19)

In deel C worden de volgende hoofdstukken toegevoegd: „C.47 Test op toxiciteit bij vissen in vroege levensstadia (FELS — fish early-life stage) INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 210 (2013) van de OESO. Tests in de vroege levensfasen van vissen zijn bedoeld om de letale en subletale effecten van chemische stoffen op de geteste levensfasen en soorten vast te stellen. Zij leveren waardevolle informatie op voor het ramen van de chronische letale en subletale effecten van de chemische stof op andere vissoorten. 2. Testrichtlijn 210 is gebaseerd op een voorstel van het Verenigd Koninkrijk dat werd besproken tijdens een bijeenkomst van OESO-deskundigen in Medmenham (Verenigd Koninkrijk) in november 1988 en werd verder bijgewerkt in 2013 in het licht van de ervaringen met het gebruik van de test en aanbevelingen van een OESO-workshop over toxiciteitstests bij vissen die werd gehouden in september 2010 (1). PRINCIPE VAN DE TEST 3. De vroege levensfasen van vissen worden blootgesteld aan een concentratiebereik van de in water opgeloste teststof. Dit gebeurt bij voorkeur onder doorstroomomstandigheden, al kunnen semistatische omstandigheden ook worden aanvaard als dat niet mogelijk is. Voor meer informatie dient de OESO-leidraad voor het testen op aquatische toxiciteit bij moeilijke stoffen en mengsels te worden geraadpleegd (2). Aan het begin van de test worden bevruchte eieren in testkamers geplaatst, waarna de test doorloopt gedurende de tijd die nodig is voor de controlevissen om de jonge levensstadium te bereiken. Deze periode is specifiek voor elke soort. De letale en subletale effecten worden beoordeeld en vergeleken met de controlewaarden om de laagste concentratie met waargenomen effecten (lowest observed effect concentration, LOEC) te bepalen, om zo i) de concentratie waarbij geen effect wordt waargenomen (no observed effect concentration, NOEC) en/of ii) de ECx (bv. EC10, EC50) te bepalen door met behulp van een regressiemodel een raming te maken van de concentratie die zou leiden tot een verandering van het effect met x %. De rapportage van de relevante effectconcentraties en parameters kan afhankelijk zijn van het regelgevingskader. De ECx moet in het bereik van de testconcentraties liggen, zodat de ECx kan worden bepaald door interpolatie in plaats van extrapolatie (zie aanhangsel 1 voor definities). INFORMATIE OVER DE TESTSTOF 4. Met de term “teststof” wordt verwezen naar datgene dat wordt getest. De oplosbaarheid in water (zie hoofdstuk A.6 van deze bijlage) en de dampspanning (zie hoofdstuk A.4 van deze bijlage) van de teststof moeten bekend zijn. Tevens moet er een betrouwbare analysemethode, met een bekende en gerapporteerde nauwkeurigheid en bepaalbaarheidsgrens, beschikbaar zijn voor de kwantificering van de chemische stof in de testoplossingen. Hoewel dit niet nodig is voor het uitvoeren van de test, kunnen de resultaten van een acute-toxiciteitstest (zie hoofdstukken C.1 of C.49 van deze bijlage), bij voorkeur uitgevoerd op de soorten die voor deze test werden gekozen, nuttige informatie opleveren. 5. Indien de testmethode wordt gebruikt voor het testen van een mengsel, moet de samenstelling van het mengsel in de mate van het mogelijke worden gekarakteriseerd, bv. aan de hand van de chemische identiteit van de bestanddelen, hun kwantitatieve aandeel in het mengsel en hun stofspecifieke eigenschappen (zoals die hierboven vermeld). Voordat de testmethode wordt gebruikt om een mengsel te testen voor regelgevingsdoeleinden, dient te worden overwogen of zij aanvaardbare resultaten zal opleveren voor het beoogde regelgevingsdoel. 6. Nuttige gegevens over de teststof zijn de structuurformule, de zuiverheid van de stof, de oplosbaarheid van de stof in water, de stabiliteit van de stof in water en licht, pKa, Pow en de resultaten van een onderzoek naar de mate van gemakkelijke biologische afbreekbaarheid (bv. hoofdstuk C.4 of C.29 van deze bijlage). GELDIGHEID VAN DE TEST 7. Een test is uitsluitend onder de volgende voorwaarden geldig: — het gehalte aan opgeloste zuurstof moet gedurende de gehele test > 60 % van de verzadigingswaarde van lucht bedragen; — het verschil in watertemperatuur tussen de testkamers en tussen de opeenvolgende dagen mag op geen enkel moment van de test groter zijn dan ± 1,5 °C. Tevens mag de watertemperatuur niet hoger of lager zijn dan het temperatuurbereik dat voor de vissoort wordt gespecificeerd (aanhangsel 2); — analytische meting van de testconcentraties is verplicht; — het totale percentage bevruchte eitjes en uitgekomen vissen in de controlegroep en eventueel in de controle met alleen het oplosmiddel dat de test overleeft, moet groter of gelijk zijn aan de minimale percentages in aanhangsel 2. 8. Als er zich een kleine afwijking van de geldigheidscriteria voordoet, moeten de gevolgen daarvan voor de betrouwbaarheid van de testgegevens worden overwogen en moeten die overwegingen worden opgenomen in het verslag. De effecten op het overleven, het uitkomen en de groei in de oplosmiddelcontrole in vergelijking met de negatieve controle moeten worden gerapporteerd en besproken met het oog op de betrouwbaarheid van de testgegevens. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Testkamers 9. Alle glazen, roestvrijstalen of andere chemisch inerte bakken mogen worden gebruikt. Aangezien bekend is dat silicone een sterk vermogen heeft om lipofiele stoffen te absorberen, dient het gebruik van siliconenleidingen bij doorstroomstudies en het gebruik van siliconendichtingen die met water in contact komen, tot een minimum te worden beperkt door bv. glazen monobloc-aquaria te gebruiken. De afmetingen van de bakken moeten groot genoeg zijn om de nodige groei toe te laten in de controlegroep, het gehalte opgeloste zuurstof in stand te houden (voor kleine vissoorten volstaat bijvoorbeeld een bak met een volume van 7 liter) en de densiteitscriteria te handhaven die in punt 19 zijn vastgelegd. Het is wenselijk de testkamers willekeurig in het testgebied te plaatsen. Een gerandomiseerde blokopzet waarbij elke behandeling aanwezig is in elk blok, geniet de voorkeur boven een volledig gerandomiseerde opzet. De testkamers moeten worden beschermd tegen ongewenste invloeden van buitenaf. Het testsysteem moet bij voorkeur vooraf lang genoeg worden behandeld met concentraties van de teststof om stabiele blootstellingsconcentraties te kunnen aantonen voordat de testorganismen in het systeem worden geïntroduceerd. Keuze van de soorten 10. In tabel 1 staan de aanbevolen vissoorten. Dit sluit niet uit dat ook andere soorten mogen worden gebruikt, maar in dat geval kan het nodig zijn de testprocedure aan te passen om geschikte proefomstandigheden te creëren. Als er wordt gekozen voor een andere vissoort, moet worden aangegeven waarom er voor deze soort is gekozen en moet tevens worden gerapporteerd welke experimentele methode wordt toegepast. Leefomstandigheden van de broedvis 11. Meer informatie over de relatief beste leefomstandigheden voor de broedvissen vindt u in aanhangsel 3 en de genoemde referenties (3) (4) (5). Omgaan met bevruchte eieren, embryo's en larven 12. In eerste instantie kunnen bevruchte eieren, embryo's en larven binnen de hoofdbak worden onderverdeeld in kleinere glazen of roestvrijstalen bakken die zijn voorzien van gaaswanden waardoor de testoplossing vrij door de hoofdbak kan stromen. Een niet-turbulente doorstroming in deze kleine bakken kan worden verkregen door deze aan een arm te hangen die ze op en neer beweegt, waarbij de organismen te allen tijde onder water blijven. Bevruchte eitjes van zalmachtigen kunnen op een rek of gaas worden gelegd met gaten die zo groot zijn dat de larven, nadat ze zijn uitgekomen, erdoorheen kunnen vallen. 13. Indien er eihouders, roosters of gaaswerken zijn gebruikt om de eitjes in de hoofdbak op hun plaats te houden, moeten deze worden verwijderd zodra de larven uitkomen, zoals beschreven in de richtsnoeren in aanhangsel 3. Stukken gaas die voorkomen dat larven ontsnappen, mogen niet worden verwijderd. Als de larven moeten worden overgeplaatst, mogen zij niet aan de lucht worden blootgesteld. Er mogen geen netten worden gebruikt om larven uit de eihouders te halen. Het moment van overplaatsing is afhankelijk van de soort en moet worden gedocumenteerd in het verslag. Soms is overplaatsing echter niet nodig. Water 14. Water waarin de gekozen testsoort in afdoende mate langdurig kan overleven en groeien is geschikt als testwater (zie aanhangsel 4). Gedurende de testperiode moet de waterkwaliteit constant zijn. Om ervoor te zorgen dat het verdunningswater de testresultaten niet noemenswaardig beïnvloedt (bijvoorbeeld door complexvorming met de teststof) en geen ongunstige invloed heeft op de conditie van de broedvissen, moeten regelmatig monsters worden genomen en geanalyseerd. Zware metalen (bv. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), de belangrijkste anionen en kationen (bv. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO42-), ammonium, het totale residugehalte aan chloorpesticiden, het totaalgehalte aan organische koolstof en zwevende deeltjes moeten bijvoorbeeld halfjaarlijks worden bepaald als van het verdunningswater bekend is dat het een relatief constante kwaliteit heeft. Als van het water bekend is dat het een variabele kwaliteit heeft, moeten de metingen vaker worden verricht; de frequentie ervan is dan afhankelijk van hoe variabel de waterkwaliteit is. In aanhangsel 4 worden enkele chemische kenmerken van geschikt verdunningswater genoemd. Testoplossingen 15. Voor doorstroomtests is een systeem vereist dat de stamoplossing van de teststof continu verdeelt en verdunt en ervoor zorgt dat de testkamers de juiste reeks testconcentraties krijgen toegediend (bv. met een doseerpomp, mechanisme voor evenredige verdunning of saturatorsysteem). De stroomsnelheid van de stamoplossingen en het verdunningswater moet regelmatig worden gecontroleerd en mag gedurende de gehele test hooguit 10 % afwijken. Een stroomsnelheid die overeenkomt met ten minste vijf testkamervolumes per 24 uur is wenselijk (3). Als de in punt 19 vastgestelde densiteit wordt geëerbiedigd, is een lagere stroomsnelheid van bv. 2-3 testkamervolumes echter ook mogelijk om te voorkomen dat het voeder te snel wordt verwijderd. 16. De testoplossingen met de gekozen concentraties worden bereid door verdunning van een stamoplossing. De stamoplossing wordt bij voorkeur bereid door eenvoudig mengen of schudden van de teststof in verdunningswater met mechanische middelen (bijvoorbeeld door te roeren en/of met ultrasone trillingen). Voor het maken van een stamoplossing van een passende concentratie kunnen verzadigingskolommen (oplosbaarheidskolommen) of passieve doseringsmethoden (6) worden gebruikt. Het gebruik van een draagvloeistof wordt niet aanbevolen. Indien echter een oplosmiddel noodzakelijk is, moet gelijktijdig een controletest met het oplosmiddel worden uitgevoerd, met dezelfde oplosmiddelconcentratie als voor de chemische behandelingen wordt gebruikt. Dat wil zeggen dat het oplosmiddelniveau bij voorkeur gelijk moet zijn voor alle concentraties en voor de oplosmiddelcontrole. Voor sommige verdunningssystemen kan dat technisch moeilijk zijn; in dat geval dient de oplosmiddelconcentratie in de oplosmiddelcontrole gelijk te zijn aan de hoogste oplosmiddelconcentratie in de dosisgroep. Voor moeilijk te testen stoffen dient OESO-leidraad nr. 23 voor het testen op aquatische toxiciteit bij moeilijke stoffen en mengsels te worden geraadpleegd (2). Als er een oplosmiddel wordt gebruikt, dient de keuze van het juiste oplosmiddel af te hangen van de chemische eigenschappen van de teststof. In OESO-leidraad nr. 23 wordt een maximumconcentratie van 100 μl/l aanbevolen. Om potentiële effecten van het oplosmiddel op de gemeten eindpunten (7) te vermijden, wordt aanbevolen om de oplosmiddelconcentratie zo laag mogelijk te houden. 17. Voor een semi-statische test kunnen twee verschillende verversingsprocedures worden toegepast. Ofwel worden nieuwe testoplossingen bereid in schone bakken en worden de overlevende eieren en larven voorzichtig overgeplaatst naar de nieuwe bakken, ofwel worden de testorganismen in de testbakken gehouden terwijl een deel (ten minste twee derde) van het volume testoplossing/controle wordt vervangen. PROCEDURE Blootstellingsomstandigheden Duur 18. De test moet worden gestart zo snel mogelijk nadat de eieren zijn bevrucht en bij voorkeur in de testoplossing zijn geplaatst vóór, of zo snel mogelijk na, het begin van het blastodiscus-stadium. De duur van de test hangt af van de vissoort die wordt gebruikt. Aanhangsel 2 bevat de aanbevolen duur voor enkele soorten. Densiteit 19. Het aantal bevruchte eitjes aan het begin van de test moet toereikend zijn om te kunnen voldoen aan de statistische vereisten. De eitjes moeten willekeurig worden verdeeld over de verschillende behandelingen. Daarbij moeten ten minste 80 eitjes per concentratie worden gebruikt, gelijk verdeeld over ten minste drie replicaat-testkamers. De densiteit (biomassa per volume testoplossing) moet zo laag zijn dat het gehalte aan opgeloste zuurstof van minimaal 60 % van de luchtverzadigingswaarde zonder beluchting in stand kan worden gehouden tijdens het eistadium en het larvaal stadium. Bij doorstroomtests wordt een densiteit van maximaal 0,5 g/l nat gewicht per 24 uur en maximaal 5 g/l oplossing op een willekeurig moment (3) aanbevolen. Licht en temperatuur 20. De fotoperiode en watertemperatuur moeten worden afgestemd op de gekozen vissoort (zie aanhangsel 2). Voeding 21. Het voeder en het voeren zijn van kritiek belang, en het is essentieel dat voor elk levensstadium het juiste voeder wordt gegeven op het juiste moment en in een hoeveelheid die volstaat om de normale groei te ondersteunen. De dieren in alle replicaten dienen ongeveer dezelfde voeding te krijgen, tenzij er correcties nodig zijn om rekening te houden met de sterfte. Overtollig voedsel en fecaal materiaal moeten indien nodig worden verwijderd om te voorkomen dat er zich afvalstoffen ophopen. Aanhangsel 3 bevat gedetailleerde voederschema's, al worden het voer en de voederschema's voortdurend verfijnd om de overleving te verbeteren en de groei te optimaliseren naarmate meer ervaring wordt opgedaan. Levend voeder is een vorm van milieuverrijking en dient daarom te worden gebruikt in plaats van of als aanvulling op droogvoer of bevroren voeder, voor zover dat gepast is voor de desbetreffende soort en het desbetreffende levensstadium. Testconcentraties 22. Normaliter zijn er vijf concentraties van de teststof nodig, met een minimum van vier replicaten per concentratie, die een constante factor van maximaal 3,2 van elkaar verschillen. Bij het selecteren van de reeks concentraties moet rekening worden gehouden (1) met eventuele informatie over het acute toxiciteitsonderzoek, bij voorkeur bij dezelfde soort, en/of met een bereikbepalingstest. Bij het selecteren van de reeks testconcentraties dient evenwel rekening te worden gehouden met alle bronnen van informatie, met inbegrip van bronnen als een “read-across” of gegevens van een acute toxiciteitstest bij vissenembryo's. Een limiettest of uitgebreide limiettest met minder dan vijf concentraties kan als definitieve test worden aanvaard als er enkel empirische NOEC's moeten worden vastgesteld. Als er minder dan vijf concentraties worden gebruikt, moet er een motivering worden gegeven. Er mogen geen concentraties van de teststof worden gebruikt die hoger zijn dan de LC50 over 96 uur of, indien dit lager is, 10 mg/l. Controles 23. In aanvulling op de testreeks met concentraties van de teststof, moeten een verdunningswatercontrole en, indien nodig, een oplosmiddelcontrole met enkel het oplosmiddel als draagvloeistof worden uitgevoerd (zie punt 16). Frequentie van de analytische bepalingen en metingen 24. Voor aanvang van de blootstellingsperiode moet de juiste werking van het afgiftesysteem van de teststof zijn gewaarborgd voor alle replicaten (bijvoorbeeld door de testconcentraties te meten). De noodzakelijke analysemethoden moeten zijn vastgesteld, inclusief een passende bepaalbaarheidsgrens (limit of quantification, LOQ) en voldoende kennis over de stabiliteit van de stof in het testsysteem. Tijdens de test worden de concentraties van de teststof regelmatig bepaald om de blootstelling te karakteriseren. Er moeten minimaal vijf bepalingen plaatsvinden. In doorstroomsystemen moet de teststof ten minste een keer per week in één replicaat per concentratie analytisch worden bepaald, waarbij systematisch wordt gewisseld van replicaat. Aanvullende analytische bepalingen komen de kwaliteit van het testresultaat vaak ten goede. De monsters moeten mogelijk worden gefilterd om eventuele deeltjes te verwijderen (bijvoorbeeld met een poriëngrootte van 0,45 μm) of worden gecentrifugeerd om ervoor te zorgen dat de bepalingen betrekking hebben op de teststof in ware oplossing. Om de adsorptie van de teststof te beperken, moeten de filters worden verzadigd voor gebruik. Wanneer de gemeten concentraties niet binnen de nominale concentratie van 80-120 % blijven, dienen de effectconcentraties te worden bepaald en uitgedrukt in verhouding tot het rekenkundige gemiddelde van de concentraties voor doorstroomtests (zie aanhangsel 6 van testmethode C.20 voor de berekening van het rekenkundig gemiddelde (8)), en uitgedrukt in verhouding tot het geometrische gemiddelde van de gemeten concentraties voor semistatische tests (zie hoofdstuk 5 in de OESO-leidraad voor het testen op aquatische toxiciteit bij moeilijke stoffen en mengsels (2)). 25. In de loop van de test moet het gehalte aan opgeloste zuurstof, de temperatuur en de pH in alle testbakken ten minste één keer per week worden gemeten. Het zoutgehalte en de hardheid moeten worden gemeten aan het begin en het einde van de test, indien gerechtvaardigd. De temperatuur moet bij voorkeur in ten minste één testbak continu worden gecontroleerd. Waarnemingen 26. Stadium van embryonale ontwikkeling : het embryonale stadium aan het begin van de blootstelling aan de teststof moet zo nauwkeurig mogelijk worden gecontroleerd. Hiervoor kan een representatief monster van eitjes worden gebruikt die afdoende zijn gefixeerd en geklaard. 27. Uitkomen en overleven : minimaal één keer per dag moet uitkomen en overleven worden geobserveerd en de aantallen geregistreerd. Als er vroeg in de embryonale ontwikkeling (bijvoorbeeld op dag één of dag twee van de test) schimmel op eitjes wordt vastgesteld, dienen die eitjes te worden geteld en verwijderd. Dode embryo's, larven en jonge vissen moeten meteen worden verwijderd zodra ze worden opgemerkt, aangezien zij snel kunnen ontbinden en uiteen kunnen vallen door het gedrag van de overige vissen. Het verwijderen van dode organismen moet zeer voorzichtig gebeuren om beschadiging van naastgelegen eitjes/larven te voorkomen. De tekenen van dood variëren per soort en per stadium. Bijvoorbeeld: — voor bevruchte eitjes: met name in de eerste stadia duidelijk minder doorzichtig en een verandering van kleur als gevolg van coagulatie en/of precipitatie van proteïne, hetgeen resulteert in een wit ondoorschijnend uiterlijk; — voor embryo's, larven en jonge vissen: onbeweeglijkheid en/of geen ademhaling en/of geen hartslag en/of witte ondoorschijnende kleur van het centrale zenuwstelsel en/of geen reactie op een mechanische prikkel. 28. Afwijkend uiterlijk : het aantal larven of jonge vissen dat een afwijkende lichaamsvorm vertoont dient op gepaste tijden te worden geregistreerd, naargelang van de duur van de test en de aard van de beschreven afwijkingen. Larven en jonge vissen met een afwijking kunnen van nature voorkomen en bij sommige vissoorten kan het aantal oplopen tot enkele procenten van de controlegroep(en). Wanneer de misvormingen en het ermee samenhangende afwijkende gedrag zo ernstig worden geacht dat het organisme er aanzienlijk onder lijdt, en het een punt heeft bereikt waarop het niet meer zal herstellen, mag het uit de test worden verwijderd. Dergelijke dieren moeten worden geëuthanaseerd en in de latere gegevensanalyse als sterfgevallen worden behandeld. Voor de meeste soorten die in deze testmethode worden aanbevolen, is de normale embryonale ontwikkeling gedocumenteerd (9) (10) (11) (12). 29. Afwijkend gedrag : afwijkingen, zoals hyperventilatie, ongecoördineerd zwemmen en atypisch(e) onbeweeglijkheid of eetgedrag moeten op gepaste tijden worden geregistreerd naargelang van de duur van de test (bv. een keer per dag voor warmwatersoorten). Deze effecten zijn moeilijk te kwantificeren, maar kunnen, als zij worden waargenomen, helpen om de sterftegegevens te interpreteren. 30. Gewicht : aan het eind van de test worden alle overlevende vissen tenminste per replicaat gewogen (waarbij het aantal dieren in het replicaat en het gemiddelde gewicht per dier worden gerapporteerd): nat gewicht — (drooggedept) geniet de voorkeur, al mogen gegevens over het droge gewicht ook worden gerapporteerd (13). 31. Lengte : aan het eind van de test worden de individuele lengtes gemeten. Het is aanbevolen om de totale lengte te meten, al kan ook de standaardlengte worden gebruikt in het geval er vinrot in de staart of vinerosie is opgetreden. Voor alle vissen in een bepaalde test moet dezelfde methode worden gebruikt. De individuele lengte kan worden gemeten met een schuifmaat, een digitale camera of een gekalibreerd micrometer-oculair. De typische minimumlengten zijn gedefinieerd in aanhangsel 2. GEGEVENS EN RAPPORTAGE Verwerking van de resultaten 32. Het is aanbevolen dat de testopzet en de selectie van de statistische proef een voldoende groot onderscheidend vermogen (80 % of hoger) waarborgen om biologisch significante veranderingen in de eindpunten op te sporen wanneer er een NOEC moet worden gerapporteerd. De rapportage van de relevante effectconcentraties en parameters kan afhankelijk zijn van het regelgevingskader. Als er een ECx moet worden gerapporteerd, moeten de testopzet en de selectie van het regressiemodel van dien aard zijn dat de ECx kan worden geraamd, zodat i) het betrouwbaarheidsinterval van 95 % voor ECx nul niet omvat en niet te ruim is, ii) het betrouwbaarheidsinterval van 95 % voor het voorspelde gemiddelde bij ECx het controlegemiddelde niet omvat en iii) er geen significant gebrek aan afstemming tussen het regressiemodel en de gegevens bestaat. Voor elke aanpak moet de procentuele verandering in elk eindpunt waarvan opsporing of raming significant is, worden geïdentificeerd. De testopzet moet dat mogelijk maken. Als niet aan bovenstaande voorwaarden voor het bepalen van ECx is voldaan, moet de NOEC-aanpak worden gehanteerd. Het is niet waarschijnlijk dat voor alle eindpunten dezelfde procentuele verandering geldt, en het is evenmin waarschijnlijk dat er een haalbaar experiment kan worden opgezet dat voor alle eindpunten aan deze criteria voldoet. Daarom is het van belang om bij het opzetten van het experiment bijzondere aandacht te schenken aan die eindpunten die van belang zijn voor het respectieve experiment. In de aanhangsels 5 en 6 zijn statistische stroomdiagrammen en richtsnoeren voor elke aanpak opgenomen die als leidraad kunnen dienen voor de behandeling van gegevens en voor de keuze van de meest geschikte statistische proef of het meest geschikte model. Andere statistische aanpakken mogen worden gebruikt voor zover zij wetenschappelijk gerechtvaardigd zijn. 33. De variatie moet binnen elke set replicaatbakken worden geanalyseerd met behulp van variantieanalyse of kruistabellen. Bij die analyse moet een passende statistische analysemethode worden gebruikt. Bij het maken van een meervoudige vergelijking tussen de resultaten van de afzonderlijke concentraties en de resultaten van de controlegroepen, wordt de stap-omlaag-toets van Jonckheere-Terpstra of van Williams aanbevolen voor continue responsen, en de stap-omlaag-toets van Cochran-Armitage voor binaire responsen die overeenkomen met een monotone concentratierespons en geen aanwijzingen van extrabinomiale variantie (14). Wanneer er aanwijzingen zijn van extrabinomiale variantie, wordt aanbevolen om de correctie van Rao-Scott op de toets van Cochran-Armitage (15) (16) of de toets van Williams, Dunnett (na een hoektransformatie) of Jonckheere-Terpstra, toegepast op replicaatverhoudingen, te gebruiken. Wanneer de gegevens niet stroken met een monotone concentratierespons, kan het nuttig zijn om de methode van Dunnett, Dunn of Mann-Whitney te gebruiken voor continue responsen, en de exacte toets van Fisher voor binaire responsen (14) (17) (18). Bij het toepassen van statistische methodes of modellen moet ervoor worden gezorgd dat aan de vereisten van de methode of het model is voldaan (bv. de variabiliteit van kamer tot kamer is geraamd en meegenomen in de testopzet en de gebruikte toets of het gebruikte model). De gegevens moeten worden beoordeeld op normaliteit, en in aanhangsel 5 is beschreven wat er met de residuen van een ANOVA moet gebeuren. In aanhangsel 6 worden aanvullende overwegingen voor de regressieaanpak besproken. Om aan de vereisten van een statistische proef te voldoen, moeten transformaties worden overwogen. Transformaties om een regressiemodel passend te maken moeten echter zeer zorgvuldig worden uitgewerkt, aangezien een verandering in de niet-getransformeerde respons met 25 % bijvoorbeeld niet overeenkomt met een verandering van 25 % in een getransformeerde respons. In alle analyses is de testkamer en niet de afzonderlijke vis de analyse-eenheid en de experimenteenheid; zowel de hypothesetoetsen als de regressie dienen dat te weerspiegelen (3) (14) (19) (20). Testverslag 34. In het testverslag moet de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: Stof die uit één component bestaat — fysisch voorkomen, oplosbaarheid in water en aanvullende relevante fysisch-chemische eigenschappen; — chemische identificatie, zoals IUPAC- of CAS-naam, CAS-nummer, SMILES- of InChI-code, structuurformule, zuiverheid, chemische identiteit van onzuiverheden, indien van toepassing en praktisch haalbaar, enz. (met inbegrip van het gehalte aan organische koolstof, indien van toepassing); Stof die uit meerdere componenten bestaat, UVCB's en mengsels: — voor zover mogelijk gekarakteriseerd aan de hand van bv. chemische identiteit (zie hierboven), kwantitatief voorkomen en relevante fysisch-chemische eigenschappen van de bestanddelen. Proefdiersoort: — wetenschappelijke naam, stam, bron en verzamelmethode van de bevruchte eitjes en daaropvolgende behandeling. Testomstandigheden: — gebruikte testprocedure (bv. semistatisch of doorstroom, densiteit); — fotoperiode(n); — testopzet (bv. aantal testkamers en replicaten, aantal eitjes per replicaat, materiaal en afmetingen van de testkamer (hoogte, breedte, volume), watervolume per testkamer); — wijze waarop de stamoplossingen werden bereid en verversingsfrequentie (indien een ontsluitingsmiddel is gebruikt, moeten de aard en de concentratie daarvan worden vermeld); — methode voor het doseren van de teststof (bv. pompen, verdunningssystemen); — de recovery van de methode en de nominale testconcentraties, de bepaalbaarheidsgrens, de gemiddelden van de gemeten waarden en standaarddeviaties in de testbakken en de methode waarmee die werden verkregen, en bewijs dat de metingen betrekking hebben op de concentraties van de teststof in ware oplossing; — kenmerken van het verdunningswater: pH, hardheid, temperatuur, gehalte aan opgeloste zuurstof, restchloorgehalte (indien gemeten), totale hoeveelheid organische koolstof (indien gemeten), zwevende deeltjes (indien gemeten), zoutgehalte van het testmedium (indien gemeten), alsmede de resultaten van eventuele andere metingen; — waterkwaliteit in de testbakken: pH, hardheid, temperatuur en gehalte aan opgeloste zuurstof; — gedetailleerde gegevens over de voeding (bijvoorbeeld het type voedsel, de leverancier, het rantsoen en de frequentie). Afzonderlijk (of per replicaat) en, waar passend, als gemiddelde en variatiecoëfficiënt gerapporteerde resultaten voor de volgende eindpunten: — gegevens waaruit blijkt dat de totale overleving in de controlegroepen voldeed aan de aanvaardbaarheidsnorm voor het gebruikte proefdier (aanhangsel 2); — gegevens over de sterfte in elk stadium (embryo, larve en jonge vis) en cumulatieve sterfte; — dagen tot het uitkomen, aantal larven dat elke dag is uitgekomen, en het einde van het uitkomen; — aantal gezonde vissen aan het eind van de test; — gegevens over de lengte (vermelden of het gaat om standaard- of totale lengte) en het gewicht van de overlevende dieren; — gevallen, aantal en beschrijving van morfologische afwijkingen (indien aanwezig); — gevallen, aantal en beschrijving van effecten op het gedrag (indien aanwezig); — gebruikte aanpak voor de statistische analyse (regressieanalyse of variantieanalyse) en de behandeling van gegevens (gebruikte statistische proef of gebruikt model); — concentratie waarbij geen effect wordt waargenomen voor elke beoordeelde respons (NOEC); — laagste concentratie met waargenomen effecten (bij p = 0,05) voor elke beoordeelde respons (LOEC); — ECx voor elke beoordeelde respons, indien van toepassing, en betrouwbaarheidsintervallen (bv. 90 % of 95 %) en een grafiek van het gepaste model dat werd gebruikt om deze waarde te berekenen, de helling van de concentratie/responscurve, de formule van het regressiemodel, de geraamde modelparameters en hun standaardfout. Alle afwijkingen van deze testmethode. Bespreking van de resultaten, met inbegrip van de eventuele invloed van afwijkingen van deze testmethode op de resultaten van de test. Tabel 1 Aanbevolen vissoorten voor de test ZOETWATER ESTUARIEN en MARIEN Oncorhynchus mykiss Regenboogforel Cyprinodon variegatus Edelsteentandkarper Pimephales promelas Amerikaanse dikkop-elrits Menidia sp. “Silverside” Danio rerio Zebravis Oryzias latipes Japanse rijstvis of medaka LITERATUUR (1) OESO (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr. 171, OESO, Parijs. (2) OESO (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr. 23, OESO Parijs. (3) ASTM (1988), Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. American Society for Testing and Materials, E 1241-88. 26 blz. (4) Brauhn, J.L. and R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. and B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, 69-92. (8) Hoofdstuk C.20 van deze bijlage, Daphnia magna voortplantingstest. (9) Hansen, D.J. and P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.L. Mayer and J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, and A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, 370 — 376. (14) OESO (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr.54, OESO, Parijs. (15) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. (16) Rao, J.N.K. and A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. (17) Dunnett C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of Ameican Statistical Association, 50, 1096-1121. (18) Dunnett C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491. (19) Rand, G.M. and S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, New York. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan and J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Philadelphia. Aanhangsel 1 DEFINITIES Vorklengte (FL): de lengte van het uiteinde van de snuit tot het einde van de middenstraal van de staartvin, wordt gebruikt bij vissen waarbij het moeilijk is om te bepalen waar de wervelkolom ophoudt (www.fishbase.org) Standaardlengte (SL): de lengte van een vis, gemeten van het uiteinde van de bek tot het achtereinde van de laatste wervel of het achtereinde van het midlaterale van de hypurale plaat. Eenvoudig gesteld wordt de lengte van de staartvin in deze meting niet meegerekend. (www.fishbase.org) Totale lengte (TL): de lengte van het uiteinde van de bek tot het uiteinde van de langste lob van de staartvin, gewoonlijk gemeten met de lobben samengedrukt langs de middenlijn. Dit is een meting in rechte lijn, die niet wordt gemeten over de welving van het lichaam (www.fishbase.org) Figuur 1: beschrijving van de verschillende lengtes die worden gebruikt. Chemische stof: een stof of mengsel ECx : (Effect concentration for x % effect) is de concentratie die binnen een bepaalde blootstellingstijd x % van een effect op testorganismen veroorzaakt ten opzichte van een controle. De EC50 is bijvoorbeeld de geschatte concentratie die gedurende een bepaalde blootstellingsperiode bij 50 % van een blootgestelde populatie een effect op een testeindpunt zal hebben. De Lowest Observed Effect Concentration (LOEC) is de laagste geteste concentratie van een teststof waarbij de stof een statistisch significant effect (p ≤ 0,05) heeft vergeleken met de controlegroep. Alle testconcentraties boven de LOEC moeten echter een schadelijk effect hebben dat gelijk is aan of groter dan de effecten die worden waargenomen bij de LOEC. Indien niet aan deze beide voorwaarden kan worden voldaan, moet uitgebreid worden toegelicht hoe de LOEC (en daarmee de NOEC) is geselecteerd. Aanhangsels 5 en 6 bevatten richtsnoeren hieromtrent. No Observed Effect Concentration (NOEC) (concentratie waarbij geen effect wordt waargenomen): de testconcentratie direct onder de LOEC, die in vergelijking met de controle geen statistisch significant effect heeft (p < 0,05) binnen een aangegeven blootstellingsperiode. Teststof: alle volgens deze testmethode geteste stoffen of mengsels. UVCB: stoffen waarvan de samenstelling niet bekend of variabel is, complexe reactieproducten of biologische materialen. IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry. SMILES: Simplified Molecular Input Line Entry Specification. Aanhangsel 2 TESTOMSTANDIGHEDEN, DUUR EN OVERLEVINGSCRITERIA VOOR AANBEVOLEN VISSOORTEN SOORT TESTOMSTANDIGHEDEN AANBEVOLEN DUUR VAN DE TEST Typische minimale gemiddelde totale lengte van de controlevissen aan het einde van het onderzoek (mm) (98) OVERLEVING BINNEN CONTROLEGROEP (minimum) Temperatuur (°C) Zoutgehalte (0/00) Fotoperiode (uur) Uitkomen eitjes Overleving na het uitkomen Zoetwater: Oncorhynchus mykiss Regenboogforel 10 ± 1,5 (99) 12 — 16 (100) 2 weken nadat de controlevissen vrij kunnen eten (of 60 dagen na het uitkomen) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Amerikaanse dikkop-elrits 25 ± 1,5 16 32 dagen na de start van de test (of 28 dagen na het uitkomen) 18 70 % 75 % Danio rerio Zebravis 26 ± 1,5 12 — 16 (101) 30 dagen na het uitkomen 11 70 % 75 % Oryzias latipes Japanse rijstvis of medaka 25 ± 2 12 — 16 (101) 30 dagen na het uitkomen 17 80 % 80 % Estuarien en marien: Cyprinodon variegatus Edelsteentandkarper 25 ± 1,5 15-35 (102) 12 — 16 (101) 32 dagen na de start van de test (of 28 dagen na het uitkomen) 17 75 % 80 % Menidia sp. Silverside 22 — 25 15-35 (102) 13 28 dagen 20 80 % 60 % Aanhangsel 3 RICHTSNOEREN VOOR HET VOEDEREN EN HANTEREN VAN BROED- EN TESTVISSEN VAN AANBEVOLEN SOORTEN SOORT VOEDSEL (*9) OVERPLAATSINGSTIJD NA HET UITKOMEN TIJD TOT DE EERSTE VOEDING Broedvis Net uitgekomen larve Jonge exemplaren Soort Frequentie Zoetwater: Oncorhynchus mykiss Regenboogforel forelvoer Geen (1) startvoer voor forellen BSN 2-4 voedingen per dag 14-16 dagen na het uitkomen of bij het naar boven zwemmen (niet essentieel) 19 dagen na het uitkomen of bij het naar boven zwemmen Pimephales promelas Amerikaanse dikkop-elrits BSN, voervlokken, FBS BSN BSN48, voervlokken 2-3 keer per dag zodra 90 % is uitgekomen 2 dagen na het uitkomen Danio rerio Zebravis BSN, voervlokken Commercieel larvenvoer, protozoa (2), proteïne (3) BSN48, voervlokken, BSN een keer per dag; voervlokken twee keer per dag zodra 90 % is uitgekomen 2 dagen na het uitkomen Oryzias latipes Japanse rijstvis of medaka voervlokken BSN, voervlokken (of protozoa or rotiferen) BSN48, voervlokken (of rotiferen) BSN een keer per dag; voervlokken twee keer per dag of voervlokken en rotiferen een keer per dag niet van toepassing 6-7 dagen na het paaien Estuarien en marien: Cyprinodon variegatus Edelsteentandkarper BSN, voervlokken, FBS BSN BSN48 2-3 voedingen per dag niet van toepassing 1 dag na het uitkomen/naar boven zwemmen Menidia sp. Silverside BSN48, voervlokken BSN BSN48 2-3 voedingen per dag niet van toepassing 1 dag na het uitkomen/naar boven zwemmen Aanhangsel 4 ENKELE CHEMISCHE KENMERKEN VAN GESCHIKT VERDUNNINGSWATER Bestanddeel Drempelconcentratie Vaste deeltjes 5 mg/l Totaalgehalte aan organische koolstof 2 mg/l Niet-geïoniseerde ammoniak 1 μg/l Restchloorgehalte 10 μg/l Totaal organofosforpesticiden 50 ng/l Totaalgehalte aan organochloor-pesticiden en polychloorbifenylen 50 ng/l Totaalgehalte aan organisch chloor 25 ng/l Aluminium 1 μg/l Arseen 1 μg/l Chroom 1 μg/l Kobalt 1 μg/l Koper 1 μg/l IJzer 1 μg/l Lood 1 μg/l Nikkel 1 μg/l Zink 1 μg/l Cadmium 100 ng/l Kwik 100 ng/l Zilver 100 ng/l Aanhangsel 5 STATISTISCHE RICHTSNOEREN VOOR NOEC-BEPALING Algemene opmerkingen De replicaatbak is de analyse-eenheid. Voor continue metingen, zoals het meten van de grootte, dient daarom een gemiddelde of mediaan te worden berekend voor het replicaat, en die replicaatwaarden zijn de gegevens die worden geanalyseerd. Het onderscheidend vermogen van de gebruikte tests moet worden aangetoond, bij voorkeur op basis van een adequate historische gegevensbank voor elk laboratorium. De grootte van het effect die kan worden gedetecteerd met een onderscheidend vermogen van 75-80 % moet voor elk eindpunt worden vermeld met de statistische toets die zal worden gebruikt. De gegevensbanken die beschikbaar zijn bij het ontwikkelen van deze testmethode, bepalen het mogelijke onderscheidende vermogen van de aanbevolen statistische toetsen. Elk afzonderlijk laboratorium moet aantonen dat het in staat is om aan deze vereiste inzake het onderscheidend vermogen te voldoen door een eigen analyse van dat vermogen te verrichten of door aan te tonen dat de variatiecoëfficiënt (VC) voor elke respons het 90e percentiel van de VC's die werden gebruikt bij de ontwikkeling van de TG, niet overschrijdt. Deze VC's zijn vermeld in tabel 1. Als er enkel gemiddelden of medianen per replicaat beschikbaar zijn, kan de VC binnen het replicaat buiten beschouwing worden gelaten.. Tabel 1 90e percentiel VC's voor geselecteerde zoetwatersoorten Soort Respons VC_Tussen replicaten VC_Binnen replicaten Regenboogforel Lengte 17,4 9,8 Gewicht 10,1 28 Amerikaanse dikkop-elrits Lengte 16,9 13,5 Gewicht 11,7 38,7 Zebravis Lengte 43,7 11,7 Gewicht 11,9 32,8 Voor nagenoeg alle statistische toetsen die worden gebruikt om toxicologische onderzoeken van laboratoria te evalueren, is het de vergelijking van de dosisgroepen met de controlegroepen die van belang is. Daarom is het niet raadzaam te eisen dat er een significante ANOVA F-toets plaatsvindt voordat een toets van Dunnett of William wordt gebruikt, of een significante toets van Kruskal-Wallis voordat de toets van Jonckheere-Terpstra, Mann-Whitney of Dunn wordt gebruikt (Hochberg and Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). De toets van Dunnett bevat een multipliciteitscorrectie, en de percentages vals-positieven en vals-negatieven worden nadelig beïnvloed door de F-toets als poortwachter te gebruiken. Evenzo waarborgen de stap-omlaagtoetsen van Williams en Jonckheere-Terpstra waarbij een significantieniveau van 0,05 wordt gehanteerd bij elke stap, een totaalpercentage van vals-positieven van 5 %, en dat percentage en het onderscheidend vermogen van de toetsen worden nadelig beïnvloed door de F- of de Kruskal-Wallis-toets als poortwachter te gebruiken. De toetsen van Mann-Whitney en Dunn moeten worden gecorrigeerd voor multipliciteit en daarbij wordt aanbevolen om de Bonferroni-Holm-correctie te gebruiken. De meeste aanbevelingen inzake het toetsen van hypotheses en het verifiëren van de aannamen die aan de basis liggen van deze toetsen, worden in OESO (2006) besproken, waarin ook een uitgebreide literatuurlijst is opgenomen. Behandeling van controles wanneer een oplosmiddel wordt gebruikt Als er een oplosmiddel wordt gebruikt, moeten zowel een verdunningswatercontrole als een oplosmiddelcontrole worden uitgevoerd. De twee controles dienen te worden vergeleken voor elke respons en te worden gecombineerd voor statistische analyse, als er geen significant verschil wordt vastgesteld tussen de controles. Is dat wel het geval, dan dient de oplosmiddelcontrole te worden gebruikt om de NOEC te bepalen of de ECx te ramen en wordt de watercontrole niet gebruikt. Zie de beperkingen in de geldigheidscriteria (punt 7) Voor de lengte, het gewicht, het percentage uitgekomen eitjes of sterfte onder de larven of afwijkende larven en de eerste en laatste dag van het uitkomen of het naar boven zwemmen, moet een T-toets of een Mann-Whitney-toets worden gebruikt om de verdunningswatercontrole en de oplosmiddelcontrole te vergelijken bij het significantieniveau van 0,05, waarbij alle dosisgroepen buiten beschouwing worden gelaten. De resultaten van die toetsen moeten worden gerapporteerd. Groottemetingen (lengte en gewicht) De waarden voor de lengte en het gewicht van de afzonderlijke vissen kunnen normaal of lognormaal verdeeld zijn. De gemiddelde waarden per replicaat zijn gewoonlijk normaal verdeeld vanwege de centrale limietstelling en bevestigd op basis van gegevens uit meer dan 100 ELS-onderzoeken bij drie zoetwatersoorten. Wanneer de gegevens of de historische gegevensbanken wijzen op een lognormale verdeling van de groottewaarden van de afzonderlijke vissen, kan de gemiddelde logaritme per replicaat van de waarden voor de afzonderlijke vissen worden berekend en kunnen de gegevens voor analyse de antilogaritmen van die gemiddelde replicaatlogaritmen zijn. De gegevens moeten worden beoordeeld op overeenstemming met een normale verdeling en homogeniteit van variantie. Daartoe dienen de residuen van een ANOVA-model met concentratie als enige verklarende klassevariabele te worden gebruikt. Daarbij kan worden gebruikgemaakt van een visuele bepaling op basis van puntenwolken en histogrammen of stam-en-bladgrafieken. Als alternatief kan ook een formele toets zoals die van Shapiro-Wilk of Anderson-Darling worden gebruikt. De overeenstemming met de homogeniteit van variantie kan worden beoordeeld aan de hand van een visueel onderzoek van dezelfde puntenwolk of formeel op basis van een toets van Levene. Enkel parametrische toetsen (zoals Williams en Dunnett) moeten worden beoordeeld op normaliteit en homogeniteit van variantie. Daarbij moet aandacht worden geschonken aan mogelijke uitschieters en het effect daarvan op de analyse. De uitschieterstoets van Tukey en een visueel onderzoek van de hierboven genoemde puntenwolk met residuen kunnen worden gebruikt. Er zij op gewezen dat de waarnemingen betrekking hebben op volledige replicaten. Het uitsluiten van uitschieters uit de analyse moet dus steeds zorgvuldig worden overwogen. De statistische toetsen waarbij gebruik wordt gemaakt van de kenmerken van de testopzet en de biologische verwachtingen, zijn trendtoetsen die met stapjes omlaag worden toegepast, zoals die van Williams en Jonckheere-Terpstra. In die toetsen wordt uitgegaan van een monotone concentratierespons, en de gegevens moeten worden beoordeeld op overeenstemming met die aanname. Dat kan visueel gebeuren op basis van een puntenwolk van de replicagemiddelden ten opzichte van de testconcentratie. Het is nuttig om een stuksgewijze lineaire curve over die puntenwolk te leggen waarin de concentratiegemiddelden gewogen naar monstergrootte van het replicaat met elkaar worden verbonden. Als die stuksgewijze curve sterk afwijkt van de monotoniteit, wijst dat erop dat er mogelijk andere toetsen dan trendtoetsen moeten worden gebruikt. Als alternatief kunnen formele toetsen worden gebruikt. Een eenvoudige manier om een formele toets uit te voeren is om lineaire en kwadratische contrasten van de concentratiegemiddelden te berekenen. Als het kwadratische contrast significant is en het lineaire contrast niet, dan kan dat op problemen met de monotoniteit wijzen, die nader moet worden beoordeeld aan de hand van puntenwolken. Wanneer de normaliteit of de homogeniteit van variantie een probleem kan zijn, kunnen die contrasten worden berekend op basis van op rang getransformeerde gegevens. Alternatieve werkwijzen, zoals de monotoniteitstoets van Bartholomew, kunnen worden gebruikt, maar maken het proces complexer. Figuur 2: NOEC-stroomdiagram groottemetingen (lengte en gewicht) Tenzij de gegevens niet stroken met de vereisten voor deze toetsen, wordt de NOEC bepaald door de toets van Williams of Jonckheere-Terpstra met stapjes omlaag toe te passen. OESO (2006) bevat meer informatie over deze procedures. Voor gegevens die niet stroken met de vereisten voor een stap-omlaagtrendtoets, kan de toets van Dunnett of van Tamhane-Dunnett (T3) worden gebruikt. Beide toetsen bevatten een correctie voor multipliciteit. In deze toetsen wordt uitgegaan van normaliteit en, in het geval van Dunnett, ook van homogeniteit van variantie. Indien niet aan die voorwaarden is voldaan, kan de niet-parametrische toets van Dunn worden gebruikt. OESO (2006) bevat meer informatie over al deze toetsen. Figuur 2 geeft een overzicht van hoe kan worden nagegaan welke test de voorkeur geniet. Aantal uitgekomen eitjes en overlevende larven Deze gegevens hebben betrekking op de percentages eitjes die uitkomen of larven die overleven in afzonderlijke replicaten. Deze percentages moeten worden beoordeeld op extrabinomiale variantie, wat gebruikelijk maar niet alomtegenwoordig is voor zulke metingen. Het stroomdiagram in figuur 3 kan helpen om de optimale toets te kiezen; zie de tekst voor een gedetailleerde beschrijving. Er zijn twee toetsen die vaak worden gebruikt: de C(α)-toets van Tarone (Tarone, 1979) en chi-kwadraattoetsen, die elk afzonderlijk op elke testconcentratie moeten worden toegepast. Als er extrabinomiale variantie wordt vastgesteld in minstens één testconcentratie, moeten methoden worden gebruikt die daarmee rekening houden. Formule 1: C (α)-toets van Tarone (Tarone 1979) waarbij p het gemiddelde percentage voor een bepaalde concentratie is, m het aantal replicaatbakken, nj het aantal individuen in replicaat j, en xj het aantal individuen in dat replicaat die een respons vertonen, hetzij die niet uitgekomen zijn of dood zijn. Deze toets wordt afzonderlijk toegepast op elke concentratie. Deze toets kan worden gezien als een gecorrigeerde chi-kwadraattoets, maar uit beperkte simulaties van het onderscheidend vermogen uitgevoerd door Tarone is gebleken dat zij krachtiger is dan een chi-kwadraattoets. Figuur 3: NOEC-stroomdiagram voor uitgekomen eitjes en sterfte onder de larven. Wanneer er geen significante aanwijzingen van extrabinomiale variantie zijn, kan de stap-omlaagtoets van Cochran-Armitage worden gebruikt. Replicaten worden in deze toets buiten beschouwing gelaten, dus wanneer er dergelijke aanwijzingen zijn, wordt de correctie van Rao-Scott op de toets van Cochran-Armitage aanbevolen, die rekening houdt met replicaten, replicaatgrootte en extrabinomiale variantie. Voorbeelden van alternatieve toetsen zijn de stap-omlaagtoetsen van Williams en Jonckheere-Terpstra en de toets van Dunnett, zoals beschreven voor de groottemetingen. Deze toetsen zijn van toepassing ongeacht eventuele extrabinomiale variantie, maar hebben een iets beperkter onderscheidend vermogen (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao and Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Eerste of laatste dag van het uitkomen of naar boven zwemmen De respons is een geheel getal, dat aangeeft op welke dag van de test de aangegeven waarneming wordt waargenomen voor een bepaalde replicaatbak. Het waardenbereik is gewoonlijk erg beperkt, en vaak zijn grote delen van de waarden gelijk, waarbij bv. de eerste dag waarop eitjes uitkomen dezelfde is voor alle controlereplicaten en soms ook voor een of twee lage testconcentraties. Parametrische proeven zoals Williams en Dunnett zijn niet geschikt voor zulke gegevens. Tenzij er aanwijzingen zijn van ernstige niet-monotoniteit, is de stap-omlaagtoets van Jonckheere-Terpstra bijzonder goed in staat om effecten van de teststof te detecteren. Anders kan de proef van Dunn worden gebruikt. Afwijkingen bij de larven De respons is het aantal larven dat een of andere afwijking vertoont. Deze respons heeft vaak een lage incidentie en vertoont een aantal soortgelijke problemen als de eerste dag van het uitkomen. Soms is de concentratierespons ook grillig. Als de gegevens op zijn minst ruwweg een monotone concentratievorm volgen, is de stap-omlaagtoets van Jonckheere-Terpstra goed in staat om effecten te detecteren. Anders kan de proef van Dunn worden gebruikt. VERWIJZINGEN Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, second edition, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, 1096-1121. Dunn O. J. (1964 ); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, 241-252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, 482-491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, 639-648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, 431-454. Hochberg, Y. and A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, New York. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. OESO (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series on Testing and Assessment, nr. 54. Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, OESO, Parijs. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1992) — A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, 577-585. Rao J.N.K. and Scott A.J. (1999) — A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, 1373-1385. Robertson, T., Wright F.T. and Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, 585-590. Williams D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, 103-117. Williams D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, 519-531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, 949-952. Williams D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, 9-14. Aanhangsel 6 STATISTISCHE RICHTSNOEREN VOOR REGRESSIERAMINGEN Algemene opmerkingen De waarnemingen die worden gebruikt om een model te passen zijn replicaatgemiddelden (lengte en gewicht) of percentages van het replicaat (uitgekomen eitjes en sterfte onder de larven) (OESO 2006). Gewoonlijk wordt aanbevolen om een gewogen regressie te hanteren met de monstergrootte van het replicaat als wegingsfactor. Ook andere weegschema's zijn mogelijk, zoals een weging op basis van de voorspelde gemiddelde respons of een combinatie van die laatste en een weging op basis van de monstergrootte van het replicaat. Weging op basis van reciproque waarden van de variantie binnen de concentratie van de monsters wordt niet aanbevolen (Bunke et al. 1999, Seber and Wild, 2003, Motulsky and Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Bij een eventuele transformatie van de responsen voorafgaand aan de analyse dient de onafhankelijkheid van de waarnemingen te worden bewaard en dienen de ECx en de betrouwbaarheidslimieten te worden uitgedrukt in de oorspronkelijke meeteenheden, en niet in getransformeerde eenheden. Een verandering met 20 % in de lengtelogaritme is bijvoorbeeld niet gelijk aan een verandering met 20 % in de lengte (Lyles et.al 2008, Draper and Smith 1999). Het stroomdiagram in figuur 4 geeft een overzicht voor ECx-ramingen. De details zijn beschreven in onderstaande tekst. Figuur 4: Stroomdiagram voor ECx, raming van de gemiddelde lengte voor het replicaat of het percentage uitgekomen eitjes of sterfte onder de larven, zie tekst voor meer informatie. Overwegingen voor uitgekomen eitjes en sterfte onder de larven Voor het aantal uitgekomen eitjes en de sterfte onder de larven is het over het algemeen het beste om een aflopend model te passen, tenzij er een probitmodel wordt gepast, zoals hieronder beschreven. Dat wil zeggen dat het percentage eitjes dat niet uitkomt of het percentage larven dat sterft moet worden gemodelleerd. De reden daarvoor is dat ECx betrekking heeft op een concentratie waarbij er een verandering gelijk aan x % van de gemiddelde controlerespons plaatsvindt. Als 5 % van de eitjes in de controlegroep niet uitkomt en het percentage niet-uitgekomen eitjes wordt gemodelleerd, heeft EC20 betrekking op een concentratie waarbij er een verandering optreedt gelijk aan 20 % van het percentage niet-uitgekomen eitjes in de controlegroep, namelijk 5 %, en dat is een verandering van 0,2*0,05=0,01 of 1 procentpunt in een percentage niet-uitgekomen eitjes van 6 %. Een dergelijke kleine verandering kan niet op een zinvolle manier worden geraamd op basis van de beschikbare gegevens en is niet van biologisch belang. Als daarentegen het percentage eitjes dat uitkomt wordt gemodelleerd, dan zou het controlepercentage in dit voorbeeld 95 % zijn, en komt een verlaging ten opzichte van het controlegemiddelde met 20 % neer op een verandering van 0,95*0,2=0,18, dus van een percentage uitgekomen eitjes van 95 % naar een percentage uitgekomen eitjes van 77 % (= 95-18). Die effectconcentratie kan wel worden geraamd en is naar verwachting van groter belang. Bij groottemetingen is dit geen probleem, hoewel schadelijke effecten voor de grootte gewoonlijk neerkomen op een afname van de grootte. Modellen voor de grootte (lengte en gewicht) en het percentage uitgekomen eitjes of overlevende larven. Met uitzondering van het hormetische model van Brain-Cousens zijn al deze modellen beschreven en aanbevolen in OESO (2006). De zogeheten OESO 2-5 worden ook besproken voor ecotoxiciteitstests in Slob (2002). Er zijn natuurlijk nog talrijke andere modellen die nuttig kunnen zijn. In Bunke, et al. (1999) worden verschillende modellen opgesomd die hier niet zijn opgenomen, en er zijn ook talrijke modellen te vinden in de verwijzingen. Onderstaande modellen worden voorgesteld omdat zij bijzonder geschikt zouden zijn voor ecotoxiciteitstests en omdat zij gangbaar zijn. Met 5 testconcentraties plus controle — Bruce-Versteeg — Enkelvoudig exponentieel (OESO 2) — Exponentieel met vormparameter (OESO 3) — Enkelvoudig exponentieel met ondergrens (OESO 4) Met 6 of meer testconcentraties plus controle — Exponentieel met vormparameter en ondergrens (OESO 5) — Michaelis-Menten — Hill Wanneer er zichtbare aanwijzingen zijn van hormese (weinig waarschijnlijk bij de percentages uitgekomen eitjes of overlevende larven, maar wordt soms waargenomen bij groottewaarnemingen) — Brain-Cousens hormetisch; Brain and Cousens (1989) Alternatieve modellen voor uitgekomen eitjes en sterfte onder de larven — Oplopende modellen voor deze responsen kunnen worden gepast met behulp van probitmodellen (of logistische modellen) als er geen aanwijzingen van extrabinomiale variantie zijn en de controle-incidentie is geraamd bij het passen van het model. Dit is niet de methode die de voorkeur verdient, aangezien het individu als analyse-eenheid wordt behandeld, en niet het replicaat (Morgan 1992, O'Hara Hines and Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Geschiktheid van een enkel model — Waargenomen en voorspelde procentuele daling bij elke testconcentratie visueel vergelijken (Motulsky and Christopoulos 2004, Draper and Smith 1999). — De vierkantswortel van de gemiddelde regressiefout vergelijken met de vierkantswortel van de zuivere gemiddelde fout met behulp van een F-toets (Draper and Smith 1999). — Controleren of elke term in het model significant verschilt van nul (d.w.z. bepalen of alle termen in het model van belang zijn) (Motulsky and Christopoulos 2004). — Puntenwolken van residuen uit regressie vs. testconcentratie, mogelijk op een log(conc)-schaal. Deze puntenwolk mag geen patroon vertonen; de punten moeten willekeurig verspreid zijn rond een horizontale lijn op nulhoogte. — De gegevens moeten worden beoordeeld op normaliteit en homogeniteit van variantie zoals aangegeven in aanhangsel 5. — Voorts moet de normaliteit van de residuen over het regressiemodel worden beoordeeld met behulp van de methoden die in aanhangsel 5 zijn vermeld voor de residuen voor ANOVA. Modellen vergelijken — Gebruik de AICc-criteria van Akiake. Kleinere AICc-waarden wijzen op een betere passing, en als AICc(B)-AICc(A)≥10, dan is model A nagenoeg altijd beter dan model B (Motulsky and Christopoulos (2004). — Vergelijk de twee modellen visueel door na te gaan hoe goed zij aan bovenstaande criteria voor een enkel model voldoen. — Er wordt aanbevolen om het zuinigheidsprincipe te hanteren, waarbij het meest eenvoudige model dat redelijk geschikt is voor de gegevens, wordt gebruikt (Ratkowsky 1993, Lyles et.al 2008). Kwaliteit van de ECx-raming Het betrouwbaarheidsinterval (CI) voor ECx mag niet te ruim zijn. Er moet statistisch worden beoordeeld hoe ruim het betrouwbaarheidsinterval kan zijn zonder dat de ECx zijn nut verliest. Simulaties voor regressiemodellen die geschikt zijn voor het percentage uitgekomen eitjes en gegevens over de grootte wijzen uit dat ongeveer 75 % van de betrouwbaarheidsintervallen voor ECx (x=10, 20 of 30) slechts twee testconcentraties omvatten. Dat kan als algemene leidraad worden gebruikt voor wat aanvaardbaar is en als praktische leidraad voor wat haalbaar is. Verschillende auteurs vermelden dat betrouwbaarheidsintervallen moeten worden gerapporteerd voor alle modelparameters en dat ruime betrouwbaarheidsintervallen wijzen op onaanvaardbare modellen (Ott and Longnecker 2008, Alvord and Rossio 1993, Motulsky and Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber and Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). Het CI voor ECx (of een andere modelparameter) mag de nul niet omvatten (Motulsky and Christopoulos 2004). Dit is de regressie die gelijk is aan het minimale significante verschil dat vaak wordt genoemd in aanpakken om hypotheses te toetsen (bv. Wang et al 2000). Het betrouwbaarheidsinterval voor de gemiddelde responsen bij de LOEC dient ook het controlegemiddelde niet te omvatten. Men dient zich af te vragen of de parameterramingen wetenschappelijk plausibel zijn. Als het betrouwbaarheidsinterval voor y0 ± 20 % is, is er bijvoorbeeld geen EC10-raming plausibel. Als het model een effect van 20 % voorspelt bij concentratie C en het maximale waargenomen effect bij C en lagere concentraties 10 % bedraagt, dan is de EC20 niet plausibel (Motulsky and Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). ECx hoort geen extrapolatie te vereisen buiten het bereik van positieve concentraties (Draper and Smith 1999, OESO 2006). Als algemene leidraad kan bijvoorbeeld worden gesteld dat ECx niet meer mag bedragen dan ongeveer 25 % minder dan de laagste geteste concentratie of meer dan de hoogste geteste concentratie. VERWIJZINGEN Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, 155-163. Brain P. and Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: 93-96. Bunke, O., Droge, B. and Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, 197-240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, second edition, Chapman and Hall, London. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, second edition, Chapman and Hall, London. Draper, N.R. and Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, third edition. New York: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, Report EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, New York. Lyles, R. H., C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, and C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. 2008 November; 29(6): 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, London. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, VS. O'Hara Hines, R. J. and J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics Vol. 49, blz. 107-121 OESO (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Series Testing and Assessment, nr. 54, Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling, OESO, Parijs. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, sixth edition, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, 195-199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003 Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, 298-312 Wang, Q., D.L. Denton, and R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, Vol. 19, blz. 113–117, 2000. C.48 Test voor kortetermijneffecten op de voortplanting van vissen INLEIDING 1. Deze testmethode is gelijkwaardig aan testrichtlijn (TG) 229 (2012) van de OESO. De noodzaak om een vistest te ontwikkelen en te valideren waarmee actieve endocriene chemische stoffen kunnen worden gedetecteerd, komt voort uit de bezorgdheid dat de chemicaliënniveaus in het milieu schadelijke effecten kunnen hebben bij mensen en dieren als gevolg van de interactie van deze chemicaliën met het hormoonstelsel. In 1998 is de OESO een actie gestart om bestaande richtsnoeren te herzien en nieuwe richtsnoeren te ontwikkelen voor het screenen en testen op potentiële hormoonontregelaars. Eén onderdeel van de actie was de ontwikkeling van een testrichtsnoer voor het screenen van chemische stoffen die uitwerken op het hormoonstelsel van vissoorten. De test voor kortetermijneffecten op de voortplanting van vissen heeft een uitgebreid validatieprogramma ondergaan, bestaande uit interlaboratoriumstudies met geselecteerde chemische stoffen om de relevantie en betrouwbaarheid aan te tonen van de test voor de detectie van chemische stoffen die van invloed zijn op de voortplanting door middel van verschillende mechanismen, waaronder endocriene middelen (1, 2, 3, 4, 5). Alle eindpunten van de OESO-testrichtsnoer zijn gevalideerd voor de Amerikaanse dikkop-elrits, en een deelverzameling van eindpunten is gevalideerd voor het Japanse rijstvisje (vitellogenine en secundaire geslachtskenmerken) en de zebravis (vitellogenine). De validatiewerkzaamheden zijn collegiaal getoetst door een panel van deskundigen die zijn benoemd door de nationale coördinatoren van het OESO-programma voor testrichtsnoeren (6) en deels door een onafhankelijk panel van deskundigen in opdracht van het United States Environmental Protection Agency (29). De test is niet ontworpen voor de herkenning van specifieke mechanismen van hormonale ontwrichting omdat de proefdieren een intacte hypothalamus-hypofyse-gonade-as (HPG-as) hebben, die kan reageren op chemische stoffen die op verschillende niveaus uitwerken op de HPG-as. 2. Deze testmethode beschrijft een screening in vivo waarbij geslachtsrijpe mannetjes- en kuitschietende vrouwtjesvissen bij elkaar worden gehouden en gedurende een beperkt deel van hun levenscyclus (21 dagen) worden blootgesteld aan een chemische stof. Na afloop van de 21-daagse blootstellingsperiode worden twee biomerker-eindpunten bij de mannetjes en de vrouwtjes gemeten als indicatoren van endocriene activiteit van de teststof; deze eindpunten zijn vitellogenine en secundaire geslachtskenmerken. De vitellogenine wordt gemeten bij de Amerikaanse dikkop-elrits, het Japanse rijstvisje en de zebravis, terwijl de secundaire geslachtskenmerken worden gemeten bij de Amerikaanse dikkop-elrits en het Japanse rijstvisje. Daarnaast wordt de kwantitatieve vruchtbaarheid dagelijks bewaakt gedurende de volledige test. De geslachtsklieren worden eveneens geconserveerd en de histopathologie kan worden geëvalueerd om de voortplantingsgeschiktheid van de proefdieren te beoordelen en de bewijskracht van andere eindpunten te ondersteunen. 3. Deze bioassay fungeert als een in-vivoscreeningstest van de voortplanting en de toepassing ervan moet worden gezien in samenhang met het “Conceptueel kader van de OESO voor het testen en beoordelen van hormoonontregelende stoffen” (30). In dit conceptuele kader wordt de test voor kortetermijneffecten op de voortplanting van vissen voorgesteld op niveau 3 als in-vivotest die gegevens moet opleveren over geselecteerde endocriene mechanismen/wegen. INLEIDENDE OVERWEGINGEN EN BEPERKINGEN 4. Vitellogenine (VTG) wordt gewoonlijk geproduceerd door de lever van vrouwelijke gewervelde oviparen in reactie op doorstromend endogeen oestrogeen. Vitellogenine is een precursor van eidooierproteïnen en wordt vanuit de lever in de bloedbaan naar het ovarium getransporteerd en daar opgenomen en gemodificeerd door de zich ontwikkelende eitjes. Vitellogenine is vrijwel niet detecteerbaar in het plasma van onvolwassen vrouwtjes- en mannetjesvissen omdat deze over onvoldoende circulerend oestrogeen beschikken; hun lever is echter wel in staat om vitellogenine samen te stellen en af te scheiden in reactie op exogene oestrogeenstimulatie. 5. Het meten van vitellogenine dient om chemische stoffen met verschillende oestrogene werkingsmechanismen te detecteren. De detectie van oestrogene chemicaliën is mogelijk door de inductie van vitellogenine in mannetjesvissen te meten en is overvloedig gedocumenteerd in de collegiaal getoetste wetenschappelijke literatuur (bijvoorbeeld (7)). Vitellogenine-inductie is ook aangetoond na blootstelling aan aromatiseerbare androgenen (8, 9). Een vermindering in het circulatieniveau van oestrogenen bij vrouwtjes, bijvoorbeeld door de remming van de aromatase die het endogene androgeen omzet in het natuurlijke oestrogeen 17β-estradiol, veroorzaakt een afname van het VTG-niveau, dat wordt gebruikt om chemicaliën met aromatase-remmende eigenschappen te detecteren (10, 11). De biologische relevantie van de vitellogeninereactie na remming van oestrogenen/aromatase is vastgesteld en ruimschoots gedocumenteerd. Mogelijk wordt de productie van VTG bij vrouwtjes echter ook beïnvloed door algemene toxiciteit en niet-endocriene toxische werkingsmechanismen, bijvoorbeeld hepatotoxiciteit. 6. Er zijn verschillende meetmethoden ontwikkeld en gestandaardiseerd voor routinegebruik. Dit is het geval bij soortspecifieke methoden van Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) waarbij gebruik wordt gemaakt van immunochemie voor de kwantificering van VTG die wordt geproduceerd in kleine bloed- of levermonsters van afzonderlijke vissen (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). Voor de VTG-meting worden bloedmonsters van de Amerikaanse dikkop-elrits, bloedmonsters of een kop-/staarthomogenaat van de zebravis, en levermonsters van het Japanse rijstvisje genomen. Bij het rijstvisje is er een goede correlatie tussen de in het bloed en in de lever gemeten VTG (19). In aanhangsel 6 worden de aanbevolen procedures voor monsterneming ten behoeve van VTG-analyse beschreven. Uitrustingen voor het meten van VTG zijn op grote schaal beschikbaar. Dergelijke uitrustingen moeten zijn gebaseerd op een gevalideerde soortspecifieke ELISA-methode. 7. Secundaire geslachtskenmerken van bepaalde soorten mannetjesvissen zijn extern zichtbaar en kwantificeerbaar, en reageren op circulatieniveaus van endogene androgenen. Dit geldt voor de Amerikaanse dikkop-elrits en het Japanse rijstvisje, maar niet voor de zebravis, die geen kwantificeerbare secundaire geslachtskenmerken heeft. Vrouwtjes behouden de mogelijkheid om mannelijke secundaire geslachtskenmerken te ontwikkelen wanneer ze worden blootgesteld aan androgene chemicaliën in water. Er bestaan in de wetenschappelijke literatuur verscheidene studies waarin dit type reactie is gedocumenteerd bij de Amerikaanse dikkop-elrits (20) en het Japanse rijstvisje (21). Een afname van de secundaire geslachtskenmerken bij mannetjes moet met de nodige omzichtigheid worden geïnterpreteerd vanwege het geringe statistische onderscheidingsvermogen en dient te worden gebaseerd op het oordeel van deskundigen en het gewicht van het bewijs. De bruikbaarheid van zebravissen in deze test is beperkt in verband met het ontbreken van kwantificeerbare secundaire geslachtskenmerken die reageren op androgeen werkende chemische stoffen. 8. Bij de Amerikaanse dikkop-elrits is de voornaamste indicator van exogene androgene blootstelling het aantal nuptiale papillen op de bek van het vrouwtje. Bij het Japanse rijstvisje vormt het aantal papillaire uitsteeksels de voornaamste aanwijzing voor exogene blootstelling aan androgene chemicaliën bij de vrouwtjesvis. In aanhangsels 5A en 5B worden de procedures aanbevolen die moeten worden gevolgd voor de evaluatie van geslachtskenmerken bij respectievelijk de Amerikaanse dikkop-elrits en het Japanse rijstvisje. 9. Bij deze 21 dagen durende test bij vissen wordt de kwantitatieve eiproductie beoordeeld en worden de geslachtsklieren geconserveerd om de histopathologie optimaal te kunnen onderzoeken. Sommige regelgevingsinstanties kunnen dit aanvullend eindpunt voorschrijven met het oog op een vollediger beoordeling van de voortplantingsgeschiktheid van de proefdieren of in gevallen waarin vitellogenine en secundaire geslachtskenmerken geen respons vertoonden op blootstelling aan de chemische stof. Hoewel sommige eindpunten erg diagnostisch kunnen zijn (bv. VTG-inductie bij mannetjes en papilvorming bij vrouwtjes), zijn niet alle eindpunten in de test (bv. vruchtbaarheid en histopathologie van de geslachtsklieren) bedoeld om specifieke werkingsmechanismen op celniveau onomstotelijk te identificeren. De reeks eindpunten maakt het als geheel veeleer mogelijk om conclusies te formuleren over mogelijke hormoonontregelingen en kan zo richtsnoeren opleveren voor verdere tests. Hoewel de vruchtbaarheid niet specifiek hormoongebonden is, is het vanwege de aangetoonde gevoeligheid voor endocrien actieve chemische stoffen (5) een belangrijk eindpunt om op te nemen in de test. Wanneer de vruchtbaarheid en andere eindpunten niet worden beïnvloed, kan immers met meer vertrouwen worden gesteld dat een verbinding naar alle waarschijnlijkheid niet endocrien actief is. Wordt de vruchtbaarheid echter wel beïnvloed, dan zal dat sterk bijdragen tot conclusies binnen een weight-of-evidence-benadering. Verderop in deze testmethode zijn richtsnoeren beschreven voor de interpretatie van de gegevens en de aanvaarding van de testresultaten. 10. De in deze testmethode gebruikte definities staan in aanhangsel 1. PRINCIPE VAN DE TEST 11. In deze test worden mannetjes- en vrouwtjesvissen in geslachtsrijpe staat samen blootgesteld in testbakken. Hun volwassen en geslachtsrijpe staat maakt een duidelijk onderscheid naar sekse en daardoor een sekse-afhankelijke analyse van elk eindpunt mogelijk, en waarborgt hun gevoeligheid voor exogene chemische stoffen. Aan het eind van de test wordt het geslacht bevestigd door macroscopisch onderzoek van de geslachtsklieren na opening van het onderlijf aan de buikzijde met een schaar. Een overzicht van de toepasselijke bioassay-omstandigheden staat in aanhangsel 2. De test wordt gewoonlijk begonnen met vissen die als steekproef zijn genomen uit een populatie die tot kuitschieten in staat is; oudere dieren moeten niet worden gebruikt. Richtsnoeren voor de leeftijd van de vissen en hun reproductieve status worden gegeven in het onderdeel over de selectie van vissen. De test wordt uitgevoerd met drie concentraties van blootstelling aan chemicaliën en een controlegroep in water, alsook, indien nodig, een controlegroep in een oplossing. Voor de zebravis worden twee bakken of replicaten per behandeling gebruikt (waarbij elke bak 5 mannetjes en 5 vrouwtjes bevat). Voor de Amerikaanse dikkop-elrits worden vier bakken of replicaten per behandeling gebruikt (waarbij elke bak 2 mannetjes en 4 vrouwtjes bevat). Deze indeling is aangepast aan het territoriumgedrag van het dikkop-elritsmannetje en waarborgt tevens voldoende onderscheidend vermogen. Voor het Japans rijstvisje worden vier bakken of replicaten per behandeling gebruikt (waarbij elke bak 3 mannetjes en 3 vrouwtjes bevat). De blootstelling vindt plaats gedurende 21 dagen en de monsters van de vissen worden genomen op dag 21 van de blootstelling. De kwantitatieve vruchtbaarheid wordt dagelijks bewaakt. 12. Bij de monsterneming op dag 21 worden alle dieren op humane wijze gedood. Secundaire geslachtskenmerken worden gemeten bij de Amerikaanse dikkop-elrits en het Japanse rijstvisje (zie aanhangsels 5A en 5B); bloedmonsters worden genomen voor de vaststelling van VTG bij de zebravis en de Amerikaanse dikkop-elrits, als alternatief kan de kop/staart worden genomen voor de vaststelling van VTG bij de zebravis (aanhangsel 6); voor de VTG-analyse van het Japanse rijstvisje wordt de lever uitgenomen (aanhangsel 6); de geslachtsklieren worden in hun geheel of ontleed gefixeerd voor een eventuele histopathologische beoordeling (22). AANVAARDBAARHEIDSCRITERIA VOOR DE TEST 13. De uitkomsten van de test zijn alleen aanvaardbaar als aan de onderstaande voorwaarden wordt voldaan: — het sterftecijfer in de controlegroepen in water (oplosmiddel) mag aan het eind van de blootstellingsperiode niet hoger zijn dan 10 procent; — het gehalte aan opgeloste zuurstof moet gedurende de gehele blootstellingsperiode minimaal 60 procent van de verzadigingswaarde van lucht zijn geweest; — het verschil in watertemperatuur tussen de testbakken mag op geen enkel moment tijdens de blootstellingsperiode groter zijn dan ± 1,5 °C. Tevens mag de watertemperatuur niet meer dan 2 °C hoger of lager zijn dan het temperatuurbereik dat voor de vissoort wordt gespecificeerd (aanhangsel 2); — er moet bewijs beschikbaar zijn waaruit blijkt dat de gehalten aan teststof in de oplossing binnen ± 20 % van de gemiddelde gemeten waarden zijn gehouden. — voordat met de blootstelling aan de chemische stof wordt gestart en in de controlereplicaten tijdens de test moeten er aanwijzingen zijn dat de vissen actief kuitschieten in alle replicaten. BESCHRIJVING VAN DE METHODE Apparatuur 14. Standaardlaboratoriumapparatuur, met name: a. zuurstof- en pH-meters; b. apparatuur voor het bepalen van de hardheid en alkaliteit van water; c. geschikte apparatuur voor de temperatuurregeling en bij voorkeur ook voor continue bewaking; d. bakken van chemisch inert materiaal met een inhoud die geschikt is voor de aanbevolen densiteit en bezettingsgraad (zie aanhangsel 2); e. kuitsubstraat voor de Amerikaanse dikkop-elrits en de zebravis (zie aanhangsel 4 voor de nodige details); f. weegschaal met een toereikende nauwkeurigheid (d.w.z. nauwkeurig tot op ± 0,5 mg). Water 15. Water waarin de gekozen testsoort langdurig kan overleven en groeien is geschikt als testwater. Gedurende de testperiode moet de waterkwaliteit constant zijn. De pH-waarde moet binnen een bereik van 6,5 tot 8,5 blijven, maar tijdens een test mag deze niet meer dan ± 0,5 pH-eenheden schommelen. Om ervoor te zorgen dat het verdunningswater de testresultaten niet noemenswaardig beïnvloedt (bijvoorbeeld door complexvorming met de teststof), moeten regelmatig monsters worden genomen en geanalyseerd. Zware metalen (bijvoorbeeld Cu, Pb, Zn, Hg, Cd en Ni), de belangrijkste anionen en kationen (bijvoorbeeld Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl- en SO4 2-), bestrijdingsmiddelen (bijvoorbeeld het totaalgehalte aan organofosforpesticiden en het totaalgehalte aan organochloorpesticiden) en het totaalgehalte aan organische koolstof en zwevende deeltjes moeten bijvoorbeeld om de drie maanden worden bepaald als van het verdunningswater bekend is dat het een relatief constante kwaliteit heeft. Indien is aangetoond dat de waterkwaliteit gedurende ten minste één jaar constant blijft, zijn minder frequente bepalingen en langere intervallen (bijvoorbeeld zes maanden) toelaatbaar. In aanhangsel 3 worden enkele chemische kenmerken van aanvaardbaar verdunningswater vermeld. Testoplossingen 16. De testoplossingen met de gekozen concentraties worden bereid door verdunning van een stamoplossing. De stamoplossing wordt bij voorkeur bereid door eenvoudig mengen en schudden van de teststof in verdunningswater met mechanische middelen (bijvoorbeeld door te roeren of met ultrasone trillingen). Voor het maken van een stamoplossing van een passende concentratie kunnen verzadigingskolommen (oplosbaarheidskolommen) worden gebruikt. Het gebruik van een draagvloeistof wordt niet aanbevolen. Indien echter een oplosmiddel noodzakelijk is, moet gelijktijdig een controletest met het oplosmiddel worden uitgevoerd, met dezelfde oplosmiddelconcentratie als voor de chemische behandelingen wordt gebruikt. Voor moeilijk te testen stoffen kan een oplosmiddel uit technisch oogpunt de beste keuze zijn; raadpleeg hiervoor de OESO-leidraad voor het testen op aquatische toxiciteit bij moeilijke stoffen en mengsels (23). De keuze van het juiste oplosmiddel hangt af van de chemische eigenschappen van de stof of het mengsel. In de OESO-leidraad wordt een maximum van 100 μl/l aanbevolen, dat in acht dient te worden genomen. In een recente bespreking (24) worden echter aanvullende bedenkingen geuit over het gebruik van oplosmiddelen voor het testen van endocriene activiteit. Derhalve wordt aanbevolen de oplosmiddelconcentratie, indien nodig, tot het minimum te beperken als dit technisch uitvoerbaar is (afhankelijk van de fysisch-chemische eigenschappen van de teststof). 17. Er moet gebruik worden gemaakt van een doorstroomtestsysteem. Een dergelijk systeem verdeelt en verdunt continu de stamoplossing van de teststof (bijvoorbeeld met een doseerpomp, mechanisme voor evenredige verdunning of saturatorsysteem) om ervoor te zorgen dat de testkamers de juiste testconcentratie krijgen toegediend. De stroomsnelheid van de stamoplossingen en het verdunningswater moet regelmatig, bij voorkeur dagelijks, worden gecontroleerd en mag gedurende de gehele test hooguit 10 % afwijken. Er moet goed op worden gelet dat het gebruik van laagwaardige plastic slangen en andere materialen die biologisch actieve chemicaliën kunnen bevatten, worden vermeden. Bij de keuze van het materiaal voor het doorstroomsysteem moet rekening worden gehouden met mogelijke adsorptie van de teststof aan dit materiaal. Leefomstandigheden van de vis 18. De testvissen moeten worden geselecteerd uit een laboratoriumpopulatie, bij voorkeur van één stam, die bij het begin van de test minimaal twee weken gehouden is onder omstandigheden die qua waterkwaliteit en verlichting overeenkomen met die tijdens de test. Het is van belang dat de densiteit en de bezettingsgraad (zie voor definities aanhangsel 1) worden afgestemd op de gekozen vissoort (zie aanhangsel 2). 19. Na een aanpassingsperiode van 48 uur wordt de sterfte geregistreerd en worden de volgende criteria toegepast: — sterfte groter dan 10 % van de populatie in zeven dagen: de hele partij wordt afgekeurd; — sterfte tussen 5 % en 10 % van de populatie: acclimatisering gedurende nog zeven dagen; als de sterfte gedurende deze zeven dagen hoger dan 5 % is, wordt de gehele partij afgekeurd; — sterfte minder dan 5 % van de populatie binnen zeven dagen: de gehele partij wordt geaccepteerd. 20. Vissen mogen tijdens de acclimatiseringsperiode, de pre-blootstellingsperiode of de blootstellingsperiode niet worden behandeld voor ziekten. Pre-blootstellingsperiode en selectie van de vissen 21. Aanbevolen wordt de dieren gedurende een pre-blootstellingsperiode van één à twee weken in bakken te houden die soortgelijk zijn aan de testbakken. De vissen kunnen tijdens deze periode en de blootstellingsfase naar believen worden gevoederd. De blootstellingsfase begint met seksueel dimorfe volwassen vissen uit een laboratoriumaanbod van geslachtsrijpe dieren (bijvoorbeeld met duidelijk zichtbare secundaire geslachtskenmerken bij de Amerikaanse dikkop-elrits en het Japanse rijstvisje) die actief kuitschieten. Slechts als algemene richtsnoer (niet toe te passen zonder aandacht te schenken aan de feitelijke reproductieve status van een gegeven partij vissen) geldt dat Amerikaanse dikkop-elritsen ongeveer 20 (± 2) weken oud moeten zijn, aangenomen dat ze hun hele leven zijn gehouden bij 25 ± 2 °C. Japanse rijstvisjes moeten ongeveer 16 (± 2) weken oud zijn, aangenomen dat ze hun hele leven zijn gehouden bij 25 ± 2 °C. Zebravissen moeten ongeveer 16 (± 2) weken oud zijn, aangenomen dat ze hun hele leven zijn gehouden bij 26 ± 2 °C. De eiproductie moet dagelijks worden beoordeeld tijdens de periode voorafgaand aan de blootstelling. Er wordt aanbevolen om te wachten tot de vissen in alle replicaatbakken kuitschieten, voordat zij in de blootstellingsfase van de test worden opgenomen. Er kan in deze fase geen kwantitatief richtsnoer worden gegeven voor de wenselijke dagelijkse eiproductie, maar gemiddelde broedsels van > 10 eitjes/vrouwtje/per dag zijn relatief gebruikelijk voor alle soorten. Er moet een willekeurige blokopzet volgens de resultaten voor de eiproductie worden gehanteerd om replicaten toe te wijzen aan de verschillende testniveaus. TESTOPZET 22. Er wordt gebruikgemaakt van drie concentraties van de teststof, één controletest (met water) en indien nodig één controletest met oplosmiddel. De gegevens kunnen worden geanalyseerd om statistisch significante verschillen vast te stellen tussen de reacties op behandeling en op de controles. Deze analyses brengen aan het licht of nadere langdurige tests op schadelijke effecten (op het gebied van overleven, ontwikkeling, groei en voortplanting) eerder nodig zijn voor de teststof dan voor gebruik ten behoeve van risicobeoordeling (25). 23. Voor de zebravis worden op dag 21 van het experiment mannetjes en vrouwtjes van elke behandelingsconcentratie (5 mannetjes en 5 vrouwtjes in elk van beide duplo's) en van de controlegroep(en) genomen voor het meten van de vitellogenine. Voor het Japanse rijstvisje worden op dag 21 van het experiment mannetjes en vrouwtjes van elke behandelingsconcentratie (3 mannetjes en 3 vrouwtjes in elk van de vier duplo's) en van de controlegroep(en) genomen voor het meten van de vitellogenine en de secundaire geslachtskenmerken. Voor de Amerikaanse dikkop-elrits worden op dag 21 van de blootstelling mannetjes en vrouwtjes (2 mannetjes en 4 vrouwtjes in elk van de vier duplo's) en van de controlegroep(en) genomen voor het meten van de vitellogenine en de secundaire geslachtskenmerken. Een kwantitatieve beoordeling van de vruchtbaarheid is nodig, en de geslachtsklierweefsels dienen in hun geheel of ontleed te worden gefixeerd voor een eventuele histopathologische beoordeling, indien die noodzakelijk zou zijn. Selectie van testconcentraties 24. Voor de doeleinden van deze test moet de hoogste testconcentratie worden ingesteld op de laagste van de volgende waarden: de maximale toegelaten concentratie (MTC), die wordt bepaald met een dosisbereikstest of op basis van andere toxiciteitsgegevens, 10 mg/l of de maximale oplosbaarheid in water. De MTC is gedefinieerd als de hoogste testconcentratie van de teststof die tot minder dan 10 % sterfte leidt. In deze benadering wordt ervan uitgegaan dat er empirische gegevens over acute toxiciteit of andere toxiciteitsgegevens bestaan op basis waarvan de MTC kan worden geschat. Omdat de schatting van de MTC onnauwkeurig kan zijn is een deskundig oordeel normaliter noodzakelijk. 25. Drie testconcentraties met een constante tussenliggende factor van maximaal 10, en een verdunningswatercontrole (en indien nodig een oplosmiddelcontrole), zijn verplicht. Aanbevolen wordt een bereik van tussenliggende factoren van 3,2 tot 10. PROCEDURE Selectie en weging van de testvissen 26. Het is belangrijk om de variatie in het gewicht van de vissen aan het begin van de test zoveel mogelijk te beperken. In aanhangsel 2 worden geschikte gewichtbereiken aangegeven voor de verschillende vissoorten die worden aanbevolen voor deze test. Voor de gehele partij vissen die in deze test wordt gebruikt, geldt dat het bereik van het afzonderlijke gewicht van mannetjes en vrouwtjes aan het begin van de test indien mogelijk binnen ± 20 % van het rekenkundig gemiddelde van het betreffende geslacht moet worden gehouden. Het verdient aanbeveling om voorafgaande aan de test een steekproef te nemen om het gemiddelde gewicht te bepalen. Blootstellingsomstandigheden Duur 27. De test duurt 21 dagen, volgend op een pre-blootstellingsperiode. De aanbevolen pre-blootstellingsperiode is één à twee weken. Voeding 28. De vissen dienen naar believen voldoende te worden gevoederd met passende voeding (aanhangsel 2) om hun lichamelijke conditie op peil te houden. Bacteriegroei en troebelheid van het water moeten zoveel mogelijk worden voorkomen. Als algemene richtsnoer geldt dat de dagelijkse hoeveelheid voeder kan worden verdeeld in twee of drie gelijke porties voor meer dan één voeding per dag, met ten minste drie uur tijd tussen elke voeding. Eén grotere portie is ook aanvaardbaar, met name tijdens weekeinden. De vissen dienen niet gevoederd te worden gedurende de 12 uur voorafgaande aan de monsterneming/necropsie. 29. Het visvoeder dient te worden gecontroleerd op de aanwezigheid van verontreinigende stoffen zoals organochloorpesticiden, polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) en polychloorbifenylen (PCB's). Voeder met een verhoogd gehalte aan fyto-oestrogenen die de testreactie op een bekende oestrogeenagonist (bv. 17b-oestradiol) kunnen verstoren, dient te worden vermeden. 30. Ongebruikt voeder en fecaal materiaal moet ten minste tweemaal per week uit de testbakken worden verwijderd, bijvoorbeeld door de bodem van elke tank zorgvuldig te reinigen met een hevel. Licht en temperatuur 31. De fotoperiode en watertemperatuur moeten worden afgestemd op de gekozen vissoort (zie aanhangsel 2). Frequentie van de analytische bepalingen en metingen 32. Voor aanvang van de blootstellingsperiode moet de juiste werking van het afgiftesysteem van de teststof zijn gewaarborgd. Alle noodzakelijke analysemethoden moeten zijn vastgesteld, inclusief voldoende kennis over de chemische stabiliteit in het testsysteem. Tijdens de test worden de concentraties van de teststof regelmatig als volgt gemeten: de stroomsnelheid van het verdunningswater en de toxische stamoplossing moet bij voorkeur dagelijks, maar minimaal tweemaal per week, worden gecontroleerd en mag gedurende de gehele test hooguit 10 % afwijken. Het is raadzaam de feitelijke concentraties van de teststof in alle bakken bij aanvang van de test en vervolgens met wekelijkse tussenpozen te meten. 33. Het is wenselijk de resultaten te baseren op gemeten concentraties. Indien de concentratie van de teststof in de oplossing gedurende de gehele test goed binnen een marge van ± 20 % van de nominale concentratie is gehouden, mogen de resultaten echter worden gebaseerd op nominale of gemeten waarden. 34. Monsters moeten mogelijk worden gefilterd (bijvoorbeeld met een poriëngrootte van 0,45 μm) of gecentrifugeerd. Indien nodig verdient centrifugeren de voorkeur. Als het testmateriaal echter niet aan filters adsorbeert, is filtratie mogelijk een geschikt alternatief. 35. In de loop van de test moet het gehalte aan opgeloste zuurstof, de temperatuur en de pH in alle testbakken ten minste één keer per week worden gemeten. De totale hardheid en alkaliteit moeten ten minste één keer per week worden gemeten in de bakken met de controlegroepen en in één bak met de hoogste concentratie teststof. De temperatuur moet bij voorkeur in ten minste één testbak continu worden gecontroleerd. Opmerkingen 36. In de loop van de test of na afloop van de test worden een aantal reacties (bijvoorbeeld overleven) en biologische reacties (bijvoorbeeld de VTG-niveaus) bepaald. De kwantitatieve vruchtbaarheid moet dagelijks worden bewaakt. Meting en beoordeling van deze eindpunten worden hierna beschreven. Overleven 37. De vissen moeten gedurende de test dagelijks worden onderzocht. De sterfte moet worden geregistreerd en de dode vissen moeten zo snel mogelijk worden verwijderd. Dode vissen mogen noch in de controle- noch in de behandelbakken worden vervangen. Het geslacht van de vissen die tijdens de test sterven, moet worden vastgesteld door macroscopisch onderzoek van de geslachtsklieren. Gedrag en uiterlijk 38. Elke vorm van afwijkend gedrag (ten opzichte van de controlegroepen) moet worden genoteerd. Dit kan zich uitstrekken tot tekenen van algemene toxiciteit waaronder hyperventilatie, ongecoördineerd zwemmen, evenwichtsverlies en atypisch(e) onbeweeglijkheid of eetgedrag. In aanvulling hierop moeten ook externe afwijkingen (zoals bloedingen, ontkleuring) worden genoteerd. Dergelijke tekenen van toxiciteit dienen bij de interpretatie van de gegevens zorgvuldig in beschouwing te worden genomen, omdat ze kunnen duiden op concentraties waarbij biomerkers van endocriene activiteit niet meer betrouwbaar zijn. Dergelijke gedragswaarnemingen kunnen ook bruikbare kwalitatieve informatie opleveren voor mogelijke vistestvoorschriften in de toekomst. Zo is bijvoorbeeld agressief territoriumgedrag waargenomen bij normale mannetjes of gemasculiniseerde vrouwtjes van Amerikaanse dikkop-elritsen bij blootstelling aan androgenen; bij zebravissen wordt het kenmerkende paar- en paaigedrag na zonsopgang verminderd of verstoord door blootstelling aan oestrogenen of antiandrogenen. 39. Omdat sommige aspecten van het uiterlijk (vooral de kleur) bij behandeling snel kunnen veranderen, is het van belang dat kwalitatieve waarnemingen worden genoteerd voordat dieren uit het testsysteem worden gehaald. De ervaringen die tot nu toe met Amerikaanse dikkop-elritsen zijn opgedaan, duiden erop dat sommige endocrien actieve stoffen in eerste instantie veranderingen in de volgende externe kenmerken teweeg kunnen brengen: lichaamskleur (licht of donker), kleurpatronen (aanwezigheid van verticale banen) en lichaamsvorm (kop en borstregio). Er dienen derhalve tijdens de test en aan het einde van het onderzoek waarnemingen te worden genoteerd over het fysieke voorkomen van de vissen. Vruchtbaarheid 40. Er moeten dagelijks kwantitatieve waarnemingen worden geregistreerd per replicaat. De eiproductie moet worden geregistreerd als aantal eitjes/overlevend vrouwtje/dag, per replicaat. De eitjes worden dagelijks uit de testkamers gehaald. Voor de Amerikaanse dikkop-elrits en de zebravis moeten de kuitsubstraten in de testkamer worden geplaatst, opdat de vissen in normale omstandigheden kuit kunnen schieten. Aanhangsel 4 bevat meer informatie over de aanbevolen kuitsubstraten voor de zebravis (aanhangsel 4A) en de Amerikaanse dikkop-elrits (aanhangsel 4B). Voor het Japanse rijstvisje wordt het niet noodzakelijk geacht om in een kuitsubstraat te voorzien. Op humane wijze doden van de vissen 41. Op dag 21, d.w.z. bij beëindiging van de blootstelling, dienen de vissen te worden geëuthanaseerd met passende hoeveelheden tricaïne (tricaïne-methaansulfonaat, metacaïne, MS-222 (CAS.886-86-2), 100-500 mg/l gebufferd met 300 mg/l NaHCO3 (natriumbicarbonaat, CAS.144-55-8)) ter vermindering van slijmvliesirritatie; vervolgens worden bloed- of weefselmonsters genomen om het VTG-niveau te bepalen, zoals toegelicht in het onderdeel over vitellogenine. Waarneming van secundaire geslachtskenmerken 42. Sommige endocrien actieve stoffen kunnen tot veranderingen leiden in bepaalde secundaire geslachtskenmerken (aantal nuptiale papillen bij het mannetje van de Amerikaanse dikkop-elrits, papillaire uitsteeksels bij het mannetje van het Japanse rijstvisje). Met name stoffen met bepaalde werkingsmechanismen kunnen een abnormaal optreden van secundaire geslachtskenmerken veroorzaken bij dieren van de andere sekse. Zo kunnen androgene receptoragonisten, zoals trenbolon, methyltestosteron en dihydrotestosteron, tot gevolg hebben dat vrouwelijke dikkop-elritsen geprononceerde nuptiale papillen ontwikkelen of dat vrouwelijke rijstvisjes papillaire uitsteeksels ontwikkelen (11, 20, 21). Ook is beschreven dat oestrogene receptoragonisten het aantal nuptiale papillen en de grootte van de dorsale nekverdikking bij volwassen mannetjes van de Amerikaanse dikkop-elrits kunnen verminderen (26, 27). Dergelijke morfologische waarnemingen kunnen bruikbare kwalitatieve en kwantitatieve informatie opleveren voor mogelijke vistestvoorschriften in de toekomst. Het aantal en de grootte van nuptiale papillen bij Amerikaanse dikkop-elritsen en papillaire uitsteeksels bij Japanse rijstvisjes kunnen hetzij direct, hetzij meer praktisch bij geconserveerde specimina worden gekwantificeerd. De aanbevolen procedures voor de beoordeling van secundaire geslachtskenmerken bij Amerikaanse dikkop-elritsen en Japanse rijstvisjes zijn respectievelijk beschikbaar in aanhangsel 5A en aanhangsel 5B. Vitellogenine (VTG) 43. Er wordt bloed afgenomen uit de staartader of -slagader met een gehepariniseerd microhematocriet capillair buisje, of door een hartpunctie met een injectiespuit. Afhankelijk van de grootte van de vissen lopen de af te nemen hoeveelheden bloed gewoonlijk uiteen van 5 tot 60 μl per stuk voor Amerikaanse dikkop-elritsen en van 5 tot 15 μl per stuk voor zebravissen. Het plasma wordt van het bloed gescheiden door middel van centrifuge en bij -80 °C bewaard met een proteaseremmer totdat het wordt onderzocht op VTG. Als alternatief wordt bij Japanse rijstvisjes de lever gebruikt en kan bij zebravissen het kop-/staarthomogenaat worden gebruikt als weefselbron voor de bepaling van VTG (aanhangsel 6). De VTG-meting moet zijn gebaseerd op een gevalideerde homologe ELISA-methode met homologe VTG-norm en homologe antilichamen. Aanbevolen wordt een methode te gebruiken waarmee VTG-niveaus kunnen worden gemeten van slechts een paar ng/ml plasma (of ng/mg weefsel), dat wil zeggen het basisniveau bij niet-blootgestelde mannetjesvissen. 44. De kwaliteitscontrole van de VTG-analyse wordt verricht door het gebruik van normen, blanco-bepalingen en ten minste analyse in duplo. Voor elke ELISA-methode moet het matrixeffect (effect van de verdunning van het monster) worden getest om de minimale verdunningsfactor per monster te bepalen. Elke ELISA-plaat die voor VTG-analyses wordt gebruikt, dient de volgende kwaliteitscontrolemonsters te bevatten: ten minste 6 kalibratienormen die het bereik van de verwachte VTG-concentraties bestrijken en ten minste één assayblanco met niet-specifieke binding (in duplo geanalyseerd). De absorptie van deze blanco's moet minder bedragen dan 5 % van de maximale absorptie volgens de kalibratienorm. Er worden ten minste twee aliquots (tankduplicaten) van elk verdunningsmonster geanalyseerd. Tankduplicaten die meer dan 20 % verschillen, dienen opnieuw te worden geanalyseerd. 45. De correlatiecoëfficiënt (R2) voor kalibratiecurves moet groter zijn dan 0,99. Een hoge correlatie is echter niet voldoende om een toereikende voorspelling van de concentratie in het gehele bereik te waarborgen. Behalve dat de correlatie voor de kalibratiecurve voldoende hoog moet zijn, moet de concentratie van elke norm, zoals berekend vanuit de kalibratiecurve, altijd tussen 70 en 120 % van de nominale concentratie van die norm vallen. Als de nominale concentraties gaan afwijken van de kalibratieregressielijn (bijvoorbeeld bij lagere concentraties), kan het noodzakelijk zijn de kalibratiecurve te splitsen in een laag en een hoog bereik of een non-lineair model toe te passen dat past bij de absorptiegegevens. Als de curve wordt gesplitst, moet voor beide lijnsegmenten gelden dat R2 > 0,99. 46. De detectiegrens wordt gedefinieerd als de concentratie van de laagste analysenorm en de kwantificeringsgrens als de concentratie van de laagste analysenorm vermenigvuldigd met de laagste verdunningsfactor. 47. Op elke dag dat er VTG-tests worden uitgevoerd, wordt een verrijkt monster geanalyseerd dat is gemaakt volgens een testonafhankelijke referentienorm (aanhangsel 7). De verhouding tussen de verwachte concentratie en de gemeten concentratie wordt gerapporteerd samen met de resultaten van elke set tests die op die dag is uitgevoerd. Evaluatie van de histopathologie van de geslachtsklieren 48. De regelgevingsinstanties kunnen voorschrijven dat een histopathologisch onderzoek van de geslachtsklieren wordt verricht om het doelorgaan op de HPG-as te bestuderen na blootstelling aan de chemische stof. Daartoe worden de geslachtsklieren in hun geheel of ontleed gefixeerd. Als er een histopathologisch onderzoek nodig is, zal bij de beoordeling van de endocriene activiteit van de teststof worden gekeken naar specifieke hormoongebonden effecten op de geslachtsklieren. Voorbeelden van deze diagnostische responsen zijn de aanwezigheid van testisoöcyten, hyperplasie van de cellen van Leydig, verminderde dooiervorming, ve