RICHTLIJN 2006/56/EG VAN DE COMMISSIE

van 12 juni 2006

tot wijziging van de bijlagen bij Richtlijn 93/85/EEG van de Raad betreffende de bestrijding van aardappelringrot

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 93/85/EEG van de Raad van 4 oktober 1993 betreffende de bestrijding van aardappelringrot (1), en met name op artikel 12,

Overwegende hetgeen volgt:

Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., het pathogene agens van aardappelringrot (hierna „het organisme” genoemd), is een van de belangrijke schadelijke organismen voor aardappelen.

Sindsdien zijn het inzicht in de biologie van het organisme en de detectie- en identificatiemethoden aanzienlijk verbeterd. Verder moeten diverse technische bepalingen betreffende de bestrijdingsmaatregelen opnieuw worden bezien naar aanleiding van de ervaringen die met de bestrijding van het organisme in de praktijk zijn opgedaan.

In verband met deze ontwikkelingen moeten de maatregelen in de bijlagen bij Richtlijn 93/85/EEG worden herzien en bijgewerkt.

Wat de detectie- en identificatiemethoden betreft, worden recent ontwikkelde methoden, zoals fluorescente in-situ hybridisatie (FISH) en de polymerasekettingreactie (PCR), in de richtlijn opgenomen en worden een aantal verbeteringen aangebracht in verscheidene technische onderdelen van de huidige detectie- en identificatiemethode.

Ten aanzien van de technische aspecten van de bestrijdingsmaatregelen zijn er verbeterde bepalingen gekomen voor de wijze van bewaring van de geteste monsters met het oog op de traceerbaarheid, de elementen die nodig zijn om de omvang van de waarschijnlijke besmetting te bepalen, de gegevens van de kennisgeving van de bevestigde aanwezigheid van het organisme en de besmette zone, alsmede de maatregelen die in besmet verklaarde productieplaatsen en in de afgebakende zones moeten worden genomen.

De in deze richtlijn vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Permanent Plantenziektekundig Comité,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:

Artikel 1

De bijlagen bij Richtlijn 93/85/EEG worden vervangen door de overeenkomstige teksten in de bijlage bij deze richtlijn.

Artikel 2

1. De lidstaten dienen uiterlijk op 31 maart 2007 de nodige wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen vast te stellen en bekend te maken om aan deze richtlijn te voldoen. Zij delen de Commissie de tekst van die bepalingen onverwijld mee, alsmede een tabel ter weergave van het verband tussen die bepalingen en deze richtlijn.

Zij passen die bepalingen toe vanaf 1 april 2007.

Wanneer de lidstaten die bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen zelf of bij de officiële bekendmaking daarvan naar deze richtlijn verwezen. De regels voor die verwijzing worden vastgesteld door de lidstaten.

2. De lidstaten delen de Commissie onmiddellijk de tekst van de belangrijkste bepalingen van intern recht mee die zij op het onder deze richtlijn vallende gebied vaststellen.

Artikel 3

Deze richtlijn treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Artikel 4

Deze richtlijn is gericht tot de lidstaten.

(1) PB L 259 van 18.10.1993, blz. 2.

BIJLAGE I

ONDERZOEKSMETHODE VOOR DE DIAGNOSE, DETECTIE EN IDENTIFICATIE VAN DE RINGROTBACTERIE, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

OVERZICHT VAN DE ONDERZOEKSMETHODE

Deze onderzoeksmethode beschrijft de verschillende procedures voor:

i) de diagnose van ringrot in aardappelknollen en -planten;

ii) de detectie van Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in monsters van aardappelknollen en -planten;

iii) de identificatie van Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. ssp. sepedonicus).

ALGEMENE BEGINSELEN

In de aanhangsels worden geoptimaliseerde protocollen voor de verschillende methoden, gevalideerde reagentia, en nadere bijzonderheden betreffende de bereiding van analyse- en controlemateriaal beschreven. Aanhangsel 1 bevat een lijst van laboratoria die bij de optimalisering en validering van de protocollen zijn betrokken.

Aangezien de protocollen betrekking hebben op de detectie van een quarantaineorganisme en daarbij levensvatbare culturen van C. m. ssp. sepedonicus als controlemateriaal gebruikt worden, moeten de procedures onder adequate quarantaineomstandigheden met de nodige faciliteiten voor afvalverwijdering worden uitgevoerd en moeten de officiële autoriteiten voor plantenquarantaine de vereiste vergunningen hebben verstrekt.

De testparameters moeten zodanig zijn dat C. m. ssp. sepedonicus bij de drempelwaarden die voor de gekozen methoden zijn vastgesteld op consistente en reproduceerbare wijze gedetecteerd wordt.

Het is essentieel dat de positieve controlemonsters zorgvuldig bereid worden.

Om de testen met de vereiste drempelwaarden te kunnen verrichten moet verder de apparatuur juist ingesteld, in goede staat van onderhoud en geijkt zijn, moeten de reagentia zorgvuldig gehanteerd en bewaard worden en moeten alle maatregelen worden genomen om kruisbesmetting tussen de monsters te voorkomen; zo moeten de positieve controlemonsters gescheiden van de analysemonsters bewaard worden. Er moeten kwaliteitsbewakingsnormen worden toegepast om administratieve en andere fouten te vermijden, met name bij de etikettering en documentatie.

Een vermoed optreden als bedoeld in artikel 4, lid 2, van Richtlijn 93/85/EEG betekent dat een positieve uitslag is verkregen bij een diagnostische of screeningtest op een monster zoals aangegeven in de stroomdiagrammen.

Als de eerste screeningtest (IF of PCR/FISH) positief is, wordt besmetting met C. m. ssp. sepedonicus vermoed en moet een tweede screeningtest worden uitgevoerd. Is de tweede screeningtest ook positief, dan wordt het vermoeden bevestigd (vermoed optreden) en moeten de testen volgens de onderzoeksmethode worden voortgezet. Als de tweede screeningtest negatief is, wordt aangenomen dat het monster niet met C. m. ssp. sepedonicus besmet is.

Een positieve IF-test als bedoeld in artikel 4, lid 2, is dus gedefinieerd als een positieve IF-uitslag die door een tweede screeningtest (PCR/FISH) is bevestigd.

Onder bevestigde aanwezigheid als bedoeld in artikel 5, lid 1, wordt verstaan dat een reincultuur van C. m. ssp. sepedonicus is geïsoleerd en geïdentificeerd en de pathogeniteit ervan bevestigd is.

1. WEERGAVE IN STROOMDIAGRAM

1.1. Methode voor de diagnose van ringrot in aardappelknollen en -planten met symptomen van ringrot

De testprocedure is bedoeld voor aardappelknollen en -planten met symptomen die karakteristiek zijn voor ringrot of een vermoeden daarvan doen rijzen. Dit omvat een snelle screeningtest, isolatie van het pathogeen uit geïnfecteerd vaatweefsel op diagnostische media en, in geval van een positieve uitslag, identificatie van de cultuur als C. m. ssp. sepedonicus.

1.2. Methode voor de detectie en identificatie van Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in monsters van symptoomloze aardappelknollen

Principe

Deze testprocedure is bedoeld voor het opsporen van latente infecties in aardappelknollen. Een positieve uitslag bij ten minste twee, op verschillende biologische principes gebaseerde screeningtesten moet worden bevestigd door isolatie van het pathogeen. In geval van isolatie van karakteristieke kolonies wordt de procedure vervolgd door identificatie van een reincultuur als C. m. ssp. sepedonicus. Een positieve uitslag bij slechts één van de screeningtesten is niet voldoende om het monster als verdacht aan te merken.

Met de screening- en isolatietesten moet een detectiegrens worden gehaald van 103-104 cellen/ml van de geresuspendeerde pellet die als positieve controle aan elke testreeks wordt toegevoegd.

1.3. Methode voor de detectie en identificatie van Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus in monsters van symptoomloze aardappelplanten

2. VISUEEL ONDERZOEK NAAR RINGROTSYMPTOMEN

2.1. Aardappelplanten

In ons Europese klimaat worden symptomen zelden in het veld aangetroffen en dan vaak nog slechts aan het eind van het seizoen. Bovendien worden de symptomen dikwijls gemaskeerd of vertroebeld door andere ziekten, veroudering of mechanische schade. Daarom kunnen de symptomen bij veldinspecties gemakkelijk worden gemist. De verwelkingssymptomen verschillen sterk van die van bruinrot; de verwelking verloopt doorgaans traag en beperkt zich in eerste instantie tot de bladranden. Jonge geïnfecteerde bladeren blijven vaak doorgroeien, maar minder in de geïnfecteerde delen. Daardoor krijgen de bladeren een afwijkende vorm. Wanneer het vaatweefsel in de stengel geblokkeerd is, vertonen de bladeren daarboven vaak een bleekgele tot oranje verkleuring in de zones tussen de nerven. Geïnfecteerde blaadjes, bladeren en zelfs stengels kunnen uiteindelijk afsterven. Vaak zijn de bladeren en knollen alleen wat kleiner dan normaal. Soms treedt dwerggroei op. Kleurenfoto's van diverse symptomen kunnen worden bekeken op de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

2.2. Aardappelknollen

De eerste symptomen zijn een lichte glazigheid of doorschijnendheid van het weefsel, zonder verzachting rond het vaatstelsel, vooral bij de navel. De vaatring bij het naveleinde kan iets donkerder van kleur zijn dan normaal. Het eerste gemakkelijk te herkennen symptoom is een geelachtige verkleuring van de vaatring en kolommetjes van kaasachtig materiaal dat uit de vaten komt wanneer er zacht in de knol geknepen wordt. Deze afscheiding bevat miljoenen bacteriën. Het vaatweefsel kan bruin worden en de symptomen die de knollen in dit stadium vertonen, lijken op die van bruinrot door Ralstonia solanacearum. Aanvankelijk kunnen deze symptomen beperkt blijven tot een deel van de ring, dat overigens niet dicht bij het naveleinde hoeft te liggen, waarna zij zich geleidelijk kunnen uitbreiden tot de hele ring. Naarmate de infectie voortschrijdt wordt het vaatweefsel vernietigd. De buitencortex kan loskomen van de binnencortex. In de gevorderde stadia van de infectie ontstaan er barsten aan het oppervlak van de knol, die vaak aan de randen roodachtig bruin zijn. Recentelijk hebben zich in Europa verscheidene gevallen voorgedaan waarbij in de centrale cortex en de vaatring tegelijk verrotting optrad, met als gevolg secundaire invasie met inwendige uitholling en necrose. Een secundaire aantasting door schimmels of bacteriën kan de symptomen maskeren en het kan moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, gevorderde ringrotsymptomen te onderscheiden van andere soorten knolrot. Er kunnen atypische symptomen voorkomen. Kleurenfoto's van diverse symptomen kunnen worden bekeken op de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. BEREIDING VAN DE MONSTERS

3.1. Aardappelknollen

Opmerkingen:

— De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. Intensievere bemonstering houdt in dat er meer testen op monsters van deze grootte worden genomen. Wanneer een groter aantal knollen wordt genomen, treedt remming op of zijn de resultaten moeilijk te interpreteren. De procedure is echter ook goed toepasbaar voor monsters van minder dan 200 knollen, wanneer er niet zo veel beschikbaar zijn.

— De hierna beschreven detectiemethoden zijn gevalideerd met monsters van 200 knollen.

— Het hierna beschreven aardappelextract kan ook worden gebruikt voor de detectie van de bruinrotbacterie, Ralstonia solanacearum.

De optimale voorbereiding met het oog op de bereiding van het monster is als volgt.

Was de knollen. Gebruik geschikte ontsmettingsmiddelen (wanneer een PCR-test uitgevoerd zal worden chloorverbindingen om eventueel aanwezig pathogeen-DNA te verwijderen) en reinigingsmiddelen na elk monster. Laat de knollen aan de lucht drogen. Deze wasprocedure is vooral nuttig, maar niet verplicht, voor monsters met veel aanhangende grond en als een PCR-test of directe isolatie moet worden uitgevoerd.

3.1.1. Verwijder met een schoon, ontsmet scalpel of aardappelschilmes de schil aan het naveleinde van elke knol, zodat het vaatweefsel zichtbaar wordt. Snijd voorzichtig een kleine kegelvormige kern vaatweefsel uit het naveleinde van elke knol en zorg er daarbij voor dat deze zo weinig mogelijk niet-vaatweefsel bevat (zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

NB:

Houd (rottende) knollen met verdachte symptomen apart en test die afzonderlijk.

Als bij het uitsnijden van het naveleindstukje voor ringrot verdachte symptomen worden waargenomen, moet de knol visueel worden onderzocht na bij de navel te zijn doorgesneden. Doorgesneden knollen met verdachte symptomen moet men ten minste twee dagen bij kamertemperatuur laten verkurken waarna zij onder quarantaineomstandigheden bij 4-10 °C worden bewaard totdat alle testen zijn uitgevoerd. Alle knollen van het monster, ook die met verdachte symptomen, moeten overeenkomstig bijlage II worden bewaard.

3.1.2. Verzamel de naveleindstukjes in ongebruikte, afsluitbare en/of verzegelbare wegwerpcontainers (als de containers wel opnieuw gebruikt worden, moeten ze grondig worden gereinigd en met chloorverbindingen worden ontsmet. De naveleindstukjes moeten bij voorkeur direct worden verwerkt. Is dat niet mogelijk, dan moeten zij zonder toevoeging van buffer in de container worden bewaard; gekoeld mogen zij hooguit 72 uur worden bewaard, bij kamertemperatuur hooguit 24 uur. Door droging en verkurking van de stukjes en groei van saprofyten tijdens de opslag kan de detectie van de ringrotbacterie bemoeilijkt worden.

3.1.3. Verwerk de naveleindstukjes volgens een van onderstaande procedures:

a) overgiet de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 3) en schud 4 uur (bij minder dan 24 °C) dan wel 16-24 uur (gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of

b) homogeniseer de stukjes met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer in een blender (bv. Waring of Ultra Thurax) of door ze fijn te maken in een afgesloten wegwerpbaar maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba sterk polytheen, 150 mm × 250 mm; d.m.v. straling gesteriliseerd) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex).

NB:

Bij gebruik van een blender is er een groot risico op kruisbesmetting tussen de monsters. Neem maatregelen om aërosolvorming en morsen tijdens de extractie te vermijden. Voor elk monster moeten pas gesteriliseerde blendermessen en vaten gebruikt worden. Als de PCR-test wordt gedaan, moet worden vermeden dat er DNA in de containers of maalapparatuur terechtkomt. Aanbevolen wordt om in geval van de PCR-test het materiaal in wegwerpzakken fijn te maken en wegwerpbuizen te gebruiken.

3.1.4. Schenk de bovenstaande vloeistof af. Als de vloeistof erg troebel is, wordt dit verholpen door centrifugeren bij laag toerental (maximaal 180 g gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 4-10 °C of vacuümfiltratie (40-100 µm) waarbij het filter met ongeveer 10 ml extractiebuffer (aanhangsel 3) wordt nagespoeld.

3.1.5. Concentreer de bacteriefractie door centrifugeren bij 7 000 g gedurende 15 minuten (of 10 000 g gedurende 10 minuten) bij een temperatuur van 4-10 °C. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren.

3.1.6. Resuspendeer de pellet in 1,5 ml pelletbuffer (aanhangsel 3). Gebruik 500 µl voor C. m. ssp. sepedonicus, 500 µl voor Ralstonia solanacearum en 500 µl voor referentiedoeleinden. Voeg aan het referentiealiquot van 500 µl en aan het niet-gebruikte analysealiquot steriele glycerol toe tot een eindconcentratie van 10-25 % (V/V), vortex en bewaar tussen –16 en –24 °C (enkele weken) of –68 en –86 °C (enkele maanden). Bewaar de analysealiquots tijdens het onderzoek bij 4-10 °C.

Herhaald invriezen en ontdooien wordt niet aangeraden.

Als het extract moet worden vervoerd, moet het binnen 24 à 48 uur in een koelbox worden afgeleverd.

3.1.7. Het is noodzakelijk dat alle positieve controles en monsters van C. m. ssp. sepedonicus gescheiden behandeld worden om contaminatie te voorkomen. Dit geldt voor de IF-glaasjes en voor alle testen.

3.2. Aardappelplanten

NB:

Voor de detectie van latente C. m. ssp. sepedonicus-populaties wordt aangeraden samengestelde monsters te testen. De methode is goed bruikbaar voor samengestelde monsters van maximaal 200 stengeldelen. (Surveyonderzoeken moeten gebaseerd zijn op een statistisch representatieve steekproef van de onderzochte plantenpopulatie.)

3.2.1. Snijd met een schoon, ontsmet mes of dito snoeischaar een stuk van 1 à 2 cm van het onderste deel van de stengel af, vlak boven het bodemniveau.

Ontsmet de stengeldelen kort met ethanol 70 % en dep ze direct droog met tissuepapier.

Doe de stengeldelen in een gesloten steriele container overeenkomstig de onderstaande bemonsteringsprocedures.

3.2.2. Verwerk de stengeldelen volgens een van de volgende procedures:

a) overgiet de stengeldelen met voldoende (ongeveer 40 ml) extractiebuffer (aanhangsel 3) en schud 4 uur (bij minder dan 24 °C) dan wel 16-24 uur (gekoeld) in een rondschudapparaat (50-100 rpm), of

b) verwerk de stengeldelen onmiddellijk door ze fijn te maken in een sterk maceratiezakje (bv. Stomacher of Bioreba) met voldoende extractiebuffer (aanhangsel 3) met een rubberen hamer of geschikte maalapparatuur (bv. Homex). Is dit niet mogelijk, dan kunnen zij gekoeld hooguit 72 uur worden bewaard en bij kamertemperatuur hooguit 24 uur.

3.2.3. Laat 15 minuten bezinken en schenk de bovenstaande vloeistof af.

3.2.4. Het is doorgaans niet nodig het extract verder te zuiveren of de bacteriefractie te concentreren; desgewenst kan dit worden gedaan door filtratie en/of centrifugering zoals beschreven onder 3.1.4-3.1.6.

3.2.5. Verdeel het oorspronkelijke of geconcentreerde monsterextract in twee gelijke delen. Houd de ene helft gedurende het onderzoek op 4-10 °C en bewaar de andere helft na toevoeging van 10-25 % (V/V) steriele glycerol tussen –16 en –24 °C (enkele weken) of –68 en –86 °C (enkele maanden) voor het geval verder onderzoek nodig is.

4. IF-TEST

Principe

De IF-test wordt als eerste screeningtest aanbevolen vanwege de aangetoonde robuustheid ten opzichte van de vereiste drempelwaarden.

Wanneer de IF-test als eerste screeningtest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede screeningtest een PCR- of FISH-test worden gedaan. Wanneer de IF-test als tweede screeningtest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd voor de verdere analysen.

NB:

Gebruik altijd een polyklonaal antilichaam als de IF-test de eerste screeningtest is. Bij een positieve IF-test met een polyklonaal antilichaam kan verder screenen van het monster met een monoklonaal antilichaam de specificiteit verhogen, al kan dit ten koste gaan van de gevoeligheid.

Gebruik antilichamen tegen een referentiestam van C. m. ssp. sepedonicus. Aanbevolen wordt van elke nieuwe partij antilichamen de titer te bepalen. De titer wordt gedefinieerd als de hoogste verdunning waarbij een optimale reactie optreedt bij het testen van een suspensie met 105-106 cellen/ml van de homologe stam van C. m. ssp. sepedonicus met een geschikt fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-conjugaat, overeenkomstig de aanbevelingen van de fabrikant. De ruwe polyklonale of monoklonale antilichamen moeten een IF-titer hebben van ten minste 1:2 000. Bij het onderzoek moeten de antilichamen worden gebruikt in werkverdunningen rond de titer. Gebruik gevalideerde antilichamen (zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

De test moet worden uitgevoerd op vers bereide monsterextracten. Zo nodig kan de test ook goed worden uitgevoerd op extracten die tussen –68 en –86 °C in glycerol zijn bewaard. De glycerol kan uit het monster worden verwijderd door toevoegen van 1 ml pelletbuffer (aanhangsel 4), centrifugeren bij 7 000 g gedurende 15 minuten en resuspensie in een gelijk volume pelletbuffer. Dit is vaak niet nodig, met name als de monsters op de objectglaasjes worden gefixeerd door ze door de vlam te halen (zie 2.2).

Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van C. m. ssp. sepedonicus, gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 2, en eventueel in buffervloeistof.

Natuurlijk geïnfecteerd weefsel (geconserveerd door vriesdrogen of invriezen bij –16 tot –24 °C) moet zo mogelijk als soortgelijke controle op hetzelfde glaasje worden gebruikt.

Als negatieve controles worden aliquots monsterextract gebruikt waarbij eerdere testen negatief waren.

Gebruik microscoopglaasjes met meerdere venstertjes, bij voorkeur tien venstertjes met een diameter van minstens 6 mm.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

4.1. Prepareer de objectglaasjes volgens een van onderstaande procedures:

i) voor pellets met betrekkelijk weinig zetmeelsediment: Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm — vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van een 1:100-verdunning van de geresuspendeerde aardappelpellet op het eerste venstertje. Pipetteer vervolgens eenzelfde volume onverdunde pellet (1/1) op de resterende venstertjes van de rij. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 1.

ii) voor andere pellets: Maak decimale oplossingen, (1:10 en 1:100) van de geresuspendeerde pellet in pelletbuffer. Pipetteer een afgemeten standaardvolume (15 µl is genoeg voor een venstertje met een diameter van 6 mm — vergroot het volume voor grotere venstertjes naar rato) van de geresuspendeerde pellet en van elke verdunning op een rij venstertjes. De tweede rij kan worden gebruikt voor duplo's of voor een tweede monster zoals aangegeven in figuur 2.

4.2. Laat de druppels bij kamertemperatuur of door verwarming tot 40-45 °C drogen. Fixeer de bacteriecellen op het glaasje door het te verwarmen (15 minuten op 60 °C), door de vlam te halen, met ethanol 95 % of volgens de specifieke aanwijzingen van de leverancier van de antilichamen.

Zo nodig kunnen de gefixeerde glaasjes hierna bevroren in een doos met droogmiddel bewaard worden voor verder onderzoek (dit mag niet langer dan nodig en hooguit drie maanden duren).

IF-procedure

i) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 4.1, onder i): Maak een reeks tweevoudige verdunningen van het antilichaam in IF-buffer. Het eerste venstertje krijgt de helft van de titer (T/2) en de volgende een kwart van de titer (T/4), de helft daarvan (T/2), de titer (T) en tweemaal de titer (2T).

ii) Bij het prepareren van objectglaasjes volgens 4.1, onder ii): Maak de werkverdunning van het antilichaam aan in IF-buffer. De werkverdunning beïnvloedt de specificiteit.

Figuur 1. Prepareren van het objectglaasje volgens 4.1, onder i) en 4.3, onder i)

Verdunningen van geresuspendeerde pellet 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Verdunning van geresuspendeerde pellet (T = titer) T/2 T/4 T/2 T 2T  Tweevoudige verdunningen van antiserum/antilichaam Monster 1 1 2 3 4 5 Duplo van monster 1, of monster 2 6 7 8 9 10





Figuur 2. Prepareren van het objectglaasje volgens 4.1, onder ii) en 4.3, onder ii)

Werkverdunning van antiserum/antilichaam 1/1 1/10 1/100 leeg leeg  Decimale verdunning van geresuspendeerde pellet Monster 1 1 2 3 4 5 Duplo van monster 1, of monster 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Leg de microscoopglaasjes op vochtig papier. Bedek alle testvenstertjes volledig met de antilichaamverdunning(en). Het op elk venstertje aangebrachte volume antilichaam moet ten minste gelijk zijn aan het volume aangebracht extract.

Wanneer de leverancier van de antilichamen geen specifieke aanwijzingen heeft verstrekt, moet de volgende procedure worden gevolgd.

4.3.2. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 °C).

4.3.3. Schud de druppels van elk glaasje af en spoel de glaasjes zorgvuldig met IF-buffer. Was door onderdompeling 5 minuten in IF-buffer-Tween (aanhangsel 3) en vervolgens 5 minuten in IF-buffer. Vermijd aërosolvorming en druppeloverdracht waardoor kruisbesmetting kan optreden. Verwijder overtollig vocht zorgvuldig door zachtjes af te deppen.

4.3.4. Leg de glaasjes op vochtig papier. Bedek alle venstertjes met de verdunning van het FITC-conjugaat die gebruikt werd om de titer te bepalen. Het op de venstertjes aangebrachte volume conjugaat moet identiek zijn met het volume aangebracht antilichaam.

4.3.5. Incubeer de glaasjes op vochtig papier afgedekt gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 °C).

4.3.6. Schud de druppels conjugaat van het glaasje af. Spoel af en was als voorheen (punt 4.3.3).

Verwijder overtollig vocht zorgvuldig.

4.3.7. Pipetteer 5-10 µl van 0,1 M fosfaatgebufferde glycerol (aanhangsel 3), of een commercieel verkrijgbaar antifading inbedmiddel, op elk venstertje en breng een dekglaasje aan.

Aflezen van de IF-test

4.4.1. Beoordeel de glaasjes met een epifluorescentiemicroscoop die voorzien is van geschikte filters voor excitatie van FITC. Gebruik een geschikt olie- of water-immersieobjectief voor een totale vergroting van 500-1 000 ×. Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden.

Onderzoek eerst het positieve controleglaasje. De cellen moeten helder fluorescerend en volledig gekleurd zijn bij de bepaalde antilichaamtiter of werkverdunning. De IF-test (deel 4) moet herhaald worden bij afwijkende kleuring.

4.4.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor C. m. ssp. sepedonicus kenmerkende morfologie (zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan, of beter dan, die van de positieve controlestam bij dezelfde antilichaamverdunning. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden.

Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes.

4.4.3. Aan de immunofluorescentietest zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden vaak achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën gevonden die qua grootte en morfologie lijken op C. m. ssp. sepedonicus.

4.4.4. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie bij de titer of werkverdunning van de antilichamen zoals aangegeven in punt 4.3.

4.4.5. Interpretatie van de IF-test

i) Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 4). De IF-uitslag is positief als het monster ten minste 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat. Het monster wordt als mogelijk besmet aangemerkt en moet nader onderzocht worden.

ii) De IF-test is negatief als het monster minder dan 5 × 103 cellen per ml geresuspendeerde pellet bevat; het monster wordt als negatief aangemerkt. Verder onderzoek is dan niet nodig.

5. FISH-TEST

Principe

Wanneer de FISH-test als eerste screeningtest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningtest een IF-test worden gedaan. Wanneer de FISH-test als tweede screeningtest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

NB:

Gebruik gevalideerde C. m. ssp. sepedonicus-specifieke oligo-probes (aanhangsel 7). Bij de voorbereidende testen met deze methode moeten minstens 103-104 cellen van C. m. ssp. sepedonicus per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden.

De onderstaande procedure wordt bij voorkeur uitgevoerd op vers bereid monsterextract maar kan ook goed worden uitgevoerd op monsterextract dat in glycerol bewaard is tussen –16 en –24 °C of –68 en –86 °C.

Als negatieve controles worden aliquots monsterextract gebruikt waarbij eerdere testen op C. m. ssp. sepedonicus negatief waren.

Als positieve controles worden suspensies bereid met 105-106 cellen/ml van C. m. ssp. sepedonicus (bv. stam NCPPB 4053 of PD 406) in 0,01 M fosfaatbuffer (PB) van een drie- tot vijfdaagse cultuur (voor de bereiding zie aanhangsel 2). Maak afzonderlijke positieve controleglaasjes van de homologe stam of een andere referentiestam van C. m. ssp. sepedonicus, gesuspendeerd in aardappelextract, zoals beschreven in aanhangsel 2.

Het gebruik van de FITC-gelabelde eubacteriële oligo-probe kan als controle voor het hybridisatieproces dienen, omdat hierdoor alle eubacteriën in het monster worden gekleurd.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

5.1. Fixatie van het aardappelextract

Het volgende protocol is gebaseerd op Wullings e.a., (1998):

5.1.1. Bereid het fixatief (aanhangsel 7).

5.1.2. Pipetteer 100 µl van elk monsterextract in een eppendorfbuisje en centrifugeer 8 minuten bij 7 000 g.

5.1.3. Verwijder de bovenstaande vloeistof en los de pellet op in 500 µl korter dan 24 uur tevoren bereid fixatief. Vortex en incubeer overnacht bij 4 °C.

Een alternatief fixatief is ethanol 96 %. In dat geval wordt de pellet van punt 5.1.2. opgelost in 50 µl 0,01 M fosfaatbuffer en 50 µl ethanol 96 %. Vortex en incubeer 30-60 minuten bij 4 °C.

5.1.4. Centrifugeer 8 minuten bij 7 000 g, schenk de bovenstaande vloeistof af en resuspendeer de pellet in 75 µl 0,01 M PB (zie aanhangsel 3).

5.1.5. Breng 16 µl van de gefixeerde suspensies op een schoon objectglaasje met venstertjes zoals aangegeven in figuur 3. Breng twee verschillende monsters op het glaasje, onverdund en in een 1:100-verdunning (gebruik hiervoor 10 µl in 0,01 M PB). De resterende monsteroplossing (49 µl) kan na toevoeging van eenzelfde volume ethanol 96 % bij –20 °C worden bewaard. Als de FISH-test herhaald moet worden, wordt de ethanol door centrifugeren verwijderd en een gelijk deel 0,01 M PB toegevoegd en door vortexen gemengd.

Figuur 3. Overzicht van het FISH-glaasje

Monster 1 Blanco Blanco Blanco Monster 2 venster 1 venster 2 venster 3 venster 4 venster 5 Monster 1 Blanco Blanco Blanco Monster 2 venster 6 venster 7 venster 8 venster 9 venster 10 Dekglaasje 1 Dekglaasje 2

5.1.6. Droog de glaasjes aan de lucht (of op een droger bij 37 °C) en fixeer ze door ze door de vlam te halen.

Op dit punt kan de procedure worden onderbroken om de volgende dag verder te gaan met de hybridisatie. De objectglaasjes moeten stofvrij en droog bij kamertemperatuur worden bewaard.

5.2. Prehybridisatie en hybridisatie

5.2.1. Bereid een oplossing van 10 mg lysozym (Sigma L-6876) in 10 ml water (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Deze oplossing kan worden bewaard, maar mag niet meer dan één keer worden bevroren en ontdooid. Bedek elk venstertje met ongeveer 50 µl lysozym-oplossing en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dompel de glaasjes vervolgens eenmaal in gedemineraliseerd water en dep ze droog met filtreerpapier.

In plaats van lysozym kan ook 50 µl van een oplossing van 40-400 µg ml-1 proteïnase K in buffer (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) op elk venstertje worden aangebracht, waarna 30 minuten bij 37 °C wordt geïncubeerd.

5.2.2. Dehydrateer de cellen in een ethanolreeks (50 %, 80 %, 96 %, telkens 1 minuut). Droog de glaasjes aan de lucht in een houder.

5.2.3. Maak een vochtige incubatiekamer door de bodem van een luchtdicht vat te bedekken met tissue- of filtreerpapier, doordrenkt met 1x hybmix (aanhangsel 7). Pre-incubeer het vat in de hybridisatieoven gedurende ten minste 10 minuten bij 55 °C.

5.2.4. Bereid de hybridisatieoplossing (aanhangsel 7), reken 45 µl per glaasje, en pre-incubeer 5 minuten bij 55 °C.

5.2.5. Plaats de glaasjes op een op 45 °C ingestelde verwarmingsplaat en breng 10 µl hybridisatieoplossing aan op elk van de vier venstertjes op het glaasje of de glaasjes.

5.2.6. Breng twee dekglaasjes (24 × 24 mm) op elk objectglaasje aan zonder lucht in te sluiten. Plaats de objectglaasjes in de voorverwarmde incubatiekamer en hybridiseer overnacht in de oven in het donker bij 55 °C.

5.2.7. Bereid drie bekerglazen met 1 l ultrazuiver water (UPW), 1 l 1x hybmix (334 ml 3x hybmix en 666 ml UPW) en 1 l 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix en 833 ml UPW). Pre-incubeer elk bekerglas in een waterbad bij 55 °C.

5.2.8. Verwijder de dekglaasjes van de objectglaasjes en plaats de objectglaasjes in een houder.

5.2.9. Verwijder de overmaat probe door 15 minuten bij 55 °C te incuberen in het bekerglas met 1x hybmix.

5.2.10. Plaats de houder in de 1/2x hybmix wasoplossing en incubeer nogmaals 15 minuten.

5.2.11. Dompel de objectglaasjes even in UPW en leg ze op filtreerpapier. Verwijder overtollige vloeistof door het oppervlak voorzichtig met filtreerpapier te bedekken. Pipetteer 5-10 μl antifading inbedmiddel (bv. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA of gelijkwaardig) op elk venstertje en plaats een groot dekglaasje (24 × 60 mm) op het objectglaasje.

5.3. Aflezen van de FISH-test

5.3.1. Beoordeel de objectglaasjes onmiddellijk met een microscoop die geschikt is voor epifluorescentiemicroscopie bij een vergroting van 630 of 1000x en olie-immersie. Met een filter dat geschikt is voor fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) lichten eubacteriële cellen (waaronder de meeste gramnegatieve cellen) in het monster groen op. Met een filter voor tetramethylrodamine-5-isothiocyanaat lichten Cy3-gekleurde cellen van C. m. ssp. sepedonicus rood op. Vergelijk de celmorfologie met die van de positieve controles. De cellen moeten helder fluoresceren en volledig gekleurd zijn. De FISH-test (deel 9.4) moet herhaald worden bij afwijkende kleuring. Bekijk de venstertjes langs twee diameters in een rechte hoek en rond de omtrek. Onderzoek bij monsters zonder of met een gering aantal cellen ten minste 40 microscoopvelden.

5.3.2. Kijk vervolgens in de testvenstertjes van de objectglaasjes uit naar helder fluorescerende cellen met een voor C. m. ssp. sepedonicus kenmerkende morfologie (zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). De intensiteit van de fluorescentie moet gelijkwaardig zijn aan, of beter dan, die van de positieve controlestam. Cellen met onvolledige kleuring of met een zwakke fluorescentie moeten genegeerd worden.

5.3.3. Als contaminatie wordt vermoed, moet de test herhaald worden. Dit kan het geval zijn als alle glaasjes in een partij positieve cellen vertonen doordat de buffer gecontamineerd is, of als er positieve cellen worden aangetroffen op de coating van het glaasje buiten de venstertjes.

5.3.4. Aan de FISH-test zijn verschillende problemen verbonden wat de specificiteit betreft. In pellets van naveleindstukjes en stengeldelen van aardappel worden soms, maar veel minder vaak dan bij de IF-test, achtergrondpopulaties van fluorescerende cellen met atypische morfologie en kruisreagerende saprofytische bacteriën gevonden die qua grootte en morfologie lijken op C. m. ssp. sepedonicus.

5.3.5. Besteed alleen aandacht aan fluorescerende cellen met een karakteristieke grootte en morfologie, zie punt 5.3.2.

5.3.6. Interpretatie van het resultaat van de FISH-test

i) De resultaten van de FISH-test zijn valide als, in alle positieve controles en in geen van de negatieve controles, met het FITC-filter heldergroen fluorescerende cellen met een voor C. m. ssp. sepedonicus karakteristieke grootte en morfologie worden waargenomen en met het rodaminefilter helderrood fluorescerende cellen. Wanneer er helder fluorescerende cellen met een karakteristieke morfologie worden aangetroffen, bepaal dan het gemiddelde aantal typische cellen per microscoopveld en bereken het aantal typische cellen per ml geresuspendeerde pellet (aanhangsel 4). Monsters met ten minste 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als mogelijk besmet aangemerkt. Er is dan verder onderzoek nodig. Monsters met minder dan 5 × 103 typische cellen per ml geresuspendeerde pellet worden als negatief aangemerkt.

ii) De FISH-test is negatief als met het rodaminefilter geen helderrood fluorescerende cellen die karakteristiek zijn voor C. m. ssp. sepedonicus, mits die wel met dat filter in de positieve controlepreparaten zijn waargenomen.

6. PCR-TEST

Principe

Wanneer de PCR-test als eerste screeningtest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet als tweede verplichte screeningtest een IF-test worden gedaan. Wanneer de PCR-test als tweede screeningtest gebruikt wordt en de uitslag positief is, moet het stroomdiagram worden gevolgd om de diagnose af te ronden.

Het wordt aangeraden deze methode alleen algemeen als eerste screeningtest te gebruiken als er voldoende gespecialiseerde ervaring mee is opgedaan.

NB:

Bij de voorbereidende testen met deze methode moeten 103-104 cellen van C. m. ssp. sepedonicus per ml, toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden. Er kunnen optimalisatieproeven nodig zijn om in alle laboratoria een maximale gevoeligheid en specificiteit te bereiken.

Gebruik gevalideerde PCR-reagentia en -protocollen. Kies bij voorkeur een methode met een interne controle.

Neem de nodige voorzorgen om contaminatie van het monster met doel-DNA te vermijden. De PCR-test moet worden uitgevoerd door ervaren analisten in speciale moleculair-biologische laboratoria om de kans op contaminatie met doel-DNA tot een minimum te beperken.

Negatieve controles (bij de DNA-extractie en de PCR-procedure) moeten altijd op dezelfde wijze worden behandeld als de uiteindelijke monsters, om na te gaan of er verontreiniging met DNA is opgetreden.

In de PCR-test moeten de volgende negatieve controles worden meegenomen:

— monsterextract waarbij een eerdere test op C. m. ssp. sepedonicus negatief was;

— controles met de buffer die bij de extractie van de bacterie en het DNA uit het monster is gebruikt;

— PCR-reactiemix.

Als positieve controles moeten worden genomen:

— aliquots van geresuspendeerde pellets waaraan C. m. ssp. sepedonicus is toegevoegd (voor de bereiding zie aanhangsel 2);

— een suspensie van 106 cellen/ml van C. m. ssp. sepedonicus in water uit een virulent isolaat (bv. NCPPB 2140 of NCPPB 4053);

— gebruik zo mogelijk ook DNA dat is geëxtraheerd uit positieve controlemonsters in de PCR-test.

Om contaminatie te vermijden moeten de positieve controles in een andere ruimte worden bereid dan de analysemonsters.

De monsterextracten moeten zo veel mogelijk vrij van grond zijn. Het kan dus soms raadzaam zijn om extracten uit gewassen aardappelen te bereiden als er PCR-protocollen gebruikt zullen worden.

6.1. DNA-zuiveringsmethoden

Maak gebruik van positieve en negatieve controlemonsters zoals hierboven beschreven.

Bereid het controlemateriaal op precies dezelfde wijze als monstermateriaal.

Er zijn diverse methoden beschikbaar voor het zuiveren van doel-DNA uit complexe monstersubstraten, waarbij remmers van de PCR en andere enzymatische reacties worden verwijderd en het doel-DNA in het monsterextract wordt geconcentreerd.

De volgende methode is geoptimaliseerd voor gebruik met de gevalideerde PCR-methode als beschreven in aanhangsel 6.

6.1.a) Methode volgens Pastrik (2000)

1. Pipetteer 220 µl lysisbuffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) in een eppendorfbuisje van 1,5 ml.

2. Voeg 100 µl monsterextract toe en plaats het buisje 10 minuten in een verwarmingsblok of waterbad op 95 °C.

3. Koel het buisje 5 minuten op ijs.

4. Voeg 80 µl lysozym-voorraadoplossing (50 mg lysozym per ml in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toe en incubeer 30 minuten bij 37 °C.

5. Voeg 220 µl Easy DNA® solution A (Invitrogen) toe, vortex grondig en incubeer 30 minuten bij 65 °C.

6. Voeg 100 µl Easy DNA® solution B (Invitrogen), vortex krachtig tot het neerslag vrij in het buisje beweegt en het monster gelijkmatig viskeus is.

7. Voeg 500 µl chloroform toe en vortex tot de viscositeit afneemt en het mengsel homogeen is.

8. Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 °C om de fasen te scheiden en de interfase te vormen.

9. Breng de bovenste fase over in een schoon eppendorfbuisje.

10. Voeg 1 ml ethanol 100 % (–20 °C) toe, vortex kort en incubeer 10 minuten op ijs.

11. Centrifugeer 20 minuten bij 15 000 g en 4 °C en verwijder de ethanol van de pellet.

12. Voeg 500 µl ethanol 80 % (–20 °C) en meng door het buisje om te keren.

13. Centrifugeer 10 minuten bij 15 000 g en 4 °C, bewaar de pellet en verwijder de ethanol.

14. Droog de pellet aan de lucht of in een DNA Speed Vac.

15. Resuspendeer de pellet in 100 µl steriel UPW en laat minstens 20 minuten bij kamertemperatuur staan.

16. Bewaar bij –20 °C voor de PCR.

17. Draai eventueel aanwezig wit neerslag af in een centrifuge en gebruik 5 µl van de bovenstaande vloeistof, die het DNA bevat, voor de PCR.

6.1.b) Andere methoden

Er kunnen andere DNA-extractiemethoden (bv. Qiagen DNeasy Plant Kit) worden gebruikt, mits die even doeltreffend blijken te zijn bij het zuiveren van DNA uit controlemonsters met 103-104 pathogene cellen/ml.

6.2. PCR

6.2.1. Bereid analyse- en controletemplates voor de PCR volgens het gevalideerde protocol (aanhangsel 6). Bereid een tienvoudige verdunning van monster-DNA-extract (1:10 in UPW).

6.2.2. Bereid de geschikte PCR-reactiemix in een contaminatievrije omgeving volgens het gepubliceerde protocol (aanhangsel 6). Het gevalideerde PCR-protocol is een multiplexreactie die ook een interne PCR-controle omvat.

6.2.3. Voeg 5 µl DNA-extract per 25 µl PCR-reactiemix in steriele PCR-buisjes.

6.2.4. Neem ook een negatief controlemonster mee met alleen PCR-reactiemix; voeg hieraan in plaats van het monster UPW toe uit dezelfde bron als in de PCR-mix is gebruikt.

6.2.5. Plaats de buisjes in hetzelfde PCR-apparaat als voor de voorbereidende testen is gebruikt en werk het geoptimaliseerde PCR-programma af (aanhangsel 6).

6.3. Analyse van het PCR-product

6.3.1. Scheid de amplicons met behulp van agarosegelelektroforese. Laat minimaal 12 µl geamplificeerd DNA-reactiemengsel van elk monster, gemengd met 3 µl laadbuffer (aanhangsel 6) lopen in 2,0 % (m/V) agarosegels in TAE-buffer (Tris-acetaat-EDTA, aanhangsel 6) bij 5-8 V/cm. Gebruik een geschikte DNA-marker, bv. 100 bp ladder.

6.3.2. Maak de DNA-banden zichtbaar door kleuren met ethidiumbromide (0,5 mg/l) gedurende 30-45 minuten. Deze stof is mutageen — neem de nodige voorzorgen in acht.

6.3.3. Onderzoek de gekleurde gel door transilluminatie met kortgolvig UV (bv. λ = 302 nm) op geamplificeerde PCR-producten van de verwachte lengte (aanhangsel 6) en leg het resultaat vast.

6.3.4. Ga bij alle nieuwe bevindingen/gevallen na of het PCR-amplicon authentiek is met behulp van een restrictie-enzymanalyse op een monster van het resterende geamplificeerde DNA door dat bij de optimale temperatuur en gedurende de optimale tijd met een geschikt enzym en geschikte buffer (zie aanhangsel 6) te incuberen. Scheid de verkregen fragmenten met behulp van agarosegelelektroforese zoals hierboven beschreven; bekijk het karakteristieke restrictiefragmentenpatroon onder UV-transilluminatie na kleuring met ethidiumbromide en vergelijk dit met de niet-gedigesteerde en de gedigesteerde positieve controle.

Interpretatie van het resultaat van de PCR-test:

De PCR-test is negatief als er geen C. m. ssp. sepedonicus-specifiek PCR-amplicon van de verwachte lengte wordt aangetroffen in het analysemonster, maar wel in alle positieve controlemonsters (bij multiplex-PCR met plantspecifieke interne controleprimers moet er een tweede PCR-product van de verwachte lengte met het analysemonster geamplificeerd zijn).

De PCR-test is positief als het C. m. ssp. sepedonicus-specifieke PCR-amplicon van de verwachte lengte en met het verwachte restrictiepatroon (indien nodig) wordt aangetoond, mits dit niet in een van de negatieve controlemonsters geamplificeerd is. Een positief resultaat kan ook op betrouwbare wijze worden bevestigd door de test met een tweede set PCR-primers te herhalen (deel 9.3).

NB:

Als het verwachte amplicon wel bij het positieve controlemonster met C. m. ssp. sepedonicus in water wordt verkregen, maar niet bij de positieve controles met C. m. ssp. sepedonicus in aardappelextract, is remming van de PCR waarschijnlijk de oorzaak. Bij multiplex-PCR-protocollen met interne PCR-controles is er waarschijnlijk sprake van remming als geen van beide amplicons worden verkregen.

Er moet aan contaminatie worden gedacht als het verwachte amplicon in een of meer van de negatieve controles wordt gevonden.

7. BIOASSAY

NB:

Bij de voorbereidende testen met deze methode moeten 103-104 kolonievormende eenheden van C. m. ssp. sepedonicus per ml, die zijn toegevoegd aan monsterextracten waarbij een eerdere test negatief was, reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden (voor de bereiding zie aanhangsel 2).

De grootste detectiegevoeligheid wordt verkregen met vers bereid monsterextract en optimale groeicondities. De methode kan echter ook goed worden toegepast op extracten die tussen –68 en –86 °C in glycerol zijn bewaard.

Sommige auberginerassen vormen een voortreffelijk selectief ophopingsmedium voor de groei van C. m. ssp. sepedonicus, ook als er geen symptomen aanwezig zijn, en kunnen goed dienst doen voor een bevestigingstest op waardplanten.

De groeicondities moeten optimaal zijn om de kans op fout-negatieve testuitslagen tot een minimum te beperken.

Voor nadere bijzonderheden over het kweken zie aanhangsel 8.

7.1. Verdeel het resterende analysealiquot van de geresuspendeerde pellet van deel 3.1.6 of 3.2.5 in zijn geheel over een aantal aubergines volgens een van de hierna beschreven methoden (7.3 of 7.4). Gebruik alleen planten in het 2- tot volgroeid 3-bladstadium. Om de geresuspendeerde pellet helemaal te gebruiken en de inoculatie doeltreffend te laten verlopen, zijn voor de onderstaande procedures per monster 15-25 aubergineplanten nodig.

7.2. Geef de aubergines een à twee dagen vóór de inoculatie geen water om de turgor te verminderen.

Snede-inoculatie

7.3.1. Houd de plant tussen twee vingers en pipetteer een druppel (ongeveer 5-10 µl) van de gesuspendeerde pellet op de stengel tussen de zaadlobben en het eerste blad.

7.3.2. Maak met een steriel scalpel vanaf de pelletdruppel een diagonale snede van ongeveer 1,0 cm lang en ongeveer 2/3 van de stengeldikte diep.

7.3.3. Stop de snede dicht met steriele vaseline uit een injectiespuit.

7.4. Injectie-inoculatie

Inoculeer de auberginestengels net boven de zaadlobben met een injectiespuit voorzien van een hypodermische naald (minimaal 23G). Verdeel het monster over de aubergines.

7.5. Inoculeer met behulp van dezelfde methode (7.3 of 7.4) vijf planten als positieve controles met een waterige suspensie van 105-106 cellen/ml van een bekende cultuur van C. m. ssp. sepedonicus en zo mogelijk met natuurlijk geïnfecteerd knolweefsel (zie deel 4).

7.6. Inoculeer volgens dezelfde methode (7.3 of 7.4) vijf planten als negatieve controles met steriele pelletbuffer.

7.7. Incubeer de planten onder quarantaineomstandigheden maximaal vier weken bij 18-24 °C. Zorg tijdens de incubatie voor voldoende licht, een hoge vochtigheidsgraad (70-80 %) en adequate bewatering waarbij verzadiging met water of verwelking door watergebrek wordt voorkomen. De cellen van C. m. ssp. sepedonicus sterven boven 30 °C af; de optimale groeitemperatuur is 21 °C. Incubeer positieve en negatieve controleplanten op van elkaar gescheiden plaatsen in een broeikas of groeikamer om contaminatie te vermijden; is dat wegens ruimtegebrek niet mogelijk, zorg er dan voor dat de verschillende behandelingen strikt gescheiden gehouden worden. Als planten met verschillende monsters dicht bij elkaar geïncubeerd moeten worden, moeten zij met behulp van schermen gescheiden gehouden worden. Bij het bemesten, bewateren, onderzoeken en alle overige handelingen moet de uiterste zorg in acht genomen worden om kruisbesmetting te vermijden. De kassen en groeikamers moeten absoluut vrij van alle schadelijke insecten gehouden worden, aangezien die de bacterie van het ene monster naar het andere kunnen overbrengen.

7.8. Begin na een week regelmatig naar symptomen te zoeken. Tel het aantal planten met symptomen. C. m. ssp. sepedonicus doet auberginebladeren verwelken; dit kan beginnen als een verslapping van de bladranden of tussen de nerven. Verwelkt weefsel kan eerst donkergroen of gevlekt zijn, maar verbleekt voordat het necrotisch wordt. Verwelkte plekken tussen de nerven zien er vaak vettig en doorweekt uit. Necrotisch weefsel heeft vaak een heldergele rand. De planten gaan niet altijd dood; hoe langer het duurt voordat de symptomen zich voordoen, des te groter de overlevingskans. De planten kunnen over de infectie heen groeien. Jonge aubergines zijn veel vatbaarder voor lage populaties C. m. ssp. sepedonicus dan oudere planten; vandaar de noodzaak om planten in of net vóór het 3-bladstadium te gebruiken.

Verwelking kan ook veroorzaakt worden door populaties van andere bacteriën of schimmels in de pellet van knolweefsel. Dit zijn bijvoorbeeld Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora ssp. carotovora en E. carotovora ssp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, alsmede grote populaties saprofytische bacteriën. Met name kan Erwinia chrysanthemi bladsymptomen en verwelking veroorzaken die grote overeenkomst vertonen met de symptomen van C. m. ssp. sepedonicus. Het enige verschil is dat bij infectie met Erwinia chrysanthemi de stengels zwart worden. Andere verwelkingen onderscheiden zich van die veroorzaakt door C. m. ssp. sepedonicus doordat hele bladeren of hele planten snel verwelken. Ook kan een gramkleuring worden uitgevoerd, waarmee C. m. ssp. sepedonicus van Erwinia spp. kan worden onderscheiden.

7.9. Zodra de symptomen bij de aubergines worden waargenomen, moet getracht worden de bacterie weer te isoleren uit delen verwelkt bladweefsel of stengelweefsel van de planten (zie punt 3.1.3 voor de maceratie van weefsel). Ontsmet de oppervlakte van de auberginebladeren en stengels door ze met ethanol 70 % af te vegen. Voer een IF- of PCR-test uit op sap van de aubergine en isoleer op geschikte (selectieve) media (zie deel 8). Ook kan een gramkleuring (aanhangsel 9) worden uitgevoerd. Identificeer reinculturen van vermoedelijke C. m. ssp. sepedonicus en bevestig de pathogeniteit (zie deel 9 en 10).

7.10. In bepaalde gevallen, met name wanneer de groeiomstandigheden niet optimaal zijn, kan C. m. ssp. sepedonicus zelfs na vier weken incuberen nog als latente infectie in aubergines voorkomen. Als na vier weken geen symptomen zijn waargenomen, voer dan een IF- of PCR-test uit op een samengesteld monster van stengeldelen van 1 cm lang van elke testplant, die boven de inoculatieplaats zijn afgesneden. Als de test positief is, moet de bacterie opnieuw geïsoleerd worden op geschikte (selectieve) media volgens de in deel 8 beschreven procedure. Identificeer reinculturen van vermoedelijke C. m. ssp. sepedonicus en bevestig de pathogeniteit (zie deel 9 en 10).

Interpretatie van het resultaat van de bioassay:

De met de bioassay verkregen resultaten zijn valide als de planten van de positieve controle karakteristieke symptomen vertonen, de bacteriën weer uit deze planten geïsoleerd kunnen worden en op de negatieve controles geen symptomen worden gevonden.

De bioassay is negatief indien de proefplanten niet met C. m. ssp. sepedonicus besmet blijken te zijn en C. m. ssp. sepedonicus wel in de positieve controles wordt gedetecteerd.

De bioassay is positief indien de proefplanten wel met C. m. ssp. sepedonicus besmet zijn.

8. ISOLATIE VAN C. M. SSP. SEPEDONICUS

NB:

De diagnose is pas compleet als C. m. ssp. sepedonicus geïsoleerd, geïdentificeerd (zie deel 9) en door middel van een pathogeniteitstest (deel 10) bevestigd is. Hoewel C. m. ssp. sepedonicus een moeilijk kweekbaar organisme is, kan het geïsoleerd worden uit weefsel dat de symptomen vertoont.

C. m. ssp. sepedonicus kan echter overwoekerd worden door snelgroeiende saprofytische bacteriën en daarom wordt niet aanbevolen hem rechtstreeks uit de pellet van knol- of stengelweefsel (punt 3.1.6 of 3.2.5) te isoleren. Met een selectief medium en een adequate verdunning van de geresuspendeerde pellet van de naveleindstukjes of stengels van aardappelen kan C. m. ssp. sepedonicus in principe wel direct geïsoleerd worden.

De isolatie moet worden uitgevoerd bij alle symptomatische aardappelknollen of stengeldelen en bij aubergines die geen symptomen vertonen maar waarbij de IF/PCR-test van het samengestelde monster positief was (zie deel 7.10). Zo nodig moeten auberginestengels worden gemacereerd overeenkomstig punt 3.1.3.

Als positieve controles moeten decimale verdunningen van een suspensie van 106 kve/ml van C. m. ssp. sepedonicus (bv. NCPPB 4053 of PD 406) worden bereid. Om contaminatie uit te sluiten moeten de positieve controles volledig gescheiden van de analysemonsters worden bereid.

Voor elke nieuw bereide charge van een selectief medium moet worden nagegaan of die geschikt is voor het kweken van de bacterie voordat hij voor het testen van routinemonsters wordt gebruikt.

Onderzoek het controlemateriaal op dezelfde wijze als de monsters.

8.1. Selectieve uitplating

8.1.1. Bereid van een aliquot van 100 µl van een geresuspendeerde aardappelpellet of plantensap van de aubergines decimale verdunningen in pelletbuffer (aanhangsel 3).

8.1.2. Isolatie uit onverdunde aardappelpellet lukt meestal niet omdat C. m. ssp. sepedonicus zo lastig te kweken is en er concurrentie door saprofyten optreedt. Aangezien de bacterie in geïnfecteerd weefsel gewoonlijk in grote aantallen aanwezig is, kunnen de saprofyten meestal worden uitverdund terwijl het pathogeen achterblijft. Daarom wordt aanbevolen 100 µl van elk van de monsters, verdunning 1:100 tot en met 1:10 000 op MTNA of NCP-88 (aanhangsel 5) (bij gebruik van petrischalen met een diameter van 90 mm — bij andere afmetingen het volume aanpassen) met een drigalski-spatel uit te spatelen op een strijkplaat.

NB:

Een andere mogelijkheid is de oorspronkelijke 100 µl aardappelpellet-aliquot met een spatel op een eerste agarplaat uit te strijken en het op de spatel achtergebleven materiaal op een tweede plaat uit te spatelen; dit wordt dan nog eens met een derde plaat gedaan, zodat door het uitspatelen een verdunningseffect wordt verkregen.

8.1.3. Incubeer de platen in het donker bij 21-23 °C.

8.1.4. Na drie dagen worden de platen voor het eerst beoordeeld, waarbij op C. m. ssp. sepedonicus lijkende kolonies worden geteld, met de controleplaten als vergelijking; de tellingen worden na vijf, zeven en tien dagen herhaald.

8.2. Reinkweken van verdachte kolonies

NB:

Subculturen van C. m. ssp. sepedonicus-achtige kolonies moeten op YGM-media worden gekweekt voor de inoculatie van aubergines en/of de identificatie; dit moet worden gedaan voordat de platen te vol worden, dat wil zeggen bij voorkeur na drie tot vijf dagen.

8.2.1. Strijk C. m. ssp. sepedonicus-achtige kolonies uit op een van de volgende media (voor de samenstelling zie aanhangsel 5):

nutriënt-dextroseagar (alleen voor subcultuur);

gist-pepton-glucoseagar;

gistextract-minerale-zoutenagar.

Incubeer tot tien dagen bij 21-24 °C.

C. m. ssp. sepedonicus groeit langzaam en brengt meestal binnen tien dagen minuscule, crèmekleurige, koepelvormige kolonies voort. Voor foto's van karakteristieke kolonies van C. m. ssp. Sepedonicus, zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

8.2.2. Strijk opnieuw uit om een reincultuur te krijgen.

De groeisnelheden wordt beter met een subcultuur. Karakteristieke kolonies zijn roomwit of ivoorkleurig, soms geel, afgerond, glad, hoog, convex, slijmachtig-vloeibaar, hebben gave randen en zijn gewoonlijk 1-3 mm in diameter.

Een eenvoudige gramkleuring (aanhangsel 9) kan de keuze van de kolonies voor verder onderzoek gemakkelijker maken.

8.2.3. Identificeer vermoedelijke culturen (zie deel 9) en verricht een pathogeniteitstest (zie deel 10).

9. IDENTIFICATIE

Identificeer reinculturen van vermoedelijke C. m. ssp. sepedonicus-isolaten aan de hand van ten minste twee van de volgende, op verschillende biologische principes gebaseerde testen.

Voor zover van toepassing moet elke test ook worden uitgevoerd op bekende referentiestammen.

9.1. Voedingstesten en enzymatische identificatietesten

Bepaal de volgende fenotypische eigenschappen, die universeel aan-, respectievelijk afwezig zijn in C. m. ssp. sepedonicus, volgens de methoden van Lelliott en Stead (1987), Klement e.a. (1990), Schaad (2001), Anoniem (1987).

Alle media moeten bij 21 °C worden geïncubeerd en na zes dagen worden onderzocht. Indien geen groei is opgetreden, incuberen tot maximaal 20 dagen.

Alle testen moeten een controle met bekende C. m. ssp. sepedonicus omvatten. Voedingstest en fysiologische testen moeten worden uitgevoerd met inocula van nutriënt-agarsubculturen. Morfologische vergelijkingen moeten worden gemaakt aan de hand van nutriënt-dextroseagarculturen.

Test Verwacht resultaat oxidatie/fermentatietest (O/F) inert of zwak oxidatief oxidaseactiviteit – groei bij 37 °C – ureaseactiviteit – esculinehydrolyse + zetmeelhydrolyse – of zwak tolerantie tegen 7 % NaCl – indoolvorming – katalaseactiviteit + H2S-vorming – citraatassimilatie – afbraak van gelatine – zuurvorming uit glycerol – zuurvorming uit lactose – of zwak zuurvorming uit ramnose – zuurvorming uit salicine – gramkleuring (aanhangsel 9) +

9.2. IF-test

a) Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in IF-buffer (aanhangsel 3).

b) Bereid een tweevoudige verdunningsreeks van een geschikt antiserum.

c) Pas de IF-procedure toe (deel 4).

d) De IF-test is positief als de IF-titer van de kweek gelijkwaardig is aan die van de positieve controle.

9.3. PCR-test

a) Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in UPW.

b) Verwarm 100 µl van de celsuspensie in gesloten buisjes 4 minuten in een verwarmingsblok of kokendwaterbad op 100 °C. Zo nodig kan vers bereid NaOH toegevoegd worden tot een eindconcentratie van 0,05 M om de cellysis te bevorderen. Hierna kunnen de monsters bij –16 tot –24 °C worden opgeslagen tot zij nodig zijn.

c) Gebruik geschikte PCR-procedures voor de amplificatie van C. m. ssp. sepedonicus (bv. Pastrik, 2000, zie aanhangsel 4; Li en de Boer, 1995; Mills e.a., 1997; Pastrik en Rainey, 1999; Schaad e.a., 1999).

d) Er wordt een positieve identificatie van C. m. ssp. sepedonicus verkregen als de PCR-amplicons van dezelfde grootte zijn en dezelfde restrictiefragmentlengtepolymorfismen hebben als de positieve controlestam.

9.4. FISH-test

a) Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in UPW.

b) Pas de FISH-procedure toe (deel 5).

c) De FISH-test is positief als de kweek en de positieve controle dezelfde reacties vertonen.

9.5. Vetzuurprofiel (FAP)

a) Laat de kweek 72 uur bij 21 °C (±1 °C) groeien op trypticasesoja-agar.

b) Pas een geschikte FAP-procedure toe (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) De FAP-test is positief als het profiel van de vermoedelijke cultuur identiek is aan die van de positieve controle. De aanwezigheid van de karakteristieke vetzuren 15:1 ante-iso A, 15:0 iso, 15:0 ante-iso, 16:0 iso, 16:0 en 17:0 ante-iso is een sterke aanwijzing voor C. m. ssp. sepedonicus. Bij andere genera, zoals Curtobacterium, Arthrobacter en Micrococcus, komen ook enkele van deze zuren voor; 15:1 ante-iso is echter in deze bacteriën zeldzaam, maar komt wel in alle Clavibacter-soorten voor in een concentratie tussen 1 en 5 %. In C. m. ssp. sepedonicus ligt de waarde gewoonlijk rond de 5 %.

9.6. BOX-PCR

a) Bereid een suspensie van ongeveer 106 cellen/ml in UPW.

b) Voer de test uit volgens de procedure (Smith e.a., 2001).

10. BEVESTIGINGSTEST

De pathogeniteitstest moet worden uitgevoerd voor de definitieve bevestiging van een diagnose van C. m. ssp. sepedonicus en voor de bepaling van de virulentie van culturen die als C. m. ssp. sepedonicus geïdentificeerd zijn.

10.1. Bereid een inoculum van ongeveer 106 cellen/ml uit drie dagen oude kweken van het te onderzoeken isolaat en een geschikte positieve controlestam van C. m. ssp. sepedonicus.

10.2. Inoculeer vijf à tien auberginestengels van jonge zaailingen in het 3-bladstadium (deel 7.3 of 7.4).

10.3. Incubeer bij 18-24 °C met voldoende licht, een hoge relatieve vochtigheid en adequate bewatering waarbij verzadiging met water en droogtestress worden voorkomen (deel 7.7). Met reinculturen moet binnen twee weken typische verwelking optreden; planten die daarna geen symptomen vertonen (zie deel 7.8), moeten maximaal drie weken worden geïncubeerd bij temperaturen die de groei van aubergines bevorderen, maar 25 °C niet overschrijden (aanhangsel 8). Indien er na drie weken geen symptomen zijn, kan de cultuur niet worden bevestigd als een pathogene vorm van C. m. ssp. sepedonicus.

10.4. Neem voor de isolatie een stuk stengel van symptomatische planten 2 cm boven het inoculatiepunt. Maak dit fijn en suspendeer het in een klein volume steriel gedestilleerd water of steriele 50 mM fosfaatbuffer (aanhangsel 3). Maak een isolaat uit de suspensie door uitplaten van verdunningen of uitstrijken op MTNA en YPGA (aanhangsel 5), incubeer gedurende drie tot vijf dagen bij 21-23 °C en bestudeer de vorming van karakteristieke kolonies van C. m. ssp. sepedonicus.

Aanhangsel 1 Bij de optimalisering en validering van de protocollen ingeschakelde laboratoria Laboratorium (1) Plaats Land Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Wenen en Linz Oostenrijk Departement Gewasbescherming Merelbeke België Plantedirektoratet Lyngby Denemarken Central Science Laboratory York Engeland Scottish Agricultural Science Agency Edinburgh Schotland Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Frankrijk Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Frankrijk Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Duitsland Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Duitsland State Laboratory Dublin Ierland Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Nederland Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Noorwegen Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lissabon Portugal Nacionalni institut za biologijo Ljubljana Slovenië Centro de Diagnóstico de Aldearrubia Salamanca Spanje (1) Voor contactpersonen zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.

Aanhangsel 2 Bereiding van positieve en negatieve controles voor de screeningtesten (PCR/IF en FISH) Maak een cultuur van 72 uur van een virulente stam van C. m. ssp. sepedonicus [NCPPB 4053 of PD 406] op MTNA-basismedium en suspendeer deze in 10 mM fosfaatbuffer om een celdichtheid van ongeveer 1-2 × 108 kve/ml te verkrijgen. Dit wordt meestal bereikt met een licht troebele suspensie met een optische dichtheid van 0,20 bij 600 nm. Neem stukjes uit het naveleinde van 200 knollen van een partij aardappelen met blanke schil waarvan bekend is dat zij vrij zijn van C. m. ssp. sepedonicus. Verwerk de stukjes op de gebruikelijk wijze en resuspendeer de pellet in 10 ml. Doe in 10 steriele microvaatjes van 1,5 ml telkens 900 µl geresuspendeerde pellet. Breng 100 µl van de suspensie van C. m. ssp. sepedonicus over in het eerste microvaatje. Meng door vortexen. Doe in de volgende vijf microvaatjes telkens een decimale verdunning. De zes microvaatjes met bacteriën worden als positieve controles gebruikt. De vier microvaatjes zonder bacteriën worden als negatieve controles gebruikt. Etiketteer de microvaatjes als zodanig. Doe aliquots van 100 µl in steriele microvaatjes van 1,5 ml om van elk controlemonster negen duplicaten te maken. Bewaar deze tussen –16 en –24 °C tot gebruik. De aanwezigheid en concentratie van C. m. ssp. sepedonicus in de controlemonsters moet eerst door middel van IF bevestigd worden. Voor de PCR-test wordt bij elke reeks analysemonsters een DNA-extractie van de positieve en negatieve controlemonsters gedaan. Voor de IF- en de FISH-test worden bij elke reeks analysemonsters bepalingen aan de positieve en negatieve controlemonsters gedaan. Bij de IF-, FISH- en PCR-tests moet C. m. ssp. sepedonicus ten minste worden gedetecteerd in de positieve controles met 106 en 104 cellen/ml en mag hij in geen van de negatieve controles worden gedetecteerd.

Aanhangsel 3 Buffers voor testprocedures ALGEMEEN: Ongeopende gesteriliseerde buffers kunnen maximaal een jaar bewaard worden. 1. Buffers voor de extractieprocedure 1.1. Extractiebuffer (50 mM fosfaatbuffer, pH 7,0) Deze buffer wordt gebruikt voor de extractie van de bacterie uit plantenweefsel door homogenisatie of schudden. NaH2PO4 (watervrij) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Gedestilleerd water 1,00 l Los de ingrediënten op, controleer de pH en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C. De volgende extra bestanddelen kunnen van pas komen: Doel Hoeveelheid (per l) Lubrol-vlokken Ontvlokkingsmiddel (1) 0,5 g DC siliconen-antischuim Antischuimmiddel (1) 1,0 ml Tetranatriumpyrofosfaat Antioxidant 1,0 g Polyvinylpyrrolidon-40 000 (PVP-40) Binding van PCR-remmers 50 g 1.2. Pelletbuffer (10 mM fosfaatbuffer, pH 7,2) Deze buffer word gebruikt om de extracten van de stukjes naveleinde te resuspenderen en te verdunnen nadat ze door centrifugeren in een pellet geconcentreerd zijn. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Gedestilleerd water 1,00 l Los de ingrediënten op, controleer de pH en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C. 2. Buffers voor de IF-test 2.1. IF-buffer (10 mM fosfaatgebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS), pH 7,2 Deze buffer wordt gebruikt voor het verdunnen van antilichamen. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Gedestilleerd water 1,0 l Los de ingrediënten op, controleer de pH en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C. 2.2. IF-buffer-Tween Deze buffer wordt gebruikt voor het wassen van de objectglaasjes. Voeg 0,1 % Tween 20 aan de IF-buffer toe. 2.3. Fosfaatgebufferde glycerol, pH 7,6 Deze buffer wordt gebruikt als inbedvloeistof op de vensters van de IF-glaasjes om de fluorescentie te versterken. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Glycerol 50 ml Gedestilleerd water 100 ml Antifading inbedmiddelen zijn in de handel verkrijgbaar, bv. Vectashield® (Vector Laboratories) of Citifluor® (Leica). (1) Voor gebruik bij de homogenisatie-extractiemethode.

Aanhangsel 4 Bepaling van het besmettingsniveau met de IF- en de FISH-test 1. Tel het aantal typische fluorescerende cellen per veld (c). 2. Bereken het aantal typische fluorescerende cellen per venstertje van het objectglaasje (C). C = c × S/s waarbij S = oppervlakte van een venstertje van het objectglaasje, en s = oppervlakte van het objectiefveld

s = πi2/4G2K2 waarbij i = veldcoëfficiënt (tussen 8 en 24, afhankelijk van het type oculair), K = buiscoëfficiënt (1 of 1,25), G = vergrotingsfactor (100x, 40x enz.) van het objectief. 3. Bereken het aantal typische fluorescerende cellen per ml geresuspendeerde pellet (N) N = C × 1 000/y × F waarbij y = volume van de geresuspendeerde pellet op het venster, en F = verdunningsfactor van de geresuspendeerde pellet.

Aanhangsel 5 Isolatie- en kweekmedia voor C. m. ssp. sepedonicus a) Algemene kweekmedia Nutriënt-agar (NA) Nutrient Agar (Difco) 23,0 g Gedestilleerd water 1,0 l Los de ingrediënten op en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C. Nutriënt-dextroseagar (NDA) Difco Bacto Nutrient Agar met 1 % d(+)-glucose (monohydraat). Steriliseer 20 minuten in de autoclaaf bij 115 °C. Gist-pepton-glucoseagar (YPGA) Gistextract (Difco) 5,0 g Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g d(+)-glucose (monohydraat) 10,0 g Bacto-Agar (Difco) 15,0 g Gedestilleerd water 1,0 l Los de ingrediënten op en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C. Gistextract-minerale-zoutenmedium (YGM) Bacto-Yeast-Extract (Difco) 2,0 g d(+)-glucose (monohydraat) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4. H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Bacto-Agar (Difco) 18 g Gedestilleerd water 1,0 l Los de ingrediënten op en steriliseer telkens een halve liter medium 20 minuten in de autoclaaf bij 115 °C. b) Gevalideerde selectieve kweekmedia MTNA-medium Tenzij anders vermeld zijn alle bestanddelen afkomstig van BDH. Gistextract (Difco) 2,0 g Mannitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4. H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar (Oxoid no. 1) 16,0 g Gedestilleerd water 1,0 l Los de ingrediënten op en breng de pH op 7,2. Autoclaveer 15 minuten bij 121 °C, koel af tot 50 °C en voeg de volgende antibiotica toe: trimethoprim 0,06 g, nalidixinezuur 0,002 g, amfotericine B 0,01 g. Voorraadoplossingen antibiotica: trimethoprim (Sigma) en nalidixinezuur (Sigma) (beide 5 mg/ml) in methanol 96 %, amfotericine B (Sigma) (1 mg/ml) in dimethylsulfoxide. De voorraadoplossingen worden gefiltersteriliseerd. NB: Het basismedium is drie maanden houdbaar. Na toevoeging van antibiotica is het één maand houdbaar indien koel bewaard. NCP-88 medium Nutrient Agar (Difco) 23 g Gistextract (Difco) 2 g D-mannitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Gedestilleerd water 1,0 l Los de ingrediënten op en breng de pH op 7,2. Autoclaveer, koel af tot 50 °C en voeg de volgende antibiotica toe: polymyxine B-sulfaat (Sigma) 0,003 g, nalidixinezuur (Sigma) 0,008 g, cycloheximide (Sigma) 0,2 g. Maak de volgende voorraadoplossingen van de antibiotica: nalidixinezuur in 0,01 M NaOH, cycloheximide in ethanol 50 %, polymyxine B-sulfaat in gedestilleerd water. De voorraadoplossingen worden gefiltersteriliseerd. NB: Het basismedium is drie maanden houdbaar. Na toevoeging van antibiotica is het één maand houdbaar indien koel bewaard.

Aanhangsel 6 Gevalideerd PCR-protocol en bijbehorende reagentia NB: Bij de voorbereidende testen moeten op zijn minst 103-104 cellen van C. m. ssp. sepedonicus per ml monsterextract reproduceerbaar gedetecteerd kunnen worden. De voorbereidende testen mogen verder geen fout-positieve uitslagen vertonen bij een selectie van bacteriestammen. 1. Multiplex-PCR-protocol met interne PCR-controle (Pastrik, 2000) 1.1. Oligonucleotide-primers Forward primer PSA-1 5’- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3’ Reverse primer PSA -R 5’- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3’ Forward primer NS-7-F 5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3’ Reverse Primer NS-8-R 5’- tcc gca ggt tca cct acg ga -3’ Verwachte amplicongrootte van C. m. ssp. sepedonicus template-DNA = 502 bp (PSA-primerset). Verwachte amplicongrootte van de 18S rRNA interne PCR-controle = 377 bp (NS-primerset). 1.2. PCR-reactiemix Reagens Hoeveelheid per reactie Eindconcentratie Steriel UPW 15,725 µl 10x PCR-buffer (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (fraction V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % d-nTP mix (20mM) 0,125 µl 0,1 mM Primer PSA-1 (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer PSA-R (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Primer NS-7-F (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Primer NS-8-R (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Taq polymerase (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Monstervolume 5,0 µl Totaalvolume 25,0 µl 1.3. PCR-reactiecondities Werk het volgende programma af: 1 cyclus van: i) 3 minuten bij 95 °C (denaturatie van het template-DNA) 10 cycli van: ii) 1 minuut bij 95 °C (denaturatie van het template-DNA) iii) 1 minuut bij 64 °C (annealing van de primers) iv) 1 minuut bij 72 °C (extensie van de kopie) 25 cycli van: v) 30 seconden bij 95 °C (denaturatie van het template-DNA) vi) 30 seconden bij 62 °C (annealing van de primers) vii) 1 minuut bij 72 °C (extensie van de kopie) 1 cyclus van: viii) 5 minuten bij 72 °C (laatste extensie) ix) koeling op 4 °C. NB: Dit programma is geoptimaliseerd voor een MJ Research PTC 200 thermal cycler. Bij gebruik van andere modellen moet de duur van de cycli ii), iii), iv), v), vi) en vii) wellicht gewijzigd worden. 1.4. Restrictie-enzymanalyse van de amplicons PCR-amplicons van DNA van C. m. ssp. sepedonicus produceren met enzym Bgl II na 30 minuten incuberen bij 37 °C een karakteristiek restrictiefragmentlengtepolymorfisme. De uit C. m. ssp. sepedonicus-specifiek fragment verkregen restrictiefragmenten zijn 282 en 220 bp lang. 2. Bereiding van de laadbuffer 2.1. Broomfenolblauw (10 %-voorraadoplossing) Broomfenolblauw 5 g Gedestilleerd water (bidest) 50 ml 2.2. Laadbuffer Glycerol (86 %) 3,5 ml Broomfenolblauw (5.1) 300 µl Gedestilleerd water (bidest) 6,2 ml 3. 10x TAE-buffer (Tris-Acetaat-EDTA), pH 8,0 Tris-buffer 48,4 g IJsazijn 11,42 ml EDTA (dinatriumzout) 3,72 g Gedestilleerd water 1,00 l Verdun tot 1x voor gebruik. De buffer is ook in de handel verkrijgbaar (bv. Invitrogen of gelijkwaardig). (1) De methoden zijn gevalideerd met Taq polymerase van Perkin Elmer (AmpliTaq of Gold) en Gibco BRL. (2) De concentratie van de primers NS-7 F en NS-8-R is geoptimaliseerd voor de extractie van stukjes naveleinde van aardappel met behulp van de homogenisatiemethode en DNA-zuivering volgens Pastrik (2000) (zie deel 6.1.a) en deel 6.2). Als de extractie wordt uitgevoerd door schudden of andere DNA-isolatiemethoden moeten de reagensconcentraties opnieuw geoptimaliseerd worden.

Aanhangsel 7 Gevalideerde reagentia voor de FISH-test 1. Oligo-probes Cms-specifieke probe CMS-CY3-01: 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Niet-specifieke eubacteriële probe EUB-338-FITC: 5’- gct gcc tcc cgt agg agt-3’ 2. Fixatief (LET OP! HET FIXATIEF BEVAT HET GIFTIGE PARAFORMALDEHYDE. DRAAG HANDSCHOENEN EN ADEM DE DAMPEN NIET IN. AANGERADEN WORDT OM IN EEN ZUURKAST TE WERKEN.) i) Verwarm 9 ml water van moleculair-biologische kwaliteit (bv. ultrazuiver water, UPW) tot ongeveer 60 °C en voeg 0,4 g paraformaldehyde toe. Het paraformaldehyde lost op na toevoeging van 5 druppels NaOH 1 N en roeren met een magneetroerder. ii) Breng de pH op 7,0 door toevoegen van 1 ml fosfaatbuffer 0,1 M (PB, pH 7,0) en 5 druppels HCl 1 N. Controleer de pH met indicatorpapier en corrigeer zo nodig met HCl of NaOH. (LET OP! GEBRUIK GEEN PH-METER IN OPLOSSINGEN DIE PARAFORMALDHYDE BEVATTEN.) iii) Filtreer de oplossing over een 0,22 µm membraanfilter en bewaar stofvrij bij 4 °C tot gebruik. iv) Opmerking: Een alternatief fixatief is ethanol 96 %. 3. 3x Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (gefiltersteriliseerd en geautoclaveerd) 15 mM Verdun tot 1x voor gebruik. 4. Hybridisatieoplossing 1x Hybmix Natriumdodecylsulfaat (SDS) 0,01 % probe EUB 338 5 ng/μl probe CMSCY301 5 ng/μl Bereid hoeveelheden hybridisatieoplossing zoals in tabel 1 aangegeven. Voor elk objectglaasje (dat twee verschillende monsters in duplo bevat) is 90 μl hybridisatieoplossing nodig. Tabel 1 Hoeveelheden te bereiden hybridisatieoplossing Aantal glaasjes: 2 glaasjes 8 glaasjes Steriel UPW 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Probe EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Probe CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Total volume (μl) 90,0 360,0 NB: Alle oplossingen die lichtgevoelige oligo-probes bevatten, moeten bij –20 °C in het donker bewaard worden en tijdens het gebruik tegen direct zonlicht en kunstlicht worden beschermd. 5. 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Gedestilleerd water 1,00 l Los de ingrediënten op, controleer de pH en steriliseer 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C.

Aanhangsel 8 Kweken van aubergines Zaaizaad van aubergineplanten (Solanum melongena) in gepasteuriseerde zaaigrond. Zaailingen met volledig ontwikkelde zaadlobben (10-14 dagen) worden overgepoot in gepasteuriseerde potgrond. Aubergineplanten moeten worden gekweekt in een kas met de volgende omgevingsomstandigheden: daglengte: 14 uur of natuurlijke daglengte indien groter; temperatuur: overdag 21-24 °C, 's nachts 15 °C.

Vatbare auberginerassen: „Black Beauty”, „Long Tom”, „Rima”, „Balsas”. Leverancier: zie de website: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.