BIJLAGE I

HOOFDSTUK 1

PRESTATIECRITERIA EN ANDERE VOORSCHRIFTEN VOOR ANALYSEMETHODEN

1.1. Voorschriften voor screeningsmethoden

1.1.1. Categorieën geschikte screeningsmethoden

Kwalitatieve, semikwantitatieve of kwantitatieve methoden worden gebruikt als geschikte screeningsmethoden.

1.1.2. Voorschriften voor biologische, biochemische of fysisch-chemische screeningsmethoden

Voor verboden of niet-toegelaten stoffen moet het CCβ zo laag zijn als redelijkerwijs haalbaar en in ieder geval lager dan de actiedrempel voor stoffen waarvoor overeenkomstig Verordening (EU) 2019/1871 actiedrempels zijn vastgesteld.

Voor toegelaten farmacologisch werkzame stoffen moet het CCβ lager zijn dan de MRL of het maximumgehalte.

Voor screeningsdoeleinden mogen alleen analysemethoden worden gebruikt waarvan op gedocumenteerde en traceerbare wijze kan worden aangetoond dat zij gevalideerd zijn en een fout-conformcijfer hebben van ten hoogste 5 % (β-fout). Wordt een vermoedelijk niet-conforme uitslag verkregen, dan moet die uitslag worden bevestigd door middel van een bevestigingsmethode.

Kwantitatieve screeningsmethoden die zowel voor screening als voor bevestiging worden gebruikt, moeten aan dezelfde voorschriften inzake nauwkeurigheid, bereik en precisie voldoen als beschreven in de punten 1.2.2.1 en 1.2.2.2.

1.2. Voorschriften voor bevestigingsmethoden

1.2.1. Algemene voorschriften voor bevestigingsmethoden

Voor verboden of niet-toegelaten stoffen moet de CCα zo laag zijn als redelijkerwijs haalbaar. Voor verboden of niet-toelaten stoffen waarvoor krachtens Verordening (EU) 2019/1871 een actiedrempel is vastgesteld, moet de CCα ten hoogste gelijk zijn aan de actiedrempel.

Voor toegelaten stoffen moet de CCα boven de MRL of het maximumgehalte liggen, maar zo dicht mogelijk in de buurt daarvan liggen.

Voor bevestigingsdoeleinden worden alleen analysemethoden gebruikt waarvan op gedocumenteerde en traceerbare wijze kan worden aangetoond dat zij gevalideerd zijn en een fout-niet-conformcijfer (α-fout) hebben van ten hoogste 1 % voor verboden of niet-toegelaten stoffen of van ten hoogste 5 % voor toegelaten stoffen.

Bevestigingsmethoden moeten informatie verschaffen over de structurele chemische samenstelling van de analyt. Bevestingsmethoden die alleen gebaseerd zijn op chromatografische analyse, zonder gebruikmaking van massaspectrometrische detectie, zijn daarom op zichzelf niet geschikt als bevestigingsmethode voor verboden of niet-toegelaten farmacologisch werkzame stoffen. Indien massaspectrometrie niet geschikt is voor toegelaten stoffen, kunnen andere methoden, zoals HPLC-DAD en -FLD, of een combinatie daarvan, worden gebruikt.

Indien volgens de bevestigingsmethode vereist, wordt een geschikte interne standaard aan het begin van het extractieprocedé aan de analyseportie toegevoegd. Al naargelang van de beschikbaarheid worden hiervoor met een stabiele isotoop gemerkte vormen van de analyt gebruikt, die bijzonder geschikt zijn voor massaspectrometrische detectie, dan wel analoge verbindingen die structureel nauw met de analyt verwant zijn. Indien geen geschikte interne standaard kan worden gebruikt, wordt de identificatie van de analyt bij voorkeur bevestigd met behulp van co-chromatografie (1). In dat geval mag slechts één piek worden verkregen, waarvan de hoogte (of het oppervlak) evenredig aan de hoeveelheid toegevoegde analyt is toegenomen. Indien dit niet haalbaar is, moeten matrixgematchte of matrixverrijkte standaarden worden gebruikt.

1.2.2. Algemene prestatiecriteria voor bevestigingsmethoden

1.2.2.1. Juistheid aan de hand van terugvinding

Bij herhaalde analyse van een gecertificeerd referentiemateriaal moet de afwijking tussen de experimenteel bepaalde, voor terugvinding gecorrigeerde gemiddelde massafractie en de gecertificeerde waarde voldoen aan de in tabel 1 vermelde intervallen voor de minimale juistheid.

Tabel 1

Minimale juistheid van kwantitatieve methoden

Massafractie Interval ≤ 1 μg/kg tussen – 50 % en + 20 % > 1 μg/kg tot 10 μg/kg tussen – 30 % en + 20 % ≥ 10 μg/kg tussen – 20 % en + 20 %

Zijn er geen gecertificeerde referentiematerialen beschikbaar, dan mag de juistheid van de metingen op andere manieren worden beoordeeld, bijvoorbeeld door gebruik te maken van materialen waaraan door interlaboratoriumonderzoeken waarden zijn toegekend, of door toevoegingen van bekende hoeveelheden van de analyt(en) aan een blancomatrix.

1.2.2.2. Precisie

De variatiecoëfficiënt (VC) voor de herhaalde analyse van een referentiemateriaal of materiaal met toegevoegde analyt onder intralaboratoriumreproduceerbaarheidsomstandigheden mag niet groter zijn dan de waarde die volgt uit de vergelijking van Horwitz. Deze vergelijking luidt:

CV = 2(1 – 0,5 log C)

waarbij C de massafractie is, uitgedrukt als een macht (exponent) van 10 (bijvoorbeeld 1 mg/g = 10-3). Voor massafracties kleiner dan 120 μg/kg geeft de vergelijking van Horwitz onaanvaardbaar hoge waarden. Daarom mag de maximaal toegestane variatiecoëfficiënt niet groter zijn dan de waarden in tabel 2.

Tabel 2

Aanvaardbare variatiecoëfficiënt

Massafractie VC reproduceerbaarheid (%) ≥ 1 000 μg/kg 16 (aangepast op basis van vergelijking van Horwitz) > 120-1 000 μg/kg 22 (aangepast op basis van vergelijking van Horwitz) 10-120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

Voor analyses die onder herhaalbaarheidsomstandigheden worden uitgevoerd, moet de variatiecoëfficiënt onder herhaalbaarheidsomstandigheden ten hoogste gelijk zijn aan twee derde van de in tabel 2 vermelde waarden.

1.2.3. Voorschriften voor chromatografische scheiding

Bij vloeistofchromatografie (LC) of gaschromatografie (GC) bedraagt de minimaal aanvaardbare retentietijd voor de te bepalen analyt(en) tweemaal de retentietijd die overeenkomt met het dode volume van de kolom. De retentietijd van de analyt in het extract moet overeenkomen met die van de ijkstandaard, een matrixgematchte standaard of een matrixverrijkte standaard met een tolerantie van ± 0,1 minuut. Voor snelle chromatografie, waarbij de retentietijd minder dan 2 minuten bedraagt, is een afwijking van minder dan 5 % van de retentietijd aanvaardbaar. Indien een interne standaard wordt gebruikt, moet de verhouding tussen de chromatografische retentietijd van de analyt en die van de interne standaard, dat wil zeggen de relatieve retentietijd van de analyt, overeenkomen met die van de ijkstandaard, de matrixgematchte standaard of de matrixverrijkte standaard met een maximale afwijking van 0,5 % voor gaschromatografie en 1 % voor vloeistofchromatografie voor methoden die zijn gevalideerd vanaf de datum van inwerkingtreding van deze verordening.

1.2.4. Specifieke prestatiecriteria voor massaspectrometrie

1.2.4.1. Massaspectrometrische detectie

Massaspectrometrische detectie wordt uitgevoerd met behulp van een aantal van de volgende opties:

1. opnemen van volledige massaspectra (full scans, FS);

2. alleen geselecteerde massa’s scannen (selected ion monitoring, SIM);

3. technieken voor sequentiële massaspectrometrie (MSn), zoals selected reaction monitoring (SRM, waarbij alleen die ionen die volgens een specifieke manier fragmenteren worden gescand);

4. een combinatie van technieken voor massaspectrometrie (MS) of sequentiële massaspectrometrie (MSn) met de juiste ionisatiemethoden.

Zowel lageresolutiemassaspectrometrie (LRMS, bij een resolutie van één massaeenheid) als hogeresolutiemassaspectrometrie (HRMS), waaronder bijvoorbeeld dubbel focusserende sectorinstrumenten, time-of-flight-instrumenten (TOF) en Orbitrap-instrumenten, zijn geschikt.

Ter bevestiging van de identiteit van een analyt bij hogeresolutiemassaspectrometrie (HRMS) moet de massa-afwijking van alle diagnostische ionen minder dan 5 ppm bedragen (of in het geval van m/z < 200, minder dan 1 mDa). Op basis hiervan moet de effectieve resolutie zo worden geselecteerd dat zij geschikt is voor het beoogde doel, en moet de resolutie normaliter groter zijn dan 10 000 voor het hele massabereik bij een dalwaarde van 10 %, of dan 20 000 bij de halfwaardebreedte (FWHM).

Wanneer massaspectrometrische bepaling wordt uitgevoerd door het opnemen van full-scanspectra (zowel LRMS als HRMS), zijn alleen diagnostische ionen met een relatieve intensiteit van meer dan 10 % in het referentiespectrum van de ijkstandaard, matrixgematchte standaard of matrixverrijkte standaarden geschikt. Diagnostische ionen moeten het molecuul-ion (indien aanwezig bij een intensiteit van ≥ 10 % van de hoofdpiek) en karakteristieke fragment- of product-ionen omvatten.

Selectie van precursor-ionen: Wanneer massaspectrometrische bepaling wordt uitgevoerd door fragmentatie na selectie van precursor-ionen, wordt de selectie van precursor-ionen uitgevoerd bij een resolutie van één massaeenheid of beter. Bij het geselecteerde precursor-ion moet het gaan om het molecuul-ion, kenmerkende adducten van het molecuul-ion, karakteristieke product-ionen of een van hun isotoop-ionen. Als de precursorselectie een massaselectievenster van meer dan één Dalton heeft, bv. in het geval van dataonafhankelijke acquisitie (data-independent acquisition), wordt de techniek beschouwd als een full-scanbevestigingsanalyse.

Fragment- en product-ionen: De geselecteerde fragment- of product-ionen moeten diagnostisch zijn voor het gemeten analyt/product. Niet-selectieve transities (bv. het tropylium-kation of verlies van water) moeten zo veel mogelijk worden weggelaten. De abundantie van diagnostische ionen wordt bepaald aan de hand van het oppervlak of de hoogte van de piek van geïntegreerde geëxtraheerd-ionchromatogrammen (extracted-ion chromatograms). Dit geldt ook wanneer voor de identificatie gebruik wordt gemaakt van full-scanmetingen. De signaal-ruisverhouding van alle diagnostische ionen moet ten minste drie op één (3:1) bedragen.

Relatieve intensiteiten; de relatieve intensiteiten van de diagnostische ionen (de ionverhouding) worden uitgedrukt als percentage van de intensiteit van het meest abundante ion of de meest abundante overgang. De ionverhouding moet worden bepaald door spectra te vergelijken of door de signalen van de geëxtraheerd-ionmassasporen te integreren. De ionverhouding van de te bevestigen analyt moet overeenkomen met die van de matrixgematchte standaarden, matrixverrijkte standaarden of standaardoplossingen bij vergelijkbare concentraties, gemeten onder dezelfde omstandigheden, binnen een relatieve afwijking van ± 40 %.

Bij iedere massaspectrometrische analyse moet ten minste één ionverhouding worden bepaald. Dit zijn bij voorkeur ionen die in één scan worden verkregen, maar de ionen kunnen ook afkomstig zijn van verschillende scans in dezelfde injectie (d.w.z. full- en fragmentatiescan).

1.2.4.2. Identificatie

Er wordt een systeem van identificatiepunten gebruikt om geschikte acquisitiemethoden en evaluatiecriteria te selecteren. Voor de bevestiging van de identiteit van stoffen in een matrix waarvoor een MRL is vastgesteld (toegelaten gebruik), zijn ten minste 4 identificatiepunten vereist. Voor niet-toegelaten of verboden stoffen zijn 5 identificatiepunten vereist. Eén punt kan afkomstig zijn van de chromatografische scheiding. Tabel 3 toont het aantal identificatiepunten dat elk van de technieken oplevert. Om het voor bevestiging vereiste aantal identificatiepunten te bereiken, kunnen de met verschillende technieken verkregen identificatiepunten bij elkaar worden opgeteld.

1. Alle massaspectrometrische analyses moeten worden gecombineerd met een scheidingstechniek met voldoende scheidend vermogen en selectiviteit voor de specifieke toepassing. Geschikte scheidingstechnieken zijn onder meer vloeistof- en gaschromatografie, capillaire elektroforese (CE) en superkritische chromatografie (supercritical fluid chromatography, SFC). In het geval van een analyt met een isobare of isomere verbinding is een aanvaardbare retentietijd (d.w.z. ± 0,5 % bij GC en ± 1 % bij LC en SFC) vereist om de identiteit ervan te bevestigen.

2. Er mogen maximaal drie afzonderlijke technieken worden gecombineerd om het minimumaantal identificatiepunten te verkrijgen.

3. Verschillende ionisatiemethoden (bv. elektronenionisatie en chemische ionisatie) worden als verschillende technieken beschouwd. Tabel 3 Identificatiepunten per techniek Techniek Identificatiepunten Scheiding (GC-, LC-, SFC-, CE-methode) 1 LR-MS ion 1 Selectie van precursor-ionen bij massabereik < ± 0,5 Da 1 (indirect) LR-MSn product-ion 1,5 HR-MS ion 1,5 HR-MSn product-ion 2,5 Tabel 4 Voorbeelden van het aantal identificatiepunten voor specifieke technieken en combinaties van technieken (n = een geheel getal) Techniek(en) Scheiding Aantal ionen Identificatiepunten GC-MS (EI of CI) GC n 1 + n GC-MS (EI of CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI of CI) 2 derivaten GC 2 (derivaat A) + 2 (derivaat B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- of LC-MS/MS GC of LC 1 precursor + 2 producten 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- of LC-MS/MS GC of LC 2 precursors + 2 producten 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- of LC-MS3 GC of LC 1 precursor + 1 MS2-product + 1 MS3-product 1 + 1 + 1,5 + 1,5 = 5 GC- of LC-HRMS GC of LC N 1 + n × 1,5 GC- of LC-HRMS/MS GC of LC 1 precursor (massabereik < ± 0,5 Da) + 1 product 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- of LC-HRMS en HRMS/MS GC of LC 1 full-scan-ion + 1 HRMS-product-ion (a) 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- en LC-MS GC en LC 2 ionen (GCMS) + 1 ion (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5. Specifieke prestatiecriteria voor de bepaling van een analyt met behulp van vloeistofchromatografie met andere detectietechnieken dan massaspectrometrie

Alleen voor toegelaten stoffen kunnen de volgende technieken worden gebruikt als alternatief voor op massaspectrometrie gebaseerde methoden, mits aan de relevante criteria voor deze technieken wordt voldaan:

1. full-scan diodearray-detectiespectrofotometrie (DAD) indien gebruikt met HPLC;

2. spectometrie met fluorescentiedetectie (FLD) indien gebruikt bij HPLC.

Vloeistofchromatografie met UV-VIS-detectie (vaste golflengte) is als zodanig niet geschikt als bevestigingsmethode.

1.2.5.1. Prestatiecriteria voor full-scan diodearray-spectrofotometrie

Er moet worden voldaan aan de prestatiecriteria voor chromatografische scheiding in hoofdstuk 1.2.3.

De absorptiemaxima in het uv-spectrum van de analyt moeten bij dezelfde golflengten liggen als die van de ijkstandaard in de matrix, binnen een maximale marge die afhankelijk is van de resolutie van het detectiesysteem. Voor diodearray-detectie is de karakteristieke maximale marge ± 2 nm. Het spectrum van de analyt boven 220 nm mag voor de delen van de twee spectra met een relatieve extinctie van ten minste 10 % niet zichtbaar verschillen van het spectrum van de ijkstandaard. Aan dit criterium wordt voldaan wanneer ten eerste dezelfde maxima aanwezig zijn en ten tweede het verschil tussen de twee spectra op geen enkel punt groter is dan 10 % van de extinctie van de ijkstandaard. Wanneer gebruik wordt gemaakt van computerondersteunde library searching en matching moet de vergelijking tussen de spectrumgegevens van de officiële monsters en die van de ijkoplossing boven een bepaalde kritieke matchfactor liggen. Deze factor wordt tijdens de validatie voor elke analyt vastgesteld aan de hand van spectra die aan de hierboven beschreven criteria voldoen. Nagegaan moet worden of er variaties in de spectra optreden als gevolg van de monstermatrix en de detectorprestaties.

1.2.5.2. Prestatiecriteria voor spectrofotometrie met fluorescentiedetectie

Er moet worden voldaan aan de prestatiecriteria voor chromatografische scheiding in hoofdstuk 1.2.3.

De excitatie- en emissiegolflengte worden in combinatie met de chromatografiecondities zodanig gekozen dat de effecten van storende componenten in blancomonsterextracten zo gering mogelijk zijn. De excitatie- en de emissiegolflengte moeten minimaal 50 nanometer uit elkaar liggen.

De afstand tussen de karakteristieke piek van de analyt en de top van de dichtstbijzijnde piek in het chromatogram moet ten minste eenmaal de volle piekbreedte zijn op 10 % van de maximumhoogte van de piek van de analyt.

Dit geldt voor moleculen die zelf fluoresceren en voor moleculen die na omzetting of derivatisering fluorescentie vertonen.

HOOFDSTUK 2

VALIDATIE

2.1. Te bepalen prestatiekenmerken voor analysemethoden

Door middel van de validatie van de methode moet worden aangetoond dat de analysemethode voldoet aan de criteria voor de desbetreffende prestatiekenmerken. Verschillende controledoeleinden vereisen verschillende categorieën methoden. Tabel 5 geeft aan welk prestatiekenmerk moet worden gecontroleerd voor welk type methode; elk van de parameters wordt in dit hoofdstuk nader toegelicht.

Tabel 5

Indeling van analysemethoden naar de te bepalen prestatiekenmerken

Methode Bevestiging Screening Kwalitatief Kwantitatief Kwalitatief Semikwantitatief Kwantitatief Stoffen A A, B A, B A, B A, B Identificatie overeenkomstig punt 1.2 x x CCα x x CCβ — x x x Juistheid x x Precisie x (x) x Relatief matrixeffect/absolute terugvinding (*) x x Selectiviteit/specificiteit x x x x Stabiliteit (#) x x x x Robuustheid x x x x xDoor middel van de validatie moet worden aangetoond dat aan de voorschriften voor het prestatiekenmerk is voldaan. (x)Voor semikwantitatieve screeningsmethoden hoeft niet te worden voldaan aan de precisievoorschrijften van punt 1.2.2.2. De precisie moet echter worden bepaald om aan te tonen dat de methode geschikt is om fout-conforme analyseresultaten te vermijden. AVerboden of niet-toegelaten stoffen. BToegelaten stoffen.

2.2. Juistheid, herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid

Dit hoofdstuk bevat voorbeelden en referenties voor validatieprocedures. Er mogen ook andere methoden worden gebruikt om aan te tonen dat de methode voldoet aan de prestatiecriteria, mits zij dezelfde hoeveelheid informatie van dezelfde kwaliteit opleveren.

2.2.1. Conventionele validatie

Om de parameters volgens conventionele methoden te berekenen moeten verscheidene afzonderlijke proeven gedaan worden. Elk prestatiekenmerk moet voor elke grotere verandering worden bepaald (zie punt 2.4). Bij multianalytmethoden kunnen verschillende analyten tegelijkertijd geanalyseerd worden, mits eventueel relevante storingen zijn uitgesloten. Verscheidene prestatiekenmerken kunnen op een soortgelijke wijze bepaald worden. Om werk te besparen wordt het daarom aangeraden om proeven zo veel mogelijk te combineren (bijvoorbeeld herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid met specificiteit, analyse van blancomonsters ter bepaling van de beslissingsgrens voor bevestiging en testen op specificiteit).

2.2.1.1. Juistheid op basis van een gecertificeerd referentiemateriaal

Het verdient de voorkeur de juistheid van een analysemethode te bepalen met behulp van gecertificeerd referentiemateriaal (CRM). De procedure hiervoor wordt beschreven in de ISO-norm 5725-4:1994 (2).

Hier volgt een voorbeeld:

1. analyseer zes identieke monsters van het CRM volgens de testinstructies voor de methode;

2. bepaal de concentratie van de analyt in elk van deze monsters;

3. bereken het gemiddelde, de standaardafwijking en de variatiecoëfficiënt (in %) voor deze zes identieke monsters;

4. bereken de juistheid door de bepaalde gemiddelde concentratie te delen door de gecertificeerde waarde (gemeten als concentratie) en vermenigvuldig met 100 om het resultaat als percentage uit te drukken.

Juistheid (in %) = (gemiddelde voor de terugvinding gecorrigeerde gemeten concentratie) × (100/gecertificeerde waarde)

2.2.1.2. Juistheid op basis van monsters met toegevoegde analyt

Indien er geen gecertificeerd referentiemateriaal beschikbaar is, wordt de juistheid van de methode bepaald aan de hand van experimenten met behulp van een blancomatrix waaraan analyt is toegevoegd, ten minste overeenkomstig het volgende schema:

1. voor methoden die zijn gevalideerd vanaf de datum van inwerkingtreding van deze verordening, blancomateriaal selecteren en analyt toevoegen in een concentratie van: a) 0,5 (3), 1,0 en 1,5 maal de actiedrempel, of b) 0,1 (4), 1,0 en 1,5 maal de MRL of het maximumgehalte voor toegelaten stoffen, of c) 1,0, 2,0 en 3,0 maal het LGG voor niet-toegelaten stoffen (waarvoor geen actiedrempel is vastgesteld);

2. de analyse wordt voor elke concentratie in zesvoud uitgevoerd;

3. analyseer de monsters;

4. bereken de in elk monster gemeten concentratie;

5. bereken de juistheid voor elk monster met behulp van onderstaande vergelijking en bereken vervolgens de gemiddelde juistheid en de variatiecoëfficiënt voor de zes resultaten bij elk concentratieniveau.

Juistheid (in %) = (gemiddelde voor de terugvinding gecorrigeerde gemeten concentratie) × (100/toegevoegde concentratie)

Voor methoden voor toegelaten stoffen die vóór de datum van toepassing van deze verordening zijn gevalideerd, volstaat een bepaling van de juistheid van de methode met 6 aliquots waaraan 0,5, 1,0 en 1,5 maal de MRL dan wel het maximumgehalte is toegevoegd.

2.2.1.3. Herhaalbaarheid

1. Voor methoden die zijn gevalideerd vanaf de datum van inwerkingtreding van deze verordening, wordt een reeks monsters van identieke blancomatrices van dezelfde soort bereid. De analyt wordt eraan toegevoegd tot concentraties worden bereikt die overeenstemmen met: a) 0,5 (5), 1,0 en 1,5 maal de actiedrempel, of b) 0,1 (6), 1,0 en 1,5 maal de MRL of het maximumgehalte voor toegelaten stoffen, of c) 1,0, 2,0 en 3,0 maal het LGG voor niet-toegelaten of verboden stoffen indien er geen actiedrempel geldt.

2. De analyse wordt voor elke concentratie ten minste in zesvoud uitgevoerd.

3. Analyseer de monsters.

4. Bereken de in elk monster gemeten concentratie.

5. Bereken de gemiddelde concentratie, de standaardafwijking en de variatiecoëfficiënt (in %) van de monsters met toegevoegde analyt.

6. Herhaal deze stappen nog ten minste tweemaal.

7. Bereken de totale gemiddelde concentraties, standaardafwijkingen (door het gemiddelde van de gekwadrateerde standaardafwijkingen van de afzonderlijke gevallen te berekenen en daar vervolgens de vierkantswortel van te nemen) en de variatiecoëfficiënten voor de monsters met toegevoegde analyt. Voor methoden voor toegelaten stoffen die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn gevalideerd, volstaat een bepaling van de herhaalbaarheid met matrices waaraan analyt is toegevoegd tot concentraties van 0,5, 1,0 en 1,5 maal de MRL dan wel het maximumgehalte. Als alternatief kan de herhaalbaarheid worden berekend overeenkomstig de ISO-norm 5725-2:2019 (7).

2.2.1.4. Intralaboratoriumreproduceerbaarheid

1. Bereid voor validaties die na de datum van inwerkingtreding van deze verordening worden uitgevoerd, een reeks monsters van gespecificeerd testmateriaal (identieke of verschillende matrices), waaraan de analyt(en) is (zijn) toegevoegd tot concentraties worden bereikt die overeenstemmen met: a) 0,5 (5), 1,0 en 1,5 maal de actiedrempel, of b) 0,1 (6), 1,0 en 1,5 maal de MRL of het maximumgehalte voor toegelaten stoffen, of c) 1,0, 2,0 en 3,0 maal het LGG voor niet-toegelaten of verboden stoffen indien er geen actiedrempel geldt.

2. Voer de analyse bij elk concentratieniveau uit met ten minste zes identieke monsters van blancomateriaal.

3. Analyseer de monsters.

4. Bereken de in elk monster gemeten concentratie.

5. Herhaal deze stappen op ten minste twee andere tijdstippen met andere partijen blancomateriaal, andere analisten en onder zo veel mogelijk andere omgevingsomstandigheden, bv. andere partijen reagentia, oplosmiddelen, andere omgevingstemperaturen, andere apparatuur, of een variatie van andere parameters.

6. Bepaal de gemiddelde concentratie, de standaardafwijking en de variatiecoëfficiënt (in %) van de monsters met toegevoegde analyt. Voor methoden voor toegelaten stoffen die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn gevalideerd, volstaat een bepaling van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid met matrices waaraan analyt is toegevoegd tot concentraties van 0,5, 1,0 en 1,5 maal de MRL dan wel het maximumgehalte. Als alternatief kan de berekening voor intralaboratoriumreproduceerbaarheid/intermediaire precisie ook worden uitgevoerd overeenkomstig de ISO-norm 5725-2:2019, de ISO-norm 11843-1:1997 (8), Codex CAC/GL 59-2006 (9).

2.2.2. Validatie volgens andere modellen

Om de parameters volgens andere modellen te berekenen, moet met een proefopzet worden gewerkt. De proefopzet moet worden uitgewerkt afhankelijk van het aantal verschillende diersoorten en factoren dat wordt onderzocht. De validatieprocedure moet dus beginnen met te kijken naar de monsterpopulaties die in de toekomst in het laboratorium zullen worden onderzocht, om op basis daarvan te bepalen welke de belangrijkste diersoorten zijn en welke factoren van invloed kunnen zijn op de meetresultaten. Aan de hand van de factoriële benadering kan de meetonzekerheid van de testresultaten, verkregen onder uiteenlopende testomstandigheden in een bepaald laboratorium, zoals andere analisten, andere apparatuur, andere partijen reagentia, andere matrices, andere analysetijden en andere analysetemperaturen, worden beoordeeld. Vervolgens moet het concentratiebereik al naargelang van het doel van de bepalingen en, voor toegelaten stoffen, de MRL, of, voor verboden of niet-toegelaten stoffen, het maximumgehalte of de actiedrempel of het LGG, worden gekozen.

De factoriële benadering is gericht op het vaststellen van betrouwbare precisiegegevens en meetgegevens door gelijktijdige gecontroleerde variatie van de gekozen factoren. Dit maakt het mogelijk het gecombineerde effect van factoriële en willekeurige effecten te beoordelen. De proefopzet maakt het ook mogelijk de robuustheid (10) van de analysemethode te onderzoeken en de standaardafwijking van de interne reproduceerbaarheid over de verschillende matrices te bepalen.

Hieronder wordt een voorbeeld gegeven van een alternatieve benadering waarbij gebruik wordt gemaakt van een uitgewerkte orthogonale proefopzet.

Er kunnen tot zeven factoren (geluidsfactoren) worden onderzocht. De studie is zodanig opgezet dat de precisie, juistheid (op basis van monsters met toegevoegde analyt), gevoeligheid, meetonzekerheid en kritische concentraties gelijktijdig kunnen worden bepaald door volgens de proefopzet te werk te gaan.

Tabel 6

Voorbeeld van een uitgewerkte orthogonale proefopzet met 7 factoren (I-VII) die op twee niveaus (A/B) worden gevarieerd in een validatiestudie met acht analysegangen (combinatie van factorniveaus).

Factor I II III IV V VI VII Analysegang 01 A A A A A A A Analysegang 02 A A B A B B B Analysegang 03 A B A B A B B Analysegang 04 A B B B B A A Analysegang 05 B A A B B A B Analysegang 06 B A B B A B A Analysegang 07 B B A A B B A Analysegang 08 B B B A A A B

De kenmerken van de methode worden berekend zoals beschreven door Jülicher et al. (11).

2.2.3. Andere validatiemethoden

Er mogen ook andere methoden worden gebruikt om aan te tonen dat de methode voldoet aan de prestatiecriteria voor het desbetreffende prestatiekenmerk, mits zij dezelfde hoeveelheid informatie van dezelfde kwaliteit opleveren. De validatie kan ook plaatsvinden door middel van een interlaboratoriumonderzoek zoals vastgesteld door de Codex Alimentarius, ISO of IUPAC (12) of volgens alternatieve methoden zoals intralaboratoriumonderzoek of interne validatie (13). Indien andere validatieprocedures worden gevolgd, moeten het model en de strategie waarop deze berusten met de verschillende eisen, aannamen en formules in het validatieprotocol worden vastgelegd of moet hier in elk geval naar worden verwezen.

2.3. Selectiviteit/specificiteit

Het vermogen om de analyt te onderscheiden van nauw verwante stoffen wordt zo goed mogelijk bepaald. Storingen met homologen, isomeren, afbraakproducten, endogene stoffen, analogen, metabolieten van het betrokken residu, matrixverbindingen of andere mogelijk storende stoffen moeten worden bepaald en indien nodig moet de methode worden gewijzigd om de vastgestelde storingen te vermijden. Om de specificiteit van de methode te bepalen, wordt de volgende benadering gevolgd:

1. kies een reeks chemisch verwante verbindingen of andere stoffen die met enige waarschijnlijkheid kunnen worden aangetroffen met de betrokken verbinding en die in de monsters aanwezig kunnen zijn, en verifieer of zij de analyse van de doelanalyt(en) zouden kunnen verstoren;

2. analyseer een voldoende aantal representatieve blancomonsters, bv. verschillende partijen of partijen van verschillende diersoorten (n ≥ 20) en ga na of er storingen van signalen, pieken of ionensporen optreden in het gebied waar de doelanalyt verwacht wordt te elueren;

3. voeg aan representatieve blancomonsters in een relevante concentratie een of meer stoffen toe die de identificatie en/of kwantificering van de analyt zouden kunnen verstoren en onderzoek of de toegevoegde stof: a) tot een foute identificatie kan leiden; b) de identificatie van de doelanalyt belemmert; c) de kwantificering merkbaar beïnvloedt.

2.4. Robuustheid

Getest moet worden of de analysemethode goed blijft presteren onder verschillende proefomstandigheden, zoals verschillende bemonsteringsomstandigheden en kleine veranderingen die zich bij routinetests kunnen voordoen. Om de robuustheid van de methode te testen, moet het bij de wijzigingen van de proefomstandigheden slechts om kleine veranderingen gaan. Het belang van deze veranderingen wordt geëvalueerd. Elk prestatiekenmerk wordt bepaald voor alle kleine veranderingen die een significant effect op de prestaties van de bepaling blijken te hebben.

2.5. Stabiliteit

De stabiliteit van de ijkstandaard, matrixgematchte standaard en/of matrixverrijkte standaarden en van analyt- of matrixbestanddelen in het monster tijdens de opslag of analyse moet worden bepaald, aangezien instabiliteit de testresultaten zou kunnen beïnvloeden.

Doorgaans is de stabiliteit van de analyt onder verschillende opslagcondities goed gekarakteriseerd. De proeven voor het toezicht op de opslagcondities van standaarden en monsters, die in het kader van het normale systeem voor de erkenning en kwaliteitscontrole van laboratoria worden verricht, kunnen de vereiste informatie opleveren. Indien stabiliteitsgegevens voor analyten in de matrix beschikbaar zijn (bv. op basis van informatie van de EURL’s, gepubliceerde gegevens enz.) hoeven deze gegevens niet door elk laboratorium te worden bepaald. Een verwijzing naar beschikbare stabiliteitsgegevens van analyten in oplossing en in matrix kan echter alleen worden aanvaard als voor identieke omstandigheden wordt gezorgd.

Indien de vereiste stabiliteitsgegevens niet beschikbaar zijn, moeten de volgende benaderingen worden gevolgd.

2.5.1. Bepaling van de stabiliteit van de analyt in oplossing

1. Bereid verse stamoplossingen van de analyt(en) en verdun deze zoals is aangegeven in de testinstructies om voldoende aliquots (bijvoorbeeld 40) te verkrijgen van elke geselecteerde concentratie. Er moeten monsters worden bereid van: a) oplossingen van de analyt die worden gebruikt voor toevoeging; b) oplossingen van de analyt die worden gebruikt voor de eindanalyse; c) eventuele andere oplossingen die van belang zijn (bv. gederivatiseerde standaarden).

2. Meet het analytgehalte in de versbereide oplossing volgens de testinstructies.

3. Breng adequate volumes over in geschikte recipiënten, etiketteer deze en bewaar ze volgens de licht- en temperatuuromstandigheden van het schema in tabel 7. Bij de keuze van de opslagtijd wordt rekening gehouden met de toegepaste analysepraktijk, idealiter totdat de eerste afbraakverschijnselen tijdens de identificatie en/of kwantificering waarneembaar zijn. Indien tijdens het stabiliteitsonderzoek geen afbraak wordt waargenomen, moet de opslagduur voor het stabiliteitsonderzoek gelijk zijn aan de duur van de maximale opslagperiode van de oplossing.

4. Bereken de concentratie van de analyt(en) in elk aliquot in vergelijking met de concentratie van de analyt in de versbereide oplossing aan de hand van de onderstaande formule: Resterende analyt (%) = Ci × 100/Cvers Ci = concentratie op tijdstip i Cvers = concentratie van de verse oplossing De gemiddelde waarde van vijf identiek bereide oplossingen die zijn opgeslagen, mag niet meer dan 15 % afwijken van de gemiddelde waarde van vijf identiek bereide verse oplossingen. De gemiddelde waarde van de vijf verse oplossingen wordt gebruikt als basis voor de berekening van het procentuele verschil. Tabel 7 Schema voor bepaling van de stabiliteit van de analyt in oplossing – 20 °C + 4 °C + 20 °C Donker 10 aliquots 10 aliquots 10 aliquots Licht 10 aliquots

2.5.2. Bepaling van de stabiliteit van de analyt(en) in de matrix

1. Gebruik waar mogelijk praktijkmonsters. Is er geen praktijkmatrix beschikbaar, dan moet een blancomatrix worden gebruikt waaraan analyt is toegevoegd.

2. Wanneer er wel een praktijkmatrix beschikbaar is, bepaal dan de concentratie in de matrix, terwijl de matrix nog vers is. Sla verdere aliquots van het gehomogeniseerde gevormde materiaal op bij – 20 °C of lager indien nodig, en bepaal de concentraties van de analyt zolang het monster in het laboratorium wordt bewaard.

3. Indien er geen praktijkmatrix voorhanden is, neem dan wat blancomatrix en homogeniseer deze. Verdeel de matrix in vijf aliquots. Voeg aan elk aliquot de analyt toe, die bij voorkeur in een kleine hoeveelheid waterige oplossing is bereid. Analyseer één aliquot onmiddellijk. Bewaar de resterende aliquots ten minste bij – 20 °C of lager indien nodig en analyseer ze na opslag op korte, middellange en lange termijn, rekening houdend met de toegepaste analysemethoden.

4. Registreer de maximaal aanvaardbare opslagtijd en de optimale opslagcondities. De gemiddelde waarde van vijf identiek bereide oplossingen die zijn opgeslagen, mag niet meer dan de intralaboratoriumreproduceerbaarheid afwijken van de gemiddelde waarde van vijf identiek bereide verse oplossingen. De gemiddelde waarde van de vijf verse oplossingen wordt gebruikt als basis voor de berekening van het procentuele verschil.

2.6. Beslissingsgrens voor bevestiging (CCα)

De CCα moet worden bepaald voor bevestigingsmethoden. De CCα wordt vastgesteld onder omstandigheden die voldoen aan de voorschriften voor identificatie of identificatie plus kwantificering zoals gedefinieerd onder “Prestatiecriteria en andere voorschriften voor analysemethoden” in hoofdstuk 1.

Voor de controle op de conformiteit van monsters is in de CCα-waarde (beslissingsgrens) al rekening gehouden met de gecombineerde standaardmeetonzekerheid.

1. Voor niet-toegelaten of verboden farmacologisch werkzame stoffen wordt de CCα als volgt berekend: a) methode 1: met behulp van de ijkcurve volgens de ISO-norm 11843-1:1997 (14) (in deze norm aangeduid als de kritieke waarde van de nettotoestandsvariabele). In dit geval moet blancomateriaal worden gebruikt waaraan analyt op en boven de actiedrempel of het LGG in equidistante stappen is toegevoegd. Analyseer de monsters. Zet na identificatie waar mogelijk het signaal, of anders de herberekende concentratie, uit tegen de toegevoegde concentratie. De beslissingsgrens is gelijk aan de concentratie die overeenkomt met de y-asafsnede plus 2,33 maal de standaardafwijking van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid van de asafsnede. Deze methode is alleen van toepassing op kwantitatieve analyses. De met deze benadering verkregen beslissingsgrenzen moeten worden geverifieerd door analyse van blancomatrix waaraan analyt is toegevoegd tot de berekende beslissingsgrens; b) methode 2: door ten minste twintig representatieve blancomonsters per matrix te analyseren om de signaal-ruisverhouding te berekenen voor het tijdsinterval waarin de analyt verwacht wordt. Als beslissingsgrens kan driemaal de signaal-ruisverhouding worden genomen. Dit geldt voor kwantitatieve en kwalitatieve bepalingen. De met deze benadering verkregen beslissingsgrenzen moeten worden geverifieerd door analyse van blancomatrix waaraan analyt is toegevoegd tot de berekende beslissingsgrens; c) methode 3: CCα = LGG + k(eenzijdig, 99 %) × (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid bij het LGG Voor niet-toegelaten of verboden farmacologisch werkzame stoffen kan, afhankelijk van de validatieproef (en de desbetreffende vrijheidsgraden), redelijkerwijs de t-verdeling worden toegepast, of wordt — indien de gaussverdeling (eenzijdig, n = ∞) als uitgangspunt wordt genomen — een k-factor van 2,33 gebruikt. De intralaboratoriumreproduceerbaarheid en de juistheid zijn geschikt om de (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid te bepalen, indien deze wordt bepaald door rekening te houden met alle relevante beïnvloedende factoren. Methode 2 voor de berekening van de CCα mag slechts tot 1 januari 2026 worden gebruikt voor methoden die vóór de datum van inwerkingtreding van deze verordening zijn gevalideerd. Voor methoden die na de inwerkingtreding van deze verordening zijn gevalideerd, mag alleen methoden 1 of 3 worden gebruikt.

2. Voor toegelaten stoffen wordt de CCα als volgt berekend: a) voor toegelaten stoffen in matrix/soort-combinaties waarvoor een MRL of maximumgehalte is vastgesteld: i) methode 1: met behulp van de ijkcurve volgens ISO-norm 11843-1:1997 (in deze norm aangeduid als de kritieke waarde van de nettotoestandsvariabele). In dit geval moet blancomateriaal worden gebruikt waaraan analyt op en boven de MRL of het maximumgehalte in equidistante stappen is toegevoegd. Analyseer de monsters. Zet na identificatie waar mogelijk het signaal, of anders de herberekende concentratie, uit tegen de toegevoegde concentratie. De beslissingsgrens is gelijk aan de concentratie die overeenkomt met de MRL of het maximumgehalte plus 1,64 maal de standaardafwijking van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid bij het toelaatbare gehalte (α = 5 %); ii) methode 2: CCα = MRL (of maximumgehalte) + k(eenzijdig, 95 %) × (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid bij de MRL of het maximumgehalte. Voor toegelaten stoffen kan, afhankelijk van de validatieproef (en de desbetreffende vrijheidsgraden), redelijkerwijs de t-verdeling worden toegepast, of wordt — indien de gaussverdeling (eenzijdig, n = ∞) als uitgangspunt wordt genomen — een k-factor van 1,64 gebruikt. De intralaboratoriumreproduceerbaarheid en de juistheid zijn geschikt om de (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid te bepalen, indien deze wordt bepaald door rekening te houden met alle relevante beïnvloedende factoren. Voor farmacologisch werkzame stoffen waarvoor de MRL voor de som van verschillende stoffen is vastgesteld, wordt de CCα van de stof met de hoogste concentratie in het monster als de CCα gebruikt om de som van de stoffen in het gemeten monster te beoordelen; b) voor toegelaten stoffen in matrix/soort-combinaties waarvoor geen MRL is vastgesteld, mogen geen residuen aanwezig zijn tenzij een toegelaten behandeling overeenkomstig artikel 11 van Richtlijn 2001/82/EG heeft plaatsgevonden. Voor toegelaten stoffen waarvoor geen MRL is vastgesteld, wordt de bij Uitvoeringsverordening (EU) 2018/470 van de Commissie (15) vastgestelde cascade-MRL gebruikt voor de berekening van de CCα. Methode 1 of 2 zoals in punt a) hierboven wordt toegepast, waarbij “MRL” dan echter wordt gelezen als “0,5 maal de cascade-MRL, met als doelstelling 0,1 maal de cascade-MRL, voor zover redelijkerwijs mogelijk”.

2.7. Detectievermogen voor screening (CCβ)

Het CCβ moet worden bepaald voor screeningsmethoden. Het CCβ wordt vastgesteld zoals gedefinieerd onder “Prestatiecriteria en andere voorschriften voor analysemethoden” in hoofdstuk 1 van deze bijlage en overeenkomstig de voorschriften in tabel 5. De volledige voorschriften voor identificatie (zie 1.2.3, 1.2.4, 1.2.5) hoeven echter niet te worden toegepast voor screeningsmethoden.

1. Voor niet-toegelaten of verboden farmacologisch werkzame stoffen moet een maximale β-fout van 5 % worden gewaarborgd. Het CCβ wordt als volgt berekend: a) methode 1: met behulp van de ijkcurve volgens ISO-norm 11843-1:1997 (in deze norm aangeduid als de minimaal aantoonbare waarde van de nettotoestandsvariabele). In dit geval moet representatief blancomateriaal worden gebruikt waaraan analyt op en onder de actiedrempel of, indien geen actiedrempel is vastgesteld, rond de STC in equidistante stappen is toegevoegd. Analyseer de monsters. Zet het signaal uit tegen de toegevoegde concentratie. Het detectievermogen is gelijk aan de concentratie die overeenkomt met de STC plus 1,64 maal de standaardafwijking van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid van het gemiddelde gemeten gehalte bij de STC. Extrapolatie tot ver onder de laagste toegevoegde concentratie (< 50 % van de laagste toegevoegde concentratie) moet tijdens de validatiestap met behulp van experimentele gegevens worden bevestigd; b) methode 2: onderzoek aan blancomateriaal waaraan analyt is toegevoegd in concentraties die overeenstemmen met of hoger liggen dan de STC. Voor elk concentratieniveau worden twintig blanco’s met toegevoegde analyt geanalyseerd om een betrouwbare basis voor deze bepaling te waarborgen. Het detectievermogen is gelijk aan de concentratie waarbij er nog maar ≤ 5 % fout-conforme uitslagen overblijven; c) methode 3: CCβ = STC + k(eenzijdig, 95 %) × (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid bij of boven de STC. Voor niet-toegelaten of verboden farmacologisch werkzame stoffen kan, afhankelijk van de validatieproef (en de desbetreffende vrijheidsgraden), redelijkerwijs de t-verdeling worden toegepast, of wordt — indien de gaussverdeling (eenzijdig, n = ∞) als uitgangspunt wordt genomen — een k-factor van 1,64 gebruikt. De intralaboratoriumreproduceerbaarheid en de juistheid zijn geschikt om de (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid te bepalen, indien deze wordt bepaald door rekening te houden met alle relevante beïnvloedende factoren.

2. Voor toegelaten stoffen moet een maximale β-fout van 5 % worden gewaarborgd. Het CCβ wordt als volgt berekend: a) methode 1: met behulp van de ijkcurve volgens ISO-norm 11843-1:1997 (in deze norm aangeduid als een minimaal aantoonbare waarde van de nettotoestandsvariabele). In dit geval moet representatief blancomateriaal worden gebruikt waaraan analyt op en onder het toelaatbare gehalte in equidistante stappen is toegevoegd, te beginnen vanaf de STC. Analyseer de monsters en identificeer de analyt(en). Bereken de standaardafwijking van het gemiddelde gemeten gehalte bij de STC. Het detectievermogen is gelijk aan de concentratie die overeenkomt met de STplus 1,64 maal de standaardafwijking van de intralaboratoriumreproduceerbaarheid van het gemiddelde gemeten gehalte bij de STC; b) methode 2: door onderzoek aan blancomateriaal waaraan analyt is toegevoegd in concentraties die onder het toelaatbare gehalte liggen. Voor elk concentratieniveau worden twintig blanco’s met toegevoegde analyt geanalyseerd om een betrouwbare basis voor deze bepaling te waarborgen. Het detectievermogen is gelijk aan de concentratie waarbij er nog maar ≤ 5 % fout-conforme uitslagen overblijven; c) methode 3: CCβ = STC + k(eenzijdig, 95 %) × (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid bij of boven de STC. Voor niet-toegelaten of verboden farmacologisch werkzame stoffen kan, afhankelijk van de validatieproef (en de desbetreffende vrijheidsgraden), redelijkerwijs de t-verdeling worden toegepast, of wordt — indien de gaussverdeling (eenzijdig, n = ∞) als uitgangspunt wordt genomen — een k-factor van 1,64 gebruikt (hetzij bij gebruik via cascade, hetzij bij regulier gebruik op basis van de MRL). De intralaboratoriumreproduceerbaarheid en de juistheid zijn geschikt om de (gecombineerde) standaardmeetonzekerheid te bepalen, indien deze wordt bepaald door rekening te houden met alle relevante beïnvloedende factoren. Voor farmacologisch werkzame stoffen waarvoor de MRL voor de som van verschillende stoffen is vastgesteld, wordt het CCβ van de stof met de hoogste concentratie in het monster gebruikt als het CCβ om de som van de stoffen in het gemeten monster te beoordelen.

2.8. IJkcurves

Indien voor de kwantificering ijkcurves worden gebruikt:

1. moeten ten minste vijf, bij voorkeur equidistante, concentraties (inclusief nulniveau) voor het uitzetten van de curve gebruikt worden;

2. wordt het werkbereik van de ijkcurve aangegeven;

3. worden de wiskundige formule van de curve en de goodness-of-fit van de gegevens (determinatiecoëfficiënt R2) met de curve aangegeven;

4. worden aanvaardbaarheidsintervallen voor de parameters van de curve aangegeven.

Voor ijkcurves op basis van een standaardoplossing, matrixgematchte standaarden of matrixverrijkte standaarden, worden aanvaardbare intervallen aangegeven voor de parameters van de ijkcurve, die van reeks tot reeks kunnen verschillen.

2.9. Absolute terugvinding

De absolute terugvinding van de methode moet worden bepaald als er geen interne standaard of geen matrixverrijkte ijking wordt gebruikt.

Wanneer aan de in tabel 1 vastgestelde voorschriften inzake juistheid is voldaan, mag een vaste correctiefactor worden gebruikt. Indien dit niet het geval is, moet de voor die specifieke batch verkregen terugvindingsfactor worden gebruikt. Als alternatief wordt de standaardadditieprocedure (16) of een interne standaard gebruikt in plaats van een terugvindingscorrectiefactor.

De absolute terugvinding wordt berekend voor ten minste zes representatieve partijen matrix.

Vóór de extractie wordt analyt toegevoegd aan een aliquot van blancomatrix en na de monstervoorbereiding wordt analyt bij een relevant concentratieniveau toegevoegd aan een tweede aliquot van blancomatrix, waarna de concentratie van de analyt wordt bepaald.

De terugvinding wordt als volgt berekend:

Terugv (analyt) = (matrixverrijkte standaard)/(matrixgematchte standaard) × 100

2.10. Relatieve matrixeffecten

Het relatieve matrixeffect wordt in alle gevallen bepaald. Dit kan gebeuren in het kader van de validatie of in afzonderlijke proeven. Het relatieve matrixeffect wordt berekend voor ten minste twintig verschillende blancopartijen (matrix/soort), afhankelijk van het toepassingsgebied van de methode, bv. de verschillende soorten die moeten worden bestreken.

Aan de blancomatrix moet na extractie de analyt worden toegevoegd bij de actiedrempel, de MRL of het maximumgehalte, waarna zij samen met een zuivere oplossing van de analyt moet worden geanalyseerd.

Het relatieve matrixeffect of de matrixfactor (MF) wordt als volgt berekend:

IS: interne standaard

MMS: matrixgematchte standaard

De variatiecoëfficiënt mag niet groter zijn dan 20 % voor de MF (standaard genormaliseerd voor IS).

HOOFDSTUK 3

KWALITEITSCONTROLE TIJDENS ROUTINEANALYSE — DOORLOPENDE VERIFICATIE VAN DE PRESTATIES VAN DE METHODE

Er moet worden voldaan aan de voorschriften voor het waarborgen van de kwaliteit van de analyseresultaten van de ISO/IEC-norm 17025:2017 (17).

Bij routineanalyse wordt bij voorkeur gebruikgemaakt van de analyse van gecertificeerde referentiematerialen (CRM’s) om het bewijs te leveren van de prestaties van de methode. Aangezien er zelden CRM’s beschikbaar zijn die de relevante analyten bevatten bij de vereiste concentratieniveaus, mogen als alternatief ook referentiematerialen worden gebruikt die worden verstrekt en gekenmerkt door de EURL’s of door laboratoria met een accreditatie volgens de ISO/IEC-norm 17043:2010 (18). Een ander toegestaan alternatief is gebruik te maken van intern referentiemateriaal dat regelmatig wordt gecontroleerd.

De doorlopende verificatie van de prestaties van de methode tijdens routineanalyses moet worden uitgevoerd tijdens de screeningsstap en de bevestigingsstap.

1. Voor de screeningsstap: Voor elke reeks (batch) van uitgevoerde analyses wordt tegelijkertijd een set van de volgende kwaliteitscontrolemonsters geanalyseerd: a) controlemonster voor de systeemgeschiktheid van het instrument, idealiter specifiek voor de methode; b) monsters voor kwaliteitscontrole waaraan analyt is toegevoegd bij een concentratie die in de buurt van de STC ligt, en idealiter ter hoogte van het CCβ voor de screening van toegelaten farmacologisch werkzame stoffen en van de verboden of niet-toegelaten stoffen); c) conform controlemonster (blancomonsters) en, indien van toepassing, reagensblanco’s.

2. Voor de bevestigingsstap: Voor elke reeks (batch) van uitgevoerde analyses wordt tegelijkertijd een set van de volgende kwaliteitscontrolemonsters geanalyseerd: a) controlemonster voor de systeemgeschiktheid van het instrument, idealiter specifiek voor de methode; b) monsters voor kwaliteitscontrole waaraan analyt is toegevoegd bij een concentratie die in de buurt van de MRL of het maximumgehalte ligt voor toegelaten farmacologisch werkzame stoffen, of in de buurt van de actiegrens of het LGG voor verboden of niet-toegelaten stoffen (niet-conforme controlemonsters); c) conform controlemonster (blancomonsters) en, indien van toepassing, reagensblanco’s.

Voor de kwaliteitscontrolemonsters wordt de volgende volgorde aanbevolen: controlemonster voor de systeemgeschiktheid van het instrument, conform controlemonster, te bevestigen monster(s), opnieuw conform controlemonster en kwaliteitscontrolemonster met toegevoegde analyt (niet-conforme controlemonsters).

Voor kwantitatieve methoden moet met elke batch officiële monsters vóór of na de bovengenoemde monsters een ijkcurve worden geanalyseerd en gemeten.

Waar haalbaar wordt de juistheid (op basis van monsters met toegevoegde analyt) van alle doelanalyten in de niet-conforme controlemonsters beoordeeld aan de hand van kwaliteitscontrolekaarten overeenkomstig hoofdstuk 7.7 van de ISO/IEC-norm 17025:2017. Indien hiervoor een onevenredig groot aantal juistheidsbepalingen nodig is, mag het aantal analyten worden teruggebracht tot een aantal representatieve analyten.

HOOFDSTUK 4

UITBREIDING VAN HET GEVALIDEERDE TOEPASSINGSGEBIED VAN EEN EERDER GEVALIDEERDE METHODE

Soms is het nodig het toepassingsgebied van een voorheen volledig gevalideerde methode uit te breiden. In deze gevallen moet het toepassingsgebied op efficiënte en analytisch verantwoorde wijze worden uitgebreid. Dit kan worden bereikt door een validatie uit te voeren op een beperkt aantal monsters (bv. het halve aantal monsters) in vergelijking met een volledige validatie.

Om vast te stellen welk type en welk aantal wijzigingen in één enkele beperkte validatieregeling kunnen worden gevalideerd, moet echter altijd een beroep worden gedaan op deskundigheid en eerdere ervaringen; voor een wijziging van de detectietechniek zou bijvoorbeeld in elk geval een volledige validatie nodig zijn.

Om de geldigheid van de methode te blijven waarborgen, moeten de prestaties ervan in het algemeen doorlopend worden gemonitord en vergeleken met de aanvankelijk verkregen validatieparameters. Idealiter is deze doorlopende controle van de prestaties van de methode zodanig opgezet dat de ontbrekende gegevens voor een volledige validatie in de loop der tijd kunnen worden verzameld (bv. met enkele gegevenspunten afkomstig van kwaliteitscontrolemonsters uit elke analysereeks).

4.1. Uitbreidingen van methoden wat betreft de reeks concentraties

Als gevolg van wijzigingen van MRL’s, maximumgehalten en actiedrempels kan het nodig zijn het concentratiebereik waarvoor een methode is gevalideerd, aan te passen. In een dergelijk geval is de toepassing van een beperkte validatieregeling aanvaardbaar.

De ijkcurves voor het gewijzigde bereik moeten volgens de gevalideerde procedure worden opgesteld. Er moeten verschillende batches worden geanalyseerd waaraan analyt is toegevoegd bij verschillende concentratieniveaus (zie 2.2.1, 2.2.2). De juistheid, herhaalbaarheid en intralaboratorium-reproduceerbaarheid/intermediaire precisie moeten binnen een aanvaardbaar bereik liggen ten opzichte van de oorspronkelijk gevalideerde methode. Indien relevant moet een herberekening van het CCβ (screeningsmethoden) en de CCα (bevestigingsmethoden) worden uitgevoerd.

4.2. Uitbreidingen van methoden wat betreft aanvullende stoffen

In het algemeen is uitbreiding van de methode tot aanvullende verbindingen alleen mogelijk voor analyten die qua structuur en kenmerken vergelijkbaar zijn met die welke al in de analysemethode zijn opgenomen. In een dergelijk geval is de toepassing van een beperkte validatieregeling aanvaardbaar. Evenmin mag van de beschrijving van de methode worden afgeweken.

De ijkcurves voor de aanvullende stoffen moeten volgens de gevalideerde procedure worden opgesteld. Er moeten verschillende batches van matrixmaterialen worden geanalyseerd waaraan analyt is toegevoegd bij verschillende concentratieniveaus (zie 2.2.1, 2.2.2). De juistheid, herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid/intermediaire precisie moeten binnen een bereik liggen dat vergelijkbaar is met dat van de andere analyten van de oorspronkelijk gevalideerde methode en in overeenstemming zijn met de voorschriften van punt 1.2.2. Voor de nieuwe analyten moet een berekening van het CCβ (screeningsmethoden) en de CCα (bevestigingsmethoden) worden gemaakt.

4.3. Uitbreidingen van methoden wat betreft de matrices/soorten

De opname van nieuwe matrices of soorten in een reeds gevalideerde analysemethode wordt altijd per geval afgewogen op basis van de tot dusver opgedane kennis en ervaring met de methode en voorbereidende proeven waarbij potentiële matrixeffecten en storingen worden beoordeeld. In het algemeen is dit alleen mogelijk voor matrices met vergelijkbare eigenschappen en voor niet-kritische analyten (stabiliteit, detecteerbaarheid).

IJkkrommen (standaard of matrix) moeten volgens de gevalideerde procedure worden opgesteld. Er moeten verschillende batches van matrixmateriaal worden geanalyseerd waaraan analyt is toegevoegd bij verschillende concentratieniveaus (zie 2.2.1, 2.2.2). De juistheid, herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid/intermediaire precisie moeten binnen een bereik liggen dat aanvaardbaar is ten opzichte van de oorspronkelijk gevalideerde methode en in overeenstemming zijn met de voorschriften van punt 1.2.2. Afhankelijk van de validatiemethode kan een herberekening van het CCβ (screeningsmethoden) of de CCα (bevestigingsmethoden) nodig zijn.

Als de resultaten niet binnen een aanvaardbaar bereik liggen ten opzichte van de waarden voor de oorspronkelijke matrix, is een aanvullende volledige validatie nodig om de specifieke prestatieparameters voor de matrix/soort te bepalen.

Wanneer de MRL’s voor een specifieke stof voor bepaalde matrices verschillen, zal het hoogstwaarschijnlijk moeilijk zijn om het toepassingsgebied van de methode aan te passen aan de aanvullende matrix/soort en concentratie, aangezien in dit geval twee wijzigingen moeten worden overwogen. In dergelijke gevallen wordt een volledige validatie aanbevolen.

(1) Co-chromatografie is een procedure waarbij het monsterextract vóór de chromatografiestap(pen) in tweeën gedeeld wordt: een deel wordt als zodanig chromatografisch gescheiden; het andere deel wordt gemengd met de standaardanalyt die moet worden gemeten. Vervolgens wordt dit mengsel ook chromatografisch gescheiden. De hoeveelheid toegevoegde standaardanalyt moet ongeveer gelijk zijn aan de geschatte hoeveelheid analyt in het extract. Co-chromatografie wordt gebruikt om de identificatie van een analyt te verbeteren wanneer chromatografische methoden worden gebruikt, vooral wanneer er geen geschikte interne standaard gebruikt kan worden.

(*) De hier aangegeven VC (%) dient als richtsnoer; hij moet zo laag zijn als redelijkerwijs mogelijk.

(a) Er wordt geen extra identificatiepunt voor de selectie van het precursor-ion verkregen als dit precursor-ion hetzelfde ion is (of een adduct of isotoop) als het HRMS-ion in de full-scanmonitoring.

(#) Indien stabiliteitsgegevens voor analyten in een matrix beschikbaar zijn uit wetenschappelijke literatuur of uit een ander laboratorium, hoeven deze gegevens niet opnieuw door het betrokken laboratorium te worden bepaald. Een verwijzing naar beschikbare stabiliteitsgegevens van analyten in oplossing kan echter alleen worden aanvaard als voor identieke omstandigheden wordt gezorgd.

(*) Relevant voor MS-methoden om door middel van de validatie aan te tonen dat aan de voorschriften voor de prestatiekenmerken is voldaan. Het relatieve matrixeffect van de methode moet worden bepaald wanneer dit effect niet tijdens de validatieprocedure is beoordeeld. De absolute terugvinding van de methode moet worden bepaald als er geen interne standaard of geen matrixverrijkte ijking wordt gebruikt.

(2) ISO 5725-4:2020 Nauwkeurigheid (juistheid en precisie) van meetmethoden en –resultaten — Deel 4: Basismethoden voor het bepalen van de juistheid van een standaard meetmethode (punt 3).

(3) Wanneer voor een niet-toegelaten farmacologisch werkzame stof validatie van een concentratie van 0,5 maal de actiedrempel redelijkerwijs niet haalbaar is, kan de concentratie van 0,5 maal de actiedrempel worden vervangen door de laagste concentratie tussen 0,5 en 1,0 maal de actiedrempel die redelijkerwijs haalbaar is.

(4) Wanneer voor een specifieke farmacologisch werkzame stof validatie van een concentratie van 0,1 maal de MRL redelijkerwijs niet haalbaar is, kan de concentratie van 0,1 maal de MRL worden vervangen door de laagste concentratie tussen 0,1 en 0,5 maal de MRL die redelijkerwijs haalbaar is.

(5) Wanneer voor een niet-toegelaten farmacologisch werkzame stof validatie van een concentratie van 0,5 maal de actiedrempel redelijkerwijs niet haalbaar is, kan de concentratie van 0,5 maal de actiedrempel worden vervangen door de laagste concentratie tussen 0,5 en 1,0 maal de actiedrempel die redelijkerwijs haalbaar is.

(6) Wanneer voor een specifieke farmacologisch werkzame stof validatie van een concentratie van 0,1 maal de MRL redelijkerwijs niet haalbaar is, kan de concentratie van 0,1 maal de MRL worden vervangen door de laagste concentratie tussen 0,1 en 0,5 maal de MRL die redelijkerwijs haalbaar is.

(7) ISO 5725-2:2019 Nauwkeurigheid (juistheid en precisie) van meetmethoden en –resultaten — Deel 2: Basismethode voor de bepaling van herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van een standaard meetmethode (punt 3).

(8) ISO 11843-1:1997 — Detectievermogen — Deel 1: Termen en definities.

(9) Commissie van de Codex Alimentarius, Voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties, Wereldgezondheidsorganisatie, Guidelines on estimation of uncertainty of results (CAC/GL 59-2006).

(10) De veranderingen van de proefomstandigheden waarnaar daarin wordt verwezen, kunnen betrekking hebben op de monstermaterialen, analyten, opslagcondities en omgevings- en/of monstervoorbereidingsomstandigheden. Voor alle proefomstandigheden die in de praktijk aan fluctuaties onderhevig zouden kunnen zijn (bijvoorbeeld stabiliteit van de reagentia, samenstelling van het monster, pH, temperatuur) worden alle afwijkingen die invloed zouden kunnen hebben op het resultaat van de analyse aangegeven.

(11) Jülicher, B., Gowik, P., and Uhlig, S. (1998), Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept. Analyst, 120, 173.

(12) IUPAC (1995), Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B., and Uhlig, S. (1998), Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiodearray detection. Method description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr., 716, 221.

(14) ISO 11843-1:1997 — Detectievermogen — Deel 1: Termen en definities.

(15) Uitvoeringsverordening (EU) 2018/470 van de Commissie van 21 maart 2018 betreffende nadere regels voor de maximumwaarde voor residuen die in aanmerking moet worden genomen bij de controle van levensmiddelen die afkomstig zijn van overeenkomstig artikel 11 van Richtlijn 2001/82/EG in de Unie behandelde dieren (PB L 79 van 22.3.2018, blz. 16).

(16) De hoeveelheid toegevoegde standaardanalyt kan bijvoorbeeld ongeveer twee- tot vijfmaal zo groot zijn als de geschatte hoeveelheid analyt in het monster. Deze procedure is bedoeld om het gehalte van een analyt in een monster te bepalen met inachtneming van de terugvinding van de analysemethode.

(17) ISO/IEC 17025:2017 — Algemene eisen voor de bekwaamheid van beproevings- en kalibratielaboratoria (hoofdstuk 7.7).

(18) ISO/IEC 17043:2010 — Conformiteitsbeoordeling — Algemene eisen voor ringtesten.