NL Publicatieblad van de Europese Unie L 54/1

VERORDENING (EG) Nr. 152/2009 VAN DE COMMISSIE

van 27 januari 2009

tot vaststelling van de bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders

(Voor de EER relevante tekst)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Verordening (EG) nr. 882/2004 van het Europees Parlement en de Raad van 29 april 2004 inzake officiële controles op de naleving van de wetgeving inzake diervoeders en levensmiddelen en de voorschriften inzake diergezondheid en dierenwelzijn (1), en met name op artikel 11, lid 4, onder a), b) en c),

Overwegende hetgeen volgt:

(1) De volgende besluiten, die zijn vastgesteld ter uitvoering van Richtlijn 70/373/EEG, zijn overeenkomstig artikel 61, lid 2, van Verordening (EG) nr. 882/2004 nog van kracht: — Eerste Richtlijn 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders (2); — Tweede Richtlijn 71/393/EEG van de Commissie van 18 november 1971 betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders (3); — Derde Richtlijn 72/199/EEG van de Commissie van 27 april 1972 betreffende de vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders (4); — Vierde Richtlijn 73/46/EEG van de Commissie van 5 december 1972 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders (5); — Eerste Richtlijn 76/371/EEG van de Commissie van 1 maart 1976 houdende vaststelling van gemeenschappelijke bemonsteringsmethoden voor de officiële controle van diervoeders (6); — Zevende Richtlijn 76/372/EEG van de Commissie van 1 maart 1976 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (7); — Achtste Richtlijn 78/633/EEG van de Commissie van 15 juni 1978 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (8); — Negende Richtlijn 81/715/EEG van de Commissie van 31 juli 1981 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (9); — Tiende Richtlijn 84/425/EEG van de Commissie van 25 juli 1984 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (10); — Richtlijn 86/174/EEG van de Commissie van 9 april 1986 tot vaststelling van de methode voor de berekening van de energiewaarde van mengvoeders voor pluimvee (11); — Elfde Richtlijn 93/70/EEG van de Commissie van 28 juli 1993 tot vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (12); — Twaalfde Richtlijn 93/117/EG van de Commissie van 17 december 1993 tot vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (13); — Richtlijn 98/64/EG van de Commissie van 3 september 1998 tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van aminozuren, ruwvet en olaquindox in diervoeders en houdende wijziging van Richtlijn 71/393/EEG (14); — Richtlijn 1999/27/EG van de Commissie van 20 april 1999 tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van amprolium, diclazuril en carbadox in dierenvoeders, houdende wijziging van de Richtlijnen 71/250/EEG en 73/46/EEG en houdende intrekking van Richtlijn 74/203/EEG (15); — Richtlijn 1999/76/EG van de Commissie van 23 juli 1999 tot vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de bepaling van het gehalte aan lasalocide-natrium van diervoeders (16); — Richtlijn 2000/45/EG van de Commissie van 6 juli 2000 tot vaststelling van communautaire analysemethoden voor de bepaling van vitamine A, vitamine E en tryptofaan in diervoeders (17); — Richtlijn 2002/70/EG van de Commissie van 26 juli 2002 tot vaststelling van voorschriften voor de gehaltebepaling van dioxinen en dioxineachtige pcb’s in diervoeders (18); — Richtlijn 2003/126/EG van de Commissie van 23 december 2003 inzake de analysemethoden voor de bepaling van bestanddelen van dierlijke oorsprong in het kader van de officiële controle van diervoeders (19).

(2) Aangezien Richtlijn 70/373/EEG door Verordening (EG) nr. 882/2004 is vervangen, moeten de uitvoeringsbesluiten van die richtlijn door één verordening worden vervangen. Tegelijkertijd moeten de methoden worden aangepast aan de ontwikkeling van wetenschap en techniek. Methoden die niet meer aan het beoogde doel beantwoorden, moeten worden geschrapt. Het is de bedoeling de bemonsteringsvoorschriften te zijner tijd aan te passen aan recente ontwikkelingen in de wijze waarop diervoeders geproduceerd, opgeslagen, vervoerd en in de handel gebracht worden, maar vooralsnog moeten de huidige bemonsteringsvoorschriften van kracht blijven.

(3) De Richtlijnen 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG en 2003/126/EG moeten derhalve worden ingetrokken.

(4) De in deze verordening vervatte maatregelen zijn in overeenstemming met het advies van het Permanent Comité voor de voedselketen en de diergezondheid,

HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD:

Artikel 1

De bemonstering voor de officiële controle van diervoeders in verband met de bepaling van de bestanddelen, toevoegingsmiddelen en ongewenste stoffen, met uitzondering van bestrijdingsmiddelenresiduen en micro-organismen, geschiedt volgens de in bijlage I beschreven methoden.

Artikel 2

Voor de voorbereiding van de monsters voor de analyse en de weergave van de resultaten worden de in bijlage II beschreven methoden gebruikt.

Artikel 3

De analyse voor de officiële controle van diervoeders wordt uitgevoerd met de methoden die worden beschreven in bijlage III (analysemethoden ter controle van de samenstelling van voedermiddelen en mengvoeders), bijlage IV (analysemethoden ter controle van het gehalte aan toegelaten toevoegingsmiddelen in diervoeders), bijlage V (analysemethoden voor de controle op ongewenste stoffen in diervoeders) en bijlage VI (analysemethoden voor de bepaling van bestanddelen van dierlijke oorsprong in het kader van de officiële controle van diervoeders).

Artikel 4

De energiewaarde van mengvoeders voor pluimvee wordt berekend overeenkomstig bijlage VII.

Artikel 5

De in bijlage VIII beschreven analysemethoden voor de controle op de illegale aanwezigheid van niet meer toegelaten toevoegingsmiddelen in diervoeders worden ter bevestiging gebruikt.

Artikel 6

De Richtlijnen 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG en 2003/126/EG worden ingetrokken.

Verwijzingen naar de ingetrokken richtlijnen gelden als verwijzingen naar deze verordening en worden gelezen volgens de concordantietabel in bijlage IX.

Artikel 7

Deze verordening treedt in werking op de twintigste dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Unie.

Zij is van toepassing met ingang van 26 augustus 2009.

Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselijk in elke lidstaat. Gedaan te Brussel, 27 januari 2009. Voor de Commissie Androulla VASSILIOU Lid van de Commissie

(1) PB L 165 van 30.4.2004, blz. 1; gerectificeerd in PB L 191 van 28.5.2004, blz. 1.

(2) PB L 155 van 12.7.1971, blz. 13.

(3) PB L 279 van 20.12.1971, blz. 7.

(4) PB L 123 van 29.5.1972, blz. 6.

(5) PB L 83 van 30.3.1973, blz. 21.

(6) PB L 102 van 15.4.1976, blz. 1.

(7) PB L 102 van 15.4.1976, blz. 8.

(8) PB L 206 van 29.7.1978, blz. 43.

(9) PB L 257 van 10.9.1981, blz. 38.

(10) PB L 238 van 6.9.1984, blz. 34.

(11) PB L 130 van 16.5.1986, blz. 53.

(12) PB L 234 van 17.9.1993, blz. 17.

(13) PB L 329 van 30.12.1993, blz. 54.

(14) PB L 257 van 19.9.1998, blz. 14.

(15) PB L 118 van 6.5.1999, blz. 36.

(16) PB L 207 van 6.8.1999, blz. 13.

(17) PB L 174 van 13.7.2000, blz. 32.

(18) PB L 209 van 6.8.2002, blz. 15.

(19) PB L 339 van 24.12.2003, blz. 78.

BIJLAGE I BEMONSTERINGSMETHODEN 1. DOEL EN TOEPASSINGSGEBIED De monsters voor de officiële controle van diervoeders worden genomen volgens de hierna beschreven methoden. De aldus verkregen monsters worden representatief geacht voor de bemonsterde partijen. 2. BEMONSTERAARS De monsters worden genomen door personen die daartoe door de lidstaten zijn gemachtigd. 3. DEFINITIES Partij: hoeveelheid van een product die een eenheid vormt, en waarvan aangenomen wordt dat zij uniforme kenmerken bezit. Basismonster: een hoeveelheid die op een bepaald punt uit de partij is genomen. Verzamelmonster: het geheel van basismonsters van dezelfde partij. Deelmonster: een gedeelte dat representatief is voor het verzamelmonster en dat wordt verkregen door verkleinen van dat monster. Eindmonster: een gedeelte van het deelmonster of van het gehomogeniseerde verzamelmonster. 4. APPARATUUR 4.1. De bemonsteringsapparatuur moet zijn vervaardigd uit materiaal dat de te bemonsteren producten niet verontreinigt. Deze apparatuur kan door de lidstaten worden goedgekeurd. 4.2. Aanbevolen apparatuur voor de bemonstering van vaste diervoeders 4.2.1. Handmatige bemonstering 4.2.1.1. Schop met platte bodem en verticale randen 4.2.1.2. Boor met lange gleuf of met een in vakken ingedeelde gleuf. De afmetingen van de boor moeten zijn aangepast aan de kenmerken van de partij (diepte van de verpakking, afmetingen van de zak enz.) en aan de grootte van de deeltjes waaruit het diervoeder is samengesteld. 4.2.2. Mechanische bemonstering Voor de bemonstering van diervoeders die in beweging zijn, mag gebruik worden gemaakt van goedgekeurde mechanische apparaten. 4.2.3. Monsterverdeler Voor het nemen van basismonsters, alsmede voor de bereiding van deelmonsters en van eindmonsters, mag gebruik worden gemaakt van apparaten waarmee het monster in ongeveer gelijke delen kan worden verdeeld. 5. KWANTITATIEVE VEREISTEN 5.A. Voor de controle van stoffen of producten die gelijkmatig in het diervoeder verdeeld zijn 5.A.1. Partij De grootte van de partij moet zodanig zijn dat ieder deel van deze partij kan worden bemonsterd. 5.A.2. Basismonsters 5.A.2.1. Onverpakte diervoeders: Minimumaantal basismonsters: 5.A.2.1.1. partijen van niet meer dan 2,5 ton zeven 5.A.2.1.2. partijen van meer dan 2,5 ton √ 20 maal het aantal ton waaruit de partij is samengesteld (1), tot maximaal 40 basismonsters 5.A.2.2. Verpakte diervoeders: Minimumaantal te bemonsteren verpakkingen (2): 5.A.2.2.1. Verpakkingen met een inhoud van meer dan 1 kg: 5.A.2.2.1.1. partijen samengesteld uit 1-4 verpakkingen alle verpakkingen 5.A.2.2.1.2. partijen samengesteld uit 5-16 verpakkingen vier 5.A.2.2.1.3. partijen samengesteld uit meer dan 16 verpakkingen √ het aantal verpakkingen waaruit de partij is samengesteld (1), tot maximaal 20 verpakkingen 5.A.2.2.2. Verpakkingen met een inhoud van niet meer dan 1 kg vier 5.A.2.3. Vloeibare of halfvloeibare diervoeders: Minimumaantal te bemonsteren verpakkingen (2): 5.A.2.3.1. Recipiënten met een inhoud van meer dan 1 liter: 5.A.2.3.1.1. partijen samengesteld uit 1-4 recipiënten alle recipiënten 5.A.2.3.1.2. partijen samengesteld uit 5-16 recipiënten vier 5.A.2.3.1.3. partijen samengesteld uit meer dan 16 recipiënten √ het aantal recipiënten waaruit de partij is samengesteld (1), tot maximaal 20 recipiënten 5.A.2.3.2. Recipiënten met een inhoud van niet meer dan 1 liter vier 5.A.2.4. Voederblokken en likstenen Minimumaantal te bemonsteren blokken of likstenen (2): één blok of liksteen per partij van 25 eenheden, tot maximaal vier blokken of likstenen. 5.A.3. Verzamelmonster Per partij is één verzamelmonster vereist. De totale massa van de basismonsters die samen het verzamelmonster vormen, mag niet lager zijn dan de hierna vermelde hoeveelheden: 5.A.3.1. Onverpakte diervoeders 4 kg 5.A.3.2. Verpakte diervoeders: 5.A.3.2.1. verpakkingen met een inhoud van meer dan 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. verpakkingen met een inhoud van niet meer dan 1 kg massa van de inhoud van vier oorspronkelijke verpakkingen 5.A.3.3. Vloeibare of halfvloeibare diervoeders: 5.A.3.3.1. recipiënten met een inhoud van meer dan 1 liter 4 liter 5.A.3.3.2. recipiënten met een inhoud van niet meer dan 1 liter volume van de inhoud van vier oorspronkelijke recipiënten 5.A.3.4. Voederblokken en likstenen: 5.A.3.4.1. met een massa van meer dan 1 kg per stuk 4 kg 5.A.3.4.2. met een massa van niet meer dan 1 kg per stuk massa van vier oorspronkelijke blokken of likstenen 5.A.4. Eindmonsters Na eventuele verkleining worden uit het verzamelmonster eindmonsters verkregen. Er moet ten minste één eindmonster worden geanalyseerd. Het voor de analyse bestemde eindmonster omvat minimaal: vaste diervoeders 500 g vloeibare of halfvloeibare diervoeders 500 ml 5.B. Voor de controle van ongewenste stoffen of producten die waarschijnlijk niet gelijkmatig in het diervoeder verdeeld zijn, zoals aflatoxinen, moederkoren, ricinus en crotalaria in voedermiddelen (3) 5.B.1. Partij: zie 5.A.1. 5.B.2. Basismonsters 5.B.2.1. Onverpakte diervoeders: zie 5.A.2.1. 5.B.2.2. Verpakte diervoeders: Minimumaantal te bemonsteren verpakkingen: 5.B.2.2.1. partijen samengesteld uit 1-4 verpakkingen alle verpakkingen 5.B.2.2.2. partijen samengesteld uit 5-16 verpakkingen vier 5.B.2.2.3. partijen samengesteld uit meer dan 16 verpakkingen √ het aantal verpakkingen waaruit de partij is samengesteld (1), tot maximaal 40 verpakkingen 5.B.3. Verzamelmonsters Het aantal verzamelmonsters hangt af van de grootte van de partij. Het minimumaantal verzamelmonsters per partij staat hieronder vermeld. De totale massa van de basismonsters die samen een verzamelmonster vormen, mag niet kleiner zijn dan 4 kg. 5.B.3.1. Onverpakte diervoeders Massa van de partij in ton: Minimumaantal verzamelmonsters per partij: niet meer dan 1 1 meer dan 1 en niet meer dan 10 2 meer dan 10 en niet meer dan 40 3 meer dan 40 4 5.B.3.2. Verpakte diervoeders Aantal verpakkingen waaruit de partij is samengesteld: Minimumaantal verzamelmonsters per partij: 1 tot en met 16 1 17 tot en met 200 2 201 tot en met 800 3 meer dan 800 4 5.B.4. Eindmonsters Na verkleining worden uit het verzamelmonster eindmonsters verkregen. Er moet ten minste één eindmonster per verzamelmonster worden geanalyseerd. De massa van het voor de analyse bestemde monster mag niet minder bedragen dan 500 g. 6. INSTRUCTIES BETREFFENDE DE BEMONSTERING, DE BEREIDING EN DE VERPAKKING VAN DE MONSTERS 6.1. Algemeen De monsters moeten zo snel mogelijk worden genomen en bereid, met inachtneming van de voorzorgsmaatregelen die vereist zijn om verandering of verontreiniging van het product te voorkomen. De bemonsteringsapparatuur alsmede de oppervlakken en recipiënten die bestemd zijn voor de monsters moeten schoon en droog zijn. 6.2. Basismonsters 6.2.A. Voor de controle van stoffen of producten die gelijkmatig in het diervoeder verdeeld zijn De basismonsters moeten op willekeurige wijze uit de gehele partij worden genomen. De massa of het volume daarvan moet ongeveer gelijk zijn. 6.2.A.1. Onverpakte diervoeders De partij wordt op denkbeeldige wijze in een aantal ongeveer gelijke delen verdeeld. Op willekeurige wijze wordt een aantal delen gekozen overeenkomstig het aantal onder 5.A.2 vermelde basismonsters en er wordt minstens één monster uit elk van deze delen genomen. Eventueel kunnen de monsters worden getrokken wanneer de partij in beweging wordt gebracht (laden of lossen). 6.2.A.2. Verpakte diervoeders Nadat het vereiste aantal te bemonsteren verpakkingen genomen is, zoals in 5.A.2 is aangegeven, wordt uit de inhoud van elke verpakking met een boor of een schop een gedeelte genomen. Eventueel worden de monsters genomen nadat de verpakkingen afzonderlijk zijn geledigd. In elk verzamelmonster worden klonters zo nodig fijngemaakt en weer aan het monster toegevoegd. 6.2.A.3. Vloeibare of halfvloeibare homogene of homogeniseerbare diervoeders Nadat het vereiste aantal te bemonsteren recipiënten gekozen is, zoals in 5.A.2 is aangegeven, wordt uit elke recipiënt een monster genomen nadat zo nodig de inhoud ervan gehomogeniseerd is. De basismonsters kunnen eventueel worden genomen bij het aftappen van het product. 6.2.A.4. Vloeibare of halfvloeibare, niet-homogeniseerbare diervoeders Nadat het vereiste aantal te bemonsteren recipiënten genomen is, zoals in 5.A.2 is aangegeven, worden op verschillende niveaus monsters genomen. De monsters mogen ook worden genomen bij het aftappen van het product, na de eerste fracties ervan te hebben verwijderd. In beide gevallen mag het totale volume van de monsters niet minder dan 10 liter bedragen. 6.2.A.5. Voederblokken en likstenen Nadat het vereiste aantal te bemonsteren blokken of likstenen genomen is, zoals in 5.A.2 is aangegeven, wordt een gedeelte van elk blok of elke liksteen genomen. 6.2.B. Voor de controle van ongewenste stoffen of producten die waarschijnlijk niet gelijkmatig in het diervoeder verdeeld zijn, zoals aflatoxinen, moederkoren, ricinus en crotalaria in voedermiddelen De partij wordt op denkbeeldige wijze in een aantal ongeveer gelijke delen verdeeld overeenkomstig het aantal in 5.B.3 vermelde verzamelmonsters. Wanneer dit aantal meer dan één bedraagt, wordt het totaal aantal in 5.B.2 voorgeschreven basismonsters op ongeveer gelijke wijze over de verschillende delen verdeeld. Vervolgens worden ongeveer gelijke hoeveelheden genomen (4), zodanig dat de totale massa van de monsters van elk deel niet minder bedraagt dan de minimumhoeveelheid van 4 kg die vereist is voor elk verzamelmonster. De basismonsters afkomstig van verschillende delen mogen niet worden samengevoegd. 6.3. Bereiding van de verzamelmonsters 6.3.A. Voor de controle van stoffen of producten die gelijkmatig in het diervoeder zijn verdeeld De ondermonsters worden samengevoegd zodat één verzamelmonster wordt verkregen. 6.3.B. Voor de controle van ongewenste stoffen of producten die waarschijnlijk niet gelijkmatig in het diervoeder verdeeld zijn, zoals aflatoxinen, moederkoren, ricinus en crotalaria in voedermiddelen De van elk gedeelte van de partij afkomstige basismonsters worden samengevoegd en het in 5.B.3 voorgeschreven aantal verzamelmonsters wordt gevormd, waarbij ervoor moet worden gezorgd dat de herkomst van elk verzamelmonster wordt vermeld. 6.4. Bereiding van de eindmonsters Elk verzamelmonster wordt zorgvuldig gemengd zodat een homogeen monster wordt verkregen (5). Zo nodig wordt het verzamelmonster eerst tot ten minste 2 kg of 2 liter (deelmonster) verkleind met een mechanische of automatische monsterverdeler of door kwarteren. Vervolgens worden minstens drie laboratoriummonsters met ongeveer dezelfde massa of hetzelfde volume bereid, die aan de in 5.A.4 of 5.B.4 vermelde kwantitatieve eisen beantwoorden. Elk monster moet in een daartoe geschikte recipiënt worden overgebracht. Alle nodige voorzorgen moeten worden genomen om elke wijziging in de samenstelling van het monster of elke verontreiniging of verandering die tijdens het vervoer of de opslag kan plaatsvinden, te voorkomen. 6.5. Verpakking van de eindmonsters De recipiënten of verpakkingen worden zodanig verzegeld en geëtiketteerd (het etiket moet deel uitmaken van het zegel) dat het onmogelijk is deze te openen zonder het zegel te beschadigen. 7. BEMONSTERINGSRAPPORT Voor elke monsterneming wordt een bemonsteringsrapport opgesteld aan de hand waarvan de bemonsterde partij op ondubbelzinnige wijze kan worden geïdentificeerd. 8. BESTEMMING VAN DE MONSTERS Voor elk verzamelmonster wordt ten minste één eindmonster zo spoedig mogelijk naar het met de analyse belaste laboratorium gezonden, tezamen met de voor de analist noodzakelijke gegevens. (1) Indien de uitkomst een gebroken getal is, moet dit getal op het eerstvolgende hogere gehele getal worden afgerond. (2) Voor verpakkingen of recipiënten met een inhoud van niet meer dan 1 kg of 1 liter en voor blokken of likstenen met een massa van niet meer dan 1 kg per stuk, bestaat het basismonster uit de inhoud van één oorspronkelijke verpakking of recipiënt, dan wel één blok of liksteen. (3) De onder 5.A beschreven methoden worden gebruikt voor de controle op aflatoxinen, moederkoren, ricinus en crotalaria in volledige en aanvullende diervoeders. (4) Voor verpakte diervoeders wordt uit de inhoud van elke verpakking met behulp van een boor of schop een gedeelte genomen, zo nodig nadat de verpakkingen elk afzonderlijk zijn geleegd. (5) In elk verzamelmonster worden klonters zo nodig fijngemaakt en weer aan het monster toegevoegd.

BIJLAGE II ALGEMENE BEPALINGEN BETREFFENDE ANALYSEMETHODEN VOOR DIERVOEDERS A. VOORBEREIDING VAN MONSTERS VOOR DE ANALYSE 1. Doel De hieronder beschreven werkwijzen hebben betrekking op het voor de analyse gereedmaken van de naar de controlelaboratoria gezonden eindmonsters nadat de bemonstering overeenkomstig bijlage I heeft plaatsgevonden. Deze monsters worden zodanig voorbereid dat de voor de uitvoering van de analysemethoden afgewogen hoeveelheden homogeen zijn en representatief voor de eindmonsters. 2. Voorzorgsmaatregelen De voor de monstervoorbereiding te volgen werkwijze hangt af van de analysemethode. Het is dus van groot belang dat de gevolgde werkwijze geschikt is voor de gebruikte analysemethode. Alle noodzakelijke bewerkingen moeten zodanig worden uitgevoerd dat verontreiniging van het monster en verandering in de samenstelling ervan zo veel mogelijk worden vermeden. Het malen, mengen en zeven moet zo snel mogelijk gebeuren onder zo gering mogelijke blootstelling van het monster aan lucht en licht. Vermijd het gebruik van maaltoestellen die het monster aanmerkelijk kunnen verwarmen. Voor diervoeders die bijzonder gevoelig zijn voor warmte wordt malen met de hand aanbevolen. Ook moet er voor gewaakt worden dat het maaltoestel zelf niet de oorzaak van verontreiniging met sporenelementen vormt. Als de monstervoorbereiding niet kan worden uitgevoerd zonder dat het vochtgehalte van het monster daardoor sterk verandert, moet het vochtgehalte vóór en na de voorbereiding worden bepaald volgens de methode van deel A van bijlage III. 3. Werkwijze Verdeel het monster in geschikte deelmonsters voor analyse- en referentiedoeleinden door middel van geschikte monsterverdelingsmethoden, zoals met een schep verdelen, statisch spleetverdelen of roterend verdelen. Kwarteren wordt niet aanbevolen omdat dit tot grote fouten in de deelmonsters kan leiden. Bewaar het referentiemonster in een geschikt schoon en droog vat, dat voorzien is van een luchtdichte stop, en bereid deelmonsters voor de analyse van ten minste 100 g zoals hieronder beschreven. 3.1. Diervoeders die als zodanig gemalen kunnen worden Zeef, tenzij in de analysemethode anders is aangegeven, het hele monster door een zeef met mazen van 1 mm (overeenkomstig ISO-aanbeveling R565), zo nodig na malen. Maal niet te fijn. Meng het gezeefde monster en doe het in een geschikt schoon en droog vat, dat voorzien is van een luchtdichte stop. Meng nogmaals, vlak voor de hoeveelheid voor analyse wordt afgewogen. 3.2. Diervoeders die na drogen gemalen kunnen worden Droog het monster, tenzij in de analysemethoden anders is aangegeven, zo ver dat het vochtgehalte tot 8-12 % is teruggebracht, overeenkomstig de voordroogmethode zoals beschreven in punt 4.3 van de in bijlage III, deel A, opgenomen vochtbepalingsmethode. Ga dan verder te werk als in paragraaf 3.1. 3.3. Vloeibare of halfvloeibare diervoeders Verzamel het monster is een geschikt schoon en droog vat, dat voorzien is van een luchtdichte stop. Meng het grondig, vlak voor de hoeveelheid voor analyse wordt afgewogen. 3.4. Andere diervoeders Monsters die niet volgens een van de bovenstaande methoden kunnen worden bereid, moeten worden behandeld volgens een andere werkwijze, die zodanig is dat in ieder geval de voor de analyse afgewogen hoeveelheden homogeen zijn en representatief voor de eindmonsters. 4. Bewaren van monsters Bewaar de monsters bij een temperatuur die hun samenstelling niet zal beïnvloeden. Monsters die bestemd zijn voor de analyse van vitaminen of producten die bijzonder gevoelig zijn voor licht moeten worden bewaard in bruine glazen vaten. B. BEPALINGEN BETREFFENDE IN DE ANALYSEMETHODEN GEBRUIKTE REAGENTIA EN APPARATUUR 1. Tenzij in de analysemethoden anders is aangegeven, moeten alle voor de analyse gebruikte reagentia analytisch zuiver zijn (p.a.). Bij het bepalen van sporenelementen moet de zuiverheid van de reagentia gecontroleerd worden door een blancoproef. Afhankelijk van de verkregen uitkomst kan verdergaande zuivering van de reagentia nodig zijn. 2. Elke in de analysemethoden genoemde handeling waar het gaat om bereiding van oplossingen, verdunning, spoelen of wassen, zonder dat de aard van het gebruikte oplosmiddel is aangegeven, houdt in dat water moet worden gebruikt. Als algemene regel geldt dat water moet zijn gedemineraliseerd of gedestilleerd. In bepaalde gevallen, die in de analysemethoden nader worden aangegeven, moet het een speciale zuiveringsbehandeling hebben ondergaan. 3. Van de standaardapparatuur die normaal in de controlelaboratoria aanwezig is, worden alleen speciale instrumenten en toestellen of apparatuur waaraan bijzondere eisen zijn gesteld in de analysemethoden vermeld. Deze moeten schoon zijn, vooral wanneer het gaat om de bepaling van kleine hoeveelheden stof. C. TOEPASSING VAN ANALYSEMETHODEN EN WEERGAVE VAN DE RESULTATEN 1. Extractieprocedure In verscheidene methoden wordt een specifieke extractieprocedure genoemd. In de regel mogen ook andere extractieprocedures worden gebruikt, mits bewezen is dat de gevolgde procedure voor de geanalyseerde matrix hetzelfde extractierendement heeft als de in de methode genoemde procedure. 2. Clean-upprocedure In verscheidene methoden wordt een specifieke clean-upprocedure genoemd. In de regel mogen ook andere clean-upprocedures worden gebruikt, mits bewezen is dat de gevolgde procedure voor de geanalyseerde matrix dezelfde analyseresultaten geeft als de in de methode genoemde procedure. 3. Vermelding van de gebruikte analysemethode In het algemeen wordt voor de bepaling van elke stof in diervoeders één analysemethode vastgesteld. Wanneer er meer methoden zijn opgegeven, moet de door het controlelaboratorium gebruikte methode in het analyserapport worden aangegeven. 4. Aantal bepalingen Het in het analyserapport vermelde resultaat is de gemiddelde waarde uit ten minste twee, op aparte porties van het monster uitgevoerde bepalingen, met voldoende herhaalbaarheid. Als echter bij de analyse op ongewenste stoffen het resultaat van de eerste bepaling significant (> 50 %) onder de te controleren specificatie ligt, zijn verdere bepalingen niet nodig, mits adequate kwaliteitszorgprocedures zijn gevolgd. Als bij de controle van het opgegeven gehalte van een stof of ingrediënt de uitslag van de eerste bepaling het opgegeven gehalte bevestigt, d.w.z. de uitslag ligt binnen de tolerantiegrenzen voor het opgegeven gehalte, zijn verdere bepalingen niet nodig, mits adequate kwaliteitszorgprocedures zijn gevolgd. In sommige gevallen zijn deze tolerantiegrenzen in wetgeving vastgelegd, bijvoorbeeld in Richtlijn 79/373/EEG van de Raad (1). 5. Weergave van het analyseresultaat Het analyseresultaat moet worden opgegeven op de in de analysemethode vastgelegde wijze, met een passend aantal significante cijfers en waarbij zo nodig rekening wordt gehouden met het vochtgehalte van het eindmonster voor de behandeling. 6. Meetonzekerheid en terugvindingspercentage bij de analyse van ongewenste stoffen Voor ongewenste stoffen in de zin van Richtlijn 2002/32/EG, met inbegrip van dioxinen en dioxineachtige pcb's, wordt een product dat bedoeld is voor het voederen van dieren als niet in overeenstemming met het vastgestelde maximumgehalte beschouwd als het resultaat van de analyse dat maximumgehalte overschrijdt, met inachtneming van de uitgebreide meetonzekerheid en de correctie voor terugvinding. Aan de hand van de gemeten concentratie, gecorrigeerd voor terugvinding en na aftrek van de uitgebreide meetonzekerheid, wordt nagegaan of aan het maximumgehalte wordt voldaan. Deze werkwijze geldt alleen als de meetonzekerheid en de correctie voor terugvinding voor de gebruikte analysemethode kunnen worden bepaald (dus bijvoorbeeld niet voor microscopisch onderzoek). Het analyseresultaat wordt als volgt weergegeven (voor zover de meetonzekerheid en het terugvindingspercentage voor de gebruikte analysemethode kunnen worden bepaald): a) gecorrigeerd voor de terugvinding, waarbij het terugvindingspercentage moet worden vermeld. De correctie voor terugvinding is niet nodig bij terugvindingspercentages tussen 90 en 110 %; b) als „x ± U”, waarbij x het analyseresultaat is en U de uitgebreide meetonzekerheid, met een dekkingsfactor 2, zodat een betrouwbaarheidsniveau van ongeveer 95 % wordt verkregen. Als het analyseresultaat echter significant (> 50 %) onder de te controleren specificatie ligt, mag het analyseresultaat zonder correctie voor terugvinding worden opgegeven en mag de vermelding van het terugvindingspercentage en de meetonzekerheid achterwege blijven, mits adequate kwaliteitszorgprocedures zijn gevolgd en de analyse alleen tot doel heeft na te gaan of aan de wettelijke bepalingen is voldaan. (1) PB L 86 van 6.4.1979, blz. 30.

BIJLAGE III ANALYSEMETHODEN TER CONTROLE VAN DE SAMENSTELLING VAN VOEDERMIDDELEN EN MENGVOEDERS A. BEPALING VAN VOCHT 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vocht in diervoeders. Er wordt op gewezen dat in het geval van diervoeders die vluchtige stoffen, zoals organische zuren, bevatten bij de bepaling van het vochtgehalte ook een aanzienlijke hoeveelheid vluchtige stoffen wordt gemeten. Dit voorschrift heeft geen betrekking op de analyse van melkproducten als voedermiddelen, van minerale stoffen en mengsels die overwegend uit mineralen bestaan, van dierlijke en plantaardige vetten en van oliehoudende zaden en vruchten. 2. Beginsel Het monster wordt gedroogd onder bepaalde omstandigheden, die afhankelijk zijn van de aard van het diervoeder. Het massaverlies wordt door weging bepaald. Vaste diervoeders met een hoog vochtgehalte moeten eerst worden voorgedroogd. 3. Apparatuur 3.1. Molen van een materiaal dat geen vocht absorbeert, die gemakkelijk te reinigen is en waarmee snel en gelijkmatig kan worden gemalen zonder noemenswaardig warmte op te wekken, die zo goed mogelijk kan worden afgesloten van de buitenlucht en voldoet aan de eisen genoemd onder 4.1.1 en 4.1.2 (bv. microkruisslagmolens, micromolens met waterkoeling, demonteerbare kogelmolens, langzaam lopende kogelmolens en molens met getande schijven). 3.2. Analytische balans, nauwkeurigheid 1 mg. 3.3. Droogschalen van roestbestendig metaal of van glas voorzien van een luchtdicht afsluitend deksel en met een zodanig nuttig oppervlak dat het monster kan worden uitgespreid tot ongeveer 0,3 g/cm2. 3.4. Elektrische droogstoof met thermostaat (± 2 oC), waarmee de temperatuur snel kan worden geregeld en die goed ventileert (1). 3.5. Elektrische vacuümdroogstoof met oliepomp, voorzien van een inrichting voor toevoer van gedroogde, warme lucht of voorzien van een droogmiddel (bv. calciumoxide). 3.6. Exsiccator met dikke, geperforeerde plaat van metaal of porselein en met een effectief droogmiddel. 4. Werkwijze NB : De in dit hoofdstuk beschreven handelingen moeten direct na het openen van de verpakking van de monsters worden uitgevoerd. De analyses moeten ten minste in duplo worden uitgevoerd. 4.1. Voorbereiding 4.1.1. Diervoeders met uitzondering van de onder 4.1.2 en 4.1.3 genoemde Neem ten minste 50 g van het monster. Maak dit, zo nodig, op passende wijze fijn, zodanig dat veranderingen in het vochtgehalte worden voorkomen (zie 6). 4.1.2. Granen en grutten Neem ten minste 50 g van het monster. Maal dit tot deeltjes van zodanige grootte dat ten minste 50 % ervan door een zeef van 0,5 mm gaat en dat niet meer dan 10 % blijft liggen op een zeef met ronde mazen van 1 mm. 4.1.3. Vloeibare of brijachtige diervoeders; diervoeders die in hoofdzaak bestaan uit vet Neem ongeveer 25 g monster, tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, voeg een passende hoeveelheid watervrij zand toe, tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, en meng tot een homogeen product is verkregen. 4.2. Drogen 4.2.1. Diervoeders met uitzondering van de onder 4.2.2 en 4.2.3 genoemde Weeg een droogschaal (3.3) met deksel tot op 1 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde droogschaal en spreid gelijkmatig uit. Plaats de droogschaal zonder deksel in een vooraf op 103 oC gebrachte droogstoof. Om te voorkomen dat de temperatuur te veel daalt, dient de droogschaal zo snel mogelijk in de droogstoof gebracht te worden. Laat gedurende 4 uur drogen, gerekend vanaf het tijdstip dat de stoof weer op een temperatuur van 103 oC is. Sluit na het openen van de stoof de droogschaal met het deksel, neem hem uit de stoof, laat gedurende 30-45 minuten afkoelen in de exsiccator (3.6) en weeg tot op 1 mg nauwkeurig. Monsters die in hoofdzaak bestaan uit vet, worden nog eens gedurende 30 minuten bij 103 oC in de stoof gedroogd. Het verschil tussen de resultaten van beide wegingen mag niet meer bedragen dan 0,1 % vocht. 4.2.2. Graan, meel, grutten en gries Weeg een droogschaal (3.3) met deksel tot op 0,5 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het fijngemaakte monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde droogschaal en spreid gelijkmatig uit. Plaats de droogschaal zonder deksel in een vooraf op 130 oC gebrachte droogstoof. Om te voorkomen dat de temperatuur te veel daalt, dient de droogschaal zo snel mogelijk in de droogstoof gebracht te worden. Laat gedurende 2 uur drogen, gerekend vanaf het tijdstip dat de stoof weer op een temperatuur van 130 oC is. Sluit na het openen van de stoof de droogschaal met het deksel, neem hem uit de stoof, laat gedurende 30-45 minuten afkoelen in de exsiccator (3.6) en weeg tot op 1 mg nauwkeurig. 4.2.3. Mengvoeders met een gehalte aan sacharose of lactose van meer dan 4 %: voedermiddelen als johannesbrood, gehydrolyseerde graanproducten, moutkiemen, suikerbietensnijdsels, visperssap en suikersap, en mengvoeders met meer dan 25 % minerale zouten met kristalwater. Weeg een droogschaal (3.3) met deksel tot op 0,5 mg nauwkeurig. Breng ongeveer 5 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de getarreerde droogschaal en spreid gelijkmatig uit. Plaats de droogschaal zonder deksel in de vooraf op 80-85 oC gebrachte vacuümdroogstoof (3.5). Om te voorkomen dat de temperatuur te veel daalt, dient de droogschaal zo snel mogelijk in de droogstoof gebracht te worden. Stel de druk in op 10 cm kwik en droog het monster gedurende 4 uur bij deze druk, hetzij onder toevoer van droge, warme lucht, hetzij met behulp van een droogmiddel (ongeveer 300 g voor 20 monsters). In het laatste geval wordt bij het bereiken van de voorgeschreven druk de verbinding met de vacuümpomp verbroken. Reken de droogtijd vanaf het tijdstip dat de droogstoof weer op een temperatuur van 80-85 oC is. Laat na het beëindigen van de droogtijd de druk in de stoof voorzichtig weer komen op die van de buitenlucht. Sluit na het openen van de vacuümdroogstoof de droogschaal met het deksel, neem hem uit de stoof, laat gedurende 30-45 minuten afkoelen in de exsiccator (3.6) en weeg vervolgens tot op 1 mg nauwkeurig. Droog nogmaals gedurende 30 minuten onder vacuüm in de stoof bij 80-85 oC en weeg opnieuw. Het verschil tussen de resultaten van beide wegingen mag niet meer bedragen dan 0,1 % vocht. 4.3. Voordrogen 4.3.1. Diervoeders met uitzondering van de onder 4.3.2 genoemde Vaste diervoeders met een hoog gehalte aan vocht, die moeilijk fijn te maken zijn, worden als volgt voorgedroogd: Breng 50 g van het ongemalen monster (geperste diervoeders of diervoeders in brokken zo nodig grof breken), tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, in een geschikte recipiënt (bv. een schaal van aluminium van 20 bij 12 cm met een rand van 0,5 cm). Droog in een stoof bij een temperatuur van 60-70 oC, totdat het vochtgehalte is teruggebracht tot een waarde tussen 8 % en 12 %. Neem de recipiënt uit de droogstoof en laat onafgedekt gedurende 1 uur afkoelen in het laboratorium; weeg vervolgens tot op 10 mg nauwkeurig. Maak het monster onmiddellijk daarna fijn als beschreven onder 4.1.1 en droog, al naargelang de aard van het monster, als beschreven onder 4.2.1 of 4.2.3. 4.3.2. Granen Granen met een vochtgehalte van meer dan 17 % moeten als volgt worden voorgedroogd: Breng 50 g van het ongemalen graan, tot op 10 mg nauwkeurig gewogen, in een geschikte recipiënt (bv. een schaal van aluminium van 20 bij 12 cm met een rand van 0,5 cm). Droog in een stoof gedurende 5-7 minuten bij een temperatuur van 130 oC. Neem de recipiënt uit de droogstoof en laat onafgedekt gedurende 2 uur afkoelen in het laboratorium; weeg vervolgens tot op 10 mg nauwkeurig. Maak onmiddellijk daarna fijn als beschreven onder 4.1.2 en droog als beschreven onder 4.2.2. 5. Berekening van de resultaten Het vochtgehalte van het monster in procent (X) wordt weergegeven door de volgende formules: 5.1. Drogen zonder voordrogen waarbij: m = oorspronkelijke massa van het monster (in g); m0 = massa van het gedroogde monster (in g). 5.2. Drogen zonder voordrogen waarbij: m = oorspronkelijke massa van het monster (in g); m1 = massa van het monster na voordrogen (in g); m2 = massa van het monster na fijnmaken (in g); m0 = massa van het gedroogde monster (in g). 5.3. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan 0,2 % absoluut. 6. Waarneming Indien het monster fijngemaakt moet worden en dit een verandering van het vochtgehalte van het product ten gevolge heeft, dienen de analyseresultaten die betrekking hebben op de bestanddelen van het diervoeder, omgerekend te worden naar het vochtgehalte van het oorspronkelijke monster. B. BEPALING VAN VOCHT IN DIERLIJKE EN PLANTAARDIGE VETTEN EN OLIËN 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vocht, water en andere vluchtige stoffen in dierlijke en plantaardige vetten en oliën. 2. Beginsel Het monster wordt bij 103 oC gedroogd tot constante massa (het massaverlies tussen twee opeenvolgende wegingen mag niet meer dan 1 mg zijn). Het massaverlies wordt door weging bepaald. 3. Apparatuur 3.1. Schaal met vlakke bodem, van corrosiebestendig materiaal, diameter 8-9 cm, hoogte circa 3 cm. 3.2. Thermometer met een versterkt reservoir en een expansieruimte, gekalibreerd van ongeveer 80 oC tot ten minste 110 oC, lengte circa 10 cm. 3.3. Zandbad of elektrische verwarmingsplaat. 3.4. Exsiccator met een effectief droogmiddel. 3.5. Analytische balans. 4. Werkwijze Breng ongeveer 20 g van het gehomogeniseerde monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, in de droge, getarreerde schaal (3.1) met de thermometer (3.2). Verhit onder voortdurend roeren met de thermometer op het zandbad of op de verwarmingsplaat (3.3) zodanig dat na ongeveer 7 minuten een temperatuur van 90 oC bereikt wordt. Verminder de toevoer van warmte overeenkomstig de frequentie waarmee gasbellen van de bodem van de schaal opstijgen. De temperatuur mag niet hoger komen dan 105 oC. Roer onder voortdurend schrapen over de bodem van de schaal tot de belvorming ophoudt. Verwarm nog enkele malen tot 103 ± 2 oC om er zeker van te zijn dat al het vocht uitgedreven wordt; laat tussen twee opeenvolgende verhittingen afkoelen tot 93 oC. Laat vervolgens in de exsiccator (3.4) afkoelen tot kamertemperatuur en weeg. Herhaal deze procedure totdat het massaverlies tussen twee opeenvolgende wegingen niet meer bedraagt dan 2 mg. NB : Een massatoename van het monster na herhaalde verwarming duidt op oxidatie van het vet. Gebruik in dat geval bij de berekening het resultaat van de weging die vlak voor de massatoename gedaan werd. 5. Berekening van de resultaten Het vochtgehalte van het monster in procent (X) volgt uit de volgende formule: waarbij: m = massa van het analysemonster (in g); m1 = massa van de schaal met inhoud voor verhitting (in g); m2 = massa van de schaal met inhoud na verhitting (in g); Resultaten beneden 0,05 % moeten aangegeven worden als „minder dan 0,05 %”. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan 0,05 % absoluut. C. BEPALING VAN HET GEHALTE AAN RUW EIWIT 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan ruw eiwit in diervoeders aan de hand van het stikstofgehalte, bepaald volgens de kjeldahlmethode. 2. Beginsel Het monster wordt ontsloten met zwavelzuur in aanwezigheid van een katalysator. De zure oplossing wordt met een oplossing van natriumhydroxide basisch gemaakt. De ammoniak wordt afgedestilleerd en opgevangen in een bekende hoeveelheid zwavelzuur, waarvan de overmaat met een standaardoplossing natriumhydroxide wordt getitreerd. Ook kan de vrijgekomen ammoniak in een overmaat boorzuur worden geleid, waarna met zoutzuur of zwavelzuur wordt getitreerd. 3. Reagentia 3.1. Kaliumsulfaat. 3.2. Katalysator: koper(II)oxide (CuO) of koper(II)sulfaat-pentahydraat (CuSO4·5H2O). 3.3. Zinkkorrels. 3.4. Zwavelzuur, ρ 20 = 1,84 g/ml. 3.5. Zwavelzuur, gesteld, c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Zwavelzuur, gesteld, c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Zwavelzuur, gesteld, c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Methylroodindicator: los 300 mg methylrood op in 100 ml ethanol, σ = 95-96 % (V/V). 3.9. Natriumhydroxideoplossing (mag technisch zuiver zijn), β = 40 g/100 ml (m/V: 40 %). 3.10. Natriumhydroxide, gestelde oplossing, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Natriumhydroxide, gestelde oplossing, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Puimsteenkorrels, met zoutzuur gewassen en gegloeid. 3.13. Aceetanilide (smeltpunt 114 oC, N-gehalte 10,36 %). 3.14. Sacharose (vrij van stikstof). 3.15. Boorzuur (H3BO3). 3.16. Methylroodindicatoroplossing: los 100 mg methylrood op in 100 ml ethanol of methanol. 3.17. Broomkresolgroenoplossing: los 100 mg broomkresolgroen op in 100 ml ethanol of methanol. 3.18. Boorzuuroplossing (10-40 g/l, afhankelijk van de gebruikte apparatuur). Bij colorimetrische eindpuntsbepaling moeten de methylrood- en broomkresolgroenindicator aan de boorzuuroplossingen worden toegevoegd. Bij de bereiding van 1 liter boorzuur wordt, voordat het volume wordt aangevuld, 7 ml methylroodindicatoroplossing (3.16) en 10 ml broomkresolgroenoplossing (3.17) toegevoegd. De pH van de boorzuuroplossing kan afhankelijk van het gebruikte water van keer tot keer verschillen. Vaak moet een kleine hoeveelheid base worden toegevoegd om een positieve blanco te verkrijgen. NB : Toevoeging van 3-4 ml NaOH (3.11) aan 1 liter boorzuuroplossing van 10 g/l geeft doorgaans goede resultaten. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur in het donker en afgeschermd tegen bronnen van ammoniakdamp. 3.19. Zoutzuur, gesteld, c(HCl) = 0,10 mol/l. NB: Andere gestelde oplossingen (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 en 3.19) mogen worden gebruikt, mits hiervoor in de berekeningen wordt gecorrigeerd. De concentraties moeten altijd tot op vier decimalen worden uitgedrukt. 4. Apparatuur Apparatuur, geschikt voor het uitvoeren van ontsluiting, destillatie en titratie volgens Kjeldahl. 5. Werkwijze 5.1. Ontsluiting Weeg 1 g van het monster tot op 0,001 g nauwkeurig af en breng dit in de recipiënt van de ontsluitingsapparatuur. Voeg hieraan toe 15 g kaliumsulfaat (3.1), een geschikte hoeveelheid katalysator (3.2) (0,3-0,4 g koper(II)oxide of 0,9-1,2 g koper(II)sulfaat-pentahydraat), 25 ml zwavelzuur (3.4) en zo nodig een paar puimsteenkorrels (3.12); meng het geheel. Verwarm de recipiënt eerst zacht, zo nodig onder af en toe zwenken, totdat de massa is verkoold en het schuim is verdwenen; verhit vervolgens krachtiger tot de vloeistof regelmatig kookt. Er is voldoende verhit wanneer het kokende zuur tegen de wand van de recipiënt condenseert. Zorg ervoor dat de wand niet oververhit raakt en dat er geen organische stof aan de wand gaat vastzitten. Kook nog twee uur nadat de oplossing helder en lichtgroen geworden is; laat vervolgens afkoelen. 5.2. Destillatie Voeg genoeg water toe om de sulfaten volledig op te lossen. Laat afkoelen; voeg zo nodig enkele zinkkorrels (3.3) toe. Volg de procedure van punt 5.2.1 of 5.2.2. 5.2.1. Destillatie met opvang in zwavelzuur Breng in de opvangkolf van de destillatieapparatuur een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid van 25 ml zwavelzuur (3.5 of 3.7), afhankelijk van het verwachte stikstofgehalte. Voeg enkele druppels methylroodindicator (3.8) toe. Verbind de ontsluitingsrecipiënt met de koeler van het destillatieapparaat en zorg ervoor dat het uiteinde van de koelbuis zich ten minste 1 cm onder het vloeistofoppervlak in de opvangkolf bevindt (zie opmerking 8.3). Giet langzaam 100 ml natriumhydroxideoplossing (3.9) in de ontsluitingsrecipiënt, zonder ammoniakverlies (zie opmerking 8.1). Verwarm de recipiënt totdat alle ammoniak overgedestilleerd is. 5.2.2. Destillatie met opvang in boorzuur Volg de hierna beschreven procedure als het ammoniakgehalte van het destillaat met de hand bepaald wordt. Volg de gebruiksaanwijzing van de destillatieapparatuur als deze volledig geautomatiseerd is, inclusief bepaling van het ammoniakgehalte van het destillaat. Plaats een opvangkolf met 25-30 ml boorzuuroplossing (3.18) aan het uiteinde van de koeler, zodanig dat het uiteinde zich onder het vloeistofoppervlak van de oplossing met overmaat boorzuur bevindt. Stel het destillatieapparaat in op een afgifte van 50 ml natriumhydroxideoplossing (3.9). Stel het destillatieapparaat in werking volgens de gebruiksaanwijzing en destilleer de door het toevoegen van de natriumhydroxideoplossing vrijkomende ammoniak af. Vang het destillaat op in de boorzuuroplossing. De hoeveelheid destillaat (duur van de stoomdestillatie) hangt af van de hoeveelheid stikstof in het monster. Volg de gebruiksaanwijzing. NB : Bij een halfautomatisch destillatieapparaat verlopen de toevoeging van overmaat natriumhydroxide en de stoomdestillatie automatisch. 5.3. Titratie Volg de procedure van punt 5.3.1 of 5.3.2. 5.3.1. Zwavelzuur Titreer de overmaat zwavelzuur in de opvangkolf terug met natriumhydroxideoplossing (3.10 of 3.11, afhankelijk van de concentratie van het gebruikte zwavelzuur), totdat het eindpunt is bereikt. 5.3.2. Boorzuur Titreer de inhoud van de opvangkolf met een buret met het gestelde zoutzuur (3.19) of zwavelzuur (3.6) en lees af hoeveel titrant gebruikt is. Bij colorimetrische eindpuntsbepaling is het eindpunt bij het eerste spoor van roze kleur in de vloeistof. Lees de buret met een nauwkeurigheid van 0,05 ml af. Een magneetroerder met verlichting of een fotometrische detector kan helpen bij de bepaling van het eindpunt. Bij gebruik van een stoomdestillatieapparaat met automatische titratie gebeurt dit automatisch. Volg de gebruiksaanwijzing voor het gebruikte destillatieapparaat (al dan niet met titrator). NB : Bij gebruik van een automatisch titratiesysteem begint de titratie onmiddellijk na de destillatie en wordt de 1 %-boorzuuroplossing (3.18) gebruikt. Bij een volledig automatisch destillatieapparaat kan de automatische titratie van de ammoniak ook worden uitgevoerd met eindpuntsbepaling met een potentiometrisch pH-systeem. In dat geval wordt een automatische titrator met pH-meter gebruikt. De pH-meter moet door middel van gangbare ijkmethoden naar behoren geijkt zijn in het pH-gebied tussen 4 en 7. Het eindpunt van de titratie, het steilste punt in de titratiecurve (buigpunt) ligt bij pH 4,6. 5.4. Blancobepaling Om te bevestigen dat de reagentia vrij van stikstof zijn, wordt een blancobepaling (ontsluiting, destillatie en titratie) uitgevoerd met 1 g sacharose (3.14) in plaats van het monster. 6. Berekening van de resultaten De berekeningen worden uitgevoerd zoals aangegeven in punt 6.1 of 6.2. 6.1. Berekening voor titratie als beschreven in punt 5.3.1 Het gehalte aan ruw eiwit, uitgedrukt als massapercentage, wordt berekend met de volgende formule: waarbij: V0 = het volume (in ml) NaOH (3.10 of 3.11) dat in de blancobepaling is gebruikt; V1 = het volume (in ml) NaOH (3.10 of 3.11) dat in de titratie van het monster is gebruikt; c = de concentratie (in mol/l) natriumhydroxide (3.10 of 3.11); m = de massa (in g) van het monster. 6.2. Berekening voor titratie als beschreven in punt 5.3.2 6.2.1. Titratie met zoutzuur Het gehalte aan ruw eiwit, uitgedrukt als massapercentage, wordt berekend met de volgende formule: waarbij: m = de massa (in g) van het monster; c = de concentratie (in mol/l) van het gestelde zoutzuur (3.19); V0 = het volume (in ml) zoutzuur dat in de blancobepaling is gebruikt; V1 = het volume (in ml) zoutzuur dat in de monsterbepaling is gebruikt. 6.2.2. Titratie met zwavelzuur Het gehalte aan ruw eiwit, uitgedrukt als massapercentage, wordt berekend met de volgende formule: waarbij: m = de massa (in g) van het analysemonster; c = de concentratie (in mol/l) van het gestelde zwavelzuur (3.6); V0 = het volume (in ml) zwavelzuur (3.6) dat voor de blancobepaling is gebruikt; V1 = het volume (in ml) zwavelzuur (3.6) dat voor de monsterbepaling is gebruikt. 7. Verificatie van de methode 7.1. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan: — 0,2 % absoluut voor ruweiwitgehalten van minder dan 20 %, — 1,0 % van het hoogste resultaat voor ruweiwitgehalten van 20 % tot 40 %, — 0,4 % absoluut voor ruweiwitgehalten van meer dan 40 %. 7.2. Nauwkeurigheid Voer de bepaling (ontsluiting, destillatie en titratie) uit op 1,5-2,0 g aceetanilide (3.13) in aanwezigheid van 1 g sacharose (3.14); 1 g aceetanilide verbruikt 14,80 ml zwavelzuur (3.5). Er moet ten minste 99 % worden teruggevonden. 8. Opmerkingen 8.1. De apparatuur kan tot het manuele, halfautomatische of automatische type behoren. Indien de ontsluitingsvloeistof tussen ontsluiting en destillatie overgebracht moet worden, mag er geen verlies optreden. Indien de recipiënt van de destillatieapparatuur niet voorzien is van een druppeltrechter, moet de natriumhydroxideoplossing langzaam langs de wand toegevoegd worden, onmiddellijk voordat de recipiënt met de koeler wordt verbonden. 8.2. Herhaal de bepaling met een grotere hoeveelheid zwavelzuur (3.4) dan hierboven vermeld, wanneer het materiaal tijdens het ontsluiten vast wordt. 8.3. Voor producten met een laag stikstofgehalte kan het volume zwavelzuur (3.7) dat in de opvangkolf wordt gebracht zo nodig worden verminderd tot 10 of 15 ml en met water tot 25 ml worden aangevuld. 8.4. Voor routineanalyse mogen andere analysemethoden worden gebruikt om het ruweiwitgehalte te bepalen, maar de in dit deel C beschreven kjeldahlmethode is de referentiemethode. Voor elke matrix afzonderlijk moet worden aangetoond dat met de alternatieve methode (bv. Dumas) dezelfde resultaten worden verkregen als met de referentiemethode. Aangezien de met de alternatieve methode verkregen resultaten ook na verificatie van de gelijkwaardigheid van beide methoden enigszins kunnen afwijken van de met de referentiemethode verkregen resultaten, moet in het analyseverslag worden vermeld welke methode voor de bepaling van het ruweiwitgehalte gebruikt is. D. BEPALING VAN UREUM 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan ureum in diervoeders. 2. Beginsel Het monster wordt onder toevoeging van een klaringsmiddel in water gesuspendeerd. De suspensie wordt gefiltreerd. In het filtraat wordt na toevoegen van 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) het gehalte aan ureum bepaald door meting van de extinctie bij een golflengte van 420 mm. 3. Reagentia 3.1. 4-Dimethylaminobenzaldehydoplossing: los 1,6 g 4-DMAB op in 100 ml ethanol 96 % en voeg 10 ml zoutzuur (ρ20 = 1,19 g/ml) toe. Het reagens is slechts twee weken houdbaar. 3.2. Carrez I-oplossing: los 21,9 g zinkacetaat, Zn(CH3COO)2·2H2O, en 3 g ijsazijn op in water. Vul met water aan tot 100 ml. 3.3. Carrez II-oplossing: los 10,6 g kaliumhexacyanoferraat(II), K4Fe(CN)6·3H2O, op in water. Vul met water aan tot 100 ml. 3.4. Actieve kool die geen ureum adsorbeert (controleer dit). 3.5. Ureum, oplossing van 0,1 % (m/V). 4. Apparatuur 4.1. Roteerapparaat met ongeveer 35-40 omwentelingen per minuut. 4.2. Reageerbuizen: 160 × 16 mm, met geslepen stop. 4.3. Spectrofotometer. 5. Werkwijze 5.1. Analyse van het monster Breng 2 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, en 1 g actieve kool (3.4) in een maatkolf van 500 ml. Voeg 400 ml water en 5 ml Carrez I-oplossing (3.2) toe, meng gedurende ongeveer 30 seconden en voeg 5 ml Carrez II-oplossing (3.3) toe. Laat gedurende 30 minuten mengen in het roteerapparaat. Vul vervolgens met water aan tot de streep, schud en filtreer. Pipetteer van het heldere en kleurloze filtraat 5 ml in een reageerbuis met geslepen stop, voeg 5 ml 4-DMAB-oplossing (3.1) toe en meng. Plaats de buis in een waterbad op 20 oC (± 4 oC). Meet na 15 minuten met de spectrofotometer de extinctie van de monsteroplossing bij 420 nm. Vergelijk het resultaat met de blanco-oplossing van de reagentia. 5.2. IJkgrafiek Breng in maatkolven van 100 ml resp. 1, 2, 4, 5 en 10 ml ureumoplossing (3.5), vul aan tot de streep met water (en meng). Pipetteer van elk van deze oplossingen 5 ml af, voeg hieraan telkens 5 ml 4-DMAB-oplossing (3.1) toe en meng. Meet de extinctie tegen een oplossing die 5 ml 4-DMAB en 5 ml water, vrij van ureum, bevat, zoals hierboven aangegeven. Stel een ijkgrafiek op. 6. Berekening van de resultaten Bepaal aan de hand van de ijkgrafiek de hoeveelheid ureum in het monster. Druk het resultaat uit als percentage van het monster. 7. Opmerkingen 7.1. Indien het gehalte aan ureum meer bedraagt dan 3 % wordt het monster teruggebracht tot 1 g, of het filtraat zodanig verdund dat in 500 ml niet meer dan 50 mg ureum aanwezig is. 7.2. Bij lage gehalten aan ureum moet meer analysemateriaal afgewogen worden, zo lang een helder en kleurloos filtraat wordt verkregen. 7.3. Indien het monster eenvoudige stikstofverbindingen bevat, zoals aminozuren, wordt de extinctie bij 435 nm gemeten. E. BEPALING VAN VLUCHTIGE STIKSTOFHOUDENDE BASEN I. DOOR MICRODIFFUSIE 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vluchtige stikstofhoudende basen, uitgedrukt als ammoniak, in diervoeders. 2. Beginsel Het monster wordt met water geëxtraheerd, de oplossing geklaard en gefiltreerd. De vluchtige stikstofhoudende basen worden met een kaliumcarbonaatoplossing door microdiffusie uitgedreven, in een boorzuuroplossing opgevangen en met zwavelzuur getitreerd. 3. Reagentia 3.1. Trichloorazijnzuur, oplossing van 20 % (m/V). 3.2. Indicator: los 33 mg broomkresolgroen en 65 mg methylrood op in 100 ml ethanol 95-96 % (V/V). 3.3. Boorzuuroplossing: los 10 g boorzuur op in 200 ml ethanol 95-96 % (V/V) en 700 ml water in een maatkolf van 1 liter. Voeg 10 ml indicator (3.2) toe. Meng en neutraliseer de oplossing zo nodig met natriumhydroxideoplossing tot zwak rood. 1 ml van deze oplossing kan maximaal 300 μg NH3 binden. 3.4. Verzadigde oplossing van kaliumcarbonaat: los 100 g kaliumcarbonaat op in 100 ml kokend water. Laat afkoelen en filtreer. 3.5. Zwavelzuur 0,01 mol/l. 4. Apparatuur 4.1. Roteerapparaat met ongeveer 35-40 omwentelingen per minuut. 4.2. Conwayschalen (zie figuur) van glas of kunststof. 4.3. Microburet, verdeeld tot in 1/100 ml. 5. Werkwijze Breng 10 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, met 100 ml water in een maatkolf van 200 ml en laat gedurende 30 minuten roteren. Voeg 50 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.1) toe, vul aan tot de streep met water, schud krachtig en filtreer door een vouwfilter. Pipetteer in het midden van de conwayschaal 1 ml boorzuuroplossing (3.3) en in de buitenring 1 ml filtraat van het monster. Sluit de schaal gedeeltelijk met het ingevette deksel. Breng dan snel in de buitenring 1 ml verzadigde kaliumcarbonaatoplossing (3.4) en sluit de schaal luchtdicht af. Manipuleer vervolgens voorzichtig met de schaal zodanig, dat de beide oplossingen in de buitenring gemengd worden. Laat dan ten minste gedurende 4 uur staan bij kamertemperatuur of gedurende 1 uur bij 40 oC. Titreer vervolgens de vluchtige basen in de boorzuuroplossing met zwavelzuur (3.5) met behulp van een microburet (4.3). Verricht op gelijke wijze een blancobepaling zonder analysemateriaal. 6. Berekening van de resultaten 1 ml H2SO40,01 mol/l komt overeen met 0,34 mg ammoniak. Druk het resultaat uit als percentage van het monster. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan: — 10 % relatief bij gehalten aan ammoniak van minder dan 1,0 %; — 0,1 % absoluut bij gehalten aan ammoniak van 1,0 % of meer. 7. Opmerking Indien het gehalte aan ammoniak in het monster meer bedraagt dan 0,6 % wordt het oorspronkelijke filtraat verdund. II. DOOR DESTILLATIE 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan vluchtige stikstofhoudende basen, uitgedrukt als ammoniak, in vismelen die vrijwel geen ureum bevatten. De methode is alleen toepasbaar indien het gehalte aan ammoniak minder bedraagt dan 0,25 %. 2. Beginsel Het monster wordt met water geëxtraheerd, de oplossing geklaard en gefiltreerd. Na toevoegen van magnesiumoxide worden de vluchtige stikstofhoudende basen bij kooktemperatuur uitgedreven en opgevangen in een bekende hoeveelheid zwavelzuur. De overmaat zuur wordt teruggetitreerd met natriumhydroxideoplossing. 3. Reagentia 3.1. Trichloorazijnzuur, oplossing van 20 % (m/V). 3.2. Magnesiumoxide. 3.3. Antischuimemulsie (bv. siliconen). 3.4. Zwavelzuur 0,05 mol/l. 3.5. Natriumhydroxideoplossing 0,1 mol/l. 3.6. Methylroodoplossing 0,3 % in ethanol 95-96 % (V/V). 4. Apparatuur 4.1. Roteerapparaat met ongeveer 35-40 omwentelingen per minuut. 4.2. Destillatieapparatuur volgens Kjeldahl. 5. Werkwijze Breng 10 g van het monster, tot op 1 mg nauwkeurig gewogen, met 100 ml water in een maatkolf van 200 ml en laat gedurende 30 minuten roteren. Voeg 50 ml trichloorazijnzuuroplossing (3.1) toe, vul aan tot de streep met water, schud krachtig en filtreer door een vouwfilter. Breng van het heldere filtraat een bepaalde hoeveelheid — afhankelijk van het te verwachten gehalte aan vluchtige stikstofhoudende basen (in het algemeen 100 ml) — in de destillatiekolf. Verdun tot 200 ml en voeg 2 g magnesiumoxide (3.2) en enkele druppels antischuimemulsie (3.3) toe. De oplossing moet basisch reageren t.o.v. lakmoespapier; indien dit niet het geval is, moet meer magnesiumoxide (3.2) toegevoegd worden. Volg de in punt 5.2 of 5.3 beschreven methode voor het bepalen van het ruweiwitgehalte (deel C van deze bijlage). Verricht op gelijke wijze een blancobepaling zonder analysemateriaal. 6. Berekening van de resultaten 1 ml H2SO40,05 mol/l komt overeen met 1,7 mg ammoniak. Druk het resultaat uit als percentage van het monster. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer bedragen dan 10 % relatief. F. BEPALING VAN AMINOZUREN (MET UITZONDERING VAN TRYPTOFAAN) 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van de vrije (synthetische en natuurlijke) aminozuren en de totale hoeveelheid (vrije en in peptiden gebonden) aminozuren in diervoeders, waarbij gebruik wordt gemaakt van een aminozuuranalysator. De methode kan worden gebruikt voor bepaling van de volgende aminozuren: cysteïne/cystine, methionine, lysine, threonine, alanine, arginine, asparaginezuur, glutaminezuur, glycine, histidine, isoleucine, leucine, fenylalanine, proline, serine, tyrosine en valine. Deze methode maakt geen onderscheid tussen het aminozuur zelf en de zouten ervan, en kan niet differentiëren tussen de D- en L-vorm van aminozuren. De methode kan niet worden gebruikt voor de bepaling van tryptofaan of van hydroxyanalogen van aminozuren. 2. Beginsel 2.1. Vrije aminozuren De vrije aminozuren worden met verdund zoutzuur geëxtraheerd. Stikstofhoudende macromoleculen die meekomen bij de extractie worden geprecipiteerd met sulfosalicylzuur en door filtratie verwijderd. De pH van de gefiltreerde oplossing wordt op 2,20 gebracht. De aminozuren worden gescheiden door ionenwisselingschromatografie, en na reactie met ninhydrine bepaald door fotometrische detectie bij 570 nm. 2.2. Totaal aminozuurgehalte De gekozen werkwijze is afhankelijk van de te onderzoeken aminozuren. Cysteïne/cystine en methionine moeten vóór hydrolyse tot resp. cysteïnezuur en methioninesulfon worden geoxideerd. Tyrosine moet worden bepaald in hydrolysaten van niet-geoxideerde monsters. Alle andere aminozuren die in punt 1 zijn genoemd kunnen zowel in geoxideerde als in niet-geoxideerde monsters worden bepaald. De oxidatie wordt uitgevoerd bij 0 oC met een mengsel van permierenzuur en fenol. Overmaat oxidatiemiddel wordt ontleed met dinatriumdisulfiet. Het geoxideerde of niet-geoxideerde monster wordt gedurende 23 uur gehydrolyseerd met zoutzuur (3.20). De pH van het hydrolysaat wordt op 2,20 gebracht. De aminozuren worden door ionenwisselingschromatografie van elkaar gescheiden en worden bepaald door reactie met ninhydrine gevolgd door fotometrische detectie bij 570 nm (440 nm voor proline). 3. Reagentia Er moet dubbel gedestilleerd water of water van vergelijkbare kwaliteit worden gebruikt (geleidbaarheid < 10 μS). 3.1. Waterstofperoxide, w = 30 % (m/m). 3.2. Mierenzuur, w = 98-100 % (m/m). 3.3. Fenol. 3.4. Dinatriumdisulfiet. 3.5. Natriumhydroxide. 3.6. 5-Sulfosalicylzuur-dihydraat. 3.7. Zoutzuur, d = 1,18 g/ml (ongeveer). 3.8. Trinatriumcitraat-dihydraat. 3.9. 2,2′-Thiodiethanol (thiodiglycol). 3.10. Natriumchloride. 3.11. Ninhydrine. 3.12. Petroleumether, kooktraject 40-60 oC. 3.13. Norleucine, of een andere verbinding die kan dienen als interne standaard. 3.14. Stikstofgas (< 10 ppm zuurstof). 3.15. Octaan-1-ol. 3.16. Aminozuren. 3.16.1. Standaardverbindingen als genoemd in punt 1. Zuivere verbindingen, zonder kristalwater. Vóór gebruik gedurende een week drogen in vacuüm boven P2O5 of H2SO4. 3.16.2. Cysteïnezuur. 3.16.3. Methioninesulfon. 3.17. Natriumhydroxideoplossing, c = 7,5 mol/l: Los 300 g NaOH (3.5) op in water en vul aan tot 1 liter. 3.18. Natriumhydroxideoplossing, c = 1 mol/l: Los 40 g NaOH (3.5) op in water en vul aan tot 1 liter. 3.19. Mierenzuur-fenoloplossing: Meng 889 g mierenzuur (3.2) met 111 g water en voeg 4,73 g fenol (3.3) toe. 3.20. Hydrolysemengsel, c = 6 mol HCl/l met 1 g fenol/l: Voeg 1 g fenol (3.3) toe aan 492 ml HCl (3.7) en vul aan met water tot 1 liter. 3.21. Extractiemengsel, c = 0,1 mol HCl/l met 2 % thiodiglycol: neem 8,2 ml HCl (3.7), meng met circa 900 ml water, voeg 20 ml thiodiglycol (3.9) toe en vul aan met water tot 1 liter (meng 3.7 en 3.9 niet direct). 3.22. 5-Sulfosalicylzuuroplossing, β = 6 %: Los 60 g 5-sulfosalicylzuur (3.6) op in water en vul aan met water tot 1 liter. 3.23. Oxidatiemengsel (permierenzuur-fenol): Meng in een klein bekerglas 0,5 ml waterstofperoxide (3.1) met 4,5 ml mierenzuur-fenoloplossing (3.19). Incubeer gedurende 1 uur bij 20-30 oC zodat er permierenzuur wordt gevormd, en koel vervolgens in een ijsbad met smeltend ijs (15 minuten) voordat de vloeistof aan het monster wordt toegevoegd. Voorzichtig: vermijd aanraking met de huid en draag beschermende kleding. 3.24. Citraatbuffer, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Los 19,61 g natriumcitraat (3.8), 5 ml thiodiglycol (3.9), 1 g fenol (3.3) en 16,50 ml HCl (3.7) op in ongeveer 800 ml water. Breng de pH op 2,20. Vul aan met water tot 1 liter. 3.25. Elutiebuffers, bereid overeenkomstig de voorschriften voor de gebruikte analysator (4.9). 3.26. Ninhydrinereagens, bereid overeenkomstig de voorschriften voor de gebruikte analysator (4.9). 3.27. Standaardaminozuuroplossingen. Deze oplossingen moeten worden bewaard bij een temperatuur van minder dan 5 oC. 3.27.1. Stamoplossing van aminozuren (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml van elk aminozuur in zoutzuur. Commercieel verkrijgbaar. 3.27.2. Stamoplossing van cysteïnezuur en methioninesulfon, c = 1,25 μmol/ml. Los 0,2115 g cysteïnezuur (3.16.2) en 0,2265 g methioninesulfon (3.16.3) op in citraatbuffer (3.24) in een maatkolf van 1 liter, en vul aan tot de streep met citraatbuffer. Bewaar, niet langer dan twaalf maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC. Deze oplossing wordt niet gebruikt wanneer de stamoplossing (3.27.1) cysteïnezuur en methioninesulfon bevat. 3.27.3. Stamoplossing van de interne standaard, bv. norleucine, c = 20 μmol/ml. Los 0,6560 g norleucine (3.13) op in citraatbuffer (3.24) in een maatkolf van 250 ml en vul aan tot de streep met citraatbuffer. Bewaar, niet langer dan zes maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC. 3.27.4. Standaardaminozuurijkoplossing voor gebruik bij hydrolysaten, c = 5 nmol/50 μl cysteïnezuur en methioninesulfon, en c = 10 nmol/50 μl van de andere aminozuren. Los 2,2 g natriumchloride (3.10) op in een 100 ml bekerglas met 30 ml citraatbuffer (3.24). Voeg 4,00 ml stamoplossing van aminozuren (3.27.1) toe, 4,00 ml stamoplossing van cysteïnezuur en methioninesulfon (3.27.2), en — indien van toepassing — 0,50 ml stamoplossing van de interne standaard (3.27.3). Breng de pH met natriumhydroxideoplossing (3.18) op 2,20. Breng kwantitatief over in een maatkolf van 50 ml, vul aan tot de streep met citraatbuffer (3.24) en meng. Bewaar, niet langer dan drie maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC. Zie ook de opmerkingen in punt 9.1. 3.27.5. Standaardaminozuurijkoplossing voor gebruik bij hydrolysaten, bereid volgens punt 5.3.3.1, en voor gebruik bij extracten (5.2). De ijkoplossing wordt bereid als beschreven in 3.27.4, met weglating van natriumchloride. Bewaar, niet langer dan drie maanden, bij een temperatuur van minder dan 5 oC. 4. Apparatuur 4.1. Rondbodemkolf, 100 of 250 ml, met terugvloeikoeler. 4.2. Fles van borosilicaatglas, 100 ml, met schroefdop voorzien van rubber/teflon inlay (bv. Duran, Schott) voor gebruik in de oven. 4.3. Oven met geforceerde ventilatie en temperatuurregulering, nauwkeuriger dan ± 2 oC. 4.4. pH-meter (in drie decimalen afleesbaar). 4.5. Membraanfilter, 0,22 μm. 4.6. Centrifuge. 4.7. Rotatieverdamper. 4.8. Schudapparaat of magneetroerder. 4.9. Aminozuuranalysator of HPLC-apparatuur met ionenwisselingskolom, onderdeel voor de ninhydrinereactie, nakolomsderivatisering en fotometrische detector. De kolom wordt gevuld met gesulfoneerd polystyreenhars waarop aminozuren van elkaar en van ander ninhydrinepositief materiaal worden gescheiden. Het debiet van buffer en ninhydrine wordt gereguleerd door pompen met een nauwkeurigheid van ±0,5 %, zowel tijdens de standaardijking als tijdens de analyse van het monster. Bij sommige aminozuuranalysatoren kunnen hydrolysemethoden worden gebruikt waarbij het hydrolysaat een natriumconcentratie heeft van c = 0,8 mol/l, terwijl ook al het uit de oxidatiestap overgebleven mierenzuur nog aanwezig is. Andere analysatoren geven geen goede scheiding van bepaalde aminozuren in hydrolysaten met een overmaat mierenzuur en/of een hoge natriumconcentratie. In zulke gevallen wordt het volume zuur gereduceerd door verdamping tot ongeveer 5 ml na hydrolyse en vóór instelling van de juiste pH. De verdamping gebeurt onder vacuüm bij ten hoogste 40 oC. 5. Werkwijze 5.1. Monstervoorbereiding Het monster wordt gemalen tot de deeltjes een zeef met een maaswijdte van 0,5 mm passeren. Monsters met een hoog vochtgehalte moeten voor het malen eerst worden gevriesdroogd, of aan de lucht gedroogd bij ten hoogste 50 oC. Monsters met een hoog vetgehalte moeten voor het malen worden geëxtraheerd met petroleumether (3.12). 5.2. Bepaling van vrije aminozuren in diervoeders en voormengsels Weeg een geschikte hoeveelheid (1-5 g) van het voorbewerkte monster (5.1) op 0,2 mg nauwkeurig af in een erlenmeyer en voeg 100,0 ml extractiemengsel (3.21) toe. Schud of roer het mengsel gedurende 60 minuten in een schudapparaat of met een magneetroerder (4.8). Laat het neerslag bezinken en pipetteer 10,0 ml van de bovenstaande vloeistof in een bekerglas van 100 ml. Voeg onder aanhoudend roeren 5,0 ml sulfosalicylzuuroplossing (3.22) toe, en roer nog 5 minuten door op de magneetroerder. Filtreer of centrifugeer de bovenstaande vloeistof om eventueel aanwezig neerslag te verwijderen. Breng 10,0 ml van de verkregen oplossing in een bekerglas van 100 ml op pH 2,20 met natriumhydroxideoplossing (3.18), spoel de oplossing met citraatbuffer (3.24) in een maatkolf van geschikt volume, en vul aan tot de streep met bufferoplossing (3.24). Voeg, als er een interne standaard wordt gebruikt, 1,00 ml interne standaard (3.27.3) toe per 100 ml eindoplossing en vul aan tot de streep met bufferoplossing (3.24). Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4. Als chromatografie van de extracten niet dezelfde dag mogelijk is, moeten zij worden bewaard bij een temperatuur van minder dan 5 oC. 5.3. Bepaling van de totale hoeveelheid aminozuren 5.3.1. Oxidatie Weeg een 0,1-1 g van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 0,2 mg nauwkeurig af in: — een rondbodemkolf van 100 ml (4.1) in geval van open hydrolyse (5.3.2.3), of — een rondbodemkolf van 250 ml (4.1) als een lage natriumconcentratie vereist wordt (5.3.3.1), of — een fles van 100 ml met schroefdop (4.2) voor gesloten hydrolyse (5.3.2.4). De ingewogen hoeveelheid monster moet een stikstofgehalte van ongeveer 10 mg hebben en mag niet meer dan 100 mg vocht bevatten. Breng de kolf/fles in een ijsbad met smeltend ijs op 0 oC, voeg 5 ml oxidatiemengsel (3.23) toe en meng met een gebogen glazen spatel. Sluit de kolf/fles met de spatel erin af met luchtdichte folie en zet het ijsbad met het gesloten vat gedurende 16 uur in een koelkast bij 0 oC. Neem de kolf/fles na 16 uur uit de koelkast en ontleed de overmaat oxidatiereagens door 0,84 g dinatriumdisulfiet (3.4) toe te voegen. Ga verder met 5.3.2.1. 5.3.2. Hydrolyse 5.3.2.1. Hydrolyse van geoxideerde monsters Voeg aan het volgens 5.3.1 geoxideerde monster 25 ml hydrolysemengsel (3.20) toe, waarbij zorgvuldig alle sporen van het mengsel van de wand van het vat en van de spatel worden gespoeld. Ga, afhankelijk van de gebruikte hydrolyseprocedure, verder met 5.3.2.3 of 5.3.2.4. 5.3.2.2. Hydrolyse van niet-geoxideerde monsters Weeg 0,1-1 g van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 0,2 mg nauwkeurig af in een rondbodemkolf van 100 ml of 250 ml (4.1) of in een fles met schroefdop van 100 ml (4.2). De ingewogen hoeveelheid monster moet een stikstofgehalte van ongeveer 10 mg hebben. Voeg voorzichtig 25 ml hydrolysemengsel (3.20) toe en meng met het monster. Ga verder met punt 5.3.2.3 of punt 5.3.2.4. 5.3.2.3. Open hydrolyse Doe drie glasparels bij het mengsel (bereid volgens 5.3.2.1 of 5.3.2.2) en kook gedurende 23 uur in een kolf voorzien van een terugvloeikoeler. Spoel, na beëindiging van de hydrolyse, de koeler schoon met 5 ml citraatbuffer (3.24). Neem de koeler van de kolf en plaats de kolf in een ijsbad. Ga verder met 5.3.3. 5.3.2.4. Gesloten hydrolyse Zet de fles met het volgens 5.3.2.1 of 5.3.2.2 bereide mengsel in een oven (4.3) bij 110 oC. Laat gedurende het eerste uur de schroefdop los op de fles staan, om te voorkomen dat zich druk opbouwt als gevolg van gasvorming en om explosies te voorkomen. Sluit de fles niet af met de dop. Draai de dop na een uur op de fles en laat deze gedurende 23 uur in de oven (4.3) staan. Neem de fles uit de oven als de hydrolyse is voltooid, draai de dop voorzichtig van de fles en zet deze in een bad met smeltend ijs. Laat afkoelen. Breng, afhankelijk van de manier waarop de pH wordt ingesteld (5.3.3), de inhoud van de fles met behulp van citraatbuffer (3.24) kwantitatief over in een bekerglas of rondbodemkolf van 250 ml. Ga verder met 5.3.3. 5.3.3. Aanpassen van de pH Ga verder met aanpassing van de pH volgens 5.3.3.1 of 5.3.3.2, afhankelijk van de natriumtolerantie van de aminozuuranalysator (4.9). 5.3.3.1. Chromatografiesystemen (4.9) die een lage natriumconcentratie vereisen Bij aminozuuranalysatoren die een lage natriumconcentratie vereisen (en waarbij het volume zuur wordt ingedampt) wordt aanbevolen een stamoplossing van de interne standaard (3.27.3) te gebruiken. Voeg in dit geval vóór het indampen 2,00 ml van de stamoplossing van de interne standaard (3.27.3) toe aan het hydrolysaat. Voeg twee druppels octaan-1-ol (3.15) toe aan het hydrolysaat, verkregen volgens 5.3.2.3 of 5.3.2.4. Breng met een rotatieverdamper (4.7) onder vacuüm bij 40 oC het volume terug tot 5-10 ml. Wordt het eindvolume per ongeluk kleiner dan 5 ml, dan moet het hydrolysaat worden weggegooid en de analyse opnieuw worden ingezet. Breng de pH op 2,20 met natriumhydroxideoplossing (3.18) en ga verder met 5.3.4. 5.3.3.2. Alle andere aminozuuranalysatoren (4.9) Neem het volgens 5.3.2.3 of 5.3.2.4 verkregen hydrolysaat en neutraliseer het ten dele door voorzichtig, onder roeren, 17 ml natriumhydroxideoplossing (3.17) toe te voegen; let op dat de temperatuur niet hoger wordt dan 40 oC. Breng de pH op 2,20 bij kamertemperatuur met natriumhydroxideoplossing (3.17) en daarna natriumhydroxideoplossing (3.18). Ga verder met 5.3.4. 5.3.4. Monsteroplossing voor chromatografie Breng het op pH gebrachte hydrolysaat (5.3.3.1 of 5.3.3.2) met citraatbuffer (3.24) kwantitatief over in een 200 ml maatkolf en vul aan tot de streep met buffer (3.24). Als er nog geen interne standaard is gebruikt, voeg dan nu 2,00 ml interne standaard (3.27.3) toe en vul aan tot de streep met citraatbuffer (3.24). Meng goed. Ga verder met de chromatografiestap (5.4). Als chromatografie van de monsteroplossingen niet dezelfde dag mogelijk is, moeten zij worden bewaard bij een temperatuur van minder dan 5 oC. 5.4. Chromatografie Laat het extract (5.2) of hydrolysaat (5.3.4) voor de chromatografische bepaling op kamertemperatuur komen. Schud het mengsel en filtreer een geschikte hoeveelheid door een 0,22 μm membraanfilter (4.5). De resulterende heldere oplossing wordt gebruikt voor ionenwisselingschromatografie met behulp van een aminozuuranalysator (4.9). Injectie kan met de hand worden gedaan of automatisch. Het is van belang dat steeds dezelfde hoeveelheid oplossing ±0,5 % op de kolom wordt gebracht voor analyse van standaarden en monsters — tenzij er een interne standaard wordt gebruikt — en dat de verhouding natrium/aminozuur in standaard- en monsteroplossingen onderling zo veel mogelijk overeenkomen. Hoe vaak er ijkbepalingen nodig zijn is afhankelijk van de stabiliteit van het ninhydrinereagens en van het analytische systeem in het algemeen. Standaarden en monsters worden zodanig met citraatbuffer (3.24) verdund dat de standaard een piekoppervlakte levert die 30-200 % bedraagt van de piekoppervlakte van het monster. Er zal een zekere variabiliteit zitten in de chromatografie van aminozuren, afhankelijk van het type analysator en de gebruikte soort hars. Het systeem waarvoor wordt gekozen moet de aminozuren van elkaar en van andere ninhydrinepositieve stoffen kunnen scheiden. Binnen het bepalingsbereik moet het chromatografiesysteem een lineaire respons geven op veranderingen in de hoeveelheid aminozuren die op de kolom worden gebracht. Er moeten bij de chromatografische analyse van een equimolaire oplossing van de te bepalen aminozuren dal/piekratio’s worden verkregen die overeenkomen met de hieronder genoemde. Deze equimolaire oplossing moet ten minste 30 % bevatten van de maximale hoeveelheid van elk aminozuur die met het aminozuuranalysesysteem (4.9) nog nauwkeurig kan worden bepaald. Voor scheiding van threonine en serine mag de dal/piekratio voor de kleinste piek van de twee overlappende aminozuren op het chromatogram niet meer bedragen dan 2:10. (Als alleen cysteïne/cystine, methionine, threonine en lysine worden bepaald, wordt de nauwkeurigheid van de bepaling ongunstig beïnvloed door onvoldoende scheiding van aangrenzende pieken.) Voor alle andere aminozuren moet de scheiding beter zijn dan 1:10. Het systeem moet lysine van „lysineartefacten” en van ornithine kunnen scheiden. 6. Berekening van de resultaten De piekoppervlakte van monster en standaard wordt voor elk aminozuur afzonderlijk bepaald en het gehalte (X), uitgedrukt als g aminozuur per kg monster, wordt berekend. Vermenigvuldig bij gebruik van een interne standaard met: A = piekoppervlakte van hydrolysaat of extract; B = piekoppervlakte van standaardijkoplossing; C = piekoppervlakte van interne standaard in hydrolysaat of extract; D = piekoppervlakte van interne standaard, standaardijkoplossing; M = molecuulgewicht van het te bepalen aminozuur; c = concentratie standaard in μmol/ml; m = massa monster (g) (gecorrigeerd tot oorspronkelijke massa indien gedroogd of ontvet); V = ml totaal hydrolysaat (5.3.4) of ml berekend totaal verdunningsvolume van het extract (6.1). Cystine en cysteïne worden in hydrolysaten van geoxideerde monsters beide bepaald als cysteïnezuur, maar berekend als cystine (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol) door een molecuulgewicht van 120,15 (= 0,5 × 240,30 g/mol) te nemen. Methionine wordt in hydrolysaten van geoxideerd monster bepaald als methioninesulfon, maar berekend als methionine met gebruikmaking van het molecuulgewicht van methionine: 149,21 g/mol. Toegevoegd vrij methionine wordt na extractie bepaald als methionine; voor de berekening wordt hetzelfde molecuulgewicht gebruikt. 6.1. Het totale verdunningsvolume van extracten (F) voor de bepaling van vrije aminozuren (5.2) wordt als volgt berekend: V = eindvolume van het extract. 7. Evaluatie van de methode De methode is in 1990 getest in een internationaal ringonderzoek, waarvoor vier soorten diervoeders zijn gebruikt (mengvoer voor varkens, slachtkuikenvoer, eiwitconcentraat, voormengsel). De waarden, na eliminatie van uitschieters, van gemiddelde en standaardafwijking worden gegeven in de hierna volgende tabellen: Gemiddelden in g/kg Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Slachtkuikenvoer 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Eiwitconcentraat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Voormengsel 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria. 7.1. Herhaalbaarheid De herhaalbaarheid, uitgedrukt als intralaboratoriumstandaardafwijking, van bovengenoemd ringonderzoek wordt weergegeven in onderstaande tabellen: Intralaboratoriumstandaardafwijking (Sr) in g/kg Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Slachtkuikenvoer 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Eiwitconcentraat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Voormengsel 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.

Variatiecoëfficiënt (%) van de intralaboratoriumstandaardafwijking (Sr) Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Slachtkuikenvoer 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Eiwitconcentraat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Voormengsel 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria. 7.2. Reproduceerbaarheid De waarden van de interlaboratoriumstandaardafwijking, verkregen in bovengenoemd ringonderzoek worden weergegeven in onderstaande tabel: Interlaboratoriumstandaardafwijking (SR) in g/kg Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Slachtkuikenvoer 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Eiwitconcentraat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Voormengsel 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria.

Variatiecoëfficiënt (%) van de interlaboratoriumstandaardafwijking (SR) Referentiemateriaal Aminozuur Threonine Cysteïne/cystine Methionine Lysine Varkensmengvoer 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Slachtkuikenvoer 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Eiwitconcentraat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Voormengsel 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = aantal deelnemende laboratoria. 8. Gebruik van referentiematerialen Of de methode op de juiste manier is toegepast dient te worden geverifieerd door herhaalde bepaling van gecertificeerde referentiematerialen, voor zover beschikbaar. Aanbevolen wordt de ijking uit te voeren met gecertificeerde aminozuurijkoplossingen. 9. Opmerkingen 9.1. In verband met verschillen tussen aminozuuranalysatoren moeten de uiteindelijke concentraties van de ijkoplossingen van standaardaminozuren (3.27.4 en 3.27.5) en van het hydrolysaat (5.3.4) als richtsnoer worden beschouwd. Het lineaire meetbereik van het apparaat moet voor alle aminozuren worden gecontroleerd. De standaardoplossing wordt zodanig verdund met citraatbuffer dat pieken in het midden van het bereik worden verkregen. 9.2. Indien HPLC-apparatuur wordt gebruikt voor de analyse van de hydrolysaten moeten de proefomstandigheden worden geoptimaliseerd overeenkomstig de aanbevelingen van de leverancier. 9.3. Bij toepassing van de methode op diervoeders die meer dan 1 % chloride bevatten (krachtvoer, minerale voeders, aanvullende diervoeders) is het mogelijk dat voor methionine een te lage waarde wordt gemeten en is een speciale behandeling vereist. G. BEPALING VAN TRYPTOFAAN 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan en de hoeveelheid vrij tryptofaan in diervoeders. Zij maakt geen onderscheid tussen de D- en de L-vorm. 2. Beginsel Voor de bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan wordt het monster onder basische condities gehydrolyseerd met een verzadigde bariumhydroxideoplossing en gedurende 20 uur tot 110 oC verhit. Na de hydrolyse wordt er een interne standaard toegevoegd. Voor de bepaling van de hoeveelheid vrij tryptofaan wordt het monster onder licht zure condities geëxtraheerd in aanwezigheid van een interne standaard. Het tryptofaan en de interne standaard in het hydrolysaat of extract worden bepaald door HPLC met fluorescentiedetectie. 3. Reagentia 3.1. Er dient dubbel gedestilleerd water of water van gelijkwaardige kwaliteit te worden gebruikt (conductiviteit < 10 μS/cm). 3.2. Standaardstof: tryptofaan (zuiverheid/gehalte ≥ 99 %), gedroogd onder vacuüm boven difosforpentaoxide. 3.3. Interne standaard: α-methyltryptofaan (zuiverheid/gehalte ≥ 99 %), gedroogd onder vacuüm boven difosforpentaoxide. 3.4. Bariumhydroxide-octahydraat (er dient op te worden toegezien dat Ba(OH)2·8H2O niet langdurig aan lucht wordt blootgesteld om de vorming van BaCO3 te voorkomen; dit zou de bepaling kunnen storen) (zie opmerking 9.3). 3.5. Natriumhydroxide. 3.6. Orthofosforzuur, w = 85 % (m/m). 3.7. Zoutzuur, ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Methanol, HPLC-kwaliteit of gelijkwaardig. 3.9. Petroleumether, kooktraject 40-60 oC. 3.10. Natriumhydroxideoplossing, c = 1 mol/l: Los 40,0 g NaOH (3.5) op in water en vul met water aan tot 1 liter (3.1). 3.11. Zoutzuur, c = 6 mol/l: Neem 492 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter. 3.12. Zoutzuur, c = 1 mol/l: Neem 82 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter. 3.13. Zoutzuur, c = 0,1 mol/l: Neem 8,2 ml HCl (3.7) en vul met water aan tot 1 liter. 3.14. Orthofosforzuur, c = 0,5 mol/l: Neem 34 ml orthofosforzuur (3.6) en vul met water (3.1) aan tot 1 liter. 3.15. Geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Los 0,2553 g tryptofaan (3.2) in een maatkolf van 500 ml op in zoutzuur (3.13) en vul aan tot de streep met zoutzuur (3.13). Gedurende maximaal vier weken houdbaar bij -18 oC. 3.16. Geconcentreerde internestandaardoplossing, c = 2,50 μmol/ml: Los 0,2728 g α-methyltryptofaan (3.3) in een maatkolf van 500 ml op in zoutzuur (3.13) en vul aan tot de streep met zoutzuur (3.13). Gedurende maximaal vier weken houdbaar bij -18 oC. 3.17. IJkstandaardoplossing van tryptofaan en interne standaard: Neem 2,00 ml geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15) en 2,00 ml geconcentreerde internestandaardoplossing (α-methyltryptofaan) (3.16). Verdun met water (3.1) en methanol (3.8) tot ongeveer hetzelfde volume en ongeveer dezelfde methanolconcentratie (10-30 %) als het eindhydrolysaat. Deze oplossing moet vóór gebruik vers worden bereid. Bescherm tijdens de bereiding tegen direct zonlicht. 3.18. Azijnzuur. 3.19. 1,1,1-Trichloor-2-methylpropaan-2-ol 3.20. Ethanolamine, m > 98 % (m/m). 3.21. Oplossing van 1 g 1,1,1-trichloor-2-methylpropaan-2-ol (3.19) in 100 ml methanol (3.8). 3.22. Mobiele fase voor HPLC: 3,00 g azijnzuur (3.18) + 900 ml water (3.1) +50,0 ml oplossing (3.21) van 1,1,1-trichloor-2-methylpropaan-2-ol (3.19) in methanol (3.8) (1 g/100 ml). Breng de pH met ethanolamine (3.20) op 5,00. Vul aan met water tot 1 000 ml (3.1). 4. Apparatuur 4.1. HPLC-apparatuur met een spectrofluorimetrische detector. 4.2. HPLC-kolom: 125 mm × 4 mm, C18, vulling van 3 μm, of een gelijkwaardige kolom. 4.3. pH-meter. 4.4. Polypropyleenkolf, inhoud 125 ml, met brede hals en schroefdop. 4.5. Membraanfilter, 0,45 μm. 4.6. Autoclaaf 110 (± 2) oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7. Schudapparaat of magneetroerder. 4.8. Vortexmenger. 5. Werkwijze 5.1. Monstervoorbewerking Het monster wordt gemalen tot de deeltjes een zeef met een maaswijdte van 0,5 mm passeren. Monsters met een hoog vochtgehalte moeten voor het malen eerst worden gevriesdroogd, of aan de lucht gedroogd bij ten hoogste 50 oC. Monsters met een hoog vetgehalte dienen voorafgaand aan het malen te worden geëxtraheerd met petroleumether (3.9). 5.2. Bepaling van de hoeveelheid vrij tryptofaan (extract) Weeg een geschikte hoeveelheid (1-5 g) van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 1 mg nauwkeurig af in een erlenmeyer. Voeg 100,0 ml zoutzuur (3.13) en 5,00 ml geconcentreerde internestandaardoplossing (3.16) toe. Schud of meng gedurende 60 minuten met behulp van een schudapparaat of een magneetroerder (4.7). Laat het bezinksel neerslaan en pipetteer 10,0 ml van de bovenstaande oplossing in een bekerglas. Voeg 5 ml orthofosforzuur (3.14) toe. Breng de pH met natriumhydroxide (3.10) op 3. Voeg voldoende methanol (3.8) toe om een methanolconcentratie tussen 10 en 30 % in het eindvolume te verkrijgen. Breng over in een maatkolf met een geschikt volume en verdun met water tot een volume dat is vereist voor de chromatografie (bij benadering hetzelfde volume als de ijkstandaardoplossing (3.17)). Filtreer een paar ml van de oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm (4.5) vóór injectie in de HPLC-kolom. Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4. Bescherm de standaardoplossing en extracten tegen direct zonlicht. Als het niet mogelijk is de extracten dezelfde dag te analyseren, kunnen ze gedurende maximaal drie dagen bij 5 oC worden bewaard. 5.3. Bepaling van de totale hoeveelheid tryptofaan (hydrolysaat) Weeg 0,1-1 g van het voorbewerkte monster (5.1) tot op 0,2 mg nauwkeurig af in de polypropyleenmaatkolf (4.4). De ingewogen hoeveelheid monster moet een stikstofgehalte hebben van ongeveer 10 mg. Voeg 8,4 g bariumhydroxide-octahydraat (3.4) en 10 ml water toe. Meng in een vortexmenger (4.8) of magneetroerder (4.7). Laat de magneet met tefloncoating in het mengsel zitten. Spoel de wanden van het vat af met 4 ml water. Plaats de schroefdop erop en sluit de maatkolf losjes. Breng over in een autoclaaf (4.6) met kokend water en laat het geheel 30-60 minuten stomen. Sluit de autoclaaf en autoclaveer gedurende 20 uur bij 110 (± 2) oC. Breng de temperatuur terug tot iets onder 100 oC alvorens de autoclaaf te openen. Voeg 30 ml water op kamertemperatuur aan het warme mengsel toe om uitkristalliseren van Ba(OH)2·8H2O tegen te gaan. Schud of roer voorzichtig. Voeg 2,00 ml geconcentreerde internestandaardoplossing (α-methyltryptofaan) (3.16) toe. Laat de vaten gedurende 15 minuten in een water/ijsbad afkoelen. Voeg 5 ml orthofosforzuur (3.14) toe. Laat het vat in het koelbad, neutraliseer al roerend met zoutzuur (3.11) en breng de pH met zoutzuur (3.12) op 3,0. Voeg voldoende methanol toe om een methanolconcentratie tussen 10 en 30 % in het eindvolume te verkrijgen. Breng over in een maatkolf met een geschikt volume en verdun met water tot het volume dat voor de chromatografie vereist is (bv. 100 ml). Toevoeging van methanol mag geen neerslag veroorzaken. Filtreer een paar ml van de oplossing door een membraanfilter van 0,45 μm (4.5) vóór injectie in de HPLC-kolom. Ga verder met de chromatografiestap volgens 5.4. Bescherm de standaardoplossing en de hydrolysaten tegen direct zonlicht. Als het niet mogelijk is de hydrolysaten dezelfde dag te analyseren, kunnen ze gedurende maximaal drie dagen bij 5 oC worden bewaard. 5.4. HPLC-bepaling De volgende condities voor isocratische elutie worden als leidraad aangegeven; er mogen andere parameters worden gebruikt mits hiermee gelijkwaardige resultaten worden verkregen (zie ook de opmerkingen in punt 9.1 en 9.2): HPLC-kolom (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, vulling van 3 μm, of gelijkwaardig; kolomtemperatuur: kamertemperatuur; mobiele fase (3,22): 3,00 g azijnzuur (3.18) + 900 ml water (3.1) +50,0 ml oplossing (3.21) van 1,1,1-trichloor-2-methylpropaan-2-ol (3.19) in methanol (3.8) (1 g/100 ml). Breng de pH op 5,00 met ethanolamine (3.20). Vul aan tot 1 000 ml met water (3.1); elutiesnelheid: 1 ml/min; benodigde tijd: ongeveer 34 minuten; detectiegolflengte: excitatie: 280 nm, emissie: 356 nm; injectievolume 20 μl. 6. Berekening van de resultaten De hoeveelheid tryptofaan (X) in g per 100 g monster wordt berekend met de volgende formule: A = piekoppervlakte van interne standaard, ijkstandaardoplossing (3.17); B = piekoppervlakte van tryptofaan, extract (5.2) of hydrolysaat (5.3); V1 = volume in ml (2 ml) van geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15), toegevoegd aan de ijkoplossing (3.17); c = concentratie in μmol/ml (= 2,50) van geconcentreerde tryptofaanoplossing (3.15), toegevoegd aan de ijkoplossing (3.17); V2 = volume in ml van geconcentreerde internestandaardoplossing (3.16), toegevoegd bij de extractie (5.2) (= 5,00 ml) of aan het hydrolysaat (5.3) (= 2,00 ml); C = piekoppervlakte van interne standaard, extract (5.2) of hydrolysaat (5.3); D = piekoppervlakte van tryptofaan, ijkstandaardoplossing (3.17); V3 = volume in ml (= 2,00 ml) van geconcentreerde internestandaardoplossing (3.16) toegevoegd aan de ijkstandaardoplossing (3.17); m = massa van het analysemonster in g (gecorrigeerd tot de oorspronkelijke massa indien gedroogd en/of ontvet); M = molecuulgewicht van tryptofaan (= 204,23 g/mol). 7. Herhaalbaarheid Het verschil tussen de resultaten van een duplobepaling mag niet meer dan 10 % van het hoogste resultaat bedragen. 8. Resultaten van een ringonderzoek In EG-verband is een ringonderzoek verricht (de vierde vergelijkende studie) waarbij drie monsters werden geanalyseerd door maximaal twaalf laboratoria om de hydrolysemethode te certificeren. De analyses werden voor elk monster vijfmaal uitgevoerd. De resultaten staan in de volgende tabel: monster 1 varkensvoer monster 2 varkensvoer met toegevoegd L-tryptofaan monster 3 varkenskrachtvoer L 12 12 12 n 50 55 50 Gemiddelde [g/kg] 2,42 3,40 4,22 Sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CVr [ %] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [ %] 6,3 6,0 2,2 L = aantal laboratoria die resultaten hebben ingestuurd; n = aantal afzonderlijke resultaten, na eliminatie van uitschieters (m.b.v. Cochran- en Dixon-toets); Sr = standaardafwijking van de herhaalbaarheid; SR = standaardafwijking van de reproduceerbaarheid; r = herhaalbaarheid; R = reproduceerbaarheid; CVr = variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid, in %; CVR = variatiecoëfficiënt van de reproduceerbaarheid, in %. Bij een ander ringonderzoek in EG-verband (de derde vergelijkende studie) werden twee monsters geanalyseerd door maximaal 13 laboratoria om de methode voor extractie van vrij tryptofaan te certificeren. De analyses werden voor elk monster vijfmaal uitgevoerd. De resultaten staan in de volgende tabel: monster 4 mengsel van tarwe en soja monster 5 mengsel van tarwe en soja (= monster 4) met toegevoegd tryptofaan (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Gemiddelde [g/kg] 0,391 0,931 Sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [ %] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [ %] 4,71 5,11 L = aantal laboratoria die resultaten hebben ingestuurd; n = aantal afzonderlijke resultaten, na eliminatie van uitschieters (m.b.v. Cochran- en Dixon-toets); Sr = standaardafwijking van de herhaalbaarheid; SR = standaardafwijking van de reproduceerbaarheid; r = herhaalbaarheid; R = reproduceerbaarheid; CVr = variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid, in %; CVR = variatiecoëfficiënt van de reproduceerbaarheid, in %. Bij een ander ringonderzoek in EG-verband werden vier monsters geanalyseerd door maximaal zeven laboratoria met als doel een tryptofaancertificatie voor hydrolyse. De resultaten staan in onderstaande tabel. De analyses werden voor elk monster vijfmaal uitgevoerd. monster 1 varkensmengvoer (CRM 117) monster 2 vismeel met laag vetgehalte (CRM 118) monster 3 sojameel (CRM 119) monster 4 mageremelkpoeder (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Gemiddelde [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 Sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = aantal laboratoria die resultaten hebben ingestuurd; n = aantal afzonderlijke resultaten, na eliminatie van uitschieters (m.b.v. Cochran- en Dixon-toets); Sr = standaardafwijking van de herhaalbaarheid; SR = standaardafwijking van de reproduceerbaarheid; r = herhaalbaarheid; R = reproduceerbaarheid; CVr = variatiecoëfficiënt van de herhaalbaarheid, in %; CVR = variatiecoëfficiënt van de reproduceerbaarheid, in %. 9. Opmerkingen 9.1. Onder de volgende speciale chromatografische condities kan een betere scheiding tussen tryptofaan en α-methyltryptofaan worden verkregen. Isocratische elutie met gradiëntreiniging van de kolom: HPLC-kolom: 125 mm × 4 mm, C18, vulling van 5 μm, of een gelijkwaardige kolom; kolomtemperatuur: 32 oC; mobiele fase: A: 0,01 mol/l KH2PO4/methanol, 95+5 (V+V); B: methanol; gradiëntprogramma: 0 min 100 % A 0 % B; 15 min 100 % A 0 % B; 17 min 60 % A 40 % B; 19 min 60 % A 40 % B; 21 min 100 % A 0 % B; 33 min 100 % A 0 % B; elutiesnelheid: 1,2 ml/minuut; benodigde tijd: ongeveer 33 minuten. 9.2. De chromatografie varieert afhankelijk van het type HPLC en kolomvullingsmateriaal. Met het gekozen systeem moet een basislijnscheiding tussen tryptofaan en de interne standaard tot stand gebracht kunnen worden. Verder is het van belang dat afbraakproducten goed van tryptofaan en de interne standaard worden gescheiden. Er moeten hydrolysaten zonder interne standaard worden gebruikt om de basislijn onder de interne standaard te controleren op verontreinigingen. Het is van belang dat de uitvoeringstijd lang genoeg is voor de elutie van alle afbraakproducten, daar anders traag eluerende pieken de volgende chromatografische bepalingen kunnen storen. Binnen het bepalingsgebied moet het chromatografiesysteem een lineaire respons geven. De lineaire respons moet worden gemeten bij een constante (de normale) concentratie van de interne standaard en bij verschillende tryptofaanconcentraties. Het is van belang dat de piekgrootte zowel voor tryptofaan als voor de interne standaard binnen het lineaire gebied van het HPLC/fluorescentiesysteem ligt. Als de piek van tryptofaan en/of de interne standaard te klein of te groot is, dient de analyse te worden herhaald met een andere monstergrootte en/of een gewijzigd eindvolume. 9.3. Bariumhydroxide De oplosbaarheid van bariumhydroxide neemt mettertijd steeds verder af. Dit resulteert in een troebele oplossing voor de HPLC-bepaling, die lage waarden voor tryptofaan kan opleveren. H. BEPALING VAN RUW VET 1. Doel en toepassingsgebied Dit voorschrift beschrijft de methoden voor de bepaling van het gehalte aan ruw vet in diervoeder. Zij heeft geen betrekking op de analyse van oliehoudende zaden en vruchten. Naargelang van de aard en samenstelling van het diervoeder en de reden van de analyse moet één van de twee hieronder beschreven methoden worden gevolgd. 1.1. Methode A — rechtstreeks extraheerbaar ruw vet Deze methode geldt voor voedermiddelen van plantaardige oorsprong, met uitzondering van die waarvoor methode B kan worden toegepast. 1.2. Methode B — totaal ruw vet Deze methode geldt voor voedermiddelen van dierlijke oorsprong en voor alle mengvoeders. Zij moet worden gebruikt voor alle diervoeders waaruit het ruwe vet niet volledig kan worden geëxtraheerd zonder voorafgaande hydrolyse; dit geldt bijvoorbeeld voor glutenproducten, gist, aardappeleiwitten en producten die behandelingen als extrusie, vervlokking en verhitting ondergaan. 1.3. Interpretatie van de resultaten In alle gevallen waarin met methode B als uitkomst een hoger percentage wordt geconstateerd dan met methode A, wordt de uitkomst van methode B als de juiste waarde beschouwd. 2. Beginsel 2.1. Methode A Het ruwe vet wordt geëxtraheerd met petroleumether. Het oplosmiddel wordt afgedestilleerd en het residu gedroogd en gewogen. 2.2. Methode B Het monster wordt bij verhoogde temperatuur met zoutzuur behandeld. Het mengsel wordt afgekoeld en gefiltreerd. Het residu wordt gewassen en gedroogd en verder volgens methode A geanalyseerd. 3. Reagentia 3.1. Petroleumether, kooktraject: 40-60 oC. Het broomgetal moet kleiner dan 1 zijn en het verdampingsresidu kleiner dan 2 mg/100 ml. 3.2. Natriumsulfaat, watervrij. 3.3. Zoutzuur, c = 3 mol/l. 3.4. Filtermateriaal, bijvoorbeeld kiezelgoer, Hyflo-supercel. 4. Apparatuur 4.1. Extractieapparaat. Indien het apparaat werkt met een hevel (Soxhlet) moet de refluxsnelheid zodanig zijn dat ongeveer tien cyclussen per uur worden doorlopen; bij apparaten zonder hevel moet de refluxsnelheid ongeveer 10 ml per minuut zijn. 4.2. Extractiehulzen die geen in petroleumether oplosbaar materiaal bevatten en een aan de eisen van 4.1 aangepaste porositeit hebben. 4.3. Droogstoof, hetzij een vacuümstoof ingesteld op 75 oC ± 3 oC of een oven met luchtcirculatie ingesteld op 100 oC ± 3 oC. 5. Werkwijze 5.1. Methode A (zie punt 8.1) Weeg 5 g van het monster tot op 1 mg nauwkeurig af, breng dit in een extractiehuls (4.2) en dek het af met ontvette watten. Breng de huls in een extractieapparaat (4.1) en extraheer gedurende 6 uur met petroleumether (3.1). Vang het extract op in een van enkele stukjes puimsteen voorzien, gedroogd en getarreerd kolfje (2). Destilleer het oplosmiddel af en droog het residu vervolgens gedurende 1,5 uur in de droogstoof (4.3). Laat afkoelen in een exsiccator en weeg. Droog nogmaals gedurende 30 minuten om zeker te zijn dat de massa van het vet constant is (het massaverlies tussen de twee wegingen mag niet meer bedragen dan 1 mg). 5.2. Methode B Weeg 2,5 g van het monster tot op 1 mg nauwkeurig af (8.2), breng het in een bekerglas van 400 ml of een erlenmeyer van 300 ml en voeg 100 ml zoutzuur (3.3) en enkele stukjes puimsteen toe. Bedek het bekerglas met een horlogeglas of sluit de erlenmeyer aan op een terugvloeikoeler. Breng het mengsel op een kleine vlam of op een kookplaat net aan de kook en laat het gedurende 1 uur zachtjes koken. Draag er zorg voor dat de stof niet aan de wand gaat vastzitten. Koel af en voeg zoveel filtermateriaal (3.4) toe dat bij het filtreren geen vetverlies optreedt. Filtreer door nat, vetvrij dubbel filtreerpapier. Was het residu met koud water totdat het waswater neutraal is. Controleer of het filtraat vet bevat. Indien in het filtraat vet aanwezig is, moet het monster vóór de hydrolyse geëxtraheerd worden met petroleumether, volgens methode A. Breng het dubbelfilter met residu op een horlogeglas en droog het g