(6)

de volgende hoofdstukken C.31 tot C.46 worden toegevoegd: „ C.31. TEST MET TERRESTRISCHE PLANTEN: OPKOMST EN GROEI VAN ZAAILINGEN INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 208 (2006) van de OESO. Testmethoden worden periodiek herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruitgang en om aan de regelgeving te kunnen blijven voldoen. Deze bijgewerkte testmethode is bedoeld om de potentiële effecten van chemische stoffen op de opkomst en groei van zaailingen te bepalen. De methode als zodanig heeft geen betrekking op chronische effecten en effecten op de voortplanting (d.w.z. zaadzetting, bloemvorming, vruchtrijping). De blootstellingsomstandigheden en de eigenschappen van de chemische stof zijn bepalende factoren bij het kiezen van de juiste testmethoden (bij het testen van metalen/metaalverbindingen moet bijvoorbeeld rekening worden gehouden met effecten van de pH en de desbetreffende tegenionen (1). Deze testmethode heeft geen betrekking op planten die aan dampen van chemische stoffen worden blootgesteld. De testmethode is geschikt voor het testen van algemene chemische stoffen, biociden en gewasbeschermingsmiddelen (ook bekend als plantenbeschermingsmiddelen of pesticiden). De methode is ontwikkeld op basis van bestaande methoden (2) (3) (4) (5) (6) (7). Ook andere literatuur over plantentests is in aanmerking genomen (8) (9) (10). De gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 2. Met de test worden de effecten op de opkomst van zaailingen en de vroege groei van hogere planten bepaald na blootstelling aan de teststof in de grond (of een geschikte grondmatrix). Zaden worden in contact gebracht met grond die is behandeld met de teststof, en worden 14 tot 21 dagen na opkomst van 50 % van de zaailingen in de controlegroep op effecten onderzocht. De gemeten eindpunten zijn visuele vaststelling van de zaailingenopkomst, het drooggewicht van de scheuten (of versgewicht van de scheuten) en in bepaalde gevallen de hoogte van de scheuten, alsook een beoordeling van zichtbare schadelijke effecten op verschillende delen van de plant. Deze metingen en observaties worden vergeleken met die gedaan aan onbehandelde controleplanten. 3. Afhankelijk van de verwachte blootstellingsroute wordt de teststof hetzij opgenomen in de grond (of eventueel een kunstmatige grondmatrix) of aangebracht op het oppervlak van de grond. Voor opname in de grond wordt een grote hoeveelheid grond behandeld. Deze wordt vervolgens in potten gedaan, waarna zaden van de betreffende plant in de grond worden geplant. Aanbrenging op het oppervlak gebeurt op grond in potten waarin de zaden al zijn geplant. De testeenheden (controlepotten en potten met behandelde grond, plus zaden) worden vervolgens onder omstandigheden geplaatst die bevorderlijk zijn voor de kieming/groei van de planten. 4. De test kan worden opgezet met het doel de dosis-responscurve te bepalen of kan in één concentratie/dosering worden uitgevoerd als een limiettest, naargelang van het doel van het onderzoek. Als de resultaten van de test met één concentratie/dosering een bepaald toxiciteitsniveau overschrijden (bv. wanneer er effecten groter dan x % worden waargenomen), kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd om de boven- en ondergrens voor de toxiciteit te bepalen, gevolgd door een test met meerdere concentraties/doseringen om een dosis-responscurve te verkrijgen. Er wordt een passende statistische analyse uitgevoerd om de effectieve concentratie ECx of de effectieve toepassingsdosering ERx (bv. EC25, ER25, EC50, ER50) voor de meest gevoelige gemeten parameter(s) te verkrijgen. Bij deze test kunnen ook de concentratie zonder waargenomen effect (NOEC) en de laagste concentratie met waargenomen effect (LOEC) worden berekend. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF 5. De volgende informatie is nuttig voor het vaststellen van de verwachte route van blootstelling aan de chemische stof en het ontwerpen van de test: structuurformule, zuiverheid, wateroplosbaarheid, oplosbaarheid in organische oplosmiddelen, 1-octanol/water-verdelingscoëfficiënt, sorptiegedrag van de grond, dampspanning, chemische stabiliteit in water en licht, en biologische afbreekbaarheid. GELDIGHEID VAN DE TEST 6. Voor een geldige test moet in de controles aan de volgende prestatiecriteria worden voldaan: — ten minste 70 % van de zaailingen moet opkomen; — de zaailingen mogen geen zichtbare tekenen van fytotoxische effecten vertonen (bv. chlorose, necrose, verwelking, blad- en stengelmisvormingen) en de planten mogen alleen de variatie in groei en uiterlijk vertonen die voor die specifieke soort normaal is; — de gemiddelde overleving van opgekomen controlezaailingen aan het eind van de onderzoeksperiode moet minstens 90 % zijn; — de omgevingsomstandigheden voor alle planten van een bepaalde soort moeten identiek zijn en de groeimedia moeten dezelfde hoeveelheid grondmatrix, hulpmedium of substraat bevatten uit dezelfde bron. REFERENTIESTOF 7. Met regelmatige tussenpozen kan een referentiestof worden getest om te verifiëren dat de prestaties van de test, de respons van de betreffende testplanten en de testomstandigheden niet beduidend zijn veranderd in de loop van de tijd. De prestaties van het testsysteem in een bepaald laboratorium kunnen ook worden beoordeeld aan de hand van historische metingen van de biomassa of groei van controleplanten, en op deze manier kan de kwaliteit binnen een laboratorium worden bewaakt.. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Natuurlijke grond — kunstmatig substraat 8. Planten kunnen in potten worden gekweekt in zanderige leemgrond, lemige zandgrond of zanderige kleileemgrond die ten hoogste 1,5 % organische koolstof bevat (circa 3 % organisch materiaal). In de handel verkrijgbare potgrond of een kunstmatig grondmengsel met ten hoogste 1,5 % organische koolstof kan eveneens worden gebruikt. Kleigrond is niet geschikt indien van de teststof bekend is dat deze een hoge affiniteit voor klei heeft. Bodemgrond moet gezeefd worden over een zeef met mazen van 2 mm om de grond te homogeniseren en grove korrels te verwijderen. Van de uiteindelijk bereide grond moeten de soort, de textuur, het percentage organische koolstof, de pH, het zoutgehalte en de elektrische geleidbaarheid worden gerapporteerd. De grond moet worden ingedeeld volgens een standaardclassificatiediagram (11). Om het effect van bodempathogenen te beperken kan de grond gepasteuriseerd worden of met hitte worden behandeld. 9. Het gebruik van natuurlijke grond kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijken en de variabiliteit ervan vergroten door variërende fysisch-chemische eigenschappen en microbiële populaties. Deze variabelen zijn van invloed op het vochtvasthoudend vermogen, het vermogen om chemische stoffen te binden, de luchtdoorlatendheid en het gehalte aan nutriënten en spoorelementen. Naast de variaties in fysische factoren zullen er ook variaties in chemische eigenschappen zijn, zoals de pH en redoxpotentiaal, die invloed kunnen hebben op de biologische beschikbaarheid van de teststof (12) (13) (14). 10. Kunstmatige substraten worden doorgaans niet voor het testen van gewasbeschermingsmiddelen gebruikt; ze kunnen wel van nut zijn voor het testen van algemene chemische stoffen of wanneer het wenselijk is de variabiliteit die kenmerkend is voor natuurlijke grond te minimaliseren en de vergelijkbaarheid van de testresultaten te vergroten. Substraten dienen uit inerte materialen te bestaan die minimale interactie met de teststof, het als drager fungerende oplosmiddel, of beide, vertonen. Zuurgewassen kwartszand, minerale wol en glaskorrels (bv. 0,35 tot 0,85 mm in diameter) zijn geschikte inerte materialen die de teststof (15) nauwelijks absorberen, zodat de stof maximaal beschikbaar is voor opname door de zaailing via de wortel. Ongeschikte substraten zijn onder meer vermiculiet, perliet en andere sterk absorberende materialen. Er moeten nutriënten voor de groei van de plant worden toegevoegd om stress door nutriëntentekorten te voorkomen, en waar mogelijk moet dit worden beoordeeld door middel van biochemische analyses of visuele beoordeling van controleplanten. Criteria voor het selecteren van soorten voor de test 11. De selectie van soorten moet redelijk breed zijn, bv. wat betreft taxonomische diversiteit in het plantenrijk, verspreiding, abundantie, soortspecifieke levenscycluskenmerken en habitat, zodat uiteenlopende responsen worden verkregen (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Bij de selectie moeten de volgende kenmerken in aanmerking worden genomen: — de soort heeft uniforme zaden die gemakkelijk verkrijgbaar zijn bij een of meer betrouwbare standaard zaadbronnen en vertoont consistente, betrouwbare en gelijkmatige kieming en een gelijkvormige groei van de zaailingen. — de plant leent zich voor laboratoriumtests en kan betrouwbare resultaten opleveren die reproduceerbaar zijn binnen één testfaciliteit en tussen verschillende testfaciliteiten; — de gevoeligheid van de geteste soort is in overeenstemming met de respons van planten die worden aangetroffen in de omgeving die blootstaat aan de chemische stof; — ze zijn in enige mate gebruikt in eerdere toxiciteitstests, en uit hun gebruik in bijvoorbeeld herbicide-bioassays, screening op zware metalen, tests op zout- of mineralenstress of allelopathiestudies is gebleken dat ze gevoelig zijn voor een grote verscheidenheid van stressoren; — ze kunnen groeien onder de groeiomstandigheden van de testmethode; — ze voldoen aan de geldigheidscriteria van de test. Aanhangsel 2 bevat een beperkte lijst van soorten die van oudsher het meest worden gebruikt, en aanhangsel 3 een lijst van mogelijke niet-gewassoorten. 12. Hoeveel soorten er getest moeten worden hangt af van de toepasselijke wettelijke voorschriften, en daarom wordt dit niet gespecificeerd in deze testmethode. Aanbrenging van de teststof 13. De chemische stof moet in een geschikte drager (bv. water, aceton, ethanol, polyethyleenglycol, Arabische gom, zand) worden aangebracht. Ook mengsels (geformuleerde producten of formuleringen) met werkzame en diverse toevoegingsstoffen kunnen getest worden. Verwerking in grond/kunstmatig substraat 14. Chemische stoffen die in water oplosbaar of suspendeerbaar zijn, worden aan water toegevoegd waarna de oplossing met een geschikt mengapparaat wordt vermengd met grond. Dit type test kan geschikt zijn als de blootstelling via grond of poriënwater plaatsvindt en er bezorgdheid is over opname via de wortels. Het watervasthoudend vermogen van de grond mag niet worden overschreden door de toevoeging van de teststof. Voor elke testconcentratie moet hetzelfde volume water worden toegevoegd, maar om klontering van de grond tot agglomeraten te voorkomen mag dit volume niet te groot zijn. 15. Slecht in water oplosbare stoffen water moeten in een geschikt vluchtig oplosmiddel (bv. aceton, ethanol) worden opgelost en met zand worden vermengd. Het oplosmiddel kan dan met een luchtstroom onder voortdurend mengen uit het zand worden verwijderd. Het behandelde zand wordt vermengd met de experimentele grond. Aan een tweede controle worden alleen zand en oplosmiddel toegevoegd. Er worden gelijke hoeveelheden zand, behandeld met oplosmiddel dat weer verwijderd is, aan alle dosisniveaus en de tweede controle toegevoegd. Voor vaste, onoplosbare teststoffen worden droge grond en de chemische stof in een geschikt mengapparaat vermengd. Hierna wordt de grond in potten gedaan en worden de zaden direct gezaaid. 16. Wanneer in plaats van grond een kunstmatig substraat wordt gebruikt, kunnen wateroplosbare stoffen vlak voor de test in de nutriëntenoplossing worden opgelost. Stoffen die onoplosbaar zijn in water, maar die in water kunnen worden gesuspendeerd door een oplosmiddel als drager te gebruiken, moeten met de drager aan de nutriëntenoplossing worden toegevoegd. Niet in water oplosbare chemische stoffen waarvoor geen niet-toxische wateroplosbare drager beschikbaar is, moeten in een geschikt vluchtig oplosmiddel worden opgelost. De oplossing wordt vermengd met zand of glaskorrels en vervolgens in een rotatieverdamper verdampt, waardoor een gelijkmatige laag van de stof achterblijft op het zand of de korrels. Voordat de potten worden gevuld moet een gewogen deel van de korrels met hetzelfde organische oplosmiddel worden geëxtraheerd en het gehalte aan chemische stof worden bepaald. Aanbrenging op het oppervlak 17. Voor gewasbeschermingsmiddelen wordt de teststof vaak aangebracht door het grondoppervlak te bespuiten met de testoplossing. Alle apparatuur die bij het uitvoeren van de tests wordt gebruikt, met inbegrip van apparatuur voor de bereiding en toediening van de chemische stof, moet een zodanige kwaliteit en capaciteit hebben dat de tests op een nauwkeurige wijze kunnen worden uitgevoerd en een reproduceerbare bedekking wordt verkregen. De bedekking moet voor alle grondoppervlakken hetzelfde zijn. Omstandigheden waarbij stoffen aan apparatuur kunnen adsorberen of ermee kunnen reageren moeten worden vermeden (bv. het gebruik van plastic slangen bij lipofiele chemische stoffen of stalen onderdelen en elementen). De manier waarop de teststof op het grondoppervlak wordt gespoten is een nabootsing van typische spuittanktoepassingen. De spuitvolumes moeten in het algemeen overeenkomen met die in de normale landbouwpraktijk en dienen gerapporteerd te worden (hoeveelheid water enz.). Er moet een type straalpijp worden gekozen dat een gelijkmatige bedekking van het grondoppervlak geeft. Wanneer oplosmiddelen en dragers worden gebruikt, moet een tweede groep van controleplanten worden opgezet die alleen oplosmiddel/drager krijgen. Dit is niet nodig voor gewasbeschermingsmiddelen die als formuleringen worden getest. Verificatie van de concentratie/dosering van de teststof 18. De toegepaste concentraties/doseringen moeten op passende wijze geverifieerd worden. Voor oplosbare chemische stoffen kan verificatie van alle testconcentraties/-doseringen plaatsvinden door de hoogste in de test gebruikte concentratie testoplossing te analyseren waarbij de verdere verdunning wordt gedocumenteeerd en er gekalibreerde toepassingsapparatuur wordt gebruikt (bv. gekalibreerd analytisch glaswerk, kalibratie van spuitapparatuur). Voor onoplosbare chemische stoffen moet bij de verificatie het gewicht van de aan de grond toegevoegde teststof worden vermeld. Een analyse van de grond kan nodig zijn indien de homogeniteit moet worden aangetoond. PROCEDURE Testopzet 19. Zaden van dezelfde soort worden in potten geplant. Hoeveel zaden er per pot worden geplant is afhankelijk van de soort, grootte van de potten en duur van de test. Het aantal planten per pot moet zodanig zijn dat de groeiomstandigheden adequaat zijn en de potten in de loop van de test niet overvol raken. De maximale plantdichtheid is ongeveer 3-10 zaden per 100 cm2, afhankelijk van de grootte van de zaden. Voorbeelden van aanbevolen aantallen zijn: voor maïs, soja, tomaat, komkommer en suikerbiet 1 à 2 planten per pot van 15 cm, voor koolzaad en erwt 3 planten per pot van 15 cm, en voor ui, tarwe en andere soorten met kleine zaden 5 à 10 planten per pot van 15 cm. Het aantal zaden en replicaatpotten (een replicaat is gedefinieerd als een pot; planten in dezelfde pot zijn dus geen replicaten) moet optimale statistische analyse mogelijk maken (21). Er moet worden opgemerkt dat de variabiliteit groter zal zijn voor soorten waarbij een kleiner aantal grote zaden per pot (replicaat) wordt gebruikt dan voor soorten waarbij per pot een groter aantal kleine zaden kan worden gebruikt. Deze variabiliteit kan worden beperkt door in elke pot evenveel zaden te planten. 20. Het gebruik van controlegroepen moet waarborgen dat de waargenomen effecten samenhangen met of zijn toe te schrijven aan blootstelling aan de teststof. De controlegroep dient in elk opzicht identiek te zijn aan de testgroep, behalve wat betreft blootstelling aan de teststof. Binnen een test moeten alle planten, ook de controles, afkomstig zijn uit dezelfde bron. Voor vertekening te voorkomen moeten de test- en controlepotten willekeurig worden ingedeeld. 21. Zaden omhuld met een dunne laag insecticide of fungicide (d.w.z. gecoate zaden) moeten worden vermeden. Het gebruik van bepaalde niet-systemische contactfungiciden (bv. captan, thiram) wordt door sommige regelgevende instanties echter wel toegestaan (22). Bij bezorgdheid over zaadoverdraagbare pathogenen kunnen de zaden kort in een oplossing met een lage concentratie (5 %) natriumhypochloriet worden geweekt, gevolgd door grondig spoelen onder stromend water en drogen. Herstelbehandeling met een ander gewasbeschermingsmiddel is niet toegestaan. Testomstandigheden 22. De testomstandigheden moeten de omstandigheden die vereist zijn voor normale groei van de geteste soorten en variëteiten benaderen (aanhangsel 4 bevat voorbeelden van testomstandigheden). De opkomende planten moeten volgens goede tuinbouwpraktijken in klimaatkamers, fytotrons of kassen worden gekweekt. Bij het gebruik van kweekfaciliteiten omvatten deze praktijken meestal het reguleren en voldoende frequent (bv. dagelijks) registreren van de temperatuur, vochtigheid, koolstofdioxideconcentratie, licht (intensiteit, golflengte, fotosynthetisch actieve straling) en lichtperiode, manier van bewatering enz. om een goede groei te waarborgen, die wordt afgelezen aan de controleplanten van die specifieke soort. De kastemperatuur moet gereguleerd worden met ventilatie-, verwarmings- en/of koelingssystemen. Voor in kassen uitgevoerde tests worden in het algemeen de volgende omstandigheden aanbevolen: — temperatuur: 22 °C ± 10 °C; — vochtigheid: 70 % ± 25 %; — fotoperiode: minimaal 16 uur licht — lichtintensiteit: 350 ± 50 μE/m2/s. Extra verlichting kan nodig zijn als de intensiteit lager wordt dan 200 μE/m2/s, in het golflengtebereik 400-700 nm, behalve voor bepaalde soorten die minder licht nodig hebben. Tijdens het onderzoek moeten de omgevingsomstandigheden worden gemonitord en gerapporteerd. De planten worden in niet-poreuze plastic of glazen potten gekweekt, met onder de pot een bak of schotel. De potten kunnen periodiek worden verplaatst om de variabiliteit in de groei van de planten (door verschillen in testomstandigheden binnen de kweekfaciliteit) te minimaliseren. De potten moeten groot genoeg zijn om normale groei mogelijk te maken. 23. Er kunnen extra nutriënten aan de grond worden toegevoegd voor zover dat nodig is om een goede groeikracht te behouden. Of en op welk moment dit moet gebeuren kan worden beoordeeld door observatie van de controleplanten. Het wordt aanbevolen de planten van onderaf te bewateren (bv. gebruikmakend van pitten van glasvezels). In eerste instantie mag wel van bovenaf worden bewaterd om de zaadkieming te stimuleren en om op het oppervlak aangebrachte teststof sneller in de grond te laten dringen. 24. De specifieke kweekomstandigheden dienen te worden afgestemd op de geteste soort en de onderzochte teststof. Controle- en behandelde planten moeten onder dezelfde omgevingsomstandigheden worden gehouden, waarbij wel passende maatregelen moeten worden genomen om (bv. bij een vluchtige teststof) kruisblootstelling tussen verschillende behandelingen en van controles aan de teststof te voorkomen. Tests met één concentratie/dosering 25. Om te bepalen welke concentratie/dosering van de chemische stof geschikt is voor het uitvoeren van een test met één concentratie of dosering (challenge test/limiettest), moet rekening worden gehouden met een aantal factoren. Voor algemene chemische stoffen zijn onder meer de fysisch-chemische eigenschappen van belang. Voor gewasbeschermingsmiddelen moet gekeken worden naar de fysisch-chemische eigenschappen en het gebruikspatroon van de chemische stof, de maximale concentratie of toepassingsdosering, het aantal toepassingen per seizoen en/of de persistentie van de teststof. Om vast te stellen of een algemene chemische stof fytotoxische eigenschappen heeft, kan het zinvol zijn om bij de maximale concentratie van 1 000 mg/kg droge grond te testen. Bereikbepalingstest 26. Indien nodig kan een bereikbepalingstest worden uitgevoerd om een indicatie te krijgen van de concentraties/doseringen die in het definitieve dosis-responsonderzoek moeten worden getest. De testconcentraties/-doseringen voor een bereikbepalingstest moeten ruim uit elkaar liggen (bv. 0,1, 1,0, 10, 100 en 1 000 mg/kg droge grond). Voor gewasbeschermingsmiddelen kunnen de concentraties/doseringen gebaseerd worden op de aanbevolen of maximale concentratie of toepassingsdosering, bv. 1/100, 1/10, 1/1 van de aanbevolen/maximale concentratie of toepassingsdosering. Tests met meerdere concentraties/doseringen 27. Een test met meerdere concentraties/doseringen wordt uitgevoerd om een dosis-responsrelatie vast te stellen en een ECx of ERx-waarde te bepalen voor opkomst, biomassa en/of zichtbare effecten, in vergelijking met niet-blootgestelde controles, zoals vereist door regelgevende instanties. 28. Het aantal en de onderlinge afstand van de concentraties of doseringen moeten zodanig zijn dat een betrouwbare dosis-responsrelatie en regressievergelijking worden verkregen en de ECx. of ERx. kan worden geschat. De gekozen concentraties/doseringen moeten de te bepalen ECx of ERxwaarden omvatten. Als bijvoorbeeld een EC50-waarde moet worden bepaald, is het wenselijk de test uit te voeren met doseringen die 20 tot 80 % effect veroorzaken. Om dit te bereiken worden bij voorkeur ten minste vijf testconcentraties/-doseringen gebruikt in een meetkundige reeks met een reden van ten hoogste 3, plus een onbehandelde controle. Voor elke dosisgroep en de controlegroep moet het aantal replicaten ten minste vier zijn en het totale aantal zaden ten minste 20. Bij bepaalde planten met een laag kiemingspercentage of een variabel groeigedrag zijn wellicht meer replicaten nodig om de statistische power te vergroten. Als een groter aantal testconcentraties/-doseringen wordt gebruikt, kan met minder replicaten worden volstaan. Als schatting van de NOEC nodig is, zijn mogelijk meer replicaten nodig om de gewenste statistische power te verkrijgen (23). Observaties 29. Gedurende de observatieperiode, d.w.z. 14 tot 21 dagen na opkomst van 50 % van de controleplanten (dit kunnen ook oplosmiddelcontroles zijn), worden de planten regelmatig geobserveerd (ten minste wekelijks en zo mogelijk dagelijks) op opkomst, zichtbare tekenen van fytotoxiciteit en sterfte. Aan het eind van de test moeten het opkomstpercentage en de biomassa van overlevende planten worden geregistreerd, alsook zichtbare schadelijke effecten op verschillende delen van de plant. Het kan hierbij gaan om een afwijkend uiterlijk van de opgekomen zaailingen, dwerggroei, chlorose, verkleuring, sterfte en effecten op de ontwikkeling van de plant. De biomassa aan het eind kan gemeten worden als het uiteindelijke gemiddelde drooggewicht van de scheuten, door de scheuten vanaf het grondoppervlak te oogsten en tot een constant gewicht te drogen bij 60 °C. De biomassa aan het eind kan ook gemeten worden als het versgewicht van de scheuten. De hoogte van de scheuten kan een ander eindpunt zijn als de regelgeving dat vereist. Er moet een uniform scoringssysteem voor zichtbare schade worden gebruikt om de waarneembare toxische reponsen te evalueren. Voorbeelden van kwalitatieve en kwantitatieve visuele beoordelingen zijn te vinden in literatuur (23) (24). GEGEVENS EN RAPPORTAGE Statistische analyse Test met één concentratie/dosering 30. De gegevens voor elke plantensoort moeten met behulp van een passende statistische methode worden geanalyseerd (21). Het niveau van het effect bij de testconcentratie/dosering, of de waarneming dat een bepaald effect niet wordt bereikt bij de testconcentratie/dosering, moet gerapporteerd worden (bv. < x% effect waargenomen bij y concentratie of dosering). Test met meerdere concentraties/doseringen 31. Er wordt een dosis-responsrelatie vastgesteld in de vorm van een regressievergelijking. Er kunnen verschillende modellen worden gebruikt. Voor het schatten van ECx of ERx (bv. EC25, ER25, EC50, ER50) en de bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen voor de opkomst van zaailingen als een binaire respons kunnen de logit-, probit-, Weibull-, Spearman-Karber-, getrimde Spearman-Karber-methode enz. geschikt zijn. Voor de groei van de zaailingen (gewicht en hoogte) als continue eindpunten kunnen de ECx of ERx en de bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen worden geschat door middel van geschikte regressieanalyse (bv. niet-lineaire regressieanalyse volgens Bruce-Versteeg (25)). Waar mogelijk moet de R2 0,7 of hoger zijn voor de meest gevoelige soort en moeten de gebruikte testconcentraties/-doseringen het gebied tussen 20 % tot 80 % effect omvatten. Als de NOEC moet worden geschat, worden bij voorkeur krachtige statistische tests toegepast die gekozen worden op basis van gegevensverdeling (21) (26). Testverslag 32. Het testverslag moet de onderzoeksresultaten bevatten, alsook een gedetailleerde beschrijving van de testomstandigheden, een diepgaande bespreking van de resultaten, analyse van de meetgegevens en de uit de analyse getrokken conclusies. Een overzichtstabel en een samenvatting van de resultaten zijn eveneens vereist. In het testverslag moet informatie worden opgenomen: Teststof: — chemische idententificatiegegevens, relevante eigenschappen van de geteste chemische stof (bv. log Pow, oplosbaarheid in water, dampspanning en informatie over het lot en het gedrag in het milieu, indien beschikbaar); — details over de bereiding van de testoplossing en verificatie van testconcentraties zoals beschreven in punt 18. Geteste soort: — gegevens over het testorganisme: soort/variëteit, plantenfamilies, wetenschappelijke en gewone naam, bron en geschiedenis van het zaad, zo gedetailleerd mogelijk (d.w.z. naam van de leverancier, kiemingspercentage, grootte van de zaden klasse, partij- of lotnummer, jaar of groeiseizoen waarin het zaad werd geoogst, datum van beoordeling van kieming), levensvatbaarheid, enz.; — aantal geteste mono- en dicotyle soorten; — motivering van de keuze van de soort; — beschrijving van de bewaring, behandeling en instandhouding van het zaad. Testomstandigheden: — testfaciliteit (bv. klimaatkast, fytotron en kas); — beschrijving van het testsysteem (bv. afmetingen en materiaal van de potten en hoeveelheden grond); — kenmerken van de grond (textuur of soort grond: korrelgrootteverdeling en indeling, fysische en chemische eigenschappen met inbegrip van % organisch materiaal, % organische koolstof en pH); — bereiding van grond/substraat (bv. grond, kunstmatige grond, zand e.a.) voorafgaand aan test; — beschrijving van het voedingsmedium, indien gebruikt; — aanbrenging van de teststof: beschrijving van de aanbrengingsmethode, beschrijving van apparatuur, blootstellingsdoseringen en -volumes met inbegrip van chemische verificatie, beschrijving van de kalibratiemethode en beschrijving van omgevingsomstandigheden tijdens de aanbrenging; — groeiomstandigheden: lichtintensiteit (bv. fotosynthetisch actieve straling (PAR)), fotoperiode, max/min temperaturen, bewateringsschema en — methode, — aantal zaden per pot, aantal planten per dosis, aantal replicaten (potten) per blootstellingsdosering; — soort en aantal controles (negatieve en/of positieve controles, oplosmiddelcontrole indien gebruikt); — duur van de test. Resultaten: — tabel met alle eindpunten voor elk replicaat, testconcentratie/dosering en soort; — aantal en percentage opgekomen planten in vergelijking met controles; — gemeten biomassa (drooggewicht of versgewicht van scheuten) van de planten uitgedrukt als percentage van de controles; — scheuthoogte van de planten als percentage van de controles, indien gemeten; — percentage zichtbare schade en een kwalitatieve en kwantitatieve beschrijving van zichtbare schade (chlorose necrose, verweking, blad- en stengelmisvorming, alsook eventuele afwezigheid van effecten) door de teststof in vergelijking met controleplanten; — beschrijving van de waarderingsschaal gebruikt voor het beoordelen van zichtbare schade, indien visuele waarderingen worden opgegeven; — voor onderzoeken met één dosering moet het percentage schade worden vermeld; — ECx of ERx (bv. EC50, ER50, EC25, ER25)-waarden en bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen. Als regressieanalyse is uitgevoerd moeten de standaardfout voor de regressievergelijking en de standaardfout voor individuele parameterschattingen (helling, snijpunt met de y-as) worden opgegeven; — NOEC (en LOEC) indien berekend; — beschrijving van de gebruikte statistische procedures en aannames; — grafische weergave van deze gegevens en de dosis-responsrelatie voor de geteste soort. Afwijkingen van de in deze testmethode beschreven procedures en eventuele ongebruikelijke gebeurtenissen tijdens de test. LITERATUUR (1) Schrader G., Metge K., and Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193. (2) International Organisation of Standards. (1993). ISO 11269-1 Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth. (3) International Organisation of Standards. (1995). ISO 11269-2 Soil Quality -- Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora — Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants. (4) American Standard for Testing Material (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests. (5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, Part 158.540. Subdivision J, Parts 122-1 and 123-1. (6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines: — 850.4000: Background — Non-target Plant Testing; — 850.4025: Target Area Phytotoxicity; — 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence); — 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test; — 850.4225: Seedling Emergence, Tier II; — 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test. (7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines. (8) Boutin, C., Freemark, K.E. and Keddy, C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Non-target plant testing and evaluation. Technical Report Series No.145. Canadian Wildlife Service (Headquarters), Environment Canada, Hull, Québec, Canada. (9) Forster, R., Heimbach, U., Kula, C., and Zwerger, P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms — A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial Non-Target Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. No 48. (10) Hale, B., Hall, J.C., Solomon, K., and Stephenson, G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centre for Toxicology, University of Guelph, Ontario Canada. (11) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sc. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962). (12) Audus, L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. In: Audus, L.J. ed. The Physiology and biochemistry of Herbicides, London, New York, Academic Press, NY, Chapter 5, pp. 163-206. (13) Beall, M.L., Jr. and Nash, R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575. (14) Beetsman, G.D., Kenney, D.R. and Chesters, G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250. (15) U.S. Food and Drug Administration (FDA). (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 pp., FDA, Washington, DC. (16) McKelvey, R.A., Wright, J.P., Honegger, J.L. and Warren, L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science vol. 58:1161-1174 (17) Boutin, C.; Elmegaard, N. and Kjær, C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Comité risicobeoordeling Ecotoxicology vol. 13(4): 349-369. (18) Boutin, C., and Rogers, C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides — An analysis with two databases. Ecotoxicology vol.9(4):255-271. (19) Boutin, C. and Harper, J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271. (20) Boutin, C., Lee, H.-B., Peart, T.E., Batchelor, S.P. and Maguire, R.J.. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541. (21) OECD (2006). Draft Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Series on Testing and Assessment No 54, Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris. (22) Hatzios, K.K. and Penner, D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63. (23) Hamill, P.B., Marriage, P.B. and G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25:386-389. (24) Frans, R.E. and Talbert, R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. In: B. Truelove (Ed.) Research Methods in Weed Science, 2nd ed. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23. (25) Bruce, R.D. and Versteeg, D. J.(1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1485-1492. (26) Hoofdstuk C.33 van deze bijlage: Voortplantingstest met regenwormen (Eisenia fetida/Eisenia andrei). Aanhangsel 1 Definities Werkzaam bestanddeel (of werkzame stof) : een materiaal bedoeld om een specifiek biologisch effect teweeg te brengen (bv. ter bestrijding van insecten, plantenziekten of onkruid in het behandelde gebied), ook bekend als werkzaam bestanddeel van de technisch zuivere stof). Chemische stof : een stof of een mengsel. Gewasbeschermingsmiddelen of pesticiden : materialen met een specifieke biologische activiteit die doelbewust worden gebruikt om gewassen te beschermen tegen plagen (bv. schimmelziekten, insecten en concurrerende planten). ECx — concentratie voor x % effect, of ERx — dosering voor x % effect : de concentratie of dosering die in vergelijking met de controle een ongewenste verandering in het eindpunt van de test veroorzaakt van x % (25 % of 50 % afname van de opkomst van zaailingen, het scheutgewicht of het uiteindelijke aantal aanwezige planten, of toename van zichtbare schade correspondeert bijvoorbeeld respectievelijk met een EC25/ER25 of EC50/ER50). Opkomst : het boven de grond verschijnen van het coleoptiel of de zaadlob. Formulering : het in de handel verkrijgbare geformuleerde product dat de werkzame stof ( werkzame bestanddeel) bevat; ook bekend als „eindpreparaat” (8) of „voor het typische eindgebruik bestemde product”. LOEC (Lowest Observed Effect Concentration) : de laagste concentratie teststof waarbij effect werd waargenomen. In deze test heeft de concentratie die overeenkomt met de LOEC een statistisch significant effect (p < 0,05) binnen een bepaalde blootstellingsperiode, in vergelijking met de controle, en is deze concentratie hoger dan de NOEC-waarde. Niet-doelwitplanten : die planten die zich buiten het gebied van de doelplanten bevinden. Voor gewasbeschermingsmiddelen zijn dit meestal planten buiten het behandelingsgebied. NOEC (No Observed Effect Concentration) : de hoogste concentratie teststof waarbij geen effect werd waargenomen. In deze test heeft de concentratie die overeenkomt met de NOEC geen statistisch significant effect (p < 0,05) binnen een bepaalde blootstellingsperiode in vergelijking met de controle. Fytoxicity : schadelijke afwijkingen (vastgesteld door metingen en visuele beoordeling) van het normale beeld van opkomst en groei van planten als reactie op een bepaalde chemische stof. Replicaat : de experimentele eenheid die representatief is voor een controlegroep en/of dosisgroep. In deze onderzoeken wordt de pot gedefinieerd als replicaat. Visuele beoordeling : waardering van zichtbare schade op basis van waarnemingen van de plantstand, groeikracht, misvormingen, chlorose, necrose en het algehele uiterlijk in vergelijking met een controle. Teststof : alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels. Aanhangsel 2 Lijst van soorten die van oudsher bij plantentests worden gebruikt Familie Soort Gewone namen DICOTYLEDONAE Apiaceae (Umbelliferae) Daucus carota Wortel Asteraceae (Compositae) Helianthus annuus Zonnebloem Asteraceae (Compositae) Lactuca sativa sla Brassicaceae (Cruciferae) Sinapis alba Witte mosterd Brassicaceae (Cruciferae) Brassica campestris var. chinensis Paksoi Brassicaceae (Cruciferae) Brassica napus Koolzaad Brassicaceae (Cruciferae) Brassica oleracea var. capitata Kool Brassicaceae (Cruciferae) Brassica rapa Meiraap/stoppelknol Brassicaceae (Cruciferae) Lepidium sativum Tuinkerszaad Brassicaceae (Cruciferae) Raphanus sativus Radijs Chenopodiaceae Beta vulgaris Suikerbieten Cucurbitaceae Cucumis sativus Komkommer Fabaceae (Leguminosae) Glycine max (G. soja) Soja Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus aureus Mungbonen Fabaceae (Leguminosae) Phaseolus vulgaris Stamboon, prinsessenboon, tuinboon Fabaceae (Leguminosae) Pisum sativum Erwt Fabaceae (Leguminosae) Trigonella foenum-graecum Fenegriek Fabaceae (Leguminosae) Lotus corniculatus Rolklaver Fabaceae (Leguminosae) Trifolium pratense Rode klaver Fabaceae (Leguminosae) Vicia sativa Wikken Linaceae Linum usitatissimum Vlas Polygonaceae Fagopyrum esculentum Boekweit Solanaceae Solanum lycopersicon Tomaat MONOCOTYLEDONAE Liliaceae (Amarylladaceae) Allium cepa Uien Poaceae (Gramineae) Avena sativa Haver Poaceae (Gramineae) Hordeum vulgare Gerst Poaceae (Gramineae) Lolium perenne Perennial ryegrass Poaceae (Gramineae) Oryza sativa Rijst Poaceae (Gramineae) Secale cereale Rogge Poaceae (Gramineae) Sorghum bicolor Graansorgho, kafferkoren Poaceae (Gramineae) Triticum aestivum Tarwe Poaceae (Gramineae) Zea mays Maïs Aanhangsel 3 Lijst van mogelijke niet-gewassoorten Mogelijke soorten voor toxiciteitstests met planten volgens de OESO Opmerking: De volgende tabel bevat informatie over 52 niet-gewassoorten (literatuur is tussen haakjes vermeld voor alle gegevens) De vermelde opkomstpercentages zijn afkomstig uit gepubliceerde literatuur en zijn uitsluitend als indicatie bedoeld. Persoonlijke ervaringen kunnen variëren naargelang van de zaadbron en andere factoren. FAMILIE Soort Botanische naam (gewone Nederlandse naam) Levensduur (9) en habitat Zaadgewicht (mg) Fotoperiode voor kieming of groei (10) Plantdiepte (mm) (11) Kiemtijd (dagen) (12) Speciale behandelingen (13) Toxiciteitstest (14) Zaadleveranciers (15) Andere referenties (16) APIACEAE Torilis japónica (heggendoornzaad) E, T verstoorde terreinen, hagen, weiden (16, 19) 1,7 - 1,9 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 5 (50 %) (19) koude stratificatie (7, 14, 18, 19) rijping kan nodig zijn (19) kieming geremd in het donker (1, 19) geen speciale behandelingen (5) POST (5) ASTERACEAE Bellis perennis (madeliefje) M grasland, akkers, vaak gemaaide grasgrond (16, 19) 0,09-0,17 (4, 19) L = D (14) 0 (4) 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) kieming niet beïnvloed door bestraling (18, 19) geen speciale behandelingen (4, 14) POST (4) A, D, F 7 Centaurea cyanus (korenbloem) A akkers, bermen, open habitats (16) 4,1-4,9 (4, 14) L = D (14) 0-3 (2, 4, 14) 14-21 (100 %) (14) geen speciale behandelingen (2, 4) POST (2,4) A, D, E, F 7 Centaurea nigra (knoopkruid) M akkers, bermen, open habitats (16, 19) 2,4-2,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) rijping kan nodig zijn (18, 19) kieming geremd in het donker (19) geen speciale behandelingen (5, 14, 26) POST (5, 22, 26) A Inula helenium Griekse alant M vochtige, verstoorde terreinen (16) 1 - 1,3 (4, 14, 29) 0 (4, 29) geen speciale behandelingen (4) POST (4) A, F Leontodon hispidus (leeuwentand) M akkers, bermen, open habitats (16 19) 0,85-1,2 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) kieming geremd in het donker (17, 18, 19) geen speciale behandelingen (5, 23) POST (5, 22, 23) Rudbeckia hirta (rudbeckia) T, M verstoorde terreinen (16) 0,3 (4, 14) L = D (14) 0 (4, 33) < 10 (100 %) (33) geen speciale behandelingen (4, 14, 33) POST (4, 33) C, D, E, F Solidago canadensis Canadese guldenroede M weide, open terreinen (16) 0,06-0,08 (4, 14) L = D (11) 0 (4) 14-21 (11) 1:1 vermengen met zand en 24 uur weken in 500 ppm GA (11) geen speciale behandelingen (4) POST (4) E, F Xanthium pensylvanicum — A akkers, open habitats (16) 25-61 (14, 29) 0 (1) 5 (29) kieming mogelijk geremd in het donker (1) 12 uur weken in warm water (29) PRE en POST (31) A Xanthium spinosum (stekelnoot) A open habitats (16) 200 (14) L = D (14) L > D (6) 10 (6) scarificatie (14) geen speciale behandelingen (6) PRE en POST (6) A Xanthium strumarium (Iate stekelnoot) A akkers, open habitats (16) 67,4 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) geen speciale behandelingen (6, 14, 21) PRE en POST (6, 21, 28, 31) A BRASSICACEAE Cardamine pratensis (pinksterbloem) M akkers, bermen, vaak gemaaide grasvelden (16 19) 0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) kieming geremd in het donker (18, 19) geen speciale behandelingen (5, 14, 22) POST (5, 22) F CARYOPHYLLACEAE Lychnis flos-cuculi (echte koekoeksbloem) M (16) 0,21 (14) L = D (14) < 14 (100 %) (14, 25) rijping kan nodig zijn (18) geen speciale behandelingen (5, 14, 15, 22-26) POST (5, 15, 22-26) F CHENOPODIACEAE Chenopodium album (ganzenvoet) A akkerranden, verstoorde terreinen (16 19) 0,7 - 1,5 (14, 19, 34) L = D (14) 0 (1, 19) 2 (50 %) (19) behandeling verschilt afhankelijk van de zaadkleur (19) kiemrust bij droge opslag (19) kieming geremd in het donker (1, 18, 19) koude stratificatie (18) geen speciale behandeling (14, 34) PRE en POST (28, 31, 34) A 32 CLUSIACEAE Hypericum perforatum (sint-janskruid) M akkers, bouwland, open habitats (16 19) 0,1-0,23 (14, 19) L = D (14) 0 (1, 19) 3 (19) 11 (90 %) (18) kieming geremd in het donker (1, 18, 19) geen speciale behandelingen (5, 14, 15, 25, 27) POST (5, 15, 25, 27) A, E, F CONVOLVULACEAE Ipomoea hederacea — A bermen, open habitats, maïsvelden (16) 28,2 (14) L > D (6, 10) 10-20 (6, 10, 21) 4 (100 %) (10) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) geen speciale behandelingen (6, 21) PRE en POST (6, 12, 21, 28) A CYPERACEAE Cyperus rotundus — M bouwland, weiden, bermen (16, 30) 0,2 (14) L = D (14) 0 (1) 10-20 (6, 10) 12 (91 %) (10) kieming geremd in het donker (1) geen speciale behandelingen (6, 10, 14) PRE en POST (6, 28, 31) B 7 FABACEAE Lotus corniculatus (rolklaver) M grassige gebieden, bermen, open habitats (16, 19) 1-1,67 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificatie (14, 19) kieming niet beïnvloed door bestraling (18, 19) geen speciale behandelingen (23, 25) POST (5, 23, 25) A, D, E, F Senna obtusifolia — A natte bossen (16) 23-28 (9) L = D (14) L > D (9) 10-20 (6,9) zaden 24 uur in water weken (9) scarificatie (14) zaadlevensvatbaarheid zaad verschilt afhankelijk van de kleur (1) geen speciale behandelingen (6) POST (6,9) A Sesbania exaltata — A alluviale grond (16) 11-13 (9, 14) L > D (9) 10-20 (9, 21) zaden 24 uur in water weken (9) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) geen speciale behandelingen (21) PRE en POST (9, 21, 28, 31) A Trifolium pratense (rode klaver) M akkers, bermen, bouwland (16, 19) 1,4 - 1,7 (14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) scarificatie (14, 18) rijping kan nodig zijn (19) kieming niet beïnvloed door bestraling (1, 19) geen speciale behandelingen (5) POST (5) A, E, F LAMIACEAE Leonurus cardiaca (hartgespan) M open terreinen (16) 0,75-1,0 (4, 14) L = D (14) 0 (4) geen speciale behandelingen (4, 14) POST (4) F Mentha spicata (aarmunt) M vochtige gebieden (16) 2,21 (4) 0 (4) geen speciale behandelingen (4) POST (4) F Nepeta cataria (kattenkruid) M verstoorde terreinen (16) 0,54 (4, 14) L = D (14) 0 (4) geen speciale behandelingen (2, 4, 14) POST (2,4) F Prunella vulgaris (brunel) M akkers, grassige gebieden, verstoorde terreinen (16, 19) 0,58-1,2 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) kieming geremd in het donker (18, 19) meer kieming bij grotere zaden (1) geen speciale behandelingen (4, 14, 22) POST (4, 22) A, F Stachys officinalis (betonie) M graslanden, akkerranden (19) 14-18 (14, 19) L = D (14) 7 (50 %) (19) geen speciale behandelingen (5, 14, 22) POST (5, 22) F MALVACEAE Abutilón theophrasti (fluweelblad) A akkers, open habitats (16) 8,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 10, 21) 4 (84 %) (10) scarificatie (14) geen speciale behandelingen (5, 10, 21) PRE en POST (6, 22, 28, 31) A, F Sida spinosa — A akkers, bermen (16) 3,8 (14) L = D (14) 10-20 (6, 21) scarificatie (14) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) geen speciale behandelingen (6, 21) PRE en POST (6, 21, 28, 31) A, F PAPAVERACEAE Papaver rhoeas (grote klaproos) A akkers, bouwland, verstoorde terreinen (16 19) 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) L = D (14) 0 (4, 29) 4 (50 %) (19) koude stratificatie, en scarificatie (1, 19, 32) geen speciale behandelingen (4, 14, 29) POST (4) A, D, E, F, G POACEAE Agrostis tenuis (gewoon struisgras) gazons, weiden (16) 0,07 (14) L > D (Ю) 20 (10) 10 (62 %) (10) kieming geremd in het donker (1, 17, 19) geen speciale behandelingen (10) POST (10) A, E Alopecurus myosuroides (duist) A akkers, open habitats (16) 0,9-1,6 (29, 34) L = D (14) 2 (29) < 24 (30 %) (34) scarificatie (14) behandelen met 101 mg/l KNO3 (14) warme stratificatie (1) kieming geremd in het donker (1) geen speciale behandelingen (34) PRE en POST (28, 34) A 32 Avena fatua (oot) A beteelde terreinen, open habitats (16) 7-37,5 (14, 30) L = D (14) L > D (6) 10-20 (6, 10) 3 (70 %) (18) scarificatie (7, 32) kieming geremd in het donker (1) koude stratificatie (1, 18) geen speciale behandelingen (6, 10, 14) PRE en POST (6, 10, 28, 31) A Bromus tectorum (zwenkdravik) A akkers, bermen, bouwland (16) 0,45-2,28 (14, 29) L = D (14) 3 (29) rijpingsperiode (1, 7, 32) kieming geremd door licht (1 ) geen speciale behandelingen (14) PRE en POST (28, 31) A Cynosurus cristatus (kamgras) P akkers, bermen, open habitats (16, 19) 0,5-0,7 (14, 19, 29) L = D (14) 0 (29) 3 (50 %) (19) kieming niet beïnvloed door bestraling (19) geen speciale behandelingen (14, 29) POST (5) A Digitaria sanguinalis (harig vingergras) A akkers, bermen, open habitats (16) 0,52-0,6 (14, 30) L = D (14) 10-20 (21). 7 (75 %) 14 (94 %) (7) scarificatie, koude stratificatie, en maturatie (1, 7, 14, 32) behandelen met 101 mg/l KNO3 (14) kieming geremd in het donker (1) geen speciale behandelingen (21) PRE en POST (18, 25, 31) A Echinochloa crusgalli (Europese hanenpoot) A (16) 1,5 (14) L = D (14) L > D (3) 10-20 (7, 21) scarificatie (7, 32) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) geen speciale behandelingen (3, 14, 21) PRE en POST (3, 21, 28, 31) A Elymus canadensis — P oevers, verstoorde terreinen (16) 4-5 (14, 30) L = D (11) 1 (11) 14-28 (11) geen speciale behandelingen (2, 11) POST (2) C, D, E Festuca pratensis (beemdlangbloem) P akkers, vochtige gebieden (16 19) 1,53-2,2 (16, 19) L = D (14) L > D (10) 20 (10) 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) geen speciale behandelingen (10, 19) POST (10) A 7 Hordeum pusillum — A weiden, bermen, open habitats (16) 3,28 (14) warme stratificatie (1) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) PRE (31) 7 Phleum pratense — P akkers, bouwland, verstoorde terreinen (16 19) 0,45 (14, 19) L > D (10, 14) 0-10 (10, 19) 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) kieming geremd in het donker (19) kieming niet beïnvloed door bestraling (17) geen speciale behandelingen (10, 14, 17, 19) POST (10) A, E POLYGONACEAE Polygonum convolvulus (zwaluwtong) A open habitats, bermen (16) 5-8 (4, 14, 29) L = D (20) 0-2 (4, 29) koude stratificatie gedurende 4-8 weken (1, 2, 4, 20, 29) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) PRE en POST 1, 2, 20, 28, 31 A 32 Polygonum lapathifolium (beklierde duizendknoopa) A vochtige grond (16) 1,8-2,5 (14). L > D (6) 5 (94 %) (18) kieming niet beïnvloed door bestraling (1) kieming geremd in het donker (18) koude stratificatie (1) geen speciale behandelingen (5) PRE en POST (6) A, E Polygonum pennsylvanicum — A akkers, open habitats (16) 3,6-7 (14, 29) 2 (29) koude stratificatie gedurende 4 weken bij 0 — 5 °C (1, 29) kieming geremd in het donker (1) PRE (31) A, E Polygonum periscaria (perzikkruid) A verstoorde terreinen, bouwland (16, 19) 2,1-2,3 (14, 19) L > D (13) 0 (19) < 14 (13) 2 (50 %) (19) scarificatie, koude stratificatie, GA-behandeling (14) koude stratificatie, rijping (17-19) kieming geremd in het donker (19) geen speciale behandelingen (13) POST (13) A 32 Rumex crispus (krukzuring) P akkers, bermen, open terreinen (16, 19) 1,3-1,5 (4, 14, 19) L = D (14, 33) 0 (4, 19, 33) 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) kieming geremd in het donker (18, 19) rijping kan nodig zijn (18) geen speciale behandelingen (4, 14, 33) POST (4, 33) A, E 32 PRIMULACEAE Anagallis arvensis — A akkers, open terreinen, verstoorde terreinen (16, 19) 0,4-0,5 (4, 14, 19) L = D (14) 1 (50 %) (19) koude stratificatie, GA-behandeling (1, 14, 18, 19, 32) licht vereist voor kieming (1 ) geen speciale behandelingen (2, 4) POST (2,4) A, F RANUNCULACEAE Ranunculus acris (boterbloem) M akkers, bermen, open terreinen (16, 19) 1,5-2 (14, 19, 29) L = D (14) 1 (29) 41 -56 (19, 29) geen speciale behandelingen (5, 14, 22, 24-26) POST (5, 22, 24-26) 32 ROSACEAE Geum urbanum (geel nagelkruid) M hagen, vochtige gebieden (16, 19) 0,8 - 1,5 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) kieming geremd in het donker (18, 19) warme stratificatie (1) geen speciale behandelingen (5, 14, 22, 25, 26) POST (5, 22, 25, 26) A RUBIACEAE Galium aparine (kleefkruid) A akkers, open terreinen, verstoorde terreinen (16, 19) 7-9 (14, 19) L = D (14) 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) koude stratificatie (1, 18, 19) kieming niet beïnvloed door bestraling (18, 19) kieming geremd door licht (1) geen speciale behandelingen (6, 14) PRE en POST (6, 28) A 32 Galium mollugo (glad walstro) M houtwallen, open terreinen (8) 7 (29) L = D (14) 2 (29) geen speciale behandelingen (5, 14, 22, 24, 26, 29) POST (5, 22, 24, 26) A SCROPHULARIACEAE Digitalis purpurea (vingerhoedskruid) T, M houtwallen, open terreinen (16, 19) 0,1 -0,6 (4, 14, 19) L = D (14) 0 (4, 19) 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) kieming geremd in het donker (1, 17-19) geen speciale behandelingen (4, 22-26) POST (4, 22 — 26) D, G, F Veronica persica (ereprijsl) A akkers, open terreinen, verstoorde terreinen (16, 19) 0,5-0,6 (14, 19) L = D (14) 0 (19) 3 (19) 5 (96 %) (18) kieming geremd in het donker (18, 19) koude stratificatie (18) geen speciale behandelingen (14) PRE en POST (28) A 32 Genoemde zaadleveranciers ID leverancier Gegevens van leverancier A Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ VERENIGD KONINKRIJK +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com B Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 V.S. (727) 344 — 4050 www.tropilab.com C Pterophylla — Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 CANADA (519) 586 — 3985 D Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 USA (303) 431 — 7333 www.applewoodseed.com E Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 V.S. (800) 873 — 3321 www.ernstseed.com F Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB VERENIGD KONINKRIJK +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk G Thompson & Morgan P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 CANADA (800) 274 — 7333 www.thompson-morgan.com GENOEMDE LITERATUUR (1) Baskin, C.C. & Baskin, J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto (2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-UpÒ). Ecotoxicology, 12:271-285. (3) Boutin, C., Lee, H-B., Peart, T., Batchelor, P.S., & Maguire, R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10):2532-2541. (4) Boutin, C., Elmegaard, N., & Kjaer, C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13:349-369. (5) Breeze, V., Thomas, G., & Butler, R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121:669-677. (6) Brown, R.A., & Farmer, D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. In: Plants for toxicity assessment: 2nd volume. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, & M.A. Lewis, eds. American Society for Testing & Materials, Philadelphia. pp 197 — 208. (7) Buhler, D.D. & Hoffman, M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K. (8) Clapham, A.R., Tutin, T.G., & Warburg, E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, 3rd ed. Cambridge University Press, Cambridge (9) Clay, P.A. & Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486. (10) Cole, J.F.H. & Canning, L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC — Weeds. pp. 151 — 156. (11) Fiely, M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Persoonlijke mededeling. (www.ernstseed.com) (12) Fletcher, J.S., Johnson, F.L., & McFarlane, J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9:769-776. (13) Fletcher, J.S., Pfleeger, T.G., Ratsch, H.C., & Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7):1189-1196. (14) Flynn, S., Turner, R.M., and Dickie, J.B. 2004. Seed Information Database (release 6.0, Oct 2004) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid) (15) Franzaring, J., Kempenaar, C., & van der Eerden, L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28. (16) Gleason, H.A. & Cronquist, A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, 2nd ed. New York Botanical Garden, Bronx, NY (17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98:555-558. (18) Grime, J.P., Mason, G., Curtis, A.V., Rodman, J., Band, S.R., Mowforth, M.A.G., Neal, A.M., & Shaw, S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69:1017-1059. (19) Grime, J.P., Hodgson, J.G., & Hunt, R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., London (20) Kjaer, C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34:453-459. (21) Klingaman, T.E., King, C.A., & Oliver, L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40:227-232. (22) Marrs, R.H., Williams, C.T., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59:71-86. (23) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69:223-235. (24) Marrs, R.H., Frost, A.J., & Plant, R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73:25-42. (25) Marrs, R.H., Frost, A.J., Plant, R.A., & Lunnis, P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of non-target plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293. (26) Marrs, R.H. & Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388. (27) Marshall, E.J.P. & Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC — Weeds. pp. 1021-1028. (28) McKelvey, R.A., Wright, J.P., & Honegger, J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174. (29) Morton, S. (Herbiseed). 2004. Persoonlijke mededeling. (http://www.herbiseed.com) (30) USDA, NRCS. 2004. The Plants Database, version 3.5. (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA (31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [U.S. E.P.A./Office of Pesticide Programs/Environmental Fate and Effects Division/Environmental Epidemiology Branch]. (32) Webster, R.H. 1979. Technical Report No. 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford. (33) White, A. L. & Boutin, C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Persoonlijke mededeling. (34) Zwerger, P. & Pestemer, W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17:711-718. Aanhangsel 4 Voorbeelden van geschikte groeiomstandigheden voor bepaalde gewassoorten De volgende omstandigheden zijn voor tien gewassoorten geschikt bevonden en kunnen ook voor bepaalde andere soorten als richtsnoer voor tests in klimaatkasten worden gebruikt: Koolstofdioxideconcentratie: 350 ± 50 ppm; Relatieve vochtigheid: 70 ± 5 % in lichte perioden en 90 ± 5 % in donkere perioden; Temperatuur: 25 ± 3 °C bij dag, 20 ± 3 °C bij nacht; Fotoperiode: 16 uur licht/8 uur donker, uitgaande van een gemiddelde golflengte van 400 tot 700 nm; Licht: luminantie van 350 ± 50 μE/m2/s, gemeten vlak boven het bladerdek. De gewassoorten zijn: — tomaat (Solanum lycopersicon); — komkommer (Cucumis sativus); — sla (Lactuca sativa); — sojaboon (Glycine max); — kool (Brassica oleracea var. capitata); — wortel (Daucus carota); — haver (Avena sativa); — Engels raaigras (Lolium perenne); — mais (Zea mays); — ui (Allium cepa). C.32. Voortplantingstest met Enchytraeidae INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 220 (2004) van de OESO. De test is opzet om de effecten van stoffen op het voortplantingsresultaat van enchytreeën, Enchytraeus albidus Henle 1873, in de bodem te beoordelen. Zij is in principe gebaseerd op een methode die door het Umweltbundesamt in Duitsland (1) is ontwikkeld en die is onderworpen aan een ringtest (2). Er is ook rekening gehouden met andere methoden voor het testen van het toxisch effect van stoffen op enchytreeën en regenwormen (3)(4)(5)(6)(7)(8). INLEIDENDE OVERWEGINGEN 2. In de bodem levende ringwormen (Annelidae) van het geslacht Enchytraeus zijn ecologisch belangrijke soorten voor ecotoxicologische tests. Hoewel enchytreeën vaak worden aangetroffen in bodems die regenwormen bevatten, zijn ze vaak ook talrijk in bodems waarin geen regenwormen worden gevonden. Enchytreeën kunnen zowel in laboratoriumproeven als in semiveld- en veldexperimenten worden gebruikt. Vanuit praktisch oogpunt zijn veel Enchytraeus-soorten gemakkelijk te hanteren en te kweken, en hun generatietijd is aanzienlijk korter dan die van regenwormen. De duur van een voortplantingstest met enchytreeën is daardoor slechts 4 tot 6 weken, terwijl deze voor regenwormen (Eisenia fetida) 8 weken is. 3. Meer informatie over de ecologie en ecotoxicologie van enchytreeën in het terrestrische milieu is te vinden in (9)(10)(11)(12). PRINCIPE VAN DE TEST 4. Volwassen enchytreeën worden blootgesteld aan een bereik van concentraties van de teststof die door kunstmatige grond zijn gemengd. De test kan in twee stappen worden gesplitst: (a) een bereikbepalingstest, indien er onvoldoende informatie beschikbaar is, waarin de mortaliteit het belangrijkste eindpunt is dat na twee weken blootstelling wordt beoordeeld, en (b) een definitieve voortplantingstest, waarin het totale aantal door een moederdier voortgebrachte nakomelingen en de overleving van de moederdieren worden beoordeeld. De definitieve test duurt zes weken. Na de eerste drie weken worden de volwassen wormen verwijderd en worden de morfologische veranderingen geregistreerd. Na nog eens drie weken wordt het aantal nakomelingen geteld dat uit de door de volwassen dieren geproduceerde cocons is gekomen. Het voortplantingsresultaat van de dieren die zijn blootgesteld aan de teststof, wordt vergeleken met dat van de controle(s) om (i) de No Observed Effect Concentration (NOEC) en/of (ii) de ECx (bv. EC10, EC50) te bepalen door met een regressiemodel een schatting te maken van de concentratie die zou leiden tot een afname van het voortplantingsresultaat met x %. De ECx (bv. EC10, EC50) moet binnen de testconcentraties vallen, zodat de ECx daarna afkomstig is van interpolatie in plaats van extrapolatie. INFORMATIE OVER DE TESTSTOF 5. Bij voorkeur zijn de oplosbaarheid in water, de log Kow, de grond/water-verdelingscoëfficiënt (bv. hoofdstuk C.18 of C.19 van deze bijlage) en de dampspanning van de teststof bekend. Aanvullende informatie over het lot van de teststof in de bodem, zoals de fotolyse- en hydrolysesnelheid, is gewenst. 6. Deze testmethode kan zowel voor in water oplosbare als voor in water onoplosbare stoffen worden gebruikt. De wijze van aanbrengen van de teststof zal echter verschillen. De testmethode is niet van toepassing op vluchtige stoffen, d.w.z. stoffen waarvoor de Henry-constante of de lucht/water-verdelingscoëfficiënt groter dan één is, of stoffen waarvoor de dampspanning bij 25 °C groter dan 0,0133 Pa is. GELDIGHEID VAN DE TEST 7. Voor een geldige test moet in de controles aan de volgende prestatiecriteria worden voldaan: — de mortaliteit van volwassen dieren mag aan het eind van de bereikbepalingstest en na de eerste drie weken van de voortplantingstest niet hoger zijn dan 20 %. — aannemende dat bij de opzet van de test 10 volwassen dieren per vat zijn gebruikt, moeten aan het eind van de test gemiddeld ten minste 25 nakomelingen per vat zijn voortgebracht. — de variatiecoëfficiënt rond het gemiddelde aantal jonge dieren mag aan het eind van de voortplantingstest niet hoger zijn dan 50 %. Wanneer een test niet aan de hierboven genoemde geldigheidscriteria voldoet, moet de test worden beëindigd, tenzij voortzetting van de test kan worden gemotiveerd. De motivering moet in het testverslag worden opgenomen. REFERENTIESTOF 8. Een referentiestof moet hetzij op gezette tijden of als onderdeel van elke test worden getest om te verifiëren dat de respons van de testorganismen in de loop van de tijd niet significant is gewijzigd. Een geschikte referentiestof is carbendazim, waarvan is aangetoond dat het de overleving en voortplanting van enchytreeën beïnvloedt (13)(14), maar er kunnen ook andere stoffen worden gebruikt waarvan de toxiciteitsgegevens goed bekend zijn. In een ringtest is een formulering van carbendazim gebruikt die bekend is onder de handelsnaam Derosal ™, wordt geleverd door AgrEvo Company (Frankfurt, Duitsland) en 360 g/l (32,18 %) werkzaam bestanddeel bevat (2). De in de ringtest bepaalde EC50 voor de voortplanting lag in het bereik van 1,2 ± 0,8 mg werkzaam bestanddeel (w.b.)/kg droge massa (2). Indien in de testreeks een positieve toxische standaard wordt opgenomen, wordt één concentratie gebruikt en moet het aantal replicaten hetzelfde zijn als in de controles. Voor carbendazim wordt het testen van 1,2 mg w.b./kg drooggewicht (getest als vloeibare formulering) aanbevolen. BESCHRIJVING VAN DE TEST Benodigdheden 9. De testvaten moeten van glas of een ander chemisch inert materiaal gemaakt zijn. Glazen potten (bv. inhoud: 0,20 - 0,25 liter; diameter: ≈ ≈ 6 cm) zijn geschikt. De vaten moeten een transparant deksel hebben (bv. van glas of polyethyleen) dat zo is ontworpen dat verdampingsverlies wordt tegengegaan, maar gasuitwisseling tussen de grond en de lucht mogelijk is. De deksels moeten transparant zijn om licht door te kunnen laten. 10. Een standaard-laboratoriumuitrusting is vereist, in het bijzonder: — droogkast; — stereomicroscoop; — pH-meter en fotometer; — geschikte nauwkeurige weegschalen; — adequate apparatuur voor temperatuurregeling; — adequate apparatuur voor vochtigheidsregeling (niet noodzakelijk als de blootstellingsvaten een deksel hebben); — incubator of kleine kast met klimaatregelaar; — pincet, haken of ogen; — fotobad. Bereiding van de kunstmatige grond 11. In deze test wordt een kunstmatige grond gebruikt (5)(7) die als volgt is samengesteld (gebaseerd op drooggewicht, gedroogd tot een constant gewicht bij 105 °C): — 10 % veenmosturf, luchtdroog en fijngemalen (een deeltjesgrootte van 2 ± 1 mm is aanvaardbaar); er wordt aanbevolen te controleren dat grond die is gemaakt op basis van een verse batch turf, geschikt is voor het kweken van de wormen, voordat de grond in een test wordt gebruikt; — 20 % kaolienklei (met bij voorkeur meer dan 30 % kaoliniet); — ongeveer 0,3 tot 1,0 % calciumcarbonaat (CaCO3, verpulverd, analytisch zuiver) om een pH van 6,0 ± 0,5 te verkrijgen; de toe te voegen hoeveelheid calciumcarbonaat zal vooral afhangen van de kwaliteit/aard van de turf; — ongeveer 70 % luchtdroog kwartszand (afhankelijk van de benodigde hoeveelheid CaCO3), overwegend bestaande uit fijn zand; meer dan 50 % van de deeltjes moet een grootte tussen 50 en 200 micron hebben. Het is raadzaam aan te tonen dat de kunstmatige grond geschikt is voor het kweken van de wormen en geschikt is om aan het geldigheidscriterium te voldoen, voordat de grond in een definitieve test wordt gebruikt. In het bijzonder wordt aangeraden een dergelijke controle uit te voeren om te garanderen dat de uitvoering van de test niet in het gedrang komt wanneer het gehalte organische koolstof van de kunstmatige grond wordt verlaagd, bv. door vermindering van het turfgehalte tot 4-5 % en dienovereenkomstige verhoging van het zandgehalte. Door een dergelijke verlaging van het gehalte organische koolstof kan de hechting van de teststof aan de grond (organische koolstof) afnemen en kan de beschikbaarheid van de teststof voor de wormen toenemen. Aangetoond is dat Enchytraeus albidus aan de geldigheidscriteria voor de voortplanting kan voldoen bij tests in veldgrond met een lager gehalte organische koolstof dan hierboven genoemd (bv. 2,7 %) (15), en de — weliswaar beperkte — ervaring leert dat dit ook kan worden bereikt in kunstmatige grond met 5 % turf. Noot: Wanneer in aanvullende tests (bv. van de latere fasen) natuurlijke grond wordt gebruikt, moet eveneens worden aangetoond dat de grond geschikt is en dat wordt voldaan aan de geldigheidscriteria. 12. De droge bestanddelen van de grond worden grondig gemengd (bv. in een grote laboratoriummenger). Dit moet ten minste één week voor aanvang van de test geschieden. De gemengde grond moet ten minste twee dagen worden opgeslagen om de zuurgraad te equilibreren/stabiliseren. Voor de bepaling van de pH moet een mengsel van grond en een oplossing van 1 M kaliumchloride (KCl) of 0,01 M calciumchloride (CaCl2) in een verhouding van 1:5 worden gebruikt (zie (16) en aanhangsel 3). Als de grond zuurder is dan het vereiste bereik (zie punt 11), kan de zuurgraad worden verlaagd door toevoeging van een passende hoeveelheid CaCO3. Als de grond te alkalisch is, kan dit worden gecorrigeerd door toevoeging van meer van het in punt 11 bedoelde mengsel, maar zonder CaCO3 13. Het maximale waterhoudend vermogen (WHV) van de kunstmatige grond wordt bepaald overeenkomstig de procedures als beschreven in aanhangsel 2. Een of twee dagen voor aanvang van de test wordt de droge kunstmatige grond vooraf bevochtigd door genoeg gedeïoniseerd water toe te voegen om ongeveer de helft van het uiteindelijke watergehalte te verkrijgen, d.w.z. 40 tot 60 % of het maximale waterhoudend vermogen. Bij aanvang van de test wordt de vooraf bevochtigde grond verdeeld in zoveel porties als het aantal testconcentraties (en in voorkomend geval referentiestof) en controles dat voor de test wordt gebruikt. Het vochtgehalte wordt aangepast tot 40-60 % van WHVmax door de teststofoplossing en/of gedestilleerd of gedeïoniseerd water toe te voegen (zie de punten 19-21). Het vochtgehalte wordt aan het begin en aan het eind van de test bepaald (door droging tot constant gewicht bij 105 °C) en moet binnen het optimale bereik voor de overleving van de wormen liggen. Een ruwe controle van het vochtgehalte van de grond wordt verkregen wanneer men de grond lichtjes in de hand knijpt. Als het vochtgehalte in orde is, moeten kleine druppels water tussen de vingers verschijnen. Selectie en voorbereiding van de proefdieren 14. De aanbevolen testsoort is Enchytraeus albidus, Henle 1837 (witte potworm), een lid van de familie der Enchytraeidae (orde Oligochaeta, stam Annelida). E. albidus is een van de grootste soorten enchytreeën, met een geregistreerde lengte tot 35 mm (17)(18). E. albidus komt over de hele wereld voor en wordt aangetroffen in mariene, limnische en terrestrische habitats, hoofdzakelijk in ontbindend organisch materiaal (zeewier, compost) en zelden in weiden (9). Deze brede ecologische tolerantie en een aantal morfologische variaties zouden erop kunnen duiden dat er verschillende rassen bestaan. 15. E. albidus is in de handel verkrijgbaar als voeding voor vissen. Gecontroleerd dient te worden of de cultuur verontreinigd is door andere, gewoonlijk kleinere soorten (1) (19). Indien verontreiniging optreedt, moeten alle wormen met water worden gewassen in een petrischaal. Vervolgens moeten grote volwassen exemplaren van E. albidus worden geselecteerd (met behulp van een stereomicroscoop) om een nieuwe cultuur te beginnen, en moeten alle overige wormen worden vernietigd. E. albidus kan worden gekweekt in een grote diversiteit aan organische stoffen (zie aanhangsel 4). De levenscyclus van E. albidus is kort, aangezien volwassenheid wordt bereikt tussen 33 dagen (bij 18 °C) en 74 dagen (bij 12 °C) (1). Voor de test worden enkel culturen gebruikt die zonder problemen gedurende ten minste 5 weken (één generatie) in het laboratorium zijn gehouden. 16. Andere soorten van het geslacht Enchytraeus zijn ook geschikt, bv. E. buchholzi Vejdovsky 1879 of E. crypticus Westheide & Graefe 1992 (zie aanhangsel 5). Indien andere soorten van het geslacht Enchytraeus worden gebruikt, moeten ze duidelijk worden geïdentificeerd en moet de motivering van de keuze van de soort worden gerapporteerd. 17. De dieren die in de tests worden gebruikt, zijn volwassen wormen. Zij moeten eitjes (witte stipjes) in de clitellumstreek hebben en van ongeveer gelijke lengte zijn (circa 1 cm). Synchronisatie van de kweekcultuur is niet noodzakelijk. 18. Als de enchytreeën niet in hetzelfde type grond en onder dezelfde omstandigheden (inclusief voeding) worden gekweekt als gebruikt voor de uiteindelijke test, moeten zij ten minste 24 uur en maximaal drie dagen worden geacclimatiseerd. In eerste instantie moet een groter aantal volwassen dieren worden geacclimatiseerd dan voor de uitvoering van de test benodigd is, om rekening te houden met de mogelijke afkeuring van beschadigde of anderszins ongeschikte exemplaren. Aan het eind van de acclimatiseringsperiode worden voor de test enkel wormen geselecteerd die eitjes hebben en geen gedragsafwijkingen vertonen (bv. uit de grond proberen te ontsnappen). De wormen worden voorzichtig met een juwelierspincet, haken of ogen verwijderd en geplaatst in een petrischaal met een kleine hoeveelheid zoet water. Synthetisch zoet water als voorgesteld in hoofdstuk C.20 van deze bijlage (Daphnia magna voortplantingstest) heeft voor dit doel de voorkeur, omdat gedeïoniseerd, gedemineraliseerd of kraanwater schadelijk kan zijn voor de wormen. De wormen worden onder een stereomicroscoop geïnspecteerd, en wormen die geen eitjes bevatten worden verwijderd. Mijten en springstaarten die de culturen mogelijk hebben geïnfecteerd, worden zorgvuldig verwijderd. Gezonde wormen die niet voor de test worden gebruikt, worden teruggeplaatst in de stamcultuur. Bereiding van testconcentraties In water oplosbare teststof 19. Een oplossing van de teststof wordt bereid in gedeïoniseerd water in een hoeveelheid die voldoende is voor alle replicaten van één testconcentratie. Aanbevolen wordt een passende hoeveelheid water te gebruiken om het vereiste vochtgehalte te bereiken, d.w.z. 40 tot 60 % van WHVmax (zie punt 13). Elke oplossing van de teststof wordt grondig door één batch vooraf bevochtigde grond gemengd voordat de grond in het testvat wordt gedaan. In water onoplosbare teststof 20. Indien de teststof niet in water oplosbaar is, maar wel oplosbaar in organische oplosmiddelen, kan de teststof worden opgelost in een zo klein mogelijk volume van een geschikt organisch oplosmiddel (bv. aceton). Enkel vluchtige oplosmiddelen mogen worden gebruikt. Het oplosmiddel wordt op een kleine hoeveelheid, bv. 2.5 g, fijn kwartszand gespoten of daarmee vermengd. Het oplosmiddel wordt verwijderd door het gedurende ten minste één uur in een afzuigkast te verdampen. Het mengsel van kwartszand en teststof wordt toegevoegd aan de vooraf bevochtigde grond en, na toevoeging van een passende hoeveelheid gedeïoniseerd water, grondig gemengd om het vereiste vochtgehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke mengsel wordt in de testvaten gedaan. 21. Voor chemische stoffen die slecht in water en slecht in organische oplosmiddelen oplosbaar zijn, kan het equivalent van 2,5 g fijngemalen kwartszand per testvat worden gemengd met de hoeveelheid teststof die nodig is om de gewenste testconcentratie te verkrijgen. Dit mengsel van kwartszand en teststof wordt toegevoegd aan de vooraf bevochtigde grond en, na toevoeging van een passende hoeveelheid gedeïoniseerd water, grondig gemengd om het vereiste vochtgehalte te verkrijgen. Het uiteindelijke mengsel wordt verdeeld over de testvaten. De procedure wordt voor iedere testconcentratie herhaald en tevens wordt een passende controlegroep bereid. 22. Stoffen mogen normaal gesproken niet worden getest bij concentraties die hoger zijn dan 1 000 mg/kg droge massa grond. Testen bij hogere concentraties kan voor de doelstellingen van een specifieke test echter noodzakelijk zijn. UITVOERING VAN DE PROEVEN Test-en controlegroepen 23. Voor elke testconcentratie wordt een hoeveelheid testgrond overeenkomend met 20 g drooggewicht in het testvat gedaan (zie de punten 19-21). Er worden ook controles, zonder de teststof, voorbereid. Aan elk vat wordt voeding toegevoegd overeenkomstig de in punt 29 beschreven procedures. Aan elk testvat worden willekeurig tien wormen toegewezen. De wormen worden voorzichtig naar elk testvat overgebracht en met behulp van bijvoorbeeld een juwelierspincet, haken of ogen op de oppervlakte van de grond geplaatst. Het aantal replicaten voor testconcentraties en voor controles hangt af van de gebruikte testopzet (zie punt 34). De testvaten worden willekeurig in de testincubator geplaatst en deze posities worden wekelijks opnieuw gerandomiseerd. 24. Als voor de toevoeging van de teststof een oplosmiddel wordt gebruikt, moet er naast de testreeksen één controlereeks zijn die besproeid kwartszand of kwartszand vermengd met oplosmiddel bevat. De concentratie van het oplosmiddel of dispergeermiddel moet dezelfde zijn als die in de vaten met de teststof. Er moet een controlereeks met extra kwartszand (2,5 g per vat) worden uitgevoerd voor stoffen die moeten worden toegediend overeenkomstig de in punt 21 beschreven procedures. Testomstandigheden 25. De testtemperatuur is 20 ± 2 °C. Om wormen te ontmoedigen uit de grond te ontsnappen, wordt de test uitgevoerd bij gecontroleerde licht-donkercycli (bij voorkeur 16 uur licht en 8 uur donker), met een verlichting van 400 tot 800 lux in het gebied van de testvaten. 26. Om de vochtigheidsgraad van de grond te controleren, worden de vaten aan het begin van de test en vervolgens één keer per week gewogen. Gewichtsverlies wordt aangevuld door de toevoeging van een passende hoeveelheid gedeïoniseerd water. Er zij opgemerkt dat het vochtverlies kan worden beperkt door in de testincubator een hoge luchtvochtigheid (> 80 %) te handhaven. 27. Het vochtgehalte en de pH moeten aan het begin en aan het eind van de bereikbepalingstest en de definitieve test worden gemeten. De metingen moeten geschieden in de controlegrondmonsters en in de behandelde grondmonsters (alle concentraties) die op dezelfde wijze zijn bereid en worden bewaard als de testculturen, maar geen wormen bevatten. Aan deze grondmonsters mag uitsluitend aan het begin van de test voedsel worden toegevoegd om de microbiële activiteit te bevorderen. De hoeveelheid toegevoegd voedsel moet gelijk zijn aan die van de testculturen. Het is niet nodig om tijdens de test verder voedsel aan deze vaten toe te voegen. Voeding 28. Er mag voedsel worden gebruikt dat de populatie enchytreeën in stand kan houden. Havervlokken, bij voorkeur vóór gebruik in een autoclaaf gesteriliseerd om microbiële besmetting te voorkomen (verhitting is ook geschikt) zijn als voedingsstof geschikt bevonden. 29. Voedsel wordt de eerst keer verstrekt door vóór de plaatsing van de wormen 50 mg gemalen havervlokken met de grond in elk vat te vermengen. Daarna wordt wekelijks tot en met dag 21 voedsel verstrekt. Op dag 28 wordt geen voeding verstrekt, omdat de volwassen dieren in die fase zijn verwijderd en de jonge wormen vanaf dit punt relatief weinig aanvullende voeding nodig hebben. De voeding tijdens de test bestaat uit 25 mg gemalen havervlokken per vat en wordt voorzichtig op het oppervlak van de grond aangebracht om beschadiging van de wormen te vermijden. Om schimmelgroei te beperken moeten de havervlokken in de grond worden begraven door ze te bedekken met kleine hoeveelheden grond. Als het voedsel niet volledig wordt opgegeten, moet de portie worden verkleind. Opzet van de bereikbepalingstest 30. Indien nodig wordt een bereikbepalingstest uitgevoerd met bijvoorbeeld vijf teststofconcentraties van 0,1, 1,0, 10, 100 en 1 000 mg/kg (drooggewicht grond). Eén replicaat voor elke behandeling en controle volstaat. 31. De bereikbepalingstest duurt twee weken. Aan het eind van de test wordt de mortaliteit van de wormen beoordeeld. Een worm wordt als dood geregistreerd indien hij niet reageert op een mechanische stimulus op de kop. Aanvullende informatie over de mortaliteit kan ook nuttig zijn om de reeks concentraties voor de definitieve test vast te stellen. Veranderingen in het gedrag van de volwassen dieren (bv. onvermogen om in de grond te graven, bewegingsloos tegen de glazen wand van het testvat liggen) en de morfologie van de volwassen dieren (bv. de aanwezigheid van open wonden) moeten daarom ook worden geregistreerd, evenals de aanwezigheid van eventuele nakomelingen. Dit laatste kan worden vastgesteld aan de hand van de in aanhangsel 6 beschreven kleuringsmethode. 32. De LC50 kan worden geschat door het meetkundig gemiddelde van de mortaliteitsgegevens te berekenen. Bij het vaststellen van het concentratiebereik voor de definitieve test worden de effecten op de voortplanting geacht maximaal een factor 10 kleiner te zijn dan de LC50. Dit is echter een empirisch verband dat in specifieke gevallen anders kan zijn. Aanvullende waarnemingen die tijdens de bereikbepalingstest worden gedaan, zoals het voorkomen van nakomelingen, kunnen het concentratiebereik van de teststof dat in de definitieve test moet worden gebruikt, helpen verfijnen. 33. Voor een nauwkeurige bepaling van de LC50 wordt aanbevolen de test uit te voeren met ten minste vier replicaten elk van de teststofconcentratie en een toereikend aantal concentraties om ten minste vier statistisch significant verschillende gemiddelde responsen op deze concentraties te veroorzaken. Indien van toepassing wordt voor de controles hetzelfde aantal concentraties en replicaten gebruikt. Opzet van de definitieve voortplantingstest 34. Op basis van de aanbevelingen voortvloeiende uit een ringtest (2) worden drie opzetten voorgesteld. — Voor de bepaling van de NOEC moeten ten minste vijf concentraties worden getest die een meetkundige reeks vormen. Aanbevolen wordt vier replicaten voor elke testconcentratie plus acht controles te gebruiken. De concentraties moeten worden gekozen met intervallen die onderling verschillen met een factor van niet meer dan 1,8. — Voor de bepaling van de ECx (bv. EC10, EC50) moeten ten minste vijf concentraties worden getest en moet de ECx in het concentratiebereik liggen om bepaling van ECx door interpolatie in plaats van extrapolatie mogelijk te maken. Het wordt aanbevolen ten minste vier replicaten voor elke testconcentratie en vier replicaten voor de controles te gebruiken. De intervalsfactor kan variëren, d.w.z. kleiner dan of gelijk aan 1,8 in het verwachte effectbereik en groter dan 1,8 bij de hogere en lagere concentraties. — Een gecombineerde aanpak maakt het mogelijk om zowel de NOEC als de ECx te bepalen. Er moeten acht behandelingsconcentraties die een meetkundige reeks vormen, worden gebruikt. Aanbevolen wordt vier replicaten voor iedere behandeling plus acht controles te gebruiken. De concentraties moeten worden gekozen met intervallen die onderling verschillen met een factor van niet meer dan 1,8. 35. Er moeten tien volwassen wormen per testvat worden gebruikt (zie punt 23). Voedsel wordt aan het begin van de test en vervolgens één keer per week aan de testvaten toegevoegd (zie punt 29) tot en met dag 21. Op dag 21 worden de grondmonsters voorzichtig met de hand doorzocht, worden de levende volwassen wormen geobserveerd en geteld en worden veranderingen in het gedrag (bv. onvermogen om in de grond te graven, bewegingsloos tegen de glazen wand van het testvat liggen) en de morfologie (bv. de aanwezigheid van open wonden) geregistreerd. Alle volwassen wormen worden vervolgens uit de testvaten en de testgrond verwijderd. De testgrond die geproduceerde cocons bevat, wordt nog eens drie weken onder dezelfde testomstandigheden geïncubeerd, behalve dat enkel op dag 35 voedsel wordt toegevoegd (d.w.z. 25 mg gemalen havervlokken per vat). 36. Na zes weken worden de nieuw uitgekomen wormen geteld. De methode gebaseerd op kleuring met Bengaals rood (zie aanhangsel 6) wordt aanbevolen, maar er is ook aangetoond dat andere natte (maar niet warme) extractie- en drijftechnieken (zie aanhangsel 6) geschiktheid zijn (4)(10)(11)(20). Kleuring met Bengaals rood wordt aanbevolen, omdat natte extractie uit een grondsubstraat hinder kan ondervinden van troebelheid als gevolg van gesuspendeerde kleideeltjes. Limiettest 37. Als bij de hoogste concentratie in de bereikbepalingstest (d.w.z. 1 000 mg/kg) geen effecten worden waargenomen, kan de voortplantingstest worden uitgevoerd als een limiettest, waarbij 1 000 mg/kg wordt gebruikt om aan te tonen dat de NOEC voor de voortplanting groter is dan deze waarde. Samenvatting en tijdschema van de test 38. De stappen van de test kunnen als volgt worden samengevat: Tijdstip Bereikbepalingstest Definitieve test Dag – 7 of eerder — Bereid kunstmatige grond (mengen van droge bestanddelen) — Bereid kunstmatige grond (mengen van droge bestanddelen) Dag – 5 — Controleer de pH van de kunstmatige grond — Meet WHVmax van de grond — Controleer de pH van de kunstmatige grond — Meet WHVmax van de grond Dag – 5 tot – 3 — Sorteer de wormen voor acclimatisering — Sorteer de wormen voor acclimatisering Dag – 3 tot 0 — Acclimatiseer de wormen gedurende ten minste 24 uur — Acclimatiseer de wormen gedurende ten minste 24 uur Dag – 1 — Bevochtig vooraf de kunstmatige grond en verdeel de grond in batches — Bevochtig vooraf de kunstmatige grond en verdeel de grond in batches Dag 0 — Bereid stamoplossingen — Breng teststof aan — Weeg het testsubstraat af in de testvaten — Meng het voedsel erdoorheen — Plaats de wormen — Meet de pH en het vochtgehalte van de grond — Bereid stamoplossingen — Breng teststof aan — Weeg het testsubstraat af in de testvaten — Meng het voedsel erdoorheen — Plaats de wormen — Meet de pH en het vochtgehalte van de grond Dag 7 — Controleer het vochtgehalte van de grond — Controleer het vochtgehalte van de grond — Geef voedsel Dag 14 — Bepaal de mortaliteit van de volwassen dieren — Schat het aantal nakomelingen — Meet de pH en het vochtgehalte van de grond — Controleer het vochtgehalte van de grond — Geef voedsel Dag 21 — Observeer het gedrag van de volwassen dieren — Verwijder de volwassen dieren — Bepaal de mortaliteit van de volwassen dieren — Controleer het vochtgehalte van de grond — Geef voedsel Dag 28 — Controleer het vochtgehalte van de grond — Geef géén voedsel Dag 35 — Controleer het vochtgehalte van de grond — Geef voedsel Dag 42 — Tel de jonge wormen — Meet de pH en het vochtgehalte van de grond GEGEVENS EN RAPPORTAGE Verwerking van de resultaten 39. Hoewel aanhangsel 7 een overzicht bevat, wordt in deze testmethode geen definitieve statistische richtsnoer voor de analyse van de testresultaten gegeven. 40. In de bereikbepalingstest is het belangrijkste eindpunt de mortaliteit. Veranderingen in het gedrag (bv. onvermogen om in de grond te graven, bewegingsloos tegen de glazen wand van het testvat liggen) en de morfologie (bv. de aanwezigheid van open wonden) van de volwassen wormen moeten echter ook worden geregistreerd, evenals de aanwezigheid van eventuele nakomelingen. Normaal gesproken moet probit-analyse (21) of logistische regressie worden toegepast om de LC50 te bepalen. In gevallen waarin deze analysemethode niet geschikt is (bv. als er minder dan drie concentraties met gedeeltelijke sterfte beschikbaar zijn), kunnen echter andere methoden worden gebruikt. Tot deze methoden behoren onder andere voortschrijdende gemiddelden (22), de getrimde Spearman-Karber-methode (23) of eenvoudige interpolatie (bv. meetkundig gemiddelde van LC0 en LC100, berekend als de vierkantswortel van LC0 vermenigvuldigd met LC100). 41. In de definitieve test is de vruchtbaarheid (d.w.z. het aantal voortgebrachte jonge dieren) het eindpunt van de test. Net als in de bereikbepalingstest moeten echter ook hier alle andere schadelijke tekenen worden geregistreerd in het eindverslag. De statistische analyse vereist dat het rekenkundig gemiddelde en de standaardafwijking per behandeling en per controle voor de voortplanting worden berekend. 42. Als een variantieanalyse is uitgevoerd, kunnen de standaardafwijking (s) en het aantal vrijheidsgraden (df) worden vervangen door respectievelijk de schatting van de gepoolde variantie verkregen uit de ANOVA en haar aantal vrijheidsgraden, mits de variantie niet afhankelijk is van de concentratie. Gebruik in dit geval de afzonderlijke varianties van de controle en de behandelingen. Deze waarden worden doorgaans berekend door commerciële statistische software met de resultaten per vat als replicaten. Als het poolen van de gegevens voor de negatieve en oplosmiddelcontroles redelijk lijkt, in plaats van het toetsen tegen een hiervan, moet worden getoetst of ze niet significant verschillen (zie punt 45 en aanhangsel 7 voor geschikte toetsen). 43. De verdere statistische toetsen en gevolgtrekkingen hangen af van de vraag of de replicaatwaarden normaal verdeeld zijn en homogeen zijn voor wat betreft hun variantie. Schatting van NOEC 44. De toepassing van krachtige toetsen heeft de voorkeur. Er dient gebruik te worden gemaakt van informatie uit bv. eerdere ervaring met ringtesten of andere historische gegevens over de vraag of gegevens ongeveer normaal verdeeld zijn. Homogeniteit van variantie (homoscedasticiteit) is crucialer. De ervaring leert dat de variantie vaak toeneemt bij een hoger gemiddelde. In deze gevallen zou een gegevenstransformatie kunnen leiden tot homoscedasticiteit. Een dergelijke transformatie moet echter worden gebaseerd op de ervaring met historische gegevens in plaats van op gegevens van het lopende onderzoek. Bij homogene gegevens moeten multipele t-toetsen zoals de Williams-toets (α = 0,05, eenzijdig) (24)(25) of in bepaalde gevallen de toets van Dunnett (26)(27) worden uitgevoerd. Er zij opgemerkt dat in het geval van ongelijke aantallen replicaten de tabel met t-waarden moet worden aangepast zoals voorgesteld door Dunnett en Williams. Soms nemen de responsen als gevolg van grote variatie niet regelmatig toe of af. In het geval van een sterke afwijking van monotoniciteit is de toets van Dunnett geschikter. Als er afwijkingen van homoscedasticiteit zijn, kan het redelijk zijn om mogelijke effecten op varianties nader te onderzoeken om te bepalen of de t-toetsen kunnen worden toegepast zonder al te zeer aan statistisch onderscheidingsvermogen in te boeten (28). Anders kan een multipele Mann-Whitney-toets, bv. de Bonferroni-toets volgens Holm (29), of wanneer deze gegevens heteroscedasticiteit vertonen maar anderszins consistent zijn met een onderliggende monotone dosis-respons, een andere verdelingsvrije toets (bv. Jonckheere-Terpstra (30) (31) of Shirley (32) (33)) worden toegepast, en deze zal doorgaans de voorkeur hebben boven t-toetsen voor ongelijke varianties. (Zie ook het schema in aanhangsel 7.) 45. Als een limiettest is uitgevoerd en er is voldaan aan de voorwaarden van parametrische toetsprocedures (normaliteit, homogeniteit), kan de gepaarde t-toets worden gebruikt, of anders de Mann-Whitney-toets (29). Schatting van ECx 46. Om een ECx-waarde te berekenen worden de gemiddelden per behandeling gebruikt voor regressieanalyse (lineair of niet-lineair), nadat een passende dosis-responsfunctie is verkregen. Voor de groei van wormen als een continue respons kunnen ECx-waarden worden geschat met behulp van geschikte regressieanalyse (35). Tot de geschikte functies voor binaire gegevens (mortaliteit/overleving en aantal geproduceerde nakomelingen) behoren de normale sigmoïde, logistische of Weibull-functies, met twee tot vier parameters, waarvan sommige ook hormetische responsen kunnen modelleren. Als een dosis-responsfunctie werd gefit door lineaire regressieanalyse, moet bij de regressieanalyse een significante r2 (determinatiecoëfficiënt) en/of helling worden gevonden voordat de ECx kan worden geschat door in de door de regressieanalyse gevonden vergelijking een waarde in te vullen die overeenkomt met x % van het controlegemiddelde. De 95 %-betrouwbaarheidsgrenzen worden berekend overeenkomstig Fieller (geciteerd in Finney (21)) of andere passende moderne methoden. 47. De respons kan ook worden gemodelleerd als een percentage of proportie van de modelparameter die wordt geïnterpreteerd als de gemiddelde respons van de controle. In deze gevallen kan de normale (logistische, Weibull) sigmoïde curve vaak gemakkelijk aan de resultaten worden gefit met de probit-regressieprocedure (21). In deze gevallen moet de weegfunctie aan de metrische responsen worden aangepast zoals aangegeven door Christensen (36). Als echter hormese is waargenomen, moet probit-analyse worden vervangen door een logistische of Weibull-functie met vier parameters, die wordt gefit met een niet-lineaire regressieprocedure (36). Als geen geschikte dosis-responsfunctie aan de gegevens kan worden gefit, kunnen alternatieve methoden worden gebruikt om de ECx en de betrouwbaarheidsgrenzen te schatten, zoals voortschrijdende gemiddelden volgens Thompson (22) en de getrimde Spearman-Karber-methode (23). TESTVERSLAG 48. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: — fysische aard en relevante fysisch-chemische eigenschappen (bv. oplosbaarheid in water, dampspanning); — chemische naam volgens de IUPAC-nomenclatuur, CAS-nummer, batch, partij, structuurformule en zuiverheid van de teststof; — datum waarop de geldigheidsduur van het monster verstrijkt. Diersoort: — gebruikte testdieren: soort, wetenschappelijke naam, bron van de organismen en kweekomstandigheden. Testomstandigheden: — ingrediënten en bereiding van de kunstmatige grond; — wijze van aanbrengen van de teststof; — beschrijving van de testomstandigheden, met inbegrip van de temperatuur, het vochtgehalte, de pH, enz.; — volledige beschrijving van de testopzet en procedures. Testresultaten: — mortaliteit van de volwassen wormen na twee weken en het aantal nakomelingen aan het eind van de bereikbepalingstest; — mortaliteit van de volwassen wormen na drie weken blootstelling en de volledige gegevens over nakomelingen aan het eind van de definitieve test; — eventuele waargenomen fysieke of pathologische symptomen en gedragsveranderingen in de testorganismen; — de LC50, de NOEC en/of ECx (bv. EC50, EC10) voor de voortplanting als een of meer hiervan van toepassing zijn, met betrouwbaarheidsintervallen en een grafiek van het gefitte model dat is gebruikt voor de berekening ervan, en alle informatie en waarnemingen die van nut zijn voor de interpretatie van de resultaten. Afwijkingen van de procedures beschreven in deze testmethode en alle ongebruikelijke voorvallen tijdens de test. LITERATUUR (1) Römbke J (1989). Entwicklung eines Reproduktionstests an Bodenorganismen — Enchytraeen. Abschlußbericht des Battelle-Instituts e.V. Frankfurt für das Umweltbundesamt (Berlin), FE-Vorhaben 106 03 051/01. (2) Römbke, J. & Moser, T. (1999). Organisation and Performance of an International Ringtest for the Validation of the Enchytraeid Reproduction Test. UBA-Texte 4/99, 150 + 223 blz. (3) Westheide, W. & Bethge-Beilfuss, D. (1991). The sublethal enchytraeid test system: guidelines and some results, In: Modern Ecology: Basic and Applied Aspects. Esser, G. & Overdieck, D. (eds.). blz. 497-508. Elsevier, Amsterdam, (4) Dirven-Van Breemen, E., Baerselmann, R. & Notenboom, J. (1994). Onderzoek naar de Geschiktheid van de Potwormsoorten Enchytraeus albidus en Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Annelida) in Bodemecotoxicologisch Onderzoek. RIVM Rapport Nr. 719102025. 46 pp. (5) Hoofdstuk C.8 van deze bijlage, Toxiciteit voor regenwormen. (6) ISO (International Organization for Standardization) (1993). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 1: Determination of acute toxicity using Artificial Soil substrate, No. 11268-1. ISO, Geneve. (7) ISO (International Organization for Standardization) (1996). Soil Quality — Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction, No. 11268-2. ISO, Geneve. (8) Rundgren, S. & A.K. Augustsson (1998). Test on the enchytraeid Cognettia sphagnetorum (Vejdovsky 1877). In: Løkke, H. & C.A.M. Van Gestel, Handbook of soil invertebrate toxicity tests. John Wiley and Sons, Chichester, 73-94. (9) Kasprzak, K. (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23, 217-232. (10) Römbke, J. (1995). Enchytraeen (Oligochaeta) als Bioindikator, UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 7, 246-249. (11) Dunger, W. & Fiedler, H.J. (1997). Methoden der Bodenbiologie. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York. (12) Didden, W.A.M. (1993). Ecology of terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37, 2-29. (13) Becker, H. (1991). Bodenorganismen — Prüfungskategorien der Forschung. UWSF — Z. Umweltchem. Ökotox. 3, 19-24. (14) Römbke, J. & Federschmidt, A. (1995). Effects of the fungicide Carbendazim on Enchytraeidae in laboratory and field tests, Newsletter on Enchytraeidae 4, 79-96. (15) Römbke, J., Riepert, F. & Achazi R. (2000): Enchytraeen als Testorganismen. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (eds.). Spektrum Verl., Heidelberg. 59-81. (16) ISO (International Organization for Standardization) (1994). Soil Quality — Determination of pH, No. 10390. ISO, Geneve. (17) Bell, A.W. (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902, 1-13. (18) Nielsen, C.O. & Christensen, B. (1959). The Enchytraeidae, critical revision and taxonomy of European species. Natura Jutlandica 8-9, 1-160. (19) Bouguenec, V. & Giani, N. (1987). Deux nouvelles especes d'Enchytraeus (Oligochaeta, Enchytraeidae) et rediscription d'E. bigeminus. Remarques sur le genre Enchytraeus. Ann. Limnol. 23, 9-22. (20) Korinkova, J. & Sigmund, J. (1968). The colouring of bottom-fauna samples before sorting, Vestnik Ceskoslovensko Spolecnosti Zoologicke 32, 300-305. (21) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis (3rd ed.), blz. 19-76. Cambridge Univ. Press. (22) Finney, D. J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. — Charles Griffin & Company Ltd, London. (23) Hamilton, M.A., R.C. Russo & R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; Correctie Environ. Sci. Technol. 12(1998), 417. (24) Williams, D.A., (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117. (25) Williams, D.A., (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531. (26) Dunnett, C.W., (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121. (27) Dunnett, C.W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491. (28) Hoeven, N. van der, (1998). Power analysis for the NOEC: What is the probability of detecting small toxic effects on three different species using the appropriate standardized test protocols? Ecotoxicology 7: 355-361 (29) Holm, S., (1979): A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70. (30) Jonckheere, A. R. (1954). A Distribution-free k-Sample Test Against Ordered Alternatives. Biometrika 41, 133-145. (31) Terpstra, T. J. (1952). The Asymptotic Normality and Consistency of Kendall's Test Against Trend, When Ties are Present in One Ranking. Indagationes Math. 14, 327-333. (32) Shirley, E. A. (1979). The comparison of treatment to control group means in toxicology studies. Applied Statistics 28, 144-151. (33) Williams, D.A. (1986). A Note on Shirley's Nonparametric Test for Comparing Several Dose Levels with a Zero-Dose Control. Biometrics 42, 183-186. (34) Sokal, R.R. & F.J. Rohlf. (1981). Biometry. The Principle and practice of statistics in biological research. 2nd edition. W.H. Freeman and Company. New York. (35) Christensen, E.R., (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18, 213-221. (36) Van Ewijk, P.H. & J.A. Hoekstra. (1993). Calculation of the EC50 and its confidence interval when sub-toxic stimulus is present. Ecotox, Environ. Safety. 25, 25-32. Aanhangsel 1 Definities Voor de toepassing van deze testmethode worden de volgende definities gehanteerd: Stof betekent een substantie of mengsel. ECx (Effect concentration for x % effect) is de concentratie die binnen een bepaalde blootstellingstijd x % van een effect op testorganismen veroorzaakt ten opzichte van een controle. In deze test worden de effectconcentraties uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond. LC0 (No lethal concentration) is de concentratie van een teststof die binnen een bepaalde blootstellingstijd geen van de blootgestelde testorganismen doodt. In deze test wordt de LC0 uitgedrukt als een massa van de teststof per droge massa van de testgrond. LC50 (Median lethal concentration) is de concentratie van een teststof die binnen een bepaalde blootstellingstijd 50 % van de