8)

In deel B worden de volgende hoofdstukken toegevoegd: „B.63 REPRODUCTIE-/ONTWIKKELINGSTOXICITEIT, SCREENINGTEST INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 421 (2016) van de OESO. OESO-richtlijnen voor het testen van chemische stoffen worden periodiek in het licht van de wetenschappelijke vorderingen getoetst. De oorspronkelijke screeningtestrichtlijn 421 werd vastgesteld in 1995 op basis van een protocol voor een voorbereidende screeningtest voor reproductietoxiciteit (Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test) die was besproken op twee bijeenkomsten van deskundigen, in 1990 in Londen (1) en in 1992 in Tokio (2). 2. Deze testmethode is bijgewerkt met eindpunten die relevant zijn voor hormoonontregelaars, naar aanleiding van de prioritaire actie die de OESO in 1998 is gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (3). Zo werd OESO TG 407 (toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen), hoofdstuk B.7 van deze bijlage) in 2008 uitgebreid door er geschikte parameters in op te nemen om de endocriene werking van teststoffen vast te kunnen stellen. Met de bijwerking van TG 421 werd beoogd om in screeningtestrichtlijnen een aantal voor hormoonontregelaars relevante eindpunten op te nemen, waarbij de blootstellingsperioden bepaalde gevoelige perioden in de ontwikkeling (prenatale en vroeg-postnatale perioden) beslaan. 3. De aanvullende, voor hormoonontregelaars relevante eindpunten die werden geselecteerd en die ook deel uitmaken van TG 443 (uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie, hoofdstuk B.56 van deze bijlage), werden in TG 421 opgenomen op basis van een haalbaarheidsstudie waarin wetenschappelijke en technische vragen met betrekking tot de opname ervan werden onderzocht, alsook aanpassingen van de testopzet die eventueel voor de opname ervan noodzakelijk zouden zijn (4). 4. Deze testmethode is ontworpen voor het verkrijgen van beperkte informatie over de effecten van een teststof op het mannelijke en vrouwelijke voortplantingsvermogen, zoals de gonadale functie, paringsgedrag, conceptie, ontwikkeling van de vrucht en geboorte. Deze testmethode is geen alternatief noch een vervanging voor de bestaande testmethoden B.31, B.34, B.35 of B.56. INLEIDENDE OVERWEGINGEN 5. Deze screeningtestmethode kan worden gebruikt om oriënterende gegevens te verkrijgen over mogelijke effecten op de voortplanting en/of ontwikkeling, hetzij in een vroeg stadium van de beoordeling van de toxicologische eigenschappen van chemische stoffen, hetzij voor chemische stoffen waarbij dergelijke effecten worden vermoed. De methode kan ook worden gebruikt als deel van een reeks initiële screeningtests voor bestaande chemische stoffen waarvoor weinig of geen toxicologische gegevens beschikbaar zijn, als bereikbepalingsonderzoek voor uitvoeriger onderzoeken naar reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, of wanneer het gebruik ervan anderszins relevant wordt geacht. Bij het uitvoeren van het onderzoek moeten de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad nr. 19 over het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische verschijnselen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (5). 6. Deze testmethode verschaft geen volledige informatie over alle aspecten van reproductie en ontwikkeling. Met name voor het detecteren van postnatale gevolgen van prenatale blootstelling of effecten die tijdens postnatale blootstelling zijn veroorzaakt, is de informatie die deze methode oplevert slechts beperkt. Als gevolg van (onder andere) het betrekkelijk kleine aantal dieren in de dosisgroepen, de selectiviteit van de eindpunten en de korte onderzoeksduur, kan met deze methode geen bewijs worden verkregen om definitief te concluderen dat een stof geen effecten veroorzaakt. Als er verder geen gegevens zijn uit andere tests op reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, zijn positieve resultaten evenwel nuttig voor een eerste gevarenbeoordeling en kunnen ze als basis dienen voor beslissingen over de noodzaak en timing van aanvullende tests. 7. De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen (6). In dit conceptueel kader is de uitgebreide TG 421 van de OESO ondergebracht in niveau 4 als eenin-vivobepaling waarmee gegevens kunnen worden verkregen over schadelijke effecten op eindpunten die relevant zijn voor het endocrien systeem. Een endocrien signaal hoeft op zichzelf echter niet als voldoende bewijs te worden beschouwd dat de teststof een hormoonontregelaar is. 8. Bij deze testmethode wordt aangenomen dat de teststof oraal wordt toegediend. Als andere blootstellingsroutes worden gebruikt, moet de methode mogelijk worden aangepast. 9. Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is. 10. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 11. De teststof wordt in geleidelijk oplopende doseringen aan verschillende groepen mannetjes en vrouwtjes toegediend. De mannetjes moeten ten minste vier weken lang de teststof toegediend krijgen, tot en met de dag voordat ze worden gedood (inclusief twee weken voorafgaand aan het paren, tijdens de paringsperiode en ongeveer twee weken na het paren). Gezien de beperkte doseringsperiode vóór paring, is de vruchtbaarheid mogelijk geen bijzonder gevoelige indicator voor testiculaire toxiciteit. Een uitvoerig histologisch onderzoek van de testes is daarom noodzakelijk. De combinatie van een twee weken durende doseringsperiode voor het paren, gevolgd door waarnemingen op het gebied van paring/vruchtbaarheid, met een totale doseringsperiode van ten minste vier weken gevolgd door een uitvoerige histopathologie van de mannelijke geslachtsklieren, wordt voldoende geacht om het merendeel van de effecten op de mannelijke vruchtbaarheid en de spermatogenese te kunnen detecteren. 12. De vrouwtjes moeten het hele onderzoek lang de teststof toegediend krijgen. Dit betekent twee weken voorafgaand aan het paren (zodat het onderzoek ten minste twee volledige oestruscycli omvat), de variabele tijd tot conceptie, de duur van de dracht en ten minste dertien dagen na het werpen, tot en met de dag voordat ze worden gedood. 13. De duur van het onderzoek, na acclimatisering en beoordeling van de oestruscyclus voorafgaand aan de behandeling, is afhankelijk van het gedrag van het vrouwtje en beloopt ongeveer 63 dagen (ten minste 14 dagen vóór het paren, (tot) 14 dagen paring, 22 dagen dracht, en ten slotte een zoogperiode van 13 dagen). 14. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens de testperiode sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van de test nog in leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Keuze van de diersoort 15. Deze testmethode is ontworpen om te worden toegepast met ratten. Indien de in deze testmethode gespecificeerde parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uitvoerig worden gemotiveerd. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars in OESO TG 407 (die overeenkomt met hoofdstuk B.7 van deze bijlage) zijn alleen ratten gebruikt. Stammen met een lage vruchtbaarheid of waarvan bekend is dat er vaak ontwikkelingsstoornissen optreden, mogen niet worden gebruikt. Er moet gebruikgemaakt worden van gezonde dieren die nog niet eerder gepaard hebben en nog niet eerder aan experimenten zijn onderworpen. Van de proefdieren moeten soort, stam, geslacht, gewicht en leeftijd bekend zijn. Per geslacht mag bij aanvang van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Wanneer het onderzoek wordt uitgevoerd als voorstudie voor een onderzoek van langere duur of een onderzoek over een volledige generatie, verdient het de voorkeur dat de dieren in beide onderzoeken tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben. Huisvesting en voeding 16. Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °) zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % zijn en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. 17. De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; de dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden ondergebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Drachtige vrouwtjes moeten in aparte kooien worden ondergebracht en nestmateriaal krijgen. Zogende vrouwtjes moeten samen met hun jongen in aparte kooien worden ondergebracht. 18. Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afgerond. Voorbereiding van de dieren 19. Gezonde jonge volwassen dieren worden aselect ingedeeld in de controle- en behandelgroepen. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven, voordat de test begint, minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Voorbereiding van de doses 20. Aanbevolen wordt om de teststof oraal toe te dienen, tenzij andere toedieningswegen geschikter worden geacht. Wanneer voor de orale weg wordt gekozen, wordt de teststof gewoonlijk via een sonde toegediend; als alternatieve mogelijkheid kunnen teststoffen echter ook via het voer of het drinkwater worden toegediend. 21. Waar nodig wordt de teststof in een geschikt vehiculum opgelost of gesuspendeerd. Aanbevolen wordt eerst na te gaan of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/emulsie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel andere vehicula. Wanneer een ander vehiculum dan water wordt gebruikt, moeten de toxische kenmerken daarvan bekend zijn. Voorts moeten de stabiliteit en homogeniteit van de teststof in het vehiculum worden bepaald. PROCEDURE Aantal en geslacht van de dieren 22. Aanbevolen wordt dat elke groep aan het begin van de test ten minste 10 mannetjes en 12-13 vrouwtjes telt. Bij de vrouwtjes wordt vóór blootstelling de oestruscyclus beoordeeld. Dieren die geen normale 4-5-daagse cyclus hebben, worden niet het onderzoek opgenomen. Daarom wordt aanbevolen met extra vrouwtjes te beginnen om uiteindelijk op 10 vrouwtjes per groep uit te komen. Behalve in geval van duidelijke toxische effecten wordt verwacht dat dit ten minste 8 drachtige vrouwtjes per groep zal opleveren, hetgeen normaal gesproken het minimaal aanvaardbare aantal drachtige vrouwtjes per groep is. Het doel is voldoende drachten en nakomelingen tot stand te brengen om een betekenisvolle evaluatie mogelijk te maken van de mogelijke invloed van de stof op de vruchtbaarheid, de dracht en het gedrag van moeder en jongen, en op de groei en ontwikkeling van de F 1 -nakomelingen, vanaf de conceptie tot dag 13 na het werpen. Dosering 23. In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist. De dosisniveaus kunnen worden gebaseerd op informatie uit acute-toxiciteitstests of op de resultaten van onderzoeken bij herhaalde toediening. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een vehiculum gebruik wordt gemaakt, moet dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend worden. 24. De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica. Er moet ook rekening mee gehouden worden dat er verschillen kunnen zijn in gevoeligheid tussen drachtige en niet-drachtige dieren. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of ernstig lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (No-Observed Adverse Effect Level, NOAEL) aan te tonen. Intervallen van een factor twee of vier zijn vaak optimaal om de dalende dosisniveaus vast te stellen en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor 10) tussen de doseringen te gebruiken. 25. Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op hormoongevoelige eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd. Limiettest 26. Als volgens de hier beschreven procedures een onderzoek met orale toediening wordt uitgevoerd met één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag of, in het geval van toediening via het voer of het drinkwater, het equivalente percentage in het voer of het drinkwater, en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledige test met meerdere dosisniveaus te doen. De limiettest is bruikbaar, behalve wanneer vanwege de verwachte blootstelling van de mens een hogere orale dosis nodig wordt geacht. Voor andere toedieningsvormen, zoals inhalatie of toediening op de huid, zal de maximaal haalbare concentratie vaak worden bepaald door de fysisch-chemische eigenschappen van de teststoffen. Toediening van de doses 27. De dieren krijgen de teststof 7 dagen per week dagelijks toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Afgezien van irriterende of bijtende teststoffen die normaliter bij hogere concentraties ergere effecten vertonen, moet de variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt gewaarborgd. 28. Het is belangrijk dat er bij een teststof die via het voer of het drinkwater wordt toegediend, voor wordt gezorgd dat de hoeveelheden teststof de normale voer- of waterbalans niet verstoren. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; daarbij moet worden aangegeven welk alternatief is gebruikt. Wanneer de teststof met een sonde wordt toegediend, moeten de doses dagelijks op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten ten minste wekelijks worden aangepast om een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier te verkrijgen. Proefopzet 29. Voor beide geslachten moet de toediening ten minste 2 weken voor het paren beginnen, nadat de dieren ten minste vijf dagen lang zijn geacclimatiseerd en de vrouwtjes gescreend zijn op normale oestruscycli (in een voorbehandelingsperiode van 2 weken). Het onderzoek moet zodanig worden ingepland dat de beoordeling van de oestruscyclus begint kort nadat de dieren volledig geslachtsrijp zijn. Dit kan enigszins variëren voor verschillende rattenstammen in verschillende laboratoria, bv. voor Sprague Dawley-ratten op een leeftijd van 10 weken, voor Wistar-ratten op een leeftijd van ongeveer 12 weken. Moederdieren met jongen moeten op dag 13 na het werpen worden gedood of kort daarna. De dag van de geboorte (d.w.z. wanneer het werpen is voltooid) wordt gedefinieerd als dag 0 na het werpen. Vrouwtjes die geen tekenen van copulatie vertonen, worden 24-26 dagen na de laatste dag van de paringsperiode gedood. Voor beide geslachten wordt de toediening gedurende de paringsperiode voortgezet. Daarna moeten de mannetjes de teststof ten minste nog toegediend krijgen tot de minimale totale doseringsperiode van 28 dagen is afgerond. Vervolgens worden ze gedood of, anders, in leven gehouden en verder behandeld voor een eventuele tweede paring. 30. De dagelijkse toediening aan de moederdieren moet doorgaan gedurende de dracht en ten minste tot en met dag 13 na het werpen of de dag voordat ze gedood worden. Voor onderzoeken waarbij de toediening van de teststof door middel van inhalatie of dermaal plaatsvindt, moet deze ten minste worden voortgezet tot en met dag 19 van de dracht en zo spoedig mogelijk en niet later dan postnatale dag (PND) 4 worden hervat. 31. In aanhangsel 2 wordt de proefopzet in een diagram weergegeven. De paringsprocedure 32. Normaal gesproken moet men voor dit onderzoek één mannetje met één vrouwtje (1:1) laten paren. Hierop zijn uitzonderingen mogelijk in geval van incidentele sterfte van mannetjes. Het vrouwtje moet bij hetzelfde mannetje worden geplaatst totdat aanwijzingen voor copulatie zijn waargenomen of er twee weken zijn verstreken. Elke ochtend worden de vrouwtjes onderzocht op de aanwezigheid van sperma of vaginale plug. Dag 0 van de dracht wordt gedefinieerd als de dag waarop aanwijzingen voor paring worden bevestigd (observatie van een vaginale plug en/of sperma). Wanneer het paren geen succes heeft, kan worden overwogen de vrouwtjes opnieuw te laten dekken door mannetjes van dezelfde groep waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond. Nestgrootte 33. Op PND 4 kan de grootte van de nesten worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie, zodat elk nest uiteindelijk zoveel mogelijk bestaat uit vier of vijf jongen per geslacht, afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam. Bij twee van de overtollige jongen moeten bloedmonsters worden afgenomen, gepoold en gebruikt ter bepaling van de serumspiegels van T4. Selectieve eliminatie van jongen, bijvoorbeeld op grond van lichaamsgewicht of anogenitale afstand (AGD), is niet gepast. Als het door het aantal mannelijke of vrouwelijke jongen niet mogelijk is om op vier of vijf per geslacht per nest uit te komen, is gedeeltelijke aanpassing (bv. zes mannetjes en vier vrouwtjes) aanvaardbaar. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de streefgrootte (8 of 10 jongen/nest) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de streefgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4. 34. Als de nestgrootte niet wordt aangepast, worden er op PND 4 twee jongen per nest gedood en worden er bloedmonsters genomen voor het meten van de serumspiegels van schildklierhormonen. De twee jongen per nest moeten zo mogelijk vrouwelijke jongen zijn om de mannelijke jongen te bewaren voor de beoordeling van de tepelretentie, tenzij er na verwijdering van deze jongen geen enkel vrouwtje meer overblijft voor de beoordeling aan het einde van het onderzoek. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de 8 of 10 jongen/nest (afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de normale nestgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4. Waarnemingen bij levende dieren Klinische waarnemingen 35. Gedurende de hele testperiode moeten er minstens eenmaal per dag, en vaker als er tekenen van toxiciteit worden waargenomen, algemene klinische waarnemingen worden verricht. Deze moet bij voorkeur elke dag op dezelfde tijd(en) plaatsvinden, rekening houdend met de piekperiode voor de verwachte effecten na de toediening. Met de teststof samenhangende veranderingen in het gedrag, tekenen van een moeilijke of langdurige worp en alle tekenen van toxiciteit, inclusief sterfte, moeten worden vastgelegd, met inbegrip van de aanvang, de ernst en de duur van de toxiciteitsverschijnselen. Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water 36. De mannetjes en vrouwtjes moeten worden gewogen op de eerste dag dat zij de teststof krijgen toegediend, vervolgens ten minste eenmaal per week en aan het einde van het onderzoek. De vrouwtjes moeten worden gewogen op de dagen 0, 7, 14 en 20 tijdens de dracht, binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op de dagen 4 en 13 na het werpen. Deze waarnemingen worden voor elk volwassen dier apart gerapporteerd. 37. Vóór het paren, tijdens de dracht en tijdens het zogen, moet ten minste wekelijks de voerconsumptie worden gemeten. Tijdens de paringsperiode is deze meting facultatief. Wanneer de teststof via het drinkwater wordt toegediend, moet ook de waterconsumptie gedurende deze perioden worden gemeten. Oestruscycli 38. Voordat de behandeling begint, moeten de oestruscycli worden gecontroleerd om te selecteren op vrouwelijke proefdieren met regelmatige cycli (zie punt 22). Ook moeten er van het begin van de behandelingsperiode totdat paring is gebleken, dagelijks vaginale uitstrijkjes worden onderzocht. Indien vermoed wordt dat effecten van acute stress bij het begin van de behandeling de oestruscyclus zouden kunnen verstoren, kunnen de laboratoria de proefdieren gedurende 2 weken blootstellen en vervolgens ten minste 2 weken lang dagelijks vaginale uitstrijkjes nemen ter controle van de oestruscycli gedurende de periode vóór paring tot in de paringsperiode, totdat paring gebleken is. Wanneer monsters van vaginale/cervicale cellen worden genomen, moet erop worden gelet verstoring van het slijmvlies, die tot schijndracht kan leiden, te voorkomen (7) (8). Parameters met betrekking tot de nakomelingen 39. De drachttijd moet worden geregistreerd en wordt berekend vanaf dag 0 van de dracht. Elke worp moet zo spoedig mogelijk na de geboorte worden onderzocht, teneinde het aantal en geslacht van de jongen vast te stellen, alsmede het aantal doodgeborenen, levendgeborenen, ondermaatse jongen (jongen die aanmerkelijk kleiner zijn dan de corresponderende controlejongen) en de aanwezigheid van macroscopisch zichtbare afwijkingen. 40. Levende jongen moeten worden geteld en gesekst en de nesten moeten binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op de dagen 4 en 13 na het werpen worden gewogen. Naast de in punt 35 beschreven waarnemingen moet elk afwijkend gedrag van de nakomelingen worden geregistreerd. 41. De AGD van elk jong moet worden gemeten op dezelfde postnatale dag tussen postnatale dag 0 en het einde van postnatale dag 4. Het lichaamsgewicht van elk jong moet worden bepaald op de dag dat de AGD wordt gemeten en de AGD moet genormaliseerd worden tot een maat voor jonggrootte, bij voorkeur de derdemachtswortel van het lichaamsgewicht (9). Het aantal tepels/tepelhoven bij mannelijke jongen moet worden geteld op postnatale dag 12 of 13, zoals aanbevolen in OESO-leidraad 151 (10). Klinische biochemie 42. Er worden bloedmonsters genomen van een gedefinieerde plaats op basis van het volgende schema: — van ten minste twee jongen per nest op PND 4 als het aantal jongen dit toelaat (zie de punten 33-34); — van alle moederdieren en ten minste twee jongen per nest op het tijdstip van doden op dag 13, en — van alle volwassen mannetjes op het tijdstip van doden. Alle bloedmonsters worden onder passende omstandigheden bewaard. In de bloedmonsters van de jongen op dag 13 en de volwassen mannetjes worden de serumspiegels van schildklierhormonen (T4) bepaald. Een verdere bepaling van T4 in bloedmonsters van moederdieren en jongen op dag 4 wordt verricht indien relevant. Eventueel kunnen ook andere hormonen worden gemeten indien relevant. Voor de schildklierhormoonanalyse kan bloed van jongen per nest gepoold worden. De schildklierhormonen (T4 en TSH) worden bij voorkeur als „totaal” gemeten. 43. De volgende factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concentraties van de hormoonbepalingen: — tijdstip waarop de dieren worden gedood, vanwege de schommelingen in de hormoonconcentraties gedurende de dag; — wijze waarop de dieren worden gedood: onnodige stress bij de dieren, waardoor de hormoonconcentraties kunnen worden beïnvloed, moet worden voorkomen; — testkits voor hormoonbepalingen, die verschillende standaardkrommen kunnen hebben. 44. Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kunnen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hormoonconcentraties. Pathologie Macroscopische obductie 45. Op het tijdstip waarop ze worden gedood of tijdens het onderzoek sterven, worden de dieren macroscopisch onderzocht op afwijkingen of pathologische veranderingen. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan de organen van het voortplantingssysteem. Het aantal implantatieplaatsen moet worden geregistreerd. In de ochtend van de dag van obductie moeten er vaginale uitstrijkjes onderzocht worden om de fase van de oestruscyclus te bepalen en deze in verband te kunnen brengen met de histopathologie van de eierstokken. 46. De testes en epididymides, evenals de prostaat en de zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel van alle volwassen mannetjes moeten zo nodig worden ontdaan van aanhechtend weefsel en zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Optionele organen die eventueel ook gewogen kunnen worden, zijn onder meer het m levator ani plus bulbocavernosuscomplex, de Cowperse klieren en de glans penis bij mannetjes en de gepaarde ovaria (nat gewicht) en uterus (inclusief cervix) bij vrouwtjes; indien deze gewichten worden meegenomen, moeten ze zo snel mogelijk na de sectie worden opgenomen. 47. Dode jongen en jongen die op dag 13 na het werpen, of kort daarna, zijn gedood, moeten in elk geval uitwendig zorgvuldig worden onderzocht op macroscopisch zichtbare afwijkingen. Daarbij wordt met name gelet op de uitwendige voortplantingsorganen, die op tekenen van een afwijkende ontwikkeling worden onderzocht. Op dag 13 moet van 1 mannelijk en 1 vrouwelijk jong per nest de schildklier worden geconserveerd. 48. Van alle volwassen dieren moeten de ovaria, testes, secundaire geslachtsorganen (uterus en cervix, epididymides, prostaat, zaadblaasjes met coagulans uitscheidende klieren), schildklier en alle organen die macroscopische letsels vertonen, worden geconserveerd. Voor routineonderzoek van testes en epididymides wordt fixatie in formaline niet aanbevolen. Voor deze weefsels is het gebruik van Bouin’s fixatief of gemodificeerde Davidson-oplossing een aanvaardbare methode (11). De tunica albuginea kan voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen. Histopathologie 49. De ovaria, testes en epididymides van de dieren in de hoogste dosisgroep en de controlegroep moeten aan een uitvoerig histologisch onderzoek worden onderworpen (met speciale aandacht voor de stadia van de spermatogenese en de histopathologie van de interstitiële testiculaire celstructuur). De overige geconserveerde organen, waaronder de schildklier van jongen en van volwassen dieren, kunnen worden onderzocht indien nodig. Het gewicht van de schildklier kan na de fixatie worden bepaald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbeschadigingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden. Wanneer er veranderingen worden waargenomen in de groep met de hoogste dosering, moeten ook de dieren in de andere doseringsgroepen worden onderzocht. In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (11) zijn nadere gegevens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de histopathologie van endocriene weefsels. GEGEVENS EN RAPPORTAGE Gegevens 50. Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast moeten alle gegevens worden samengevat in tabelvorm, waarbij voor elke testgroep worden vermeld: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met het oog op een humane behandeling is gedood, het tijdstip van sterfte of humane doding, het aantal vruchtbare dieren, het aantal drachtige vrouwtjes, het aantal dieren met toxiciteitsverschijnselen, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen met vermelding van de aanvang, de duur en de ernst van de toxische effecten, de aard van de histopathologische veranderingen en alle relevante gegevens over de nesten. In aanhangsel 3 is een opzet van een overzichtstabel opgenomen die heel praktisch is gebleken voor de beoordeling van effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. 51. Vanwege de beperkte omvang van het onderzoek, zijn statistische analyses in de vorm van toetsen voor „significantie” voor veel eindpunten, vooral die in verband met de voortplanting, van beperkte waarde. Als er statistische analyses worden gebruikt, moeten de gekozen methoden geschikt zijn voor de verdeling van de onderzochte variabele en moeten ze vóór de start van het onderzoek worden gekozen. De statistische analyse van de AGD en de tepelretentie moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nesteffecten. Waar passend is het nest de analyse-eenheid. De statistische analyse van lichaamsgewicht van de jongen moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nestgrootte. Vanwege de geringe groepsgrootte kan het ook nuttig zijn om gebruik te maken van historische controlegegevens (bv. voor nestgrootte), indien beschikbaar, ter ondersteuning van de interpretatie van het onderzoek. Evaluatie van de resultaten 52. De resultaten van dit toxiciteitsonderzoek worden beoordeeld aan de hand van de waargenomen effecten en de resultaten van de obductie en het microscopisch onderzoek. De beoordeling omvat het verband tussen de dosis van de teststof en de aanwezigheid of afwezigheid, de frequentie en de ernst van afwijkingen zoals macroscopisch letsel, gespecificeerde doelorganen, onvruchtbaarheid, klinische afwijkingen, aantasting van de reproductie- en nestresultaten, veranderingen in het lichaamsgewicht, effecten op de mortaliteit en andere toxische effecten. 53. Vanwege de korte behandelperiode van de mannetjes moeten bij de beoordeling van effecten op de voortplanting bij mannetjes niet alleen de vruchtbaarheidsgegevens, maar ook de histopathologie van de testes en de epididymides in aanmerking worden genomen. Ook het gebruik van historische controlegegevens over voortplanting/ontwikkeling (bv. voor nestgrootte, AGD, tepelretentie, T4-serumspiegels), indien beschikbaar, kan nuttig zijn ter ondersteuning van de interpretatie van het onderzoek. 54. Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëvalueerd. Testverslag 55. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: — bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar; — stabiliteit van de teststof, indien bekend. Stof die uit één component bestaat: — fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen; — chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz. Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels: — voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen. Vehiculum (indien van toepassing): — motivering voor de keuze van het vehiculum, indien geen water wordt gebruikt. Proefdieren: — gebruikte soort/stam; — aantal, leeftijd en geslacht van de dieren; — herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.; — gewicht van elk dier aan het begin van de test; — motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten. Testomstandigheden: — achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus; — gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat; — gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof; — omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing; — gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water; — gedetailleerde beschrijving van de randomisatieprocedure voor de selectie van te ruimen jongen, indien van toepassing. Resultaten: — lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht; — indien beschikbaar, voedselverbruik en waterverbruik; — gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis, met inbegrip van vruchtbaarheid, dracht en andere gegevens over toxiciteit; — duur van de dracht; — toxische of andere effecten op de reproductie, de jongen, de postnatale groei enz.; — aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische waarnemingen; — aantal volwassen vrouwtjes met een normale of abnormale oestruscyclus en cyclusduur van deze vrouwtjes; — aantal levend geboren jongen en verliezen na implantatie; — gegevens over het lichaamsgewicht van jongen; — AGD van alle jongen (en lichaamsgewicht op de dag van de AGD-meting); — tepelretentie bij mannelijke jongen; — schildklierhormoonspiegels bij dag 13-jongen en volwassen mannetjes (en moederdieren en dag 4-jongen indien gemeten); — aantal jongen met macroscopisch zichtbare afwijkingen, macroscopische beoordeling van de uitwendige geslachtsorganen, aantal ondermaatse jongen; — tijdstip van sterfte tijdens het onderzoek en of de dieren overleefden tot het einde van het onderzoek; — aantal implantaties, nestgrootte en nestgewichten op het moment van registratie; — lichaamsgewicht bij het doden van de dieren en gegevens over het gewicht van organen voor de ouderdieren; — obductiebevindingen; — een gedetailleerde beschrijving van histopathologische bevindingen; — resorptiegegevens (indien beschikbaar); — een statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing. Bespreking van de resultaten. Conclusies. Interpretatie van resultaten 56. Op basis van dit onderzoek kan de reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit worden beoordeeld bij de toediening van herhaalde doses (zie de punten 5 en 6). Het onderzoek zou een indicatie kunnen geven of verder onderzoek nodig is en biedt oriëntatiepunten voor de opzet van vervolgonderzoeken. OESO-leidraad nr. 43 moet worden geraadpleegd voor hulp bij de interpretatie van resultaten op het gebied van reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit (12). In OESO-leidraad nr. 106 over de histologische beoordeling van endocriene en voortplantingstests bij knaagdieren (11) is informatie te vinden over het prepareren en beoordelen van (endocriene) organen en vaginale uitstrijkjes, die van nut kan zijn voor deze TG. LITERATUUR (1) OESO (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (2) OESO (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (3) OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (4) OESO (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (5) OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (6) OESO (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 150), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research, Part B, 80 (2), 84-97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. and Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights, Reproductive Toxicology, 13: 383-390. (10) OESO (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 151), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (11) OESO (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 106), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (12) OESO (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 43), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. Aanhangsel 1 DEFINITIES (ZIE OOK OESO-LEIDRAAD 150 (6)) Androgene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te werken. Antiandrogene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk androgeen hormoon (bv. testosteron) te onderdrukken. Antioestrogene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17β-oestradiol) te onderdrukken. Antithyreoïde werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme de werking van een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te onderdrukken. Chemische stof: een stof of mengsel. Dosering: een algemene term die de dosis, de frequentie en de duur van de toediening omvat. Dosis: de toegediende hoeveelheid teststof. De dosis wordt uitgedrukt als gewicht van de teststof per eenheid lichaamsgewicht van het proefdier per dag (bv. mg/kg lichaamsgewicht/dag), of als constante voedingsconcentratie. Manifeste toxiciteit: een algemene term die duidelijke toxiciteitsverschijnselen beschrijft die optreden na de toediening van de teststof. Deze verschijnselen moeten een beoordeling van de gevaren mogelijk maken en van een zodanige aard zijn dat verwacht mag worden dat bij een hogere toegediende dosis ernstige toxische verschijnselen en waarschijnlijk sterfte optreden. Maternale toxiciteit: schadelijke effecten bij drachtige vrouwtjes, die hetzij specifiek optreden (direct effect), hetzij niet-specifiek (indirect effect). NOAEL: afkorting van „no-observed-adverse-effect level”, het niveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld. Dit is het hoogste dosisniveau waarbij nog geen aan de behandeling gebonden nadelige effecten worden vastgesteld. Oestrogene werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk oestrogeen hormoon (bv. 17β-oestradiol) te werken. Ontwikkelingstoxiciteit: de wijze waarop reproductietoxiciteit zich manifesteert, in de vorm van pre-, peri- en postnatale, structurele of functionele afwijkingen bij nakomelingen. Reproductietoxiciteit: schadelijke effecten op de nakomelingen en/of verstoring van de voortplantingsfuncties of het voortplantingsvermogen bij mannetjes en vrouwtjes. Teststof: elke volgens deze testmethode getest(e) stof of mengsel. Thyreoïde werking: het vermogen van een chemische stof om in een zoogdierorganisme als een natuurlijk schildklierhormoon (bv. T3) te werken. Validering: een wetenschappelijke methode die erop gericht is om de operationele vereisten en beperkingen van een testmethode te beschrijven en de betrouwbaarheid en relevantie ervan voor een bepaald doel aan te tonen. Verstoring van de vruchtbaarheid: afwijkingen in de voortplantingsfuncties of het voortplantingsvermogen bij mannetjes of vrouwtjes. Aanhangsel 2 DIAGRAM VAN DE PROEFOPZET MET DE MAXIMALE ONDERZOEKSDUUR OP BASIS VAN EEN VOLLEDIGE 14-DAAGSE PARINGSPERIODE ﻿Aanhangsel 3 OVERZICHTSTABEL VAN DE EFFECTEN OP REPRODUCTIE/ONTWIKKELING WAARNEMINGEN WAARDEN Dosering (eenheden) 0 (controle) … … … … Paren bij begin (N) Oestruscyclus (ten minste gemiddelde duur en frequentie van onregelmatige cycli) Vrouwtjes met aanwijzingen voor copulatie (N) Vrouwtjes die drachtig worden (N) Dagen conceptie 1 - 5 (N) Dagen conceptie 6 -... (21) (N) Dracht ≤ 21 dagen (N) Dracht = 22 dagen (N) Dracht ≥ 23 dagen (N) Moederdieren met levend geboren jongen (N) Moederdieren met levende jongen op postnatale dag 4 (N) Implantaten/moederdier (gemiddeld) Levende jongen/moederdier bij geboorte (gemiddeld) Levende jongen/moederdier op dag 4 (gemiddeld) Geslachtsverhouding (m/v) bij geboorte (gemiddeld) Geslachtsverhouding (m/v) op dag 4 (gemiddeld) Gewicht van het nest bij geboorte (gemiddeld) Gewicht van het nest op dag 4 (gemiddeld) Gewicht van de jongen bij geboorte (gemiddeld) Gewicht van de jongen op het moment van AGD-meting (gemiddeld bij mannetjes, gemiddeld bij vrouwtjes) AGD jongen op dezelfde postnatale dag, geboorte - dag 4 (gemiddeld bij mannetjes, gemiddeld bij vrouwtjes) Gewicht van de jongen op dag 4 (gemiddeld) Tepelretentie bij mannelijke jongen op dag 13 (gemiddeld) Gewicht van de jongen op dag 13 (gemiddeld) AFWIJKENDE JONGEN Moederdieren met 0 Moederdieren met 1 Moederdieren met ≥ 2 VERLIES VAN NAKOMELINGEN Vóór geboorte/na implantatie (implantaties minus levend geborenen) Vrouwtjes met 0 Vrouwtjes met 1 Vrouwtjes met 2 Vrouwtjes met ≥ 3 Na geboorte (levend geboren en minus levende jongen op PND 13) Vrouwtjes met 0 Vrouwtjes met 1 Vrouwtjes met 2 Vrouwtjes met ≥ 3 B.64 TOXICITEITSONDERZOEK BIJ HERHAALDE TOEDIENING IN COMBINATIE MET DE SCREENINGTEST VOOR REPRODUCTIE/ONTWIKKELINGSTOXICITEIT INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 422 (2016) van de OESO. OESO-richtlijnen voor het testen van chemische stoffen worden periodiek in het licht van de wetenschappelijke vorderingen getoetst. De oorspronkelijke screeningtestrichtlijn 422 werd vastgesteld in 1996 op basis van een protocol voor een gecombineerde screeningtest voor toxiciteit bij herhaalde toediening en reproductie/ontwikkelingstoxiciteit (Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Screening Test) die was besproken op twee bijeenkomsten van deskundigen, in 1990 in Londen (1) en in 1992 in Tokyo (2). 2. Deze testmethode combineert een screeninggedeelte voor reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, gebaseerd op de ervaring die in de aangesloten landen is opgedaan bij het gebruik van de oorspronkelijke methode op bestaande chemische stoffen met een hoog productievolume en in verkennende tests met positieve controlestoffen (3) (4), en een gedeelte voor toxiciteit bij herhaalde toediening, in overeenstemming met OESO-testrichtlijn 407 (toxiciteitsonderzoek (oraal) op knaagdieren bij herhaalde toediening (28 dagen), overeenkomend met hoofdstuk B.7 van deze bijlage). 3. Deze testmethode is bijgewerkt met eindpunten die relevant zijn voor hormoonontregelaars, naar aanleiding van de prioritaire actie die de OESO in 1998 is gestart om bestaande testrichtlijnen te herzien en nieuwe testrichtlijnen te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars (5). In dit verband werd TG 407 (overeenkomend met hoofdstuk B.7 van deze bijlage) in 2008 uitgebreid met parameters die geschikt zijn om de endocriene activiteit van de teststoffen te detecteren. Met de bijwerking van TG 422 werd beoogd om in screeningtestrichtlijnen een aantal voor hormoonontregelaars relevante eindpunten op te nemen, waarbij de blootstellingsperioden bepaalde gevoelige perioden in de ontwikkeling (prenatale en vroeg-postnatale perioden) beslaan. 4. De aanvullende, voor hormoonontregelaars relevante eindpunten die werden geselecteerd en die ook deel uitmaken van TG 443 (uitgebreid onderzoek naar reproductietoxiciteit over één generatie, overeenkomend met hoofdstuk B.56 van deze bijlage), werden in TG 422 opgenomen op basis van een haalbaarheidsstudie waarin wetenschappelijke en technische vragen met betrekking tot de opname ervan werden onderzocht, alsook aanpassingen van de testopzet die eventueel voor de opname ervan noodzakelijk zouden zijn (6). 5. Deze testmethode is ontworpen voor het verkrijgen van beperkte informatie over de effecten van een teststof op het mannelijke en vrouwelijke voortplantingsvermogen, zoals de gonadale functie, paringsgedrag, conceptie, ontwikkeling van de vrucht en geboorte. Deze testmethode is geen alternatief noch een vervanging voor de bestaande testmethoden B.31, B.34, B.35 of B.56. INLEIDENDE OVERWEGINGEN 6. Bij de bepaling en evaluatie van de toxische eigenschappen van een teststof moet aan de hand van acute-toxiciteitstests eerst informatie over de toxiciteit worden verkregen. Daarna kan de orale toxiciteit door middel van herhaalde toediening worden bepaald. Dit onderzoek geeft informatie over mogelijke gevaren voor de gezondheid die zich kunnen voordoen bij herhaalde blootstelling gedurende een betrekkelijk beperkte tijd. De methode omvat het basale toxiciteitsonderzoek bij herhaalde toediening dat kan worden gebruikt voor stoffen waarvoor een onderzoek van 90 dagen niet gerechtvaardigd is (bv. als het productievolume binnen bepaalde grenzen blijft), of als voorstudie voor een langetermijnonderzoek. Bij het uitvoeren van het onderzoek moeten de richtsnoeren en overwegingen worden gevolgd die worden beschreven in de OESO-leidraad nr. 19 over het herkennen, beoordelen en gebruiken van klinische verschijnselen als humane eindpunten voor proefdiergebruik bij veiligheidsbeoordelingen (7). 7. De methode omvat bovendien een screeningtest voor reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit en kan daarom ook worden gebruikt om oriënterende gegevens te verkrijgen over mogelijke effecten op het mannelijke en vrouwelijke voortplantingsvermogen, zoals de gonadale functie, paringsgedrag, conceptie, ontwikkeling van de vrucht en geboorte, hetzij in een vroeg stadium van de beoordeling van de toxicologische eigenschappen van teststoffen hetzij voor teststoffen waarbij dergelijke effecten worden vermoed. Deze testmethode verschaft geen volledige informatie over alle aspecten van reproductie en ontwikkeling. Met name voor het detecteren van postnatale gevolgen van prenatale blootstelling of effecten die tijdens postnatale blootstelling zijn veroorzaakt, is de informatie die deze methode oplevert slechts beperkt. Als gevolg van (onder andere) de selectiviteit van de eindpunten en de korte onderzoeksduur kan met deze methode geen bewijs worden verkregen om definitief te concluderen dat een stof geen effecten veroorzaakt op de voortplanting en ontwikkeling. Als er verder geen gegevens zijn uit andere tests op reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, zijn positieve resultaten evenwel nuttig voor een eerste gevarenbeoordeling en kunnen ze als basis dienen voor beslissingen over de noodzaak en timing van aanvullende tests. 8. De resultaten die worden verkregen met de parameters die met het endocriene systeem te maken hebben, moeten worden gezien in samenhang met het conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen (8). In dit conceptueel kader is de uitgebreide TG 422 van de OESO ondergebracht in niveau 4 als eenin-vivobepaling waarmee gegevens kunnen worden verkregen over schadelijke effecten op eindpunten die relevant zijn voor het endocrien systeem. Een endocrien signaal hoeft op zichzelf echter niet als voldoende bewijs te worden beschouwd dat de teststof een hormoonontregelaar is. 9. Bij deze testmethode ligt het accent ook op neurologische effecten als specifiek eindpunt. Benadrukt moet worden dat het noodzakelijk is de dieren zorgvuldig klinisch te observeren om zoveel mogelijk informatie te verzamelen. Ze moet het mogelijk maken potentieel neurotoxische chemicaliën te identificeren, die in dit opzicht nader verdienen te worden onderzocht. Bovendien kan de methode een ruwe indicatie geven van immunologische effecten. 10. Als er geen gegevens zijn uit andere onderzoeken naar systemische toxiciteit, reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, neurotoxiciteit en/of immutoxiciteit, zijn positieve resultaten bovendien nuttig voor een eerste gevarenbeoordeling en kunnen ze als basis dienen voor beslissingen over de noodzaak en timing van aanvullende tests. De test kan vooral nuttig zijn als onderdeel van de Screening Information Data Set (SIDS) van de OESO voor de beoordeling van bestaande chemische stoffen waarvoor weinig of geen toxicologische gegevens beschikbaar zijn, en kan als alternatief dienen voor het uitvoeren van twee aparte tests voor respectievelijk toxiciteit bij herhaalde toediening (OSEO-TG 407, die overeenkomt met hoofdstuk B.7 van deze bijlage) en reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit (OSEO-TG 421, die overeenkomt met hoofdstuk B.63 van deze bijlage). De test kan ook worden gebruikt als bereikbepalingsonderzoeken voor uitvoeriger onderzoeken naar reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, of wanneer het gebruik ervan anderszins relevant wordt geacht. 11. In het algemeen wordt aangenomen dat er verschillen in gevoeligheid zijn tussen drachtige en niet-drachtige dieren. In deze gecombineerde test kan het dan ook moeilijker zijn om dosisniveaus te bepalen die geschikt zijn voor zowel de beoordeling van algemene systemische toxiciteit als specifieke reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, ten opzichte van de situatie waarin de afzonderlijke tests apart worden uitgevoerd. Bovendien kunnen de testresultaten voor algemene systemische toxiciteit moeilijker te interpreteren zijn dan wanneer een apart onderzoek bij herhaalde toediening wordt uitgevoerd, vooral wanneer de serum- en histopathologieparameters in het onderzoek niet tegelijkertijd worden beoordeeld. Vanwege de technische complexiteit vergt de uitvoering van deze gecombineerde screeningtest ruime ervaring met testen op toxiciteit. Anderzijds kan de gecombineerde test, afgezien van het geringere aantal dieren dat nodig is, een beter middel bieden om rechtstreekse effecten op voorplanting/ontwikkeling te onderscheiden van effecten die voortvloeien uit andere (systemische) effecten. 12. In deze test is de doseringsperiode langer dan in een klassiek 28-daags onderzoek bij herhaalde toediening. Er zijn echter minder dieren van elk geslacht per groep nodig dan wanneer een klassiek 28-daags onderzoek bij herhaalde toediening wordt uitgevoerd naast een screeningtest voor reproductie/ontwikkelingstoxiciteit. 13. Bij deze testmethode wordt aangenomen dat de teststof oraal wordt toegediend. Als andere blootstellingsroutes worden gebruikt, moet de methode mogelijk worden aangepast. 14. Voordat de testmethode wordt gebruikt op een mengsel om gegevens te genereren voor een beoogd regelgevingsdoel, moet worden nagegaan of, en zo ja, waarom deze methode betrouwbare resultaten oplevert voor dat doel. Zulke overwegingen zijn niet nodig wanneer het testen van het mengsel wettelijk vereist is. 15. De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 16. De teststof wordt in geleidelijk oplopende doseringen aan verschillende groepen mannetjes en vrouwtjes toegediend. De mannetjes moeten ten minste vier weken lang de teststof toegediend krijgen, tot en met de dag voordat ze worden gedood (inclusief twee weken voorafgaand aan het paren, tijdens de paringsperiode en ongeveer twee weken na het paren). Gezien de beperkte doseringsperiode voor het paren, is de vruchtbaarheid mogelijk geen bijzonder gevoelige indicator voor testiculaire toxiciteit. Een uitvoerig histologisch onderzoek van de testes is daarom noodzakelijk. De combinatie van een twee weken durende doseringsperiode voor het paren, gevolgd door waarnemingen op het gebied van paring/vruchtbaarheid, met een totale doseringsperiode van ten minste vier weken gevolgd door een uitvoerige histopathologie van de mannelijke geslachtsklieren, wordt voldoende geacht om het merendeel van de effecten op de mannelijke vruchtbaarheid en de spermatogenese te kunnen detecteren. 17. De vrouwtjes moeten het hele onderzoek lang de teststof toegediend krijgen. Dit betekent twee weken voorafgaand aan het paren (zodat het onderzoek ten minste twee volledige oestruscycli omvat), de variabele tijd tot conceptie, de duur van de dracht en ten minste dertien dagen na het werpen, tot en met de dag voordat ze worden gedood. 18. De duur van het onderzoek, na acclimatisering en beoordeling van de oestruscyclus voorafgaand aan de behandeling, is afhankelijk van het gedrag van het vrouwtje en beloopt ongeveer 63 dagen (ten minste 14 dagen vóór het paren, (tot) 14 dagen paring, 22 dagen dracht, en ten slotte een zoogperiode van 13 dagen). 19. Gedurende de periode dat de stof wordt toegediend, worden de dieren dagelijks zorgvuldig geobserveerd om tekenen van toxiciteit te ontdekken. Bij dieren die tijdens het onderzoek sterven of worden gedood, wordt obductie verricht. Dieren die aan het eind van het onderzoek nog in leven zijn, worden gedood en ook hierop wordt obductie verricht. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Keuze van de diersoort 20. Deze testmethode is ontworpen om te worden toegepast met ratten. Indien de in TG 422 gespecificeerde parameters worden onderzocht bij een andere knaagdiersoort moet dit uitvoerig worden gemotiveerd. In het internationale valideringsprogramma voor de detectie van hormoonontregelaars voor TG 407 zijn alleen ratten gebruikt. Stammen met een lage vruchtbaarheid of waarvan bekend is dat er vaak ontwikkelingsstoornissen optreden, mogen niet worden gebruikt. Er moet gebruikgemaakt worden van gezonde dieren die nog niet eerder gepaard hebben en nog niet eerder aan experimenten zijn onderworpen. Van de proefdieren moeten soort, stam, geslacht, gewicht en leeftijd bekend zijn. Per geslacht mag bij aanvang van het onderzoek het gewicht van de dieren die worden gebruikt, niet meer dan ± 20 % van het gemiddelde gewicht afwijken. Wanneer het onderzoek wordt uitgevoerd als voorstudie voor een onderzoek van langere duur of een onderzoek over een volledige generatie, verdient het de voorkeur dat de dieren in beide onderzoeken tot dezelfde stam behoren en dezelfde oorsprong hebben. Huisvesting en voeding 21. Alle procedures moeten in overeenstemming zijn met de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % bedragen en mag, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger zijn dan 70 %. Verlichting gebeurt met kunstlicht met een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. De keuze van het voer kan worden beïnvloed door de noodzaak om voor een afdoende mengbaarheid met de teststof te zorgen, wanneer de stof in het voer wordt toegediend. 22. De dieren moeten in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden gehuisvest; de dieren kunnen individueel worden gehuisvest als dat wetenschappelijk gerechtvaardigd is. Indien de dieren in groepen in kooien worden ondergebracht, mogen per kooi niet meer dan vijf dieren worden gehuisvest. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Drachtige vrouwtjes moeten in aparte kooien worden ondergebracht en nestmateriaal krijgen. Zogende vrouwtjes moeten samen met hun jongen in aparte kooien worden ondergebracht. 23. Het voeder moet regelmatig op verontreinigingen worden onderzocht. Een monster van het voedsel moet worden bewaard totdat het verslag is afgerond. Voorbereiding van de dieren 24. Gezonde jonge volwassen dieren worden gerandomiseerd en in de behandelgroepen en kooien ingedeeld. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. De dieren krijgen een unieke identificatie en blijven, voordat de test begint, minimaal vijf dagen in hun kooi om in het laboratorium te acclimatiseren. Voorbereiding van de doses 25. Aanbevolen wordt om de teststof oraal toe te dienen, tenzij andere toedieningswegen geschikter worden geacht. Wanneer voor de orale weg wordt gekozen, wordt de teststof gewoonlijk via een sonde toegediend; als alternatieve mogelijkheid kunnen teststoffen echter ook via het voer of het drinkwater worden toegediend. 26. Waar nodig wordt de teststof in een geschikt vehiculum opgelost of gesuspendeerd. Aanbevolen wordt eerst te bezien of het mogelijk is een waterige oplossing/suspensie te gebruiken, als dit niet kan een oplossing/suspensie in olie (bv. maïsolie) te overwegen en daarna eventueel andere vehicula. Van niet-waterige vehicula moeten de toxische kenmerken bekend zijn. Voorts moeten de stabiliteit en homogeniteit van de teststof in het vehiculum worden bepaald. PROCEDURE Aantal en geslacht van de dieren 27. Aanbevolen wordt dat elke groep aan het begin van de test ten minste 10 mannetjes en 12-13 vrouwtjes telt. Bij de vrouwtjes wordt vóór blootstelling de oestruscyclus beoordeeld. Dieren die geen normale 4-5-daagse cyclus hebben, worden niet het onderzoek opgenomen. Daarom wordt aanbevolen met extra vrouwtjes te beginnen om uiteindelijk op 10 vrouwtjes per groep uit te komen. Behalve in geval van duidelijke toxische effecten wordt verwacht dat dit ten minste 8 drachtige vrouwtjes per groep zal opleveren, hetgeen normaal gesproken het minimaal aanvaardbare aantal drachtige vrouwtjes per groep is. Het doel is voldoende drachten en nakomelingen tot stand te brengen om een betekenisvolle evaluatie mogelijk te maken van de mogelijke invloed van de stof op de vruchtbaarheid, de dracht en het gedrag van moeder en jongen, en op de groei en ontwikkeling van de F 1 -nakomelingen, vanaf de conceptie tot dag 13 na het werpen. Indien het de bedoeling is tussentijds dieren te doden, moet het aantal dieren worden verhoogd met het aantal dat tussentijds zal worden gedood. Er moet worden overwogen een aanvullende satellietgroep van vijf dieren per geslacht op te nemen in de controlegroep en de groep met het hoogste dosisniveau, voor waarneming van reversibiliteit, persistentie of vertraagd tot uiting komen van systemische toxische effecten gedurende ten minste 14 dagen na de behandeling. De dieren in de satellietgroepen zullen niet paren en worden dan ook niet gebruikt voor de beoordeling van reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit. Dosering 28. In het algemeen zijn drie testgroepen en een controlegroep vereist. Als er geen bruikbare algemene toxiciteitsgegevens beschikbaar zijn, kan een bereikbepalingonderzoek worden uitgevoerd (bij dieren van dezelfde stam en dezelfde herkomst) om de orde van grootte van de te gebruiken doses te helpen bepalen. Afgezien van de toediening van de teststof worden de dieren in de controlegroep op identieke wijze behandeld als de dieren in de testgroepen. Indien bij de toediening van de teststof van een vehiculum gebruik wordt gemaakt, moet dit aan de controlegroep in het hoogste gebruikte volume toegediend worden. 29. De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van de bestaande gegevens over toxiciteit en (toxico)kinetica. Er moet ook rekening mee gehouden worden dat er verschillen kunnen zijn in gevoeligheid tussen drachtige en niet-drachtige dieren. Het hoogste dosisniveau moet zo worden gekozen dat toxische effecten optreden, maar geen sterfte of duidelijk lijden. Daarna moet een dalende reeks dosisniveaus gekozen worden om het verband tussen dosering en respons aan te tonen en bij het laagste niveau te komen tot een dosis zonder schadelijke effecten. Intervallen van een factor twee tot vier zijn vaak optimaal en het is vaak beter een vierde testgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor 10) tussen de doseringen te gebruiken. 30. Bij algemene toxiciteit (bv. verminderd lichaamsgewicht, effecten op lever, hart, longen of nieren enz.) of andere veranderingen die mogelijk geen toxische reacties zijn (bv. verminderde voedselinname, leververgroting), moeten de waargenomen effecten op hormoongevoelige eindpunten met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd. Limiettest 31. Als volgens de hier beschreven procedures een onderzoek met orale toediening wordt uitgevoerd met één dosisniveau van ten minste 1 000 mg/kg lichaamsgewicht/dag of, in het geval van toediening via het voer, het equivalente percentage in het voer, of het drinkwater (berekend overeenkomstig het lichaamsgewicht), en er geen waarneembare toxische effecten optreden, en deze ook niet kunnen worden verwacht op grond van gegevens betreffende stoffen met verwante structuur, is het niet noodzakelijk een volledig onderzoek met meerdere dosisniveaus te doen. De limiettest is van toepassing tenzij blootstelling bij mensen een hogere dosering noodzakelijk maakt. Voor andere toedieningsvormen, zoals inhalatie of toediening op de huid, zal de maximaal haalbare blootstelling vaak worden bepaald door de fysisch-chemische eigenschappen van de teststoffen. Toediening van de doses 32. De dieren krijgen de teststof 7 dagen per week dagelijks toegediend. Indien de teststof via een maagsonde aan het dier wordt toegediend, moet dit in één enkele dosis gebeuren met gebruikmaking van een maagbuisje of een geschikte intubatiecanule. Het maximale volume dat in één keer kan worden toegediend, is afhankelijk van de grootte van het dier. Het volume mag niet groter zijn dan 1 ml/100 g lichaamsgewicht, behalve wanneer het om een waterige oplossing gaat: in dat geval mag 2 ml/100 g lichaamsgewicht worden gebruikt. Afgezien van irriterende of bijtende teststoffen die normaliter bij hogere concentraties ergere effecten vertonen, moet de variabiliteit in het voor de proef gebruikte volume zo klein mogelijk worden gehouden door de concentratie zodanig aan te passen dat bij alle dosisniveaus een constant volume wordt gewaarborgd. 33. Het is belangrijk dat er bij teststoffen die via het voer of het drinkwater worden toegediend, voor wordt gezorgd dat de hoeveelheden teststof de normale voer- of waterbalans niet verstoren. Wanneer de teststof in het voer wordt toegediend, kan een constante concentratie in het voer (in ppm) of een constante dosis in verhouding tot het lichaamsgewicht van de dieren worden gebruikt; daarbij moet worden aangegeven welk alternatief is gebruikt. Wanneer de teststof met een sonde wordt toegediend, moeten de doses dagelijks op vaste tijdstippen worden gegeven. De doses moeten ten minste wekelijks worden aangepast om een constant dosisniveau als functie van het lichaamsgewicht van het dier te verkrijgen. Indien een gecombineerd onderzoek wordt gebruikt als voorstudie van een langdurig chronisch toxiciteitsonderzoek of een volledig reproductietoxiciteitsonderzoek, moet in beide onderzoeken dezelfde voeding worden gebruikt. Proefopzet 34. Voor beide geslachten moet de toediening 2 weken voor het paren beginnen, nadat de dieren ten minste vijf dagen lang zijn geacclimatiseerd en de vrouwtjes gescreend zijn op normale oestruscycli (in een voorbehandelingsperiode van 2 weken). Het onderzoek moet zodanig worden ingepland dat de beoordeling van de oestruscyclus begint kort nadat de dieren volledig geslachtsrijp zijn. Dit kan enigszins variëren voor verschillende rattenstammen in verschillende laboratoria, bv. voor Sprague Dawley-ratten op een leeftijd van 10 weken, voor Wistar-ratten op een leeftijd van ongeveer 12 weken. Moederdieren met jongen moeten op dag 13 na het werpen worden gedood of kort daarna. Om de moederdieren voorafgaand aan de bloedafname een dag te laten vasten (als daaraan de voorkeur wordt gegeven) hoeven de vrouwtjes en hun jongen niet op dezelfde dag gedood te worden. De dag van de geboorte (d.w.z. wanneer het werpen is voltooid) wordt gedefinieerd als dag 0 na het werpen. Vrouwtjes die geen tekenen van copulatie vertonen, worden 24-26 dagen na de laatste dag van de paringsperiode gedood. Voor beide geslachten wordt de toediening gedurende de paringsperiode voortgezet. Daarna moeten de mannetjes de teststof ten minste nog toegediend krijgen tot de minimale totale doseringsperiode van 28 dagen is afgerond. Vervolgens worden ze gedood of, anders, in leven gehouden en verder behandeld voor een eventuele tweede paring. 35. De dagelijkse toediening aan de moederdieren moet doorgaan gedurende de dracht en ten minste tot en met dag 13 na het werpen of de dag voordat ze gedood worden. Voor onderzoeken waarbij de toediening van de teststof door middel van inhalatie of dermaal plaatsvindt, moet deze ten minste worden voortgezet tot en met dag 19 van de dracht en zo spoedig mogelijk en niet later dan postnatale dag (PND) 4 worden hervat. 36. Dieren in eventuele satellietgroepen die bestemd zijn voor vervolgwaarnemingen, paren niet. Ze moeten nog 14 dagen nadat de eerste moederdieren gedood worden, zonder behandeling geobserveerd worden om de persistentie van de toxische effecten c.q. het herstel alsmede het eventuele optreden van vertraagde toxiciteit te kunnen waarnemen. 37. In aanhangsel 2 wordt de proefopzet in een diagram weergegeven. Oestruscycli 38. Voordat de behandeling begint, moeten de oestruscycli worden gecontroleerd om te selecteren op vrouwelijke proefdieren met regelmatige cycli (zie punt 27). Ook moeten er van het begin van de behandelingsperiode totdat paring is gebleken, dagelijks vaginale uitstrijkjes worden onderzocht. Indien vermoed wordt dat effecten van acute stress bij het begin van de behandeling de oestruscyclus zouden kunnen verstoren, kunnen de laboratoria de proefdieren gedurende 2 weken blootstellen en vervolgens ten minste 2 weken lang dagelijks vaginale uitstrijkjes nemen ter controle van de oestruscycli gedurende de periode vóór paring tot in de paringsperiode, totdat paring gebleken is. Wanneer monsters van vaginale/cervicale cellen worden genomen, moet erop worden gelet verstoring van het slijmvlies, die tot schijndracht kan leiden, te voorkomen (8) (9). De paringsprocedure 39. Normaal gesproken moet men voor dit onderzoek één mannetje met één vrouwtje (1:1) laten paren. Hierop zijn uitzonderingen mogelijk in geval van incidentele sterfte van mannetjes. Het vrouwtje moet bij hetzelfde mannetje worden geplaatst totdat aanwijzingen voor copulatie zijn waargenomen of er twee weken zijn verstreken. Elke ochtend worden de vrouwtjes onderzocht op de aanwezigheid van sperma of vaginale plug. Dag 0 van de dracht wordt gedefinieerd als de dag waarop aanwijzingen voor paring worden bevestigd (observatie van een vaginale plug en/of sperma). Wanneer het paren geen succes heeft gehad, kan worden overwogen de vrouwtjes opnieuw te laten dekken door mannetjes van dezelfde groep waarvan de vruchtbaarheid is aangetoond. Nestgrootte 40. Op PND 4 kan de grootte van de nesten worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie, zodat elk nest uiteindelijk zoveel mogelijk bestaat uit vier of vijf jongen per geslacht, afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam. Bij twee van de overtollige jongen moeten bloedmonsters worden afgenomen, gepoold en gebruikt ter bepaling van de serumspiegels van T4. Selectieve eliminatie van jongen, bijvoorbeeld op grond van lichaamsgewicht of anogenitale afstand (AGD), is niet gepast. Als het door het aantal mannelijke of vrouwelijke jongen niet mogelijk is om op vier of vijf per geslacht per nest uit te komen, is gedeeltelijke aanpassing (bv. zes mannetjes en vier vrouwtjes) aanvaardbaar. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de streefgrootte (8 of 10 jongen/nest) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de streefgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4. 41. Als de nestgrootte niet wordt aangepast, worden er op PND 4 twee jongen per nest gedood en worden er bloedmonsters genomen voor het meten van de serumspiegels van schildklierhormonen. De twee jongen per nest moeten zo mogelijk vrouwelijke jongen zijn om de mannelijke jongen te bewaren voor de beoordeling van de tepelretentie, tenzij er na verwijdering van deze jongen geen enkel vrouwtje meer overblijft voor de beoordeling bij beëindiging van het onderzoek. Er worden geen jongen geëlimineerd als de nestgrootte daardoor onder de 8 of 10 jongen/nest (afhankelijk van de normale nestgrootte van de gebruikte rattenstam) zou komen. Als er maar één jong beschikbaar is boven de normale nestgrootte, wordt er slechts één jong geëlimineerd en gebruikt voor het nemen van een bloedmonster ter bepaling van serum-T4. Waarnemingen 42. Algemene klinische waarnemingen moeten ten minste eenmaal per dag plaatsvinden, bij voorkeur steeds op hetzelfde tijdstip en met inachtneming van de piekperiode van de te verwachten effecten na toediening. De gezondheidstoestand van de dieren moet worden geregistreerd. De dieren moeten ten minste tweemaal per dag worden geobserveerd op ziekteverschijnselen en sterfte. 43. Alle ouderdieren worden eenmaal vóór de eerste blootstelling nauwkeurig klinisch onderzocht (om intra-individuele vergelijking mogelijk te maken) en vervolgens ten minste eenmaal per week. Dit onderzoek moet buiten de kooi op een vaste onderzoekplaats en bij voorkeur steeds op dezelfde dag uitgevoerd worden. De gegevens moeten zorgvuldig worden opgetekend, bij voorkeur met behulp van scoringssystemen die door het testlaboratorium expliciet zijn gedefinieerd. Er moet zo veel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en dat de waarnemers niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan. Tekenen waarop moet worden gelet zijn onder meer (maar niet alleen): veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van af- en uitscheiding, en onwillekeurige reacties zoals traanvorming, rechtopstaan van het haar, verandering van de pupilgrootte of een ongewoon ademhalingspatroon. Ook verandering in gang, houding en reactiviteit op vastpakken, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, herhaaldelijk ronddraaien), een moeilijke of langdurige worp of bizar gedrag (bv. zelfverminking, achteruitlopen) moeten worden opgetekend (10). 44. In de loop van het onderzoek moet op enig moment bij vijf mannetjes en vijf vrouwtjes, die aselect worden gekozen uit elke groep, de sensorische reactiviteit op stimuli van verschillende aard (bv. auditief, visueel of proprioceptief) (8) (9) (11) worden bepaald en moet een bepaling van de grijpkracht (12) en de motorische activiteit (13) plaatsvinden. Meer informatie over de procedures die kunnen worden gevolgd, is te vinden in de desbetreffende literatuur. Er kunnen evenwel ook andere dan de genoemde procedures worden toegepast. Bij mannetjes moeten deze functionele waarnemingen tegen het einde van hun doseringsperiode worden gedaan, kort voordat ze gedood zullen worden, maar ook voordat er bloed wordt afgenomen voor hematologische en klinisch-chemische bepalingen (zie de punten 53-56, waaronder voetnoot 1). Vrouwtjes moeten tijdens deze functionele tests in een vergelijkbare fysiologische toestand verkeren en moeten bij voorkeur eenmaal worden getest in de laatste week van de zoogperiode (bv. zoogdag 6-13), kort voordat ze gedood worden. Probeer moederdieren en jongen steeds zo kort mogelijk van elkaar te scheiden. 45. Als het onderzoek wordt verricht als voorstudie voor een daaropvolgend subchronisch onderzoek van 90 dagen of langetermijnonderzoek, kunnen de eenmalige functionele waarnemingen tegen het einde van het onderzoek achterwege worden gelaten. In dat geval moeten de functionele waarnemingen in het bedoelde vervolgonderzoek plaatsvinden. Daar staat echter tegenover dat de beschikbaarheid van gegevens betreffende functionele waarnemingen uit het onderzoek met herhaalde toediening, de keuze van de dosisniveaus voor het daaropvolgende subchronische of langetermijnonderzoek ten goede kan komen. 46. Bij wijze van uitzondering kunnen functionele waarnemingen ook achterwege worden gelaten bij groepen die anders tekenen van toxiciteit vertonen in een mate die aanzienlijk zou interfereren met de uitvoering van de functionele test. 47. De drachttijd moet worden geregistreerd en wordt berekend vanaf dag 0 van de dracht. Elke worp moet zo spoedig mogelijk na de geboorte te worden onderzocht, teneinde het aantal en geslacht van de jongen vast te stellen, alsmede het aantal doodgeborenen, levendgeborenen, ondermaatse jongen (jongen die aanmerkelijk kleiner zijn dan de corresponderende controlejongen) en de aanwezigheid van macroscopisch zichtbare afwijkingen. 48. Levende jongen moeten worden geteld en gesekst en de nesten moeten binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op dag 4 en dag 13 na het werpen worden gewogen. Naast de in punt 43 en 44 beschreven waarnemingen voor ouderdieren moet elk afwijkend gedrag van de nakomelingen worden geregistreerd. 49. De AGD van elk jong moet worden gemeten op dezelfde postnatale dag tussen postnatale dag 0 en het einde van postnatale dag 4. Het lichaamsgewicht van elk jong moet worden bepaald op de dag dat de AGD wordt gemeten en de AGD moet genormaliseerd worden tot een maat voor jonggrootte, bij voorkeur de derdemachtswortel van het lichaamsgewicht (14). Het aantal tepels/tepelhoven bij mannelijke jongen moet worden geteld op postnatale dag 12 of 13, zoals aanbevolen in OESO-leidraad 151 (15). Lichaamsgewicht en consumptie van voer en water 50. De mannetjes en vrouwtjes moeten worden gewogen op de eerste dag dat zij de teststof krijgen toegediend, vervolgens ten minste eenmaal per week en aan het einde van het onderzoek. De vrouwtjes moeten worden gewogen op de dagen 0, 7, 14 en 20 tijdens de dracht, binnen 24 uur na de geboorte (dag 0 of 1 na het werpen) en ten minste op dag 4 en dag 13 na het werpen. Deze waarnemingen worden voor elk volwassen dier apart gerapporteerd. 51. Vóór het paren, tijdens de dracht en tijdens het zogen, moet ten minste wekelijks de voerconsumptie worden gemeten. Tijdens de paringsperiode is deze meting facultatief. Wanneer de teststof via het drinkwater wordt toegediend, moet ook de waterconsumptie gedurende deze perioden worden gemeten. Hematologie 52. Tijdens het onderzoek moeten eenmaal bij vijf mannetjes en vijf vrouwtjes, die aselect worden gekozen uit elke groep, de volgende hematologische onderzoeken worden verricht: hematocriet, hemoglobinegehalten, aantal rode bloedcellen, reticulocyten, totaal aantal en gedifferentieerde aantallen witte bloedcellen, aantal bloedplaatjes en bloedstollingstijd/vermogen. Indien de teststof of de vermeende metabolieten ervan oxiderende eigenschappen hebben, of hiervan een vermoeden bestaat, moeten andere bepalingen worden uitgevoerd, zoals van de methemoglobineconcentratie en de Heinz-lichaampjes. 53. Bij het nemen van de bloedmonsters moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel en hoe de monsters zijn genomen. Tijdens de bloedafname moeten de vrouwtjes in een vergelijkbare fysiologische toestand verkeren. Om praktische problemen in verband met de variabiliteit in het begin van de dracht te vermijden, kan de bloedafname bij vrouwtjes aan het einde van de periode voor het paren worden uitgevoerd als alternatief voor de monstername net voor of tijdens het euthanaseren van de dieren. De bloedmonsters van de mannetjes moeten bij voorkeur net voor of tijdens het euthanaseren van de dieren worden genomen. Als alternatieve mogelijkheid kan de bloedafname bij mannetjes ook aan het einde van de periode voor het paren worden uitgevoerd, wanneer dat tijdstip ook voor de vrouwtjes wordt gekozen. 54. De bloedmonsters moeten onder passende omstandigheden worden bewaard. Klinische biochemie 55. Klinisch-biochemische bepalingen die bedoeld zijn om wezenlijke toxische effecten in weefsels en met name effecten op de nieren en lever te onderzoeken, moeten worden verricht op bloedmonsters die zijn genomen bij de geselecteerde vijf mannetjes en vijf vrouwtjes uit elke groep. Het is aan te bevelen in de nacht voordat de bloedmonsters worden genomen de dieren voedsel te onthouden ( 22 ) . Onderzoek van plasma of serum moet omvatten: natrium, kalium, glucose, totaal cholesterol, ureum, creatinine, totaal proteïne en albumine, ten minste twee enzymen die een indicatie geven van hepatocellulaire effecten (zoals alanineaminotransferase, aspartaataminotransferase en sorbitoldehydrogenase), en galzuren. Bepaling van andere enzymen (van hepatische of andere oorsprong) en bilirubine kan onder bepaalde omstandigheden nuttige informatie geven. 56. Er worden bloedmonsters genomen van een gedefinieerde plaats op basis van het volgende schema: — van ten minste twee jongen per nest op PND 4 als het aantal jongen dit toelaat (zie de punten 40-41); — van alle moederdieren en ten minste twee jongen per nest op het tijdstip van doden op dag 13, en — van alle volwassen mannetjes op het tijdstip van doden. Alle bloedmonsters worden onder passende omstandigheden bewaard. In de bloedmonsters van de jongen op dag 13 en de volwassen mannetjes worden de serumspiegels van schildklierhormonen (T4) bepaald. Een verdere bepaling van T4 in bloedmonsters van moederdieren en jongen op dag 4 wordt verricht indien relevant. Eventueel kunnen ook andere hormonen worden gemeten indien relevant. Voor de schildklierhormoonanalyse kan bloed van jongen per nest gepoold worden. De schildklierhormonen (T4 en TSH) worden bij voorkeur als „totaal” gemeten. 57. Als optie kunnen tijdens de laatste week van het onderzoek de volgende urineonderzoeken worden verricht bij vijf aselect gekozen mannetjes uit elke groep, waarbij op regelmatige tijdstippen urinemonsters moeten worden genomen: uitzien, volume, osmolaliteit of relatieve dichtheid, pH, eiwit, glucose en bloed/bloedcellen. 58. Bovendien moet worden overwogen serummarkers van algemene weefselbeschadiging te onderzoeken. Andere onderzoeken die moeten worden uitgevoerd als van de teststof bekend is, of vermoed wordt, dat zij de desbetreffende metabolische profielen beïnvloedt, zijn: calcium, fosfaat, triglyceriden en glucose bij nuchtere toestand, specifieke hormonen, methemoglobine en cholesterinase. Deze moeten per geval geïdentificeerd worden. 59. De volgende factoren kunnen van invloed zijn op de variabiliteit en de absolute concentraties van de hormoonbepalingen: — tijdstip waarop de dieren worden gedood, vanwege de schommelingen in de hormoonconcentraties gedurende de dag; — wijze waarop de dieren worden gedood: onnodige stress bij de dieren, waardoor de hormoonconcentraties kunnen worden beïnvloed, moet worden voorkomen; — testkits voor hormoonbepalingen, die verschillende standaardkrommen kunnen hebben. 60. Plasmamonsters die specifiek voor hormoonbepaling zijn bedoeld, moeten telkens op hetzelfde moment van de dag worden genomen. De verschillende in de handel verkrijgbare „assay kits” kunnen verschillende numerieke waarden opleveren bij de analyse van hormoonconcentraties. 61. In het geval van ontoereikende basisgegevens uit het verleden moet worden overwogen de hematologische en klinisch-biochemische variabelen te bepalen, bij voorkeur bij een groep dieren die niet in de testgroepen zijn opgenomen, of anders voordat met de toediening wordt begonnen. Voor vrouwtjes moeten de gegevens verkregen zijn bij zogende dieren. PATHOLOGIE Macroscopische obductie 62. Bij alle volwassen dieren in het onderzoek moet een volledige macroscopische obductie worden uitgevoerd, waaronder een zorgvuldig onderzoek van het huidoppervlak, alle lichaamsopeningen alsmede de schedelholte, de borstholte en de buikholte, en de inhoud daarvan. Bijzondere aandacht moet worden geschonken aan de organen van het voortplantingssysteem. Het aantal implantatieplaatsen moet worden geregistreerd. Op de dag van obductie moeten er vaginale uitstrijkjes onderzocht worden om de fase van de oestruscyclus te bepalen en deze in verband te kunnen brengen met de histopathologie van de vrouwelijke geslachtsorganen. 63. De testes en epididymides, evenals de prostaat en de zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren als geheel van alle volwassen mannetjes moeten zo nodig worden ontdaan van aanhechtend weefsel en zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. Optionele organen die eventueel ook gewogen kunnen worden, zijn onder meer het m levator ani plus bulbocavernosuscomplex, de Cowperse klieren en de glans penis bij mannetjes en de gepaarde ovaria (nat gewicht) en uterus (inclusief cervix) bij vrouwtjes; indien deze gewichten worden meegenomen, moeten ze zo snel mogelijk na de sectie worden opgenomen. Van alle volwassen dieren moeten de ovaria, testes, epididymides, secundaire geslachtsorganen en alle organen die macroscopische letsels vertonen, worden geconserveerd. 64. Van alle volwassen mannetjes en vrouwtjes en één mannelijk en één vrouwelijk dag 13-jong uit elk nest moeten de schildklieren in een fixeermiddel worden bewaard dat geschikt is voor het beoogde latere histopathologische onderzoek. Het gewicht van de schildklier kan na de fixatie worden bepaald. Aanhechtend weefsel moet zeer voorzichtig en pas na fixatie worden verwijderd, om beschadiging van de weefsels te voorkomen. Weefselbeschadigingen kunnen de histopathologische analyse negatief beïnvloeden. De bloedmonsters moeten worden genomen net voor of tijdens het euthanaseren van de dieren; er moet worden genoteerd uit welk lichaamsdeel. De monsters moeten onder de juiste omstandigheden worden bewaard (zie punt 56). 65. Bovendien moeten van ten minste vijf volwassen mannetjes en vrouwtjes die aselect worden gekozen uit elke groep (afgezien van dieren die stervend zijn aangetroffen en/of zijn gedood vóór beëindiging van het onderzoek) de lever, nieren, bijnieren, thymus, milt, hersenen en het hart zo nodig worden ontdaan van aanhechtend weefsel en zo spoedig mogelijk na de sectie nat worden gewogen om te voorkomen dat ze uitdrogen. De volgende weefsels moeten in een fixeermiddel worden bewaard dat zowel voor het type weefsel als voor het beoogde latere histopathologische onderzoek geschikt is: elk macroscopisch waarneembaar letsel, hersenen (representatieve delen waaronder cerebrum, cerebellum en pons), ruggenmerg, oog, maag, dunne en dikke darm (inclusief Peyerse platen), lever, nieren, bijnieren, milt, hart, thymus, luchtpijp en longen (conserveren door opblazen met een fixatief en dan onderdompelen), geslachtsklieren (testes en ovaria), secundaire geslachtsorganen (uterus en cervix, epididymides, prostaat, zaadblaasjes plus coagulans uitscheidende klieren), vagina, urineblaas, lymfeklieren (naast de meest proximale afvoerende lymfeklier moet ook een andere lymfeklier worden uitgenomen, afhankelijk van de ervaringen van het laboratorium (16)), perifere zenuwen (nervus ischiadicus of nervus tibialis), bij voorkeur dicht bij de spier, skeletspier en bot, met beenmerg (een coupe, of in plaats daarvan een direct op een objectglaasje aangebracht stukje beenmergaspiraat). Aanbevolen wordt de testes te fixeren door middel van onderdompeling in Bouin-oplossing of gemodificeerde Davidson-oplossing (16) (17) (18); fixatie in formaline wordt voor deze weefsels niet aanbevolen. De tunica albuginea kan voorzichtig en ondiep met een naald worden ingeprikt op de beide polen van het orgaan, zodat het fixatief snel kan binnendringen. Uit de klinische en andere bevindingen kan de noodzaak blijken verder weefsel te onderzoeken. Ook organen waarvan op basis van de bekende eigenschappen van de teststof verondersteld wordt dat ze kunnen worden aangetast, moeten worden bewaard. 66. De volgende weefsels kunnen nuttige aanwijzingen geven voor met het endocrien systeem samenhangende effecten: geslachtsklieren (ovaria en testes), secundaire geslachtsorganen (uterus inclusief cervix, epididymides, zaadblaasjes met coagulans afscheidende klieren, dorsolaterale en ventrale prostaat), vagina, hypofyse, mannelijke borstklier en bijnier. Er bestaat onvoldoende documentatie over veranderingen in de mannelijke borstklieren, maar deze parameter zou kan erg gevoelig kunnen zijn voor stoffen met oestrogene werking. De waarneming van niet in de lijst van punt 65 opgenomen organen/weefsels is facultatief. 67. Dode jongen en jongen die op dag 13 na het werpen, of kort daarna, zijn gedood, moeten in elk geval uitwendig zorgvuldig worden onderzocht op macroscopisch zichtbare afwijkingen. Daarbij wordt met name gelet op de uitwendige voortplantingsorganen, die op tekenen van een afwijkende ontwikkeling worden onderzocht. Histopathologie 68. Bij alle dieren in de groep behandeld met het hoogste dosisniveau en bij de dieren in de controlegroep moet een volledig histopathologisch onderzoek worden verricht op de bewaarde organen en weefsels (met speciale aandacht voor de stadia van de spermatogenese en de histopathologie van de interstitiële testiculaire celstructuur). Van jongen en van de overgebleven volwassen dieren kan de schildklier worden onderzocht indien nodig. Wanneer er behandelingsgerelateerde veranderingen worden waargenomen in de hogedosisgroep, moeten ook de dieren in de andere doseringsgroepen worden onderzocht. In de richtsnoeren voor histopathologisch onderzoek (10) zijn nadere gegevens opgenomen over de sectie, de fixatie, het snijden van coupes en de histopathologie van endocriene weefsels. 69. Alle macroscopisch waarneembare beschadigingen moeten onderzocht worden. Om bij te dragen tot de bepaling van de NOAEL moeten de doelorganen in andere dosisgroepen worden onderzocht, vooral in groepen waarvoor een NOAEL wordt geclaimd. 70. Bij het histopathologisch onderzoek van de dieren in de satellietgroepen moet speciaal worden gelet op die organen en weefsels waarin effecten blijken te zijn opgetreden bij de andere behandelde groepen. GEGEVENS EN RAPPORTAGE Gegevens 71. Er worden voor elk dier apart gegevens verstrekt. Daarnaast moeten alle gegevens worden samengevat in tabelvorm, waarbij voor elke testgroep worden vermeld: het aantal dieren aan het begin van de test, het aantal dieren dat tijdens de test dood is aangetroffen of met het oog op een humane behandeling is gedood, het tijdstip van sterfte of doding, het aantal vruchtbare dieren, het aantal drachtige vrouwtjes, het aantal dieren met toxiciteitsverschijnselen, een beschrijving van de waargenomen toxiciteitsverschijnselen met vermelding van de aanvang, de duur en de ernst van de toxische effecten, de aard van de histopathologische veranderingen en alle relevante gegevens over de nesten. In aanhangsel 3 is een opzet van een overzichtstabel opgenomen die heel praktisch is gebleken voor de beoordeling van effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. 72. Waar mogelijk moeten getalsmatige resultaten met behulp van een geschikte en algemeen erkende statistische methode worden geëvalueerd. Het gebruik van meerdere t-tests moet worden voorkomen door vergelijking van het effect over een dosisbereik. De statistische methoden moeten gedurende de opzet van het onderzoek worden gekozen. De statistische analyse van de AGD en de tepelretentie moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nesteffecten. Waar passend is het nest de analyse-eenheid. De statistische analyse van lichaamsgewicht van de jongen moet worden gebaseerd op de gegevens voor afzonderlijke jongen, waarbij rekening wordt gehouden met nestgrootte. Vanwege de beperkte omvang van het onderzoek, zijn statistische analyses in de vorm van toetsen voor „significantie” voor veel eindpunten, vooral die in verband met de voortplanting, van beperkte waarde. Sommige van de meest gebruikte methoden, met name parametrische toetsen voor het meten van de centrale tendens, zijn niet geschikt. Als er statistische analyses worden gebruikt, moeten de gekozen methoden geschikt zijn voor de verdeling van de onderzochte variabele en moeten ze vóór de start van het onderzoek worden gekozen. Evaluatie van de resultaten 73. De resultaten van dit toxiciteitsonderzoek worden beoordeeld aan de hand van de waargenomen effecten en de resultaten van de obductie en het microscopisch onderzoek. De beoordeling omvat het verband tussen de dosis van de teststof en de aanwezigheid of afwezigheid, de frequentie en de ernst van afwijkingen zoals macroscopisch letsel, gespecificeerde doelorganen, onvruchtbaarheid, klinische afwijkingen, aantasting van de reproductie- en nestresultaten, veranderingen in het lichaamsgewicht, effecten op de mortaliteit en andere toxische effecten. 74. Vanwege de korte behandelperiode van de mannetjes, moeten bij de beoordeling van effecten op de voortplanting bij mannetjes niet alleen de vruchtbaarheidsgegevens, maar ook de histopathologie van de testes en de epididymides in aanmerking worden genomen. Ook het gebruik van historische controlegegevens over voortplanting/ontwikkeling (bv. voor nestgrootte, AGD, tepelretentie, T4-serumspiegels), indien beschikbaar, kan nuttig zijn ter ondersteuning van de interpretatie van het onderzoek. 75. Voor de kwaliteitscontrole wordt voorgesteld historische controlegegevens te verzamelen en variatiecoëfficiënten te berekenen voor numerieke gegevens, met name voor de parameters die verband houden met het opsporen van hormoonontregelaars. Deze gegevens kunnen voor vergelijkingsdoeleinden worden gebruikt wanneer daadwerkelijk uitgevoerd onderzoek wordt geëvalueerd. Testverslag 76. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: — bron, partijnummer, uiterste gebruiksdatum, indien beschikbaar; — stabiliteit van de teststof, indien bekend. Stof die uit één component bestaat: — fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen; — chemische identificatiegegevens, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar enz. Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB’s en mengsels: — voor zover mogelijk, karakterisering aan de hand van chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen . Vehiculum (indien van toepassing): — motivering voor de keuze van het vehiculum, indien geen water wordt gebruikt. Proefdieren: — gebruikte soort/stam; — aantal, leeftijd en geslacht van de dieren; — herkomst, leefomstandigheden, voeding enz.; — gewicht van elk dier aan het begin van de test; — motivering voor het gebruik van een ander soort dan ratten. Testomstandigheden: — achtergrond voor de keuze van de dosisniveaus; — gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat; — gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof; — omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing; — gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water; — gedetailleerde beschrijving van de randomisatieprocedure voor de selectie van te ruimen jongen, indien van toepassing. Resultaten: — lichaamsgewicht en veranderingen in het lichaamsgewicht; — waar van toepassing, voedselverbruik en waterverbruik; — gegevens over de toxische reactie naar geslacht en dosis, met inbegrip van vruchtbaarheid, dracht en andere gegevens over — toxiciteit; — duur van de dracht; toxische of andere effecten op de reproductie, de jongen, de postnatale groei enz.; — aard, ernst en duur van (al dan niet reversibele) klinische waarnemingen; — bepalingen van de sensorische activiteit, grijpkracht en motorische activiteit; — uitgevoerde hematologische onderzoeken en de relevante referentiewaarden; — uitgevoerde klinisch-biochemische onderzoeken en de relevante referentiewaarden; — aantal volwassen vrouwtjes met een normale of abnormale oestruscyclus en cyclusduur van deze vrouwtjes; — aantal levend geboren jongen en verliezen na implantatie; — aantal jongen met macroscopisch zichtbare afwijkingen; macroscopische beoordeling van de uitwendige geslachtsorganen, aantal ondermaatse jongen; — tijdstip van sterfte tijdens het onderzoek en of de dieren overleefden tot het einde van het onderzoek; — aantal implantaties, nestgrootte en nestgewichten op het moment van registratie; — gegevens over het lichaamsgewicht van jongen; — AGD van alle jongen (en lichaamsgewicht op de dag van de AGD-meting); — tepelretentie bij mannelijke jongen; — schildklierhormoonspiegels bij dag 13-jongen en volwassen mannetjes (en moederdieren en dag 4-jongen indien gemeten); — lichaamsgewicht bij het doden van de dieren en gegevens over het gewicht van organen voor de ouderdieren; — obductiebevindingen; — een gedetailleerde beschrijving van histopathologische bevindingen; — resorptiegegevens (indien beschikbaar); — een statistische behandeling van de resultaten, indien van toepassing. Bespreking van de resultaten. Conclusies. Interpretatie van resultaten 77. Op basis van dit onderzoek kan de reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit worden beoordeeld bij de toediening van herhaalde doses. Aangezien de nadruk wordt gelegd op zowel het eindpunt algemene toxiciteit als het eindpunt reproductie-/ontwikkelingstoxiciteit, kan met de resultaten van het onderzoek in het bijzonder onderscheid worden gemaakt tussen reproductie-/ontwikkelingseffecten die zich voordoen bij afwezigheid van algemene toxiciteit, en reproductie-/ontwikkelingseffecten die alleen tot uitdrukking komen bij niveaus die ook toxisch zijn voor ouderdieren (zie de punten 7-11). Het onderzoek zou een indicatie kunnen geven of verder onderzoek nodig is en zou oriëntatiepunten kunnen bieden voor de opzet van vervolgonderzoeken. OESO-leidraad nr. 43 moet worden geraadpleegd voor hulp bij de interpretatie van resultaten op het gebied van reproductie- en voortplantingstoxiciteit (19). In OESO-leidraad nr. 106 over de histologische beoordeling van endocriene en voortplantingstests bij knaagdieren (16) is informatie te vinden over het prepareren en beoordelen van (endocriene) organen en vaginale uitstrijkjes, die van nut kan zijn voor deze testmethode. LITERATUUR (1) OESO (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (2) OESO (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokyo, 27th-29th October, 1992. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. and Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). J. Toxicol , Sci., 19, 141-149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. and Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. Fundam. Appl. Toxicol ., 18, 89-95. (5) OESO (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10th-11th March 1998. Op aanvraag verkrijgbaar bij de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (6) OESO (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (No 217), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (7) OESO (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations, Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment, (No 19), Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, Parijs. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M.and Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies, Birth Defects Research , Part B, 80 (2), 84-97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons, in Auston C.R. and Short R.V. (Eds.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization, Cambridge, New York. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Environmental Health Criteria Document (No 60). (11) Moser V.C., McDaniel K.M. and Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol . Appl. Pharmacol ., 108, 267-283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. and Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol ., 1, 233-236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Re