BIJLAGE II

ONDERZOEKSMETHODE VOOR DE DIAGNOSE, DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

OVERZICHT VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

Deze onderzoeksmethode beschrijft de verschillende procedures voor:

i) de diagnose van bruinrot in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en enkele andere waardplanten;

ii) de detectie van Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) in monsters van aardappelknollen, aardappel- en tomatenplanten en andere waardplanten, water en grond;

iii) de identificatie van R. solanacearum.

INHOUD

Bladzijde Algemene beginselen 40 DEEL I Toepassing van de onderzoeksmethode 40 1. Stroomdiagram voor de diagnose van bruinrot (R. solanacearum) in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot 40 2. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen 43 3. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere waardplanten 46 DEEL II Methoden voor de detectie van R. solanacearum in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot 48 1. Symptomen 48 2. Snelle screeningstests 48 3. Isolatieprocedure 49 4. Identificatietests voor R. solanacearum 49 DEEL III 1. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen 49 1.1. Bereiding van de monsters 49 1.2. Testmethode 51 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere planten 51 2.1. Bereiding van de monsters 51 2.2. Testmethode 52 DEEL IV 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water 53 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water 55 2.1. Bereiding van de monsters 55 2.2. Testmethode 55 DEEL V 1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond 56 2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond 58 2.1. Bereiding van de monsters 58 2.2. Testmethode 58 DEEL VI Geoptimaliseerde protocollen voor de detectie en identificatie van R. solanacearum 58 A. Diagnose en detectie 58 1. Slijmdradentest 58 2. Detectie van poly-β-hydroxybutyraatkorrels 58 3. Serumagglutinatietests 59 4. Selectieve isolatie 60 4.1. Selectieve uitplating 60 4.2. Ophopingsprocedure 60 5. Immunofluorescentiestest (IF-test) 61 6. Polymerasekettingreactietest (PCR-test) 64 6.1. DNA-zuiveringsmethoden 65 a) Methode volgens Pastrik (2000) 65 b) Andere methoden 65 6.2. PCR 66 6.3. Analyse van het PCR-product 66 7. Fluorescentie-in-situ-hybridisatietest (FISH-test) 67 8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-tests 69 a) Indirecte ELISA 69 b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA 70 9. Bioassay 71 B. Identificatietests 72 1. Voedingstests en enzymatische identificatietests 72 2. IF-test 72 3. ELISA-test 73 4. PCR-test 73 5. FISH-test 73 6. Vetzuurprofiel (FAP) 73 7. Stamkarakterisatie 73 7.1. Biovarbepaling 73 7.2. Genetische vingerafdruk 74 7.3. PCR-methoden 74 C. Bevestigingstest 74 Aanhangsel 1 Bij de optimalisering en validering van de protocollen ingeschakelde laboratoria 76 Aanhangsel 2 Isolatie- en kweekmedia voor R. solanacearum 77 Aanhangsel 3 A) In de handel verkrijgbaar gestandaardiseerd controlemateriaal 79 B) Bereiding van positieve en negatieve controles voor de screeningstests (PCR/IF en FISH) 80 Aanhangsel 4 Buffers voor testprocedures 82 Aanhangsel 5 Bepaling van het besmettingsniveau met de IF- en de FISH-test 85 Aanhangsel 6 Gevalideerde PCR-protocollen en -reagentia 86 Aanhangsel 7 Gevalideerde reagentia voor de FISH-test 91 Aanhangsel 8 Aubergine- en tomatenteelt 93 Literatuurverwijzingen 94

ALGEMENE BEGINSELEN

In de aanhangsels worden geoptimaliseerde protocollen voor de verschillende methoden, gevalideerde reagentia, en nadere bijzonderheden betreffende de bereiding van analyse- en controlemateriaal beschreven. Aanhangsel 1 bevat een lijst van laboratoria die bij de optimalisering en validering van de protocollen zijn betrokken.

Aangezien de protocollen betrekking hebben op de detectie van een quarantaineorganisme en daarbij levensvatbare culturen van R. solanacearum als controlemateriaal gebruikt worden, moeten de procedures onder adequate quarantaineomstandigheden met de nodige faciliteiten voor afvalverwijdering worden uitgevoerd en moeten de officiële autoriteiten voor plantenquarantaine de vereiste vergunningen hebben verstrekt.

De testparameters moeten zodanig zijn dat R. solanacearum bij de drempelwaarden die voor de gekozen methoden zijn vastgesteld op consistente en reproduceerbare wijze gedetecteerd wordt.

Het is essentieel dat de positieve controlemonsters zorgvuldig bereid worden.

Om de tests met de vereiste drempelwaarden te kunnen verrichten moet verder de apparatuur juist ingesteld, in goede staat van onderhoud en geijkt zijn, moeten de reagentia zorgvuldig gehanteerd en bewaard worden en moeten alle maatregelen worden genomen om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen; zo moeten de positieve controlemonsters gescheiden van de analysemonsters bewaard worden. Er moeten kwaliteitsbewakingsnormen worden toegepast om administratieve en andere fouten te vermijden, met name bij de etikettering en documentatie.

Een vermoede aanwezigheid als bedoeld in artikel 4, lid 2, van Richtlijn 98/57/EG betekent dat een positieve uitslag is verkregen bij een diagnostische of screeningstest op een monster zoals aangegeven in de stroomdiagrammen. Een positieve eerste screeningstest (IF, PCR/FISH, selectieve isolatie) moet met een tweede, op andere biologische principes gebaseerde screeningstest worden bevestigd.

Als de eerste screeningstest positief is, wordt besmetting met R. solanacearum vermoed en moet een tweede screeningstest worden uitgevoerd. Is de tweede screeningstest ook positief, dan wordt het vermoeden bevestigd (vermoede aanwezigheid) en moeten de tests volgens de onderzoeksmethode worden voortgezet. Als de tweede screeningstest negatief is, wordt aangenomen dat het monster niet met R. solanacearum besmet is.

Onder bevestigde aanwezigheid als bedoeld in artikel 5, lid 1, van Richtlijn 98/57/EG wordt verstaan dat een reincultuur van R. solanacearum is geïsoleerd en geïdentificeerd en de pathogeniteit ervan bevestigd is.

DEEL I

TOEPASSING VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

1. Stroomdiagram voor de diagnose van bruinrot (R. solanacearum) in aardappelknollen en aardappel-, tomaten- en andere waardplanten met symptomen van bruinrot

De testprocedure is bedoeld voor aardappelknollen en -planten met symptomen die karakteristiek zijn voor bruinrot of een vermoeden daarvan doen rijzen. Ze omvat een snelle screeningstest, isolatie van het pathogeen uit geïnfecteerd vaatweefsel op (selectief) medium en, in geval van een positieve uitslag, identificatie van de cultuur als R. solanacearum.

2. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen

Principe

Deze testprocedure is bedoeld voor het opsporen van latente infecties in aardappelknollen. Een positieve uitslag bij ten minste twee, op verschillende biologische principes gebaseerde screeningstests3 moet worden bevestigd door isolatie van het pathogeen. In geval van isolatie van karakteristieke kolonies wordt de procedure vervolgd door identificatie van een reincultuur als R. solanacearum. Een positieve uitslag bij slechts één van de screeningstests is niet voldoende om het monster als verdacht aan te merken.

Met de screenings- en isolatietests moet een detectiegrens worden gehaald van 103-104 cellen/ml van de geresuspendeerde pellet die als positieve controle aan elke testreeks wordt toegevoegd.

3. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- of andere waardplanten

DEEL II

METHODEN VOOR DE DETECTIE VAN R. SOLANACEARUM IN AARDAPPELKNOLLEN EN AARDAPPEL-, TOMATEN- EN ANDERE WAARDPLANTEN MET SYMPTOMEN VAN BRUINROT

1. Symptomen (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Symptomen bij aardappel

Aardappelplant. Het eerste infectiestadium uit zich in bladverwelking nabij de top van de plant bij hoge temperaturen overdag met herstel's nachts. Aanvankelijk blijven de bladeren groen, later vergelen ze en treedt bruine necrose op. Ook komt epinastie voor. De verwelking van scheuten of hele planten is al snel onomkeerbaar; de plant zakt ineen en sterft. Het vaatweefsel in dwars doorgesneden stengels van verwelkte planten ziet er doorgaans bruin uit en uit het snijvlak komt een melkachtig bacterieslijm (spontaan of als de stengel wordt dichtgeknepen). Wanneer een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, komen er slijmdraden uit de vaatbundels.

Aardappelknol. De aardappelknollen moeten dicht bij het naveleinde (stoloon) dwars of over de stoloon overlangs doorgesneden worden. Het eerste infectiestadium uit zich in een glazige gele tot lichtbruine verkleuring van de vaatbundelring, waaruit na enkele minuten spontaan roomkleurig bacterieslijm komt. Later wordt de vaatverkleuring duidelijker bruin en kan de necrose zich tot in het parenchym uitstrekken. In gevorderde stadia komt uit de navel en de ogen bacterieslijm waaraan bodemdeeltjes blijven hangen. Op de schil kunnen door instorting van onderliggend vaatweefsel roodbruine, iets verzonken laesies verschijnen. In gevorderde stadia van de ziekte komt secundair vaak zacht bacterieel of schimmelrot voor.

1.2. Symptomen bij tomaat

Tomatenplant. Het eerste zichtbare symptoom is dat de jongste bladeren er slap bijhangen. In voor het pathogeen gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur ongeveer 25 °C, 100 % luchtvochtigheid) volgen na enkele dagen epinastie en eenzijdige of totale verwelking van de plant, waarna deze volledig inzakt. In minder gunstige omstandigheden (bodemtemperatuur lager dan 21 °C) treedt minder verwelking op, maar kunnen zich aan de stengel grote aantallen bijwortels ontwikkelen. Vanaf de voet van de stengel verschijnen met water verzadigde ribbels, wat wijst op necrose in het vaatstelsel. Als de stengel dwars wordt doorgesneden, komt er wit of gelig bacterieslijm uit het bruin verkleurde vaatweefsel.

1.3. Symptomen bij andere waardplanten

Solanum dulcamara (bitterzoet) en S. nigrum (zwarte nachtschade) — In het wild wordt verwelking bij deze onkruidplanten zelden waargenomen, tenzij bij bodemtemperaturen van meer dan 25 °C of extreem hoge inoculumniveaus (bijvoorbeeld wanneer S. nigrum vlak naast zieke aardappel- of tomatenplanten groeit). Als verwelking wel optreedt, zijn de symptomen dezelfde als bij tomaat. Niet-verwelkende S. dulcamara die met wortel en stengel in water staat kan op een dwarse doorsnede van de onderste of onder water gelegen stengeldelen een lichtbruine verkleuring van het vaatweefsel vertonen. Bacterieslijm of -slijmdraden kunnen uit het vaatweefsel komen als een doorgesneden stengel verticaal in water wordt gezet, ook als er geen verwelkingssymptomen zijn.

2. Snelle screeningstests

Snelle screeningstests zijn nuttig voor een voorlopige diagnose, maar niet essentieel. Voer een of meer van de onderstaande gevalideerde tests uit.

2.1. Slijmdradentest

(Zie VI.A.1)

2.2. Detectie van poly-β-hydroxybutyraatkorrels (PHB-korrels)

Kleur thermisch gefixeerde uitstrijkjes bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel op een objectglaasje met nijlblauw A of sudanzwart om de karakteristieke PHB-korrels in de cellen van R. solanacearum te zien (VI.A.2).

2.3. Serumagglutinatietests

(Zie VI.A.3)

2.4. Andere tests

Andere geschikte snelle screeningstests zijn onder meer de IF-test (VI.A.5), FISH-test (VI.A.7), ELISA-tests (VI.A.8) en PCR-tests (VI.A.6).

3. Isolatieprocedure

a) Neem wat slijm of verkleurd vaatweefsel uit de aardappelknol of uit de stengel van de verwelkte aardappel-, tomaten- of andere waardplant. Suspendeer dit in een klein volume steriel gedestilleerd water of steriele fosfaatbuffer 50 mM (aanhangsel 4) en laat 5-10 minuten staan.

b) Maak een reeks decimale verdunningen van de suspensie.

c) Breng 50-100 µl van de suspensie en verdunningen over op een algemeen medium (NA, YPGA of SPA; aanhangsel 2) en/of op Kelman's tetrazoliummedium (aanhangsel 2) of een ander gevalideerd selectief medium (zoals SMSA; aanhangsel 2). Gebruik daarvoor een geschikte techniek. Plaat als positieve controle eventueel ook een verdunde celsuspensie van R. solanacearum biovar 2 uit.

d) Incubeer de platen 2-6 dagen bij 28 °C. — Op een algemeen medium vormen virulente isolaten van R. solanacearum parelwitte, platte, onregelmatige en uitvloeiende kolonies, vaak met kenmerkende slierten in het midden. Avirulente isolaten vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig roomkleurige, botervette kolonies. — Op Kelman's tetrazolium en SMSA zijn de slierten bloedrood. Avirulente isolaten van R. solanacearum vormen kleine, ronde, niet-uitvloeiende, volledig dieprode, botervette kolonies.

4. Identificatietests voor R. solanacearum

Onder VI. B worden tests beschreven om de identificatie van vermoedelijke isolaten van R. solanacearum te bevestigen.

DEEL III

1. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappelknollen

1.1. Bereiding van de monsters

Opmerkingen

— De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. Intensievere bemonstering houdt in dat er meer tests op monsters van deze grootte worden genomen. Wanneer een groter aantal knollen per monster wordt genomen, treedt remming op of zijn de resultaten moeilijk te interpreteren. De procedure is echter ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen, wanneer er niet zoveel beschikbaar zijn.

— De hierna beschreven detectiemethoden zijn gevalideerd met monsters van 200 knollen.

— Het hierna beschreven aardappelextract kan ook worden gebruikt voor de detectie van de aardappelringrotbacterie, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Facultatieve behandeling vóór de bereiding van het monster:

a) Incubeer de monsters vooraf maximaal twee weken voor de test bij 25-30 °C, zodat eventueel aanwezige R. solanacearum zich vermenigvuldigt.

b) Was de knollen. Gebruik geschikte ontsmettingsmiddelen (als een PCR-test uitgevoerd wordt, chloorverbindingen om eventueel aanwezig pathogeen-DNA te verwijderen) en reinigingsmiddelen na elk monster. Laat de knollen aan de lucht drogen. Deze wasprocedure is vooral nuttig, maar niet verplicht, voor monsters met veel aanhangende grond en als een PCR-test of directe isolatie moet worden uitgevoerd.

1.1.1. Verwijder met een schoon, ontsmet scalpel of aardappelschilmes de schil aan het naveleinde (stoloon) van elke knol, zodat het vaatweefsel zichtbaar wordt. Snij voorzichtig een kleine kegelvormige kern vaatweefsel uit het naveleinde van elke knol en zorg er daarbij voor dat deze zo weinig mogelijk niet-vaatweefsel bevat (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: Houd (rottende) knollen met verdachte symptomen van bruinrot apart en test die afzonderlijk.

Als bij het uitsnijden van het naveleindstukje voor bruinrot verdachte symptomen worden waargenomen, moet de knol visueel worden onderzocht en bij de navel worden doorgesneden. Doorgesneden knollen met vermoedelijke symptomen moeten ten minste twee dagen bij kamertemperatuur worden bewaard om verkurking te laten optreden en vervolgens gekoeld (bij 4-10 °C) onder de juiste quarantaineomstandigheden worden opgeslagen. Alle knollen, ook die met verdachte symptomen, moeten overeenkomstig bijlage III worden bewaard.

1.1.2. Verzamel de naveleindstukjes in ongebruikte afsluitbare of verzegelbare wegwerpcontainers (als de containers wel opnieuw gebruikt worden, moeten ze grondig worden gereinigd en met chloorverbindingen worden ontsmet). De naveleindstukjes worden bij voorkeur direct verwerkt. Is dat niet mogelijk, dan moeten ze zonder toevoeging van buffer in de container worden bewaard; gekoeld mogen ze hooguit 72 uur worden bewaard, bij kamertemperatuur hooguit 24 uur.

Verwerk de naveleindstukjes volgens een van onderstaande procedures:

a) overgiet de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud 4 uur (bij minder dan 24 °C) of 16-24 uur (gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of

b) homogeniseer de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) in een blender (bv. Waring of Ultra Thurax) of door ze fijn te maken in een afgesloten wegwerpbaar maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba sterk polytheen, 150 × 250 mm, met straling gesteriliseerd) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex).

NB: Bij gebruik van een blender is er een groot risico op kruisbesmetting tussen de monsters. Neem maatregelen om aërosolvorming en morsen tijdens de extractie te vermijden. Voor elk monster moeten pas gesteriliseerde blendermessen en vaten gebruikt worden. Als de PCR-test wordt gedaan, moet worden vermeden dat er DNA in de containers of maalapparatuur achterblijft. Aanbevolen wordt om voor de PCR-test het materiaal in wegwerpzakjes fijn te maken en wegwerpbuisjes te gebruiken.

1.1.3. Schenk de bovenstaande vloeistof af. Als de vloeistof erg troebel is, kan dit worden verholpen door centrifugeren bij laag toerental (maximaal 180 g, 10 minuten, 4-10 °C) of vacuümfiltratie (40-100 µm) waarbij het filter met ongeveer 10 ml extractiebuffer wordt nagespoeld.

1.1.4. Concentreer de bacteriefractie door 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g (of 10 minuten bij 10 000 g) bij 4-10 °C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.

1.1.5. Resuspendeer de pellet in 1,5 ml pelletbuffer (aanhangsel 4). Gebruik 500 µl voor de test op R. solanacearum, 500 µl voor die op Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus en 500 µl voor referentiedoeleinden. Voeg aan het referentiealiquot van 500 µl en aan het niet-gebruikte analysealiquot steriele glycerol toe tot een eindconcentratie van 10-25 % (V/V), vortex en bewaar tussen –16 en –24 °C (enkele weken) of –68 en –86 °C (enkele maanden). Bewaar de analysealiquots tijdens het onderzoek bij 4-10 °C.

Herhaald invriezen en ontdooien wordt niet aangeraden.

Als het extract moet worden vervoerd, moet het binnen 24 à 48 uur in een koelbox worden afgeleverd.

1.1.6. Alle positieve R. solanacearum-controles en -monsters moeten gescheiden behandeld worden om contaminatie te voorkomen. Dit geldt voor de IF-glaasjes en voor alle tests.

1.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels:

selectieve isolatie (VI.A.4);

IF-test (VI.A.5);

PCR-tests (VI.A.6);

FISH-test (VI.A.7);

ELISA-tests (VI.A.8);

bioassay (VI.A.9).

2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in monsters van symptoomloze aardappel-, tomaten- en andere waardplanten

2.1. Bereiding van de monsters

NB: Voor de detectie van latente R. solanacearum-populaties wordt aangeraden samengestelde monsters te testen. De methode is goed bruikbaar voor samengestelde monsters van maximaal 200 stengeldelen. Surveyonderzoeken moeten gebaseerd zijn op een statistisch representatieve steekproef van de onderzochte plantenpopulatie.

2.1.1. Doe stengeldelen van 1-2 cm in een gesloten steriele container overeenkomstig de onderstaande bemonsteringsprocedures.

Zaailingen van tomatenplanten: Snij met een schoon, ontsmet mes een stuk van 1 cm van het onderste deel van elke stengel, vlak boven het bodemniveau.

Kas- of vollegrondtomatenplanten: Snij met een schoon, ontsmet mes de onderste zijscheut van elke plant zo dicht mogelijk bij de hoofdstengel af. Neem de onderste 1 cm van elke zijscheut.

Andere planten: Snij met een schoon, ontsmet mes of dito snoeischaar een stuk van 1 cm van het onderste deel van de stengel af, vlak boven het bodemniveau. Snij van S. dulcamara of andere in water groeiende planten een stuk van 1-2 cm van het deel van de stengel onder water of de stoloon met waterwortels.

Test bij het bemonsteren van een bepaalde plaats bij voorkeur een statistisch representatieve steekproef van ten minste tien planten per bemonsteringspunt van elke mogelijke onkruidwaard. Het pathogeen is het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, al kan natuurlijke infectie in overblijvend bitterzoet (S. dulcamara) in waterlopen het hele jaar worden gedetecteerd. Het organisme komt onder meer voor in aardappelopslag, S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium en andere planten van de nachtschadefamilie, en daarnaast in Pelargonium spp. en Portulaca oleracea. R. solanacearum biovar 2/ras 3 kan in specifieke omstandigheden voorkomen in de wortel of rizosfeer van Europese onkruidsoorten als Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfara en Urtica dioica.

NB: In dit stadium kan het visuele onderzoek naar inwendige symptomen (vaatverkleuring of bacterieslijm) plaatsvinden. Bewaar en test stengeldelen met symptomen afzonderlijk (zie deel II).

2.1.2. Ontsmet de stengeldelen kort met ethanol 70 % en dep ze direct droog met tissuepapier. Verwerk de stengeldelen daarna volgens een van de volgende procedures:

a) overgiet de stengeldelen met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 4) en schud gedurende 4 uur (bij minder dan 24 °C) dan wel 16-24 uur (indien gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of

b) verwerk de stengeldelen onmiddellijk door ze fijn te maken in een sterk maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba) met voldoende extractiebuffer (aanhangsel 4) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). Is dit niet mogelijk, dan kunnen ze gekoeld hooguit 72 uur worden bewaard en bij kamertemperatuur hooguit 24 uur.

2.1.3. Laat 15 minuten bezinken en schenk de bovenstaande vloeistof af.

2.1.4. Het is doorgaans niet nodig het extract verder te zuiveren of de bacteriefractie te concentreren; desgewenst kan dit worden gedaan door filtratie en/of centrifugering zoals beschreven onder III.1.1.3 tot 1.1.5.

2.1.5. Verdeel het oorspronkelijke of geconcentreerde monsterextract in twee gelijke delen. Houd de ene helft gedurende het onderzoek op 4-10 °C en bewaar de andere helft na toevoeging van 10-25 % (V/V) steriele glycerol tussen –16 en –24 °C (enkele weken) of –68 en –86 °C (enkele maanden) voor het geval verder onderzoek nodig is.

2.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests en de geoptimaliseerde protocollen in de aanhangsels:

selectieve isolatie (VI.A.4);

IF-test (VI.A.5);

PCR-tests (VI.A.6);

FISH-test (VI.A.7);

ELISA-tests (VI.A.8);

bioassay (VI.A.9).

DEEL IV

1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water

2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in water

Principe

Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in oppervlaktewatermonsters en monsters afvalwater van aardappelverwerkingsinstallaties of riooleffluent. De verwachte detectiegevoeligheid hangt echter van het substraat af. De gevoeligheid van de isolatietest hangt af van de populatie concurrerende saprofytische bacteriën, die doorgaans veel groter is in aardappelverwerkingsafvalwater of effluent dan in oppervlaktewater. Met de onderstaande methode kan in oppervlaktewater een concentratie van 103 cellen per liter nog worden gedetecteerd, maar voor afvalwater ligt de gevoeligheid waarschijnlijk aanzienlijk lager. Daarom wordt afvalwater het beste getest na een eventuele zuivering (bv. sedimentatie, filtratie), waardoor de populatie saprofytische bacteriën wordt gereduceerd. Bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen moet rekening worden gehouden met de gevoeligheid van de testmethode. Deze methode is met succes toegepast bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in oppervlaktewater, maar heeft haar beperkingen bij vergelijkbaar onderzoek op aardappelverwerkingsafvalwater of riooleffluent.

2.1. Bereiding van de monsters

Opmerkingen

— In oppervlaktewater is R. solanacearum het beste te detecteren laat in het voorjaar, in de zomer en in de herfst, bij een watertemperatuur van meer dan 15 °C.

— Herhaalde bemonstering van dezelfde plaatsen op verschillende tijdstippen in die periode reduceert de weersinvloed en verhoogt daardoor de betrouwbaarheid van de detectie.

— Zware regenval en de geografie van de waterloop kunnen leiden tot een grote verdunning die de aanwezigheid van het pathogeen kan maskeren.

— Bemonster oppervlaktewater in de buurt van waardplanten (indien aanwezig).

2.1.1. Neem op de bemonsteringsplaatsen in steriele wegwerpbuizen of -flessen watermonsters op een diepte van meer dan 30 cm (indien mogelijk) en binnen 2 m van de oever. Neem afvalwater- of effluentmonsters bij het lozingspunt. Neem bij voorkeur monsters van maximaal 500 ml per bemonsteringspunt. Als kleinere monsters worden genomen, worden op elke bemonsteringsplaats bij voorkeur op ten minste drie verschillende tijdstippen telkens twee submonsters in duplo van ten minste 30 ml genomen. Kies voor intensief onderzoek ten minste drie bemonsteringsplaatsen per 3 km waterloop en bemonster ook de zijwaterlopen.

2.1.2. Vervoer de monsters koel (4-10 °C) en in het donker en test ze binnen 24 uur.

2.1.3. Concentreer de bacteriefractie indien nodig op een van de volgende manieren:

a) centrifugeer submonsters van 30-50 ml 10 minuten bij 10 000 g (of 15 minuten bij 7 000 g), bij voorkeur bij 4-10 °C. Giet de bovenstaande vloeistof af. Resuspendeer de pellet in 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4);

b) filtreer de suspensie door een membraan (minimale maasgrootte 0,45 µm). Was het filter met 5-10 ml pelletbuffer en bewaar de wasvloeistof. Deze werkwijze is geschikt voor grotere volumes water met weinig saprofyten.

Monsters van aardappelverwerkingsafvalwater of effluent worden doorgaans beter niet geconcentreerd, omdat te grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën de detectie van R. solanacearum hinderen.

2.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels.

DEEL V

1. Stroomdiagram voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond

2. Methoden voor de detectie en identificatie van R. solanacearum in grond

Principe

Met de gevalideerde detectiemethode in dit deel kan het pathogeen worden gedetecteerd in bodemmonsters en monsters van vast aardappelverwerkingsafval of rioolslib. Ze is echter niet gevoelig genoeg om detectie van lage concentraties of onregelmatig verspreide populaties van R. solanacearum in natuurlijk besmette monsters van deze substraten te waarborgen.

Houd bij de beoordeling van de betrouwbaarheid van negatieve uitslagen en bij onderzoek naar de aan- of afwezigheid van het pathogeen in bodems of slib rekening met de gevoeligheid van de testmethode. De betrouwbaarste manier om na te gaan of het pathogeen in een bodem aanwezig is, is een vatbare waardplant te planten en op infectie te controleren, maar ook met die methode kunnen lage besmettingsniveaus niet altijd worden gedetecteerd.

2.1. Bereiding van de monsters

2.1.1. Neem bodemmonsters volgens de standaardprincipes voor bemonstering bij nematodenonderzoek. Verzamel 0,5-1 kg grond per monster op 60 plaatsen per 0,3 ha (in een raster van 7 × 7 m) op een diepte van 10-20 cm. Gebruik 120 bemonsteringspunten per 0,3 ha als aanwezigheid van het pathogeen wordt vermoed. Bewaar de monsters bij 12-15 °C. Bemonster aardappelverwerkings- en rioolslib door in totaal 1 kg slib te verzamelen dat representatief is voor het hele te testen volume. Meng elk monster grondig voor het testen.

2.1.2. Dispergeer submonsters van 10-25 g grond of slib in 60-150 ml extractiebuffer (aanhangsel 4) op een rondschudapparaat (250 rpm, maximaal 2 uur). Voeg zo nodig steriele 0,02 % Tween 20 en 10-20 g steriele kiezel toe voor een betere dispersie.

2.1.3. Bewaar de suspensie tijdens het testen bij 4 °C.

2.2. Testmethode

Zie de stroomdiagrammen en beschrijvingen van de tests in de aanhangsels.

DEEL VI

GEOPTIMALISEERDE PROTOCOLLEN VOOR DE DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN R. SOLANACEARUM

A. Diagnose en detectie

1. Slijmdradentest

De volgende eenvoudige oriënterende test geeft aan of R. solanacearum aanwezig is in stengels van verwelkende aardappel-, tomaten- of andere planten. Snij de stengel vlak boven het bodemniveau af. Dompel het snijvlak in een buis schoon water. Kijk of er na enkele minuten spontaan bacterieslijmdraden uit de doorgesneden vaatbundels komen.

2. Detectie van poly-β-hydroxybutyraatkorrels

1. Maak op een objectglaasje een uitstrijkje van bacterieslijm uit geïnfecteerd weefsel of uit een 48 uur oude kweek op YPGA- of SPA-medium (aanhangsel 2).

2. Maak uitstrijkjes van een biovar 2-stam van R. solanacearum als positieve controle en eventueel van een bekende PHB-negatieve soort als negatieve controle.

3. Laat aan de lucht drogen en haal elk glaasje door de vlam om de uitstrijkjes te fixeren.

4. Kleur de preparaten met nijlblauw of sudanzwart en bekijk ze onder de microscoop volgens de onderstaande procedure.

Nijlblauwkleuring

a) Overgiet elk glaasje met een 1 % oplossing van nijlblauw A in water. Incubeer 10 minuten bij 55 °C.

b) Laat de kleuroplossing weglopen. Spoel even in rustig stromend kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier.

c) Overgiet met azijnzuur 8 % en incubeer 1 minuut bij kamertemperatuur.

d) Spoel even in rustig stromend kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier.

e) Herbevochtig met een druppel water en breng een dekglaasje aan.

f) Bekijk het preparaat met een epifluorescentiemicroscoop (450 nm, olie-immersie, 600-1 000 ×).

g) Kijk of er een helderoranje fluorescentie van PHB-korrels te zien is. Controleer onder doorvallend natuurlijk licht of de korrels zich wel degelijk in de cellen bevinden en de celmorfologie karakteristiek is voor R. solanacearum.

Sudanzwartkleuring

a) Overgiet elk glaasje met een 0,3 % oplossing van sudanzwart B in ethanol 70 %. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.

b) Laat de kleuroplossing weglopen. Spoel even met kraanwater. Verwijder overtollig water met tissuepapier.

c) Dompel even in xyleen en dep droog op tissuepapier. Let op! Xyleen is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast.

d) Overgiet met waterige safranineoplossing 0,5 % (m/V) en laat 10 seconden bij kamertemperatuur inwerken. Let op! Safranine is gevaarlijk. Neem de nodige voorzorgen en werk in een zuurkast.

e) Spoel in rustig stromend kraanwater. Dep droog op tissuepapier. Breng een dekglaasje aan.

f) Bekijk het preparaat met een lichtmicroscoop onder doorvallend licht (olie-immersie, 1 000 ×).

g) Kijk of er blauwzwarte PHB-korrels te zien zijn in R. solanacearum-cellen met roze celwanden.

3. Serumagglutinatietests

Agglutinatie van R. solanacearum-cellen in bacterieslijm of weefselextract van planten met symptomen is het beste waar te nemen met gevalideerde antilichamen (aanhangsel 3) die met kleur zijn gelabeld, bv. met rode Staphylococcus aureus of gekleurde latexdeeltjes. Volg bij gebruik van in de handel verkrijgbare kits (aanhangsel 3) de instructies van de fabrikant en anders de volgende procedure:

a) Meng ongeveer 5 µl van een suspensie van gelabeld antilichaam met ongeveer 5 µl bacterieslijm op venstertjes van een objectglaasje met meerdere venstertjes.

b) Maak positieve en negatieve controles met suspensies van R. solanacearum biovar 2 en een heterologe stam.

c) Meng zachtjes gedurende 15 seconden. In positieve monsters treedt agglutinatie op.

4. Selectieve isolatie

4.1. Selectieve uitplating

NB: Controleer vóór de eerste toepassing van deze methode of de toevoeging van 103-104 kve/ml R. solanacearum aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar wordt gedetecteerd.

Gebruik een geschikt gevalideerd selectief medium, bv. SMSA zoals gemodificeerd door Elphinstone e.a. (1996) (aanhangsel 2).

Om R. solanacearum te onderscheiden van andere bacteriën die op het medium kolonies kunnen vormen, is zorg vereist. Kolonies van R. solanacearum kunnen bovendien een atypische morfologie vertonen op overvolle platen en in aanwezigheid van antagonistische bacteriën. Test het monster bij een vermoeden van concurrentie of antagonisme met een andere test opnieuw.

Deze methode is het gevoeligst met vers bereide monsterextracten. Zij kan echter ook worden gebruikt met extracten die tussen –68 en –86 °C in glycerol zijn bewaard.

Maak als positieve controle decimale verdunningen van een suspensie van 106 kve/ml van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Om contaminatie uit te sluiten moeten de positieve controles volledig gescheiden van de analysemonsters worden bereid.

Ga voor elke nieuw bereide charge van een selectief medium na of die geschikt is voor het kweken van de bacterie en gebruik haar pas daarna om routinemonsters te testen.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

4.1.1. Neutraliseer eventueel aanwezige saprofytische kolonievormende populaties door verdunning en uitplating. Strijk per plaat monsterextract en per verdunning 50-100 µl uit.

4.1.2. Incubeer de platen bij 28 °C. Bekijk ze na 48 uur en daarna zes dagen lang dagelijks. Karakteristieke kolonies van R. solanacearum op SMSA zijn melkwit, plat, onregelmatig en uitvloeiend; na drie dagen incubatie worden ze in het midden roze tot bloedrood, met interne strepen en slierten (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

NB: R. solanacearum vormt op dit medium soms ook atypische kolonies. Deze kunnen klein, rond, helemaal rood en niet of slechts gedeeltelijk uitvloeiend zijn, waardoor ze moeilijk van saprofytische kolonievormende bacteriën te onderscheiden zijn.

4.1.3. Kweek vermoedelijke R. solanacearum-kolonies rein na uitstrijken of uitplaten van verdunningen op een algemeen medium om geïsoleerde kolonies te krijgen (aanhangsel 2).

4.1.4. De kweek kan worden bewaard in steriel water (pH 6-8, chloorvrij) in het donker en bij kamertemperatuur (kort) of in een geschikt cryoprotectans bij –68 à –86 °C of gevriesdroogd (lang).

4.1.5. Identificeer vermoedelijke culturen (VI. B) en voer een pathogeniteitstest uit (VI. C).

Interpretatie van het resultaat van de selectieve uitplating

De test is negatief als de platen na zes dagen geen kolonies of geen vermoedelijke R. solanacearum-kolonies vertonen, mits er geen aanwijzingen zijn voor remming door concurrentie of antagonisme van andere bacteriën en de positieve controles wel karakteristieke R. solanacearum-kolonies vertonen.

De test is positief als er vermoedelijke R. solanacearum-kolonies worden geïsoleerd.

4.2. Ophopingsprocedure

Gebruik een gevalideerd ophopingsmedium, bv. gemodificeerde Wilbrink-bouillon (aanhangsel 2).

Deze procedure dient om populaties van R. solanacearum in monsterextracten selectief te stimuleren en de detectiegevoeligheid te verbeteren. Ook worden remmers van de PCR-reactie doeltreffend verdund (1:100). De ophoping van R. solanacearum kan echter mislukken door concurrentie of antagonisme van saprofytische organismen die vaak ook worden gestimuleerd. Daarom is isolatie van R. solanacearum uit kweken in ophopingsbouillon soms moeilijk. Voor de ELISA-test verdienen specifieke monoklonale (in plaats van polyklonale) antilichamen de voorkeur, daar populaties van serologisch verwante saprofyten ook kunnen toenemen.

4.2.1. Breng voor ophoping+PCR 100 µl monsterextract over in 10 ml ophopingsbouillon (aanhangsel 2) in DNA-vrije buisjes of flesjes. Voor ophoping+ELISA kan de concentratie van het monsterextract worden verhoogd (bv. 100 µl in 1,0 ml ophopingsbouillon).

4.2.2. Incubeer 72 uur bij 27-30 °C (al dan niet op een schudapparaat) met de dop los op de buisjes voor de beluchting.

4.2.3. Meng de suspensies voor de ELISA- of PCR-test grondig.

4.2.4. Behandel de bouillon vervolgens op dezelfde manier als de monsters in de boven beschreven tests.

NB: Bij een hoge kans op remming van de ophoping van R. solanacearum door grote populaties concurrerende saprofytische bacteriën levert ophoping van de monsterextracten vóór centrifugering of andere concentratiestappen vaak betere resultaten op.

5. Immunofluorescentiestest (IF-test)

Principe

De IF-test wordt als eerste screeningstest aanbevolen vanwege de aangetoonde robuustheid ten opzichte van de vereiste drempelwaarden.

Wanneer de IF-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede screeningstest een isolatie-, PCR- of FISH-test worden gedaan. Wanneer de IF-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd voor de verdere analyses.

NB: Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugaat, overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. De gevalideerde polyklonale antiserums hebben allemaal een IF-titer van ten minste 1:2 000. Bij het onderzoek moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer.

De test moet worden uitgevoerd op vers bereide monsterextracten. Zo nodig kan de test ook goed worden uitgevoerd op extracten die tussen –68 en –86 °C in glycerol zijn bewaard. De glycerol kan uit het monster worden verwijderd door toevoegen van 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4), 15 minuten centrifugeren bij 7 000 g en resuspensie in een gelijk volume pelletbuffer. Dit is vaak niet nodig, met name als de monsters op de objectglaasjes worden gefixeerd door ze door de vlam te halen.

Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B), en eventueel in buffervloeistof.

Natuurlijk geïnfecteerd weefsel (geconserveerd door vriesdrogen of invriezen bij –16 tot–24 °C) moet zo mogelijk als soortgelijke controle op hetzelfde glaasje worden gebruikt.

Als negatieve controle kunnen aliquots monsterextract worden gebruikt waarbij een eerdere test voor R. solanacearum negatief was.

Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Gebruik microscoopglaasjes met meerdere venstertjes, bij voorkeur tien venstertjes met een diameter van minstens 6 mm.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

5.1. Prepareer de objectglaasjes volgens een van onderstaande procedures:

i) voor pellets met betrekkelijk weinig zetmeelsediment: Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm — vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van een 1:100-verdunning van de geresuspendeerde aardappelpellet op het eerste venstertje. Pipetteer vervolgens eenzelfde volume onverdunde pellet (1/1) op de resterende venstertjes van de rij. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 1.

ii) voor andere pellets: Maak decimale oplossingen (1:10 en 1:100) van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm — vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van de geresuspendeerde pellet en van elke verdunning op een rij venstertjes. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 2.

5.2. Laat de druppels bij kamertemperatuur of door verwarming tot 40-45 °C drogen. Fixeer de bacteriecellen op het glaasje door het te verwarmen (15 minuten op 60 °C), door het door de vlam te halen, met ethanol 95 % of volgens de specifieke aanwijzingen van de leverancier van de antilichamen.

Zo nodig kunnen de gefixeerde glaasjes hierna bevroren in een doos met droogmiddel bewaard worden voor verder onderzoek (dit mag niet langer dan nodig en hooguit drie maanden duren).

5.3. IF-procedure

i) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 5.1. i): Maak een reeks tweevoudige verdunningen. Het eerste venstertje krijgt een halve titer (T/2) en de volgende een kwart titer (T/4), een halve titer (T/2), een titer (T) en twee titers (2T).

ii) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 5.1. ii): Maak de werkverdunning van het antilichaam aan in IF-buffer. De werkverdunning beïnvloedt de specificiteit.

Figuur 1 Prepareren van het objectglaasje volgens 5.1. i) en 5.3. i)

Verdunningen van geresuspendeerde pellet 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Verdunning van geresuspendeerde pellet (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Tweevoudige verdunningen van antiserum/antilichaam Monster 1 1 2 3 4 5 Duplo van monster 1, of monster 2 6 7 8 9 10





Figuur 2 Prepareren van het objectglaasje volgens 5.1. ii) en 5.3. ii)

Werkverdunning van antiserum/antilichaam 1/1 1/10 1/100 leeg leeg  Decimale verdunning van geresuspendeerde pellet Monster 1 1 2 3 4 5 Duplo van monster 1, of monster 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Leg de glaasjes op vochtig tissuepapier. Bedek alle testvenstertjes volledig met antilichaamverdunning. Het op elk venstertje aangebrachte volume antilichaam moet ten minste gelijk zijn aan het volume aangebracht extract.

Wanneer de leverancier van de antilichamen geen specifieke aanwijzingen heeft verstrekt, moet de volgende procedure worden gevolgd.

5.3.2. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 °C).

5.3.3. Schud de druppels van elk glaasje af en spoel de glaasjes zorgvuldig met IF-buffer. Was door onderdompeling gedurende 5 minuten in IF-buffer-Tween (aanhangsel 4) en vervolgens in IF-buffer. Vermijd aërosolvorming en druppeloverdracht waardoor kruisbesmetting kan optreden. Verwijder overtollig vocht zorgvuldig door zachtjes af te deppen.

5.3.4. Leg de glaasjes op vochtig papier. Bedek alle venstertjes met de verdunning van het FITC-conjugaat die gebruikt werd om de titer te bepalen. Het volume conjugaat op de venstertjes moet identiek zijn aan het volume antilichaam.

5.3.5. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 °C).

5.3.6. Schud de druppels conjugaat van het glaasje af. Spoel af en was als voorheen (5.3.3).

Verwijder overtollig vocht zorgvuldig.

5.3.7. Pipetteer 5-10 µl 0,1 M fosfaatgebufferde glycerol (aanhangsel 4), of een in de handel verkrijgbaar antifading inbedmiddel, op elk venstertje en breng een dekglaasje aan.

5.4. Aflezen van de IF-test

5.4.1 Bekijk de glaasjes met een epifluorescentiemicroscoop die voorzien is van geschikte filters voor excitatie van FITC (olie- of waterimmersie, 500-1 000 ×). Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden.

Onderzoek eerst het positieve controleglaasje. De cellen moeten helder fluorescerend en volledig gekleurd zijn bij de bepaalde antilichaamtiter of werkverdunning. De IF-test (VI.A.5) moet herhaald worden bij afwijkende kleuring.

5.4.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende morfologie (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan die van de positieve controlestam bij dezelfde antilichaamverdunning. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden.

Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes.

5.4.3. Aan de immunofluorescentietest zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden vaak achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën gevonden die qua grootte en morfologie lijken op R. solanacearum.

5.4.4. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie bij de titer of werkverdunning van de antilichamen zoals aangegeven in punt 5.3.

5.4.5. Interpretatie van de IF-test

i) Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 5). De IF-uitslag is positief als het monster ten minste 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat. Het monster wordt als mogelijk besmet aangemerkt en moet nader onderzocht worden.

ii) De IF-test is negatief als het monster minder dan 5 × 103 cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat; het monster wordt als negatief aangemerkt. Verder onderzoek is dan niet nodig.

6. Polymerasekettingreactietest (PCR-test)

Principe

Wanneer de PCR-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningstest isolatie of IF worden gedaan. Wanneer PCR als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

Het wordt aangeraden deze methode alleen algemeen als eerste screeningstest te gebruiken als er voldoende gespecialiseerde ervaring mee is opgedaan.

NB: Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten 103-104 cellen/ml R. solanacearum, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden. Er kunnen optimalisatieproeven nodig zijn om in alle laboratoria een maximale gevoeligheid en specificiteit te bereiken.

Gebruik gevalideerde PCR-reagentia en -protocollen (aanhangsel 6). Kies bij voorkeur een methode met een interne controle.

Neem de nodige voorzorgen om contaminatie van het monster met doel-DNA te vermijden. De PCR-test moet worden uitgevoerd door ervaren analisten in speciale moleculair-biologische laboratoria om de kans op contaminatie met doel-DNA tot een minimum te beperken.

Negatieve controles (bij de DNA-extractie en de PCR-procedures) moeten altijd op dezelfde wijze worden behandeld als de uiteindelijke monsters, om na te gaan of er verontreiniging met DNA is opgetreden.

In de PCR-test moeten de volgende negatieve controles worden meegenomen:

— monsterextract waarbij een eerdere test op R. solanacearum negatief was;

— controles met de buffer die bij de extractie van de bacterie en het DNA uit het monster is gebruikt;

— PCR-reactiemix.

Als positieve controles moeten worden genomen:

— aliquots van geresuspendeerde pellets waaraan R. solanacearum is toegevoegd (voor de bereiding zie aanhangsel 3, onder B);

— een suspensie van 106 cellen/ml van R. solanacearum in water uit een virulent isolaat (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3, onder B);

— gebruik zo mogelijk ook DNA dat is geëxtraheerd uit positieve controlemonsters in de PCR-test.

Om contaminatie te vermijden moeten de positieve controles in een andere ruimte worden bereid dan de analysemonsters.

De monsterextracten moeten zoveel mogelijk vrij van grond zijn. Het kan dus soms raadzaam zijn om extracten uit gewassen aardappelen te bereiden als er PCR-protocollen gebruikt zullen worden.

Zie aanhangsel 3 voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

6.1. DNA-zuiveringsmethoden

Gebruik positieve en negatieve controlemonsters zoals hierboven beschreven (aanhangsel 3).

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

Er zijn diverse methoden beschikbaar voor het zuiveren van doel-DNA uit complexe monstersubstraten, waarbij remmers van de PCR en andere enzymatische reacties worden verwijderd en het doel-DNA in het monsterextract wordt geconcentreerd. De volgende methode is geoptimaliseerd voor gebruik met de gevalideerde PCR-methoden als beschreven in aanhangsel 6.

a) Methode volgens Pastrik (2000)

1) Pipetteer 220 µl lysisbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in een eppendorfbuisje van 1,5 ml.

2) Voeg 100 µl monsterextract toe en zet het buisje 10 minuten in een verwarmingsblok of waterbad op 95 °C.

3) Koel het buisje 5 minuten op ijs.

4) Voeg 80 µl lysozym-voorraadoplossing (50 mg lysozym per ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C.

5) Voeg 220 µl Easy DNA® solution A (Invitrogen) toe, vortex grondig en incubeer 30 minuten bij 65 °C.

6) Voeg 100 µl Easy DNA® solution B (Invitrogen) toe, vortex krachtig tot het neerslag vrij in het buisje beweegt en het monster gelijkmatig viskeus is.

7) Voeg 500 µl chloroform toe en vortex tot de viscositeit afneemt en het mengsel homogeen is.

8) Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 °C om de fasen te scheiden en de interfase te vormen.

9) Breng de bovenste fase over in een schoon eppendorfbuisje.

10) Voeg 1 ml ethanol 100 % (–20 °C) toe, vortex kort en incubeer 10 minuten op ijs.

11) Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 °C en verwijder de ethanol van de pellet.

12) Voeg 500 µl ethanol 80 % (–20 °C) en meng door het buisje om te keren.

13) Centrifugeer 10 minuten bij 15 000 g en 4 °C, bewaar de pellet en verwijder de ethanol.

14) Droog de pellet aan de lucht of in een DNA Speed Vac.

15) Resuspendeer de pellet in 100 µl steriel UPW en laat minstens 20 minuten bij kamertemperatuur staan.

16) Bewaar bij –20 °C voor de PCR.

17) Draai eventueel aanwezig wit neerslag af in een centrifuge en gebruik 5 µl van de bovenstaande vloeistof, die het DNA bevat, voor de PCR.

b) Andere methoden

Er kunnen andere DNA-extractiemethoden (bv. Qiagen DNeasy Plant Kit) worden gebruikt, mits die even doeltreffend blijken te zijn bij het zuiveren van DNA uit controlemonsters met 103-104 pathogene cellen/ml.

6.2. PCR

6.2.1. Bereid analyse- en controletemplates voor de PCR volgens de gevalideerde protocollen (VI.A.6). Bereid een tienvoudige verdunning van monster-DNA-extract (1:10 in UPW).

6.2.2. Bereid de geschikte PCR-reactiemix in een contaminatievrije omgeving volgens de gepubliceerde protocollen (aanhangsel 6). Gebruik zo mogelijk een multiplex-PCR-protocol met interne PCR-controle.

6.2.3. Voeg volgens de PCR-protocollen in steriele PCR-buisjes 2-5 µl DNA-extract toe per 25 µl PCR-reactiemix (aanhangsel 6).

6.2.4. Neem ook een negatief controlemonster mee met alleen PCR-reactiemix; voeg hieraan in plaats van het monster UPW toe uit dezelfde bron als in de PCR-mix is gebruikt.

6.2.5. Zet de buisjes in hetzelfde PCR-apparaat als voor de voorbereidende tests is gebruikt en werk het geoptimaliseerde PCR-programma af (aanhangsel 6).

6.3. Analyse van het PCR-product

6.3.1. Scheid de amplicons met behulp van agarosegelelektroforese. Laat minimaal 12 µl geamplificeerd DNA-reactiemengsel van elk monster, gemengd met 3 µl laadbuffer (aanhangsel 6), lopen in 2,0 % (m/V) agarosegels in TAE-buffer (Tris-acetaat-EDTA, aanhangsel 6) bij 5-8 V/cm. Gebruik een geschikte DNA-marker, bv. 100 bp ladder.

6.3.2. Maak de DNA-banden zichtbaar door kleuring met ethidiumbromide (0,5 mg/l) gedurende 30-60 minuten. Deze stof is mutageen – neem de nodige voorzorgen in acht.

6.3.3. Onderzoek de gekleurde gel door transilluminatie met kortgolvig UV (λ = 302 nm) op geamplificeerde PCR-producten van de verwachte lengte (aanhangsel 6) en leg het resultaat vast.

6.3.4. Ga bij alle nieuwe bevindingen/gevallen na of het PCR-amplicon authentiek is met behulp van een restrictie-enzymanalyse op een monster van het resterende geamplificeerde DNA door dat bij de optimale temperatuur en gedurende de optimale tijd met een geschikt enzym en geschikte buffer (aanhangsel 6) te incuberen. Scheid de verkregen fragmenten met behulp van agarosegelelektroforese zoals hierboven beschreven; bekijk het karakteristieke restrictiefragmentpatroon onder UV-transilluminatie na kleuring met ethidiumbromide en vergelijk dit met de niet-gedigesteerde en de gedigesteerde positieve controle.

Interpretatie van het resultaat van de PCR-test

De PCR-test is negatief als er geen R. solanacearum-specifiek PCR-amplicon van de verwachte lengte wordt aangetroffen in het analysemonster, maar wel in alle positieve controlemonsters (bij multiplex-PCR met plantspecifieke interne controleprimers moet er een tweede PCR-product van de verwachte lengte met het analysemonster geamplificeerd zijn).

De PCR-test is positief als het R. solanacearum-specifieke PCR-amplicon van de verwachte lengte en met het verwachte restrictiepatroon (indien nodig) wordt aangetoond, mits dit niet in een van de negatieve controlemonsters geamplificeerd is. Een positief resultaat kan ook op betrouwbare wijze worden bevestigd door de test met een tweede set PCR-primers te herhalen (aanhangsel 6).

NB: Als het verwachte amplicon wel bij het positieve controlemonster met R. solanacearum in water wordt verkregen, maar niet bij de positieve controles met R. solanacearum in aardappelextract, is remming van de PCR waarschijnlijk de oorzaak. Bij multiplex-PCR-protocollen met interne PCR-controles is er waarschijnlijk sprake van remming als geen van beide amplicons worden verkregen.

Er moet aan contaminatie worden gedacht als het verwachte amplicon in een of meer van de negatieve controles wordt gevonden.

7. Fluorescentie-in-situ-hybridisatietest (FISH-test)

Principe

Wanneer de FISH-test als eerste screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningstest een isolatie- of IF-test worden gedaan. Wanneer de FISH-test als tweede screeningstest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

NB: Gebruik gevalideerde, R. solanacearum-specifieke oligo-probes (aanhangsel 7). Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten minstens 103-104 cellen van R. solanacearum per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden.

De onderstaande procedure wordt bij voorkeur uitgevoerd op vers bereid monsterextract maar kan ook goed worden uitgevoerd op monsterextract dat in glycerol bewaard is tussen –16 en –24 °C of –68 en –86 °C.

Als negatieve controle worden aliquots monsterextract gebruikt waarbij eerdere tests op R. solanacearum negatief waren.

Als positieve controle worden suspensies bereid met 105-106 cellen/ml R. solanacearum biovar 2 (bv. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3) in 0,01 M fosfaatbuffer (PB) van een drie- tot vijfdaagse cultuur. Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van R. solanacearum gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 3, onder B).

Het gebruik van de FITC-gelabelde eubacteriële oligo-probe kan als controle voor het hybridisatieproces dienen, omdat hierdoor alle eubacteriën in het monster gekleurd worden.

Zie aanhangsel 3, onder A, voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

7.1. Fixatie van het aardappelextract

Het volgende protocol is gebaseerd op Wullings e.a. (1998):

7.1.1. Bereid het fixatief (aanhangsel 7).

7.1.2. Pipetteer 100 µl van elk monsterextract in een eppendorfbuisje en centrifugeer 7 minuten bij 7 000 g.

7.1.3. Verwijder de bovenstaande vloeistof en los de pellet op in 200 µl korter dan 24 uur tevoren bereid fixatief. Vortex en incubeer 1 uur in de koelkast.

7.1.4. Centrifugeer 7 minuten bij 7 000 g, schenk de bovenstaande vloeistof af en resuspendeer de pellet in 75 µl 0,01 M PB (aanhangsel 7).

7.1.5. Breng 16 µl van de gefixeerde suspensies op een schoon objectglaasje met venstertjes zoals aangegeven in figuur 7.1. Breng twee verschillende monsters op het glaasje, onverdund en in een 1:100-verdunning (gebruik hiervoor 10 µl in 0,01 M PB). De resterende monsteroplossing (49 µl) kan na toevoeging van eenzelfde volume ethanol 96 % bij –20 °C worden bewaard. Als de FISH-test herhaald moet worden, wordt de ethanol door centrifugeren verwijderd en een gelijk deel 0,01 M PB toegevoegd en door vortexen gemengd.

Figuur 7.1 Overzicht van het FISH-glaasje

Monster 1 Blanco Blanco Blanco Monster 2 venster 1 venster 2 venster 3 venster 4 venster 5 Monster 1 Blanco Blanco Blanco Monster 2 venster 6 venster 7 venster 8 venster 9 venster 10 Dekglaasje 1 Dekglaasje 2

7.1.6. Droog de glaasjes aan de lucht (of op een droger bij 37 °C) en fixeer ze door ze door de vlam te halen.

Op dit punt kan de procedure worden onderbroken om de volgende dag verder te gaan met de hybridisatie. De objectglaasjes moeten stofvrij en droog bij kamertemperatuur worden bewaard.

7.2. Hybridisatie

7.2.1. Dehydrateer de cellen in een ethanolreeks (50 %, 80 %, 96 %, telkens 1 minuut). Droog de glaasjes aan de lucht in een houder.

7.2.2. Maak een vochtige incubatiekamer door de bodem van een luchtdicht vat te bedekken met tissue- of filtreerpapier, doordrenkt met 1× hybmix (aanhangsel 7). Pre-incubeer het vat in de hybridisatieoven gedurende ten minste 10 minuten bij 45 °C.

7.2.3. Breng 10 µl hybridisatieoplossing (aanhangsel 7) aan op acht venstertjes (1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 en 10; figuur 7.1) van elk glaasje en laat de twee middelste venstertjes (3 en 8) blanco.

7.2.4. Leg zonder lucht in te sluiten een dekglaasje (24 × 24 mm) op de eerste en laatste vier venstertjes. Zet de objectglaasjes in de voorverwarmde incubatiekamer en hybridiseer 5 uur in de oven in het donker bij 45 °C.

7.2.5. Bereid drie bekerglazen met 1 l Milli Q (water van moleculair-biologische kwaliteit), 1 l 1X hybmix (334 ml 3× hybmix en 666 ml Milli Q) en 1 l 1/8× hybmix (42 ml 3× hybmix en 958 ml Milli Q). Pre-incubeer elk bekerglas in een waterbad bij 45 °C.

7.2.6. Verwijder de dekglaasjes van de objectglaasjes en doe de objectglaasjes in een houder.

7.2.7. Verwijder de overmaat probe door 15 minuten bij 45 °C te incuberen in het bekerglas met 1X hybmix.

7.2.8. Zet de houder in de 1/8X hybmix (wasoplossing) en incubeer nogmaals 15 minuten.

7.2.9. Dompel de objectglaasjes even in Milli Q en leg ze op filtreerpapier. Verwijder overtollige vloeistof door het oppervlak voorzichtig met filtreerpapier te bedekken. Pipetteer 5-10 μl antifading inbedmiddel (bv. Vectashield van Vecta Laboratories, CA, USA of gelijkwaardig) op elk venstertje en leg een groot dekglaasje (24 × 60 mm) op het objectglaasje.

7.3. Aflezen van de FISH-test

7.3.1. Bekijk de objectglaasjes onmiddellijk met een microscoop die geschikt is voor epifluorescentiemicroscopie bij een vergroting van 630 of 1 000 × en olie-immersie. Met een filter dat geschikt is voor fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) lichten eubacteriële cellen (waaronder de meeste gramnegatieve cellen) in het monster groen op. Met een filter voor tetramethylrodamine-5-isothiocyanaat lichten Cy3-gekleurde cellen van R. solanacearum rood op. Vergelijk de celmorfologie met die van de positieve controles. De cellen moeten helder fluoresceren en volledig gekleurd zijn. Bij afwijkende kleuring moet de FISH-test herhaald worden (VI.A.7). Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden.

7.3.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende morfologie (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan, of beter dan, die van de positieve controlestam. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden.

7.3.3. Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes.

7.3.4. Aan de FISH-test zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden soms, maar veel minder vaak dan bij de IF-test, achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën waargenomen die qua grootte en morfologie lijken op R. solanacearum.

7.3.5. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie.

7.3.6. Interpretatie van het resultaat van de FISH-test

i) De resultaten van de FISH-test zijn valide als in alle positieve controles en in geen van de negatieve controles met het FITC-filter heldergroen fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum karakteristieke grootte en morfologie worden waargenomen en met het rodaminefilter helderrood fluorescerende cellen. Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 4). Monsters met ten minste 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als mogelijk besmet aangemerkt. Er is dan verder onderzoek nodig. Monsters met minder dan 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als negatief aangemerkt.

ii) De FISH-test is negatief als met het rodaminefilter geen helderrood fluorescerende cellen met een voor R. solanacearum kenmerkende grootte en morfologie worden waargenomen, mits die met dat filter wel in de positieve controlepreparaten zijn waargenomen.

8. Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)-tests

Principe

ELISA mag wegens de relatief lage gevoeligheid alleen als facultatieve test naast IF, PCR of FISH worden gebruikt. Bij de DAS-ELISA-test zijn ophoping en monoklonale antilichamen verplicht (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Voorafgaande ophoping van de monsters kan de gevoeligheid van ELISA verhogen, maar dit mislukt soms wegens concurrentie van andere organismen in het monster.

NB: Gebruik gevalideerde antilichamen tegen R. solanacearum (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum met een geschikt conjugaat met het tweede antilichaam overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. Bij het onderzoek moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer van de commerciële formulering.

Bepaal de titer van de antilichamen op een suspensie van 105-106 cellen/ml van de homologe stam van R. solanacearum.

Gebruik als negatieve controle een monsterextract waarbij eerdere tests op R. solanacearum negatief waren en een suspensie van een niet-kruisreagerende bacterie in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).

Gebruik als positieve controle aliquots monsterextract waarbij eerdere tests negatief waren, gemengd met 103-104 cellen/ml van R. solanacearum biovar 2 (bv. stam NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3, onder A en B). Gebruik een standaardsuspensie van 105-106 cellen/ml van R. solanacearum in PBS om de resultaten op elke plaat te vergelijken.

Zie aanhangsel 3, onder A, voor gestandaardiseerd materiaal voor positieve en negatieve controles voor deze test.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

Er zijn twee gevalideerde ELISA-protocollen.

a) Indirecte ELISA (Robinson-Smith e.a. (1995))

1) Gebruik aliquots van 100-200 µl monsterextract. (Soms worden niet-specifieke resultaten gereduceerd door 4 minuten verwarming bij 100 °C in een waterbad of verwarmingsblok.)

2) Voeg een gelijk volume coatingbuffer van dubbele sterkte toe (aanhangsel 4) en vortex.

3) Doe telkens 100 µl in ten minste twee putjes van een microtiterplaat (bv. Nunc-Polysorp of gelijkwaardig) en incubeer 1 uur bij 37 °C of overnacht bij 4 °C.

4) Schud het extract uit de putjes. Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4) en laat de laatste spoelvloeistof minstens 5 minuten in de putjes.

5) Bereid de benodigde verdunning van antilichamen tegen R. solanacearum in blokkeerbuffer (aanhangsel 4). Gebruik de aanbevolen verdunningen voor gevalideerde in de handel verkrijgbare antilichamen (doorgaans tweemaal de titerconcentratie).

6) Doe 100 µl in elk putje en incubeer 1 uur bij 37 °C.

7) Schud de antilichaamoplossing uit de putjes en spoel zoals onder 4.

8) Bereid in blokkeerbuffer de benodigde verdunning conjugaat (tweede antilichaam met alkalische fosfatase). Doe 100 µl in elk putje en incubeer 1 uur bij 37 °C.

9) Schud het conjugaat uit de putjes en spoel als onder 4.

10) Doe 100 µl oplossing van alkalischefosfatasesubstraat (aanhangsel 4) in elk putje. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en lees gedurende 90 minuten periodiek de extinctie bij 405 nm af.

b) DASI (Double-Antibody Sandwich Indirect)-ELISA

1) Bereid de benodigde verdunning van polyklonale immunoglobulines tegen R. solanacearum in coatingbuffer (pH 9,6) (aanhangsel 4). Doe 200 µl in elk putje. Incubeer 4-5 uur bij 37 °C of 16 uur bij 4 °C.

2) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4). Doe in ten minste twee putjes 190 µl monsterextract. Doe in telkens twee putjes per plaat ook een positieve en een negatieve controle. Incubeer 16 uur bij 4 °C.

3) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).

4) Bereid een geschikte verdunning van specifieke monoklonale antilichamen tegen R. solanacearum in PBS (aanhangsel 4) met 0,5 % bovien serumalbumine (BSA) en doe 190 µl in elk putje. Incubeer 2 uur bij 37 °C.

5) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).

6) Bereid een geschikte verdunning van conjugaat van anti-muis-immunoglobulines met alkalische fosfatase in PBS. Doe 190 µl in elk putje. Incubeer 2 uur bij 37 °C.

7) Spoel de putjes drie keer met PBS-Tween (aanhangsel 4).

8) Bereid een oplossing van alkalischefosfatasesubstraat met 1 mg p-nitrofenylfosfaat per ml substraatbuffer (aanhangsel 4). Doe 200 µl in elk putje. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur en lees gedurende 90 minuten periodiek de extinctie bij 40 nm af.

Interpretatie van de ELISA-testresultaten

De ELISA-test is negatief als de gemiddelde optische dichtheid (OD) in de duplomonsterputjes kleiner is dan 2 × OD in het putje met de negatieve monsterextractcontrole, mits de OD voor de positieve controles altijd groter is dan 1,0 (na 90 minuten incubatie met substraat) en groter is dan 2 × OD voor de negatieve monsterextracten.

De ELISA-test is positief als de gemiddelde OD in de duplomonsterputjes groter is dan 2 × OD voor het negatieve monsterextract, mits de OD in elk putje voor negatieve controle kleiner is dan 2 × OD voor de positieve controles.

Negatieve ELISA-aflezingen in putjes voor positieve controle wijzen op een slechte uitvoering of op remming van de test. Positieve ELISA-aflezingen in putjes voor negatieve controle wijzen op kruisbesmetting of niet-specifieke antilichaambinding.

9. Bioassay

NB: Bij de voorbereidende tests met deze methode moeten 103-104 kolonievormende eenheden R. solanacearum per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden (voor de bereiding zie aanhangsel 3).

De grootste detectiegevoeligheid wordt verkregen met vers bereid monsterextract en optimale groeicondities. De methode kan echter ook goed worden toegepast op extracten die tussen –68 en –86 °C in glycerol zijn bewaard.

Het volgende protocol is gebaseerd op Janse (1988).

9.1. Neem voor elk monster tien testplanten van een vatbaar tomatenras (bv. Moneymaker of een door het testlaboratorium even vatbaar bevonden ras) in het volgroeid 3-bladstadium. Voor nadere bijzonderheden over de teelt zie aanhangsel 8. Aubergines (bv. Black Beauty of een even vatbaar ras) in het 2- tot volgroeid 3-bladstadium kunnen ook worden gebruikt. De symptomen zijn bij aubergines minder ernstig en ontwikkelen zich trager. Gebruik daarom zo mogelijk tomatenplanten.

Verdeel 100 µl monsterextract over de testplanten.

9.2.1. Injectie-inoculatie

Inoculeer de stengels net boven de zaadlobben met een injectiespuit voorzien van een hypodermische naald (minimaal 23G). Verdeel het monster over de testplanten.

9.2.2. Snede-inoculatie

Houd de plant tussen twee vingers en pipetteer een druppel (5-10 µl) gesuspendeerde pellet op de stengel tussen de zaadlobben en het eerste blad.

Maak met een steriel scalpel vanaf de pelletdruppel een diagonale snede van ongeveer 1,0 cm lang en ongeveer 2/3 van de stengeldikte diep.

Stop de snede dicht met steriele vaseline uit een injectiespuit.

9.3. Inoculeer met dezelfde techniek vijf zaailingen met een waterige suspensie van 105-106 cellen/ml, bereid uit een 48 uur oude kweek van een virulente stam van R. solanacearum biovar 2 als positieve controle en met pelletbuffer (aanhangsel 4) als negatieve controle. Houd de positieve en negatieve controleplanten gescheiden van de andere om kruisbesmetting te vermijden.

9.4. Teelt de testplanten maximaal vier weken in quarantaine bij 25-30 °C en hoge luchtvochtigheid met aangepaste bewatering zodat geen oververzadiging of verwelking optreedt. Incubeer positieve en negatieve controleplanten op van elkaar gescheiden plaatsen in een broeikas of groeikamer om contaminatie te vermijden; is dat wegens ruimtegebrek niet mogelijk, zorg er dan voor dat de verschillende behandelingen strikt gescheiden gehouden worden. Als planten voor verschillende monsters dicht bij elkaar geïncubeerd moeten worden, moeten ze met geschikte schermen gescheiden gehouden worden. Bij het bemesten, bewateren en onderzoeken en bij alle overige handelingen moet de uiterste zorg in acht genomen worden om kruisbesmetting te vermijden. De kassen en groeikamers moeten absoluut vrij van insecten gehouden worden, aangezien die de bacterie van het ene monster naar het andere kunnen overbrengen.

Let op symptomen van verwelking, epinastie, chlorose en/of verminderde groei.

9.5. Isoleer reinculturen die vermoedelijk uit R. solanacearum bestaan uit geïnfecteerde planten (II.3) en identificeer ze (VI. B).

9.6. Als na drie weken geen symptomen zijn waargenomen, voer dan een IF-, PCR- of isolatietest uit op een samengesteld monster van stengeldelen van 1 cm lang van elke testplant, die boven de inoculatieplaats zijn afgesneden. Als de test positief is, verdunnen en uitplaten (4.1).

9.7. Identificeer eventuele reinculturen die vermoedelijk uit R. solanacearum bestaan (VI. B).

Interpretatie van het resultaat van de bioassay

De met de bioassay verkregen resultaten zijn valide als de planten van de positieve controle karakteristieke symptomen vertonen, de bacteriën weer uit deze planten geïsoleerd kunnen worden en op de negatieve controles geen symptomen worden gevonden.

De bioassay is negatief als de testplanten niet met R. solanacearum geïnfecteerd zijn, mits R. solanacearum in de positieve controles wel wordt gedetecteerd.

De bioassay is positief als de testplanten wel met R. solanacearum geïnfecteerd zijn.

B. IDENTIFICATIETESTS

Identificeer reinculturen van vermoedelijke R. solanacearum-isolaten aan de hand van ten minste twee van de volgende, op verschillende biologische principes gebaseerde tests.

Voorzover van toepassing moet elke test ook worden uitgevoerd op bekende referentiestammen (aanhangsel 3).

1. Voedingstests en enzymatische identificatietests

Bepaal de volgende fenotypische eigenschappen, die universeel aan- dan wel afwezig zijn in R. solanacearum, volgens de methoden van Lelliott en Stead (1987), Klement e.a. (1990) en Schaad (2001):

Test Verwacht resultaat vorming van fluorescerend pigment – poly-β-hydroxybutyraatkorrels + oxidatie/fermentatietest (O/F) O+/F– katalaseactiviteit + oxidasetest van Kovac + nitraatreductie + citraatassimilatie + groei bij 40 °C – groei in NaCl 1 % + groei in NaCl 2 % – argininedihydrolaseactiviteit – gelatineafbraak – zetmeelhydrolyse – esculinehydrolyse – levanvorming –

2. IF-test

2.1. Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in IF-buffer (aanhangsel 4).

2.2. Bereid een tweevoudige verdunningsreeks van een geschikt antiserum (zie website http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Pas de IF-procedure toe (VI.A.5).

2.4. De IF-test is positief als de IF-titer van de kweek gelijkwaardig is aan die van de positieve controle.

3. ELISA-test

NB: Als naast deze test slechts één andere identificatietest wordt uitgevoerd, mag dat geen serologische test zijn.

3.1. Bereid een suspensie van ongeveer 108 cellen/ml in 1X PBS (aanhangsel 4).

3.2. Voer een geschikte ELISA-procedure uit met een specifiek monoklonaal antilichaam tegen R. solanacearum.

3.3. De ELISA-test is positief als de ELISA-aflezing voor de cultuur ten minste de helft van die voor de positieve controle bedraagt.

4. PCR-tests

4.1. Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in steriel water van moleculair-biologische kwaliteit.

4.2. Verwarm 100 µl van de celsuspensie 4 minuten in gesloten buisjes in een verwarmingsblok of waterbad bij 100 °C. Hierna kunnen de monsters bij –16 tot –24 °C worden opgeslagen tot zij nodig zijn.

4.3. Pas geschikte PCR-procedures toe voor de amplificatie van voor R. solanacearum specifieke amplicons (bv. Seal e.a. (1993), Pastrik en Maiss (2000), Pastrik e.a. (2002), Boudazin e.a. (1999), Opina e.a. (1997), Weller e.a. (1999)).

4.4. De identificatie van R. solanacearum is positief als de PCR-amplicons van dezelfde lengte zijn en dezelfde restrictiefragmentlengtepolymorfismen hebben als bij de positieve controlestam.

5. FISH-test

5.1. Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in UPW.

5.2. Voer de FISH-procedure uit (VI.A.7) met ten minste twee R. solanacearum-specifieke oligo-probes (aanhangsel 7).

5.3. De FISH-test is positief als de kweek en de positieve controle dezelfde reacties vertonen.

6. Vetzuurprofiel (FAP)

6.1. Laat de kweek 48 uur bij 28 °C groeien op trypticasesoja-agar (Oxoid).

6.2. Voer een geschikte FAP-procedure uit (Janse (1991), Stead (1992)).

6.3. De FAP-test is positief als het profiel van de vermoedelijke cultuur identiek is aan dat van de positieve controle. De aanwezigheid van kenmerkende vetzuren (14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH en 18:1 2OH) en de afwezigheid van 16:0 3OH wijzen sterk op Ralstonia sp.

7. Stamkarakterisatie

Voor elke nieuwe isolatie van R. solanacearum wordt stamkarakterisatie met een van de volgende methoden aanbevolen.

Voorzover van toepassing moet elke test ook worden uitgevoerd op bekende referentiestammen (aanhangsel 3).

7.1. Biovarbepaling

R. solanacearum wordt ingedeeld in biovars op basis van het vermogen drie disachariden en twee hexosealcoholen te assimileren of oxideren (Hayward (1964), Hayward e.a. (1990)). Het kweekmedium voor de biovartest staat in aanhangsel 2. Voer de test uit door steekenting van het medium met reinculturen van isolaten van R. solanacearum en incubatie bij 28 °C. Breng het medium over op steriele platen met 96 putjes (200 µl per putje). De test is positief bij een verkleuring van olijfgroen naar geel binnen 72 uur.

Biovar 1 2 3 4 5 Assimilatie van: maltose – + + – + lactose – + + – + d(+)-cellobiose – + + – + mannitol – – + + + sorbitol – – + + – dulcitol – – + + –

Subfenotypen van biovar 2 worden met aanvullende tests onderscheiden:

Biovar 2A (wereldwijd) Biovar 2A (in Chili en Colombia) Biovar 2T (tropen) Trehaloseassimilatie – + + meso-Inositolassimilatie + – + d-Riboseassimilatie – – + Pectolytische activiteit (1) laag laag hoog

7.2. Genetische vingerafdruk

Er zijn diverse technieken voor moleculaire differentiatie van stammen van R. solanacearum, waaronder:

7.2.1. RFLP-analyse (restriction fragment length polymorphism, polymorfisme van de lengte van restrictiefragmenten) (Cook e.a. (1989));

7.2.2. PCR van repetitieve DNA-sequenties met REP-, BOX- en ERIC-primers (Louws e.a. (1995), Smith e.a. (1995));

7.2.3. AFLP-analyse (amplified fragment length polymorphism, polymorfisme van de lengte van geamplificeerde fragmenten) (Van der Wolf e.a. (1998)).

7.3. PCR-methoden

Specifieke PCR-primers (Pastrik e.a. (2002), zie aanhangsel 6) kunnen worden gebruikt om een onderscheid te maken tussen stammen van groep 1 (biovars 3, 4, 5) en 2 (biovars 1, 2A, 2T) van R. solanacearum, zoals oorspronkelijk bepaald met RFLP-analyse (Cook e.a. (1989)) en analyse van de 16S-rDNA-sequentie (Taghavi e.a. (1996)).

C. BEVESTIGINGSTEST

De pathogeniteitstest moet worden uitgevoerd voor de definitieve bevestiging van een diagnose van R. solanacearum en voor de bepaling van de virulentie van culturen die als R. solanacearum geïdentificeerd zijn.

1) Bereid een inoculum van ongeveer 106 cellen/ml van een 24-48 uur oude kweek van het te testen isolaat en van een geschikte positieve controlestam van R. solanacearum (bv. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; aanhangsel 3).

2) Inoculeer vijf à tien vatbare tomaten- of aubergineplanten in het volgroeid 3-bladstadium (VI.A.9).

3) Incubeer maximaal twee weken bij 25-28 °C en hoge luchtvochtigheid met aangepaste bewatering om oververzadiging en droogtestress te voorkomen. Met reinculturen treedt binnen 14 dagen een typische verwelking op. Als er dan nog geen symptomen zijn, kan niet worden bevestigd dat het om een pathogene vorm van R. solanacearum gaat.

4) Let op symptomen van verwelking, epinastie, chlorose en verminderde groei.