++++

RICHTLIJN VAN DE RAAD

van 29 maart 1977

betreffende het biologisch toezicht op de bevolking in verband met het gevaar van lood

( 77/312/EEG )

DE RAAD VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN ,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap , inzonderheid op artikel 235 ,

Gezien het voorstel van de Commissie ,

Gezien het advies van het Europese Parlement ( 1 ) ,

Gezien het advies van het Economisch en Sociaal Comité ( 2 ) ,

Overwegende dat een van de voornaamste taken van de Europese Economische Gemeenschap bestaat in het bevorderen van de harmonische ontwikkeling der economische activiteit in de gehele Gemeenschap , alsmede van een gestadige en evenwichtige expansie , welke taken niet denkbaar zijn zonder bestrijding van verontreiniging en hinder , noch zonder verbetering van de kwaliteit van het bestaan en van de bescherming van het milieu ;

Overwegende dat de verschillende gebruiksvormen van lood thans leiden tot verontreiniging van talrijke bestanddelen van het milieu als gevolg van deze stof ;

Overwegende dat de talrijke bronnen van lood in het milieu de bepaling van de totale blootstelling van een individu aan deze verontreinigende stof bemoeilijken en dat derhalve de bescherming van de gezondheid van de mens een zo nauwlettend mogelijk toezicht vereist op de totale loodopname van het individu ;

Overwegende dat er op de bevolking in verband met het gevaar van lood een biologisch toezicht dient te worden uitgeoefend en dat de resultaten van dit toezicht dienen te worden geëvalueerd , met het oog op de eventuele uitwerking van nieuwe voorstellen ;

Overwegende dat de technische bijzonderheden en de biologische referentieniveaus voor dit toezicht moeten worden vastgesteld ;

Overwegende dat de bepaling van het bloedloodgehalte thans het beste middel is tervaststelling van de dosis lood die een persoon als gevolg van blootstelling aan deze in het milieu aanwezige stof recentelijk heeft ontvangen en dat de enzymactiviteit van delta-aminolaevulinezuurdehydratase ( ALAD ) kan dienen als oriënterende of aanvullende factor bij het onderzoek naar de blootstelling aan lood ;

Overwegende dat er overeenkomstig het Actieprogramma van de Europese Gemeenschappen inzake het milieu ( 3 ) coordinatie moet plaatsvinden van de nationale programma's ter verbetering van de kwaliteit van het bestaan en voorrang moet worden gegeven aan een actie met betrekking tot lood ,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD :

Artikel 1

De Lid-Staten nemen de nodige maatregelen om een gemeenschappelijke procedure voor biologisch toezicht toe te passen ten einde te bepalen in hoeverre de bevolking wordt blootgesteld aan de gevaren van lood buiten de plaats van arbeid .

Artikel 2

Deze gemeenschappelijke procedure , waarvan de toepassingsduur tot vier jaar beperkt is , berust op de meting van het bloedloodgehalte .

Bij wijze van oriënterend of aanvullend onderzoek mag de ALAD-meting eveneens worden toegepast op de in de bijlagen II en III aangegeven wijze .

Artikel 3

1 . Voor dit biologisch toezicht worden vastgesteld :

- de wijze van bemonstering en analyse ,

- de frequentie van de bemonstering .

2 . Het nemen van de bloedmonsters geschiedt op basis van vrijwilligheid .

Artikel 4

De bemonstering heeft betrekking op :

- groepen van ten minste 100 personen in stedelijke gebieden met meer dan 0,5 miljoen inwoners ;

- groepen van ten minste 100 personen - voor : over dit aantal kan worden bereikt - gekozen uit de bevolkingsgroepen die zijn blootgesteld aan significante bronnen van loodverontreiniging ;

- kritische groepen , bepaald door de bevoegde instanties van de Lid-Staten .

In elke Lid-Staat worden tijdens elke campagne ten minste 50 analyses per 1 miljoen inwoners verricht .

Artikel 5

De bemonstering van de in artikel 4 bedoelde groepen geschiedt tijdens de duur van het programma in elk betrokken gebied in ten minste twee campagnes , met een tussentijd van ten minste 24 maanden . De tweede campagne hoeft niet per se betrekking te hebben op dezelfde individuen als die van de eerste campagne .

Artikel 6

Voor de evaluatie van de resultaten van het biologisch toezicht worden met het oog op de in artikel 8 bedoelde maatregelen de volgende bloedloodgehalten , waarbij rekening is gehouden met de in bijlage I omschreven dosiseffect relaties , tegelijkertijd in aanmerking genomen als referentieniveaus :

- ten hoogste 20 mg Pb per 100 ml bloed voor 50 % van de onderzochte bevolkingsgroep ;

- ten hoogste 30 mg Pb per 100 ml bloed voor 90 % van de onderzochte bevolkingsgroep ;

- ten hoogste 35 mg Pb per 100 ml bloed voor 98 % van de onderzochte bevolkingsgroep .

Artikel 7

Met betrekking tot de bepaling van het bloedloodgehalte :

- delen de Lid-Staten aan de Commissie de namen mede van de aan het programma van biologisch toezicht deelnemende laboratoria , alsmede de gehanteerde analysemethoden ;

- organiseert de Commissie , in contact met de Lid-Staten , programma's voor de onderlinge vergelijking der verkregen gegevens , waaraan de bovenbedoelde laboratoria deelnemen ;

- bestudeert de Commissie , in contact met de Lid-Staten , de resultaten van deze programma's ten einde de vergelijkbaarheid van de analysemethoden te verbeteren .

Artikel 8

Wanneer uit het resultaat van de analyses blijkt dat de in artikel 6 vermelde referentieniveaus eenmaal of verscheidene malen zijn overschreden :

- verifiëren de Lid-Staten de betrouwbaarheid van de verkregen uitkomsten ;

- stellen de Lid-Staten een onderzoek in naar de bronnen van blootstelling waardoor deze overschrijdingen worden veroorzaakt ; deze maatregel heeft ook betrekking op alle personen met een bloedloodgehalte van meer dan 35 mg per 100 ml ;

- treffen de Lid-Staten de maatregelen die door de bevoegde nationale instanties nodig worden geacht .

Artikel 9

1 . Binnen zes maanden na de kennisgeving van deze richtlijn wijzen de Lid-Staten de bevoegde nationale instantie aan , die aan de Commissie de volgende gegevens doet toekomen :

- de gegevens betreffende het biologisch toezicht op de in artikel 4 bedoelde bevolkingsgroepen met gegevens betreffende de analysemethoden , de onderzochte bevolkingsgroepen en de gebieden waar de bemonstering is verricht ; deze gegevens moeten de anonimiteit der onderzochte personen waarborgen ; de wijze en vorm van toezending van deze gegevens worden in gemeenschappelijk overleg tussen de Commissie en de Lid-Staten bepaald ;

- de informatie betreffende de oorzaken of de verschijnselen die worden verondersteld de oorzaak te zijn van de overschrijding der in artikel 6 vermelde referentieniveaus .

2 . De bevoegde nationale instantie stelt de Commissie bovendien in kennis van de maatregelen genomen op grond van artikel 8 , derde streepje .

Artikel 10

De Commissie roept ten minste tweemaal per jaar de vertegenwoordigers van de Regeringen der Lid-Staten in vergadering bijeen , ten einde met name :

- te zorgen voor de geharmoniseerde uitvoering van het biologisch toezicht , inzonderheid van het bepaalde in de artikelen 4 en 5 ;

- zorg te dragen voor de vergelijkbaarheid van de verrichte analyses ;

- de gegevens te bestuderen en de uitwisseling van gegevens tussen de Lid-Staten betreffende de bij het biologisch toezicht verkregen uitkomsten alsmede betreffende de op grond van artikel 8 genomen maatregelen te vergemakkelijken .

Artikel 11

Aan de hand van de op grond van artikel 9 verkregen gegevens , wordt door de Commissie in contact met de bevoegde nationale instanties :

- jaarlijks een samenvattend verslag over de uitvoering van het onderhavige programma opgesteld , dat aan de Lid-Staten alsmede aan de Raad en het Europese Parlement wordt toegezonden ;

- aan het einde van dit programma een algemeen verslag opgesteld dat als grondslag zal dienen voor de eventuele voorbereiding van nieuwe voorstellen , waarbij eveneens rekening wordt gehouden met de op het stuk van de wetenschappelijke en technische kennis gemaakte vorderingen .

Artikel 12

De Lid-Staten nemen de vereiste maatregelen om aan deze richtlijn binnen een termijn van twaalf maanden na de kennisgeving daarvan gevolg te geven en brengen de Commissie daarvan onmiddellijk op de hoogte .

Artikel 13

Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten .

Gedaan te Brussel , 29 maart 1977 .

Voor de Raad

De Voorzitter

T . BENN

( 1 ) PB nr . C 28 van 9 . 2 . 1976 , blz . 31 .

( 2 ) PB nr . C 50 van 4 . 3 . 1976 , blz . 9 .

( 3 ) PB nr . C 112 van 20 . 12 . 1973 , blz . 3 .

BIJLAGE I

DOSIS-EFFECT RELATIES

De bloedloodgehalten die in aanmerking worden genomen voor de evaluatie van de resultaten van het biologisch toezicht , vloeien voort uit de analyse van de wetenschappelijke gegevens met betrekking tot de verschillende toxische effecten van lood . Op grond van deze analyse , waarbij rekening wordt gehouden met de normale variaties van de biologische waarden van de bevolking , kunnen nagenoeg kwantitatieve relaties tussen dosis en effect worden vastgesteld . De onderstaande dosis-effect relaties worden voor de tenuitvoerlegging van deze richtlijn aangehouden :

Een vermindering van de ALAD-werking in de rode bloedlichaampjes ten gevolge van een blootstelling aan lood is , zolang zij geen stoornis in de hematopoëse teweegbrengt , voor de bevolking toelaatbaar . Bij een bloedloodgehalte lager dan 15 à 20 mg/100 ml , veroorzaakt de vermindering van de ALAD-werking volgens de huidige opvatting geen stoornis in de hematopoëse .

Een toeneming in het bloed van de protoporfyrinen in de rode bloedlichaampjes ( PPE ) wijst op een interactie met het ijzergebruik waardoor de synthese van het haem wordt geremd . De toeneming van de PPE treedt op bij bloedloodgehalten hoger dan 20 tot 30 mg/100 ml . Toeneming van de PPE kan echter ook andere oorzaken hebben .

Een interactie met de synthese van glutathion is slechts voor een fractie van de bevolking toelaatbaar en dan nog alleen , indien zij gering is en niet tot andere subklinische effecten leidt . Deze ontoelaatbare interactie met de synthese van glutathion treedt eerst op bij een bloedloodgehalte hoger dan 30 mg/100 ml .

Een significante verhoging van de uitscheiding van delta-aminolevulinezuur in de urine ( ALAU ) wijst op een storing van het metabolisme van de porfyrinen en is een symptoom van een slechte gezondheid . De statistisch gezien significante stijging van de ALAU-werking doet zich pas voor bij een bloedloodgehalte hoger dan 35 mg/100 ml .

BIJLAGE II

OVEREENSTEMMING TUSSEN BLOEDLOODGEHALTE EN ENZYMISCHE WERKING

In de zin van artikel 2 van deze richtlijn is de overeenstemming tussen bloedloodgehalte en de enzymische ALAD-werking , gemeten volgens de Europese standaardmethode ( bijlage III ) als volgt :

Bloedloodgehalte ( mg/100 ml bloed ) * ALAD-werking ( eenheden/liter ) *

35 * 20 *

30 * 25 *

20 * 35 *

Zolang de gemeten ALAD-waarden voor de verschillende bevolkingsgroepen significant hoger zijn dan de bovenstaande grenzen , behoeven geen bevestigende metingen van het bloedloodgehalte te worden uitgevoerd .

BIJLAGE III

TECHNISCHE VOORSCHRIFTEN VOOR HET BEPALEN VAN DE ALAD-WERKING

Europese standaardmethode voor het bepalen van de werking van delta-aminolevulinezuur-dehydratase

Het principe van de methode voor het bepalen van de werking van delta-aminolevulinezuurdehydratase is welbekend . Deze methode is gebaseerd op de incubatie van het enzym op een overdadige voedingsbodem van delta-aminolevulinezuur . Het na een bepaalde tijd gevormde porfobilinogeen ( PBG ) wordt vermengd met het gewijzigd reagens van Ehrlich , en de dan verkregen kleur wordt gemeten met een fotometer , in vergelijking met een blanco . De geproduceerde hoeveelheid porfobilinogeen is een maatstaf voor de ALAD-werking .

METHODE

Invloed van het licht

Recent onderzoek heeft aangetoond dat vooral PBG zeer gevoelig is voor licht . De gehele analyse moet worden uitgevoerd bij afwezigheid van elk spoor van direct zonlicht in het laboratorium ( niet alleen op de plaats waar de analyse wordt uitgevoerd ) .

Eerste fase - Het nemen van het bloedmonster en het bewaren daarvan voor de analyse :

- Neem met een plastic ( niet met lood gestabiliseerde ) injectiespuit , waarin zich < 5 mg gedroogde heparine bevindt , 2 ml aderlijk bloed af .

- Breng viermaal een hoeveelheid van 0,2 ml over in plastic ( niet met lood gestabiliseerde ) buisjes en koel ze tot 4 C . Pipetteer met van een maatverdeling voorziene pipetten van het type Marbourg .

- Als de analyse binnen de drie uur wordt uitgevoerd , behoeven de afgenomen hoeveelheden niet te worden gekoeld .

- De maximale bewaartijd van de monsters bij 4 * C bedraagt 24 uur .

- Vlak voor de analyse moeten alle monsters 10 minuten in een ijswaterbad worden geplaatst .

Opmerking : Van de plastic materialen die gebruikt mogen worden , noemen wij : polyethyleen , polystyreen en polypropyleen . De bewaartermijn van 24 uur bij 4 * C berust op een voorzichtige schatting . Deze periode is voldoende om het monster van de plaats waar het genomen is ter analyse naar een centraal laboratorium te vervoeren . Van de vier bloedmonsters moeten er drie voor de bepaling van de ALAD worden gebruikt en het vierde voor de blancoproef .

Tweede fase - Bepaling van hematocriet :

Deze bepaling moet worden uitgevoerd :

- tegelijk met de monsterneming ,

- volgens een capillaire methode , waarvoor twee monsters nodig zijn .

Centrifugeer , nadat één kant van de buis is afgesloten , het monster met een snelheid van ten minste 30 000 omw/min ( niet korter dan 5 min ) .

Opmerking : Het verdient de voorkeur deze bepaling ter plaatse uit te voeren en in ieder geval binnen 24 uur na de monsterneming . Gebruik zo mogelijk een cetrifuge voor microhematocriet .

Derde fase - Hemolyse :

- Hemolyseer drie bloedmonsters , die eerst zijn " ontdooid " met 1,3 ml gedestilleerd water dat vooraf op een temperatuur van 37 * C is gebracht , gedurende 10 minuten bij een temperatuur van 37 min of meer 0,2 * C .

- Voeg water toe , bij voorkeur met een blaaspipet van 2 ml met maatverdeling ; meng daarna grondig .

- Schud in dit stadium de monsters niet meer .

Opmerking : Er is besloten voor de hemolyse water te gebruiken in plaats van Triton X 100 . De ervaring heeft geleerd dat hemolyse met Triton X 100 een aanzienlijke remming van de ALAD-werking ten gevolge heeft ; een verschijnsel , waarvoor nog geen verklaring is gevonden en dat zou kunnen wijzen op een artefact .

Vierde fase - Toevoeging van de ALA-oplossing aan de hemolyse :

- Bereid de ALA-oplossing .

- Doe dat hooguit 5 uur van te voren .

- Verwarm deze oplossing ten minste 10 minuten voor de toevoeging tot 37 * C .

- Voeg 1 ml van deze oplossing toe aan het hemolysaat , bij voorkeur met een blaaspipet met een kogeltje van 1 ml , meng daarna .

Opmerking : Er is een pH van 6,4 aangehouden , omdat de ervaring heeft geleerd dat bij deze pH-waarde de optimale correlatie tussen de ALAD-werking en het bloedloodgehalte bij een normale populatie wordt verkregen . Het gaat er niet om de maximale werking te verkrijgen ( die kan worden bereikt door de pH te verhogen ) ; aangezien de te bepalen werking al sterk genoeg is .

Vijfde fase - Bereiding van de blancoproef :

- Neem 0,2 ml bloed , dat op dezelfde manier is behandeld als voor de bepaling van de ALAD , althans tot aan de toevoeging van de ALA-oplossing ; voeg in de plaats van de ALA-oplossing 1 ml HgCl2-TCA oplossing toe en daarna 1 ml ALA-oplossing , en handel vervolgens als voor de bepaling van de ALAD ( zie hieronder ) .

- Gebruik voor bovenstaande toevoeging blaaspipetten .

Opmerking : Slechts één controleproef wordt voor elk bloedmonster vergeleken met een serie van drie proeven ; als de voor de controleproef verkregen OD erg hoog is , moet men ter controle de behandeling herhalen .

Zesde fase - Incubatie :

- 60 minuten bij een temperatuur van 37 min of meer 0,2 * C in een waterbad .

- De incubatietijd gaat in nadat de ALA-oplossing is toegevoegd .

Opmerking : De incubatietijd is op 60 minuten gesteld , ten einde op natuurlijke manier de ALAD-werking te vergroten , gezien het feit dat geen enkele andere fase een vergroting van deze activiteit langs kunstmatige weg tot gevolg heeft . De ervaring heeft geleerd , dat bij een tijdsverloop van meer dan 2 uur de relatie tussen de incubatietijd en de activiteit lineair verloopt .

De incubatietemperatuur is om praktische redenen op 37 * C gehouden .

Zevende fase - Beëindiging van de PBG-reactie :

- Voeg 1 ml HgCl2-TCA oplossing toe aan het incubatiemengsel , bij voorkeur met een blaaspipet met een kogeltje van 1 ml .

Achtste fase - Centrifugeren en filtreren :

- 30 000 omw/min .

- Filtreer over Whatman-papier nr . 54 of een gelijkwaardig produkt ( zuurbestendig ) .

Opmerking : Het centrifugeren moet ongeveer 10 minuten in beslag nemen .

De filtratiefase is ingevoerd om het mee-pipetteren van kleine deeltjes aan de oppervlakte van de bovestaande vloeistof te vermijden . Het schijnt dat deze deeltjes een kleurreactie teweegbrengen met het reagens van Ehrlich . Verscheidene proeven hebben aangetoond , dat de invoering van de filtratiefase een verbeterde reproduceerbaarheid oplevert . Zo nodig kan de filtratiefase door een tweede centrifugering worden vervangen .

Negende fase - Reactie met het reagens van Ehrlich :

- Vermeng 1 ml van de bovenstaande vloeistof met 1 ml van het gewijzigd reagens van Ehrlich , met behulp van een blaaspipet met kogeltje .

- Voer de menging uit met een mixer type Vortex , ten einde de homogeniteit te waarborgen .

- Laat de reactie 5 minuten doorgaan en meet dan de extinctie .

Opmerking : Een goede vermenging van de gefiltreerde bovenstaande vloeistof met het reagens van Ehrlich is zeer belangrijk voor de homogeniteit .

Tiende fase - Meting van de extinctie :

- IJk de spectrofotometer met behulp van een fenolftaleïne-oplossing in een basische bufferoplossing .

- Meet de extinctie van het monster ten opzichte van de blancoproef bij 555 nm in een cuvette van 1 cm ( of 2 cm , als de absorptie heel zwak is ) .

Elfde fase - Berekening van de enzymactiviteit :

- Met de volgende vergelijking kan de activiteit worden berekend :

OD corr . maal 35 maal 2 maal 100 maal K/Hct % maal 60 maal 62 = mmol ALA/mn/ml RBC = eenheid/ml

waarin

OD = gemeten extinctie ,

60 = incubatietijd ,

35 = verdunningsfactor ,

62 = molaire extinctiecoëfficiënt in cm2/mmol ,

K = spectrofotometrische correctiecoëfficiënt .

Opmerking : De voorgestelde eenheden zijn in overeenstemming met de aanbevelingen van de " Union Internationale de Biochemie " , ten aanzien van de nomenclatuur van de enzymen .

OPLOSSINGEN

1 . Bereiding van de ALA-oplossing

Oplossing A :

Los 1,78 g Na2HPO4 * 2H2O op in 100 ml gedestilleerd water ( bij voorkeur door deïonisatie verkregen ) .

Oplossing B :

Los 1,38 g NaH2PO4 * 1H2O op in 100 ml gedestilleerd water .

29 ml van oplossing A + 71 ml van oplossing B leveren een bufferoplossing op van 0,1 M natriumfosfaat met een pH van 6,4 .

Deze ioniserende kracht van de bufferoplossing is noodzakelijk om tijdens de reactie elke wijziging in de pH van de oplossing te voorkomen .

Los 167,6 mg ALA-CHl op in oplossing B ( deze moet altijd zuur zijn ) ; met oplossing A wordt de pH op 6,4 gebracht . Vervolgens wordt het volume tot 100 ml aangevuld met de bufferoplossing van 0,1 M natriumfosfaat met een pH van 6,4 . Het resultaat van deze bereiding is een oplossing van 0,01 M ALA .

2 . Oplossing van HgCl2-TCA

Los 1,35 g HgCl2 op in 100 ml trichloorazijnzuur van 10 % .

Oplossing van het reagens van Ehrlich

Reagentia :

2,5 g p-dimethylaminobenzaldehyde ( pDMAB ) ,

0,25 g HgCl2 , opgelost in 10 ml ijsazijn ,

perchloorzuur , s.g . 1,7 ,

ijsazijn .

Bereiding :

Los het pDMAB op in 50 ml azijnzuur en voeg hieraan 24,5 ml perchloorzuur en 4 ml HgCl2-oplossing toe . Mengen , koelen en op 100 ml brengen met het ijsazijn in een maatkolf ( 1 ) . Bewaren in een donkere fles .

IJking :

Jaarlijks moet op communautair niveau door een door de Lid-Staten gezamenlijk aangewezen laboratorium een ijking worden uitgevoerd .

( 1 ) Als op dat moment een bruine kleur verschijnt , moet men het reagens weggooien .