3)

De volgende hoofdstukken worden toegevoegd: „B.49. IN-VITROMICRONUCLEUSTEST BIJ ZOOGDIERCELLEN INLEIDING 1. De in-vitromicronucleusbepaling (MNvit) is een genotoxiciteitstest waarmee micronuclei (MN) in het cytoplasma van interfasecellen worden opgespoord. Micronuclei kunnen ontstaan uit acentrische chromosoomfragmenten (d.w.z. zonder centromeer) of volledige chromosomen die tijdens het anafasestadium van de celdeling niet naar de polen kunnen migreren. De bepaling spoort de activiteit van clastogene en aneugene chemische stoffen (stoffen en mengsels) (1) (2) op in cellen die tijdens of na blootstelling aan de teststof celdeling hebben ondergaan. Bij deze testmethode (TM) mogen protocollen met en zonder de actinepolymerisatieremmer cytochalasine B (cytoB) worden gebruikt. De toevoeging van cytoB alvorens de beoogde mitose plaatsvindt, maakt identificatie en selectieve analyse mogelijk van de micronucleusfrequentie in cellen die één mitose hebben voltooid, omdat dergelijke cellen binucleair zijn (3) (4). Met deze TM is het ook mogelijk protocollen zonder cytokineseblokkering te gebruiken op voorwaarde dat er bewijzen zijn dat de geanalyseerde celpopulatie mitose heeft ondergaan. 2. De MNvit-bepaling kan niet alleen worden gebruikt om chemische stoffen (stoffen en mengsels) te identificeren die micronuclei induceren, maar het gebruik van een cytokineseblokkering, de immunochemische labeling van kinetochoren of hybridisatie met centromere/telomere proben (fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)) kan ook informatie verstrekken over de mechanismen van chromosoombeschadiging en de vorming van micronuclei (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). De labeling- en hybridisatieprocedures kunnen worden gebruikt wanneer sprake is van een toename van micronucleivorming en de onderzoeker wenst te bepalen of die toename het gevolg is van clastogene en/of aneugene gebeurtenissen. 3. Micronuclei vertonen schade die is doorgegeven aan dochtercellen, terwijl in metafasecellen gescoorde chromosoomafwijkingen mogelijk niet doorgegeven worden. Omdat micronuclei in interfasecellen op relatief objectieve wijze kunnen worden beoordeeld, hoeft het laboratoriumpersoneel alleen na te gaan of de cellen al dan niet deling hebben ondergaan en hoeveel cellen een micronucleus bevatten. Bijgevolg kunnen de preparaten vrij snel worden gescoord en kan de analyse worden geautomatiseerd. Zo wordt het in de praktijk mogelijk om niet honderden, maar duizenden cellen per behandeling te scoren, hetgeen de bepaling krachtiger maakt. Aangezien micronuclei kunnen ontstaan uit achtergebleven chromosomen, is het tot slot mogelijk om stoffen op te sporen die aneuploïdie induceren en die moeilijk onderzocht kunnen worden in conventionele tests op chromosoomafwijkingen, bv. OESO-testrichtlijn 473 (hoofdstuk B.10 van deze bijlage) (17). Aan de hand van de MNvit-bepaling is het zonder bijzondere technieken, zoals de in punt 2 beschreven FISH, echter niet mogelijk te differentiëren tussen stoffen die polyploïdie induceren en stoffen die clastogeniciteit induceren. 4. De MNvit-bepaling is een in-vitromethode waarvoor meestal gekweekte menselijke cellen of cellen van knaagdieren worden gebruikt. Zij biedt een brede basis voor onderzoek van mogelijke in-vitrobeschadiging van chromosomen, omdat zowel aneugenen als clastogenen kunnen worden opgespoord. 5. De MNvit-bepaling is robuust en effectief in verschillende celtypen en in de aanwezigheid of afwezigheid van cytoB. Er zijn uitgebreide gegevens die de validiteit van de MNvit-bepaling met behulp van diverse cellijnen van knaagdieren (CHO, V79, CHL/IU en L5178Y) en humane lymfocyten ondersteunen (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31). Hieronder zijn met name begrepen de internationale valideringsonderzoeken die zijn gecoördineerd door de Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) en de verslagen van de International Workshop on Genotoxicity Testing (4) (16). De beschikbare gegevens zijn ook opnieuw beoordeeld tijdens een retrospectief valideringsonderzoek naar het gewicht van de evidentie door het Europees Centrum voor de validering van alternatieve methoden (ECVAM) van de Europese Commissie, en de testmethode is door het Raadgevend wetenschappelijk comité van het ECVAM bekrachtigd als wetenschappelijk geldig (32) (33) (34). Het gebruik van de humane TK6 lymfoblastoïde cellijn (35), HepG2-cellen (36) (37) en primaire embryocellen van de Syrische hamster (38) is beschreven, hoewel ze niet zijn gebruikt in valideringsonderzoeken. DEFINITIES 6. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1. TOELICHTING 7. Bij in vitro uitgevoerde tests moet er meestal een exogene metabole activeringsbron worden gebruikt, tenzij de cellen qua metabolisme competent zijn met betrekking tot de geteste stoffen. Het exogene metabole activeringssysteem kan de omstandigheden in vivo niet volledig nabootsen. Er moet ook goed op worden gelet dat omstandigheden die kunnen leiden tot artefactuele positieve resultaten die niet het gevolg zijn van intrinsieke mutageniteit maar die worden veroorzaakt door veranderingen in factoren zoals opvallende wijzigingen in de pH of de osmolaliteit of door een sterke cytotoxiciteit, worden vermeden (39) (40) (41). Indien de teststof op het ogenblik van toevoeging een wijziging in de pH van het medium veroorzaakt, moet de pH worden aangepast, bij voorkeur door de stamoplossing te bufferen zodat alle volumes van alle testconcentraties, en voor alle controles, dezelfde blijven. 8. Om de inductie van micronuclei te analyseren, is het van essentieel belang dat zowel in de behandelde als de onbehandelde culturen mitose heeft plaatsgevonden. Het meest informatieve stadium voor het scoren van micronuclei is in cellen die één mitose voltooid hebben tijdens of na de behandeling met de teststof. PRINCIPE VAN DE TEST 9. Culturen van humane cellen of zoogdiercellen worden blootgesteld aan de teststof met en zonder een exogene metabole activeringsbron tenzij cellen met een toereikende metaboliseringscapaciteit worden gebruikt. In elke test worden gelijktijdig controles met oplosmiddel/medium (VC) en positieve controles (PC) uitgevoerd. 10. Tijdens of na blootstelling aan de teststof worden de cellen gekweekt tijdens een periode die lang genoeg is om ervoor te zorgen dat chromosoom- of spoeldraadbeschadiging leidt tot de vorming van micronuclei in interfasecellen. Voor de inductie van aneuploïdie moet de teststof gewoon aanwezig zijn tijdens mitose. Geoogste en gekleurde interfasecellen worden onderzocht op de aanwezigheid van micronuclei. Idealiter mogen micronuclei alleen worden gescoord in de cellen die de mitose hebben voltooid tijdens blootstelling aan de teststof of tijdens de periode na de blootstelling, als een dergelijke periode wordt toegepast. In culturen die behandeld zijn met een cytokineseblokker wordt dit bereikt door uitsluitend binucleaire cellen te scoren. Wanneer geen cytokineseblokker wordt gebruikt, is het belangrijk aan te tonen dat de onderzochte cellen wellicht celdeling hebben ondergaan tijdens of na de blootstelling aan de teststof. Het is belangrijk dat alle protocollen aantonen dat celproliferatie zich zowel in de controleculturen als de behandelde culturen heeft voorgedaan, en de mate van door de teststof geïnduceerde cytoxiciteit of cytostase moet worden beoordeeld in de culturen of (in parallelle culturen) die voor micronuclei gescoord zijn. BESCHRIJVING VAN DE BEPALING Preparaten 11. Primaire culturen van humane lymfocyten uit perifeer bloed (5) (19) (42) (43) en een aantal knaagdiercellijnen zoals CHO, V79, CHL/IU, en L5178Y mogen worden gebruikt (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Het gebruik van andere cellijnen en celtypen moet worden verantwoord op basis van hun aangetoonde prestaties in de bepaling, zoals beschreven in het hoofdstuk over aanvaardbaarheidscriteria. Omdat de achtergrondfrequentie van micronuclei van invloed zal zijn op de gevoeligheid van de bepaling, wordt aanbevolen dat celtypen met een lage, stabiele achtergrondfrequentie van micronucleusvorming worden gebruikt. 12. Humane lymfocyten uit perifeer bloed dienen te worden verkregen van gezonde, jonge mensen (ongeveer 18-35 jaar oud), niet-rokers die voor zover bekend onlangs niet zijn blootgesteld aan genotoxische stoffen of straling. Indien cellen van meer dan één donor voor gebruik worden gepoold, moet het aantal donors aangegeven worden. De micronucleusfrequentie neemt met de leeftijd toe en deze tendens is meer uitgesproken bij vrouwen dan bij mannen (44). Dit moet in aanmerking worden genomen bij de selectie van te poolen donorcellen. Media en cultuuromstandigheden 13. Er moet worden gezorgd voor geschikte kweekmedia en incubatieomstandigheden (kweekvat, CO2-concentratie, temperatuur en vochtigheid) voor de culturen. Permanente cellijnen en stammen moeten geregeld worden gecontroleerd om na te gaan of het modale aantal chromosomen stabiel is en er geen besmetting met mycoplasma heeft plaatsgevonden; indien er wel een besmetting heeft plaatsgevonden of indien het modale aantal chromosomen gewijzigd is, mogen ze niet worden gebruikt. De normale tijd voor de celcyclus bij de in het testlaboratorium gebruikte kweekomstandigheden moet bekend zijn. Indien de methode met cytokineseblokker wordt toegepast, moet de concentratie van de cytokineseremmer worden geoptimaliseerd voor het welbepaalde celtype en moet deze aantoonbaar een goede opbrengst opleveren van binucleaire cellen die vervolgens kunnen worden gescoord. Prepareren van de culturen 14. Permanente cellijnen en stammen: cellen uit stamculturen worden met een zodanige dichtheid in een kweekmedium geënt dat de kolonies niet aaneengroeien in een monolaagcultuur en dat de suspensieculturen voor het oogsten geen overmatige dichtheid bereiken, en bij 37 °C geïncubeerd. 15. Lymfocyten: met een stollingsremmer (bv. heparine) behandeld volledig bloed of geïsoleerde lymfocyten worden gekweekt in aanwezigheid van een mitogeen (bv. fytohemagglutinine (PHA)), voordat ze aan de teststof en cytoB worden blootgesteld. Metabolische activering 16. Exogene metabole activeringssystemen moeten worden gehanteerd bij het gebruik van cellen met ontoereikende endogene metabole capaciteit. Het meest gebruikte systeem is een post-mitochondriale fractie aangevuld met een cofactor (S9), verkregen uit de lever van knaagdieren die zijn behandeld met enzym-inducerende stoffen als Aroclor 1254 (45) (46) of een combinatie van fenobarbiton en β-naftoflavon (46) (47) (48) (49). De laatste combinatie druist niet in tegen het Verdrag van Stockholm inzake persistente organische verontreinigende stoffen (50) en Verordening (EG) nr. 850/2004 betreffende persistente organische verontreinigende stoffen (66). Bovendien is aangetoond dat zij even effectief is als Aroclor 1254 voor de inducering van oxidasen met gemengde functie (46) (47) (48) (49). De S9-fractie wordt meestal gebruikt bij een concentratie van 1-10 % (v/v) in het uiteindelijke medium. De omstandigheden voor het gebruik van een metabool activeringssysteem kunnen afhankelijk zijn van de aard van de geteste chemische verbinding en het kan in sommige gevallen aangewezen zijn om meer dan een S9-concentratie te gebruiken. 17. Genetisch aangepaste cellijnen waarin specifieke activeringsenzymen van mensen of knaagdieren tot expressie komen, kunnen de behoefte aan een exogeen metabool activeringssysteem elimineren en mogen als testcellen worden gebruikt. In zulke gevallen moet voor de keuze van de gebruikte cellijnen een wetenschappelijke verantwoording worden gegeven (bv. aan de hand van de relevantie van de oxidasen met gemengde functie voor het metabolisme van de teststof (51), en hun reactievermogen op bekende clastogenen en aneugenen (zie afzonderlijk gedeelte over aanvaardbaarheidscriteria). Er dient te worden erkend dat de geteste stof misschien niet wordt gemetaboliseerd door de tot expressie gekomen oxidase(n) met gemengde functie; in dit geval zouden negatieve resultaten er niet op wijzen dat de teststof geen micronuclei kan induceren. Teststof/Bereiding 18. Vaste stoffen moeten in geschikte oplosmiddelen of media worden opgelost en, eventueel, vóór de behandeling van de cellen worden verdund. Vloeibare stoffen kunnen rechtstreeks aan het testsysteem worden toegediend en/of vóór de behandeling worden verdund. Bij het testen van gassen of vluchtige stoffen moeten geschikte aanpassingen van de standaardprotocollen worden gevolgd, zoals de behandeling in gesloten vaten (52) (53). Tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is, moeten verse bereidingen van de teststof worden gebruikt. Testomstandigheden Oplosmiddelen/media 19. Chemische reacties tussen het oplosmiddel/medium en de teststof moeten uitgesloten zijn of het oplosmiddel/medium moet onverenigbaar zijn met het overleven van de cellen of het behoud van de S9-activiteit bij de gebruikte concentratie. Als er andere dan gangbare oplosmiddelen/media (bv. water, celkweekmedium, dimethylsulfoxide) worden gebruikt, moeten gegevens worden verstrekt waaruit blijkt dat ze verenigbaar zijn met de teststof en dat zij geen genetische toxiciteit vertonen. Aanbevolen wordt waar mogelijk eerst te bezien of een waterig oplosmiddel/medium kan worden gebruikt. Gebruik van cytoB als cytokineseblokker 20. Een van de belangrijkste overwegingen bij de uitvoering van de MNvit-bepaling is ervoor te zorgen dat de cellen die worden gescoord tijdens de behandeling of de incubatieperiode na de behandeling, als deze wordt toegepast, de mitose hebben voltooid. CytoB is de stof die het meest wordt gebruikt om cytokinese te blokkeren, omdat zij de samenstelling van actine afremt en derhalve de scheiding van dochtercellen na mitose voorkomt, wat leidt tot de vorming van binucleaire cellen (5) (54) (55). Micronucleusscoring kan daarom worden beperkt tot cellen die tijdens of na behandeling mitose hebben ondergaan. Tegelijkertijd kan het effect van de teststof op de celproliferatiekinetiek worden gemeten. CytoB dient als cytokineseblokker te worden gebruikt wanneer menselijke lymfocyten worden gebruikt omdat de tijden voor de celcyclus tussen de culturen en tussen de donors variabel zullen zijn en omdat niet alle lymfocyten op PHA zullen reageren. Andere methoden zijn gebruikt tijdens het testen van cellijnen om vast te stellen of de gescoorde cellen zich gedeeld hebben; deze worden hierna besproken (zie punt 26). 21. De geschikte cytoB-concentratie dient door het laboratorium voor elk celtype te worden bepaald om de optimale frequentie van binucleaire cellen te verkrijgen in de controleculturen van de oplosmiddelen/media. De geschikte cytoB-concentratie is doorgaans tussen 3 en 6 μg/ml. Meting van celproliferatie en cytotoxiciteit en keuze van blootstellingsconcentraties 22. Bij de bepaling van de hoogste te testen concentratie van de teststof moeten concentraties worden vermeden die kunnen leiden tot artefactuele positieve reacties, zoals reacties die bovenmatige cytotoxiciteit voortbrengen, neerslag in het cultuurmedium en uitgesproken wijzigingen in pH of osmolaliteit (39) (40) (41). 23. Metingen van celproliferatie worden verricht om er zeker van te zijn dat de behandelde cellen tijdens de bepaling mitose hebben ondergaan en dat de behandelingen worden uitgevoerd met de passende mate van cytotoxiciteit (zie punt 29). Cytotoxiciteit dient te worden bepaald met en zonder metabole activering in cellen die metabole activering nodig hebben met behulp van de relatieve toename van de celpopulatie (RICC) of de relatieve populatieverdubbeling (RPD) (zie aanhangsel 2 voor formules) tenzij cytoB wordt gebruikt. Wanneer cytoB wordt gebruikt, kan de cytotoxiciteit worden bepaald met behulp van de replicatie-index (RI) (zie aanhangsel 2 voor formule). 24. De behandeling van culturen met cytoB en de meting van de relatieve frequenties van mononucleaire, binucleare en multinucleaire cellen in de cultuur verschaft een nauwkeurige methode om het effect van een behandeling op de celproliferatie en de cytotoxische of cytostatische activiteit te kwantificeren (5) en zorgt ervoor dat alleen cellen worden gescoord die zich tijdens of na de behandeling hebben gedeeld. 25. In studies met cytoB kan cytostase/cytotoxiciteit worden gekwantificeerd met behulp van de cytokineseblokproliferatie-index (CBPI) (5) (26) (56) of kan deze worden afgeleid van de RI van minstens 500 cellen per cultuur (zie aanhangsel 2 voor formules). Wanneer cytoB wordt gebruikt om de celproliferatie te beoordelen, moet een CBPI of RI worden bepaald op basis van minstens 500 cellen per cultuur. Deze metingen kunnen onder meer worden gebruikt om de cytotoxiciteit te schatten door de waarden in de behandelde culturen en de controleculturen met elkaar te vergelijken. De beoordeling van andere cytotoxiciteitsmarkers (bv. aaneengroeien, aantal cellen, apoptose, necrose, metafasetelling) kan nuttige informatie opleveren. 26. In studies zonder cytoB moet worden aangetoond dat de in de cultuur gescoorde cellen deling hebben ondergaan tijdens of na de behandeling van de teststof, anders kunnen er valsnegatieve reacties worden gegenereerd. Methoden die gebruikt zijn om ervoor te zorgen dat gedeelde cellen worden gescoord zijn onder meer het inbrengen en vervolgens opsporen van broomdeoxyuridine (BrdU) om cellen met replicaat te identificeren (57), de vorming van klonen wanneer cellen van permanente cellijnen in situ worden behandeld en gescoord op een voorwerpglaasje van een microscoop (proliferatie-index (PI)) (25) (26) (27) (28), of de meting van de relatieve populatieverdubbeling (RPD) of relatieve toename van de celpopulatie (RICC) of andere beproefde methoden (16) (56) (58) (59) (zie aanhangsel 2 voor formules). De beoordeling van andere markers voor cytotoxiciteit of cytostase (bv. aaneengroeien, aantal cellen, apoptose, necrose, metafasetelling) kan nuttige informatie verschaffen. 27. Er moeten ten minste drie analyseerbare testconcentraties worden beoordeeld. Om dit te bereiken, kan het nodig zijn om het experiment uit te voeren met een groter aantal dicht bij elkaar liggende concentraties en de micronucleusvorming te analyseren in die concentraties die het passende bereik van cytotoxiciteiten bieden. Een alternatieve strategie bestaat erin een voorafgaande cytoxiciteitstest uit te voeren om het bereik voor de definitieve test te beperken. 28. Bij de hoogste concentratie moet worden gestreefd naar 55 ± 5 % cytotoxiciteit. Hogere niveaus kunnen leiden tot chromosoombeschadiging als neveneffect van cytotoxiciteit (60). Wanneer er cytotoxiciteit optreedt, moeten de testconcentraties een interval van 55 ± 5 % cytotoxiciteit tot geen of vrijwel geen toxiciteit bestrijken. 29. Als geen cytotoxiciteit of neerslag wordt waargenomen, moet de hoogste testconcentratie overeenstemmen 0,01 M, 5 mg/mL of 5 μl/mL (de laagste van deze drie). De voor analyse geselecteerde concentraties moeten in het algemeen van elkaar gescheiden zijn door een interval van niet meer dan 10. Voor teststoffen die een steile concentratie/responscurve vertonen, zal het wellicht nodig zijn om de intervallen van de teststofconcentraties dichter bij elkaar te leggen zodat ook de culturen in het matige en lage toxiciteitsbereik gescoord zullen worden. 30. Wanneer oplosbaarheid een beperkende factor is, moet de maximale concentratie, indien niet beperkt door de cytotoxiciteit, de laagste concentratie zijn waarbij in de culturen een minimale neerslag zichtbaar is, op voorwaarde dat het scoren niet wordt verstoord. De neerslag moet worden beoordeeld aan de hand van methoden zoals onderzoek met de lichtmicroscoop, waarbij neerslag wordt vastgesteld die aanhoudt of die verschijnt tijdens de cultuur (aan het einde van de behandeling). Controle 31. Bij elk experiment moeten tegelijkertijd positieve en oplosmiddel/medium-controles worden uitgevoerd, zowel met als zonder metabole activering. 32. Positieve controles zijn nodig om aan te tonen dat de gebruikte cellen, en het testprotocol, clastogenen en aneugenen kunnen identificeren en om de metabole capaciteit van het S9-preparaat te bevestigen. Voor de positieve controle dienen bekende induceerders van micronucleusvorming te worden gebruikt in concentraties die naar verwachting kleine, maar reproduceerbare stijgingen ten opzichte van het achtergrondniveau zullen geven en de gevoeligheid van het testsysteem aantonen. De concentraties van de positieve controle moeten zodanig worden gekozen dat de effecten duidelijk zijn maar de gecodeerde objectglaasjes niet onmiddellijk als zodanig herkenbaar zijn. 33. Een clastogeen dat metabole activering nodig heeft (bv. cyclofosfamide; benzo[a]pyreen) dient te worden gebruikt om het metabole vermogen van het testsysteem aan te tonen en om aan te tonen dat het testsysteem in staat is om clastogenen te detecteren. Ook andere positieve controles mogen worden gebruikt, maar moeten worden gerechtvaardigd. Omdat sommige positieve controles waarvoor metabole activering nodig is in bepaalde behandelingsomstandigheden of in bepaalde cellijnen actief kunnen zijn zonder exogene metabole activering, moet in de geselecteerde cellijn en bij de geselecteerde concentraties worden getest of metabole activering noodzakelijk is en of het S9-preparaat actief is. 34. Op dit ogenblik zijn er geen aneugenen bekend die metabole activering nodig hebben voor hun genotoxische activiteit (16). Positieve controles die momenteel worden erkend voor aneugene activiteit zijn bijvoorbeeld colchicine en vinblastine. Andere stoffen mogen worden gebruikt indien zij uitsluitend, of voornamelijk, door aneugene activiteit micronuclei induceren. Om te voorkomen dat er twee positieve controles (voor clastogeniciteit en aneugeniciteit) zonder metabole activering nodig zijn, kan de aneugeniciteitscontrole dienen als positieve controle zonder S9, en kan de clastogeniciteitscontrole worden gebruikt om te testen of het gebruikte metabole activeringssysteem adequaat is. Positieve controles voor zowel clastogeniciteit als aneugeniciteit moeten worden gebruikt in cellen waarvoor geen S9 nodig is. De voorgestelde positieve controles zijn opgenomen in aanhangsel 3. 35. Wanneer geschikte stoffen beschikbaar zijn, kan het gebruik van stoffen uit een verwante chemische klasse als positieve controle worden overwogen. Alle aangewende positieve controles dienen geschikt te zijn voor het celtype en de activeringsomstandigheden. 36. Voor elk oogsttijdstip dienen oplosmiddel/medium-controles in het experiment te worden opgenomen. Daarnaast moeten er ook onbehandelde negatieve controles (zonder oplosmiddel/medium) worden gebruikt, tenzij in het verleden in het laboratorium of in de literatuur reeds is aangetoond dat het gekozen oplosmiddel geen genotoxische of andere schadelijke effecten veroorzaakt. UITVOERING VAN DE PROEF Behandelingsschema 37. Voor een maximale kans op detectie van een aneugeen of clastogeen dat actief is in een specifiek stadium in de celcyclus, is het belangrijk dat voldoende aantallen cellen tijdens alle stadia van hun celcyclus met de teststof worden behandeld. Het behandelingsschema voor cellijnen en primaire celculturen kan daarom enigszins verschillen van dat voor lymfocyten die mitogene stimulering nodig hebben om hun celcyclus aan te vatten - deze worden besproken in punten 41-43 (16). 38. Theoretische overwegingen en gegevens uit de literatuur (18) wijzen erop dat de meeste aneugenen en clastogenen zullen worden gedetecteerd in een korte behandelingsperiode van 3 tot 6 uur in aanwezigheid en afwezigheid van S9, gevolgd door de verwijdering van de teststof en een groeiperiode van 1,5 - 2,0 celcycli (6). Cellen worden bemonsterd op een tijdstip dat overeenkomt met ongeveer 1,5 - 2,0 maal de normale (d.w.z. onbehandelde) lengte van een celcyclus na het begin of aan het einde van de behandeling (zie tabel 1). De bemonsterings- of hersteltijden kunnen worden verlengd als bekend is of vermoed wordt dat de teststof de celcyclusduur beïnvloedt (bv. bij het testen van nucleosideanalogen). 39. Omwille van de mogelijke cytotoxiciteit van S9-preparaten voor gekweekte zoogdiercellen, wordt een verlengde blootstellingsbehandeling van 1,5 - 2,0 normale celcycli alleen gebruikt zonder S9. Bij de verlengde behandeling worden keuzes geboden om de behandeling van de cellen met de teststof toe te staan met of zonder cytoB. Deze keuzes zijn bedoeld voor situaties waarin ongerustheid kan bestaan over mogelijke interacties tussen de teststof en cytoB. 40. De voorgestelde celbehandelingsschema's zijn weergegeven in tabel 1. Deze algemene behandelingsschema's kunnen worden gewijzigd afhankelijk van de stabiliteit of reactiviteit van de teststof of de bijzondere groeikenmerken van de gebruikte cellen. Alle behandelingen dienen te beginnen en te eindigen terwijl de cellen exponentieel groeien. Deze schema's worden uitvoeriger besproken in punten 41-47. Tabel 1 Celbehandeling en oogsttijdstippen voor de MNvit-bepaling Lymfocyten, primaire cellen en cellijnen behandeld met cytoB + S9 3-6 uur behandelen in aanwezigheid van S9; de S9 en het behandelingsmedium verwijderen; vers medium en cytoB toevoegen; 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna oogsten. – S9 Korte blootstelling 3-6 uur behandelen; het behandelingsmedium verwijderen; vers medium en cytoB toevoegen; 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna oogsten. – S9 Verlengde blootstelling Optie A: Gedurende 1,5 - 2 normale celcycli behandelen in aanwezigheid van cytoB; oogsten aan het einde van de blootstellingsperiode. Optie B: Gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli behandelen; de teststof verwijderen; vers medium en cytoB toevoegen; 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna oogsten. Cellijnen behandeld zonder cytoB (Identiek aan de hierboven geschetste behandelingsschema's met de uitzondering dat geen cytoB wordt toegevoegd) Lymfocyten, primaire cellen en cellijnen met cytoB 41. Wat lymfocyten betreft is de doeltreffendste aanpak de blootstelling aan de teststof 44-48 uur na de PHA-stimulering te starten, wanneer de cyclussynchronisatie verdwenen is (5). In de voorlopige bepaling worden cellen gedurende 3 tot 6 uur zowel met als zonder S9 met de teststof behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en vervangen door vers medium met cytoB, en de cellen worden 1,5 - 2,0 normale celcycli later geoogst. 42. Als beide voorlopige tests met de korte (3-6 uur) behandeling negatief of onduidelijk zijn, wordt een volgende behandeling met langere blootstelling, zonder S9 gebruikt. Er zijn twee behandelingskeuzes mogelijk die allebei aanvaardbaar zijn. Het kan echter passender zijn om voor optie A te kiezen voor gestimuleerde lymfocyten wanneer de exponentiële groei 96 uur na de stimulering mogelijk afneemt. De celculturen mogen ook niet samengevloeid zijn op het ogenblik dat in optie B het laatste monster wordt genomen. — Optie A: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de teststof behandeld en aan het einde van de behandelingstijd geoogst. — Optie B: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de teststof behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en vervangen door vers medium, en de cellen worden na bijkomende 1,5 - 2,0 normale celcycli geoogst. 43. Primaire cellen en cellijnen dienen op een gelijkaardige wijze te worden behandeld als lymfocyten behalve dat het niet nodig is ze gedurende 44-48 uur met PHA te stimuleren. Andere cellen dan lymfocyten dienen zo te worden blootgesteld dat de cellen zich op het ogenblik waarop de studie eindigt nog in log-fasegroei bevinden. Cellijnen zonder cytoB 44. Cellen dienen 3-6 uur zowel met als zonder S9 te worden behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en vervangen door vers medium, en de cellen worden 1,5 - 2,0 normale celcycli daarna geoogst. 45. Als beide voorlopige tests met de korte (3-6 uur) behandeling negatief of onduidelijk zijn, wordt een volgende behandeling met langere blootstelling (zonder S9) gebruikt. Er zijn twee behandelingskeuzes mogelijk die allebei even aanvaardbaar zijn: — Optie A: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de teststof behandeld en aan het einde van de behandelingstijd geoogst. — Optie B: de cellen worden gedurende 1,5 - 2,0 normale celcycli met de teststof behandeld. Het behandelingsmedium wordt verwijderd en vervangen door vers medium, en de cellen worden na bijkomende 1,5 - 2,0 normale celcycli geoogst. 46. In monolagen kunnen aan het einde van de 3-6 uur durende behandeling mitotische cellen (herkenbaar aan hun ronde vorm en het feit dat ze loslaten van het oppervlak) aanwezig zijn. Omdat deze mitotische cellen gemakkelijk loskomen, kunnen ze verloren gaan wanneer het medium met de teststof wordt verwijderd. Daarom moeten deze cellen zorgvuldig worden verzameld wanneer de culturen worden gewassen, en vervolgens terug in de culturen gebracht, opdat er geen cellen in mitose, en die gevaar voor micronuclei lopen, op het oogsttijdstip verloren gaan. Aantal culturen 47. Voor elke concentratie van de teststof en voor culturen met het medium/de oplossing en culturen met negatieve controle moeten twee culturen worden gebruikt. Wanneer aan de hand van laboratoriumgegevens uit het verleden kan worden aangetoond dat de verschillen tussen duploculturen minimaal zijn, kan het gebruik van één cultuur voor elke concentratie aanvaardbaar zijn. Wanneer één cultuur wordt gebruikt, wordt aanbevolen om een hoger aantal concentraties te analyseren. Oogsten van de cellen en bereiding van de objectglaasjes 48. Elke cultuur wordt afzonderlijk geoogst en verwerkt. Het prepareren van de cellen kan een hypotone behandeling inhouden, maar deze stap is niet nodig als op een andere manier toereikende cellenspreiding wordt gerealiseerd. Verschillende technieken kunnen worden gebruikt bij de bereiding van de objectglaasjes op voorwaarde dat er voor het scoren hoogwaardige celpreparaten worden verkregen. Het celcytoplasma moet behouden blijven om de detectie van micronuclei en (in de methode met cytokineseblokker) betrouwbare identificatie van binucleaire cellen mogelijk te maken. 49. De objectglaasjes kunnen worden gekleurd met behulp van diverse methoden, zoals Giemsa of fluorescerende DNA-specifieke kleurstoffen (59). Door het gebruik van een DNA-specifieke kleurstof (bv. acridine oranje (61) of Hoechst 33258 plus pyronine-Y (62)) kunnen sommige artefacten die zich bij het gebruik van niet voor DNA specifieke kleurstoffen kunnen voordoen, worden voorkomen. Antikinetochore antilichamen, FISH met pancentromere DNA-proben of geprepareerde in situ labeling met pancentromeer-specifieke primers, samen met de passende DNA-tegenkleuring, kunnen worden gebruikt om de inhoud (chromosoom/chromosoomfragment) van micronuclei te identificeren indien de mechanistische informatie over hun vorming van belang is (15) (16). Andere methoden voor differentiatie tussen clastogenen en aneugenen kunnen worden gebruikt indien is aangetoond dat zij doeltreffend zijn. Analyse 50. Alle objectglaasjes, ook die van het oplosmiddel/medium en de controles, worden vóór de microscopische analyse onafhankelijk gecodeerd. Volgens een alternatieve methode kunnen gecodeerde monsters worden geanalyseerd met behulp van een gevalideerde automatische stromingscytometer of een beeldanalysesysteem. 51. In met cytoB behandelde culturen moeten de micronucleusfrequenties worden geanalyseerd in ten minste 2 000 binucleaire cellen per concentratie (ten minste 1 000 binucleaire cellen per cultuur; twee culturen per concentratie). Indien één cultuur wordt gebruikt, moeten ten minste 2 000 binucleaire cellen per concentratie van die cultuur worden gescoord. Als er in elke concentratie aanzienlijk minder dan 1 000 binucleaire cellen per cultuur, of 2 000 bij gebruik van één cultuur, beschikbaar zijn voor scoring, en als er geen aanzienlijke toename van micronuclei wordt gedetecteerd, moet de test worden herhaald met behulp van meer cellen, of met minder toxische concentraties, naargelang het geval. Er moet gezorgd worden dat er geen binucleaire cellen met onregelmatige vorm worden gescoord of cellen waarvan de twee nuclei sterk in grootte verschillen; ook mogen binucleaire cellen niet worden verward met slecht verspreide multinucleaire cellen. Cellen die meer dan twee hoofdnuclei bevatten, mogen niet op micronuclei worden geanalyseerd, aangezien de basismicronucleusfrequentie in deze cellen hoger kan zijn (63) (64). Het scoren van mononucleaire cellen is aanvaardbaar indien is aangetoond dat de teststof de cytoB-activiteit stoort. 52. In cellijnen die zonder behandeling met cytoB worden bepaald, moeten micronuclei worden gescoord in ten minste 2 000 cellen per concentratie (ten minste 1 000 cellen per cultuur; twee culturen per concentratie). Wanneer slechts één cultuur per concentratie wordt gebruikt, moeten ten minste 2 000 cellen van die cultuur worden gescoord. 53. Wanneer cytoB wordt gebruikt, moet een CBPI of een RI worden vastgesteld om de celproliferatie te beoordelen (zie aanhangsel 2) met behulp van ten minste 500 cellen per cultuur. Wanneer de behandelingen worden uitgevoerd zonder cytoB, is het essentieel dat er bewijs wordt geleverd dat de cellen die gescoord worden zich hebben voortgeplant, zoals besproken in punten 24-27. Aanvaardbaarheidscriteria 54. Een laboratorium dat voorstelt om de in deze testmethode beschreven MNvit-bepaling te gebruiken, dient aan te tonen dat het in staat is om op betrouwbare en nauwkeurige wijze stoffen met bekende aneugene en clastogene activiteit te detecteren, met en zonder metabole activering, evenals bekende negatieve stoffen, met behulp van de referentiestoffen in aanhangsel 3. Als bewijs van zijn vermogen om deze testmethode correct uit te voeren, dient het laboratorium bewijs te leveren dat de cellen die voor micronucleusvorming worden gescoord één kerndeling hebben voltooid indien de test wordt uitgevoerd zonder gebruik van cytoB. 55. De chemische stoffen in aanhangsel 3 worden aanbevolen voor gebruik als referentiestoffen. Vervangende of aanvullende stoffen kunnen worden opgenomen als hun activiteit bekend is en als ze micronuclei induceren met behulp van dezelfde actiemechanismen, en als wordt aangetoond dat zij relevant zijn voor de stoffen die met behulp van de MNvit-procedure zullen worden getest. De rechtvaardiging kan bestaan in een valideringsonderzoek dat gebruikmaakt van een brede keuze aan stoffen of dat gericht is op een smaller spectrum op basis van de chemische klasse van de teststof of het beschadigingsmechanisme dat wordt onderzocht. 56. Oplosmiddel/mediumcontrole en onbehandelde culturen dienen reproduceerbaar lage en consistente micronuclei frequenties op te leveren (doorgaans 5-25 micronuclei/1 000 cellen voor de celtypen die zijn geïdentificeerd in punt 11). Andere celtypen kunnen verschillende responsbereiken vertonen die moeten worden bepaald tijdens hun validering voor gebruik in de MNvit-bepaling. Gegevens van negatieve controle, oplosmiddelcontrole en positieve controle moeten worden aangewend om historische controlebereiken vast te stellen. Deze gegevens moeten worden gebruikt om te beslissen over de geschiktheid van de gelijktijdig uitgevoerde negatieve/positieve controles voor een experiment. 57. Indien voor de bepaling kleine wijzigingen aan het protocol (bv. gebruik van automatische in plaats van handmatige scoringstechnieken; gebruik van een nieuw celtype) worden voorgesteld, moet de doeltreffendheid van de wijziging worden aangetoond voordat het gewijzigde protocol aanvaardbaar voor gebruik kan worden geacht. Aantonen dat het gewijzigde protocol doeltreffend is, omvat aantonen dat de belangrijkste mechanismen van chromosoombreuken en chromosoomwinst of -verlies kunnen worden gedetecteerd en dat passende positieve en negatieve resultaten kunnen worden bereikt voor de klasse van de individuele stof, of het brede bereik van de stoffen die getest moet(en) worden. GEGEVENS EN RAPPORTAGE Verwerking van de resultaten 58. Als de techniek met de cytokineseblokker wordt gebruikt, worden alleen de frequenties van binucleaire cellen met micronuclei (onafhankelijk van het aantal micronuclei per cel) gebruikt bij de evaluatie van micronucleusinductie. Het scoren van de aantallen cellen met één, twee of meer micronuclei kan nuttige informatie opleveren, maar is niet verplicht. 59. Gelijktijdige metingen van de cytotoxiciteit en/of cytostase voor alle behandelde en oplosmiddel/medium controleculturen dienen te worden vastgesteld (58). De CBPI of RI moeten worden berekend voor alle behandelde en controleculturen als meting van celcyclusvertraging wanneer de methode met de cytokineseblokker wordt gebruikt. Als er geen cytoB wordt gebruikt, moeten de RPD of de RICC of PI worden gebruikt (zie aanhangsel 2). 60. De gegevens moeten voor elke cultuur apart worden verstrekt. Daarnaast moet een overzicht van alle gegevens in tabelvorm worden gegeven. 61. Stoffen die micronuclei in de MNvit-bepaling induceren, kunnen dit doen omdat ze chromosoombreuken, chromosoomverlies of een combinatie van beide induceren. Verdere analyse aan de hand van antikinetochore antilichamen, centromeerspecifieke in situ proben of andere methoden mogen worden gebruikt om vast te stellen of het mechanisme van micronucleusinductie te wijten is aan clastogene en/of aneugene activiteit. Evaluatie en interpretatie van de resultaten 62. Een duidelijk positieve of negatieve reactie behoeft niet te worden bevestigd door aanvullende tests. Onduidelijke resultaten kunnen worden opgehelderd door de analyse van nogmaals 1 000 cellen uit alle culturen om verlies van blindering te voorkomen. indien deze aanpak geen oplossing biedt voor het resultaat, moeten verdere testen worden verricht. Bij vervolgexperimenten dient wijziging van parameters te worden overwogen om, indien nodig, de bepaling uit te breiden tot een breder scala van omstandigheden. Parameters die voor wijziging in aanmerking komen zijn bijvoorbeeld de testconcentratie-intervallen, de tijdstippen van behandeling en oogst van de cellen en de omstandigheden bij metabole activering. 63. Er zijn verschillende criteria om tot een positief resultaat te besluiten, zoals een concentratieafhankelijke of een statistisch significante stijging van het aantal cellen met micronuclei. In eerste instantie moet naar de biologische relevantie van de resultaten worden gekeken. De overweging of de waargenomen waarden binnen of buiten het historische controlebereik vallen, kan als leidraad dienen tijdens de beoordeling van de biologische relevantie van de respons. Als hulpmiddel bij de evaluatie van de testresultaten kunnen passende statistische methoden worden gebruikt (65). De resultaten van statistische tests moeten echter worden beoordeeld met betrekking tot de dosis-effectrelatie. Reproduceerbaarheid en gegevens uit het verleden moeten ook in aanmerking worden genomen. 64. Hoewel de meeste experimenten duidelijk positieve of negatieve resultaten zullen opleveren, zal een definitieve uitspraak over de effecten van de teststof in sommige gevallen onmogelijk zijn. Deze onduidelijke of twijfelachtige responsen kunnen zich blijven voordoen, hoe vaak het experiment ook wordt herhaald. 65. Positieve resultaten bij de MNvit-bepaling wijzen erop dat de teststof in gekweekte zoogdiercellen chromosoombreuk of chromosoomverlies induceert. Negatieve resultaten wijzen erop dat de stof onder de testomstandigheden in gekweekte zoogdiercellen geen chromosoombreuken en/of chromosoomwinst of -verlies induceert. Testverslag 66. Het testverslag dient ten minste de volgende informatie te bevatten, indien relevant voor het voeren van het onderzoek: Onderzochte stof: — identificatiegegevens, nummer bij de Chemical Abstracts Service (CAS) en EG-nummer; — fysische toestand en zuiverheid; — fysisch-chemische eigenschappen die voor de uitvoering van het onderzoek relevant zijn; — reactiviteit van de teststof met het oplosmiddel/medium of de celcultuurmedia; Oplosmiddel/Medium: — motivering voor de keuze van het oplosmiddel/medium; — oplosbaarheid en stabiliteit van de teststof in het oplosmiddel/medium; Cellen: — type en bron van de gebruikte cellen; — bruikbaarheid van het gebruikte celtype; — afwezigheid van mycoplasma, indien van toepassing; — informatie over de lengte van de celcyclus, verdubbelingstijd of proliferatie-index; — wanneer er lymfocyten worden gebruikt, het geslacht, de leeftijd en het aantal bloeddonors, indien van toepassing; — indien lymfocyten worden gebruikt, of volledig bloed dan wel geïsoleerde lymfocyten zijn blootgesteld; — aantal overentingen, indien van toepassing; — methoden om de celculturen in leven te houden, indien van toepassing; — modaal aantal chromosomen; — normale tijd voor de celcyclus (negatieve controle); Testomstandigheden: — naam van de cytokineseblokker (bv. cytoB), indien gebruikt, de concentratie ervan en de blootstellingsduur; — achtergrond voor de keuze van de concentraties en het aantal culturen, met inbegrip van gegevens over de cytotoxiciteit en beperkte oplosbaarheid, indien beschikbaar; — samenstelling van het medium en CO2-concentratie, indien van toepassing; — concentraties van de teststof; — toegevoegde concentratie (en/of volume) van het medium en de teststof; — incubatietemperatuur en -tijd; — duur van de behandeling; — oogsttijdstip na behandeling; — celdichtheid bij het enten, indien van toepassing; — aard en samenstelling van het metabool activeringssysteem, met inbegrip van aanvaardbaarheidscriteria; — positieve controlestoffen en negatieve controles; — gebruikte methoden voor de bereiding van de objectglaasjes en kleuringstechniek. — criteria voor micronucleusidentificatie; — aantal geanalyseerde cellen; — methoden voor de meting van de cytotoxiciteit; — eventuele aanvullende gegevens met betrekking tot de cytotoxiciteit: — criteria om te bepalen of het resultaat positief, negatief of onduidelijk is; — toegepaste methode(n) van statistische analyse; — methoden, zoals het gebruik van een kinetochoor-antilichaam, om na te gaan of micronuclei volledige of gedeeltelijke chromosomen bevatten, indien van toepassing; Resultaten: — toegepaste meting van cytotoxiciteit, bv. CBPI of RI in het geval van de methode met cytokineseblokker; RICC, RPD of PI wanneer de methoden met cytokineseblokker niet worden toegepast; andere waarnemingen wanneer van toepassing, bv. aaneengroei van cellen, apoptose, necrose, metafasetelling, frequentie van binucleaire cellen; — neerslagverschijnselen; — gegevens over de pH en de osmolaliteit van het behandelingsmedium, indien bepaald; — definitie van aanvaardbare cellen voor analyse; — distributie van mono-, bi- en multinucleaire cellen indien een methode met cytokineseblokker wordt toegepast; — aantal cellen met micronuclei, afzonderlijk vermeld voor elke behandelde en controlecultuur, en bepaling of deze behoren tot binucleaire of mononucleaire cellen, indien van toepassing; — indien mogelijk het verband tussen concentratie en respons; — scheikundige gegevens (concentraties en oplosmiddelen) over tegelijkertijd uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles; — scheikundige gegevens over in het verleden uitgevoerde negatieve (oplosmiddel/medium) en positieve controles met vermelding van spreiding, gemiddelde, standaardafwijking en betrouwbaarheidsinterval (bv. 95 %); — statistische analyse; eventuele p-waarden; Bespreking van de resultaten Conclusies LITERATUUR (1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4. (2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15. (3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246. (4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172. (5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104. (6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198. (7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43. (8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20. (9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using Crest antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302. (10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334. (11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213. (12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525. (13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20. (14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245. (15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219. (16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163. (17) OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paris. Available at: [www.oecd.org/env/testguidelines] (18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36. (19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60. (20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87. (21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124. (22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152. (23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208. (24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59. (25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81-116. (26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells - comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190. (27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71. (28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163. (29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134. (30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580. (31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152. (32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. ESAC 25th meeting, 16-17 november, 2006, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, Available at: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283. (35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115. (36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260. (37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328. (38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70. (39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205. (40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305. (41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886. (42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36. (43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18. (44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45. (45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215. (46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65. (47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177. (48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88. (49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59. (50) UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Available at: [http://www.pops.int/] (51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274. (52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, pp. 91-103. (53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801. (54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44. (55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112. (56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to „Report from the in vitro micronucleus assay working group”, Mutation Res., 564, 97-100. (57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65. (58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184. (60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247. (64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75. (65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. New York, NY, pp. 463-467. (66) Regulation (EC) No 850/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 april 2004 on persistent organic pollutants and amending Directive 79/117/EEC, OJ L 229, 30.4.2004, p. 5. Aanhangsel 1 Definities Aneugeen: elke stof die of elk proces dat leidt tot aneuploïdie in cellen of organismen door de wisselwerking met componenten van de mitose en meiose in de celdelingscyclus. Aneuploïdie: elke afwijking van het normale diploïde (of haploïde) aantal chromosomen met één chromosoom of meer dan één chromosoom, maar niet met (een) volledige reeks(en) chromosomen (polyploïdie). Apoptose: geprogrammeerde celdood, gekenmerkt door een reeks stappen die leiden tot de afbraak van cellen in door membraan samengehouden deeltjes die vervolgens worden geëlimineerd door fagocytose of door verwijdering. Celproliferatie: toename van het aantal cellen als gevolg van mitose. Centromeer: DNA-plek van een chromosoom waar beide chromatiden worden samengehouden en waar beide kinetochoren zij aan zij zijn aangehecht. Clastogeen: elke stof die of elk proces dat structurele chromosoomafwijkingen veroorzaakt in celpopulaties of organismen. Cytokinese: deling van de cel onmiddellijk na de mitose, waarbij twee dochtercellen worden gevormd die elk één nucleus bevatten. Cytokineseblokproliferatie-index (CBPI): de verhouding cellen na tweede deling in de behandelde populatie ten opzichte van de onbehandelde controlegroep (zie aanhangsel 2 voor formule). Cytostase: afremming van celgroei (zie aanhangsel 2 voor formule). Cytotoxiciteit: schadelijke gevolgen voor de celstructuur of -functie die uiteindelijk celdood veroorzaken. Genotoxisch: een algemene term die alle typen DNA- of chromosoombeschadiging omvat, waaronder breuken, adductherschikkingen, mutaties, chromosoomafwijkingen en aneuploïdie. Niet alle soorten genotoxische effecten leiden tot mutaties of stabiele chromosoombeschadiging. Interfasecellen: cellen die zich niet in het stadium van de mitose bevinden. Kinetochoor: een hoofdzakelijk uit eiwitten bestaande structuur die zich assembleert nabij het centromeer van een chromosoom en waar tijdens de celdeling de spoeldraden aan vastzitten, zodat de verplaatsing van de dochterchromosomen naar de polen van de dochtercellen regelmatig kan verlopen. Micronucleus: kleine kern die buiten en naast de hoofdkern van cellen tijdens de telofase van de mitose of meiose ontstaat door achtergebleven chromosoomfragmenten of volledige chromosomen. Mitose: deling van de celkern die doorgaans wordt ingedeeld in profase, prometafase, metafase, anafase en telofase. Mitotische index: de verhouding tussen het aantal cellen in de metafase en het totale aantal cellen in een populatie; deze index geeft een indicatie van de snelheid waarmee deze populatie groeit. Mutageen: produceert een erfelijke wijziging van DNA-basepaarsequentie(s) in genen of van de structuur van chromosomen (chromosoomafwijkingen). Non-disjunctie: het feit dat de chromatiden niet uit elkaar gaan en niet afzonderlijk overgaan in de dochtercellen in ontwikkeling, wat leidt tot dochtercellen met abnormale chromosoomaantallen. Polyploïdie: afwijkingen in het aantal chromosomen in cellen of organismen waarbij (een) volledige reeks(en) van chromosomen betrokken is/zijn, in tegenstelling tot een afzonderlijk chromosoom of afzonderlijke chromosomen (aneuploïdie). Proliferatie-index (PI): methode voor cytotoxiciteitsmeting wanneer geen cytoB wordt gebruikt (zie aanhangsel 2 voor formule). Relatieve toename van de celpopulatie (RICC): methode voor cytotoxiciteitsmeting wanneer geen cytoB wordt gebruikt (zie aanhangsel 2 voor formule). Relatieve populatieverdubbeling (RPD): methode voor cytotoxiciteitsmeting wanneer geen cytoB wordt gebruikt (zie aanhangsel 2 voor formule). Replicatie-index (RI): de verhouding tussen het aantal voltooide celdelingscycli in een behandelde cultuur en het aantal voltooide celdelingscyli in de onbehandelde controlecultuur, tijdens de blootstellingsperiode en het herstel (zie aanhangsel 2 voor formule). Teststof: iedere stof of ieder mengsel die/dat met deze TM wordt getest. Aanhangsel 2 Formules voor beoordeling van de cytotoxiciteit 1. Wanneer cytoB wordt gebruikt, moet de evaluatie van de cytotoxiciteit uitgaan van de cytokineseblokproliferatie-index (CBPI) of replicatie-index (RI) (16) (58). De CBPI geeft het gemiddelde aantal celcycli per cel aan tijdens de periode van blootstelling aan cytoB en kan worden gebruikt om de celproliferatie te berekenen. De RI geeft het relatieve aantal nuclei in behandelde culturen in vergelijking met de controleculturen aan en kan worden gebruikt om het % cytostase te berekenen: % cytostase = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} en: T = cultuur behandeld met teststof C = controlecultuur behandeld met medium waarbij: Zo is een CBPI van 1 (alle cellen zijn mononucleair) gelijk aan 100 % cytostase. Cytostase = 100 – RI T = behandelde culturen C = controleculturen 2. Zo betekent een RI van 53 % dat, in vergelijking met het aantal cellen van de controlecultuur die zich gedeeld hebben om binucleaire en multinucleaire cellen te vormen, slechts 53 % van dit aantal in de behandelde cultuur zich heeft gedeeld, d.w.z. 47 % cytostase. 3. Wanneer geen cytoB wordt gebruikt, wordt aanbevolen om de cytotoxiciteit te behoordelen op basis van de relatieve toename van de celpopulatie (RICC) of de relatieve populatieverdubbeling (RPD) (58) aangezien beide rekening houden met het percentage van de celpopulatie dat zich gedeeld heeft. waarbij: Populatieverdubbeling = [log (aantal cellen na behandeling ÷ aanvankelijk aantal cellen)] ÷ log 2 4. Zo geeft een RICC of een RPD van 53 % aan dat de cytotoxiciteit/cytostase 47 % bedraagt. 5. Met behulp van een proliferatie-index (PI) kan de cytotoxiciteit worden beoordeeld door het aantal klonen te tellen dat bestaat uit 1 cel (cl1), 2 cellen (cl2), 3 tot 4 cellen (cl4) en 5 tot 8 cellen (cl8) 6. De PI is ook toegepast als waardevolle en betrouwbare cytotoxiciteitsparameter voor in situ gekweekte cellijnen in afwezigheid van cytoB (25) (26) (27) (28). Aanhangsel 3 Aanbevolen referentiestoffen voor het beoordelen van de prestaties (16) Categorie Chemische stof CAS-nr. EG-nr. 1. Clastogenen werkzaam zonder metabolische activering Cytosine arabinoside 147-94-4 205-705-9 Mitomycine C 50-07-7 200-008-6 2. Clastogenen waarvoor metabolische activering vereist is Benzo(a)pyreen 50-32-8 200-028-5 Cyclofosfamide 50-18-0 200-015-4 3. Aneugenen Colchicine 64-86-8 200-598-5 Vinblastine 143-67-9 205-606-0 4. Negatieve stoffen Di(2-ethylhexyl)ftalaat 117-81-7 204-211-0 Nalidixinezuur 389-08-2 206-864-7 Pyreen 129-00-0 204-927-3 Natriumchloride 7647-14-5 231-598-3 B.50. HUIDSENSIBILISATIE: LOKALE LYMFKLIERTEST: AA INLEIDING 1. De OESO-richtlijnen inzake het testen van chemische stoffen (Guidelines for the Testing of Chemicals) en de daarop gebaseerde EU-testmethoden worden regelmatig herzien in het licht van de wetenschappelijke vooruitgang, zich wijzigende behoeften aan regelgeving en overwegingen met het oog op dierenwelzijn. De eerste testmethode (TM) (B.42) voor het bepalen van de huidsensibilisatie bij muizen, de lokale lymfkliertest (LLKT; OESO-testrichtlijn 429) is herzien (1). Er zijn publicaties verschenen met de gegevens over de validering van de LLKT en een overzicht van gerelateerd onderzoek (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). In de LLKT wordt radio-isotoop thymidine of jodium gebruikt om de proliferatie van de lymfocyten te meten en de test is daarom slechts beperkt bruikbaar indien de aankoop, het gebruik en de verwijdering van radioactief materiaal problematisch zijn. De LLKT: AA (afvoerend auriculair) (ontwikkeld door Daicel Chemical Industries, Ltd) is een niet-radioactieve aanpassing van de LLKT, waarin het adenosinetrifosfaat (ATP)-gehalte gemeten wordt via bioluminescentie, als indicator voor de proliferatie van lymfocyten. De LLKT: AA-testmethode werd door een internationaal panel voor collegiale toetsing gevalideerd, beoordeeld en aanbevolen als nuttig instrument om huidsensibiliserende en niet-huidsensibiliserende chemische stoffen op te sporen, binnen bepaalde beperkingen (10) (11) (12) (13). Deze TM werd ontworpen om de potentiële huidsensibilisatie door chemische stoffen (stoffen en mengsels) bij dieren te bepalen. In hoofdstuk B.6 van de bijlage en in OESO-testrichtlijn 406 worden proeven met cavia's gebruikt: de maximalisatietest en de Buehlertest (14). De LLKT (hoofdstuk B.42 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 429) en de twee niet-radioactieve aanpassingen, LLKT: AA (hoofdstuk B.50 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 442 A) en LLKT: BrdU-ELISA (hoofdstuk B.51 van deze bijlage; OESO-testrichtlijn 442 B), bieden allemaal een voordeel ten opzichte van de proeven met cavia's in B.6 en OESO-testrichtlijn 406 (14) ten aanzien van een beperking en verfijning van het gebruik van dieren. 2. NET zoals de LLKT, bestudeert het LLKT: AA-onderzoek de inductiefase van huidsensibilisatie en levert kwantitatieve gegevens die voor een dosis/responsbepaling kunnen worden gebruikt. Bovendien neemt de mogelijkheid om huidsensibiliserende stoffen op te sporen zonder gebruik te maken van isotopenmerking voor DNA het risico op beroepsmatige blootstelling aan radioactiviteit en de problemen met afvalverwijdering weg. Dat maakt het dan weer mogelijk om vaker muizen te gebruiken om huidsensibiliserende stoffen op te sporen, waardoor het gebruik van cavia's in onderzoek naar huidsensibilisatie mogelijk beperkt kan worden (i.e. B.6; OESO-testrichtlijn 406) (14). DEFINITIES 3. Gebruikte definities worden gegeven in aanhangsel 1. TOELICHTING EN BEPERKINGEN 4. De LLKT: AA is een aangepaste LLKT-methode om potentiële huidsensibiliserende chemische stoffen op te sporen, binnen specifieke beperkingen. Dit houdt niet noodzakelijkerwijs in dat de LLKT: AA in alle gevallen in plaats van de LLKT of de proef met cavia's moet worden gebruikt, (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406) (14), maar veeleer dat de test gelijkwaardig is en als alternatief kan worden gebruikt, waarbij positieve en negatieve resultaten niet langer behoeven te worden bevestigd (10) (11). Het testlaboratorium moet vóór de uitvoering van het onderzoek alle beschikbare informatie over de teststof in overweging nemen. Die informatie zal de identiteit en de chemische structuur van de teststof bevatten; de fysisch-chemische eigenschappen ervan; de resultaten van andere in vitro of in vivo toxiciteitsproeven op de teststof; en toxicologische gegevens van chemische stoffen met een verwante structuur. Deze informatie moet in aanmerking genomen worden om te bepalen of de LLKT: AA geschikt is voor de teststof (gezien de incompatibiliteit van beperkte soorten chemische stoffen met de LLKT: AA [zie punt 5]) en om te helpen bij het bepalen van de dosis. 5. De LLKT: AA is een in-vivomethode en leidt er derhalve niet toe dat er bij de bepaling van allergische contactsensibilisatie geen dieren meer worden gebruikt. Deze methode kan het gebruik van dieren voor dit doel verminderen in vergelijking met de proeven met cavia's (B.6; OESO-testrichtlijn 406) (14). Bovendien wordt de manier waarop de dieren gebruikt worden voor het testen van allergische contactsensibilisatie aanzienlijk verfijnd (minder pijn en leed), aangezien er bij de LLKT: AA, in tegenstelling tot de B.6 en OESO-testrichtlijn 406, geen door provocatie geïnduceerde overgevoeligheidsreacties van de huid hoeven te worden opgewekt. Ondanks de voordelen van de LLKT: AA ten opzichte van B.6 en OESO-testrichtlijn 406 (14), zijn er bepaalde beperkingen waardoor het gebruik van B.6 of OESO-testrichtlijn 406 (bv. het testen van bepaalde metalen, valspositieve resultaten met bepaalde stoffen die de huid irriteren (zoals bepaalde oppervlakteactieve stoffen) (6) (1 en hoofdstuk B.42 van deze bijlage), oplosbaarheid van de teststof) nodig kan zijn. Daarnaast kan in het geval van chemische klassen of stoffen die functionele groepen bevatten waarvan is aangetoond dat ze als potentiële stoorfactoren (16) werken, het gebruik van proeven met cavia's nodig zijn (d.w.z. B.6; OESO-testrichtlijn 406 (14). Het is aanbevolen om de beperkingen die voor de LLKT (1, en hoofdstuk B.42 van deze bijlage) werden vastgesteld, ook toe te passen op de LLKT: AA (10). Daarnaast is het gebruik van de LLKT: AA mogelijk niet geschikt om stoffen te testen die de ATP-waarden beïnvloeden (bv. stoffen met een ATP-remmende werking) of die de correcte meting van intracellulair ATP kunnen verstoren (bv. aanwezigheid van enzymen die ATP afbreken, aanwezigheid van extracellulair ATP in de lymfklier). Buiten die vastgestelde beperkingen dient de LLKT: AA toegepast te worden voor het testen van alle stoffen, tenzij die stoffen eigenschappen hebben die de nauwkeurigheid van de LLKT: AA kunnen beïnvloeden. Bovendien moet er rekening gehouden worden met mogelijke positieve grensgevallen bij de resultaten wanneer er stimuleringsindex (SI)-waarden tussen 1,8 en 2,5 verkregen worden (zie punten 31-32). Dit is gebaseerd op de valideringsdatabank van 44 stoffen, waarbij een SI ≥ 1,8 gehanteerd werd (zie punt 6) waarvoor de LLKT: AA alle 32 LLKT-sensibiliserende stoffen correct geïdentificeerd heeft, maar drie van de 12 niet-sensibiliserende stoffen uit de LLKT met SI-waarden tussen 1,8 en 2,5 onjuist geïdentificeerd heeft (d.w.z. positief grensgeval) (10). Aangezien dezelfde gegevensreeks gebruikt werd om de SI-waarden te bepalen en de voorspellende eigenschappen van de test te berekenen, kunnen de vermelde resultaten de werkelijke voorspellende eigenschappen echter overschatten. PRINCIPE VAN DE TESTMETHODE 6. Het beginsel dat aan de LLKT: AA ten grondslag ligt, is dat sensibilisatoren induceren tot een proliferatie van lymfocyten in de lymfklieren die de afvoer verzorgen van de plaats waar de teststof wordt aangebracht. Deze proliferatie is evenredig met de dosis en de potentie van het aangebrachte allergeen en biedt een eenvoudige mogelijkheid om een kwantitatieve meting van de sensibilisering uit te voeren. De proliferatie wordt gemeten door de gemiddelde proliferatie in elke testgroep te vergelijken met de proliferatie in de met medium behandelde controlegroep (VC). De verhouding tussen de gemiddelde proliferatie in elke behandelde groep en in de overeenkomstige medium-controlegroep wordt bepaald en deze z.g. SI moet ≥ 1,8 zijn voordat een teststof nader kan worden beoordeeld als potentiële huidsensibilisator. De hierin beschreven procedures zijn gebaseerd op een methode waarbij het ATP-gehalte gemeten wordt via bioluminescentie (waarvan geweten is dat het verband houdt met het aantal levende cellen) (17) om een verhoogd aantal prolifererende cellen in de afvoerende auriculaire lymfklieren op te sporen (18) (19). De bioluminescentiemethode maakt gebruik van het luciferase-enzym als katalysator voor het opwekken van licht uit ATP en luciferine volgens de volgende reactie: ATP + Luciferin + O 2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + Light De intensiteit van het uitgezonden licht is lineair evenredig met het ATP-gehalte en wordt gemeten met een luminometer. De luciferine-luciferasetest is een gevoelige methode om ATP te meten die gebruikt wordt voor uiteenlopende toepassingen (20). BESCHRIJVING VAN DE TEST Keuze van de diersoort 7. Voor deze test worden bij voorkeur muizen gebruikt. Het valideringsonderzoek voor de LLKT: AA werd uitsluitend uitgevoerd met de CBA/J-stam, die daarom beschouwd wordt als de geprefereerde stam (12) (13). Er worden jonge volwassen vrouwtjesmuizen gebruikt, die nog geen jongen hebben gehad en niet drachtig zijn. Bij het begin van het onderzoek moeten de dieren 8-twaalf weken oud zijn, het gewichtsverschil tussen de dieren moet minimaal zijn en de afwijking mag niet groter zijn dan 20 % van het gemiddelde gewicht. Er mogen ook andere stammen of mannetjes worden gebruikt, wanneer er voldoende gegevens beschikbaar zijn om aan te tonen dat er geen significante stam- en/of geslachtsspecifieke verschillen in de LLKT: AA-respons zijn. Huisvesting en voeding 8. De muizen moeten in groepjes worden ondergebracht (21), tenzij een individuele behuizing van de muizen naar behoren wetenschappelijk wordt gemotiveerd. De temperatuur van de proefdierruimte dient 22 ± 3 °C te zijn. De relatieve luchtvochtigheid moet ten minste 30 % zijn en (behalve tijdens het schoonmaken van de ruimte) bij voorkeur niet hoger dan 70 % zijn, maar er moet worden gestreefd naar 50-60 %. Er moet gebruik worden gemaakt van kunstlicht met een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. Als voeding mag het gewone laboratoriumvoer worden gebruikt met een onbeperkte hoeveelheid drinkwater. Voorbereiding van de dieren 9. De dieren worden aselect ingedeeld, gemerkt om elk dier afzonderlijk te kunnen identificeren (maar niet door enigerlei vorm van oormerking) en vóór het begin van de toediening gedurende minimaal vijf dagen in hun kooi gehouden om ze aan de omstandigheden in het laboratorium te laten wennen. Vóór het begin van de behandeling worden alle dieren onderzocht om vast te stellen dat ze geen waarneembaar huidletsel hebben. Bereiding van doseringsoplossingen 10. Vaste chemische stoffen moeten in oplosmiddelen/media worden opgelost of gesuspendeerd en, indien nodig, verdund vóór aanbrenging op een oor van de muis. Vloeibare chemische stoffen kunnen onverdund worden toegediend of vóór de toediening worden verdund. Onoplosbare chemische stoffen, zoals die gewoonlijk voorkomen in medische apparaten, moeten worden onderworpen aan een maximale extractie in een geschikt oplosmiddel om alle extraheerbare bestanddelen voor het testen vrij te maken vóór aanbrenging op een oor van de muis. Teststoffen moeten dagelijks worden geprepareerd, tenzij uit stabiliteitsgegevens blijkt dat opslag aanvaardbaar is. Betrouwbaarheidscontrole 11. Voor positieve controle gebruikte stoffen (PC's) worden gebruikt om aan te tonen dat de test correct werkt in de zin dat de test leidt tot een respons met voldoende en reproduceerbare gevoeligheid, waarbij de omvang van de respons goed gedocumenteerd is. Gelijktijdig gebruik van een PC wordt aanbevolen, omdat hiermee wordt aangetoond dat het laboratorium de competentie bezit om iedere test succesvol uit te voeren en omdat de intra- en interlaboratoriumreproduceerbaarheid en -overdraagbaarheid hiermee kan worden beoordeeld. Sommige regelgevende autoriteiten vereisen ook een PC voor elk onderzoek en gebruikers worden daarom aangespoord om de relevante autoriteiten te raadplegen alvorens zij de LLKT: AA uitvoeren. Derhalve wordt het routinematige gelijktijdige gebruik van een PC aangemoedigd, zodat geen noodzaak bestaat om aanvullende dierproeven uit te voeren om te voldoen aan dergelijke vereisten die kunnen voortkomen uit het gebruik van een periodieke PC (zie punt 12). De PC moet een positieve LLKT: AA-respons opleveren bij een blootstellingsniveau waarbij in vergelijking met de negatieve controlegroep een stijging van de SI met ≥ 1,8 wordt verwacht. De dosis van de PC moet zo worden gekozen dat de stof geen overmatige huidirritatie of systemische toxiciteit veroorzaakt en de inductie reproduceerbaar is, maar niet buitensporig (d.w.z. een SI > 10 zou buitensporig zijn). De PC die de voorkeur genieten zijn 25 % hexylcinnamaldehyde (Chemical Abstracts Service [CAS]-nummer 101-86-0) en 25 % eugenol (CAS-nummer 97-53-0,) in aceton: olijfolie (4:1, v/v). Onder bepaalde omstandigheden kunnen andere PC's worden gebruikt die aan bovengenoemde criteria voldoen, mits een afdoende motivering wordt gegeven. 12. Hoewel het gelijktijdige gebruik van een PC-groep aanbevolen wordt, kunnen er situaties zijn waarin periodiek testen (d.w.z. met intervallen ≤ zes maanden) van de PC toereikend kan zijn voor laboratoria die de LLKT: AA regelmatig uitvoeren (d.w.z. de LLKT-AA uitvoeren met een frequentie van niet minder dan eenmaal per maand) en die een historische PC-databank hebben die aantoont dat het laboratorium in staat is om reproduceerbare en nauwkeurige uitkomsten met PC's te verkrijgen. Toereikende ervaring met de LLKT: AA kan worden aangetoond door consequent positieve uitkomsten te genereren in ten minste tien onafhankelijke tests die binnen een redelijke tijdspanne (d.w.z. binnen één jaar) worden uitgevoerd. 13. Gelijktijdig gebruik van een PC-groep is verplicht in geval van een procedurewijziging in de LLKT: AA (bv. wijziging van gekwalificeerd personeel, wijziging in de materialen en/of reagentia van de testmethode, wijziging van de testapparatuur, wijziging van de bron van proefdieren), en dergelijke wijzigingen moeten in laboratoriumverslagen worden gedocumenteerd. Het effect van dergelijke wijzigingen op de nauwkeurigheid van de eerder opgerichte historische databank moet in overweging worden genomen om te bepalen of het nodig is een nieuwe historische databank op te richten, teneinde consistentie in de documentatie van de PC-uitkomsten te waarborgen. 14. Onderzoekers dienen zich ervan bewust te zijn dat de beslissing om een PC-onderzoek op periodieke basis uit te voeren in plaats van gelijktijdig, consequenties heeft voor de nauwkeurigheid en aanvaardbaarheid van negatieve onderzoeksuitkomsten die zijn gegenereerd zonder gelijktijdig gebruik van een PC tijdens het interval tussen opeenvolgende periodieke PC-onderzoeken. Indien bijvoorbeeld een valsnegatieve uitkomst is verkregen in het periodieke PC-onderzoek, kunnen negatieve resultaten voor teststoffen die zijn verkregen in het interval tussen het laatste aanvaardbare periodieke PC-onderzoek en het onaanvaardbare PC-onderzoek in twijfel worden getrokken. De implicaties van deze uitkomsten moeten zorgvuldig in overweging worden genomen om te bepalen of PC's gelijktijdig moeten worden gebruikt of dat alleen periodieke PC-onderzoeken moeten worden uitgevoerd. Tevens moet overwogen worden om minder dieren te gebruiken in de gelijktijdige PC-groep, indien dit wetenschappelijk gerechtvaardigd is en indien het laboratorium aantoont, op basis van laboratoriumspecifieke historische gegevens, dat minder muizen gebruikt kunnen worden (22). 15. Hoewel de PC moet worden getest in een medium waarvan bekend is dat het een consequente respons oplevert (bv aceton: olijfolie; 4:1, v/v), kan de regelgeving in bepaalde gevallen vereisen dat de tests ook in een ongebruikelijk medium (een klinisch/chemisch relevante formulering) worden uitgevoerd (23). Indien de gelijktijdig gebruikte PC in een ander medium wordt getest dan de teststof, moet een afzonderlijke met medium behandelde groep voor de gelijktijdig gebruikte PC worden gebruikt. 16. In gevallen waarin teststoffen van een specifieke chemische klasse of bereik van responsen worden geëvalueerd, kunnen referentiestoffen ook nuttig zijn om aan te tonen dat de testmethode correct functioneert voor het signaleren van het huidsensibilisatiepotentieel van deze soorten stoffen. Geschikte referentiestoffen moeten de volgende eigenschappen hebben: — ze moeten structureel en functioneel vergelijkbaar zijn met de klasse van de teststof die wordt getest; — hun fysische/chemische kenmerken moeten bekend zijn; — uit de LLKT afkomstige gegevens ondersteunen; AA; — uit andere diermodellen en/of van mensen afkomstige gegevens ondersteunen. UITVOERING VAN DE PROEF Aantal dieren en hoogte van de doses 17. Er worden minimaal vier dieren per dosisgroep gebruikt en ten minste drie concentraties van de teststof plus een negatieve controlegroep (NC-groep), die alleen met het medium voor de teststof wordt behandeld, en een PC (gelijktijdig of recentelijk uitgevoerd, op basis van het laboratoriumbeleid zoals beschreven in de punten 11-15). Het testen van meerdere doses van de PC moet overwogen worden, in het bijzonder wanneer de PC op periodieke basis wordt getest. Behalve dat de dieren in de controlegroepen niet met de teststof worden behandeld, worden ze verder op identieke wijze behandeld als de dieren in de behandelde groepen. 18. De keuze van de doses en het medium wordt gebaseerd op de aanbevelingen in referenties (2) en (24). Opeenvolgende doses worden doorgaans gekozen uit een geschikte concentratiereeks, zoals 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % enz. Aan de keuze van de gebruikte concentratiereeks moet een toereikende wetenschappelijke motivering ten grondslag liggen. Bij de keuze van de drie opeenvolgende concentraties moet rekening worden gehouden met alle bestaande toxicologische gegevens (bv. met betrekking tot acute toxiciteit en huidirritatie), wanneer die beschikbaar zijn, zodat bij de hoogste concentratie de blootstelling maximaal is zonder dat dit tot systemische toxiciteit en bovenmatige lokale huidirritatie leidt (24) (25). Wanneer dergelijke informatie niet beschikbaar is, kan een initiële voorafgaande screeningtest nodig zijn (zie punten 21-24). 19. Het medium mag het testresultaat niet verstoren of er invloed op uitoefenen en moet worden gekozen met het oog op de hoogste mate van oplosbaarheid, zodat de hoogst mogelijke concentratie wordt verkregen, terwijl de oplossing/suspensie geschikt moet zijn om de teststof mee aan te brengen. Aanbevolen media zijn aceton: olijfolie (4:1 v/v), N,N-dimethylformamide, methylethylketon, propyleenglycol en dimethylsulfoxide (6), maar ook een ander medium mag worden gebruikt als daarvoor een afdoende wetenschappelijke motivering wordt gegeven. In bepaalde gevallen kan het nodig zijn als extra controle een klinisch relevant oplosmiddel te gebruiken of de commerciële formulering waarin de teststof in de handel wordt gebracht. Er moet vooral voor worden gezorgd dat hydrofiele teststoffen worden opgenomen in een medium dat de huid vochtig maakt en niet onmiddellijk wegloopt. Dit kan worden bereikt door geschikte oplosbaar makende stoffen (bv. 1 % Pluronic® L92) toe te voegen. Een volledig waterig medium moet derhalve worden vermeden. 20. Door de verwerking van lymfklieren van individuele muizen kan de spreiding over de dieren worden beoordeeld en kan een statistische vergelijking tussen de teststofmetingen en de metingen voor de met medium behandelde controlegroep worden uitgevoerd (zie punt 33). Daarnaast kan door het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren de mogelijkheid onderzocht worden om het aantal muizen in de PC-groep te verminderen (22). Verder vereisen sommige regelgevende autoriteiten het verzamelen van gegevens met betrekking tot individuele dieren. Het regelmatig vergaren van gegevens over individuele dieren brengt voordelen met zich mee op het vlak van dierenwelzijn, door dubbele tests te vermijden, die nodig zouden zijn wanneer de resultaten voor de teststoffen die aanvankelijk op een bepaalde manier verkregen werden (bv. via gepoolde gegevens over dieren) later door de regelgevende autoriteiten bekeken moeten worden volgens andere eisen (bv. gegevens over individuele dieren). Voorafgaande screeningtest 21. Wanneer er geen gegevens beschikbaar zijn om de hoogste te testen dosis te bepalen (zie punt 18), moet een voorafgaande screeningtest worden uitgevoerd om de juiste dosis te bepalen die getest moet worden in de LLKT: AA. Het doel van de voorafgaande screeningtest is om richtsnoeren te bieden voor het kiezen van de maximale dosis in het hoofdonderzoek van de LLKT: AA, indien informatie over de concentratie die systemische toxiciteit induceert (zie punt 24) en/of bovenmatige huidirritatie (zie punt 23) niet beschikbaar is. De maximale dosis die wordt getest, moet 100 % zijn van de teststof voor vloeibare stoffen of de hoogst mogelijke concentratie voor vaste stoffen of suspensies. 22. De voorafgaande screeningtest wordt uitgevoerd onder omstandigheden die identiek zijn aan die van het hoofdonderzoek van de LLKT: AA, behalve dat er geen beoordeling is van de lymfklierproliferatie en er minder dieren per dosisgroep kunnen worden gebruikt. Aanbevolen wordt per dosisgroep een of twee dieren te gebruiken. Alle muizen worden dagelijks geobserveerd op klinische verschijnselen van systemische toxiciteit of lokale irritatie op de plaats van aanbrengen. Het lichaamsgewicht van de dieren wordt geregistreerd voorafgaand aan de test en vóór de beëindiging van de test (dag 8). Beide oren van iedere muis worden onderzocht op erytheem en de responsen worden ingeschaald met behulp van tabel 1 (25). De dikte van de oren wordt gemeten met behulp van een diktemeter (bv. een digitale micrometer of Peacock Dial-diktemeter) op dag 1 (vóór aanbrenging van de dosis), dag 3 (ongeveer 48 uur na de eerste dosis), dag 7 (24 uur voor het doden) en dag 8. Daarnaast kan op dag 8 de dikte worden bepaald door oorperforatiemetingen, die uitgevoerd moeten worden nadat de dieren op humane wijze zijn gedood. Bovenmatige huidirritatie wordt aangegeven door een erytheemscore ≥ 3 en/of een toename van de oordikte ≥ 25 % op een of meer van de meetdagen (26) (27). De hoogste dosis die voor het hoofdonderzoek van de LLKT: AA wordt gekozen, is de volgende lagere dosis in de concentratiereeks van de voorafgaande screeningtest (zie punt 18) die geen systemische toxiciteit en/of bovenmatige huidirritatie veroorzaakt. Tabel 1 Erytheemscores Waarneming Score Geen erytheem 0 Zeer licht erytheem (nauwelijks waarneembaar) 1 Duidelijk gedefinieerd erytheem 2 Matig tot ernstig erytheem 3 Ernstig erytheem (diep rood) tot korstvorming waardoor de inschaling van erytheem onmogelijk is 4 23. Naast een toename van de oordikte met 25 % (26) (27), is een statistisch significante toename van de oordikte bij de behandelde muizen in vergelijking met de controlemuizen ook gebruikt om irriterende stoffen in de LLKT te signaleren (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Echter, hoewel statistisch significante toenamen kunnen voorkomen bij een toename van de oordikte met minder dan 25 %, worden ze niet specifiek met bovenmatige huidirritatie in verband gebracht (30) (31) (32) (33) (34). 24. De volgende klinische waarnemingen kunnen duiden op systemische toxiciteit (35) wanneer gebruikt als onderdeel van een geïntegreerde beoordeling en kunnen derhalve de maximale dosis aangeven die moet worden gebruikt in het hoofdonderzoek van de LLKT: AA: veranderingen in de werking van het zenuwstelsel (bv. pilo-erectie, ataxie, tremors en convulsies); veranderingen in gedrag (bv. agressiviteit, verandering in lichaamsverzorging, duidelijke verandering in het activiteitsniveau); veranderingen in ademhalingspatronen (d.w.z. veranderingen in de frequentie en intensiteit van het ademhalen, zoals kortademigheid, benauwdheid en gereutel) en veranderingen in de voedsel- en waterconsumptie. Daarnaast moet in de evaluatie rekening worden gehouden met tekenen van lethargie en/of gebrek aan reactiviteit alsmede klinische tekenen van meer dan lichte of voorbijgaande pijn en leed of een vermindering van het lichaamsgewicht van meer dan 5 % tussen dag 1 en dag 8, evenals het sterftecijfer. Stervende dieren of dieren die duidelijk pijn hebben of tekenen van hevig en voortdurend leed vertonen, moeten op humane wijze worden gedood (36). Proefopzet hoofdonderzoek 25. De proefopzet van het onderzoek is als volgt: — Dag 1: Van elk dier apart wordt het gewicht en iedere klinische waarneming bepaald en vastgelegd. Vervolgens wordt een waterige oplossing van 1 % natriumlaurylsulfaat (NLS) op het dorsum van elk oor aangebracht met een borsteltje dat in de NLS ondergedompeld wordt om het volledige dorsum van elk oor met vier tot vijf streken te bedekken. Een uur na de behandeling met NLS, wordt 25 μL van de toepasselijke verdunning van de teststof, het medium zonder teststof of de PC (gelijktijdig of recent, in overeenstemming met het laboratoriumbeleid ten aanzien van punten 11-15) aangebracht op het dorsum van elk oor. — Dagen 2, 3 en 7: Herhaal de voorafgaande behandeling met de waterige oplossing van 1 % NLS en de procedure voor het aanbrengen van de teststof die op dag 1 werden toegepast. — Dagen 4, 5 en 6: Geen behandeling. — Dag 8: Van elk dier worden het gewicht en iedere klinische waarneming vastgelegd. Ongeveer 24 tot 30 uur na het begin van het aanbrengen op dag 7, worden de dieren op humane wijze gedood. De afvoerende auriculaire lymfklieren van elke muis worden uitgeprepareerd en voor elk dier afzonderlijk behandeld in gebufferde fosfaatsaline (PBS). Referentie (22) bevat gedetailleerde informatie en diagrammen voor de identificatie en het uitprepareren van de lymfklieren. Om de lokale huidreacties in het hoofdonderzoek nader te onderzoeken, kunnen aanvullende parameters in het onderzoeksprotocol worden opgenomen, zoals de inschaling van oorerytheem of oordiktemetingen (verkregen door gebruik van een diktemeter of door oorperforatiemetingen bij de necropsie). Bereiding van de celsuspensies 26. Van elke muis wordt er een eencellige suspensie met lymfkliercellen (LKC) gemaakt die aan beide zijden werden uitgeprepareerd door de lymfklieren tussen twee objectglazen te klemmen en een lichte druk uit te oefenen om de lymfklieren te pletten. Nadat bevestigd is dat het weefsel zich in een dunne laag verspreid heeft, worden de twee glaasjes van elkaar gehaald. Het weefsel op beide objectglazen wordt gesuspendeerd in PBS door elk glaasje schuin boven het petrischaaltje te houden en het te spoelen met PBS en tegelijkertijd het weefsel van het glas te schrapen met een celschraper. De lymfklieren van NC-dieren zijn bovendien klein, men moet dus voorzichtig te werk gaan om kunstmatige beïnvloeding van de SI-waarden te voorkomen. Er dient een totaal volume van 1 ml PBS gebruikt te worden voor het spoelen van beide glaasjes. De LKC-suspensie in het petrischaaltje dient enigszins gehomogeniseerd te worden met de celschraper. Vervolgens wordt een aliquot van 20 μL van de LKC-suspensie verzameld met een micropipet, waarbij ervoor gezorgd wordt dat het membraan, dat niet zichtbaar is met het blote oog, niet wordt meegenomen, waarna de suspensie gemengd wordt met 1,98 ml PBS om een monster van 2 ml te verkrijgen. Vervolgens wordt er een tweede monster van 2 ml bereid via dezelfde procedure zodat er twee monsters gemaakt worden voor elk dier. Bepaling van celproliferatie (meten van het ATP-gehalte van de lymfocyten) 27. Toenames van het ATP-gehalte in de lymfklieren worden gemeten met de luciferine/luciferase-methode met behulp van een ATP-meetkit, die de bioluminescentie meet in relatieve lichteenheden (Relative Luminescence Units - RLU). De bepalingstijd vanaf het moment waarop het dier gedood wordt tot de meting van het ATP-gehalte voor elk individueel dier moet gelijkmatig blijven, binnen ongeveer 30 minuten, omdat het ATP-gehalte geleidelijk aan afneemt na de dood van het dier (12). De reeks procedures vanaf het uitprepareren van de auriculaire lymfklieren tot de ATP-meting dient binnen 20 minuten te worden afgerond, volgens het vooraf vastgelegde tijdspad, dat voor elk dier hetzelfde is. De ATP-luminescentie wordt gemeten voor elk monster van 2 ml, zodat in totaal twee ATP-metingen verkregen worden voor elk dier. Vervolgens wordt de gemiddelde ATP-luminescentie bepaald en gebruikt voor verdere berekeningen (zie punt 30). WAARNEMINGEN Klinische waarnemingen 28. Iedere muis wordt ten minste één keer per dag zorgvuldig geobserveerd op klinische verschijnselen van lokale irritatie op de plaats van aanbrengen of systemische toxiciteit. Alle waarnemingen worden systematisch geregistreerd en van elke muis wordt een apart overzicht bijgehouden. Waarnemingsschema's dienen criteria te omvatten om muizen die tekenen vertonen van systemische toxiciteit, overmatige lokale huidirritatie of huidcorrosie onmiddellijk aan te wijzen voor euthanasie (36). Lichaamsgewicht 29. Zoals in punt 25 is vermeld, wordt aan het begin van de test en wanneer de dieren volgens schema op humane wijze worden gedood, van elk dier het lichaamsgewicht bepaald. BEREKENING VAN RESULTATEN 30. De resultaten voor iedere behandelingsgroep worden uitgedrukt als de stimuleringsindex (SI). De SI wordt berekend door de gemiddelde RLU/muis van elke groep behandeld met teststof en de PC-groep, te delen door de gemiddelde RLU/muis voor de oplosmiddel/medium-controlegroep. De gemiddelde SI voor de VC's is dan één. 31. Binnen het beslissingsproces wordt een resultaat als positief beschouwd, indien SI ≥ 1,8 (10). Echter, de sterkte van de dosis/respons, de statistische significantie en de consistentie van de medium-controlegroep- en PC-responsen kunnen ook worden gebruikt om te bepalen of een resultaat dat een grensgeval is (d.w.z. SI-waarde tussen 1,8 en 2,5) positief wordt verklaard (2) (3) (37). 32. Voor een net positieve respons met een SI tussen 1,8 en 2,5 kan het nuttig zijn om naast de SI-waarden ook aanvullende informatie zoals het verband tussen de dosis en de respons, bewijs voor systemische toxiciteit of overmatige irritatie, en waar nodig, statistische significantie in aanmerking te nemen om die resultaten als positief aan te merken (10). Er moet ook gekeken worden naar verschillende eigenschappen van de teststof, bijvoorbeeld of deze qua structuur verwant is met bekende huidsensibilisatoren, of de stof overmatige huidirritatie veroorzaakt bij de muis en wat de aard van het waargenomen verband tussen de dosis en de reactie is. Deze en andere overwegingen worden elders gedetailleerd besproken (4). 33. Door gegevens te verzamelen op het niveau van de individuele muis, kan een statistische analyse worden uitgevoerd voor het bestaan van een dosis/responsverhouding binnen de gegevens en de mate waarin deze verhouding voorkomt. Iedere statistische beoordeling kan een evaluatie omvatten van de dosis/responsverhouding evenals afdoende aangepaste vergelijkingen van testgroepen (bv. paarsgewijs gedoseerde groep tegenover vergelijkingen van een oplossingsmiddel/medium-controlegroep). Statistische analyses kunnen bijvoorbeeld lineaire regressie omvatten of de test van William voor het beoordelen van dosis/responstrends, alsmede de test van Dunnett voor paarsgewijze vergelijkingen. Bij het kiezen van een geschikte statistische analysemethode moet de onderzoeker zich bewust blijven van mogelijke variantie-heterogeniteit en andere soortgelijke problemen, die een gegevenstransformatie of een niet-parametrische statistische analyse noodzakelijk kunnen maken. In ieder geval kan het nodig zijn dat de onderzoeker SI-berekeningen en statistische analyses uitvoert met en zonder bepaalde gegevenspunten (soms „uitbijters” genoemd). GEGEVENS EN RAPPORTAGE Gegevens 34. Gegevens dienen samengevat te worden in de vorm van een tabel waarin de RLU-waarden voor individuele dieren, de gemiddelde RLU/dier per groep, het bijbehorende residu (bv. SD, SEM) en de gemiddelde SI iedere dosisgroep in vergelijking met de gelijktijdig met oplossingsmiddel/medium behandelde controlegroep. Testverslag 35. In het testverslag wordt de volgende informatie opgenomen: Test- en controlestoffen: — identificatiegegevens (bv. CAS-nummer en EG-nummer, indien beschikbaar; bron; zuiverheid; bekende onzuiverheden; partijnummer); — de fysische aard en de fysisch-chemische eigenschappen (bv. de vluchtigheid, de stabiliteit en de oplosbaarheid); — bij een mengsel de samenstelling met voor elk bestanddeel het procentuele gehalte; Oplosmiddel/medium: — identificatiegegevens (zuiverheid; concentratie, indien van toepassing; gebruikt volume); — motivering van de keuze van het medium; Proefdieren: — bron van CBA-muizen; — microbiologische status van de dieren, indien bekend; — aantal en leeftijd van de dieren; — de herkomst van de dieren, de huisvesting, de voeding enz.; Testomstandigheden: — de bron, het partijnummer en de gegevens van de producent over de kwaliteitsgarantie/kwaliteitscontrole voor de ATP-kit; — gedetailleerde gegevens over de formulering en het aanbrengen van de teststof; — motivering voor dosiskeuze (met inbegrip van resultaten van voorafgaande screeningtest, indien uitgevoerd); — gebruikte concentraties van medium en teststof en totale hoeveelheid teststof die is aangebracht; — gedetailleerde gegevens over de kwaliteit van het voer en het water (waaronder de aard en de herkomst van het voer en de herkomst van het water); — gedetailleerde gegevens met betrekking tot het behandelings- en bemonsteringsschema; — methoden voor de meting van de toxiciteit; — criteria om te bepalen of het resultaat positief of negatief is; — gedetailleerde gegevens met betrekking tot protocolafwijkingen en een uitleg van hoe de afwijking van invloed is op de opzet en resultaten van het onderzoek; Betrouwbaarheidscontrole: — overzicht van de resultaten van de meest recente betrouwbaarheidscontrole met informatie over de teststof, de concentratie en het gebruikte medium; — tegelijkertijd en/of in het verleden bepaalde positieve en tegelijkertijd bepaalde negatieve (oplosmiddel/medium) controlegegevens voor het testlaboratorium; — indien geen gelijktijdige PC is uitgevoerd, de datum en het laboratoriumverslag voor de meest recente periodieke PC en een verslag met de historische PC-gegevens voor het laboratorium waarin de beslissing om geen gelijktijdige PC uit te voere