RICHTLIJN 92/95/EEG VAN DE COMMISSIE van 9 november 1992 tot wijziging van Zevende Richtlijn 76/372/EEG houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders

DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN,

Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Economische Gemeenschap,

Gelet op Richtlijn 70/373/EEG van de Raad van 20 juli 1970 betreffende de invoering van gemeenschappelijke bemonsterings- en analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (1), laatstelijk gewijzigd bij de Akte van Toetreding van het Koninkrijk Spanje en de Portugese Republiek, en met name op artikel 2,

Overwegende dat in Zevende Richtlijn 76/372/EEG van de Commissie van 1 maart 1976 houdende vaststelling van gemeenschappelijke analysemethoden voor de officiële controle van diervoeders (2), gewijzigd bij Richtlijn 81/680/EEG (3), de methoden zijn vastgesteld voor de bepaling van aflatoxine B1;

Overwegende dat deze methoden moeten worden aangepast aan de stand van wetenschap en techniek; dat met name moet kunnen worden beschikt over een methode voor de controle op de zeer lage maximumgehalten aan aflatoxine die zijn vastgesteld bij Richtlijn 74/63/EEG van de Raad van 17 december 1973 inzake ongewenste stoffen en produkten in diervoeding (4), laatstelijk gewijzigd bij Richtlijn 91/132/EEG (5);

Overwegende dat bovendien moet kunnen worden beschikt over een methode voor de bepaling van het gehalte aan aflatoxine B1 bij aanwezigheid van produkten die de bepaling storen, bij voorbeeld citruspulp;

Overwegende dat de in deze richtlijn vastgestelde maatregelen in overeenstemming zijn met het advies van het Permanent Comité voor veevoeders,

HEEFT DE VOLGENDE RICHTLIJN VASTGESTELD:

Artikel 1

De bijlage bij Richtlijn 76/372/EEG wordt gewijzigd overeenkomstig de bijlage bij deze richtlijn.

Artikel 2

De Lid-Staten doen de nodige wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen in werking treden om uiterlijk op 1 oktober 1993 aan het bepaalde in deze richtlijn te voldoen. Zij stellen de Commissie daarvan onverwijld in kennis.

Wanneer de Lid-Staten deze bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen naar de onderhavige richtlijn verwezen of wordt hiernaar verwezen bij de officiële bekendmaking van die bepalingen. De regels voor deze verwijzing worden door de Lid-Staten vastgesteld.

Artikel 3

Deze richtlijn is gericht tot de Lid-Staten. Gedaan te Brussel, 9 november 1992. Voor de Commissie

Ray MAC SHARRY

Lid van de Commissie

(1) PB nr. L 170 van 3. 8. 1970, blz. 2. (2) PB nr. L 102 van 15. 4. 1976, blz. 8. (3) PB nr. L 246 van 29. 8. 1981, blz. 32. (4) PB nr. L 38 van 11. 2. 1974, blz. 31. (5) PB nr. L 66 van 13. 3. 1991, blz. 16.

BIJLAGE

I. Onder deel A "Methode door middel van eendimensionale dunnelaagchromatografie" wordt de tekst van punt 1 "Doel en toepassingsgebied" gelezen:

"1. Doel en toepassingsgebied

Met behulp van deze methode is het mogelijk het gehalte aan aflatoxine B1 te bepalen in enkelvoudige diervoeders en grondstoffen. Deze methode is niet bruikbaar in aanwezigheid van citruspulp. De ondergrens van de bepaling ligt bij 0,01 mg/kg (10 ppb).

Indien de aanwezigheid van bepaalde stoffen de bepaling stoort, moet de analyse opnieuw worden verricht, maar dan volgens methode B (hogedrukvloeistofchromatografie).".

II. Onder deel B "Methode door middel van tweedimensionale dunnelaagchromatografie" wordt de tekst gelezen:

"B. BEPALING VAN AFLATOXINE B1 MET HOGEDRUKVLOEISTOFCHROMATOGRAFIE

1. Doel en toepassingsgebied Met behulp van deze methode is het mogelijk het gehalte aan aflatoxine B1 te bepalen in diervoeders, inclusief die welke citruspulp bevatten. De onderste bepalingsgrens is 0,001 mg/kg (1 ppb). 2. Principe Het monster wordt met chloroform geëxtraheerd. Het extract wordt gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wordt achtereenvolgens met een Florisil-patroon en een C18-patroon gezuiverd. De uiteindelijke scheiding en bepaling worden uitgevoerd met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met een reversed phase C18-kolom, gevolgd door derivatisering met jodium en fluorescentiedetectie. N.B.: Mycotoxinen zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen dienen in een zuurkast te worden uitgevoerd. Speciale voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer aflatoxinen in vaste vorm zijn, vanwege hun elektrostatische karakter waardoor zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden. 3. Reagentia 3.1. Chloroform, gestabiliseerd met 0,5 tot 1,0 % (m/m) ethanol. Zie opmerking 10.2. 3.2. Methanol, HPLC-kwaliteit voor bereiding van 3.6. 3.3. Aceton. 3.4. Acetonitril, HPLC-kwaliteit. 3.5. Elutiemiddelen Bereid deze één dag voor gebruik, of verwijder de lucht er ultrasoon uit. 3.5.1. Mengsel van aceton (3.3) en water, 98+2 (v+v). 3.5.2. Mengsel van water en methanol (3.2), 80+20 (v+v). 3.5.3. Mengsel van water en aceton (3.3), 85+15 (v+v). 3.6. Mobiele fase voor HPLC Mengsel van water, methanol (3.2) en acetonitril (3.4), 130+70+40 (v+v+v). N.B.: Zonoig wordt de samenstelling van de mobiele fase aangepast aan het gebruikte type HPLC-kolom. 3.7. Verzadigde oplossing van jodium in water. Voeg 2 g jodium toe aan 400 ml water. Meng gedurende ten minste 90 minuten en filtreer door een membraanfilter (4.15). Scherm deze oplossing af tegen licht om ontleding te voorkomen. 3.8. Celite 545, met zuur gewassen, of gelijkwaardig materiaal. 3.9. Florisil-patroon (Waters SEP-PAK), of gelijkwaardig materiaal. 3.10. C18-patroon (Waters SEP-PAK), of gelijkwaardig materiaal. 3.11. Inert gas, bij voorbeeld stikstof. 3.12. Aflatoxine B1, standaardoplossing in chloroform, concentratie 10 mg/ml. Controleer de concentratie van de oplossing als volgt: neem het absorptiespectrum van de oplossing op tussen 330 en 370 nm met een spectrofotometer (4.23). Meet de absorptie (A) bij het maximum dicht bij 363 nm. Bereken de concentratie aflatoxine B1 in microgram per milliliter oplossing met de formule: Concentratie (mg/ml) = 312 × A × 1000

22 300 = 13,991 × A 3.12.1. Aflatoxine B1, voorraadstandaardoplossing in chloroform Breng 2,5 ml standaardoplossing (3.12) kwantitatief over in een maatkolf van 50 ml en vul aan tot de maatstreep met chloroform (3.1). Bewaar deze oplossing goed afgesloten, in aluminiumfolie gewikkeld en op een koele (4 °C) en donkere plaats. 3.13. Aflatoxine B1, ijkoplossingen voor HPLC N.B.: Gebruik voor de bereiding van deze oplossingen met zuur gewassen glaswerk (zie bij 4, Apparatuur). 3.13.1. IJkoplossing, 4 ng/ml Laat de maatkolf met de voorraadstandaardoplossing (3.12.1) in enkele uren in aluminiumfolie tot kamertemperatuur opwarmen. Breng 400 ml van de voorraadstandaardoplossing (200 ng aflatoxine B1) over in een maatkolf van 50 ml en damp dit droog met een stroom inert gas (3.11). Los het verkregen residu op in ongeveer 20 ml water/aceton (3.5.3), vul de oplossing aan tot de maatstreep met het water/aceton-mengsel en meng goed. 3.13.2. IJkoplossing, 3 ng/ml Breng 7,5 ml van de ijkoplossing van 4 ng/ml (3.13.1) kwantitatief over in een maatkolf van 10 ml, vul aan tot de maatstreep met water/aceton (3.5.3) en meng goed. 3.13.3. IJkoplossing, 2 ng/ml, tevens referentiestandaard Breng 25 ml van de ijkoplossing van 4 ng/ml (3.13.1) kwantitatief over in een maatkolf van 50 ml, vul aan tot de maatstreep met het water/aceton-mengsel (3.5.3) en meng goed. Deze oplossing wordt ook gebruikt voor herhaalde injectie tijdens HPLC-bepalingen (5.5) en wordt hierna aangeduid als referentiestandaard. 3.13.4. IJkoplossing, 1 ng/ml Breng 2,5 ml van de ijkoplossing van 4 ng/ml (3.13.1) kwantitatief over in een maatkolf van 10 ml, vul aan tot de maatstreep met het water/aceton-mengsel (3.5.3) en meng goed. 3.14. Ampul welke een mengsel van aflatoxinen B1, B2, G1 en G2 in concentraties van respectievelijk circa 1, 0,5, 1 en 0,5 mg/ml in 1 ml chloroform bevat. 3.14.1. Testoplossing voor HPLC Breng de inhoud van de ampul (3.14) over in een glazen buis met glazen stop of in een flesje met schroefdop. Breng 40 ml van deze oplossing over in een glazen buis met glazen stop (4.22) (met zuur gewassen). Damp de chloroform droog met een stikstofstroom en los het residu op in 10 ml water/aceton-mengsel (3.5.3). 3.15. Reagentia voor bevestigingstest (6). 3.15.1. Verzadigde oplossing van natriumchloride in water. 3.15.2. Natriumsulfaat, watervrij, in korrels. 4. Apparatuur Opgelet: Het gebruik van niet met zuur gewassen glaswerk voor oplossingen van aflatoxine in water kan leiden tot verlies van aflatoxine. Bijzondere aandacht dient te worden besteed aan nieuw glaswerk en wegwerpglaswerk, zoals flesjes voor monsterwisselaars en pasteurpipetten. Glaswerk dat met oplossingen van aflatoxine in aanraking komt, moet daarom enkele uren in verdund zuur (bij voorbeeld zwavelzuur, 2 mol/l) worden gelegd en daarna ter verwijdering van zuurresten grondig met gedestilleerd water worden gespoeld (bij voorbeeld drie maal, controleren met pH-papier). In de praktijk is deze behandeling nodig voor de rondbodemkolf (4.4), de maatkolven en maatcilinders, de voor ijkoplossingen en extracten gebruikte flesjes en buizen (vooral voor flesjes voor monsterwisselaars) en de pasteurpipetten voor zover deze worden gebruikt voor het overbrengen van ijkoplossingen of extracten. 4.1. Maal- en mengtoestel. 4.2. Zeef met openingen van 1,0 mm (ISO R 565). 4.3. Schudmachine. 4.4. Rotatievacuuemverdamper, voorzien van een rondbodemkolf van 150-250 ml. 4.5. Hogedrukvloeistofchromatograaf; injector met injectielus geschikt voor injectie van 250 ml. Zie de instructies van de fabrikant voor de gedeeltelijke of volledige vulling van de injectielus. 4.6. Analytische HPLC-kolom: C18-vulling van 3 mm of 5 mm deeltjes. 4.7. Pulsvrije pomp voor de toevoer van het jodiumreagens na de kolom. 4.8. T-stuk zonder dood volume (Valco), roestvrij staal (1/16" × 0,75 mm). 4.9. Spiraalvormig reactiekanaal; teflon of roestvrij staal. In combinatie met 5 mm of 3 mm HPLC-kolommen komen afmetingen van 3 000 × 0,5 mm tot 5 000 × 0,5 mm in aanmerking. 4.10. Gethermostateerd waterbad, ingesteld op 60 °C, waarmee een temperatuurregeling van beter dan 0,1 °C mogelijk is. 4.11. Fluorescentiedetector met excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 365 nm en 435 nm (voor een filterinstrument: emissiegolflengte > 400 nm). Detectie van ten minste 0,05 ng aflatoxine B1 moet mogelijk zijn. Het kan nodig zijn enige tegendruk toe te passen (bij voorbeeld in de vorm van een restrictor of een spiraal van teflon of roestvrij staal aan de uitgang van de detector), om luchtbellen in de doorstroomcel tegen te gaan. 4.12. Recorder. 4.13. Elektronische integrator (facultatief). 4.14. Vouwfilters, doorsnede 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 of gelijkwaardig. 4.15. Membraanfilter met poriegrootte van 0,45 mm, Millipore H.A.W.P. 04700 of gelijkwaardig. 4.16. Erlenmeyerkolf van 500 ml met glazen stop. 4.17. Glazen kolom (inwendige doorsnede ongeveer 1 cm, lengte ongeveer 30 cm) voorzien van een Luer-uiteinde. 4.18. Luer nylon kraan, chloroformbestendig (bij voorbeeld Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 of gelijkwaardig). 4.19. Chemisch inerte injectiespuit, 10 ml, met Luer-verbinding. 4.20. Injectiespuit, geschikt voor HPLC-injectie van 250 ml (zie 4.5). 4.21. Microspuit van 100 ml voor de bereiding van de ijkoplossingen (nauwkeurigheid binnen 2 %, te controleren door wegen). 4.22. Glazen buizen, geijkt op 10 ml, met glazen stop. 4.23. Spectrofotometer, geschikt voor UV-meting. 4.24. Apparatuur voor bevestigingstest (6) 4.24.1. Scheitrechter van 100 ml, met teflonkraan met zuur gespoeld. 4.24.2. Verwarmingsblok, 40-50 °C. 5. Werkwijze 5.1. Monsterbereiding Maal het monster zo fijn dat het door de zeef (4.2) gaat. 5.2. Testmonster Weeg 50,0 g van het bereide monster af in de erlenmeyer (4.16). 5.3. Extractie Voeg aan het testmonster (5.2) 25 g Celite (3.8), 250 ml chloroform (3.1) en 25 ml water toe. Sluit de erlenmeyer af en schud 30 minuten op de schudmachine (4.3). Filtreer het mengsel door een vouwfilter (4.14) en vang 50 ml van het filtraat op. Neem, indien nodig, een hoeveelheid van het filtraat en verdun dit tot 50 ml met chloroform, zodanig dat de concentratie aan aflatoxine B1 niet hoger is dan 4 ng/ml. 5.4. Opzuivering (de opzuivering dient zonder noemenswaardige onderbrekingen te worden uitgevoerd). Opgelet: - Zorg dat in de onderzoekruimte geen daglicht wordt toegelaten. Dit kan worden bereikt door een van de volgende maatregelen:

(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and Contaminants 8, 17-29.

(2) ISO 3534-1977.

(3) PB nr. L 351 van 2. 12. 1989, blz. 39.

1. UV-absorberende folie op de ramen, in combinatie met gedempt licht (geen direct zonlicht); 2. gordijnen of jaloezieën in combinatie met kunstlicht (TL-buizen zijn aanvaardbaar). - Aflatoxine-bevattende oplossingen moeten zoveel mogelijk beschermd worden tegen licht (donker bewaren, aluminiumfolie gebruiken). 5.4.1. Zuivering met Florisil-SEP-PAK 5.4.1.1. Voorbereiding patroon en koppeling aan kolom Sluit aan het korte uiteinde van een Florisil-patroon (3.9) een kraan aan (zie figuur 1). Spoel de patroon en verwijder de lucht eruit door van 10 ml chloroform (3.1) met een injectiespuit (4.19) 8 ml snel via de kraan door de patroon te leiden. Verbind het lange uiteinde van de patroon met een glazen kolom (4.17) en leid de overblijvende 2 ml chloroform door de patroon in de kolom. Sluit de kraan en verwijder de injectiespuit. 5.4.1.2. Zuivering Breng het bij 5.3 verzamelde filtraat in de kolom en laat het filtraat met behulp van de zwaartekracht door de patroon elueren. Spoel met 5 ml chloroform (3.1) en vervolgens met 20 ml methanol (3.2). Verwerp de eluaten. Voorkomen moet worden dat de patroon bij deze handelingen droog komt te staan. Elueer het aflatoxine B1 met 40 ml aceton/water (3.5.1) en vang het gehele eluaat op in de rondbodemkolf van de rotatievacuuemverdamper (4.4). Damp het eluaat in aan de rotatievacuuemverdamper bij 40-50 °C tot geen aceton meer wordt afgedestilleerd. (N.B.: Op dit punt blijft er ongeveer 0,5 ml vloeistof in de kolf over; proefondervindelijk is gebleken dat verder indampen geen kwaad kan en dat wanneer er 0,5 ml vloeistof over is, er geen noemenswaardige hoeveelheid aceton meer is; acetonresten kunnen leiden tot een verlies aan aflatoxine B1 in de C18-patroon.) Voeg aan het residu 1 ml methanol (3.2) toe, zwenk de kolf rond zodat op de wand van de kolf aanwezige aflatoxine B1 wordt opgelost, voeg 4 ml water toe en meng. Koppel de patroon af en verwijder deze. Spoel de glazen kolom met water en bewaar deze voor de C18-zuivering. 5.4.2. Zuivering met C18-SEP-PAK 5.4.2.1. Voorbereiding patroon en koppeling aan kolom Sluit aan het korte uiteinde van een C18-patroon (3.10) een kraan (4.18) aan (zie figuur 1). Spoel de patroon en verwijder eventuele lucht door met een spuit (4.19) 10 ml methanol (3.2) snel via de kraan door de patroon te leiden (luchtbellen in de patroon zijn zichtbaar als lichtvlekjes tegen een grijze achtergrond). Neem 10 ml water en leid 8 ml door de patroon (bij de overgang van methanol naar water oppassen voor de vorming van luchtbellen). Verbind het lange uiteinde van de patroon met een glazen kolom (4.17) en leid de overblijvende 2 ml water door de patroon in de kolom. Sluit de kraan en verwijder de spuit. 5.4.2.2. Zuivering Breng het bij 5.4.1.2 verzamelde extract kwantitatief over in de kolom (4.17), spoel de kolf tweemaal met 5 ml water/methanol-mengsel (3.5.2) en laat de vloeistof door middel van de zwaartekracht door de patroon elueren. Voorkomen moet worden dat de patroon bij deze handelingen droog komt te staan. (Indien zich in de vernauwing van de patroon luchtbellen vormen, wordt de doorstroming gestopt en wordt zachtjes tegen de bovenzijde van de kolom getikt, zodat de bellen verdwijnen, waarna de doorstroming wordt hervat.) Elueer met 25 ml water/methanol-mengsel (3.5.2). Verwerp de eluaten. Elueer het aflatoxine B1 met 50 ml water/aceton-mengsel (3.5.3) en vang het gehele eluaat op in een maatkolf van 50 ml. Vul aan tot de maatstreep met water en meng: de verkregen monsteroplossing wordt gebruikt voor de chromatografie (5.5). Opgelet: Filtreren van het uiteindelijke extract voor de HPLC-stap is meestal niet nodig. Wordt filtreren wel nodig geacht, dan dienen geen cellulosefilters te worden gebruikt, daar deze tot een verlies aan aflatoxine B1 kunnen leiden. Teflon filters (4.15) zijn wel bruikbaar. 5.5. Hogedrukvloeistofchromatografie (Zie figuur 2 voor de opstelling van de apparatuur.) De instrumenten moeten de gelegenheid hebben om op temperatuur te komen en stabiel te worden. Opmerking 1: De voor de HPLC-mobiele fase en het reagens na de kolom vermelde stroomsnelheden zijn slechts indicatief. Zo nodig worden deze aan de aard en de afmetingen van de HPLC-kolom aangepast. Opmerking 2: De piekuitslagen van aflatoxinen zijn afhankelijk van de temperatuur en daarom moet voor eventueel verloop worden gecompenseerd (zie figuur 3). Door injectie van een vaste hoeveelheid referentiestandaard aflatoxine B1 (3.13.3) met regelmatige tussenpozen (elke derde injectie) kunnen de piekuitslagen voor aflatoxine B1 tussen deze referentiestandaarden aan de hand van de gemiddelde uitslag worden gecorrigeerd, mits het verschil tussen de uitslagen van opeenvolgende referentiestandaarden klein is (< 10 %). Daarom moeten injecties zonder onderbrekingen plaatshebben. Indien een onderbreking nodig is, dienen de laatste injectie voor de onderbreking en de eerste na de onderbreking injecties van de referentiestandaard (3.13.3) te zijn. Aangezien de ijklijn recht is en door de oorsprong gaat, worden de hoeveelheden aflatoxine B1 in het monster rechtstreeks aan de hand van de naastliggende referentiestandaarden bepaald. 5.5.1. Instelling van de HPLC-pomp Stel de HPLC-pomp (4.5) zo in dat voor een HPLC-kolom van 5 mm respectievelijk 3 mm (4.6) de stroomsnelheid van de mobiele fase (3.6) 0,5 respectievelijk 0,3 ml/min. bedraagt. 5.5.2. Instelling van de pomp na de kolom Stel de pomp (4.7) zo in dat de jodiumoplossing (3.7) een stroomsnelheid van 0,2-0,4 ml/min. heeft. Als vuistregel dienen bij stroomsnelheden van de mobiele fase van 0,5 respectievelijk 0,3 ml/min. stroomsnelheden na de kolom van ongeveer 0,4 respectievelijk 0,2 ml/min. te worden gekozen. 5.5.3. Fluorescentiedetector Stel de fluorescentiedetector (4.11) in op een excitatiegolflengte van 365 nm en een emissie-golflengte van 435 nm (filterinstrument: > 400 nm). Stel de verzwakker van de detector zo in dat voor 1 ng aflatoxine B1 de recorder ongeveer 80 % van de volledige uitslag geeft. 5.5.4. Injector Injecteer van alle oplossingen hoeveelheden van 250 ml volgens de aanwijzingen van de fabrikant van de injector. 5.5.5. Controle op de chromatografische scheiding Injecteer de testoplossing voor HPLC (3.14.1). De dalen dienen een afstand tot de basislijn te hebben van minder dan 5 % van de som van de hoogten van de aangrenzende pieken. 5.5.6. Controle op de stabiliteit van het systeem Injecteer voorafgaande aan een reeks analyses herhaaldelijk de referentiestandaard (3.13.3) totdat stabiele piekuitslagen worden verkregen. (N.B.: De piekuitslagen voor aflatoxine B1 van twee opeenvolgende injecties mogen niet meer dan 6 % van elkaar verschillen.) Controleer onmiddellijk daarna de lineariteit (5.5.7). 5.5.7. Controle op de lineariteit Injecteer de ijkoplossingen van aflatoxine B1 (3.13.1 tot en met 3.13.4). Als derde injectie wordt telkens de referentiestandaard (3.13.3) gebruikt ter correctie van het verloop in piekrespons. (N.B.: De piekuitslagen van de referentiestandaard mogen niet meer dan 10 % verschil geven in 90 minuten.) Corrigeer voor verloop met de formule bij punt 7. De ijklijn moet recht zijn en door de oorsprong lopen, binnen tweemaal de standaardfout voor de geschatte Y-waarde. De gevonden waarden mogen niet meer dan 3 % van de nominale waarden afwijken. Als aan deze eisen is voldaan, wordt dadelijk verdergegaan. Zo niet, dan worden eerst de oorzaken van de problemen opgespoord en verholpen. 5.5.8. Injectie van de monsterextracten Injecteer de gezuiverde monsterextracten (5.4.2.2). Injecteer na twee monsterextracten telkens weer de referentiestandaard (3.13.3), dus: referentiestandaard, extract, extract, referentiestandaard, extract, extract, referentiestandaard, enzovoort. 6. Bevestigingstest 6.1. Verdere behandeling van het extract (5.4.2.2) Voeg aan het bij 5.4.2.2 verkregen extract 5 ml natriumchlorideoplossing (3.15.1) toe. Extraheer het mengsel in een scheitrechter (4.24.1) driemaal telkens een minuut met 2 ml chloroform (3.1). Giet de verzamelde chloroformextracten over ongeveer 1 g natriumsulfaat (3.15.2) in een reageerbuis van 10 ml. Hiervoor kan een trechtertje (doorsnede 4 cm) met een propje watten in de vernauwing worden gebruikt, waarop zich ongeveer 1 g natriumsulfaat (3.15.2) bevindt. Was het natriumsulfaat met een paar ml chloroform en vang dit op in dezelfde reageerbuis. Damp het chloroformextract droog in dezelfde reageerbuis met behulp van het verwarmingsblok (4.24.2) en los het residu weer op in 1 ml chloroform. 6.2. Bereiding van het derivaat en dunnelaagchromatografie Zie Richtlijn 76/372/EEG van de Raad van 1 maart 1976, bijlage, methode A, onder 5.6.2. 7. Berekening van de resultaten Bereken het in het monster aanwezige gehalte aan aflatoxine B1 in mg/kg met behulp van de formule: gehalte aan aflatoxine B1 in mg/kg = m × Ve x t

Vm × M × Vf Vc waarin: m = hoeveelheid aflatoxine B1 in ng volgens de B1-piek van het monster, die als volgt wordt berekend: m = P (monster)

P (st1) + P (st2) × 2 r (st) P (monster) = piekoppervlak voor aflatoxine P1 in het monster P (st1) = piekoppervlak voor aflatoxine B1 in voorafgaande referentiestandaard (3.13.3) P (st2) = piekoppervlak voor aflatoxine B1 in eerstvolgende referentiestandaard (3.13.3) r (st) = ingespoten hoeveelheid aflatoxine B1 in de referentiestandaard (3.13.3) in ng Vm = volume van het ingespoten monsterextract in ml Ve x t = eindvolume van het monsterextract in ml, rekening houdend met eventuele verdunning (zie 5.3) M = massa van het monster in g Vf = volume van het in de Florisil-patroon overgebrachte filtraat (5.4.1.2) in ml Vc = volume van de voor de monsterextractie gebruikte chloroform in ml Indien het protocol van de hier beschreven methode wordt gevolgd, kan de formule als volgt worden vereenvoudigd: gehalte aan aflatoxine B1 in mg/kg = 20 × m 7.1. De resultaten kunnen ook worden berekend door middel van metingen van de piekhoogten. 8. Herhaalbaarheid Zie bij 10.1 (opmerkingen). 9. Reproduceerbaarheid Zie bij 10.1. 10. Opmerkingen 10.1. Precisie Een internationaal uitgevoerd ringonderzoek (1) op diervoeders leverde voor de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid de in tabel 1 weergegeven resultaten. Onder herhaalbaarheid (r) wordt hier verstaan de grootste verhouding die met een waarschijnlijkheid van 95 % bij vergelijking van twee uitkomsten van hetzelfde monster in hetzelfde laboratorium onder overeenkomstige omstandigheden niet significant is. Het begrip reproduceerbaarheid (R) is overeenkomstig gedefinieerd voor de vergelijking van twee laboratoria volgens ISO 3534-1977, 2.35 (2) en Beschikking nr. 610/89/EEG van de Commissie van 14 november 1989 (3). In tabel 1 zijn r en R ook vermeld als variatiecoëfficiënten. Tabel 1 Herhaalbaarheid (r) en reproduceerbaarheid (R), uitgedrukt als verhoudingen en overeenkomstige variatiecoëfficiënten (15 laboratoria)

Gehalte r R CVr (*) CVR (mg/kg) (%) (%) 8 & 14 1,4 1,7 11 18 (*) CV = variatiecoëfficiënt. 10.2. Stabilisatie van chloroform (3.1) De adsorptie-eigenschappen van de Florisil-patroon kunnen zich wijzigen, als de chloroform gestabiliseerd wordt met andere middelen dan ethanol. Dit moet geverifieerd worden volgens 10.3, indien de aangeduide chloroform niet beschikbaar is. 10.3. Nauwkeurigheid De juiste uitvoering van de methode wordt gecontroleerd door herhalingsbepalingen op gecertificeerde referentiematerialen. Indien die niet beschikbaar zijn, dient de methode gecontroleerd te worden met terugvindingsproeven aan blanco-monsters met toevoeging. Het gemiddelde terugvindingspercentage moet meer dan 80 % en minder dan 110% van de werkelijke waarde zijn. Figuur 1: Combinatie van kolom en patroon 1. Mobiele fase

2. Pomp

3. Injectiekraan

4. Voorkolom

5. Analytische HPLC-kolom

6. Jodiumoplossing

7. Reagenspomp 8. T-stuk

9. Gethermostateerd bad

10. Reactorspiraal

11. Fluorescentiedetector

12. Restrictor

13. Opvangvat

14. Recorder/integrator Figuur 2: Stroomschema van het LC-systeem met derivatisering met jodium na de kolom Respons gemiddelde van naastliggende

referentiestandaarden Tijd referentie- standaard extract (of ijkoplossing) extract (of ijkoplossing) referentie- standaard extract (of ijkoplossing) Figuur 3: Compensatie voor verloop in piekuitslag voor aflatoxine B1 door regelmatige injectie van referentiestandaard (3.13.3)"