++++

ZESDE RICHTLIJN VAN DE COMMISSIE

van 20 december 1974

houdende vaststelling van de gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders

( 75/84/EEG )

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN ,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap ,

Gelet op de richtlijn van de Raad von 20 juli 1970 betreffende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings - en analysemethoden voor de officiële controle van veevoeders ( 1 ) , laatstelijk gewijzigd bij de Akte ( 2 ) die is toegevoegd aan het Verdrag betreffende de toetreding van de nieuwe Lid-Staten tot de Europese Economische Gemeenschap en de Europese Gemeenschap voor Atoomenergie ( 3 ) , ondertekend te Brussel op 22 januari 1972 , inzonderheid op artikel 2 ,

Overwegende dat bovenbedoelde richtlijn bepaalt dat de officiële controle van diervoeders , welke ertoe strekt na te gaan of aan de op grond van de wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen inzake de kwaliteit en de samenstelling van diervoeders gestelde eisen is voldaan , geschiedt volgens communautaire bemonsterings - en analysemethoden ;

Overwegende dat bij de Richtlijnen nrs . 71/250/EEG , 71/393/EEG , 72/199/EEG , 73/46/EEG en 74/203/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 ( 4 ) , 18 november 1971 ( 5 ) , 27 april 1972 ( 6 ) , 5 december 1972 ( 7 ) en 25 maart 1974 ( 8 ) reeds een zeker aantal gemeenschappelijke analysemethoden is vastgelegd ; dat gezien de vorderingen welke de werkzaamheden sindsdien hebben gemaakt het dienstig is een zesde reeks methoden vast te stellen ;

Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor diervoeders ,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD :

Artikel 1

De Lid-Staten schrijven voor dat de analysen voor de officiële controle van diervoeders ten aanzien van hun gehalte aan buquinolaat , sulfachinoxaline en furazolidon geschieden volgens de in de bijlage bij deze richtlijn omschreven methoden .

De algemene bepalingen van Deel I ( inleiding ) van de bijlage van de Eerste Richtlijn nr . 71/250/EEG van de Commissie van 15 juni 1971 zijn , met uitzondering van het deel betreffende de voorbereiding van het analysemonster , op de methoden beschreven in de bijlage , van deze richtlijn toepasselijk .

Artikel 2

De Lid-Staten doen uiterlijk op 1 november 1975 de nodige wettelijke of bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden , ten einde hun wetgeving in overeenstemming te brengen met deze richtlijn . Zij stellen de Commissie onverwijld hiervan in kennis .

Artikel 3

Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten .

Gedaan te Brussel , 20 december 1974 .

Voor de Raad

De Voorzitter

François-Xavier ORTOLI

( 1 ) PB nr . L 170 van 3 . 8 . 1970 , blz . 2 .

( 2 ) PB nr . L 73 van 27 . 3 . 1972 , blz . 14 .

( 3 ) PB nr . L 73 van 27 . 3 . 1972 , blz . 5 .

( 4 ) PB nr . L 155 van 12 . 7 . 1971 , blz . 13 .

( 5 ) PB nr . L 279 van 20 . 12 . 1971 , blz . 7 .

( 6 ) PB nr . L 123 van 29 . 5 . 1972 , blz . 6 .

( 7 ) PB nr . L 83 van 30 . 3 . 1973 , blz . 21 .

( 8 ) PB nr . L 108 van 22 . 4 . 1974 , blz . 1 .

BIJLAGE

1 . BEPALING VAN BUQUINOLAAT

( ethyl-4-hydroxy-6 , 7-diisobutoxy-3-chinoline - carboxylaat )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan buquinolaat in diervoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 10 mg/kg . Decoquinaat stoort bij de bepaling .

2 . Principe

Het monster wordt met chloroform geëxtraheerd . Het extract wordt tot droog ingedampt . Het residu wordt opgenomen in chloroform en de oplossing wordt vervolgens aan dunnelaagchromatografie onderworpen . Het buquinolaat wordt met ethanol geëlueerd en spectrofotofluorimetrisch bepaald ten opzichte van standaardoplossingen .

3 . Reagentia

3.1 . Chloroform p.a .

3.2 . Ethanol 96 % ( v/v ) p.a .

3.3 . Mengsel van chloroform en ethanol : meng 10 volumedelen chloroform ( 3.1 ) en 1 volumedeel ethanol ( 3.2 ) .

3.4 . Ethanol 80 % ( v/v ) p.a .

3.5 . Silicagel G voor dunnelaagchromatografie .

3.6 . Standaard : zuiver buquinolaat .

3.7 . Standaardoplossingen :

3.7.1 . Buquinolaatoplossing 0,2 mg/ml : Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig 50 mg van de standaard ( 3.6 ) af . Los met chloroform ( 3.1 ) op in een maatkolf van 250 ml onder verwarming op een waterbad bij 50 * C . Laat afkoelen tot kamertemperatuur , vul aan tot de streep met chloroform ( 3.1 ) en meng goed .

3.7.2 . Standaard-werkoplossingen : Pipetteer respectievelijk 5,0 - 10,0 - 15,0 - 20,0 en 25,0 ml van de oplossing ( 3.7.1 ) in maatkolven van 25 ml . Vul aan tot de streep met chloroform ( 3.1 ) en meng goed . Bereid deze oplossingen direct voor het gebruik . Deze oplossingen bevatten respectievelijk 0,04 - 0,08 - 0,12 - 0,16 en 0,20 mg buquinolaat per ml .

4 . Apparatuur

4.1 . Erlenmeyers van 50 en 250 ml met ingeslepen stoppen .

4.2 . Schudmachine .

4.3 . Centrifuge , met buizen van 15 ml met ingeslepen stoppen .

4.4 . Waterbad , ingesteld op 50 * C .

4.5 . Apparatuur voor dunnelaagchromatografie .

4.6 . Glazen platen voor dunnelaagchromatografie , 200 maal 200 mm , bereid als volgt . Strijk op de platen een uniforme laag silicagel G ( 3.5 ) van 0,5 mm dikte uit en laat gedurende 15 minuten aan de lucht drogen . Laat de platen vervolgens 2 uur in de droogstoof ( 4.11 ) staan , breng ze vervolgens over in een exsiccator met droog silicagel . Kant-en-klaar platen zijn geschikt voorzover zij gelijke resultaten opleveren als de hierboven beschreven platen .

4.7 . Micropipetten van 0,50 ml .

4.8 . Zonecollector voor dunnelaagchromatografie .

4.9 . UV-lamp met korte golven .

4.10 . Spectrofotofluorimeter voorzien van een Xenonlamp en twee monochromatoren .

4.11 . Droogstoof voorzien van een ventilator in ingesteld op 100 * C .

4.12 . Vacuuemrotatieverdamper met kolf van 250 ml .

5 . Uitvoering

5.1 . Voorbereiding van het monster

Maak het monster zo fijn dat het een zeef met mazen van 1 mm maaswijdte ( overeenkomstig ISO-aanbeveling R 565 ) kan passeren .

5.2 . Extractie

Weeg tot op 1 mag nauwkeurig een hoeveelheid van het fijngemaakte en gehomogeniseerde monster af die ongeveer 1,25 mg buquinolaat bevat , breng deze over in een erlenmeyer van 250 ml ( 4.1 ) en voeg 100,0 ml chloroform ( 3.1 ) toe . Meng , sluit de kolf af en schud gedurende 1 uur met behulp van de schudmachine ( 4.2 ) . Laat vervolgens bezinken en filtreer ; verwijder de eerste paar ml van het filtraat .

Breng 80,0 ml van het heldere filtraat in een erlenmeyer van 150 ml of in een kolf van de rotatieverdamper ( 4.12 ) . Damp tot bijna droog in op een waterbad ( 4.4 ) , los het olie-achtig residu op door verschillende malen enkele ml chloroform ( 3.1 ) toe te voegen en breng de vloeistoffen kwantitatief over in een maatkolf van 10 ml via een trechter met dunne pijp . Vul tot de streep aan met chloroform ( 3.1 ) en meng goed . Indien de oplossing niet helder is , moet gedurende drie minuten bij 3 000 omwentelingen per minuut en met gesloten buis worden gecentrifugeerd .

5.3 . Dunnelaagchromatografie

Breng met behulp van een micropipet ( 4.7 ) en op onderlinge afstanden van 2 cm volumina van 0,25 ml van het in 5.2 verkregen extract en van de vijf standaardwerksoplossingen ( 3.7.2 ) puntvormig op een dunnelaagchromatografieplaat ( 4.6 ) . Ontwikkel het chromatogram met chloroform ( 3.1 ) totdat het vloeistoffront vrijwel de bovenrand van de plaat bereikt , droog vervolgens in een luchtstroom . Ontwikkel daarna met het chloroform/ethanolmengsel ( 3.3 ) totdat het vloeistoffront ongeveer 12 cm gevorderd is . Laat de oplosmiddelen verdampen . Bestraal het chromatogram met het UV-licht ( 4.9 ) en baken de buquinolaatvlekken ( Rf-waarde 0,4 tot 0,6 ) of met behulp van een naald .

5.4 . Elutie

Verzamel het kiezelgel van elke afgebakende zone met behulp van een zonecollector ( 4.8 ) en breng dit in een centrifugebuis ( 4.3 ) . Voeg in elke buis 10,0 ml ethanol ( 3.4 ) toe , schud gedurende 20 minuten en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 3 000 omwentelingen per minuut . Schenk de heldere oplossingen af in erlenmeyers van 50 ml ( 4.1 ) .

5.5 . Meting van de intensiteit van de fluorescentie

Stel voor de excitatie die golflengte tussen 200 en 280 nm in die de meest intense fluorenscentie oplevert en stel voor de emissie de golflengte 375 nm in . Stel de schaal van de spectrofotofluorimeter ( 4.10 ) in op 100 met behulp van het eluaat ( 5.4 ) dat afkomstig is van de meest geconcentreerde standaardoplossing .

Meet onder deze omstandigheden de intensiteit van de fluorescentie van de overige eluaten ( 5.4 ) . Bepaal uitgaande van de gevonden waarden de hoeveelheid ( A ) buquinolaat in mg in de 10 ml eluaat uit het monster .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan buquinolaat van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :

A/P * 50 000

waarin :

A = door spectrofluorimetrische meting bepaalde hoeveelheid buquinolaat in mg .

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

50 % van het hoogste resultaat voor buquinolaatgehalten tussen 10 en 20 mg/kg ,

10 mg/kg absoluut voor buquinolaatgehalten tussen 20 en 100 mg/kg ,

10 % van het hoogste resultaat voor buquinolaatgehalten tussen 100 en 5 000 mg/kg ,

500 mg/kg absoluut voor buquinolaatgehalten tussen 5 000 en 10 000 mg/kg ,

5 % van het hoogste resultaat voor buquinolaatgehalten van meer dan 10 000 mg/kg .

2 . BEPALING VAN SULFACHINOXALINE

( 2-sulfanylamidochinoxaline )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan sulfachinoxaline in diervoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 20 mg/kg . Andere sulfonamiden en ook arsanilzuur storen bij de bepaling .

2 . Principe

Het monster wordt met dimethylformamide en chloroform geëxtraheerd . De sulfachinoxaline wordt in een alkalisch medium gehydrolyseerd . Na neutralisering wordt het aminoderivaat gediazoteerd en met N-(1-naftyl)-etheendiamine gekoppeld . De extinctie van de oplossing wordt gemeten bij 545 nm .

3 . Reagentia

3.1 . N,N-dimethylformamide p.a .

3.2 . Chloroform p.a .

3.3 . Absolute ethanol .

3.4 . Alkalische pekel : Los 10 g natriumhydroxyde p.a . en 25 g natriumchloride p.a . in water op . Vul tot 500 ml aan met water en meng goed .

3.5 . Geconcentreerd zoutzuur p.a . ( d = 1,18 ) .

3.6 . Natriumnitrietoplossing 0,1 % ( g/v ) : Los 100 mg natriumnitriet p.a . in water op , vul tot 100 ml aan met water en meng goed . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.7 . Ammoniumsulfamaatoplossing 0,5 % ( g/v ) : Los 500 mg ammoniumsulfamaat p.a . m water op , vul tot 100 ml aan met water en meng goed . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.8 . N-(1-naftyl)-etheendiaminedihydrochloride - oplossing 0,1 % : Los 100 mg N-(1-naftyl ) etheendiaminedihydrochloride p.a . in zoutzuur 0,1 % ( v/v ) p.a . op , vul tot 100 ml met dat zoutzuur aan en meng goed . Bereid deze oplossing onmiddellijk voor gebruik .

3.9 . Standaard : zuivere sulfachinoxaline .

3.10 . Standaardoplossing : Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig 250 mg van de standaard ( 3.9 ) af . Los in 50 ml natriumhydroxyde-oplossing ( 25 ml natriumhydroxyde-oplossing p.a . 0,1 N + 25 ml water ) op , vul tot 500 ml aan met water en meng goed . Neem 5,0 ml van deze oplossing af en verdun tot 100 ml met water . 1 ml van deze oplossing bevat 25 mg sulfachinoxaline .

4 . Apparatuur

4.1 . Erlenmeyers van 250 ml met normaal slijpstuk .

4.2 . Schudmachine .

4.3 . Glazen filtertrechter , poreusheid 3 , diameter 80 mm , met afzuigkolf .

4.4 . Scheitrechters van 250 ml .

4.5 . Maatkolven van 50 , 100 , 250 en 500 ml .

4.6 . Reageerbuisjes , 150 mm maal 25 mm .

4.7 . Kokend waterbad .

4.8 . Spectrofotometer met cuvetten van 20 mm optische weglengte .

5 . Uitvoering

5.1 . Voorbereiding van het monster

Maak het monster zo fijn dat het een zeef met mazen van 1 mm maaswijdte ( overeenkomstig ISO-aanbeveling R 565 ) kan passeren .

5.2 . Extractie

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig een hoeveelheid van het fijngemaakt en gehomogeniseerde monster af die tussen de 0,25 en 1,25 mg sulfachinoxaline bevat , breng deze over in een erlenmeyer van 250 ml ( 4.1 ) en voeg 20 ml N,N-dimethylformamide ( 3.1 ) toe . Meng en verwarm gedurende 20 minuten op het waterbad ( 4.7 ) . Koel vervolgens in koud stromend water af . Voeg 60 ml chloroform ( 3.2 ) toe , sluit de erlenmeyer en schud gedurende 30 minuten met behulp van de schudmachine ( 4.2 ) .

Filtreer de vloeistof in een filtertrechter ( 4.3 ) onder lichte afzuiging . Spoel de erlenmeyer met vier porties van 5 ml chloroform ( 3.2 ) uit en breng deze vloeistoffen in de filtertrechter over . Breng vervolgens het filtraat over in een scheitrechter ( 4.4 ) , spoel de fles met ongeveer 15 ml chloroform ( 3.2 ) uit en breng de vloeistof over in de scheitrechter .

5.3 . Hydrolyse

Voeg in de scheitrechter 50 ml alkalische pekel ( 3.4 ) en 5 ml ethanol ( 3.3 ) toe . Meng volledig onder vermijding van een emulsie hetzij door de trechter een twintigtal keren om te keren , hetzij door de trechter om de horizontale as ( van pijp tot stop ) te laten draaien . Laat vervolgens staan tot de fasen gescheiden zijn ( de scheiding is doorgaans volledig na ongeveer 15 minuten ) .

Breng de bovenste fase ( waterfase ) over in een maatkolf van 250 ml ( 4.5 ) . Extraheer de chloroformfase nogmaals met drie porties van 50 ml alkalische pekel ( 3.4 ) en breng het waterig extract na elke extractie over in de maatkolf . Vul tot de streep aan met water en meng goed .

Breng 25,0 ml van de oplossing in een maatkolf van 50 ml ( 4.5 ) , voeg 5,0 ml zoutzuur ( 3.5 ) toe , vul tot de streep aan met water en meng goed . Filtreer indien nodig en verwijder de eerste 15 ml van het filtraat . Breng 10,0 ml van de oplossing respectievelijk in twee reageerbuisjes ( 4.6 ) A en B .

5.4 . Kleurontwikkeling en meting van de extinctie

Voeg 2,0 ml natriumnitrietoplossing ( 3.6 ) in elk buisje toe , schud en laat drie minuten staan . Voeg 2,0 ml ammoniumsulfamaatoplossing ( 3.7 ) toe , schud en laat twee minuten staan . Voeg vervolgens 1,0 ml N-(1-naftyl)-etheendiaminedichloorhydraatoplossing ( 3.8 ) toe in buisje A en 1,0 ml water in buisje B . Meng de inhoud van elk buisje goed dooreen . Verwijder opgeloste stikstof door met waterstraalpomp en rubberslang lichte onderdruk in de buisjes aan te brengen .

Meet na 10 minuten de extinctie E A en E B van de oplossingen met behulp van de spectrofotometer ( 4.8 ) bij 545 nm ten opzichte van water . Bepaal , uitgaande van de waarde E A - E B de hoeveelheid ( A ) sulfachinoxaline die aanwezig is in de oplossing van het monster aan de hand van de vooraf getekende ijklijn ( 5.5 ) .

5.5 . IJklijn

Breng van de standaardoplossing ( 3.10 ) hoeveelheden van 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 en 10,0 ml , die overeenkomen met 50 , 100 , 150 , 200 en 250 microgram sulfachinoxaline in maatkolven van 100 ml ( 4.5 ) . Voeg 8 ml zoutzuur ( 3.5 ) toe in elke kolf , vul tot de streep aan met water en meng goed . Pipetter 10,0 ml van elke oplossing ( hetgeen overeenkomt met respectievelijk 5 , 10 , 15 , 20 en 25 microgram sulfachinoxaline ) in reageerbuisjes ( 4.6 ) . Ontwikkel de kleuring zoals is aangegeven in 5.4 , eerste alinea . Meet vervolgens de extincties bij 545 nm ten opzichte van water . Teken de ijklijn door de extinctiewaarden uit te zetten op de ordinaat en de bijbehorende hoeveelheden sulfachinoxaline in microgrammen op de abscis .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan sulfachinoxaline van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :

A/P * 50

waarin :

A = door spectrofotometrische meting bepaalde hoeveelheid sulfachinoxaline in microgram .

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

10 mg/kg absoluut voor sulfachinoxalinegehalten tussen 20 en 100 mg/kg ,

10 % van het hoogste resultaat voor sulfachinoxalinegehalten tussen 100 en 5 000 mg kg ,

500 mg/kg absoluut voor sulfachinoxalinegehalten van 5 000 tot 10 000 mg/kg ,

5 % van het hoogste resultaat voor sulfachinoxalinegehalten van meer dan 10 000 mg/kg .

3 . BEPALING VAN FURAZOLIDON

( 3-(5-nitrofurfurylideennamino)-oxazolidine-2-on )

1 . Doel en toepassingsgebied

Het voorschrift beschrijft de methode voor de bepaling van het gehalte aan furazolidon in diervoeders , concentraten en voormengsels . De ondergrens van de bepaling ligt bij 10 mg/kg .

2 . Principe

Het furazolidon wordt , na voorafgaande ontvetting van het monster met petroleumether , met aceton geëxtraheerd . Het extract wordt chromatografisch gezuiverd op een aluminiumoxydekolom en het furazolidon wordt met aceton geëlueerd . Het eluaat wordt tot droog ingedampt en het residu wordt met amylalcohol opgenomen . Het furazolidon wordt er met een ureumoplossing uit geëxtraheerd en de extinctie van de oplossing wordt gemeten bij 375 nm .

3 . Reagentia

3.1 . Aceton p.a .

3.2 . Aluminiumoxyde voor chromatografie , neutraal , korrelgrootteverdeling 100 tot 240 mesh , bereid als volgt . Roer 500 g aluminiumoxyde in 1 liter warm gedestilleerd water en laat de bovenstaande vloeistof bezinken . Herhaal dit tweemaal en filtreer vervolgens in een Buchner-trechter . Droog het alminiumoxyde bij 105 * C tot constant gewicht .

3.3 . Amylacetaat p.a .

3.4 . Amylalcohol p.a . ( isomeermengsels zijn bruikbaar ) .

3.5 . Petroleumether , kooktraject 40 - 60 * C .

3.6 . Ureumoplossing : Meng 90 g ureum p.a . met 100 ml water , verwarm licht tot het volledig opgelost is .

3.7 . Standaard : zuiver furazolidon .

3.8 . Standaardoplossing : Weeg tot op 0,1 mg nauwkeurig 25 mg standaard ( 3.7 ) af . Los op in aceton ( 3.1 ) in een maatkolf van 250 ml ( 4.1 ) , vul tot het volume aan met aceton ( 3.1 ) en meng goed . 1 ml van deze oplossing bevat 100 mg furazolidon .

4 . Apparatuur

4.1 . Maatkolven van bruin glas , 100 en 250 ml .

4.2 . Scheitrechters van bruin glas , 100 ml .

4.3 . Extractie-apparatuur , b.v . volgens Soxhlet of Twisselmann .

4.4 . Extractiehulzen , 25 maal 80 mm of 28 maal 100 mm .

4.5 . Chromatografiebuizen van glas , binnendiameter 10 mm , lengte 300 mm .

4.6 . Kokend waterbad .

4.7 . Spectrofotometer met cuvetten van 10 mm optische weglengte .

5 . Uitvoering

N.B . Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in gedempt daglicht .

5.1 . Voorbereiding van het monster

Maak het monster zo fijn dat het een zeef met mazen van 1 mm maaswijdte ( overeenkomstig ISO-aanbeveling R 565 ) kan passeren .

5.2 . Extractie

Weeg tot op 1 mg nauwkeurig 5 tot 20 g van het fijngemaakte en gehomogeniseerde monster ( bevattende maximaal 1 mg furazolidon ) in een extractiehuls ( 4.4 ) af , plaats deze in een extractie-apparaat ( 4.3 ) en extraheer met petroleumether ( 3.5 ) . Bij het Soxhlet-apparaat zijn 13 tot 17 doorstromingen van het oplosmiddel nodig ; bij andere apparaten mag de duur van de extractie niet minder dan 30 minuten bedragen . Neem vervolgens de huls uit het apparaat , verwijder het resterende oplosmiddel en droog de huls met inhoud in een warme luchtstroom .

Plaats de huls met inhoud vervolgens in een schoon extractie-apparaat en extraheer met aceton ( 3.1 ) . Bij het Soxhlet-apparaat zijn ten minste 25 doorstromingen van het oplosmiddel nodig ; bij ieder apparaat moeten de voorwaarden die nodig zijn voor het verkrijgen van een volledige extractie vooraf worden bepaald . Damp het acetonextract op het waterbad ( 4.6 ) tot een volume van 5 tot 10 ml in en laat vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur .

5.3 . Chromatografie

Breng een prop glaswol in het onderuiteinde van een chromatografiebuis ( 4.5 ) en druk de prop met een passend staafje in tot een dikte van 2 tot 3 mm . Bereid vervolgens een aluminiumoxydesuspensie ( 3.2 ) in aceton ( 3.1 ) , breng de suspensie in de buis en laat bezinken . De aldus verkregen kolom moet een hoogte van ongeveer 200 mm hebben . Laat het aceton dalen tot juist boven de kolom .

Breng het in 5.2 verkregen acetonextract op de kolom , spoel de kolf verschillende malen met aceton ( 3.1 ) uit en breng de vloeistoffen op de kolom . Plaats een kolf onder de kolom en elueer het furazolidon met aceton ( 3.1 ) . Het in totaal te gebruiken volume aceton moet , met inbegrip van het volume waarvan gebruik werd gemaakt voor het uitspoelen , ongeveer 150 ml bedragen .

5.4 . Extractie en meting van de extinctie

Damp het in 5.3 verkregen eluaat op een waterbad ( 4.6 ) tot droog in ( het kan voorkomen dat men een kleine hoeveelheid diaceton-alcohol verkrijgt door condensatie van het aceton op het aluminiumoxyde ; dit hindert evenwel de latere extracties niet ) . Los het residu in 10 ml amylalcohol ( 3.4 ) op en breng de oplossing in een scheitrechter ( 4.2 ) over . Spoel de kolf achtereenvolgens met 10 ml amylacetaat ( 3.3 ) en met 10 ml ureumoplossing ( 3.6 ) uit , breng die oplossingen in de scheitrechter over en schud krachtig gedurende twee minuten .

Laat 3 tot 4 minuten staan voor het scheiden van de fasen en vang de waterige fase vervolgens op in een maatkolf van 100 ml ( 4.1 ) . Herhaal het spoelen en de extractie met vier porties van 10 ml ureumoplossing ( 3.6 ) en vang de waterfase telkens in de maatkolf op . Vul de inhoud van de kolf tot 100 ml aan met ureumoplossing ( 3.6 ) en meng goed . Meet de extinctie van de oplossing met behulp van de spectrofotometer ( 4.7 ) bij 375 nm ten opzichte van de ureumoplossing ( 3.6 ) . Bepaal de hoeveelheid furazolidon aan de hand van de ijklijn ( 5.5 ) .

5.5 . IJklijn

Bereid vier chromatografiekolommen op de wijze die is aangegeven in 5.3 , eerste alinea . Pipetteer respectievelijk 2,5 - 5,0 - 7,5 en 10,0 ml van de standaardoplossing ( 3.8 ) in de buizen . Elueer elke kolom met 150 ml aceton ( 3.1 ) en zet de behandeling voort zoals aangegeven in 5.4 . Teken de ijklijn door de extinctiewaarden uit te zetten op de ordinaat en de bijbehorende hoeveelheden furazolidon in mierogrammen op de abscis .

6 . Berekening van de resultaten

Het gehalte aan furazolidon van het monster in mg/kg wordt berekend met behulp van de volgende formule :

A/P

waarin :

A = door spectrofotometrische meting bepaalde hoeveelheid furazolidon in microgram .

P = afgewogen hoeveelheid van het monster in g .

7 . Herhaalbaarheid

Het verschil tussen de resultaten van een bepaling in tweevoud in hetzelfde monster mag niet meer bedragen dan :

50 % van het hoogste resultaat voor furazolidongehalten tussen 10 en 20 mg/kg ,

10 mg/kg absoluut voor furazolidongehalten tussen 20 en 100 mg/kg ,

10 % van het hoogste resultaat voor furazolidongehalten tussen 100 en 5 000 mg/kg ,

500 mg/kg absoluut voor furazolidongehalten tussen 5 000 en 10 000 mg/kg ,

5 % van het hoogste resultaat voor furazolidongehalten van meer dan 10 000 mg/kg .