VERORDENING (EEG) Nr. 2568/91 VAN DE COMMISSIE van 11 juli 1991 inzake de kenmerken van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven en de desbetreffende analysemethoden

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,

Gelet op Verordening nr. 136/66/EEG van de Raad van 22 september 1966 houdende de totstandbrenging van een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector oliën en vetten (1), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 3577/90 (2), en met name op artikel 35 bis,

Overwegende dat in de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG de benamingen en definities zijn vastgesteld van olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven die in elke Lid-Staat, in het kader van het handelsverkeer tussen de Lid-Staten onderling en in de handel met derde landen, worden verkocht;

Overwegende dat, onverminderd andere bestaande bepalingen ter zake, ter onderscheiding van de verschillende soorten olie, de fysisch-chemische kenmerken van elke soort en de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen oliën dienen te worden bepaald, zodat zuiverheid en kwaliteit van de betrokken produkten kunnen worden gewaarborgd;

Overwegende dat het dienstig is om de aanwezigheid van de kenmerken van de verschillende soorten olie in de gehele Gemeenschap op uniforme wijze te bepalen; dat daartoe communautaire methoden voor chemische analyse en organoleptische beoordeling dienen te worden vastgesteld; dat evenwel tijdens een overgangsperiode het gebruik van andere in de Lid-Staten toegepaste analysemethoden moet worden toegestaan, met dien verstande dat in geval van uiteenlopende resultaten de uitkomsten van de communautaire methode doorslaggevend zijn;

Overwegende dat als gevolg van de bepaling van de fysisch-chemische kenmerken van de olijfoliën en de omschrijving van de analysemethoden de aanvullende aantekeningen van hoofdstuk 15 van de gecombineerde nomenclatuur aanpassing behoeven;

Overwegende dat in het kader van de methode voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen oliën "panels" van geselecteerde en

getrainde proevers dienen te worden gevormd; dat derhalve de nodige tijd moet worden gelaten om een dergelijke structuur tot stand te brengen; dat, gezien de moeilijkheden die sommige Lid-Staten zullen hebben om proefpanels te vormen, dient te worden toegestaan dat op in andere Lid-Staten reeds bestaande proefpanels een beroep wordt gedaan;

Overwegende dat met het oog op de correcte werking van de regeling inzake de heffingen op de invoer van afvallen van olijven, een uniforme methode voor de bepaling van het oliegehalte van die produkten dient te worden vastgesteld;

Overwegende dat het, om de handel niet te schaden, dienstig is een beperkte periode vast te stellen waarbinnen vóór de inwerkingtreding van deze verordening verpakte olie nog mag worden afgezet;

Overwegende dat Verordening (EEG) nr. 1058/77 van de Commissie (3), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EEG) nr. 1858/88 (4), bijgevolg dient te worden ingetrokken;

Overwegende dat het Comité van beheer voor oliën en vetten geen advies heeft uitgebracht binnen de door zijn voorzitter bepaalde termijn.

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

1. Als "bij de eerste persing verkregen olijfoliën" in de zin van punt 1, onder a), b) en c), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG worden aangemerkt de oliën waarvan de respectieve kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punten 1, 2 en 3, van onderhavige verordening zijn vermeld.

2. Als "bij de eerste persing verkregen olijfolie voor verlichting" in de zin van punt 1, onder d), van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 4, van de onderhavige verordening zijn vermeld.

3. Als "geraffineerde olijfolie" in de zin van punt 2 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 5, van de onderhavige verordening zijn vermeld.

4. Als "olijfolie" in de zin van punt 3 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 6, van de onderhavige verordening zijn vermeld.

5. Als "ruwe olie uit afvallen van olijven" in de zin van punt 4 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 7, van de onderhavige verordening zijn vermeld.

6. Als "geraffineerde olie uit afvallen van olijven" in de zin van punt 5 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 8, van de onderhavige verordening zijn vermeld.

7. Als olie uit afvallen van olijven in de zin van punt 6 van de bijlage bij Verordening nr. 136/66/EEG wordt aangemerkt de olie waarvan de kenmerken overeenkomen met die welke in bijlage I, punt 9, van de onderhavige verordening zijn vermeld.

Artikel 2

1. De in bijlage I vastgestelde kenmerken van de oliën worden aan de hand van de volgende analysemethoden bepaald:

- voor de bepaling van het gehalte aan vrije vetzuren, uitgedrukt in een percentage oliezuur, de in bijlage II beschreven methode;

- voor de bepaling van het peroxidegetal, de in bijlage III beschreven methode;

- voor de bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen, de in bijlage IV beschreven methode;

- voor de bepaling van de sterolsamenstelling, de in bijlage V beschreven methode;

- voor de bepaling van het erythrodiol- en uvaolgehalte, de in bijlage VI beschreven methode;

- voor de bepaling van het gehalte aan verzadigde vetzuren op de 2-positie van de triglyceriden, de in bijlage VII beschreven methode;

- voor de bepaling van het gehalte aan trilinoleïne, de in bijlage VIII beschreven methode;

- voor de spectrofotometrische analyse, de in bijlage IX beschreven methode;

- voor de bepaling van de vetzuursamenstelling, de in de bijlagen X.A en X.B beschreven methode;

- voor de bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen, de in bijlage XI beschreven methode;

- voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken van bij de eerste persing verkregen olijfolie, de in bijlage XII beschreven methode, toegepast overeenkomstig het bepaalde in lid 2;

- voor het bewijs van raffinage, de in bijlage XIII beschreven methode.

2. De analist beoordeelt, zelfs indien hij door deskundigen wordt bijgestaan, de organoleptische kenmerken volgens de procedure die in het in bijlage XII bedoelde beoordelingsformulier is beschreven. Indien de bij de analyse geconstateerde organoleptische kenmerken verschillen van die welke

het produkt op grond van zijn benaming dient te hebben, laat de analist het monster overeenkomstig bijlage XII door een proefpanel onderzoeken.

De tweede analyse wordt door het proefpanel overeenkomstig de in bijlage XII genoemde voorschriften uitgevoerd.

Ingeval de organoleptische kenmerken in het kader van de toepassing van de interventieregeling moeten worden beoordeeld, verricht het proefpanel deze beoordeling overeenkomstig bijlage XII.

Artikel 3

Tot en met 31 oktober 1992 mogen de Lid-Staten, onverminderd de invoering van de in artikel 2 bedoelde analysemethoden, andere beproefde en wetenschappelijk verantwoorde methoden toepassen, op voorwaarde dat daardoor het vrije verkeer van produkten die op grondslag van de communautaire methoden als in overeenstemming met de voorschriften zijn erkend, niet wordt belemmerd. De betrokken Lid-Staten delen bedoelde andere methoden, alvorens deze toe te passen, aan de Commissie mede.

Ingeval de uitslag van een van deze andere methoden van die van de gemeenschappelijke methode afwijkt, geldt de met de gemeenschappelijke methode verkregen uitslag.

Artikel 4

1. Voor de beoordeling van de organoleptische kenmerken vormen de Lid-Staten "panels" van proevers, die volgens de in bijlage XII beschreven methode worden geselecteerd en geoefend.

2. Indien een Lid-Staat moeilijkheden ondervindt om op zijn grondgebied een "panel" te vormen, kan op een in een andere Lid-Staat werkzaam proefpanel beroep worden gedaan.

Artikel 5

De aanvullende aantekeningen 2, 3 en 4 van hoofdstuk 15 van de gecombineerde nomenclatuur worden vervangen door die in bijlage XIV.

Artikel 6

1. Het oliegehalte van afvallen van olijven en van de andere bij de winning van olijfolie verkregen afvallen (GN-codes 2306 90 11 en 2306 90 19) wordt bepaald overeenkomstig de in bijlage XV opgenomen methode.

2. Het in lid 1 bedoelde oliegehalte wordt uitgedrukt in gewichtspercenten berekend over de droge stof.

Artikel 7

Wat de aanwezigheid van andere ongewenste stoffen dan die bedoeld in bijlage XI betreft, gelden de communautaire bepalingen.

Artikel 8

1. Elke Lid-Staat stelt de Commissie van de ter uitvoering van deze verordening genomen maatregelen in kennis.

2. Elke Lid-Staat legt de Commissie aan het begin van elk halfjaar een verzamelstaat met de analyseresultaten van de in het voorgaande halfjaar uitgevoerde bepalingen over.

Deze resultaten worden volgens de procedure van artikel 39 van Verordening nr. 136/66/EEG door het Comité van beheer voor oliën en vetten onderzocht.

Artikel 9

Verordening (EEG) nr. 1058/77 wordt hierbij ingetrokken.

Artikel 10

1. Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.

De in bijlage XII beschreven methode wordt, behalve voor verrichtingen in het kader van de interventieregeling, met ingang van 1 januari 1992 toegepast.

2. Deze verordening is niet van toepassing op olijfoliën en oliën uit afvallen van olijven die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn verpakt en tot en met 31 oktober 1992 worden verkocht.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat.

Gedaan te Brussel, 11 juli 1991.

Voor de Commissie

Ray MAC SHARRY

Lid van de Commissie

(1) PB nr. 172 van 30. 9. 1966, blz. 3025/66.(2) PB nr. L 353 van 17. 12. 1990, blz. 23.(3) PB nr. L 128 van 24. 5. 1977, blz. 6.(4) PB nr. L 166 van 1. 7. 1988, blz. 10.

BIJLAGEN

Inhoudsopgave Bladzijde

Bijlage I:

Kenmerken van olijfolie .

4

Bijlage II:

Bepaling van de zuurgraad .

6

Bijlage III:

Bepaling van het peroxidegetal .

8

Bijlage IV:

Bepaling van het gehalte aan alifatische alcoholen met behulp van capillaire gaschromatografie .

10

Bijlage V:

Bepaling van de sterolsamenstelling en het sterolgehalte met behulp van capillaire gaschromatografie .

15

Bijlage VI:

Bepaling van het gehalte aan erythrodiol en uvaol .

23

Bijlage VII:

Bepaling van vetzuren op de 2-positie in triglyceriden van oliën en vetten .

25

Bijlage VIII:

Bepaling van het gehalte aan trilinoleïne .

29

Bijlage IX:

Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied .

33

Bijlage X.A:

Gaschromatografische analyse van methylesters van vetzuren .

36

Bijlage X.B:

Bereiding van methylesters van vetzuren overeenkomstig bijlage VI, punten I en II, van Verordening (EEG) nr. 72/77 of volgens de hieronder beschreven methode .

44

Bijlage XI:

Bepaling van het gehalte aan gehalogeneerde oplosmiddelen .

48

Bijlage XII:

Organoleptische beoordeling van olijfolie van eerste persing .

49

Bijlage XIII:

Bewijs van raffinage .

75

Bijlage XIV:

Aanvullende aantekeningen 2, 3 en 4 bij hoofdstuk 15 van de gecombineerde nomenclatuur .

77

Bijlage XV:

Bepaling van het oliegehalte van de afvallen van olijven .

80

Bijlage XVI:

Bepaling van het joodgetal .

82

BIJLAGE I

KENMERKEN VAN OLIJFOLIE

Categorie

Zuurgraad

Peroxidegetal

meq O2/kg

Gehalogeneerde

oplosmiddelen

mg/kg

(¹)

Alifatische

alcoholen

mg/kg

Verzadigde

vetzuren

2-positie

triglyceriden

%

Erythrodiol

+ Uvaol

%

Trilinoleïne

%

Cholesterol

%

Brassicasterol

%

Campesterol

%

Stigmasterol

%

Betasitosterol

%

(²)

AE 7stigmasterol

%

Totaal

sterolen

mg/kg

1. Extra olijfolie verkregen bij de eerste persing

M 1,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

2. Olijfolie verkregen bij de eerste persing

M 2,0

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

3. Courante olijfolie verkregen bij de eerste persing

M 3,3

M 20

M 0,20

M 300

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

4. Olijfolie voor verlichting verkregen bij de eerste persing

> 3,3

> 20

> 0,20

M 400

M 1,3

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

-

m 93,0

M 0,5

m 1 000

5. Geraffineerde

olijfolie

M 0,5

M 10

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

6. Olijfolie

M 1,5

M 15

M 0,20

M 350

M 1,5

M 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 000

7. Olie uit afvallen

van olijven

m 2,0

-

-

-

M 1,8

m 12

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

-

m 93,0

M 0,5

m 2 500

8. Geraffineerde olie uit afvallen van olijven

M 0,5

M 10

M 0,20

-

M 2,0

m 12

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

9. Olie uit afvallen van olijven

M 1,5

M 15

M 0,20

-

M 2,0

> 4,5

M 0,5

M 0,5

M 0,2

M 4,0

< Camp.

m 93,0

M 0,5

m 1 800

M = maximum, m = minimum.

(¹) Totaal maximumgehalte voor bestanddelen die zijn aangetoond met een elektronenvangstdetector. Voor individueel aangetoonde bestanddelen is het toegestane maximum 0,10 mg/kg.

(²) Delta-5,23-stigmastadianol + xerosterol + sitosterol + sitostanol + delta-5-avamesterol + delta-5-24.

Opmerking:

Wanneer de olijfolie aan een van de vereiste kenmerken niet voldoet, wordt deze olie ingedeeld in een lagere categorie.

Categorie

Zuurgraad

Mristinezuur

%

Linoleenzuur

%

Arachidezuur

%

Eicosaanzuur

%

Beheen(Docosaan-)

zuur

%

Lignocarinezuur

%

K232

K270

K270 met

aluminiumoxide

(¹)

Delta K

Cijfer panel

1. Extra olijfolie verkregen bij de eerste persing

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,40

M 0,20

M 0,10

M 0,010

86,5

2. Olijfolie verkregen bij de eerste persing

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,010

85,5

3. Courante olijfolie verkregen bij de eerste persing

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 2,50

M 0,25

M 0,10

M 0,010

83,5

4. Olijfolie voor verlichting verkregen bij de eerste persing

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,70

> 0,25

M 0,11

-

< 3,5

5. Geraffineerde

olijfolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,40

M 1,20

-

M 0,160

-

6. Olijfolie

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 3,30

M 1,00

-

M 0,130

-

7. Olie uit afvallen van olijven

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

-

-

-

-

-

8. Geraffineerde olie uit afvallen van olijven

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,50

M 2,50

-

M 0,250

-

9. Olie uit afvallen

van olijven

M 0,1

M 0,9

M 0,7

M 0,5

M 0,3

M 0,5

M 5,30

M 2,00

-

M 0,200

-

(¹) Als voor olie met een zuurgraad van meer dan 3,3 %, K270 na behandeling over geactiveerd aluminiumoxide hoger is dan 0,11, moet de in de bijlage XIII bedoelde test inzake raffinage worden uitgevoerd.

Opmerking:

Voor de vaststelling van de zuiverheid moet, als K270 hoger is dan de limiet, K270 na behandeling van de olie voor de betrokken categorie over een kolom geactiveerd aluminiumoxide opnieuw worden bepaald.

BIJLAGE II

BEPALING VAN DE ZUURGRAAD 1.

DOEL

Bepaling van de vrije vetzuren in olijfolie. Het gehalte aan vrije vetzuren wordt uitgedrukt in de volgens de klassieke methode berekende zuurgraad.

1.1.

Principe van de methode

Oplossing van het monster in een mengsel van oplosmiddelen, daarna titrering van de aanwezige vrije vetzuren met behulp van een oplossing van kaliumhydroxide in ethanol.

1.2.

Reagentia

Alle reagentia moeten p.a. zijn en het gebruikte water dient gedistilleerd water of water van gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

1.2.1.

Diëthylether: 95 % ethanol (v/v), mengsel 1 : 1 (v/v) in volume.

Waarschuwing: Diëthylether is zeer ontvlambaar en kan explosieve peroxiden vormen. Bij gebruik ervan dienen bijzondere voorzorgen te worden genomen.

Neutraliseer, precies op het ogenblik van gebruik, met de kaliumhydroxide-oplossing (1.2.2), in aanwezigheid van 0,3 ml phenolphtaleïne-oplossing (1.2.3) voor 100 ml mengsel.

Opmerking: Indien gebruik van diëthylether onmogelijk is, kan een mengsel van uit ethanol en tolueen bestaande oplosmiddelen worden gebruikt. Zonodig kan ethanol worden vervangen door propanol-2.

1.2.2.

Kaliumhydroxide, in ethanol getitreerde oplossing, c(KOH), ongeveer 0,1 mol/l of, indien nodig, c(KOH) ongeveer 0,5 mol/l.

De precieze concentratie van de oplossing van kaliumhydroxide in ethanol dient bekend te zijn en onmiddellijk voor gebruik te worden geverifieerd. Gebruik een oplossing die minstens vijf dagen voor gebruik is bereid en is gedecanteerd in een donkerbruine, met een rubberen stop gesloten fles. De oplossing dient kleurloos of strogeel te zijn.

Opmerking: Een stabiele, kleurloze kaliumhydroxideoplossing kan op de volgende wijze worden bereid. 1 000 ml ethanol op temperatuur en gedurende één uur koken, met reflux, met 8 g kaliumhydroxide en 0,5 g aluminiumsnippers. Onmiddellijk distilleren. In het distillaat de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide oplossen. Verschillende dagen laten rusten en de heldere supernotans van het kaliumcarbonaatneerslag decanteren.

De oplossing kan ook zonder distillatie op de volgende wijze worden bereid. Aan 1 000 ml ethanol 4 ml aluminiumbutylaat toevoegen en het mengsel enkele dagen laten staan. Het supernotans decanteren en de benodigde hoeveelheid kaliumhydroxide erin oplossen. De oplossing is klaar voor gebruik.

1.2.3.

Phenolphtaleïne, oplossing van 10 g/l in 95-96 % ethanol (v/v) of alkalisch blauw (in geval van sterk gekleurde vetten), oplossing van 20 g/l in 95-96 % ethanol (v/v).

1.3.

Apparatuur

Gebruikelijk laboratoriummateriaal, en met name:

1.3.1.

Analytische balans.

1.3.2.

Kolf van 250 ml.

1.3.3.

Buret van 10 ml, met een schaalindeling van 0,05 ml.

1.4.

Werkwijze

1.4.1.

Bereiding van het te analyseren monster

De bepaling wordt uitgevoerd op een gefiltreerd monster.

Wanneer de som van vochtgehalte en gehalte aan onzuiverheden kleiner is dan 1 %, wordt de bepaling uitgevoerd op het monster als zodanig.

1.4.2.

Monsterneming

Houd bij het nemen van het monster rekening met het verwachte zuurgetal volgens de gegevens van de volgende tabel.

Verwacht zuurgetal

Hoeveelheid af te wegen monster

(g)

Nauwkeurigheid van de weging

van het monster

(g)

< 1

1 tot 4

4 tot 15

15 tot 75

> 75

20,

10,

2,5

0,5

0,1

0,05

0,02

0,01

0,001

0,0002

Weeg het monster in de kolf (1.3.2).

1.4.3

Bepaling

Los het monster (1.4.2) op in 50 tot 150 ml van het mengsel diëthylether/ethanol (1.2.1) dat tevoren is geneutraliseerd.

Titreer, al schuddend, met de oplossing 0,1 mol/l kaliumhydroxide (1.2.2) (zie opmerking 3) tot omslag van de indicator (rose kleuring van de phenophtaleïne die ten minste 10 seconden aanhoudt).

Opmerking 1: De getitreerde kaliumhydroxideoplossing in ethanol (1.2.2) kan worden vervangen door een oplossing in water van kalium- of natriumhydroxide wanneer het erin gebrachte volume water niet tot een fasescheiding leidt.

Opmerking 2:

Als de nodige hoeveelheid 0,1 mol/l kaliumhydroxideoplossing 10 ml overschrijdt, gebruik dan een oplossing van 0,5 mol/l.

Opmerking 3:

Als de oplossing troebel wordt tijdens de titrering, voeg dan een hoeveelheid van het mengsel van oplosmiddelen (1.2.1) toe tot de oplossing helder wordt.

1.5

Formulering in zuurgraad in percentage oliezuur

De zuurgraad, uitgedrukt in gewichtspercentage, is gelijk aan:

V · c · 1 000 · 100 = V · c · M

V · c ·

M

1 000

·

100

m

=

V · c · M

10 · m

waarin:

V = het volume in ml van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing;

c

=

de precieze concentratie, in mol/l van de gebruikte, getitreerde kaliumhydroxideoplossing;

M

=

het molaire gewicht, in grammen per mol, van het zuur dat voor de weergave van de resultaten is gekozen (= 282);

m

=

de hoeveelheid af te wegen monster in gram.

Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee bepalingen.

BIJLAGE III

BEPALING VAN HET PEROXIDEGETAL 1.

DOEL

Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van het peroxidegetal van oliën en vetten.

2.

TOEPASSINGSGEBIED

Deze norm geldt voor dierlijke en plantaardige oliën en vetten.

3.

DEFINITIE

Het peroxidegetal is de hoeveelheid stoffen in het monster, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, die kaliumjodide oxideren bij de beschreven werkomstandigheden.

4.

PRINCIPE VAN DE METHODE

Het in een mengsel van azijnzuur en chloroform opgeloste vet wordt behandeld met kaliumjodide en het vrijgemaakte jodide wordt getitreerd met natriumthiosulfaatoplossing.

5.

APPARATUUR

Alle gebruikte apparatuur dient vrij te zijn van reducerende of oxiderende stoffen.

Opmerking: Geslepen oppervlakten niet invetten.

5.1.

3 ml glazen weegschuitje.

5.2.

Kolven met geslepen halzen en stoppen, van ongeveer 250 ml, vooraf gedroogd en gevuld met een zuiver, droog inert gas (stikstof of, bij voorkeur, koolstofdioxide).

5.3.

Buret van 25 of 50 ml, met een schaalindeling van 0,1 ml.

6.

REAGENTIA

6.1.

Chloroform, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog inert gas.

6.2.

IJsazijn, p.a., zuurstofvrij gemaakt door lichtjes te laten doorborrelen met een stroom zuiver, droog gas.

6.3.

Kaliumjodide, verzadigde oplossing in water, vlak vóór gebruik bereid, vrij van jodium of jodaat.

6.4.

Natriumthiosulfaat, 0,01 of 0,002 N nauwkeurig gestelde oplossing in water, onmiddellijk vóór gebruik gesteld.

6.5.

Zetmeeloplossing, 10 g/l oplossing in water, vers bereid uit natuurlijk oplosbaar zetmeel.

7.

MONSTER

Zorg ervoor dat het monster niet in de nabijheid van licht wordt genomen, dat het in het donker wordt bewaard en vervolgens koud wordt opgeslagen in volledig gevulde glazen recipiënten, hermetisch afgesloten met stoppen van geslepen glas of kurk.

8.

WERKWIJZE

De proef dient in diffuus daglicht of bij kunstlicht te worden uitgevoerd. Weeg in een glazen weegschuitje (5.1), of bij gebrek daaraan in een kolf (5.2), tot op 0,001 g nauwkeurig, een hoeveelheid van het monster volgens de volgende tabel, afhankelijk van het verwachte peroxidegetal.

Verwacht peroxidegetal

(meq O2/kg)

Hoeveelheid van het monster

(g)

0 tot 12

12 tot 20

20 tot 30

30 tot 50

50 tot 90

5,0 tot 2,0

2,0 tot 1,2

1,2 tot 0,8

0,8 tot 0,5

0,5 tot 0,3

Ontstop een kolf (5.2) en breng er het glazen weegschuitje in dat het monster bevat. Voeg 10 ml chloroform toe (6.1). Los het monster snel op door roeren. Voeg 15 ml azijnzuur (6.2) toe, daarna 1 ml kaliumjodideoplossing (6.3). Sluit snel af met de stop, schud gedurende één minuut en laat precies vijf minuten in het donker staan bij een temperatuur van 15 tot 25 oC.

Voeg ongeveer 75 ml gedistilleerd water toe. Titreer, krachtig schuddend, het vrijgekomen jodium met de natriumthiosulfaatoplossing (6.4) (0,002 N oplossing voor verwachte waarden van minder dan

12 en 0,01 N oplossing voor verwachte waarden boven 12), met gebruik van de zetmeeloplossing (6.5)

als indicator.

Voer twee bepalingen uit op hetzelfde proefmonster.

Voer terzelfder tijd een blanco bepaling uit. Indien het resultaat van de blanco bepaling meer bedraagt dan 0,05 ml van de 0,01 N natriumthiosulfaatoplossing (6.4), vervang dan de onzuivere reagentia.

9.

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Het peroxidegetal, uitgedrukt in milli-equivalenten actieve zuurstof per kilogram, wordt weergegeven met de formule:

P.V. = V · T · 1 000

P.V. =

V · T · 1 000

m

waarin:

V = de gebruikte hoeveelheid gestelde natriumthiosulfaatoplossing (6.4) in millimeter, gecorrigeerd om rekening te houden met de blanco bepaling;

T

=

de precieze normaliteit van de gebruikte natriumthiosulfaatoplossing (6.4);

m

=

het gewicht van het monster, in gram.

Neem als resultaat het rekenkundig gemiddelde van de twee uitgevoerde bepalingen.

BIJLAGE IV

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ALIFATISCHE ALCOHOLEN MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE 1.

DOEL

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het individuele en totale gehalte aan alifatische alcoholen in vetstoffen.

2.

PRINCIPE VAN DE METHODE

De vetstof, waaraan 1-eicosanol als interne standaard is toegevoegd, wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met diëthylether.

De alcoholfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden door middel van dunne-laagchromatografie met basische-kiezelgelplaten. De uit de kiezelgel afgescheiden alcoholen worden omgezet in trimethylsilyl ethers en met capillaire gaschromatografie bepaald.

3.

APPARATUUR

3.1.

Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2.

Scheitrechters van 500 ml.

3.3.

Kolven van 250 ml.

3.4.

Volledige uitrusting voor dunne-laagchromatografie met 20 × 20 cm glasplaten.

3.5.

Ultravioletlamp met een golflengte van 366 of 254 nm.

3.6.

Injectiespuiten van 100 ml en 500 ml.

3.7.

Filterkroes G 3 (poreusiteit 15-40 mm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuuem te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.

3.8.

Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21, waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten.

3.9.

Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.10.

Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een split systeem, bestaande uit:

3.10.1.

Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van p 1 oC.

3.10.2.

Een temperatuurregelbare verdampingseenheid met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement.

3.10.3.

Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid.

3.10.4.

Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid.

3.11.

Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m, inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52- of SE-54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 mm.

3.12.

Gaschromatografische injectiespuit van 10 ml met een geharde naald.

4.

REAGENTIA

4.1.

Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol. Bewaar de oplossing in goed afgesloten flessen van donker glas.

4.2.

Diëthylether, p.a.

4.3.

Natriumsulfaat, p.a., watervrij.

4.4.

Glazen dunne-laagplaten gecoat met kiezelgel, zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).

4.5.

Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 0,2 M in ethanol. Los 13 g kaliumhydroxide op in 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol aan tot 1 liter.

4.6.

Benzeen, voor chromatografische doeleinden.

4.7.

Aceton, voor chromatografische doeleinden.

4.8.

Hexaan, voor chromatografische doeleinden.

4.9.

Ethylether, voor chromatografische doeleinden.

4.10.

Chloroform, p.a.

4.11.

Dunne-laagchromatografische referentieoplossing. Een 5 % oplossing van een mengsel van C20-C28-alcoholen in chloroform.

4.12.

2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing.

4.13.

Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.

4.14.

Hexamethyldisilazaan.

4.15.

Trimethylchloorsilaan.

4.16.

Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de C20-C28 alifatische alcoholen. Direct vóór gebruik te bereiden uit een mengsel van de zuivere alcoholen.

4.17.

1-eicosanol, 0,1 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).

4.18.

Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.

4.19.

Hulpgassen:

- waterstof, gaschromatografisch zuiver;

- lucht, gaschromatografisch zuiver.

5.

WERKWIJZE

5.1.

Bereiding van het onverzeepbare residu.

5.1.1.

Breng in de kolf van 250 ml met behulp van de injectiespuit van 500 ml een hoeveelheid 0,1 % l-eicosanoloplossing (;) in chloroform (4.17) die overeenkomt met ongeveer 10 % van het gehalte aan alifatische alcoholen in het in bewerking te nemen monster. Bij voorbeeld: voeg voor 5 g monster 250 ml 0,1 % 1-eicosanoloplossing (;) toe indien het gaat om olijfolie of zaadoliën en 1 500 ml indien het gaat om olie uit afvallen van olijven.

Damp het chloroform in een stikstofstroom in tot droog en weeg in dezelfde kolf nauwkeurig ongeveer 5 g af van het gedroogde gefiltreerde monster.

5.1.2.

Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken op een waterbad onder voortdurend krachtig schudden tot de verzeping heeft plaatsgevonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 oC.

5.1.3.

Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml scheitrechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml diëthylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en laat uitzakken (zie opmerking 1).

Tap de waterige onderlaag af in een tweede scheitrechter. Herhaal de extractie van de waterlaag twee keer op dezelfde manier en gebruik hierbij telkens 60-70 ml ethylether.

Opmerking 1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylalcohol toe te voegen.

5.1.4.

Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens 50 ml gedistilleerd water tot het waswater neutraal reageert.

Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf, was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden diëthylether.

(;) Er mag ook gebruik worden gemaakt van 1-eneicosanol.

5.1.5.

Distilleer de ether tot op enkele ml af, droog door toepassing van een kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in een oven bij 100 oC gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in een exsiccator en weeg.

5.2.

Scheiding van de alcoholfractie.

5.2.1.

Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedurende 10 seconden volledig in de 0,2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing (4.5), laat de platen gedurende 2 uur in een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende 1 uur in een stoof bij 100 oC.

Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de op deze manier bereide platen moeten binnen 2 weken worden gebruikt).

Opmerking 2: Bij gebruik van basische-kiezelgelplaten voor de scheiding van de alcoholfractie is de behandeling van het onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig. Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren en andere) vastgehouden op de startlijn en is de band van de alifatische- en terpeenalcoholen duidelijk van de sterolband gescheiden.

5.2.2.

Breng in de ontwikkeltank een mengsel van benzeen/aceton, 95 : 5 (v/v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Als alternatief kan een mengsel van hexaan/ethylether, 65 : 35 (v/v), worden gebruikt. Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende ongeveer een half uur staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten.

Opmerking 3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden ververst om volkomen reproduceerbare elutiecondities te verwezenlijken.

5.2.3.

Bereid een ongeveer 5 % oplossing van het onverzeepbare residu (5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulp van de 100 ml injectiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens 2-3 ml aan van de alcohol-referentieoplossing (4.11) zodat de alcoholband na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd.

5.2.4.

Plaats de plaat in de volgens punt 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 oC en 20 oC. Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof in een hete-luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te zetten, verdampen.

5.2.5.

Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. De alifatische alcoholenband kan door bekijken onder ultraviolet licht worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte ligt als de vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen van deze band en van de band direct hierboven, die correspondeert met de triterpeenalcoholen, aan de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood.

Opmerking 4: Het voorschrift om zowel de alifatische alcoholenband als de triterpeenalcoholband samen verder te verwerken, houdt verband met het feit dat aanzienlijke hoeveelheden alifatische alcoholen bij deze methode in de triterpeenalcoholband terecht komen.

5.2.6.

Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filterkroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de metalen spatel en filtreer onder vacuuem. Verzamel het filtraat in de afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes.

Was het residu in de filterkroes drie maal met ethylether (telkens ongeveer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf. Damp het filtraat in tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), damp droog door voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende ongeveer 10 minuten in een oven bij 105 oC, laat afkoelen in een exsiccator en weeg. Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal is de alcoholfractie.

5.3.

Bereiding van de trimethylsilylethers.

5.3.1.

Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige alcoholfractie een hoeveelheid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan 9:3:1 (v/v/v) (zie opmerking 5), waarbij voor elke mg alcohol 50 ml wordt toegevoegd. Vermijd hierbij bevochtiging (zie opmerking 6).

Opmerking 5: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar, zoals bij voorbeeld bistrimethylsilyltrifluoraceetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden verdund met een gelijk volume watervrije pyridine.

5.3.2.

Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te draaien) tot de alcoholfractie volledig is opgelost. Laat ten minste 15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten. De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse.

Opmerking 6: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De vorming van witte vlokken of de verschijning van een roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van vocht of van veroudering van het reagens. In deze gevallen moet opnieuw worden begonnen.

5.4.

Gaschromatografische analyse.

5.4.1.

Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom.

5.4.1.1.

Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector.

Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.).

5.4.1.2.

Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij geconditioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een temperatuur van ten minste 20 oC boven de bij de analyse gebruikelijke temperatuur (zie opmerking 7). Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, onsteking van de vlam, aansluiting van de elektronische recorder, temperatuurregeling van de kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen.

Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende uitgevoerde conditionering van de kolom.

Opmerking 7: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten minste 20 oC lager zijn dan de maximumtemperatuur die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven.

5.4.2.

Keuze van de werkomstandigheden.

5.4.2.1.

Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden dienen:

- kolomtemperatuur: 8 minuten isotherm op 180 oC, opwarmen met 5 oC per minuut tot 260 oC , gedurende vijf minuten handhaven, afkoelen tot 160 oC en deze temperatuur 5 minuten handhaven;

- injectietemperatuur: 280 oC;

- detectortemperatuur: 290 oC;

- lineaire snelheid van het draaggas: helium 20-35 cm/s, waterstof 30-50 cm/s;

- splitverhouding: van 1 : 50 tot 1 : 100;

- gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking;

- gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag;

- papiersnelheid: 30-60 cm/uur;

- injectiehoeveelheid: 0,5-1 ml TMSE-oplossing.

Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:

- de retentietijd van de C26-alcohol moet ongeveer 18 p 5 minuten zijn;

- de piek van de C22-alcohol moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie 80 p 20 % volle schaaluitslag en voor zaadoliën 40 p20 % volle schaaluitslag.

5.4.2.2.

Voer, om de hierboven genoemde vereisten te controleren, een aantal injecties uit van oplossingen van TMSE-alcoholen en pas de omstandigheden zodanig aan dat de beste resultaten worden verkregen.

5.4.2.3.

De piek-integratieparameters moeten zodanig worden gekozen dat een juiste waarde van de piekoppervlakten wordt verkregen.

5.4.3.

Bepaling.

5.4.3.1.

Zuig in de 10 ml injectiespuit 1 ml hexaan, 0,5 ml lucht en ten slotte 0,5-1,0 ml monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden, verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald.

5.4.3.2.

Neem het chromatogram op tot alle aanwezige TMSE-alcoholen volledig zijn geëlueerd.

De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste specificaties (5.4.1.2).

5.4.4.

Identificatie van de pieken.

Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door vergelijking met mengsels van TMSE-alcoholen die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.

In figuur 1 wordt een chromatogram getoond van de alcoholfractie van een eerste persing olijfolie.

5.4.5.

Berekening.

5.4.5.1.

Bereken met de integrator de piekoppervlakten van 1-eicosanol en de C22-C28 alifatische alcoholen.

5.4.5.2.

Bereken het gehalte aan elk individueel alcohol in mg/100 g vethoudend materiaal als volgt:

alcohol x = Ax · ms · 100

alcohol x =

Ax · ms · 100

As · m

waarin:

Ax = piekoppervlak van alcohol x, in integratoreenheden;

As

=

piekoppervlak van 1-eicosanol, in integratoreenheden;

ms

=

hoeveelheid van het toegevoegde 1-eicosanol, in milligram;

m

=

hoeveelheid van het onderzochte monster, in gram.

6.

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Geef de gehaltes van de individuele alifatische alcoholen op in mg/100 g vethoudend materiaal en hun som als "totaal alifatische alcoholen".

AANHANGSEL Bepaling van de lineaire snelheid van het draaggas

Injecteer 1-3 ìl methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek (tM).

De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij L de lengte is van de kolom in centimeters en tMde gemeten tijd in seconden.

BIJLAGE V

BEPALING VAN DE STEROLSAMENSTELLING EN HET STEROLGEHALTE MET BEHULP VAN CAPILLAIRE GASCHROMATOGRAFIE 1.

DOEL

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de bepaling van het individuele en totale sterolgehalte van vetstoffen.

2.

PRINCIPE VAN DE METHODE

De vetstof, waaraan a-cholestanol als interne standaard is toegevoegd, wordt verzeept met ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met ethylether.

De sterolfractie wordt van het onverzeepbare extract gescheiden met behulp van basische kiezelgel dunne-laagchromatografie. De van de dunne-laagplaat verzamelde sterolen worden omgezet in trimethylsilylethers en via capillaire gaschromatografie kwantitatief bepaald.

3.

APPARATUUR

3.1.

Kolf van 250 ml, voorzien van een refluxkoeler met slijpstukken.

3.2.

Scheitrechters van 500 ml.

3.3.

Kolven van 250 ml.

3.4.

Volledige uitrusting voor dunne-laagchromatografie met 20 × 20 cm glasplaten.

3.5.

Ultravioletlamp met een golflengte van 366 of 254 nm.

3.6.

Injectiespuiten van 100 ml en 500 ml.

3.7.

Filterkroes G 3 (poreusiteit 15-40 mm) met een diameter van ongeveer 2 cm en een hoogte van ongeveer 5 cm, geschikt om onder vacuuem te filtreren en voorzien van een slijpstuk 12/21.

3.8.

Afzuigkolf van 50 ml, voorzien van een slijpstuk 12/21, waarmee deze op de filterkroes kan worden aangesloten.

3.9.

Konisch afgeronde centrifugebuis van 10 ml, afsluitbaar.

3.10.

Gaschromatograaf, geschikt voor het werken met een capillaire kolom, voorzien van een splitsysteem bestaande uit:

3.10.1.

Een gethermostatiseerde ruimte waarmee de kolommen op de gewenste temperatuur kunnen worden gehouden met een nauwkeurigheid van p1 oC.

3.10.2.

Een temperatuurgeregelde verdampingseenheid met een gepersilaniseerd glazen verdampingselement.

3.10.3.

Een vlamionisatiedetector en een versterker-/verzwakkereenheid,

3.10.4.

Een integrerende recorder, geschikt voor gebruik met de versterker-/verzwakkereenheid (3.10.3), met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid.

3.11.

Een glazen of fused-silica capillaire kolom met een lengte van 20-30 m, inwendige diameter 0,25-0,32 mm, inwendig gecoat met SE-52- of SE-54-vloeistof of equivalent in een uniforme dikte tussen 0,10 en 0,30 mm.

3.12.

Gaschromatografische injectiespuit van 10 ml met een geharde naald.

4.

REAGENTIA

4.1.

Kaliumhydroxideoplossing, ongeveer 2 M in ethanol. Los 130 g kaliumhydroxide (minimumgehalte 85 %) onder koeling op in 200 ml gedistilleerd water en vul aan tot 1 liter met ethanol. Bewaar de oplossing in goed afgesloten flessen van donker glas.

4.2.

Ethylether, p.a.

4.3.

Natriumsulfaat, p.a., watervrij.

4.4.

Glazen dunne-laagplaten gecoat met kiezelgel zonder fluorescentie-indicator, met een dikte van 0,25 mm (deze zijn gebruiksklaar in de handel te verkrijgen).

4.5.

Kaliumhydroxideoplossing, 0,2 M in Methanol. Los 13 g kaliumhydroxide op in 20 ml gedistilleerd water en vul met methanol aan tot 1 liter.

4.6.

Benzeen, voor chromatografische doeleinden.

4.7.

Aceton, voor chromatografische doeleinden.

4.8.

Hexaan, voor chromatografische doeleinden.

4.9.

Ethylether, voor chromatografische doeleinden.

4.10.

Chloroform, p.a.

4.11.

Dunnelaagchromatografische referentieoplossing: cholesterol of fytosterol, 5 % oplossing in chloroform.

4.12.

2,7-dichloorfluoresceïne, 0,2 % oplossing in ethanol. Deze oplossing moet licht basisch worden gemaakt door toevoeging van enkele druppels 2 M alcoholische kaliumhydroxideoplossing.

4.13.

Pyridine, watervrij, voor chromatografische doeleinden.

4.14.

Hexamethyldisilazaan.

4.15.

Trimethylchloorsilaan.

4.16.

Standaardoplossingen van de trimethylsilylethers van de sterolen. Direct vóór gebruik te bereiden uit de zuivere sterolen of uit het mengsel van sterolen verkregen uit de oliën die deze sterolen bevatten.

4.17.

a-cholestanol, 0,2 % (m/v) oplossing in chloroform (interne standaard).

4.18.

Draaggas: waterstof of helium, gaschromatografisch zuiver.

4.19.

Hulpgassen:

- waterstof, gaschromatografisch zuiver,

- lucht, gaschromatografisch zuiver.

5.

WERKWIJZE

5.1.

Bereiding van het onverzeepbare residu.

5.1.1.

Breng in de kolf van 250 ml met behulp van de injectiespuit van 500 ml een hoeveelheid 0,2 % a-cholestanoloplossing in chloroform (4.17) die overeenkomt met ongeveer 10 % van de sterolfractie van het te onderzoeken monster. Bij voorbeeld: voeg voor 5 g monster 500 ml 0,2 % a-cholestanoloplossing toe indien het gaat om olijfolie en 1 500 ml indien het gaat om zaadoliën of olie uit afvallen van olijven.

Damp met behulp van een stikstofstroom droog en weeg vervolgens in dezelfde kolf nauwkeurig 5 g van het gedroogde gefiltreerde monster af.

Dierlijke of plantaardige oliën en vetten die een aanmerkelijke hoeveelheid cholesterol bevatten, kunnen een piek vertonen met dezelfde retentietijd als cholestanol. Is dit het geval dan moet de sterolfractie tevens zonder interne standaard worden geanalyseerd.

5.1.2.

Voeg 50 ml 2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing toe, bevestig de refluxkoeler en verhit tot zachtjes koken op een waterbad onder voortdurend krachtig schudden tot de verzeping heeft plaatsgevonden (de oplossing wordt helder). Verhit verder gedurende 20 minuten, voeg dan 50 ml gedistilleerd water toe via de bovenkant van de koeler, verwijder de koeler en laat de kolf afkoelen tot ongeveer 30 oC.

5.1.3.

Breng de inhoud van de kolf kwantitatief over in een 500 ml scheitrechter, waarbij de kolf meerdere keren wordt gespoeld met gedistilleerd water tot in totaal ongeveer 50 ml. Voeg ongeveer 80 ml ethylether toe, schud krachtig gedurende ongeveer 30 seconden en laat uitzakken (zie opmerking 1).

Tap de waterige onderlaag af en vang deze op in een tweede scheitrechter. Herhaal de extractie van de waterlaag twee keer op dezelfde manier en gebruik hierbij telkens 60-70 ml ethylether.

Opmerking 1: Eventuele emulsies kunnen worden vernietigd door met een pipet kleine hoeveelheden ethylalcohol of methylalcohol toe te voegen.

5.1.4.

Verzamel de etherextracten in een scheitrechter en was met telkens 50 ml gedistilleerd water tot het waswater neutraal reageert.

Verwijder het waswater, droog met watervrij natriumsulfaat en filtreer over watervrij natriumsulfaat in een van tevoren gewogen 250 ml kolf, was de trechter en het filter na met kleine hoeveelheden ethylether.

5.1.5.

Distilleer de ether tot op enkele ml af, droog door toepassing van een kleine onderdruk of in een stikstofstroom, voltooi het droogproces in een oven bij 100 oC gedurende ongeveer een kwartier, laat afkoelen in een exsiccator en weeg.

5.2.

Scheiding van de sterolfractie.

5.2.1.

Bereiding van de basische platen: dompel de kiezelgelplaten (4.4) gedurende 10 seconden volledig in de 0,2 M ethanolische kaliumhydroxideoplossing, laat de platen gedurende 2 uur in een zuurkast drogen en plaats ze ten slotte gedurende 1 uur in een stoof bij 100 oC.

Verwijder de platen uit de stoof en bewaar ze tot het moment van gebruik in een met calciumchloride gevulde exsiccator (de op deze manier bereide platen moeten binnen 2 weken worden gebruikt).

Opmerking 2: Bij gebruik van basische-kiezelgelplaten voor de scheiding van de sterolfractie is de behandeling van het onverzeepbare residu met aluminiumoxide niet nodig. Met deze werkwijze worden alle zure stoffen (vetzuren en andere) vastgehouden op de startlijn en is de sterolband duidelijk gescheiden van de band van de alifatische- en triterpeenalcoholen.

5.2.2.

Breng in de ontwikkeltank een mengsel van benzeen/aceton, 95 : 5 (v/v), tot een hoogte van ongeveer 1 cm. Als alternatief kan een mengsel van hexaan/ethylether, 65 : 35 (v/v), worden gebruikt. Sluit de tank af met een geschikt deksel en laat hem gedurende ongeveer een half uur staan zodat een vloeistof/dampevenwicht kan worden bereikt. Stroken filtreerpapier, hangend in de loopvloeistof, kunnen tegen de binnenkant van de tank worden bevestigd. Dit bekort de benodigde ontwikkeltijd met ongeveer een derde en zorgt tevens voor een meer uniforme en regelmatige elutie van de componenten.

Opmerking 3: Bij elke bepaling dient de loopvloeistof te worden ververst om volkomen reproduceerbare elutiecondities te verwezenlijken.

5.2.3.

Bereid een ongeveer 5 % oplossing van het onverzeepbare residu (5.1.5) in chloroform en breng hiervan met behulp van de 100 ml injectiespuit 0,3 ml aan op 2 cm van de zijkant van de chromatografische plaat (5.2.1) in een vloeiende lijn, die zo dun en uniform mogelijk moet zijn. Breng aan één eind van de plaat op dezelfde hoogte tevens 2-3 ml aan van de sterol-referentieoplossing (4.11) zodat de sterolband na de ontwikkeling kan worden geïdentificeerd.

5.2.4.

Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient te liggen tussen 15 oC en 20 oC. Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete luchtstroom of door de plaat gedurende korte tijd in een zuurkast te zetten.

5.2.5.

Besproei de plaat licht en uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. De sterolband kan door bekijken onder ultraviolet licht worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte ligt als de vlek van de referentieoplossing. Markeer de grenzen van de band aan de zijkanten van de fluorescentie met een zwart potlood.

5.2.6.

Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in het gemarkeerde gebied af. Breng het afgeschraapte, fijngemaakte materiaal over in de filterkroes (3.7). Voeg 10 ml hete chloroform toe, meng zorgvuldig met de metalen spatel en filtreer onder vacuuem. Verzamel het filtraat in de afzuigkolf (3.8), verbonden aan de filterkroes.

Was het residu in de filterkroes drie maal met ethylether (telkens ongeveer 10 ml), vang het filtraat op in dezelfde kolf. Damp het filtraat in tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren gewogen 10 ml centrifugebuis (3.9), damp droog door voorzichtige verwarming in een zachte stikstofstroom, voeg enkele druppels aceton toe, damp weer droog, plaats de buis gedurende ongeveer 10 minuten in een oven bij 105 oC, laat afkoelen in een exsiccator en weeg.

Het in de centrifugebuis aanwezige materiaal is de sterolfractie.

5.3.

Bereiding van de trimethylsilylethers.

5.3.1.

Voeg aan de in de centrifugebuis aanwezige sterolfractie een hoeveelheid silyleringsreagens toe, bestaande uit een mengsel van pyridine/hexamethydisilazaan/trimethylchloorsilaan 9 : 3 : 1 (v/v/v) (zie opmerking 4), waarbij voor elke mg sterol 50 ml wordt toegevoegd. Vermijd hierbij bevochtiging (zie opmerking 5).

Opmerking 4: Deze oplossing is kant en klaar in de handel verkrijgbaar. Andere silyleringsreagentia zijn ook bruikbaar, zoals bij voorbeeld bistrimethylsilyltrifluoaceetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, hetgeen moet worden verdund met een gelijk volume watervrije pyridine.

5.3.2.

Sluit de centrifugebuis, schud voorzichtig (zonder de buis om te draaien) tot de sterolen volledig zijn opgelost. Laat ten minste 15 minuten staan bij kamertemperatuur en centrifugeer enkele minuten. De heldere oplossing is gereed voor de gaschromatografische analyse.

Opmerking 5: De lichte opaalachtige weerschijn die kan worden gevormd, is normaal en veroorzaakt geen storing. De vorming van witte vlokken of de verschijning van een roze kleur zijn aanwijzingen voor de aanwezigheid van vocht of van veroudering van het reagens. In deze gevallen moet opnieuw worden begonnen.

5.4.

Gaschromatografische analyse.

5.4.1.

Voorbereidende werkzaamheden, conditionering van de kolom.

5.4.1.1.

Bevestig de kolom in de gaschromatograaf, waarbij het inlaatstuk wordt aangesloten aan het splitsysteem en het uiteinde aan de detector.

Voer de gebruikelijke controle uit van het gaschromatografische systeem (lekken in de gasvoorziening, detectorefficiëntie, efficiëntie van het splitsysteem en van het recordersysteem, enz.).

5.4.1.2.

Indien de kolom voor de eerste keer wordt gebruikt, dient hij geconditioneerd te worden. Laat een kleine gasstroom door de kolom gaan, zet de gaschromatografische eenheid aan en verwarm geleidelijk tot een temperatuur van ten minste 20 oC boven de bij de analyse gebruikelijke temperatuur (zie opmerking 6). Houd deze temperatuur aan gedurende ten minste 2 uur, stel vervolgens de hele apparatuur in gebruik (regeling van de gassnelheid en het splitsysteem, ontsteking van de vlam, aansluiting van de elektronische recorder, regeling van de temperatuur van de kolomruimte, de detector en de injector, enz.) en registreer het signaal met een gevoeligheid die ten minste twee keer groter is dan gebruikelijk bij de analyse. De basislijn moet lineair zijn, zonder enige piek en mag niet verlopen.

Een rechtlijnig negatief verloop vormt een indicatie voor lekkage bij de kolomverbindingen; een positief verloop wijst op een onvoldoende uitgevoerde conditionering van de kolom.

Opmerking 6: De temperatuur van het conditioneren moet altijd ten minste 20 oC lager zijn dan de maximumtemperatuur die voor de gebruikte stationaire fase is aangegeven.

5.4.2.

Keuze van de werkomstandigheden.

5.4.2.1.

Als richtlijn voor de werkomstandigheden kunnen de volgende waarden dienen:

- kolomtemperatuur: 260 oC p5 oC;

- injectietemperatuur: 280 oC;

- detectortemperatuur: 290 oC;

- lineaire snelheid van het draaggas: helium 20-35 cm/s, waterstof 30-50 cm/s;

- splitverhouding: van 1 : 50 tot 1 : 100;

- gevoeligheid: 4 tot 16 keer de minimumverzwakking;

- gevoeligheid van de recorder: 1-2 mV volle schaaluitslag;

- papiersnelheid: 30-60 cm/uur;

- injectiehoeveelheid: 0,5-1 ml TMSE-oplossing.

Deze richtlijnen dienen afhankelijk van de karakteristieken van de kolom en de gaschromatograaf zodanig te worden gekozen dat chromatogrammen worden verkregen die aan de volgende eisen voldoen:

- de retentietijd van b-sitosterol moet ongeveer 20 p5 minuten zijn;

- de campesterolpiek moet de volgende grootte hebben: voor olijfolie (gemiddeld gehalte 3 %) 15

p5 % volle schaaluitslag, voor sojaolie (gemiddelde gehalte 20 %) 80 p10 % volle schaaluitslag;

- alle aanwezige sterolpieken moeten gescheiden zijn. Daarnaast moeten andere pieken voldoende gescheiden zijn, dat wil zeggen dat het signaal tussen pieken volledig naar de basislijn moet terugkeren. Onvolledige scheiding kan echter getolereerd worden mits de piek met een relatieve retentietijd van 1,02 met behulp van een loodlijn kan worden gekwantificeerd.

5.4.3.

Bepaling.

5.4.3.1.

Zuig in de 10 ml injectiespuit 1 ml hexaan, o,5 ml lucht en ten slotte 0,5-1,0 ml monsteroplossing. Trek de plunjer van de spuit zover uit dat de naald leeg is. Penetreer met de naald het membraan van de injectie-eenheid en injecteer snel na 1-2 seconden, verwijder daarna voorzichtig na ongeveer 5 seconden de naald.

5.4.3.2.

Neem het chromatogram op tot alle aanwezige TMSE-sterolen volledig zijn geëlueerd.

De basislijn moet blijven voldoen aan de vereiste kwalificaties (5.4.1.2).

5.4.4.

Identificatie van de pieken.

Identificeer de individuele pieken op basis van de retentietijden en door een vergelijking met mengsels van TMSE-sterolen die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd.

De sterolen worden geëlueerd in de volgorde: cholesterol, brassicasterol, 24-methyleencholesterol, campesterol, campestanol, stigmasterol, D7-campesterol, D5,23-stigmastadienol, clerosterol, b-sitosterol, sitostanol, D5-avanesterol, D5,24-stigmastadienol, D7-stigmastenol, D7-avenasterol.

In tabel I worden de relatieve retentietijden ten oprichte van sitosterol opgegeven voor SE 52- en SE 54-kolommen.

In de figuren 1 en 2 worden typische chromatogrammen getoond voor enkele oliën.

5.4.5.

Berekening.

5.4.5.1.

Bereken met de integrator de oppervlakten van de a-cholestanol en de sterolpieken. Houd geen rekening met pieken van stoffen die niet op de lijst van tabel I voorkomen. De responsfactor van a-cholestanol wordt op 1 gesteld.

5.4.5.2.

Bereken de concentratie van elk individueel sterol in mg/100 g vethoudend materiaal als volgt:

sterol x = Ax . ms . 100

sterol x =

Ax · ms · 100

As · m

waarin:

Ax = piekoppervlak van sterol x, in integratoreenheden;

As

=

piekoppervlak van á-cholestanol, in integratoreenheden;

ms

=

hoeveelheid van het toegevoegde á-cholestanol, in milligram;

m

=

hoeveelheid van het onderzochte monster, in gram.

6.

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1.

Geef de gehaltes van de individuele sterolen op in mg/100 g vethoudend materiaal en hun som als "totaal sterolen".

6.2.

Het percentage van elk individueel sterol wordt berekend door de verhouding te bepalen tussen het betrokken piekoppervlak en de som van de piekoppervlakken van de sterolen:

% van sterol × = Ax · 100

% van sterol × =

Ax · 100

ÓA

waarin:

Ax = piekoppervlak van sterol ×;

ÓA

=

som van de piekoppervlakken van alle sterolen.

AANHANGSEL Bepaling van de lineaire snelheid van het draaggas

Injecteer 1-3 ml methaan (of propaan) in de onder normale omstandigheden werkende gaschromatograaf en meet de tijd die deze stof nodig heeft om door de kolom te gaan vanaf het moment van injectie tot het verschijnen van de piek (tM).

De lineaire snelheid van het draaggas in cm/s wordt gegeven door L/tM, waarbij L de lengte is van de kolom in centimeters en tMde gemeten tijd in seconden.

Tabel I

Relatieve retentietijden voor de sterolen

AE-5,23-Stigmastadienol

Piek

Identificatie

Relatieve retentietijd

SE

54-kolom

SE

52-kolom

1

cholesterol

D5-cholesteen-3b-ol

0,67

0,63

2

cholestanol

5a-cholestaan-3b-ol

0,68

0,64

3

brassicasterol

[24S]-24-methyl9D>D5,22-cholestadieen-3b-ol

0,73

0,71

4

24-methyleen-cholesterol

24-methyleen9D>D5,24-cholestadieen-3b-ol

0,82

0,80

5

campesterol

[24R]-24-methyl9D>D5-cholesteen-3b-ol

0,83

0,81

6

campestanol

[24R]-24-methyl-cholestaan-3b-ol

0,85

0,82

7

stigmasterol

[24S]-24-ethyl9D>D5,22-cholestadieen-3b-ol

0,88

0,87

8

D7-campesterol

[24R]-24-methyl9D>D7-cholesteen-3b-ol

0,93

0,92

9

D5,23-stigmastadienol

[24R,S]-24-ethyl9D>D5,23-cholestadieen-3b-ol

0,95

0,95

10

chlerosterol

[24S]-24-ethyl9D>D5,25-cholestadieen-3b-ol

0,96

0,96

11

b-sitosterol

[24R]-24-ethyl9D>D5-cholesteen-3b-ol

1,00

1,00

12

sitostanol

24-ethyl-cholestaan-3b-ol

1,02

1,02

13

D5-avenasterol

[24Z]-24-ethylideen-5-cholesteen-3b-ol

1,03

1,03

14

D5,24-stigmastadienol

[24S,R]-24-ethyl9D>D5,24-cholestadieen-3b-ol

1,08

1,08

15

D7-stigmastenol

[24R,S]-24-ethyl9D>D7,24-cholesteen-3b-ol

1,12

1,12

16

D7-avenasterol

[24Z]-24-ethylideen9D>D7-cholesteen-3b-ol

1,16

1,16

De capillaire gaschromatografische bepaling van erythrodiol en uvaol, welke dezelfde sterolanalyse gebruikt, wordt momenteel door de NGD gepubliceerd.

BIJLAGE VI

BEPALING VAN HET GEHALTE AAN ERYTHRODIOL EN UVAOL OPMERKING VOORAF

Erythrodiol (onder deze term verstaat men gewoonlijk het geheel van diolen, erythrodiol en uvaol samen) is een bestanddeel van het onverzeepbare residu, en is kenmerkend voor bepaalde vetstoffen. De concentratie ervan is beduidend hoger in olijfolie vervaardigd door extractie dan in de andere soorten olie waarin het voorkomt (koudgeperste olijfolie, druivepittenolie), en daarom kan door bepaling ervan de aanwezigheid van door extractie verkregen olijfolie worden aangetoond.

1.

DOEL

De methode beschrijft de werkwijze voor de bepaling van erythrodiol in vetstoffen.

2.

PRINCIPE VAN DE METHODE

De vetstof wordt verzeept met een ethanolische kaliumhydroxideoplossing, waarna het onverzeepbare residu wordt geëxtraheerd met diëthylether en wordt gezuiverd door passage over een kolom met aluminiumoxide.

Het onverzeepbare residu wordt gefractioneerd met behulp van kiezelgel dunne-laagchromatografie en de band van de sterolfractie en die van de erythrodiolfractie worden afgezonderd. De van de dunne-laagplaat verzamelde sterolen en erythrodiol worden omgezet in trimethylsilylethers en het mengsel wordt via gaschromatografie kwantitatief bepaald. Het resultaat wordt uitgedrukt als percentage van erythrodiol in de totale hoeveelheid erythrodiol en sterolen.

3.

APPARATUUR

3.1.

Dezelfde apparatuur als die welke is beschreven in bijlage V (bepaling van de sterolfractie).

4.

REAGENTIA

4.1.

Dezelfde reagentia als die welke zijn beschreven in bijlage V (bepaling van de sterolfractie).

4.2.

Referentieoplossing van erythrodiol 0,5 % in chloroform.

5.

WERKWIJZE

5.1.

Bereiding van het onverzeepbare residu

Men gaat te werk zoals beschreven in paragraaf 5.1.2 van bijlage V.

5.2.

Scheiding van de erythrodiol- en de sterolfractie.

5.2.1.

Zie paragraaf 5.2.1 van methode C-51.

5.2.2.

Zie paragraaf 5.2.2 van vorengenoemde methode.

5.2.3.

Bereid een 5 % oplossing van het onverzeepbare residu in chloroform. Breng van deze oplossing met behulp van de 0,1 ml injectiespuit 0,3 ml aan op ongeveer 1,5 cm van de benedenrand van de chromatografische plaat in een vloeiende lijn die zo dun en uniform mogelijk moet zijn. Breng aan één kant van de plaat tevens enkele microliter van de cholesterol- en erythrodioloplossingen aan als referentie.

5.2.4.

Plaats de plaat in de volgens 5.2.2 voorbehandelde ontwikkeltank. De omgevingstemperatuur dient ongeveer 20 oC te bedragen. Sluit de tank onmiddellijk af met het deksel en laat elueren tot het vloeistoffront tot ongeveer 1 cm van de bovenkant van de plaat is gekomen. Verwijder de plaat uit de tank en laat de loopvloeistof verdampen in een hete luchtstroom.

5.2.5.

Besproei de plaat uniform met de 2,7-dichloorfluoresceïneoplossing. Door bekijken onder ultraviolet licht kunnen de sterolband en de erythrodiolband worden geïdentificeerd aangezien deze op dezelfde hoogte liggen als de referentievlek. Markeer met een punt iets buiten de zijkanten van de fluorescentie.

5.2.6.

Schraap met een metalen spatel de kiezelgel in de gemarkeerde gebieden af. Breng het afgeschraapte materiaal in de afzuigkolf van 50 ml; voeg 15 ml hete chloroform toe, schud goed en filter op de filterkroes door de kiezelgel op het filter te leggen. Was het residu driemaal met hete chloroform (telkens ongeveer 10 ml), en vang het filtraat op in een glazen kolf van 100 ml. Damp het filtraat in tot een volume van 4-5 ml, breng de resterende oplossing over in de van tevoren getarreerde 10 ml konisch afgeronde centrifugebuis, damp droog door voorzichtige verwarming in een stikstofstroom, en weeg.

5.3.

Bereiding van trimethylsilylethers

Ga te werk zoals is beschreven in punt 5.3 van bijlage V.

5.4.

Gaschromatografische analyse

Ga te werk zoals beschreven in punt 5.4 van bijlage V. De werkwijze van de gaschromatografische analyse moet zodanig zijn dat niet alleen aan de eisen voor de bepaling van de sterolen wordt voldaan, maar dat ook een scheiding van TMSE van het erythrodiol en van het uvaol wordt verkregen.

Injecteer de monsteroplossing en laat het papier draaien totdat de aanwezige sterolen, erythrodiol en uvaol zijn geëlueerd; identificeer vervolgens de pieken (de retentietijden van erythrodiol en uvaol zijn circa 1,45, respectievelijk 1,55 maal groter dan die van B-sitosterol) en bereken de oppervlakten ervan zoals aangegeven voor de sterolen.

6.

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Erythrodiol, % = A1 + A2 + ÓA · 100

Erythrodiol, % =

A1 + A2

A1 + A2 + ÓA

· 100

waarin:

A1 = piekoppervlak van erythrodiol, in vierkante millimeter;

A2

= piekoppervlak van uvaol, in vierkante millimeter;

ÓA

= som van de piekoppervlakten van de aanwezige sterolen, in vierkante millimeter.

Het resultaat wordt uitgedrukt tot op éen cijfer achter de komma.

BIJLAGE VII

BEPALING VAN VETZUREN OP DE 2-POSITIE IN TRIGLYCERIDEN VAN OLIËN EN VETTEN 1.

DOEL

Deze norm beschrijft een methode voor de bepaling van de samenstelling van de vetzuurfractie van een olie of vet, veresterd op de 2-positie van glycerol.

2.

TOEPASSINGSGEBIED

Deze norm geldt voor oliën en vetten met een smeltpunt onder 45 oC ten gevolge van de specifieke kenmerken van de werking van pancreaslipase.

Ze geldt niet onvoorwaardelijk voor oliën en vetten die aanzienlijke hoeveelheden bevatten van: vetzuren met 12 of minder koolstofatomen (kokosnootolie en palmpitolie, botervet) of sterk onverzadigde vetzuren (met meer dan vier dubbele bindingen) die 20 of meer koolstofatomen bevatten (visolie en olie van zeedieren) of vetzuren die andere geoxygeneerde groepen dan de zuurgroep bevatten.

3.

PRINCIPE

Mogelijke neutralisering van zure oliën en vetten in een oplosmiddel. Zuivering door op een aluminiumoxidekolom te brengen. Gedeeltelijke hydrolyse van triglyceriden met pancreaslipase gedurende een bepaalde tijd. Afscheiding van de gevormde monogleriden door dunne-laagychromatografie en methanolyse van deze monoglyceriden. Analyse van deze methylesters door gas/vloeistofchromatografie.

4.

APPARATUUR

4.1.

Rondbodemkolf van 100 ml.

4.2.

Rondbodemkolf van 25 ml, met geslepen stop.

4.3.

1 m lange luchtcondensator voor kolf 4.2.

4.4.

Kolf van 250 ml.

4.5.

Bekerglas van 50 ml.

4.6.

Scheitrechter van 500 ml.

4.7.

Glazen chromatografiekolom over 13 mm invoerdiameter en 400 mm lang, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan.

4.8.

Centrifugebuis van 10 ml, met ingeslepen glazen stop.

4.9.

Buret van 5 ml met schaalindeling van 0,05 ml.

4.10.

Hypodermische injectiespuit van 1 ml met dunne naald.

4.11.

Micro-injectiespuit waaruit druppels van 3-4 mm/l komen.

4.12.

Uitstrijkapparaat voor dunne-laagchromatografie.

4.13.

Glazen platen voor dunne-laagchromatografie, 20 × 20 cm.

4.14.

Glazen ontwikkeltank voor dunne-laagchromatografie, met een deksel van geslepen glas, geschikt voor platen van 20 × 20 cm.

4.15.

1Spray voor dunne-laagchromatografie.

4.16.

Oven afgesteld op 103 p 2 oC.

4.17.

Thermostaat regelbaar tussen 30 en 45 oC, tot op 0,5 oC nauwkeurig.

4.18.

Rotatie-vacuuemverdamper.

4.19.

Vibrerend elektrisch schudapparaat, waarmee de centrifugebuis krachtig kan worden geschud.

4.20.

Ultravioletlamp voor onderzoek van de dunne-laagplaten.

En voor de controle van de lipaseactiviteit:

4.21.

pH-meter.

4.22.

Spiraalvormig roerstaafje.

4.23.

Buret van 5 ml.

4.24.

Stopwatch.

En voor de eventuele bereiding van lipase:

4.25.

Laboratoriumschudapparaat, geschikt voor de dispersie en menging van heterogene materialen.

5.

REAGENTIA

5.1.

n-Hexaan of bij gebreke daarvan petroleumether (kookpunt 30-50 oC), chromatografische kwaliteit.

5.2.

2-Propanol of ethanol, 95 % (v/v), p.a.

5.3.

2-Propanol of ethanol, l/l oplossing in water.

5.4.

Diëthylether, vrij van peroxiden.

5.5.

Aceton.

5.6.

Mierezuur, ten minste 98 % (m/m).

5.7.

Ontwikkelvloeistof: mengsel van n-hexaan (5.1), diëthylether (5.4) en mierezuur (5.6) in verhoudingen 70/30/1 (v/v/v).

5.8.

Geactiveerd aluminiumoxide voor chromatografische doeleinden, neutraal, kwaliteit Brockmann I.

5.9.

Siliciumdioxidepoeder met bindmiddel, geschikt voor dunne-laagchromatografie.

5.10.

Pancreaslipase van geschikte kwaliteit (zie de opmerkingen 1 en 2).

5.11.

Natriumhydroxide, 120 g/l oplossing in water.

5.12.

Zoutzuur 6 N oplossing in water.

5.13.

Calciumchloride (CACl2), 220 g/l oplossing in water.

5.14.

Natriumcholaat, voor enzymatische doeleinden, 1 g/l oplossing in water.

5.15.

Bufferoplossing: 1 M oplossing in water van trishydroxymethylaminomethaan wordt op pH 8 gebracht door toevoeging van zoutzuur (5.12) (potentiometrisch te controleren).

5.16.

Phenolphtaleïne, 10 g/l oplossing in 95 % ethanol (v/v).

5.17.

2,7-dichloorfluoresceïne, 2 g/l oplossing in 95 % ethanol (v/v), licht alkalisch gemaakt door toevoeging van één druppel 1 N-natriumhydroxideoplossing per 100 ml.

En voor de controle van de lipasewerking:

5.18.

Geneutraliseerde olie.

5.19.

Natriumhydroxide, 0,1 N waterige oplossing.

5.20.

Natriumcholaat voor enzymatische doeleinden, 200 g/l oplossing in water.

5.21.

Arabische gom, 100 g/l oplossing in water.

6.

BEREIDING VAN HET MONSTER

Indien het monster een zuurgraad heeft van minder dan 3 %, bepaald overeenkomstig bijlage II: direct zuiveren over aluminiumoxide overeenkomstig punt 6.2.

Indien het monster een zuurgraad heeft van meer dan 3 %, bepaald overeenkomstig bijlage II: neutraliseren met alkali in aanwezigheid van een oplosmiddel (6.1), dan brengen op aluminiumoxide (6.2).

6.1.

Neutralisering met alkali in aanwezigheid van een oplosmiddel

Breng in een scheitrechter (4.6) ongeveer 10 g ruwe olie en voeg 100 ml hexaan (5.1) toe, 50 ml 2-propanol (5.2), enkele druppels phenolphtaleïneoplossing (5.16) en een hoeveelheid van de natriumhydroxideoplossing (5.11) die overeenkomt met de vrije zuurgraad van de olie plus 0,3 % overmaat. Schud krachtig gedurende één minuut, voeg 50 ml gedistilleerd water toe, schud opnieuw en laat bezinken.

Laat, na scheiding van de lagen, de onderste laag met de zepen weglopen. Verwijder tevens mogelijke intermediaire lagen (slijmachtige en onopgeloste stoffen). Was de hexaanoplossing van de geneutraliseerde olie met opeenvolgende porties van 25-30 ml van de 2-propanoloplossing (5.3) tot de roze kleur van de phenolphtaleïne verdwijnt. Verwijder het merendeel van het hexaan door destillatie onder vacuuem in de rotatievacuuemverdamper (4.18), droog de olie bij 30-40 oC onder vacuuem met behulp van een stroom zuivere stikstof tot de hexaan volledig is verwijderd.

6.2.

Zuivering met aluminiumoxide.

Bereid een oplossing van 15 g geactivieerd aluminiumoxide (5.8) in 50 ml hexaan (5.1) en giet het, al roerend, op de chromatografiekolom (4.7). Laat het aluminiumoxide gelijkmatig bezinken en laat het niveau van het oplosmiddel dalen tot 1-2 mm boven de absorbent. Giet zorgvuldig een oplossing van 5 g olie in 25 ml hexaan (5.1) op de kolom, verzamel het volledige effluent van de kolom in een rondbodemkolf (4.1).

7.

KLAARMAKEN VAN DE CHROMATOGRAFISCHE PLATEN

Reinig de glazen platen (4.13) grondig met ethanol, petroleumether en aceton ten einde alle vetsporen te verwijderen.

Plaats in een kolf (4.4) 30 g siliciumdioxidepoeder (5.9). Voeg 60 ml gedistilleerd water toe. Plaats de stop erop en schud krachtig gedurende één minuut. Breng de massa onmiddellijk over op het uitstrijkapparaat (4.12) en bedek de zuivere platen met een 0,25 mm dikke laag.

Droog de platen gedurende 15 minuten aan de lucht en daarna gedurende een uur in de oven (4.16) bij 103 p 2 oC. Koel de platen in een droogstoof tot kamertemperatuur vóór gebruik.

Klaargemaakte platen zijn in de handel beschikbaar.

8.

WERKWIJZE

8.1.

Hydrolyse met pancreaslipase.

Weeg in de centrifugebuis (4.8) ongeveer 0,1 g van het bereide monster; indien het monster een vloeibare olie is, ga dan direct te werk als hieronder vermeld; indien het een vast vet is dan moet het worden opgelost in 0,2 ml hexaan (5.1) met zonodig voorzichtige verwarming.

Voeg 20 mg lipase (5.10) en 2 ml bufferoplossing (5.15) toe. Schud goed maar zorgvuldig en voeg 0,5 ml natriumcholaatoplossing (5.14) toe en 0,2 ml calciumchlorideoplossing (5.13). Sluit de buis met de geslepen stop, schud voorzichtig (vermijd natmaken van de stop) en plaats de buis onmiddellijk in het thermostaatbad (4.17) dat op 40 p 0,5 oC wordt gehouden en schud met de hand gedurende precies één minuut.

Haal de buis uit het thermostaatbad en schud krachtig door middel van het elektrisch schudapparaat (4.19) gedurende precies twee minuten.

Koel onmiddellijk af onder stromend water; voeg 1 ml zoutzuur (5.12) en 1 ml diëthylether (5.4) toe. Plaats de stop erop en meng krachtig door middel van het elektrisch schudapparaat. Laat staan en verwijder de organische laag met de injectiespuit (4.10), zonodig na centrifugering.

8.2.

Scheiding van de monoglyceriden door dunne-laagchromatografie.

Breng het extract met de micro-injectiespuit (4.11) aan op de chromatografische plaat, ongeveer 1,5 cm van de benedenrand in een dunne, uniforme lijn, zo smal mogelijk. Plaats de plaat in de goed verzadigde ontwikkeltank (4.14) en ontwikkel met de ontwikkelvloeistof (5.7) bij ongeveer 20 oC tot ongeveer 1 cm van de bovenrand van de plaat.

Droog de plaat aan de lucht bij de temperatuur van de vloeistoftank en besproei ze met 2,7-dichloorfluoresceïne-oplossing (5.17). Markeer de plaats (band) van de monoglyceriden (Rf ongeveer 0,035) onder UV-licht (4.20).

8.3.

Analyse van de monoglyceriden met gas/vloeistofchromatografie.

Verwijder de onder 8.2 verkregen band met een spatel (vermijd daarbij meenemen van stoffen die op de basislijn zijn achtergebleven) en breng deze over in de methyleringskolf (4.2).

Behandel het verkregen siliciumdioxide direct volgens de in bijlage X.B vermelde methodes ten einde de monoglyceriden om te zetten in methylesters en daarna de esters te onderzoeken met gaschromatografie zoals beschreven in bijlage X.A.

9.

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Bereken de samenstelling van de vetzuren op de 2-positie tot op één cijfer achter de komma (zie opmerking 3).

10.

OPMERKINGEN

Opmerking 1: Controle van de activiteit van het lipase

Bereid een olie-emulsie door in een geschikte mixer een mengsel te schudden van 165 ml van een oplossing van arabische gom (5.21), 15 g ijsschilfers en 20 ml geneutraliseerde olie (5.18).

Breng 10 ml van deze emulsie in een bekerglas (4.5), voeg hieraan 0,3 ml natriumcholaatoplossing (5.20) en 20 ml gedistilleerd water toe.

Plaats het bekerglas in een waterbad, gethermostatiseerd op 37 p0,5 oC (zie opmerking 4), en breng de elektroden van een pH-meter (4.21) en een roerstaafje (4.22) in.

Voeg vervolgens door middel van een buret (4.23) druppel voor druppel de natriumhydroxideoplossing (5.19) toe, tot een pH van 8,5 is bereikt.

Voeg een voldoende hoeveelheid van een lipaseoplossing in water (zie hieronder) toe. Zodra de pH-meter een pH van 8,3 aangeeft, de stopwatch starten (4.24) en druppelsgewijs de natriumhydroxideoplossing (5.19) toevoegen met een zodanige snelheid dat de pH op 8,3 blijft. Noteer elke minuut het verbruikte volume alkalioplossing.

Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij op de x-as de tijd wordt aangegeven en op de y-as het volume verbruikte alkalioplossing om de pH constant te houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn.

De hierboven genoemde lipasesuspensie is een suspensie van 1 per 1 000 (m/m) in water. Voor elke test dient voldoende van deze suspensie te worden gebruikt, zodat ongeveer 1 ml van de alkalioplossing in vier tot vijf minuten wordt verbruikt. Meestal is ongeveer 1-5 mg van het poeder nodig. De lipase-eenheid wordt gedefineerd als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 meq zuur vrijmaakt. Dan wordt de activiteit A van het gebruikte poeder, uitgedrukt in lipase-eenheden per milligram, berekend aan de hand van de formule:

Opmerking 1: A = V · 10

A =

V · 10

m

waarin:

V = het volume natriumhydroxideoplossing (5.19) verbruikt per minuut (berekend uit de grafiek);

m

=

de hoeveelheid onderzochte lipase, in milligram, van het poedermonster

Opmerking 2: Bereiding van lipase

Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel verkrijgbaar, maar kan ook in het laboratorium als volgt worden bereid:

Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 oC, verwijder al het omgevende vet en bindweefsel en verklein het restant in een kogelmolen met fijne messen tot een vloeibare pasta is overgebleven. Meng deze pasta met het roerstaafje (4.25) gedurende vier tot zes uur, samen met 2,5 liter watervrij aceton, en centrifugeer. Extraheer het residu nog driemaal met hetzelfde volume aceton, dan tweemaal met een l/l (v/v) mengsel van aceton en diëthylether en ten slotte tweemaal met diëthylether.

Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuuem; hierdoor wordt een stabiel poeder verkregen dat in een koelkast dient te worden opgeslagen.

Opmerking 3: Het is in ieder geval aan te raden de samenstelling te bepalen van het totaal aan vetzuren van hetzelfde monster, aangezien de vergelijking met de samenstelling van de zuren op de 2-positie nuttig is voor interpretatie van de verkregen cijfers.

Opmerking 4: De hydrolysetemperatuur is vastgesteld op 37 oC omdat een vloeibare olie wordt gebruikt. Ze wordt evenwel op 40 oC gebracht voor het monster om het onderzoek van vetten met smeltpunten tot 45 oC mogelijk te maken.

BIJLAGE VIII

BEPALING VAN HET GEHALTE VAN TRILINOLEÏNE 1.

DOEL

Deze norm beschrijft een methode voor de scheiding en de kwantitatieve bepaling van de triglyceridensamenstelling van plantaardige oliën, aan de hand van hun molecuulgewicht, en het aantal dubbele bindingen, uitgedrukt in hun equivalent koolstofgetal (zie opmerking 1).

2.

TOEPASSINGSGEBIED

Deze norm geldt voor alle plantaardige oliën die triglyceriden bevatten van vetzuren met lange keten. De methode geldt in het bijzonder voor de opsporing van de aanwezigheid van kleine hoeveelheden halfdrogende oliën (rijk aan linolzuur) in plantaardige oliën die als overwegend onverzadigd vetzuur oliezuur bevatten, zoals olijfolie.

3.

PRINCIPE

Scheiding van triglyceriden, uitgedrukt in hun equivalent koolstofgetal met hoge-drukvloeistofchromatografie (omgekeerde vaste polariteit) en interpretatie van de chromatogrammen.

4.

APPARATUUR

4.1.

Hoge-drukvloeistofchromatograaf waarmee thermostatische controle van de kolomtemperatuur mogelijk is.

4.2.

Injectie-eenheid met een capaciteit van 10 mm/l.

4.3.

Detector: differentiële refractometer. De gevoeligheid bij volledige schaaluitslag dient ten minste 10-%-eenheid te zijn van de brekingsindex.

4.4.

Kolom: buis van roestvrij staal, 250 mm lang en met een binnendiameter van 4,5 mm, gepakt met siliciumdioxidedeeltjes van 5 mm diameter en met 22-23 % koolstof in de vorm van octadecylsilaan (zie opmerking 2).

4.5.

Recorder en/of integrator.

5.

REAGENTIA

De reagentia dienen p.a. te zijn. Elutievloeistoffen dienen ontgast te zijn en kunnen verschillende malen worden gerecycleerd zonder dat dit invloed heeft op de scheidingen.

5.1.

Chloroform.

5.2.

Aceton.

5.3.

Acetonitril.

5.4.

Elutievloeistof: acetonitril + aceton (verhoudingen moeten worden aangepast om de gewenste scheiding te verkrijgen; begin met een 50 : 50-mengsel).

5.5.

Oplosmiddel: aceton of 1 : 1 acetonchloroformmengsel.

5.6.

Referentieglyceriden: in de handel verkrijgbare triglyceriden (tripalmpitaat, triolaat, enz.) kunnen worden gebruikt en zo kunnen de retentietijden worden uitgezet tegen het equivalente koolstofgetal, of anders kan een met sojaolie verkregen referentiechromatogram worden opgesteld (zie opmerking 3 en 4 en de figuren 1 en 2).

6.

BEREIDING VAN MONSTERS

Een 5 % oplossing van de te analyseren monsters wordt bereid door het afwegen van 0,5 p0,001 g van het monster in een kolf met een schaalindeling van 10 ml en het bijvullen tot 10 ml met het oplosmiddel (5.5).

7.

WERKWIJZE

7.1.

Installeer het chromatografiesysteem. Pomp de elutievloeistof (5.4) op in een tempo van 1,5 ml/mm ten einde het volledige systeem te zuiveren. Wacht tot een stabiele basislijn wordt verkregen.

Injecteer 10 ml van het volgens punt 6 bereide monster.

8.

BEREKENING EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

Gebruik de methode met interne standaard, dat wil zeggen ga ervan uit dat de som van de piekoppervlakken voor de verschillende triglyceriden gelijk is aan 100 %. Bereken het relatieve percentage van elk triglyceride aan de hand van de formule:

% triglyceride = som van de piekoppervlakken × 100

% triglyceride =

piekoppervlak

som van de piekoppervlakken

× 100

waarbij het resultaat met één cijfer achter de komma wordt opgegeven.

Opmerking 1: De elutievolgorde kan worden bepaald door het berekenen van de equivalente koostofgetallen, dikwijls gedefinieerd met de vergelijking ECN = CN - 2n, waarin CN het koolstofgetal is en n het aantal dubbele bindingen; zij kan veel preciezer worden berekend door rekening te houden met de oorsprong van de dubbele binding. Indien no, n1 en n1n de aantallen dubbele bindingen zijn die respectievelijk worden toegeschreven aan oliezuur, linolzuur en linoleenzuur, kan het equivalent koolstofgetal worden berekend aan de hand van de formule:

ECN = CN - do no - d1 n1 - d1 n n1 n,

waarin de coëfficiënten do, d1 en d1n kunnen worden berekend door middel van de referentieglyceriden. Onder de in deze methode gespecificeerde voorwaarden zal de verkregen vergelijking dicht liggen bij:

ECN = CN - [2,60 no] - [2,35 n1] - [2,17 n1n].

Opmerking 2: Voorbeelden: Lichrosorb (Merck) RP 18 Art. 50333,

Lichrosphere (Merck) 100 CH 18 Art. 50377 of een soortgeijk produkt.

Opmerking 3: Met verschillende referentieglyceriden kan ook de resolutie ten opzichte van triolaat worden berekend

Opmerking 3: a = RTmoleaat

á =

RTm

RTmoleaat

door gebruik van de gereduceerde retentietijd RTm = RT - RT oplosmiddel

De grafiek van log á tegen f (aantal dubbele bindingen) maakt het mogelijk de retentiewaarden te bepalen voor alle triglyceriden van vetzuren in de referentietriglyceriden (zie figuur 2).

Opmerking 4: De efficiëntie van de kolom moet zodanig zijn dat de piek van LLL (trilinolaat) afkomstig van de triglyceriden duidelijk gescheiden is van de aangrenzende RT.

Monoglyceriden

en diglyceriden

P = palmitinezuur St = stearinezuur

P

= palmitinezuur

St

= stearinezuur

O = oliezuur

L

= linolzuur

Ln

= linoleenzuur

La = stearinezuur My = myristinezuur P

La

= laurinezuur

My

= myristinezuur

P

= palmitinezuur

St

= stearinezuur

O

= oliezuur

L

= linolzuur

Ln

= linoleenzuur

Aantal dubbele bindingen (n)

BIJLAGE IX

SPECTROFOTOMETRISCH ONDERZOEK IN HET ULTRAVIOLETTE GEBIED Opmerking vooraf

Spectrofotometrisch onderzoek in het ultraviolette gebied kan informatie verschaffen over de kwaliteit van een vet, de toestand van bewaring en veranderingen veroorzaakt door technologische processen.

De absorptie bij de in deze methode aangegeven golflengten wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van dubbele en drievoudig onverzadigde systemen. Deze absorpties worden uitgedrukt als de specifieke extincties E1cm;%(de extinctie van een 1 % oplossing van het vet in het aangegeven oplosmiddel, bij een optische weglengte van 1 cm), en worden volgens afspraak als K, ook extinctiecoëfficiënt genoemd, opgegeven.

1.

DOEL

Deze methode beschrijft de werkwijze voor de uitvoering van een spectrofotometrisch onderzoek van vetten in het ultraviolette gebied.

2.

PRINCIPE VAN DE METHODE

Het te onderzoeken vet wordt opgelost in het vereiste oplosmiddel, vervolgens wordt de extinctie bepaald bij de opgegeven golflengten ten opzichte van het zuivere oplosmiddel. De specifieke extincties worden uit de aflezingen van de spectrofotometer berekend.

3.

APPARATUUR

3.1.

Een spectrofotometer, geschikt voor metingen in het ultraviolette gebied tussen 220 en 360 nm, instelbaar tot op de nm nauwkeurig.

3.2.

Kwartscuvetten, met deksel, met een optische weglengte van 1 cm. Gevuld met water of een ander geschikt oplosmiddel mogen de cuvetten onderling geen verschillen vertonen groter dan 0,01 extinctie-eenheden.

3.3.

Maatkolven van 25 ml.

3.4.

Chromatografiekolom met een lengte van 450 mm en een doorsnede van 35 mm, voorzien van een overloopbuis met een doorsnede van ongeveer 10 mm.

4.

REAGENTIA

4.1.

Iso-octaan (2,2,4-trimethylpentaan), voor spectrofotometrische doeleinden: bij 220 nm moet dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie hebben van ten minste 60 % en bij 250 nm van ten minste 95 %, of

- cyclohexaan, voor spectrofotometrische doeleinden: bij 220 nm moet dit ten opzichte van gedistilleerd water een transmissie hebben van ten minste 40 % en bij 250 nm van ten minste 95 %, of

- een ander geschikt oplosmiddel, dat het vet volledig oplost (bij voorbeeld ethylalcohol voor ricinusolie).

4.2.

Aluminiumhydroxide, voor kolomchromatografische doeleinden, voorbehandeld en gecontroleerd zoals omschreven in aanhangsel I.

4.3.

Hexaan voor chromatografische doeleinden.

5.

WERKWIJZE

5.1.

Het te onderzoeken monster dient volledig homogeen te zijn en vrij van onzuiverheden. Oliën die bij kamertemperatuur vloeibaar zijn, worden over papier gefiltreerd bij een temperatuur van ongeveer 30 oC, vetten worden gehomogeniseerd en gefiltreerd bij een temperatuur die niet meer dan 10 oC boven het smeltpunt ligt.

5.2.

Weeg nauwkeurig ongeveer 0,25 g van het voorbehandelde monster af in een maatkolf van 25 ml, vul aan tot de streep met het aangegeven oplosmiddel en homogeniseer. De verkregen oplossing moet volmaakt helder zijn. Indien opalescentie of troebeling optreedt dient direct over papier te worden gefiltreerd.

5.3.

Vul een cuvet met deze oplossing en meet de extincties ten opzichte van het oplosmiddel bij geschikte golflengten tussen 232 en 276 nm.

De gemeten extinctiewaarden moeten tussen 0,1 en 0,8 liggen. Zo niet, dan moeten de metingen worden herhaald bij een aangepaste inweeg van het monster.

5.4.

Indien een meting van de specifieke extinctie is vereist na het doorlopen van de aluminiumoxidekolom, ga dan als volgt te werk. Breng in de chromatografiekolom 30 g aluminiumoxide in een hexaansuspensie. Verwijder, nadat de suspensie is uitgezakt, zoveel van de overmaat hexaan dat boven het aluminiumoxide nog ongeveer 1 cm hexaan staat. Los 10 g volgens punt 5.1 gehomogeniseerd en gefiltreerd vet op in 100 ml hexaan en giet de oplossing op de kolom. Verzamel het eluaat en verwijder het oplosmiddel onder vacuuem bij een temperatuur onder 25 oC. Met het aldus verkregen vet dient de bepaling onmiddellijk te worden voortgezet, zoals omschreven in punt 5.2.

6.

WEERGAVE VAN DE RESULTATEN

6.1.

Geef de specifieke extincties op, die bij de verschillende golflengten als volgt worden berekend:

Kl = c · s

Kl =

Eë

c · s

waarin:

Kë = specifieke extinctie bij golflengte ë,

Eë

=

extinctie, gemeten bij golflengte ë;

c

=

gehalte van de oplossing, in g/100 ml;

s

=

optische weglengte, in centimeter.

De resultaten dienen te worden opgegeven met twee cijfers achter de komma.

6.2.

Het spectrofotometrisch onderzoek van olijfolie volgens de officiële bij de EEG-Verordening voorgeschreven methode vereist de bepaling van de specifieke extinctie in een iso-octaan oplossing bij golflengten van 232 en 270 nm en de bepaling van de grootheid DK volgens de formule:

DK = Km - Km - 4 + Km + 4

DK = Km -

Km - 4 + Km + 4

2

waarin:

Km = de specifieke extinctie bij golflengte m, de golflengte van het absorptiemaximum bij ongeveer 270 nm.

AANHANGSEL I Bereiding van de aluminiumoxidekolom en het testen van de activiteit A.1.1.

Bereiding van de aluminiumoxidekolom

Breng in een hermetisch afsluitbare kolf een hoeveelheid aluminiumoxide, welke gedurende 3 uur in een oven bij een temperatuur van 380-400 oC is gedroogd, voeg per 100 g aluminiumoxide 5 ml gedistilleerd water toe, sluit de kolf onmiddellijk, schud regelmatig en laat vervolgens gedurende ten minste 12 uur staan alvorens dit te gebruiken.

A.1.2.

Controle op de activiteit van het aluminiumoxide

Vul een chromatografiekolom met 30 g aluminiumoxide. Ga hierbij te werk zoals omschreven in punt 5.4 en leid een mengsel door bestaande uit:

- 95 % koudgeperste olijfolie van eerste persing met een specifieke extinctie van minder dan 0,18 bij 268 nm,

- 5 % bij de raffinage met aarde behandelde aardnotenolie met een specifieke extinctie van ten minste 4,0 bij 268 nm.

Indien de door de kolom gelopen vloeistof een specifieke extinctie van ten minste 0,11 bij 268 nm heeft dan kan het aluminiumhydroxide worden gebruikt, zo niet dan moet het percentage water worden opgevoerd.

AANHANGSEL II IJking van de spectrofotometer A.2.

Het apparaat moet regelmatig (ten minste iedere 6 maanden) worden gecontroleerd op een correcte golflengteaanwijzing en op de nauwkeurigheid van de respons.

A.2.1.

De golflengte kan worden gecontroleerd met een kwiklamp of met geschikte filters.

A.2.2.

Ga, om de respons van de fotocel en de fotomultiplier te controleren, als volgt te werk: weeg 0,2000 g kaliumchromaat, voor spectrofotometrische doeleinden, af in een 1 000 ml maatkolf en los op in 0,05 M kaliumhydroxideoplossing en vul hiermee aan tot de streep. Pipetteer 25 ml van deze oplossing in een 500 ml maatkolf en vul aan tot de streep met dezelfe kaliumhydroxideoplossing.

Bepaal de extinctie van deze oplossing bij 275 nm, waarbij wordt gemeten tegen de kaliumhydroxideoplossing. De met een 1 cm cuvet gemeten extinctie moet 0,200 p 0,005 bedragen.

BIJLAGE X.A

GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN 1.

DOEL

Deze norm beschrijft de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatografische bepaling met gepakte of capillaire kolom van een mengsel van methylesters van vetzuren, verkregen volgens bijlage X.B.

Deze norm kan niet worden toegepast op gepolymeriseerde vetzuren.

2.

REAGENTIA

2.1.

Draaggas

Inert gas (stikstof, helium, argon, waterstof, enz.), zeer goed gedroogd en met een zuurstofgehalte kleiner dan 10 mg/kg.

Opmerking 1: Waterstof, dat uitsluitend als draaggas wordt gebruikt bij capillaire kolommen, kan de snelheid van de analyse verdubbelen, maar is gevaarlijk. Veiligheidsvoorzieningen zijn verkrijgbaar.

2.2.

Hulpgassen

2.2.1.

Waterstof (zuiverheid ten minste 99,9 %), vrij van organisch materiaal.

2.2.2.

Lucht of zuurstof, vrij van organisch materiaal.

2.3.

Standaardmengsel

Een mengsel van methylesters van zuivere vetzuren of de methylesters van een vetstof met bekende samenstelling, bij voorkeur met dezelfde vetzuursamenstelling als het te analyseren monster.

Zorg ervoor oxidatie van meervoudig onverzadigde vetzuren te voorkomen.

3.

APPARATUUR

De richtlijnen hebben betrekking op apparatuur die gewoonlijk wordt gebruikt bij gas/vloeistofchromatografie met een gepakte en/of capillaire kolom en een vlamionisatiedetector. Elk apparaat waarmee de efficiëntie en het scheidend vermogen zoals bepaald volgens en aangegeven in punt 4.1.2 kunnen worden bereikt, is geschikt.

3.1.

Gaschromatograaf

De gaschromatograaf dient te bestaan uit de volgende onderdelen:

3.1.1.

Injectiestuk

a) voor een gepakte kolom moet een injectiestuk worden gebruikt dat een zo klein mogelijke dode ruimte heeft (het injectiestuk moet kunnen worden verwarmd tot een temperatuur die 20 tot 50 oC hoger is dan die van de kolom);

b)

voor capillaire koloms dient een speciaal ontworpen injectiestuk te worden gebruikt. Dit injectiestuk mag van het splittype zijn of van het kolominjectortype.

Opmerking 2: Indien geen vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen aanwezig zijn, mag een beweegbare naaldinjector worden gebruikt.

3.1.2.

Oven

De oven moet de kolom tot ten minste 260 oC kunnen verwarmen en de gekozen temperatuur op 1 oC nauwkeurig kunnen aanhouden voor een gepakte kolom en op 0,1 oC voor een capillaire kolom. De laatstgenoemde voorwaarde is van bijzonder belang wanneer een fused-silica capillaire kolom wordt gebruikt.

Het verdient aanbeveling steeds temperatuur-geprogrammeerde gaschromatografie toe te passen, in het bijzonder voor vetzuren met minder dan 16 koolstofatomen.

3.1.3.

Gepakte kolom

3.1.3.1.

Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren verbindingen (dat wil zeggen glas of roestvrij staal), van de volgende afmetingen:

a) lengte: 1 tot 3 m. Er dient een relatief korte kolom te worden gebruikt als vetzuren met lange ketens (meer dan 20 C-atomen) aanwezig zijn. Voor de bepaling van C 4- en C 6-vetzuren wordt een kolom van twee meter aanbevolen;

b)

inwendige diameter: 2-4 mm.

Opmerking 3: In een roestvrij stalen kolom kunnen meervoudig onverzadigde componenten met meer dan drie dubbele bindingen zich ontleden.

Opmerking 4: Er mag een systeem met dubbele gepakte kolommen worden gebruikt.

3.1.3.2.

Pakking

a)

Drager: zuurgewassen, gesilaniseerde diatomeeënaarde of elke andere geschikte inerte drager met een korrelgrootte tussen 125 en 200 mm (onderlinge verschillen niet groter dan 25 mm), afhankelijk van de inwendige diameter en de lengte van de kolom.

b)

Stationaire fase: type polyester van polaire vloeistof (bij voorbeeld van diëthyleenglycolpolysuccinaat, butaandiolpolysuccinaat, ethyleenglycolpolyadipaat, enz.), cyaansiliconen of elke andere vloeistof die de vereiste chromatografische scheiding mogelijk maakt (zie punt 4). De stationaire fase moet ongeveer 5-20 % (m/m) van de pakking uitmaken. Voor bepaalde scheidingen kunnen apolaire stationaire fasen worden gebruikt.

3.1.3.3.

Conditionering van de kolom

Maak, indien mogelijk, de kolom los van de detector en verwarm de oven geleidelijk tot 185 oC; laat bij deze temperatuur gedurende ten minste 16 uur een stroom inert gas door de nieuwe kolom gaan met een snelheid van 20-60 ml/min. en bij 195 oC nog eens gedurende 2 uur.

3.1.4.

Capillaire kolom

3.1.4.1.

Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren verbindingen (gewoonlijk glas of fused silica). Inwendige diameter 0,2-0,8 mm. De binnenzijde dient een adequate behandeling te ondergaan (bij voorbeeld voorbehandeling van de oppervlakte, inactivering) voordat ze met de stationaire fase wordt gecoat. In de meeste gevallen is een kolom van 25 m voldoende.

3.1.4.2.

Stationaire fase: gewoonlijk van het type polyglycol (poly(ethyleenglycol) 20 000), polyester (butaandiolpolysuccinaat) of polair polysiloxaan (cyaansiliconen). Er mogen kruiselings verbonden kolommen worden gebruikt.

Opmerking 5: Polaire polysiloxanen kunnen moeilijkheden geven bij het identificeren en de scheiding van linoleenzuur en vetzuren van C20.

De coating moet dun zijn, dat wil zeggen 0,1-0,2 mm.

3.1.4.3.

Montage en conditionering van de kolom

Neem de gebruikelijke voorzorgen voor het monteren van capillaire kolommen, dat wil zeggen bevestiging van de kolom in de oven, keuze en montage van verbindingsstukken (lekken), plaatsing van de uiteinden van de kolom in de injector en de detector (beperking van dode ruimten). Leid een stroom van draaggas onder druk door de kolom (bij voorbeeld 0,3 bar (30 kPa) voor een kolom van 25 m lengte en een inwendige diameter van 0,3 mm).

Conditioneer de kolom door de temperatuur in de oven geprogrammeerd met 3 oC/min. te verhogen van de omgevingstemperatuur tot 10 oC onder de ontledingstemperatuur van de stationaire fase. Houd de oven gedurende 1 uur op deze temperatuur, tot stabilisatie van de basislijn. Verlaag de temperatuur tot 180 oC en werk onder isotherme omstandigheden.

Opmerking 6: In de handel zijn geschikte, reeds geconditioneerde kolommen verkrijgbaar.

3.1.5.

Detector

De detector moet bij voorkeur verwarmd kunnen worden tot een temperatuur die hoger is dan de kolomtemperatuur.

3.2.

Injectiespuit

Injectiespuit van maximaal 10 ml, met schaalverdeling in 0,1 ml.

3.3

Registratieapparatuur

Als de curve van de registratieapparatuur dient te worden gebruikt voor de berekening van de samenstelling van het geanalyseerde mengsel, is een elektronisch registratieapparaat met grote nauwkeurigheid vereist. Dit apparaat moet compatibel zijn met de overige apparatuur en dient de volgende kenmerken te hebben:

a) responstijd kleiner dan 1,5 sec., liefst kleiner dan 1 sec. (de responstijd is de tijd die nodig is om de pen van het registratieapparaat van 0 tot 90 % te laten gaan bij een plotseling signaal van 100 %);

b)

papierbreedte: minimaal 20 cm;

c)

papiersnelheid: regelbaar van 0,4-2,5 cm/min.

3.4.

Rekenapparatuur (optioneel)

Elektronische rekenapparatuur (bij voorbeeld een integrator) biedt de mogelijkheid snelle en nauwkeurige berekeningen uit te voeren. De integratie moet lineair zijn, een voldoende gevoeligheid hebben en de correctie van het eventuele verloop van de basislijn moet toereikend zijn.

4.

WERKWIJZE

De in de punten 4.1 tot en met 4.3 beschreven handelingen betreffen het gebruik van een vlamionisatiedetector.

Als alternatief mag een gaschromatograaf met een katharometer (reagerend op verschillen in warmtegeleiding) worden gebruikt. De werkomstandigheden worden dan gewijzigd als beschreven in punt 6.

4.1.

Werkomstandigheden

4.1.1.

Bepaling van de optimale werkomstandigheden

4.1.1.1.

Gepakte kolom

Bij het vaststellen van de optimale werkomstandigheden moet rekening worden gehouden met de volgende variabelen:

a) lengte en diameter van de kolom;

b)

aard en hoeveelheid van de stationaire fase;

c)

temperatuur van de kolom;

d)

debiet van het draaggas;

e)

gewenst scheidend vermogen;

f)

de hoeveelheid van het monster, die zodanig moet worden gekozen dat de detector en de elektrometer een lineaire respons geven;

g)

duur van de analyse.

In het algemeen zullen bij de in de tabellen 1 en 2 vermelde waarden de gewenste resultaten worden verkregen, dat wil zeggen ten minste 2 000 theoretische schotels voor methylstearaat bij een elutie binnen ongeveer 15 min.

Als de apparatuur dit toelaat, dient het injectiestuk op een temperatuur te worden gebracht van ongeveer 200 oC en de detector op een temperatuur gelijk aan of hoger dan de kolomtemperatuur.

Het debiet van de waterstof naar de vlamionisatiedetector dient in het algemeen, afhankelijk van de diameter van de kolom, 0,5 tot 1 maal het debiet van het draaggas te zijn. Het debiet van de zuurstof is ongeveer 5 tot 10 maal zo groot als die van de waterstof.

Tabel 1

Inwendige diameter van de kolom (mm)

Debiet van het draaggas (ml/min.)

2

15 tot 25

3

20 tot 40

4

40 tot 60

Tabel 2

Concentratie van de stationaire fase (% (m/m))

Kolomtemperatuur (oC)

5

175

10

180

15

185

20

185

4.1.1.2.

Capillaire kolom

De efficiëntie en permeabiliteit van capillaire kolommen brengen mee dat de scheiding tussen de componenten en de duur van de analyse sterk afhankelijk zijn van het debiet van het draaggas in de kolom. Daarom moeten de werkomstandigheden worden geoptimaliseerd door aanpassing van deze variabele (of eenvoudiger door beïnvioeding van het drukverval van de kolom), naar gelang men de scheiding wenst te verbeteren of een snelle analyse wenst.

4.1.2.

Bepaling van het aantal theoretische schotels (efficiëntie) en van het scheidend vermogen

(Zie figuur 1.)

Voer de analyse uit met een mengsel van ongeveer gelijke hoeveelheden methylstearaat en- oleaat (bij voorbeeld methylesters van cacaoboter).

Kies de kolomtemperatuur en het debiet van het draaggas zodanig dat het maximum van de methylstearaatpiek ongeveer 15 minuten na de oplosmiddelpiek wordt geregistreerd. Gebruik een hoeveelheid van het mengsel van methylesters die groot genoeg is om een methylstearaatpiek te krijgen die tot ongeveer driekwart van de hele schaal reikt.

Bereken het aantal theoretische schotels "n" (efficiëntie) met de formule:

n = 16 [ wl ]²

n = 16 [

dr1

wl

]²

en het scheidend vermogen "R" met de formule:

R = w1 + w2

R =

2D

w1 + w2

waarin:

dr1

= de retentie-afstand, in millimeter, vanaf de start van het chromatogram tot het maximum van de piek van methylstearaat;

w1 en w2

= de basisbreedten, in millimeter, van de pieken voor methylstearaat en -oleaat, gemeten tussen de snijpunten van de raakli