ZESDE RICHTLIJN 95/32/EG VAN DE COMMISSIE

van 7 juli 1995

inzake voor de controle op de samenstelling van kosmetische produkten toe te passen analysemethoden

(Voor de EER relevante tekst)

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 76/768/EEG van de Raad van 27 juli 1976 betreffende de onderlinge aanpassing van de wetgevingen der Lid-Staten inzake kosmetische produkten (1), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 94/32/EG van de Commissie (2), inzonderheid op artikel 8, lid 1,

Overwegende dat bij Richtlijn 76/768/EEG in officiële controles op kosmetische produkten is voorzien, teneinde vast te stellen of de in de communautaire bepalingen betreffende de samenstelling van de kosmetische produkten vervatte voorwaarden in acht worden genomen;

Overwegende dat zo spoedig mogelijk alle noodzakelijke analysemethoden dienen te worden vastgesteld; dat daartoe met de vaststelling van bepaalde methoden in Richtlijn 80/1335/EEG van de Commissie (3), gewijzigd bij Richtlijn 87/143/EEG (4), in Richtlijn 82/434/EEG van de Commissie (5), gewijzigd bij Richtlijn 90/207/EEG (6), en in de Richtlijnen 83/514/EEG (7), 85/490/EEG (8) en 93/73/EEG (9) van de Commissie vijf fasen zijn afgesloten; dat in dat verband een zesde fase wordt gevormd door de vaststelling van methoden voor, respectievelijk, de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur, salicylzuur en propionzuur in kosmetische produkten en de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether in kosmetische produkten.

Overwegende dat de in deze richtlijn vervatte maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Comité voor de aanpassing van Richtlijn 76/768/EEG aan de technische vooruitgang,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:

Artikel 1

De Lid-Staten nemen de nodige maatregelen om te bereiken dat bij de officiële controles van kosmetische produkten

- de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur, salicylzuur en propionzuur,

- de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether

volgens de in de bijlage beschreven methoden geschieden.

Artikel 2

1. De Lid-Staten doen de nodige wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om uiterlijk op 30 september 1996 aan deze richtlijn te voldoen. Zij stellen de Commissie daarvan onverwijld in kennis.

Wanneer de Lid-Staten deze bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen naar de onderhavige richtlijn verwezen of wordt hiernaar verwezen bij de officiële bekendmaking van die bepalingen. De regels voor deze verwijzing worden vastgesteld door de Lid-Staten.

2. De Lid-Staten delen de Commissie de tekst van alle bepalingen van intern recht mede die zij op het onder deze richtlijn vallende gebied vaststellen.

Artikel 3

Deze richtlijn treedt in werking op de twintigste dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publikatieblad van de Europese Gemeenschappen.

Artikel 4

Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten.

Gedaan te Brussel, 7 juli 1995.

Voor de Commissie

Emma BONINO

Lid van de Commissie

(1) PB nr. L 262 van 27. 9. 1976, blz. 169.

(2) PB nr. L 181 van 15. 7. 1994, blz. 31.

(3) PB nr. L 383 van 31. 12. 1980, blz. 27.

(4) PB nr. L 57 van 27. 2. 1987, blz. 56.

(5) PB nr. L 185 van 30. 6. 1982, blz. 1.

(6) PB nr. L 108 van 28. 4. 1990, blz. 92.

(7) PB nr. L 291 van 24. 10. 1983, blz. 9.

(8) PB nr. L 295 van 7. 11. 1985, blz. 30.

(9) PB nr. L 231 van 14. 9. 1993, blz. 34.

BIJLAGE

I. KWALITATIEVE EN KWANTITATIEVE ANALYSE VAN BENZOËZUUR, 4-HYDROXYBENZOËZUUR, SORBINEZUUR, SALICYLZUUR EN PROPIONZUUR IN COSMETICA

1. Doel en toepassingsgebied

Dit voorschrift beschrijft de kwalitatieve en de kwantitatieve analyse van benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur, salicylzuur en propionzuur in cosmetica. Er worden afzonderlijke methoden beschreven voor de kwalitatieve analyse van deze conserveermiddelen, voor de kwantitatieve analyse van propionzuur en voor die van 4-hydroxybenzoëzuur, salicylzuur, sorbinezuur en benzoëzuur.

2. Definitie

De volgens deze methode bepaalde gehaltes aan benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, salicylzuur, sorbinezuur en propionzuur worden uitgedrukt als massapercentage van de vrije zuren in het produkt.

A. KWALITATIEVE ANALYSE

1. Beginsel

Na zuur/base-extractie van de conserveermiddelen wordt het extract geanalyseerd met behulp van dunne-laagchromatografie (DLC) met derivatisering op de plaat. Afhankelijk van de resultaten wordt de identificatie bevestigd met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie of, in het geval van propionzuur, gaschromatografie.

2. Reagentia

2.1. Algemeen

Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van minstens vergelijkbare zuiverheid te zijn.

2.2. Aceton.

2.3. Diëthylether.

2.4. Acetonitril.

2.5. Tolueen.

2.6. n-Hexaan.

2.7. Paraffine, vloeibaar.

2.8. Zoutzuur, 4 M.

2.9. Kaliumhydroxide, 4 M in water.

2.10. Calciumchloride, CaCl2 72H2O.

2.11. Lithiumcarbonaat, Li2CO3.

2.12. 2-Broom-2′-acetonafton.

2.13. 4-Hydroxybenzoëzuur.

2.14. Salicylzuur.

2.15. Benzoëzuur.

2.16. Sorbinezuur.

2.17. Propionzuur.

2.18. Referentieoplossingen

Bereid oplossingen van 0,1 % (m/v) (100 mg/100 ml) van elk van de vijf conserveermiddelen (2.13 t/m 2.17) in diëthylether (2.3).

2.19. Derivatiseringsreagens

Een oplossing van 0,5 % (m/v) 2-broom-2′-acetonafton (2.12) in acetonitril (2.4) (50 mg/10 ml). Deze oplossing moet wekelijks vers worden bereid en de koelkast worden bewaard.

2.20. Katalysatoroplossing

Een oplossing van 0,3 % (m/v) lithiumcarbonaat (2.11) in water (300 mg/100 ml). Deze oplossing moet vers worden bereid.

2.21. Loopvloeistof

Tolueen (2.5)/aceton (2.2) 20:0,05, v/v).

2.22. Vloeibare paraffine (2.7)/n-hexaan (2.6) (1:2, v/v).

3. Apparatuur

Gangbare laboratoriumuitrusting.

3.1. Waterbad, in staat de temperatuur op 60 °C te houden.

3.2. Ontwikkeltank.

3.3. UV-stralingsbron, 254 en 366 nm.

3.4. Dunne-laagplaten, kieselgel 60, zonder fluorescentie-indicator, 20 × 20 cm, laagdikte 0,25 mm met een concentreringszone van 2,5 × 20 cm (Merck 11845, of gelijkwaardig).

3.5. Injectiespuit, 10 µl.

3.6. Injectiespuit, 25 µl.

3.7. Oven, geschikt voor temperaturen tot 105 °C.

3.8. Glazen buizen met schroefdop, 50 ml.

3.9. Filtreerpapier, diameter 90 mm, Schleicher & Schuell, Weissband no. 5892, of gelijkwaardig.

3.10. Universeel pH-indicatorpapier, pH 1-11.

3.11. Glazen monsterflesjes (vials), 5 ml.

3.12. Rotatieverdamper (Rotavapor of gelijkwaardig).

3.13. Verwarmingsplaat.

4. Werkwijze

4.1. Monstervoorbereiding

Weeg in een 50 ml glazen buis met schroefdop (3.8) circa 1 g monster af. Voeg vier druppels zoutzuur 4 M (2.8) en 40 ml aceton (2.2) toe. Bij sterk alkalische produkten, zoals toiletzeep, moeten 20 druppels zoutzuur 4 M worden toegevoegd. Controleer met indicatorpapier (3.10) dat de pH ongeveer 2 is. Sluit de buis en schud krachtig gedurende 1 minuut.

Om de extractie van de conserveermiddelen in de acetonfase te bevorderen, kan het mengsel zonodig voorzichtig tot circa 60 °C verwarmd worden, zodat de vetfase smelt. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en filtreer over een papieren filter (3.9) in een erlenmeyer.

Breng 20 ml van het filtraat over in een erlenmeyer van 200 ml, voeg 20 ml water toe en meng. Breng de pH van het mengsel met kaliumhydroxide 4 M (2.9) op ongeveer 10; gebruik indicatorpapier (3.10) om de pH te bepalen.

Voeg 1 g calciumchloride (2.10) toe en schud krachtig. Filtreer over een papieren filter (3.9) in een scheitrechter van 250 ml die 75 ml diëthylether (2.3) bevat en schud krachtig gedurende 1 minuut. Wacht tot de fasen gescheiden zijn en verzamel de waterlaag in een erlemeyer van 250 ml. Verwerp de etherlaag. Breng op geleide van indicatorpapier de pH van de waterige oplossing door toevoeging van zoutzuur 4 M op ongeveer 2. Voeg 10 ml diëthylether toe, sluit de kolf en schud krachtig gedurende 1 minuut. Wacht tot de fasen gescheiden zijn en breng de etherlaag over in een rotatieverdamper (3.12). Verwerp de waterlaag.

Damp de etherfractie in tot deze bijna droog is en los het residu op in 1 ml diëthylether (2.3). Breng de aldus verkregen oplossing over in een monsterflesje (3.11).

4.2. Dunne-laagchromatografie

Breng voor elk van de te chromatograferen referentieoplossingen en monsteroplossingen op de startlijn in de concentreringszone van een DLC-plaat (3.4) met een injectiespuit (3.5) op gelijke afstanden circa 3 µl lithiumcarbonaatoplossing (2.20) op en droog de plaat in een koude luchtstroom.

Leg de DLC-plaat op een op 40 °C gebrachte verwarmingsplaat (3.13) teneinde de vlekken zo klein mogelijk te houden. Breng met een injectiespuit 10 µl van elk van de referentieoplossingen (2.18) en van de monsteroplossingen (4.1) op de startlijn van de plaat op, exact op de plaatsen waar tevoren de lithiumcarbonaatoplossing is opgebracht.

Breng tenslotte op exact dezelfde plaatsen waar de referentieoplossingen, respectievelijk de monsteroplossingen en de lithiumcarbonaatoplossing zijn opgebracht circa 15 µl derivatiseringsreagens (2.19) (oplossing van 2-broom-2′-acetonafton) op.

Verwarm de DLC-plaat gedurende 45 minuten in een oven (3.7) op 80 °C. Laat de plaat afkoelen en plaats hem in een ontwikkeltank (3.2) met loopvloeistof (2.21) (tolueen/aceton), die gedurende 15 minuten geconditioneerd is (zonder filtreerpapierbekleding). Ontwikkel de plaat tot het vloeistoffront een afstand van 15 cm heeft afgelegd (dit duurt circa 80 minuten).

Droog de plaat in een koude luchtstroom en bekijk de verkregen vlekken onder UV-licht (3.3). Om de fluorescentie van de zwakke vlekken te verbeteren kan de DLC-plaat in vloeibare paraffine/n-hexaan (2.22) worden gedompeld.

5. Indentificatie

Bereken de Rf van de verkregen vlekken.

Vergelijk de Rf-waarde en het gedrag onder UV-bestraling van het monster met de resultaten van de referentieoplossingen.

Trek een voorlopige conclusie omtrent de identiteit van de aanwezige conserveermiddelen. Verricht de in deel B beschreven HPLC-analyse of, indien propionzuur aanwezig lijkt, de in deel C beschreven GC-analyse. Vergelijk de voor het monster verkregen retentietijden met die van de referentieoplossingen.

Bepaal aan de hand van de gecombineerde resultaten van DLC en HPLC of GC welke conserveermiddelen in het monster aanwezig waren.

B. KWANTITATIEVE ANALYSE VAN BENZOËZUUR, 4-HYDROXYBENZOËZUUR, SORBINEZUUR EN SALICYLZUUR

1. Beginsel

Het monster wordt na aanzuren geëxtraheerd met een mengsel van ethanol en water. Na filtratie worden de conserveermiddelen kwantitatief bepaald met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC).

2. Reagentia

2.1. Alle reagentia moeten van analysekwaliteit en waar van toepassing geschikt voor HPLC zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van minstens vergelijkbare zuiverheid te zijn.

2.2 Ethanol, absoluut.

2.3. 4-Hydroxybenzoëzuur.

2.4. Salicylzuur.

2.5. Benzoëzuur.

2.6. Sorbinezuur.

2.7. Natriumacetaat (CH3COONa 73H2O).

2.8. Azijnzuur, d²04 = 1,05 g/ml.

2.9. Acetonitril.

2.10. Zwavelzuur, 2 M.

2.11. Kaliumhydroxide, 0,2 M in water.

2.12. 2-Methoxybenzoëzuur.

2.13. Ethanol/watermengsel

Meng negen volumedelen ethanol (2.2) met één volumedeel water (2.1)

2.14 Interne-standaardoplossing

Bereid een oplossing van circa 1 g 2-methoxybenzoëzuur (2.12) in 500 ml ethanol/watermengsel (2.13)

2.15. Mobiele fase voor HPLC

2.15.1. Acetaatbuffer: voeg aan 1 liter water 6,35 g natriumacetaat (2.7) en 20 ml azijnzuur (2.8) toe.

2.15.2. Bereid de mobiele fase door negen volumedelen acetaatbuffer (2.15.1) te mengen met één volumedeel acetonitril (2.9).

2.16. Stamoplossing conserveermiddelen

Weeg in een maatkolf van 50 ml ongeveer 0,05 g 4-hydroxybenzoëzuur (2.3), 0,2 g salicylzuur (2.4), 0,2 g benzoëzuur (2.5) en 0,05 g sorbinezuur (2.6) nauwkeurig af en vul aan met ethanol/watermengsel (2.13). Bewaar de oplossing in de koelkast. Deze oplossing is een week houdbaar.

2.17. Standaardoplossingen conserveermiddelen

Breng respectievelijk 8, 4, 2, 1 en 0,5 ml van de stamoplossing (2.16) over in maatkolven van 20 ml. Voeg telkens 10 ml interne-standaardoplossing (2.14) en 0,5 ml zwavelzuur 2 M (2.10) toe. Vul aan met ethanol/watermengsel (2.13). Deze oplossingen moeten vers worden bereid.

3. Apparatuur

Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede

3.1. Waterbad, 60 °C.

3.2. Hogedruk-vloeistofchromatograaf, voorzien van een variabele golflengte UV-detector en een injectielus van 10µl.

3.3. Analytische kolom

Roestvrij staal, lengte 12,5-25 cm, inwendige diameter 5,6 mm, gepakt met Nucleosil 5C18, of gelijkwaardig.

3.4. Filtreerpapier, diameter 90 mm, Schleicher & Schuell, Weissband no. 5892, of gelijkwaardig.

3.5. Glazen buizen met schroefdop, 50 ml.

3.6. Glazen monsterflesjes (vials), 5 ml.

3.7. Kooksteentjes, carborundum, afmeting 2-4 mm, of gelijkwaardig.

4. Werkwijze

4.1. Monstervoorbereiding

4.1.1. Monstervoorbereiding zonder toevoeging van de interne standaard.

Weeg in een 50 ml glazen buis met schroefdop (3.5) 1 g van het monster af. Pipetteer 1 ml zwavelzuur 2 M (2.10) en vervolgens 40 ml ethanol/watermengsel (2.13) in de buis. Voeg circa 1 g kooksteenjes (3.7) toe, sluit de buis en schud krachtig gedurende ten minste 1 minuut tot een homogene suspensie is verkregen. Plaats de buis gedurende precies 5 minuten in een waterbad (3.1) op 60 °C om de extractie van de conserveermiddelen naar de ethanolfase te bevorderen.

Koel de buis hierna onmiddellijk onder koud stromend water en laat het extract gedurende 1 uur bij 5 °C staan.

Filtreer het extract over een papieren filter (3.4). Breng circa 2 ml van het filtraat over in een monsterflesje (3.6). Bewaar het extract bij 5 °C en voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur na de bereiding van het extract uit.

4.1.2. Monstervoorbereiding met toevoeging van de interne standaard.

Weeg in een 50 ml glazen buis met schroefdop (1 ± 0,1 g monster op drie cijfers na de komma af (= a g). Pipetteer 1 ml zwavelzuur 2 M (2.10) en vervolgens 30 ml ethanol/watermengsel (2.13) in de buis. Voeg circa 1 g kooksteentjes (3.7) en 10 ml interne-standaardoplossing (2.14) toe. Sluit de buis en schud krachtig gedurende tenminste 1 minuut tot een homogene suspensie is verkregen. Plaats de buis gedurende precies 5 minuten in een waterbad op 60 °C (3.1) om de extractie van de conserveermiddelen naar de ethanolfase te bevorderen. Koel de buis hierna onmiddellijk onder koud stromend water en laat het extract gedurende 1 uur bij 5 °C staan.

Filtreer het extract over een papieren filter (3.4). Breng circa 2 ml van het filtraat over in een monsterflesje (3.6). Bewaar het filtraat bij 5 °C en voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur na de bereiding van het extract uit.

4.2. HPLC

Mobiele fase: acetonitril/acetaatbuffer (2.15).

Stel het debiet van de mobiele fase door de kolom in op 2 ± 0,5 ml/minuut. Stel de detectorgolflengte in op 240 nm.

4.2.1. IJklijn

Injecteer achtereenvolgens 10 µl van elk van de standaard-conserveermiddeloplossingen (2.17) in de vloeistofchromatograaf (3.2). Bepaal in de verkregen chromatogrammen de verhouding tussen de piekhoogtes van de onderzochte conserveermiddelen en die van de interne standaard. Maak voor elk conserveermiddel een ijklijn door de aldus bepaalde verhoudingen uit te zetten tegen de concentratie van het conserveermiddel een ijklijn door de aldus bepaalde verhoudingen uit te zetten tegen de concentratie van het conserveermiddel in de respectievelijke standaardoplossingen.

Controleer dat hierbij een lineaire afhankelijkheid wordt verkregen.

4.2.2. Bepaling

Injecteer 10 µl van het geëxtraheerde monster (4.1.1) in de vloeistofchromatograaf en neem het chromatogram op. Injecteer 10 µl van één van de standaardoplossingen conserveermiddelen (2.17) en neem het chromatogram op. Vergelijk de beide chromatogrammen. Als er in het chromatogram van het monster (4.1.1) geen pieken aanwezig zijn met ongeveer dezelfde retentietijd als 2-methoxybenzoëzuur (aanbevolen interne standaard), injecteer dan 10 µl van het extract met toegevoegde interne standaard (4.1.2) in de vloeistofchromatograaf en neem het chromatogram op.

Indien in het chromatogram van het monster (4.1.1) een piek optreedt met dezelfde retentietijd als 2-methoxybenzoëzuur, moet een andere geschikte interne standaard gekozen worden (indien één van de onderzochte conserveermiddelen niet in het chromatogram verschijnt, kan dit conserveermiddel als interne standaard gebruikt worden).

Ga na dat de met de standaardoplossingen en de monsteroplossing verkregen chromatogrammen aan de volgende voorwaarden voldoen:

- de piekscheiding van het slechts gescheiden paar moet ten minste 0,90 zijn (voor een definitie van de piekscheiding zie figuur 1);

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 1: piekscheiding

PB nr. L 231 van 14. 9. 1993, blz. 34.- Indien de vereiste scheiding niet wordt verkregen, moet een efficiëntere kolom worden gebruikt of moet de samenstelling van de mobiele fase worden aangepast tot dit wel het geval is.

- de asymmetriefactor As van alle verkregen pieken moet tussen 0,9 en 1,5 liggen (voor een definitie van de piekasymmetriefactor zie figuur 2). Voor het bepalen van de asymmetriefactor wordt het aanbevolen het chromatogram met een papiersnelheid van minimaal 2 cm/minuut op te nemen;

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 2: piekasymmetriefactor

- er moet een vlakke basislijn worden verkregen.

5. Berekening

Bepaal met behulp van de ijkgrafiek de concentratie van de conserveermiddelen in het monster uit de verhoudingen van de piekhoogtes van de onderzochte conserveermiddelen tot die van 2-methoxybenzoëzuur (interne standaard). Bereken het gehalte aan benzoëzuur, 4-hydroxybenzoëzuur, sorbinezuur of salicylzuur in het monster in massaprocenten (xi) met de volgende formule:

xi % (m/m) = 100 7 20 7 b 106 7 a = b 500 7 a

b = concentratie (µg/ml) van het conserveermiddel in het monsterextract (4.1.2), zoals afgelezen uit de ijkgrafiek;

a = monsterinweeg (g) (4.1.2).

6. Herhaalbaarheid (1)

Bij een gehalte aan 4-hydroxybenzoëzuur van 0,40 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,035 % bedragen.

Bij een gehalte aan benzoëzuur van 0,50 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,050 % bedragen.

Bij een gehalte aan salicylzuur van 0,50 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,045 % bedragen.

Bij een gehalte aan sorbinezuur van 0,60 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,035 % bedragen.

7. Opmerkingen

7.1. Uit een op de methode uitgevoerde robuustheidstest is gebleken dat de bij de extractie van de zuren uit het monster gebruikte hoeveelheid zwavelzuur kritiek is; tevens moeten de voor de op te werken hoeveelheid monster aangegeven grenzen nauwgezet worden aangehouden.

7.2 Desgewenst kan een geschikte guardkolom gebruikt worden.

C. KWANTITATIEVE ANALYSE VAN PROPIONZUUR

1. Doel en toepassingsgebied

Deze methode beschrijft de kwantitatieve analyse van propionzuur tot een maximumconcentratie van 2 % (m/m) in cosmetica.

2. Definitie

De volgens deze methode bepaalde propionzuurconcentratie wordt uitgedrukt als massapercentage (% m/m) van het produkt.

3. Beginsel

Na extractie van het propionzuur uit het produkt wordt het gehalte bepaald met behulp van gaschromatografie (GC) met 2-methylpropionzuur als interne standaard.

4. Reagentia

Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van gelijkwaardige kwaliteit te zijn.

4.1. Ethanol 96 % (v/v).

4.2. Propionzuur.

4.3. 2-Methylpropionzuur.

4.4. Orthofosforzuur, 10 % (m/v).

4.5. Propionzuuroplossing

Weeg in een maatkolf van 50 ml circa 1 g propionzuur nauwkeurig af (= p g) en vul aan met ethanol (4.1).

4.6. Interne-standaardoplossing

Weeg in een maatkolf van 50 ml circa 1 g 2-methylpropionzuur nauwkeurig af (= e g) en vul aan met ethanol (4.1).

5. Apparatuur

Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede

5.1. Gaschromatograaf met vlamionisatiedetector.

5.2. Glazen buis (20 % × 150 mm) met schroefdop.

5.3. Waterbad, 60 °C.

5.4. Glazen injectiespuit, 10 ml, met membraanfilter (poriëndiameter 0,45 µm).

6. Werkwijze

6.1. Monstervoorbereiding

6.1.1. Monstervoorberiding zonder interne standaard

Weeg in een glazen buis (5.2) circa 1 g monster af. Voeg 0,5 ml orthofosforzuur (4.4) en 9,5 ml ethanol (4.1) toe. Sluit de buis en schud krachtig. Plaats de buis zonodig gedurende 5 minuten in een waterbad op 60 °C (5.3) om de vetfase volledig op te lossen. Koel snel af onder stromend water.

Filtreer een deel van de oplossing over een membraanfilter (5.4). Chromatografeer het filtraat nog dezelfde dag.

6.1.2. Monstervoorbereiding met interne standaard

Weeg in een glazen buis (5.2) 1 ± 0,1 g monster tot op drie cijfers achter de komma af (= a g). Voeg 0,5 ml orthofosforzuur (4.4), 0,5 ml interne-standaardoplossing (4.6) en 9 ml ethanol (4.1) toe. Sluit de buis en schud krachtig. Plaats de buis zonodig gedurende 5 minuten in een waterbad op 60 °C (5.3) om de vetfase op te lossen. Koel snel af onder stromend water.

Filtreer een deel van de oplossing over een membraanfilter (5.4). Chromatografeer het filtraat nog dezelfde dag.

6.2. Condities voor gaschromatografie

De volgende condities worden aanbevolen:

Kolom

Materiaal roestvrij staal

Lengte 2 m

Diameter 1/8″

Vulling 10 % PTM 1000 (of (gelijkwaardig) + 1 % H3PO4, op Chromosorb WAW 100-120 mesh

Temperatuur

Injector 200 °C

Kolom 120 °C

Detector 200 °C

Dragergas

stikstof

Debiet 25 ml/min.

6.3. Chromatografie

6.3.1. IJklijn

Pipetteer in maatkolven van 20 ml respectievelijk 0,25, 0,5, 1, 2 en 4 ml propionzuuroplossing (4.5). Pipetter in elke maatkolf 1 ml interne standaardoplossing (4.6), vul aan met ethanol (4.1) en meng. De aldus verkregen oplossingen bevatten e mg/ml 2-methylpropionzuur als interne standaard (d.w.z. 1 mg/ml als e = 1,000) en p/4, p/2, p, 2p en 4p mg/ml propionzuur (d.w.z. 0,25, 0,5, 1, 2 en 4 mg/ml als p = 1,000).

Injecteer achtereenvolgens 1 µl van elk van deze oplossingen in de gaschromatograaf en construeer de ijklijn door de verhouding van de piekoppervlaktes van propionzuur en 2-methlypropionzuur uit te zetten tegen de overeenkomstige massaverhouding.

Injecteer elke oplossing drie maal en bereken de gemiddelde verhouding van de piekoppervlakten.

6.3.2. Bepaling

Injecteer 1 µl van het volgens 6.1.1 verkregen filtraat. Vergelijk het chromatogram met dat van één van de standaardoplossingen (6.3.1). Als er een piek aanwezig is met ongeveer dezelfde retentietijd als 2-methylpropionzuur moet een andere interne standaard gekozen worden. Injecteer als er geen interferentie is 1 µl van het volgens 6.1.2 bereide filtraat en bepaald de oppervlakten van de propionzuurpiek en de piel van de interne standaard.

Injecteer elke oplossing drie maal en bereken de gemiddelde verhouding van de piekoppervlakten.

7. Berekening

7.1. Lees uit de in 6.3.1 verkregen ijkgrafiek de massaverhouding (K) af die overeenkomst met de volgens 6.3.2 berekende verhouding van de piekoppervlakten.

7.2. Bereken uit de aldus verkregen massaverhouding het propionzuurgehalte van het monster (X) als massapercentage met behulp van de volgende formule:

x % (m/m) = K 0,5 7 100 7 e 50 7 a = K e a

waarbij

K = de in 7.1 gevonden verhouding;

a = massa (g) afgewogen van de interne standaard (4.6);

e = massa (g) van het ingewogen monster (6.1.2).

Rond de resultaten af tot op een cijfer na de komma.

8. Herhaalbaarheid (1)

Bij een propionzuurgehalte van 2 % (m/m) mag het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,12 % bedragen.

II. KWALITATIEVE EN KWANTITATIEVE ANALYSE VAN HYDROCHINON, HYDROCHINONMONOMETHYLETHER, HYDROCHINONMONOËTHYLETHER EN HYDROCHINONMONOBENZYLETHER IN COSMETICA

A. IDENTIFICATIE

1. Doel en toepassingsgebied

Deze methode beschrijft de kwalitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether (monobenzon) in huidbleekmiddelen.

2. Beginsel

Hydrochinon en de ethers daarvan worden aangetoond met behulp van dunne-laagchromatografie (DLC).

3. Reagentia

Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn.

3.1. Ethanol, 96 % (v/v).

3.2. Chloroform.

3.3. Diëthylether.

3.4. Loopvloeistof

Chloroform/diëthylether, 66:33 (v/v).

3.5. Ammonia, 25 % (m/m) (d²04 = 0,91 g/ml).

3.6. Ascorbinezuur.

3.7. Hydrochinon.

3.8. Hydrochinonmonomethylether.

3.9. Hydrochinonmonoëthylether.

3.10. Hydrochinonmonobenzylether (monobenzon).

3.11. Referentieoplossingen

Onderstaande referentieoplossingen moeten vers worden bereid en zijn gedurende één dag houdbaar.

3.11.1. Weeg 0,05 g hydrochinon (3.7) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml.

3.11.2. Weeg 0,05 g hydrochinonmonomethylether (3.8) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml.

3.11.3. Weeg 0,05 g hydrochinonmonoëthylether (3.9) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml.

3.11.4. Weeg 0,05 g hydrochinonmonobenzylether (3.10) af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Voeg ammonia (3.5) toe tot de pH 10 is en vul aan met ethanol (3.1) tot een volume van 10 ml.

3.12. Zilvernitraat.

3.13. 12-Molybdofosforzuur.

3.14. Kaliumferricyanide-hexahydraat.

3.15. Ferrichloride-hexahydraat.

3.16. Sproeireagentia

3.16.1. Voeg aan een 5 % (m/v) oplossing van zilvernitraat (3.12) in water ammonia (3.5) toe tot het gevormde neerslag weer oplost.

Waarschuwing:

De oplossing kan na verloop van tijd ontleden en explosief worden en moet daarom na gebruik worden weggegooid.

3.16.2. 10 % (m/v) oplossing van 12-molybdofosforzuur (3.13) in ethanol (3.1).

3.16.3. Bereid een 1 % (m/v) oplossing van kaliumferricyanide (3.14) in water en een 2 % (m/v) oplossing van ferrichloride (3.15) in water. Meng vlak voor het gebruik gelijke delen van beide oplossingen.

4. Apparatuur

Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede

4.1. Gebruikelijke DLC-uitrusting.

4.2. DLC-platen, gebruiksklaar: silicagel GHR/UV254, 20 cm × 20 cm (Machery-Nagel of gelijkwaardig), laagdikte 0,25 mm.

4.3. Ultrasoonbad.

4.4. Centrifuge.

4.5. UV-lamp, 254 nm.

5. Werkwijze

5.1. Monstervoorbereiding

Weeg 3 g monster af in een reageerbuis van 10 ml met maatverdeling. Voeg 0,250 g ascorbinezuur (3.6) en 5 ml ethanol (3.1) toe. Breng de oplossing met ammonia (3.5) op een pH van 10. Vul aan met ethanol (3.1) tot 10 ml. Sluit de buis met een stop en homogeniseer gedurende 10 minuten in een ultrasoonbad. Filtreer over een papieren filter of centrifugeer bij 3 000 toeren/min.

5.2. Dunne-laagchromatografie

5.2.1. Verzadig een chromatografiebak met loopvloeistof (3.4).

5.2.2. Breng op een plaat 2 µl van elk van de referentieoplossingen (3.11) en 2 µl monsteroplossing (5.1) op. Ontwikkel de plaat bij kamertemperatuur in het donker, totdat het vloeistoffront een afstand van 15 cm heeft afgelegd.

5.2.3. Neem de plaat uit de bak en laat hem bij kamertemperatuur drogen.

5.3. Detectie

5.3.1. Inspecteer de plaat onder UV-licht van 254 nm en markeer de plaats van de vlekken.

5.3.2. Besproei de plaat met

- zilvernitraatreagens (3.16.1), of

- 12-molybdofosforzuurreagens (3.16.2) en verwarm tot circa 120 °C, of

- kaliumferricyanideoplossing en ferrichlorideoplossing (3.16.3).

6. Identificatie

Bereken de Rf-waarde van de verschillende vlekken.

Vergelijk de met de monsteroplossing verkregen vlekken met die van de referentieoplossingen daarbij lettend op de Rf-waarden, de kleur van de vlekken onder UV-bestraling en de kleur na zichtbaar maken met sproeireagens.

Voer de in het volgende onderdeel (B) beschreven HPLC-bepaling uit en vergelijk de met het monster verkregen retentietijden met die van de referentieoplossingen.

Bepaal aan de hand van de gecombineerde resultaten van DLC en HPLC of hydrochinon en/of ethers daarvan aanwezig zijn.

7. Opmerkingen

Onder de beschreven omstandigheden werden de volgende Rf-waarden verkregen:

hydrochinon 0,32

hydrochinonmonomethylether 0,53

hydrochinonmonoëthylether 0,55

hydrochinonmonobenzylether 0,58

B. KWANTITATIEVE ANALYSE

1. Doel en toepassingsgebied

Deze methode beschrijft een werkwijze voor de kwantitatieve analyse van hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether in huidbleekmiddelen.

2. Beginsel

Het monster wordt met een water/methanolmengsel geëxtraheerd, onder voorzichtig verwarmen om eventuele vetten te doen smelten. De kwantitatieve analyse van de te bepalen stoffen in de verkregen oplossing wordt uitgevoerd met behulp van reversed phase vloeistofchromatografie met UV-detectie.

3. Reagentia

3.1. Alle reagentia moeten van analysekwaliteit zijn. Het gebruikte water dient gedestilleerd water of water van minstens gelijkwaardige zuiverheid te zijn.

3.2. Methanol.

3.3. Hydrochinon.

3.4. Hydrochinonmonomethylether.

3.5. Hydrochinonmonoëthylether.

3.6. Hydrochinonmonobenzylether (monobenzon).

3.7. Tetrahydrofuran, geschikt van HPLC.

3.8. Water/methanolmengsel 1:1 (v/v). Meng één volumedeel water met één volumedeel methanol (3.2).

3.9. Mobiele fase: tetrahydrofuran/watermengsel 45:55 (v/v). Meng 45 volumedelen tetrahydrofuran (3.7) met 55 volumedelen water.

3.10. Standaardoplossing

Weeg in een maatkolf van 50 ml 0,06 g hydrochinon (3.3), 0,08 g hydrochinonmonomethylether (3.4), 0,1 g hydrochinonmonoëthylether (3.5) en 0,12 g hydrochinonmonobenzylether (3.6) af. Los op en vul aan met methanol (3.2). Bereid de standaardoplossing door 10 ml van deze oplossing met water/methanolmengsel (3.8) tot 50 ml te verdunnen. Deze oplossingen moeten vers worden bereid.

4. Apparatuur

Gangbare laboratoriumuitrusting, alsmede

4.1. Waterbad, in staat de temperatuur op 60 °C te houden.

4.2. Hogedruk-vloeistofchromatograaf, voorzien van een UV-detector met variabele golflengte en een injectielus van 10 µl.

4.3. Analytische kolom

Roestvrijstalen chromatografiekolom, lengte 250 mm, inwendige diameter 4,6 mm, gepakt met Zorbax phenyl (chemisch gebonden fenethylsilaan op Zorbax SIL, end-capped met trimethylchloorsilaan), deeltjesgrootte 6 µm, of gelijkwaardig. Gebruik geen guardkolom, behalve een fenylguard, of gelijkwaardig.

4.4. Filtreerpapier, diameter 90 mm, Schleicher & Schuell, Weissband No. 5892, of gelijkwaardig.

5. Werkwijze

5.1. Monstervoorbereiding

Weeg in een maatkolf van 50 ml 1 ± 0,1 g monster tot op drie cijfers achter de komma af (= a g). Dispergeer het monster in 25 ml water/methanolmengsel (3.8). Sluit de kolf en schud krachtig tot een homogene suspensie is verkregen. Schud ten minste 1 minuut. Plaats de kolf in een waterbad (4.1) bij 60 °C om de extractie te bevorderen. Koel de kolf en vul aan met water/methanolmengsel (3.8). Filtreer het extract over een papieren filter (4.4). Voer de HPLC-bepaling binnen 24 uur na bereiding van het extract uit.

5.2. HPLC

5.2.1. Stel het debiet van de mobiele fase (3.9) op 1 ml/min. en de detectorgolflengte op 295 nm in.

5.2.2. Injecteer 10 µl van de volgens 5.1 verkregen monsteroplossing en neem het chromatogram op. Bepaal de oppervlakten van de pieken. Voer een ijking uit als beschreven in 5.2.3. Vergelijk de chromatogrammen van het monster en de standaardoplossingen. Bepaal aan de hand van de piekoppervlakten en de responsiefactoren (RF), berekend als aangegeven in 5.2.3, de concentratie van de te analyseren stoffen in de monsteroplossing.

5.2.3. IJking

Injecteer 10 µl standaardoplossing (3.10) en neem het chromatogram op. Herhaal de meting enige malen, totdat een constante piekoppervlakte wordt verkregen.

Bepaal de responsiefactor RF:

RFi = pi ci

waarbij

pi = piekoppervlakte van respectievelijk hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether;

ci = concentratie (in g/50 ml) van respectievelijk hydrochinon, hydrochinonmonomethylether, hydrochinonmonoëthylether en hydrochinonmonobenzylether in de standaardoplossing (3.10);

Ga na dat de met de standaardoplossing en de monsteroplossing verkregen chromatogrammen aan de volgende voorwaarden voldoen:

- de piekscheiding van het slechtst gescheiden paar moet minimaal 0,90 zijn (voor een definitie van de piekscheiding zie figuur 1);

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 1: piekscheiding

Indien de vereiste scheiding niet wordt verkregen, moet een efficiëntere kolom worden gebruikt of moet de samenstelling van de mobiele fase worden aangepast tot dit wel het geval is.

- de asymmetriefactor As van alle verkregen pieken moet tussen 0,9 en 1,5 liggen (voor een definitie van de piekasymmetriefactor zie figuur 2). Voor het bepalen van de asymmetriefactor wordt het aanbevolen het chromatogram met een papiersnelheid van minimaal 2 cm/minuut op te nemen;

>REFERENTIE NAAR EEN FILM>

Figuur 2: piekasymmetriefactor

- er moet een vlakke basislijn worden verkregen.

6. Berekening

Bereken aan de hand van de piekoppervlakten de concentratie(s) van de te bepalen stof(fen) in het monster. Bereken de concentratie (xi) als massapercentage met de formule

xi % (m/m) = bi 7 100 RFi 7 a

waarbij

a = massa (g) van het ingewogen monster;

bi = piekoppervlakte van component i van het monster.

7. Herhaalbaarheid (1)

7.1. Bij een gehalte aan hydrochinon van 2 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,13 % bedragen.

7.2. Bij een gehalte aan hydrochinonmonomethylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,1 % bedragen.

7.3. Bij een gehalte aan hydrochinonmonoëthylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,11 % bedragen.

7.4. Bij een gehalte aan hydrochinonmonobenzylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee parallel aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,11 % bedragen.

8. Reproduceerbaarheid (1)

8.1. Bij een gehalte aan hydrochinon van 2 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,37 % bedragen.

8.2. Bij een gehalte aan hydrochinonmonomethylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,21 % bedragen.

8.3. Bij een gehalte aan hydrochinonmonoëthylether van 1,0 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,19 % bedragen.

8.4. Bij een gehalte aan hydrochinonmonobenzylether van 1 % mag de absolute waarde van het verschil tussen de resultaten van twee onder verschillende omstandigheden (verschillende laboratoria, verschillende analisten, verschillende apparatuur en/of verschillende tijdstippen) aan hetzelfde monster uitgevoerde bepalingen niet meer dan 0,11 % bedragen.

9. Opmerkingen

9.1. Wanneer een hydrochinongehalte van aanzienlijk meer dan 2 % wordt gevonden en een nauwkeurige gehaltebepaling vereist is, dient het monsterextract (5.1) te worden verdund tot de concentratie ongeveer zodanig is als met een monster dat 2 % hydrochinon bevat, zou worden verkregen, waarna de bepaling wordt herhaald.

(Bij sommige apparatuur kan de extinctie bij hoge hydrochinonconcentraties buiten het lineaire gebied van de detector uitvallen).

9.2 Storingen

Met de hierboven beschreven methode kunnen hydrochinon en de ethers daarvan in een enkele isocratische analyse worden bepaald. Door het gebruik van een fenylkolom wordt een voldoende retentie voor hydrochinon verkregen, hetgeen niet kan worden gegarandeerd wanneer een C18-kolom met de beschreven mobiele fase wordt gebruikt.

Deze methode is echter gevoelig voor storing door een aantal parabenen. Treedt een dergelijke storing op, dan moet de bepaling herhaald worden met een andere mobiele fase/stationaire fasesysteem. Geschikte methoden staan beschreven in de referenties (1) en (2) namelijk,

kolom: Zorbax ODS, 4,6 mm × 25 cm, of gelijkwaardig

temperatuur: 36 °C

debiet: 1,5 ml/min.

mobiele fase:

voor hydrochinon: methanol/water 5:95 (v/v)

voor hydrochinonmonomethylether: methanol/water 30:70 (v/v)

voor hydrichononmonobenzylether: methanol/water 80:20 (v/v)

kolom: Spherisorb S5-ODS, of gelijkwaardig

mobiele fase: water/methanol 90:10 (v/v)

debiet: 1,5 ml/min.

Deze condities zijn geschikt voor hydrochinon.

(1) Volgens ISO 5725.

(1) Volgens ISO 5725.

(1) Volgens ISO 5725.

(1) M. Herpol-Borremans en M.O. Masse, Identification et dosage de l'hydroquinone et ses éthers méthylique et benzylique dans les produits cosmétiques pour blanchir la peau, Int. J. Cosmet. Sci. 8, 203-214 (1986).

(2) J. Firth and I. Rix. Determination of Hydriquinone in skin toning creams, Analyst (1986), 111, p. 129.