BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE van 9 september 1997 inzake een voorlopige onderzoeksmethode voor de diagnose, detectie en identificatie van Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in aardappelen (97/647/EG)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 77/93/EEG van de Raad van 21 december 1976 betreffende de beschermende maatregelen tegen het binnenbrengen en de verspreiding in de Gemeenschap van voor planten en voor plantaardige producten schadelijke organismen (1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 97/14/EG (2), en met name op artikel 15, lid 3,

Overwegende dat in Beschikking 95/506/EG van de Commissie van 24 november 1995 tot machtiging van bepaalde lidstaten om ten aanzien van het Koninkrijk der Nederlanden tijdelijk aanvullende maatregelen te nemen tegen de verspreiding van Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (3), gewijzigd bij Beschikking 96/599/EG (4), en met name in artikel 1, lid 2, onder a), bb), is bepaald dat de lidstaten voor officieel onderzoek of onderzoek onder officieel toezicht op Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith de door de Plantenbeschermingsorganisatie voor Europa en het gebied van de Middellandse Zee (EPPO) (5) vastgestelde quarantaineprocedure nr. 26 moeten toepassen of een andere procedure die is goedgekeurd volgens de procedure van artikel 16 bis van Richtlijn 77/93/EEG;

Overwegende dat het door de diensten van de Commissie van de Europese Gemeenschappen onder auspiciën van het Permanent Plantenziektekundig Comité ingestelde ad hoc-comité van deskundigen inzake bacterieziekten van planten de details heeft vastgesteld van een voorlopige onderzoeksmethode waarin rekening is gehouden met de vorderingen op het gebied van detectie en onderzoekprocedures sinds de publicatie van quarantaineprocedure nr. 26 van de EPPO; dat het hierbij gaat om een voorlopige methode, aangezien met name wat betreft de gevoeligheid en specificiteit van tests verder onderzoek wordt uitgevoerd met het oog op selectie en standaardisering van de beste tests voor een verder geactualiseerde onderzoeksmethode;

Overwegende dat de in deze beschikking vastgestelde voorlopige onderzoeksmethode in overeenstemming is met het advies van het Permanent Plantenziektekundig Comité,

HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:

Artikel 1

Voor de toepassing van het bepaalde in artikel 1, lid 2, onder a), bb), van Beschikking 95/506/EG, zoals laatstelijk gewijzigd, wordt voor Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith de quarantaineprocedure nr. 26 van de Plantenbeschermingsorganisatie voor Europa en het gebied van de Middellandse Zee (EPPO) vervangen door de voorlopige onderzoeksmethode voor diagnose, detectie en identificatie van Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith die is vastgesteld in de bijlage bij deze beschikking.

Artikel 2

Deze beschikking is gericht tot de lidstaten.

Gedaan te Brussel, 9 september 1997.

Voor de Commissie

Franz FISCHLER

Lid van de Commissie

(1) PB L 26 van 31. 1. 1977, blz. 20.

(2) PB L 87 van 2. 4. 1997, blz. 17.

(3) PB L 291 van 6. 12. 1995, blz. 48.

(4) PB L 265 van 18. 10. 1996, blz. 18.

(5) Bulletin EPPO/OEPP 20, 255-262 (1990).

BIJLAGE

INTERIM-ONDERZOEKSMETHODE VOOR DE DIAGNOSE, DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN PSEUDOMONAS SOLANACEARUM (SMITH) SMITH

OMVANG VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

De onderzoeksmethode beschrijft de verschillende procedures die betrokken zijn bij de:

i) diagnose van bruinrot in aardappelplanten en -knollen,

ii) detectie van Pseudomonas solanacearum in monsters aardappelknollen,

iii) identificatie van Pseudomonas solanacearum.

In de aanhangsels worden bijzonderheden verstrekt voor de bereiding van het te toetsen materiaal, met name groeimedia, buffers, oplossingen en reagentia.

INHOUD

Deel I. Toepassing van de onderzoeksmethode . 4

1. Diagnose van bruinrot in aardappelplanten en -knollen . 4

2. Detectie en identificatie van Pseudomonas solanacearum in monsters aardappelknollen . 6

Deel II. Diagnose van bruinrot in aardappelplanten en -knollen . 8

1. Symptomen van bruinrot . 8

2. Snelle screeningstoets(en) . 8

3. Isolatieprocedure . 9

4. Bevestigingstoets(en) . 9

Deel III. Detectie en identificatie van Pseudomonas solanacearum in monsters aardappelknollen . 12

1. Voorbereiding van het te onderzoeken monster . 12

2. Immunofluorescentie (IF)-toets . 13

3. Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay (Elisa)-toets . 15

4. Polymerase Chain Reaction (PCRTM)-toets . 15

5. Selectieve uitplating . 17

6. Biotoets . 18

7. Aanrijkingstoets . 18

8. Pathogeniciteitstoets . 18

Aanhangsel 1. Voedingsbodems voor isolatie en kweek van Pseudomonas solanacearum . 19

Aanhangsel 2. Materialen ter voorbereiding van een monster . 20

Aanhangsel 3. Materialen voor de IF-toets . 21

Aanhangsel 4. Bepaling van het besmettingsniveau in de IF-toets . 22

Aanhangsel 5. Materialen voor de Elisa-toets . 23

Aanhangsel 6. Materialen voor de PCR-toets . 24

Aanhangsel 7. Materialen voor de selectieve uitplating en aanrijkingstoetsen . 24

Literatuurverwijzingen . 25

DEEL I

TOEPASSING VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

1. Diagnose van bruinrot in aardappelplanten en -knollen

Deze toetsprocedure is bedoeld voor planten en knollen met symptomen die kenmerkend of verdacht zijn voor bruinrot. Ze omvat een snelle screeningstoets, isolatie van het pathogeen uit geïnfecteerd vaatweefsel op diagnostische media en, in geval van een positieve uitslag, identificatie van de cultuur als Pseudomonas solanacearum.

Weergave in stroomdiagram

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Referenties in stroomdiagram

>BEGIN VAN DE GRAFIEK>

(1) Beschrijving van symptomen wordt gegeven in deel II.1.

(2) Snelle screeningstoetsen maken een voorlopige diagnose mogelijk.

Geschikte toetsen zijn:

- Slijmdradentoets met vaatweefsel uit de stengel (deel II.2)

- Onderzoek op poly-ß-hydroxybutyraatkorrels (deel II.2)

- IF-toets (deel III.2)

- Elisa-toets (deel III.3)

- PCR-toets (deel III.4).

(3) Hoewel isolatie van het pathogeen uit plantenmateriaal met typische symptomen door middel van de verdunningsplaatmethode betrekkelijk eenvoudig is, kan het kweken uit vergevorderde infectiestadia mislukken. Saprofytische bacteriën die op aangetast weefsel groeien, kunnen het pathogeen op het isolatiemedium overwoekeren of remmen. Als de isolatietoets negatief is maar de ziekteverschijnselen typisch zijn, moet de isolatie worden herhaald, bij voorkeur door selectieve uitplating.

(4) Een betrouwbare identificatie van een reincultuur van Pseudomonas solanacearum wordt verkregen met minstens één van de in deel II.4.1 vermelde toetsen, in combinatie met een pathogeniciteitstoets (deel II.4.3). Stamkarakterisatie is facultatief maar wordt voor elk nieuw geval aanbevolen.

>EIND VAN DE GRAFIEK>

2. Detectie en identificatie van Pseudomonas solanacearum in monsters aardappelknollen

Deze toetsprocedure is bedoeld voor opsporing van latente infecties in aardappelknollen met een of liefst meer screeningstoets(en) die, indien positief, worden bevestigd door de isolatie van het pathogeen. In geval van isolatie van typische kolonies wordt de procedure vervolgd door identificatie van een reincultuur als Pseudomonas solanacearum.

Weergave in stroomdiagram

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Referenties in stroomdiagram

>BEGIN VAN DE GRAFIEK>

(1) Monstergrootte

De standaardmonstergrootte is 200 knollen.

Nochtans is de procedure ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen.

(2) Screeningstoets(en)

Eén enkele toets is mogelijk niet voldoende gevoelig of betrouwbaar om Pseudomonas solanacearum in een monster te detecteren. Daarom wordt meer dan één toets aanbevolen. Die dienen bij voorkeur gebaseerd te zijn op verschillende biologische principes.

(3) Immunofluorescentie (IF)-toets

De IF-toets (indirecte methode) is een zeer gangbare screeningstoets. Dat is een voordeel boven andere toetsen die nog niet geheel ontwikkeld of gevalideerd zijn. Deze toets wordt ingezet voor vele andere quarantaine- en kwaliteitsbacteriën, zoals Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Met de in deze methode gespecifieerde afleesparameters is het een gevoelige test. De detectiegrens is 103-104 cellen per ml aardappelextractpellet.

De kritische factor voor de betrouwbaarheid van het toetsresultaat is de kwaliteit van het antiserum. Alleen een antiserum met een hoge titer (minimaal 2 000 voor het ruwe antiserum) is aanvaardbaar en alle toetsen moeten worden uitgevoerd bij de antiserumtiter of één verdunning onder de titer. De indirecte methode geniet de voorkeur. De directe methode kan worden toegepast als het niveau van de gevoeligheid en specificiteit van de toets gelijkwaardig is aan die van de indirecte methode.

De IF-toets heeft het voordeel van subjectieve interpretatie van de celmorfologie en de intensiteit van de fluorescentie, die informatie geven over de specificiteit van de reactie. Er zijn immers kruisreacties mogelijk door serologisch verwante bodembacteriën of door in aardappelweefsels voorkomende bacteriën met celmorfologie van Pseudomonas solanacearum. De IF-toets kan als enige screeningstoets worden ingezet. Indien kruisreacties worden vermoed, moet een aanvullende screeningstoets worden uitgevoerd die op een verschillend biologisch principe gebaseerd is. In dergelijke gevallen is selectieve uitplating aangewezen.

(4) Selectieve uitplating

Met het gemodificeerde SMSA-medium en de in deze methode gespecifieerde toetsmethodiek is selectieve uitplating een gevoelige en selectieve toets voor Pseudomonas solanacearum. Het resultaat is drie tot zes dagen na de verwerking van het monster beschikbaar. Het pathogeen wordt rechtstreeks in de cultuur verkregen en kan daarna snel worden geïdentificeerd. Om het potentieel van deze toets ten volle te benutten moeten er zeer zorgvuldig kleine naveleinden worden geprepareerd om te vermijden dat secundaire, met aardappelknollen geassocieerde bacteriën in het extract terechtkomen. Deze kunnen met Pseudomonas solanacearum op het medium competitie aangaan en de ontwikkeling en groei van het pathogeen verstoren. Sommige stammen van Pseudomonas solanacearum kunnen een zwakke groei vertonen want de bestanddelen van het medium kunnen ook het doelorganisme beïnvloeden. Voorzichtigheid is daarom geboden om Pseudomonas solanacearum te onderscheiden van andere bacteriën die zich op het medium kunnen ontwikkelen. Selectieve uitplating kan als enige screeningstoets worden gebruikt. Indien een negatief toetsresultaat wordt verkregen en remming van Pseudomonas solanacearum door andere bacteriën op het medium wordt vermoed dan moet een aanvullende screeningstoets uitgevoerd worden. In dergelijke gevallen is de IF-toets aangewezen.

(5) Elisa-toets

Algemeen is de Elisa-toets minder gevoelig dan de IF-toets (de detectiegrens is 104-105 cellen per ml aardappelextractpellet). De toets is echter snel en goedkoop maar kent doorgaans meer vals-positieve (kruisreacties) resultaten en vals-negatieve (remming door fenolmoleculen in het aardappelextract) resultaten. De specificiteit van het antiserum moet bijzonder hoog zijn. De Elisa-toets kan niet als de enige screeningstoets worden ingezet.

(6) PCR-toets

PCR is potentieel geschikt voor een zeer gevoelige detectie, maar de toets wordt gemakkelijk door bestanddelen in planten- of knolextracten geremd waardoor een vals-negatieve uitslag wordt bekomen. Bepaalde aardappelcultivars bevatten meer remstoffen dan andere. Derhalve is het nodig die remstoffen te verwijderen door een aangepaste behandeling. De remming kan door verdunning van het extract worden gereduceerd, maar daarbij wordt ook het aantal Pseudomonas solanacearum bacteriën verdund. In alle stadia van de voorbereiding van het monster en van de toets is grote omzichtigheid geboden om besmetting te vermijden die vals-positieve resultaten met zich zou brengen, zoals ook organismen met homologe DNA-sequenties die in de aardappelextractpellet kunnen voorkomen. Om die redenen kan de directe PCR-test niet als enige screeningstoets worden ingezet.

(7) Aanrijkingstoets

Incubatie van de aardappelextractpellet in een semiselectieve bouillon, zoals de gemodificeerde SMSA-bouillon, maakt vermeerdering van Pseudomonas solanacearum mogelijk. Misschien is het nog belangrijker dat hierdoor potentiële remmers van de Elisa- en PCR-toets worden gereduceerd. Zo kan Pseudomonas solanacearum in een aanrijkingsbouillon door middel van IF, Elisa en PCR worden gedetecteerd. Directe uitplating van de aangerijkte bouillons wordt ontraden. Deze aanrijkingsmethoden zijn echter nog niet grondig beproefd en getest. Zij worden hier vermeld omdat ze potentieel de hoogste detectiegevoeligheid hebben, maar door de beperkte ervaring kunnen ze echter niet als de enige detectiemethoden worden gebruikt.

(8) Biotoets

De biotoets wordt ingezet voor isolatie van Pseudomonas solanacearum uit aardappelextractpellets door selectieve aanrijking in een gevoelige waardplant zoals tomatenplanten of aubergines. De toets vereist optimale incubatievoorwaarden zoals in deze methode gespecifieerd. Bacteriën die op het gemodificeerd SMSA-medium een remmend effect op Pseudomonas solanacearum hebben, verstoren deze toets hoogstwaarschijnlijk niet.

(9) Bevestigende toets(en)

Met minstens één van de in deel II.4.1 vermelde toetsen wordt, in combinatie met een pathogeniciteitstoets (deel II.4.3), een betrouwbare identificatie van een reincultuur van Pseudomonas solanacearum verkregen. Stamkarakterisatie is facultatief maar wordt voor elk nieuw geval aanbevolen.

>EIND VAN DE GRAFIEK>

DEEL II

DIAGNOSE VAN BRUINROT IN AARDAPPELPLANTEN EN -KNOLLEN

1. Symptomen van bruinrot

De aardappelplant

Het eerste stadium van de infectie is verwelking van de bladeren nabij de kop van de plant bij hoge temperaturen overdag met herstel gedurende de nacht. De verwelking wordt snel onomkeerbaar en eindigt in het afsterven van de plant. Het vaatweefsel in dwars doorgesneden stengels van verwelkte planten kan bruin verkleurd zijn en een melkachtig slijm verschijnt spontaan op het snijvlak of kan gemakkelijk uit het snijvlak naar buiten worden geperst. Wanneer een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, stromen er na korte tijd draden bacterieslijm uit de open vaatbundels.

De aardappelknol

Aardappelknollen moeten dichtbij het naveleinde (stoloon) dwars doorgesneden worden. Het eerste infectiestadium is een glazig gele tot lichtbruine verkleuring van de vaatbundelring, waaruit na enkele minuten een roomkleurig bacterieslijm naar buiten treedt, hetzij spontaan hetzij na licht aandrukken met de duimen op de schil bij het snijvlak. Later wordt de vaatverkleuring duidelijker bruin en kan de necrose zich tot in het parenchymateuze weefsel uitstrekken. In vergevorderde stadia van infectie, breekt het slijm uit het naveleinde en de ogen naar buiten. Er ontstaan roodbruine, iets verzonken lesies op de schil, van waaruit bacterieslijm sijpelt dat bodemdeeltjes doet vasthechten.

2. Snelle screeningstoetsen

Een snelle screening vergemakkelijkt een voorlopige diagnose. Hiervoor kan een of meerdere van de volgende toetsen toegepast worden:

Slijmdradentoets

De aanwezigheid van Pseudomonas solanacearum in verwelkende aardappelstengels kan met de volgende, eenvoudige oriënterende proef worden vastgesteld:

Snij de stengel vlak boven het bodemniveau af. Zet de stengel verticaal met het snijvlak in een bekerglas met water. Kort daarna zullen draden bacterieslijm spontaan uit de vaatbundels stromen. Geen enkele andere bacterie die in aardappelplanten een vaatinfectie veroorzaakt, zal dit verschijnsel vertonen.

Detectie van poly-â-hydroxybutyraat (PHB)-korrels

De PHB-korrels in de cellen van Pseudomonas solanacearum worden door kleuring met nijlblauw A of soedanzwart B zichtbaar gemaakt.

Ga te werk als volgt:

Maak een uitstrijkje van het bacterieslijm of van het gesuspendeerde vaatweefsel op een microscoopglaasje of maak een uitstrijkje van een 48-uurskweek op YPGA of SPA (aanhangsel 1). Maak ook uitstrijkjes van een ras 3/biovar 2-stam als positieve controle en, indien nodig geacht, uitstrijkjes van heterologe bacteriestammen als negatieve controle.

Laat de uitstrijkjes drogen aan de lucht. Haal de onderzijde van het glaasje enkele malen snel door de vlam zodat de uitstrijkjes gefixeerd zijn.

Nijlblauwkleuring

1. Overgiet de gefixeerde uitstrijkjes met een 1 % waterige oplossing van nijlblauw A. Laat de kleurstofoplossing gedurende 10 minuten bij 55 °C inwerken.

2. Laat de kleuringsoplossing weglopen. Was eventjes in rustig stromend kraantjeswater. Verwijder overtollig water met papierdoek.

3. Overgiet de uitstrijkjes dan met een 8 % waterige azijnzuuroplossing.

Laat 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken.

4. Was in rustig stromend kraantjeswater. Droog de glaasjes op papierdoek.

5. Herbevochtig de uitstrijkjes met een druppel water en breng een dekglaasje aan.

6. Onderzoek de gekleurde uitstrijkjes met een epifluorescentiemicroscoop bij 450 nm met olie-immersie bij een vergroting van 1 000 ×.

Kijk naar een helderoranje fluorescentie van PHB-korrels in de bacteriecellen. Controleer de uitstrijkjes ook onder doorvallend natuurlijk licht om er zeker van te zijn dat de korrels zich wel degelijk in de cellen bevinden en natuurlijk dat de celmorfologie typisch is voor Pseudomonas solanacearum.

Soedanzwartkleuring

1. Overgiet de gefixeerde uitstrijkjes met een 0,3 % soedanzwart B-oplossing in 70 % ethanol. Laat 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.

2. Laat de kleuringsoplossing weglopen. Was eventjes in kraantjeswater. Verwijder overtollig water met papierdoek.

3. Dompel de uitstrijkjes eventjes in xylol. Droog de glaasjes op papierdoek. Voorzichtig! Xylol is een schadelijk product. Werk in een zuurkast.

4. Overgiet de uitstrijkjes met 0,5 % (w/v) waterige safranine-oplossing en laat 10 seconden bij kamertemperatuur inwerken.

Voorzichtig! Safranine is een schadelijk product. Werk in een zuurkast.

5. Was in rustig stromend kraantjeswater. Droog de glaasjes op papierdoek. Breng een dekglaasje aan.

6. Onderzoek de gekleurde uitstrijkjes onder een microscoop met doorvallend licht met olie-immersie bij een vergroting van 1 000 ×.

PHB-korrels in cellen van Pseudomonas solanacearum kleuren blauwzwart. De celwand kleurt roze.

Andere screeningstoetsen

Alternatieve screeningstoetsen zijn de IF-toets (deel III.2), de Elisa-toets (deel III.3) en de PCR-toets (deel III.4).

3. Isolatieprocedure

3.1. Verwijder bacterieslijm of secties verkleurd vaatweefsel uit de knol of uit de stengel en suspendeer dit in een klein volume steriel gedistilleerd water of steriele 50 mM fosfaatbuffer. Laat 5-10 minuten weken.

3.2. Maak van het maceraat een reeks decimale verdunningen, bv.

>NUM>1/>DEN>10 en >NUM>1/>DEN>100

of meer indien nodig geacht.

3.3. Breng een standaardvolume van het maceraat en de aangemaakte verdunningen op een algemene voedingsbodem (NA, YPGA of SPA - aanhangsel 1) en/of op Kelman's tetrazolium medium (aanhangsel 1) en/of op selectief SMSA-medium (aanhangsel 7). Verdeel het door middel van een geschikte verdunningsuitplatingstechniek. Indien nodig geacht, ent dan een stel afzonderlijke platen van elk gebruikt medium met een verdunde celsuspensiekweek van een virulente ras 3/biovar 2-stam van Pseudomonas solanacearum als positieve controle.

3.4. Incubeer de platen gedurende drie dagen bij 28 °C. De incubatietijd kan tot zes dagen verlengd worden bij zwakke groei. Op gemodificeerd SMSA-medium worden de kolonies van Pseudomonas solanacearum bij langere incubatie vaak a-typisch en sterven ze af.

Op een algemene voedingsbodem ontwikkelen virulente isolaten van Pseudomonas solanacearum parelwitte, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies, vaak met kenmerkende slierten.

Op Kelman's tetrazolium medium ontwikkelen virulente isolaten van Pseudomonas solanacearum crèmekleurige, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies met een oog van bloedrood gekleurde slierten. Avirulente vormen van Pseudomonas solanacearum ontwikkelen botervette dieprode kolonies.

Op het gemodificeerde SMSA-medium ontwikkelen virulente isolaten van Pseudomonas solanacearum melkwitte, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies met duidelijke rode tot purperen ogen. Avirulente vormen van Pseudomonas solanacearum ontwikkelen minder uitvloeiende kolonies die volledig roze tot rood zijn.

3.5. Kweek kolonies met kenmerkende morfologie rein door een subcultuur op een algemene voedingsbodem. Vermijd regelmatig subcultiveren. Dit kan tot verlies van virulentie leiden.

4. Bevestigingstoetsen

4.1. Identificatie van Pseudomonas solanacearum

Identificeer reinculturen met ten minste één van de volgende procedures:

Voedingstests en enzymatische tests

De geselecteerde testen zijn bepalend voor de vaststelling van de species en de biovar.

Noot: Neem bij elke toets de geschikte controlestammen mee op.

Onderstaande fenotypische eigenschappen van Pseudomonas solanacearum zijn universeel aan- of afwezig:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Noot: Media en methoden zijn te vinden in Lelliott and Stead, 1987.

IF-toets

Maak een suspensie van 106 cellen per ml van de kweek en een positieve controlestam. Maak een reeks tweevoudige verdunningen van het antiserum. Pas de IF-procedure toe (deel III.2). De IF-titer van de kweek moet gelijkwaardig zijn aan die van de positieve controle.

Elisa-toets

Maak een suspensie van > 106 cellen per ml van de kweek en een positieve controlestam. Pas de Elisa-procedure toe (deel III.3). De Elisa-waarde van de kweek moet gelijkwaardig zijn aan die van de positieve controle.

PCR-toets

Maak een suspensie van 106 cellen per ml van de kweek en een positive controlestam. Pas de PCR-procedure toe (deel III.4). Het PCR-product van de kweek moet dezelfde grootte en hetzelfde restrictie enzyme analyse (REA)-patroon hebben als die van de positieve controle.

Fluorescente in situ-hybridisatie (FISH)

Maak een suspensie van 106 cellen per ml van de kweek en een positieve controlestam. Pas de FISH-procedure toe (Van Beuningen et al., 1995) met de OLI-1 PCR-primer (Seal et al., 1993). De kweek moet dezelfde reactie vertonen als de positieve controle.

Maken van eiwitprofiel

Gedenatureerde eiwitten van hele cellen worden door middel van polyacrylamidegelelektroforese - PAGE (Stead, 1992a) gescheiden.

Maken van vetzuurprofiel (FAP)

Laat de kweek gedurende 48 uur bij 28 °C of trypticasesoja-agar groeien en pas de FAP-procedure toe (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead; 1992b). Het profiel van de kweek moet identiek zijn met dat van de positieve controle. Onder de aangegeven omstandigheden zijn 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH en 18:1 2OH kenmerkende vetzuren.

4.2. Stamkarakterisatie

Stamkarakterisatie is facultatief maar wordt voor elk nieuw geval aangeraden. Maak desgevallend gebruik van minstens één van de volgende procedures:

Bepaling van biovar

Pseudomonas solanacearum wordt in biovars gescheiden op grond van het vermogen zuren te produceren uit drie hexosealcoholen en drie suikers (Hayward, 1964, 1994):

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Aanvullende tests onderscheiden biovar 2 in subfenotypes (Hayward, 1994):

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bepaling van ras

Het ras (Buddenhagen et al., 1962) wordt bepaald op grond van een pathogeniciteitstest in tomatenplanten of aubergines en in tabaksplanten en aan de hand van een overgevoeligheidsreactie (OR) in tabaksbladeren (Lozano en Sequeira, 1970):

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bepaling van het ras door de pathogeniciteitstest of door de overgevoeligheidstest op tabak is niet steeds zeer betrouwbaar en kan in de plaats daarvan afgeleid worden uit de biovar en de natuurlijke waard waaruit de bacterie geïsoleerd werd.

De kweek kan verder worden gekarakteriseerd door:

"Fingerprinting" van het genoom

Moleculaire differentiatie van stammen in het Pseudomonas solanacearum-complex kan plaatsvinden door middel van:

RFLP-analyse (Cook et al., 1989)

PCR van repetitieve DNA-sequenties [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al., 1995; Smith et al., 1995)]

4.3. Pathogeniciteitstoets

Deze test is bedoeld als bevestiging van de identificatie en om de virulentie van de als Pseudomonas solanacearum geïdentificeerde bacteriecultuur aan te tonen.

Maak een inoculum aan van 106 cellen per ml van de kultuur en een ras 3/biovar 2-stam als positieve controle. Inoculeer 5-10 tomatenplanten of aubergines, bij voorkeur in het derde volgroeide bladstadium of ouder (deel III.6) en incubeer de geënte planten tot twee weken bij een temperatuur van 22 tot 28 °C en hoge relatieve luchtvochtigheid. Geef dagelijks water. Controleer vanaf de vierde dag op verwelkingssymptomen en/of epinastie, vergeling, dwerggroei. Isoleer als volgt uit planten met symptomen:

- Verwijder een sectie van de stengel 2 cm boven het inoculatiepunt.

- Breng het over in een klein volume steriel gedistilleerd water of steriele 50 mM fosfaatbuffer en verdeel het in kleine stukjes. Plaat uit, incubeer en controleer op typische kolonies van Pseudomonas solanacearum.

DEEL III

DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN PSEUDOMONAS SOLANACEARUM IN MONSTERS AARDAPPELKNOLLEN

Noot: De standaardmonstergrootte is 200 knollen. Nochtans is de procedure ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen.

1. Voorbereiding van het te onderzoeken monster

Noot: De met deze procedure verkregen aardappelextractpellet kan ook worden gebruikt voor de detectie van Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Opties vóór het testen indien nuttig geacht:

i) Incubeer het monster tot 14 dagen bij 25-30 °C om de vermeerdering van lage Pseudomonas solanacearum-populaties te bevorderen.

ii) Was de knollen in stromend water met de aangewezen desinfectantia en reinigingsmiddelen. Laat de knollen aan de lucht drogen.

1.1. Verwijder met een schoon en gedesinfecteerd scalpel of aardappelschilmes de schil aan het naveleinde zodat de vaatweefsels net zichtbaar worden. Snij zorgvuldig een kegelvormige kern vaatweefsel (doorsnede 3-5 mm) uit het naveleinde van elke knol. Beperk de hoeveelheid niet-vaatweefsel tot een strikt minimum.

Behandel aldus iedere knol uit het monster.

Noot: In dit stadium kan het visuele onderzoek van de knollen (deel II.1) plaatsvinden. Houd elke knol met verdachte symptomen of met rotting apart en toets die afzonderlijk (deel II).

1.2. Verzamel de naveleinden in een geschikte container en sluit deze af. De naveleinden moeten bij voorkeur direct worden verwerkt. Als dat niet mogelijk is, bewaar ze dan hoogstens 24 uur - of bij 4 °C niet langer dan 72 uur.

1.3. Verwerk de naveleinden volgens één van onderstaande procedures:

i) Breng de naveleinden in een geschikt vaatje over.

Voeg een voldoende hoeveelheid maceratiebuffer toe (aanhangsel 2) om de naveleinden te bedekken.

Vermaal de naveleinden in een Waring-menger of met Ultra Thurrax totdat ze net volledig gehomogeniseerd zijn. Vermijd overmatige homogenisatie.

Laat het maceraat dan 15-30 minuten weken.

ii) Breng de naveleinden in een geschikt vaatje over.

Voeg een voldoende hoeveelheid maceratiebuffer toe om de naveleinden te bedekken.

Zet het vaatje op of in een roterende schudder.

Incubeer bij 50-100 toeren per minuut gedurende 4 uur bij 20-22 °C of gedurende 16-24 uur bij 4 °C.

iii) Breng de naveleinden over in een maceratiezakje (type Stomacherzakje met afmetingen van 105 mm × 150 mm, radiatiesteriel).

Maak de naveleinden zorgvuldig fijn met een geschikt stuk gereedschap, bv. een hamer totdat ze net volledig gehomogeniseerd zijn.

Voeg een voldoende hoeveelheid maceratiebuffer toe om de fijngemaakte naveleinden te bedekken.

Laat het maceraat dan 15-30 minuten weken.

1.4. Extraheer de bacteriën uit de verwerkte naveleinden volgens één van onderstaande procedures:

i) Giet het maceraat voorzichtig in een centrifugebuis over maar laat de stukjes in het vaatje of het zakje. Als het overgegoten maceraat troebel is centrifugeer dan bij niet meer dan 180 g gedurende 10 minuten bij een temperatuur onder de 10 °C.

Centrifugeer het overgegoten maceraat of het supernatans van de eerste centrifugefase bij 7 000 g gedurende 15 minuten of bij 10 000 g gedurende 10 minuten bij een temperatuur onder de 10 °C.

Giet dan het supernatans af zonder de pellet te verstoren.

ii) Filter het maceraat door een filtreersysteem met poriën van 40-100 µm.

Bevorder de filtratie door een vacuümpomp te gebruiken.

Verzamel het filtraat in een centrifugebuis.

Was de filter met maceratiebuffer.

Centrifugeer het filtraat bij 7 000 g gedurende 15 minuten of bij 10 000 g gedurende 10 minuten bij een temperatuur onder de 10 °C.

Giet het supernatans af zonder de pellet te verstoren.

1.5. Resuspendeer de pellet in 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 2).

Verdeel in twee gelijke delen en breng elke fractie over in een microvaatje.

Gebruik één microvaatje voor de toetsen. Bewaar dit extract tijdens het onderzoek bij 4 °C.

Voeg 10-25 % (v/v) steriele glycerol aan het andere microvaatje toe. Meng door vortexen. Bewaar dit vaatje bij - 18 °C (weken) of bij - 70 °C (maanden).

2. Immunofluorescentie (IF)-toets

Gebruik antiserum voor Pseudomonas solanacearum, bij voorkeur tegen ras 3/biovar 2. Bepaal de titer op een suspensie van 106 cellen per ml van de homologe stam van Pseudomonas solanacearum met een geschikte verdunning van het fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugaat, overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. Het ruwe antiserum moet een IF-titer hebben van ten minste 1 : 2 000.

Gebruik microscoopglaasjes met meerdere venstertjes, bij voorkeur met tien venstertjes met een doorsnede van minstens 6 mm.

Neem een FITC-conjugaatcontrole in elk objectglaasje op. De test moet worden herhaald met inbegrip van een PHB-controletoets indien er in de FITC-controle ook maar één positieve cel wordt aangetroffen.

Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes met een suspensie van 106 cellen per ml van een geschikte ras 3/biovar 2-stam van Pseudomonas solanacearum. Neem in elk stel tests één dergelijk glaasje op.

2.1. Prepareer de objectglaasjes volgens een van onderstaande procedures:

i) Voor pellets met betrekkelijk weinig zetmeel:

Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is voor een venster met een doorsnede van 6 mm geschikt - vergroot het volume voor grotere vensters naar rato) van de geresuspendeerde pellet op een rijtje vensters. De andere rij kan als duplicaat worden gebruikt of voor een tweede monster als aangegeven in figuur 1.

ii) Voor andere pellets:

Maak decimale oplossingen, dit wil zeggen >NUM>1/>DEN>10,>NUM>1/>DEN>100 en >NUM>1/>DEN>1 000, van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is voor een venster met een doorsnede van 6 mm geschikt - vergroot het volume voor grotere vensters naar rato) van de geresuspendeerde pellet en van elke verdunning op een rijtje vensters. De andere rij kan als duplicaat worden gebruikt of voor een tweede monster als aangegeven in figuur 2.

2.2. Laat de druppels drogen. Fixeer de bacteriecellen op het glaasje ofwel door te verwarmen, ofwel door door de vlam te halen ofwel door te flamberen met 95 % ethanol.

2.3. IF-werkwijze:

i) Volgens het prepareren van objectglaasjes in 2.1.i):

Maak een aantal tweevoudige verdunningen van het antiserum aan in IF-buffer (aanhangsel 3), met name ¼ van de titer (>NUM>T/>DEN>4), ½ van de titer (>NUM>T/>DEN>2), de titer (T) en tweemaal de titer (2T).

ii) Volgens het prepareren van objectglaasjes in 2.1.ii):

Maak de werkverdunning (WV) van het antiserum aan in IF-buffer. De werkverdunning is de verdunning van het antiserum met optimale specificiteit en is meestal de helft van de titer.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

2.3.1. Schik de microscoopglaasjes op vochtige papierdoek.

Bedek de testvenstertjes met de antiserumverdunning(en). Breng PBS aan op de FITC-vensters. Het op de venstertjes aangebrachte volume antiserum moet gelijkwaardig zijn aan het volume aangebracht extract.

2.3.2. Incubeer afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

2.3.3. Schud de druppels antiserum van het glaasje af en spoel de glaasjes zorgvuldig met IF-buffer. Was 5 minuten in IF-buffer-Tween en vervolgens 5 minuten in IF-buffer (aanhangsel 3).

Verwijder zorgvuldig de overmaat aan vocht.

2.3.4. Schik de microscoopglaasjes op vochtig vloeipapier.

Bedek alle venstertjes met de verdunning van het FITC-conjugaat die gebruikt werd om de titer van het antiserum te bepalen. Het op de venstertjes aangebrachte volume conjugaat moet identiek zijn met het volume aangebracht antiserum.

2.3.5. Incubeer afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

2.3.6. Schud de druppels conjugaat van het glaasje af. Spoel af en was als voorheen (in 2.3.3).

Verwijder zorgvuldig de overmaat aan vocht.

2.3.7. Pipetteer 5-10 µl van 0,1M fosfaat gebufferde glycerol (aanhangsel 3), of een gelijkwaardig inbedmiddel, op elk venstertje en breng een dekglaasje aan.

2.4. Aflezen van de IF-toets

Onderzoek de glaasjes met een epifluorescentiemicroscoop die voorzien is van geschikte filters voor excitatie van FITC. Gebruik een geschikt olie-immersie objectief voor een totale vergroting van 500 x-1000 x. Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek.

Controleer eerst het positieve controleglaasje. De cellen moeten helder fluorescerend en volledig gekleurd zijn.

Noot: de test moet herhaald worden bij afwijkende kleuring.

Lees de toetsglaasjes af. Kijk eerst uit naar fluorescerende cellen in de FITC-controlevenstertjes. Fluorescerende cellen in de FITC-controle wijst op aspecifieke binding van het conjugaat, autofluorescentie of contaminerende cellen van de testvenstertjes. Noot: De toets moet herhaald worden indien zulks wordt waargenomen.

Kijk vervolgens in de testvenstertjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor Pseudomonas solanacearum kenmerkende morfologie. De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan die van de positieve controlestam bij dezelfde antiserumverdunning. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie mogen genegeerd worden, tenzij er veel van dergelijke cellen zijn (zie verder).

Interpretatie van het resultaat van de IF-toets

i) Wanneer geen helder fluorescerende cellen met een kenmerkende morfologie worden aangetroffen, is de IF-toets negatief.

ii) Wanneer wel helder fluorescerende cellen met een kenmerkende morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddeld aantal cellen per objectiefveld en bereken het aantal cellen (N) per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 4).

Een populatie van ongeveer 10³ cellen per ml geresuspendeerde pellet wordt gezien als detectiegrens van de IF-toets.

- voor monsters met N > 10³ cellen per ml is de IF-toets positief,

- voor monsters met N < 10³ cellen per ml kan de IF-toets als positief worden beschouwd.

iii) Wanneer relatief grote aantallen (> 105 cellen per ml) van onvolledig gekleurde of zwak fluorescerende cellen worden waargenomen op de titer van het antiserum dan moet

- hetzij een tweede toets uitgevoerd worden die gebaseerd is op een verschillend biologisch principe;

- hetzij een tweede IF-toets uitgevoerd worden met een tweede, verschillend antiserum en/of een verdere verdunning van de geresuspendeerde pellet.

3. Elisa-test

(Naar: Robinson-Smith et al., 1995)

Gebruik antiserum voor Pseudomonas solanacearum, bij voorkeur tegen ras 3/biovar 2. Bepaal de titer op een suspensie van 106 cellen per ml van de homologe stam van Pseudomonas solanacearum.

Aanbevolen wordt het gebruik van NUNC Polysorp-microtiterplaten.

Neem een negatieve aardappelextractcontrole en een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-controle op.

Gebruik een suspensie van > 106 cellen per ml van een ras 3/biovar 2-stam van Pseudomonas solanacearum als positieve controle. Op eenzelfde manier als het (de) monster(s) onderzoeken, maar goed van de monsters op de microtiterplaat gescheiden houden.

3.1. Pipetteer 100-200 µl geresuspendeerde pellet in een microvaatje.

Verwarm gedurende 4 minuten bij 100 °C. Breng het microvaatje over op ijs.

3.2. Voeg een gelijk volume carbonaatcoatingbuffer van dubbele sterkte toe (aanhangsel 5). Meng door vortexen.

3.3. Breng in elk van minstens twee putjes van de microtiterplaat 100 µl van het mengsel aan. Incubeer 1 uur bij 37 °C of overnacht bij 4 °C.

3.4. Ledig de putjes. Was de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 5) en laat de laatste wasoplossing minstens 5 minuten in de putjes.

3.5. Maak de aangewezen verdunning van Pseudomonas solanacearum antiserum in een buffer met blokkerend agens (aanhangsel 5). Breng 100 µl antiserumverdunning in de putjes aan.

Incubeer 1 uur bij 37 °C.

3.6. Ledig de putjes. Was de putjes goed als voorheen (3.4).

3.7. Maak de aangewezen verdunning van alkalische-fosfataseconjugaat in een buffer met blokkerend agens. Breng 100 µl conjugaatverdunning in de putjes aan.

Incubeer 1 uur bij 37 °C.

3.8. Ledig de putjes. Was de putjes goed als voorheen (3.4 en 3.6).

3.9. Maak de alkalische-fosfatasesubstraatoplossing (aanhangsel 5). Breng 100 µl op de putjes aan en laat gedurende 30 minuten tot 1 uur in het donker bij kamertemperatuur incuberen.

3.10. Lees de absorptie bij 409 nm af.

Interpretatie van de uitslag van de Elisa-test

De Elisa-test is negatief als de optische dichtheid (OD) van het monster < is dan 2 × OD van de negatieve controle.

De Elisa-test is positief als de optische dichtheid van het monster > is dan 2 × OD van de negatieve controle.

4. PCR-test

Naar: Seal et al., 1993

Noot: Er moet in alle stadia van de monsterbereiding en andere PCR-handelingen gebruik worden gemaakt van pipetpunten met filterprop.

Maak een suspensie van 106 cellen per ml van een ras 3/biovar 2-stam van Pseudomonas solanacearum als positieve controle. Test overeenkomstig het (de) monster(s).

4.1. Pipetteer 100 µl van de geresuspendeerde pellet in een microbuisje.

Alternatief: breng 90 µl van de geresuspendeerde pellet over in een microvaatje, voeg 10 µl 0,5 M NaOH toe en meng door het microvaatje herhaaldelijk om te keren.

4.2. Verhit 4 minuten bij 100 °C. Breng dan het microvaatje onmiddellijk over in ijs.

4.3. Maak tenminste twee decimale verdunningen, bv.

>NUM>1/>DEN>10 en >NUM>1/>DEN>100 of meer indien nodig geacht, in steriel gedistilleerd of ultrapuur water (UPW).

4.4. Maak de PCR-mix (aanhangsel 6) in een steriel vaatje door de volgende bestanddelen in onderstaande volgorde aan elkaar toe te voegen:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Voor meer reacties

Bereken de hoeveelheid van elk bestanddeel voor het vereiste aantal reacties. Meng de bestanddelen en breng 45-48 µl van het mengsel in steriele PCR-reactievaatjes over. Bewaar de vaatjes met de PCR-reactiemix in ijs.

Voor reactievolumes van 25 µl:

verminder de bestanddelen proportioneel.

4.5. PCR-amplificatie

4.5.1. Facultatief! Pulscentrifugeer de vaatjes met het verhitte extract en de positieve controle.

Voeg in de aangegeven volgorde 2-5 µl van het (de) monster(s), de watercontrole en de positieve controle aan de reactievaatjes met de PCR-mix toe. Plaats de vaatjes zorgvuldig in het verwarmingsblok van het PCR-apparaat.

4.5.2. Werk het volgende amplificatieprogramma af:

één cyclus van:

i) 2 minuten bij 96 °C: denaturatie van de DNA-strengen

gevolgd door 50 cycli van:

ii) 20 seconden bij 94 °C: denaturatie

iii) 20 seconden bij 68 °C: aanhechten van de primers

iv) 30 seconden bij 72 °C: polymerisatie van de kopie

gevolgd door één cyclus van:

v) 10 minuten bij 72 °C: verdere polymerisatie

en eindig met één cyclus van:

vi) incubatie op 4 °C

Noot: Deze parameters gelden voor een Perkin Elmer 9600. Andere PCR-apparaten kunnen een afdekking met minerale olie in de PCR-reactievaatjes en/of aanpassing van de duur van de fasen ii), iii) en iv) in het amplificatieprogramma nodig hebben.

4.5.3. Neem de reactievaatjes uit het PCR-apparaat voor analyse van het PCR-product. Indien analyse niet direct mogelijk is, bewaar dan de vaatjes bij 4 °C voor analyse binnen 24 uur of bij -18 °C voor later.

4.6. Analyse van het PCR-product

De PCR-fragmenten worden aangetoond door elektroforese in agarosegel en kleuring met ethidiumbromide.

4.6.1. Breng de gewenste hoeveelheid agarosegel langzaam aan de kook in tris-acetaat-elektroforese (TAE)-buffer.

4.6.2. Koel de gesmolten agaroseoplossing tot 50-60 °C. Giet de oplossing in de vorm van het elektroforeseapparaat. Plaats de kam in de agaroseoplossing en laat stollen.

4.6.3. Verwijder de kam. Voeg TAE-buffer toe in het electroforesebakje zodat de gel net (2-3 mm) met de buffer bedekt is.

4.6.4. Breng 3 µl druppels opbrengbuffer op parafilm. Voeg 12 µl van het PCR-product van de reactievaatjes van de monsters, de positieve controle en van de watercontrole toe en meng beide door behoedzame aspiratie in de pipetpunt.

De opgegeven volumes kunnen aan de capaciteit van de putjes in de agarosegel worden aangepast.

4.6.5. Vul voorzichtig de putjes in de gel. Neem als referentie een geschikte DNA-merker in minstens één putje op.

4.6.6. Verbind de draden van de stroombron en het elektroforeseapparaat. Voer de elektroforese uit bij 5-8 V/cm totdat het merkerfront op ongeveer 1 cm van het einde van de gel is.

4.6.7. Schakel de stroombron uit. Ontkoppel de draden van het elektroforeseapparaat.

Verwijder de gel zorgvuldig. Plaats de gel in de ethidiumbromideoplossing. Laat 30 tot 45 minuten inwerken.

Noot: Draag bij het gebruik van ethidiumbromide, dat een krachtig mutageen is, te allen tijde wegwerphandschoenen!

4.6.8. Laat de gel gedurende 10-15 minuten in gedistilleerd water weken.

4.6.9. Maak het (de) geamplificeerde DNA-fragment(en) met UV-licht zichtbaar. Het PCR-product van Pseudomonas solanacearum met de primers OLI-1 en Y-2 is 288 baseparen lang. Toets de lengte van de gevisualiseerde fragmenten aan de DNA-merker en aan de positieve controle.

Noot: De watercontrole moet in ieder geval negatief zijn. Indien positief, dan moet de test overgedaan worden.

4.6.10. Fotografeer de gel indien een duurzame registratie van het analyseresultaat nodig is.

4.6.11. Bevestig de authenticiteit van het geamplificeerde fragment door restrictie-enzym-analyse (REA).

4.7. Restrictie-enzym-analyse (REA)

4.7.1. Breng 8,5 µl van het PCR-product (van 4.5.3) over in een microvaatje. Voeg 1 µl van 10 × enzymbuffer en 0,5 µl van het restrictie-enzym AvaII toe.

4.7.2. Meng de componenten door behoedzame aspiratie in een pipetpunt. Indien er druppels op de wanden van het microvaatje achterblijven, is een microcentrifugepuls wenselijk.

Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.

4.7.3. Analyseer het behandelde PCR-product door agarosegelelektroforese zoals voorheen in 4.6.

Interpretatie van het resultaat van de PCR-toets

De PCR-toets is negatief indien het kenmerkende DNA-fragment van 288 bp niet gedetecteerd wordt en het fragment voor de positieve controlestam van Pseudomonas solanacearum wel gedetecteerd wordt.

De PCR-toets is positief indien het kenmerkende DNA-fragment van 288 bp wordt gedetecteerd en de REA-analyse van het PCR-product identiek is met de positieve controlestam van Pseudomonas solanacearum.

5. Selectieve uitplatingstoets

Naar: Elphinstone et al., 1996

5.1. Voer de test uit met een geschikte verdunningsuitplatingstechniek, bv.:

i) Maak minstens twee decimale verdunningen, namelijk >NUM>1/>DEN>10 en >NUM>1/>DEN>100 of meer indien nodig geacht, van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (50-100 µl) van de geresuspendeerde pellet en elke verdunning op gemodificeerd SMSA-medium (aanhangsel 7) en verspreid dit met een steriel glasstaafje over het hele oppervlak van het medium.

Maak voorts, indien nuttig geacht, een verdunningsuitstrijk met een entoog met 10 µl van de geresuspendeerde pellet. De öse tussen de uitstijken afvlammen.

ii) Breng een afgemeten standaardvolume (50-100 µl) van de geresuspendeerde pellet op een plaat gemodificeerd SMSA-medium en verspreid dit met een steriel glasstaafje over het hele oppervlak van het medium. Strijk de staaf zonder afvlammen op nog twee andere platen gemodificeerd SMSA-medium.

5.2. Breng afzonderlijk met dezelfde verdunningsuitplatingstechniek een suspensie van 106 cellen per ml van een ras 3/biovar 2-stam van Pseudomonas solanacearum als positieve controle op een stel gemodificeerde SMSA-platen aan.

5.3. Incubeer de platen bij 28 °C. Begin de platen na drie dagen af te lezen. Indien negatief, incubeer verder tot zes dagen. Virulente isolaten van Pseudomonas solanacearum ontwikkelen melkwitte, platte, onregelmatige en vloeibare kolonies met duidelijke rode tot purperen centra, die interne streping of kransvorming vertonen.

5.4. Kweek de kolonies met kenmerkende morfologie rein door een subcultuur op een algemene voedingsbodem (aanhangsel 1).

5.5. Identificeer reinculturen (deel II.4.1) en bevestig Pseudomonas solanacearum met een pathogeniciteitstest (deel II.4.3).

Interpretatie van het resultaat van de selectieve uitplatingstoets

De selectieve uitplatingstoets is negatief als er na zes dagen geen kolonies worden geïsoleerd of als er geen kenmerkende kolonies van Pseudomonas solanacearum worden geïsoleerd, mits er geen aanwijzingen zijn van remming door kolonies van andere bacteriën, en mits er wel kenmerkende kolonies van Pseudomonas solanacearum worden aangetroffen op de positive controle.

De selectieve uitplatingstoets is positief als er wel kenmerkende kolonies van Pseudomonas solanacearum worden geïsoleerd.

6. Biotoets

Naar: Janse, 1988

6.1. Neem voor elke toets tien proefplanten van een gevoelige tomaat- of auberginecultivar in het derde volgroeide bladstadium. Geef de proefplanten 24 uur voor enting geen water.

6.2. Verdeel 100 µl van de geresuspendeerde pellet over de proefplanten. Inoculeer in de stengel tussen de kiemblaadjes en op een of meer andere plaatsen.

6.3. Inoculeer door dezelfde techniek, tien zaailingen met een suspensie van 106 cellen per ml van een ras 3/biovar 2-stam van Pseudomonas solanacearum als positieve controle en tien zaailingen met pelletbuffer als negatieve controle.

Houd de positieve controleplanten gescheiden van de andere planten om besmetting te vermijden.

6.4. Incubeer de zaailingen verder tot vier weken bij een constante temperatuur van 22-28 °C en hoge relatieve luchtvochtigheid en geef dagelijks water. Let op het ontstaan van verwelking, epinastie, chlorose en/of verminderde groei.

6.5. Isoleer van geïnfecteerde planten (deel II). Identificeer reinculturen met kenmerkende morfologie (deel II.4.1) en bevestig Pseudomonas solanacearum met een pathogeniciteitstoets (deel II.4.3).

6.6. Controleer indien nodig geacht de afwezigheid van infectie in proefplanten die geen enkel teken van infectie vertonen. Neem van iedere proefplant een stukje van 1 cm van de stengel ter hoogte van 2 cm boven het inoculatiepunt. Homogeniseer de weefsels in maceratiebuffer en voer de selectieve uitplatingstoets uit (deel III.5.1). Indien positief, identificeer reinculturen met kenmerkende morfologie (deel II.4.1) en bevestig Pseudomonas solanacearum met een pathogeniciteitstoets (deel II.4.3).

Interpretatie van het resultaat van de biotoets

De biotoets is negatief indien de proefplanten niet met Pseudomonas solanacearum geïnfecteerd zijn, en indien Pseudomonas solanacearum wordt gedetecteerd in de positieve controle.

De biotoets is positief indien de proefplanten wel met Pseudomonas solanacearum geïnfecteerd zijn.

7. Aanrijkingstoests

Naar: J.G. Elphinstone et al., 1996

7.1. Breng 100 µl van de geresuspendeerde pellet over in 3 ml gemodificeerde SMSA-bouillon (aanhangsel 7).

7.2. Incubeer gedurende minstens 48 uur, maar in ieder geval niet langer dan 72 uur, bij 28 °C met de dop los op het buisje met het oog op beluchting.

7.3. Druk de dop aan en vortex. Neem fracties voor de IF-toets (deel III.2), de Elisa-toets (deel III.3) en/of de PCR-toets (deel III.4).

8. Pathogeniciteitstoets

Zie deel II.4.3.

Aanhangsel 1

Voedingsbodems voor het kweken van Pseudomonas solanacearum

Glucose-nutriënt-agar

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bereid hoeveelheden van een halve liter mediumvloeistof in kolven van 1 liter.

Los de bestanddelen op.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Tot 50 °C afkoelen. Platen gieten.

Gist-pepton-glucose-agar

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bereid hoeveelheden van een halve liter mediumvloeistof in kolven van 1 liter.

Los de bestanddelen op.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Tot 50 °C afkoelen. Platen gieten.

Sucrose-pepton-agar

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bereid hoeveelheden van een halve liter mediumvloeistof in kolven van 1 liter.

Los de bestanddelen op. Breng de pH zo nodig op 7,2-7,4.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Tot 50 °C afkoelen. Platen gieten.

Kelmans tetrazolium-medium

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bereid hoeveelheden van een halve liter mediumvloeistof in kolven van 1 liter.

Los de bestanddelen op. Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Tot 50 °C afkoelen.

Een via een filter gesteriliseerde waterige oplossing van trifenyltetrazoliumchloride (Sigma) toevoegen om een eindconcentratie van 50 mg per l te verkrijgen.

Platen gieten.

Aanhangsel 2

Materialen voor voorbereiding van een monster

Maceratiebuffer: 50 mM fosfaatbuffer, pH 7,0

Deze buffer wordt gebruikt voor maceratie van weefsel.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Los de bestanddelen op en controleer de pH. Aliquot voorzover nodig geacht. Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Toevoeging van 5 % PVP-40 wordt bij de uitvoering van de directe PCR-test aanbevolen ter verlaging van de incidentie van amplificatieremming door aromatische moleculen in het extract.

Geadviseerd wordt een ontvlokkingsmiddel, een antischuimmiddel of een antioxidant toe te voegen bij gebruik van de Waring-menger of de Ultra Turrax-homogenisatieprocedure voor maceratie van de aardappelweefselkernen.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Afzonderlijk in autoclaaf steriliseren. Aan de gewenste concentratie toevoegen.

Pelletbuffer: 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,2

Deze buffer word gebruikt om de pellets van aardappelnaveleinden opnieuw te suspenderen en te verdunnen.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Los de bestanddelen op en controleer de pH. Aliquot voorzover nodig geacht. Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Aanhangsel 3

Materialen voor de IF-test

IF-buffer: 10 mM met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS), pH 7,2

Deze buffer word gebruikt voor verdunning van antisera.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Los de bestanddelen op en controleer de pH. Aliquot voorzover nodig geacht.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

IF-buffer-Tween

Deze buffer wordt gebruikt voor het wassen van de glaasjes. Voeg 0,1 % Tween 20 aan de IF-buffer toe.

0,1 M met fosfaat gebufferd glycerol, pH 7,6

Deze buffer wordt gebruikt als inbedvloeistof op de vensters van het IF-glaasje om de fluorescentie te versterken.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Aanhangsel 4

Bepaling van het besmettingsniveau met de IF-test

Oppervlakte (S) van het venster van een objectglas met meerdere vensters

= >NUM>ð D²>DEN>4

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

(1)

Oppervlakte (s) van het objectiefveld

= >NUM>ð d²>DEN>4

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

(2)

Bepaal door rechtstreekse meting of door berekening aan de hand van de volgende formule:

s = >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4 (3)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Uit (2) volgt

d = √>NUM>4 s>DEN>ð (4)

Uit (3) volgt

d = √>NUM>4 × >NUM>ð i²>DEN>G² K² × 4 >DEN>ð = >NUM>i>DEN>GK

Tel het aantal typische fluorescerende cellen per veld (c).

Bereken het aantal typische fluorescerende cellen per venster (C).

C = c >NUM>S >DEN>s

Bereken het aantal typische fluorescerende cellen per ml pellet (N)

N = C × >NUM>1 000 >DEN>y × F

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Aanhangsel 5

Materialen voor de Elisa-test

Buffer met carbonaatcoating van dubbele sterkte, pH 9,6

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Los de bestanddelen op en controleer de pH. Aliquot voorzover nodig geacht.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Als antioxidant kan natriumsulfiet in een eindconcentratie van 0,2 % worden toegevoegd als het extract een hoge fractie aromatische moleculen bevat.

10 × met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS), pH 7,4

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Los de bestanddelen op en controleer de pH. Aliquot voorzover nodig geacht.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing - Tween (PBS-T)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Buffer met blokkerend agens (antistof) (moet vers bereid worden)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Alkalische-fosfatasesubstraatoplossing, pH 9,8

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Mengen en de pH met geconcentreerd HCl op 9,8 brengen.

Met gedistilleerd water tot 1 liter aanvullen.

0,2 g MgCl2 toevoegen.

Per 15 ml oplossing twee fosfatasesubstraattabletten (Sigma) oplossen.

Aanhangsel 6

Materialen voor de PCR-test

Oligonucleotidenvolgorde van de primer:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Voor materialen: zie Seal et al. (1993).

Aanhangsel 7

Materialen voor selectieve uitplating en aanrijkingstoetsen

Selectief SMSA-medium (Engelbrecht, 1994 zoals door Elphinstone e.a., in 1996 gemodificeerd),

Basaal medium

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Bereid hoeveelheden van een halve liter mediumvloeistof in kolven van 1 liter.

Los de bestanddelen op en controlleer de pH. Vóór sterilisatie in een autoclaaf de pH zo nodig op 6,5 brengen. Pseudomonas solanacearum groeit niet goed op het medium bij een pH > 7,0.

Gedurende 15 minuten steriliseren in autoclaaf bij 121 °C.

Tot 50 °C afkoelen.

De volgende bestanddelen (alle van Sigma) toevoegen om de opgegeven eindconcentraties te verkrijgen:

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Los de bestanddelen in 70 % ethanol op tot de gegeven concentraties voor de hoeveelheid bereid medium. Sommige bestanddelen, namelijk polymyxine B en chlooramfenicol, moeten enigszins worden verwarmd en geschud.

SMSA-bouillon (Elphinstone et al., 1996)

Bereiden als voor het selectief SMSA-medium, maar zonder agar.

In 3 ml aliquots verdelen over 30 ml Universal wegwerpbuisjes.

Literatuurverwijzingen

Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.

Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113-121.

Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133-142.

Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith)Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.

Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5.

Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265-277.

Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127-135.

Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343-351.

Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335-345.

Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293-695.

Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp.

Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528-536.

Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.

Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993, Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029-1034.

Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.

Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587-1594.

Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262-4268.

Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76-111.

Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281-295.

Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266-269.