het toekennen van punten.

Controledocumenten: documenten die worden gebruikt om de individuele punten per eigenschap en de eindclassificatie van het product te noteren. (Dit document kan ook worden gebruikt om de chemische samenstelling te noteren.)

3. Onderzoekruimte

3.1. Er moeten voorzorgen worden getroffen opdat de beoordelaars in de onderzoekruimte niet door uitwendige factoren worden beïnvloed.

3.2. De onderzoekruimte moet vrij van vreemde geuren en gemakkelijk schoon te houden zijn. De muren moeten licht van kleur zijn.

3.3. De onderzoekruimte en verlichting ervan moeten zodanig zijn dat ze de eigenschappen van de te beoordelen producten niet beïnvloeden. De ruimte moet van een behoorlijke temperatuurbeheersing zijn voorzien.

4. Keuze der beoordelaars

De beoordelaar moet met boterproducten vertrouwd zijn en deskundig zijn om een sensorische evaluatie uit te voeren. Zijn deskundigheid moet regelmatig (minstens eens per jaar) door de bevoegde autoriteit worden nagegaan.

5. Eisen aan het panel

Het aantal beoordelaars in het panel moet oneven zijn met als minimum een aantal van drie. Zij moeten in meerderheid werknemers van de bevoegde autoriteit of bevoegde deskundigen zijn.

Om panelleden tot optimale prestatie te bewegen, moet vóór de beoordeling met verscheidene factoren rekening worden gehouden:

- de panelleden mogen niet aan een ziekte lijden die hun prestaties nadelig beïnvloeden. Indien een dergelijke situatie zich voordoet, moet een ander lid in het panel worden opgenomen;

- de panelleden moeten op tijd komen om te kunnen deelnemen aan de beoordeling en zich ervan vergewissen dat zij voldoende tijd voor de beoordeling hebben uitgetrokken;

- de panelleden moeten het gebruik van sterk geurende producten als parfums, lotions, aftershaves en deodorants vermijden, evenals het nuttigen van sterk gearomatiseerde (gekruide) producten enz.;

- de panelleden mogen een half uur voor het begin van de beoordelingssessie niet roken, eten, of iets anders dan water drinken.

6. Beoordeling van de waarde per eigenschap

6.1. De sensorische evaluatie moet met het oog op onderstaande drie eigenschappen worden uitgevoerd: uiterlijk, consistentie en geur en smaak.

Uiterlijk betreft de volgende kenmerken: kleur, zichtbare zuiverheid, schimmelgroei en waterdispersie. De waterdispersie wordt onderzocht volgens IDF-norm 112A/1989.

Consistentie betreft de volgende kenmerken: vastheid en smeerbaarheid.

Voor de evaluatie van de boterconsistentie kunnen fysische methoden worden gebruikt. De Commissie is voornemens die methoden te harmoniseren.

Geur en smaak betreffen de volgende kenmerken: smaak en geur.

Een belangrijke afwijking van de aanbevolen temperatuur staat een betrouwbare evaluatie van de consistentie, geur en smaak in de weg. De temperatuur is van uitermate groot belang.

6.2. Elke eigenschap moet apart sensorisch worden geëvalueerd. Het toekennen van punten moet volgens tabel 1 plaatsvinden.

6.3. Het kan wenselijk zijn dat de beoordelaars, voordat ze aan de beoordeling beginnen, een of meer referentiemonsters gezamenlijk beoordelen op uiterlijk, consistentie en geur en smaak teneinde uniformiteit te bereiken.

6.4. Voor toekenning van punten voor goedkeuring van de boter geldt het volgende:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Als de vereiste punten niet worden gehaald, moet een omschrijving van de afwijking worden gegeven. De door iedere beoordelaar per eigenschap toegekende punten moeten in het controledocument worden genoteerd. Het product wordt op grond van een meerderheidsbesluit goed- of afgekeurd. Gevallen waarin verschillen tussen de afzonderlijke punten per eigenschap groter zijn dan 1 punt, mogen niet vaak voorkomen (hoogstens eenmaal per 20 monsters). Als dat wel zo is, dient de panelleider de deskundigheid van het panel te controleren.

7. Toezicht

Een panelleider, die een officiële werknemer van de bevoegde autoriteit moet zijn en lid van het panel mag zijn, is verantwoordelijk voor de hele gang van zaken. Hij moet de individuele punten per eigenschap in het controledocument noteren en vastleggen of het product goed- of afgekeurd is.

8. Bemonstering en bereiding van het monster

8.1. - Het is, om vooroordeel te vermijden, gewenst dat de identiteit van de monsters tijdens de evaluatie geheim blijft.

- De panelleider moet een en ander vóór de evaluatie organiseren zonder de aanwezigheid van de overige panelleden.

8.2. Wanneer de sensorische evaluatie in het koelhuis wordt uitgevoerd, wordt het monster met een boterboor genomen. Als de sensorische evaluatie op een andere plaats dan het koelhuis wordt uitgevoerd, moet een monster van minstens 500 g worden genomen.

8.3. Tijdens de evaluatie moet de boter een temperatuur van 10-12 °C hebben. Grote afwijkingen moeten koste wat het kost worden vermeden.

9. Nomenclatuur

Zie tabel 2.

Tabel 1: Puntenwaardering boter

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Tabel 2: Tabel van boterafwijkingen

I. Uiterlijk

1. waterig (vrij vocht)

2. niet uniform, twee kleuren

3. streperig

4. gevlekt, gemarmerd

5. vlekkerig

6. olieafscheiding

7. te sterk gekleurd

8. slap (open structuur)

9. korrelig

10. vreemde stoffen

11. beschimmeld

12. onopgelost

II. Consistentie

14. kort, brokkelig, kruimelig

15. deegachtig, vettig

16. kleverig

17. hard

18. zacht

III. Geur en smaak

20. ontbreken

21. onzuiver(1)

22. vreemde smaak

23. muf

24. kazig, kaasgeur

25. zuur

26. gistachtig

27. a) kooksmaak

b) branderig

28. schimmelsmaak

29. ranzig

30. olieachtig, visachtig

31. talkachtig

32. a) oxidatiesmaak

b) metaalsmaak

33. voersmaak

34. ruw, bitter

35. te zout

36. goor, bedorven

37. moutachtig

38. chemische smaak

(1) Deze aanduiding moet zo weinig mogelijk worden gebruikt en alleen wanneer de afwijking niet nauwkeuriger kan worden beschreven.

BIJLAGE VIII

(Artikel 7)

TOE TE PASSEN PROCEDURE ALS ANALYSERESULTATEN WORDEN BETWIST (CHEMISCHE ANALYSE)

1. Op verzoek van de marktdeelnemer wordt binnen 7 werkdagen volgende op de mededeling van de resultaten van de eerste analyse een nadere analyse uitgevoerd, mits verzegelde duplo-monsters van het product beschikbaar zijn en mits deze behoorlijk zijn bewaard.

2. De bevoegde instantie stuurt deze monsters op verzoek en op kosten van de marktdeelnemer naar een tweede laboratorium. Dat laboratorium moet gemachtigd zijn officiële analyses uit te voeren en moet bewezen hebben over de bekwaamheid te beschikken om de betrokken analyses uit te voeren. Die bekwaamheid dient te blijken uit een succesvolle deelneming aan gezamenlijke studies, expertisetests of vergelijkingen tussen laboratoria. Het tweede laboratorium moet de referentiemethode gebruiken. De door de twee laboratoria verkregen resultaten worden als volgt beoordeeld:

a) Als beide laboratoria aan de herhaalbaarheidseis en de reproduceerbaarheidseis voldoen

Het rekenkundig gemiddelde van de door beide laboratoria verkregen resultaten wordt als eindresultaat opgegeven. Dit eindresultaat wordt beoordeeld rekening houdend met het kritische verschil, aan de hand van onderstaande formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>: rekenkundig gemiddelde van alle door beide laboratoria verkregen resultaten

mo: grenswaarde

R: reproduceerbaarheid

r: herhaalbaarheid

n1: aantal door laboratorium 1 verkregen resultaten

n2: aantal door laboratorium 2 verkregen resultaten.

Opmerking:

Als het eindresultaat wordt berekend aan de hand van de formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

of

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

(zie respectievelijk bijlage IV, punt 3 en punt 4) dan moeten R2x en r2x in de formules worden ingevoerd in plaats van R2 et r2.

b) Als beide laboratoria aan de herhaalbaarheidseis voldoen maar niet aan de reproduceerbaarheidseis

Als de tweede analyse de eerste bevestigt, wordt de ter analyse aangeboden hoeveelheid afgewezen als niet aan de eisen voldoend. Zoniet wordt de hoeveelheid aanvaard.

c) Als slechts één laboratorium aan de herhaalbaarheidseis voldoet

Bij de beslissing of de zending wordt aanvaard, wordt rekening gehouden met het eindresultaat van het laboratorium dat aan de herhaalbaarheidseis voldoet.

d) Als geen van de laboratoria aan de herhaalbaarheidseis voldoet maar wel aan de reproduceerbaarheidseis wordt voldaan

Punt a) is van toepassing.

e) Als geen van de laboratoria aan de herhaalbaarheidseis noch aan de reproduceerbaarheidseis voldoet

De ter analyse aangeboden hoeveelheid wordt aanvaard, als de door één laboratorium verkregen resultaten tot deze conclusie leiden.

f) Als de resultaten met behulp van niet-gevalideerde methoden zijn verkregen

De ter analyse aangeboden hoeveelheid wordt aanvaard, als de door één laboratorium verkregen resultaten tot deze conclusie leiden.

3. De resultaten van de tweede analyse worden op zo kort mogelijke termijn door de bevoegde autoriteit aan de marktdeelnemer meegedeeld. De kosten van de tweede analyse moeten door de marktdeelnemer worden gedragen, als de ter analyse aangeboden hoeveelheid wordt afgewezen.

4. Indien de marktdeelnemer het bewijs levert dat de bemonsteringsprocedure niet correct is uitgevoerd, moet de bemonstering zo mogelijk binnen 5 werkdagen na de monsterneming worden overgedaan. Wanneer niet opnieuw een monster kan worden genomen, wordt de ter analyse aangeboden hoeveelheid aanvaard.

BIJLAGE IX

(Artikel 8)

BEPALING VAN HET VOCHTGEHALTE VAN BOTER

1. Onderwerp en toepassingsgebied

Deze referentiemethode beschrijft de werkwijze voor de bepaling van het vochtgehalte van boter.

2. Referentie

IDF-norm 50 C: 1995 - Melk en melkproducten - Bemonsteringsmethodes.

3. Definitie

Vochtgehalte van boter: het massaverlies na uitvoering van het verwarmingsproces beschreven in deze norm. Het vochtgehalte wordt uitgedrukt in gram per 100 gram.

4. Principe

Verdamping van het vocht uit een testportie in aanwezigheid van puimsteen bij een temperatuur van 102 °C in een droogstoof.

5. Apparatuur en materiaal

Gebruikelijke laboratoriumuitrusting, en in het bijzonder:

5.1. Analytische balans, tot 1 mg nauwkeurig.

5.2. Exsiccator met een goed droogmiddel (bijvoorbeeld, goed voorgedroogde silicagel met een vochtindicator).

5.3. Geventileerde, thermostatisch geregelde droogstoof waarvan de temperatuur kan worden gehandhaafd op 102 ± 2 °C.

5.4. Glazen, porseleinen of niet corrodeerbare metalen schalen, ongeveer 20 mm hoog met een diameter van 60 tot 80 mm.

5.5. Korrelige, gewassen puimsteen met een diameter van 0,8-10 mm.

6. Bemonstering

Zie IDF 50 C: 1995.

7. Procedure

7.1. Klaarmaken van het testmonster

Verwarm het monster in een gesloten pot van glas of van een daartoe geschikte kunststof, voor de helft tot tweederde gevuld, tot een temperatuur waarop het monster voldoende zacht is om het goed te kunnen mengen tot een homogeen geheel (met een mechanische shaker of met de hand). De temperatuur bij het mengen mag normaal gezien de 35 °C niet overschrijden. Laat het monster tot omgevingstemperatuur afkoelen. Open de monsterpot zo snel mogelijk na het afkoelen en roer kort (niet langer dan 10 s) met een daartoe geschikt voorwerp, bijvoorbeeld een lepel of een spatel, alvorens te wegen.

7.2. Bepaling van het vochtgehalte

7.2.1. Leg ongeveer 10 g puimsteen in de schaal (5.4).

7.2.2. Droog de schaal met de puimsteen in de droogstoof (5.3) op 102 ± 2 °C gedurende ten minste 1 uur.

Opmerking:

de droogtijden vermeld onder 7.2.2, 7.2.5 en 7.2.7 gelden vanaf het ogenblik waarop de temperatuur van de droogstoof 102 ± 2 °C bereikt.

7.2.3. Laat de schaal afkoelen in de exsiccator (5.2) tot de temperatuur van de balans en weeg tot op 1 mg.

7.2.4. Weeg in de schaal, tot op 1 mg, een testportie van ongeveer 5 g van het monster.

7.2.5. Zet de schaal in de droogstoof op 102 ± 2 °C gedurende 3 uur.

7.2.6. Laat de schaal afkoelen in de exsiccator tot de temperatuur van de balans en weeg tot op 1 mg.

7.2.7. Herhaal het droogproces gedurende bijkomende periodes van 1 uur, waarbij telkens wordt gekoeld en gewogen zoals beschreven onder punt 7.2.6 tot een constante massa bereikt wordt (massaverandering niet meer dan 1 mg).

Als de massa toeneemt, de laagst geregistreerde massa gebruiken voor de berekening.

8. Weergave van resultaten

8.1. Berekeningsmethode en formule

Bereken het vochtgehalte, W, in massaprocenten met behulp van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

m0: massa van de schaal met de puimsteen (7.2.3), in g

m1: massa van de testportie, de schaal en de puimsteen voor verhitting (7.2.4), in g

m2: massa van de testportie, de schaal en de puimsteen na verhitting (7.2.7), in g.

Rond het resultaat af tot één cijfer na de komma.

8.2. Herhaalbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige bepalingen, die gelijktijdig of kort na elkaar zijn uitgevoerd door dezelfde persoon onder dezelfde omstandigheden op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,2 % bedragen.

8.3. Reproduceerbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige en onafhankelijke bepalingen, die zijn uitgevoerd door twee personen in verschillende laboratoria op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,3 % bedragen.

9. Verslag van het onderzoek

Het verslag van het onderzoek dient de gebruikte methode en de verkregen resultaten te vermelden. Het dient tevens alle details te vermelden die niet gespecificeerd worden in deze internationale norm of die naar keuze zijn, evenals de details inzake omstandigheden die de resultaten hebben kunnen beïnvloeden. Het verslag van het onderzoek moet alle noodzakelijke informatie bevatten voor volledige identificatie van het monster.

BIJLAGE X

(Artikel 8)

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN VETVRIJE DROGE STOF VAN BOTER

1. Onderwerp en toepassingsgebied

Deze norm beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van boter.

2. Referentie

IDF-norm 50 C: 1995 - Melk en melkproducten - Bemonsteringsmethodes.

3. Definities

Gehalte aan vetvrije droge stof van boter: het massapercentage bepaald volgens de gespecificeerde procedure. Het gehalte wordt uitgedrukt in gram per 100 gram.

4. Principe

Verdamping van het vocht uit een bekende massa boter, extractie van het vet met petroleumether en wegen van het residu.

5. Reagens

Petroleumether met een kooktraject tusen 30 en 60 °C. Het reagens mag niet meer dan 1 mg residu overlaten na verdamping van 100 ml.

6. Apparatuur en materiaal

6.1. Analytische balans, tot 1 mg nauwkeurig.

6.2. Exsiccator met een goed droogmiddel (bijvoorbeeld, goed voorgedroogde silicagel met een vochtindicator).

6.3. Geventileerde, thermostatisch geregelde droogstoof waarvan de temperatuur kan worden gehandhaafd op 102 +- 2 °C.

6.4. Glazen, porseleinen of niet corrodeerbare metalen schalen, met een tuit van ongeveer 20 mm hoog en een diameter van 60 tot 80 mm, voorzien van een glanzen roerstaaf.

6.5. Filterkroes, met glasfilter, poriënwijdte 16 tot 40 μm, met afzuigkolf.

7. Bemonstering

Zie IDF-norm 50 C: 1995.

8. Procedure

8.1. Klaarmaken van het testmonster

Verwarm het monster in de gesloten pot van glas of van een daarvoor geschikte kunststof, voor de helft tot tweederde gevuld, tot een temperatuur waarop het monster voldoende zacht is om het goed te kunnen mengen tot een homogeen geheel (met een mechanische shaker of met de hand). De temperatuur bij het mengen mag normaal gezien de 35 °C niet overschrijden. Laat het monster tot ongevingstemperatuur afkoelen. Open de monsterpot zo snel mogelijk na het afkoelen en roer kort (niet langer dan 10 s) met een daartoe geschikt voorwerp, bijvoorbeeld een lepel of een spatel, alvorens te wegen.

8.2. Bepaling

8.2.1. Droog de schaal met de staaf (6.4) en de kroes (6.5) in de droogstoof (6.3) gedurende 1 uur. Laat deze voorwerpen afkoelen in de exsiccator en weeg ze samen (d.w.z. schaal, staaf en kroes) tot op 1 mg (m0).

Opmerking:

- Als regel kan men stellen dat een koeltijd van 45 min volstaat.

- Het is belangrijk dat dezelfde combinatie van schaal, staaf en kroes wordt gebruikt voor elke testportie wanneer meer dan één testportie wordt geanalyseerd.

8.2.2. Verwijder de kroes en weeg de schaal en de staaf samen tot op 1 mg (m1).

8.2.3. Weeg in de schaal, tot op 1 mg, een testportie van ongeveer 5 g van het monster (8.1) (m2).

8.2.4. Zet de schaal (met daarin de staaf en de boter) in de droogstoof op 102 +- 2 °C en laat een nacht staan.

8.2.5. Laat de schaal (8.2.3) afkoelen tot kamertemperatuur.

8.2.6. Voeg 15 ml warm (ongeveer 25 °C) petroleumether toe in de schaal en maak zo veel mogelijk sediment los van de schaal met behulp van de glasstaaf. Breng de oplossing over in de kroes en laat ze filtreren in de afzuigkolf.

8.2.7. Herhaal de onder punt 8.2.6 beschreven handeling nog vier maal. Als het oppervlak van de schaal geen vetsporen vertoont, breng dan tijdens de vierde spoeling zo veel mogelijk sediment over in de kroes. Als er wel vetsporen zijn, herhaal dan de onder punt 8.2.6 beschreven handeling tot al het vet is verwijderd.

8.2.8. Spoel het sediment in de kroes met 25 ml warm petroleumether.

8.2.9. Droog de schaal samen met de glasstaaf en de kroes gedurende 30 minuten in de droogstoof op 102 +- 2 °C.

8.2.10. Laat afkoelen in de exsiccator tot kamertemperatuur en weeg tot op 1 mg.

8.2.11. Herhaal de onder de punten 8.2.9 en 8.2.10 beschreven handelingen tot voor de schaal, de staaf en de kroes samen (m3) een constante massa is bereikt (massaverandering niet meer dan 1 mg).

9. Weergave van resultaten

9.1. Berekening van het gehalte aan vetvrije droge stof

Bereken het gehalte aan vetvrije droge stof, SNF, in massaprocenten met behulp van de volgende formule:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

m0 massa van de lege schaal, de glasstaaf en de kroes (8.2.1), in g

m1 massa van de lege schaal en de glasstaaf (8.2.2), in g

m2 massa van de testportie en de schaal met de glasstaaf (8.2.3), in g

m3 eindmassa, in g, in de schaal met de glasstaaf en de kroes met het sediment (8.2.11).

Rond het resultaat af tot één cijfer na de komma.

9.2. Herhaalbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige bepalingen, die gelijktijdig of kort na elkaar zijn uitgevoerd door dezelfde persoon onder dezelfde omstandigheden op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,1 % bedragen.

9.3. Reproduceerbaarheid

Het absolute verschil tussen de resultaten van twee enkelvoudige en onafhankelijke bepalingen, die zijn uitgevoerd door twee personen in verschillende laboratoria op identiek testmateriaal mag niet meer dan 0,2 % bedragen.

10. Verslag van het onderzoek

Het verslag van het onderzoek dient de gebruikte methode en de verkregen resultaten te vermelden. Het dient tevens alle details te vermelden die niet gespecificeerd worden in deze internationale norm of die naar keuze zijn, evenals de details inzake omstandigheden die de resultaten hebben kunnen beïnvloeden. Het verslag van het onderzoek moet alle noodzakelijke informatie bevatten voor volledige identificatie van het monster.

Opmerking:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Geconcludeerd kan worden dat de betrouwbaarheidswaarden die zijn verkregen voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van boter ook gelden voor de bepaling van het gehalte aan vetvrije droge stof van melk.

BIJLAGE XI

(Artikel 8)

BEPALING VAN HET VETGEHALTE VAN BOTER

Het vetgehalte wordt indirect vastgesteld door de bepaling van het vochtgehalte en het gehalte aan vetvrije droge stof overeenkomstig bijlage IX, respectievelijk bijlage X. Het massapercentage van vet is gelijk aan

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

W: het massapercentage van water

SNF: het massapercentage van vetvrije droge stof.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

BIJLAGE XII

(Artikel 9)

BEPALING VAN HET VANILLINEGEHALTE IN BOTERCONCENTRAAT, BOTER OF ROOM MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC)

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van vanilline in boter, boterconcentraat of room.

2. Principe

Extractie van een bekende hoeveelheid monster met een mengsel van isopropanol/ethanol/acetonitril (1:1:2). Neerslaan van het grootste gedeelte van het vet door afkoelen tussen - 15 en - 20 °C, gevolgd door centrifugeren.

Na verdunnen met water, bepaling van het vanillinegehalte met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

3. Apparatuur

Gebruikelijke laboratoriumapparatuur en in het bijzonder:

3.1. Diepvriezer met een temperatuurbereik van - 15 tot - 20 °C

3.2. Wegwerpinjectiespuiten van 2 ml

3.3. Membraanmicrofilters met een poriëngrootte van 0,45 μm en bestand tegen een oplossing met 5 % extractie-oplossing (4.4)

3.4. Vloeistofchromatografiesysteem, bestaande uit een pomp (stroomsnelheid 1,0 ml/min.), een injector (20 μl injectie, automatisch of manueel), een UV-detector (ingesteld op 306 nm, 0,01 AU full scale), recorder of integrator, en een kolomthermostaat ingesteld op 25 °C

3.5. Analysekolom (250 mm x 4,6 mm I.D.), gepakt met LiChrospher RP 18 (Merck, 5 m) of equivalent

3.6. Voorkolom (ong. 20 mm x 3 mm I.D.), droog gepakt met Perisorb RP 18 (30-40 m) of equivalent

4. Reagentia

Alle gebruikte reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

4.1. Isopropanol

4.2. Ethanol 96 % (v/v)

4.3. Acetonitril

4.4. Extractievloeistof

Meng isopropanol (4.1), ethanol (4.2) en acetonitrile (4.3) in de verhouding 1:1:2 (v/v).

4.5. Vanilline (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)

4.5.1. Stockoplossing vanilline (= 500 μg/ml)

Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig ongeveer 50 mg (CM mg) vanilline (4.5) af in een maatkolf van 100 ml; voeg 25 ml extractieoplossing (4.4) toe en vul aan met water.

4.5.2. Standaardoplossing vanilline (= 10 μg/ml)

Pipetteer 5,00 ml van de stockoplossing vanilline (4.5.1) in een maatkolf van 250 ml en vul aan met water.

4.6. Methanol, HPLC-kwaliteit

4.7. IJsazijn

4.8. Water, HPLC-kwaliteit

4.9. HPLC-loopvloeistof

Meng 300 ml methanol (4.6), ongeveer 500 ml water (4.8) en 20,0 ml azijnzuur (4.7) in een maatkolf van 1000 ml en vul aan met water (4.8). Filtreer door een filter van 0,45 μm (3.3).

5. Werkwijze

5.1. Bereiding van het testmonster

5.1.1. Boter

Verwarm het monster totdat dit begint te smelten. Vermijd plaatselijke oververhitting boven 40 °C. Homogeniseer het monster door het te schudden, wanneer het zacht genoeg is. Roer de boter 15 s en neem daarna een testmonster. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 5 g (SM g) boter af in een maatkolf van 100 ml. (SM = de massa van het testmonster)

5.1.2. Boterconcentraat

Plaats direct voor de monsterneming de verpakking met het boterconcentraat in een oven bij 40-50 °C totdat het product volledig gesmolten is. Meng het monster door zwenken of roeren, maar voorkom dat luchtbellen ontstaan doordat te hard wordt geroerd. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 4 g (SM g) boterconcentraat af in een maatkolf van 100 ml.

5.1.3. Room

Verwarm het monster in een waterbad of broedstoof bij een temperatuur van 35-40 °C. Verdeel het vet homogeen door zwenken en, indien nodig, door roeren. Koel het monster snel af tot 20 +- 2 °C. Het monster moet er homogeen uitzien, anders moet de werkwijze worden herhaald. weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 10 g (SM g) room af in een maatkolf van 100 ml.

5.2. Bereiding van de testoplossing

Voeg ongeveer 75 ml extractieoplossing (4.4) toe aan het testmonster (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3), roer of schud ongeveer 15 min. krachtig en vul aan met extractieoplossing (4.4). Breng ongeveer 10 ml van dit extract over in een reageerbuis, die afgesloten wordt met een stop. Plaats de reageerbuis in de diepvriezer (3.1) en wacht ongeveer 30 min.. Centrifugeer het koude extract 5 min. bij ongeveer 2000 op en giet onmiddellijk af. Laat de afgegoten oplossing op kamertemperatuur komen. Pipetteer 5 ml van de afgegoten oplossing in een maatkolf van 100 ml en vul aan met water. Filtreer een fractie door een membraanmicrofilter (3.3). Het filtraat is gereed voor de bepaling met behulp van HPLC.

5.3. Kalibrering

Pipetteer 5 ml van de standaardoplossing vanilline (4.5.2) in een maatkolf van 100 ml. Voeg 5 ml extractieoplossing (4.4) toe en vul tot de merkstreep aan met water. Deze oplossing bevat 0,5 μg/ml vanilline.

5.4. Bepaling met behulp van HPLC

Laat het chromatografische systeem ongeveer 30 min stabiliseren. Injecteer de standaardoplossing (5.3). Herhaal dit totdat het verschil in piekoppervlakte of piekhoogte tussen twee opeenvolgende injecties kleiner is dan 2 %. Onder de beschreven omstandigheden bedraagt de retentietijd van vanilline ongeveer 9 min. Analyseer de standaardoplossing (5.3) in duplo door injectie van 20 μl. Injecteer 20 μl van de testoplossingen (5.2). Bepaal de oppvervlakte of de hoogte van de vanillinepiek. Herhaal de duplobepaling van de standaardoplossing (5.3) na tien injecties van de testoplossingen (5.2).

6. Berekening van de resultaten

Bereken de gemiddelde oppervlakte (of de gemiddelde hoogte) (AC) van de vanillinepieken die horen bij de duplo-injecties van de standaardoplossingen vóór en na iedere reeks testoplossingen (vier oppervlakken of piekhoogtes in totaal).

Bereken de responsfactor (R):

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin CM gelijkstaat met de massa van de vanilline in mg (4.5.1).

Het gehalte (mg/kg) van vanilline (C) in het testmonster wordt verkregen door:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

waarin:

AS= de piekoppervlakte van de vanillinepiek van het testmonster;

SM= de massa van het testmonster in g (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3).

Bij analyse van vanilline in room wordt de concentratie van de verklikstof uitgedrukt in mg/verklikstof/kg melkvet. Hiertoe wordt C vermenigvuldigd met 100/f. f is het vetgehalte van de room in procenten (m/m).

20= de factor die gebaseerd is op de verdunningen van de standaard en het testmonster;

0,96= de correctiefactor voor het vetgehalte in de eerste verdunning van het testmonster.

Opmerking:

In plaats van de piekoppervlakken kunnen piekhoogtes worden gebruikt (zie 8.3).

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Herhaalbaarheid (r)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur zijn uitgevoerd op identiek monstermateriaal, mag niet groter zijn dan 16 mg/kg.

7.2. Reproduceerbaarheid (R)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door verschillende personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur zijn uitgevoerd op identiek monstermateriaal, mag niet groter zijn dan 27 mg/kg.

8. Tolerantiegrenzen

8.1. Voor de controle op de homogene verdeling van de verklikstof in het product moeten drie monsters van het gemerkte product worden genomen.

8.2. Uit vanille of synthetische vanille vervaardigde verklikstof.

8.2.1. Het bijmengingsgehalte van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde bedraagt 250 g per ton boterconcentraat of boter. Bij toevoeging van verklikstoffen aan room bedraagt het bijmengingsgehalte 250 g per ton melkvet.

8.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 221,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 159,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 221,0 mg/kg en 159,0 mg/kg.

8.3. Uitsluitend uit vanillepeulen of integrale extracten daarvan vervaardigde verklikstof:

8.3.1. Het bijmengingsgehalte van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde bedraagt 100 g per ton boterconcentraat of boter. Bij toevoeging van verklikstoffen aan room bedraagt het bijmengingsgehalte 100 g per ton melkvet.

8.3.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 79,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 54,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 79,0 mg/kg en 54,0 mg/kg.

9. Aantekeningen

9.1. De herhaalbaarheid r is de waarde waaronder met een gespecificeerde waarschijnlijkheid het absolute verschil ligt tussen de resultaten die met dezelfde methode onder dezelfde omstandigheden (dezelfde apparatuur, hetzelfde laboratorium, en kort na elkaar) zijn verkregen bij twee enkelvoudige bepalingen uitgevoerd met identiek monstermateriaal; tenzij anders aangegeven, bedraagt die waarschijnlijkheid 95 %.

9.2. De reproduceerbaarheid R is de waarde waaronder met een gespecificeerde waarschijnlijkheid het absolute verschil ligt tussen de resultaten die met dezelfde methode onder verschillende omstandigheden (verschillende personen, verschillende laboratoria en/of verschillende tijdstippen) zijn verkregen bij twee enkelvoudige bepalingen uitgevoerd met identiek monstermateriaal; tenzij anders aangegeven, bedraagt die waarschijnlijkheid 95 %.

9.3. De recovery van toegevoegd vanilline bij een gehalte van 250 mg/kg butteroil varieert van 97,0 tot 103,8 %. Het gemiddelde gehalte dat gevonden werd, bedroeg 99,9 % met een standaardafwijking van 2,7 %.

9.4. De standaardoplossing bevat 5 % extractieoplossing ter compensatie van de piekverbreding als gevolg van de aanwezigheid van 5 % van de extractieoplossing van de testmonsters. Hierdoor is een kwantificering via de piekhoogte mogelijk.

9.5. De analyse is gebaseerd op een lineaire ijklijn door de oorsprong.

Door gebruikmaking van geschikte verdunningen van de standaardoplossing (4.5.2), moet de eerste keer dat de analyse wordt uitgevoerd en verder met regelmatige tussenpozen en na veranderingen in of herstel van de HPLC-apparatuur, de lineariteit worden gecontroleerd.

BIJLAGE XIII

(Artikel 9)

BEPALING VAN DE ETHYLESTER VAN β-APO-8'-CAROTEENZUUR IN BOTERCONCENTRAAT EN BOTER MET BEHULP VAN SPECTROMETRIE

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van de ethylester van β-apo-8'-caroteenzuur (apocaroteenzuurester) in boterconcentraat en boter. Onder apocaroteenzuurester wordt verstaan de totale hoeveelheid van alle stoffen in een extract van monsters, verkregen op de in de methode beschreven wijze, die bij 400 nm licht absorberen.

2. Principe

Het botervet wordt opgelost in petroleumether en vervolgens wordt de absorptie bij 440 nm gemeten. Het gehalte aan apocaroteenzuurester wordt met behulp van een externe standaard bepaald.

3. Apparatuur

3.1. Meetpipetten, 0,25, 0,50, 0,75 en 1,0 ml

3.2. Spectrofotometer, geschikt voor meting bij 440 nm (en 447-449 nm) en voorzien van cuvetten met een optische weglengte van 1 cm.

3.3. Maatkolven, 20 ml en 100 ml

3.4. Analytische balans, tot 1 mg nauwkeurig.

4. Reagentia

Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

4.1. Suspensie van apocaroteenzuurester (ongeveer 20 %)

4.1.1. Bepaal het gehalte van deze suspensie als volgt:

Weeg nauwkeurig ongeveer 400 mg af in een maatkolf van 100 ml, los 20 ml chloroform op (4.4) en vul aan tot het gewenste volume met cyclohexaan (4.5). Vul 5 ml van deze oplossing aan tot 100 ml met cyclohexaan (oplossing A). Vul 5 ml van oplossing A aan tot 100 ml met cyclohexaan. Meet de absorptie bij 447-449 nm (meer het maximum door cyclohexaan als blanco te nemen en door bakjes van 1 cm optische weglengte te nemen.

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Hierbij is:

Amax= maximale absorptie van de meetoplossing;

A= gewicht van het monster in gram;

2550= absorptie van een referentieoplossing (1 %, 1 cm);

P= het gehalte van de suspensie in %.

Opmerking:

Een suspensie van apocaroteenzuurester is gevoelig voor lucht, warmte en licht. Een ongeopende oorspronkelijke verpakking (luchtdicht onder stikstof) kan op een koele plaats gedurende ongeveer twaalf maanden worden bewaard. Na opening moet de inhoud binnen een korte periode worden gebruikt.

4.1.2. Standaardoplossing van apocaroteenzuurester, ongeveer 0,2 mg/ml

Weeg ongeveer 0,100 g suspensie van apocaroteenzuurester (4.1.1) (Wg) tot op 0,1 mg nauwkeurig af. Los op in petroleumether (4.2) en breng de oplossing kwantitatief over in een maatkolf van 100 ml en vul aan met petroleumether tot de maatstreep.

Deze oplossing bevat (W.P)/10 mg apocaroteenzuurester/ml.

Opmerking:

De oplossing moet op een koele donkere plaats worden bewaard. Na een maand is zij niet meer bruikbaar.

4.2. Petroleumether (40-60 °C).

4.3. Natriumsulfaat (watervrije korrels), vooraf gedurende twee uur gedroogd bij 102 °C.

4.4. Chloroform.

4.5. Cyclohexaan.

5. Procedure

5.1. Bereriding van het te analyseren monster

5.1.1. Boterconcentraat.

Smelt het monster in een oven bij ongeveer 45 °C.

5.1.2. Boter

Smelt het monster in een oven bij ongeveer 45 °C en filtreer een representatieve hoeveelheid in een omgeving zonder sterk natuurlijk of kunstlicht bij 45 °C over een filter dat 10 g watervrij natriumsulfaat (4.3) bevat. Vang een bruikbare hoeveelheid botervet op.

5.2. Analyse

Weeg ongeveer 1 g boterconcentraat of geëxtraheerd botervet (5.1.2) tot op 1 mg nauwkeurig af (Mg). Breng deze hoeveelheid met behulp van petroleumether (4.2) kwantitatief over in een maatkolf van 20 ml (V), vul aan tot de maatstreep en meng goed.

Breng een hoeveelheid hiervan over in een cuvet van 1 cm en meet de absorptie bij 440 nm met petroleumether als blanco. Lees de concentratie van apocaroteenzuurester in de oplossing af uit de ijkcurve (C μg/ml).

5.3. IJkcurve

Pipetteer 0, 0,25, 0,5, 0,75 en 1,0 ml van de standaardoplossing van apocaroteenzuurester (4.1.2) in vijf maatkolven van 100 ml. Vul met petroleumether (4.2) aan tot de maatstreep en meng.

De concentraties van de oplossingen liggen ongeveer tussen 0 en 2 μg/ml en worden nauwkeurig berekend aan de hand van de concentratie van de standaardoplossing (4.1.2): W.P/10 mg/ml. Meet de absorptie bij 440 nm met petroleumether als blanko.

Zet de absorptie op de y-as uit tegen de concentratie van apocaroteenzuurester op de x-as.

6. Berekening van de resultaten

6.1. Het gehalte aan apocaroteenzuurester, uitgedrukt als mg/kg product, is:

(C.V)/M voor boterconcentraat en

0,82 (C.V)/M voor boter

waarin:

C= het gehalte aan apocaroteenzuurester in μg/ml, afgelezen uit de ijkcurve (5.3)

V= volume (ml) van de testoplossing (5.2)

M= de massa van het geanalyseerde monster in gram (5.2)

0,82= een correctiefactor voor het gehalte van boter aan botervet.

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Herhaalbaarheid

7.1.1. Analyse van boter

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 1,4 mg/kg.

7.1.2. Analyse van boterconcentraat

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 1,6 mg/kg.

7.2. Reproduceerbaarheid.

7.2.1. Analyse van boter

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 4,7 mg/kg.

7.2.2. Analyse van boterconcentraat

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 5,3 mg/kg.

7.3. Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn vastgesteld op basis van een experiment dat in 1995 in elf laboratoria werd uitgevoerd met twaalf monsters met verklikstoffen (zes blinde duplo's) voor boter en twaalf monsters met verklikstoffen (zes blinde duplo's) voor boterconcentraat.

8. Tolerantiegrenzen

8.1. Om na te gaan of de toevoeging van verklikstoffen aan het product op correcte wijze is gebeurd, moeten van dit product drie monsters worden genomen.

8.2. Boter

8.2.1. Het bijmengingsgehalte voor boter bedraagt, rekening houdend met de achtergrondabsorptie, 22 mg/kg.

8.2.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vegeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 18,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 13,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 18,0 mg/kg en 13,0 mg/kg.

8.3. Boterconcentraat

8.3.1. Het bijmengingsgehalte voor boterconcentraat bedraagt, rekening houdend met de achtergrondabsorptie, 24 mg/kg.

8.3.2. De uit analyse van het product verkregen resultaten van de drie monsters worden gebruikt om het gehalte aan en de homogene toevoeging van de verklikstof te verifiëren, en het laagste resultaat wordt vergeleken met de volgende waarden (kritisch verschil bij een waarschijnlijkheid van 95 % (CrD95)):

- 20,0 mg/kg (95 % van het minimum-bijmengingsgehalte);

- 14,0 mg/kg (70 % van het minimum-bijmengingsgehalte).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat het laagste resultaat oplevert, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 20,0 mg/kg en 14,0 mg/kg.

BIJLAGE XIV

(Artikel 9)

BEPALING VAN SITOSTEROL OF STIGMASTEROL IN BOTERCONCENTRAAT OF IN BOTER MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van sitosterol of stigmasterol in boterconcentraat en boter. Onder sitosterol wordt verstaan de totale hoeveelheid (β-sitosterol en 22-dihydro-β-sitosterol; overige sitosterolen gelden als te verwaarlozen.

2. Uitgangspunt

Het boterconcentraat of de boter wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxide-oplossing, waarna de onverzeepbare bestanddelen worden geëxtraheerd met diethylether.

De sterolen worden omgezet in trimethylsilylethers en met behulp van capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald, waarbij betulinol als interne standaard wordt gebruikt.

3. Apparatuur

3.1. Kolf, 150 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2. Scheitrechters, 500 ml.

3.3. Kolven, 250 ml.

3.4. Tegendrukscheitrechters, 250 ml, of soortgelijke apparatuur voor het opvangen van gebruikte diethylether.

3.5. Glazen kolom, 350 mm x 20 mm, met een filterplaat van gesinterd glas.

3.6. Waterbad of verwarmingsmantel.

3.7. Reactieflesjes, 2 ml.

3.8. Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, bestaande uit:

3.8.1. een oven waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van +- 1 °C;

3.8.2. een injector met regelbare temperatuur;

3.8.3. een vlamionisatiedetector met elektronische versterker;

3.8.4. elektronische rekenapparatuur (integrator), geschikt voor gebruik met een elektronische versterker (3.8.3).

3.9. Een fused-silica capillaire kolom, inwendig gecoat met BP1 of equivalent met een uniforme dikte van 0,25 μm; met deze kolom moet resolutie van de trimethylsilylderivaten van lanosterol en sitosterol mogelijk zijn. Hiervoor kan een BP1-kolom met een lengte van 12 m en een inwendige diameter van 0,2 mm worden gebruikt.

3.10. Injectiespuit, van ten hoogste 1 μl, geschikt voor de injector.

4. Reagentia

Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

4.1. Ethanol, minimaal 95 % zuiver.

4.2. Kaliumhydroxide, oplossing van 60 %. Los 600 g kaliumhydroxide (minimaal 85 %) op in water en vul aan met water tot 1 liter.

4.3. Betulinol, minimaal 99 % zuiver.

4.3.1. Oplossingen van betulinol in diethylether (4.4):

4.3.1.1. De concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van sitosterol moet 1,0 mg/ml zijn.

4.3.1.2. De concentratie van de betulinol-oplossing voor de bepaling van stigmasterol moet 0,4 mg/ml zijn.

4.4. Diethylether, van analysekwaliteit (peroxide- en restvrij).

4.5. Natriumsulfaat, watervrij, 2 uur gedroogd bij 102 °C.

4.6. Silyleringsreagens, b.v. TRI-SIL (verkrijgbaar bij Pierce Chemical Co, Cat. nr. 49001) of gelijkwaardig. (Waarschuwing: TRI-SIL is ontvlambaar, toxisch, bijtend en mogelijkerwijs carcinogeen. Het laboratoriumpersoneel moet op de hoogte zijn van de veiligheidsvoorschriften voor TRI-SIL en de nodige voorzorgsmaatregelen nemen.)

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.

Opmerking 1:

De zuiverheid van het voor de ijking gebruikte standaardmateriaal moet volgens de interne normalisatiemethode worden bepaald. Aangenomen wordt dat alle in het monster aanwezige sterolen in het chromatogram voorkomen, dat het totale piekoppervlak overeenkomt met 100 % van de sterol-bestanddelen en dat de detector voor alle sterolen dezelfde respons geeft. Gecontroleerd moet worden of het systeem op het bij de analyse gebruikte concentratiebereik lineair is.

4.8.1. Sitosterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig, ongeveer 0,5 mg/ml (W1) sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat.

4.9. Stigmasterol, bekende zuiverheid (P) minimaal 90 %.

4.9.1. Stigmasterol-standaardoplossing: bereid een oplossing die, tot op 0,001 mg/ml nauwkeurig, ongeveer 0,2 mg/ml (W1) stigmasterol (4.9) in diethylether (4.4) bevat.

4.10. Mengsel voor controle van de resolutie: bereid een oplossing die 0,05 mg/ml lanosterol (4.7) en 0,5 mg/ml sitosterol (4.8) in diethylether (4.4) bevat.

5. Werkwijze

5.1. Bereiding van de standaardoplossingen voor chromatografie: de interne standaardoplossing (4.3.1.) moet op hetzelfde moment aan de desbetreffende standaardoplossing met sterolen en aan het verzeepte monster (5.2.2.) worden toegevoegd.

5.1.1. Standaardoplossing sitosterol voor chromatografie: breng 1 ml van de standaardoplossing sitosterol (4.8.1) in elk van twee reactieflesjes (3.7) en verdamp de diethylether met een stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.1) toe en verdamp de diethylether met een stikstofstroom.

5.1.2. Standaardoplossing stigmasterol voor chromatografie: breng 1 ml van de standaardoplossing stigmasterol (4.9.1 ) in elk van de twee reactieflesjes (3.7) en verdamp de diethylether met een stikstofstroom. Voeg 1 ml interne standaardoplossing (4.3.1.2) toe en verdamp de diethylether met een stikstofstroom.

5.2. Bereiding van de onverzeepbare bestanddelen

5.2.1. Laat het botermonster smelten door verwarming tot ten hoogste 35 °C, meng het monster zorgvuldig door het te roeren.

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 1 g boter (W2) of boterconcentraat (W2) af in een kolf van 150 ml (3.1). Voeg 50 ml ethanol (4.1) en 10 ml kaliumhydroxide-oplossing (4.2) toe. Bevestig de refluxkoeler, verwarm tot ongeveer 75 °C en handhaaf deze temperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot kamertemperatuur.

5.2.2. Voeg 1,0 ml interne standaardoplossing toe (4.3.1.1 als sitosterol wordt bepaald of 4.3.1.2 als stigmasterol wordt bepaald). Meng zorgvuldig en breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een scheitrechter van 500 ml (3.2), waarna de kolf achtereenvolgens wordt gewassen met 50 ml water en 250 ml diethylether (4.4). Schud de scheitrechter krachtig gedurende 2 minuten en wacht tot de fasen gescheiden zijn. Laat de waterige onderlaag weglopen en was de etherlaag door viermaal te schudden met 100 ml water.

Opmerking 2:

Om emulsievorming te voorkomen moet het wassen met water de eerste tweemaal voorzichtig gebeuren (tienmaal omkeren). De derde maal kan gedurende 30 seconden krachtig worden geschud. Indien er een emulsie ontstaat, kan deze worden afgebroken door 5-10 ml ethanol toe te voegen. Indien ethanol wordt toegevoegd, moet er nog eens tweemaal krachtig met water worden gewassen.

5.2.3. Laat de heldere zeepvrije etherlaag door een glazen kolom (3.5) met 30 g watervrij natriumsulfaat (4.5) lopen. Vang de ether op in een kolf van 250 ml (3.3). Voeg een kooksteentje toe en damp de oplossing vrijwel droog op een waterbad of met een verwarmingsmantel. Zorg er daarbij voor dat het verdampte oplosmiddel wordt opgevangen.

Opmerking 3:

Als de vloeistof bij een te hoge temperatuur volledig wordt ingedampt, is het mogelijk dat er ook sterolen verloren gaan.

5.3. Bereiding van de trimethylsilylethers

5.3.1. Breng de in de kolf resterende etheroplossing over in een reactieflesje van 2 ml (3.7) met 2 ml diethylether en verdamp de ether met een stikstofstroom. Was de kolf tweemaal als volgt: breng 2 ml diethylether in de kolf, breng deze over naar het reactieflesje en verdamp de ether met stikstof.

5.3.2. Silyleer het monster door 1 ml TRI-SIL (4.6) toe te voegen. Sluit het vat af en schud krachtig om de sterolen op te lossen. Verwarm, als de sterolen niet volledig oplossen, tot 65-70 °C. Laat de oplossing gedurende ten minste 5 minuten staan alvorens deze in de gaschromatograaf te injecteren. Silyleer de standaardoplossing en het mengsel om de resolutie op dezelfde manier te controleren als de monsters (4.10).

Opmerking 4:

Het silyleren moet in een watervrije omgeving gebeuren. Wanneer betulinol onvolledig is gesilyleerd, verschijnt er vlak bij de betulinol-piek een tweede piek.

Het silyleringsproces wordt gestoord door de aanwezigheid van ethanol in de oplossing, die een gevolg kan zijn van onvoldoende wassen na de extractie. Indien dit probleem aanhoudt, was dan na de extractie een vijfde maal, waarbij gedurende 30 seconden krachtig wordt geschud.

5.4. Gaschromatografie

5.4.1. Keuze van de werkomstandigheden:

Volg voor de instelling van de gaschromatograaf de instructies van de fabrikant op.

Voor de werkomstandigheden gelden de volgende richtlijnen:

- kolomtemperatuur: 265 °C

- injectortemperatuur: 280 °C

- detectortemperatuur: 300 °C

- stroomsnelheid draaggas: 0,6 ml/min.

- waterstofdruk: 84 kPa

- luchtdruk: 155 kPa

- splitverhouding: van 10: 1 tot 50: 1; de splitverhouding moet volgens de instructies van de fabrikant worden geoptimaliseerd en vervolgens moet worden gecontroleerd of de respons van de detector op het gebruikte concentratiebereik lineair is.

Opmerking 5:

Het is vooral belangrijk dat de liner van de injector regelmatig wordt schoongemaakt.

- geïnjecteerde hoeveelheid: 1 μl TMSE-oplossing.

Laat het systeem equilibreren en begin niet met de analyse voordat de respons voldoende stabiel is.

Stel de omstandigheden, die afhankelijk van de kenmerken van de kolom en de gaschromatograaf zijn, zodanig in, dat er chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:

- de resolutie tussen de sitosterol-piek en de lanosterol-piek moet afdoende zijn. Bij een gesilyleerd mengsel voor controle op de resolutie (4.10) moet een soortgelijk chromatogram worden verkregen als in figuur 1 is weergegeven,

- voor onderstaande sterolen moet ongeveer de daarbij vermelde relatieve retentietijd worden verkregen:

cholesterol: 1,0

stigmasterol: 1,3

sitosterol: 1,5

betulinol: 2,5

- de retentietijd voor betulinol moet ongeveer 24 minuten zijn.

5.4.2. Analyse:

Injecteer 1 μl gesilyleerde standaardoplossing (stigmasterol of sitosterol) en stel de kalibratieparameters van de integrator in.

Injecteer 1 μl gesilyleerde standaardoplossing om de responsfactor in vergelijking met betulinol te bepalen.

Injecteer 1 μl gesilyleerde monsteroplossing en meet de piekoppervlakken. Voor en na elke chromatografische reeks moet er 1 μl standaardoplossing worden geïnjecteerd.

Als leidraad kan worden gesteld dat vóór en na elke reeks van 6 monsteroplossingen de standaardoplossing wordt geïnjecteerd.

Opmerking 6:

Bij de integratie van de stigmasterol-piek moet ook het oppervlak van eventuele staarten, zoals aangegeven bij de punten 1, 2 en 3 in figuur 2b, worden meegerekend.

Wanneer de totale hoeveelheid sitosterol wordt bepaald, moet bij de integratie van de sitosterol-piek ook het oppervlak van de piek van 22-dihydro-β-sitosterol (stigmastanol), dat vlak na sitosterol evolueert, worden meegerekend.

6. Berekening van de resultaten

6.1. Bepaal het oppervlak van de sterol-pieken en de betulinol-pieken bij de standaardoplossingen voor en na een reeks en bereken R1:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Bepaal het oppervlak van de sterol-piek (stigmasterol en sitosterol) en de betulinolpiek in de monsteroplossing en bereken R2:

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

W1= sterolconcentratie van de standaard in de standaardoplossing (4.8.1 of 4.9.1) in mg/ml;

W2= gewicht van het monster in gram (5.2.1);

P= zuiverheid van de standaard-sterol (4.8 of 4.9);

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Boter

7.1.1. Herhaalbaarheid

7.1.1.1. Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 19,3 mg/kg.

7.1.1.2. Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, binnen een zo kort mogelijke tijd uitgevoerd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 23,0 mg/kg.

7.1.2. Reproduceerbaarheid

7.1.2.1. Stigmasterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 31,9 mg/kg.

7.1.2.2. Sitosterol

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen, uitgevoerd door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur op hetzelfde monster, mag niet groter zijn dan 8,7 % van het gemiddelde van de bepalingen.

7.1.3. Herkomst van de precisiegegevens

De precisiegegevens zijn vastgesteld op