6)

Bijlage VII wordt vervangen door: „BIJLAGE VII BEPALING VAN HET PERCENTAGE GLYCEROL-2-MONOPALMITAAT 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED Hier wordt de analysemethode beschreven voor de bepaling van het percentage palmitinezuur op de 2-positie van triglyceriden via de bepaling van glycerol-2-monopalmitaat Deze methode kan worden gebruikt voor plantaardige oliën die bij kamertemperatuur (20 °C) vloeibaar zijn. 2. PRINCIPE Na een voorbehandeling wordt het oliemonster behandeld met pancreaslipase: door een partiële en specifieke hydrolyse op de 1- en 3-positie van het triglyceride ontstaan 2-monoglyceriden. Het percentage glycerol-2-monopalmitaat in de monoglyceridefractie wordt na silylering bepaald met behulp van capillaire gaschromatografie. 3. APPARATUUR EN STANDAARDMATERIAAL 3.1. Erlenmeyer, 25 ml. 3.2. Bekerglazen, 100, 250 en 300 ml. 3.3. Glazen chromatografiekolom met een inwendige diameter van 21-23 mm en een lengte van 400 mm, voorzien van een filter van gesinterd glas en een kraan. 3.4. Maatcilinders, 10, 50, 100 en 200 ml. 3.5. Kolven, 100 en 250 ml 3.6. Rotatieverdamper. 3.7. Centrifugebuizen met een ronde bodem, 10 ml, met geslepen stop. 3.8. Centrifuge voor buizen van 10 en 100 ml. 3.9. Waterbad waarin de temperatuur op 40 °C + 0,5 °C kan worden gehouden. 3.10. Meetpipetten, 1 en 2 ml. 3.11. Injectiespuit, 1 ml. 3.12. Micro-injectiespuit, 100 μl. 3.13. Scheitrechter, 1 000 ml. 3.14. Gaschromatograaf voor een capillaire kolom met een „cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen en een oven waarin de ingestelde temperatuur op ± 1 °C nauwkeurig kan worden gehouden. 3.15. „Cold on column” injector om het monster direct op de kolom te brengen. 3.16. Vlamionisatiedetector en elektrometer. 3.17. Recorder/integrator, geschikt voor de elektrometer, met een responstijd van niet meer dan één seconde en met een variabele papiersnelheid. 3.18. Capillaire kolom, glas of kwartsglas, met een lengte van 8-12 m en een inwendige diameter van 0,25-0,32 mm en bekleed met een laagje 5 % methylpolysiloxaan of fenylmethylpolysiloxaan met een dikte van 0,10-0,30 μm, die bij 370 °C kan worden gebruikt. 3.19. Micro-injectiespuit, 10 μl, met een geharde naald, met een lengte van ten minste 7,5 cm, voor directe injectie op de kolom. 4. REAGENTIA 4.1. Silicagel met een korrelgrootte tussen 0,063 en 0,200 mm (70/280 mesh), als volgt voorbehandeld: droog de silicagel in een porseleinen kroes in een droogstoof gedurende 4 uur bij 160 °C en laat vervolgens in een exsiccator afkoelen. Voeg als volgt een volume water toe dat overeenkomt met 5 % van het gewicht van de silicagel: weeg in een erlenmeyer van 500 ml 152 g silicagel af en voeg 8 g gedestilleerd water toe; sluit de erlenmeyer af en schud voorzichtig om het water uniform te verdelen. Laat ten minste 12 uur vóór gebruik rusten. 4.2. n-Hexaan (voor chromatografie). 4.3. Isopropanol. 4.4. Isopropanol, 1/1 (v/v) oplossing in water. 4.5. Pancreaslipase. De gebruikte lipase moet een activiteit tussen 2,0 en 10 lipase-eenheden per mg hebben (In de handel is pancreaslipase met een activiteit tussen 2 en 10 enzymeenheden per mg verkrijgbaar.) 4.6. Tris(hydroxymethyl)aminomethaan-bufferoplossing: 1 M oplossing in water, met geconcentreerd HCl (1/1 v/v) op pH 8 gebracht (controle met potentiometer). 4.7. Natriumcholaat, enzymkwaliteit, 0,1 %-oplossing in water (deze oplossing moet binnen 15 dagen na de bereiding worden gebruikt). 4.8. Calciumchloride, 22 %-oplossing in water. 4.9. Diethylether (voor chromatografie). 4.10. Elutievloeistof: mengsel van n-hexaan en diethylether (87/13 v/v). 4.11. Natriumhydroxide, 12 %-oplossing (g/g). 4.12. Fenolftaleïne, 1 %-oplossing in ethanol. 4.13. Draaggas: waterstof of helium (voor gaschromatografie). 4.14. Hulpgassen: waterstof (minimaal 99 %, watervrij en zonder organische stoffen) en lucht (voor gaschromatografie en met dezelfde zuiverheid). 4.15. Silaniseringsreagens: mengsel pyridine/hexamethyldisilazaan/trimethylchloorsilaan (9/3/1 v/v/v) (In de handel zijn gebruiksklare oplossingen verkrijgbaar.) Er kunnen ook andere silyleringsreagentia worden gebruikt, bijvoorbeeld bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide + 1 % trimethylchloorsilaan, verdund met een gelijk volume watervrije pyridine. 4.16. Referentiemonsters: zuivere monoglyceriden of mengsels van monoglyceriden met een bekende samenstelling die vergelijkbaar is met die van het monster. 5. PROCEDURE 5.1. Voorbehandeling van het monster 5.1.1. Olie met een gehalte aan vrij zuur van minder dan 3 % behoeft niet vóór de silicagel-kolomchromatografie te worden geneutraliseerd. Olie met een gehalte aan vrij zuur van meer dan 3 % moet overeenkomstig punt 5.1.1.1 worden geneutraliseerd. 5.1.1.1. Breng in een scheitrechter van 1 000 ml (3.13) 50 g olie en 200 ml n-hexaan. Voeg 100 ml isopropanol toe en een hoeveelheid 12 %-natriumhydroxideoplossing (4.11) die overeenkomt met het gehalte aan vrij zuur van de olie plus 5 %. Schud krachtig gedurende één minuut. Voeg 100 ml gedestilleerd water toe, schud opnieuw en laat bezinken. Laat na scheiding van de lagen de onderste laag met de zepen weglopen. Verwijder tevens mogelijke tussenlagen (slijmachtige en onopgeloste stoffen). Was de oplossing van de geneutraliseerde olie in hexaan met opeenvolgende porties van 50-60 ml van de oplossing van isopropanol in water (1/1 v/v) (4.4) tot de roze kleur van fenolftaleïne verdwijnt. Verwijder het merendeel van het hexaan door vacuümdestillatie (bijvoorbeeld met een rotatieverdamper) en breng de olie over in een kolf van 100 ml (3.5). Droog de olie onder vacuüm tot het oplosmiddel volledig is verwijderd. Na deze bewerking moet de zuurgraad van de olie lager dan 0,5 % zijn. 5.1.2. Breng 1,0 g olie, voorbehandeld zoals hierboven beschreven, in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) en los dit op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Laat de oplossing vóór de silicagel-kolomchromatografie gedurende ten minste 15 minuten rusten. Centrifugeer de oplossing, als deze troebel is, om optimale omstandigheden voor de chromatografie te waarborgen. (Er kunnen gebruiksklare SPE-silicagelpatronen van 500 mg worden gebruikt). 5.1.3. Voorbehandeling van de chromatografiekolom Giet ongeveer 30 ml elutievloeistof (4.10) in de kolom (3.3) en breng met een glasstaaf onder in de kolom een propje watten; duw het aan om de lucht te verwijderen. Bereid in een bekerglas een suspensie van 25 g silicagel (4.1) in ongeveer 80 ml elutievloeistof en giet dit met behulp van een trechter in de kolom. Controleer of alle silicagel in de kolom is gegoten; spoel met elutievloeistof (4.10), open de kraan en laat het vloeistofniveau zakken tot ongeveer 2 mm boven de bovenkant van de silicagel-laag. 5.1.4. Kolomchromatografie Weeg in een erlenmeyer van 25 ml (3.1) precies 1,0 g monster af, voorbehandeld volgens punt 5.1. Los het monster op in 10 ml elutievloeistof (4.10). Schenk de oplossing op de chromatografiekolom, voorbehandeld volgens punt 5.1.3. Zorg dat het oppervlak van de kolom niet verstoord wordt. Open de kraan en laat de monsteroplossing inzakken tot de bovenkant van de silicagel-laag. Elueer met 150 ml elutievloeistof. Stel de snelheid in op 2 ml/minuut (zodat de 150 ml in ongeveer 60-70 minuten door de kolom loopt). Vang het eluaat op in een vooraf getarreerde kolf van 250 ml. Verdamp het oplosmiddel onder vacuüm en verwijder de laatste sporen ervan onder een stikstofstroom. Weeg de kolf en bereken de opgevangen hoeveelheid extract. (Bij gebruik van gebruiksklare SPE-silicagelpatronen is de werkwijze: Breng 1 ml oplossing (5.1.2) in de vooraf voorbereide patronen met 3 ml n-hexaan. Elueer na het doorlopen van de oplossing met 4 ml n-hexaan/diethylether (9/1 v/v). Vang het eluaat op in een buis van 10 ml en damp droog onder een stikstofstroom. Laat pancreaslipase (5.2) op het residu inwerken. Het is van cruciaal belang dat de vetzuursamenstelling vóór en na de passage door de SPE-patroon wordt bepaald). 5.2. Hydrolyse met pancreaslipase 5.2.1. Weeg in de centrifugebuis overeenkomstig punt 5.1 0,1 g van de voorbehandelde olie af. Voeg 2 ml bufferoplossing (4.6), 0,5 ml natriumcholaatoplossing (4.7) en 0,2 ml calciumchlorideoplossing toe en schud na elke toevoeging goed. Sluit de buis met de geslepen stop en zet hem in het waterbad bij 40 ± 0,5 °C. 5.2.2. Voeg 20 mg lipase toe, schud voorzichtig (zorg dat de stop niet nat wordt) en zet de buis gedurende precies 2 minuten in het waterbad, haal de buis eruit, schud krachtig gedurende precies één minuut en laat de buis afkoelen. 5.2.3. Voeg 1 ml diethylether toe, zet de stop op de buis en schud krachtig, centrifugeer en breng de etheroplossing met een micro-injectiespuit over in een schone droge buis. 5.3. Bereiding van de gesilaniseerde verbindingen en voorbereiding van de gaschromatografie 5.3.1. Breng met een micro-injectiespuit 100 μl oplossing (5.2.3) in een rondbodemkolf van 10 ml. 5.3.2. Verwijder het oplosmiddel onder een zachte stikstofstroom, voeg 200 μl silaniseringsreagens (4.15) toe, zet de stop op de kolf en laat gedurende 20 minuten staan. 5.3.3. Voeg na 20 minuten 1-5 ml (afhankelijk van de chromatografie-omstandigheden) n-hexaan toe: de resulterende oplossing is gereed voor gaschromatografie. 5.4. Gaschromatografie De werkomstandigheden zijn als volgt: — temperatuur van de injector („on column” injector) onder het kookpunt van het oplosmiddel (68 °C); — temperatuur van de detector: 350 °C; — temperatuur van de kolom: de oventemperatuur wordt als volgt geprogrammeerd: eerst gedurende 1 minuut op 60 °C, daarna met 15 °C per minuut oplopend tot 180 °C, vervolgens met 5 °C per minuut oplopend tot 340 °C en ten slotte gedurende 13 minuten op 340 °C; — Draaggas: waterstof of helium met een lineaire snelheid die voldoende is om de in figuur 1 aangegeven resolutie te verkrijgen. De retentietijd van triglyceride C54 moet 40 + 5 minuten zijn (zie figuur 2). (Bovenstaande werkomstandigheden worden ter indicatie aangegeven. Ze moeten in elke situatie worden geoptimaliseerd om de gewenste resolutie te verkrijgen. De piekhoogte van glycerol-2-monopalmitaat moet minimaal 10 % van de volle schaaluitslag van de recorder zijn.) — Geïnjecteerde hoeveelheid: 0,5-1 μl van de oplossing (5 ml) in n-hexaan (5.3.3). 5.4.1. Identificatie van de pieken De verschillende monoglyceriden worden geïdentificeerd aan de hand van de verkregen retentietijd en door vergelijking met de pieken voor standaardmengsels monoglyceriden die onder dezelfde omstandigheden zijn geanalyseerd. 5.4.2. Kwantitatieve bepaling Met een elektronische integrator wordt het oppervlak van elke piek berekend. 6. WEERGAVE VAN DE RESULTATEN Het percentage glycerol-2-monopalmitaat wordt aan de hand van de verhouding tussen het piekoppervlak voor deze stof en het piekoppervlak voor alle monoglyceriden samen (zie figuur 2) berekend met de formule: Gycerolmonopalmitaat (%) = Hierbij is: Ax = het piekoppervlak voor glycerol-2-monopalmitaat en ΣA = de som van de piekoppervlakken van alle monoglyceriden samen. Het resultaat moet met één cijfer achter de komma worden vermeld. 7. ANALYSEVERSLAG Het analyseverslag moet bevatten: — een verwijzing naar deze methode; — alle informatie die nodig is om het monster volledig te kunnen identificeren; — het resultaat van de analyse; — elke afwijking van deze methode, ongeacht of dit op grond van een besluit van de betrokken partijen of om een andere reden is gebeurd; — de identificatiegegevens van het laboratorium, de datum van de analyse en de handtekeningen van de voor de analyse verantwoordelijke personen. Figuur 1 Chromatogram van de producten van de silaniseringsreactie, verkregen door de inwerking van lipase op een geraffineerde olijfolie waaraan 20 % veresterde olie is toegevoegd (100 %). Figuur 2 Chromatogram van: A) onveresterde olijfolie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. Chromatogram van: B) veresterde olie na lipase en na silanisering; onder deze omstandigheden (capillaire kolom van 8-12 m) wordt de wasfractie tegelijk met de diglyceridefractie of vlak daarna geëlueerd. Na lipase mag het gehalte aan triglyceriden niet hoger zijn dan 15 %. 8. OPMERKINGEN Opmerking 1: BEREIDING VAN LIPASE Lipase met voldoende lipaseactiviteit is in de handel verkrijgbaar. Het kan ook als volgt in het laboratorium worden bereid: Koel 5 kg verse varkenspancreas af tot 0 °C. Verwijder het omringende vet en bindweefsel en maal het restant in een messenmolen fijn tot een vloeibare pasta is overgebleven. Roer deze pasta gedurende 4-6 uur met 2,5 l watervrije aceton en centrifugeer daarna. Extraheer het residu nog driemaal met hetzelfde volume watervrije aceton en vervolgens tweemaal met een 1/1 (v/v) mengsel van aceton en diethylether en tweemaal met diethylether. Droog het residu gedurende 48 uur onder vacuüm; hierdoor wordt een stabiel poeder verkregen dat lange tijd vochtvrij in een koelkast kan worden bewaard. Opmerking 2: CONTROLE VAN DE LIPASEACTIVITEIT Bereid als volgt een olijfolie-emulsie: Schud in een mengapparaat gedurende 10 minuten een mengsel van 165 ml van een oplossing van arabische gom (100 g/l), 15 g ijsgruis en 20 ml vooraf geneutraliseerde olijfolie. Breng in een bekerglas van 50 ml achtereenvolgens 10 ml van deze emulsie, 0,3 ml natriumcholaatoplossing (0,2 g/ml) en 20 ml gedestilleerd water. Zet het bekerglas in een waterbad dat op 37 °C is ingesteld; hang de elektroden van de pH-meter in de vloeistof en voeg een roermagneetje toe. Voeg met een buret druppelsgewijs een 0,1 N natriumhydroxideoplossing toe tot een pH van 8,3 is bereikt. Voeg een hoeveelheid suspensie van lipasepoeder in water toe (0,1 g lipase/ml). Start de stopwatch zodra de pH-meter een pH van 8,3 aangeeft en voeg druppelsgewijs de natriumhydroxideoplossing met een zodanige snelheid toe dat de pH 8,3 blijft. Noteer elke minuut het verbruikte volume. Geef in grafiekvorm de verkregen gegevens weer, waarbij op de x-as de tijd wordt aangegeven en op de y-as het volume (ml) 0,1 N alkalioplossing dat is verbruikt om de pH constant te houden. Het resultaat dient een rechte lijn te zijn. De lipaseactiviteit, uitgedrukt in lipase-eenheden per mg, wordt met de volgende formule berekend: Hierbij is: A = de activiteit in lipase-eenheden/mg; V = het volume (ml) 0,1 N natriumhydroxideoplossing per minuut (berekend uit de grafiek); N = de normaliteit van de natriumhydroxideoplossing; m = de massa van het onderzochte lipase (in mg). Eén lipase-eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die per minuut 10 micro-equivalent zuur vrijmaakt.”.