NL Publicatieblad van de Europese Unie L 220/1

VERORDENING (EG) Nr. 761/2009 VAN DE COMMISSIE

van 23 juli 2009

tot wijziging, in verband met de aanpassing ervan aan de technische vooruitgang, van Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie houdende vaststelling van testmethoden uit hoofde van Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH)

(Voor de EER relevante tekst)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG en 2000/21/EG van de Commissie (1), en met name op artikel 13, lid 3,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) Verordening (EG) nr. 440/2008 van de Commissie (2) bevat de testmethoden voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen, die worden toegepast voor de uitvoering van Verordening (EG) nr. 1907/2006.

(2) Verordening (EG) nr. 440/2008 dient te worden bijgewerkt teneinde daarin wijzigingen in bepaalde testmethoden en verscheidene nieuwe, door de OESO goedgekeurde testmethoden op te nemen. De belanghebbenden zijn over dit voorstel geraadpleegd. De wijzigingen behelzen de aanpassing van de desbetreffende methoden aan de wetenschappelijke en technische vooruitgang.

(3) De bepalingen inzake dampspanning moeten worden herzien om daar de nieuwe effusiemethode in op te nemen.

(4) Het is noodzakelijk een nieuwe methode voor de meting van de naar de lengte gewogen meetkundig gemiddelde diameter van vezels toe te voegen.

(5) Er dient met prioriteit een nieuwe in-vitrotestmethode voor huidirritatie in Verordening (EG) nr. 440/2008 te worden opgenomen teneinde overeenkomstig Richtlijn 86/609/EEG van de Raad van 24 november 1986 inzake de onderlinge aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen van de lidstaten betreffende de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (3), tot een verlaging van het aantal proefdieren te komen. Hoewel een ontwerp voor een in-vitrotestmethode voor huidirritatie nog bij de OESO in behandeling is, dient methode B.46 in dit uitzonderlijke geval in deze verordening te worden opgenomen. Methode B.46 dient zo spoedig te worden geactualiseerd, zodra er binnen de OESO overeenstemming is bereikt of nadere informatie die een dergelijke herziening rechtvaardigt, beschikbaar komt.

(6) De bepalingen betreffende de groeiremmingstest met algen moeten worden herzien om er meer soorten in op te nemen en aan te sluiten bij de eisen inzake de risico-evaluatie en de indeling van chemische stoffen.

(7) Er dient een nieuwe methode voor de meting van de aerobe mineralisatie in oppervlaktewater te worden toegevoegd, in de vorm van een simulatietest voor de biologische afbreekbaarheid, en een nieuwe methode voor de beoordeling van de toxiciteit bij het genus Lemna door middel van een groeiremmingstest.

(8) Verordening (EG) nr. 440/2008 moet dan ook dienovereenkomstig worden gewijzigd.

(9) De bepalingen van deze verordening zijn in overeenstemming met het advies van het bij artikel 133 van Verordening (EG) nr. 1907/2006 ingestelde comité,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De bijlage van Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt als volgt gewijzigd:

1) Deel A wordt als volgt gewijzigd: a) hoofdstuk A.4 wordt vervangen door hoofdstuk A.4 in bijlage I van deze verordening; b) hoofdstuk A.22 in bijlage II van deze verordening wordt toegevoegd.

2) Deel B wordt als volgt gewijzigd: hoofdstuk B.46 in bijlage III van deze verordening wordt toegevoegd.

3) Deel C wordt als volgt gewijzigd: a) hoofdstuk C.3 wordt vervangen door hoofdstuk C.3 in bijlage IV van deze verordening; b) de hoofdstukken C.25 en C.26 in de bijlagen V en VI van deze verordening worden toegevoegd.

Artikel 2

Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat. Gedaan te Brussel, 23 juli 2009. Voor de Commissie Stavros DIMAS Lid van de Commissie

(1) PB L 396 van 30.12.2006, blz. 1.

(2) PB L 142 van 31.5.2008, blz. 1.

(3) PB L 358 van 18.12.1986, blz. 1.

BIJLAGE I A.4. DAMPSPANNING 1. METHODE Deze methode is gelijkwaardig aan OESO TG 104 (2004). 1.1. INLEIDING Deze herziene versie van methode A.4 (1) bevat een aanvullende meetmethode, Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie, ontwikkeld voor stoffen met zeer lage spanningen (tot 10–10 Pa). Gezien de behoefte aan meetmethoden, met name voor het bepalen van de dampspanning van stoffen met lage dampspanning, zijn de overige meetmethoden van deze methode herzien met betrekking tot andere toepassingsbereiken. Bij thermodynamisch evenwicht is de dampspanning van een zuivere stof alleen een functie van de temperatuur. De fundamentele principes worden besproken in de referenties (2) en (3). Er bestaat geen meetmethode die voor alle mogelijke waarden van de dampspanning, van minder dan 10–10 tot 105 Pa, van toepassing is. Deze methode omvat acht meetmethoden voor de dampspanning, die toepasbaar zijn voor verschillende dampspanningsbereiken. Tabel 1 biedt een vergelijking van de toepasbaarheid en het meetbereik van de verschillende methoden. De meetmethoden kunnen alleen worden toegepast voor verbindingen die niet ontleden onder de testomstandigheden. In gevallen waarin de experimentele methoden om technische redenen niet kunnen worden toegepast kan de dampspanning ook worden geschat. Een aanbevolen schattingsmethode wordt beschreven in het aanhangsel. 1.2. DEFINITIES EN EENHEDEN De dampspanning van een stof wordt gedefinieerd als de verzadigingsdruk boven een vaste stof of vloeistof. Voor de druk dient de SI-eenheid, de pascal (Pa), te worden gebruikt. Andere eenheden die in het verleden zijn gebruikt worden hieronder weergegeven, samen met hun herleidingsfactoren: 1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfeer = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa De SI-eenheid van temperatuur is de kelvin (K). De formule voor het herleiden van graden Celsius naar Kelvin is: T = t + 273,15 Hierin is T de Kelvintemperatuur ofwel de thermodynamische temperatuur en t de Celsiustemperatuur. Tabel 1 Meetmethode Vaste stoffen Vloeistoffen Geschatte herhaalbaarheid Geschatte reproduceerbaarheid Aanbevolen bereik Dynamische methode Laag smeltpunt Ja tot 25 % 1-5 % tot 25 % 1-5 % 103 Pa tot 2x103 Pa 2 × 103 Pa tot 105 Pa Statische methode Ja Ja 5-10 % 5-10 % 10 Pa – 105 Pa 10–2 Pa tot 105 Pa (1) Isoteniscoopmethode Ja Ja 5-10 % 5-10 % 102 Pa tot 105 Pa Effusiemethode: dampspanningsbalans Ja Ja 5-20 % tot 50 % 10–3 tot– 1 Pa Effusiemethode: Knudsencel Ja Ja 10-30 % — 10–10 tot 1 P Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie Ja Ja 5-30 % tot 50 % 10–10 tot 1 Pa Gasverzadigingsmethode Ja Ja 10-30 % tot 50 % 10–10 tot 103 Pa Draaienderotormethode Ja Ja 10-20 % — 10–4 tot 0,5 Pa 1.3. PRINCIPE VAN DE TEST Over het algemeen wordt de dampspanning bepaald bij verschillende temperaturen. Binnen een beperkt temperatuurbereik is de logaritme van de dampspanning van een zuivere stof omgekeerd evenredig met de thermodynamische temperatuur, volgens de vereenvoudigde vergelijking van Clausius-Clapeyron: waarin: p = de dampspanning van de stof in pascal (Pa) ΔHv = de verdampingswarmte in J mol–1 R = de universele molaire gasconstante, 8,314 J mol–1 K–1 T = de thermodynamische temperatuur in K 1.4. REFERENTIESTOFFEN Het is niet nodig om referentiestoffen te gebruiken. Deze stoffen zijn in de eerste plaats bedoeld om van tijd tot tijd de werking van een methode te controleren en om vergelijkingen tussen resultaten van verschillende methoden mogelijk te maken. 1.5. BESCHRIJVING VAN DE METHODE 1.5.1. Dynamische methode (methode van Cottrell) 1.5.1.1. Principe De dampspanning wordt bepaald door het meten van de kooktemperatuur van een stof bij verschillende ingestelde waarden van de druk tussen ongeveer 103 Pa en 105 Pa. Deze methode wordt ook aanbevolen voor het bepalen van de kooktemperatuur. Voor dat doel is de methode bruikbaar tot 600 K. De kooktemperatuur van vloeistoffen op een diepte van 3 tot 4 centimeter is ongeveer 0,1 °C hoger dan aan de oppervlakte, vanwege de hydrostatische druk van de vloeistofkolom. In de methode van Cottrell (4) wordt de thermometer in de damp boven de oppervlakte van de vloeistof geplaatst en wordt de kokende vloeistof voortdurend over de kwikbol van de thermometer geleid. De kwikbol wordt bedekt door een dunne vloeistoflaag die in evenwicht is met de damp bij atmosferische druk. Zo geeft de thermometer de echte kooktemperatuur aan, zonder meetfouten door oververhitting of hydrostatische druk. De oorspronkelijk door Cottrell gebruikte pomp is weergegeven in figuur 1. Buis A bevat de kokende vloeistof. Een platina draad B, die in de bodem is bevestigd, bevordert gelijkmatig koken. De zijbuis C leidt naar een condensor en de mantel D zorgt ervoor dat het koude condensaat niet bij de thermometer E kan komen. Als de vloeistof in A kookt, worden de in de trechter opgevangen bellen en vloeistof via de twee armen van de pomp F over de kwikbol van de thermometer geleid. Figuur 1 Figuur 2 Cottrell-pomp (4) A: Thermokoppel B: Vacuümbuffervolume C: Precisiemanometer D: Vacuüm E: Meetpunt F: Verwarmingselement (ca. 150 W) 1.5.1.2. Apparatuur In figuur 2 is een zeer nauwkeurig meetapparaat weergegeven, dat werkt volgens het Cottrell-principe. Het bestaat uit een buis met een kookgedeelte aan de benedenzijde, een koeler in het midden, en een uitgang en een flens aan de bovenzijde. De Cottrell-pomp wordt in het kookgedeelte geplaatst, dat wordt verwarmd door middel van een elektrisch verwarmingspatroon. De temperatuur wordt gemeten via een mantelthermokoppel of een weerstandsthermometer die bij de flens aan de bovenzijde naar binnen steekt. De uitgang wordt verbonden aan het drukregelingssysteem, dat bestaat uit een vacuümpomp, een buffervolume, een manostaat voor het inlaten van stikstof om de druk te regelen, en een manometer. 1.5.1.3. Werkwijze De stof wordt in het kookgedeelte gebracht. Indien vaste stoffen niet als poeder beschikbaar zijn, kunnen er problemen ontstaan, maar deze kunnen soms worden opgelost door de koelwatermantel te verwarmen. De apparatuur wordt bij de flens afgesloten en de stof wordt ontgast. Vervolgens wordt de laagst gewenste druk ingesteld en wordt het verwarmingssysteem aangezet. Tegelijkertijd wordt de temperatuurvoeler verbonden met een recorder. Het evenwicht is bereikt, wanneer bij een constante druk een constante kooktemperatuur kan worden afgelezen. Wees voorzichtig om „stoten” tijdens het koken te voorkomen. Voorts moet volledige condensatie plaatsvinden op de koeler. Bij het bepalen van de dampspanning van bij lage temperatuur smeltende stoffen moet men voorkomen dat de condensor verstopt raakt. Nadat dit evenwichtspunt is geregistreerd, wordt een hogere druk ingesteld. Dit proces wordt herhaald totdat een druk van 105 Pa is bereikt (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal). Ter controle moeten de evenwichtspunten nogmaals worden bepaald bij afnemende druk. 1.5.2. Statische methode 1.5.2.1. Principe In de statische methode (5) wordt de dampspanning bij thermodynamisch evenwicht bepaald bij een ingestelde temperatuur. Deze methode is geschikt voor stoffen en vloeistoffen die uit meerdere componenten bestaan en vaste stoffen in het bereik van 10–1 tot 105 Pa en eveneens, mits behoedzaam uitgevoerd, in het bereik van 1 tot 10 Pa. 1.5.2.2. Apparatuur De opstelling bestaat uit een thermostatisch bad (met een nauwkeurigheid van ±0,2 K), een vat voor het monster dat verbonden is aan de vacuümleiding, een manometer en een drukregelingssysteem. De monsterruimte (figuur 3a) is verbonden aan de vacuümleiding via een kraan en een hulpmanometer (een U-buis met een geschikte manometervloeistof) die dient voor de nulpuntsinstelling. Afhankelijk van het drukbereik en het chemisch gedrag van de teststof zijn kwik, siliconenoliën en ftalaten geschikte manometervloeistoffen. Het gebruik van kwik dient echter om milieuredenen waar mogelijk te worden vermeden. De teststof mag niet merkbaar oplossen in of reageren met de vloeistof in de U-buis (figuur 3b). Voor de manometer kan kwik worden gebruikt in het bereik van normale drukken tot 102 Pa; siliconenvloeistoffen en ftalaten zijn geschikt voor drukken van 10 tot 102 Pa. Er bestaan ook andere drukmeters die gebruikt kunnen worden tot 102 Pa, en verwarmbare membraancapaciteitmanometers kunnen zelfs worden gebruikt bij drukken beneden 10–1 Pa. De temperatuur wordt aan de buitenkant van de monsterruimte of in het vat zelf gemeten. 1.5.2.3. Werkwijze Vul bij gebruikmaking van de in figuur 3a beschreven opstelling de U-buis met de gewenste vloeistof, die moet zijn ontgast bij hogere temperatuur voordat tot aflezen wordt overgegaan. De teststof wordt in de opstelling gebracht en bij lagere temperatuur ontgast. In het geval van een meercomponentensysteem moet de temperatuur laag genoeg zijn om te verzekeren dat de samenstelling van het materiaal niet verandert. Een evenwichtstoestand kan sneller worden bereikt door te roeren. Het monster kan onderkoeld worden met vloeibare stikstof of droog ijs, waarbij condensatie van lucht of pompvloeistof moet worden vermeden. Met de kraan boven de monsterruimte in geopende stand wordt vervolgens de ingesloten lucht gedurende een aantal minuten uit de apparatuur gepompt. Zo nodig moet de ontgassing verschillende keren herhaald worden. Figuur 3a Figuur 3b Als het monster verhit wordt met de kraan gesloten, stijgt de dampspanning. Dit verandert het evenwicht van de vloeistof in de U-buis. Om hiervoor te compenseren, wordt stikstof of lucht via de kraan in het toestel binnengelaten tot de vloeistof in de drukmeter weer bij nul staat. De hiervoor vereiste druk kan afgelezen worden bij kamertemperatuur op een manometer of op een instrument met hogere precisie. Deze druk komt overeen met de dampspanning van de stof bij die meettemperatuur. Bij gebruikmaking van de in figuur 3b weergegeven opstelling wordt de dampspanning direct afgelezen. De dampspanning wordt bepaald met voldoende kleine temperatuurintervallen (ongeveer 5 tot 10 meetpunten in totaal) tot aan de gewenste maximumtemperatuur. Ter controle moeten de metingen bij lage temperaturen herhaald worden. Als de waarden die verkregen worden bij de herhaalde metingen niet overeenkomen met de grafiek die is verkregen bij stijgende temperatuur, kan dit te wijten zijn aan een van de volgende situaties: i) Het monster bevat nog altijd lucht (bijvoorbeeld stoffen met hoge viscositeit) of bij lage temperatuur kokende stoffen die vrijkomt/vrijkomen bij verwarming; ii) De stof ondergaat een chemische reactie in het onderzochte temperatuurbereik (bijvoorbeeld afbraak, polymerisatie). 1.5.3. Isoteniscoopmethode 1.5.3.1. Principe De isoteniscoop (6) is gebaseerd op het principe van de statische methode. Bij deze methode wordt een monster in een bol gebracht die op constante temperatuur wordt gehouden en die wordt verbonden met een manometer en een vacuümpomp. Verontreinigingen die vluchtiger zijn dan de te onderzoeken stof worden verwijderd door te ontgassen bij gereduceerde druk. De dampspanning van het monster bij de ingestelde temperatuur wordt in evenwicht gebracht met een bekende druk van een inert gas. De isoteniscoop is ontwikkeld om de dampspanning van bepaalde vloeibare koolwaterstoffen te meten, maar is eveneens geschikt voor onderzoek van vaste stoffen. Over het algemeen is de methode niet geschikt voor meercomponentensystemen. Bij monsters die niet-vluchtige verontreinigingen bevatten vertonen de resultaten slechts geringe meetfouten. Het aanbevolen meetbereik is 102 tot 105 Pa. 1.5.3.2. Apparatuur Een voorbeeld van een meetinstrument is afgebeeld in figuur 4. Zie ASTM D 2879-86 (6) voor een volledige beschrijving. 1.5.3.3. Werkwijze Voor vloeistoffen dient de stof zelf als vulvloeistof in de hulpmanometer. Een hoeveelheid vloeistof die voldoende is voor het vullen van de bol en de korte arm van de manometer, wordt in de isoteniscoop gebracht. De isoteniscoop wordt met het vacuümsysteem verbonden, leeggepompt en daarna gevuld met stikstof. Het leegmaken en doorspoelen van het systeem wordt tweemaal herhaald om de resterende zuurstof te verwijderen. De gevulde isoteniscoop wordt horizontaal gehouden zodat het monster zich in een dunne laag verspreidt over de monsterbol en de manometer. De druk in het systeem wordt gereduceerd tot 133 Pa en het monster wordt zachtjes verwarmd tot het juist kookt (verwijdering van opgeloste gassen). De isoteniscoop wordt dan zo gedraaid dat het monster terugloopt naar de bol en het de korte arm van de manometer vult. De druk wordt op 133 Pa gehouden. De uitgetrokken punt van de monsterbol wordt verwarmd met een kleine vlam, totdat de damp die uit het monster vrijkomt voldoende expandeert om een deel van het monster uit het bovenste gedeelte van de bol en de manometerarm te verplaatsen naar het manometergedeelte van de isoteniscoop en zo een met damp gevulde, stikstofvrije ruimte te creëren. Vervolgens wordt de isoteniscoop in een thermostatisch bad geplaatst, en de druk van de stikstof aangepast tot deze druk gelijk is aan de druk van het monster. Bij het evenwichtspunt is de dampspanning van de stikstof gelijk aan de dampspanning van de stof. Figuur 4 Voor vaste stoffen worden manometervloeistoffen zoals siliconenoliën of ftalaten gebruikt, afhankelijk van het druk- en temperatuurbereik. De ontgaste manometervloeistof wordt in de ronding van de lange arm van de isoteniscoop gebracht. Daarna wordt de te onderzoeken vaste stof in de bol gebracht en bij hogere temperatuur ontgast. Vervolgens wordt de isoteniscoop gekanteld zodat de manometervloeistof in de U-buis kan stromen. 1.5.4. Effusiemethode: dampspanningsbalans (7) 1.5.4.1. Principe Een monster van een teststof wordt verwarmd in een kleine oven en in een vacuüm stolp gebracht. De oven wordt afgesloten met een deksel met kleine openingen van bekende diameter. De damp van de stof die door een van de openingen ontsnapt, wordt naar de balansschaal van een zeer gevoelige balans geleid, die ook is omgeven door een vacuüm stolp. In sommige ontwerpen wordt de balansschaal omgeven door een koelpot voor warmteafvoer naar buiten door middel van thermische geleiding en wordt deze door straling gekoeld zodat de ontsnappende damp erop condenseert. De impuls van de dampstroom werkt als kracht op de balansschaal. De dampspanning kan op twee manieren worden afgeleid: rechtstreeks uit de kracht op de balansschaal en tevens uit de verdampingssnelheid met behulp van de Hertz-Knudsen-vergelijking (2): waarin: G = verdampingssnelheid (kg s–1 m–2) M = molaire massa (g mol–1) T = temperatuur (K) R = universele gasconstante (J mol–1 K–1) p = dampspanning (Pa) Het aanbevolen meetbereik is 10–3 tot 1 Pa. 1.5.4.2. Apparatuur Het algemene principe van de opstelling is weergegeven in figuur 5. Figuur 5 A: Grondplaat F: Koelpot en koelstaaf B: Instrument met bewegende spiraal G: Verdampingsoven C: Stolp H: Dewarvat met vloeibare stikstof D: Balans met balansschaal I: Temperatuurmeting van het monster E: Vacuüm meetinstrument J: Teststof 1.5.5. Effusiemethode: Knudsencel 1.5.5.1. Principe Deze methode berust op de schatting van de massa van de hoeveelheid teststof die per tijdseenheid in de vorm van damp door een gekalibreerde micro-opening uit een Knudsencel (8) stroomt, in ultravacuüm toestand. De uitgestroomde dampmassa kan verkregen worden door bepaling van de afname van de massa van de cel of door condensatie van de damp bij lage temperatuur en bepaling van de hoeveelheid verdampte stof met behulp van chromatografie. De dampspanning wordt berekend door toepassing van de Hertz-Knudsen-vergelijking (zie paragraaf 1.5.4.1) met correctiefactoren die afhankelijk zijn van de parameters van de apparatuur (9). Het aanbevolen meetbereik is 10–10 tot 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Apparatuur Het algemene principe van de opstelling is weergegeven in figuur 6. Figuur 6 1: Verbinding naar vacuüm 7: Deksel met schroefdraad 2: Uitsparingen voor platina weerstandsthermometer of temperatuurmeting en -regeling 8: Vleugelmoeren 3: t Deksel voor vacuümva 9: Bouten 4: O-ring 10: Roestvrijstalen uitstroomcel 5: Aluminium vacuümvat 11: Verwarmingspatroon 6: Onderdeel voor het plaatsen en verwijderen van de cellen 1.5.6. Effusiemethode: isotherme thermogravimetrie 1.5.6.1. Principe Deze methode berust op bepaling van de verhoogde verdampingssnelheden voor de teststof bij hogere temperaturen en omgevingsdruk door middel van thermogravimetrie (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). De verdampingssnelheden vT worden verkregen door de gekozen verbinding bloot te stellen aan een atmosfeer van langzaam stromend inert gas en bij bekende isotherme temperaturen T in Kelvin de gewichtsafname gedurende geschikte tijdsperioden te meten. De dampspanningen pT worden berekend uit de vT-waarden met behulp van het lineaire verband tussen de logaritme van de dampspanning en de logaritme van de verdampingssnelheid. Indien nodig kan worden geëxtrapoleerd tot temperaturen van 20 en 25 °C door log pT uit te zetten tegen 1/T. Deze methode is geschikt voor stoffen met dampspanningen tot 10–10 Pa (10–12 mbar) en met een zuiverheid die zo dicht mogelijk de 100 % benadert, teneinde een verkeerde interpretatie van de gemeten gewichtsafname te vermijden. 1.5.6.2. Apparatuur Het algemene principe van de proefopstelling is weergegeven in figuur 7. Figuur 7 De verdampte teststofmoleculen worden meegevoerd in een stroom van droog stikstofgas. Deze strijkt langs het dragerplaatje, dat aan een microbalans in een thermostatisch geregelde ruimte hangt. Na het verlaten van deze ruimte wordt de gasstroom gezuiverd door een sorptiemiddel. 1.5.6.3. Werkwijze De teststof wordt als homogene laag op het oppervlak van een geruwd glasplaatje aangebracht. Bij vaste stoffen wordt het plaatje gelijkmatig bevochtigd met een oplossing van de stof in een geschikt oplosmiddel en in een inerte atmosfeer gedroogd. Voor de meting wordt het dragerplaatje in een thermogravimetrisch analyseapparaat gehangen, waarna continu de gewichtsafname als functie van de tijd wordt gemeten. De verdampingssnelheid vT bij een bepaalde temperatuur wordt berekend uit de gewichtsafname Δm van het dragerplaatje met behulp van de vergelijking waarin F staat voor de oppervlakte van de teststoflaag, gewoonlijk de oppervlakte van het dragerplaatje, en t de tijd is waarin de massa met Δm afneemt. De dampspanning pT wordt berekend op basis van het verband met de verdampingssnelheid vT: Log pT = C + D log vT waarin C en D constanten zijn die specifiek zijn voor de gebruikte proefopstelling en die afhangen van de diameter van de meetruimte en de stroomsnelheid van het stikstofgas. Deze constanten moeten eenmalig worden bepaald door een reeks verbindingen met bekende dampspanningen te meten en log pT uit te zetten tegen log vT (11)(21)(22). Het verband tussen de dampspanning pT en de kelvintemperatuur T wordt gegeven door Log pT = A + B 1/T waarin A en B constanten zijn die worden verkregen door log pT uit te zetten tegen 1/T. Met behulp van deze vergelijking kan door extrapolatie de dampspanning voor iedere andere temperatuur worden verkregen. 1.5.7. Gasverzadigingsmethode (23) 1.5.7.1. Principe Inert gas wordt bij kamertemperatuur en met een bekende stroomsnelheid door of over een monster van de teststof geleid. De stroomsnelheid moet laag genoeg zijn om de noodzakelijke verzadiging in de gasfase te verzekeren. De getransporteerde stof wordt opgevangen, over het algemeen met behulp van een sorptiemiddel, en aan kwantitatieve analyse onderworpen. Als een alternatief voor dampvallen met daarop volgende analyse kunnen in serie gezette analytische technieken zoals chromatografie worden gebruikt om de hoeveelheid getransporteerde stof te meten. De dampspanning wordt berekend met de aanname dat wordt voldaan aan de ideale gaswet en dat de totale druk van een gasmengsel gelijk is aan de som van de drukken van de componenten van het gasmengsel. De partiële druk van de teststof, met andere woorden de dampspanning, wordt berekend uit het bekende totale gasvolume en het gewicht van het getransporteerde materiaal. De gasverzadigingsmethode is geschikt voor vaste en vloeibare stoffen en kan worden gebruikt voor dampspanningen tot 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). De methode is het betrouwbaarst voor dampspanningen beneden 103 Pa. Boven 103 Pa levert de methode over het algemeen een te hoge waarde voor de dampspanning op, waarschijnlijk als gevolg van aerosolvorming. Aangezien de metingen van de dampspanningen bij kamertemperatuur worden uitgevoerd hoeven de data niet te worden geëxtrapoleerd vanaf hoge temperaturen en wordt extrapolatie vanaf hoge temperaturen, dikwijls aanleiding tot ernstige meetfouten, vermeden. 1.5.7.2. Apparatuur De methode vereist het gebruik van een thermostatisch geregeld vat. In de opzet in figuur 8 is een vat weergegeven met drie houders voor vaste monsters en drie houders voor vloeibare monsters, zodat zowel voor een vast als voor een vloeibaar monster een analyse in drievoud kan worden uitgevoerd. De temperatuur wordt constant gehouden ±0,5 °C of beter. Figuur 8 Als dragergas wordt over het algemeen stikstof gebruikt, maar in een enkel geval kan een ander gas nodig zijn (24). Het dragergas moet droog zijn. De gasstroom wordt in 6 stromen gesplitst, geregeld met naaldventielen (opening ongeveer 0,79 mm), en stroomt het vat in door koperen buizen met een binnendiameter van 3,8 mm. Als zich een temperatuurevenwicht heeft ingesteld stroomt het gas door het monster en de sorptieval, waarna het het vat verlaat. Vaste monsters worden geladen in glazen buisjes met een binnendiameter van 5 mm, met propjes glaswol aan weerszijden (zie figuur 9). In figuur 10 is een houder voor vloeibare monsters weergegeven en een sorptiesysteem. De best reproduceerbare methode om de dampspanning van vloeistoffen te meten is door de vloeistof aan te brengen op glasparels of op een inert sorptiemiddel als silica, en hiermee de houder te beladen. Als alternatief kan men het dragergas door een grof glasfrit leiden en het door een kolom van vloeibare teststof laten borrelen. Figuur 9 Figuur 10 Het sorptiesysteem bevat een voor- en een nafilter. Bij heel lage dampspanningen worden slechts kleine hoeveelheden stof door het sorptiemiddel opgevangen en kan adsorptie aan de glaswol en de glazen buizen tussen monster en sorptiemiddel een aanzienlijk probleem vormen. Met vast CO2 gekoelde dampvallen vormen een andere efficiënte manier om het verdampte materiaal te verzamelen. Ze geven geen tegendruk op de verzadigingskolom en bovendien laat het opgevangen materiaal zich gemakkelijk kwantitatief analyseren. 1.5.7.3. Werkwijze De stroomsnelheid van het uitstromende dragergas wordt gemeten bij kamertemperatuur. De stroomsnelheid wordt gedurende het experiment regelmatig gecontroleerd om zeker te zijn van de nauwkeurigheid van de waarde voor het totale volume van het dragergas. Continue controle met een massastroommeter verdient de voorkeur. Verzadiging van de gasfase kan aanzienlijke contacttijden vergen en dus vrij lage gasstroomsnelheden (25). Aan het einde van het experiment worden het voor- en het nafilter van het sorptiesysteem apart geanalyseerd. De verbinding op elk filter wordt gedesorbeerd door toevoeging van een oplosmiddel. De resulterende oplossingen worden aan kwantitatieve analyse onderworpen om de massa te bepalen die van elk filter is gedesorbeerd. De keuze van de analysemethode (alsmede de keuzen van het sorptiemiddel en het desorberende oplosmiddel) hangt af van de aard van de teststof. De desorptie-efficiëntie wordt bepaald door een bekende hoeveelheid van de monsterstof op het sorptiemiddel aan te brengen, desorptie uit te voeren en te analyseren hoeveel is teruggewonnen. Het is van belang dat de desorptie-efficiëntie wordt gecontroleerd op of nabij de monsterconcentratie onder testomstandigheden. Om er zeker van te zijn dat het dragergas verzadigd is met de teststof worden drie verschillende gasstroomsnelheden gebruikt. Als de berekende dampspanning niet verandert afhankelijk van de stroomsnelheid wordt aangenomen dat het gas is verzadigd. De dampspanning wordt berekend met behulp van de vergelijking: waarin: p = dampspanning (Pa) W = massa van de verdampte teststof (g) V = volume verzadigd gas (m3) R = universele molaire gasconstante (J mol–1 K–1) T = temperatuur (K) M = molaire massa van de teststof (g mol–1). De gemeten volumes moeten worden gecorrigeerd voor druk- en temperatuurverschillen tussen de stroomsnelheidsmeter en de verzadigingskolom. 1.5.8. Draaienderotormethode 1.5.8.1. Principe Bij deze methode wordt gebruikgemaakt van een draaienderotorviscositeitsmeter, met als meetelement een kleine stalen kogel die zweeft in een magnetisch veld en die aan het draaien wordt gebracht door rotatie van de velden (26)(27)(28). De draaisnelheid kan worden bepaald met meetspoelen. Als de kogel een bepaalde draaisnelheid (gewoonlijk ongeveer 400 toeren per seconde) heeft bereikt, wordt de energietoevoer gestopt waardoor een vertraging van de draaisnelheid optreedt, die het gevolg is van de gaswrijving. De afname van de rotatiesnelheid wordt gemeten als functie van de tijd. De dampspanning wordt afgeleid uit de drukafhankelijke snelheidsafname van de stalen kogel. Het aanbevolen meetbereik is 10–4 tot 0,5 Pa. 1.5.8.2. Apparatuur Een schematische tekening van de proefopstelling is afgebeeld in figuur 11. De meetkop wordt geplaatst in een van thermostaatregeling voorziene ruimte (geregeld op 0,1 °C). De monsterhouder wordt in een aparte van een thermostaatregeling voorziene ruimte (eveneens geregeld op 0,1 °C) gebracht. Om condensatie te voorkomen, worden alle andere onderdelen van de opstelling op een hogere temperatuur gehouden. Het hele toestel wordt verbonden aan een hoogvacuümsysteem. Figuur 11 2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE 2.1. GEGEVENS In elk van de voorafgaande methoden moet de dampspanning ten minste bij twee temperaturen worden bepaald. Bepaling van de dampspanning bij drie of meer temperaturen in het bereik van 0 tot 50 °C verdient de voorkeur, aangezien men dan kan controleren of de dampspanningskromme lineair is. Bij de effusiemethode (Knudsencel en isotherme thermogravimetrie) en de gasverzadigingsmethode, wordt een temperatuurbereik voor de meting van 120 tot 150 °C aanbevolen in plaats van 0 tot 50 °C. 2.2. TESTVERSLAG In het verslag moeten de volgende gegevens worden opgenomen: — de gebruikte methode; — de nauwkeurige specificatie van de te onderzoeken stof (beschrijving en verontreinigingen) en indien van toepassing, voorafgaande zuivering; — het vereiste minimumaantal van twee waarden voor de dampspanning en de bijbehorende temperaturen — bij voorkeur drie of meer — in het bereik van 0 tot 50 °C (of 120 tot 150 °C); — ten minste één van de temperaturen dient 25 °C of lager te zijn, indien technisch mogelijk volgens de gekozen methode; — alle ruwe gegevens; — grafiek van log p tegen 1/T; — geschatte waarde van de dampspanning bij 20 of 25 °C. Indien een verandering (faseovergang, ontleding) wordt waargenomen, dienen de volgende gegevens te worden opgenomen: — aard van de verandering; — temperatuur waarbij de verandering optreedt bij atmosferische druk; — dampspanning bij 10 °C respectievelijk 20 °C beneden de overgangstemperatuur en bij 10 °C respectievelijk 20 °C boven deze temperatuur (tenzij het een overgang is van vaste fase naar gasfase). Alle gegevens en opmerkingen die van belang zijn voor de interpretatie van de resultaten, met name gegevens met betrekking tot verontreinigingen en de fysische toestand van de onderzochte stof, dienen te worden gerapporteerd. 3. LITERATUUR (1) Publicatieblad van de Europese Unie L 383 A, 26-47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., en Vodar, B., Eds., Butterworths, London. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. (5) NF T 20-048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa — Static method. (6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20-047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000) (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22-28 (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269-278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393-400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161-168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512-20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002) (23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Register, Washington DC (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., en Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., en Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Bij gebruik van een capacitieve manometer. Aanhangsel Schattingsmethode INLEIDING De berekende waarden van de dampspanning kunnen als volgt worden gebruikt: — om te bepalen welke van de experimentele methoden geschikt is; — om een schatting of grenswaarde te verkrijgen, ingeval de experimentele methode om technische redenen niet toegepast kan worden. SCHATTINGSMETHODE De dampspanning van vloeistoffen en vaste stoffen kan worden geschat met behulp van de gewijzigde Correlatie van Watson (a). Het enige benodigde gegeven is de normale kooktemperatuur. De methode is toepasbaar in het drukbereik van 105 tot 10–5 Pa. Uitgebreide informatie over deze methode wordt gegeven in het „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Zie ook OECD Environmental Monograph No.67 (c). BEREKENINGSMETHODE De dampspanning wordt als volgt berekend: waarin: T = betreffende temperatuur Tb = normaal kookpunt Pvp = dampspanning bij temperatuur T ΔHvb = verdampingswarmte ΔZb = compressibiliteitscoëfficiënt (geschat op 0,97) m = empirische factor afhankelijk van de fysische toestand bij de betreffende temperatuur Voorts: waarin KF een empirische factor is waarin de polariteit van de stof tot uitdrukking komt. KF-waarden voor verscheidene typen verbindingen worden opgesomd in referentie (b). Dikwijls zijn gegevens beschikbaar waarin een kookpunt bij verlaagde druk wordt gegeven. In dergelijke gevallen wordt de dampspanning als volgt berekend: waarin T1 staat voor het kookpunt bij de verlaagde druk P1. VERSLAG Bij gebruik van de schattingsmethode dient de berekening uitvoerig in het verslag te worden gedocumenteerd. LITERATUUR (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No.67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

BIJLAGE II A.22. NAAR LENGTE GEWOGEN MEETKUNDIG GEMIDDELDE VAN DE DIAMETER VAN VEZELS 1. METHODE 1.1. INLEIDING In deze methode wordt een procedure beschreven voor de bepaling van het naar lengte gewogen meetkundig gemiddelde van de diameter (Length Weighted Geometric Mean Diameter — LWGMD) van in bulk geproduceerde synthetische anorganische vezels (Man Made Mineral Fibres — MMMF). Aangezien er een waarschijnlijkheid van 95 % is dat de LWGMD van de populatie tussen de 95 %-betrouwbaarheidsniveaus (LWGMD ± twee keer de standaardfout) van het monster ligt, zal als testwaarde de onderste 95 %-betrouwbaarheidsgrens van het monster worden gerapporteerd (d.w.z. LWGMD minus twee keer de standaardfout). De methode is gebaseerd op een bijwerking (juni 1994) van een ontwerp-bedrijfsprocedure van de HSE, die is overeengekomen tijdens een bijeenkomst van de ECFIA en de HSE in Chester op 26 september 1993 en voor en op basis van een tweede interlaboratoriumproef is ontwikkeld (1, 2). Deze meetmethode kan worden gebruikt voor de karakterisering van de vezeldiameter van bulkstoffen of producten die MMMF bevatten, zoals refractaire keramische vezels (RKV), synthetische glasvezels (Man Made Vitreous Fibres — MMVF) of kristallijne en polykristallijne vezels. Weging naar lengte is een methode om te compenseren voor het effect op de diameterdistributie ten gevolge van het breken van lange vezels bij de bemonstering of behandeling van het materiaal. Voor de meting van de grootteverdeling van MMMF-diameters worden meetkundige statistische methoden (meetkundig gemiddelde) gebruikt, omdat deze diameters meestal een grootteverdeling hebben die een lognormaalverdeling benadert. Meting van de lengte èn de diameter is zowel saai als tijdrovend, maar als alleen de vezels worden gemeten die een oneindig dunne lijn in een REM-gezichtsveld raken, is de waarschijnlijkheid dat een bepaalde vezel wordt geselecteerd evenredig met de lengte daarvan. Aangezien daarmee de lengte in de berekening van de weging naar lengte wordt verdisconteerd, behoeft alleen nog de diameter te worden gemeten en kan de LWGMD-2SE volgens de beschrijving worden berekend. 1.2. DEFINITIES Deeltje: Een object met een lengte/breedte-verhouding van minder dan 3:1. Vezel: Een object met een lengte/breedte-verhouding (aspectverhouding) van ten minste 3:1. 1.3. TOEPASSINGSGEBIED EN BEPERKINGEN De methode is bedoeld voor diameterdistributies met een mediane diameter van 0,5 μm tot 6 μm. Grotere diameters kunnen met een lagere REM-vergrotingsfactor worden gemeten, maar de methode krijgt steeds meer beperkingen voor kleinere vezels en als de mediane diameter kleiner is dan 0,5 μm, wordt een TEM-meting (transmissie-elektronenmicroscoop) aanbevolen. 1.4. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE Uit de vezelmat of uit losse bulkvezels wordt een aantal representatieve boormonsters genomen. De lengte van de bulkvezels wordt met behulp van een vergruisprocedure verkleind en een representatief deelmonster wordt gedispergeerd in water. Er worden meetmonsters geëxtraheerd, gefiltreerd over een polycarbonaatfilter met een poriegrootte van 0,2 μm en geprepareerd voor onderzoek met een rasterelektronenmicroscoop (REM). De vezeldiameters worden gemeten bij een vergrotingsfactor van 10 000 × of meer (1) met behulp van een steekproefname langs een lijn om een zuivere raming van de mediane diameter te krijgen. Het onderste 95 %-betrouwbaarheidsinterval (op basis van een eenzijdige toets) wordt berekend om een raming te krijgen van de laagste waarde van het meetkundig gemiddelde van de vezeldiameter van het materiaal. 1.5. BESCHRIJVING VAN DE TESTMETHODE 1.5.1. Veiligheids/voorzorgmaatregelen De blootstelling van personen aan vezels in de lucht moet tot een minimum worden beperkt en voor het hanteren van de droge vezels moet een zuurkast of een handschoenenkast worden gebruikt. Om de effectiviteit van de beperkende maatregelen te bepalen moet periodiek monitoring van de blootstelling van personen worden uitgevoerd. Bij het hanteren van MMMF moeten wegwerphandschoenen worden gebruikt om huidirritatie te beperken en kruisbesmetting te voorkomen. 1.5.2. Apparatuur — Pers en matrijzen (voor 10 MPa). — Polycarbonaatfilter met capillaire poriën met een poriegrootte van 0,2 μm (diameter 25 mm). — Cellulose-ester membraanfilter met een poriegrootte van 5 μm dat als secundair filter kan worden gebruikt. — Glazen filtreerapparaat (of wegwerp-filtratiesystemen) voor filters met een diameter van 25 mm (bv. glazen microanalysekit van Millipore, typenr. XX10 025 00). — Vers gedestilleerd water dat is gefiltreerd over een filter met een poriegrootte van 0,2 μm om micro-organismen te verwijderen. — Sputter coater met een goud- of goud/palladiumtarget. — Rasterelektronenmicroscoop met een resolutie tot 10 nm en een vergrotingsfactor van 10 000 ×. — Diversen: spatels, scalpelmesje type 24, pincet, REM-buisjes, koolstoflijm of koolstofkleefband, zilverpasta. — Ultrasone sonde of ultrasoon bad (tafelmodel). — Monsterboor of kurkboor om boormonsters van een MMMF-mat te nemen. 1.5.3. Testprocedure 1.5.3.1. Monstername Voor matten en platen wordt een 25 mm monsterboor of kurkboor gebruikt om monsters van de doorsnede te nemen. Deze moeten gelijkmatig gespreid over de breedte van een klein stuk van de mat worden genomen of, als een langer stuk van de mat beschikbaar is, uit aselect gekozen plaatsen. Dezelfde apparatuur kan worden gebruikt om aselecte monsters uit losse vezels te nemen. Indien mogelijk moeten er zes monsters worden genomen om de ruimtelijke variatie in het bulkmateriaal te verdisconteren. De zes boormonsters worden in een matrijs met een diameter van 50 mm bij 10 Mpa verbrijzeld. Het materiaal wordt met een spatel gemengd en opnieuw aan 10 Mpa blootgesteld. Vervolgens wordt het materiaal uit de matrijs verwijderd en in een gesloten glazen fles bewaard. 1.5.3.2. Monstervoorbereiding Indien nodig kan organisch bindmiddel worden verwijderd door de vezels gedurende ongeveer één uur bij 450 °C in een oven te leggen. Verdeel het monster in vieren door een kegelvormig hoopje te maken en dit in vieren te verdelen („cone and quarter”-techniek) (dit moet in een zuurkast gebeuren). Voeg met een spatel een kleine hoeveelheid (< 0,5 g) monster toe aan 100 ml vers gedestilleerd water dat over een membraanfilter van 0,2 μm is gefiltreerd (ook andere bronnen van ultrazuiver water mogen worden gebruikt, als is aangetoond dat deze aan de eisen voldoen). Dispergeer grondig met een ultrasone sonde die bij een vermogen van 100 W zodanig is ingesteld dat cavitatie optreedt (als er geen sonde beschikbaar is, wordt de volgende methode gebruikt: gedurende 30 seconden herhaaldelijk schudden en omkeren; gedurende vijf minuten ultrasoneren in een tafelmodel ultrasoon bad; vervolgens nog eens gedurende 30 seconden herhaaldelijk schudden en omkeren). Onmiddellijk na het dispergeren van de vezels wordt met een pipet met brede opening (inhoud 2-5 ml) een aantal analysemonsters genomen (bv. drie monsters van 3, 6 en 10 ml). Elk analysemonster wordt onder vacuüm gefiltreerd over een polycarbonaatfilter van 0,2 μm op een secundair MEC-filter met een poriegrootte van 5 μm, waarbij een glazen filterkroes van 25 mm met een cilindrisch reservoir wordt gebruikt. In de filterkroes wordt ongeveer 5 ml gefiltreerd gedestilleerd water gebracht en het analysemonster wordt langzaam in het water gepipetteerd, waarbij de pipetpunt onder de meniscus wordt gehouden. De pipet en het reservoir moeten na het pipetteren grondig worden gespoeld, aangezien dunne vezels de neiging hebben aan het oppervlak te blijven. Verwijder het filter voorzichtig, maak het los van het secundaire filter en leg het in een houder om te laten drogen. Snij met een type 24 scalpelmes met een schokkende beweging een kwart of halve filterschijf met het filterresidu af. Plak de doorsnede met een stukje koolstofkleefband of koolstoflijm zorgvuldig op een REM-stub. Op ten minste drie plaatsen wordt zilverpasta aangebracht om het elektrisch contact aan de randen van het filter en de stub te verbeteren. Als de lijm/zilverpasta droog is, wordt met een sputter coater ongeveer 50 nm goud of goud/palladium op het oppervlak van het neerslag aangebracht. 1.5.3.3. REM: kalibratie en uitvoering 1.5.3.3.1. Kalibratie De kalibratie van de REM moet ten minste één keer per week worden gecontroleerd (liefst één keer per dag) met een gecertificeerd kalibratierooster. De kalibratie moet aan de hand van een gecertificeerde standaard worden gecontroleerd en als de gemeten waarde (REM) niet binnen ±2 % van de gecertificeerde waarde ligt, moet de REM-kalibratie worden aangepast en opnieuw worden gecontroleerd. De REM moet met een reële monstermatrix bij een vergrotingsfactor van 2 000 × in staat zijn tot een resolutie van ten minste een minimale zichtbare diameter van 0,2 µm. 1.5.3.3.2. Uitvoering De REM moet worden gebruikt met een vergrotingsfactor van 10 000 × (2) onder omstandigheden die een goede resolutie met een aanvaardbaar beeld geven bij een lage aftastsnelheid van bijvoorbeeld 5 seconden per opname. Hoewel de operationele vereisten van verschillende REM’s kunnen uiteenlopen, wordt bij materialen met een betrekkelijk laag atoomgewicht in het algemeen de beste zichtbaarheid en resolutie verkregen bij gebruik van een versnellingsspanning van 5-10 keV met een kleine stipafmeting en een korte werkafstand. Aangezien er een lineair traject wordt afgelegd, moet er een helling van 0° worden gebruikt om opnieuw scherpstellen tot een minimum te beperken of als de REM een eucentrische objecttafel heeft, moet de eucentrische werkafstand worden gebruikt. Er kan een lagere vergrotingsfactor worden gebruikt als het materiaal geen kleine vezels (kleine diameter) bevat en de vezeldiameter groot is (> 5 μm). 1.5.3.4. Groottebepaling 1.5.3.4.1. Onderzoek bij lage vergrotingsfactor om het monster te evalueren In eerste instantie wordt het monster bij een lage vergrotingsfactor onderzocht om na te gaan of grote vezels aan elkaar klitten en om de dichtheid van de vezels te bepalen. Als er te veel klitten zijn, wordt aanbevolen een nieuw monster te maken. Met het oog op de statistische nauwkeurigheid moet er een minimaal aantal vezels worden gemeten en een hoge vezeldichtheid zal wellicht wenselijk lijken, aangezien het bestuderen van lege velden tijdrovend is en niet tot de analyse bijdraagt. Als het filter echter te veel materiaal bevat, wordt het moeilijk alle meetbare vezels te meten en omdat kleine vezels achter grotere vezels verborgen kunnen liggen, worden deze dan wellicht gemist. Bij een vezeldichtheid van meer dan 150 vezels per millimeter van het lineaire traject kan een systematische fout tot een te hoge LWGMD leiden. Anderzijds leidt een lage vezelconcentratie tot een langere analysetijd en het is vaak kosteneffectief om een monster te maken met een vezeldichtheid die dichter bij het optimum ligt in plaats van tellingen te blijven uitvoeren bij filters met een lage concentratie. Een optimale vezeldichtheid moet gemiddeld ongeveer één of twee telbare vezels per gezichtsveld bij een vergrotingsfactor 5 000 opleveren. De optimale dichtheid is echter wel afhankelijk van de grootte (diameter) van de vezels, dus de experimentator moet zijn kennis en ervaring gebruiken om te beoordelen of de vezeldichtheid in de buurt van de optimale dichtheid ligt of niet. 1.5.3.4.2. Weging van de vezeldiameters naar lengte Alleen de vezels die een op het scherm van de REM getrokken (oneindig) dunne lijn raken (of kruisen), worden geteld. Daartoe wordt over het centrum van het scherm een horizontale (of verticale) lijn getrokken. Er kan ook één punt in het centrum van het scherm worden aangebracht, waarna een continue scan in één richting over het filter wordt gestart. Van elke vezel met een aspectverhouding van meer dan 3:1 die dit punt raakt of kruist, wordt de diameter gemeten en geregistreerd. 1.5.3.4.3. Groottebepaling van de vezels Aanbevolen wordt ten minste 300 vezels te meten. Elke vezel wordt slechts eenmaal gemeten op het snijpunt met de lijn of het punt op het scherm (of vlakbij het snijpunt als de randen van de vezels niet goed te zien zijn). Als er vezels met een niet-uniforme doorsnede worden aangetroffen, wordt er een meting gebruikt van de gemiddelde diameter van de vezel. Bij de bepaling van de rand en het meten van de kortste afstand tussen de randen van de vezel moet zorgvuldig worden gewerkt. De groottebepaling kan on-line gebeuren of off-line met opgeslagen beelden of foto’s. Halfautomatische beeldmeetsystemen die de gegevens direct downloaden naar een spreadsheet worden aanbevolen, aangezien ze tijd besparen en fouten bij het overschrijven elimineren en de berekeningen kunnen worden geautomatiseerd. Voor lange vezels moet bij een lage vergrotingsfactor worden gecontroleerd of de uiteinden niet naar het gezichtsveld van de meting terugkrullen, zodat vaststaat dat deze vezels slechts één keer worden gemeten. 2. GEGEVENS 2.1. BEHANDELING VAN DE RESULTATEN Vezeldiameters hebben meestal geen normaalverdeling. Door een log-transformatie uit te voeren kan er echter een verdeling worden verkregen die de normaalverdeling benadert. Bereken het rekenkundig gemiddelde (gemiddelde lnD) en de standaarddeviatie (SDlnD) van de natuurlijke logaritmen (lnD) van de n vezeldiameters (D): (1) (2) Om de standaardfout (SElnD) te krijgen wordt de standaarddeviatie gedeeld door de vierkantswortel van het aantal metingen: (3) Van het gemiddelde wordt twee keer de standaardfout afgetrokken en van deze waarde (gemiddelde minus twee keer de standaardfout) wordt de e-macht berekend; dit levert het meetkundig gemiddelde minus twee keer de standaardfout van het meetkundig gemiddelde: (4) 3. RAPPORTAGE TESTVERSLAG In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen: — de waarde van LWGMD-2SE; — eventuele afwijkingen van de procedure, met name degene die gevolgen kunnen hebben voor de precisie of de nauwkeurigheid van de resultaten, met een afdoende motivering. 4. REFERENTIES 1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. 2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Deze vergrotingsfactor is geschikt voor vezels van 3 µm; voor vezels van 6 µm zal een vergrotingsfactor van 5 000 × wellicht geschikter zijn. (2) Zie voor vezels van 3 µm de vorige voetnoot.

BIJLAGE III B.46. IN VITRO HUIDIRRITATIE: TEST MET GERECONSTRUEERD HUMAAN EPIDERMISMODEL 1. METHODE 1.1. INLEIDING Onder huidirritatie wordt verstaan: het ontstaan van reversibele beschadiging van de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur (zoals gedefinieerd in het wereldwijd geharmoniseerd systeem voor de indeling en etikettering van chemische stoffen (Globally Harmonized System of classification and labelling of chemicals) van de Verenigde Naties (GHS)) (1). Deze testmethode behelst een in-vitroprocedure die binnen een teststrategie een opzichzelfstaande vervangende test vormt. De procedure kan, afhankelijk van informatieverplichtingen, gebruikt worden om de irritatie van de huid door stoffen te bepalen, in een benadering met meervoudige bewijsvoering („weight of evidence” benadering) (2). De bepaling van huidirritatie ging meestal gepaard met het gebruik van proefdieren (zie methode B.4) (3). De betekenis van methode B.4 voor dierenwelzijn ligt in de mogelijkheid om huidcorrosie/-irritatie vast te stellen door toepassing van een sequentiële teststrategie waarbij gevalideerde in-vitro- en ex-vivomethoden worden gebruikt, zodat pijn en lijden van dieren wordt vermeden. Er zijn op dit moment drie gevalideerde in-vitrotestmethoden of richtsnoeren voor het testen, B.40, B.40bis en TG 435 (4, 5, 6), die bruikbaar zijn voor het deel van de sequentiële teststrategie van B.4 dat betrekking heeft op corrosie. Deze testmethode is gebaseerd op gereconstrueerde humane epidermismodellen, die door hun globale samenstelling (het gebruik van humane epidermale keratinocyten als bron van cellen, en de kenmerkende weefsel- en celstructuur) in biochemisch en fysiologisch opzicht sterke overeenkomst vertonen met de bovenste delen van de humane huid, d.w.z. de epidermis. Volgens de procedure van deze testmethode kunnen de gevaarseigenschappen van irriterende stoffen van GHS-categorie 2 geïdentificeerd worden. De testmethode omvat ook een reeks prestatienormen voor de beoordeling van soortgelijke en gewijzigde testmethoden met gereconstrueerde humane epidermis (7). Voor twee in-vitrotestmethoden, die commercieel verkrijgbaar zijn als EpiSkinTM en EpiDermTM, waarin gereconstrueerde humane epidermis als modelsysteem wordt gebruikt, zijn prevaliderings-, optimaliserings- en valideringsstudies uitgevoerd (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17). Deze referenties zijn gebaseerd op R 38. Bepaalde herberekeningsaspecten ten behoeve van het GHS worden in referentie 25 besproken. Methoden waarvan de prestaties overeenkomen met die van EpiSkinTM (gevalideerde referentiemethode 1), worden aanbevolen als een opzichzelfstaande test ter vervanging van de in-vivotest bij konijnen om irriterende stoffen van GHS-categorie 2 te classificeren. Methoden waarvan de prestaties overeenkomen met die van EpiDermTM (gevalideerde referentiemethode 2), worden uitsluitend aanbevolen als screeningstest of als onderdeel van een sequentiële teststrategie in een „weight of evidence”-benadering voor het classificeren van irriterende stoffen van GHS-categorie 2. Voordat een voorgestelde in-vitrohuidirritatietest met gereconstrueerde humane epidermis voor regelgevingsdoeleinden kan worden gebruikt, moeten de betrouwbaarheid, relevantie (nauwkeurigheid) en beperkingen met het oog op het voorgestelde gebruik worden bepaald, om te verzekeren dat deze kwaliteiten vergelijkbaar zijn met die van gevalideerde referentiemethode 1, overeenkomstig de in deze testmethode beschreven prestatienormen (aanhangsel). Twee andere in-vitrotestmethoden met gereconstrueerde humane epidermis zijn gevalideerd overeenkomstig de normen die in deze testmethode zijn opgenomen, en de resultaten die met deze testen zijn verkregen komen overeen met die van gevalideerde referentiemethode 1 (18) Dit zijn de gemodificeerde EpiDermTM-testmethode (gemodificeerde referentiemethode 2) en de SkinEthic RHETM-testmethode („me too”-methode 1). 1.2. DEFINITIES De volgende definities zijn voor deze testmethode relevant: Nauwkeurigheid: De mate van overeenstemming tussen resultaten verkregen met de testmethode en erkende referentiewaarden. Het is een maat voor de prestaties van de testmethode en één aspect van relevantie. Deze term en de term „concordantie”, waaronder het percentage correcte uitkomsten van een testmethode wordt verstaan, worden vaak door elkaar gebruikt.. Batchcontrolestof: Benchmarkstof die een gematigde weefselrespons, gemeten als de levensvatbaarheid van de cellen, teweegbrengt. Levensvatbaarheid van de cellen: Parameter waarmee de totale activiteit van een celpopulatie wordt weergegeven, bijvoorbeeld als het vermogen van cellulaire mitochondriale dehydrogenasen om de vitale kleurstof MTT (3-[4,5-dimethylthiazool-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide) te reduceren. Deze parameter is, afhankelijk van het gemeten eindpunt en de opzet van de test, gecorreleerd met het totale aantal levende cellen en/of de vitaliteit van de cellen. ET50 : De blootstellingstijd die nodig is om de levensvatbaarheid van de cellen met 50 % te doen dalen bij aanbrenging van de markerstof in een bepaalde, vaste concentratie, zie ook IC50. Percentage fout-negatieve uitslagen: Het percentage van alle positieve stoffen dat door een testmethode onterecht als negatief wordt geïdentificeerd. Het is één indicator van de prestaties van de testmethode. Percentage fout-positieve uitslagen: Het percentage van alle negatieve (niet-actieve) stoffen dat onterecht als positief wordt geïdentificeerd. Het is één indicator van de prestaties van de testmethode. Oneindige dosis: Hoeveelheid op de huid aangebrachte teststof die groter is dan de hoeveelheid die nodig is om het huidoppervlak volledig en gelijkmatig te bedekken. GHS (Globally Harmonized System of classification and labelling of chemicals): Een systeem dat criteria vastlegt voor de indeling van stoffen en mengsels op basis van gevaarseigenschappen, overeenkomstig gestandaardiseerde soorten en niveaus van gevaren van fysisch-chemische aard en gevaren voor de gezondheid en het milieu, en dat de desbetreffende voorlichtingselementen bepaalt, zoals pictogrammen, signaalwoorden, gevarenaanduidingen, voorzorgsmaatregelen en veiligheidsinformatiebladen, waarmee informatie over de schadelijke effecten van de stoffen kenbaar wordt gemaakt met de bedoeling mensen (waaronder werkgevers, werknemers, transporteurs, consumenten en medewerkers van spoeddiensten) en het milieu te beschermen (1), en dat in de EU wordt uitgevoerd in Verordening (EG) nr. 1272/2008. IC50 : De concentratie waarin een markerstof de levensvatbaarheid van de weefsels met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd, zie ook ET50. Prestatienormen: Normen, gebaseerd op een gevalideerde referentiemethode, die de basis vormen voor de beoordeling van de vergelijkbaarheid van een voorgestelde, in mechanistisch en functioneel opzicht gelijksoortige testmethode. Hieronder begrepen zijn: I) essentiële componenten van de testmethode; II) een minimumlijst van referentiestoffen die zijn gekozen uit de stoffen die zijn gebruikt om de aanvaardbare prestaties van de gevalideerde referentiemethode aan te tonen; en III) de nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidsniveaus die door de voorgestelde testmethode moeten worden gehaald wanneer ze worden beoordeeld aan de hand van de minimumlijst van referentiestoffen; deze waarden zijn gebaseerd op de waarden die voor de gevalideerde referentiemethode zijn verkregen. Betrouwbaarheid: Indicator van de mate waarin een testmethode, uitgevoerd volgens een vast protocol, op reproduceerbare wijze binnen één laboratorium en tussen verschillende laboratoria verspreid over de tijd kan worden uitgevoerd. De betrouwbaarheid wordt bepaald door berekening van intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid. Gevoeligheid: Het percentage van alle positieve/actieve stoffen dat door middel van de test correct wordt ingedeeld. De gevoeligheid is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert, en is een belangrijke factor bij de beoordeling van de relevantie van een testmethode. Specificiteit: Het percentage van alle negatieve/niet-actieve stoffen dat door middel van de test correct wordt ingedeeld. De specificiteit is een maat voor de nauwkeurigheid van een testmethode die categoriale resultaten oplevert, en is een belangrijke factor bij de beoordeling van de relevantie van een testmethode. Huidirritatie: Het ontstaan van reversibele beschadiging van de huid na het aanbrengen van een teststof gedurende maximaal 4 uur. Huidirritatie is een lokaal optredende, niet-immunogene reactie die zich kort na stimulatie voordoet (24). Het voornaamste kenmerk is dat het een reversibel proces is waarbij ontstekingsreacties en de meeste klinische symptomen van ontstekinggerelateerde irritatie (erytheem, oedeem, jeuk en pijn) optreden. 1.3. MOGELIJKHEDEN EN BEPERKINGEN Een beperking van de testen met gereconstrueerde humane epidermis die onder deze testmethode vallen, is dat stoffen daarmee uitsluitend kunnen worden ingedeeld als huidirriterende stoffen van VN-GHS-categorie 2. Aangezien het met deze testen niet mogelijk is om stoffen in de optionele VN-GHS-categorie 3 in te delen, worden alle overige stoffen niet geclassificeerd (geen categorie). Afhankelijk van de eisen op het gebied van regelgeving en eventuele toekomstige toevoeging van nieuwe eindpunten, verbeteringen of de ontwikkeling van nieuwe „me too”-tests, kan het nodig zijn deze testmethode te herzien. Deze testmethode is geëigend voor de identificatie van de gevaarseigenschappen van irriterende stoffen die uit één component bestaan (19), maar geeft geen adequate informatie over huidcorrosie. Gassen en aerosolen kunnen niet getest worden en mengsels zijn tot nu toe nog niet in een valideringsstudie beoordeeld. 1.4. PRINCIPE VAN DE TEST De teststof wordt plaatselijk aangebracht op een driedimensionaal humaan epidermismodel, dat is opgebouwd uit normale epidermale keratinocyten van humane oorsprong, die zijn gekweekt tot een meerlaags, sterk gedifferentieerd model van de humane epidermis. Het model bestaat uit een georganiseerd stratum basale, stratum spinosum en stratum granulosum, en een meerlagig stratum corneum met intercellulaire lamellaire lipidenlagen waarvan de verdeling in het weefsel analoog is aan de patronen die in vivo worden gezien. Het principe van de bepaling met het gereconstrueerde humane epidermismodel berust op de hypothese dat irriterende stoffen door diffusie het stratum corneum kunnen penetreren en cytotoxisch zijn voor de onderliggende cellagen. De levensvatbaarheid van de cellen wordt bepaald door meting van de omzetting door dehydrogenase van de vitale kleurstof MTT (3-[4,5-dimethylthiazool-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide, thiazolylblauw; EINECS-nummer 206-069-5, CAS-nummer 298-93-1) in een blauw formazanzout, dat op kwantitatieve wijze wordt gemeten nadat het uit het weefsel is geëxtraheerd (20). Irriterende stoffen worden geïdentificeerd op grond van hun vermogen om een de levensvatbaarheid van de cellen te verminderen tot onder gedefinieerde drempelwaarden (d.w.z. ≤ 50 %, voor irriterende stoffen van VN-GHS-categorie 2). Stoffen waarbij de levensvatbaarheid van de cellen boven de gedefinieerde drempelwaarde blijft, worden niet geclassificeerd (d.w.z. > 50 %, geen categorie). De testsystemen op basis van gereconstrueerde humane epidermis kunnen gebruikt worden om vaste stoffen, vloeistoffen, halfvaste stoffen en wassen te testen. Vloeistoffen mogen waterig of niet-waterig zijn; vaste stoffen mogen al dan niet in water oplosbaar zijn. Indien mogelijk moeten vaste stoffen in de vorm van een fijn poeder worden getest. Aangezien voor de validering van de testsystemen met een gereconstrueerd humaan epidermismodel 58 zorgvuldig gekozen stoffen zijn gebruikt, die een breed spectrum van chemische klassen vertegenwoordigen, kan verwacht worden dat de methoden algemeen bruikbaar zullen zijn voor stoffen van uiteenlopende chemische klassen (16). In de validering zijn 13 irriterende stoffen van GHS-categorie 2 opgenomen. Er dient te worden opgemerkt dat niet-bijtende zuren, basen, zouten en andere anorganische stoffen niet in de validering zijn opgenomen en dat sommige bekende categorieën irriterende organische stoffen, zoals hydroperoxiden, fenolen en oppervlakteactieve stoffen, niet of slechts tot op zekere hoogte zijn opgenomen. 1.5. AANTONING VAN BEKWAAMHEID Laboratoria kunnen het wenselijk achten om, voordat zij een onder deze testmethode vallende gevalideerde methode routinematig gaan gebruiken, eerst hun technische bekwaamheid te toetsen met de tien stoffen die in tabel 1 worden aanbevolen. Bij deze testmethode wordt de optionele VN-GHS-categorie 3 als geen categorie beschouwd. Voordat, onder deze testmethode, nieuwe soortgelijke (me-too)-methoden die in structureel en functioneel opzicht vergelijkbaar zijn met gevalideerde referentiemethoden, of gewijzigde versies van gevalideerde methoden, voor regelgevingsdoeleinden kunnen worden ingezet, moet aan de hand van de prestatienormen die in het aanhangsel van deze testmethode zijn beschreven, worden aangetoond dat hun betrouwbaarheid en nauwkeurigheid vergelijkbaar zijn met die van de gevalideerde referentiemethoden. Tabel 1. Stoffen voor bekwaamheidstoetsing, een subgroep van de in het aanhangsel opgenomen lijst van referentiestoffen Stof CAS-nummer In vivo score Fysische toestand GHS-categorie Naftaleenazijnzuur 86-87-3 0 s geen cat. Isopropanol 67-63-0 0,3 l geen cat. Methylstearaat 112-61-8 1 s geen cat. Heptylbutyraat 5870-93-9 1,7 l optionele cat. 3 Hexylsalicylaat 6259-76-3 2 l optionele cat. 3 Cyclamenaldehyde 103-95-7 2,3 l cat. 2 1-Broomhexaan 111-25-1 2,7 l cat. 2 Butylmethacrylaat 97-88-1 3 l cat. 2 1-Methyl-3-fenyl-1-piperazine 5271-27-2 3,3 s cat. 2 Heptanal 111-71-7 4 l cat. 2 1.6. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Hieronder volgt een beschrijving van de componenten en procedures van een test met een gereconstrueerd humaan epidermismodel voor het bepalen van huidirritatie. Een gereconstrueerd humaan epidermismodel kan worden vervaardigd, bereid, of commercieel worden verkregen (bv. EpiSkin™, EpiDerm™ en SkinEthic RHE™). Protocollen van de standaardtestmethoden EpiSkin™, EpiDerm™ en SkinEthic RHE™ zijn beschikbaar op [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] (21, 22, 23). De tests moeten als volgt worden uitgevoerd: 1.6.1. Componenten van het gereconstrueerde humane epidermismodel 1.6.1.1. Algemene modelvoorwaarden Om het epitheel op te bouwen moeten normale humane keratinocyten worden gebruikt. Er moeten meerdere lagen levende epitheelcellen (stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum) aanwezig zijn onder een functioneel stratum corneum. Het stratum corneum moet uit meerdere lagen bestaan en het vereiste lipidenprofiel hebben, zodat een sterke en functionele barrière wordt gevormd waar cytotoxische markerstoffen, bv. natriumdodecylsulfaat (SDS) of Triton X-100, niet snel doorheen kunnen dringen. De barrièrefunctie kan beoordeeld worden door de concentratie te bepalen waarin een markerstof de levensvatbaarheid van het weefsel met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd, of door de blootstellingstijd te bepalen die nodig is om de levensvatbaarheid van de cellen met 50 % te doen dalen (ET50) bij aanbrenging van de markerstof in een bepaalde, vaste concentratie. De omsluitingseigenschappen van het model moeten voorkomen dat materiaal om het stratum corneum heen het levende weefsel kan bereiken. Dat zou een slecht model voor huidblootstelling opleveren. Het huidmodel mag niet verontreinigd zijn met bacteriën, virussen, mycoplasma of fungi. 1.6.1.2. Functionele modelvoorwaarden 1.6.1.2.1. Levensvatbaarheid De levensvatbaarheid wordt bij voorkeur gekwantificeerd door middel van de MTT-test (20). De optische dichtheid (OD) van de (opgeloste) kleurstof die wordt geëxtraheerd uit het weefsel dat met de negatieve controlestof (NC) is behandeld, dient ten minste 20 keer zo hoog te zijn als de OD van het extractieoplosmiddel alleen. Ook moet worden aangetoond dat het met NC behandelde weefsel stabiel is in kweek (constante levensvatbaarheidswaarden geeft) voor de duur van de blootstelling. 1.6.1.2.2. Barrièrefunctie Het stratum corneum met de daarin aanwezige lipiden dient sterk genoeg te zijn om snelle penetratie van cytotoxische markerstoffen, bv. SDS of Triton X-100, te weerstaan, wat wordt beoordeeld aan de hand van de IC50 of ET50. 1.6.1.2.3. Morfologie Histologisch onderzoek van de gereconstrueerde huid/epidermis moet door gekwalificeerde medewerkers worden uitgevoerd, die kunnen beoordelen of de structuur van het weefsel op die van humane huid/epidermis lijkt (onder meer een meerlagig stratum corneum). 1.6.1.2.4. Reproduceerbaarheid De resultaten van de methode waarbij een bepaald model wordt gebruikt moeten reproduceerbaar zijn in de tijd, wat bij voorkeur door middel van een geschikte batchcontrolestof (benchmarkstof) wordt vastgesteld (zie aanhangsel). 1.6.1.2.5. Kwaliteitscontroles (QC) van het model Elke weefselbatch van het epidermale model moet voldoen aan bepaalde criteria voor productievrijgave, waarvan de criteria voor levensvatbaarheid (paragraaf 1.6.1.2.1) en barrièrefunctie (paragraaf 1.6.1.2.2) het belangrijkst zijn. Door de leverancier van het huidmodel (of de onderzoeker als het model in het laboratorium zelf is ontwikkeld) moet een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) worden vastgesteld voor de IC50 of de ET50. De barrière-eigenschappen van het weefsel moeten na ontvangst door het laboratorium worden gecontroleerd. Een betrouwbare voorspelling van irritatie-effecten kan uitsluitend worden gedaan op grond van resultaten verkregen met deugdelijk weefsel. Bij wijze van voorbeeld zijn hieronder de aanvaardbaarheidsbereiken voor de gevalideerde referentiemethoden gegeven. Tabel 2. Voorbeelden van QC-criteria voor batchvrijgave Ondergrens aanvaardbaarheid Gemiddelde van aanvaardbaarheidsbereik Bovengrens aanvaardbaarheid Gevalideerde referentiemethode 1 (SDS-behandeling van 18 uur) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Gevalideerde referentiemethode 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h 1.6.1.3. Het aanbrengen van de test- en controlestoffen Voor elke behandeling, ook voor de controles, moet een voldoende aantal weefselmonsters worden gebruikt (ten minste drie per experiment). Voor zowel vloeibare als vaste stoffen geldt dat er zo veel teststof moet worden opgebracht dat het huidoppervlak gelijkmatig bedekt is, d.w.z. ten minste 25 μl/cm2 of 25 mg/cm2, maar er mag geen oneindige dosis (zie 1.2, definities) worden gebruikt. In het geval van vaste stoffen moet het epidermisoppervlak voor aanbrenging worden bevochtigd met gedeïoniseerd of gedestilleerd water, om voor een goed contact met de huid te zorgen. Indien mogelijk moeten vaste stoffen in de vorm van een fijn poeder worden getest. Aan het eind van de blootstellingsperiode moet de teststof zorgvuldig met waterige buffer of 0,9 % NaCl van het huidoppervlak worden gewassen. Afhankelijk van het gereconstrueerde humane epidermismodel dat wordt gebruikt, varieert de blootstellingsperiode van 15 tot 60 minuten, en de incubatietemperatuur van 20 tot 37 °C. Voor details, zie de SOP’s (Standard Operating Procedures) voor de drie methoden (21, 22, 23). In elke studie moeten negatieve controles (NC) en positieve controles (PC) worden gebruikt om aan te tonen dat de levensvatbaarheid (NC), de barrièrefunctie en de resulterende gevoeligheid (PC) van de weefsels binnen een gedefinieerd historisch aanvaardbaarheidsbereik liggen. Als PC-stof wordt een waterige SDS-oplossing van 5 % aanbevolen. Als NC-stoffen zijn water of met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) geschikt. 1.6.1.4. Metingen van de levensvatbaarheid van de cellen Het belangrijkste aspect van de testprocedure is dat de levensvatbaarheid niet onmiddellijk na de blootstelling aan de teststoffen wordt gemeten, maar pas nadat de behandelde en gewassen weefsels voldoende lang zijn geïncubeerd in vers medium. Gedurende deze periode kan het weefsel herstellen van zwak irriterende effecten en vertonen zich duidelijke cytotoxische effecten. In de optimaliseringsfase van de test (9, 10, 11, 12, 13) is gebleken dat een na-incubatie van 42 uur optimaal is, en deze tijd is dan ook aangehouden bij de validering van de referentietestmethoden. De MTT-omzettingstest is een gevalideerde kwantitatieve methode, en de aangewezen methode voor het meten van de levensvatbaarheid van de cellen. De test werkt goed met geconstrueerd driedimensionaal weefsel. Het huidmonster wordt 3 uur in een MTT-oplossing met een geschikte concentratie (bv. 0,3-1 mg/ml) gelegd. Het neergeslagen blauwe formazanproduct wordt vervolgens met een oplosmiddel (bv. isopropanol, aangezuurde isopropanol) uit het weefsel geëxtraheerd, en de formazanconcentratie wordt bepaald door de OD te meten bij 570 nm, bij een bandbreedte van maximaal ongeveer 30 nm. De optische eigenschappen van de teststof of chemische effecten van de teststof op het MTT kunnen de test storen en tot een foutieve bepaling van de levensvatbaarheid leiden (omdat de teststof de kleurproductie kan voorkomen of omkeren, of juist veroorzaken). Dit kan gebeuren als een bepaalde teststof niet volledig van de huid wordt verwijderd door wassen, of als de stof in de epidermis penetreert. Als de teststof rechtstreekse effecten op het MTT heeft, zelf gekleurd is, of tijdens de weefselbehandeling gekleurd raakt, moeten er aanvullende controles worden uitgevoerd om storing van de levensvatbaarheidsmeting door de teststof te detecteren en daarvoor te corrigeren. Voor een gedetailleerde beschrijving van hoe rechtstreekse MTT-reductie kan worden getest, zie het testprotocol bij de gevalideerde referentiemethoden (21, 22, 23). Niet-specifieke kleur (NSC) veroorzaakt door deze storende effecten mag niet meer zijn dan 30 % van NC (met het oog op correcties). Als NSC > 30 %, wordt de teststof als incompatibel met de test beschouwd. 1.6.1.5. Aanvaardbaarheidscriteria voor de test Bij elke test met deugdelijke weefselbatches (zie paragraaf 1.6.1.2.5) geeft de OD die men meet voor met NC behandelde weefsels, per definitie de kwaliteit weer van de weefsels die het hele proces van verzending en ontvangst, evenals alle stappen uit het irritatietestprotocol hebben doorgemaakt. De OD-waarden van controles mogen niet onder historisch vastgestelde ondergrenzen komen. Evenzo komt de gevoeligheid die de weefsels nog bezitten en het vermogen van de weefsels om op een irriterende stof te reageren onder de specifieke omstandigheden van elke test, tot uitdrukking in metingen met weefsels die met PC, bv. 5 % waterige SDS-oplossing, zijn behandeld (de levensvatbaarheid is bijvoorbeeld ≤ 40 % voor gevalideerde referentiemethode 1, en ≤ 20 % voor gevalideerde referentiemethode 2). Er moeten bijbehorende en geschikte grenzen voor de toegestane variabiliteit tussen weefselmonsters worden gedefinieerd (bijvoorbeeld: als standaarddeviaties worden gebruikt moeten die ≤ 18 % zijn). 2. GEGEVENS 2.1. GEGEVENS Voor elke behandeling moeten de gegevens die voor elk individueel testmonster zijn verkregen (bv. OD-waarden en de berekende procentuele levensvatbaarheid van de cellen voor elke teststof, inclusief de classificatie) in tabelvorm worden gerapporteerd, met vermelding van gegevens van eventuele herhaalde experimenten. Daarnaast moeten voor elke bepaling gemiddelden ± standaarddeviatie worden vermeld. Waargenomen interacties met het MTT-reagens en gekleurde teststoffen moeten voor alle geteste stoffen worden gemeld. 2.2. INTERPRETATIE VAN DE RESULTATEN De OD-waarde die voor elk testmonster wordt verkregen kan gebruikt worden voor het berekenen van de procentuele levensvatbaarheid in vergelijking met NC, die op 100 % wordt gesteld. De drempelwaarde van de procentuele levensvatbaarheid van de cellen die als scheiding tussen irriterende en niet-geclassificeerde teststoffen fungeert, en de statistische procedure(s) die worden gebruikt om de resultaten te evalueren en irriterende stoffen te identificeren, moeten duidelijk worden gespecificeerd en gedocumenteerd, en de juistheid daarvan moet worden aangetoond. De voor de gevalideerde referentiemethoden geldende drempelwaarden voor de voorspelling van irritatie zijn hieronder gegeven: De teststof wordt beschouwd als irriterend voor de huid overeenkomstig VN-GHS-categorie 2: i) als de levensvatbaarheid van het weefsel na blootstelling en na-incubatie minder is dan of gelijk is aan (≤) 50 %. De teststof wordt beschouwd als behorend tot geen categorie: ii) als de levensvatbaarheid van het weefsel na blootstelling en na-incubatie meer dan (>) 50 % is. 3. RAPPORTAGE 3.1. TESTRAPPORT Het testrapport moet de volgende informatie bevatten: Test- en controlestoffen: — de chemische naam of namen, zoals de IUPAC- of CAS-naam, en het CAS-nummer, indien dit bekend is; — de zuiverheid en de samenstelling van de stof (in gewichtsprocent(en)); — de fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het onderzoek relevant zijn (bv. fysische toestand, stabiliteit en vluchtigheid, pH, oplosbaarheid in water indien bekend); — de behandeling van de test-/controlestoffen voorafgaand aan de test, indien van toepassing (bv. verwarmen, fijnmalen); — de bewaaromstandigheden. Motivering voor het gebruikte huidmodel en protocol. Testomstandigheden: — het gebruikte celsysteem; — kalibratie-informatie voor de meetapparatuur (bijvoorbeeld een spectrofotometer), en de bandbreedte die voor het meten van de levensvatbaarheid van de cellen is gebruikt; — volledige ondersteunende informatie over het specifieke gebruikte huidmodel, met inbegrip van de deugdelijkheid daarvan. Hieronder moet ten minste informatie zijn over: i) de levensvatbaarheid, ii) de barrièrefunctie, iii) de morfologie, iv) de reproduceerbaarheid en voorspelbaarheid, v) kwaliteitscontroles (QC) van het model; — gedetailleerde informatie over de gebruikte testprocedure; — de gebruikte testdoses, duur van de blootstelling en de na-incubatie; — een beschrijving van eventuele modificaties van de testprocedure; — verwijzingen naar historische gegevens over het model. Deze moeten ten minste omvatten: i) de aanvaardbaarheid van de QC-gegevens met verwijzing naar historische batchgegevens, ii) de aanvaardbaarheid van de waarden voor de positieve en negatieve controles met verwijzing naar gemiddelde waarden en bereiken van negatieve en positieve controles; — een beschrijving van de gebruikte evaluatiecriteria inclusief een motivering van de geselecteerde drempelwaarde(n) voor het voorspellingsmodel. Resultaten: — een tabel met de gegevens voor de individuele testmonsters; — een beschrijving van andere waargenomen effecten. Bespreking van de resultaten. Conclusies. 4. REFERENTIES 1. Verenigde Naties (VN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), tweede herziene uitgave, VN, New York en Genève, 2007. Beschikbaar op: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. 2. REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Beschikbaar op: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. 3. Test Method B.4. Acute toxicity; dermal irritation/corrosion. 4. Test Method B.40. In vitro skin corrosion: transcutaneous electrical resistance test (TER). 5. Test Method B.40 bis. In vitro skin corrosion: Human skin model test. 6. OECD (2006). Test Guideline 435. OECD guideline for the testing of chemicals. In vitro membrane barrier test method. Opgesteld op 19 juli 2006. Beschikbaar op: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. 7. ECVAM (2009) Performance standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Beschikbaar onder Download Study Documents, op: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 8. Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. en Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the management team. Toxicology in Vitro 15, 57-93. 9. Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. en Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765-770. 10. Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. en Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107-114. 11. Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. en Spielmann H. (2005). The EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests — an assessment of the performance of the optimised test. ATLA 33, 351-367. 12. Cotovio, J., Grandidier, M.-H., Portes, P., Roguet, R. en Rubinsteen, G. (2005). The in vitro acute skin irritation of chemicals: optimisation of the EPISKIN prediction model within the framework of the ECVAM validation process. ATLA 33, 329-249. 13. Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. en Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, 109-129. 14. Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. en Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test. ATLA 35, 559-601. 15. Hoffmann, S. (2006). ECVAM skin irritation validation study phase II: Analysis of the primary endpoint MTT and the secondary endpoint IL1-α. 135 blz. + bijlagen. Beschikbaar onder Download Study Documents, op: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 16. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. en Zuang. V (2007). ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Selection of test chemicals. ATLA 35, 603-619. 17. J. Cotovio, M.-H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy — results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol.14, 351-358. 18. ESAC-verklaring betreffende geüpdatete EpiDerm-test en soortgelijke SkinEthic-test, 5 november 2008. 19. EC (2006). Verordening (EG) nr. 1907/2006 van het Europees Parlement en de Raad van 18 december 2006 inzake de registratie en beoordeling van en de autorisatie en beperkingen ten aanzien van chemische stoffen (REACH), tot oprichting van een Europees Agentschap voor chemische stoffen, houdende wijziging van Richtlijn 1999/45/EG en houdende intrekking van Verordening (EEG) nr. 793/93 van de Raad en Verordening (EG) nr. 1488/94 van de Commissie alsmede Richtlijn 76/769/EEG van de Raad en de Richtlijnen 91/155/EEG, 93/67/EEG, 93/105/EG, en 2000/21/EG van de Commissie. Official Journal of the European Union L396/1 van 30.12.2006. OPOCE, Luxemburg. 20. Mosman, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. 21. EpiSkin™ SOP, versie 1.6 (januari 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 hours assay for the prediction of acute skin irritation of chemicals. Beschikbaar onder Download Study Documents, op: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 22. EpiDerm™ SOP, versie 5.0 (oktober 2004). Draft Standard Operating Procedure. In vitro Skin Irritation Test: human skin model. Model: EpiDermTM- 200. Beschikbaar onder Download Study Documents, op: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 23. SkinEthic RHETM SOP. Komt beschikbaar onder Download Study Documents, op: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. 24. Harvell, J.D., Lamminstausta, K, Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis, Mc Graw-Hill, New York, blz. 7-18 25. Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13 november 2008. Aanhangsel Beoordeling van de prestatiekenmerken van voorgestelde in vitro gereconstrueerde humane epidermismodellen voor huidirritatie INLEIDING Voorgestelde procedures die onder deze testmethode vallen moeten geëvalueerd worden aan de hand van stoffen die het volledige bereik van Draize-irritatiescores bestrijken, om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de procedures vast te stellen. Evaluatie van deze voorgestelde procedures met de 20 aanbevolen referentiestoffen (tabel 2) moet betrouwbaarheids- en nauwkeurigheidswaarden opleveren die vergelijkbaar zijn met die van gevalideerde referentiemethode 1 (tabel 3) (1). De normen voor nauwkeurigheid en betrouwbaarheid waaraan moet worden voldaan, zijn hieronder vermeld onder II en III. De groep referentiestoffen omvat niet-geclassificeerde en geclassificeerde (VN-GHS-categorie 2) stoffen, die relevante chemische klassen vertegenwoordigen, zodat de betrouwbaarheid en prestaties (gevoeligheid, specificiteit, percentages fout-negatieve uitslagen, fout-positieve uitslagen en nauwkeurigheid) van de voorgestelde testmethode vergeleken kunnen worden met die van gevalideerde referentiemethode 1. Zowel de betrouwbaarheid van de testmethode als het vermogen om irriterende stoffen van VN-GHS-categorie 2 correct te identificeren, moeten worden bepaald voordat de methode kan worden gebruikt voor het testen van nieuwe stoffen. PRESTATIENORMEN De prestatienormen omvatten de volgende drie elementen: I) essentiële componenten van de testmethode, II) referentiestoffen en III) gespecificeerde nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidswaarden (2). Deze prestatienormen zijn gebaseerd op de prestatienormen gedefinieerd na voltooiing van het huidirritatievalideringsonderzoek van het Europees Centrum voor de validering van alternatieve methoden (ECVAM) (3). I) Essentiële componenten van de testmethode Algemene modelvoorwaarden Om het epitheel op te bouwen moeten normale humane keratinocyten worden gebruikt. Er moeten meerdere lagen levende epitheelcellen (stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum) aanwezig zijn onder een functioneel stratum corneum. Het stratum corneum moet uit verschillende lagen bestaan en het vereiste lipidenprofiel hebben, zodat een sterke en functionele barrière wordt gevormd waar cytotoxische markerstoffen, bv. SDS of Triton X-100, niet snel doorheen kunnen dringen. De barrièrefunctie kan beoordeeld worden door de concentratie te bepalen waarin een markerstof de levensvatbaarheid van het weefsel met 50 % doet dalen (IC50) na een vaste blootstellingstijd, of door de blootstellingstijd te bepalen die nodig is om de levensvatbaarheid van de cellen met 50 % te doen dalen (ET50) bij aanbrenging van de markerstof in een bepaalde, vaste concentratie. De omsluitingseigenschappen van het model moeten voorkomen dat materiaal om het stratum corneum heen het levende weefsel kan bereiken. Dat zou een slecht model voor huidblootstelling opleveren. Het huidmodel mag niet verontreinigd zijn met bacteriën, virussen, mycoplasma of fungi. Functionele modelvoorwaarden Levensvatbaarheid De levensvatbaarheid wordt bij voorkeur gekwantificeerd door middel van de MTT-test (4). De OD van de (opgeloste) kleurstof die uit het met NC behandelde weefsel wordt geëxtraheerd, moet ten minste 20 keer zo hoog zijn als de OD van het extractieoplosmiddel alleen. Ook moet worden aangetoond dat het met NC behandelde weefsel stabiel is in kweek (constante levensvatbaarheidswaarden geeft) voor de duur van de blootstelling. Barrièrefunctie Het stratum corneum met de daarin aanwezige lipiden dient sterk genoeg te zijn om snelle penetratie van cytotoxische markerstoffen, bv. SDS of Triton X-100, te weerstaan, wat wordt beoordeeld aan de hand van de IC50 of ET50. Morfologie Histologisch onderzoek van de gereconstrueerde huid/epidermis moet door gekwalificeerde medewerkers worden uitgevoerd die kunnen beoordelen of de structuur van het weefsel op die van humane huid/epidermis lijkt (onder meer een meerlagig stratum corneum). Reproduceerbaarheid De resultaten van de methode met een specifiek model moeten reproduceerbaar zijn in de tijd, en dit wordt bij voorkeur vastgesteld door middel van een geschikte batchcontrolestof (benchmarkstof) (zie definities onder punt 1.2). Kwaliteitscontroles (QC) van het model Elke weefselbatch van het gebruikte epidermale model moet voldoen aan bepaalde criteria voor productievrijgave, waarvan de criteria voor levensvatbaarheid en barrièrefunctie het belangrijkst zijn. Door de leverancier van het huidmodel (of de onderzoeker als het model in het laboratorium zelf is ontwikkeld) moet een aanvaardbaarheidsbereik (boven- en ondergrens) worden vastgesteld voor de IC50 of de ET50. De barrière-eigenschappen van het weefsel moeten na ontvangst door het laboratorium worden gecontroleerd. Een betrouwbare voorspelling van irritatie-effecten kan uitsluitend worden gedaan op grond van resultaten verkregen met deugdelijk weefsel. Bij wijze van voorbeeld zijn hieronder de aanvaardbaarheidsbereiken voor de gevalideerde referentiemethoden gegeven. Tabel 1. Voorbeelden van QC-criteria voor batchvrijgave Ondergrens aanvaardbaarheid Gemiddelde van aanvaardbaarheidsbereik Bovengrens aanvaardbaarheid Gevalideerde referentiemethode 1 (SDS-behandeling van 18 uur) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Gevalideerde referentiemethode 2 (1 % Triton X-100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h II) Referentiestoffen Referentiestoffen worden gebruikt om na te gaan of de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van een voorgestelde nieuwe testmethode met in vitro gereconstrueerde humane epidermis, die in structureel en functioneel opzicht voldoende gelijkenis vertoont met gevalideerde referentiemethoden, of licht gewijzigd is ten opzichte van een gevalideerde referentiemethode, zich laten vergelijken met de overeenkomstige kwaliteiten van gevalideerde referentiemethode 1 (1). Onder de 20 referentiestoffen die in tabel 2 zijn vermeld bevinden zich zowel stoffen van VN-GHS-categorie 2, als stoffen die verschillende relevante chemische klassen vertegenwoordigen. Deze lijst van stoffen bestaat uit: 10 stoffen van VN-GHS-categorie 2, 3 stoffen van optionele VN-GHS-categorie 3, en 7 niet-ingedeelde stoffen. Bij deze testmethode wordt de optionele categorie 3 als geen categorie beschouwd. Deze referentiestoffen vormen het minimum aan stoffen dat gebruikt moet worden voor de evaluatie van de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van een huidirritatietestmethode met gereconstrueerde humane epidermis. Wanneer een stof uit de lijst niet beschikbaar is, kan een andere stof waarvoor voldoende in-vivoreferentiegegevens beschikbaar zijn, worden gebruikt Indien gewenst kan de minimumlijst van referentiestoffen worden uitgebreid met stoffen die andere chemische klassen vertegenwoordigen en waarvoor voldoende in-vivoreferentiegegevens beschikbaar zijn, om de nauwkeurigheid van de voorgestelde testmethode nader te evalueren. Tabel 2. Referentiestoffen voor de bepaling van de nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidswaarden van huidirritatiemodellen met gereconstrueerde humane epidermis Stof (1) CAS-nr. EINECS-nr. Fysische toestand In vivo score GHS in vitro cat. GHS in vivo cat. 1-broom-4-chloorbutaan 6940-78-9 230-089-3 l 0 cat. 2 geen cat. diethylftalaat 84-66-2 201-550-6 l 0 geen cat. geen cat. naftaleenazijnzuur 86-87-3 201-705-8 s 0 geen cat. geen cat. allylfenoxyacetaat 7493-74-5 231-335-2 l 0,3 geen cat. geen cat. Isopropanol 67-63-0 200-661-7 l 0,3 geen cat. geen cat. 4-methylthiobenzaldehyde 3446-89-7 222-365-7 l 1 cat. 2 geen cat. methylstearaat 112-61-8 203-990-4 s 1 geen cat. geen cat. heptylbutyraat 5870-93-9 227-526-5 l 1,7 geen cat. optionele cat. 3 hexylsalicylaat 6259-76-3 228-408-6 l 2 geen cat. optionele cat. 3 tri-isobutylfosfaat 126-71-6 204-798-3 l 2 cat. 2 optionele cat. 3 1-decanol 112-30-1 203-956-9 l 2,3 cat. 2 cat. 2 cyclamenaldehyde 103-95-7 203-161-7 l 2,3 cat. 2 cat. 2 1-broomhexaan 111-25-1 203-850-2 l 2,7 cat. 2 cat. 2 2-chloormethyl-3,5-dimethyl-4-methoxypyridinehydrochloride 86604-75-3 434-680-9 s 2,7 cat. 2 cat. 2 a-terpineol 98-55-5 202-680-6 l 2,7 cat. 2 cat. 2 di-n-propyldisulfide 629-19-6 211-079-8 l 3 geen cat. cat. 2 butylmethacrylaat 97-88-1 202-615-1 l 3 cat. 2 cat. 2 benzeenthiol, 5-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl 7340-90-1 438-520-9 l 3,3 cat. 2 cat. 2 1-methyl-3-fenyl-1-piperazine 5271-27-2 431-180-2 s 3,3 cat. 2 cat. 2 Heptanal 111-71-7 203-898-4 l 4 cat. 2 cat. 2 De lijst van stoffen in tabel 2 is zodanig samengesteld dat zij een representatieve afspiegeling vormt van de groep van 58 stoffen die in het internationale huidirritatievalideringsonderzoek van het ECVAM zijn gebruikt. De stoffen van tabel 2 zijn aan de hand van de volgende criteria gekozen: — de stoffen zijn commercieel verkrijgbaar — ze bestrijken het volledige bereik van Draize-irritatiescores (van niet-irriterend tot sterk irriterend) — de chemische structuur van de stoffen is goed omschreven — de stoffen zijn representatief voor de in het ECVAM-valideringsonderzoek bepaalde reproduceerbaarheid en voorspellingskracht van de gevalideerde methode — de stoffen zijn representatief voor de chemische functionaliteit die in het valideringsproces is gebruikt — de stoffen kennen geen extreem toxisch profiel (bv. carcinogeen of toxisch voor het voortplantingssysteem) en er zijn ook geen buitensporige verwijderingskosten aan verbonden. III) Gedefinieerde nauwkeurigheids- en betrouwbaarheidswaarden De prestaties (gevoeligheid, specificiteit, percentage fout-negatieve uitslagen, percentage fout-positieve uitslagen en nauwkeurigheid) van de voorgestelde testmethode moeten vergelijkbaar zijn met die van gevalideerde referentiemethode 1 (tabel 3), dat wil zeggen dat de gevoeligheid ten minste (≥) 80 % moet zijn, de specificiteit ten minste (≥) 70 %, en de nauwkeurigheid ten minste (≥) 75 %. De berekening van de prestaties moet gebaseerd zijn op alle classificaties die voor de 20 stoffen in de verschillende deelnemende laboratoria zijn verkregen. In elk laboratorium dient de classificatie van elke stof plaats te vinden op basis van de gemiddelde levensvatbaarheid over de uitgevoerde experimenten (minimaal drie geldige experimenten). Tabel 3 Prestaties van gevalideerde referentiemethode 1 (2) Test-methode Aantal stoffen Gevoeligheid Specificiteit Percentage fout-negatief Percentage fout-positief Nauwkeurigheid Gevalideerde referentiemethode 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Gevalideerde referentiemethode 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % De betrouwbaarheid van de voorgestelde testmethode moet vergelijkbaar zijn met die van de gevalideerde referentiemethoden. Reproduceerbaarheid binnen een laboratorium Bepaling van de intralaboratoriumvariabiliteit zou een concordantie van ten minste (≥) 90 % te zien moeten geven tussen de classificaties van de 20 referentiestoffen (categorie 2/geen categorie), die in verschillende, onafhankelijke experimenten binnen één laboratorium tot stand zijn gekomen. Reproduceerbaarheid tussen laboratoria Het is niet nodig om een bepaling van interlaboratoriumreproduceerbaarheid uit te voeren als de voorgestelde testmethode in slechts een laboratorium zal worden gebruikt. Voor methoden waarvan het de bedoeling is dat zij tussen laboratoria worden overgedragen, moet de concordantie tussen classificaties van de 20 referentiestoffen (categorie 2/geen categorie) die tot stand zijn gekomen in verschillende, onafhankelijke experimenten in bij voorkeur minimaal drie laboratoria, ten minste (≥) 80 % zijn. REFERENTIES 1. Spielmann, H., mailto:Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., mailto:Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. en Zuang, V. (2007). The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EPISKIN and EpiDerm assays and on the skin integrity function test. ATLA 35, 559-601. 2. OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Parijs. 3. ECVAM (2007) Performance standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Beschikbaar onder Download Study Documents, op http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Bereikbaar op 27.10.2008. 4. Mosman, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63. 5. Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. en Zuang. V (2007). ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Selection of test chemicals. ATLA 35, 603-619. (1) De 20 referentiestoffen vormen een representatieve selectie uit de 58 stoffen die oorspronkelijk zijn gebruikt voor de validering van referentiemethode 1 (EpiSkin™). Een volledige lijst van teststoffen en de criteria volgens welke zij worden gekozen is beschikbaar (5). (2) Tabel 3 geeft de prestaties van gevalideerde referentiemethode 1, die betrekking hebben op het vermogen van deze methode om irriterende stoffen (VN-GHS-categorie 2) en niet-geclassificeerde stoffen (geen categorie met inbegrip van optionele categorie 3) correct te identificeren, voor respectievelijk de 58 en 20 referentiestoffen (tabel 2). (3) EpiSkin™ (4) Gebaseerd op 13 irriterende stoffen van GHS-categorie 2. (5) Gebaseerd op 45 irriterende stoffen van GHS-categorie 3 of stoffen zonder GHS-categorie.

BIJLAGE IV C.3. ZOETWATERALGEN EN CYANOBACTERIËN: GROEIREMMINGSTEST 1. METHODE Deze methode komt overeen met OESO TG 201 (2006) (1). 1.1. INLEIDING Testmethoden worden periodiek in het licht van de wetenschappelijke vorderingen getoetst en geactualiseerd. Testmethode C.3 moest worden herzien om er andere soorten in op te nemen en om te voldoen aan de eisen inzake vaststelling van de gevaren en indeling van chemische stoffen. De herziening is uitgevoerd op basis van uitgebreide praktische ervaring, vorderingen van de wetenschap op het gebied van toxiciteitsonderzoek bij algen en uitgebreid gebruik in het kader van regelgeving sinds de oorspronkelijke vaststelling. 1.2. DEFINITIES In de context van deze methode wor