2)

In bijlage V wordt het volgende deel I bis ingevoegd: „DEEL I BIS Methoden voor de analyse van mageremelkpoeder bestemd voor openbare interventie Parameter Methode Eiwit ISO 8968 deel 1 Vetstoffen ISO 1736 Water ISO 5537 Zuurgraad ISO 6091 Lactaten ISO 8069 Fosfataseproef ISO 11816 deel 1 Onoplosbaarheidsindex ISO 8156 Verbrande deeltjes (2) ADPI Micro-organismen ISO 4833 deel 1 Karnemelk Aanhangsel I Lebwei (3) Aanhangsels II en III Zure wei (4) ISO 8069 of inspecties ter plaatse Sensorische controles (5) ISO 22935 delen 2 en 3 Aanhangsel I MAGEREMELKPOEDER: KWANTITATIEVE BEPALING VAN FOSFATIDYLSERINE EN FOSFATIDYLETHANOLAMINE Methode: reversed phase HPLC 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED De methode beschrijft een procedure voor de kwantitatieve bepaling van fosfatidylserine (PS) en fosfatidylethanolamine (PE) in mageremelkpoeder (MMP) en is geschikt voor de detectie van vaste stoffen uit karnemelk in MMP. 2. DEFINITIE Gehalte aan PS + PE: de massafractie van de met de hier beschreven methode bepaalde stof. Het resultaat wordt uitgedrukt in milligram fosfatidylethanolamine dipalmitoyl (PEDP) per 100 g poeder. 3. PRINCIPE VAN DE METHODE De aminofosfolipiden worden met methanol uit opgelost melkpoeder geëxtraheerd. PS en PE worden met behulp van reversed phase HPLC en fluorescentiedetectie als o-ftaaldialdehyde-derivaten bepaald. Het gehalte aan PS en PE in het testmonster wordt aan de hand van een standaardmonster met een bekend gehalte aan PEDP gekwantificeerd. 4. REAGENTIA Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn, tenzij anders wordt vermeld. 4.1. Standaardmateriaal: PEDP met een zuiverheid van ten minste 99 % NB: Het standaardmateriaal moet bij – 18 °C worden bewaard. 4.2. Reagentia voor de bereiding van het standaardmonster en het testmonster 4.2.1. Methanol, HPLC-kwaliteit 4.2.2. Chloroform, HPLC-kwaliteit 4.2.3. Tryptamine-monohydrochloride 4.3. Reagentia voor de o-ftaaldialdehyde-derivatisering 4.3.1. Natriumhydroxide, 12 M oplossing in water 4.3.2. Boorzuur, 0,4 M oplossing in water, waarvan de pH met natriumhydroxide (4.3.1) op 10,0 is gebracht 4.3.3. 2-mercapto-ethanol 4.3.4. o-Ftaaldialdehyde (OPA) 4.4. Loopvloeistoffen voor HPLC 4.4.1. De loopvloeistoffen moeten met reagentia van HPLC-kwaliteit worden bereid. 4.4.2. Water van HPLC-kwaliteit 4.4.3. Methanol met een fluorimetrisch bepaalde zuiverheid 4.4.4. Tetrahydrofuraan 4.4.5. Natriumdiwaterstoffosfaat 4.4.6. Natriumacetaat 4.4.7. Azijnzuur 5. APPARATUUR 5.1. Analytische balans, tot op 1 mg nauwkeurig en tot op 0,1 mg afleesbaar 5.2. Bekerglazen, 25 en 100 ml 5.3. Pipetten waarmee 1 en 10 ml kan worden toegevoegd 5.4. Magneetroerder 5.5. Meetpipetten waarmee 0,2, 0,5 en 5 ml kan worden toegevoegd 5.6. Maatkolven, 10, 50 en 100 ml 5.7. Injectiespuiten, 20 en 100 μl 5.8. Ultrasoonbad 5.9. Centrifuge, geschikt voor 27 000 × g 5.10. Glazen flesjes, ongeveer 5 ml 5.11. Maatcilinder, 25 ml 5.12. pH-meter, tot op 0,1 pH-eenheid nauwkeurig 5.13. HPLC-apparatuur 5.13.1. Gradiëntpompsysteem, geschikt voor een debiet van 1,0 ml/minuut bij 200 bar 5.13.2. Autosampler, geschikt voor derivatisering 5.13.3. Kolomverwarming, geschikt om de kolom op 30 °C ± 1 °C te houden 5.13.4. Fluorescentiedetector, geschikt voor een excitatiegolflengte van 330 nm en een emissiegolflengte van 440 nm 5.13.5. Integrator of software voor gegevensverwerking, geschikt voor piekoppervlakmeting 5.13.6. Kolom: LiChrospher® – 100 (250 × 4,6 mm) of een vergelijkbare kolom, gepakt met octadecylsilaan (C 18) met een deeltjesgrootte van 5 μm 6. MONSTERNEMING De monsters moeten overeenkomstig ISO-norm 707 worden genomen. 7. PROCEDURE 7.1. Bereiding van de interne standaardoplossing 7.1.1. Weeg 30,0 ± 0,1 mg tryptamine-monohydrochloride (4.2.3) af in een maatkolf van 100 ml (5.6) en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. 7.1.2. Pipetteer 1 ml (5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 10 ml (5.6) en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep voor een tryptamineconcentratie van 0,15 mM. 7.2. Bereiding van de testoplossing 7.2.1. Weeg 1,000 ± 0,001 g MMP-monster af in een bekerglas van 25 ml (5.2). Voeg met een pipet (5.3) 10 ml gedestilleerd water van 40 °C ± 1 °C toe en roer gedurende 30 minuten met een magneetroerder (5.4) om eventuele klontjes op te lossen. 7.2.2. Pipetteer 0,2 ml (5.5) melkpoederoplossing in een maatkolf van 10 ml (5.6), voeg met een injectiespuit (5.7) 100 μl 0,15 mM tryptamineoplossing (7.1) toe en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. Meng zorgvuldig door omkeren en ultrasoonbehandeling (5.8) gedurende 15 minuten. 7.2.3. Centrifugeer (5.9) gedurende 10 minuten bij 27 000 g × g en vang het supernatans in een glazen flesje (5.10) op. NB: De testoplossing moet bij 4 °C worden bewaard totdat de HPLC-analyse wordt uitgevoerd. 7.3. Bereiding van de externe standaardoplossing 7.3.1. Weeg 55,4 mg PEDP (4.1) af in een maatkolf van 50 ml (5.6) en voeg met een maatcilinder (5.11) ongeveer 25 ml chloroform (4.2.2) toe. Verwarm de kolf (met een stop erop) tot 50 °C ± 1 °C en meng zorgvuldig tot het PEDP oplost. Koel de kolf af tot 20 °C, vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep en meng door omkeren. 7.3.2. Pipetteer 1 ml (5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 100 ml (5.6) en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. Pipetteer 1 ml (5.3) van deze oplossing in een maatkolf van 10 ml (5.6), voeg 100 μl (5.7) 0,15 mM tryptamineoplossing (7.1) toe en vul met methanol (4.2.1) aan tot de maatstreep. Meng door omkeren. NB: De standaardoplossing moet bij 4 °C worden bewaard totdat de HPLC-analyse wordt uitgevoerd. 7.4. Bereiding van het derivatiseringsreagens Weeg 25,0 ± 0,1 mg OPA (4.3.4) af in een maatkolf van 10 ml (5.6), voeg 0,5 ml (5.5) methanol (4.2.1) toe en meng zorgvuldig om het OPA op te lossen. Vul met boorzuuroplossing (4.3.2) aan tot de maatstreep en voeg met een injectiespuit (5.7) 20 μl 2-mercapto-ethanol (4.3.3) toe. NB: Het derivatiseringsreagens moet bij 4 °C in een bruine fles worden bewaard en is gedurende één week stabiel. 7.5. Bepaling met HPLC 7.5.1. Loopvloeistoffen (4.4) Vloeistof A: oplossing van 0,3 mM natriumdiwaterstoffosfaat en 3 mM natriumacetaat (met azijnzuur op pH 6,5 ± 0,1 gebracht): methanol:tetrahydrofuraan = 558:440:2 (v/v/v). Vloeistof B: methanol 7.5.2. Aanbevolen loopvloeistofgradiënt: Tijd (min) Vloeistof A (%) Vloeistof B (%) Debiet (ml/min) Aanvankelijk 40 60 0 0,1 40 60 0,1 5,0 40 60 0,1 6,0 40 60 1,0 6,5 40 60 1,0 9,0 36 64 1,0 10,0 20 80 1,0 11,5 16 84 1,0 12,0 16 84 1,0 16,0 10 90 1,0 19,0 0 100 1,0 20,0 0 100 1,0 21,0 40 60 1,0 29,0 40 60 1,0 30,0 40 60 0 NB: De loopvloeistofgradiënt moet wellicht enigszins worden gewijzigd om de resolutie van figuur 1 te krijgen. Kolomtemperatuur: 30 °C. 7.5.3. Injectievolume: 50 μl derivatiseringsreagens en 50 μl testoplossing 7.5.4. Equilibreren van de kolom Spoel de kolom elke dag eerst gedurende 15 minuten met 100 % vloeistof B; breng vervolgens de verhouding A:B op 40:60 en equilibreer gedurende 15 minuten bij 1 ml/min. Voer een blancobepaling uit door methanol (4.2.1) te injecteren. NB: Spoel de kolom, als deze lange tijd niet wordt gebruikt, gedurende 30 minuten met methanol:chloroform = 80:20 (v/v). 7.5.5. Bepaal het gehalte aan PS + PE van het testmonster. 7.5.6. Voer de reeks chromatografische analyses uit, waarbij de tijd van run tot run constant wordt gehouden om constante retentietijden te krijgen. Injecteer om de 5-10 testoplossingen de externe standaardoplossing (7.3) om de responsfactor te berekenen. NB: Om de 20-25 runs moet de kolom worden gereinigd door gedurende ten minste 30 minuten met 100 % vloeistof B (7.5.1) te spoelen. 7.6. Wijze van integratie 7.6.1. PEDP-piek PEDP wordt als één piek geëlueerd. Bepaal het piekoppervlak door dal-tot-dalintegratie. 7.6.2. Tryptamine-piek Tryptamine wordt als één piek geëlueerd (figuur 1). Bepaal het piekoppervlak door dal-tot-dalintegratie. 7.6.3. PS- en PE-piekgroepen Onder de beschreven omstandigheden (figuur 1) wordt PS geëlueerd als twee hoofdpieken die elkaar gedeeltelijk overlappen, voorafgegaan door een kleinere piek. PE wordt geëlueerd als drie hoofdpieken die elkaar gedeeltelijk overlappen. Bepaal het totale oppervlak van elke piekgroep, waarbij de basislijn overeenkomstig figuur 1 wordt bepaald. 8. BEREKENING EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN Het gehalte aan PS en PE in het testmonster wordt als volgt berekend: C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2)) Hierbij is: C = gehalte aan PS of PE (mg/100 g poeder) in het testmonster A1 = PEDP-piekoppervlak van de standaardoplossing (punt 7.3) A2 = PS- of PE-piekoppervlak van de testoplossing (punt 7.2) T1 = tryptamine-piekoppervlak van de standaardoplossing (punt 7.3) T2 = tryptamine-piekoppervlak van de testoplossing (punt 7.2). 9. NAUWKEURIGHEID VAN DE METHODE NB: De waarden voor de herhaalbaarheid zijn berekend volgens de internationale IDF-norm (*). 9.1. Herhaalbaarheid De relatieve standaarddeviatie van de herhaalbaarheid, die een maat is voor de variabiliteit van onafhankelijke analyseresultaten die binnen korte tijd door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur onder dezelfde omstandigheden met hetzelfde testmonster worden verkregen, mag niet groter zijn dan 2 %. Als twee bepalingen onder deze omstandigheden worden uitgevoerd, mag het relatieve verschil tussen de twee resultaten niet groter zijn dan 6 % van het rekenkundig gemiddelde van de resultaten. 9.2. Reproduceerbaarheid Als twee resultaten door personen in verschillende laboratoria met verschillende apparatuur onder verschillende omstandigheden bij de analyse van hetzelfde testmonster worden verkregen, mag het relatieve verschil tussen de twee resultaten niet groter zijn dan 11 % van het rekenkundig gemiddelde van de resultaten. 10. REFERENTIES 10.1. Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M.: „Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”, Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988). Figuur 1 HPLC-patroon van OPA-derivaten van fosfatidylserine (PS) en fosfatidylethanolamine (PE) in methanolextract van opgelost mageremelkpoeder. De integratiewijze voor de pieken van PS, PE en tryptamine (interne standaard) wordt gerapporteerd Aanhangsel II DETECTIE VAN LEBWEI IN VOOR OPENBARE OPSLAG BESTEMD MAGEREMELKPOEDER DOOR DE BEPALING VAN CASEÏNEMACROPEPTIDEN MET BEHULP VAN HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE (HPLC) 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED Met deze methode kan lebwei in voor openbare opslag bestemd mageremelkpoeder worden gedetecteerd door middel van bepaling van de caseïnemacropeptiden. 2. REFERENTIE Internationale norm ISO 707: Melk en melkproducten — Leidraad voor monsterneming. 3. DEFINITIE Het gehalte aan vaste lebweibestanddelen wordt gedefinieerd als het massapercentage, zoals bepaald door het gehalte aan caseïnemacropeptiden volgens onderstaande methode. 4. PRINCIPE — Het mageremelkpoeder wordt opgelost en de vetten en eiwitten worden verwijderd met trichloorazijnzuur, gevolgd door centrifugeren of filtreren. — De hoeveelheid caseïnemacropeptiden (CMP) in het supernatans wordt met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) bepaald. — Het voor de monsters verkregen resultaat wordt beoordeeld aan de hand van standaardmonsters die bestaan uit mageremelkpoeder waaraan al dan niet een bekend percentage weipoeder is toegevoegd. 5. REAGENTIA Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn. 5.1. Trichloorazijnzuuroplossing Los 240 g trichloorazijnzuur (CCl3COOH) op in water en vul aan tot 1 000 ml. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. 5.2. Loopvloeistof, pH 6,0 Los 1,74 g dikaliumwaterstoffosfaat (K2HPO4), 12,37 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) en 21,41 g natriumsulfaat (Na2SO4) op in ongeveer 700 ml water. Zo nodig wordt de pH met verdund fosforzuur of een kaliumhydroxideoplossing op 6,0 gebracht. Vul met water aan tot 1 000 ml en meng. NB: De samenstelling van de loopvloeistof kan worden aangepast om aan het certificaat van de standaards of de aanbevelingen van de fabrikant van het pakkingsmateriaal van de kolom te voldoen. Filtreer de loopvloeistof vóór gebruik over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm. 5.3. Spoelvloeistof Meng één deel acetonitril (CH3CN) met negen delen water. Filtreer het mengsel vóór gebruik over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm. NB: Elke andere spoelvloeistof met een bactericide werking die geen nadelige effecten op het scheidend vermogen van de kolom heeft, kan worden gebruikt. 5.4. Standaardmonsters 5.4.1. Mageremelkpoeder dat aan de eisen van deze verordening voldoet (standaard [0]). 5.4.2. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 5 % m/m lebweipoeder met een standaardsamenstelling (standaard [5]). 6. APPARATUUR 6.1. Analytische balans 6.2. Eventueel een centrifuge met een centrifugaalkracht tot minimaal 2 200 g, voorzien van centrifugebuizen met stop of dop met een inhoud van ongeveer 50 ml 6.3. Mechanisch schudapparaat 6.4. Magneetroerder 6.5. Glazen trechters, diameter ongeveer 7 cm 6.6. Filtreerpapier, normaal, diameter ongeveer 12,5 cm 6.7. Glazen filtreerapparaat met membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm 6.8. Meetpipetten, geschikt voor 10 ml (ISO 648, klasse A, of ISO/R 835) of een doseersysteem dat in twee minuten 10,0 ml kan toevoegen 6.9. Doseersysteem dat 20,0 ml water bij ongeveer 50 °C kan toevoegen 6.10. Waterbad met thermostaat, ingesteld op 25 ± 0,5 °C 6.11. HPLC-apparaat bestaande uit: 6.11.1. pomp; 6.11.2. injector, al dan niet automatisch, capaciteit 15 tot 30 μl; 6.11.3. twee kolommen in serie, TSK 2 000-SW (lengte 30 cm, inwendige diameter 0,75 cm) of gelijkwaardig (bv. TSK 2 000-SWxl en Agilent Technologies Zorbax GF 250), en een voorkolom (3 cm × 0,3 cm), gepakt met I 125 of gelijkwaardig materiaal; 6.11.4. kolomoven met thermostaat, ingesteld op 35 ± 1 °C; 6.11.5. UV-detector met variabele golflengte, instelbaar op 205 nm, met een gevoeligheid van 0,008 Å; 6.11.6. integrator waarmee van dal tot dal kan worden geïntegreerd. NB: Zo nodig kan met kolommen op kamertemperatuur worden gewerkt, maar het scheidend vermogen daarvan is iets lager. In dergelijke gevallen mogen de temperatuurschommelingen binnen een analyseserie niet meer dan ± 5 °C bedragen. 7. MONSTERNEMING 7.1. De monsters moeten worden genomen volgens de procedure van internationale norm ISO 707. De lidstaten mogen echter een andere monsternemingsmethode gebruiken, mits deze de beginselen van bovengenoemde norm in acht neemt. 7.2. Bewaar het monster onder zodanige omstandigheden dat bederf of wijziging van de samenstelling uitgesloten is. 8. PROCEDURE 8.1. Bereiding van het testmonster Breng het melkpoeder over in een houder waarvan de inhoud ongeveer twee keer zo groot is als het volume van het poeder, voorzien van een luchtdicht deksel. Sluit de houder onmiddellijk. Meng het melkpoeder grondig door de houder herhaaldelijk om te keren. 8.2. Testhoeveelheid Weeg in een centrifugebuis (6.2) of een geschikte kolf met stop (50 ml) 2,000 ± 0,001 g testmonster af. 8.3. Verwijdering van vetten en eiwitten 8.3.1. Voeg aan de testhoeveelheid 20,0 ml warm water (50 °C) toe. Los het poeder op door gedurende 5 minuten op het schudapparaat (6.3) te schudden. Zet de buis in het waterbad (6.10) en equilibreer op 25 °C. 8.3.2. Voeg in twee minuten onder krachtig roeren met de magneetroerder (6.4) 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (5.1) van ongeveer 25 °C toe. Zet de buis gedurende 60 minuten in een waterbad (6.10). 8.3.3. Centrifugeer (6.2) gedurende 10 minuten bij 2 200 g of filtreer over filtreerpapier (6.6), waarbij de eerste 5 ml filtraat niet wordt opgevangen. 8.4. Chromatografische bepaling 8.4.1. Injecteer een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid van 15-30 μl supernatans of filtraat (8.3.3) in het HPLC-apparaat (6.11) bij een debiet van 1,0 ml loopvloeistof (5.2) per minuut. NB 1: Afhankelijk van de inwendige diameter van de gebruikte kolommen of de aanwijzingen van de fabrikant van de kolom kan een ander debiet worden gebruikt. NB 2: Spoel de kolommen gedurende elke onderbreking met water. Laat nooit loopvloeistof (5.2) in de kolommen staan. Spoel de kolommen vóór elke onderbreking van meer dan 24 uur met water en vervolgens gedurende ten minste drie uur met oplossing (5.3) bij een debiet van 0,2 ml per minuut. 8.4.2. De resultaten van de chromatografische analyse van het testmonster [E] worden verkregen in de vorm van een chromatogram, waarin elke piek als volgt wordt geïdentificeerd door zijn retentietijd RT: Piek II: De tweede piek van het chromatogram met een RT van ongeveer 12,5 minuten. Piek III: De derde piek van het chromatogram (de piek van de CMP) met een RT van 15,5 minuten. De keuze van de kolom(men) kan een significante invloed hebben op de retentietijd van de verschillende pieken. De integrator (6.11.6) berekent automatisch het oppervlak A van elke piek: AII: het oppervlak van piek II AIII: het oppervlak van piek III Om eventuele onregelmatigheden ten gevolge van slecht werkende apparatuur of kolommen of de herkomst en aard van het geanalyseerde monster te kunnen signaleren, moet vóór de kwantitatieve interpretatie het algemene beeld van elk chromatogram worden bekeken. Bij twijfel wordt de analyse herhaald. 8.5. Kalibratie 8.5.1. Volg voor de standaardmonsters (5.4) exact de onder 8.2 tot en met 8.4.2 beschreven procedure. Gebruik vers bereide oplossingen omdat CMP in 8 % trichloorazijnzuur ontleedt. Het verlies wordt bij 30 °C geraamd op 0,2 % per uur. 8.5.2. Conditioneer de kolommen vóór de chromatografische bepaling van de monsters door herhaaldelijk het standaardmonster (5.4.2) in oplossing (8.5.1) te injecteren totdat het oppervlak en de retentietijd van de CMP-piek constant zijn. 8.5.3. Bepaal de responsfactoren R door hetzelfde volume filtraat (8.5.1) te injecteren als voor de monsters is gebruikt. 9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN 9.1. Berekeningswijze en formules 9.1.1. Berekening van de responsfactoren R: Piek II: RII = 100/(AII[0]) Hierbij is: RII = de responsfactor voor piek II AII[0] = het oppervlak van piek II van standaardmonster [0], verkregen bij 8.5.3 Piek III: RIII = W/(AIII[5] – AIII[0]) Hierbij is: RIII = de responsfactor voor piek III AIII [0] en AIII [5] = het oppervlak van piek III van respectievelijk standaardmonster [0] en standaardmonster [5], verkregen bij 8.5.3 W = de hoeveelheid wei in standaardmonster[5], d.w.z. 5. 9.1.2. Berekening van het relatieve oppervlak van de pieken van monster [E] SII[E] = RII × AII[E] SIII[E] = RIII × AIII[E] SIV[E] = RIV × AIV[E] Hierbij zijn: SII[E], SIII[E] en SIV[E] = het relatieve oppervlak van respectievelijk de pieken II, III en IV van monster [E] AII[E] en AIII[E] = het oppervlak van respectievelijk de pieken II en III van monster [E], verkregen bij 8.4.2 RII en RIII = de bij punt 9.1.1 berekende responsfactoren 9.1.3. Berekening van de relatieve retentietijd van piek III van monster [E]: RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5]) Hierbij is: RRTIII[E] = de relatieve retentietijd van piek III van monster [E] RTIII[E] = de retentietijd van piek III van monster [E], verkregen bij 8.4.2 RTIII[5] = de retentietijd van piek III van standaardmonster [5], verkregen bij 8.5.3 9.1.4. Experimenteel is aangetoond dat er tot 10 % een lineair verband is tussen de relatieve retentietijd van piek III (RRTIII[E]) en het toegevoegde percentage weipoeder: — RRTIII[E] < 1,000 bij een weigehalte > 5 % — RRTIII[E] ≥ 1,000 bij een weigehalte ≤ 5 % De toegestane onzekerheid voor de waarden van RRTIII is ± 0,002. Doorgaans verschilt de waarde RRTIII [0] weinig van 1,034. Afhankelijk van de toestand van de kolommen mag deze waarde 1,000 benaderen, maar moet zij wel altijd groter dan 1,000 blijven. 9.2. Bereken het percentage lebweipoeder in het monster: W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)] Hierbij is: W = het percentage m/m lebwei in monster [E] SIII[E] = het relatieve oppervlak van piek III van monster [E], verkregen bij 9.1.2 1,3 = het gemiddelde relatieve oppervlak van piek III, uitgedrukt in gram lebwei per 100 g, bepaald in onvermengd mageremelkpoeder van verschillende herkomst. Deze waarde is experimenteel vastgesteld. SIII[0] = het relatieve oppervlak van piek III, dat gelijk is aan RIII × AIII[0]. Deze waarden zijn bij respectievelijk 9.1.1 en 8.5.3 verkregen. (SIII[0] – 0,9) = de correctie voor het gemiddelde relatieve oppervlak 1,3 als SIII[0] afwijkt van 0,9. Het gemiddelde relatieve oppervlak van piek III van standaardmonster [0] is experimenteel vastgesteld op 0,9. 9.3. Nauwkeurigheid van de methode 9.3.1. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die tegelijkertijd of kort na elkaar door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 0,2 % m/m. 9.3.2. Reproduceerbaarheid Het verschil tussen twee aparte en onafhankelijke resultaten die in twee verschillende laboratoria op identiek testmateriaal zijn verkregen, mag niet groter zijn dan 0,4 % m/m. 9.4. Interpretatie 9.4.1. Wei wordt geacht afwezig te zijn als het relatieve oppervlak van piek III (SIII[E]), uitgedrukt in gram lebwei per 100 g product, ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9) is, waarbij: 2,0 de maximaal toelaatbare waarde voor het relatieve oppervlak van piek III, rekening houdend met het gemiddelde relatieve oppervlak van piek III, d.w.z. 1,3, de onzekerheid ten gevolge van de variatie in de samenstelling van mageremelkpoeder en de reproduceerbaarheid van de methode (9.3.2) (SIII[0] – 0,9) de correctie die nodig is als het oppervlak SIII[0] afwijkt van 0,9 (zie 9.2) 9.4.2. Bepaal, als het relatieve oppervlak van piek III (SIII[E]) > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) is en het relatieve oppervlak van piek II (SII[E]) ≤ 160 is, het lebweigehalte volgens 9.2. 9.4.3. Bepaal, als het relatieve oppervlak van piek III (SIII[E]) > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) is en het relatieve oppervak van piek II (SII[E]) ≤ 160 is, het totale eiwitgehalte (P %); zie vervolgens de figuren 1 en 2. 9.4.3.1. De resultaten van de analyse van monsters onvermengd mageremelkpoeder met een hoog totaal eiwitgehalte zijn verzameld in de figuren 1 en 2. De doorgetrokken lijn is het resultaat van de lineaire regressie, waarvan de coëfficiënten worden berekend volgens de kleinste kwadratenmethode. De onderbroken lijn is de bovengrens van het relatieve oppervlak van piek III die met een waarschijnlijkheid van 90 % niet zal worden overschreden. De vergelijkingen voor de onderbroken lijnen van de figuren 1 en 2 zijn: SIII = 0,376 P % – 10,7 (figuur 1) SIII = 0,0123 SII[E] + 0,93 (figuur 2) Hierbij is: SIII = het relatieve oppervlak van piek III, berekend aan de hand van het totale eiwitgehalte of aan de hand van het relatieve oppervlak van piek SII[E] P % = het totale eiwitgehalte, uitgedrukt in gewichtspercenten SII[E] = het bij 9.1.2 berekende relatieve oppervlak van het monster Deze vergelijkingen komen overeen met het bij 9.2 vermelde getal 1,3. De afwijking (T1 en T2) tussen het gevonden relatieve oppervlak SIII[E] en het relatieve oppervlak SIII is: T1 = SIII[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)] Als T1 en/of T2 gelijk aan nul of negatief zijn, kan de aanwezigheid van lebwei niet worden vastgesteld. Als T1 en T2 positief zijn, dan is lebwei aanwezig. Het lebweigehalte wordt berekend met de volgende vergelijking: W = T2 + 0,91 Hierbij is: 0,91 = de afstand op de verticale as tussen de doorgetrokken lijn en de onderbroken lijn. Aanhangsel III BEPALING VAN VASTE LEBWEIBESTANDDELEN IN MAGEREMELKPOEDER 1. DOEL: DETECTIE VAN DE TOEVOEGING VAN VASTE LEBWEIBESTANDDELEN AAN MAGEREMELKPOEDER 2. REFERENTIES: INTERNATIONALE NORM ISO 707 3. DEFINITIE Het gehalte aan vaste lebweibestanddelen wordt gedefinieerd als het massapercentage, zoals bepaald door het gehalte aan caseïnemacropeptiden volgens onderstaande methode. 4. PRINCIPE De monsters worden met behulp van reversed phase hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) onderzocht op de aanwezigheid van caseïnemacropeptide A. Het resultaat wordt beoordeeld aan de hand van standaardmonsters die bestaan uit mageremelkpoeder waaraan al dan niet een bekend percentage weipoeder is toegevoegd. Een resultaat dat hoger is dan 1 % m/m geeft aan dat vaste lebweibestanddelen aanwezig zijn. 5. REAGENTIA Alle reagentia dienen van analysekwaliteit te zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van ten minste gelijkwaardige zuiverheid te zijn. Acetonitril moet van spectroscopie- of HPLC-kwaliteit zijn. 5.1. Trichloorazijnzuuroplossing Los 240 g trichloorazijnzuur (CCl3COOH) op in water en vul aan tot 1 000 ml. De oplossing moet helder en kleurloos zijn. 5.2. Loopvloeistoffen A en B Loopvloeistof A: breng 150 ml acetonitril (CH3CN), 20 ml isopropanol (CH3CHOHCH3) en 1,00 ml trifluorazijnzuur (TFA, CF3COOH) in een maatkolf van 1 000 ml. Vul met water aan tot 1 000 ml. Loopvloeistof B: breng 550 ml acetonitril, 20 ml isopropanol en 1,00 ml TFA in een maatkolf van 1 000 ml. Vul met water aan tot 1 000 ml. Filtreer de loopvloeistof vóór gebruik over een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm. 5.3. Conservering van de kolommen Na de analyses wordt de kolom gespoeld met loopvloeistof B (volgens een gradiënt) en vervolgens met acetonitril (volgens een gradiënt gedurende 30 minuten). De kolom wordt in acetonitril bewaard. 5.4. Standaardmonsters 5.4.1. Mageremelkpoeder dat aan de eisen voor openbare opslag voldoet (standaard [0]) 5.4.2. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 5 % m/m lebweipoeder met een standaardsamenstelling (standaard [5]) 5.4.3. Hetzelfde mageremelkpoeder dat is vermengd met 50 % m/m lebweipoeder met een standaardsamenstelling (standaard [50]) 6. APPARATUUR 6.1. Analytische balans 6.2. Eventueel een centrifuge met een centrifugaalkracht tot minimaal 2 200 g, voorzien van centrifugebuizen met stop of dop met een inhoud van ongeveer 50 ml 6.3. Mechanisch schudapparaat 6.4. Magneetroerder 6.5. Glazen trechters, diameter ongeveer 7 cm 6.6. Filtreerpapier, normaal, diameter ongeveer 12,5 cm 6.7. Glazen filtreerapparaat met membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm 6.8. Meetpipetten, geschikt voor 10 ml (ISO 648, klasse A, of ISO/R 835) of een doseersysteem dat in 2 minuten 10,0 ml kan toevoegen 6.9. Doseersysteem dat 20,0 ml water bij ongeveer 50 °C kan toevoegen 6.10. Waterbad met thermostaat, ingesteld op 25 ± 0,5 °C 6.11. HPLC-apparaat bestaande uit: 6.11.1. binaire gradiëntpomp; 6.11.2. injector, al dan niet automatisch, capaciteit 100 μl; 6.11.3. kolom Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (lengte 25 cm, inwendige diameter 0,46 cm) of een gelijkwaardige reversed phase silica-kolom met grote poriën; 6.11.4. kolomoven met thermostaat, ingesteld op 35 ± 1 °C; 6.11.5. uv-detector met variabele golflengte, instelbaar op 210 nm (indien nodig kan een langere golflengte tot 220 nm worden gebruikt), met een gevoeligheid van 0,02 Å; 6.11.6. integrator waarmee de integratie kan worden ingesteld op gemeenschappelijke basislijn of dal-tot-dal. NB: Zo nodig kan met kolommen op kamertemperatuur worden gewerkt, mits de kamertemperatuur dan niet meer dan 1 °C fluctueert, omdat de variatie in de retentietijd van CMPA anders te groot wordt. 7. MONSTERNEMING 7.1. De monsters moeten worden genomen volgens de procedure van internationale norm ISO 707. De lidstaten mogen echter een andere monsternemingsmethode gebruiken, mits deze de beginselen van bovengenoemde norm in acht neemt. 7.2. Bewaar het monster onder zodanige omstandigheden dat bederf of wijziging van de samenstelling uitgesloten is. 8. PROCEDURE 8.1. Bereiding van het testmonster Breng het melkpoeder over in een houder waarvan de inhoud ongeveer twee keer zo groot is als het volume van het poeder, voorzien van een luchtdicht deksel. Sluit de houder onmiddellijk. Meng het melkpoeder grondig door de houder herhaaldelijk om te keren. 8.2. Testhoeveelheid Weeg in een centrifugebuis (6.2) of een geschikte kolf met stop (50 ml) 2,00 ± 0,001 g testmonster af. NB: Weeg bij mengsels een zodanige hoeveelheid testmonster af dat de ontvette testhoeveelheid overeenkomt met 2,00 g. 8.3. Verwijdering van vetten en eiwitten 8.3.1. Voeg aan de testhoeveelheid 20,0 ml warm water (50 °C) toe. Los het poeder op door gedurende 5 minuten op het schudapparaat (6.3) te schudden. Zet de buis in het waterbad (6.10) en equilibreer op 25 °C. 8.3.2. Voeg in 2 minuten onder krachtig roeren met de magneetroerder (6.4) met constante snelheid 10,0 ml trichloorazijnzuuroplossing (5.1) van ongeveer 25 °C toe. Zet de buis gedurende 60 minuten in een waterbad (6.10). 8.3.3. Centrifugeer (6.2) gedurende 10 minuten bij 2 200 g of filtreer over filtreerpapier (6.6), waarbij de eerste 5 ml filtraat niet wordt opgevangen. 8.4. Chromatografische bepaling 8.4.1. De reversed phase HPLC-methode sluit de mogelijkheid van vals-positieve resultaten door de aanwezigheid van zurekarnemelkpoeder uit. 8.4.2. Voordat de reversed phase HPLC-analyse wordt uitgevoerd, moeten de gradiëntomstandigheden worden geoptimaliseerd. Voor gradiëntsystemen met een dood volume (d.w.z. het volume vanaf het punt waar de twee loopvloeistoffen samenkomen tot en met het volume in de injectorlus) van ongeveer 6 ml is een retentietijd van 26 ± 2 minuten voor CMPA optimaal. Voor gradiëntsystemen met een kleiner dood volume (bv. 2 ml) moet 22 minuten als optimale retentietijd worden gehanteerd. Neem oplossingen van de standaardmonsters (5.4) met en zonder 50 % lebwei. Injecteer 100 μl supernatans of filtraat (8.3.3) in het HPLC-apparaat bij de in tabel 1 vermelde verkennende gradiëntomstandigheden. Tabel 1 Verkennende gradiëntomstandigheden om de chromatografische analyse te optimaliseren Tijd (min) Debiet (ml/min) % A % B Curve Aanvankelijk 1,0 90 10 * 27 1,0 60 40 lineair 32 1,0 10 90 lineair 37 1,0 10 90 lineair 42 1,0 90 10 lineair Door de twee chromatogrammen te vergelijken kan de plaats van de CMPA-piek worden bepaald. Met onderstaande vergelijking kan de beginsamenstelling van de loopvloeistof voor de normale gradiënt (8.4.3) worden berekend: % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6)*1,11 Hierbij is: RTcmpA = de retentietijd van CMPA in de verkennende gradiënt 10 = aanvankelijke % B van de verkennende gradiënt 2,5 = % B halverwege minus aanvankelijke % B van de normale gradiënt 13,5 = tijdstip halverwege de verkennende gradiënt 26 = vereiste retentietijd voor CMPA 6 = verhouding van de hellingen van de verkennende en de normale gradiënt 30 = aanvankelijke % B minus % B na 27 minuten van de verkennende gradiënt 27 = looptijd van de verkennende gradiënt 8.4.3. Neem oplossingen van de testmonsters Injecteer een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid van 100 μl supernatans of filtraat (8.3.3) in het HPLC-apparaat bij een debiet van 1,0 ml loopvloeistof (5.2) per minuut. De samenstelling van de loopvloeistof bij het begin van de analyse wordt volgens 8.4.2 bepaald. Normaliter is deze ongeveer A:B = 76:24 (5.2). Onmiddellijk na het injecteren wordt een lineaire gradiënt gestart die leidt tot een 5 % hoger percentage B na 27 minuten. Vervolgens wordt een nieuwe lineaire gradiënt gestart die het percentage B in de loopvloeistof in 5 minuten op 90 % brengt. Deze samenstelling wordt gedurende 5 minuten gehandhaafd, waarna de samenstelling via een lineaire gradiënt in 5 minuten wordt gewijzigd tot de aanvankelijke samenstelling. Afhankelijk van het interne volume van het pompsysteem kan 15 minuten na het bereiken van de aanvankelijke samenstelling opnieuw worden geïnjecteerd. NB 1: De retentietijd van CMPA moet 26 ± 2 minuten zijn. Dit kan worden bereikt door de aanvankelijke en eindsamenstelling van de eerste gradiënt te variëren. Het verschil in % B tussen de aanvankelijke en eindsamenstelling van de eerste gradiënt moet echter 5 % blijven. NB 2: De loopvloeistoffen moeten afdoende worden ontgast en moeten ook ontgast blijven. Dit is essentieel voor een goede werking van het gradiëntpompsysteem. De standaarddeviatie voor de retentietijd van de CMPA-piek moet kleiner zijn dan 0,1 minuut (n = 10). NB 3: Om de vijf monsters moet referentiemonster [5] worden geïnjecteerd en worden gebruikt om een nieuwe responsfactor R (9.1.1) te berekenen. 8.4.4. De resultaten van de chromatografische analyse van het testmonster [E] worden verkregen in de vorm van een chromatogram waarop de CMPA-piek aan de hand van zijn retentietijd van ongeveer 26 minuten kan wordt geïdentificeerd. De integrator (6.11.6) berekent automatisch de piekhoogte H van de CMPA-piek. Op ieder chromatogram moet de plaats van de basislijn worden gecontroleerd. Als de basislijn zich niet op de juiste plaats bevindt, moet de analyse of de integratie worden herhaald. NB: Als de CMPA-piek afdoende van de andere pieken gescheiden is, moet de dal-tot-dalbasislijn worden gebruikt; in andere gevallen worden loodlijnen getrokken naar een gemeenschappelijke basislijn die in de buurt van de CMPA-piek moet beginnen (dus niet bij t = 0!). Gebruik voor de standaard en de monsters dezelfde integratievorm en controleer bij een gemeenschappelijke basislijn of deze voor de monsters en de standaard consistent is. Om eventuele onregelmatigheden ten gevolge van slecht werkende apparatuur of kolommen of in verband met de herkomst en aard van het geanalyseerde monster te kunnen signaleren, moet vóór de kwantitatieve interpretatie het algemene beeld van elk chromatogram worden bekeken. Bij twijfel wordt de analyse herhaald. 8.5. Kalibratie 8.5.1. Volg voor de standaardmonsters (5.4.1 tot 5.4.2) exact de onder 8.2 tot en met 8.4.4 beschreven procedure. Gebruik vers bereide oplossingen omdat CMP in 8 % trichloorazijnzuur bij kamertemperatuur ontleedt. Bij 4 °C blijft de oplossing 24 uur stabiel. Bij een lange reeks analyses is het gebruik van een gekoelde monsterhouder in de automatische injector wenselijk. NB: 8.4.2 kan worden overgeslagen als de aanvankelijke % B uit eerdere analyses bekend is. Het chromatogram van referentiemonster [5] moet analoog zijn aan figuur 1. In deze figuur wordt de CMPA-piek voorafgegaan door twee kleine pieken. Het is essentieel dat eenzelfde scheiding wordt verkregen. 8.5.2. Injecteer vóór de chromatografische bepaling van de monsters 100 μl standaardmonster [0] zonder lebwei (5.4.1). Het chromatogram mag geen piek vertonen op de retentietijd van de CMPA-piek. 8.5.3. Bepaal de responsfactoren R door hetzelfde volume filtraat (8.5.1) te injecteren als voor de monsters is gebruikt. 9. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN 9.1. Berekeningswijze en formules 9.1.1. Berekening van de responsfactor R: CMPA-piek: R = W/H Hierbij is: R = de responsfactor voor de CMPA-piek H = de hoogte van de CMPA-piek W = de hoeveelheid wei in standaardmonster [5] 9.2. Berekening van het percentage lebweipoeder in het monster W(E) = R × H(E) Hierbij is: W(E) = het percentage m/m lebwei in monster (E) R = de responsfactor van de CMPA-piek (9.1.1) H(E) = de hoogte van de CMPA-piek van monster (E) Als W(E) groter is dan 1 % en het verschil tussen de retentietijd en die van standaardmonster [5] kleiner is dan 0,2 minuut, zijn er vaste lebweibestanddelen aanwezig. 9.3. Nauwkeurigheid van de methode 9.3.1. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van twee bepalingen die tegelijkertijd of kort na elkaar door dezelfde persoon met dezelfde apparatuur op identiek testmateriaal zijn uitgevoerd, mag niet groter zijn dan 0,2 % m/m. 9.3.2. Reproduceerbaarheid Niet bepaald. 9.3.3. Lineariteit Van 0 tot 16 % lebwei moet er een lineaire relatie worden verkregen met een correlatiecoëfficiënt > 0,99. 9.4. Interpretatie In de grenswaarde van 1 % is ook de onzekerheid vanwege de reproduceerbaarheid opgenomen. Figuur 1 Ni-4,6-standaard (*) Internationale IDF-norm 135B/1991. Melk en melkproducten. Precisie van analysemethoden. Schets van een procedure voor een ringonderzoek.”.