„BIJLAGE XX bis

METHODE VOOR DE DETECTIE VAN ANDERE OLIËN IN OLIJFOLIËN

1. DOEL

Deze methode wordt gebruikt om de aanwezigheid te detecteren van andere plantaardige oliën in olijfoliën. Plantaardige oliën met een hoog linolzuurgehalte (soja, koolzaad, zonnebloem enz.) en sommige plantaardige oliën met een hoog oliegehalte, zoals olie van hazelnoot of zonnebloem met een hoog oliegehalte en oliën uit perskoeken van olijven, kunnen worden gedetecteerd in olijfoliën. Het gedetecteerde niveau is afhankelijk van het soort andere olie en de olijfsoort. Bij hazelnootolie komt een detectieniveau tussen 5 en 15 % het meest voor. Met deze methode kan het type gedetecteerde andere olie niet worden bepaald en wordt alleen aangegeven of de olie echt of onecht is.

2. PRINCIPE

De olie wordt gezuiverd door middel van vastefase-extractie (SPE) op kiezelgelpatronen. De samenstelling van triacylglycerol (TAG) wordt bepaald door middel van vloeistofchromatografie met omgekeerde fase in hoge resolutie met gebruik van een refractieve indexdetector en propaannitril als de mobiele fase. Methylesters van vetzuren (FAME's) worden bereid uit gezuiverde olie door middel van methylering met een koude oplossing van KOH in methanol (bijlage X.B) waarna de esters worden geanalyseerd middels capillaire gaschromatografie met gebruik van hoogpolaire kolommen (bijlage X.A). De theoretische triacylglycerolsamenstelling wordt berekend op basis van de samenstelling van vetzuren door een computerprogramma waarbij wordt uitgegaan van een 1,3-willekeurig, 2-willekeurige verdeling van vetzuren in de triacylglycerol, met beperkingen voor verzadigde vetzuren op de 2-positie. De berekeningsmethode is een aanpassing van de in bijlage XVIII beschreven procedure. Er worden meerdere wiskundige algoritmes berekend op basis van theoretische en experimentele (HPLC-) triacylglycerolsamenstellingen en de daaruit voortvloeiende waarden worden vergeleken met die welke zijn opgenomen in een database die is opgebouwd op basis van echte olijfoliën.

3. MATERIAAL EN REAGENTIA

3.1. Zuivering van de olie

3.1.1. Kegelvormige kolven van 25 ml.

3.1.2. Glazen buizen van 5 ml met schroefdraad aan de bovenkant en doppen voorzien van PTFE-verbinding.

3.1.3. Silicagelpatronen, 1 g (6 ml) voor vastefase-extractie (bijvoorbeeld Waters, Massachusetts, VS).

3.1.4. n -hexaan, van analysekwaliteit.

3.1.5. Loopvloeistofmengsel van hexaan/diethylether (87:13, V/V).

3.1.6. N -heptaan, van analysekwaliteit.

3.1.7. Aceton, van analysekwaliteit.

3.2. HPLC-analyse van triaglycerolen

3.2.1. Micro-injectiespuitjes (50 μL) en naalden voor HPLC-injectie.

3.2.2. Propaannitril, super zuiverheid of HPLC-kwaliteit (bijvoorbeeld: ROMIL, Cambridge, Verenigd Koninkrijk), gebruikt als mobiele fase.

3.2.3. HPLC-kolom (inwendige diameter van 25 cm × 4 μm), gepakt met RP-18-fase (deeltjesgrootte 4 μm).

3.3. Bereiding van methylesters van vetzuren

(zie bijlage X.B)

3.3.1. Methanol met maximaal 0,5 % water.

3.3.2. Heptaan, van analysekwaliteit.

3.3.3. Een 2 M kaliumhydroxideoplossing in methanol. Los 1,1 g kaliumhydroxide op in 10 ml methanol.

3.3.4. Glazen buizen van 5 ml met schroefdraad aan de bovenkant en doppen voorzien van PTFE-verbinding.

3.4. GC-analyse van FAME's

(Zie de methode voor het bepalen van onverzadigde transvetzuren door middel van capillaire gaschromatografie zoals beschreven in bijlage X.A).

3.4.1. Micro-injectiespuitjes (5 μL) en naalden voor GC-injectie.

3.4.2. Waterstof of helium als draaggas.

3.4.3. Waterstof en zuurstof voor vlamionisatiedetector.

3.4.4. Stikstof of helium als hulpdraaggas.

3.4.5. Een fused-silica capillaire kolom (inwendige diameter 50-60 m × 0,25-0,30 mm) gecoat met cyanopropylpolysiloxaan of cyanopropylfenylsiloxaan-fasen (SP-2380 of soortgelijk) met een laagdikte van 0,20-0,25 μm.

4. APPARATUUR

4.1. Vacuümapparaat voor vastefase-extractie.

4.2. Rotatieverdamper.

4.3. HPLC-uitrusting, bestaande uit: 4.3.1. Ontgasser voor de mobiele fase. 4.3.2. Rheodyne-injectieventiel met een lus van 10 μL. 4.3.3. Hogedrukpompeenheid. 4.3.4. Thermostatische stoof voor de HPLC-kolom die in staat is lagere temperaturen dan de omgevingstemperatuur te creëren (15-20 °C), (bijvoorbeeld van het type Peltier). 4.3.5. Refractieve indexdetector. 4.3.6. Gecomputeriseerd gegevensverzamelingssysteem voorzien van een integratieprogramma.

4.4 Capillaire gaschromatografie-uitrusting zoals beschreven in bijlage X.A, voorzien van: 4.4.1. Splitinjector. 4.4.2. Vlamionisatiedetector (FID). 4.4.3. Stoof met programeerbare temperatuur. 4.4.4. Gecomputeriseerd gegevensverzamelingssysteem voorzien van een integratieprogramma.

4.5. Computer met Microsoft Excel-programma

5. ANALYSEPROCEDURE

5.1. Zuivering van de olie

Plaats een SPE-patroon silicagel in een apparaat voor elutie onder vacuüm en was onder vacuüm met 6 ml hexaan. Hef het vacuüm op om te voorkomen dat de kolom uitdroogt en plaats een kegelvormige kolf onder de patroon. Breng vervolgens in de kolom een oplossing van olie (ongeveer 0,12 g) in 0,5 ml hexaan, opdat de oplossing in de silicagel binnendringt; elueer vervolgens met 10 ml van het loopvloeistofmengsel (punt 3.1.5) hexaan/diethylether (87:13 V/V) onder vacuüm. Homogeniseer de geëlueerde loopvloeistof en giet ongeveer de helft van het volume in een andere kegelvormige kolf. Laat beide oplossingen afzonderlijk onder verminderde druk bij kamertemperatuur tot uitdroging verdampen in een rotatieverdamper. Los voor analyse van de triaglycerolen een van de residuen op in 1 ml aceton (zie de eerste alinea van 5.2) en giet deze in een glazen buis van 5 ml met schroefdraad aan de bovenkant. Los het andere residu in 1 ml n-heptaan en giet dit in een tweede glazen buis van 5 ml met schroefdraad aan de bovenkant om de methylesters van vetzuren voor te bereiden.

Opmerking: Zuivering van de olie kan worden uitgevoerd met behulp van een silicagelkolom, zoals beschreven in IUPAC-methode 2.507.

5.2. HPLC-analyse van triaglycerolen

Installeer het HPLC-systeem, waarbij de kolomtemperatuur op 20 °C wordt gehouden en gebruik propaannitril als de mobiele fase bij een stroomsnelheid van 0,6 ml/min. Voer een injectie van het oplosmiddel uit wanneer de basislijn stabiel is; gebruik indien de basislijn wordt verstoord in het gebied van 12 tot 25 min. een ander soort aceton of een mengsel van propaannitril/aceton (25:75) om het monster op te lossen.

Opmerking: Sommige soorten aceton leiden tot verstoringen van de basislijn in het voornoemde gebied.

Injecteer 10 μl van de oplossing van gezuiverde olie in aceton (5 %). Het duurt ongeveer 60 min. voor de uitvoering is voltooid. De temperatuur van de stoof en de stroomsnelheid moeten worden aangepast om een chromatogram te verkrijgen dat lijkt op het in afbeelding 1 afgebeelde chromatogram, waar de trilinoleïnepiek (piek 1) elueert bij 15,5 min. en de resoluties tussen de paren LLL/OLLn (pieken 1 en 2) en OLL/OOLn (pieken 4 en 5) goed zijn.

De hoogte van piek 2 (OLLn+PoLL) moet minstens 3 % van de volledige schaaluitslag behalen.

5.3. Voorbereiding van methylesters van vetzuren

Voeg 0,1 ml van een 2M kaliumhydroxideoplossing in methanol toe aan de oplossing zuivere olie in 1 mL n-heptaan. Doe een dop op de buis en schroef deze vast. Schud de buis krachtig gedurende 15 seconden en laat stratificeren tot de bovenlaag helder wordt (5 minuten). De n-heptaanoplossing is klaar om te worden geïnjecteerd in de gaschromatograaf. De oplossing kan maximaal 12 uur worden bewaard bij kamertemperatuur.

5.4. Gaschromatografie-analyse van methylesters van vetzuren

De in de methode voor de bepaling van onverzadigde transvetzuren beschreven procedure moet worden gebruikt (zie bijlage X.A).

Het gaschromatografiesysteem wordt geïnstalleerd met een stooftemperatuur van 165 °C. De aanbevolen stooftemperatuur is isotherm bij 165 °C gedurende 10 min. en wordt daarna met 1,5 °C/min. verhoogd tot 200 °C. Er wordt een injectietemperatuur aanbevolen tussen de 220 °C en 250 °C om de vorming van transvetzuren te minimaliseren (zie bijlage X.A). De temperatuur van de detector is 250 °C. Waterstof of helium moet worden gebruikt als draaggas bij een druk in de kolomkop van ongeveer 130 kPa. Injecteer een volume van 1 μL in de splitinjectiemode.

Er moet een gaschromatografieprofiel worden verkregen dat lijkt op het profiel dat is weergegeven in afbeelding 2. Er moet speciale aandacht worden besteed aan de resolutie tussen C18:3 en C20:1 (de C18:3-piek moet verschijnen voor de C20:1-piek). Om deze omstandigheden te bereiken, moeten de aanvangstemperatuur en/of de druk in de kolomkop worden geoptimaliseerd. Pas de injectieomstandigheden aan (temperatuur, splitverhouding en volume-injectie) om de onderscheiding van palmitinezuur en palmitoleïnezuur te minimaliseren.

De hoogte van de C20:0-piek moet ongeveer 20 % van de volledige schaaluitslag zijn om de transisomeren te kwantificeren. Als de C18:0-piek is verstoord, verminder dan de monsterhoeveelheid.

6. INTEGRATIE VAN DE CHROMATOGRAFISCHE PIEKEN

6.1. HPLC-chromatogram

In afbeelding 1 wordt een typisch HPLC-chromatogram weergegeven van triacylglycerolen van een gezuiverde olijfolie. Voor integratie van de pieken moeten drie basislijnen worden getraceerd: de eerste tussen het begin van piek 1 en het einde van piek 3, de tweede tussen het begin van piek 4 en het dal voor piek 8 en de derde tussen het dal voor piek 8 en het einde van piek 18.

Het totale oppervlak is de som van de oppervlakken van alle pieken (geïdentificeerd en niet-geïdentificeerd) van piek 1 tot en met piek 18. Het percentage van elke piek wordt gegeven door:

De percentages dienen te worden opgegeven met twee cijfers achter de komma.

6.2. GC-chromatogram

In afbeelding 2 wordt een GC-chromatogram weergegeven van alkylesters van vetzuren die zijn verkregen van een gezuiverde olijfolie. De percentages van de volgende vetzuren moeten worden berekend:

Palmitinezuur; P (C16:0) = methylester + ethylester Stearinezuur; S (C18:0) = methylester Palmitoleïnezuur; Po (C16:1) = som van methylesters van de twee cis-isomeren Oliezuur; O (C18:1) = som van methylesters van de twee cis-isomeren + ethylester + transisomeren Linolzuur; L (C18:2) = methylester + ethylester + transisomeren Linoleenzuur; Ln (C18:3) = methylester + transisomeren Arachidonzuur; A (C20:0) = methylester Eicoseenzuur; G (C20:1) = methylester

Esters van ethyl en transisomeren kunnen ontbreken in het GC-chromatogram.

Het totale oppervlak (AT) is de som van alle pieken die voorkomen in het chromatogram van C14:0 tot C24:0, met uitzondering van het oppervlak dat overeenkomt met het squaleen. Het percentage van elke piek wordt als volgt berekend:

De resultaten dienen te worden opgegeven met twee cijfers achter de komma.

Voor de berekening van de computerprogramma's is het niet nodig om te normaliseren tot 100, aangezien dit automatisch wordt gedaan.

Afbeelding 1

HPLC-chromatogram van TAG's van een "Chamlali"-olijfolie uit eerste persing Belangrijkste componenten van de chromatografische pieken

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tabel 1

Herhaalbaarheidsgegevens van de bepaling van TAG's van olijfolie van de eerste persing door middel van HPLC bij een kolomtemperatuur van 20 °C en met gebruik van propaannitril als mobiele fase

ECN HPLC-pieken TAG's Monster 1 Monster 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5 Gemid-delde (%) RSDr (%) Gemid-delde (%) RSDr (%) Gemid-delde (%) RSDr (%) Gemid-delde (%) RSDr (%) Gemid-delde (%) RSDr (%) 42 1 LLL 0,020 7,23 0,066 5,18 0,095 4,10 0,113 0,95 0,34 1,05 2 OLLn+ PoLL 0,085 7,44 0,24 1,78 0,26 2,25 0,35 2,02 0,50 2,83 3 PLLn 0,023 15,74 0,039 5,51 0,057 5,62 0,082 4,35 0,12 6,15 44 4 OLL 0,47 1,52 1,53 0,42 2,62 0,98 3,35 1,05 4,37 1,13 5 OOLn+ PoOL 1,07 2,01 1,54 0,46 1,61 0,71 1,72 1,07 1,77 2,40 6 PLL+ PoPoO 0,11 12,86 0,24 4,37 0,65 1,32 1,35 0,73 2,28 1,24 7 POLn+ PpoPo+ PpoL 0,42 5,11 0,49 2,89 0,55 2,01 0,85 1,83 1,09 1,96 46 8 OOL+ LnPP 6,72 0,63 8,79 0,31 11,21 0,42 13,25 0,33 15,24 0,23 9 PoOO 1,24 2,86 1,49 0,95 1,63 0,85 2,12 0,45 2,52 0,56 10 SLL+ PLO 2,70 0,65 4,05 0,70 6,02 0,65 9,86 0,53 11,53 0,31 11 PoOP+ SpoL+ SOLn+ SpoPo 0,64 4,42 0,69 3,02 0,79 1,23 1,53 0,89 1,70 1,66 48 12+13 OOO+ PLP+ PoPP 49,60 0,07 48,15 0,06 42,93 0,06 33,25 0,10 24,16 0,06 14 SOL 0,82 1,72 0,92 1,56 1,05 1,32 1,25 1,05 1,60 1,77 15 POO 22,75 0,25 21,80 0,20 21,05 0,30 20,36 0,35 20,17 0,14 50 16 POP 3,05 0,46 4,56 0,42 4,98 0,52 5,26 0,41 5,57 0,38 17 SOO 6,87 0,21 5,56 0,33 4,86 0,43 4,12 0,72 3,09 0,69 18 POS+ SLS 1,73 1,23 1,65 1,10 1,54 0,99 1,49 1,10 1,41 1,00 n = 3 replicaties RSDr = relatieve standaardafwijking van de herhaalbaarheid

Afbeelding 2

GC-chromatogram van alkylesters van vetzuren verkregen uit een olie uit perskoeken van olijven door middel van transesterificatie met een koude oplossing van KOH in methanol

7. DETECTIE VAN ANDERE OLIËN IN OLIJFOLIËN

De berekeningsmethode voor de detectie van andere oliën in olijfoliën door middel van een vergelijking van wiskundige algoritmes met een database die is opgebouwd uit echte olijfoliën is opgenomen in bijlage I bij norm IOC/T.20/Doc. nr. 25.”