BESCHIKKING VAN DE COMMISSIE van 14 april 1993 tot vaststelling van de methoden voor het opsporen van residuen van stoffen met hormonale werking en van stoffen met thyreostatische werking

(93/256/EEG)DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 85/358/EEG van de Raad van 16 juli 1985 tot aanvulling van Richtlijn 81/602/EEG betreffende het verbod van bepaalde stoffen met hormonale werking en van stoffen met thyreostatische werking (1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 88/146/EEG (2), en met name op artikel 5, lid 2,

Overwegende dat krachtens artikel 8, lid 1, van Richtlijn 64/433/EEG van de Raad van 26 juni 1964 inzake gezondheidsvraagstukken op het gebied van het intracommunautaire handelsverkeer in vers vlees (3), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 92/5/EEG (4), en krachtens artikel 11, lid 4, tweede alinea, van Richtlijn 85/397/EEG van de Raad van 5 augustus 1985 inzake hygiënische en veterinairrechtelijke problemen bij het intracommunautaire handelsverkeer in warmtebehandelde melk (5), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 89/662/EEG (6), het onderzoek naar residuen moet worden verricht met wetenschappelijk erkende, in de praktijk beproefde methoden, inzonderheid die welke in de communautaire richtlijnen of in andere internationale normen zijn omschreven;

Overwegende dat de vaststelling van de methoden voor de analyse van de monsters ook de omschrijving van de toe te passen analysetechnieken, de voorschriften voor de bemonstering, alsmede de criteria met betrekking tot de uitvoering van de analyse dient te omvatten;

Overwegende dat de vastgestelde analysetechnieken voldoende gevoelig moeten zijn om de aanwezigheid van residuen van stoffen met hormonale werking en van stoffen met thyreostatische werking aan te tonen;

Overwegende dat de bemonstering een essentieel onderdeel is van het analyseproces; dat derhalve bemonsteringsvoorschriften moeten worden vastgesteld;

Overwegende dat in deze beschikking rekening dient te worden gehouden met de criteria die zijn vastgesteld in punt 1 van de bijlage bij Richtlijn 85/591/EEG van de Raad van 20 december 1985 betreffende de invoering van communautaire bemonsteringswijzen en analysemethoden voor de controle van voor menselijke voeding bestemde levensmiddelen (7);

Overwegende dat, in verband met de ontwikkeling van de wetenschappelijke en technische kennis en voor de duidelijkheid, Beschikking 87/410/EEG van de Commissie (8) dient te worden ingetrokken;

Overwegende dat de in deze beschikking vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Veterinair Comité,

HEEFT DE VOLGENDE BESCHIKKING GEGEVEN:

Artikel 1

Voor de opsporing van residuen van stoffen met hormonale werking en van stoffen met thyreostatische werking kunnen de volgende routine-analysemethoden worden gebruikt:

- immunoassay,

- dunne-laagchromatografie,

- vloeistofchromatografie,

- gaschromatografie,

- massaspectrometrie,

- spectrometrie

of een andere methode die voldoet aan criteria die vergelijkbaar zijn met de criteria die in de bijlage voor dergelijke methoden zijn vastgesteld.

Artikel 2

Voor de bemonstering in het kader van deze analyses gelden de volgende voorschriften:

1. De monsters moeten representatief zijn en groot genoeg om een adequate analyse mogelijk te maken, de analyse te kunnen herhalen en indien nodig een bevestigingsanalyse te kunnen uitvoeren.

2. De monsters moeten zo worden gemerkt dat identificatie steeds mogelijk is.

3. De wijze van bemonstering, de verpakking, de bewaring, het vervoer en de opslag van de monsters mogen het monster op geen enkele wijze aantasten en mogen geen invloed hebben op de uitkomsten van het onderzoek. Onbevoegden mogen geen toegang hebben tot de monsters.

Artikel 3

De criteria voor de routine-analysemethoden voor het opsporen van stoffen met hormonale werking en van stoffen met thyreostatische werking, zijn vermeld in de bijlage.

Artikel 4

Deze beschikking wordt vóór 1 januari 1996 opnieuw bezien met het oog op aanpassing aan de ontwikkeling van de wetenschappelijke en technische kennis.

Artikel 5

Beschikking 87/410/EEG wordt ingetrokken.

Artikel 6

Deze beschikking is gericht tot de Lid-Staten.

Gedaan te Brussel, 14 april 1993.

Voor de Commissie

René STEICHEN

Lid van de Commissie

(1) PB nr. L 191 van 23. 7. 1985, blz. 46.

(2) PB nr. L 70 van 16. 3. 1988, blz. 16.

(3) PB nr. 121 van 29. 7. 1964, blz. 2012/64.

(4) PB nr. L 57 van 2. 3. 1992, blz. 1.

(5) PB nr. L 226 van 24. 8. 1985, blz. 13.

(6) PB nr. L 395 van 30. 12. 1989, blz. 13.

(7) PB nr. L 372 van 31. 12. 1985, blz. 50.

(8) PB nr. L 223 van 11. 8. 1987, blz. 18.

BIJLAGE

1. DEFINITIES EN ALGEMENE BEPALINGEN

1.1. Definities

1.1.1. Routine-analysemethoden

Analysemethoden die door de Lid-Staten worden toegepast in het kader van de nationale plannen voor de opsporing van residuen bij voor de voedselproduktie gehouden dieren en produkten daarvan overeenkomstig Richtlijn 86/469/EEG van de Raad (1). De routinemethoden moeten zijn gevalideerd door operationele laboratoria en zij moeten voldoen aan de in deze bijlage vastgestelde criteria. Zij kunnen worden gebruikt voor screeningsdoeleinden en/of bevestigingsdoeleinden:

- Methoden voor screeningsdoeleinden (screeningsmethoden) zijn methoden die worden gebruikt om de aanwezigheid van een analyt of een klasse van analyten vast te stellen op het betrokken concentratieniveau. Met deze methoden kunnen in korte tijd veel monsters worden verwerkt en ze worden gebruikt om uit grote aantallen monsters die monsters te selecteren die mogelijk positief reageren. Zij zijn erop gericht fout-negatieve resultaten te vermijden.

- Methoden voor bevestigingsdoeleinden (bevestigingsmethoden) zijn methoden die volledige of aanvullende informatie leveren voor de ondubbelzinnige identificatie van de analyt op het betrokken concentratieniveau. Deze methoden zijn erop gericht fout-positieve resultaten te vermijden en de kans op fout-negatieve resultaten binnen aanvaardbare perken te houden.

1.1.2. Analyt

De analyt is dat deel van een analysemonster, waarvan de aanwezigheid of afwezigheid moet worden aangetoond, dat moet worden geïdentificeerd en/of waarvan het gehalte moet worden bepaald. Onder het begrip "analyt" vallen, indien nodig, ook de derivaten van de analyt die tijdens de analyse worden gevormd.

Een kwantitatieve meting van een analyt moet worden weergegeven als:

- een hoeveelheid, uitgedrukt in massa-eenheden (b.v. mg, ng)

of

- een gehalte, uitgedrukt in een massafractie (b.v. mg kg 1, ng kg 1), een massaconcentratie (b.v. mg·l 1) of een concentratie (b.v. mol·l 1).

1.1.3. Monsters

1.1.3.1. Laboratoriummonster

Dit is een hoeveelheid monstermateriaal zoals die voor keuring of onderzoek naar het laboratorium wordt gezonden.

1.1.3.2. Analysemonster

Dit is een monster dat is bereid uit het laboratoriummonster, en waaruit de analyseporties worden genomen.

1.1.3.3. Analyseportie

Dit is de hoeveelheid materiaal, genomen uit het analysemonster (of uit het laboratoriummonster indien beide hetzelfde zijn), waarop de waarneming of de test daadwerkelijk wordt uitgevoerd.

1.1.4. Standaardanalyt

De standaardanalyt is een welbepaalde stof met een gekend analytgehalte en met de hoogst mogelijke zuiverheid, die als referentie bij de analyse wordt gebruikt.

1.1.5. Referentiemateriaal

Het referentiemateriaal is een materiaal waarvan één of meer eigenschappen met behulp van een gevalideerde methode zijn bevestigd, zodat hiermee een apparaat kan worden geijkt of een meetmethode kan worden gecontroleerd.

1.1.6. Blancobepalingen

1.1.6.1. Bepaling van het blancomonster

Dit is het volledige analyseproces, toegepast op een testportie, genomen uit een monster zonder de analyt.

1.1.6.2. Blancobepaling reagentia

Dit is het volledige analyseproces, toegepast met weglating van de analyseportie of met vervanging van de analyseportie door een overeenkomstige hoeveelheid geschikt oplosmiddel.

1.1.7. Specificiteit

De specificiteit is de geschiktheid van een methode om een onderscheid te maken tussen de te bepalen analyt en andere stoffen. Deze eigenschap is in hoofdzaak afhankelijk van het gebruikte meetprincipe, maar kan variëren naar gelang van de klasse waartoe de verbinding of de matrix behoort.

Bijzonderheden inzake de specificiteit moeten ten minste betrekking hebben op die stoffen waarvan kan worden verwacht dat zij een signaal veroorzaken als het beschreven meetprincipe wordt toegepast, bij voorbeeld homologe verbindingen, analoge verbindingen en metabolieten van het betrokken residu. Uit deze bijzonderheden inzake de specificiteit moet kunnen worden afgeleid in hoeverre met de methode onder de gegeven proefomstandigheden een kwantitatief onderscheid kan worden gemaakt tussen de analyt en de andere stoffen.

1.1.8. Nauwkeurigheid

In deze beschikking wordt onder nauwkeurigheid verstaan de nauwkeurigheid van het gemiddelde. De te hanteren definitie hiervan is vastgelegd in ISO-norm 3534-1977 onder punt 2.83 ( "Accuracy of the mean: the closeness of agreement between the true value and the mean result which would be obtained by applying the experimental procedure a very large number of times") (Nauwkeurigheid van het gemiddelde: de mate van overeenstemming tussen de ware waarde en het gemiddelde resultaat dat zou worden verkregen door de testprocedure een zeer groot aantal malen toe te passen).

De nauwkeurigheid wordt vooral beperkt door:

a) toevallige afwijkingen;

b) systematische afwijkingen.

Bij een zeer groot aantal herhalingen benadert de nauwkeurigheid van het gemiddelde de systematische afwijking. Het aantal herhalingen moet worden vermeld ten behoeve van de niet-experimentele beoordeling van de methode.

De maat voor de nauwkeurigheid is het verschil tussen de gemiddelde waarde die is gemeten voor referentiemateriaal, en zijn ware waarde, uitgedrukt in een percentage van de ware waarde. Als geen referentiemateriaal beschikbaar is, kunnen de relevante parameters worden bepaald door het analyseren van monstermateriaal waaraan een bekende hoeveelheid analyt is toegevoegd.

Indien geen absolute bepalingsmethoden, noch gecertificeerd referentiemateriaal beschikbaar zijn, mag voor de bepaling van de hoeveelheid analyt in een monster gebruik worden gemaakt van de resultaten die zijn verkregen met een methode die een hoge mate van specificiteit, nauwkeurigheid en precisie voor die analyt vertoont.

1.1.9. Precisie

De precisie is de mate van overeenstemming tussen de resultaten die worden verkregen door de testprocedure een aantal malen onder de voorgeschreven omstandigheden toe te passen (ISO-norm 3534-1977 (2), punt 2.84) en omvat herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid.

Herhaalbaarheid

Dit is de mate van overeenstemming tussen onafhankelijk van elkaar verkregen testresultaten onder herhaalbaarheidsomstandigheden, dat wil zeggen met dezelfde methode bij identiek analysemateriaal in hetzelfde laboratorium door dezelfde medewerker met dezelfde apparatuur en kort na elkaar.

Reproduceerbaarheid

Dit is de mate van overeenstemming tussen onafhankelijk van elkaar verkregen testresultaten onder reproduceerbaarheidsomstandigheden, dat wil zeggen met dezelfde methode bij identiek analysemateriaal in verschillende laboratoria door verschillende medewerkers met verschillende apparatuur.

Krachtens de bijlage bij Richtlijn 85/591/EEG van de Raad (3) dienen de waarden voor de precisie van de analysemethoden die krachtens de bepalingen van deze richtlijn voor vaststelling in aanmerking komen, te worden verkregen door middel van een gemeenschappelijk onderzoek dat bij voorkeur wordt uitgevoerd overeenkomstig ISO-norm 5725-1986 (4). In dat verband zijn de begrippen herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid gedefinieerd in ISO-norm 5725-1986. Voor die onderzoeken moet monstermateriaal worden gebruikt waarvan de analytconcentratie gekend is en schommelt rond het op te leggen maximale residugehalte.

Totdat de reproduceerbaarheid van een methode is bepaald aan de hand van een gemeenschappelijk onderzoek mag de voorselectie van in aanmerking komende methoden aan de hand van niet-experimentele beoordeling plaatsvinden op basis van de beschikbare gegevens over de herhaalbaarheid.

De te gebruiken maat voor de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid is de variatiecoëfficiënt zoals die is gedefinieerd in ISO-norm 3534-1977, punt 2.35 (Coefficient of variation: the ratio of the standard deviation to the absolute value of the arithmetic mean) (Variatiecoëfficiënt: het quotiënt van de standaardafwijking en de absolute waarde van het rekenkundige gemiddelde).

1.1.10. Aantoonbaarheidsgrens

De aantoonbaarheidsgrens is het kleinst gemeten gehalte waaruit de aanwezigheid van de analyt met een redelijke statistische zekerheid kan worden afgeleid (ten minste 95 % voor niet-toegelaten stoffen - zie punt 1.2.6.1). De aantoonbaarheidsgrens kan op verschillende manieren worden berekend:

a) Een manier is bepalingen aan ten minste 20 representatieve blancomonsters uit te voeren. De aantoonbaarheidsgrens wordt dan berekend als het gehalte dat overeenkomt met de gemiddelde gemeten waarde plus drie keer de standaardafwijking voor de blanco bepalingen.

Opmerking 1: De hoeveelheid analyseportie die normaal bij de bepaling wordt gebruikt, moet worden opgegeven.

Opmerking 2: Als te verwachten is dat factoren als soort, geslacht, ouderdom, voeding of andere omgevingsfactoren de eigenschappen van een methode kunnen beïnvloeden, is een serie van ten minste 20 blancomonsters vereist voor elke individuele homogene populatie waarop de methode wordt toegepast.

b) Een andere manier is de aantoonbaarheidsgrens te berekenen als het gehalte dat overeenkomt met drie keer de piek-tot-piekruis; dit is alleen toepasbaar bij spectrometrische bepalingen waarbij representatieve blancobepalingen alleen ruis geven.

1.1.11. Bepaalbaarheidsgrens

De bepaalbaarheidsgrens is de kleinste hoeveelheid analyt waarvoor de methode is gevalideerd met gespecificeerde nauwkeurigheid en precisie.

1.1.12. Gevoeligheid

De gevoeligheid is een maat voor de mogelijkheid om met een methode verschillen in de concentratie van een analyt waar te nemen. In deze beschikking wordt de gevoeligheid berekend als de helling van de ijklijn bij het betrokken concentratieniveau.

1.1.13. Uitvoerbaarheid

De uitvoerbaarheid is een eigenschap van een analyseproces die afhangt van het toepassingsgebied van de methode en die wordt bepaald door de eisen inzake bij voorbeeld de snelheid waarmee de monsters worden verwerkt en de kosten.

1.1.14. Toepasbaarheid

De toepasbaarheid is een overzicht van monstermaterialen en/of analyten waarop de methode zonder meer of met welbepaalde geringe aanpassingen kan worden toegepast.

1.1.15. Interpretatie van de resultaten

1.1.15.1. Positief resultaat

De aanwezigheid van de analyt in het monster wordt volgens de gebruikte analysemethode bewezen als aan de algemene criteria en de specifieke criteria voor de desbetreffende detectiemethode wordt voldaan.

a) Voor stoffen met een nultolerantie is het resultaat van de analyse "positief" als de identiteit van de analyt in het monster ondubbelzinnig is bewezen;

b) Voor stoffen met een vastgesteld maximaal residugehalte is het resultaat van de analyse "positief" als het experimenteel bepaalde gehalte aan de analyt in het monster (na eventuele correctie voor de terugvinding) groter is dan het vastgestelde maximale residugehalte, waarbij rekening wordt gehouden met de aanvaardbare waarschijnlijkheid van fout-positieve of fout-negatieve resultaten.

1.1.15.2. Negatief resultaat

Het resultaat van de analyse wordt als "negatief" beschouwd volgens de gebruikte analysemethode als aan de algemene criteria en de specifieke criteria voor de desbetreffende detectiemethode wordt voldaan wanneer het gaat om analyses van adequaat referentiemateriaal en om blancobepalingen, en als

a) in geval van stoffen waarvoor een nultolerantie geldt, de identiteit van de analyt niet ondubbelzinnig is bewezen,

of

b) in geval van stoffen met een vastgesteld maximaal residugehalte, het gemeten gehalte aan analyt in het monster lager is dan het in punt 1.1.15.1, onder b), bedoelde niveau. Opmerking: Een negatief resultaat bewijst in geval a) niet dat de analyt niet in het monster aanwezig is, of in geval b) niet dat het ware analytgehalte beneden het maximale residugehalte ligt.

1.1.16. Co-chromatografie

Bij deze procedure wordt de gezuiverde testoplossing vóór de chromatografiestap(pen) in tweeën gedeeld en wordt:

a) een deel als zodanig chromatografisch gescheiden;

b) aan het andere deel de te identificeren standaardanalyt toegevoegd en wordt deze gemengde oplossing van testoplossing en standaardanalyt chromatografisch gescheiden. De hoeveelheid toegevoegde standaardanalyt moet ongeveer gelijk zijn aan de geschatte hoeveelheid analyt in de testoplossing.

1.1.17. Immunogram

In deze beschikking wordt een immunogram gedefinieerd als een grafische afbeelding van de immunochemische respons uitgezet tegen de retentietijd of het elutievolume zoals verkregen uit de chromatografische scheiding met (in het algemeen off-line) immunochemische detectie van de componenten van het monsterextract.

1.2. Algemene eisen

1.2.1. Criteria

Krachtens de bijlage bij Richtlijn 85/591/EEG moeten bij de toetsing van de analysemethoden de onderstaande criteria worden aangehouden.

1.2.2. Screeningsmethoden

Voor screeningsmethoden kunnen geen vaste eisen gelden. Bij de uitvoering dient er vooral op te worden toegezien dat fout-negatieve resultaten bij het betrokken concentratieniveau zo weinig mogelijk voorkomen.

1.2.2.1. De specificiteit moet worden aangegeven.

1.2.2.2. Nauwkeurigheid en precisie

Kwantificering is niet altijd noodzakelijk. Afhankelijk van het feit of het gebruik van een stof verboden of toegestaan is, kan een screeningsmethode kwalitatief of kwantitatief zijn. Fout-positieve resultaten zijn aanvaardbaar maar fout-negatieve resultaten bij het betrokken concentratieniveau moeten zo weinig mogelijk voorkomen.

1.2.2.3. Aantoonbaarheidsgrens

Deze moet geschikt zijn voor het toepassingsgebied. Voor stoffen met een vastgesteld maximaal residugehalte moet de aantoonbaarheidsgrens voldoende laag zijn om residuen op dit niveau aan te tonen. Voor stoffen die niet mogen worden gebruikt bij voor de voedselproduktie gehouden dieren, moet de aantoonbaarheidsgrens zo laag als mogelijk zijn.

1.2.2.4. Uitvoerbaarheid

Het is wenselijk dat de monsters met hoge snelheid kunnen worden verwerkt en de kosten dienen laag te zijn.

1.2.3. Bevestigingsmethoden

1.2.3.1. Specificiteit

Bevestigingsmethoden moeten, voor zover mogelijk, ondubbelzinnige informatie opleveren over de chemische structuur van de analyt. Indien meer dan één stof dezelfde respons geeft, kan de methode geen onderscheid maken tussen deze stoffen.

Methoden die alleen zijn gebaseerd op chromatografische analyse, zonder gebruikmaking van moleculaire spectrometrische detectie, zijn niet geschikt als bevestigingsmethoden.

Indien een bepaalde techniek als zodanig onvoldoende specifiek is, kan de gewenste specificiteit worden bereikt door de toepassing van anlysemethoden die bestaan uit geschikte combinaties van zuivering, chromatografische scheiding(en) en spectrometrische of immunochemische detectie, bij voorbeeld GC-MS, LC-MS, IAC/GC-MS, GC-IR, LC-IR, LC/IMG.

1.2.3.2. Nauwkeurigheid

Bij herhaalde analyse van een referentiemateriaal gelden ten aanzien van de afwijking van het gemiddelde experimenteel bepaalde gehalte (eventuele correctie voor de terugvinding) ten opzichte van de ware waarde, de volgende richtwaarden:

Bij herhaalde analyse van een referentiemateriaal onder reproduceerbaarheidsomstandigheden gelden de volgende typische waarden voor de "interlaboratory" variatiecoëfficiënt (VC), berekend volgens de Horwitz-vergelijking [VC(%) = 2(5) 0,5 logC)], waarin C het gehalte is, uitgedrukt als een macht van 10):

variatiecoëfficiënt (VC) gewoonlijk tussen de helft en twee derde van de hierboven aangegeven waarden. 1.2.3.4. Aantoonbaarheidsgrens

Deze is toereikend voor het toepassingsgebied (zie punt 1.2.6.1).

1.2.3.5. Bepaalbaarheidsgrens

Deze is toereikend voor het toepassingsgebied (zie punt 1.2.6.2).

1.2.3.6. Gevoeligheid

Deze is toereikend voor het toepassingsgebied.

1.2.3.7. Uitvoerbaarheid

Snelheid en kosten zijn van minder belang dan bij screeningsmethoden. Bij bevestigingsmethoden zijn de meeste aspecten van de uitvoerbaarheid van ondergeschikte betekenis vergeleken met de andere in deze beschikking gedefinieerde criteria. Gewoonlijk is het voldoende dat de nodige reagentia en apparatuur beschikbaar zijn.

1.2.4. IJklijn

Als bij de methode gebruik wordt gemaakt van een ijklijn, moet de volgende informatie worden gegeven:

- de mathematische formule waarmee de ijklijn wordt beschreven;

- het aanvaardbare bereik waarbinnen de parameters van de ijklijn van dag tot dag mogen variëren;

- het werkbereik van de ijklijn.

Indien mogelijk moeten geschikte interne standaarden en referentiematerialen worden gebruikt om de kwaliteit van ijklijnen van bevestigingsmethoden te controleren, en tevens dienen details van de variantie van de variabelen die ten minste geldt voor het werkbereik van de ijklijn, te worden gegeven.

1.2.5. Gevoeligheid voor storingen

1.2.5.1. Voor alle proefomstandigheden die in de praktijk aan fluctuaties onderhevig zouden kunnen zijn (bij voorbeeld stabiliteit van de reagentia, samenstelling van het monster, pH, temperatuur) dienen alle afwijkingen, die invloed zouden kunnen hebben op het resultaat van de analyse, te worden aangegeven. In de beschrijving van de methode dient te worden aangegeven op welke wijze te voorziene storingen kunnen worden verholpen. Indien noodzakelijk dienen alternatieve detectieprincipes, geschikt voor bevestiging, te worden beschreven.

1.2.5.2. Indien co-chromatografie wordt toegepast, moet slechts één piek worden verkregen, waarvan de toename van de piekhoogte (of het oppervlak) evenredig is met de hoeveelheid toegevoegd analyt. Bij GC of LC dient de piekbreedte op maximumhoogte binnen een bereik van 90-110 % van de oorspronkelijke breedte te blijven en moeten de retentietijden identiek zijn binnen een marge van 5 %. Bij DLC-methoden mag de vlek, waarvan wordt aangenomen dat hij wordt veroorzaakt door de analyt, alleen in intensiteit toenemen; er mag geen nieuwe vlek worden gevormd en de vlek mag visueel niet van uiterlijk veranderen.

1.2.5.3. Het is van het grootste belang dat eventuele aan matrixcomponenten toe te schrijven storingen worden bestudeerd.

1.2.6. Relatie tussen toegestane residuniveaus en analysegrenzen

1.2.6.1. Voor stoffen die niet mogen worden gebruikt bij voor de voedselproduktie gehouden dieren moet de aantoonbaarheidsgrens van de analysemethode laag genoeg zijn om te garanderen dat residugehalten, die te verwachten zijn na illegaal gebruik, met ten minste 95 % waarschijnlijkheid worden opgespoord.

1.2.6.2. Voor stoffen met een vastgesteld maximaal residugehalte, mag de bepaalbaarheidsgrens van de methode vermeerderd met drie keer de standaardafwijking die de methode vertoont voor een monster met een gehalte gelijk aan het maximale residugehalte, niet hoger zijn dan het vastgestelde maximale residugehalte.

1.2.6.3. Voor stoffen met een vastgesteld maximaal residugehalte moet de methode zowel bij dat gehalte, als bij de helft en het dubbel van dat gehalte worden gevalideerd.

2. CRITERIA VOOR DE IDENTIFICERING EN KWANTIFICERING VAN RESIDUEN

2.1. Algemene bepalingen

Laboratoria die analyses uitvoeren voor de definitieve bevestiging van de aanwezigheid van residuen van organische stoffen met een laag moleculair gewicht, dienen erop toe te zien dat aan de criteria voor de interpretatie van de resultaten wordt voldaan overeenkomstig de in dit deel vastgelegde eisen. De criteria zijn gericht op identificatie van de analyt en hebben ten doel fout-positieve resultaten te voorkomen. Een analyseresultaat kan slechts positief zijn indien wordt voldaan aan de criteria die voor de desbetreffende analysemethode zijn vastgelegd.

2.2. Algemene beschouwingen voor de hele analysemethode

2.2.1. Voorbehandeling van het monster

Het monster moet op een zodanige manier worden verkregen, vervoerd en behandeld dat er een maximale kans is dat de analyt, indien aanwezig, wordt aangetoond.

2.2.2. Gevoeligheid voor storingen

De in punt 1.2.5 (Gevoeligheid voor storingen) genoemde gegevens moeten beschikbaar worden gesteld.

2.2.3. Algemene criteria voor de hele procedure

2.2.3.1. De specificiteit (punt 1.1.7), de aantoonbaarheidsgrens (punt 1.1.10) en de bepaalbaarheidsgrens (punt 1.1.11) van de methode voor de opsporing van de analyt in het onderzochte monstermateriaal moeten bekend zijn.

Opmerking: Deze informatie kan verkregen worden uit testgegevens en/of theoretische beschouwingen.

2.2.3.2. Voor een positief resultaat mag het fysische en chemische gedrag van de analyt tijdens de analyse niet te onderscheiden zijn van het gedrag van de overeenkomstige standaardanalyt in het betreffende monstermateriaal.

2.2.3.3. Zowel een positief als een negatief resultaat van de analyse is alleen dan geldig wanneer de specificiteit, de aantoonbaarheidsgrens en de bepaalbaarheidsgrens van de methode voor de betrokken analyt en het betrokken monstermateriaal in acht worden genomen.

2.2.3.4. Referentiemateriaal of materiaal waaraan bekende hoeveelheden analyt zijn toegevoegd, dienen bij voorkeur de gehele procedure te doorlopen, samen met iedere serie analysemonsters. Als alternatief kan een interne standaard aan de analysemonsters worden toegevoegd.

2.2.4. Criteria voor off-line fysische en/of chemische voorconcentratie, zuivering en scheiding

2.2.4.1. De analyt moet aanwezig zijn in de fractie die kenmerkend is voor de overeenkomstige standaardanalyt in het betreffende monstermateriaal onder dezelfde proefomstandigheden.

2.2.4.2. De retentiegegevens voor standaardmateriaal, controlemonsters en analyseporties dienen te worden opgegeven samen met het eindresultaat: positief of negatief.

2.2.5. Critera voor kwantitatieve bepalingen

2.2.5.1. De terugvinding moet worden gemeten en gespecificeerd voor alle kwantitatieve bepalingen.

2.2.5.2. De voor de terugvinding geconstateerde variabiliteit binnen het laboratorium dient zo laag mogelijk te zijn.

2.2.5.3. Er moet duidelijk zijn aangegeven of de eindresultaten al of niet zijn gecorrigeerd voor de terugvinding. Als dit is gedaan moet de gebruikte methode voor de correctie worden beschreven.

2.3. Criteria voor analysemethoden die alleen in combinatie met andere methoden voor bevestigingsdoeleinden mogen worden gebruikt

2.3.1. Kwaliteitseisen voor de bepaling van een analyt via IA

2.3.1.1. Het werkbereik van de ijklijn moet worden gespecificeerd en moet in het algemeen concentraties omvatten die ten minste een factor tien verschillen.

2.3.1.2. Ten minste zes ijkpunten zijn vereist, die adequaat moeten zijn verdeeld over de ijklijn.

2.3.1.3. Bruikbare parameters voor kwaliteitscontrole moeten overeenstemmen met die van eerdere bepalingen, bij voorbeeld NSB en de parameters van de ijklijn.

2.3.1.4. In elke bepaling moeten controlemonsters worden opgenomen. Concentraties: nul en in het lagere, middelste en hogere gedeelte van het werkbereik. De resultaten voor deze monsters moeten overeenstemmen met die van eerdere bepalingen.

Alle oorspronkelijke meetgegevens voor de controlemonsters en voor de analyseportie moeten woren meegedeeld samen met het eindresultaat: positief of negatief.

2.3.2. Criteria voor de bepaling van een analyt via GC of LC met niet-specifieke detectie

2.3.2.1. De analyt moet elueren bij de retentietijd die karakteristiek is voor de overeenkomstige standaardanalyt onder dezelfde proefomstandigheden.

2.3.2.2. De afstand tussen de karakteristieke piek van de analyt en de top van de dichtstbijzijnde piek in het chromatogram moet ten minste eenmaal de volle piekbreedte zijn op 10 % van de maximumhoogte.

2.3.2.3. Voor nadere informatie kan co-chromatografie worden toegepast, alsmede chromatografie met ten minste twee kolommen met verschillende polariteit.

2.3.3. Criteria voor de bepaling van een analyt via DLC

2.3.3.1. De Rf-waarde(n) van de analyt moet(en) overeenstemmen met de Rf-waarde(n) die karakteristiek is (zijn) voor de standaardanalyt. Hieraan wordt voldaan wanneer het verschil tussen de Rf-waarde(n) van de analyt en de Rf-waarde(n) van de standaardanalyt onder dezelfde proefomstandigheden kleiner is dan ± 3 %.

2.3.3.2. De vlekken van de analyt mogen visueel niet te onderscheiden zijn van de vlekken van de standaardanalyt.

2.3.3.3. De afstand tussen de vlek van de analyt en het middelpunt van de dichtstbijzijnde vlek moet ten minste gelijk zijn aan de helft van de som van de diameters van de vlekken.

2.3.3.4. Voor nadere informatie kan co-chromatografie en/of tweedimensionale DLC worden toegepast.

2.4. Criteria voor analysemethoden die ter bevestiging mogen worden gebruikt

2.4.1. Criteria voor de bepaling van een analyt via LC/IA of LC/IMG

2.4.1.1. De piek van de analyt in het IMG moet bij LC/IMG zijn opgebouwd uit ten minste vijf LC-fracties.

2.4.1.2. Aan de criteria onder de punten 2.2.4.1 en 2.2.4.2 moet worden voldaan.

2.4.1.3. Reagentia

De herkomst en de eigenschappen van het antilichaam en de andere reagentia moeten worden gespecificeerd.

2.4.1.4. IJklijn

Aangezien de methode gebaseerd is op ijklijnen, moet de in punt 1.2.4 (ijklijn) genoemde informatie worden verstrekt. Aan de voor IA gespecificeerde kwaliteitseisen (punten 2.3.1.1 tot en met 2.3.1.4) moet worden voldaan.

2.4.1.5. Voor bevestigingsdoeleinden moeten, indien de methode niet in combinatie met andere methoden wordt gebruikt, twee verschillende LC-scheidingen of twee immunogrammen met gebruikmaking van antilichamen met verschillende specificiteit worden uitgevoerd.

2.4.2. Criteria voor de bepaling van een analyt via LC-SP

2.4.2.1. Aan de criteria onder de punten 2.3.2.1 en 2.3.2.2 moet worden voldaan.

2.4.2.2. De absorptiemaxima in het spectrum van de analyt moeten bij dezelfde golflengten liggen als die van de standaardanalyt, binnen een marge die afhankelijk is van de resolutie van het detectiesysteem. Voor detectie met diodearray is de karakteristieke marge ± 2 nm.

2.4.2.3. Het spectrum van de analyt boven 220 nm mag voor de delen van de twee spectra met een relatieve absorptie & ge; 10 % niet visueel verschillen van het spectrum van de standaardanalyt. Aan dit criterium wordt voldaan wanneer dezelfde maxima aanwezig zijn en het verschil tussen de twee spectra op geen enkel punt groter is dan 10 % van de absorptie van de standaardanalyt.

2.4.2.4. Voor bevestigingsdoeleinden is, indien de methode niet in combinatie met andere methoden wordt gebruikt, co-chromatografie in de LC-stap verplicht. Zie punt 1.2.5.2 voor de eisen gesteld aan co-chromatografie.

2.4.3. Criteria voor de bepaling van een analyt via DLC-SP

2.4.3.1. De methode moet voldoen aan de voor DLC gespecificeerde criteria (punten 2.3.3.1 tot en met 2.3.3.3).

2.4.3.2 De absorptiemaxima in het spectrum van de analyt moeten bij dezelfde golflengten liggen als die van de standaardanalyt, binnen een marge die afhankelijk is van de resolutie van het detectiesysteem.

2.4.3.3. Het spectrum van de analyt mag niet visueel verschillen van het spectrum van de standaardanalyt.

2.4.3.4. Voor bevestigingsdoeleinden is, indien de methode niet in combinatie met andere methoden wordt gebruikt, co-chromatografie in de DLC-stap verplicht. Zie punt 1.2.5.2 voor de eisen gesteld aan co-chromatografie.

2.4.4. Criteria voor de bepaling van een analyt via GC-MS

2.4.4.1. GC-criteria

2.4.4.1.1. Aan de criteria onder de punten 2.3.2.1 en 2.3.2.2. moet worden voldaan.

2.4.4.1.2. Er moet gebruikt worden gemaakt van een interne standaard indien een daarvoor geschikt materiaal beschikbaar is. Bij voorkeur wordt hiervoor een stabiele, met een isotoop gemerkte vorm van de analyt gebruikt of, indien deze niet beschikbaar is, een verwante standaard met een retentietijd vlakbij die van de analyt.

2.4.4.1.3. De verhouding tussen de retentietijd van de analyt bij GC en de retentietijd van de interne standaard, d.i. de relatieve retentietijd van de analyt, moet dezelfde zijn als die van de standaardanalyt in een hiermee overeenkomende matrix, binnen een marge van ± 0,5 %.

2.4.4.1.4. Voor bevestigingsdoeleinden moet, indien geen interne standaard wordt gebruikt, identificatie van de analyt worden ondersteund door gebruik te maken van co-chromatografie.

2.4.4.2. Criteria voor LRMS

2.4.4.2.1. Bij gebruik als screeningsmethode moet ten minste de intensiteit van het meest abundante diagnostische ion worden gemeten.

2.4.4.2.2. Bij gebruik als bevestigingsmethode moeten de intensiteiten van bij voorkeur ten minste vier diagnostische ionen worden gemeten. Indien de verbinding met de gebruikte methode geen vier diagnostische ionen oplevert, moet de identificatie van de analyt gebaseerd zijn op de resultaten van ten minste twee onafhankelijke GC-LRMS-methoden met verschillende derivaten en/of ionisatietechnieken, die telkens twee of drie diagnostische ionen produceren.

Het moleculaire ion is bij voorkeur een van de vier gekozen diagnostische ionen.

2.4.4.2.3. De relatieve abundantie van alle gemeten diagnostische ionen van de analyt moet overeenstemmen met die van de standaardanalyt, bij voorkeur binnen een marge van ± 10 % (EI mode) of ± 20 % (CI mode).

2.4.5. Criteria voor de identificatie van een analyt via IR

2.4.5.1. Definitie van adequate pieken

Adequate pieken zijn absorptiemaxima in het infraroodspectrum van een standaardanalyt, die aan de volgende eisen voldoen:

2.4.5.1.1. Het absorptiemaximum ligt in het golfgetalgebied van 1 800-500 cm 1.

2.4.5.1.2. De intensiteit van de absorptie is niet minder dan:

a) een specifieke molaire absorptie van 40 ten opzichte van de nullijn en van 20 ten opzichte van de basislijn van de piek, of

b) een relative absorptie die gelijk is aan 12,5 % van de absorptie van de piek met maximale absorptie in het gebied van 1 800 - 500 cm 1 wanneer beide ten opzichte van de nullijn worden gemeten, en aan 5 % van de absorptie van de piek met maximale absorptie in het gebied van 1 800 - 500 cm 1 wanneer beide ten opzichte van de basislijn van de piek worden gemeten.

Opmerking: Hoewel adequate pieken volgens a) vanuit theoretisch oogpunt de voorkeur verdienen, zijn adequate pieken volgens b) in de praktijk gemakkelijker te bepalen.

2.4.5.2. Het aantal pieken in het infrarood-spectrum van de analyt, waarvan de frequentie binnen een marge van ± 1 cm 1 overeenkomt met een adequate piek in het spectrum van de standaardanalyt, wordt bepaald.

2.4.5.3. IR-criteria

2.4.5.3.1. Absorptie moet aanwezig zijn in alle gebieden van het spectrum van de analyt die overeenkomen met een adequate piek in het referentiespectrum van de standaardanalyt.

2.4.5.3.2. In het infraroodspectrum van de standaardanalyt moeten minimaal zes adequate pieken aanwezig zijn. Indien er minder dan zes adequate pieken zijn, kan het desbetreffende spectrum niet als referentiespectrum worden gebruikt.

2.4.5.3.3. De "score", dat is het percentage adequate pieken dat in het infraroodspectrum van de analyt wordt gevonden, moet ten minste 50 bedragen.

2.4.5.3.4. Wanneer een gebied niet exact overeenkomt met een adequate piek, mag het relevante gebied van het analytspectrum de aanwezigheid van een overeenkomstige piek niet uitsluiten.

2.4.5.3.5. De procedure is alleen van toepassing op absorptiepieken in het spectrum van het monster met een intensiteit van ten minste drie maal de piek-tot-piekruis.

2.5. Andere analysemethoden

Andere analysemethoden of combinaties van methoden dan die welke zijn vermeld in de punten 2.3 en 2.4 (bv. LC-MS, MS-MS, GC-IR) mogen als screeningsmethode of als bevestigingsmethode worden toegepast, mits voldaan wordt aan vergelijkbare criteria aan de hand waarvan ondubbelzinnige identificatie van de analyt in het betrokken concentratiegebied mogelijk is.

AANHANGSEL Lijst van afkortingen en symbolen CI = chemische ionisatie

EI = elektroneninvangionisatie

g = gram

GC = gaschromatografie

IA = immunoassay

IAC = immunoaffiniteitschromatografie

IMG = immunogram

IR = infraroodspectrometrie

kg = kilogram (103 g)

l = liter(s)

LC = vloeistofchromatografie

LRMS = lage-resolutiemassaspectrometrie

mg = milligram (10 3 g)

MS = massaspectrometrie

ng = nanogram (10 9 g)

NSB = niet-specifieke binding = aspecifieke binding (ASB)

Rf = afgelegde afstand in verhouding tot het front van het solvens

SP = spectrometrie, bij voorbeeld met diodearraydetectie

DLC = dunne-laagchromatografie

mg = microgram (10 6 g)

/ = off-line gekoppelde technieken

- = on-line gekoppelde technieken

bij voorbeeld LC/GC - MS = LC off-line gevolgd door GC met on-line MS

(1) PB nr. L 275 van 26. 9. 1986, blz. 36.

(2) International Organization for Standardization: Statistics - vocabulary and symbols.

(3) PB nr. L 372 van 31. 12. 1985, blz. 50.

(4) International Organization for Standardization: Precision of test methods - determination or repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.