Beschikking van de Commissie

van 22 februari 2001

tot vaststelling van de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten en tot intrekking van Beschikking 92/532/EEG

(kennisgeving geschied onder nummer C(2001) 426)

(Voor de EER relevante tekst)

(2001/183/EG)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 91/67/EEG van de Raad van 28 januari 1991 inzake veterinairrechtelijke voorschriften voor het in de handel brengen van aquicultuurdieren en aquicultuurproducten(1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 98/45/EG(2), en met name op artikel 15,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) De schema's voor de bemonstering en de methoden voor het stellen van de diagnose met het oog op de opsporing en de bevestiging van bepaalde visziekten zijn vastgesteld bij Beschikking 92/532/EEG van de Commissie(3), gewijzigd bij Beschikking 96/240/EG(4).

(2) Sedert de vaststelling van Beschikking 92/532/EEG hebben zich in de praktijk en op wetenschappelijk gebied bepaalde ontwikkelingen voorgedaan en is Richtlijn 91/67/EEG gewijzigd. Ten gevolge daarvan moeten de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden worden aangepast.

(3) Deze aanpassing heeft betrekking op het onderzoeken en opsporen van virussen die virale hemorragische septikemie (VHS) en infectieuze hematopoïetische necrose (IHN) veroorzaken, en op wijzigingen die in overeenstemming zijn met de laatste wijzigingen van Richtlijn 91/67/EEG.

(4) Het communautair referentielaboratorium voor visziekten dat bij Richtlijn 93/53/EEG van de Raad(5) is ingesteld, is geraadpleegd.

(5) Duidelijkheidshalve moet Beschikking 92/532/EEG tot vaststelling van de bemonsteringsschema's en de diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van bepaalde visziekten worden ingetrokken.

(6) De in deze beschikking vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Permanent Veterinair Comité,

HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:

Artikel 1

De bemonsteringsschema's en diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van virale hemorragische septikemie (VHS) en infectieuze hematopoïetische necrose (IHN) worden vastgesteld in de bijlage.

Artikel 2

Beschikking 92/532/EEG wordt bij deze beschikking ingetrokken.

Artikel 3

Deze beschikking is gericht tot de lidstaten.

Gedaan te Brussel, 22 februari 2001.

Voor de Commissie

David Byrne

Lid van de Commissie

(1) PB L 46 van 19.2.1991, blz. 1.

(2) PB L 189 van 3.7.1998, blz. 12.

(3) PB L 337 van 21.11.1992, blz. 18.

(4) PB L 79 van 29.3.1996, blz. 19.

(5) PB L 175 van 19.7.1993, blz. 23.

BIJLAGE

BEMONSTERINGSSCHEMA'S EN DIAGNOSTISCHE METHODEN VOOR DE OPSPORING EN BEVESTIGING VAN VIRALE HEMORRAGISCHE SEPTIKEMIE (VHS) EN INFECTIEUZE HEMATOPOÏETISCHE NECROSE (IHN)

INLEIDING

In deze bijlage:

a) worden richtsnoeren en minimumvoorwaarden inzake bemonsteringsschema's en diagnostische methoden voor de opsporing en bevestiging van virale hemorragische septikemie (VHS) en infectieuze hematopoïetische necrose (IHN) vastgesteld;

b) worden de bepalingen opgenomen van de bijlagen B en C bij Richtlijn 91/67/EEG betreffende de erkenning van gebieden en van bedrijven in niet-erkende gebieden en het behoud van die erkenning;

c) worden bepalingen vastgesteld inzake de deugdelijke diagnose van VHS en IHN en inzake de officiële erkenning van gebieden en van bedrijven in niet-erkende gebieden overeenkomstig de artikelen 5 en 6 van Richtlijn 91/67/EEG;

d) worden voorschriften vastgesteld voor zowel de instanties die bevoegd zijn voor de bestrijding van VHS en IHN als het laboratoriumpersoneel dat de tests met betrekking tot deze ziekten uitvoert. De nadruk ligt dan ook op de bemonsteringsprocedures, de beginselen en toepassingen van laboratoriumtests en de evaluatie van de resultaten daarvan, alsmede op de gedetailleerde beschrijving van de laboratoriumtechnieken. De laboratoria mogen echter wijzigingen aanbrengen in de in deze bijlage beschreven tests of andere tests gebruiken, op voorwaarde dat kan worden aangetoond dat die tests even gevoelig en specifiek zijn.

Deel I omvat bemonsteringsschema's en diagnostische methoden voor het toezicht op VHS en IHN teneinde de status van erkend gebied of van erkend bedrijf in een niet-erkend gebied te verkrijgen en te behouden.

Deel II geeft een overzicht van de diagnostische procedures voor de bevestiging van IHN en VHS bij vermoedelijke uitbraken.

Deel III bevat de criteria en richtsnoeren voor het opzetten van een officieel programma voor gezondheidscontrole, waarbij moet worden aangetoond dat een gebied of bedrijf sedert een bepaalde tijd vrij is van VHS en/of IHN.

Deel IV bevat aanbevelingen met betrekking tot de procedure voor VHS- en IHN-virustitratie om de gevoeligheid van de celcultures voor infectie te verifiëren.

Deel V bestaat uit een lijst van acroniemen en afkortingen.

DEEL I

Bemonsteringsschema's en diagnostische methoden voor het toezicht op VHS en IHN in gebieden en op bedrijven in niet-erkende gebieden, met het oog op het verkrijgen of behouden van de status van erkend gebied of van erkend bedrijf in een niet-erkend gebied

I. Controles en bemonstering

1. Algemene bepalingen betreffende klinische gezondheidscontroles en het verzamelen en selecteren van monsters in het kader van het toezicht op VHS en/of IHN in gebieden en op bedrijven in niet-erkende gebieden, met het oog op het verkrijgen of behouden van de status van erkend gebied of van erkend bedrijf in een niet-erkend gebied

De tabellen 1A, 1B en 1C geven een overzicht van de klinische gezondheidscontroles en de bemonsteringen van weefselmateriaal van vis en/of van ovariële vloeistof die moeten worden uitgevoerd in gebieden of op bedrijven in niet-erkende gebieden, met het oog op het verkrijgen of behouden van de erkenning ten aanzien van VHS en/of IHN overeenkomstig de bijlagen B en C bij Richtlijn 91/67/EEG. Verdere details worden vastgesteld in de punten I.I.2-I.I.4. De tabellen 1A en 1B zijn niet van toepassing op bedrijven - zowel nieuwe bedrijven als bedrijven die hun activiteiten hervatten - die werken met vis, eieren of gameten uit een erkend gebied of uit een erkend bedrijf in een niet-erkend gebied, voorzover die bedrijven voldoen aan de voorwaarden die zijn vastgesteld in Richtlijn 91/67/EEG, bijlage C, onder I.A.6. a) of I.A.6.b) of II.A.3.a) of II.A.3.b).

De klinische onderzoeken moeten worden uitgevoerd in de periode van oktober tot en met juni of wanneer de watertemperatuur minder dan 14 °C bedraagt. Als op bedrijven tweemaal per jaar een klinisch onderzoek moet worden verricht, moet tussen de onderzoeken een tijdsspanne van ten minste vier maanden liggen. Alle productie-eenheden (vijvers, tanks, netkooien enz.) moeten worden onderzocht op de aanwezigheid van dode en zwakke vissen en van vissen met abnormaal gedrag. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de plaats waar het water wegloopt aangezien zwakke vissen meestal daar te vinden zijn wegens de stroming van het water.

De te bemonsteren vis wordt als volgt geselecteerd:

- Indien regenboogforel aanwezig is, moet het monster volledig uit die vissoort bestaan. Indien geen regenboogforel aanwezig is, moet het monster bestaan uit vissen van alle wel aanwezige soorten die gevoelig zijn voor VHSV en/of INHV (volgens de lijst in bijlage A bij Richtlijn 91/67/EEG). De soorten moeten proportioneel in het monster vertegenwoordigd zijn.

- Wanneer voor de visproductie meer dan één waterbron wordt gebruikt, moet het monster zo worden genomen dat alle waterbronnen vertegenwoordigd zijn.

- Wanneer de aanwezigheid wordt geconstateerd van zwakke vissen, vissen met abnormaal gedrag of pas gestorven vissen (nog niet in ontbinding), moeten bij voorkeur deze vissen in het monster worden opgenomen. Indien dergelijke vissen niet aanwezig zijn, moet het monster bestaan uit gezonde vissen met een normaal voorkomen en moet ervoor worden gezorgd dat alle onderdelen van het bedrijf en alle jaarklassen proportioneel in het monster vertegenwoordigd zijn.

2. Specifieke bepalingen, waaronder het verzamelen van monsters, voor het toezicht op VHS en/of IHN in gebieden of op bedrijven in niet-erkende gebieden met het oog op het verkrijgen of behouden van de erkenning

1. Een gebied of een bedrijf in een niet-erkend gebied dat onder toezicht van de officiële instanties wordt gesteld, kan ten aanzien van VHS en/of IHN de status van erkend gebied of van erkend bedrijf in een niet-erkend gebied verkrijgen volgens een van de volgende procedures:

a) Model A - toezichtsprogramma met een looptijd van twee jaar

Als gedurende ten minste twee jaar geen klinische of andere symptomen van VHS en/of IHN zijn waargenomen, moet in alle bedrijven in het te erkennen gebied of in elk te erkennen bedrijf in een niet-erkend gebied gedurende twee jaar tweemaal per jaar een gezondheidscontrole worden uitgevoerd. Gedurende deze controleperiode van twee jaar die voorafgaat aan het verkrijgen van de erkenning, mogen evenmin klinische of andere symptomen van VHS en/of IHN worden waargenomen en moeten monsters worden genomen overeenkomstig tabel 1A. De monsters moeten worden geselecteerd, voorbewerkt en onderzocht als omschreven in deel I, secties I-IV, en de laboratoriumtests op VHS en/of IHN moeten een negatieve reactie opleveren; of

b) Model B - toezichtsprogramma met een looptijd van twee jaar met een verminderd aantal monsters

Nadat een officieel programma voor gezondheidscontrole is uitgevoerd aan de hand waarvan wordt aangetoond dat een bedrijf sedert ten minste vier jaar vrij is van VHS en INH, moet in alle bedrijven in het te erkennen gebied of in elk te erkennen bedrijf in een niet-erkend gebied gedurende twee jaar tweemaal per jaar een gezondheidscontrole worden uitgevoerd. Gedurende deze controleperiode van twee jaar die voorafgaat aan het verkrijgen van de erkenning, mogen evenmin klinische of andere symptomen van VHS en/of IHN worden waargenomen en moeten monsters worden genomen overeenkomstig tabel 1B. De monsters moeten worden geselecteerd, voorbewerkt en onderzocht als omschreven in deel I, secties I-IV, en de laboratoriumtests op VHS en/of IHN moeten een negatieve reactie hebben opgeleverd. Een programma voor gezondheidscontrole kan door de officiële instanties worden aanvaard als element waaruit blijkt dat een bedrijf vrij is van VHS en INH, als is voldaan aan de in deel III opgenomen criteria en richtsnoeren.

2. Specifieke bepalingen voor de erkenning van bedrijven - zowel nieuwe bedrijven als bedrijven die hun activiteiten hervatten - die werken met vis, eieren of gameten uit een erkend gebied of uit een erkend bedrijf in een niet-erkend gebied.

Bedrijven - zowel nieuwe bedrijven als bedrijven die hun activiteiten hervatten - die werken met vis, eieren of gameten uit een erkend gebied of uit een erkend bedrijf in een niet-erkend gebied, kunnen worden erkend volgens de voorwaarden die zijn vastgesteld in Richtlijn 91/67/EEG, bijlage C, onder I.A.6.a)/b) of II.A.3.a)/b). De bemonsteringsvoorschriften die zijn vastgesteld in de modellen A en B hierboven (de punten I.I.2.1.a) en I.I.2.1.b)) zijn in dat geval niet van toepassing op deze bedrijven.

3. Toezichtsprogramma voor het behoud van de erkenning ten aanzien van VHS en/of IHN

Teneinde de aan een gebied of aan een bedrijf in een niet-erkend gebied verleende erkenning ten aanzien van VHS en/of IHN te kunnen behouden, moeten controles worden verricht en monsters worden genomen overeenkomstig tabel 1C. De monsters moeten worden geselecteerd, voorbewerkt en onderzocht als omschreven in deel I, secties I-IV, en de laboratoriumtests moeten een negatieve reactie ten aanzien van de agentia van VHS en/of IHN opleveren.

3. Voorbewerking en verzending van vismonsters

Vóór het vervoer naar het laboratorium moeten bij de vissen met steriele dissectie-instrumenten stukjes worden weggenomen uit de te onderzoeken organen; deze stukjes moeten in steriele plastic buisjes worden gedaan die zijn gevuld met een transportmedium, d.i. een celkweekmedium met 10 % kalfsserum en antibiotica. Een combinatie van 200 I.E. penicilline, 200 μg streptomycine en 200 μg kanamycine per ml wordt aanbevolen, maar ook andere antibiotica die doeltreffend zijn gebleken, mogen worden gebruikt. Het te onderzoeken weefselmateriaal is afkomstig van de milt, de voornier en bovendien van het hart of de hersenen. In sommige gevallen moet ook ovariële vloeistof worden onderzocht (de tabellen 1A-C).

Ovariële vloeistof of stukjes orgaan van maximaal tien vissen (de tabellen 1A-C) mogen tot één verzamelmonster worden samengevoegd in een steriel buisje waarin zich ten minste 4 ml transportmedium bevindt. Ieder monster moet ten minste 0,5 gram weefsel bevatten.

De buisjes moeten in geïsoleerde recipiënten (bv. dikwandige polystyreendozen) worden geplaatst met voldoende ijs of "koelpatronen" om de monsters tijdens het vervoer naar het laboratorium koel te houden. Bevriezing van de monsters moet worden vermeden. De temperatuur van het monster tijdens het vervoer mag nooit meer dan 10 °C bedragen en bij aankomst moet de transportdoos nog ijs bevatten of moeten één of meer "koelpatronen" nog geheel of gedeeltelijk bevroren zijn.

Met het virologisch onderzoek moet zo snel mogelijk worden begonnen en in elk geval uiterlijk 48 uur na de bemonstering. In uitzonderlijke gevallen(1) mag uiterlijk 72 uur na de bemonstering met het virologisch onderzoek worden begonnen, op voorwaarde dat het voor onderzoek verzamelde materiaal met een transportmedium is beschermd en dat tijdens het vervoer aan de in punt I.I.3, derde alinea, genoemde temperatuurvoorschriften kan worden voldaan.

De vis mag ook in zijn geheel naar het laboratorium worden verzonden indien tijdens het vervoer aan de temperatuurvoorschriften kan worden voldaan. Hele vis mag in absorberend papier worden gewikkeld en zo in een plastic zak verpakt, waarbij koeling als hierboven omschreven vereist is. De vis mag ook levend worden verzonden.

Verpakking en etikettering moeten in overeenstemming zijn met de huidige nationale en internationale voorschriften op het gebied van vervoer.

4. Verzamelen van extra diagnostisch materiaal

Naar gelang van de met het betrokken diagnostisch laboratorium gemaakte afspraken kan van de vissen ook ander weefselmateriaal worden verzameld en voor aanvullende tests worden voorbewerkt.

II. Voorbewerking van de monsters voor virologisch onderzoek

1. Invriezen in uitzonderingsgevallen

Indien zich praktische problemen voordoen (bv. slecht weer, dagen waarop niet wordt gewerkt, problemen in het laboratorium enz.) waardoor het onmogelijk wordt de cellen te inoculeren binnen 48 uur na de bemonstering, mag het weefselmonster in het celkweekmedium worden ingevroren bij ten hoogste - 20 °C, en mag het virologisch onderzoek alsnog in de daaropvolgende 14 dagen worden verricht. Het weefsel mag echter vóór het onderzoek slechts één keer worden ingevroren en ontdooid. Er moet een register worden bijgehouden met gegevens over de reden van elke invriezing van weefselmonsters (storm, dode cellijnen enz.).

2. Homogeniseren van de organen

In het laboratorium wordt de inhoud van de buisjes volledig gehomogeniseerd (met een stomacher, een mixer of een vijzel en stamper met steriel zand) en het homogenaat wordt vervolgens gesuspendeerd in het oorspronkelijke transportmedium.

Als het monster bestaat uit hele vis die minder dan 4 cm lang is, moet de vis, nadat het stuk achter de anus is verwijderd, met een steriele schaar of scalpel in kleine stukken worden geknipt. Als het monster bestaat uit hele vis met een lengte tussen 4 en 6 cm, moeten de ingewanden inclusief de nieren worden verzameld. Als het monster bestaat uit hele vis die langer is dan 6 cm, moeten weefselmonsters worden genomen als omschreven in punt I.I.3. De weefselmonsters moeten met een steriele schaar of scalpel in kleine stukken worden geknipt die vervolgens worden gehomogeniseerd zoals hierboven beschreven en in het transportmedium worden gesuspendeerd.

De verhouding tussen het weefselmateriaal en het transportmedium moet in het laboratorium zo worden bijgesteld dat het uiteindelijk 1:10 bedraagt.

3. Centrifugeren van het homogenaat

Het homogenaat wordt gecentrifugeerd in een op 2 tot 5 °C gekoelde centrifuge bij 2000 tot 4000 x g gedurende 15 minuten; het supernatans wordt voor onderzoek verzameld en met antibiotica - bijvoorbeeld 1 mg gentamicine/ml - behandeld, hetzij gedurende 4 uur bij 15 °C, hetzij een hele nacht bij 4 °C.

Als het monster in het transportmedium (d.i. in contact met antibiotica) is vervoerd, hoeft het supernatans niet meer met antibiotica te worden behandeld.

Door de behandeling met antibiotica wordt bacteriële verontreiniging van de monsters tegengegaan en wordt filtratie door membraanfilters overbodig.

Indien het verzamelde supernatans binnen 48 uur na de verzameling wordt opgeslagen bij - 80 °C, mag het nog slechts één keer voor virologisch onderzoek worden gebruikt.

Indien zich praktische problemen voordoen (bv. defecte incubator, problemen met celcultures enz.) waardoor het onmogelijk wordt de cellen te inoculeren binnen 48 uur na de bemonstering, mag het supernatans bij - 80 °C worden ingevroren en mag het virologisch onderzoek alsnog in de daaropvolgende 14 dagen worden verricht.

Voordat de cellen worden geïnoculeerd, wordt het supernatans gemengd met gelijke delen van een adequate verdunning van een mengsel van antisera tegen inheemse serotypes van het IPN-virus; dit mengsel wordt dan geïncubeerd gedurende ten minste één uur bij 15 °C of gedurende ten hoogste 18 uur bij 4 °C. De titer van het antiserum, bepaald met behulp van een 50 %-plaque neutralisatietest, moet ten minste 1:2000 bedragen.

Alle inocula worden met een antiserum tegen het IPN-virus (in sommige delen van Europa wordt dit virus gevonden bij 50 % van de vismonsters) behandeld om te vermijden dat het IPN-virus CPE doet ontstaan in de geënte celcultures. Door deze behandeling wordt de duur van het virologisch onderzoek ingekort en vermindert het aantal gevallen waarin het ontstaan van CPE als indicator voor de aanwezigheid van VHS- of IHN-virus zou moeten worden aangemerkt.

Als de monsters afkomstig zijn van productie-eenheden die als vrij van IPN worden beschouwd, is het niet verplicht de inocula met antiserum tegen het IPN-virus te behandelen.

III. Virologisch onderzoek

1. Celcultures en groeimedia

BF-2- of RTG-2-cellen en EPC- of FHM-cellen worden bij 20 tot 30 °C gekweekt in een adequaat medium, bijvoorbeeld Eagle's MEM (of varianten daarvan) waaraan 10 % foetaal runderserum en de normale concentraties antibiotica zijn toegevoegd.

Voor cultures in gesloten recipiënten wordt het medium bij voorkeur gebufferd met bicarbonaat. Bij celcultures in open recipiënten mag het medium worden gebufferd met Tris-HCl (23 mM) en natriumbicarbonaat (6 mM). De pH moet 7,6 +- 0,2 bedragen.

Alleen jonge (vier tot 48 uur oude) celcultures in actieve groei (niet-confluent) mogen met weefselmateriaal worden geënt.

2. Enten van celcultures

De met antibiotica behandelde orgaansuspensie wordt op de celcultures geënt in twee verdunningen, namelijk de primaire verdunning en een verdunning 1:10 daarvan, zodat de uiteindelijke verdunning van het weefselmateriaal in het celkweekmedium 1:100, respectievelijk 1:1000 bedraagt (teneinde homologe interferentie te voorkomen). Ten minste twee cellijnen moeten worden geïnoculeerd (zie punt I.III.1). De verhouding tussen de hoeveelheid inoculum en het volume van het celkweekmedium moet ongeveer 1:10 bedragen.

Voor iedere verdunning en iedere cellijn moet een celoppervlak van ten minste 2 cm2 worden gebruikt, wat overeenstemt met één putje van een celkweekplaat met 24 putjes. Het gebruik van celkweekplaten wordt aanbevolen, maar andere recipiënten met ongeveer dezelfde of grotere oppervlakken voor celgroei mogen ook worden aangewend.

3. Bebroeden van celcultures

De geënte celcultures worden gedurende zeven tot tien dagen bij 15 °C bebroed. Wanneer de kleur van het celkweekmedium van rood naar geel omslaat, wat wijst op de verzuring van het medium, moet de pH worden bijgesteld met een steriele bicarbonaatoplossing of een stof met dezelfde werking, om ervoor te zorgen dat de cellen gevoelig blijven voor virusinfectie.

Om de gevoeligheid van de celcultures voor infectie te verifiëren wordt ten minste om de zes maanden of telkens als wordt vermoed dat de gevoeligheid van de cellen is verminderd, een titratie uitgevoerd met VHSV en IHNV uit de ingevroren voorraad. In deel IV is een hiervoor aanbevolen procedure opgenomen.

4. Microscopische waarnemingen

Regelmatig (ten minste driemaal per week) moeten de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE worden gecontroleerd onder een microscoop met vergroting 40 - 150 maal. Wanneer een duidelijk CPE wordt geconstateerd, moet onmiddellijk worden begonnen met de identificatie van het virus overeenkomstig sectie I.IV.

5. Voortkweek

Als na de eerste incubatie gedurende zeven tot tien dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op verse celcultures met ongeveer hetzelfde celoppervlak als de primaire cultuur.

Zeven tot tien dagen na enting worden gelijke hoeveelheden van het medium (supernatans) van alle cultures/putjes van de primaire cultuur naar cellijn samengevoegd. Die mengsels worden vervolgens, overeenkomstig het bepaalde in punt I.III.2, geënt op homologe celcultures, onverdund en in een verdunning 1:10 (wat resulteert in uiteindelijke verdunningen van het supernatans van 1:10, respectievelijk 1:100). Ook worden gelijke hoeveelheden van 10 % van het medium van de primaire cultuur rechtstreeks geënt in een putje met een verse celcultuur (voortkweek van het ene putje in het andere). Vóór de inoculatie mag een pre-incubatie van alle verdunningen met het antiserum tegen IPN-virus in een adequate verdunning worden toegepast overeenkomstig punt I.II.3.

De geënte cultures worden daarna gedurende zeven tot tien dagen bebroed bij 15 °C en gecontroleerd overeenkomstig punt I.III.4.

Indien een toxisch CPE wordt waargenomen in de eerste drie dagen van de bebroeding, mag in dat stadium worden voortgekweekt, maar de cellen moeten dan gedurende zeven dagen worden bebroed en nogmaals worden voortgekweekt en gedurende zeven dagen bebroed. Indien na drie dagen een toxisch CPE wordt waargenomen, mogen de cellen nog een keer worden gepasseerd en bebroed zodat in totaal ook 14 dagen zijn verstreken sedert de primaire bebroeding. In de laatste zeven dagen van de bebroeding zou geen toxiciteit mogen worden waargenomen.

Als er ondanks behandeling met antibiotica sprake is van een bacteriële verontreiniging, moet het supernatans vóór de voortkweek gedurende 15 tot 30 minuten bij een temperatuur van 2 tot 5 °C worden gecentrifugeerd bij 2000 tot 4000 x g, en/of worden gefiltreerd met een filter van 0,45 μm (membraanfilter met een geringe eiwitbinding). Verder gelden dezelfde voortkweekprocedures als voor toxisch CPE.

IV. Virusidentificatie

1. Virusidentificatietests

Wanneer in een cultuur CPE wordt geconstateerd, wordt het medium (supernatans) verzameld en onderzocht met behulp van één of meer van de volgende technieken: neutralisatie, IF, Elisa. Indien met de tests het virus niet binnen een week met zekerheid kan worden geïdentificeerd, moet het supernatans naar een nationaal referentielaboratorium of naar het communautair referentielaboratorium voor visziekten worden verzonden voor onmiddellijke identificatie.

2. Neutralisatie

De cellen worden uit het verzamelde supernatans verwijderd door centrifugeren (2000 tot 4000 x g) of door membraanfiltrering (0,45 μm) met een membraanfilter met een geringe eiwitbinding, en vervolgens wordt het supernatans verdund in celkweekmedium tot een verhouding 1:100 en 1:10000.

Aan gelijke hoeveelheden van de beide supernatansverdunningen wordt telkens eenzelfde hoeveelheid van elk van de onderstaande reagentia toegevoegd en deze mengsels worden vervolgens 60 minuten bij 15 °C bebroed:

- Serum met groepspecifieke antistoffen tegen VHSV in een verdunning van 1:50 (vol:vol)(2)

- Serum met groepspecifieke antistoffen tegen IHNV in een verdunning van 1:50 (vol:vol)(3)

- Mengsel van antisera tegen inheemse serotypes van IPNV in een verdunning van 1:50 (vol:vol)(4)

- Alleen medium (positieve controle).

Ten minste twee celcultures worden geënt met telkens 50 μl van iedere virus-serumcombinatie en vervolgens bebroed bij 15 °C. De ontwikkeling van CPE wordt gecontroleerd overeenkomstig punt I.III.4.

Sommige VHS-virusstammen geven geen reactie in neutralisatietests. Dergelijke isolaten moeten aan de hand van IF of Elisa worden geïdentificeerd.

Andere neutralisatietests die doelmatig zijn gebleken, mogen eveneens worden gebruikt.

3. IF

Voor ieder te identificeren virusisolaat worden cellen aangebracht op ten minste acht dekglaasjes (of soortgelijke dragers) in een zodanige verhouding dat er na 24 uur groei een confluentie optreedt van 60 tot 90 %. EPC-cellen worden aanbevolen omdat zij zich stevig aan glas hechten, maar ook andere cellijnen zoals BF-2, RTG-2 of FHM mogen worden gebruikt.

Wanneer de cellen zich aan het glas hebben gehecht (ongeveer één uur na het aanbrengen), of na incubatie van de cultures gedurende ten hoogste 24 uur, worden zij geïnoculeerd met het te identificeren virus. Vier cultures worden geënt in een v/v-verhouding van 1:10 en vier cultures in een verhouding 1:1000. Zij worden vervolgens gedurende 20 tot 30 uur bebroed bij 15 °C.

Na de incubatie worden de cultures tweemaal gewassen in Eagle's MEM zonder serum, gefixeerd met 80 % ijskoude aceton en vervolgens gemerkt met behulp van een dubbelelaag-IIFT. De eerste laag reagens bestaat uit poly- of monoclonale antilichamen van referentiekwaliteit. De tweede laag reagens is een fluorochroomgeconjugeerd antiserum gericht tegen het immunoglobuline van de eerste laag. Voor ieder te testen antiserum worden ten minste één cultuur die is geïnoculeerd in een sterkere concentratie, en één cultuur die is geïnoculeerd in een zwakkere concentratie, gemerkt. In de test moeten ook de nodige negatieve en positieve controles worden opgenomen. Fluorochromen als FITC of TRITC worden daarvoor aanbevolen.

Aan de gemerkte cultures wordt glycerol-fysiologisch zout toegevoegd. De cultures worden onderzocht onder invallend UV-licht. Daarbij wordt gebruikgemaakt van een oculair met vergroting 10 maal of 12 maal en van een objectief met vergroting 25 maal of 40 maal en met een diafragma > 0,7, respectievelijk > 1,3.

De bovenstaande IF-techniek wordt alleen gegeven als voorbeeld. Andere IF-technieken (van referentiekwaliteit qua celcultures, fixatie en antilichamen) die doeltreffend zijn gebleken, mogen eveneens worden gebruikt.

4. Elisa

Putjes in microtiterplaten worden gedurende één nacht gecoat met aanbevolen verdunningen van gezuiverde immunoglobulinefracties van antistoffen van referentiekwaliteit.

Na wassen van de putjes met PBS-Tween-20-buffer wordt het te identificeren virus in de putjes gebracht in verdunningstappen van twee of vier en mag het gedurende 60 minuten bij 37 °C in reactie gaan met de antistoffen die voor coating zijn gebruikt. Nadat de platen opnieuw zijn gewassen met PBS-Tween-20-buffer worden gebiotiniseerde antistoffen met een specificiteit die overeenstemt met die van de voor coating gebruikte antistoffen, toegevoegd en wordt het geheel met het oog op binding gedurende 60 minuten bij 20 °C geplaatst. Vervolgens worden de platen opnieuw gewassen zoals hierboven beschreven en wordt een conjugaat van HRP met streptavidine toegevoegd en gedurende één uur bij 20 °C geplaatst om te reageren. Na een laatste wasbeurt wordt het gebonden enzym zichtbaar gemaakt met de normaal bij de Elisa-techniek gebruikte substraten (OPD, enz.).

De hierboven beschreven Elisa op basis van biotine-avidine is slechts een voorbeeld. Varianten zijn toegestaan voorzover zij doelmatig zijn gebleken.

TABEL 1A

Controle- en bemonsteringsschema dat in gebieden en op bedrijven in niet-erkende gebieden moet worden toegepast in de tweejarige controleperiode die voorafgaat aan het verkrijgen van de erkenning ten aanzien van VHS en/of IHN

(overeenkomstig Richtlijn 91/67/EEG, de bijlagen B en C, en de bepalingen in deel I van deze bijlage)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Maximumaantal vissen per verzamelmonster: tien.

TABEL 1B

Controle- en bemonsteringsschema dat moet worden toegepast in de tweejarige controleperiode die voorafgaat aan het verkrijgen van de erkenning ten aanzien van VHS en/of IHN door gebieden en door bedrijven in niet-erkende gebieden waarvoor officieel is aangetoond dat zij gedurende enige tijd vrij zijn van deze ziekten

(overeenkomstig Richtlijn 91/67/EEG, de bijlagen B en C, en de bepalingen in de delen I en III van deze bijlage)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Maxiumaantal vissen per verzamelmonster: tien.

TABEL 1C

Controle- en bemonsteringsschema dat moet worden toegepast in gebieden en op bedrijven in niet-erkende gebieden met het oog op het behoud van de erkenning ten aanzien van VHS en/of IHN

(overeenkomstig Richtlijn 91/67/EEG, de bijlagen B en C, en de bepalingen in deel I van deze bijlage)

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

Maximumaantal vissen per verzamelmonster: tien

DEEL II

Diagnostische procedures voor de bevestiging van IHN en VHS bij vermoedelijke uitbraken

Voor de diagnose van IHN en VHS wordt gebruikgemaakt van een van de volgende technieken:

- A. Conventionele virusisolatie gevolgd door serologische virusidentificatie

- B. Virusisolatie en gelijktijdige serologische virusidentificatie

- C. Andere diagnosetechnieken (IIFT, Elisa).

Voor de bevestiging van een eerste geval van IHN en/of VHS op bedrijven in erkende gebieden mag techniek C nooit alleen worden gebruikt; in dat geval moet ook gebruik worden gemaakt van techniek A of B.

Het voor virologisch onderzoek bestemde weefselmateriaal mag in sommige gevallen vergezeld gaan van extra materiaal voor bacteriologisch, parasitologisch, histologisch of ander onderzoek, met het oog op het stellen van een differentiële diagnose.

A. Conventionele virusisolatie gevolgd door serologische virusidentificatie

I.1. Selectie van monsters

Ten minste tien vissen met typische symptomen van IHN of VHS moeten voor onderzoek worden geselecteerd.

I.2. Voorbewerking en verzending van vismonsters

Zie punt I.I.3.

I.3. Verzamelen van extra diagnostisch materiaal

Zie punt I.I.4.

II. Voorbewerking van monsters voor virologisch onderzoek

Zie sectie I.II.

III. Virologisch onderzoek

Zie sectie I.III.

IV. Virusidentificatie

Zie sectie I.IV.

B. Virusisolatie en gelijktijdige serologische virusidentificatie

I.1. Selectie van monsters

Zie punt II.A.I.1.

I.2. Voorbewerking en verzending van vismonsters

Zie punt I.I.3.

I.3. Verzamelen van extra diagnostisch materiaal

Zie punt I.I.4.

II.1. Homogeniseren van de organen

Zie punt I.II.2.

II.2. Centrifugeren van het homogenaat

Het homogenaat wordt gecentrifugeerd in een op 2 tot 5 °C gekoelde centrifuge bij 2000 tot 4000 x g gedurende 15 minuten; het supernatans wordt voor onderzoek verzameld en met antibiotica - bijvoorbeeld 1 mg gentamicine/ml - behandeld gedurende vier uur bij 15 °C, of gefiltreerd door membraanfiltrering (0,45 μm) met een membraanfilter met een geringe eiwitbinding.

II.3. Behandeling van het supernatans met diagnostische antisera

De suspensie van met antibioticum behandelde of via membraan gefiltreerde organen wordt verdund in de verhoudingen 1:10 en 1:1000 in een celkweekmedium; deze hoeveelheid wordt in gelijke delen verdeeld en die delen worden gemengd met een gelijk deel van de in punt I.IV.2 genoemde reagentia en gedurende 60 minuten bij 15 °C bebroed.

III.1. Celcultures en groeimedia

Zie punt I.III.1.

III.2. Enten van celcultures

Van elk virus-serummengsel (bereid als bepaald in punt II.B.II3) worden ten minste twee celcultures per cellijn geïnoculeerd met telkens 50 μl.

III.3. Bebroeden van celcultures

Zie punt I.III.3.

III.4. Microscopische waarnemingen

Dagelijks worden de geënte celcultures op de aanwezigheid van CPE gecontroleerd onder een miscroscoop met vergroting 40-150 maal. Indien CPE wordt verhinderd door een van de gebruikte antisera, kan worden aangenomen dat het virus daardoor is geïdentificeerd.

Indien CPE niet door een van de antisera wordt verhinderd, dient het virus te worden geïdentificeerd overeenkomstig het bepaalde in sectie I.IV.

III.5. Voortkweek

Als na zeven tot tien dagen geen CPE is waargenomen, wordt voortgekweekt op cultures die zijn geënt met supernatans en groeimedium (punt II.B.II.3) overeenkomstig punt I.III.5.

C. Andere diagnosetechnieken

IIFT of Elisa wordt overeenkomstig het bepaalde in punt I.IV.3, respectievelijk punt I.IV.4 uitgevoerd op overeenkomstig punt I.II.2 voorbewerkt supernatans. Deze snelle technieken moeten binnen 48 uur na bemonstering met een virologisch onderzoek overeenkomstig het bepaalde in II.A of II.B worden aangevuld indien:

a) een negatief resultaat werd verkregen of

b) een positief resultaat werd verkregen met materiaal van de eerste uitbraak van IHN of VHS in een erkend gebied.

Op weefselmateriaal mogen andere diagnosetechnieken worden toegepast, bijvoorbeeld RT-PCR, IF op vriescoupes of immunohistochemische tests op in formaline gefixeerd weefselmateriaal. Deze technieken moeten steeds vergezeld gaan van inoculatie van niet-gefixeerd weefselmateriaal op celcultures.

DEEL III

Elementen waaruit blijkt dat een gebied of een bedrijf in een niet-erkend gebied sedert een bepaalde tijd vrij is van VHS en IHN

Richtsnoeren en criteria voor een officieel programma voor gezondheidscontrole

1. Een programma voor gezondheidscontrole kan op gang worden gebracht:

- nadat een officieel erkend programma voor de uitroeiing van VHS en/of IHN is uitgevoerd, in het kader waarvan alle vis uit het bedrijf is verwijderd en het bedrijf is gereinigd, ontsmet en stilgelegd voordat er opnieuw vis is binnengebracht uit een erkend bedrijf of

- in viskwekerijen waar nog nooit besmetting met VHSV of IHNV is geconstateerd.

2. Het programma voor gezondheidscontrole moet gebaseerd zijn op klinische onderzoeken en op laboratoriumtests.

3. Het programma moet twee klinische gezondheidscontroles per jaar omvatten overeenkomstig de richtsnoeren van deel I.

4. Bij ten minste één van de elk jaar te verrichten controles moeten van elk bedrijf 30 monsters van visweefsel en/of ovariële vloeistof worden genomen. De monsters worden geselecteerd, voorbewerkt en in het laboratorium getest overeenkomstig de delen I, II en IV.

5. Het programma voor gezondheidscontrole moet gedurende ten minste vier jaar worden toegepast in alle bedrijven in het te erkennen gebied of op elk te erkennen bedrijf in een niet-erkend gebied.

6. Het programma wordt alleen officieel erkend als geen enkel geval van VHS of IHN is geconstateerd of opgespoord (geen klinische besmetting, noch virusisolatie).

DEEL IV

Procedure voor titratie om de gevoeligheid van de celcultures voor infectie te verifiëren

Aanbevolen procedures voor titratie als bedoeld in punt I.III.3:

Er moeten ten minste twee VHSV-isolaten en één IHNV-isolaat worden gebruikt. De isolaten moeten representatief zijn voor de grootste virusgroep in de EU, bijvoorbeeld voor VHSV een pathogeen isolaat uit regenboogforel in zoet water en een marien isolaat dat pathogeen is voor tarbot, en voor IHNV een pathogene regenboogforelstam uit Europa. Er moeten duidelijk gedefinieerde isolaten uit de lidstaten worden gebruikt. Het communautair referentielaboratorium voor visziekten zorgt voor de nodige referentie-isolaten.

In celkweekflessen worden batches van virus met een laag aantal overentingen gekweekt in BF-2- of RTG-2-cellen voor VHSV, en in EPC- of FHM-cellen voor IHNV. Er moet een celcultuurmedium met ten minste 10 % serum worden gebruikt. Gebruik voor de enting een lage MOI (< 1).

Bij volledig CPE wordt het virus geoogst door centrifugeren van het celcultuursupernatans bij 2000 x g gedurende 15 minuten; filtersterilisatie over een membraanfilter van 0,45 ìm en verdeling in geëtiketteerde cryobuizen. Het virus wordt bewaard bij een temperatuur van - 80 °C.

Een week na invriezing worden drie duplobuizen met elk virus onder koud water ontdooid en getitreerd op hun respectieve cellijnen. Ten minste om de zes maanden, of als het vermoeden bestaat dat de gevoeligheid van een cellijn is verminderd, wordt elk virusisolaat ontdooid en getitreerd.

Titratieprocedures moeten uitvoerig worden beschreven en telkens moet dezelfde procedure worden gevolgd.

Bij titratie door eindpuntverdunning moeten ten minste zes duplo's voor iedere verdunningsstap worden gebruikt. De titers worden vergeleken met eerder verkregen titers. Als de titer van een van de drie virusisolaten met een factor 2 log of meer afneemt ten opzichte van de eerder verkregen titer, mag de cellijn niet langer worden gebruikt voor controledoeleinden.

Als in een laboratorium verschillende cellijnen worden bewaard, moeten deze cellijnen afzonderlijk worden onderzocht.

De gegevens moeten ten minste tien jaar worden bewaard.

DEEL V

Acroniemen en afkortingen

BF-2 Bluegill fry-2 (cellijn)

CPE Cytopathogeen effect

CRL Communautair referentielaboratorium voor visziekten

Elisa Enzyme Linked Immunosorbent Assay

EPC Epithelioma papulosum cyprini (cellijn)

FHM Fathead minnow (cellijn)

FITC Fluoresceïne isothiocyanaat

Hepes N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur

HRP Mierikswortelperoxidase

IF Immunofluorescentie

IIFT Indirecte immunofluorescentietest

IHN(V) Infectieuze hematopoïetische necrose (virus)

IPN(V) Infectieuze pancreatische necrose (virus)

MEM Minimum Essential Medium

MOI Multiplicity of infection (Verhouding tussen het aantal infectieuze virusdeeltjes en het aantal cellen in een cultuur waaraan die virusdeeltjes worden toegevoegd)

OPD Orthofenyleendiamine

PBS Phosphate Buffered Saline (met fosfaat gebufferde zoutoplossing)

RTG-2 Rainbow trout gonad (cellijn)

RT-PCR Reversed transcriptase polymerase drain reaction

Tris-HCl Tris (hydroxymethyl) aminomethaan - HCl

TRITC Tetramethyl-rhodamine-isothiocyanaat

VHS(V) Virale hemorragische septikemie (virus)

(1) Bijvoorbeeld als de vis wordt verzameld in zeer afgelegen gebieden waar geen dagelijkse verzendingen mogelijk zijn.

(2) Of zoals aangegeven door het referentielaboratorium in verband met de mogelijke cytotoxiciteit van de antisera.

(3) Of zoals aangegeven door het referentielaboratorium in verband met de mogelijke cytotoxiciteit van de antisera.

(4) Of zoals aangegeven door het referentielaboratorium in verband met de mogelijke cytotoxiciteit van de antisera.