BIJLAGE I

Regeling voor de tests die krachtens de artikelen 3, 4, 5, 7 en 8 moeten worden verricht

1. ALGEMENE BEGINSELEN BETREFFENDE DE AANWEZIGHEID VAN HET GESPECIFICEERDE PLAAGORGANISME

1.1. Er wordt vermoed dat het gespecificeerde plaagorganisme aanwezig is wanneer de eerste detectietest die op de nader omschreven plant wordt verricht, een positief resultaat oplevert. Voor symptomatisch plantaardig materiaal mag de eerste detectietest een selectieve isolatie zijn.

1.2. De aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme op symptomatische monsters van de nader omschreven planten wordt in de volgende gevallen bevestigd: a) wanneer de eerste detectietest een selectieve isolatie is die tot kolonies met een karakteristieke morfologie leidt: positieve resultaten in twee identificatietests; b) wanneer de eerste detectietest een andere test dan een selectieve isolatie is: i) positieve resultaten in twee identificatietests nadat het monster is onderworpen aan selectieve isolatie; ii) een positief resultaat in een tweede detectietest die geen selectieve isolatie is.

1.3. De aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme op asymptomatische monsters van de nader omschreven planten wordt in de volgende gevallen bevestigd: a) wanneer de tweede detectietest een positief resultaat oplevert, mits de eerste of tweede detectietest een moleculaire test (op basis van DNA) is (TaqMan®-real-time PCR of conventionele PCR); b) voor monsters die zijn genomen in een lidstaat of een gebied van een lidstaat waar het gespecificeerde plaagorganisme voor zover bekend niet voorkomt en voor monsters die uit een andere lidstaat afkomstig zijn: wanneer de tweede detectietest een positief resultaat oplevert, zoals bedoeld in punt a), en twee identificatietests positieve resultaten opleveren nadat het monster is onderworpen aan selectieve isolatie.

2. TESTS

2.1. Detectietests

De detectietests moeten van dien aard zijn dat op consistente wijze ten minste 104 cellen/ml geresuspendeerde pellet kunnen worden gedetecteerd.

De tweede detectietest moet gebaseerd zijn op andere biologische beginselen of andere nucleotiden dan de eerste detectietest.

De detectietests zijn de volgende:

a) immunofluorescentietests, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

b) FISH-test (van Beuningen et al. (1995) (1)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

c) isolatie, zoals beschreven in internationale diagnostische normen. Een van de volgende mogelijkheden moet worden toegepast: i) directe isolatie op semi-selectieve (of niet-selectieve) groeimedia, zoals beschreven in internationale diagnostische normen; ii) na aanrijking door middel van de bioassay, isolatie zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

d) een conventionele PCR waarvoor de primers van Pastrik (2000) (2) worden gebruikt, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

e) TaqMan®-real-time-PCR’s waarvoor primers en probes worden gebruikt van: i) Schaad et al. (1999) (3), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (zogenoemde NYtor-test), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iii) Gudmestad et al. (2009) zoals aangepast door Vreeburg et al. (2018)4, zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iv) Massart et al. (2014) (5), zoals beschreven in internationale diagnostische normen.

2.2. Identificatietests

De identificatietests zijn de volgende:

a) een immunofluorescentietest, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

b) een conventionele PCR (Pastrik (2000)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

c) TaqMan®-real-time-PCR’s waarvoor primers en probes worden gebruikt van: i) Schaad et al. (1999), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; ii) Vreeburg et al. (2018) (zogenoemde NYtor-test), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iii) Gudmestad et al. (2009) zoals aangepast door Vreeburg et al. (2018), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iv) Massart et al. (2014), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

d) DNA-barcodering, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

e) MALDI-TOF-MS (Zaluga et al. (2011) (6)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen.

3. STROOMSCHEMA’S VAN PROCEDURES

Stroomschema 1: diagnostische procedure voor de aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme in symptomatische monsters van de nader omschreven plant

a Isolatie kan als de eerste of de tweede detectietest worden gebruikt. Indien de aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme op het groeimedium wordt vermoed, worden kolonies gezuiverd om reinculturen te verkrijgen waarop vervolgens twee identificatietests worden verricht. Beide identificatietests moeten positieve resultaten opleveren om de aanwezigheid van het plaagorganisme te bevestigen.

b De derde detectietest moet gebaseerd zijn op andere biologische beginselen of andere nucleotiden.

Stroomschema 2: diagnostische procedure voor het gespecificeerde plaagorganisme in asymptomatische monsters van de nader omschreven plant

a Isolatie mag niet worden gebruikt.

b De derde detectietest moet gebaseerd zijn op andere biologische beginselen of andere nucleotiden. Isolatie mag niet worden gebruikt.

c Wat de in punt 1.3, b), bedoelde monsters betreft, is voor de bevestiging van de aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme na de tweede positieve detectietest isolatie van het gespecificeerde plaagorganisme uit het monster vereist, gevolgd door twee positieve identificatietests.

4. MONSTERVOORBEREIDING

4.1. Monsters van asymptomatische knollen

De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de verwerking van de stukjes van het naveleinde om het extract voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme te verkrijgen, wordt in internationale diagnostische normen beschreven.

4.2. Monsters van asymptomatisch plantaardig materiaal met uitzondering van knollen

De detectie van latente infecties wordt verricht op samengestelde monsters van stengeldelen. De procedure mag worden toegepast voor maximaal 200 stengeldelen van verschillende planten in één monster. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de ontsmetting en verwerking van de delen van de stengels om het extract voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme te verkrijgen, wordt in internationale diagnostische normen beschreven.

4.3. Monsters van symptomatische nader omschreven planten

Stukjes weefsel worden aseptisch verwijderd uit het vaatweefsel van knollen of uit de vaatbundels in de stengels van nader omschreven planten die verwelkingssymptomen vertonen. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de verwerking van dit weefsel om het extract voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme te verkrijgen, wordt in internationale diagnostische normen uitvoerig beschreven.

(1) Van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995). Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungs Forschung 1, 266-269.

(2) Pastrik, K.H. (2000). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA. European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D. (1999). Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system. Plant Disease 83, 1095-1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol, A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011). GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter. Systematic and applied microbiology 34, 400-7. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.