BIJLAGE I

Testmethoden voor de detectie en identificatie van het gespecificeerde plaagorganisme zoals bedoeld in artikel 3, lid 2

1. Tests aan de hand van sporen

Voor detectie en identificatie worden zomersporangia en rustsporen gebruikt die door zeven uit grond of rechtstreeks van het plantenmateriaal zijn verkregen.

2. Detectiemethoden

Om sporen van het gespecificeerde plaagorganisme uit grond te extraheren, wordt één van de volgende methoden toegepast:

a) methode voor het zeven van grond zoals beschreven door Pratt (1976) (1);

b) methode voor het zeven van grond zoals beschreven door Van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) zonalecentrifugatietechniek voor de verwerking van monsters met hoge doorvoer, zoals beschreven door Wander et al. (2007) (3).

3. Identificatiemethoden

Na de extractie worden de sporen van het gespecificeerde plaagorganisme aan de hand van één van de volgende methoden geïdentificeerd:

a) morfologische identificatie onder een lichtmicroscoop bij een vergroting van 100x à 400x;

b) conventionele PCR met primers op basis van Lévesque et al. (2001) (4) en Van den Boogert et al. (2005) (5);

c) real-time-PCR met primers en probes volgens Van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) real-time-PCR met primers en probes volgens Smith et al. (2014) (7).

4. Levensvatbaarheid van rustsporen

De levensvatbaarheid van rustsporen kan door middel van een microscopisch onderzoek of een bioassay worden bepaald. De levensvatbaarheid van sporangia kan worden bepaald door middel van een microscopisch onderzoek van in lactofenol of water geplaatste sporangia (Przetakiewicz 2015) (8). Sporangia met gegranuleerde inhoud of met licht afgerond protoplasma mogen als levensvatbaar worden beschouwd. Sporangia die permanent geplasmolyseerd zijn of geen zichtbare inhoud hebben, worden als dood beschouwd.

Als alternatief of in geval van twijfel mag een bioassay, zoals beschreven in bijlage IV, punt 3, worden uitgevoerd.

5. Bepaling van pathotypen

Om pathotypen te bepalen worden verse wratten gebruikt.

Het inoculum voor de test wordt volgens een van de volgende methoden aangemaakt:

a) de methode van SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), bestaande uit de twee volgende stappen: i) aanmaak van het inoculum Oud (bruin) wratweefsel wordt in kleinere stukken gebroken en bij kamertemperatuur aan de lucht gedroogd totdat het hard wordt. Het harde weefsel wordt manueel of mechanisch gemalen. Het gemalen materiaal wordt droog gezeefd, waarbij de fractie van 25-75 μm wordt opgevangen en vervolgens met de chloroformmethode van Pratt (1976)1 wordt geëxtraheerd; ii) aanmaak van verse wratten Ongeveer 10 mg geëxtraheerde rustsporen wordt op het oppervlak van 10 ml steriel gedistilleerd water in een klein kunststof petrischaaltje gestrooid en bij 20 °C in het donker geïncubeerd tot de sporen ontkiemen. Aardappelknollen met kleine kiemen van 1 à 2 mm lang worden met de gemerkte kiemen naar boven in transparante kunststof bakken geplaatst waarin vochtige papieren doekjes zijn aangebracht. Rond de kiemen wordt met een spuit een ring van gesmolten vaseline aangebracht. De ring moet ongebroken en hoog genoeg zijn, zodat de sporensuspensie niet weglekt. De 10 ml ontkiemende rustsporen wordt met steriel water verder verdund tot 20 ml en met een pipet of knijpfles in de ringen aangebracht totdat de kiem volledig in sporensuspensie is ondergedompeld. De kunststof bakken worden met deksels afgedekt en gedurende vier dagen bij 10 °C geïncubeerd, waarna de bakken worden geopend, het inoculum en de vaselineringen worden verwijderd en de bakken in een benevelde kas met een temperatuur van 15 à 18 °C (16 uur licht) worden geplaatst;

b) de methode van Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c) de methode van Potoček et al. (1991) (10);

d) de methode van Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)).

Voor de bepaling van alle voor de Unie relevante pathotypen, namelijk (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) en 38(Nevşehir), wordt overeenkomstig de tabel een differentiële infectietest met verschillende rassen van de nader omschreven plant gebruikt. De infectietest wordt volgens het in punt d) vermelde protocol (methode van Glynne-Lemmerzahl) uitgevoerd.

Selectieve gevoeligheid van aardappelcultivars voor de bepaling van pathotypen van S. endobioticum

Cultivar Pathotypen van S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R “S”: vatbaar “R”: resistent *: betekent dat het ras licht vatbaar is voor S. endobioticum (“aanwezigheid van niet-necrotische sorusplekken zonder vorming van wratten”).

(1) Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21-29.

(2) Van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25-31.

(3) Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165-174.

(4) Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200—201.

(5) Van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47-57.

(6) Van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129-133.

(7) Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422-432.

(8) Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. from Poland. American Journal of Potato Research 92: 704-708.

(9) Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114-115.

(10) Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191-205.

(11) Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34-60.

(12) Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288-297.

(13) Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125-135.