BIJLAGE

De bijlage bij Verordening (EG) nr. 440/2008 wordt als volgt gewijzigd:

De volgende hoofdstukken B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 en B.58 worden toegevoegd:

„B.53. ONDERZOEK NAAR ONTWIKKELINGSNEUROTOXICITEIT

INLEIDING

1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 426 (2007) van de OESO. In juni 1995 boog een werkgroep inzake reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit van de OESO in Kopenhagen zich over de noodzaak om de bestaande OESO-testrichtlijnen voor reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit bij te werken en over de ontwikkeling van nieuwe richtsnoeren voor nog niet behandelde eindpunten (1). De werkgroep deed de aanbeveling een testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit te schrijven uitgaande van een Amerikaanse EPA-richtlijn, die inmiddels is herzien (2). In juni 1996 werd in Kopenhagen een tweede raadplegingsbijeenkomst gehouden om het Secretariaat een leidraad te bieden voor de opzet van een nieuwe testrichtlijn voor ontwikkelingsneurotoxiciteit, met inbegrip van de hoofdelementen, bv. details over de keuze van de diersoort, toedieningsperiode, testperiode, te beoordelen eindpunten en criteria voor de evaluatie van de resultaten. In 1998 werd een Amerikaanse richtlijn over risicobeoordeling van neurotoxiciteit gepubliceerd (3). In oktober 2000 vonden back-to-back een OESO-raadplegingsbijeenkomst met deskundigen en een workshop van het Risk Science Institute van het ILSI plaats en in 2005 vond in Tokio een raadplegingsbijeenkomst met deskundigen plaats. Deze bijeenkomsten vonden plaats om de wetenschappelijke en technische problemen in verband met de huidige testrichtlijn te bespreken en de aanbevelingen van de bijeenkomsten (4)(5)(6)(7) werden bij de ontwikkeling van deze testmethode in aanmerking genomen. Aanvullende informatie over de uitvoering, interpretatie en de voor deze testmethode gebruikte terminologie is te vinden in de OESO-leidraden nr. 43: „Reproductive Toxicity Testing and Assessment” (8) en nr. 20: „Neurotoxicity Testing” (9).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN

2. Van een aantal stoffen is bekend dat ze ontwikkelingsneurotoxische effecten bij de mens en andere soorten veroorzaken (10)(11)(12)(13). Voor het beoordelen en evalueren van de toxische kenmerken van een stof kan het nodig zijn om de potentiële ontwikkelingsneurotoxiciteit te bepalen. Onderzoeken naar ontwikkelingsneurotoxiciteit zijn bedoeld om gegevens, waaronder dosis-responskarakteriseringen, te verkrijgen over de potentiële functionele en morfologische effecten op het ontwikkelende zenuwstelsel van de nakomelingen die kunnen ontstaan door blootstelling in utero en in het begin van hun leven.

3. Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit kan als een apart onderzoek worden uitgevoerd, worden opgenomen in een onderzoek naar reproductietoxiciteit en/of neurotoxiciteit bij volwassenen (bv. testmethoden B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)) of worden toegevoegd aan een onderzoek naar prenatale-ontwikkelingstoxiciteit (bv. testmethode B.31 (17)). Wanneer het onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit wordt opgenomen in of toegevoegd aan een ander onderzoek, is het absoluut noodzakelijk dat de integriteit van beide onderzoekstypen behouden blijft. Alle testen moeten voldoen aan de toepasselijke wetgeving of richtlijnen van de overheid of de instelling voor het gebruik van proefdieren in onderzoek (bv. 18).

4. Het testlaboratorium moet vóór uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof bestuderen. Deze informatie betreft de identiteit en structuur van de stof; de fysisch-chemische eigenschappen ervan; de resultaten van eventuele andere in-vitro- of in-vivotoxiciteitstesten met de stof; toxicologische gegevens over qua structuur verwante stoffen, en het/de verwachte vorm(en) van gebruik van de stof. Deze informatie is noodzakelijk om alle betrokkenen ervan te verzekeren dat de test relevant is voor de bescherming van de gezondheid van de mens en helpt bij het kiezen van een geschikte aanvangsdosis.

PRINCIPE VAN DE TEST

5. De teststof wordt aan dieren toegediend tijdens de dracht en de zoogperiode. Om de effecten bij drachtige en zogende vrouwtjes te beoordelen, worden moederdieren getest. Dit kan ook vergelijkende informatie geven (moederdieren versus nakomelingen). Voor beoordeling van de neurotoxiciteit worden willekeurig nakomelingen uit nesten gekozen. De beoordeling bestaat uit observaties om macroscopische neurologische en gedragsafwijkingen te detecteren, waaronder de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling, ontogenie van het gedrag, motorische activiteit, motorische en sensorische functie, en het leervermogen en geheugen; alsmede de beoordeling van het hersengewicht en de neuropathologie tijdens de postnatale ontwikkeling en volwassenheid.

6. Als de testmethode wordt uitgevoerd als een apart onderzoek, kunnen aanvullende beschikbare dieren in elke groep worden gebruikt voor specifieke neurogedrags-, neuropathologische, neurochemische of elektrofysiologische procedures die ter ondersteuning kunnen dienen van de gegevens die zijn verkregen van de door deze testmethode aanbevolen onderzoeken (16)(19)(20)(21). De aanvullende procedures kunnen vooral nuttig zijn als empirische waarnemingen, verwachte effecten of het werkingsmechanisme duiden op een bepaald type neurotoxiciteit. Deze aanvullende procedures kunnen zowel bij de moederdieren als bij de jongen worden gebruikt. Daarnaast kunnen ook ex-vivo- of in-vivoprocedures worden gebruikt, mits deze procedures niet de integriteit van de in-vivoprocedures doen veranderen.

VOORBEREIDINGEN VOOR DE TEST

Keuze van de diersoort

7. De testsoort die de voorkeur verdient is de rat; andere soorten kunnen in voorkomende gevallen worden gebruikt. Merk echter op dat de in deze testmethode vermelde dracht- en postnatale dagen specifiek zijn voor vaak gebruikte rattenstammen en dat er vergelijkbare dagen moeten worden gekozen als een andere soort of ongebruikelijke stam wordt gebruikt. Het gebruik van een andere soort moet worden gemotiveerd aan de hand van toxicologische, farmacokinetische en/of andere gegevens. In de motivering moet de beschikbaarheid van soortspecifieke postnatale neurogedrags- en neuropathologische beoordelingen aan de orde komen. Als een eerdere test aanleiding gaf tot bezorgdheid, moet de in die test gebruikte soort/stam worden overwogen. Omdat verschillende rattenstammen verschillende prestatiekenmerken vertonen, moeten er aanwijzingen zijn dat de vruchtbaarheid en het responsvermogen van de gekozen stam toereikend zijn. De betrouwbaarheid en gevoeligheid van andere soorten voor de detectie van ontwikkelingsneurotoxiciteit moeten worden gedocumenteerd.

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

8. De temperatuur in de proefdierruimte moet 22 °C (± 3 °C) zijn. Hoewel de relatieve luchtvochtigheid ten minste 30 % moet bedragen en, behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte, bij voorkeur niet hoger mag zijn dan 70 %, moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Het is ook mogelijk de lichtcyclus vóór het paren en gedurende de duur van het onderzoek om te draaien, zodat de beoordelingen van functie- en gedragseindpunten tijdens de donkere periode (onder rood licht) kunnen worden uitgevoerd, d.w.z. als de dieren normaliter actief zijn (22). Veranderingen van de licht-donkercyclus dienen vergezeld te gaan van een passende acclimatiseringstijd om de dieren aan de nieuwe cyclus te laten wennen. Als voeding mag het gewone proefdiervoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Het soort voeding en het soort water moeten worden gerapporteerd en beide moeten worden geanalyseerd op onzuiverheden.

9. De dieren kunnen elk apart of in kleine groepen van hetzelfde geslacht worden ondergebracht. Het paren moet plaatsvinden in kooien die voor dat doel geschikt zijn. Na gebleken copulatie of niet later dan dag 15 van de dracht, moeten gedekte dieren afzonderlijk in kooien worden ondergebracht, die zijn bestemd voor werpen of moederschap. De kooien worden zodanig geplaatst dat mogelijke effecten door de plaatsing van de kooi tot een minimum worden beperkt. Als het moment van werpen nadert, moeten de gedekte vrouwtjes worden voorzien van geschikt en gedefinieerd nestmateriaal. Het is algemeen bekend dat onjuiste behandeling of stress tijdens de dracht kan leiden tot ongunstige uitkomsten, zoals prenatale sterfte en afwijkende foetale en postnatale ontwikkeling. Om verlies van de foetus als gevolg van factoren die geen verband houden met de behandeling, te voorkomen, moeten de dieren tijdens de dracht voorzichtig worden behandeld en moet stress als gevolg van externe factoren, zoals overmatig geluid van buitenaf, worden vermeden.

Voorbereiding van de dieren

10. Er moeten gezonde dieren worden gebruikt die aan de omstandigheden in het laboratorium hebben kunnen wennen en waarop geen eerdere proeven zijn uitgevoerd, tenzij het onderzoek is opgenomen in een ander onderzoek (zie punt 3). De kenmerken van de proefdieren qua soort, stam, herkomst, geslacht, gewicht en leeftijd worden vastgelegd. Aan elk dier moet een uniek identificatienummer worden toegekend, waarmee het gemarkeerd wordt. De dieren van alle testgroepen moeten zoveel mogelijk van gelijk gewicht en gelijke leeftijd zijn, en moeten tot de normale variëteiten van de onderzochte soort en stam behoren. Bij elk dosisniveau moeten jongvolwassen vrouwtjes worden gebruikt die nog geen jongen hebben gehad. Dekking door mannetjes met dezelfde ouders moet worden vermeden en daar moet op worden toegezien. Drachtdag (gestation day, GD) 0 is de dag waarop een vaginale prop en/of sperma worden waargenomen. Als bij een leverancier dieren zijn aangeschaft die op een bekend tijdstip zijn gedekt, moet een passende acclimatiseringstijd (bv. 2-3 dagen) in acht worden genomen. Gedekte vrouwtjes moeten op neutrale wijze worden toegewezen aan de controle- en behandelgroepen en zo gelijk mogelijk worden verdeeld over de groepen (er wordt bijvoorbeeld een gestratificeerde gerandomiseerde procedure aanbevolen voor een gelijke verdeling over alle groepen, zoals wat betreft lichaamsgewicht). Vrouwtjes die door hetzelfde mannetje zijn geïnsemineerd, moeten gelijkelijk over de groepen worden verdeeld.

PROCEDURE

Aantal en geslacht van de dieren

11. Elke test- en controlegroep moet een voldoende aantal drachtige vrouwtjes bevatten die worden blootgesteld aan de teststof om ervoor te zorgen dat het aantal nakomelingen dat wordt geproduceerd toereikend is voor beoordeling van de neurotoxiciteit. Bij elk dosisniveau wordt aanbevolen in totaal 20 nesten te gebruiken. Doseringsopzetten waarbij gebruik wordt gemaakt van duplo's en opeenvolgende groepen zijn toegestaan als het totaal aantal nesten per groep wordt bereikt en passende statistische modellen worden gebruikt om rekening te houden met duplo's.

12. Op of vóór postnatale dag (PND) 4 (dag van werpen is PND 0), moet de grootte van elk nest worden aangepast door eliminatie van extra jongen door willekeurige selectie tot alle nesten een gelijke nestgrootte hebben (23). De nestgrootte mag niet groter zijn dan de gemiddelde nestgrootte voor de gebruikte knaagdierstam (8-12). Het nest moet zoveel mogelijk bestaan uit gelijke aantallen mannelijke en vrouwelijke jongen. Er dient geen selectieve eliminatie van jongen, bv. op grond van lichaamsgewicht, plaats te vinden. Na standaardisatie van de nesten (ruimen) en voorafgaand aan verder testen van functie-eindpunten, krijgen individuele jongen waarmee testen vóór of na spening uitgevoerd gaan worden, een unieke identificatie met behulp van een geschikte humane methode voor identificatie van jongen (bv. 24).

Toewijzen van dieren aan functie- en gedragstesten, bepaling hersengewicht en neuropathologische beoordelingen

13. Met deze testmethode kunnen dieren die in utero en via het zogen zijn blootgesteld, op verscheidene manieren worden toegekend aan functie- en gedragstesten, bepaling van geslachtsrijping en hersengewicht en neuropathologische beoordeling (25). Andere testen van de neurogedragsfunctie (bv. sociaal gedrag), neurochemie of neuropathologie kunnen per geval worden toegevoegd, mits de integriteit van de oorspronkelijke vereiste testen niet in het gedrang komt.

14. De jongen worden gekozen uit elke dosisgroep en toegewezen aan eindpuntsbeoordelingen op of na PND 4. De selectie van de jongen moet zodanig gebeuren, dat in alle testen beide geslachten uit elk nest in elke dosisgroep zo veel mogelijk gelijk vertegenwoordigd zijn. Voor het testen van de motorische activiteit moet op alle leeftijden vóór spening hetzelfde paar van mannelijke en vrouwelijke jongen worden getest (zie punt 35). Voor alle andere testen kunnen hetzelfde paar of verschillende paren van mannelijke en vrouwelijke dieren worden toegewezen aan verschillende gedragstesten. Er moeten mogelijk verschillende jongen worden toegewezen aan testen van de cognitieve functie met gespeende dieren versus die met volwassen dieren om verstoring door de effecten van leeftijd en eerdere training in deze bepalingen te voorkomen (26)(27). Op het moment van spenen (PND 21) kunnen jongen die niet zijn geselecteerd voor onderzoek, op humane wijze worden afgevoerd. Eventuele veranderingen in toewijzing van jongen moeten worden gerapporteerd. De statistische meeteenheid moet het nest (of het moederdier) zijn en niet het jong.

15. De toewijzing van jongen aan de onderzoeken vóór en na spening, cognitieve testen, pathologische onderzoeken enz. kan op verschillende wijzen plaatsvinden (zie figuur 1 voor algemene opzet en aanhangsel 1 voor voorbeelden van toewijzingen). In elke dosisgroep voor onderzoeken vóór en na spening worden de volgende minimumaantallen van dieren aanbevolen:

Klinische observaties en lichaamsgewicht Alle dieren Gedetailleerde klinische observaties 20/geslacht (1/geslacht/nest) Hersengewicht (na fixatie) PND 11-22 10/geslacht (1/nest) Hersengewicht (niet gefixeerd) ~ PND 70 10/geslacht (1/nest) Neuropathologie (immersie- of perfusiefixatie) PND 11-22 10/geslacht (1/nest) Neuropathologie (perfusiefixatie) PND ~70 10/geslacht (1/nest) Geslachtsrijping 20/geslacht (1/geslacht/nest) Andere ontwikkelingsmijlpalen (facultatief) Alle dieren Ontogenie van het gedrag 20/geslacht (1/geslacht/nest) Motorische activiteit 20/geslacht (1/geslacht/nest) Motorische en sensorische functie 20/geslacht (1/geslacht/nest) Leervermogen en geheugen 10/geslacht (1) (1/nest)

Dosering

16. Er worden ten minste drie dosisniveaus en een gelijktijdige controlegroep gebruikt. De dosisniveaus moeten zodanig zijn verdeeld, dat een gradatie in toxische effecten wordt verkregen. Tenzij de fysisch-chemische aard of biologische eigenschappen van de stof dit beperken, moet het hoogste dosisniveau zodanig worden gekozen dat enige maternale toxiciteit optreedt (bv. klinische symptomen, verminderde gewichtstoename (niet meer dan 10 %) en/of aanwijzingen voor dosisbeperkende toxiciteit in een doelorgaan). De hoge dosis kan worden beperkt tot 1 000 mg/kg/dag lichaamsgewicht, met enkele uitzonderingen. Zo kan de verwachte blootstelling voor mensen erop wijzen dat een hoger dosisniveau moet worden gebruikt. Een andere mogelijkheid is verkennende onderzoeken of voorlopige bereikbepalingsonderzoeken uit te voeren om de hoogste te gebruiken dosering te bepalen waarbij een minimale mate van maternale toxiciteit optreedt. Als gebleken is dat de teststof toxisch is voor de ontwikkeling, hetzij in een standaard-ontwikkelingstoxiciteitsonderzoek, hetzij in een verkennend onderzoek, moet het hoogste dosisniveau de maximale dosis zijn die geen overmatige toxiciteit bij nakomelingen, of in utero dan wel neonatale sterfte of misvormingen induceert die voldoende is/zijn om een beletsel te vormen voor een betekenisvolle beoordeling van neurotoxiciteit. Het laagste dosisniveau moet erop gericht zijn geen aanwijzingen voor maternale of ontwikkelingstoxiciteit, waaronder neurotoxiciteit, te produceren. Er moet een dalende reeks dosisniveaus worden gekozen teneinde een eventuele doseringsgerelateerde respons en het laagste dosisniveau waarbij geen schadelijk effect werd vastgesteld (no-observed-adverse-effect level, NOAEL) aan te tonen, of doses nabij de detectiegrens waarmee een benchmarkdosis kan worden bepaald. Intervallen van een factor twee tot vier zijn vaak optimaal voor het vaststellen van de dalende dosisniveaus en het is vaak beter een vierde dosisgroep toe te voegen dan zeer grote intervallen (bv. meer dan een factor tien) tussen de doseringen te gebruiken.

17. De dosisniveaus moeten worden gekozen in het licht van alle bestaande toxiciteitsgegevens en aanvullende informatie over het metabolisme en de toxicokinetiek van de teststof of verwante stoffen. Aan de hand van deze informatie kan ook worden aangetoond of het doseringsschema adequaat is. Op grond van blootstellings- en farmacokinetische gegevens moet directe toediening aan jongen worden overwogen (28)(29). De voor- en nadelen moeten zorgvuldig worden overwogen alvorens onderzoeken met directe toediening uit te voeren (30).

18. De gelijktijdige controlegroep wordt met placebo of, als bij de toediening van de teststof een medium wordt gebruikt, met medium behandeld. Alle dieren krijgen normaliter dezelfde hoeveelheid teststof of medium toegediend, op basis van lichaamsgewicht. Bij gebruik van een medium of een ander additief om toediening te vergemakkelijken, moet met de volgende factoren rekening worden gehouden: effecten op de absorptie, de distributie, het metabolisme of de retentie van de teststof; effecten op de chemische eigenschappen van de teststof die de toxische kenmerken daarvan kunnen veranderen, en effecten op de voedsel- of waterconsumptie of de voedingsstatus van de dieren. Het medium mag geen effecten teweegbrengen die de interpretatie van het onderzoek kunnen verstoren, noch mag het neurogedragstoxisch zijn of gevolgen hebben voor de voortplanting of ontwikkeling. Voor nieuwe media moet naast een mediumcontrolegroep een placebocontrolegroep worden opgenomen. De dieren in de controlegroep(en) moeten op identieke wijze worden behandeld als de testgroepdieren.

Toediening van de doses

19. De teststof of het medium moet worden toegediend via de weg die het meest relevant is voor mogelijke menselijke blootstelling en gebaseerd zijn op de beschikbare informatie betreffende metabolisme en distributie bij de proefdieren. De toedieningsweg zal doorgaans oraal (bv. via maagsonde, voeding, drinkwater) zijn, maar andere wegen (bv. dermaal, inhalatie) kunnen ook worden gebruikt, naargelang van de kenmerken en verwachte of bekende blootstellingsroutes bij de mens (verdere richtsnoeren staan in leidraad nr. 43 (8)). De keuze voor een bepaalde toedieningsweg moet worden gemotiveerd. De teststof moet elke dag op ongeveer hetzelfde tijdstip worden toegediend.

20. De aan elk dier toegediende dosis moet normaliter gebaseerd zijn op het meest recente individuele lichaamsgewicht van het dier. Voorzichtigheid is echter geboden bij het aanpassen van de doses tijdens het laatste derde deel van de dracht. Als bij de behandelde moederdieren sprake is van overmatige toxiciteit, moeten die dieren op humane wijze worden gedood.

21. De teststof of het medium moet minimaal dagelijks worden toegediend aan gedekte vrouwtjes vanaf het moment van nidatie (GD 6) tot en met de zoogperiode (PND 21), zodat de jongen tijdens de pre- en postnatale neurologische ontwikkeling aan de teststof worden blootgesteld. De leeftijd waarop de toediening start, en de duur en frequentie van de toediening kunnen worden aangepast als er aanwijzingen zijn die een testopzet die relevanter is voor blootstellingen bij de mens, ondersteunen. De toedieningsduur moet voor andere soorten zodanig worden aangepast, dat de blootstelling plaatsvindt tijdens alle vroege perioden van de hersenontwikkeling (d.w.z. gelijkwaardig aan prenatale en vroeg-postnatale hersengroei bij de mens). De toediening kan beginnen vanaf de start van de dracht (GD 0), hoewel er rekening moet worden gehouden met mogelijk verlies van dieren vóór nidatie als gevolg van de teststof. Toediening vanaf GD 6 voorkomt dit risico, maar in dat geval worden de ontwikkelingsfasen tussen GD 0 en 6 niet behandeld. Als een laboratorium gebruikmaakt van aangeschafte dieren die op een bepaald tijdstip zijn gedekt, is het niet mogelijk om op GD 0 te starten met toedienen. GD 6 is dan een goede startdag. Het testlaboratorium moet het doseringsschema opstellen aan de hand van relevante informatie over de effecten van de teststof, eerdere ervaring en logistieke overwegingen. Dit kan verlenging van toediening na spening inhouden. Er mag niet worden toegediend op de dag waarop wordt geworpen bij de dieren die nog niet helemaal klaar zijn met werpen. In het algemeen wordt aangenomen dat blootstelling van de jongen plaatsvindt via de moedermelk. In gevallen waarin er onvoldoende aanwijzingen zijn voor voortdurende blootstelling van de nakomelingen, moet evenwel directe toediening aan jongen worden overwogen. Aanwijzingen voor voortdurende blootstelling kunnen bv. worden verkregen uit de farmacokinetiek, toxiciteit bij de nakomelingen of veranderingen in biomarkers (28).

OBSERVATIES

Observaties bij moederdieren

22. Alle moederdieren moeten ten minste eenmaal daags zorgvuldig geobserveerd worden met betrekking tot de gezondheidstoestand, waaronder ziekelijkheid en sterfte.

23. Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten periodiek gedetailleerdere klinische observaties worden verricht (ten minste twee maal tijdens de drachttoedieningsperiode en twee maal tijdens de zoogtoedieningsperiode) met ten minste tien moederdieren per dosisniveau. De dieren moeten buiten hun kooi worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan, met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale stress bij de dieren en waarnemersvertekening, en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien mogelijk is het raadzaam de observaties in een bepaald onderzoek door dezelfde technicus te laten verrichten.

24. De aanwezigheid van waargenomen verschijnselen moet worden geregistreerd. Indien mogelijk moet de ernst van de waargenomen verschijnselen eveneens geregistreerd worden. Klinische observaties moeten onder meer (maar niet alleen) bestaan uit: veranderingen in huid, vacht, ogen, slijmvliezen, optreden van uitscheiding, en onwillekeurige reacties (zoals traanvorming, rechtop staan van het haar, pupilgrootte, een ongewoon ademhalingspatroon en/of mondademhaling en eventuele ongewone symptomen van urineren of defecatie).

25. Alle ongewone responsen met betrekking tot lichaamspositie, activiteit (bv. meer of minder intensieve verkenning van het standaardgebied) en coördinatie van bewegingen moeten ook worden genoteerd. Veranderingen in gang (bv. waggelen, ataxie), houding (bv. gebogen rug) en reactiviteit op vastpakken, neerzetten of andere prikkels uit de omgeving, alsmede de aanwezigheid van klonische of tonische bewegingen, convulsies, trillingen, stereotiep gedrag (bv. overmatige lichaamsverzorging, ongewone kopbewegingen, herhaaldelijk ronddraaien), bizar gedrag (bv. bijten of overmatig likken, zelfverminking, achteruitlopen, geluiden maken) of agressie moeten worden opgetekend.

26. Symptomen van toxiciteit moeten worden opgetekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.

27. De dieren moeten op het moment van toediening worden gewogen, en wel ten minste elke week gedurende het onderzoek, op of vlak na de dag van werpen en op PND 21 (spenen). Voor met een maagsonde uitgevoerde onderzoeken moeten de moederdieren ten minste tweemaal per week worden gewogen. Na elke bepaling van het lichaamsgewicht moeten de doses zo nodig worden aangepast. De voedselconsumptie moet tijdens de dracht en zoogperiode minimaal wekelijks worden bepaald. Indien de blootstelling via de watertoevoer verloopt, moet ten minste wekelijks de waterconsumptie worden bepaald.

Observaties bij nakomelingen

28. Alle nakomelingen moeten ten minste dagelijks zorgvuldig geobserveerd worden op symptomen van toxiciteit en ziekelijkheid en sterfte.

29. Tijdens de behandelings- en observatieperioden moeten gedetailleerdere klinische observaties van de nakomelingen worden verricht. De nakomelingen (ten minste één jong/geslacht/nest) moeten worden geobserveerd door getrainde technici die niet weten welke behandeling een gegeven dier heeft ondergaan met behulp van gestandaardiseerde procedures om te zorgen voor minimale vertekening en maximale interobserver-betrouwbaarheid. Indien mogelijk is het raadzaam de observaties door dezelfde technicus te laten verrichten. Minimaal moeten de in punten 24 en 25 beschreven eindpunten worden gecontroleerd, al naargelang van toepassing voor de ontwikkelingsfase die geobserveerd wordt.

30. Alle symptomen van toxiciteit bij de nakomelingen moeten worden opgetekend, met de dag waarop deze ontstonden, tijdstip, mate van ernst en duur.

Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen

31. Veranderingen in ontwikkelingsmijlpalen vóór spening (zoals ontvouwen van de oorschelp, openen van de ogen, doorkomen van snijtanden) hangen nauw samen met het lichaamsgewicht (30)(31). Lichaamsgewicht is mogelijk de beste indicator van lichamelijke ontwikkeling. De bepaling van ontwikkelingsmijlpalen wordt daarom alleen aanbevolen als er al aanwijzingen zijn dat deze eindpunten aanvullende informatie zullen verschaffen. De tijdstippen voor de beoordeling van deze parameters staan vermeld in tabel 1. Afhankelijk van de verwachte effecten en de resultaten van de eerste metingen kan het raadzaam zijn extra tijdstippen toe te voegen of de metingen in andere ontwikkelingsfasen te verrichten.

32. Het is raadzaam om bij de beoordeling van de lichamelijke ontwikkeling de postcoïtale leeftijd in plaats van de postnatale leeftijd te gebruiken (33). Als jongen worden getest op de dag van spening, wordt geadviseerd dit onderzoek te doen vóór de feitelijke spening om de stress van het spenen, die een verstorend effect zou kunnen geven, te vermijden. Bovendien mogen met de jongen geen testen na spening worden gedaan gedurende de twee dagen na het spenen.

Tabel 1

Tijdstippen van de beoordeling van lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen, en functie/gedragseindpunten (2)

Levensperiode Eindpunten Vóór spenen (3) Adolescentie (3) Jongvolwassen dieren (3) Lichamelijke en ontwikkelingsmijlpalen Lichaamsgewicht en klinische observaties wekelijks (4) ten minste om de twee weken ten minste om de twee weken Hersengewicht PND 22 (5) aan einde onderzoek Neuropathologie PND 22 (5) aan einde onderzoek Geslachtsrijping — wanneer van toepassing — Andere ontwikkelingsmijlpalen (6) wanneer van toepassing — — Functie/gedragseindpunten Ontogenie van het gedrag Ten minste twee metingen Motorische activiteit (waaronder gewenning) 1-3 keer (7) — eenmaal Motorische en sensorische functie — eenmaal eenmaal Leervermogen en geheugen — eenmaal eenmaal

33. Levende jongen moeten worden geteld en gesekst, bv. door visuele inspectie of meting van de anogenitale afstand (34)(35) en elk jong in een nest moet afzonderlijk worden gewogen bij de geboorte of kort daarna, ten minste wekelijks tijdens de zoogperiode en ten minste eenmaal per twee weken daarna. Bij de beoordeling van de geslachtsrijping moeten, wanneer opening van de vagina (36) of loslaten van de voorhuid (37) optreedt, de leeftijd en het lichaamsgewicht van het dier worden bepaald voor ten minste één mannetje en één vrouwtje per nest.

Ontogenie van het gedrag

34. De ontogenie van bepaald gedrag moet worden gemeten bij ten minste één jong/geslacht/nest tijdens de passende levensperiode, waarbij op alle testdagen voor al het gedrag dat wordt beoordeeld, dezelfde jongen worden gebruikt. De meetdagen moeten gelijkelijk over die periode worden verdeeld om te bepalen of de verandering in ontogenie van dat gedrag normaal of behandelingsgerelateerd is (38). Voorbeelden van gedrag waarvan de ontogenie kan worden beoordeeld zijn: oprichtreflex, negatieve geotaxis en motorische activiteit (38)(39)(40).

Motorische activiteit

35. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd (41)(42)(43)(44)(45) tijdens de levensperiode vóór spening en de volwassen levensperiode. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. De testsessie moet lang genoeg zijn om gewenning binnen een sessie voor niet-behandelde controles aan te tonen. Het wordt sterk aanbevolen ter beoordeling van de ontogenie van het gedrag de motorische activiteit te bepalen. Indien gebruikt als test voor ontogenie van het gedrag, moet het testen voor alle testsessies vóór spening met dezelfde dieren plaatsvinden. Er moet vaak genoeg worden getest om de ontogenie van gewenning binnen een sessie te kunnen beoordelen (44). Hiervoor kunnen drie of meer tijdsperioden tot en met de dag van spening nodig zijn (bv. PND 13, 17, 21). Het testen van dezelfde dieren of nestgenoten moet ook plaatsvinden op volwassen leeftijd, tegen het einde van het onderzoek (bv. PND 60-70). Zo nodig kan op extra dagen getest worden. De motorische activiteit moet worden gecontroleerd met een geautomatiseerd activiteitsregistratieapparaat dat zowel toenamen als afnamen in activiteit moet kunnen detecteren (d.w.z. de door het apparaat gemeten activiteit op baseline moet niet zo laag zijn dat afnamen niet kunnen worden gedetecteerd en ook niet zo hoog dat toenamen van de activiteit niet kunnen worden gedetecteerd). Elk apparaat moet volgens standaardprocedures worden getest om de betrouwbaarheid van de werking van alle apparaten op alle dagen zo veel mogelijk te waarborgen. De behandelgroepen moeten zo evenwichtig mogelijk over de apparaten worden verdeeld. Elk dier moet apart worden getest. De behandelgroepen moeten evenwichtig worden verspreid over de testtijden om verstoring door circadiaanse activiteitritmen te vermijden. Er moet zoveel mogelijk worden gezorgd dat variaties in de testomstandigheden minimaal zijn en niet systematisch samenhangen met de behandeling. Variabelen die van invloed kunnen zijn op veel maten van gedrag, waaronder motorische activiteit, zijn geluidsniveau, grootte en vorm van de testkooi, temperatuur, relatieve vochtigheid, lichtomstandigheden, geuren, gebruik van verblijfskooi of nieuwe testkooi en afleiding uit de omgeving.

Motorische en sensorische functie

36. De motorische en sensorische functie moet ten minste eenmaal in de adolescentieperiode en ten minste eenmaal in de jongvolwassenperiode (bv. PND 60-70) uitvoerig worden onderzocht. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Er moet voldoende worden getest om te zorgen voor een toereikende kwantitatieve sampling van de sensorische modaliteiten (bv. somatosensorisch, vestibulair) en motorische functies (bv. kracht, coördinatie). Enkele voorbeelden van testen voor de motorische en sensorische functie zijn voetzoolreflex (46), oprichtreflex (47)(48), gewenning aan auditieve schrikreactie (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) en opgewekte potentialen (55).

Leervermogen- en geheugentesten

37. Na het spenen (bv. 25 ± twee dagen) en bij jongvolwassen dieren (PND 60 en ouder) moet een test van het associatieve leervermogen en geheugen worden uitgevoerd. Zie punt 32 voor testen op het moment van spenen. Voor deze twee ontwikkelingsfasen kunnen dezelfde test of aparte test(en) worden gebruikt. Enige flexibiliteit in de keuze van de test(en) voor leervermogen en geheugen bij gespeende en volwassen ratten is toegestaan. De test(en) moet(en) echter zodanig zijn opgezet dat wordt voldaan aan twee criteria. Ten eerste moet het leervermogen worden beoordeeld als een verandering over verschillende herhaalde leervermogenonderzoeken of -sessies, of, bij testen met één onderzoek, door te kijken naar een toestand die controleert op niet-associatieve effecten van de trainingservaring. Ten tweede moet(en) de test(en) naast het oorspronkelijke leervermogen (acquisitie) een maat voor het geheugen (kortetermijn- of langetermijngeheugen) omvatten, maar deze maat voor het geheugen kan niet gerapporteerd worden indien een met dezelfde test verkregen maat voor acquisitie ontbreekt. Als uit de test(en) voor het leervermogen en geheugen een effect van de teststof naar voren komt, kunnen aanvullende testen worden overwogen om alternatieve interpretaties op grond van veranderingen in sensorische, motivatie- en/of motorische capaciteiten uit te sluiten. Naast de twee bovenstaande criteria wordt geadviseerd de test voor het leervermogen en geheugen te kiezen op grond van de aangetoonde gevoeligheid ervan voor de klasse van stoffen waartoe de teststof behoort, als dergelijke informatie in de literatuur beschikbaar is. Als dergelijke informatie ontbreekt, kunnen de volgende testen worden gedaan om te voldoen aan de bovenstaande criteria: passieve vermijding (43)(56)(57), „delayed-matching-to-position” voor de volwassen rat (58) en voor de infantiele rat (59), olfactorische conditionering (43)(60), waterlabyrint van Morris (Morris water maze) (61)(62)(63), labyrint van Biel of Cincinnati (64)(65), stervormig labyrint (radial arm maze) (66), T-labyrint (43) en acquisitie en retentie van gedrag volgens een bepaald schema (schedule-controlled behaviour) (26)(67)(68). Aanvullende testen worden in de literatuur beschreven voor gespeende (26)(27) en volwassen ratten (19)(20).

Postmortaal onderzoek

38. De moederdieren kunnen worden geëuthanaseerd nadat de nakomelingen zijn gespeend.

39. Neuropathologische beoordeling van de nakomelingen wordt uitgevoerd met weefsels van dieren die om humane redenen zijn gedood op PND 22 of eerder, tussen PND 11 en PND 22, en aan het einde van het onderzoek. Van nakomelingen die op PND 22 of eerder worden gedood, moet het hersenweefsel worden beoordeeld; van dieren die aan het einde worden gedood, moet weefsel van het centrale zenuwstelsel (CZS) en het perifere zenuwstelsel (PZS) worden beoordeeld. Dieren die worden gedood op PND 22 of eerder, kunnen worden gefixeerd door immersie of perfusie. Dieren die aan het einde van het onderzoek worden gedood, moeten door perfusie worden gefixeerd. Bij alle aspecten van de preparatie van de weefselmonsters, d.w.z. vanaf de persfusie van de dieren tot en met de dissectie van de weefselmonsters, weefselbewerking en kleuren van de glaasjes, moet evenwichtig te werk worden gegaan, zodat elke partij representatieve monsters van elke dosisgroep bevat. Nadere richtsnoeren over neuropathologie zijn te vinden in OESO-leidraad nr. 20 (9), zie ook (103).

Bewerking van weefselmonsters

40. Alle macroscopische afwijkingen die bij de obductie worden opgemerkt, moeten worden genoteerd. De weefselmonsters moeten afkomstig zijn van alle belangrijke gebieden van het zenuwstelsel. De weefselmonsters moeten worden bewaard in een geschikt fixatiemiddel en bewerkt volgens gestandaardiseerde gepubliceerde histologische protocollen (69)(70)(71)(103). Inbedding in paraffine is acceptabel voor weefsels van het CZS en PZS, maar wanneer een hogere mate van resolutie vereist is (bv. voor perifere zenuwen bij vermoeden van een perifere neuropathie en/of voor morfometrische analyse van perifere zenuwen), kan het aangewezen zijn om bij postfixatie osmium te gebruiken samen met inbedden in epoxy. Voor morfometrische analyse verzameld hersenweefsel moet bij alle dosisniveaus op hetzelfde moment in geschikte media worden ingebed om artefacten als gevolg van krimp die kan optreden bij langdurig bewaren in fixatiemiddel, te voorkomen (6).

Neuropathologisch onderzoek

41. Het kwalitatieve onderzoek heeft tot doel:

i) identificeren van gebieden binnen het zenuwstelsel waarbij sprake is van aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen;

ii) identificeren van typen neuropathologische veranderingen die het gevolg zijn van blootstelling aan de teststof, en

iii) bepalen van de mate van ernst van de neuropathologische veranderingen.

Representatieve histologische coupes van de weefselmonsters moeten door een goed opgeleide patholoog microscopisch worden onderzocht op aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen. Aan alle neuropathologische veranderingen moet een subjectieve graad van ernst worden toegekend. Een hematoxyline- en eosinekleuring kan voldoende zijn voor de beoordeling van hersencoupes van dieren die op PND 22 of eerder`om humane redenen zijn gedood. Voor coupes van CZS- en PZS-weefsels van dieren die zijn gedood aan het einde van het onderzoek wordt echter een myelinekleuring (bv. luxol fast blue/cresylviolet) en een zilverkleuring (bv. Bielschowsky- of Bodiankleuring) aanbevolen. Afhankelijk van het professionele oordeel van de patholoog en de soort veranderingen dat wordt waargenomen, kunnen andere kleuringen worden beschouwd als geschikt voor de identificatie en karakterisering van bepaalde typen veranderingen (bv. glia fibrillair zuur eiwit (glial fibrillary acidic protein, GFAP) of lectinehistochemie om veranderingen in het glia en microglia te beoordelen (72), fluoro-jade om necrose te detecteren (73)(74), of voor neurodegeneratie specifieke zilverkleuringen (75)).

42. Aangezien deze gegevens kunnen worden gebruikt bij de detectie van een behandelingsgerelateerd effect en waardevol zijn bij de interpretatie van behandelingsgerelateerde verschillen in hersengewicht of morfologie, moet morfometrische (kwantitatieve) beoordeling plaatsvinden (76)(77). Voor de morfometrische beoordeling moeten zenuwweefselmonsters worden genomen en geprepareerd. Morfometrische beoordelingen kunnen bijvoorbeeld bestaan uit lineaire of oppervlaktemetingen van specifieke hersengebieden (78). Bij lineaire of oppervlaktemetingen moeten homologe coupes worden gebruikt die zorgvuldig zijn geselecteerd op grond van betrouwbare microscopische mijlpalen (6). Stereologie kan worden gebruikt om behandelingsgerelateerde effecten op parameters, zoals volume of aantal cellen voor specifieke neuroanatomische gebieden, te identificeren (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. De hersenen moeten worden onderzocht op aanwijzingen voor behandelingsgerelateerde neuropathologische veranderingen en voor grondig onderzoek moeten geschikte monsters worden genomen van alle belangrijke hersengebieden (bv. bulbus olfactorius, hersenschors, hippocampus, basale ganglia, thalamus, hypothalamus, middenhersenen (tectum, tegmentum en hersensteel), pons, verlengde merg, kleine hersenen). Het is van belang dat voor alle dieren de coupes in hetzelfde vlak worden genomen. Bij volwassen dieren die op humane wijze worden gedood aan het einde van het onderzoek, moeten representatieve coupes van het ruggenmerg en het PZS worden verzameld. De te onderzoeken gebieden zijn onder meer het oog met de oogzenuw en het netvlies, het ruggenmerg bij de cervicale en lumbale zwellingen, de dorsale en ventrale wortelvezels, de proximale ischiaszenuw, de proximale scheenbeenzenuw (bij de knie) en de vertakkingen van de scheenbeenzenuw naar de kuitspier. De coupes van het ruggenmerg en de perifere zenuwen moeten uit zowel dwars- als lengtecoupes bestaan.

44. Neuropathologische beoordeling moet een onderzoek omvatten naar aanwijzingen voor ontwikkelingsschade aan het zenuwstelsel (6)(85)(86)(87)(88)(89), naast de cellulaire veranderingen (bv. neuronale vacuolisatie, degeneratie, necrose) en weefselveranderingen (bv. gliose, infiltratie van leukocyten, vorming van cysten). In dit opzicht is het van belang onderscheid te maken tussen behandelingsgerelateerde effecten en normale ontwikkelingen waarvan bekend is dat deze plaatsvinden tijdens de ontwikkelingsfase van het dier op het moment van doden (90). Belangrijke veranderingen die een indicatie zijn van een aanval op de ontwikkeling zijn bijvoorbeeld (maar zijn niet daartoe beperkt):

— veranderingen in de macroscopische omvang of vorm van de bulbus olfactorius, de grote hersenen of de kleine hersenen,

— veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene hersengebieden, waaronder afnamen of toenamen van de omvang van deze gebieden als gevolg van het verlies of persistentie van normaal tijdelijke populaties van cellen of axonale projecties (bv. uitwendige kiemlaag van de kleine hersenen, hersenbalk),

— veranderingen in proliferatie, migratie en differentiatie, zoals blijkt uit gebieden met overmatige apoptose of necrose, clusters of verspreide populaties van ectopische, gedesoriënteerde of misvormde neuronen of veranderingen in de relatieve omvang van verscheidene lagen van de corticale structuren,

— veranderingen in myelinisatiepatronen, zoals een algemene afname van de omvang of gewijzigde kleuring van gemyeliniseerde structuren,

— aanwijzingen voor hydrocefalus, met name vergroting van de ventrikels, stenose van het aquaduct van Sylvius en het dunner worden van de hersenhelften.

Analyse van de dosis-responsverhouding van neuropathologische veranderingen

45. De volgende stapsgewijze procedure wordt aanbevolen voor de kwalitatieve en kwantitatieve neuropathologische analyses. Eerst worden coupes van de hogedosisgroep vergeleken met die van de controlegroep. Als er geen aanwijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen bij dieren van de hogedosisgroep, is verdere analyse niet nodig. Als er wel aanwijzingen worden gevonden voor neuropathologische veranderingen in de hogedosisgroep, worden dieren van de middelhoge- en lagedosisgroepen onderzocht. Als onderzoek met de hogedosisgroep wordt stopgezet vanwege sterfgevallen of andere storende toxiciteit, moeten de hoge- en middelhogedosisgroepen geanalyseerd worden op neuropathologische veranderingen. Als er aanwijzingen zijn voor neurotoxiciteit in de lagedosisgroepen, moet in die groepen neuropathologische analyse worden verricht. Als er onderzoeksgerelateerde neuropathologische veranderingen worden gevonden in het kwalitatieve of kwantitatieve onderzoek, moet op grond van een beoordeling van alle dieren uit alle dosigroepen de dosisafhankelijkheid van de incidentie, frequentie en graad van ernst van de letsels of van de morfometrische veranderingen worden bepaald. Alle gebieden van de hersenen met aanwijzingen voor neuropathologische veranderingen moeten in deze beoordeling worden meegenomen. Voor elk type letsel moeten de kenmerken worden beschreven die zijn gebruikt om elke graad van ernst te definiëren, waarbij wordt aangegeven op basis waarvan elke mate van ernst zich onderscheidt. De frequentie van elk type letsel en de graad van ernst ervan moeten worden geregistreerd en een statistische analyse moet worden uitgevoerd ter beoordeling van de dosis-responsverhoudingen. Het wordt aanbevolen gecodeerde glaasjes te gebruiken (91).

GEGEVENS EN RAPPORTAGE

Gegevens

46. Gegevens moeten afzonderlijk worden gerapporteerd en in tabelvorm worden samengevat, met voor elke testgroep de typen veranderingen en het aantal moederdieren, nakomelingen per geslacht en nesten waarbij ieder type verandering voorkomt. Bij directe postnatale blootstelling van de nakomelingen moet de weg, duur en periode van blootstelling gerapporteerd worden.

Beoordeling en interpretatie van resultaten

47. Een onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit geeft informatie over de effecten van herhaalde blootstelling aan een stof tijdens de in-utero- en vroeg-postnatale ontwikkeling. Aangezien de nadruk wordt gelegd op zowel het eindpunt algemene toxiciteit als het eindpunt ontwikkelingsneurotoxiciteit, kan met de resultaten van het onderzoek onderscheid worden gemaakt tussen neuro-ontwikkelingseffecten die zich voordoen bij afwezigheid van algemene maternale toxiciteit, en neuro-ontwikkelingseffecten die alleen tot uitdrukking komen bij niveaus die ook toxisch zijn voor het moederdier. Vanwege de complexe onderlinge verbanden tussen onderzoeksopzet, statistische analyse en biologische significantie van de gegevens is voor een adequate interpretatie van ontwikkelingsneurotoxiciteitsgegevens het oordeel van een deskundige nodig (107)(109). Bij de interpretatie van de testresultaten moet gebruik worden gemaakt van een op bewijskracht gebaseerde aanpak (20)(92)(93)(94). Patronen van gedrags- of morfologische bevindingen, indien aanwezig, en aanwijzingen voor dosisrespons moeten worden besproken. Bij deze karakterisering moeten gegevens van alle onderzoeken die relevant zijn voor de beoordeling van ontwikkelingsneurotoxiciteit, worden meegenomen, waaronder epidemiologische onderzoeken of casereports met mensen en onderzoeken met proefdieren (bv. toxicokinetische gegevens, structuur-activiteitinformatie, gegevens uit andere toxiciteitsonderzoeken). Daartoe behoort ook het verband tussen de doses van de teststof en de aan- of afwezigheid, incidentie en de mate van eventuele neurotoxische effecten voor elk geslacht (20)(95).

48. Bij de beoordeling van de gegevens moet zowel de biologische als de statistische significantie worden besproken. Statistische analyse moet worden gezien als een instrument dat een leidraad geeft voor de interpretatie van gegevens, zonder dat het bepalend daarvoor is. De conclusie dat er geen sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, mag niet louter gebaseerd zijn op het ontbreken van statistische significantie. Evenzo geldt dat de conclusie dat er wel sprake is van een behandelingsgerelateerd effect, niet louter op statistische significantie gebaseerd mag zijn. Om mogelijke vals-negatieve bevindingen en de moeilijkheden die inherent zijn aan „aantonen van een negatieve” te voorkomen, moeten beschikbare positieve en historische controlegegevens worden besproken, met name als er geen behandelingsgerelateerde effecten zijn (102)(106). De kans op vals-positieven moet worden besproken in het licht van de totale statistische beoordeling van de gegevens (96). De beoordeling moet het eventuele verband tussen waargenomen neuropathologische en gedragsveranderingen omvatten.

49. Alle resultaten worden geanalyseerd worden met behulp van voor de testopzet toepasselijke statistische modellen. De keuze voor een parametrische of een niet-parametrische analyse moet worden gemotiveerd aan de hand van factoren zoals de aard van de gegevens (al dan niet getransformeerd) en de verspreiding ervan, alsook de relatieve robuustheid van de gekozen statistische analyse. Het doel en de opzet van het onderzoek moeten als leidraad dienen voor de keuze van statistische analyses om type I (vals-positieve) en type II (vals-negatieve) fouten tot het minimum te beperken (96)(97)(104)(105). Bij ontwikkelingsonderzoeken met multipara's in het geval dat meerdere jongen per nest worden getest, moet het nest in het statistische model worden opgenomen om opgeschroefde type I-foutenpercentages te voorkomen (98)(99)(100)(101). De statistische meeteenheid moet het nest zijn en niet het jong. De experimenten moeten zodanig zijn opgezet, dat nestgenoten niet als onafhankelijke observaties worden behandeld. Eindpunten die herhaaldelijk worden gemeten bij hetzelfde proefdier, moeten geanalyseerd worden met statistische modellen die rekening houden met deze niet-onafhankelijke werkwijze.

Testverslag

50. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen:

Teststof:

— fysische aard en, indien relevant, fysisch-chemische kenmerken,

— identificatiegegevens, waaronder de herkomst,

— zuiverheid van het preparaat en bekende en/of verwachte onzuiverheden.

Medium (indien van toepassing):

— motivering van de keuze van het medium, indien geen water of fysiologische zoutoplossing wordt gebruikt.

Proefdieren:

— gebruikte soort en stam, en een motivering voor het gebruik van een andere soort dan ratten,

— leverancier van de proefdieren,

— aantal, leeftijd bij aanvang en geslacht van de dieren,

— herkomst, huisvesting, voeding, water enz.,

— gewicht van elk dier bij aanvang van de test.

Testomstandigheden:

— motivering van de keuze van de dosisniveaus,

— motivering van de toedieningsweg en tijdsduur,

— specificaties van de toegediende doses, waaronder details van het medium, de hoeveelheid en de fysische vorm van de toegediende stof,

— gedetailleerde gegevens over de formulering van de teststof, de bereiding van het voer en de bereikte concentratie, stabiliteit en homogeniteit van het preparaat,

— gebruikte methode voor de unieke identificatie van moederdieren en nakomelingen,

— gedetailleerde beschrijving van de gerandomiseerde procedures(s) voor het toewijzen van de moederdieren aan behandelgroepen, het ruimen van jongen en het toewijzen van jongen aan testgroepen,

— gedetailleerde gegevens over de toediening van de teststof,

— omrekening van de concentratie van de teststof in het voer/drinkwater of van de inhalatieteststof (in ppm) naar de feitelijke dosis (in mg/kg lichaamsgewicht/dag), indien van toepassing,

— milieuomstandigheden,

— gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en water (bv. kraanwater, gedestilleerd water),

— data van aanvang en einde onderzoek.

Observaties en testprocedures:

— een gedetailleerde beschrijving van de gebruikte procedures voor de standaardisatie van observaties en procedures en operationele definities voor het scoren van observaties,

— een lijst van alle gebruikte testprocedures en een motivering van het gebruik ervan,

— gedetailleerde gegevens over de gebruikte gedrags/functie-, pathologische, neurochemische of elektrofysiologische procedures, waaronder informatie en details over geautomatiseerde apparatuur,

— procedures om apparatuur te ijken en om de gelijkwaardigheid van apparatuur te waarborgen en om evenwichtige behandelgroepen te krijgen bij het testen,

— een korte motivering waarin beslissingen genomen op basis van professioneel oordeel uiteengezet worden.

Resultaten (afzonderlijke en beknopte, waaronder gemiddelde en variantie indien van toepassing):

— het aantal dieren bij aanvang van het onderzoek en het aantal aan het einde van het onderzoek,

— het aantal dieren en nesten dat voor elke testmethode werd gebruikt,

— het identificatienummer van elk dier en het nest waaruit het afkomstig was,

— nestgrootte en gemiddeld geboortegewicht naar geslacht,

— gegevens over lichaamsgewicht en verandering in lichaamsgewicht, waaronder eindlichaamsgewicht voor moederdieren en nakomelingen,

— gegevens over voer- en waterconsumptie, indien van toepassing (bv. als de teststof via water wordt toegediend),

— gegevens over toxische responsen naar geslacht en dosisniveau, met inbegrip van toxiciteitsverschijnselen of sterftecijfers, waaronder het tijdstip en de oorzaak van overlijden, indien van toepassing,

— aard, ernst, duur, dag van ontstaan, tijdstip en verdere verloop van de gedetailleerde klinische observaties,

— score van elke ontwikkelingsmijlpaal (gewicht, geslachtsrijping en ontogenie van het gedrag) bij elke observatietijd,

— een gedetailleerde beschrijving van alle gedrags-, functie-, neuropathologische, neurochemische, elektrofysiologische bevindingen naar geslacht, waaronder zowel toenamen als afnamen ten opzichte van de controles,

— obductiebevindingen,

— hersengewichten,

— diagnoses gesteld op basis van neurologische verschijnselen en letsels, waaronder natuurlijk voorkomende ziekten of aandoeningen,

— beelden van voorbeeldige bevindingen,

— lageresolutiebeelden ter beoordeling van de homologie van coupes die zijn gebruikt voor morfometrie,

— absorptie- en metabolismegegevens, waaronder complementaire gegevens van een afzonderlijk toxicokinetisch onderzoek, indien beschikbaar,

— statistische behandeling van resultaten, waaronder statistische modellen die zijn gebruikt voor analyse van de gegevens, en de resultaten, ongeacht de significantie ervan,

— lijst van onderzoeksmedewerkers, inclusief beroepsopleiding.

Bespreking van de resultaten:

— informatie over dosisresponsen, naar geslacht en groep,

— verband van eventuele andere toxische effecten met een conclusie over het neurotoxische potentieel van de teststof, naar geslacht en groep,

— invloed van eventuele toxicokinetische informatie op de conclusies,

— overeenkomsten van effecten met bekende neurotoxische stoffen,

— gegevens die de betrouwbaarheid en gevoeligheid van de testmethode ondersteunen (d.w.z. positieve en historische controlegegevens),

— eventuele verbanden tussen neuropathologische en functie-effecten,

— NOAEL- of benchmarkdosis voor moederdieren en nakomelingen, naar geslacht en groep.

Conclusies

— een discussie over de algehele interpretatie van de gegevens op grond van de resultaten, waaronder een conclusie over het feit of de teststof ontwikkelingsneurotoxiciteit veroorzaakte en de NOAEL.

LITERATUUR

1. OESO (1995). Draft Report of the OECD Ad HocWorking Group on Reproduction and Developmental Toxicity. Kopenhagen, Denemarken, 13-14 juni 1995.

2. US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Onderzoek naar ontwikkelingsneurotoxiciteit. US EPA 712-C-98-239. Te vinden op: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

3. US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Te vinden op: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

4. Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss, B., Mileson, B. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects. Environ. Health Perspect., 109:79-91.

5. Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher, J.E. Jr., Fisher, J.W., Harry, G.J., Li, A.A., Makris, S.L., Padilla, S., Sultatos, L.G., Mileson, B.E. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations. Environ. Health Perspect., 109:101-111.

6. Garman, R.H., Fix,A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001). Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology. Environ. Health Perspect., 109:93-100.

7. OESO (2003). Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing. Washington D.C., US, 23-25 October 2000.

8. OESO (2008). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OESO, Parijs, juli 2008. Te vinden op: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage = en].

9. OESO (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OESO, Parijs, september 2003. Te vinden op: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

10. Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990) Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity. Neurotoxicol. Teratol., 12: 173-292.

11. Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000) Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, New York.

12. Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002) Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8:188-197.

13. Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998) Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, New York.

14. Hoofdstuk B.34 van deze bijlage, Reproductietoxiciteitsonderzoek over één generatie.

15. Hoofdstuk B.35 van deze bijlage, Reproductietoxiciteitsonderzoek over twee generaties.

16. Hoofdstuk B.43 van deze bijlage, Neurotoxiciteitsonderzoek bij knaagdieren.

17. Hoofdstuk B.31 van deze bijlage, Onderzoek naar prenatale ontwikkelingstoxiciteit.

18. Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (PB L 276 van 20.10.2010, blz. 33).

19. WHO (1986) Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals, (Environmental Health Criteria 60), Albany, New York: World Health Organization Publications Center, USA. Te vinden op: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

20. WHO (2001) Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches, (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Genève. Te vinden op: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

21. Chang, L.W., Slikker, W. (1995) Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, New York.

22. De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997) Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders. Neurotoxicol. Teratol., 19:499-509.

23. Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997) The rationale for culling of rodent litters. Fundam. Appl. Toxicol., 38:2-6.

24. Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977) Foot tattoo of neonatal mice. Lab. Animal Sci., 27:110-112.

25. Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989) Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity. Fundam. Appl. Toxicol., 13:118-136.

26. Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979) Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

27. Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987) Perinatal Development: A Psychobiological Perspective. Academic Press, Orlando.

28. Zoetis, T., Walls, I. (2003) Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research. ILSI Press, Washington, DC.

29. Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005) Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group. Int. J. Toxicol., 24:87-94.

30. Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999) Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment. Toxicol. Sci., 49: 1-4.

31. ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5A). International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Phamaceuticals for Human Use.

32. Lochry, E.A. (1987) Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations. J. Am. Coll. Toxicol., 6:433-439.

33. Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998) Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan. Neurotoxicol. Teratol., 20:449-457.

34. Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999) Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights. Reprod. Toxicol., 13:383-390.

35. Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000) Perinatal exposure to the phthalates DEHP, bbp, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat. Toxicol. Sci., 58:350-365.

36. Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985) Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:579-586.

37. Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977) Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biol. Reprod., 17:298-303.

38. Spear, L.P. (1990) Neurobehavioral assessment during the early postnatal period. Neurotoxicol. Teratol., 12:489-95.

39. Altman, J., Sudarshan, K. (1975) Postnatal development of locomotion in the laboratory rat. Anim. Behav., 23:896-920.

40. Adams, J. (1986) Methods in Behavioral Teratology. In: Handbook of Behavioral Teratology. Riley, E.P., Vorhees, C.V. (eds.) Plenum Press, New York, pp. 67-100.

41. Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979) Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing. Neurobehav. Toxicol., 1:53-66.

42. Robbins, T.W. (1977) A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity, Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (eds.) Plenum Press, New York, pp. 37-82.

43. Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993) Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat. Neurotoxicol. Teratol., 15:117-129.

44. Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985) Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes. Dev. Psychobiol., 18:247-260.

45. Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13:599-609.

46. Ross, J. F., Handley, D. E., Fix, A. S., Lawhorn, G. T., Carr, G. J. (1997) Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 19:1997. 405-411.

47. Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998) A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals.Physiol. Behav., 64:661-669.

48. Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977) A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. Toxicol. Appl. Pharmacol., 40:589-591.

49. Davis, M. (1984) The mammalian startle response. In: Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (ed), Plenum Press, New York, pp. 287-351

50. Koch, M. (1999) The neurobiology of startle. Prog. Neurobiol., 59:107-128.

51. Crofton, K.M. (1992) Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction. In Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (eds). Raven Press, New York, pp. 181-211.

52. Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989) Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response. J. Am. Coll. Toxicol., 8:199-211.

53. Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994) Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit. Hear. Res., 80:25-30.

54. Ison, J.R. (1984) Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 6:437-445.

55. Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992) Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes. In: Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (eds.), Raven Press, New York. pp. 125-145.

56. Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990) Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile. Toxicol. Appl. Pharmacol., 105:321-332.

57. Bammer, G. (1982) Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results. Neurosci. Behav. Rev., 6:247-296.

58. Bushnell, P.J. (1988) Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats. Neurotoxicol. Teratol., 10:237-244.

59. Green, R.J., Stanton, M.E. (1989) Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat. Behav. Neurosci., 103:98-105.

60. Kucharski, D., Spear, N.E. (1984) Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat. Develop. Psychobiol., 17:465-479.

61. Morris, R. (1984) Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods, 11:47-60.

62. Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989) The use of the Morris water maze in the study of memory and learning. Int. J. Neurosci., 48:29-69.

63. D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001) Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res. Rev, 36:60-90.

64. Vorhees, C.V. (1987) Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin. Neurotoxicol. Teratol., 9:235-241.

65. Vorhees, C.V. (1997) Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol., 20:387-399.

66. Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988) Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly. Neurotoxicol. Teratol., 10:327-332.

67. Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983) Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration. Toxicol. Appl. Pharmacol., 71:342-352.

68. Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981) Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding. J. Gerontol., 36:338-341.

69. Fix, A.S, Garman, R.H. (2000) Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system. Toxicol. Pathol., 28: 122-131.

70. Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994) Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Washington, DC, pp. 84-107.

71. Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002) Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, London.

72. Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996) Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex. Toxicol. Pathol., 24: 291-304.

73. Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000) Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration. Brain Res., 874:123-130.

74. Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001) Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain. Exp. Toxic. Pathol., 53:365-372.

75. De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma. Neurotoxicol. Teratol., 16, 545-561.

76. De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a) Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives. Environ. Toxicol. Pharmacol., 19:745-755.

77. De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b) 2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity. Reprod. Toxicol., 20:417-432.

78. Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979) Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period. Neurobehav. Toxicol., 1:129-135.

79. Howard, C.V., Reed, M.G. (1998) Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, New York.

80. Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998) Stereology: A practical primer for neuropathology. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 305-310.

81. Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993) Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method. Brain Res., 609: 262-268.

82. Schmitz, C. (1997) Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology. J. Neurocytol., 26:707-710.

83. West, M.J. (1999) Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias. Trends Neurosci., 22:51-61.

84. Schmitz, C., Hof, P.R. (2005) Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience, 130: 813-831.

85. Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994) Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM). Teratology, 49:113-121.

86. Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995) Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum. Develop. Brain Res., 84:294-298.

87. Jensen KF, Catalano SM. (1998) Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology. In: Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (eds) Academic Press, New York, pp. 3-41.

88. Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999) Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Science, 283:70-74.

89. Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000) Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome. Science, 287:1056-1060.

90. Friede, R. L. (1989) Developmental Neuropathology. Second edition. Springer-Verlag, Berlin.

91. House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992) Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions. Toxicol. Let., 63:127-133.

92. Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996) Setting exposure standards: a decision process. Environ. Health Perspect., 104:401-405.

93. US EPA (2005) Guidelines for Carcinogen Risk Assessment. US EPA NCEA-F-0644A.

94. US EPA (1996) Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

95. Danish Environmental Protection Agency (1995) Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

96. Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984). Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments. Neurotoxicology, 5:113-126.

97. Gad, S.C. (1989) Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology. J. Am. Coll. Toxicol., 8:21-27.

98. Abby, H., Howard, E. (1973) Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring. Dev. Psychobiol., 6:329-335.

99. Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975) Selection of the experimental unit in teratology studies. Teratology, 12:165-172.

100. Holson, R.R., Pearce, B. (1992) Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species. Neurotoxicol. Teratol., 14: 221-228.

101. Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985) Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach. Neurobehav. Toxicol. Teratol., 7:587-90.

102. Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004) A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies. Neurotoxicol. Teratol., 26:345-352.

103. Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., and an ad hoc working group of the STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006) A „best practices” approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today. Toxicol. Pathol. 34:296-313.

104. Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992) The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies. Neurotoxicol. Teratol., 14(3):205-210.

105. Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985) Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug. Biometrics, 41:295-301.

106. Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008) Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):266-287.

107. Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008) Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):288-325.

108. Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008) Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints. Neurotoxicology and Teratology, 30(4):326-348.

109. Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008) Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints Neurotoxicology and Teratology, 30(4):349-381.

Figuur 1

Algemeen testschema voor functie/gedragstesten, neuropathologische beoordeling en hersengewichten. Dit diagram is gebaseerd op de beschrijving in punten 13-15 (PND = postnatale dag). Voorbeelden van toewijzing van dieren staan in aanhangsel 1.

Aanhangsel 1 1. Hieronder worden voorbeelden van mogelijke toewijzingen beschreven en in tabelvorm gepresenteerd. Deze voorbeelden dienen ter illustratie van een aantal verschillende manieren waarop onderzoeksdieren aan verscheidene testparadigma's kunnen worden toegewezen. Voorbeeld 1 2. Eén set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) wordt gebruikt voor het testen vóór spening van de ontogenie van het gedrag. Van deze dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) op humane wijze gedood op PND 22. De hersenen worden uitgenomen, gewogen en bewerkt voor histopathologische beoordeling. Daarnaast worden hersengewichtgegevens verzameld met niet-gefixeerde hersenen van de resterende 10 mannetjes en 10 vrouwtjes per dosisniveau. 3. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor functie/gedragstesten na spening (gedetailleerde klinische observaties, motorische activiteit, auditieve schrikreactie en testen cognitieve functie bij adolescenten) en beoordeling van de leeftijd van geslachtsrijping. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) verdoofd en via perfusie gefixeerd aan het einde van het onderzoek (ongeveer PND 70). Na aanvullende in-situfixatie worden de hersenen uitgenomen en bewerkt voor neuropathologische beoordeling. 4. Voor het testen van de cognitieve functie bij jongvolwassen dieren (bv. PND 60-70) wordt een derde set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/groep (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) gedood aan het einde van het onderzoek en worden de hersenen uitgenomen en gewogen. 5. De resterende 20 dieren/geslacht/groep zijn reservedieren voor mogelijke aanvullende testen. Tabel 1 Nr. jong (8) Aantal aan een test toegewezen jongen Onderzoek/test m v 1 5 20 m + 20 v Ontogenie van het gedrag 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/morfometrie op PND 22 10 m + 10 v Hersengewicht op PND 22 2 6 20 m + 20 v Gedetailleerde klinische observaties 20 m + 20 v Motorische activiteit 20 m + 20 v Geslachtsrijping 20 m + 20 v Motorische en sensorische functie 20 m + 20 v Leervermogen- en geheugen (PND 25) 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/morfometrie van jongvolwassen dieren op ~PND 70 3 7 20 m + 20 v Leervermogen en geheugen (jongvolwassen dieren) 10 m + 10 v Hersengewicht van jongvolwassen dieren op ~ PND 70 4 8 — Reservedieren voor vervangingen of aanvullende testen Voorbeeld 2 6. Eén set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) wordt gebruikt voor het testen vóór spening van de ontogenie van het gedrag. Van deze dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau (1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) op humane wijze gedood op PND 11. De hersenen worden uitgenomen, gewogen en bewerkt voor histopathologische beoordeling. 7. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor onderzoek na spening (gedetailleerde klinische observaties, motorische activiteit, beoordeling van leeftijd van geslachtsrijping en motorische en sensorische functie). Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) verdoofd en via perfusie gefixeerd aan het einde van het onderzoek (ongeveer PND 70). Na aanvullende in-situfixatie worden de hersenen uitgenomen, gewogen en bewerkt voor neuropathologische beoordeling. 8. Voor het testen van de cognitieve functie bij adolescente en jongvolwassen dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) gebruikt. Voor het testen van de cognitieve functie op PND 23 en bij jongvolwassen dieren worden verschillende dieren gebruikt. Aan het einde worden de 10 dieren/geslacht/groep die als volwassen dieren werden getest, gedood, waarna de hersenen worden uitgenomen en gewogen. 9. De resterende 20 dieren/geslacht/groep die niet zijn geselecteerd voor de testen, worden bij het spenen gedood en afgevoerd. Tabel 2 Nr. jong (9) Aantal aan een test toegewezen jongen Onderzoek/test m v 1 5 20 m + 20 v Ontogenie van het gedrag 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/morfometrie op PND 11 2 6 20 m + 20 v Gedetailleerde klinische observaties 20 m + 20 v Motorische activiteit 20 m + 20 v Geslachtsrijping 20 m + 20 v Motorische en sensorische functie 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/morfometrie van jongvolwassen dieren op ~PND 70 3 7 10 m + 10 v (10) Leervermogen- en geheugen (PND 23) 3 7 10 m + 10 v (10) Leervermogen en geheugen (jongvolwassen dieren) Hersengewicht van jongvolwassen dieren 4 8 — Dieren gedood en afgevoerd op PND 21 Voorbeeld 3 10. Eén set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) wordt gebruikt voor bepaling van het hersengewicht en neuropathologische beoordeling op PND 11. Van deze dieren worden 10 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) op humane wijze gedood op PND 11, waarna de hersenen worden uitgenomen, gewogen en bewerkt voor histopathologische beoordeling. Daarnaast worden hersengewichtgegevens verzameld van niet-gefixeerde hersenen van de resterende 10 mannetjes en 10 vrouwtjes per dosisniveau. 11. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor ontogenie van het gedrag (motorische activiteit), onderzoek na spening (motorische activiteit en bepaling van leeftijd van geslachtsrijping) en testen van de cognitieve functie bij adolescente dieren. 12. Er wordt nog een set van 20 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt voor testen van de motorische en sensorische functie (auditieve schrikreactie) en gedetailleerde klinische observaties. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) verdoofd en via perfusie gefixeerd aan het einde van het onderzoek (ongeveer PND 70). Na aanvullende in-situfixatie worden de hersenen uitgenomen, gewogen en bewerkt voor neuropathologische beoordeling. 13. Voor het testen van de cognitieve functie bij jongvolwassen dieren wordt nog een set van 20 jongen/geslacht/dosisniveau (d.w.z. 1 mannetje en 1 vrouwtje per nest) gebruikt. Van deze dieren worden 10 dieren/geslacht/groep (d.w.z. 1 mannetje of 1 vrouwtje per nest) gedood aan het einde van het onderzoek en worden de hersenen uitgenomen en gewogen. Tabel 3 Nr. jong (11) Aantal aan een test toegewezen jongen Onderzoek/test m v 1 5 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/morfometrie op PND 11 10 m + 10 v Hersengewicht op PND 11 2 6 20 m + 20 v Ontogenie van het gedrag (motorische activiteit) 20 m + 20 v Motorische activiteit 20 m + 20 v Geslachtsrijping 20 m + 20 v Leervermogen- en geheugen (PND 27) 3 7 20 m + 20 v Auditieve schrikreactie (adolescente en jongvolwassen dieren) 20 m + 20 v Gedetailleerde klinische observaties 10 m + 10 v Hersengewicht/neuropathologie/ morfometrie op ~PND 70 4 8 20 m + 20 v Leervermogen en geheugen (jongvolwassen dieren) 10 m + 10 v Hersengewicht van jongvolwassen dieren

Aanhangsel 2 Definities Stof: een stof of mengsel. Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels.

B.54. UTEROTROFE BIOASSAY BIJ KNAAGDIEREN: EEN KORTLOPENDE SCREENINGSTEST OP OESTROGENE EIGENSCHAPPEN

INLEIDING

1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 440 (2007) van de OESO. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande richtlijnen te herzien en nieuwe richtlijnen te ontwikkelen voor het screenen op en testen van potentiële hormoonontregelaars (1), en heeft zij daaraan een hoge prioriteit toegekend. Een onderdeel van deze actie was het ontwikkelen van een testrichtlijn voor de uterotrofe bioassay bij knaagdieren. De uterotrofe bioassay bij knaagdieren werd vervolgens onderworpen aan een uitgebreid valideringsprogramma dat onder meer bestond uit het opstellen van een gedetailleerd achtergronddocument (2)(3) en het uitvoeren van uitgebreide intra- en interlaboratoriumonderzoeken om de relevantie en reproduceerbaarheid aan te tonen van de bioassay met een krachtig referentie-oestrogeen, zwakke oestrogeenreceptoragonisten, een sterke oestrogeenreceptorantagonist en een negatieve referentiestof (4)(5)(6)(7)(8)(9). Deze testmethode B.54 is het resultaat van de ervaring die is opgedaan tijdens het valideringstestprogramma en de daaruit verkregen resultaten met oestrogeenagonisten.

2. De uterotrofe bioassay bij knaagdieren is een kortlopende screeningstest die in de jaren 30 werd ontwikkeld (27)(28) en in 1962 voor het eerst werd gestandaardiseerd voor screening door een comité van deskundigen (32)(35). De test berust op de toename van het gewicht van de baarmoeder of de uterotrofe respons (zie 29 voor een overzichtsartikel). Beoordeeld wordt in welke mate een stof in staat is biologische activiteiten teweeg te brengen die overeenkomen met die van agonisten of antagonisten of natuurlijke oestrogenen (bv. 17b-estradiol); de test wordt echter veel minder vaak gebruikt voor de detectie van antagonisten dan voor de detectie van agonisten. De baarmoeder reageert op twee manieren op oestrogenen. In eerste instantie neemt het gewicht toe als gevolg van waterimbibitie. Deze respons wordt gevolgd door een gewichtstoename als gevolg van weefselgroei (30). De responsen van de baarmoeder bij ratten en muizen zijn kwalitatief vergelijkbaar.

3. Deze bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest en de toepassing ervan moet worden gezien in samenhang met het „Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen” (aanhangsel 2). In dit conceptueel kader is de uterotrofe bioassay ondergebracht in niveau 3 als een in-vivotest waarmee gegevens kunnen worden verkregen over een enkel hormoonmechanisme, d.w.z. oestrogene werking.

4. De bedoeling is dat de uterotrofe bioassay wordt opgenomen in een reeks in-vitro- en in-vivotesten voor de identificatie van stoffen die mogelijk interactie vertonen met het hormoonsysteem, op basis waarvan uiteindelijk beoordelingen van het risico voor de gezondheid van de mens of het milieu tot stand komen. Het valideringsprogramma van de OESO maakte gebruik van zowel sterke als zwakke oestrogeenagonisten bij de beoordeling van de prestatie van de test voor de identificatie van oestrogene stoffen (4)(5)(6)(7)(8). De gevoeligheid van de testprocedure voor oestrogeenagonisten werd daarbij goed aangetoond, evenals een goede intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid.

5. Wat betreft negatieve stoffen werd slechts één „negatieve” referentiestof, waarvan al gerapporteerd was dat deze negatief was volgens een uterotrofe test alsook in-vitroreceptorbindings- en receptortesten, opgenomen in het valideringsprogramma. Daarnaast zijn echter aanvullende testgegevens beoordeeld die geen verband hielden met het OESO-valideringsprogramma, en hierdoor werd de specificiteit van de uterotrofe bioassay voor de screening van oesterogeenagonisten verder ondersteund (16).

INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN

6. Oestrogeenagonisten en -antagonisten werken als liganden voor de oestrogeenreceptoren a en b en kunnen de transcriptiewerking van de receptoren respectievelijk activeren of remmen. Dit zou kunnen leiden tot schadelijke gevaren voor de gezondheid, waaronder effecten op de voortplanting en de ontwikkeling. Er bestaat daarom behoefte aan een snelle methode om een stof te beoordelen en te evalueren als een mogelijke oestrogeenagonist of -antagonist. De affiniteit van een ligand voor een oestrogeenreceptor of transcriptieactivering van reportergenen in vitro is wel informatief, maar is slechts een van de verschillende determinanten van mogelijk gevaar. Mogelijke andere determinanten zijn onder meer metabole activering en deactivering nadat de stof het lichaam is binnengetreden, distributie naar doelweefsels en klaring uit het lichaam, en zijn ten minste deels afhankelijk van de toedieningsweg en de betreffende stof. Hierdoor bestaat de behoefte de mogelijke activiteit van een stof in vivo te screenen onder relevante omstandigheden, tenzij de kenmerken van de stof wat betreft absorptie, distributie, metabolisme en eliminatie (ADME) al voldoende informatie opleveren. Baarmoederweefsels reageren met snelle en krachtige groei op stimulering door oestrogenen, met name bij proefknaagdieren, waarbij de oestruscyclus ongeveer vier dagen duurt. Knaagdiersoorten, in het bijzonder de rat, worden bovendien veel gebruikt in toxiciteitsonderzoeken naar karakterisering van gevaren. De baarmoeder van knaagdieren is daarom een geschikt doelorgaan voor de in-vivoscreening van oestrogeenagonisten en -antagonisten.

7. Deze testmethode is gebaseerd op de in het OESO-valideringsonderzoek toegepaste protocollen die betrouwbaar en herhaalbaar zijn gebleken in intra- en interlaboratoriumonderzoeken (5)(7). Op dit moment zijn er twee methoden beschikbaar, namelijk de methode met volwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan (ovx-volwassen-methode), en de methode met onvolgroeide vrouwtjes die geen ovariëctomie hebben ondergaan (onvolgroeid-methode). In het OESO-valderingstestprogramma is aangetoond dat beide methoden wat betreft gevoeligheid en reproduceerbaarheid vergelijkbaar zijn. Vanwege de intacte hypothalamus-hypofyse-gonadeas (HPG-as), is het onvolgroeide dier weliswaar enigszins minder specifiek, maar heeft het een grotere onderzoeksreikwijdte dan het dier dat ovariëctomie heeft ondergaan, omdat het kan reageren op stoffen die interactie vertonen met de HPG-as en niet alleen met de oestrogeenreceptor. De HGP-as van de rat is functioneel vanaf een leeftijd van ongeveer 15 dagen. Eerder kan de puberteit niet met behandelingen als GnRH worden versneld. Als de vrouwtjes richting de puberteit gaan, heeft het vrouwtje vóór de vaginale opening verscheidene stille cycli die niet leiden tot vaginale opening of ovulatie, maar waarbij er wel enige hormonale schommelingen zijn. Als een stof de HPG-as direct of indirect stimuleert, leidt dit tot vroegtijdige puberteit, vroege eisprong en versnelde vaginale opening. Dit treedt niet alleen op bij stoffen die inwerken op de HPG-as, maar ook bepaald voer met een hogere metaboliseerbare energiewaarde dan ander voer stimuleert de groei en versnelt de vaginale opening zonder een oestrogene werking te hebben. Dergelijke stoffen induceren geen uterotrofe respons bij volwassen ovx-dieren, omdat hun HPG-as niet werkt.

8. Met het oog op dierenwelzijn moet de voorkeur worden gegeven aan de methode met onvolgroeide ratten, zodat dat operatieve voorbehandeling van de dieren wordt voorkomen en ook wordt voorkomen dat de dieren met aanwijzingen dat deze in de oestrus komen, mogelijk niet worden gebruikt (zie punt 30).

9. De uterotrofe respons is niet geheel van oestrogene oorsprong, d.w.z. andere stoffen dan agonisten of antagonisten van oestrogenen kunnen ook een respons geven. Zo kunnen relatief hoge doses progesteron, testosteron of verscheidene synthetische progestinen allemaal leiden tot een stimulerende respons (30). Elke respons kan histologisch geanalyseerd worden op keratinisatie en verhoorning van de vagina (30). Ongeacht de mogelijke bron van de respons moet bij een positieve uitkomst van een uterotrofe bioassay normaliter actie worden ondernomen om meer duidelijkheid te verschaffen. Aanvullende aanwijzingen voor oestrogene werking kunnen komen uit in-vitrotesten, zoals de ER-bindingtesten en transcriptieactiveringstesten of uit andere in-vivotesten zoals de test op de puberale ontwikkeling bij vrouwtjes (female pubertal assay).

10. Aangezien de uterotrofe bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest, diende de gekozen valideringsaanpak zowel de overwegingen met het oog op dierenwelzijn als een gefaseerde teststrategie. Daartoe lag de focus meer op grondige validering van de reproduceerbaarheid en gevoeligheid voor oestrogene werking — de belangrijkste bron van zorg voor veel stoffen — dan op het anti-oestrogene deel van de test. Omdat het aantal stoffen met een duidelijk anti-oestrogeen profiel (niet vertroebeld door enige oestrogene activiteit) zeer beperkt is, werd slechts één anti-oestrogeen met sterke activiteit onderzocht. Deze testmethode heeft dus betrekking op het oestrogene protocol; het protocol waarin de antagonistmodus van de test wordt beschreven, is in een leidraad opgenomen (37). De reproduceerbaarheid en gevoeligheid van de test voor stoffen met zuiver anti-oestrogene activiteit wordt later duidelijker gedefinieerd, nadat de testprocedure enige tijd routinematig in gebruik is geweest en meer stoffen met dit type werking zijn geïdentificeerd.

11. Erkend wordt dat alle procedures waarbij dieren worden gebruikt, aan de plaatselijke normen voor de verzorging van dieren moeten voldoen. De beschrijvingen van verzorging en behandeling hieronder zijn minimale uitvoeringsnormen, die ondergeschikt zijn aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (38). De OESO heeft nadere richtsnoeren voor de humane behandeling van dieren opgesteld (25).

12. Net als met alle testen waarbij levende dieren worden gebruikt, is het van essentieel belang om vóór de start van de test zeker te stellen dat de gegevens echt noodzakelijk zijn. Twee situaties waarbij de gegevens noodzakelijk kunnen zijn, zijn bijvoorbeeld:

— hoge potentiële blootstelling (niveau 1 van het conceptueel kader, aanhangsel 2) of aanwijzingen voor oestrogene werking (niveau 2), om te onderzoeken of dergelijke effecten kunnen plaatsvinden in vivo,

— effecten die wijzen op oestrogene werking bij in-vivotesten van niveau 4 of 5, om aan te tonen dat de effecten verband hielden met een oestrogeen mechanisme dat niet kan worden opgehelderd met een in-vitrotest.

13. De bij deze testmethode gebruikte definities zijn opgenomen in aanhangsel 1.

PRINCIPE VAN DE TEST

14. De gevoeligheid van de uterotrofe bioassay berust op een testsysteem met proefdieren waarbij de hypothalamus-hypofyse-gonadeas niet functioneel is, wat lage endogene concentraties van circulerend oestrogeen geeft. Dit zorgt voor een laag basisgewicht van de baarmoedergewicht op baseline en een maximaal bereik van de respons op toegediende oestrogenen. Twee oestrogeengevoelige toestanden van het vrouwelijke knaagdier voldoen aan deze eis:

i) onvolgroeide vrouwtjes na spening en vóór de puberteit, en

ii) jongvolwassen vrouwtjes na ovariëctomie waarbij er voldoende tijd is voor regressie van baarmoederweefsels.

15. De teststof wordt dagelijks toegediend via een orale maagsonde of subcutane injectie. De stof wordt in geleidelijk stijgende doses toegediend aan minimaal twee behandelgroepen (zie punt 33 voor richtsnoeren) van proefdieren met één dosisniveau per groep en een toedieningsperiode van drie opeenvolgende dagen voor de onvolgroeid-methode en een minimale toedieningsperiode van drie opeenvolgende dagen voor de ovx-volwassen-methode. Ongeveer 24 uur na de laatste dosis wordt obductie verricht op de dieren. Voor oestrogeenagonisten wordt beoordeeld of het gemiddelde baarmoedergewicht van de groepen met behandelde dieren statistisch significant is toegenomen ten opzichte van dat van de mediumgroep. Een statistisch significante toename van het gemiddelde baarmoedergewicht van een testgroep wijst op een positieve respons in deze bioassay.

BESCHRIJVING VAN DE METHODE

Keuze van de diersoort

16. Voor de methode kunnen vaak gebruikte proefknaagdierstammen worden gebruikt. Tijdens de validering werden bijvoorbeeld de rattenstammen Sprague-Dawley en Wistar gebruikt. Stammen met baarmoeders waarvan bekend is of vermoed wordt dat het responsvermogen lager is, mogen niet worden gebruikt. Het laboratorium moet de gevoeligheid van de gebruikte stam aantonen, zoals beschreven in punten 26 en 27.

17. De rat en muis zijn al sinds de jaren 30 routinematig gebruikt voor de uterotrofe bioassay. De OESO-valideringsonderzoeken werden alleen met ratten verricht op grond van de aanname dat beide soorten naar verwachting gelijkwaardig zijn en dat één soort daarom voldoende moet zijn voor de wereldwijde validering, om zodoende te besparen op middelen en dieren. In de meeste onderzoeken naar reproductie- en ontwikkelingstoxiciteit is de rat de aangewezen soort. In aanmerking genomen dat er voor muizen een enorme historische databank bestaat werd er, om de reikwijdte van de testmethode van de uterotrofe bioassay bij knaagdieren uit te breiden met het gebruik van muizen als testsoorten, een beperkt follow-upvalideringsonderzoek met muizen uitgevoerd (16). Er is gekozen voor een overbruggingsaanpak met een beperkt aantal teststoffen, deelnemende laboratoria en zonder codering van monsters, in overeenstemming met de oorspronkelijke intentie om te besparen op middelen en dieren. Uit dit overbruggingsvalideringsonderzoek blijkt voor de uterotrofe bioassay bij jongvolwassen muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, dat de bij ratten en muizen verkregen gegevens kwalitatief en kwantitatief goed met elkaar overeenkomen. Dit maakt het mogelijk, in het geval de uterotrofe bioassay inleidend is voor een langdurig onderzoek, in beide onderzoeken dieren van dezelfde stam en afkomst te gebruiken. Omdat de overbruggingsaanpak werd beperkt tot ovx-muizen en in het verslag geen robuuste dataset staat die het onvolgroeid-model valideert, valt het onvolgroeid-model voor muizen niet onder de reikwijdte van de huidige testmethode.

18. In bepaalde gevallen kunnen dus muizen in plaats van ratten worden gebruikt. De keuze voor deze soort moet worden gemotiveerd op basis van toxicologische, farmacokinetische en/of andere criteria. Het kan noodzakelijk zijn om voor muizen van het protocol af te wijken. Zo is de voedselconsumptie van muizen op basis van lichaamsgewicht hoger dan die van ratten en moet daarom het gehalte aan fyto-oestrogenen in het voer voor muizen lager zijn dan voor ratten (9)(20)(22).

Huisvestings- en voedingsomstandigheden

19. Alle procedures moeten verlopen conform de plaatselijke normen voor de verzorging van proefdieren. Deze beschrijvingen van de verzorging en behandeling zijn minimumnormen, die ondergeschikt zijn aan lokale regelgeving zoals Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (38). De temperatuur in de proefdierruimte dient 22 °C te zijn (met een spreiding van ± 3 °C). De relatieve vochtigheid moet minimaal 30 % zijn en bij voorkeur niet hoger dan maximaal 70 % (behalve bij het reinigen van de ruimte). Er moet worden gestreefd naar een relatieve vochtigheid van 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht, met een dagelijkse lichtcyclus van 12 uur licht en 12 uur donker.

20. Proefdiervoer en drinkwater moeten ad libitum worden verstrekt. Jongvolwassen dieren kunnen elk apart of in groepjes van maximaal drie dieren worden ondergebracht. Vanwege de jonge leeftijd van de onvolgroeide dieren, wordt sociale groepshuisvesting aanbevolen.

21. Het is bekend dat hoge gehaltes aan fyto-oestrogenen in proefdiervoer het baarmoedergewicht bij knaagdieren in zodanige mate verhogen, dat dit de uterotrofe bioassay verstoort (13)(14)(15). Hoge gehaltes aan fyto-oestrogenen en hoge metaboliseerbare energiewaarden in proefdiervoer kan bij gebruik van onvolgroeide dieren ook leiden tot vroegtijdige pubertijd. De fyto-oestrogenen komen hoofdzakelijk uit soja- en luzerneproducten die in het proefdiervoer zijn verwerkt, en het is gebleken dat de concentratie fyto-oestrogenen in standaardproefdiervoer van partij tot partij varieert (23). Het lichaamsgewicht is een belangrijke variabele, omdat de hoeveelheid voedsel die ingenomen wordt, gerelateerd is aan het lichaamsgewicht. De feitelijke dosis fyto-oestrogenen die dieren via hetzelfde voer binnenkrijgen, kan daarom per soort en per leeftijd variëren (9). Voor onvolgroeide vrouwelijke ratten kan de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht ongeveer een factor twee groter zijn dan die voor jongvolwassen vrouwtjes die ovariëctomie hebben ondergaan. Voor jongvolwassen muizen kan de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht ongeveer een factor vier groter zijn dan die voor jongvolwassen vrouwelijke ratten die ovariëctomie hebben ondergaan.

22. Uit resultaten van uterotrofe testen (9)(17)(18)(19) blijkt echter dat beperkte hoeveelheden fyto-oestrogenen in voer aanvaardbaar zijn en de gevoeligheid van de bioassay niet verminderen. Als richtsnoer mogen de gehaltes aan fyto-oestrogenen in voer niet hoger zijn dan 350 μg genisteïne-equivalenten/gram proefdiervoer voor onvolgroeide vrouwelijke Sprague Dawley- en Wistar-ratten (6)(9). Dergelijk voer moet eveneens aangewezen zijn bij het testen van jongvolwassen ratten die ovariëctomie hebben ondergaan, omdat de voedselconsumptie op basis van lichaamsgewicht bij jongvolwassen dieren lager is dan bij onvolgroeide dieren. Als volwassen muizen die ovariëctomie hebben ondergaan, of ratten die gevoeliger zijn voor fyto-oestrogenen, gebruikt gaan worden, moet worden overwogen de gehaltes aan fyto-oestrogenen in voer op evenredige wijze te verlagen (20). Bovendien kunnen de verschillen in de beschikbare metabole energie die verschillend voer levert, leiden tot verschuiving van het moment waarop de pubertijd begint (21)(22).

23. Voorafgaand aan het onderzoek moet zorgvuldig een voer zonder een verhoogd gehalte aan fyto-oestrogenen (zie (6)(9) voor richtsnoeren) of een verhoogde metaboliseerbare energiewaarde worden uitgekozen, omdat anders verstoring van de resultaten zou kunnen optreden (15)(17)(19)(22)(36). Erop toezien dat het door het laboratorium gebruikte testsysteem naar behoren presteert, zoals beschreven in punten 26 en 27, vormt een belangrijke controle op beide factoren. Als voorzorgsmaatregel in overeenstemming met goede laboratoriumpraktijken (GLP) moet van elke partij voer die tijdens het onderzoek wordt toegediend, een representatief monster worden genomen voor mogelijke analyse van het gehalte aan fyto-oestrogenen (bv. in het geval van een hoog controle-baarmoedergewicht ten opzichte van historische controles of een inadequate respons op het referentie-oesterogeen, 17-alfa-ethinylestradiol). Aliquots moeten als onderdeel van het onderzoek geanalyseerd worden of ingevroren worden bij – 20 °C of op zodanige wijze bewaard worden da