BIJLAGE I

Regeling voor de tests die krachtens de artikelen 3, 4, 5 en 7 moeten worden verricht

1. ALGEMENE BEGINSELEN BETREFFENDE DE AANWEZIGHEID VAN HET GESPECIFICEERDE PLAAGORGANISME

1.1. Er wordt vermoed dat het gespecificeerde plaagorganisme aanwezig is wanneer de eerste detectietest die op de nader omschreven plant of op watermonsters wordt verricht, een positief resultaat oplevert.

1.2. De aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme wordt in de volgende gevallen bevestigd: a) wanneer de eerste of tweede detectietest een selectieve isolatie is die tot kolonies met een karakteristieke morfologie leidt en twee identificatietests die op de kolonies worden verricht, positieve resultaten opleveren; b) wanneer de eerste en tweede detectietest andere tests dan selectieve isolatie zijn en twee identificatietests positieve resultaten opleveren nadat het monster is onderworpen aan selectieve isolatie die tot kolonies met een karakteristieke morfologie heeft geleid. Eén van die twee identificatietests is een test zoals bedoeld in punt 2.2, e), f) en g).

2. TESTS

2.1. Detectietests

De detectietests moeten van dien aard zijn dat op consistente wijze ten minste 104 cellen/ml geresuspendeerde pellet verkregen van asymptomatische monsters kunnen worden gedetecteerd.

De tweede detectietest moet gebaseerd zijn op andere biologische beginselen of andere nucleotiden dan de eerste detectietest.

De detectietests zijn de volgende:

a) immunofluorescentietests zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

b) isolatie van het gespecificeerde plaagorganisme op het semi-selectieve groeimedium mSMSA, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

c) een conventionele PCR waarvoor de primers van Pastrik et al. (2002) (1) worden gebruikt, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

d) TaqMan®-real-time-PCR’s waarvoor primers en probes worden gebruikt van: i) Weller et al. (2000) (2), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (waarbij een TaqMan®-probe wordt gebruikt die is gemodificeerd ten opzichte van de oorspronkelijke probe zoals beschreven door Weller et al. (2000)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (zogenoemde NYtor-test), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iv) Massart et al. (2014) (5), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

e) LAMP-test (loop-mediated isothermal amplification) waarvoor de primers van Lenarčič et al. (2014) (6) worden gebruikt (alleen voor symptomatisch plantenmateriaal), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

2.2. Identificatietests

De identificatietests zijn de volgende:

a) immunofluorescentietests zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

b) conventionele PCR’s waarvoor de primers van Pastrik et al. (2002) worden gebruikt, zoals uitvoerig beschreven in internationale diagnostische normen;

c) TaqMan®-real-time-PCR’s waarvoor primers en probes worden gebruikt van: i) Weller et al. (2000), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; ii) Vreeburg et al. (2016) (waarbij een TaqMan®-probe wordt gebruikt die is gemodificeerd ten opzichte van de oorspronkelijke probe zoals beschreven door Weller et al. (2000)), zoals uitvoerig beschreven in internationale diagnostische normen; iii) Vreeburg et al. (2018) (zogenoemde NYtor-test), zoals beschreven in internationale diagnostische normen; iv) Massart et al. (2014), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

d) LAMP-test (loop-mediated isothermal amplification) waarvoor de primers van Lenarčič et al. (2014) worden gebruikt, zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

e) fylotype-specifieke multiplex conventionele PCR (Opina et al. (1997) (7); Fegan & Prior (2005) (8)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

f) DNA-barcodering (Wicker et al. (2007) (9)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen;

g) MALDI-TOF-MS (van de Bilt et al. (2018) (10)), zoals beschreven in internationale diagnostische normen.

3. STROOMSCHEMA’S VAN PROCEDURES

Stroomschema 1: diagnostische procedure voor de aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme in monsters van de nader omschreven plant

a Isolatie kan als de eerste of de tweede detectietest worden gebruikt. Indien de aanwezigheid van het gespecificeerde plaagorganisme op het groeimedium wordt vermoed, worden kolonies gezuiverd om reinculturen te verkrijgen waarop vervolgens twee identificatietests worden verricht.

b Eén van die twee identificatietests is een test zoals bedoeld in punt 2.2, e), f) en g). Beide identificatietests moeten positieve resultaten opleveren om de aanwezigheid van het plaagorganisme te bevestigen.

c De derde detectietest moet gebaseerd zijn op andere biologische beginselen of andere nucleotiden.

Stroomschema 2: diagnostische procedure voor het gespecificeerde plaagorganisme in watermonsters

a Eén van die twee identificatietests is een test zoals bedoeld in punt 2.2, e), f) en g). Beide identificatietests moeten positieve resultaten opleveren om de aanwezigheid van het plaagorganisme te bevestigen.

4. MONSTERVOORBEREIDING

4.1. Monsters van asymptomatische knollen

De standaardmonstergrootte is 200 knollen per test. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de verwerking van de stukjes van het naveleinde om het extract voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme te verkrijgen, wordt in internationale diagnostische normen beschreven.

4.2. Monsters van asymptomatische nader omschreven planten

De detectie van latente infecties wordt verricht op samengestelde monsters van stengeldelen of bladstelen. De procedure mag worden toegepast voor maximaal 200 stengeldelen of 200 bladstelen van verschillende planten in één monster. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de ontsmetting en verwerking van de delen van de stengels en bladstelen om het extract voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme te verkrijgen, wordt in internationale diagnostische normen beschreven.

4.3. Monsters van symptomatisch materiaal van de nader omschreven planten

Stukjes weefsel worden aseptisch verwijderd uit het vaatweefsel van aardappelknollen of uit de vaatbundels in de stengels van nader omschreven planten die verwelkingssymptomen vertonen. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de verwerking van dit weefsel om het extract voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme te verkrijgen, wordt in internationale diagnostische normen uitvoerig beschreven.

4.4. Monsters van oppervlakte- of recirculatiewater (met inbegrip van afvalwater van aardappelverwerkingsinstallaties of riooleffluent)

De belangrijkste test voor de detectie van het gespecificeerde plaagorganisme in monsters van oppervlaktewater, water van recirculatiesystemen en effluent (van de aardappelverwerkingsindustrie) is selectieve isolatie. De toepasselijke laboratoriumprocedure voor de verwerking van watermonsters wordt in internationale diagnostische normen beschreven.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002). Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.

(2) Weller, SA, Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000). Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay. Applied and Environmental Microbiology, 66, 2853-2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016). Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 46, 112-121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol, A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018). Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach. EPPO Bulletin 48, 86-96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014). Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay. European Journal of Plant Pathology 138, 29-37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014). Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum. PLoS ONE 9(4), e96027, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997). A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 5, 19-30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005). How complex is the “Ralstonia solanacearum species complex”. In Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (eds Allen C, Hayward AC & Prior P), blz. 449-461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (VS).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007). Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential. Applied and Environmental Microbiology 73, 6790-6801.

(10) Van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018). Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum. European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5