VERORDENING (EG) Nr. 1459/98 VAN DE COMMISSIE van 8 juli 1998 tot vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van het vanillinegehalte in boterconcentraat, boter of room

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EEG) nr. 804/68 van de Raad van 27 juni 1968 houdende een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector melk en zuivelproducten (1), laatstelijk gewijzigd bij Verordening (EG) nr. 1587/96 (2), en met name op artikel 6, lid 6, en artikel 12, lid 3,

Overwegende dat in Verordening (EG) nr. 2571/97 van de Commissie betreffende de verkoop van boter tegen verlaagde prijs en de toekenning van steun voor room, boter en boterconcentraat voor de vervaardiging van banketbakkerswerk, consumptie-ijs en andere voedingsmiddelen (3) is bepaald dat in sommige omstandigheden verklikstoffen aan room, boter of boterconcentraat moeten worden toegevoegd om te waarborgen dat deze producten volgens de voorschriften worden gebruikt;

Overwegende dat, gezien het belang van de toevoeging van verklikstoffen voor een goed functioneren van de regeling en om te waarborgen dat de bedrijven die van die regeling gebruik maken gelijk behandeld worden, het dienstig is gemeenschappelijke methoden vast te stellen voor de bepaling van het gehalte van de in Verordening (EG) nr. 2571/97 bedoelde verklikstoffen;

Overwegende dat het moeilijk is dergelijke referentiemethoden voor alle verklikstoffen tegelijk vast te stellen; dat vaststelling van een referentiemethode voor de bepaling van het vanillinegehalte in boterconcentraat, boter of room, een stap in deze richting is;

Overwegende dat de in deze verordening vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Comité van beheer voor melk en zuivelproducten,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De in de bijlage beschreven analysemethode wordt toegepast als referentiemethode voor de bepaling van het vanillinegehalte van boterconcentraat, boter of room in het kader van Verordening (EG) nr. 2571/97.

Boterconcentraat, boter of room worden geacht te voldoen aan het bepaalde in artikel 6 van Verordening (EG) nr. 2571/97 inzake de toevoeging van verklikstoffen, als de resultaten van de analyse in overeenstemming zijn met punt 8 van de bijlage bij deze verordening.

Artikel 2

Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Zij is van toepassing met ingang van 1 september 1998.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat.

Gedaan te Brussel, 8 juli 1998.

Voor de Commissie

Franz FISCHLER

Lid van de Commissie

(1) PB L 148 van 28. 6. 1968, blz. 13.

(2) PB L 206 van 16. 8. 1996, blz. 21.

(3) PB L 350 van 20. 12. 1997, blz. 3.

BIJLAGE

Bepaling van het vanillinegehalte in boterconcentraat, boter of room met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)

1. Doel en toepassingsgebied

In deze methode wordt een werkwijze beschreven voor de kwantitatieve bepaling van vanilline in boterconcentraat, boter of room.

De methode is van toepassing op de monsters die worden ontvangen op grond van Verordening (EG) nr. 2571/97.

2. Principe

Extractie van een bekende hoeveelheid monster met een mengsel van isopropanol/ethanol/acetonitrile (1:1:2). Neerslaan van het grootste gedeelte van het vet door afkoelen tussen -15 °C en -20 °C, gevolgd door centrifugeren.

Na verdunnen met water, bepaling van het vanillinegehalte met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

3. Apparatuur

Gebruikelijke laboratoriumapparatuur en in het bijzonder:

3.1. Diepvriezer met een temperatuurbereik van -15 °C tot -20°C.

3.2. Wegwerpinjectiespuiten van 2 ml.

3.3. Membraanmicrofilters met een poriëngrootte van 0,45 ìm en bestand tegen een oplossing met 5 % extractie-oplossing (4.4).

3.4. Vloeistofchromatografiesysteem, bestaande uit een pomp (stroomsnelheid 1,0 ml/min.), een injector (20 ìl injectie, automatisch of manueel), een UV-detector (ingesteld op 306 nm, 0,01 AU full scale), recorder of integrator, en een kolomthermostaat ingesteld op 25 °C.

3.5. Analysekolom (250 mm × 4,6 mm I.D.), gepakt met LiChrospher RP 18 (Merck, 5 ìm) of equivalent.

3.6. Voorkolom (ong. 20 mm × 3 mm I.D.), droog gepakt met Perisorb RP 18 (30-40 ìm) of equivalent.

4. Reagentia

Alle gebruikte reagentia moeten p.a. zijn.

4.1. Isopropanol

4.2. Ethanol 96 % (v/v)

4.3. Acetonitrile

4.4. Extractieoplossing

Meng isopropanol (4.1), ethanol (4.2) en acetonitrile (4.3) in de verhouding 1:1:2 (V/V).

4.5. Vanilline (4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)

4.5.1. Stockoplossing vanilline (=500 ìg/ml)

Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig ongeveer 50 mg (CM mg) vanilline (4.5) af in een maatkolf van 100 ml; voeg 25 ml extractieoplossing (4.4) toe en vul aan met water.

4.5.2. Standaardoplossing vanilline (=10 ìg/ml)

Pipetteer 5,00 ml van de stockoplossing vanilline (4.5.1) in een maatkolf van 250 ml en vul aan met water.

4.6. Methanol, HPLC-kwaliteit

4.7. IJsazijn

4.8. Water, HPLC-kwaliteit

4.9. HPLC-loopvloeistof

Meng 300 ml methanol (4.6), ongeveer 500 ml water (4.8) en 20,0 ml azijnzuur (4.7) in een maatkolf van 1 000 ml en vul aan met water (4.8). Filtreer door een filter van 0,45 ìm.

5. Werkwijze

5.1. Bereiding van het testmonster

5.1.1. Boter

Verwarm het monster totdat dit begint te smelten. Vermijd plaatselijke oververhitting boven 40 °C. Homogeniseer het monster door het te schudden, wanneer het zacht genoeg is. Roer de boter 15 s en neem daarna een testmonster. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 5 g (SM g) boter af in een maatkolf van 100 ml.

5.1.2. Boterconcentraat

Plaats direct voor de monsterneming de verpakking met het boterconcentraat in een oven bij 40-50 °C totdat het product volledig gesmolten is. Meng het monster door zwenken of roeren, maar voorkom dat luchtbellen ontstaan doordat te hard wordt geroerd. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 4 g (SM g) boterconcentraat af in een maatkolf van 100 ml.

5.1.3. Room

Verwarm het monster in een waterbad of broedstoof bij een temperatuur van 35-40 °C. Verdeel het vet homogeen door zwenken en, indien nodig, door roeren. Koel het monster snel af tot 20 ± 2 °C. Het monster moet er homogeen uitzien, anders moet de werkwijze worden herhaald. Weeg tot op 1 mg nauwkeurig ongeveer 10 g (SM g) room af in een maatkolf van 100 ml.

5.2. Bereiding van de testoplossing

Voeg ongeveer 75 ml extractieoplossing (4.4) toe aan testmonster (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3). Roer of schud ongeveer 15 min. krachtig en vul aan met extractieoplossing (4.4). Breng ongeveer 10 ml van dit extract over in een reageerbuis, die afgesloten wordt met een stop. Plaats de reageerbuis in de diepvriezer (3.1) en wacht ongeveer 30 min.. Centrifugeer het koude extract 5 min. bij ongeveer 2 000 opm en giet onmiddellijk af. Laat de afgegoten oplossing op kamertemperatuur komen. Pipetteer 5,00 ml van de afgegoten oplossing in een maatkolf van 100 ml en vul aan met water. Filtreer een fractie door een membraanmicrofilter (3.3). Het filtraat is gereed voor de bepaling met behulp van HPLC.

5.3. Kalibrering

Pipetteer 5,00 ml van de standaardoplossing vanilline (4.5.2) in een maatkolf van 100 ml. Voeg 5,0 ml extractieoplossing (4.4) toe en vul tot de merkstreep aan met water. Deze oplossing bevat 0,5 ìg/ml vanilline.

5.4. Bepaling met behulp van HPLC

Laat het chromatografische systeem ongeveer 30 min stabiliseren. Injecteer de standaardoplossing (5.3). Herhaal dit totdat het verschil in piekoppervlakte of piekhoogte tussen twee opeenvolgende injecties kleiner is dan 2 %. Onder de beschreven omstandigheden bedraagt de retentietijd van vanilline ongeveer 9 min. Analyseer de standaardoplossing (5.3) in duplo door injectie van 20 ìl. Injecteer 20 ìl van de testoplossingen (5.2). Bepaal de oppervlakte of de hoogte van de vanillinepiek. Herhaal de duplobepaling van de standaardoplossing (5.3) na tien injecties van de testoplossingen (5.2).

6. Berekening van de resultaten

Bereken de gemiddelde oppervlakte (of de gemiddelde hoogte) (AC) van de vanillinepieken die horen bij de duplo-injecties van de standaardoplossingen (5.3) vóór en na iedere reeks testoplossingen (vier oppervlakken of piekhoogtes in totaal).

Bereken de responsfactor (R):

R = >NUM>AC/

>DEN>CM

waarin CM gelijkstaat met de massa van de vanilline in mg (4.5.1).

Het gehalte (mg/kg) van vanilline (C) in het testmonster wordt verkregen door:

C = >NUM>AS × 20 × 0,96

>DEN>SM × R

waarin

AS = de piekoppervlakte van de vanillinepiek van het testmonster;

SM = de massa van het testmonster in g (5.1.1, 5.1.2 of 5.1.3);

20 = de factor die gebaseerd is op de verdunningen van de standaard en het testmonster;

0,96 = de correctiefactor voor het vetgehalte in de eerste verdunning van het testmonster.

Opmerking:

In plaats van de piekoppervlakken kunnen piekhoogtes worden gebruikt (zie 8.3).

7. Nauwkeurigheid van de methode

7.1. Herhaalbaarheid (r)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die binnen een zo kort mogelijke tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur zijn uitgevoerd op identiek monstermateriaal, mag niet groter zijn dan 16 mg/kg.

7.2. Reproduceerbaarheid (R)

Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur zijn uitgevoerd op identiek monstermateriaal, mag niet groter zijn dan 27 mg/kg.

8. Tolerantiegrenzen

8.1. Voor de controle op de homogene verdeling van de verklikstof in het product moeten drie monsters van het gemerkte product worden genomen.

8.2. Uit vanille of synthetische vanille vervaardigde verklikstof

8.2.1. Het bijmengingsgehalte van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde bedraagt 250 gram per ton.

8.2.2. Uitgaande van het kritische verschil - Critical Difference - bij een betrouwbaarheidsinterval van 95 % (CrD95) mag het gemiddelde van de enkelvoudige analyses die op elk van de drie monsters uitgevoerd worden om de homogene verdeling van de verklikstof in het product te controleren, niet lager zijn dan 236,0 mg/kg.

8.2.3. Naast het in 8.2.2 beschreven criterium wordt ook de laagste bij analyse van het product verkregen uitkomst gebruikt om de homogene verdeling van de verklikstof in het product te controleren. Dit gebeurt door vergelijking met de volgende grenswaarden:

- 221,5 mg/kg (95 % van het minimumbijmengingsgehalte, op basis van de CrD95 voor één monster);

- 159,0 mg/kg (70 % van het minimumbijmengingsgehalte, op basis van CrD95 voor één monster).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat de laagste uitkomst geeft, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 221,5 mg/kg en 159,0 mg/kg.

8.3. Uitsluitend uit vanillepeulen of integrale extracten daarvan vervaardigde verklikstof:

8.3.1. Het bijmengingsgehalte van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde bedraagt 100 gram per ton.

8.3.2. Uitgaande van het kritische verschil - Critical Difference - bij een betrouwbaarheidsinterval van 95 % (CrD95) mag het gemiddelde van de enkelvoudige analyses die op elk van de drie monsters uitgevoerd worden om de homogene verdeling van de verklikstof in het product te controleren, niet lager zijn dan 86,0 mg/kg.

8.3.3. Naast het in 8.3.2 beschreven criterium wordt de laagste bij analyse van het product verkregen uitkomst gebruikt om de homogene verdeling van de verklikstof in het product te controleren. Dit gebeurt door vergelijking met de volgende grenswaarden:

- 79,0 mg/kg (95 % van het minimumbijmengingsgehalte, op basis van de CrD95 één monster);

- 54,0 mg/kg (70 % van het minimumbijmengingsgehalte, op basis van de CrD95 één monster).

De concentratie van de verklikstof in het monster dat de laagste uitkomst geeft, wordt gebruikt in combinatie met interpolatie tussen 79,0 mg/kg en 54,0 mg/kg.

9. Opmerkingen

9.1. De herhaalbaarheid r is de waarde waaronder met een gespecificeerde waarschijnlijkheid het absolute verschil ligt tussen de resultaten die met dezelfde methode onder dezelfde omstandigheden (dezelfde apparatuur, hetzelfde laboratorium, en kort na elkaar) zijn verkregen bij twee enkelvoudige bepalingen uitgevoerd met identiek monstermateriaal; tenzij anders aangegeven, bedraagt die waarschijnlijkheid 95 %.

9.2. De reproduceerbaarheid R is de waarde waaronder met een gespecificeerde waarschijnlijkheid het absolute verschil ligt tussen de resultaten die met dezelfde methode onder verschillende omstandigheden (verschillende uitvoerders, verschillende laboratoria en/of op verschillende tijdstippen) zijn verkregen bij twee enkelvoudige bepalingen uitgevoerd met identiek monstermateriaal; tenzij anders aangegeven, bedraagt die waarschijnlijkheid 95 %.

9.3. De recovery van toegevoegd vanilline bij een gehalte van 250 mg/kg boterolie varieert van 97,0 tot 103,8 %. Het gemiddelde gehalte dat gevonden werd, bedroeg 99,9 % met een standaardafwijking van 2,7 %.

9.4. De standaardoplossing bevat 5 % extractieoplossing ter compensatie van de piekverbreding als gevolg van de aanwezigheid van 5 % van de extractieoplossing van de testmonsters. Hierdoor is een kwantificering via de piekhoogte mogelijk.

9.5. De analyse is gebaseerd op een lineaire ijklijn door de oorsprong. Door gebruikmaking van geschikte verdunningen van de standaardoplossing (4.5.2), moet de eerste keer dat de analyse wordt uitgevoerd en verder met regelmatige tussenpozen en na veranderingen in of herstel van de HPLC-apparatuur, de lineariteit worden gecontroleerd.