++++

VERORDENING ( EEG ) Nr . 72/77 VAN DE COMMISSIE

van 13 januari 1977

tot wijziging van Verordening ( EEG ) nr . 1470/68 betreffende het nemen en het omzetten van monsters alsmede betreffende het bepalen van het oliegehalte , het gehalte aan onzuiverheden en het vochtgehalte van oliehoudende zaden

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN ,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap ,

Gelet op Verordening nr . 136/66/EEG van de Raad van 22 september 1966 houdende de totstandbrenging van een gemeenschappelijke ordening der markten in de sector oliën en vetten ( 1 ) , laatstelijk gewijzigd bij Verordening ( EEG ) nr . 1707/73 ( 2 ) , en met name op artikel 26 , lid 3 ,

Overwegende dat , ten einde het erucazuurgehalte van koolzaad en raapzaad nauwkeurig kunnen te bepalen , een adequate methode moet worden vastgesteld ; dat daarom moet worden overgegaan tot wijziging van Verordening ( EEG ) nr . 1470/68 van de Commissie van 23 september 1968 betreffende het nemen en het omzetten van monsters alsmede betreffende het bepalen van het oliegehalte , het gehalte aan onzuiverheden en het vochtgehalte van oliehoudende zader ( 3 ) , laatstelijk gewijzigd bij Verordening ( EEG ) nr . 3025/75 ( 4 ) ;

Overwegende dat de in deze verordening vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Comité van beheer voor oliën en vetten ,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD :

Artikel 1

In Verordening ( EEG ) nr . 1470/68 wordt het volgende artikel 2 ter toegevoegd :

" De bepaling van het erucazuurgehalte als bedoeld in artikel 4 van Verordening nr . 282/67/EEG geschiedt volgens de in bijlage VI van de onderhavige verordening omschreven methode

Wordt geacht het maximumgehalte aan erucazuur als bedoeld in artikel 3 , lid 2 , eerste streepje , var . Verordening nr . 282/67/EEG te bevatten , het koolzaad en het raapzaad waarvan de olie , die daaruit volgens de in bijlage VI , onder I , omschreven methode is geëxtraheerd , ten hoogste 15 % erucazuur ( C 22 ) , berekend overeenkomstig de in bijlage VI , onder II en III , omschreven methode , bevat . "

Artikel 2

Verordening ( EEG ) nr . 1470/68 wordt aangevuld met bijlage VI , waarvan de tekst in de bijlage bij deze verordening is opgenomen .

Artikel 3

Deze verordening treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen .

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke Lid-Staat .

Gedaan te Brussel , 13 januari 1977 .

Voor de Commissie

De Vice-Voorzitter

Finn GUNDELACH

( 1 ) PB nr . 172 van 30 . 9 . 1966 , blz . 3025/66 .

( 2 ) PB nr . L 175 van 29 . 6 . 1973 , blz . 5 .

( 3 ) PB nr . L 239 van 28 . 9 . 1968 , blz . 2 .

( 4 ) PB nr . L 300 van 20 . 11 . 1975 , blz . 5 .

BIJLAGE VI

COMMUNAUTAIRE ANALYSEMETHODE VOOR HET BEPALEN VAN HET ERUCAZUURGEHALTE VAN OLIEHOUDENDE ZADEN DIE DOOR HET INTERVENTIEBUREAU WORDEN OVERGENOMEN

I . Voorbehandeling van de monsters

II . Bereiding van de methylesters van vetzuren

III . Gaschromatografische analyse van de methylesters van vetzuren

I . VOORBEHANDELING VAN DE MONSTERS

1 . De bemonstering van het zaad , het verkleinen van de laboratoriummonsters tot analysemonsters en het bepalen van het oliegehalte van het uitgangsprodukt worden uitgevoerd volgens de respectievelijk in de bijlagen I , II en V van Verordening ( EEG ) nr . 1470/68 beschreven methoden .

2 . Voorbehandeling van de uit het zaadmonster geëxtraheerde olie .

2.1 . Het monster is vloeibaar en volkomen helder :

schud het , bij wijze van voorzorgsmaatregel , voor het nemen van het analysemonster

2.2 . Het monster is vloeibaar maar troebel of bevat neerslag :

plaats het in een droogstoof bij een temperatuur van 50 * C . Schud het krachtig , nadat het deze temperatuur heeft bereikt ; laat vervolgens bezinken ; filtreer over filtreerpapier bij een temperatuur van 30 * C in de droogstoof .

Het filtraat moet helder zijn .

2.3 . Het monster is vast :

plaats het in een droogstoof bij een temperatuur die 10 * C hoger is dan het verwachte smeltpunt .

Ga te werk als beschreven sub 2.1 . , indien het gesmolten monster helder is , of sub 2.2 . , indien het gesmolten monster troebel is of een neerslag bevat .

II . BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN

1 . INLEIDING

De beschreven methoden hebben betrekking op de bereiding van vetzuremethylesters van dierlijke en plantaardige oliën en vetten , alsmede van vetzuren van willekeurige oorsprong .

De verkregen methylesters kunnen worden gebruikt voor analytisch onderzoek zoals :

gaschromatografie , dunnelaagschromatografie , infrarood - , spectrofotometrie , ...

2 . TOEPASSINGSGEBIED

De beschreven methoden zijn van toepassing op oliën en vetten van plantaardige en dierlijke oorsprong . De sub 3 beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor de bereiding van methylesters van vetzuren met 6 of meer koolstofatomen .

Bij aanwezigheid van vetzuren met 6 en 8 koolstofatomen , alsmede bij de bereiding van esters voor de gaschromatografische analyse mag het oplosmiddel niet uit de oplossing van methylesters worden verwijderd .

De algemene methode 3.1 . kan onjuiste resultaten geven bij aanwezigheid van :

- verbindingen met secundaire zuurstofgroepen ( hydroxy , hydroperoxy , keto en epoxy ) ,

- verbindingen met cyclopropaan - en cyclopropeengroepen ,

- geconjugeerde meervoudig onverzadigde verbindingen en acetyleenverbindingen ,

- wassen .

Het verdient de voorkeur in dat geval een van de sub 3.2 . beschreven methoden toe te passen . Oliën en vetten die dergelijke groepen in zeer geringe hoeveelheden bevatten ( b.v . katoenzaadolie ) kunnen volgens 3.1 . worden geanalyseerd .

Fosfolipiden kunnen na verzeping en verestering van de vetzuren worden geanalyseerd .

Onverzeepbare bestanddelen worden niet verwijderd en kunnen , indien in aanmerkelijke hoeveelheden aanwezig , storend optreden bij de uit te voeren analyses ( zie opmerking 1 ) .

3 . METHODEN VOOR DE BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN MET 6 OF MEER KOOLSTOFATOMEN

Sub 3.1 . wordt een algemene methode gegeven voor de bereiding van methylesters met behulp van boortrifluoride ; deze methode dient bij voorkeur te worden toegepast . Indien het niet mogelijk is deze methode te gebruiken , kunnen de sub 3.2 . beschreven vervangingsmethoden worden toegepast .

3.1 . Algemene methode waarbij gebruik gemaakt wordt van boortrifluoride

3.1.1 . Beginsel

Verzeping van de glyceriden en verestering van de vrijgemaakte vetzuren met boortrifluoride .

3.1.2 . Toestellen

- Rondbodemkolven van 50 en 100 ml , voorzien van slijpstuk .

- Terugvloeikoeler , lengte 20 tot 30 cm , voorzien van een op de rondbodemkolf passend slijpstuk .

- Kooksteentjes , vetvrij .

- Inlaatbuis voor stikstof .

- Maatpipet , minimaal 10 ml en voorzien van pipetteerballon , of automatische pipet .

- Reageerbuizen met ingeslepen stop .

- Scheitrechters van 250 ml .

3.1.3 . Reagentia

- Methanolische natriumhydroxyde-oplossing , ca 0,5 N . Los 2 g natriumhydroxyde op in 100 ml methanol die ten hoogste 0,5 % m/m water bevat . Op den duur kan een weinig wit neerslag van natriumcarbonaat ontstaan ; dit stoort echter niet bij de methylesterbereiding .

- Boortrifluoride-methanoloplossing 12 tot 15 % m/m ( oplossingen van 14 en 50 % zijn in de handel verkrijgbaar ( zie opmerking 2 ) .

Waarschuwing : Boortrifluoride is een toxische verbinding . Het wordt dan ook afgeraden de boortrifluoride-methanol-oplossing zelf uit boortrifluoride en methanol te bereiden ( zie opmerking 3 ) .

- Heptaan , voor chromatografische doeleinden ( zie opmerkingen 2 en 4 ) .

- Petroleumether , gedestilleerd , kooktraject 40 - 60 * C , bromidegetal < 1 , residuvrij ; of hexaan ( zie opmerking 2 ) .

- Natriumsulfaat , watervrij .

- Natriumchloride-oplossing , verzadigd .

- Methylrood , 0,1 % oplossing m/v in ethanol 60 % ( v/v ) .

- Stikstof , minder dan 5 mg zuurstof per kg .

3.1.4 . Werkwijze

Voer de hierna beschreven werkwijze bij voorkeur uit in een zuurkast in verband met de toxische eigenschappen van boortrifluoride . Reinig het gebruikte glaswerk onmiddellijk met water .

Voor oliën , vetten of vetzuren met zuren die meer dan twee dubbele bindingen bevatten , verdient het aanbeveling de lucht uit de methanol en de rondbodemkolf te verwijderen door enige minuten stikstof door te leiden .

Voer de voorbehandeling van het monster uit volgens I .

Een nauwkeurige inweging van het monster is niet vereist . De grootte of hoeveelheid van het monster is evenwel bepalend voor de keuze van de rondbodemkolf en de toe te voegen hoeveelheden reagentia ( zie hiernavolgende tabel ) .

Monster * Rondbodemkolf * NaOH 0,5 N * BF3-methanoloplossing *

mg * ml * ml * ml *

100 - 250 * 50 * 4 * 5 *

250 - 500 * 50 * 6 * 7 *

500 - 750 * 100 * 8 * 9 *

750 - 1000 * 100 * 10 * 12 *

Gebruik , indien de methylesters voor gaschromatografische analyse zijn bestemd , bij voorkeur ongeveer 350 mg monster .

Indien het kleiner is , dient er voor te worden gezorgd dat het monster representatief is ( zie opmerking 5 ) .

3.1.4.1 . Voor oliën en vetten

Breng de gewenste hoeveelheid voorbehandeld analysemonster in de rondbodemkolf . Voeg de vereiste hoeveelheid methanolische natriumhydroxyde-oplossing en enkele kooksteentjes toe . Bevestig de rondbodemkolf aan de terugvloeikoeler en kook tot alle vetdruppels in oplossing zijn gegaan ( deze bewerking duurt 5 tot 10 minuten , doch kan in uitzonderingsgevallen meer dan 10 minuten vergen ) .

Meet met de maatpipet voorzien van pipetteerballon of met de automatische pipet , de vereiste hoeveelheid boortrifluoride-methanoloplossing af en voeg deze via de terugvloeikoeler toe aan het kokende mengsel . Zet het koken daarna gedurende 2 minuten voort .

Voeg vervolgens 2 a 5 ml heptaan ( zie opmerking 4 ) via de terugvloeikoeler toe aan het kokende mengsel ( de hoeveelheid toegevoegde heptaan is niet kritisch ) en kook nog 1 minuut .

Verwijder de rondbodemkolf van de verwarmingsbron , verwijder de terugvloeikoeler en voeg onder licht zwenken enige ml verzadigde natriumchloride-oplossing toe . Voeg daarna nog zoveel natriumchloride-oplossing toe , als nodig is om de vloeistofspiegel van het mengsel in de hals van de rondbodemkolf te brengen .

Breng van de bovenstaande heptaanlaag ongeveer 1 ml met een pipet over in een reageerbuis met ingeslepen stop . Voeg een weinig watervrij natriumsulfaat toe om sporen water te binden .

Uitgaande van een analysemonster van 350 mg bevat de verkregen oplossing ongeveer 5 tot 10 % methylesters en is zij gereed voor gaschromatografisch onderzoek .

In de overige gevallen moet de heptaanoplossing worden verdund tot een concentratie van 5 tot 10 % methylesters ( zie opmerking 6 ) .

Breng om de droge esters te verkrijgen , de gehele inhoud van de rondbodemkolf ( zoutoplossing plus heptaanfase ) over in een scheitrechter van 250 ml . Decanteer en bewaar de heptaanfase . Extraheer de zoutoplossing twee maal met 50 ml petroleumether ( kooktraject 40 - 60 * C of hexaan . Verenig de twee extracten met de heptaanfase en was enkele malen met telkens 20 ml water tot zuurvrij ( indicator : methylrood ) . Droog met watervrij natriumsulfaat en verdrijf het oplosmiddel met behulp van een kokend-waterbad onder het inleiden van een stikstofstroom ( zie opmerkingen 6 en 7 ) .

Bij analysemonsters kleiner dan 500 mg verdient het de voorkeur de volumes oplosmiddel en water naar verhouding te verminderen .

3.1.4.2 . Voor vetzuren

Indien het monster alleen uit vetzuren bestaat , behoeft niet te worden verzeept .

Breng de gewenste hoeveelheid voorbehandelde vetzuren in de rondbodemkolf en voeg de vereiste hoeveelheid boortrifluoride-methanoloplossing toe . Kook gedurende 2 minuten . Pas vervolgens de sub 3.1.4.1 . beschreven werkwijze toe , vanaf : " voeg vervolgens 2 à 5 ml heptaan ... "

3.2 . Vervangingsmethoden , waarbij geen gebruik wordt gemaakt van boortrifluoride

3.2.1 . Voor oliën en vetten met een zuurgetal < 2

3.2.1.1 . Beginsel

Bereiding van methylesters van glyceriden in alkalisch milieu

3.2.1.2 . Toestellen

- Roerder , sneldraaiend , met verwarming ( b.v . een magnetische roerder met verwarming ) ,

- Erlenmeyer of rondbodemkolf van 100 ml , voorzien van een slijpstuk ,

- Inlaatbuis voor stikstof ,

- Terugvloeikoeler , voorzien van een op de erlenmeyer en rondbodemkolf passend slijpstuk ,

- Kooksteentjes , vetvrij ,

- Scheitrechters van 125 ml ,

- Erlenmeyer van 50 ml , met nauwe opening .

3.2.1.3 . Reagentia

- Methanol die ten hoogste 0,5 % m/m water bevat ;

- Methanolische kaliumhydroxyde-oplossing , ongeveer 1 N .

Los 5,6 kg kaliumhydroxyde op in 100 ml methanol die ten hoogste 0,5 % m/m water bevat ;

- Heptaan , voor chromatografische doeleinden ( zie opmerkingen 2 en 4 ) ;

- Natriumsulfaat , watervrij ;

- Stikstof , minder dan 5 mg zuurstof per kg .

3.2.1.4 . Werkwijze

Voor oliën en vetten met zuren die meer dan twee dubbele bindingen bevatten , verdient het aanbeveling de lucht uit de methanol en de kolf te verwijderen door enige minuten stikstof door te leiden .

Voer de voorbehandeling van het monster uit volgens I .

Breng in een erlenmeyer of rondbodemkolf van 100 ml ongeveer 4 g voorbehandeld monster ( zie opmerking 5 ) .

Voeg ongeveer 40 ml methanol , 0,5 ml kaliumhydroxyde-oplossing en enkele kooksteentjes toe . Sluit de terugvloeikoeler aan , schud en kook tot de oplossing helder wordt ( ongeveer 5 tot 10 minuten ) ; bij oliën van het type " ricinusolie " vormt de helderheid geen bruikbaar criterium voor de reactie ( zie opmerking 8 ) .

Laat afkoelen onder stromend water en breng de gehele inhoud over in een scheitrechter van 125 ml . Spoel de erlenmeyer of de rondbodemkolf met 20 ml heptaan ( zie opmerking 4 ) en breng over in de scheitrechter . Voeg ongeveer 40 ml water toe en schud . De esters verzamelen zich in de bovenste heptaanlaag . Laat de waterlaag af en schud deze nogmaals met 20 ml heptaan . Verenig de twee heptaanextracten en was tweemaal met telkens 20 ml water . Laat de waterlaag af en droog de esteroplossing met watervrij natriumsulfaat , filtreer over watten in een erlenmeyer van 50 ml . Damp eventueel de oplossing met behulp van een kokend-waterbad en onder een stikstofstroom in tot een volume van 20 ml is bereikt ( zie opmerkingen 6 en 7 ) .

3.2.2 . Voor oliën en vetten met een zuurgetal > 2 en vetzuren

3.2.2.1 . Beginsel

Voor oliën en vetten ( zuurgetal > 2 ) : neutraliseren van de vrije vetzuren , daarna de glyceriden alkalisch in methylesters omzetten , gevolgd door verestering van de vrije vetzuren in zuur milieu .

Voor vetzuren : verestering in zuur milieu .

3.2.2.2 . Toestellen

- Roerder , sneldraaiend , met verwarming ( b.v . magnetische roerder met verwarming ) .

- Erlenmeyer of rondbodemkolf van 250 ml , voorzien van een slijpstuk .

- Inlaatbuis voor stikstof .

- Terugvloeikoeler , voorzien van een op de erlenmeyer en de rondbodemkolf passend slijpstuk .

- Kooksteentjes , vetvrij .

- Scheitrechters van 250 ml .

- Erlenmeyer van 100 ml , met nauwe opening .

3.2.2.3 . Reagentia

- Natriummethylaat-oplossing . Los 1 g natrium op in 100 ml methanol die ten hoogste 0,5 % ( m/m ) water bevat .

- Methanolische zoutzuuroplossing ( watervrij ) , ongeveer 1 N ( zie opmerkingen 3.2.2.6 . a ) en b ) ) .

- Heptaan voor chromatografische doeleinden ( zie opmerkingen 2 en 4 ) .

- Natriumsulfaat , watervrij .

- Stikstof , minder dan 5 mg zuurstof per kg .

3.2.2.4 . Werkwijze voor oliën en vetten met een zuurgetal > 2

Voor oliën en vetten met zuren die meer dan twee dubbele bindingen bevatten , verdient het aanbeveling de lucht uit de methanol en de kolf te verwijderen door enige minuten stikstof door te leiden .

Voer de voorbehandeling van het monster uit volgens I .

Breng in een erlenmeyer of rondbodemkolf van 250 ml ongeveer 4 g voorbehandeld monster ( zie opmerking 5 ) .

Voeg 40 ml natriummethylaat ( zie opmerking 3.2.2.6 . c ) ) toe .

Sluit de terugvloeikoeler aan , schud en kook tot de oplossing helder wordt ( ongeveer 10 minuten ) . Normaal is de volledige reactie na 15 minuten afgelopen .

Voeg ten minste 50 ml methanolische zoutzuuroplossing toe en kook wederom 10 minuten ( zie opmerking 3.2.2.6 . d ) ) . Laat de erlenmeyer of de rondbodemkolf onder stromend water afkoelen , voeg 100 ml water toe en breng het mengsel over in een scheitrechter van 250 ml . Voeg 30 ml heptaan toe ( zie opmerking 4 ) . Schud krachtig en laat staan teneinde de vloeistoflagen te laten scheiden . Scheid de heptaanlaag af en schud de waterlaag nogmaals met 30 ml heptaan . Verenig de twee heptaanextracten en was deze met water tot neutraal . Laat de waterlaag af en droog het heptaanextract met watervrij natriumsulfaat , filtreer over watten in een erlenmeyer van 100 ml . Damp eventueel de oplossing met behulp van een kokend-waterbad en onder een stikstofstroom in tot een volume van 20 ml is bereikt ( zie opmerkingen 6 en 7 ) .

3.2.2.5 . Werkwijze voor vetzuren

Voor vetzuren dient onderstaande vereenvoudigde werkwijze te worden toegepast .

Voor vetzuren met meer dan twee dubbele bindingen verdient het aanbeveling de lucht uit de methanol en de kolf te verwijderen door enige minuten stikstof door te leiden .

Voer de voorbehandeling van het monster uit volgens I .

Breng in een erlenmeyer of rondbodemkolf van 250 ml ongeveer 4 g voorbehandeld monster ( zie opmerking 5 ) . Voeg 50 ml methanolische zoutzuuroplossing en enige kooksteentjes toe , sluit de terugvloeikoeler aan , en kook gedurende 10 minuten .

Laat de erlenmeyer of de rondbodemkolf onder stromend water afkoelen , voeg 100 ml water toe en breng het mengsel over in een scheitrechter van 250 ml . Voeg 30 ml heptaan toe ( zie opmerking 4 ) . Schud krachtig en laat staan teneinde de vloeistoflagen te laten scheiden . Scheid de heptaanlaag af en schud nogmaals met 30 ml heptaan . Verenig de twee heptaanextracten en was deze met water tot neutraal . Laat de waterlaag af en droog het heptaanextract met watervrij natriumsulfaat , filtreer over watten in een erlenmeyer van 100 ml . Damp eventueel de oplossing met behulp van een kokend-waterbad en onder een stikstofstroom in tot een volume van 20 ml is bereikt ( zie opmerkingen 6 en 7 ) .

3.2.2.6 . Opmerkingen

a ) Kleine hoeveelheden watervrij zoutzuurgas hunnen gemakkelijk in het laboratorium worden bereid door aan in de handel verkrijgbaar zoutzuur ( d = 1,18 ) druppelsgewijs sterk zwavelzuur ( d = 1,84 ) toe te voegen . Het ontwikkelde zoutzuurgas wordt gedroogd door het door geconcentreerd zwavelzuur te leiden .

Aangezien methanol zeer snel chloorwaterstofgas opneemt , dienen de gebruikelijke voorzorgen bij het oplossen te worden genomen , b.v . door het gas in te leiden met behulp van een kleine omgekeerde trechter die juist het niveau van de methanol raakt . Het is mogelijk van tevoren grotere hoeveelheden zoutzuremethanol-oplossingen te bereiden , in flessen met ingeslepen stop die op een donkere plaats uitstekend houdbaar zijn .

b ) Het is mogelijk methanolzwavelzuur ongeveer 1 N in plaats van methanolzoutzuur te gebruiken , maar de verestering dient dan minstens 20 minuten te duren .

Het natriumsulfaatneerslag hindert het koken , zodat het noodzakelijk is te filtreren of gebruik te maken van een magnetische roerder .

c ) Het is ook mogelijk om aan 40 ml methanol 0,4 g natrium toe te voegen en daarna het analysemonster . Dit komt neer op het bereiden van een direct te gebruiken natriummethylaat-oplossing .

d ) Bij vetten met een hoog zuurgetal ontstaat als gevolg van de betrekkelijk grote hoeveelheid toegevoegd natriummethylaat een neerslag van natriumchloride dat tijdens het koken kookvertraging kan geven . Dit neerslag kan worden gefiltreerd , maar dit is over het algemeen niet nodig gezien de korte verwarmingstijd die wordt aanbevolen .

4 . BIJZONDERE METHODEN VOOR DE BEREIDING VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN MET 4 OF MEER KOOLSTOFATOMEN

4.1 . Beginsel

De methylesters worden verkregen door reactie van oliën en vetten met een methanolische kaliumhydroxyde-oplossing in een tussenstadium voor de verzeping .

4.2 . Toepassingsgebied

De methode is voornamelijk bestemd voor de bereiding van methylesters voor gaschromatografische analyse .

De methode kan niet worden toegepast voor oliën en vetten met een zuurgetal > 2 .

4.3 . Toestellen

- Reageerbuizen met ingeslepen stop van ongeveer 20 ml ,

- Maatkolven van 50 en 100 ml ,

- Pipetten met maatverdeling van 1 ml ( of meer ) ,

- Maatbuizen van 10 ml .

4.4 . Reagentia

- Methanolische kaliumhydroxyde-oplossing , ongeveer 2 N : 11,2 g kaliumhydroxyde oplossen in 100 ml methanol die ten hoogste 0,5 m/m water bevat ;

- Heptaan , voor chromatografische doeleinden ( zie opmerkingen 2 en 4 ) ;

- Referentie-oplossing I : weeg in een maatkolf van 50 ml op 0,1 mg nauwkeurig 1 g methylpentanoaat en vul aan met heptaan tot het streepje ;

- Referentie-oplossing II : weeg in een maatkolf van 100 ml op 0,1 mg nauwkeurig 200 mg methylpentanoaat en vul aan met heptaan tot het streepje .

4.5 . Werkwijze

Indien de gaschromatografische analyse van boterzuur is vereist , dient een referentie-oplossing te worden gebruikt : referentie-oplossing I indien het verwachte gehalte aan boterzuur meer dan 1 % bedraagt , referentie-oplossing II indien dit gehalte minder dan 1 % bedraagt .

Indien de gaschromatografische bepaling van de vetzuursamenstelling is vereist , behoeft geen referentie-oplossing te worden gebruikt .

Voer de voorbehandeling van het monster uit volgens I .

Weeg in een reageerbuis met ingeslepen stop van ongeveer 20 ml op 1 mg nauwkeurig 1 g van het voorbehandelde monster . Voeg 10 ml heptaan , gemeten met het maatglas , toe . Voeg met een maatpipet 1,0 ml van de passende referentie-oplossing toe .

Opmerking

Indien de analyse van boterzuur niet vereist is , is het niet nodig het monster op 1 mg nauwkeurig te wegen en de referentie-oplossing toe te voegen .

Voeg 0,5 ml methanolische kaliumhydroxyde-oplossing , ongeveer 2 N , toe en meng de inhoud van de reageerbuis onder zwenken totdat deze helder wordt . Dit vergt ongeveer 20 sec . Bijna onmiddellijk hierna wordt de oplossing opnieuw troebel ten gevolge van de afscheiding van glycerol . De glycerol bezinkt snel .

Laat de bovenste laag met de methylesters af .

5 . OPMERKINGEN

1 . Indien het onverzeepbare gedeelte stoort , de na verzeping verkregen oplossing met water verdunnen en volgens een gebruikelijke methode ( Aanbeveling ISO/DIS 3596 of IUPAC-methode II.D.5 . ) extraheren met diethylethe , hexaan of petroleumether . Aan de zeepoplossing zuur toevoegen , de vetzuren afscheiden en omzetten in methylesters volgens 3.1.4.2 . of 3.2.2.5 .

2 . Bij de gaschromatografische analyse van de methylesters kunnen bepaalde reagentia , met name de boortrifluoride-methanoloplossingen op het chromatogram bijpieken geven ( in het C20-C22 gebied voor de boortrifluoride-methanoloplossing ) . Alle te gebruiken reagentia moeten steeds worden getest door de methylester van zuiver oliezuur te bereiden en deze te chromatograferen .

Indien bijpieken verschijnen mag het reagens niet worden gebruikt . De verschillende reagentia mogen geen bijpieken geven die bij de gaschromatografische analyse sterend werken op de pieken van de vetzuremethylesters .

3 . Indien het absoluut noodzakelijk is een boortrifluoride-methanoloplossing te bereiden , ga dan als volgt te werk . Weeg een kolf van 2 liter die 1 liter methanol bevat . Laat deze afkoelen in een ijsbad . Houd de kolf in het bad en leid BF3 uit een gasfles door een glazen buis in de methanol tot 125 g is geabsorbeerd . Voer deze bewerking uit in een zuurkast . Leid de BF3-gasstroom door de glazen buis voordat deze in de methanol wordt gebracht en to de buis uit de methanol is gehaald . Dit om te voorkomen dat vloeistof terugvloeit in het reduceerventiel . Het gas mag niet te snel uit de kolf ontsnappen , er mag geen witte damp zichtbaar zijn .

Het reagens is gedurende twee jaar houdbaar .

4 . Heptaan ( gaschromatografisch zuiver mengsel van C7-isomeren ) kan door hexaan worden vervangen , indien geen vetzuren met 20 of meer koolstofatomen aanwezig zijn .

5 . Als het analysemonster kleiner is dan het aanbevolen gewicht kan 10 mg of minder worden gebruikt . De voorgeschreven reagentia dienen naar evenredigheid te worden verminderd en het volume van de toestellen moet dienovereenkomstig worden aangepast .

6 . De methylesters moeten bij voorkeur zo spoedig mogelijk worden geanalyseerd . Indien nodig kan de heptaanoplossing met methylesters onder inert gas in een koelkast worden bewaard .

Bij langere tijd bewaren is het , om oxydatie van de methylesters te voorkomen , wenselijk een antioxydant toe te voegen in een concentratie die de analyses niet beïnvloedt , b.v . 0,05 g/1 B.H.T . ( 2,6-ditert butyl-4-methyl phenol ) = 0,005 c/c m/v .

Droge methylesters zonder oplosmiddel kunnen eventueel 24 uur worden bewaard onder inert gas en in een koelkast of langer in een onder vacuum dichtgesmolten buis en in een vriesruimte .

7 . Het gevaar bestaat dat vluchtige methylesters verloren gaan , indien afdampen van het oplosmiddel te lang wordt voortgezet of indien een te sterke stikstofstroom wordt toegepast . Voor infraroodspectrofotometrie dient het oplosmiddel zo volledig mogelijk te worden verwijderd .

Voor gaschromatografie is het wenselijk het oplosmiddel niet te verwijderen .

8 . Bij olien van het type " ricinusolie " vormt de helderheid geen bruikbaar criterium voor de reactie .

III . GASCHROMATOGRAFIE VAN METHYLESTERS VAN VETZUREN

1 . INLEIDING

Deze methode beoogt het geven van algemene richtlijnen voor de kwalitatieve en kwantitatieve gaschromatografische bepaling van de samenstelling van een mengsel van de methylesters van vetzuren , verkregen volgens II .

Gepolymeriseerde vetzuren kunnen met deze methode niet worden geanalyseerd .

De voorschriften hebben betrekking op de gebruikelijke apparatuur voor gaschromatografie met gepakte kolom en vlamionisatiedetector ( zie opmerking 1 ) .

2 . TOESTELLEN

2.1 . Gaschromatograaf

Elk apparaat waarmee het schotelgetal en het oplossend vermogen zoals bepaald volgens 4.1.2 . kunnen worden bereikt , is geschikt .

2.1.1 . Injectiestuk

Het injectiestuk moet een zo klein mogelijke dode ruimte hebben . Tenzij het gebruikte materiaal dit onmogelijk maakt , dient het injectiestuk op een temperatuur te worden gebracht , die 25 * à 50 * hoger ligt dan die van de kolom .

2.1.2 . Oven

De oven moet de kolommen tot minstens 220 * C kunnen verwarmen en de gekozen temperatuur op 1 * C nauwkeurig kunnen aanhouden .

In geval van temperatuurprogrammering wordt het gebruik van een apparaat met 2 kolommen aangeraden .

2.1.3 . Kolom

2.1.3.1 . Buis

Buis van een materiaal dat inert is ten opzichte van de te analyseren verbindingen :

glas of , indien niet voorhanden , roestvrij staal ( zie opmerking 2 ) .

Lengte : 1 tot 3 meter . Indien vetzuren met lange kookstofketens ( > C20 ) aanwezig zijn , kan een relatief korte kolom worden gebruikt .

Indien de vetzuren C4 en C6 worden bepaald , wordt het gebruik van een kolom van 2 m aanbevolen .

Inwendige diameter : 2 tot 4 mm .

2.1.3.2 . Vulling

Drager : diatomeeënaarde , zuur gewassen en gesilaniseerd , of elke andere geschikte inerte drager met een korrelgrootte tussen nauwe grenzen ( 25 mm tussen 125 en 200 mm ) , waarbij de gemiddelde waarde afhangt van de binnendiameter en de lengte van de kolom .

Stationaire fase : polaire fase , bijvoorbeeld van het polyestertype ( diëthyleenglycolpolysuccinaat , butaandiolpolysuccinaat , ethyleenglycolpolyadipaat ) , of elke andere fase die aan de hierna beschreven eisen voldoet ( bijvoorbeeld cyaansiliconen ) . De bedekkingsgraad ligt tussen 5 en 20 % . Voor bepaalde scheidingen kunnen a polaire fasen worden gebruikt .

2.1.3.3 . Conditionering

Verbreek , indien mogelijk , de verbinding kolom-detector en breng de oven van het apparaat op 10 * C boven de temperatuur , waarbij de analyse dient te worden uitgevoerd . Laat de vers bereide kolom onder een stroom van inert gas van 20 - 60 ml/min gedurende ten minste 16 uur bij deze temperatuur en daarna gedurende 2 uur bij 195 * C conditioneren .

2.1.4 . Detector

De detector moet bij voorkeur op een temperatuur kunnen worden gebracht die lieger ligt dan die van de kolom .

Bij de hierna beschreven werkwijze wordt uitgegaan van een vlamionisatiedetector ( zie opmerking 1 ) .

2.2 . Spuit

Injectiespuit van maximaal 10 ml , onderverdeeld in 0,1 ml .

2.3 . Recorder

Wanneer de geregistreerde curve wordt gebruikt om de samenstelling van het geanalyseerde mengsel te berekenen , dient een elektronische recorder met grote nauwkeurigheid te worden gebruikt .

De kenmerken van de recorder moeten aangepast zijn aan die van de te gebruiken apparatuur :

- Responsietijd < 1,5 sec ( de responsietijd is de tijd die de pen van de recorder nodig heeft om ineens van 0 naar 90 % te gaan bij het toevoeren van een signaal van 100 % ) .

- Papierbreedte : minimaal 25 cm .

- Papiersnelheid : 25 - 150 cm/uur .

2.4 . Integrator ( naar keuze )

Een elektronische integrator biedt de mogelijkheid snelle en nauwkeurige berekeningen uit te voeren . De integrator moet lineair zijn , een voldoende gevoeligheid hebben en de correctie van de basisdrift moet toereikend zijn .

3 . REAGENTIA

- Draaggas : inert gas ( stikstof , helium , argon , enz . ... ) , zeer goed gedroogd en minder dan 10 ppm zuurstof bevattend ;

- Hulpgassen :

waterstof van minimaal 99,9 % ; organisch materiaal moet afwezig zijn ;

lucht of zuurstof ; organisch materiaal moet afwezig zijn ;

- Standaardmengsel : mengsel van methylesters of methylesters van een olie met bekende samenstelling , indien mogelijk met ongeveer dezelfde samenstelling als het te analyseren monster olie of vet .

4 . WERKWIJZE

4.1 . Instellen van het apparaat

4.1.1 . Vaststellen van de optimale werkomstandigheden

Bij het kiezen van de werkomstandigheden moet rekening worden gehouden met de volgende variabelen :

kolomlengte en -diameter ,

aard en hoeveelheid van de stationaire fase ,

kolomtemperatuur ,

dragergassnelheid ,

gewenst oplossend vermogen ,

hoeveelheid op te brengen monster ,

duur van de analyse .

De monstergrootte dient zo te worden gekozen dat de respons van de combinatie detectorelektrometer lineair is .

In het algemeen zullen bij de hierna vermelde waarden de gewenste resultaten worden verkregen : theoretisch schotelgetal voor methylstearaat : ten minste 2 000 elutie van methylstearaat : ca . 15 minuten :

Inwendige diameter van de kolom * Draaggassnelheid *

2mm * 15 - 25 ml/min *

3mm * 20 - 40 ml/min *

4mm * 40 - 60 ml/min *

Concentratie van de stationaire fase * Temperatuur *

5 % * 175 * C *

10 % * 180 * C *

15 % * 185 * C *

20 % * 185 * C *

Wanneer dit met het apparaat mogelijk is , dient de temperatuur van het injectiestuk op ongeveer 200 * C en die van de detector op of boven de temperatuur van de kolom te worden ingesteld .

Bij vlamionisatiedetectie zal de snelheid van de waterstof in het algemeen ongeveer de helft van die van het draaggas zijn ; de zuurstofsnelheid is ongeveer 5 of 10 maal zo groot als die van de waterstof .

4.1.2 . Bepaling van het scheidend vermogen en het schotelgetal

Voer de analyse uit met een mengsel van ongeveer gelijke hoeveelheden methylstearaat en -oleaat ( bijvoorbeeld methylesters van cacaoboter ) . Kies de hoeveelheid monster , de kolomtemperatuur en de draaggassnelheid zodanig dat de maximale piekhoogte voor methylstearaat ongeveer 15 minuten na de piek van het oplosmiddel wordt geregistreerd en dat de methylstearaatpiek ongeveer 3/4 van de papierbreedte ( schaal ) beslaat .

Bereken het theoretische schotelgetal n ( " efficiency " ) met de formule

n = 16 ( dR1 / ( * ) 1 )2

en het scheidend vermogen R met de formule

R = 2 A / ( * ) 1 + ( * ) 2

waarin :

dR1 de retentieafstand in mm is , gemeten vanaf het inbrengen ( begin oplosmiddel piek ) tot het relatieve maximum van de piek voor methylstearaat ,

o1 en o2 de breedten in mm zijn van de pieken voor methylstearaat en -oleaat , gemeten tussen de snijpunten van de raaklijnen aan de buigpunten met de basislijn ,

D de afstand is tussen de relatieve maxima van de methylstearaat - en methyloleaatpieken .

Figuur : zie P.b .

De voor het uitvoeren van de analyse aan te houden omstandigheden zijn die waarbij voor methylstearaat een theoretisch schotelgetal van ten minste 2 000 en een scheidend vermogen van minstens 1,25 worden verkregen . Bovendien moeten de omstandigheden zo zijn dat linoleenzuur ( C18:3 ) van arachidonzuur ( C20:0 ) en gadoleïnezuur ( C20:1 ) wordt gescheiden .

4.2 . Analyse

Ga uit van 0,1 tot 2 ml van de heptaanoplossing van methylesters bereid volgens II . Bereid in het geval van esters zonder oplosmiddel , een oplossing van ongeveer 10 % in heptaan en gebruik hiervan 0,1 tot 1 ml voor injectie .

Voor het bepalen van componenten die in sporen aanwezig zijn , kan de monstergrootte worden verhoogd ( tot 10 maal ) .

Normaal wordt gewerkt onder de omstandigheden als bepaald in 4.1.1 . Het is evenwel mogelijk met een lagere kolomtemperatuur te werken wanneer de vetzuren minder dan 12 koolstofatomen bevatten , of met een hogere temperatuur wanneer vetzuren met meer dan 20 koolstofatomen moeten worden bepaald .

In deze twee voorgaande gevallen kan eventueel met temperatuurprogrammering worden gewerkt . Injecteer , indien het monster bijvoorbeeld methylesters van vetzuren * C12 bevat , het monster bij 100 * C ( of bij 50 - 60 * C bij aanwezigheid van boterzuur ) en programmeer dan direct naar de optimale temperatuur met 4 a 8 * C/min .

In bepaalde gevallen kunnen de 2 procédés worden gecombineerd : na de temperatuurprogrammeringsperiode , de elutie op constante temperatuur voortzetten tot elutie van alle componenten . Indien het apparaat niet met temperatuurprogrammering kan werken , werken bij 2 vaste temperaturen tussen 100 * C en 195 * C .

Indien nodig , verdient het aanbeveling een analyse met 2 stationaire fasen van verschillende polariteit uit te voeren om de aanwezigheid van over elkaar vallende pieken na te gaan , bv . voor visoliën of in het geval dat C18:3 en C20:0 of C18:3 en C18:2 geconjugeerd tegelijk voorkomen .

5 . UITDRUKKING VAN DE RESULTATEN

5.1 . Kwalitatieve analyse

Analyseer het vergelijkingsmengsel met bekende samenstelling onder dezelfde omstandigheden als voor het onderzoek van het monster . Bepaal de retentie-afstanden ( of retentietijden ) voor de samenstellende vetzuren . Maak een grafiek door de logaritme van de retentie-afstand ( of de retentietijd ) als functie van het aantal koolstofatomen uit te zetten ; onder isotherme omstandigheden zullen voor esters met rechte keten en een bepaalde graad van onverzadigheid , de op semi-logaritmisch papier getekende curven nagenoeg evenwijdig lopende rechte lijnen zijn .

Bij het onderzoek van het monster moeten de pieken op basis van deze rechte lijnen , zonodig door middel van interpolatie worden geïdentificeerd .

Vermijd analyse-omstandigheden , waarbij " veroorgen pieken " kunnen optreden , d.w.z . dat twee componenten tengevolge van een onvoldoende scheidend vermogen niet van elkaar kunnen worden onderscheiden .

5.2 . Kwantitatieve analyse

5.2.1 . Bepaling van de samenstelling

Gebruik de methode van " interne normalisatie " ( behoudens uitzondering ) ; hierbij wordt aangenomen dat alle in het monster aanwezige componenten op het chromatogram worden weergegeven , en dat derhalve de som van de piekoppervlakken overeenkomt met 100 % van de bestanddelen ( totale elutie ) .

Indien de apparatuur is voorzien van een integrator , maak dan gebruik van de met dit apparaat verkregen getalwaarden . Is geen integrator aanwezig , bepaal het oppervlak van elke piek d.m.v . triangulatie door de hoogte van de piek met de piekbreedte op halve hoogte te vermenigvuldigen ; hierbij dient rekening te worden gehouden met de eventuele diverse verzwakkingen die tijdens het opnemen van het chromatogram werden toegepast .

5.2.1.1 . Standaardgeval

Bereken bij afwezigheid van belangrijke componenten beneden C8 , het gehalte van een component , uitgedrukt in % methy esters , door het bepalen van het percentage dat het oppervlak van de desbetreffende piek uitmaakt van het totale piekoppervlak :

percentage ( m/m ) van component i = A/SA maal 100

uitgedrukt in methylesters

A1 = piekoppervlak van component i ;

SA1 = som van de oppervlakken van alle pieken .

5.2.1.2 . Gebruik van correctiefactoren

In bepaalde gevallen , met name bij aanvezigheid van zuren beneden C8 of van zuren met secundaire groepen en wanneer men detectoren op basis van warmtegeleidbaarheid ( katharometer ) gebruikt , moeten correctiefactoren worden gebruikt om de percentages van de piekoppervlakken om te zetten in massapercentages van de componenten .

Bepaal de corrctiefactoren met behulp van een chromatogram , verkregen door een analyse van een vergelijkingsmengsel van methylesters waarvan de samenstelling nauwkeuring bekend is , onder dezelfde omstandigheden als voor het onderzoek van het monster .

Voor het vergelijkingsmengsel :

percentage ( m/m ) van component i = B/SB maal 100

B1 = massa van component i in het vergelijkingsmengsel ;

SB1 = som van de massa's der diverse componenten van het vergelijkingsmengsel .

Het chromatogram van het vergelijkingsmengsel biedt de mogelijkheid de volgende gegevens te berekenen :

het percentage ( oppervlak/oppervlak ) van component i = C1/SC1 maal 100

C1 = piekoppervlak van component i

SC1 = som van de oppervlakken van alle pieken

waaruit kan worden afgeleid :

correctiefactor K = B maal SC/C maal SB

De correctiefactoren worden gewoonlijk op K16 = 1 betrokken , en de relatieve factoren bedragen dan :

K' = K/K16

Voor het monster wordt het gehalte aan elke component weergegeven door

percentage ( m/m ) van component i = K' * maal A * / ( S ( K' * maal A * ) ) maal 100

uitgedrukt in methylesters

5.2.1.3 . Gebruik van een inwendige standaard

In bepaalde gevallen ( met name bij de bepaling van C4 en C6 zuren en bij de bepaling van vetzuren , waarbij niet alle zuren worden geëlueerd ) moet een inwendige standaard ( resp . C5 en C15 of C17 ) worden gebruikt en derhalve ook de correctiefactor van de inwendige standaard worden vastgesteld .

percentage ( m/m ) van component i = m s maal K' i maal A i/m maal K' s maal A s maal 100

uitgedrukt in methylesters

m s = massa van de inwendige standaard in mg ;

m = massa van het monster in mg ;

K' s = correctiefactor voor de inwendige standaard ;

K' i = correctiefactor voor component i ;

A s = piekoppervlak van de inwendige standaard ;

A i = piekoppervlak van component i .

5.2.2 . Uitdrukking van de resultaten

Geef het resultaat weer met :

3 cijfers boven 10 % ,

2 cijfers tussen 1 en 10 % ,

1 cijfer beneden 1 % ,

d.w.z . steeds met een cijfer achter de komma .

5.2.3 . Herhaalbaarbeid

Het verschil tussen de resultaten van twee op dezelfde dag met hetzelfde apparaat door dezelfde persoon en op dezelfde esters uitgevoerde bepalingen mag voor de componenten die in een hoeveelheid van ten minste 5 % voorkomen , niet meer bedragen dan 3 % relatief , met een maximum van 1 % absoluut . Voor de componenten waarvan minder dan 5 % aanwezig is , neemt de herhaalbaarheid in relatieve waarde bij dalend gehalte snel af .

5.2.4 . Reproduceerbaarheid

Het verschil tussen de resultaten die in twee verschillende laboratoria werden verkregen , mag voor de componenten , die in een hoeveelheid van ten minste 5 % voorkomen , niet meer bedragen dan 10 % relatief met een maximum van 3 % absoluut . Voor de componenten waarvan minder dan 5 % aanwezig is , neemt de reproduceerbaarheid in relatieve waarde bij dalend gehalte snel af .

6 . OPMERKINGEN

1 . Een gaschromatograaf met een warmtegeleidingsvermogencel ( katharometer ) kan worden gebruikt . De beschreven omstandigheden moeten dan als volgt worden gewijzigd :

Kolom : lengte 2 a 4 m ; inwendige diameter 4 mm ;

Drager : korrelgrootte tussen 160 en 200 mm ;

Bedekkingsgraad : 15 a 25 % ;

Draaggas : helium , of , indien niet voorhanden , waterstof met een zo laag mogelijk zuur * tofgehalte ; geen hulpgassen ;

Temperatuur van het injectiestuk : 40 * C tot 60 * C boven die van de kolom ;

Kolomtemperatuur : 180 * C a 200 * C ;

Draaggassnelheid : in het algemeen tussen 60 en 80 ml/min . ;

Geïnjecteerde hoeveelheden : in het algemeen tussen 0,5 en 2 ml .

Voor de kwantitatieve analyse rekening houden met de onder 5.2.1.2 . bepaalde correctiefactoren .

2 . Bij aanwezigheid van meervoudig onverzadigde verbindingen met meer dan drie dubbele bindingen , kan een kolom van roestvrij staal ontleding van deze verbindingen veroorzaken .