Beschikking van de Commissie

van 21 februari 2002

tot wijziging van bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG van de Raad met betrekking tot de diagnostische tests voor paardenpest

(kennisgeving geschied onder nummer C(2002) 556)

(Voor de EER relevante tekst)

(2002/160/EG)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 90/426/EEG van de Raad van 26 juni 1990 tot vaststelling van veterinairrechtelijke voorschriften voor het verkeer van paardachtigen en de invoer van paardachtigen uit derde landen(1), laatstelijk gewijzigd bij Beschikking 2001/298/EG(2), en met name op artikel 23,

Overwegende hetgeen volgt:

(1) Bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG wordt een beschrijving gegeven van de complementbindingstest die moet worden uitgevoerd in het kader van de diagnose van paardenpest.

(2) In november 2000 is in het communautair referentielaboratorium in Algete, Spanje, de jaarlijkse vergadering gehouden van de nationale referentielaboratoria voor paardenpest van de lidstaten van de EU. In die vergadering is wetenschappelijk aangetoond dat de complementbindingstest zoals die momenteel in bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG wordt beschreven, aanzienlijke beperkingen heeft, vooral omdat hij uitsluitend geschikt is voor de opsporing van antilichamen na een recente besmetting of vaccinatie. Bovendien wordt de test in bijna alle laboratoria van de Gemeenschap en ook in de belangrijkste exporterende landen in de praktijk vervangen door de modernere ELISA-test.

(3) De internationaal aanvaarde laboratoriumtests voor de opsporing van antilichamen tegen het virus van paardenpest zijn beschreven in het "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines" (Handboek inzake normen voor diagnostische tests en vaccins)(3) van het Internationaal Bureau voor Besmettelijke Veeziekten (OIE). In de huidige editie is evenwel slechts één van de beschikbare ELISA-tests opgenomen.

(4) Derhalve lijkt het aangewezen bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG aan te passen aan de technische ontwikkelingen en de internationaal erkende normen.

(5) De in deze beschikking vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Permanent Veterinair Comité,

HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:

Artikel 1

Bijlage D bij Richtlijn 90/426/EEG van de Raad wordt vervangen door de bijlage bij deze beschikking.

Artikel 2

Deze beschikking is gericht tot de lidstaten.

Gedaan te Brussel, 21 februari 2002.

Voor de Commissie

David Byrne

Lid van de Commissie

(1) PB L 224 van 18.8.1990, blz. 42.

(2) PB L 102 van 12.4.2001, blz. 63.

(3) Hoofdstuk 2.1.11, vierde editie 2000.

BIJLAGE

"BIJLAGE D

PAARDENPEST

DIAGNOSE

Reagentia voor de hieronder beschreven enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kunnen worden betrokken bij het communautaire referentielaboratorium of de referentielaboratoria van het OIE voor paardenpest.

1. COMPETITIE-ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST)

De competitie-ELISA wordt gebruikt voor het aantonen van specifieke antilichamen tegen AHSV in sera van paardachtigen. Het breedspectrum, polyklonaal, anti-AHSV caviaserum is serogroepspecifiek en is geschikt voor het aantonen van antilichamen gericht tegen alle bekende serotypes van het paardenpestvirus.

De test is gebaseerd op het onderbreken van de reactie tussen het AHSV-antigeen en een anti-AHSV caviaserum door AHSV-antilichamen in een testserummonster. AHSV-antilichamen in het testserummonster gaan competitie aan met de AHSV-antilichamen in het caviaserum, wat resulteert in vermindering van de kleurontwikkeling (na toevoeging van met een enzyme gelabelled anticavia-antilichaam en substraat). De sera kunnen worden getest bij een enkele verdunning van 1 op 5 (spottestmethode) of kunnen worden getitreerd voor het verkrijgen van verdunningseindpunten. Inhibitiewaarden van meer dan 50 % kunnen als positief worden beschouwd.

Het hieronder beschreven testprotocol wordt gebruikt in het regionaal referentielaboratorium voor paardenpest in Pirbright, Verenigd Koninkrijk.

1.1. Testprocedure

1.1.1. Voorbereiding van de plaatjes

1.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met AHSV-antigeen dat is geëxtraheerd uit geïnfecteerde celculturen en verdund in carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Incubeer de ELISA-plaatjes bij 4 °C gedurende één nacht.

1.1.1.2. Was de plaatjes driemaal door de putjes te vullen met PBS (pH 7,2-7,4) en vervolgens weer leeg te slaan, en sla de plaatjes droog op absorberend papier.

1.1.2. Controleputjes

1.1.2.1. Titreer de positieve controlesera in een tweevoudige verdunningsreeks, 1 op 5 tot 1 op 640, in kolom 1 in blockingbuffer (PBS met 0,05 % (v/v) Tween-20, 5 % (w/v) mageremelkpoeder (Cadbury's MarvelTM) en 1 % (v/v) serum van een volwassen rund) tot een eindvolume van 50 μl per putje.

1.1.2.2. Pipetteer 50 μl van het negatieve controleserum in een verdunning 1 op 5 (10 μl serum + 40 μl blockingbuffer) in de putjes A en B van kolom 2.

1.1.2.3. Pipetteer 100 μl blockingbuffer in de putjes C en D van kolom 2 (BLANCO).

1.1.2.4. Pipetteer 50 μl blockingbuffer in de putjes E, F, G en H van kolom 2 (caviaserum controle).

1.1.3. Spottestmethode

1.1.3.1. Pipetteer een verdunning van elk testserum in blockingbuffer (verhouding 1 op 5) in duplo (twee putjes/monster) van de kolommen 3 tot en met 12 (10 μl serum + 40 μl blockingbuffer).

of

1.1.4. Serumtitreringsmethode

1.1.4.1. Bereid een tweevoudige verdunningsreeks van elk testserum (1 op 5 tot 1 op 640) in blockingbuffer en pipetteer deze in 8 putjes van een kolom (een verdunningsreeks per kolom: kolommen 3 tot en met 12).

vervolgens

1.1.5. Pipetteer 50 μl anti-AHSV caviaserum, reeds voorverdund tot de eindverdunning in blockingbuffer, in alle putjes van de ELISA-plaat, behalve de blanco's (elk putje bevat nu 100 μl vloeistof).

1.1.5.1. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C op een schudapparaat.

1.1.5.2. Was de plaatjes driemaal en sla droog als hierboven omschreven.

1.1.5.3. Pipetteer 50 μl konijn-anticavia-HRP-conjugaat, reeds voorverdund tot de eindverdunning in blockingbuffer, in elk putje.

1.1.5.4. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C op een schudapparaat.

1.1.5.5. Was de plaatjes driemaal en sla droog als hierboven omschreven.

1.1.6. Chromogeen

Bereid de chromogeenoplossing OPD (OPD=ortho-phenyldiamine) volgens de instructies van de fabrikant (0,4 mg per ml in steriel gedistilleerd water) enkele minuten vóór het gebruik. Voeg substraat (H2O2, waterstofperoxide) toe tot een eindconcentratie van 0,05 % (v/v) (verdunning van 1 op 2000 van een 30 %-ige oplossing van H2O2). Pipetteer 50 μl OPD-oplossing in elk putje en laat de plaatjes gedurende 10 minuten bij omgevingstemperatuur staan. Stop de reactie met 1M zwavelzuur (H2SO4) (50 μl per putje).

1.1.7. Aflezen

Lees af met behulp van een spectrofotometer bij een golflengte van 492 nm.

1.2. Berekening van de resultaten

1.2.1. Print de OD-waarden en het percentage inhibitie (PI) voor de testsera en controlesera, gebaseerd op de gemiddelde waarde van de vier caviaserum controleputjes, uit met gebruikmaking van een speciaal softwarepakket. De verkregen OD- en PI-waarden worden gebruikt om te bepalen of de testresultaten binnen aanvaardbare grenzen liggen. De OD-waarden voor de caviaserum controles liggen tussen OD = 1,4 (bovengrens) en OD = 0,4 (ondergrens). De eindpunttiter van de positieve controle, gebaseerd op 50 % PI, zou 1/240 moeten bedragen (tussen 1/120 en 1/480). Elk plaatje dat niet aan bovenstaande criteria voldoet, moet worden afgewezen. Indien het positieve controleserum evenwel een titer te zien geeft die groter is dan 1 op 480 en de testmonsters toch negatief zijn, mogen de negatieve testmonsters worden geaccepteerd.

De PI-waarden van het in duplo geteste negatieve controleserum en de in duplo blanco's moeten liggen tussen + 25 % en - 25 %, respectievelijk tussen + 95 en + 105 %. Indien deze waarden buiten de boven- en ondergrenzen liggen, is de test niet als zodanig mislukt maar is er mogelijk sprake van een te hoge achtergrondkleuring.

1.2.2. De diagnostische drempel (afkapwaarde) voor testsera bedraagt 50 % (PI 50 %). Monsters met een PI-waarde die groter is dan 50 %, worden als positief beschouwd. Monsters met een PI-waarde die lager is dan 50 %, worden als negatief beschouwd.

Monsters met duplo's waarvan één PI-waarde boven en één beneden de diagnostische drempel ligt, worden als twijfelachtig beschouwd. Dergelijke monsters kunnen opnieuw worden getest met de spottest of door titrering. Positieve monsters mogen ook worden getitreerd om een indicatie te geven van de graad van positiviteit.

Proefopstelling spottest

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

- Cont.= negatieve controle.

+ Cont.= positieve controle.

GP Cont.= Guinea Pig Control (caviacontrole).

Proefopstelling serumtitrering

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

- Cont.= negatieve controle.

+ Cont.= positieve controle.

GP Cont.= Guinea Pig Control (caviacontrole).

2. INDIRECTE ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST)

De hieronder beschreven test is in overeenstemming met de testprocedure die is beschreven in hoofdstuk 2.1.11 van het "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines" van het OIE, vierde editie, 2000.

Recombinant VP7 proteïne is gebruikt als antigeen voor de bepaling van antilichamen tegen AHSV met een hoge gevoeligheid en specificiteit. Andere voordelen zijn dat het stabiel is en niet besmettelijk.

2.1. Testprocedure

2.1.1. Vaste fase

2.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met recombinant AHSV-4 VP7, verdund in carbonaat/bicarbonaatbuffer. Incubeer de plaatjes gedurende één nacht bij 4 °C, pH 9,6.

2.1.1.2. Was de plaatjes vijfmaal met gedistilleerd water dat 0,01 % (v/v) Tween 20 (wasoplossing) bevat. Klop de plaatjes zachtjes af op absorberend materiaal om resten van het wassen te verwijderen.

2.1.1.3. Blokkeer de plaatjes met PBS + 5 % (w/v) magere melk (mageremelkpoeder van NestléTM), 200 μl per putje, gedurende 1 uur bij 37 °C.

2.1.1.4. Verwijder de blockingbuffer en klop de plaatjes zachtjes af op absorberend materiaal.

2.1.2. Testmonsters

2.1.2.1. De te testen serummonsters en de positieve en negatieve controlesera worden verdund in een verhouding 1 op 25 in PBS + 5 % (w/v) magere melk + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl per putje. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.

Voor titrering wordt een tweevoudige verdunningsreeks aangelegd te beginnen bij 1 op 25 (100 μl/putje), één serum per kolom, en wordt hetzelfde gedaan met de positieve en de negatieve controles. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.

2.1.2.2. Was de plaatjes als omschreven onder 2.1.1.2.

2.1.3. Conjugaat

2.1.3.1. Pipetteer in elk putje 100 μl met HRP geconjugeerd anti-paard gamma-globuline, verdund in PBS + 5 % melk + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.

2.1.3.2. Was de plaatjes als omschreven onder 2.1.1.2.

2.1.4. Chromogeen/Substraat

2.1.4.1. Pipetteer in elk putje 200 μl chromogeen/substraatoplossing [10 ml van 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 ml van 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolin hydrazon hydro-chloride) + 5 μl H2O2].

Kleurontwikkeling wordt gestopt door toevoeging van 50 μl 3N H2SO4 na 5 à 10 minuten (voordat de negatieve controle begint te kleuren).

Andere chromogenen, bijv. ABTS (2.2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]), TMB (tetramethyl benzidine), of OPD (ortho-phenyldiamine) mogen ook worden gebruikt.

2.1.4.2. Lees de plaatjes af bij een golflengte van 600 nm (of 620 nm).

2.2. Interpretatie van de resultaten

2.2.1. Bereken de afkapwaarde door 0,6 toe te voegen aan de waarde van de negatieve controle (0,6 is de afgeleide standaarddeviatie bij een groep van 30 negatieve sera).

2.2.2. Testmonsters met absorptiewaarden beneden de afkapwaarde worden als negatief beschouwd.

2.2.3. Testmonsters met absorptiewaarden boven de afkapwaarde + 0,15 worden als positief beschouwd.

2.2.4. Testmonsters met een tussenliggende absorptiewaarde zijn twijfelachtig en in dat geval moet een tweede methode worden toegepast om het resultaat te bevestigen.

3. BLOKKERINGS-ELISA VOOR HET AANTONEN VAN ANTILICHAMEN TEGEN HET PAARDENPESTVIRUS (AHSV) (VOORGESCHREVEN TEST)

De blokkerings-ELISA is gericht op het aantonen van specifieke antilichamen tegen AHSV in sera van elke gevoelige diersoort. VP7 is het belangrijkste antigene virusproteïne van AHSV en komt voor binnen de negen serotypen. Aangezien het monoklonale antilichaam (Mab) ook gericht is tegen het VP7, heeft de test een zeer grote gevoeligheid en specificiteit. Voorts is recombinant VP7 antigeen totaal onschadelijk en is bijgevolg een zeer hoge veiligheidsgraad gegarandeerd.

De test is gebaseerd op het onderbreken van de reactie tussen het recombinant VP7, d.i. het aan het ELISA-plaatje gebonden antigeen, en het geconjugeerde Mab dat specifiek is voor VP7. Antilichamen in het testserum blokkeren de reactie tussen het antigeen en het Mab, wat resulteert in vermindering van de kleurontwikkeling.

De hieronder beschreven test wordt uitgevoerd in het communautair referentielaboratorium voor paardenpest in Algete, Spanje.

3.1. Testprocedure

3.1.1. ELISA-plaatjes

3.1.1.1. Coat de ELISA-plaatjes met recombinant AHSV-4 VP7, voorverdund in carbonaat/bicarbonaatbuffer, pH 9,6. Incubeer de plaatjes gedurende één nacht bij 4 °C.

3.1.1.2. Was de plaatjes vijfmaal met PBST (PBS waaraan 0,05 % (v/v) Tween 20 is toegevoegd).

3.1.1.3. Stabiliseer de plaatjes door behandeling met een stabilisatieoplossing (met het oog op langdurige opslag bij 4 °C zonder verlies van werkzaamheid) en sla de plaatjes droog op absorberend materiaal.

3.1.2. Testmonsters en controles

3.1.2.1.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

3.1.2.2.

>RUIMTE VOOR DE TABEL>

3.1.3. Conjugaat

Pipetteer 50 μl voorverdund, aan HRP (horseradish-peroxidase) geconjugeerd Mab (voor VP7 specifieke monoklonale antilichamen) in elk putje en meng zachtjes om homogeniteit te garanderen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.

3.1.4. Was de plaatjes vijfmaal met PBST en sla droog als hierboven omschreven.

3.1.5. Chromogeen/Substraat

Pipetteer 100 μl chromogeen/substraatoplossing in elk putje [(1 ml ABTS (2.2'-azino-bis[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml ± 9 ml substraatbuffer (0,1M fosfaat-citraatbuffer met pH 4 die 0,03 % H2O2 bevat)] en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Stop de kleurontwikkeling door toevoeging van 2 % (w/v) SDS (natriumdodecylsulfaat) (100 μl per putje).

3.1.6. Aflezen

Lees af bij een golflengte van 405 nm in een ELISA-leesapparaat.

3.2. Interpretatie van de resultaten

3.2.1. Validering van de test

De test is geldig wanneer de optische densiteit (OD) van de negatieve controle (NC) hoger is dan 1,0 en de OD van de positieve controle (PC) lager is dan 0,2.

3.2.2. Berekening van de afkapwaarde

Positieve afkapwaarde=

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

Negatieve afkapwaarde=

>REFERENTIE NAAR EEN GRAFIEK>

NC is de OD van de negatieve controle en PC is de OD van de positieve controle.

3.2.3. Interpretatie van de resultaten

Monsters met een OD beneden de positieve afkapwaarde worden als positief voor antilichamen tegen AHSV aangemerkt.

Monsters met een OD boven de negatieve afkapwaarde worden als negatief voor antilichamen tegen AHSV aangemerkt.

Monsters met een OD tussen deze beide waarden worden als twijfelachtig aangemerkt en de betrokken dieren moeten 2 à 3 weken later opnieuw worden bemonsterd."