++++

VIJFDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE

van 25 maart 1974

houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders

( 74/203/EEG )

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN ,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap ,

Gelet op de richtlijn van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings - en analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders ( 1 ) , laatstelijk gewijzigd bij de Akte ( 2 ) die is toegevoegd aan het Verdrag betreffende de toetreding van nieuwe Lid-Staten tot de Europese Economische Gemeenschap en de Europese Gemeenschap voor Atoomenergie ( 3 ) , ondertekend te Brussel op 22 januari 1972 , inzonderheid op artikel 2 ,

Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële controle van diervoeders , welke ertoe strekt na te gaan of aan de op grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake de kwaliteit en de samenstelling van diervoeders gestelde eisen is voldaan , geschiedt volgens communautaire bemonsterings - en analysemethoden ;

Overwegende dat bij Richtlijnen nr . 71/250/EEG , nr . 71/393/EEG , nr . 72/199/EEG en nr . 73/46/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 ( 4 ) , 18 november 1971 ( 5 ) , 27 april 1972 ( 6 ) en 5 december 1972 ( 7 ) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden is vastgelegd ; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamheden sindsdien hebben gemaakt het dienstig is een vijfde reeks methoden vast te stellen ;

Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor diervoeders ,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD :

Artikel 1

De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle van diervoeders ten aanzien van het gehalte aan zetmeel en hoogmoleculaire afbraakprodukten hiervan in diervoeders die bietensnijdsels , bietenpulp , gedroogd bieteloof of gedroogde bietekoppen , aardappelpulp , gedroogde gist , produkten met een hoog inulinegehalte of kanen bevatten , geschieden volgens de in de bijlage I bij deze richtlijn omschreven methoden .

De algemene bepalingen welke vermeld staan in het deel 1 ( inleiding ) van de bijlage van de Eerste Richtlijn nr . 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 , zijn toepasselijk op de methode beschreven in bijlage I van deze richtlijn .

Artikel 2

De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle van diervoeders ten aanzien van hun gehalte aan amprolium , ethopabaat , dinitolmide ( DOT ) , nicarbazin en menadion ( vitamine K3 ) geschieden volgens de in bijlage * bij deze richtlijn omschreven methoden .

De algemene bepalingen van deel I ( inleiding ) van de bijlage van de Eerste Richtlijn nr . 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 zijn , met uitzondering van het deel betreffende de voorbereiding van het analysemonster , op de methoden beschreven in bijlage II van deze richtlijn toepasselijk .

Artikel 3

De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 november 1974 de nodige wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden ten einde hun wetgeving in overeenstemming te brengen met deze richtlijn . Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan in kennis .

Artikel 4

Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten .

Gedaan te Brussel , 25 maart 1974 .

Voor de Commissie

De Voorzitter

François-Xavier ORTOLI

( 1 ) PB nr . L 170 van 3 . 8 . 1970 , blz . 2 .

( 2 ) PB nr . L 73 van 27 . 3 . 1972 , blz . 14 .

( 3 ) PB nr . L 73 van 27 . 3 . 1972 , blz . 5 .

( 4 ) PB nr . L 155 van 12 . 7 . 1971 , blz . 13 .

( 5 ) PB nr . L 279 van 20 . 12 . 1971 , blz . 7 .

( 6 ) PB nr . L 123 van 29 . 5 . 1972 , blz . 6 .

( 7 ) PB nr . L 83 van 30 . 3 . 1973 , blz . 21 .

BIJLAGE I

BEPALING VAN ZETMEEL

- Pancreatine methode -

1 . Doel en toepasbaarheid

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van gehalte aan zetmeel en hoogmoleculaire afbraakprodukten hiervan in diervoeders die bietensnijdsels , bietenpulp , gedroogd bieteloof of gedroogde bietekoppen , aardappelpulp , gedroogde gist , produkten met een hoog inulinegehalte ( b.v . topinamboersnijdsels en -meel ) of kanen bevatten . De bepaling wordt alleen uitgevoerd indien uit het microscopisch onderzoek blijkt dat het monster niet onaanzienlijke hoeveelheden zetmeel bevat .

2 . Principe

De in het monster aanwezige suikers worden met ethanol geëxtraheerd . Het zetmeel in het residu van de extractie wordt met behulp van pancreatine omgezet tot suikers . Deze suikers worden met zoutzuur gehydrolyseerd en de gevormde glucose wordt bepaald volgens Luff-Schoorl . Door vermenigvuldiging van de aldus verkregen hoeveelheid glucose met een constante factor verkrijgt men het gehalte aan zetmeel in het monster .

3 . Reagentia

3.1 . Ethanol 90 % ( v/v ) , neutraal op fenolftaleïen .

3.2 . n-amylalcohol p.a .

3.3 . Tolueen p.a .

3.4 . Bufferoplossing : los op in water 9,078 g kalium diwaterstof fosfaat KH2PO4 en 11,876 g dinatrium waterstof fosfaat Na2HPO4.2H2O . Vul aan met water tot 1.1 .

3.5 . Natriumchloride-oplossing 0,2 N .

3.6 . Carrez-I-oplossing : los op in water 21,9 g zinkacetaat Zn(CH3COO)2 * 2H2O en 3 g ijsazijn en vul aan met water tot 100 ml .

3.7 . Carrez-II-oplossing : los op in water 10,6 g kalium hexacyanoferraat ( II ) K4 ( Fe ( CN6 ) ) * 3H2O en vul aan met water tot 100 ml .

3.8 . Zoutzuur N .

3.9 . Zoutzuur p.a . , ca . 8 N , d : 1,125

3.10 . Natronloog p.a . , ca . 10 N , d : 1,33

3.11 . Indicator : Methyloranje-oplossing 1 g/l .

3.12 . Pancreatine , poedervormig , overeenkomstig de voorschriften vermeld sub 8 . In het donker en vochtvrij bewaren in gesloten flessen .

3.13 . Reagens volgens Luff-Schoorl : giet onder voorzichtig roeren de citroenzuuroplossing ( 3.13.2 ) bij de natriumcarbonaatoplossing ( 3.13.3 ) ; voeg dan de kopersulfaatoplossing ( 3.13.1 ) toe en vul aan met water tot 1 l . Laat één nacht staan en filtreer . Controleer de normaliteit van het aldus verkregen reagens ( Cu 0,1 N ; Na2 CO3 2 N ) . De pH van de oplossing moet ongeveer 9,4 bedragen .

3.13.1 . Kopersulfaatoplossing : los op 25 g kopersulfaat p.a . Cu SO4.5H2O in 100 ml water .

3.13.2 . Citroenzuuroplossing : los op 50 g citroenzuur p.a . C6H8O7.H2O in 50 ml water .

3.13.3 . Natriumcarbonaatoplossing : los op 143,8 g natriumcarbonaat p.a . , watervrij , in ca . 300 ml warm water . Laat afkoelen .

3.14 . Puimsteenkorrels met zoutzuur uitgekookt , met water gewassen en gedroogd .

3.15 . Kaliumjodide-oplossing p.a . 300 g/l .

3.16 . Zwavelzuur , ca . 6 N , d : 1,18

3.17 . Natriumthiosulfaatoplossing 0,1 N .

3.18 . Zetmeeloplossing : voeg toe aan 1 l kokend water een mengsel van 5 g oplosbaar zetmeel in 30 ml water ; houd gedurende 3 minuten aan de kook en laat vervolgens afkoelen . Vlak voor het gebruik te bereiden .

4 . Apparatuur

4.1 . Extractie-apparaat ( zie figuur op blz . 12 ) , bestaande uit :

4.1.1 . Een conische kolf van 500 ml met wijde hals .

4.1.2 . Een terugvloeikoeler met stop passend op de conische kolf 4.1.1 .

4.1.3 . Een in de binnenbuis van de koeler beweegbare staaf , aan het benedeneinde voorzien van haken ; een klem voor het bevestigen van de staaf .

4.1.4 . Een metalen houder die aan de haken van de staaf ( 4.1.3 ) wordt opgehangen en die de filterkroes ( 4.1.5 ) draagt .

4.1.5 . Een filterkroes voor snel filtreren , maximale poriën wijdte : 90 à 150 um ( b.v . G1 ) , inhoud ca . 30 ml .

4.1.6 . Filtreerpapier van een voor de filterkroes ( 4.1.5 ) passend formaat .

4.2 . Broedstoof , ingesteld op 38 * C .

4.3 . Maatkolven van 200 ml met normaalslijpstuk en terugvloeikoeler .

4.4 . Maatkolven van 100 ml met normaalslijpstuk en terugvloeikoeler .

5 . Uitvoering

5.1 . Bereiding van het monster .

Maak het monster zo fijn dat het een zeef met mazen van 0,5 mm maaswijdte kan passeren .

5.2 . Extractie

Weeg af tot op 1 mg nauwkeurig 2 g van het monster en breng deze in de filterkroes ( 4.1.5 ) , waarvan de bodem bedekt is met een met ethanol ( 3.1 ) bevochtigd filtreerpapier ( 4.1.6 ) . Breng 55 ml ethanol ( 3.1 ) en enkele puimsteenkorrels ( 3.14 ) in de conische kolf ( 4.1.1 ) . Plaats de filterkroes in de metalen houder ( 4.1.4 ) en hang deze op aan de haken van de staaf ( 4.1.3 ) . Plaats de koelder ( 4.1.2 ) op de conische kolf en laat de staaf zover zakken dat de bodem van de kroes het ethanoloppervlak raakt . Fixeer de staaf met behulp van de klem op deze hoogte . Breng de ethanol aan de kook en houd gedurende 3 uren op kooktemperatuur . Laat vervolgens afkoelen en breng de staaf ( 4.1.3 ) zover omhoog dat de kroes zich zo hoog mogelijk in de kolf bevindt . Verwijder voorzichtig de stop van de kolf en laat 45 ml water langs de wand van de kolf toevloeien . Plaats de koeler opnieuw op de kolf en houd de filterkroes op 10 cm boven het vloeistofniveau . Breng de vloeistof aan de kook en houd gedurende 3 uren op kooktemperatuur . Laat vervolgens afkoelen , verwijder de stop van de kolf en neem de kroes uit de houder .

5.3 . Omzetting tot suikers en hydrolyse

Plaats de kroes op een afzuigkolf en laat droogzuigen . Breng het residu van de extractie in een mortier en maak het fijn . Breng het poeder met ca . 60 ml water kwantitatief over in een maatkolf van 200 ml met normaalslijpstuk en voeg toe enkele druppels amylalcohol ( 3.2 ) . Verbind de kolf met de terugvloeikoeler . Breng aan de kook en houd gedurende 1 uur op kooktemperatuur . Laat vervolgens afkoelen en verwijder de koeler .

Voeg toe 25 ml bufferoplossing ( 3.4 ) , 250 mg pancreatine ( 3.12 ) , 2,5 ml natriumchlorideoplossing ( 3.5 ) en 10 druppels tolueen ( 3.3 ) . Zwenk gedurende 2 minuten om en plaats de kolf daarna gedurende 21 uur in de broedstoof ( 4.2 ) ; zwenk van tijd tot tijd om . Laat vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur .

Voeg toe 5 ml Carrez-I-oplossing ( 3.6 ) en zwenk gedurende 1 minuut om . Voeg vervolgens toe 5 ml Carrez-II-oplossing ( 3.7 ) en zwenk opnieuw gedurende 1 minuut om . Vul de inhoud met water aan , homoger iseer en filtreer . Pipetteer 50 ml van het filtraat in een maatkolf van 100 ml ( of 100 ml in een maatkolf van 200 ml ) . Voeg toe enkele druppels indicator ( 3.11 ) en vervolgens zoutzuur 8 N ( 3.9 ) tot omslag naar rood . Voeg daarna een overmaat van 6,25 ml zoutzuur 8 N ( 3.9 ) toe ( of 12,50 ml in geval van 100 ml filtraat ) . Verbind de kolf met de terugvloeikoeler , breng de oplossing aan de kook en houd gedurende 1 uur op kooktemperatuur . Laat afkoelen , neutraliseer met natronloog 10 N ( 3.10 ) tot omslag van de indicator naar geel . Maak vervolgens de oplossing zwak zuur door toevoeging van een weinig zoutzuur N ( 3.8 ) , vul de inhoud met water aan en homogeniseer . Bepaal de hoeveelheid glucose volgens Luff-Schoorl zoals aangegeven in 5.4 .

5.4 . Titratie volgens Luff-Schoorl

Pipetteer 25 ml van het reagens volgens Luff-Schoorl ( 3.13 ) in een conische kolf van 300 ml ; voeg precies 25 ml van de in 5.3 verkregen oplossing toe , die ten hoogste 60 mg glucose mag bevatten . Voeg twee puimsteenkorrels ( 3.14 ) toe en verwarm onder omzwenken met de hand boven een vrije vlam van matige hoogte zodanig dat de vloeistof in ongeveer 2 minuten kookt . Plaats de conische kolf onmiddellijk op een draadgaas voorzien van een astbestplaat met een opening van ongeveer 6 cm doorsnede ; onder het draadgaas dient van tevoren een vlam te zijn aangestoken , die zo wordt geregeld dat alleen de bodem van de kolf wordt verwarmd . Verbind vervolgens de kolf met een terugvloeikoeler . Laat vanaf dit ogenblik gedurende precies 10 minuten koken , koel onmiddellijk af in koud water en titreer na ongeveer 5 minuten als volgt :

Voeg aan de vloeistof toe 10 ml kaliumjodide-oplossing ( 3.15 ) en onmiddellijk daarna voorzichtig wegens het gevaar voor overvloedige schuimvorming 25 ml zwavelzuur 6 N ( 3.16 ) . Titreer dan met natriumthiosulfaatoplossing 0,1 N ( 3.17 ) tot de oplossing vaalgeel kleurt ; voeg de zetmeeloplossing als indicator ( 3.18 ) toe en beëindig de titratie .

Verricht een zelfde titratie in een mengsel van precies 25 ml reagens volgens Luff-Schoorl ( 3.13 ) en 25 ml water , na toevoeging van 10 ml kaliumjodide-oplossing ( 3.15 ) en 25 ml zwavelzuur 6 N ( 3.16 ) , echter zonder verwarmen .

5.5 . Blancoproef

Verricht een blancoproef volgens de in 5.3 en 5.4 beschreven werkwijze , echter zonder monster .

6 . Berekening van de resultaten

Bepaal - zowel voor de analyse van het monster als voor de analyse van de blancoproef - met behulp van de tabel in bijlage de hoeveelheid glucose in mg die overeenkomt met het verschil tussen de resultaten van de twee titraties ( uitgedrukt in ml natriumthiosulfaat 0,1 N ) .

Bereken het gehalte aan zetmeel in het monster in procenten uit de formule :

0,72 ( a - b )

waarin :

a = mg glucose gevonden bij de analyse van het monster ,

b = mg glucose gevonden bij de analyse van de blancoproef ( zie opmerking 7.2 ) .

7 . Opmerkingen

7.1 . Door de gelijktijdige aanwezigheid van gedeeltelijk of volledig verstijfseld zetmeel en van lactose in het monster kan 0,5 tot 3 % zetmeel teveel gevonden worden . In dat geval wordt het werkelijke zetmeelgehalte als volgt verkregen :

( a ) bepaald het gehalte aan reducerende suiker van het in 5.2 verkregen ethanolextract en geef het resultaat weer in procenten glucose ;

( b ) bepaal het gehalte aan in water oplosbare reducerende suikers in het monster en geef het resultaat weer in procenten glucose ;

( c ) trek het sub ( a ) verkregen resultaat van het sub ( b ) verkregen resultaat af en vermenigvuldig het verschil met 0,9 ;

( d ) trek de sub ( c ) verkregen waarde af van het zetmeelgehalte dat bij toepassing van de methode is verkregen en volgens 6 is berekend .

7.2 . De hoeveelheid glucose gevonden bij de analyse van de blancoproef bedraagt normaal 0,25 mg . Zij mag niet meer dan 0,50 mg bedragen .

8 . Voorschriften aangaande de pancreatine

Uiterlijke kenmerken : wit-geelachtig poeder , amorf .

Glucosegehalte : de hoeveelheid glucose van de blancoproef ( zie 5.5 ) bedraagt normaal 0,25 mg . Een hoeveelheid van meer dan 0,50 mg wijst erop dat de pancreatine niet meer te gebruiken is .

Controle van het jodiumverbruik : suspendeer 62,5 mg pancreatine in ca . 50 ml water van 25 à 30 * C . Voeg toe 1 ml jodiumoplossing 0,1 N . Zwenk gedurende 2 minuten om . Titreer met een natriumthiosulfaatoplossing 0,1 N in aanwezigheid van een zetmeeloplossing als indicator . Het verbruik van jodiumoplossing door de pancreatine mag niet meer dan 0,5 ml bedragen .

Controle van de amylolytische activiteit : meng 100 ml zetmeeloplossing ( 3.18 ) , 5 ml bufferoplossing ( 3.4 ) , 0,5 ml natriumchloride-oplossing ( 3.5 ) en 62,5 mg pancreatine . Breng dit mengsel op een temperatuur van 25 à 30 * C en schud gedurende 2 minuten . Voeg onmiddellijk daarna toe 1 ml jodiumoplossing 0,1 N . De blauwe kleur moet binnen 15 minuten na toevoeging van de jodiumoplossing verdwenen zijn .

Tabel van de waarden voor 25 ml reagens volgens Luff-Schoorl

ml Na2S2O3 0,1 N , verwarmd gedurende 2 minuten , aan de kook gedurende 10 minuten

Na2S2O3 0,1 N * Glucose , fructose , invertsuikers C6H12O6 * Lactose C12H22O11 * Maltose C12H22O11 * Na2S2O3 0,1 N *

ml * mg * verschil * mg * verschil * mg * verschil * ml *

1 * 2,4 * * 3,6 * * 3,9 * * 1 *

* * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *

2 * 4,8 * * 7,3 * * 7,8 * * 2 *

* * 2,4 * * 3,7 * * 3,9 * *

3 * 7,2 * * 11,0 * * 11,7 * * 3 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *

4 * 9,7 * * 14,7 * * 15,6 * * 4 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *

5 * 12,2 * * 18,4 * * 19,6 * * 5 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 3,9 * *

6 * 14,7 * * 22,1 * * 23,5 * * 6 *

* * 2,5 * * 3,7 * * 4,0 * *

7 * 17,2 * * 25,8 * * 27,5 * * 7 *

* * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *

8 * 19,8 * * 29,5 * * 31,5 * * 8 *

* * 2,6 * * 3,7 * * 4,0 * *

9 * 22,4 * * 33,2 * * 35,5 * * 9 *

* * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *

10 * 25,0 * * 37,0 * * 39,5 * * 10 *

* * 2,6 * * 3,8 * * 4,0 * *

11 * 27,6 * * 40,8 * * 43,5 * * 11 *

* * 2,7 * * 3,8 * * 4,0 * *

12 * 30,3 * * 44,6 * * 47,5 * * 12 *

* * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *

13 * 33,0 * * 48,4 * * 51,6 * * 13 *

* * 2,7 * * 3,8 * * 4,1 * *

14 * 35,7 * * 52,2 * * 55,7 * * 14 *

* * 2,8 * * 3,8 * * 4,1 * *

15 * 38,5 * * 56,0 * * 59,8 * * 15 *

* * 2,8 * * 3,9 * * 4,1 * *

16 * 41,3 * * 59,9 * * 63,9 * * 16 *

* * 2,9 * * 3,9 * * 4,1 * *

17 * 44,2 * * 63,8 * * 68,0 * * 17 *

* * 2,9 * * 3,9 * * 4,2 * *

18 * 47,1 * * 67,7 * * 72,2 * * 18 *

* * 2,9 * * 4,0 * * 4,3 * *

19 * 50,0 * * 71,7 * * 76,5 * * 19 *

* * 3,0 * * 4,0 * * 4,4 * *

20 * 53,0 * * 75,7 * * 80,9 * * 20 *

* * 3,0 * * 4,1 * * 4,5 * *

21 * 56,0 * * 79,8 * * 85,4 * * 21 *

* * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *

22 * 59,1 * * 83,9 * * 90,0 * * 22 *

* * 3,1 * * 4,1 * * 4,6 * *

23 * 62,2 * * 88,0 * * 94,6 * * 23 *

Figur : zie P.b .

BIJLAGE II

1 . BEPALING VAN AMPROLIUM

( 1-(4-amino-2-propyl-5-pyrimidylmethyl)-2-picolinium - chloride-hydrochloride )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan amprolium in diervoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 40 mg/kg .

2 . Principe

Het monster wordt met verdunde methanol geëxtraheerd . Het extract wordt met een aluminiumoxydekolom gezuiverd en met een oplossing van 2,7-dihydroxynaftaleen , kaliumhexacyanoferraat ( III ) , kaliumcyanide en natriumhydroxyde in methanol behandeld . Er ontstaat een purperen kleur waarvan de extinctie spectrofotometrisch bij 530 nm wordt gemeten .

3 . Reagentia

3.1 . Methanol p.a .

3.2 . Verdunde methanol : meng 2 volumedelen methanol ( 3.1 ) met 1 volumedeel water .

3.3 . Kaliumhexacyanoferraat ( III)-oplossing K3Fe(Cn)6 p.a . 0,2 % ( g/v ) .

Deze oplossing is twee weken houdbaar .

3.4 . Kaliumcyanide-oplossing p.a . 1 % ( g/v ) . Deze oplossing is twee weken houdbaar .

3.5 . Natriumhydroxyde-oplossing p.a . 1,125 % ( g/v ) .

3.6 . Methanolische natriumhydroxyde-oplossing : van oplossing ( 3.5 ) worden 15 ml verdund met methanol ( 3.1 ) tot 200 ml .

3.7 . 2,7-dihydroxynaftaleen-oplossing 0,0025 % : los 25 mg 2,7-dihydroxynaftaleen p.a . in methanol ( 3.1 ) op en vul aan tot 1 000 ml met methanol ( 3.1 ) .

3.8 . Kleurreagens : breng 90 ml 2,7-dihydroxynaftaleenoplossing ( 3.7 ) in een erlenmeyer van 250 ml ( 4.1 ) en meng met 5 ml kaliumhexacyanoferraat ( III)-oplossing ( 3.2 ) . Sluit na toevoeging van 5 ml kaliumcyanide-oplossing ( 3.3 ) de erlenmeyer af , meng en laat 30 tot 35 minuten staan . Voeg vervolgens 100 ml methanolische natriumhydroxyde-oplossing ( 3.6 ) toe ; meng de oplossing goed en filtreer door een filterkroesje ( 4.3 ) af .

Dit reagens moet binnen 75 minuten na het filtreren worden gebruikt .

3.9 . Aluminiumoxyde voor kolomchromatografie . Schud , voor het gebruik , 100 g alunimoxyde met 500 ml water gedurende 30 minuten , filtreer de suspensie en was de afgefiltreerde massa driemaal met telkens 50 ml methanol ( 3.1 ) af , droog door afzuigen en laat het een nacht staan ; droog het vervolgens gedurende 2 uren in de vacuumdroogstoof bij een temperatuur van 100 * C . Laat het daarna in de exsiccator afkoelen . Controleer de activiteit door een bepaalde hoeveelheid van de standaardoplossing ( 3.11 ) volgens de methode vanaf punt 5.2 . Het daarbij gevonden percentage van het amprolium moet 100 % + 4 % bedragen .

3.10 . Standaard : amprolium overeenkomstig de volgende zuiverheidscriteria : smeltpunt onder ontleding : 248 * C .

Moleculaire extinctiecoëfficient bij 265 en 235 nm in gedestilleerd water : 11,0 maal 10 3 .

3.11 . Standaardoplossing : Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig 50 mg van de standaard ( 3.10 ) af en los met verdunde methanol ( 3.2 ) op in een maatkolf van 500 ml . Vul aan tot het volume met hetzelfde oplosmiddel en meng goed . Pipetteer 10,0 ml van deze oplossing af , vul aan tot 50 ml met verdunde methanol ( 3.2 ) in een maatkolf en meng goed . 1 ml van deze oplossing bevat 20 mg amprolium .

4 . Apparatuur

4.1 . Erlenmeyers van respectievelijk 50 , 250 em 500 ml met ingeslepen stoppen .

4.2 . Schudmachine .

4.3 . Filterkroesje , poreusheid G 3 , diameter : 60 mm .

4.4 . Glazen chromatografiebuizen ( inwendige diameter : 9 mm , lengte 400 - 500 mm ) .

4.5 . Centrifuge , met buizen van 25 ml met ingeslepen stoppen .

4.6 . Spectrofotometer , met cuvetten van 10 mm optische weglengte .

5 . Uitvoering

5.1 . Extractie en zuivering

5.1.1 . Diervoeders en voormengsels

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig 10 g van het fijngemaakte gehomogeniseerde monster af ( van voormengsels 3 tot 6 g tot op 1 mg nauwkeurig ) en breng deze in een erlenmeyer van 250 ml ( 4.1 ) . Voeg hier precies 100 ml verdunde methanol ( 3.2 ) aan toe en schud gedurende 60 minuten . Verdun zo nodig met verdunde methanol ( 3.2 ) , ten einde een amproliumgehalte van 5 tot 15 mg per ml te verkrijgen .

Breng 5 g aluminiumoxyde ( 3.9 ) en vervolgens 25,0 ml van het extract in een chromatografeerbuis ( 4.4 ) die vooraf van een prop watten werd voorzien . Laat de vloeistof door de kolom lopen , verwijder de eerste 5 ml en vang de volgende 12 ml op in een maatglas .

5.1.2 . Concentraten

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig 0,5 g van het fijngemaakte en gehomogeniseerde monster af en breng deze in een erlenmeyer van 500 ml ( 4.1 ) . Voeg hieraan 250 ml verdunde methanol ( 3.2 ) toe , schud gedurende 60 minuten en filtreer . Pipetteer 5,0 ml van het filtraat af in een maatkolf van 200 ml , vul deze met verdunde methanol ( 3.2 ) aan en meng .

5.2 . Kleurontwikkeling en meting van de extinctie

Pipetteer 5,0 ml van de onder 5.1.1 , resp . 5.1.2 verkregen oplossing in een centrifugebuis A ( 4.5 ) en 5,0 ml verdunde methanol ( 3.2 ) in een centrifugebuis B ( 4.5 ) . Breng 10,0 ml van het kleurreagens ( 3.8 ) in de twee buizen ; sluit deze buizen af , meng en laat 18 minuten staan . Centrifugeer de oplossingen A en B 3 minuten zodanig dat een heldere oplossing verkregen wordt en decanteer in erlenmeyers van 50 ml ( 4.1 ) .

Meet onmiddellijk hierna de extinctie van oplossing A fotometrisch bij 530 nm ; oplossing B geldt hierbij als blanco . Bepaald de hoeveelheid amprolium aan de hand van de ijklijn ( 5.3 ) .

5.3 . IJklijn

Breng 1,0 - 2,0 - 3,0 - 4,0 en 5,0 ml van de standaardoplossing ( 3.11 ) in centrifugebuizen ( 4.5 ) . Vul de oplossingen in de eerste vier buizen aan tot 5,0 ml met verdunde methanol ( 3.2 ) . Voeg 10,0 ml van het kleurreagens ( 3.8 ) toe in de vijf buizen . Sluit de buizen af , meng en laat 18 minuten staan . Decanteer de oplossingen na 3 minuten centrifugeren in erlenmeyers van 50 ml ( 4.1 ) .

Meet onmiddellijk hierna de extinctie van de oplossingen fotometrisch bij 530 nm ; 5 ml verdunde methanol ( 3.2 ) met 10 ml kleurreagens ( 3.8 ) geldt hierbij als blanco . Teken de ijklijn door de extinctiewaarden uit te zetten op de ordinaat en de overeenkomstige hoeveelheden amprolium in mg op de abscis .

6 . Berekening van de resultaten

6.1 . Diervoeders en voormengsels

Het gehalte aan amprolium van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :

A/P * F . 20 000

waarin :

A = door fotometrische meting bepaalde hoeveelheid amprolium in mg

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g

F = verdunningscoëfficiënt ( zoals eventueel toegepast onder 5.1.1 ) .

6.2 . Concentraten

Het gehalte aan amprolium van het monster in % wordt berekend met behulp van de volgende formule :

A/P * 200

waarin :

A = door fotometrische meting bepaalde hoeveelheid amprolium in mg

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

10 dpm absoluut voor amproliumgehalten van minder dan 100 mg/kg ;

10 % relatief voor amproliumgehalten van 100 tot 5 000 mg/kg ;

500 dpm absoluut voor amproliumgehalten van 5 000 tot 10 000 mg/kg ;

5 % relatief voor amproliumgehalten van meer dan 10 000 mg/kg .

2 . BEPALING VAN ETHOPABAAT

( 4-acetamido-2-ethoxy-methylbenzoaat )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan ethopabaat in diervoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 2 mg/kg .

2 . Principe

Het monster wordt met verdunde methanol geëxtraheerd . De oplossing wordt aangezuurd en met chloroform geëxtraheerd . Het chloroform extract wordt eerst met een alkalische oplossing en vervolgens met water gewassen . Het gezuiverde extract wordt geconcentreerd en het ethopabaat wordt met verdund zoutzuur gehydroliseerd . Het aldus gevormde aminoderivaat wordt gediazoteerd en met N-(1-naftyl)-etheendiamine gekoppeld . Het gekleurde complex wordt met butanol geëxtraheerd en de extinctie van de oplossing wordt gemeten bij 555 nm .

3 . Reagentia

3.1 . Methanol p.a .

3.2 . Methanol 50 % ( v/v ) : mengsel van een gelijk volume methanol ( 3.1 ) en water .

3.3 . Zoutzuur p.a . , d : 1,19 .

3.4 . Tot 1/10 verdund zoutzuur : Vul 10,0 ml zoutzuur ( 3.3 ) tot 100 ml aan met water .

3.5 . Zoutzuur ca . 0,3 N : Vul 25,0 ml zoutzuur ( 3.3 ) aan tot 1 000 ml met water .

3.6 . Chloroform p.a .

3.7 . Natriumcarbonaat-oplossing 4 % ( g/v ) : los 40,0 g watervrij natriumcarbonaat p.a . in water op en vul tot 1 000 ml aan met water .

3.8 . Natriumnitrietoplossing 0,2 % ( g/v ) : los 100 mg natriumnitriet p.a . in water op en vul tot 50 ml aan met water in een maatkolf . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.9 . Ammoniumsulfamaatoplossing 1,0 % ( g/v ) : Los 500 mg ammoniumsulfamaat ( ammoniumamidosulfamaat ) p.a . in water op en vul aan tot 50 ml met water in een maatkolf . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.10 . N-(1-naftyl)-etheendiamine-oplossing 0,2 % ( g/v ) : Los 100 mg N-(1-naftyl)-etheendiamine . H cl p.a . in water op en vul aan tot 50 ml met water in een maatkolf . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.11 . Natriumchloride p.a . , watervrij .

3.12 . n-Butanol p.a .

3.13 . Standaard : zuiver ethopabaat .

3.14 . Standaardoplossingen :

3.14.1 . Ethopabaat-oplossing 0,040 mg/ml : weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig 40 mg van de standaard ( 3.13 ) af en los deze met verdunde methanol ( 3.2 ) op in een maatkolf van 100 ml ; vul aan met hetzelfde oplosmiddel en meng goed . Pipetteer van de oplossing 10,0 ml af in een maatkolf van 100 ml , vul deze met methanol ( 3.2 ) aan tot 100 ml in een maatkolf en meng . Deze oplossing is een maand houdbaar .

3.14.2 . Ethopabast-oplossing 0,016 mg/20 ml : Pipetteer 5,0 ml van de oplossing ( 3.14.1 ) in een maatkolf van 250 ml , vul aan met verdund methanol ( 3.2 ) en meng . Bereid deze oplossing direct voor gebruik .

4 . Apparatuur

4.1 . Erlenmeyers van 250 ml met ingeslepen stoppen

4.2 . Scheitrechter van 100 ml met ingeslepen stoppen

4.3 . Schudmachine

4.4 . Vacuuemrotatieverdamper met ronde bodemkolven van 250 ml

4.5 . Waterbad

4.6 . Centrifuge met buizen van 50 en 15 ml met normaalslijstukken

4.7 . Luchtkoelers met normaal slijpstuk

4.8 . Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte

5 . Uitvoering

4.1 . Extratie

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig een hoeveelheid van het fijngemaakte en gehomogeniseerd monster af die ongeveer 80 mg ethopabaat bevat , breng deze over in een erlenmeyer van 250 ml en voeg 100,0 ml verdund methanol ( 3.2 ) toe .

Sluit de kolf af en schud gedurende 1 uur met behulp van de schudmachine ( 4.3 ) . Laat vervolgens bezinken en filtreer ; verwijder de eerste paar ml van het filtraat .

5.2 . Zuivering

N.B . : De onder dit punt beschreven bewerkingen moeten snel worden uitgevoerd .

Breng 20,0 ml van het heldere extract in een scheitrechter van 100 ml ( 4.2 ) en voeg 5,0 ml 1/10 verdund zoutzuur ( 3.4 ) en 20,0 ml chloroform ( 3.6 ) toe . Schud eerst voorzichtig en vervolgens gedurende 3 minuten krachtig en laat staan . Breng na scheiding van de fasen de chloroformfase over in een tweede scheitrechter van 100 ml ( 4.2 ) .

Extraheer de zure fase nog tweemaal achtereenvolgens met telkens 20,0 ml chloroform ( 3.6 ) . Verzamel de chloroformextracten in de tweede scheitrechter en verwijder de zure fase . Voeg aan de verzamelde chloroform extracten 10 ml van de natriumcarbonaat-oplossing ( 3.7 ) toe , schud gedurende 3 minuten en laat staan tot de fasen zich gescheiden hebben . Breng de chloroformfase over in een derde scheitrechter van 100 ml ( 4.2 ) en gooi de waterfase weg . Voeg 10 ml van de natriumcarbonaatoplossing ( 3.7 ) aan de chloroformoplossing toe ; schud gedurende 3 minuten en laat staan tot de fasen zich gescheiden hebben .

Breng de chloroformfase over in een vierde scheitrechter van 100 ml ( 4.2 ) en was deze fase tweemaal achtereenvolgens met telkens 25 ml water ; scheid de waterfasen af en vang het chloroformextract kwantifatief op in een kolf van 250 ml ( 4.4 ) . Verenig de waterfasen , spoel de gebruïkte scheitrechters met enige ml chloroform ( 3.6 ) en was de waterfasen met deze zelfde chloroform . Voeg na de scheiding de chloroformfase aan het in de kolf opgevangen extract toe .

5.3 . Hydrolyse

Damp het chloroformextract in tot ongeveer 2 ml in een waterbad van 50 * C met de vacuuemrotatieverdamper ( 4.4 ) . Neem het residu op met 2 tot 3 ml methanol ( 3.1 ) en spoel de oplossing kwantitatief met tweemaal 10 ml ( 4.6 ) . Voeg enige kooksteentjes toe , meng goed , en sluit een luchtkoeler ( 4.7 ) op de centrifugebuis aan . Houd de buis 45 minuten in een kokend waterbad . Koel vervolgens in stromend water .

5.4 . Kleurontwikkeling en meting van de extinctie

Voeg 1,0 ml natriumnitrietoplossing ( 3.8 ) toe , meng en laat 2 minuten staan ; voeg vervolgens 1,0 ml ammoniumsulfamaatoplossing ( 3.9 toe , meng en laat 2 minuten staan ; voeg vervolgens nog 1,0 ml N-(1-naftyl)-etheendiamine-oplossing ( 3.10 ) toe , schud en laat 10 minuten staan . Voeg tenslotte 5,0 g natriumchloride ( 3.11 ) en 10,0 ml n-butanol ( 3.12 ) toe en schud krachtig tot het natriumchloride volledig opgelost is .

Pipetteer de bovenstaande butanoloplossing af , breng ze over in een centrifugebuis van 15 ml ( 4.6 ) en centrifugeer . Meet vervolgens de extinctie E A fotometrisch bij 555 nm ten opzichte van n-butanol ( 3.12 ) .

5.5 . Blancoproef van de reagentia

Verricht op gelijke wijze vanaf punt 5.2 een blancoproef uit op 20,0 ml verdund methanol ( 3.2 ) . Meet de extinctie E B bij 555 nm ten opzichte van n-butanol ( 3.12 ) .

5.6 . Bepaling van de standaardwaarde

Voer op gelijke wijze vanaf punt 5.2 een bepaling uit met 20,0 ml standaardoplossing ( 3.14.2 ) . Meet de extinctie E C bij 555 nm ten opzichte van n-butanol ( 3.12 ) .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan ethopabaat van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :

( E A - E B ) / ( E C - E B ) * 80/P

waarin :

E A = extinctie van de monsteroplossing

E B = extinctie van de blanco

E C = extinctie van de standaardoplossing

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan

20 % relatief voor ethopabaatgehalten van minder dan 7,5 mg/kg

1,5 dpm absoluut voor ethopabaatgehalten van 7,5 tot 10 mg/kg

15 % relatief voor ethopabaatgehalten van meer dan 10 mg/kg .

3 . BEPALING VAN DINITOLMIDE ( DOT )

( 3,5-dinitro-o-toluamide )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan dinitolmide ( DOT ) in diervoeders , concentraten en voormengsels . Nitrofuranverbindingen storen . De ondergrens van de bepaling ligt bij 40 mg/kg .

2 . Principe

Het monster wordt met acetonitril geëxtraheerd . Het extract wordt met aluminiumoxyde gezuiverd en gefiltreerd . Een aliquot deel van het filtraat wordt tot droog ingedampt . Het residu wordt opgenomen in dimethylformamide en met etheendiamine behandeld . Er ontstaat een purperen kleur , waarvan de extinctie spectrofotometrisch bij 560 nm wordt gemeten .

3 . Reagentia

3.1 . Acetonitril 85 % ( v/v ) : meng 850 ml zuiver acetonitril met 150 ml water . Destilleer het mengsel voor gebruik ( kooktraject 75 * -77 * C ) .

3.2 . Aluminiumoxyde voor kolomchromatografie . Verhit gedurende ten minste 2 uur op 750 * C , koel af in een exciccator en bewaar in een bruine fles met ingeslepen stop . Voor het gebruik wordt als volgt bevochtigd : meng in een fles van bruin glas 10 g aluminiumoxyde met 0,7 ml water , sluit de fles hermetisch , verwarm gedurende 5 minuten onder krachtig schudden op een kokend waterbad . Koel daarna af onder schudden . Controleer de activiteit door een bepaalde hoeveelheid standaardoplossing ( 3.6 ) volgens de methode vanaf 5.1 te bepalen . Het daarbij gevonden gehalte aan dinitolmide moet 100 % + 2 % bedragen .

3.3 . N,N-dimethylformamide 95 % ( v/v ) : meng 95,0 ml N,N-dimethylformamide p.a . met 5,0 ml water .

3.4 . Etheendiamine p.a . , maximaal watergehalte : 2,0 % .

3.5 . Standaard : 3,5-dinitro-o-toluamide volgens de volgende zuiverheidscriteria :

Smeltpunt : 177 * C ;

Moleculaire extinctiecoëfficiënt bij 248 nm in acetonitril : 13,1 maal 10 3 ;

Moleculaire extinctiecoëfficiënt bij 266 nm in N,N-dimethylformamide : 10,1 maal 10 3 .

3.6 . Standaardoplossing : Weeg op 0,1 mg nauwkeurig 40 mg van de standaard ( 3.5 ) af en los in acetonitril ( 3.1 ) op in een maatkolf van 200 ml . Vul aan tot het volume met hetzelfde oplosmiddel en meng . Pipetteer 20,0 ml van deze oplossing in een maatkolf van 100 ml , vul aan met acetonitril ( 3.1 ) en meng . 1 ml van deze oplossing bevat 40 mg dinitolmide .

4 . Apparatuur

4.1 . Erlenmeyer van 250 ml met normaal slijpstuk .

4.2 . Terugvloeikoeler met normaal slijpstuk .

4.3 . Glas filtertrechter , poreusheid G 3 , diameter 60 mm .

4.4 . Vacuuemfiltreerapparaat , bv . volgens Witt .

4.5 . Waterbad , ingesteld op 50 * C .

4.6 . Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte .

5 . Uitvoering

5.1 . Extractie en zuivering

Weeg van het fijngemaakte en gehomogeniseerde monster 10 g op 1 mg nauwkeurig af ( van concentraten en voormengsels 1 g op 1 mg nauwkeurig ) en breng deze in een erlenmeyer van 250 ml ( 4.1 ) . Voeg hier 65 ml acetonitril ( 3.1 ) aan toe . Meng , sluit de erlenmeyer op de terugvloeikoeler ( 4.2 ) aan en verwarm gedurende 30 minuten op het waterbad ( 4.5 ) onder voortdurend schudden . Koel vervolgens in stromend koud water af . Voeg 20 g aluminiumoxyde ( 3.2 ) toe , schud gedurende 3 minuten en laat bezinken .

Zet een maatkolf van 100 ml in het filtreerapparaat ( 4.4 ) en een filter ( 4.3 ) er op . Giet de vloeistof op het filter en zuig af in de 100 ml maatkolf . Breng het neerslag vervolgens met behulp van enkele ml acetonitril ( 3.1 ) in het filter over en zuig af . Onderbreek het vacuuem , suspendeer het neerslag opnieuw in enkele ml acetonitril ( 3.1 ) en zuig opnieuw af . Herhaal deze laatste behandelingen totdat het volume van het filtraat ongeveer 95 ml is . Vul de maatkolf aan tot 100 ml met acetonitril ( 3.1 ) en meng .

Neem zo nodig een aliquot deel en verdun met acetonitril ( 3.1 ) tot een dinitolmidegehalte van 5 tot mg per ml .

5.2 . Kleurontwikkeling en meting van de extinctie

Breng telkens 4,0 ml van de onder 5.1 verkregen oplossing in drie erlenmeyers A , B en C van 50 ml . Voeg , uitsluitend aan beker C , 1,0 ml van de standaardoplossing ( 3.6 ) toe . Breng de drie glazen op het waterbad ( 4.5 ) , geplaatst in een krachtig trekkende zuurkast , en damp onder een luchtstroom tot droog in . Laat de bekerglazen tot kamertemperatuur afkoelen .

Voeg 10,0 ml N,N-dimethylformamide ( 3.3 ) toe in glas A en telkens 2,0 ml in glazen B en C . Enkele minuten licht schudden totdat het residu volledig opgelost is . Voeg vervolgens 8,0 ml etheendiamine ( 3.4 ) toe in de glazen B en C en meng . Meet precies vijf minuten na toevoeging van het etheendiamine de extinctie van de drie oplossingen met behulp van de spectrofotometer ( 4.6 ) bij 560 nm ; N,N-dimethylformamide ( 3.3 ) geldt hierbij als blanco .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan dinitolmide van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule

( E B - E A ) / ( E C - E B ) * F/P * 1 000

waarin :

E A = extinctie van oplossing A ( Blindwaardemonster )

E B = extinctie van oplossing B ( monster )

E C = extinctie van oplossing C ( monster plus toegevoegde standaard )

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g

F = verdunningscoëfficiënt ( zoals eventueel toegepast onder 5.1 ) .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud van hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

10 dpm absoluut voor dinitolmidegehalten van minder dan 100 mg/kg ;

10 % relatief voor gehalten van 100 tot 5 000 mg/kg ;

500 dpm absoluut voor gehalten van 5 000 tot 10 000 mg/kg ;

5 % relatief voor gehalten van meer dan 10 000 mg/kg .

4 . BEPALING VAN NICARBAZIN

( equimoleculair mengsel van 4,4'-dinitrocarbanilide en 2-hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan nicarbasin in diervoeders , concentraten en voormengels , die niet meer dan 5 % gedroogd groenvoeder bevatten . Nitrofuraanverbindingen , acetylenheptine en carbadox storen . De ondergrens van de bepaling ligt bij 20 mg/kg .

2 . Principe

Het monster wordt met N,N-dimethylformamide geëxtraheerd . Het extract wordt met behulp van chromatografie gezuiverd door een aluminiumoxydekolom ; het nicarbazin wordt met ethanol geëlueerd . Het eluaat wordt met ethanolische natriumhydroxyde-oplossing behandeld . Er ontstaat een gele kleur , waarvan de extinctie spectrofotometrisch bij 430 nm wordt gemeten .

3 . Reagentia

3.1 . N,N-dimethylformamide p.a .

3.2 . Aluminiumoxyde voor kolomchromatografie . Verhit gedurende ten minste 2 uur op 750 * C , koel af in een exsiccator en bewaar in een bruine fles met ingeslepen stop . Controleer de activiteit door een bepaalde hoeveelheid standaardoplossing ( 3.8.3 ) volgens de methode vanaf ( 5.2 ) te bepalen . Het daarbij gevonden gehalte aan nicarbazin moet 100 % min of meer 2 % bedragen .

3.3 . Ethanol 95 % ( v/v ) .

3.4 . Ethanol 80 % ( v/v ) .

3.5 . Natriumhydroxyde-oplossing 50 % ( g/v ) p.a .

3.6 . Ethanolische natriumhydroxyde-oplossing 1 % ( g/v ) : breng 1 ml van de natriumhydroxyde-oplossing ( 3.5 ) in een maatkolf van 50 ml en vul aan tot het volume met ethanol 80 % ( 3.4 ) . Bereid deze oplossing direct voor gebruik .

3.7 . Standaard : zuiver nicarbazin , moleculaire extinctiecoëfficient bij 362 nm in N,N-dimethylformamide : 37,8 maal 10 3 .

3.8 . Standaardoplossingen :

3.8.1 . Nicarbazin-oplossing 1,25 mg/ml : Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig 125 mg van de standaard ( 3.7 ) af en los met 75 ml N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) op in een maatkolf van 100 ml onder lichte verwarming . Laat afkoelen , vul aan tot het volume met hetzelfde oplosmiddel en meng . Beschut tegen het licht bewaren .

3.8.2 . Nacarbazin-oplossing 0,125 mg/ml : Pipetteer 10,0 ml van de oplossing ( 3.8.1 ) af , vul aan tot 100 ml met N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) in een maatkolf en meng .

3.8.3 . Nicarbazin-oplossing 0,025 mg/ml : Pipetteer 20,0 ml van de oplossing ( 3.8.2 ) af , vul aan tot 100 ml met N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) in een maatkolf en meng .

4 . Apparatuur

4.1 . Erlenmeyer van 250 ml met normaalslijpstuk .

4.2 . Terugvloeikoeler met normaalslijpstuk .

4.3 . Kokend waterbad .

4.4 . Centrifuge met buizen van 120 ml .

4.5 . Glazen chromatografiebuis ( inwendige diameter : 25 mm , lengte : 300 mm ) .

4.6 . Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte .

4.7 . Buret verdeeld in 1/10 ml .

5 . Uitvoering

5.1 . Extractie

Weeg van het fijngemaakte en gehomogeniseerde monster 10 g op 1 mg nauwkeurig af ( van concentraten en voormengsels 1 g op 1 mg nauwkeurig ) en breng deze in een erlenmeyer van 250 ml ( 4.1 ) . Pipetteer hier precies 100 ml N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) bij . Meng , sluit de erlenmeyer op de terugvloeikoeler aan ( 4.2 ) en verwarm gedurende 15 minuten op het waterbad ( 4.3 ) onder af en toe schudden . Koel vervolgens in stromend koud water .

Breng daarna de bovenstaande vloeistof over in een centrifugebuis ( 4.4 ) en centrifugeer gedurende ongeveer 3 minuten . Verdun , zo nodig 25,0 ml van de bovenstaande vloeistof met N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) tot een nicarbazingehalte van 2,0 tot 10,0 mg per ml .

5.2 . Chromatografie

Suspendeer 30 g aluminiumoxyde ( 3.2 ) in N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) en breng de suspensie in een chromatografiebuis ( 4.5 ) . Laat de vloeistof uitstromen tot de meniscus 1 cm boven de aluminiumoxydekolom staat en breng vervolgens 25,0 ml van het onder 5,1 verkregen extract op de kolom . Laat de vloeistof door de kolom lopen , waarbij moet worden voorkomen dat deze droog wordt , en was de kolom driemaal met telkens 10 ml N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) . Elueer daarna met 70 ml ethanol 95 % ( 3.3 ) . Verwijder de eerste 10 ml van het eluaat en vang de rest in fracties op als volgt :

een fractie ( a ) van 5 ml ;

een fractie ( b ) van 50 ml in een maatkolf ;

een fractie ( c ) van 5 ml .

Ga na of de fracties ( a ) en ( c ) geen gele kleur vormen bij toevoeging van ethanolische natriumhydroxyde-oplossing ( 3.6 ) . Behandel fractie ( b ) op de in 5.3 beschreven wijze .

5.3 . Kleurontwikkeling en meting van de extinctie

Pipetteer in twee maatkolven A en B van 25 ml elk 20,0 ml van fractie ( b ) van het eluaat . Voeg hieraan in kolf A 5,0 ml ethanolische natriumhydroxyde-oplossing ( 3.6 ) en in kolf B 5,0 ml ethanol 95 % toe en meng .

Meet binnen vijf minuten de extinctie van de twee oplossingen bij 430 nm ; een mengsel van 20,0 ml ethanol 95 % ( 3.3 ) en 5,0 ml ethanolische natriumhydroxyde-oplossing ( 3.6 ) geldt hierbij als blanco . Trek de waarde van de extinctie van oplossing B van die van oplossing A af . Bepaal uitgaande van deze waarde de hoeveelheid nicarbazin aan de hand van de ijklijn ( 5.4 ) .

5.4 . IJklijn

Chromatografeer 25,0 ml van de standaardoplossing ( 3.8.3 ) op de in 5.2 beschreven wijze . Breng fractie ( b ) van het eluaat over in de buret ( 4.7 ) en breng in maatkolven van 25 ml volumes van resp . 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 en 10,0 ml ( die overeenkomen met resp . 0,025 - 0,050 - 0,075 - 0,100 en 0,125 mg nicarbazin ) . Voeg in elke kolf 5,0 ml ethanolische natriumhydroxyde-oplossing ( 3.6 ) toe , vul aan tot het volume met ethanol 95 % ( 3.3 ) en meng .

Meet binnen vijf minuten de extinctie van de oplossingen bij 430 nm ; een mengsel van 20,0 ml ethanol 95 % ( 3.3 ) en 5 ml ethanolische natriumhydroxyde-oplossing ( 3.6 ) geldt hierbij als blanco .

Teken de ijklijn door de extinctiewaarden uit te zetten op de ordinaat en de overeenkomstige hoeveelheden nicarbazin in mg op de abscis .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan nicarbazin van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :

A/P * F . 10 000

waarin :

A = door fotometrische meting bepaalde hoeveelheid nicarbazin in mg ;

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g ;

F = verdunningscoëfficiënt ( zoals eventueel toegepast onder 5.1 ) .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

10 dpm absoluut voor nicarbazingehalten van minder dan 100 mg/kg ;

10 % relatief voor gehalten van 100 tot 5 000 mg/kg ;

500 dpm absoluut voor gehalten van 5 000 tot 10 000 mg/kg ;

5 % relatief voor gehalten van meer dan 10 000 mg/kg .

5 . BEPALING VAN MENADION ( VITAMINE K3 )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van menadion ( vitamine K3 ) in diervoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 1 mg/kg .

2 . Principe

Het monster wordt met verdunde ethanol geëxtraheerd . Het mengsel wordt met tannine-oplossing geklaard en gecentrifugeerd . Het extract wordt met een matriumcarbonaatoplossing behandeld en het vrijgekomen menadion net 1,2-dichloorethaan geëxtraheerd . Het dichloorethaan-extract wordt afhankelijk van het menadiongehalte direct of na droogdampen behandeld met een met zoutzuur aangezuurde oplossing van 2,4-dinitrofenylhydrazine in ethylalcohol . Het gevormd hydrazon , toegevoegd met een overmaat ammonia , geeft een blauwgroen gekleurd complex waarvan de extinctie bij 635 nm gemeten wordt .

3 . Reagentia

3.1 . Ethanol 96 % ( v/v ) .

3.2 . Ethanol ( 3.1 ) met water tot 40 % ( v/v ) verdund .

3.3 . Tannine-oplossing 10 % ( g/v ) bereid op basis van poedervormige , zuivere tannine .

3.4 . 1,2-dichloorethaan p.a .

3.5 . Natriumcarbonaat-oplossing p.a . 10 % ( g/v ) bereid op basis van watervrije natriumcarbonaat p.a .

3.6 . Zoutzuur 37 % ( g/g ) d = 1,19 .

3.7 . Absolute ethanol p.a .

3.8 . 2,4-dinitrofenylhydrazine-reagens : los 40 mg 2,4-dinitrofenylhydrazine p.a . op in circa 40 ml kokende absolute ethanol ( 3.7 ) , breng na afkoelen over in een maatkolf van 50 ml . Voeg toe 1 ml zoutzuur ( 3.6 ) en vul aan met absolute ethanol ( 3.7 ) en homogeniseer . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.9 . Ammonia 25 % ( g/g ) , d = 0,91 .

3.10 . Ammoniakbevattende ethanol-oplossing : meng 1 volumedeel ethanol ( 3.7 ) en 1 volumedeel ammonia ( 3.9 ) .

3.11 . Menadionstandaardoplossingen : los op in 1,2-dichloorethaan ( 3.4 ) 20 mg menadion ( vitamine K3 ) en vul aan tot 200 ml . Verdun aliquote delen van deze oplossing met 1,2-dichloorethaan ( 3.4 ) ten einde een serie oplossingen te krijgen waarvan de gehalten aan menadion 2 tot 10 mg per ml oplopen . Vlak voor het gebruik te bereiden .

4 . Apparatuur

4.1 . Schudmachine .

4.2 . Centrifuge ( 3 000 tot 5 000 omw . /min . ) .

4.3 . Scheitrechter , 100 en 250 ml , met ingeslepen stoppen .

4.4 . Vacuuemrotatieverdamper met ronde kolven van 250 ml .

4.5 . Waterbad .

4.6 . Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte .

5 . Uitvoering

N.B . Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffuus daglicht , eventueel in apparatuur van bruin glas .

5.1 . Af te wegen hoeveelheid monster

Weeg , afhankelijk van het te verwachten gehalte aan menadion , van het fijngemaakte monster een hoeveelheid af als volgt :

0,1 tot 5,0 g voor concentraten en voormengsels ;

20 tot 30 g voor veevoeders .

Breng de afgewogen hoeveelheid direct over in een kolf van 250 ml met ingeslepen stop .

5.2 . Extractie

Voeg precies 96 ml verdunde ethanol ( 3.2 ) toe en schud met de schudmachine gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur . Voeg toe 4,0 ml tannine-oplossing ( 3.3 ) , meng , breng het extract over in een centrifugebuis , centrifugeer ( 3 000 tot 5 000 omw . /min . ) en decanteer .

Breng een exact afgemeten hoeveelheid van 20 tot 40 ml van het extract in een schreitrechter van 250 ml , voeg toe met een pipet 50 ml 1,2-dichloorethaan ( 3.4 ) . Voeg aan dit mengsel met een pipet 20 ml natriumcarbonaat-oplossing ( 3.5 ) toe . Schud krachtig gedurende 30 seconden en vang daarna de dichloorethaanfase op in een scheitrechter van 100 ml . Voeg toe 20 ml water , schud gedurende 15 seconden , zonder de dichloorethaanfase af en verwijder er de laatste sporen water uit met strookjes filtreerpapier .

Neem bij concentraten en voormengsels een aliquot deel van het extract , verdun dit met 1,2-dichloorethaan ( 3.4 ) zo dat het 2 tot 10 mg menadion per ml bevat . Damp bij diervoeders een aliquot deel van het extract bij verminderde druk in stikstofatmosfeer op een waterbad van 40 * C in tot droog . Neem het residu vlug op in zoveel 1,2 dichloorethaan ( 3.4 ) dat de dichloorethaanoplossing 2 tot 10 mg menadion per ml bevat .

5.3 . Vorming van het hydrazon

Breng 2,0 ml van het onder ( 5.2 ) verkregen dichloorethaanextract in een maatkolf van 10 ml , voeg toe 3,0 ml 2,4-dinitrofenylhydrazinereagens ( 3.8 ) , sluit de kolf goed af met een kurk of teflonstop ten einde verlies door verdamping te voorkomen en verwarm gedurende 2 uur in een waterbad van 70 * C . Koel af , voeg 3,0 ml ammoniakbevattende ethanoloplossing ( 3.10 ) toe , meng , vul aan met absolute ethanol ( 3.7 ) en homogeniseer .

5.4 . Meting van de extinctie

Meet de extinctie van het blauwgroen gekleurde complex met behulp van de spectrofotometer bij 635 nm tegen een reagentia-blanco , verkregen door 2,0 ml 1,2-dichloorethaan ( 3.4 ) te behandelen als beschreven onder 5.3 . De hoeveelheid menadion wordt bepaald aan de hand van een voor iedere serie analyses opnieuw opgestelde ijkkurve .

5.5 . IJkkurve

2,0 ml van de menadionstandaardoplossingen ( 3.11 ) worden behandeld als beschreven onder 5.3 . Meet de extinctie als aangegeven onder 5.4 en teken de ijkkurve door de extinctiewaarden aan te brengen op de ordinaat en de overeenkomstige hoeveelheden menadion in mg op de abscis .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan menadion van het monster wordt berekend op grond van de hoeveelheid afgewogen materiaal en van de verdunningen die in de loop der analyse zijn uitgevoerd . Het resultaat wordt uitgedrukt in mg menadion per kg .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

- 20 % relatief voor gehalten aan menadion van minder dan 10 dpm ;

- 2 dpm absoluut voor gehalten van 10 tot 14 mg/kg ;

- 15 % relatief voor gehalten van 14 tot 100 mg/kg ;

- 15 dpm absoluut voor gehalten van 100 tot 150 mg/kg ;

- 10 % relatief voor gehalten van meer dan 150 mg/kg .